無菌ヒアルロン酸溶液
ヒアルロン酸を含む溶液の無菌化方法。その方法は重量平均分子量が０．６ＭＤａ〜３．６ＭＤａであるヒアルロン酸の水溶液であって、該ヒアルロン酸の濃度が０．０４質量％〜０．８質量％である水溶液を提供することを含む。その水溶液は、また、イオン強度が３質量％〜３０質量％の塩化ナトリウムの水性濃度と等価である。一旦、高塩濃度ヒアルロン酸水溶液を調製したら、その溶液を、少なくとも１時間で６日間以下の間、４０℃〜８０℃の温度に維持する。その加熱処理工程に次いで、水溶液を除菌フィルタ媒体をとおしてろ過し、除菌された高塩濃度ヒアルロン酸溶液を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明はヒアルロン酸を含むフィルタ除菌された水溶液、及び、ヒアルロン酸を含む商用体積の無菌溶液の調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
残念ながら、多くのバイオポリマーは加熱滅菌などの一般的な無菌化手順に対して感受性である。加熱滅菌はしばしばバイオポリマーの物理化学的特性に顕著な変化をもたらすことがあり、それにより、得られる無菌バイオポリマーは使用目的に適さないものとなる。
【０００３】
医療材料に現在使用されている無菌化法としては、たとえば、加熱処理、高圧蒸気滅菌（たとえば、オートクレーブ滅菌）、酸化エチレンガス（ＥＯＧ）滅菌、超臨界二酸化炭素滅菌及び放射線滅菌が挙げられる。たとえば、米国特許第６，８９１，０３５号明細書、米国特許第６，１４９，８６４号明細書、米国特許第５，６２１，０９３号明細書、米国特許第４，２６３，２５３号明細書、ＵＳ２００６／０２９２０３０及びＵＳ２００７／０００９５７８を参照されたい。利用可能な無菌化法は、通常、無菌化しようとする特定のバイオポリマーの堅牢さに関して評価される。たとえば、高圧蒸気滅菌はバイオポリマーが高温及び高圧に耐えることができる範囲でのみバイオポリマーに使用されうる。しかしながら、ヒアルロン酸を含む非常に少数のバイオポリマーしかこのような高温及び高圧に耐えることができない。ＥＯＧ滅菌はそのプロセスがバイオポリマーを熱分解するのを抑制するので有用である可能性がある。しかしながら、組成物中の残存酸化エチレンの存在は問題となることがある。
【０００４】
ヒアルロン酸は非免疫原性物質であり、その粘弾性及び親水性のために、ヒアルロン酸は、たとえば、Balazsの米国特許第４，１４１，９７３号明細書に開示されているとおり、目の硝子体もしくは関節滑液の代替品として、又は、眼科手術における支持媒体（supportive medium）として長年にわたって使用されてきた。関節滑液において、ヒアルロン酸溶液は細胞に保護環境を提供するための滑剤としての役割を果たし、このため、炎症を起こした膝関節の治療に使用されている。Chemedia S.A.のＥＰ−Ａ−０６９８３８８は増粘剤としてヒアルロン酸塩を含む人工涙液としての使用のための眼科調製物を開示している。ヒアルロン酸を含む製品の消費者使用では製造者が消費者製品を無菌化する必要があり、そして開放した複数用量製剤として使用されるならば、製剤製品を保存するための追加の工程を取らなければならない。
【０００５】
ヒアルロン酸は熱滅菌プロセスに非常に感受性があることが知られている１つのバイオポリマーである。ヒアルロン酸の加熱滅菌はヒアルロン酸の加水分解又は酸化を加速し、それにより、バイオポリマーの平均分子量の有意なそしてしばしば有害な低下を生じさせることが知られている。多くの医薬用途では、製剤中のヒアルロン酸の比較的に低分子量の形態は望ましくない。通常、ヒアルロン酸の低分子量形態はヒアルロン酸の高分子量形態の望ましいレオロジー特性を提供しない。上記の加熱滅菌法におけるヒアルロン酸の分解を補うために、所望されるよりも高い分子量を有するヒアルロン酸で開始することが可能である。しかしながら、この調節では、ヒアルロン酸の製品収率はそのバイオポリマーの平均分子量が増加するとともに減少するのでプロセス非効率をもたらすことになる。
【０００６】
ヒアルロン酸を無菌化する別の既知の方法はろ過によるものである。濃縮形態で、通常には、乾燥粉末の形態で精製ヒアルロン酸塩を調製するための工業法において一般的なろ過法が使用されており、ここで、水溶液をフィルタをとおして通過させ、次いで、乾燥させる。このようなろ過法は欧州特許出願ＥＰ８６７４５３及びＷＯ００／４４９２５明細書に記載されている。米国特許出願公開第２００６／００５２３３６号明細書は溶液の粘度を低減するために比較的に低いヒアルロン酸濃度で高分子量ヒアルロン酸をフィルタ除菌する方法を記載している。ろ過工程の次に、真空を課しそして水を除去することにより溶液中のヒアルロン酸の濃度を濃縮し、所望の、より濃縮された形態のヒアルロン酸を得る。
【０００７】
米国特許第５，０９３，４８７号明細書は溶液の粘度を低減することでより容易にろ過されうる高分子量形態のヒアルロン酸（好ましくは１．２ＭＤａを超える）を含む水溶液の調製方法を記載している。この溶液の粘度の低減は「制御された加熱処理」又は「小孔膜をとおした高圧もしくは真空を用いた最小濃度溶液のろ過」によって可能であると言われている。これらの粘度低減プロセスは、また、長時間にわたってその低粘度を維持するヒアルロン酸形態をもたらし、すなわち、誘導された粘度の低減は非可逆的であるものとして記載されている。特に、１ヶ月の処理期間にわたり、種々の加熱温度（３０℃、４０℃及び５０℃）で、１．１ＭＤａの初期重量平均分子量を有するヒアルロン酸の１ｗｔ％溶液を加熱処理することが記載されている。各ヒアルロン酸溶液で、重量平均分子量が低下していないことが報告されている。‘４８７号特許は、また、ヒアルロン酸の加熱処理された溶液が無菌化に要求される０．２２ミクロン孔サイズのフィルタをとおしてろ過されうることも報告している。
【０００８】
Blumbergらは、Changes in Physical Characteristics of Hyaluronate, pp.1454-61において、塩化ナトリウム濃度の関数としてのヒアルロン酸溶液の物性変化について報告している。粘度に関し、溶液のイオン強度の増加は粘度の低下をもたらす。粘度の低下は比較的に少量の塩を添加したときに観測される。「約０．５Ｍ[ＮａＣｌ]の後に、［粘度の］低下は緩やかになり、１．３Ｍの後には、さらに多量の塩を添加しても非常に少ししか変化はない。」、同文献1459頁。換言すると、粘度は生理食塩水のイオン強度よりもわずかに低いナトリウムイオン濃度の変化に非常に敏感であり、そして「約０．１５のナトリウムイオン強度よりも上では、ヒアルロン酸塩は比較的に鈍感である。」、同文献1459頁。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記のことに基づいて、バイオポリマーの水溶液、特に、ヒアルロン酸の水溶液の無菌化は全く型にはまったものでなく、そして実質的に分解されていない無菌溶液を得るために多くの技術的挑戦があることが判る。もし商業規模製造バッチを目的とするならば、この技術的挑戦は大きくなる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の要旨
本発明はヒアルロン酸を含む溶液の無菌化方法に関する。その方法は重量平均分子量が０．６ＭＤａ〜３．６ＭＤａであるヒアルロン酸の水溶液であって、該ヒアルロン酸の濃度が０．０４質量％〜０．８質量％である水溶液を提供することを含む。その水溶液は、また、イオン強度が３質量％〜３０質量％の塩化ナトリウムの水性濃度と等価である。一旦、高塩濃度ヒアルロン酸水溶液を調製したら、その溶液を、少なくとも１時間で６日間以下の間、４０℃〜８０℃の温度に維持する。その加熱処理工程に次いで、水溶液を除菌フィルタ媒体をとおしてろ過し、除菌された高塩濃度ヒアルロン酸溶液を提供する。
【００１１】
１つの実施形態において、その方法は重量平均分子量が０．８ＭＤａ〜２．２ＭＤａであるヒアルロン酸の水溶液であって、該ヒアルロン酸の濃度が０．１質量％〜０．５質量％である水溶液を提供することを含む。その水溶液は、また、イオン強度が４質量％〜１８質量％の塩化ナトリウムの水性濃度と等価である。一旦、高塩濃度ヒアルロン酸水溶液を調製したら、その溶液を、少なくとも１時間で１８時間以下の間、５０℃〜７５℃の温度に維持する。その加熱処理工程に次いで、水溶液を上記のとおりの除菌フィルタ媒体をとおしてろ過する。
【００１２】
本発明は、また、重量平均分子量が０．６ＭＤａ〜３．６ＭＤａであるヒアルロン酸を０．０４質量％〜０．８質量％の量で含む水溶液に関する。そのヒアルロン酸水溶液は、また、４質量％〜１８質量％の塩化ナトリウム、塩化カリウム又はそれらの混合物を含み、そして溶液はフィルタ除菌されている。
【００１３】
本発明は、また、溶液１リットル中のヒアルロン酸１ｇ毎に塩化ナトリウム約２５ｇ〜６０ｇと等価のイオン強度を含む、高塩濃度ヒアルロン酸水溶液に関する。溶液中のヒアルロン酸の濃度は０．０５質量％〜０．４質量％である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
図面の簡単な説明
【図１】図１は示した種々のプロセス条件で約７４０ｋｇのヒアルロン酸水溶液を処理するために要求される１０インチフィルタカートリッジの推定数を示す棒グラフである。
【図２】図２は水溶液中のランダムコイルヒアルロン酸の模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
発明の詳細な説明
「無菌」組成物はＵＳＰ無菌性試験を用いて決定されるとおりの生菌なしの組成物である。The United States Pharmacopeia, 30th Revision, The United States Pharmacopeial Convention:2008を参照されたい。
【００１６】
用語「ヒアルロン酸」とはヒアルロナンの繰り返し二糖副単位を含むポリマーを指す。その用語は、また、二糖副単位が１つ以上の位置でＤ−グルクロン酸及び／又はＤ−Ｎ−アセチルグルコサミン繰り返し副単位から誘導化されていてよいポリマーを含む。したがって、用語ヒアルロン酸は、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の誘導体及び塩形態（ヒアルロネートとも呼び、たとえば、ナトリウムヒアルロネート（ヒアルロン酸ナトリウム））を包含する。
【００１７】
ヒアルロン酸はβ（１−３）及びβ（１−４）グリコシド結合により結合しているＤ−グルクロン酸とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとからなる繰り返し二糖単位から形成された直鎖多糖類（長鎖生体ポリマー）である。ヒアルロン酸はタンパク及びスルホン基に対する共有結合がないので、他のグルコサミノグリカンとは区別される。ヒアルロン酸は動物中の至る処にあり、最も高濃度のものは軟結合組織に見られる。それは体内で機械目的及び輸送目的の両方で重要な役割を果たし、たとえば、それは関節に弾性を付与しそして椎間板に剛性を付与し、そしてそれは、また、目の硝子体の重要な成分である。
【００１８】
ヒアルロン酸は生体組織又は細胞を圧縮力から保護することができる化合物として眼科団体により良好に受け入れられている。したがって、ヒアルロン酸は白内障手術のための粘弾性眼科組成物の成分として提案されている。小さなせん断力下であまり粘性でないが、静的条件下で硬質弾性であるヒアルロン酸の粘弾性特性により、ヒアルロン酸が細胞及び組織のための衝撃吸収材として基本的に機能することが可能になる。ヒアルロン酸は、また、水を吸収しそして保持する能力が比較的大きい。記載したヒアルロン酸の特性は、分子量、溶液濃度及び生理的ｐＨに依存する。低濃度では、溶液中で個々の鎖が絡み合いそして連続したネットワークを形成し、それにより、系に興味深い特性、たとえば、顕著な粘弾性及び低濃度の水溶性ポリマーに特有の擬塑性を付与する。
【００１９】
ヒアルロン酸溶液は熱及び酸加水分解に感受性であることが知られており、そのため、重量平均分子量は、通常、溶液が多糖結合の加水分解を促進する条件に付したならば、時間の経過とともに低減するであろう。ヒアルロン酸の水溶液の場合には、８０℃を超える長時間の加熱、たとえば、加熱滅菌するのに使用する条件は適さず、ヒアルロン酸の重量平均分子量の実質的な低下が観測される。また、比較的高い重量平均分子量のヒアルロン酸を含むヒアルロン酸水溶液を除菌するために０．２２ミクロンの孔サイズのフィルタの使用は適さない。より小さい分子量画分はフィルタを容易に通過するが、平均分子直径が０．２μｍを超える大きな画分（平均Ｍｗが約０．６ＭＤａ以上）は容易に通過しない。しかしながら、出願人は、重量平均分子量が０．６ＭＤａ〜３．６ＭＤａであるヒアルロン酸の水溶液のフィルタ除菌を容易にする選択処理条件を発見した。
【００２０】
記述される処理条件は、ヒアルロン酸水溶液のろ過効率を改善する。特に、記述される処理条件により、比較的大規模のヒアルロン酸水溶液の製造バッチの無菌化を可能になる。出願人は重量平均分子量が０．６ＭＤａ〜３．６ＭＤａであるヒアルロン酸を含み、該ヒアルロン酸の濃度が０．０４質量％〜０．８質量％である水溶液の無菌ろ過では０．２２ミクロンの孔サイズのフィルタをとおしてろ過することができ、そのため、大規模商業生産バッチで無菌化することができることを示した。記述されるプロセスは、本質的に、溶液の特定の熱処理及び溶液が比較的高いイオン強度を有することに依存する。
【００２１】
一つのプロセス条件は熱処理が関与する。この場合において、ヒアルロン酸水溶液は、少なくとも１時間で６日間以下の間、４０℃〜８０℃の温度に維持される。しかしながら、２４時間を超える期間、この温度範囲の上限に溶液の温度を維持しないように注意しなければならない。さもなければ、ヒアルロン酸の重量平均分子量の有意な低下を観測し始める。長時間にわたって８０℃又はそれを超える温度に維持することで、多糖結合の加水分解又は酸化分解をもたらすことがある。ヒアルロン酸の重量平均分子量の観察される低下を最小限にすることに関する熱処理時間と維持温度との相関関係を考えて、推奨される熱処理を、重量平均分子量が約０．６ＭＤａ〜１．６ＭＤａであるヒアルロン酸について表１に示す。同様に、推奨される熱処理を、重量平均分子量が約１．６ＭＤａ〜３．６ＭＤａであるヒアルロン酸について表２に示す。
【００２２】
【表１】
【００２３】
【表２】
【００２４】
第二のプロセス条件はヒアルロン酸水溶液のイオン強度が関与する。イオン強度値は記載され、記載される塩化ナトリウムの水性濃度に等価であると説明される。出願人は、時折、ヒアルロン酸水溶液のイオン強度の増加をポリマーの「塩収縮ラッピング（salt shrink wrapping）」として参照する。ヒアルロン酸の「塩収縮ラッピング」（salt shrink wrapping）は図２に示す水溶液中のランダムコイルヒアルロン酸の模式図により最も上手く記載される。
【００２５】
したがって、十分な量の１種以上の塩化合物は、ヒアルロン酸と混合され、３ｗｔ％〜３０ｗｔ％、４ｗｔ％〜１８ｗｔ％又は８ｗｔ％〜１４ｗｔ％の塩化ナトリウムの水性濃度と等価であるイオン強度を有する、高塩濃度ヒアルロン酸水溶液を提供する。
【００２６】
理想的には、ヒアルロン酸水溶液のイオン強度を上げるために使用される１種以上の塩は所望の製品製剤中に存在することになる塩である。たとえば、もし、製剤を緩衝作用に付すことが必要であるならば、塩のうちの１種はバッファーの塩成分であることができる。ホウ酸塩で緩衝される製剤の場合には、塩はアルカリホウ酸塩、たとえば、ホウ酸ナトリウムであることができる。同様に、クエン酸塩又はリン酸塩で緩衝される製剤の場合には、塩は、それぞれ、アルカリクエン酸塩、たとえば、クエン酸ナトリウム、又は、アルカリリン酸塩、たとえば、リン酸二ナトリウムであることができる。ヒアルロン酸水溶液のイオン強度を上げるためにいかなる塩バッファー成分を使用してもよいことを当業者は理解するであろう。
【００２７】
眼科調製物を調製する場合にＮａＣｌ又はＫＣｌなどのアルカリ金属塩化物は、通常、調製物のモル浸透圧濃度を調節するために使用される。したがって、ＮａＣｌ、ＫＣｌ又はその２つの塩のある組み合わせはヒアルロン酸水溶液のイオン強度を上げるために使用できる。又は、塩化マグネシウム又は塩化カルシウムなどの第ＩＩ族金属塩を含む他の一般的な塩を使用することができる。
【００２８】
１つの実施形態において、高塩濃度ヒアルロン酸溶液は１リットルの溶液中のヒアルロン酸１ｇ毎に塩化ナトリウム約２５ｇ〜６０ｇに等価のイオン強度を有するであろう。たとえば、０．１ｗｔ％のヒアルロン酸溶液は塩化ナトリウム約２５ｇ〜６０ｇに等価のイオン強度を含むであろう。同様に、０．２ｗｔ％のヒアルロン酸溶液は塩化ナトリウム約５０ｇ〜１２０ｇに等価のイオン強度を含むであろう。０．３ｗｔ％のヒアルロン酸溶液は塩化ナトリウム約７５ｇ〜１８０ｇに等価のイオン強度を含むであろう。
【００２９】
酸の任意添加
溶液のｐＨも０．２２ミクロン孔サイズを有する除菌フィルタ媒体をとおしてヒアルロン酸水溶液を通過させる効率に対して影響があることが観測されている。溶液のｐＨは、また、加熱処理工程において使用される温度でのヒアルロン酸の加水分解の速度に対しても影響を与えることができる。ｐＨを約４．２〜約６．２の値に低減し、好ましくはｐＨを約５．２〜約６．２の値に低減することはヒアルロン酸溶液の除菌ろ過プロセスを促進することもできる。通常、最終製剤製品中に存在するバッファー塩に関連するバッファー酸を添加する。たとえば、製剤に緩衝作用を付す必要があるならば、対応する遊離酸を使用する。ホウ酸塩で緩衝される製剤の場合には、ホウ酸を添加するであろう。同様に、クエン酸塩で緩衝される製剤の場合には、クエン酸を添加するであろう。
【００３０】
しかしながら、もし、約６．４未満のｐＨ値を有するヒアルロン酸水溶液を調製し、その後、記載されるプロセスを用いてフィルタ除菌しようとするならば、トレードオフがある。記載したとおり、ヒアルロン酸の水溶液は加水分解に感受性があり、すなわち、ヒアルロン酸の重量平均分子量の所望しない減少をもたらす多糖結合の加水分解開裂に感受性がある。出願人は加水分解反応が酸の存在により触媒され、そのため、より低いｐＨ値はしばしば加水分解の速度を上げることになるであろうと考えられる。それゆえ、当業者は２つの競争的要因に直面し、そしてヒアルロン酸の選択グレードに対する除菌ろ過プロセスを最適化するプロセス条件を決定しなければならない。溶液のｐＨがより低いと、溶液の粘度が低下することになり、そのため、除菌フィルタをとおしてより速い流速となる。同時に、より低いｐＨ値は加水分解速度の増加及びより低い重量平均分子量のヒアルロン酸をもたらすことができる。
【００３１】
同様に、ヒアルロン酸の加水分解の速度は、比較的に高い塩基性条件、たとえば、少なくとも７．８以上のｐＨ値でも加速される。したがって、高塩濃度ヒアルロン酸溶液を調製するために添加される好ましい塩基は中性塩、たとえば、第Ｉ族又は第ＩＩ族金属クロリドである。記載されるヒアルロン酸の無菌ろ過の好ましいｐＨ範囲は約６．４〜約７．２である。
【００３２】
出願人はヒアルロン酸溶液をろ過するための孔サイズが０．２２ミクロンの２つのタイプの除菌フィルタ媒体：二層ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）媒体及び疎水性ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）媒体を調べた。実験室規模で両方のフィルタ媒体は非常に良好に機能したが、商業プロセス環境では、より大きなＰＶＤＦカートリッジがバッチ毎により一貫した流れを提供した。図１は種々のプロセス条件について、約７４０ｋｇのヒアルロン酸水溶液を処理するのに要求される１０インチフィルタカートリッジの推測数を示す棒グラフである。実際の試験は４７ｍｍフィルタディスクを用いて約２Ｌのヒアルロン酸溶液を用いて行った。これらの試験の変数としては、ヒアルロン酸の濃度、溶液中の塩化ナトリウムの濃度により報告される溶液のイオン強度、使用したフィルタ媒体（ＰＥＳ又はＰＶＤＦ）、及び、溶液中のホウ酸の有無が挙げられる。出願人は、実験運転をとおして可能な限り一貫した重量平均分子量のヒアルロン酸を維持しようと試みたが、試験ロットにおけるヒアルロン酸の重量平均分子量の若干の変動があった。ヒアルロン酸ナトリウムの分子量及び分子量分布をオンライントリプル検知による水性サイズ排除クロマトグラフィーにより決定する。Liu, X.M. らのDetailed Characterization of Cationic Hydroxyethylcellulose Derivatives using Aqueous Size-Exclusion Chromatography with on-line Triple Detection. J. Chromatogr. A. 1104, 2006. 145-153を参照されたい。
【００３３】
当業者によって理解されるとおり、記載される滅菌ろ過プロセスは高塩濃度ヒアルロン酸水溶液の粘度によって制限される。したがって、高塩濃度ヒアルロン酸溶液中のヒアルロン酸の濃度は０．８ｗｔ％未満である。というのは、ヒアルロン酸の濃度のさらなる増加は加熱処理された高塩濃度溶液をろ過するためにでさえ溶液を粘性とするであろうからである。また、より高い濃度のヒアルロン酸をフィルタ除菌するために十分な時間８０℃を超える温度で溶液を加熱することは多糖結合の有意な熱加水分解をもたらす傾向があり、重量平均分子量の有意な減少となり、そして所望の製品製剤に当初求められていた有利な粘弾性特性を失うことになる傾向がある。
【００３４】
多くの実施形態において、高塩濃度ヒアルロン酸溶液中のヒアルロン酸の濃度は０．０４ｗｔ％〜０．８ｗｔ％であり、又は、０．１ｗｔ％〜０．４ｗｔ％であり、たとえば、約０．２ｗｔ％、約０．３ｗｔ％、約０．４ｗｔ％又は約０．５ｗｔ％である。
【実施例】
【００３５】
例１：図１。０．５ｗｔ％ヒアルロン酸（ＨＡ）を、１０．０ｇのＨＡ及び２５０ｇのＮａＣｌ（１２．５ｗｔ％）のドライブレンドした混合物を、ステンレス容器内で約７０℃に維持した１７４０．０ｇの精製水に攪拌しながらゆっくりと添加することにより調製した。ＨＡは報告された重量平均分子量が約１．８ＭＤａであった。ＨＡは約２０分後に完全に溶解した外観を有した。溶液を室温に冷却させ、そして２つのプラスチックボトルに貯蔵した。溶液はコーン／プレート粘度が１ｒｐｍで３０４ｃＰ、１７ｒｐｍで１１１ｃＰであった。
【００３６】
溶液Ａ［比較例Ａ］ ０．５ｗｔ％ヒアルロン酸（ＨＡ）を、１０．０ｇのＨＡを、ステンレス容器内で約７０℃に維持した１９９０．０ｇの精製水に攪拌しながらゆっくりと添加することにより調製した。ＨＡは約４７分後に完全に溶解した外観を有した。溶液を室温に冷却させ、そして２つのプラスチックボトルに貯蔵した。溶液のコーン／プレート粘度が１ｒｐｍで１３４３ｃＰ、１７ｒｐｍで１９２．２ｃＰであった。
【００３７】
溶液Ｂ［比較例Ｂ］ １．０ｗｔ％ヒアルロン酸（ＨＡ）を、２０．０ｇのＨＡを、ステンレス容器内で約７０℃に維持した１９８０．０ｇの精製水に攪拌しながらゆっくりと添加することにより調製した。ＨＡは約７５分後に完全に溶解した外観を有した。溶液を室温に冷却させ、そして２つのプラスチックボトルに貯蔵した。溶液の見掛の高粘度のために、粘度測定は得られなかった。
【００３８】
溶液Ｃ［比較例Ｃ］ ３．０ｗｔ％ヒアルロン酸（ＨＡ）を、１５．０ｇのＨＡを、ステンレス容器内で約７０℃に維持した４８５．０ｇの精製水に攪拌しながらゆっくりと添加することにより調製した。ＨＡは約１５０分後に完全に溶解した外観を有した。生成物は非常に粘性の注ぐことができないゲルを形成し、実際に攪拌シャフト上に登り始めた。粘度測定は得られなかった。
【００３９】
１つの実施形態において、記載される除菌ろ過プロセスは、０．２２ミクロンの孔サイズのＰＥＳ又はＰＶＤＦフィルタカートリッジについて下記のプロセス条件及び溶液条件を含む。重量平均分子量が約０．７ＭＤａ〜約１．７ＭＤａであるヒアルロン酸は微細乾燥粉末として市販入手される。適量の乾燥ヒアルロン酸を適量の塩化ナトリウムとともにドライブレンディング容器に添加する。２つの粉末は塩化ナトリウム中でヒアルロン酸を有効に希釈してドライブレンドされる。一方、精製水を混合タンクに添加し、水の温度を４０℃〜８０℃に加熱しそして維持する。ドライブレンドされたヒアルロン酸／ＮａＣｌを精製水にゆっくりと添加し、そしてヒアルロン酸が完全に溶液中となる（すなわち、溶解された）ような外観となるまで溶液を攪拌する。高塩濃度ヒアルロン酸溶液を、その後、４０℃〜８０℃の温度で少なくとも１時間で６日間以下の間加熱処理する。また、維持温度が高いほど、加熱処理の時間が短いことが理解される。加熱処理に次いで、もし、もちろん、維持温度が５５℃を超えているならば、高塩濃度ヒアルロン酸溶液を好ましくは約４５℃〜５５℃に冷却する。
多くの実施形態において、ヒアルロン酸は重量平均分子量が０．６ＭＤａ〜３．６ＭＤａ、０．８ＭＤａ〜２．２ＭＤａ、０．８ＭＤａ〜１．６ＭＤａ又は１．１ＭＤａ〜１．４ＭＤａであろう。
【００４０】
例２：図１。０．２５ｗｔ％ヒアルロン酸（ＨＡ）を、１０．０ｇのＨＡ及び５００ｇのＮａＣｌ（１２．５ｗｔ％）のドライブレンドした混合物を、ステンレス容器内で約７８℃に維持した３４９０．０ｇの精製水に攪拌しながらゆっくりと添加することにより調製した。ＨＡは報告された重量平均分子量が約１．８ＭＤａであった。溶液を室温に冷却させた。溶液はコーン／プレート粘度が３０ｒｐｍで１６．３ｃＰであった。
【００４１】
例３：図１。０．１２５ｗｔ％ヒアルロン酸（ＨＡ）を、５．０ｇのＨＡ及び２５０ｇのＮａＣｌ（６．２５ｗｔ％）のドライブレンドした混合物を、ステンレス容器内で約７３℃に維持した３７４５．０ｇの精製水に攪拌しながらゆっくりと添加することにより調製した。ＨＡは報告された重量平均分子量が約１．４ＭＤａであった。ＨＡは約７５分後に完全に溶解した外観を有した。溶液を室温に冷却させた。溶液はコーン／プレート粘度が６０ｒｐｍで６．４ｃＰであった。
【００４２】
例４：図１。０．１２５ｗｔ％ヒアルロン酸（ＨＡ）を、５．０ｇのＨＡ及び２５０ｇのＮａＣｌ（６．２５ｗｔ％）のドライブレンドした混合物を、ステンレス容器内で１６０ｇのホウ酸（４ｗｔ％）を含む約７６℃に維持した３４８５．０ｇの精製水に攪拌しながらゆっくりと添加することにより調製した。ＨＡは報告された重量平均分子量が約１．４ＭＤａであった。溶液を室温に冷却させた。溶液はコーン／プレート粘度が６０ｒｐｍで３．５ｃＰであった。
【００４３】
図１に報告したデータから示唆されるとおり、４ｗｔ％のホウ酸を含む例４の溶液は、ホウ酸を含まない同等の溶液、すなわち、例３の溶液よりも、ＰＶＤＦフィルタディスクをとおして２倍近く効率がよい。さらに、例４の溶液は例３の溶液よりも、ＰＥＳフィルタディスクをとおして５倍効率がよい。
【００４４】
例５：図１。０．２５ｗｔ％ヒアルロン酸（ＨＡ）を、５．０ｇのＨＡ及び２５０ｇのＮａＣｌ（１２．５ｗｔ％）のドライブレンドした混合物を、ステンレス容器内で約７５℃に維持した１７４５．０ｇの精製水に攪拌しながらゆっくりと添加することにより調製した。ＨＡは報告された重量平均分子量が約０．８ＭＤａであった。ＨＡは約３０分後に完全に溶解した外観を有した。溶液を室温に冷却させた。溶液はコーン／プレート粘度が６０ｒｐｍで８．３ｃＰであった。
【００４５】
例６：図１。０．２５ｗｔ％ヒアルロン酸（ＨＡ）を、４．０ｇのＨＡ及び２００ｇのＮａＣｌ（１２．５ｗｔ％）のドライブレンドした混合物を、ステンレス容器内で約７３℃に維持した１３９６．０ｇの精製水に攪拌しながらゆっくりと添加することにより調製した。ＨＡは報告された重量平均分子量が約０．７ＭＤａであった。ＨＡは約３０分後に完全に溶解した外観を有した。溶液を室温に冷却させた。溶液はコーン／プレート粘度が６０ｒｐｍで８．７ｃＰであった。
【００４６】
分子量に対する維持温度の効果
例７Ａ．０．２６ｗｔ％のヒアルロン酸及び１３ｗｔ％のＮａＣｌを含む高塩濃度ヒアルロン酸溶液を、例２に記載されるとおりに調製した。５．２ｇのＨＡ及び２６０ｇのＮａＣｌのドライブレンドされた混合物を、ステンレス容器内で６９℃に維持した１７３４．８ｇの熱蒸留水に攪拌しながらゆっくりと添加した。ＨＡは約１０５分後に完全に溶解した外観を有し、その時点で、温度は６６℃であった。溶液を約１０分で約４０℃に冷却し、そして約４０℃に維持した。サンプルを０時間、１時間、２時間、３時間、４時間及び１８時間で抜き取り、その間、溶液の温度は３８℃（１８時間）〜４４℃（４時間）で変化した。水性ＧＰＣトリプル検知システムを用いて、各サンプルの重量平均分子量を決定した。また、コーン／プレート粘度決定を各サンプルで１２ｒｐｍにて行った。ＧＰＣ分子量データ及び粘度データの両方を表３に示す。
【００４７】
【表３】
【００４８】
例７Ｂ．０．２６ｗｔ％のヒアルロン酸及び１３ｗｔ％のＮａＣｌを含む高塩濃度ヒアルロン酸溶液を、例２に記載されるとおりに調製した。５．２ｇのＨＡ及び２６０ｇのＮａＣｌのドライブレンドされた混合物を、ステンレス容器内で６７℃に維持した１７３４．８ｇの熱蒸留水に攪拌しながらゆっくりと添加した。ＨＡは約１１５分後に完全に溶解した外観を有し、その時点で、温度は６９℃であった。溶液を約１０分で約５０℃に冷却し、そして約５０℃に維持した。サンプルを０時間、１時間、２時間、３時間、４時間及び１８時間で抜き取り、その間、溶液の温度は４６℃（１８時間）〜５４℃（３時間）で変化した。水性ＧＰＣトリプル検知システム（Integrated PL-GPC50、2x Waters Ultrahydrogel Linear, 7.8x300 mm）を用いて、各サンプルの重量平均分子量を決定した。また、コーン／プレート粘度決定を各サンプルで１２ｒｐｍにて行った。ＧＰＣ分子量データ及び粘度データの両方を表４に示す。
【００４９】
【表４】
【００５０】
例７Ｃ．０．２６ｗｔ％のヒアルロン酸及び１３ｗｔ％のＮａＣｌを含む高塩濃度ヒアルロン酸溶液を、例２に記載されるとおりに調製した。５．２ｇのＨＡ及び２６０ｇのＮａＣｌのドライブレンドされた混合物を、ステンレス容器内で７０℃に維持した１７３４．８ｇの熱蒸留水に攪拌しながらゆっくりと添加した。ＨＡは約１２５分後に完全に溶解した外観を有し、その時点で、温度は６７℃であった。溶液を約５分で約６１℃に冷却し、そして約６０℃に維持した。サンプルを０時間、１時間、２時間、３時間、４時間及び１８時間で抜き取り、その間、溶液の温度は５６℃（１８時間）〜６１℃（０時間）で変化した。水性ＧＰＣトリプル検知システムを用いて、各サンプルの重量平均分子量を決定した。また、コーン／プレート粘度決定を各サンプルで３０ｒｐｍにて行った。ＧＰＣ分子量データ及び粘度データの両方を表５に示す。
【００５１】
【表５】
【００５２】
例８Ａ〜８Ｃ
第二のロットのヒアルロン酸を用い、そして維持温度が約５０℃（８Ａ）、５５℃（８Ｂ）及び６０℃（８Ｃ）であったことを除いては例７を繰り返した。分子量決定を表６に示す。
【００５３】
【表６】
【００５４】
例９
０．２６ｗｔ％のヒアルロン酸及び１３ｗｔ％のＮａＣｌを含む高塩濃度ヒアルロン酸溶液を調製した。５．２ｇのＨＡ及び２６０ｇのＮａＣｌのドライブレンドされた混合物を、ステンレス容器内で約６６℃に維持した１７３４．８ｇの熱蒸留水に攪拌しながら５分間にわたってゆっくりと添加した。ＨＡは約１０７分後に完全に溶解した外観を有し、その時点で、温度は約７０℃であった。溶液を約５分で約５０℃に冷却し、そして約５０℃に維持した。Ｖｍａｘ４７ｍｍディスクフィルタ（STW 0.2 Everlux（商標）0.45/0.22ミクロン）を、５０℃の水で５分間、プレフラッシュした。加熱処理された高塩濃度ヒアルロン酸溶液を２７ｐｓｉでフィルタをとおしてろ過した。ミリポア変換プログラムを用いて、ディスクろ過は７７７Ｌの溶液体積に対して約２．７個の１０−インチフィルタカートリッジを要求する。
【００５５】
例１０
ＨＡ及びＮａＣｌ濃度を２５％低減したことを除いては例９と同様の実験であった。０．１９５ｗｔ％のヒアルロン酸及び９．７５ｗｔ％のＮａＣｌを含む高塩濃度ヒアルロン酸溶液を調製した。３．９ｇのＨＡ及び１９５ｇのＮａＣｌのドライブレンドされた混合物を、ステンレス容器内で約６９℃に維持した１８０１．１ｇの熱蒸留水に攪拌しながら５分間にわたってゆっくりと添加した。ＨＡは約１００分後に完全に溶解した外観を有し、その時点で、温度は約６９℃であった。溶液を約７分で約５１℃に冷却し、そして約５１℃に維持した。Ｖｍａｘ４７ｍｍディスクフィルタ（STW 0.2 Everlux（商標）0.45/0.22ミクロン）を、５０℃の水で５分間、プレフラッシュした。加熱処理された高塩濃度ヒアルロン酸溶液を２７ｐｓｉでフィルタをとおしてろ過した。ミリポア変換プログラムを用いて、ディスクろ過は７７７Ｌの溶液体積に対して約２．６個の１０−インチフィルタカートリッジを要求する。
【００５６】
例１１
ＨＡ及びＮａＣｌ濃度を５０％低減したことを除いては例９と同様の実験であった。０．１３ｗｔ％のヒアルロン酸及び６．５ｗｔ％のＮａＣｌを含む高塩濃度ヒアルロン酸溶液を調製した。２．６ｇのＨＡ及び１３０ｇのＮａＣｌのドライブレンドされた混合物を、ステンレス容器内で約６８℃に維持した１８６７．４ｇの熱蒸留水に攪拌しながら５分間にわたってゆっくりと添加した。ＨＡは約９７分後に完全に溶解した外観を有し、その時点で、温度は約６９℃であった。溶液を約８分で約４９℃に冷却し、そして約４９℃に維持した。Ｖｍａｘ４７ｍｍディスクフィルタ（STW 0.2 Everlux（商標）0.45/0.22ミクロン）を、５０℃の水で５分間、プレフラッシュした。加熱処理された高塩濃度ヒアルロン酸溶液を２７ｐｓｉでフィルタをとおしてろ過した。ミリポア変換プログラムを用いて、ディスクろ過は７７７Ｌの溶液体積に対して約３．０個の１０−インチフィルタカートリッジを要求する。
【００５７】
１つの実施形態において、適切なフィルタ媒体を用いてヒアルロン酸水溶液を無菌化する方法を記載する。その方法は重量平均分子量が０．６ＭＤａ〜３．６ＭＤａであるヒアルロン酸の水溶液を提供することを含む。溶液中のヒアルロン酸の濃度は０．０４質量％〜０．８質量％である。また、ろ過効率を上げるために、水溶液は３質量％〜３０質量％の塩化ナトリウムの水性濃度と等価のイオン強度を有する。塩の存在はヒアルロン酸溶液の溶液粘度を低減する。出願人は、ヒアルロン酸は比較的に高いイオン強度の溶液中でより強固にラッピングされており、バイオポリマーの旋回半径が低減されるものと信じる。高塩濃度ヒアルロン酸溶液は熱処理を受け、それがさらに溶液の粘度を低減する。したがって、高塩濃度ヒアルロン酸溶液を少なくとも１時間で６日以下の間４０℃〜８０℃の温度に維持する。その後、加熱処理された溶液を除菌フィルタ媒体をとおしてろ過する。フィルタ媒体は平均孔サイズが０．２５μｍ以下であり、たとえば、０．２２μｍの孔サイズであり、除菌された高塩濃度ヒアルロン酸溶液を提供する。水の添加時のヒアルロン酸の溶解を促進するために（通常、ヒアルロン酸は微細乾燥粉末として市販されている）、ヒアルロン酸は好ましくはＮａＣｌなどの塩とドライブレンドされている。ドライブレンドされた塩／ヒアルロン酸混合物を、その後、適量の精製水中に攪拌しながらゆっくりと添加する。
【００５８】
１つの実施形態において、高塩濃度ヒアルロン酸溶液の加熱処理は４０℃〜７０℃の温度に溶液を維持することを含むが、一般に、溶液を５０℃〜７０℃の温度に１時間〜１２時間維持することを含む。また、維持温度が高いほど、短い維持時間が要求される。たとえば、高塩濃度ヒアルロン酸水溶液が５５℃〜６５℃の温度に維持されるならば、このような加熱処理下に少なくとも１時間で１２時間以下の維持時間が推奨される。
【００５９】
除菌された高塩濃度ヒアルロン酸溶液は好ましくはヒアルロン酸の濃度が０．１５質量％〜０．６質量％であり、好ましくは４質量％〜１６質量％の塩化ナトリウムの水性濃度と等価のイオン強度を有する。
【００６０】
記載したとおり、ｐＨはヒアルロン酸ポリマーの加水分解の速度に役割を果たすことができ、加水分解は酸又は塩基の存在下で触媒されるものと信じられる。したがって、高塩濃度ヒアルロン酸溶液は、バイオポリマーの加水分解開裂、それによる時間経過に伴うヒアルロン酸の重量平均分子量の低下を制限するために、ｐＨ６．４〜７．２で最も良好に調製される。
【００６１】
ある実施形態において、加熱処理されたフィルタ除菌された高塩濃度ヒアルロン酸溶液を、眼科用途に使用するものを含めた医薬製剤を調製するために、また、骨関節炎の治療において使用する。したがって、無菌ろ過された高塩濃度ヒアルロン酸溶液を、ホウ酸及びホウ酸ナトリウムなどのバッファー成分を含む他の医薬製剤成分を含む事前無菌化された水溶液と混合することができる。眼科製剤の場合には、ｐＨは６．４〜７．２に調節される。水性製剤を商業処理の少なくとも２つの別個の部分又は相に分けることにより、フィルタ除菌を要求する製剤の体積は有意に低減される。多くの場合には、無菌化された高塩濃度ヒアルロン酸溶液は、医薬製剤中で所望のヒアルロン酸の濃度を提供するように少なくとも１０倍で希釈されうる。そのため、製剤の１／１０未満の量がフィルタ除菌を必要とする。別の場合には、無菌化された高塩濃度ヒアルロン酸溶液を少なくとも５倍に希釈することができる。医薬製剤中の残りの成分により、製剤の過半の体積部分は加熱滅菌、たとえば、オートクレーブ処理されてよく、又は、この部分はフィルタ除菌されてもよい（もちろん、製剤の過半体積は高効率でろ過されうるものと仮定する）。
【００６２】
伝統的に、除菌フィルタ媒体は、１０7コロニー形成単位（CFU）/ｃｍ２の最小濃度の試験生物ブレバンディ・ジミヌタ（Brevundimonas diminuta）（B. diminuta）で攻撃したときに、無菌エフルエントを生じるものである。フィルタ媒体は所与の高塩濃度ヒアルロン酸溶液のろ過流速（リットル／分）に役割を果たす。多くのフィルタ媒体は除菌フィルタに使用するのに利用可能である。そのフィルタ媒体としては、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）及びポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）が挙げられる。フィルタ膜は、その後、カートリッジ中に組み込まれる。たとえばデュラポア（Durapore）（登録商標）疎水性膜カートリッジは最小差圧で無菌保証、高流速及び高スループットを提供する除菌グレードのフィルタである。そのカートリッジは小体積装置及び大体積装置の液体ろ過に使用される。デュラポア（Durapore）（登録商標）０．２２μm疎水性ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜は、除菌用途において汚染物質及び微生物を確実に排除する。支持フィルタ構造（たとえば、ケージ、コア、エンドキャップ及びアダプタ）の構成材料は、通常、ポリプロピレン又はポリスルホンである。
【００６３】
別の実施形態において、ヒアルロン酸を含む溶液の無菌化方法は高塩濃度ヒアルロン酸水溶液を調製することを含む。ヒアルロン酸は重量平均分子量が０．６ＭＤａ〜２．２ＭＤａであり、そしてヒアルロン酸の濃度が０．０８質量％〜０．５質量％である。ヒアルロン酸溶液は４％〜１８％の塩化ナトリウムの水性濃度に等価のイオン強度を有する。溶液の比較的高いイオン強度は、1種以上のイオン性塩、たとえば、塩化ナトリウム又はホウ酸ナトリウムを添加することによって提供される。高塩濃度ヒアルロン酸溶液を、少なくとも1時間で１８時間以下の間、５０℃〜７５℃の温度で加熱処理に付す。加熱処理された溶液を、その後、上記のとおりの除菌フィルタ媒体をとおしてろ過する。また、水中でのヒアルロン酸の溶解を促進するために、ヒアルロン酸は、好ましくは、塩、たとえば、ＮａＣlとドライブレンドされる。ドライブレンドされた塩／ヒアルロン酸混合物を、その後、ゆっくりと攪拌しながら水に添加する。
【００６４】
別の実施形態において、高塩濃度ヒアルロン酸溶液は０．１質量％〜０．４質量％のヒアルロン酸及び８質量％〜１６質量％の塩化ナトリウムを含む。その後、溶液を記載されたとおりに加熱処理に付す。また、維持温度が高いほど、短い維持時間が必要とされる。たとえば、高塩濃度ヒアルロン酸水溶液を５５℃〜６５℃の温度に維持するならば、少なくとも２時間で８時間以下の維持時間が推奨される。
【００６５】
ヒアルロン酸を含む水溶液のために記載されるフィルタ除菌プロセスは、重量平均分子量が０．６ＭＤａ〜３．６ＭＤａであるヒアルロン酸を０．０４質量％〜０．８質量％の量で含む無菌化された水溶液を調製するために使用されうる。その水溶液は塩化ナトリウム４質量％〜１８質量％の水性濃度に等価のイオン強度を有し、そして溶液はフィルタ除菌されている。
【００６６】
１つの実施形態において、フィルタ除菌された高塩濃度ヒアルロン酸溶液は１リットルの溶液中のヒアルロン酸１ｇ毎に塩化ナトリウム約２５ｇ〜６０ｇに等価のイオン強度を有するであろう。たとえば、０．１ｗｔ％のヒアルロン酸溶液は塩化ナトリウム約２５ｇ〜６０ｇに等価のイオン強度を含むであろう。同様に、０．２ｗｔ％のヒアルロン酸溶液は塩化ナトリウム約５０ｇ〜１２０ｇに等価のイオン強度を含むであろう。０．３ｗｔ％のヒアルロン酸溶液は塩化ナトリウム約７５ｇ〜１８０ｇに等価のイオン強度を含むであろう。
【００６７】
別の実施形態において、記載される無菌ろ過方法は商業規模製造バッチ量のコンタクトレンズケア溶液を調製するために使用されうる。その方法は、最終製剤がコンタクトレンズケア溶液に適した成分をも含んでいることを除いて上述したものと同様であろう。ヒアルロン酸に関してこれらの成分の幾つかは無菌ろ過により適するが、他の成分は加熱滅菌できそうである。５，０００Ｌ〜４０，０００Ｌの最終総溶液体積の製造バッチを調製することができる。
【００６８】
また、高塩濃度ヒアルロン酸水溶液を調製することから始めることができる。ヒアルロン酸は重量平均分子量が０．６ＭＤａ〜３．６ＭＤａであり、そしてヒアルロン酸の濃度が０．０４質量％〜０．８質量％であろう。ヒアルロン酸溶液は３％〜３０％の塩化ナトリウムの水性濃度に等価のイオン強度を有するであろう。溶液の比較的高いイオン強度は、1種以上のイオン性塩、たとえば、塩化ナトリウム又はホウ酸ナトリウムを添加することによって提供される。高塩濃度ヒアルロン酸溶液を、５５℃〜７５℃の温度で少なくとも1時間で１２時間以下の間、加熱処理する。加熱処理された溶液を、その後、上記のとおりの除菌フィルタ媒体をとおしてろ過する。
【００６９】
除菌された高塩濃度ヒアルロン酸溶液を、その後、バッファー成分、１種以上の界面活性剤、１種以上のキレート化剤及び１種以上の抗菌性成分などのコンタクトレンズケア溶液の残りの成分のほとんど又はすべてを含むことができる第二の水溶液と混合する。また、２つの水溶液を混合することにより、除菌された高塩濃度ヒアルロン酸溶液は少なくとも５倍又は、ある場合には、少なくとも１０倍に希釈される。
【００７０】
記載したとおり、レンズケア溶液は第四級アンモニウム化合物（小分子を含む）及びポリマーならびに低分子量及び高分子量ビグアニドから選ばれる1種以上の抗菌性成分をも含むであろう。たとえば、ビグアニドとしては、アレキシジン、クロルヘキシジン、ヘキサメチレンビグアニド及びそれらのポリマーの遊離塩基又は塩ならびにこれらの組み合わせが挙げられる。好ましい実施形態において、レンズケア溶液としては、ポリ（ヘキサメチレンビグアニド）（ＰＨＭＢ又はＰＡＰＢ）として知られているポリマービグアニドが挙げられ、それはCosmocil（商標）CQでZeneca, Wilmington, DEから市販されている。 ＰＨＭＢはレンズケア溶液中に０．２ｐｐｍ〜５ｐｐｍ又は０．５ｐｐｍ〜２ｐｐｍで存在する。
【００７１】
より一般的な第四級アンモニウム化合物の一つは、α-[４−トリス（２−ヒドロキシエチル）−アンモニウムクロリド−２−ブテニル]ポリ［１−ジメチルアンモニウムクロリド−２−ブテニル]−ω−トリス（２−ヒドロキシエチル）アンモニウムクロリドであり、それはポリクオタニウム-1とも当該技術分野において呼ばれている。第四級アンモニウム化合物は、一般に、「ポリクオタニウム」消毒剤と当該技術分野で呼ばれており、ポリクオタニウム-1、ポリクオタニウム-10又はポリクオタニウム-42などの指定に従う特定の番号で識別される。ポリクオタニウム-1は０．５ｐｐｍ〜３ｐｐｍでレンズケア溶液中に存在する。興味深いことに、溶液中のポリクオタニウム-1の濃度を３ｐｐｍを超える濃度に増加しようとすると、沈殿物が形成することになる。沈殿物はヒアルロン酸とポリクオタニウム-1の錯体生成物であると信じられる。
【００７２】
２つの抗菌性成分のより好ましい組み合わせの一つとしては、０．５ｐｐｍ〜１．５ｐｐｍの濃度のＰＨＭＢと０．５ｐｐｍ〜１．５ｐｐｍの濃度のポリクオタニウム-1との混合物が挙げられる。このような製剤中で、ヒアルロン酸は、０．００２ｗｔ％〜０．０４ｗｔ％で存在する。
【００７３】
コンタクトレンズケア溶液は、０．０１ｗｔ％〜１ｗｔ％の一般式Ｉの両性界面活性剤を含むことができる。一般式Ｉの特定のスルホベタインは他のものよりも好ましい。たとえば、スルホベタイン3-10（Ｒ１は１０個の炭素を含む直鎖飽和アルキルであり、Ｒ２及びＲ３はそれぞれメチルであり、Ｒ４は−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−（３個の炭素）である）である。眼科組成物において使用することができる他のベタインとしては、対応するスルホベタイン3-08（Ｒ１は８個の炭素を含む直鎖飽和アルキルである）、スルホベタイン3−12（Ｒ１は１２個の炭素を含む直鎖飽和アルキルである）、スルホベタイン3−14（Ｒ１は１４個の炭素を含む直鎖飽和アルキルである）及びスルホベタイン3−16（Ｒ１は１６個の炭素を含む直鎖飽和アルキルである）が挙げられる。したがって、より好ましい特定の眼科組成物としては、一般式Ｉ（Ｒ１はＣ８〜Ｃ１６アルキルであり、Ｒ２及びＲ３はメチルであり、そしてＲ４は−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−である）のスルホベタインが挙げられる。
【００７４】
【化１】
【００７５】
コンタクトレンズケア溶液中に含まれることができる他の成分は２００８年９月３日に出願された同時係属出願の米国特許出願第１２／２０３，３８４号に記載されている。
【００７６】
１つの実施形態において、一般式Ｉのスルホベタイン、ＰＨＭＢ及びポリクオタニウム−1の水溶液を調製し、高塩濃度ヒアルロン酸溶液を処理するために使用されるフィルタ媒体と同様の除菌フィルタをとおして通過させる。その後、各フィルタ除菌された溶液を共通の混合タンクに添加する。
【００７７】
例１２
コンタクトレンズの多目的洗浄及び消毒液の商業規模の製造バッチを、4つの別個の相（水溶液）として用意し、主要混合タンクにおいて混合する。
相Ｉ．
攪拌機を装備した適切なサイズの３１６ステンレススチールのジャケット付き圧力容器に、最大攪拌を達成するために十分な精製水を添加する。相Ｉの水の体積は総バッチ体積の約６０〜９６％とすべきである。水を７０℃以上の水温とし及び／又はその温度に維持するための水を加熱する。攪拌を開始し、バッチの全体の処理にわたって攪拌を維持する。記載の順序で、以下のバッチ量でエデト酸二ナトリウム、ホウ酸、ホウ酸ナトリウム及びポロキサミン１１０７を添加しそして溶解させる。ポロキサミン１１０７の完全な溶解を確保するために、２０分以上、溶液を混合する。溶液サンプルを抜き出し、そしてｐＨを決定する。必要ならば、1N NaOH又は1N HClによりｐＨを７．３〜７．７に調整する。プロセス及び文書化要件について、加圧下でのスチームによる溶液滅菌の一般手順を参照し、確証サイクルを用いて、反応器をシールし、相Ｉ溶液を１２１℃〜１２４℃で３０〜４５分間、加熱滅菌する。滅菌時間の完了時に、相Ｉ溶液を４０℃未満に冷却する。
【００７８】
相II．
相IIは、精製水、０．２６ｗｔ％ヒアルロン酸及び１３ｗｔ％塩化ナトリウムの水性混合物である。バッチ量のヒアルロン酸と塩化ナトリウムを混合しそしてドライブレンドする。適量の水を混合しながら、ゆっくりと混合タンクにＮａＣｌ/ヒアルロン酸のドライブレンド混合物を注ぐ。ＮａＣｌ／ヒアルロン酸溶液を６５〜７５℃の温度範囲に維持しながら、ヒアルロン酸が完全に溶解するまで混合する。懸濁したヒアルロン酸を視覚的に検査するために、必要に応じてミキサーを遅くして、溶液を視覚的に検査する。
ヒアルロン酸が完全に溶解したら、溶液を５０〜５５℃に冷却する。無菌化されたミリポアCVGLフィルタをとおしてＮａＣｌ／ヒアルロン酸溶液をろ過し、相Ｉコンパウンディングタンクに入れる。差圧は３０ｐｓｉを超えるべきでない。
【００７９】
相III
攪拌機を備えた適切な圧力容器に、４０℃未満の温度の、合計バッチ質量の０．５０％〜４．９５％の精製水及びバッチ量のスルホベタイン粉末を添加し、０．０５ｗｔ％〜１０．０ｗｔ％の溶液を製造する。溶液を最低で２０分間混合する。無菌０．２２μｍミリポアフィルタ（相IIの輸送に使用されるものとは異なるフィルタアセンブリ）をとおしてスルホベタイン溶液を無菌ろ過し、相Ｉ溶液中に入れる。相Ｉ溶液を１０分以上の時間混合する。
【００８０】
相IV
攪拌機を備えた適切な圧力容器に、合計バッチ質量の０．０７８〜１．９８％の冷たい（４０℃未満）の水及びバッチ量のポリ（ヘキサメチレンビグアニド）及びポリクオタニウム-1を添加し、０．０３〜１．００％溶液を製造する。溶液を最低で１０分間混合する。無菌ミリポア０．２２μｍフィルタをとおしてＰＨＭＢ／ＰＱ−１溶液を無菌ろ過し、相Ｉ溶液中に入れる。
【００８１】
例１３
コンタクトレンズ再湿潤点眼製剤は以下のように調製される。
３．０ｗｔ％のホウ酸ＮＦ、２．１ｗｔ％のＮａＣｌ ＵＳＰ、０．７ｗｔ％のＫＣｌ ＵＳＰ及び０．５ｗｔ％のヒアルロン酸溶液（約０．８ＭＤａの平均分子量）を含む高塩濃度ヒアルロン酸塩水溶液を調製する。ＨＡ及びＮａＣｌのドライブレンドした混合物を攪拌しながらステンレス容器中で約６８℃に維持された熱蒸留水に５分かけてゆっくりと添加する。ＨＡは約１００分後に完全に溶解した外観を有する。約８分で溶液を約５５℃に冷却し、約５５℃に３時間以上維持した。ＫＣｌ及びホウ酸を、冷却後の熱処理済みＨＡ溶液に添加し、そして溶液を１０分間攪拌する。５５℃の温度で、ＰＶＤＦ０．２２μｍフィルタ媒体をとおして溶液を通過させることによって溶液を無菌ろ過する。別個に、１．７５ｗｔ％のホウ酸ナトリウム十水和物、０．０３ｗｔ％の塩化カルシウム無水物ＵＳＰ、０．０３ｗｔ％の塩化マグネシウム六水和物及び０．０２５ｗｔ％の安定化オキシクロリド錯体（purite）を含む第二の無菌化された溶液を調製する。この第二の塩溶液は従来の加熱滅菌処理を用いて無菌化することができる。あるいは、この溶液は、ＨＡ溶液を調製するのに使用されるのと同一のフィルタを用いて除菌ろ過することができる。第二の塩溶液の無菌化の後に、第二の溶液を、加熱処理された高塩濃度ヒアルロネート溶液と、４：１の体積比で混合する。コンタクトレンズ再湿潤点眼製剤として使用することができる最終的眼科製剤を表7に提供する。
【００８２】
【表７】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明はヒアルロン酸を含むフィルタ除菌された水溶液、及び、ヒアルロン酸を含む商用体積の無菌溶液の調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
残念ながら、多くのバイオポリマーは加熱滅菌などの一般的な無菌化手順に対して感受性である。加熱滅菌はしばしばバイオポリマーの物理化学的特性に顕著な変化をもたらすことがあり、それにより、得られる無菌バイオポリマーは使用目的に適さないものとなる。
【０００３】
医療材料に現在使用されている無菌化法としては、たとえば、加熱処理、高圧蒸気滅菌（たとえば、オートクレーブ滅菌）、酸化エチレンガス（ＥＯＧ）滅菌、超臨界二酸化炭素滅菌及び放射線滅菌が挙げられる。たとえば、米国特許第６，８９１，０３５号明細書、米国特許第６，１４９，８６４号明細書、米国特許第５，６２１，０９３号明細書、米国特許第４，２６３，２５３号明細書、ＵＳ２００６／０２９２０３０及びＵＳ２００７／０００９５７８を参照されたい。利用可能な無菌化法は、通常、無菌化しようとする特定のバイオポリマーの堅牢さに関して評価される。たとえば、高圧蒸気滅菌はバイオポリマーが高温及び高圧に耐えることができる範囲でのみバイオポリマーに使用されうる。しかしながら、ヒアルロン酸を含む非常に少数のバイオポリマーしかこのような高温及び高圧に耐えることができない。ＥＯＧ滅菌はそのプロセスがバイオポリマーを熱分解するのを抑制するので有用である可能性がある。しかしながら、組成物中の残存酸化エチレンの存在は問題となることがある。
【０００４】
ヒアルロン酸は非免疫原性物質であり、その粘弾性及び親水性のために、ヒアルロン酸は、たとえば、Balazsの米国特許第４，１４１，９７３号明細書に開示されているとおり、目の硝子体もしくは関節滑液の代替品として、又は、眼科手術における支持媒体（supportive medium）として長年にわたって使用されてきた。関節滑液において、ヒアルロン酸溶液は細胞に保護環境を提供するための滑剤としての役割を果たし、このため、炎症を起こした膝関節の治療に使用されている。Chemedia S.A.のＥＰ−Ａ−０６９８３８８は増粘剤としてヒアルロン酸塩を含む人工涙液としての使用のための眼科調製物を開示している。ヒアルロン酸を含む製品の消費者使用では製造者が消費者製品を無菌化する必要があり、そして開放した複数用量製剤として使用されるならば、製剤製品を保存するための追加の工程を取らなければならない。
【０００５】
ヒアルロン酸は熱滅菌プロセスに非常に感受性があることが知られている１つのバイオポリマーである。ヒアルロン酸の加熱滅菌はヒアルロン酸の加水分解又は酸化を加速し、それにより、バイオポリマーの平均分子量の有意なそしてしばしば有害な低下を生じさせることが知られている。多くの医薬用途では、製剤中のヒアルロン酸の比較的に低分子量の形態は望ましくない。通常、ヒアルロン酸の低分子量形態はヒアルロン酸の高分子量形態の望ましいレオロジー特性を提供しない。上記の加熱滅菌法におけるヒアルロン酸の分解を補うために、所望されるよりも高い分子量を有するヒアルロン酸で開始することが可能である。しかしながら、この調節では、ヒアルロン酸の製品収率はそのバイオポリマーの平均分子量が増加するとともに減少するのでプロセス非効率をもたらすことになる。
【０００６】
ヒアルロン酸を無菌化する別の既知の方法はろ過によるものである。濃縮形態で、通常には、乾燥粉末の形態で精製ヒアルロン酸塩を調製するための工業法において一般的なろ過法が使用されており、ここで、水溶液をフィルタをとおして通過させ、次いで、乾燥させる。このようなろ過法は欧州特許出願ＥＰ８６７４５３及びＷＯ００／４４９２５明細書に記載されている。米国特許出願公開第２００６／００５２３３６号明細書は溶液の粘度を低減するために比較的に低いヒアルロン酸濃度で高分子量ヒアルロン酸をフィルタ除菌する方法を記載している。ろ過工程の次に、真空を課しそして水を除去することにより溶液中のヒアルロン酸の濃度を濃縮し、所望の、より濃縮された形態のヒアルロン酸を得る。
【０００７】
米国特許第５，０９３，４８７号明細書は溶液の粘度を低減することでより容易にろ過されうる高分子量形態のヒアルロン酸（好ましくは１．２ＭＤａを超える）を含む水溶液の調製方法を記載している。この溶液の粘度の低減は「制御された加熱処理」又は「小孔膜をとおした高圧もしくは真空を用いた最小濃度溶液のろ過」によって可能であると言われている。これらの粘度低減プロセスは、また、長時間にわたってその低粘度を維持するヒアルロン酸形態をもたらし、すなわち、誘導された粘度の低減は非可逆的であるものとして記載されている。特に、１ヶ月の処理期間にわたり、種々の加熱温度（３０℃、４０℃及び５０℃）で、１．１ＭＤａの初期重量平均分子量を有するヒアルロン酸の１ｗｔ％溶液を加熱処理することが記載されている。各ヒアルロン酸溶液で、重量平均分子量が低下していないことが報告されている。‘４８７号特許は、また、ヒアルロン酸の加熱処理された溶液が無菌化に要求される０．２２ミクロン孔サイズのフィルタをとおしてろ過されうることも報告している。
【０００８】
Blumbergらは、Changes in Physical Characteristics of Hyaluronate, pp.1454-61において、塩化ナトリウム濃度の関数としてのヒアルロン酸溶液の物性変化について報告している。粘度に関し、溶液のイオン強度の増加は粘度の低下をもたらす。粘度の低下は比較的に少量の塩を添加したときに観測される。「約０．５Ｍ[ＮａＣｌ]の後に、［粘度の］低下は緩やかになり、１．３Ｍの後には、さらに多量の塩を添加しても非常に少ししか変化はない。」、同文献1459頁。換言すると、粘度は生理食塩水のイオン強度よりもわずかに低いナトリウムイオン濃度の変化に非常に敏感であり、そして「約０．１５のナトリウムイオン強度よりも上では、ヒアルロン酸塩は比較的に鈍感である。」、同文献1459頁。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記のことに基づいて、バイオポリマーの水溶液、特に、ヒアルロン酸の水溶液の無菌化は全く型にはまったものでなく、そして実質的に分解されていない無菌溶液を得るために多くの技術的挑戦があることが判る。もし商業規模製造バッチを目的とするならば、この技術的挑戦は大きくなる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の要旨
本発明はヒアルロン酸を含む溶液の無菌化方法に関する。その方法は重量平均分子量が０．６ＭＤａ〜３．６ＭＤａであるヒアルロン酸の水溶液であって、該ヒアルロン酸の濃度が０．０４質量％〜０．８質量％である水溶液を提供することを含む。その水溶液は、また、イオン強度が３質量％〜３０質量％の塩化ナトリウムの水性濃度と等価である。一旦、高塩濃度ヒアルロン酸水溶液を調製したら、その溶液を、少なくとも１時間で６日間以下の間、４０℃〜８０℃の温度に維持する。その加熱処理工程に次いで、水溶液を除菌フィルタ媒体をとおしてろ過し、除菌された高塩濃度ヒアルロン酸溶液を提供する。
【００１１】
１つの実施形態において、その方法は重量平均分子量が０．８ＭＤａ〜２．２ＭＤａであるヒアルロン酸の水溶液であって、該ヒアルロン酸の濃度が０．１質量％〜０．５質量％である水溶液を提供することを含む。その水溶液は、また、イオン強度が４質量％〜１８質量％の塩化ナトリウムの水性濃度と等価である。一旦、高塩濃度ヒアルロン酸水溶液を調製したら、その溶液を、少なくとも１時間で１８時間以下の間、５０℃〜７５℃の温度に維持する。その加熱処理工程に次いで、水溶液を上記のとおりの除菌フィルタ媒体をとおしてろ過する。
【００１２】
本発明は、また、重量平均分子量が０．６ＭＤａ〜３．６ＭＤａであるヒアルロン酸を０．０４質量％〜０．８質量％の量で含む水溶液に関する。そのヒアルロン酸水溶液は、また、４質量％〜１８質量％の塩化ナトリウム、塩化カリウム又はそれらの混合物を含み、そして溶液はフィルタ除菌されている。
【００１３】
本発明は、また、溶液１リットル中のヒアルロン酸１ｇ毎に塩化ナトリウム約２５ｇ〜６０ｇと等価のイオン強度を含む、高塩濃度ヒアルロン酸水溶液に関する。溶液中のヒアルロン酸の濃度は０．０５質量％〜０．４質量％である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
図面の簡単な説明
【図１】図１は示した種々のプロセス条件で約７４０ｋｇのヒアルロン酸水溶液を処理するために要求される１０インチフィルタカートリッジの推定数を示す棒グラフである。
【図２】図２は水溶液中のランダムコイルヒアルロン酸の模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
発明の詳細な説明
「無菌」組成物はＵＳＰ無菌性試験を用いて決定されるとおりの生菌なしの組成物である。The United States Pharmacopeia, 30th Revision, The United States Pharmacopeial Convention:2008を参照されたい。
【００１６】
用語「ヒアルロン酸」とはヒアルロナンの繰り返し二糖副単位を含むポリマーを指す。その用語は、また、二糖副単位が１つ以上の位置でＤ−グルクロン酸及び／又はＤ−Ｎ−アセチルグルコサミン繰り返し副単位から誘導化されていてよいポリマーを含む。したがって、用語ヒアルロン酸は、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の誘導体及び塩形態（ヒアルロネートとも呼び、たとえば、ナトリウムヒアルロネート（ヒアルロン酸ナトリウム））を包含する。
【００１７】
ヒアルロン酸はβ（１−３）及びβ（１−４）グリコシド結合により結合しているＤ−グルクロン酸とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとからなる繰り返し二糖単位から形成された直鎖多糖類（長鎖生体ポリマー）である。ヒアルロン酸はタンパク及びスルホン基に対する共有結合がないので、他のグルコサミノグリカンとは区別される。ヒアルロン酸は動物中の至る処にあり、最も高濃度のものは軟結合組織に見られる。それは体内で機械目的及び輸送目的の両方で重要な役割を果たし、たとえば、それは関節に弾性を付与しそして椎間板に剛性を付与し、そしてそれは、また、目の硝子体の重要な成分である。
【００１８】
ヒアルロン酸は生体組織又は細胞を圧縮力から保護することができる化合物として眼科団体により良好に受け入れられている。したがって、ヒアルロン酸は白内障手術のための粘弾性眼科組成物の成分として提案されている。小さなせん断力下であまり粘性でないが、静的条件下で硬質弾性であるヒアルロン酸の粘弾性特性により、ヒアルロン酸が細胞及び組織のための衝撃吸収材として基本的に機能することが可能になる。ヒアルロン酸は、また、水を吸収しそして保持する能力が比較的大きい。記載したヒアルロン酸の特性は、分子量、溶液濃度及び生理的ｐＨに依存する。低濃度では、溶液中で個々の鎖が絡み合いそして連続したネットワークを形成し、それにより、系に興味深い特性、たとえば、顕著な粘弾性及び低濃度の水溶性ポリマーに特有の擬塑性を付与する。
【００１９】
ヒアルロン酸溶液は熱及び酸加水分解に感受性であることが知られており、そのため、重量平均分子量は、通常、溶液が多糖結合の加水分解を促進する条件に付したならば、時間の経過とともに低減するであろう。ヒアルロン酸の水溶液の場合には、８０℃を超える長時間の加熱、たとえば、加熱滅菌するのに使用する条件は適さず、ヒアルロン酸の重量平均分子量の実質的な低下が観測される。また、比較的高い重量平均分子量のヒアルロン酸を含むヒアルロン酸水溶液を除菌するために０．２２ミクロンの孔サイズのフィルタの使用は適さない。より小さい分子量画分はフィルタを容易に通過するが、平均分子直径が０．２μｍを超える大きな画分（平均Ｍｗが約０．６ＭＤａ以上）は容易に通過しない。しかしながら、出願人は、重量平均分子量が０．６ＭＤａ〜３．６ＭＤａであるヒアルロン酸の水溶液のフィルタ除菌を容易にする選択処理条件を発見した。
【００２０】
記述される処理条件は、ヒアルロン酸水溶液のろ過効率を改善する。特に、記述される処理条件により、比較的大規模のヒアルロン酸水溶液の製造バッチの無菌化を可能になる。出願人は重量平均分子量が０．６ＭＤａ〜３．６ＭＤａであるヒアルロン酸を含み、該ヒアルロン酸の濃度が０．０４質量％〜０．８質量％である水溶液の無菌ろ過では０．２２ミクロンの孔サイズのフィルタをとおしてろ過することができ、そのため、大規模商業生産バッチで無菌化することができることを示した。記述されるプロセスは、本質的に、溶液の特定の熱処理及び溶液が比較的高いイオン強度を有することに依存する。
【００２１】
一つのプロセス条件は熱処理が関与する。この場合において、ヒアルロン酸水溶液は、少なくとも１時間で６日間以下の間、４０℃〜８０℃の温度に維持される。しかしながら、２４時間を超える期間、この温度範囲の上限に溶液の温度を維持しないように注意しなければならない。さもなければ、ヒアルロン酸の重量平均分子量の有意な低下を観測し始める。長時間にわたって８０℃又はそれを超える温度に維持することで、多糖結合の加水分解又は酸化分解をもたらすことがある。ヒアルロン酸の重量平均分子量の観察される低下を最小限にすることに関する熱処理時間と維持温度との相関関係を考えて、推奨される熱処理を、重量平均分子量が約０．６ＭＤａ〜１．６ＭＤａであるヒアルロン酸について表１に示す。同様に、推奨される熱処理を、重量平均分子量が約１．６ＭＤａ〜３．６ＭＤａであるヒアルロン酸について表２に示す。
【００２２】
【表１】
【００２３】
【表２】
【００２４】
第二のプロセス条件はヒアルロン酸水溶液のイオン強度が関与する。イオン強度値は記載され、記載される塩化ナトリウムの水性濃度に等価であると説明される。出願人は、時折、ヒアルロン酸水溶液のイオン強度の増加をポリマーの「塩収縮ラッピング（salt shrink wrapping）」として参照する。ヒアルロン酸の「塩収縮ラッピング」（salt shrink wrapping）は図２に示す水溶液中のランダムコイルヒアルロン酸の模式図により最も上手く記載される。
【００２５】
したがって、十分な量の１種以上の塩化合物は、ヒアルロン酸と混合され、３ｗｔ％〜３０ｗｔ％、４ｗｔ％〜１８ｗｔ％又は８ｗｔ％〜１４ｗｔ％の塩化ナトリウムの水性濃度と等価であるイオン強度を有する、高塩濃度ヒアルロン酸水溶液を提供する。
【００２６】
理想的には、ヒアルロン酸水溶液のイオン強度を上げるために使用される１種以上の塩は所望の製品製剤中に存在することになる塩である。たとえば、もし、製剤を緩衝作用に付すことが必要であるならば、塩のうちの１種はバッファーの塩成分であることができる。ホウ酸塩で緩衝される製剤の場合には、塩はアルカリホウ酸塩、たとえば、ホウ酸ナトリウムであることができる。同様に、クエン酸塩又はリン酸塩で緩衝される製剤の場合には、塩は、それぞれ、アルカリクエン酸塩、たとえば、クエン酸ナトリウム、又は、アルカリリン酸塩、たとえば、リン酸二ナトリウムであることができる。ヒアルロン酸水溶液のイオン強度を上げるためにいかなる塩バッファー成分を使用してもよいことを当業者は理解するであろう。
【００２７】
眼科調製物を調製する場合にＮａＣｌ又はＫＣｌなどのアルカリ金属塩化物は、通常、調製物のモル浸透圧濃度を調節するために使用される。したがって、ＮａＣｌ、ＫＣｌ又はその２つの塩のある組み合わせはヒアルロン酸水溶液のイオン強度を上げるために使用できる。又は、塩化マグネシウム又は塩化カルシウムなどの第ＩＩ族金属塩を含む他の一般的な塩を使用することができる。
【００２８】
１つの実施形態において、高塩濃度ヒアルロン酸溶液は１リットルの溶液中のヒアルロン酸１ｇ毎に塩化ナトリウム約２５ｇ〜６０ｇに等価のイオン強度を有するであろう。たとえば、０．１ｗｔ％のヒアルロン酸溶液は塩化ナトリウム約２５ｇ〜６０ｇに等価のイオン強度を含むであろう。同様に、０．２ｗｔ％のヒアルロン酸溶液は塩化ナトリウム約５０ｇ〜１２０ｇに等価のイオン強度を含むであろう。０．３ｗｔ％のヒアルロン酸溶液は塩化ナトリウム約７５ｇ〜１８０ｇに等価のイオン強度を含むであろう。
【００２９】
酸の任意添加
溶液のｐＨも０．２２ミクロン孔サイズを有する除菌フィルタ媒体をとおしてヒアルロン酸水溶液を通過させる効率に対して影響があることが観測されている。溶液のｐＨは、また、加熱処理工程において使用される温度でのヒアルロン酸の加水分解の速度に対しても影響を与えることができる。ｐＨを約４．２〜約６．２の値に低減し、好ましくはｐＨを約５．２〜約６．２の値に低減することはヒアルロン酸溶液の除菌ろ過プロセスを促進することもできる。通常、最終製剤製品中に存在するバッファー塩に関連するバッファー酸を添加する。たとえば、製剤に緩衝作用を付す必要があるならば、対応する遊離酸を使用する。ホウ酸塩で緩衝される製剤の場合には、ホウ酸を添加するであろう。同様に、クエン酸塩で緩衝される製剤の場合には、クエン酸を添加するであろう。
【００３０】
しかしながら、もし、約６．４未満のｐＨ値を有するヒアルロン酸水溶液を調製し、その後、記載されるプロセスを用いてフィルタ除菌しようとするならば、トレードオフがある。記載したとおり、ヒアルロン酸の水溶液は加水分解に感受性があり、すなわち、ヒアルロン酸の重量平均分子量の所望しない減少をもたらす多糖結合の加水分解開裂に感受性がある。出願人は加水分解反応が酸の存在により触媒され、そのため、より低いｐＨ値はしばしば加水分解の速度を上げることになるであろうと考えられる。それゆえ、当業者は２つの競争的要因に直面し、そしてヒアルロン酸の選択グレードに対する除菌ろ過プロセスを最適化するプロセス条件を決定しなければならない。溶液のｐＨがより低いと、溶液の粘度が低下することになり、そのため、除菌フィルタをとおしてより速い流速となる。同時に、より低いｐＨ値は加水分解速度の増加及びより低い重量平均分子量のヒアルロン酸をもたらすことができる。
【００３１】
同様に、ヒアルロン酸の加水分解の速度は、比較的に高い塩基性条件、たとえば、少なくとも７．８以上のｐＨ値でも加速される。したがって、高塩濃度ヒアルロン酸溶液を調製するために添加される好ましい塩基は中性塩、たとえば、第Ｉ族又は第ＩＩ族金属クロリドである。記載されるヒアルロン酸の無菌ろ過の好ましいｐＨ範囲は約６．４〜約７．２である。
【００３２】
出願人はヒアルロン酸溶液をろ過するための孔サイズが０．２２ミクロンの２つのタイプの除菌フィルタ媒体：二層ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）媒体及び疎水性ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）媒体を調べた。実験室規模で両方のフィルタ媒体は非常に良好に機能したが、商業プロセス環境では、より大きなＰＶＤＦカートリッジがバッチ毎により一貫した流れを提供した。図１は種々のプロセス条件について、約７４０ｋｇのヒアルロン酸水溶液を処理するのに要求される１０インチフィルタカートリッジの推測数を示す棒グラフである。実際の試験は４７ｍｍフィルタディスクを用いて約２Ｌのヒアルロン酸溶液を用いて行った。これらの試験の変数としては、ヒアルロン酸の濃度、溶液中の塩化ナトリウムの濃度により報告される溶液のイオン強度、使用したフィルタ媒体（ＰＥＳ又はＰＶＤＦ）、及び、溶液中のホウ酸の有無が挙げられる。出願人は、実験運転をとおして可能な限り一貫した重量平均分子量のヒアルロン酸を維持しようと試みたが、試験ロットにおけるヒアルロン酸の重量平均分子量の若干の変動があった。ヒアルロン酸ナトリウムの分子量及び分子量分布をオンライントリプル検知による水性サイズ排除クロマトグラフィーにより決定する。Liu, X.M. らのDetailed Characterization of Cationic Hydroxyethylcellulose Derivatives using Aqueous Size-Exclusion Chromatography with on-line Triple Detection. J. Chromatogr. A. 1104, 2006. 145-153を参照されたい。
【００３３】
当業者によって理解されるとおり、記載される滅菌ろ過プロセスは高塩濃度ヒアルロン酸水溶液の粘度によって制限される。したがって、高塩濃度ヒアルロン酸溶液中のヒアルロン酸の濃度は０．８ｗｔ％未満である。というのは、ヒアルロン酸の濃度のさらなる増加は加熱処理された高塩濃度溶液をろ過するためにでさえ溶液を粘性とするであろうからである。また、より高い濃度のヒアルロン酸をフィルタ除菌するために十分な時間８０℃を超える温度で溶液を加熱することは多糖結合の有意な熱加水分解をもたらす傾向があり、重量平均分子量の有意な減少となり、そして所望の製品製剤に当初求められていた有利な粘弾性特性を失うことになる傾向がある。
【００３４】
多くの実施形態において、高塩濃度ヒアルロン酸溶液中のヒアルロン酸の濃度は０．０４ｗｔ％〜０．８ｗｔ％であり、又は、０．１ｗｔ％〜０．４ｗｔ％であり、たとえば、約０．２ｗｔ％、約０．３ｗｔ％、約０．４ｗｔ％又は約０．５ｗｔ％である。
【実施例】
【００３５】
例１：図１。０．５ｗｔ％ヒアルロン酸（ＨＡ）を、１０．０ｇのＨＡ及び２５０ｇのＮａＣｌ（１２．５ｗｔ％）のドライブレンドした混合物を、ステンレス容器内で約７０℃に維持した１７４０．０ｇの精製水に攪拌しながらゆっくりと添加することにより調製した。ＨＡは報告された重量平均分子量が約１．８ＭＤａであった。ＨＡは約２０分後に完全に溶解した外観を有した。溶液を室温に冷却させ、そして２つのプラスチックボトルに貯蔵した。溶液はコーン／プレート粘度が１ｒｐｍで３０４ｃＰ、１７ｒｐｍで１１１ｃＰであった。
【００３６】
溶液Ａ［比較例Ａ］ ０．５ｗｔ％ヒアルロン酸（ＨＡ）を、１０．０ｇのＨＡを、ステンレス容器内で約７０℃に維持した１９９０．０ｇの精製水に攪拌しながらゆっくりと添加することにより調製した。ＨＡは約４７分後に完全に溶解した外観を有した。溶液を室温に冷却させ、そして２つのプラスチックボトルに貯蔵した。溶液のコーン／プレート粘度が１ｒｐｍで１３４３ｃＰ、１７ｒｐｍで１９２．２ｃＰであった。
【００３７】
溶液Ｂ［比較例Ｂ］ １．０ｗｔ％ヒアルロン酸（ＨＡ）を、２０．０ｇのＨＡを、ステンレス容器内で約７０℃に維持した１９８０．０ｇの精製水に攪拌しながらゆっくりと添加することにより調製した。ＨＡは約７５分後に完全に溶解した外観を有した。溶液を室温に冷却させ、そして２つのプラスチックボトルに貯蔵した。溶液の見掛の高粘度のために、粘度測定は得られなかった。
【００３８】
溶液Ｃ［比較例Ｃ］ ３．０ｗｔ％ヒアルロン酸（ＨＡ）を、１５．０ｇのＨＡを、ステンレス容器内で約７０℃に維持した４８５．０ｇの精製水に攪拌しながらゆっくりと添加することにより調製した。ＨＡは約１５０分後に完全に溶解した外観を有した。生成物は非常に粘性の注ぐことができないゲルを形成し、実際に攪拌シャフト上に登り始めた。粘度測定は得られなかった。
【００３９】
１つの実施形態において、記載される除菌ろ過プロセスは、０．２２ミクロンの孔サイズのＰＥＳ又はＰＶＤＦフィルタカートリッジについて下記のプロセス条件及び溶液条件を含む。重量平均分子量が約０．７ＭＤａ〜約１．７ＭＤａであるヒアルロン酸は微細乾燥粉末として市販入手される。適量の乾燥ヒアルロン酸を適量の塩化ナトリウムとともにドライブレンディング容器に添加する。２つの粉末は塩化ナトリウム中でヒアルロン酸を有効に希釈してドライブレンドされる。一方、精製水を混合タンクに添加し、水の温度を４０℃〜８０℃に加熱しそして維持する。ドライブレンドされたヒアルロン酸／ＮａＣｌを精製水にゆっくりと添加し、そしてヒアルロン酸が完全に溶液中となる（すなわち、溶解された）ような外観となるまで溶液を攪拌する。高塩濃度ヒアルロン酸溶液を、その後、４０℃〜８０℃の温度で少なくとも１時間で６日間以下の間加熱処理する。また、維持温度が高いほど、加熱処理の時間が短いことが理解される。加熱処理に次いで、もし、もちろん、維持温度が５５℃を超えているならば、高塩濃度ヒアルロン酸溶液を好ましくは約４５℃〜５５℃に冷却する。
多くの実施形態において、ヒアルロン酸は重量平均分子量が０．６ＭＤａ〜３．６ＭＤａ、０．８ＭＤａ〜２．２ＭＤａ、０．８ＭＤａ〜１．６ＭＤａ又は１．１ＭＤａ〜１．４ＭＤａであろう。
【００４０】
例２：図１。０．２５ｗｔ％ヒアルロン酸（ＨＡ）を、１０．０ｇのＨＡ及び５００ｇのＮａＣｌ（１２．５ｗｔ％）のドライブレンドした混合物を、ステンレス容器内で約７８℃に維持した３４９０．０ｇの精製水に攪拌しながらゆっくりと添加することにより調製した。ＨＡは報告された重量平均分子量が約１．８ＭＤａであった。溶液を室温に冷却させた。溶液はコーン／プレート粘度が３０ｒｐｍで１６．３ｃＰであった。
【００４１】
例３：図１。０．１２５ｗｔ％ヒアルロン酸（ＨＡ）を、５．０ｇのＨＡ及び２５０ｇのＮａＣｌ（６．２５ｗｔ％）のドライブレンドした混合物を、ステンレス容器内で約７３℃に維持した３７４５．０ｇの精製水に攪拌しながらゆっくりと添加することにより調製した。ＨＡは報告された重量平均分子量が約１．４ＭＤａであった。ＨＡは約７５分後に完全に溶解した外観を有した。溶液を室温に冷却させた。溶液はコーン／プレート粘度が６０ｒｐｍで６．４ｃＰであった。
【００４２】
例４：図１。０．１２５ｗｔ％ヒアルロン酸（ＨＡ）を、５．０ｇのＨＡ及び２５０ｇのＮａＣｌ（６．２５ｗｔ％）のドライブレンドした混合物を、ステンレス容器内で１６０ｇのホウ酸（４ｗｔ％）を含む約７６℃に維持した３４８５．０ｇの精製水に攪拌しながらゆっくりと添加することにより調製した。ＨＡは報告された重量平均分子量が約１．４ＭＤａであった。溶液を室温に冷却させた。溶液はコーン／プレート粘度が６０ｒｐｍで３．５ｃＰであった。
【００４３】
図１に報告したデータから示唆されるとおり、４ｗｔ％のホウ酸を含む例４の溶液は、ホウ酸を含まない同等の溶液、すなわち、例３の溶液よりも、ＰＶＤＦフィルタディスクをとおして２倍近く効率がよい。さらに、例４の溶液は例３の溶液よりも、ＰＥＳフィルタディスクをとおして５倍効率がよい。
【００４４】
例５：図１。０．２５ｗｔ％ヒアルロン酸（ＨＡ）を、５．０ｇのＨＡ及び２５０ｇのＮａＣｌ（１２．５ｗｔ％）のドライブレンドした混合物を、ステンレス容器内で約７５℃に維持した１７４５．０ｇの精製水に攪拌しながらゆっくりと添加することにより調製した。ＨＡは報告された重量平均分子量が約０．８ＭＤａであった。ＨＡは約３０分後に完全に溶解した外観を有した。溶液を室温に冷却させた。溶液はコーン／プレート粘度が６０ｒｐｍで８．３ｃＰであった。
【００４５】
例６：図１。０．２５ｗｔ％ヒアルロン酸（ＨＡ）を、４．０ｇのＨＡ及び２００ｇのＮａＣｌ（１２．５ｗｔ％）のドライブレンドした混合物を、ステンレス容器内で約７３℃に維持した１３９６．０ｇの精製水に攪拌しながらゆっくりと添加することにより調製した。ＨＡは報告された重量平均分子量が約０．７ＭＤａであった。ＨＡは約３０分後に完全に溶解した外観を有した。溶液を室温に冷却させた。溶液はコーン／プレート粘度が６０ｒｐｍで８．７ｃＰであった。
【００４６】
分子量に対する維持温度の効果
例７Ａ．０．２６ｗｔ％のヒアルロン酸及び１３ｗｔ％のＮａＣｌを含む高塩濃度ヒアルロン酸溶液を、例２に記載されるとおりに調製した。５．２ｇのＨＡ及び２６０ｇのＮａＣｌのドライブレンドされた混合物を、ステンレス容器内で６９℃に維持した１７３４．８ｇの熱蒸留水に攪拌しながらゆっくりと添加した。ＨＡは約１０５分後に完全に溶解した外観を有し、その時点で、温度は６６℃であった。溶液を約１０分で約４０℃に冷却し、そして約４０℃に維持した。サンプルを０時間、１時間、２時間、３時間、４時間及び１８時間で抜き取り、その間、溶液の温度は３８℃（１８時間）〜４４℃（４時間）で変化した。水性ＧＰＣトリプル検知システムを用いて、各サンプルの重量平均分子量を決定した。また、コーン／プレート粘度決定を各サンプルで１２ｒｐｍにて行った。ＧＰＣ分子量データ及び粘度データの両方を表３に示す。
【００４７】
【表３】
【００４８】
例７Ｂ．０．２６ｗｔ％のヒアルロン酸及び１３ｗｔ％のＮａＣｌを含む高塩濃度ヒアルロン酸溶液を、例２に記載されるとおりに調製した。５．２ｇのＨＡ及び２６０ｇのＮａＣｌのドライブレンドされた混合物を、ステンレス容器内で６７℃に維持した１７３４．８ｇの熱蒸留水に攪拌しながらゆっくりと添加した。ＨＡは約１１５分後に完全に溶解した外観を有し、その時点で、温度は６９℃であった。溶液を約１０分で約５０℃に冷却し、そして約５０℃に維持した。サンプルを０時間、１時間、２時間、３時間、４時間及び１８時間で抜き取り、その間、溶液の温度は４６℃（１８時間）〜５４℃（３時間）で変化した。水性ＧＰＣトリプル検知システム（Integrated PL-GPC50、2x Waters Ultrahydrogel Linear, 7.8x300 mm）を用いて、各サンプルの重量平均分子量を決定した。また、コーン／プレート粘度決定を各サンプルで１２ｒｐｍにて行った。ＧＰＣ分子量データ及び粘度データの両方を表４に示す。
【００４９】
【表４】
【００５０】
例７Ｃ．０．２６ｗｔ％のヒアルロン酸及び１３ｗｔ％のＮａＣｌを含む高塩濃度ヒアルロン酸溶液を、例２に記載されるとおりに調製した。５．２ｇのＨＡ及び２６０ｇのＮａＣｌのドライブレンドされた混合物を、ステンレス容器内で７０℃に維持した１７３４．８ｇの熱蒸留水に攪拌しながらゆっくりと添加した。ＨＡは約１２５分後に完全に溶解した外観を有し、その時点で、温度は６７℃であった。溶液を約５分で約６１℃に冷却し、そして約６０℃に維持した。サンプルを０時間、１時間、２時間、３時間、４時間及び１８時間で抜き取り、その間、溶液の温度は５６℃（１８時間）〜６１℃（０時間）で変化した。水性ＧＰＣトリプル検知システムを用いて、各サンプルの重量平均分子量を決定した。また、コーン／プレート粘度決定を各サンプルで３０ｒｐｍにて行った。ＧＰＣ分子量データ及び粘度データの両方を表５に示す。
【００５１】
【表５】
【００５２】
例８Ａ〜８Ｃ
第二のロットのヒアルロン酸を用い、そして維持温度が約５０℃（８Ａ）、５５℃（８Ｂ）及び６０℃（８Ｃ）であったことを除いては例７を繰り返した。分子量決定を表６に示す。
【００５３】
【表６】
【００５４】
例９
０．２６ｗｔ％のヒアルロン酸及び１３ｗｔ％のＮａＣｌを含む高塩濃度ヒアルロン酸溶液を調製した。５．２ｇのＨＡ及び２６０ｇのＮａＣｌのドライブレンドされた混合物を、ステンレス容器内で約６６℃に維持した１７３４．８ｇの熱蒸留水に攪拌しながら５分間にわたってゆっくりと添加した。ＨＡは約１０７分後に完全に溶解した外観を有し、その時点で、温度は約７０℃であった。溶液を約５分で約５０℃に冷却し、そして約５０℃に維持した。Ｖｍａｘ４７ｍｍディスクフィルタ（STW 0.2 Everlux（商標）0.45/0.22ミクロン）を、５０℃の水で５分間、プレフラッシュした。加熱処理された高塩濃度ヒアルロン酸溶液を２７ｐｓｉでフィルタをとおしてろ過した。ミリポア変換プログラムを用いて、ディスクろ過は７７７Ｌの溶液体積に対して約２．７個の１０−インチフィルタカートリッジを要求する。
【００５５】
例１０
ＨＡ及びＮａＣｌ濃度を２５％低減したことを除いては例９と同様の実験であった。０．１９５ｗｔ％のヒアルロン酸及び９．７５ｗｔ％のＮａＣｌを含む高塩濃度ヒアルロン酸溶液を調製した。３．９ｇのＨＡ及び１９５ｇのＮａＣｌのドライブレンドされた混合物を、ステンレス容器内で約６９℃に維持した１８０１．１ｇの熱蒸留水に攪拌しながら５分間にわたってゆっくりと添加した。ＨＡは約１００分後に完全に溶解した外観を有し、その時点で、温度は約６９℃であった。溶液を約７分で約５１℃に冷却し、そして約５１℃に維持した。Ｖｍａｘ４７ｍｍディスクフィルタ（STW 0.2 Everlux（商標）0.45/0.22ミクロン）を、５０℃の水で５分間、プレフラッシュした。加熱処理された高塩濃度ヒアルロン酸溶液を２７ｐｓｉでフィルタをとおしてろ過した。ミリポア変換プログラムを用いて、ディスクろ過は７７７Ｌの溶液体積に対して約２．６個の１０−インチフィルタカートリッジを要求する。
【００５６】
例１１
ＨＡ及びＮａＣｌ濃度を５０％低減したことを除いては例９と同様の実験であった。０．１３ｗｔ％のヒアルロン酸及び６．５ｗｔ％のＮａＣｌを含む高塩濃度ヒアルロン酸溶液を調製した。２．６ｇのＨＡ及び１３０ｇのＮａＣｌのドライブレンドされた混合物を、ステンレス容器内で約６８℃に維持した１８６７．４ｇの熱蒸留水に攪拌しながら５分間にわたってゆっくりと添加した。ＨＡは約９７分後に完全に溶解した外観を有し、その時点で、温度は約６９℃であった。溶液を約８分で約４９℃に冷却し、そして約４９℃に維持した。Ｖｍａｘ４７ｍｍディスクフィルタ（STW 0.2 Everlux（商標）0.45/0.22ミクロン）を、５０℃の水で５分間、プレフラッシュした。加熱処理された高塩濃度ヒアルロン酸溶液を２７ｐｓｉでフィルタをとおしてろ過した。ミリポア変換プログラムを用いて、ディスクろ過は７７７Ｌの溶液体積に対して約３．０個の１０−インチフィルタカートリッジを要求する。
【００５７】
１つの実施形態において、適切なフィルタ媒体を用いてヒアルロン酸水溶液を無菌化する方法を記載する。その方法は重量平均分子量が０．６ＭＤａ〜３．６ＭＤａであるヒアルロン酸の水溶液を提供することを含む。溶液中のヒアルロン酸の濃度は０．０４質量％〜０．８質量％である。また、ろ過効率を上げるために、水溶液は３質量％〜３０質量％の塩化ナトリウムの水性濃度と等価のイオン強度を有する。塩の存在はヒアルロン酸溶液の溶液粘度を低減する。出願人は、ヒアルロン酸は比較的に高いイオン強度の溶液中でより強固にラッピングされており、バイオポリマーの旋回半径が低減されるものと信じる。高塩濃度ヒアルロン酸溶液は熱処理を受け、それがさらに溶液の粘度を低減する。したがって、高塩濃度ヒアルロン酸溶液を少なくとも１時間で６日以下の間４０℃〜８０℃の温度に維持する。その後、加熱処理された溶液を除菌フィルタ媒体をとおしてろ過する。フィルタ媒体は平均孔サイズが０．２５μｍ以下であり、たとえば、０．２２μｍの孔サイズであり、除菌された高塩濃度ヒアルロン酸溶液を提供する。水の添加時のヒアルロン酸の溶解を促進するために（通常、ヒアルロン酸は微細乾燥粉末として市販されている）、ヒアルロン酸は好ましくはＮａＣｌなどの塩とドライブレンドされている。ドライブレンドされた塩／ヒアルロン酸混合物を、その後、適量の精製水中に攪拌しながらゆっくりと添加する。
【００５８】
１つの実施形態において、高塩濃度ヒアルロン酸溶液の加熱処理は４０℃〜７０℃の温度に溶液を維持することを含むが、一般に、溶液を５０℃〜７０℃の温度に１時間〜１２時間維持することを含む。また、維持温度が高いほど、短い維持時間が要求される。たとえば、高塩濃度ヒアルロン酸水溶液が５５℃〜６５℃の温度に維持されるならば、このような加熱処理下に少なくとも１時間で１２時間以下の維持時間が推奨される。
【００５９】
除菌された高塩濃度ヒアルロン酸溶液は好ましくはヒアルロン酸の濃度が０．１５質量％〜０．６質量％であり、好ましくは４質量％〜１６質量％の塩化ナトリウムの水性濃度と等価のイオン強度を有する。
【００６０】
記載したとおり、ｐＨはヒアルロン酸ポリマーの加水分解の速度に役割を果たすことができ、加水分解は酸又は塩基の存在下で触媒されるものと信じられる。したがって、高塩濃度ヒアルロン酸溶液は、バイオポリマーの加水分解開裂、それによる時間経過に伴うヒアルロン酸の重量平均分子量の低下を制限するために、ｐＨ６．４〜７．２で最も良好に調製される。
【００６１】
ある実施形態において、加熱処理されたフィルタ除菌された高塩濃度ヒアルロン酸溶液を、眼科用途に使用するものを含めた医薬製剤を調製するために、また、骨関節炎の治療において使用する。したがって、無菌ろ過された高塩濃度ヒアルロン酸溶液を、ホウ酸及びホウ酸ナトリウムなどのバッファー成分を含む他の医薬製剤成分を含む事前無菌化された水溶液と混合することができる。眼科製剤の場合には、ｐＨは６．４〜７．２に調節される。水性製剤を商業処理の少なくとも２つの別個の部分又は相に分けることにより、フィルタ除菌を要求する製剤の体積は有意に低減される。多くの場合には、無菌化された高塩濃度ヒアルロン酸溶液は、医薬製剤中で所望のヒアルロン酸の濃度を提供するように少なくとも１０倍で希釈されうる。そのため、製剤の１／１０未満の量がフィルタ除菌を必要とする。別の場合には、無菌化された高塩濃度ヒアルロン酸溶液を少なくとも５倍に希釈することができる。医薬製剤中の残りの成分により、製剤の過半の体積部分は加熱滅菌、たとえば、オートクレーブ処理されてよく、又は、この部分はフィルタ除菌されてもよい（もちろん、製剤の過半体積は高効率でろ過されうるものと仮定する）。
【００６２】
伝統的に、除菌フィルタ媒体は、１０7コロニー形成単位（CFU）/ｃｍ２の最小濃度の試験生物ブレバンディ・ジミヌタ（Brevundimonas diminuta）（B. diminuta）で攻撃したときに、無菌エフルエントを生じるものである。フィルタ媒体は所与の高塩濃度ヒアルロン酸溶液のろ過流速（リットル／分）に役割を果たす。多くのフィルタ媒体は除菌フィルタに使用するのに利用可能である。そのフィルタ媒体としては、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）及びポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）が挙げられる。フィルタ膜は、その後、カートリッジ中に組み込まれる。たとえばデュラポア（Durapore）（登録商標）疎水性膜カートリッジは最小差圧で無菌保証、高流速及び高スループットを提供する除菌グレードのフィルタである。そのカートリッジは小体積装置及び大体積装置の液体ろ過に使用される。デュラポア（Durapore）（登録商標）０．２２μm疎水性ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜は、除菌用途において汚染物質及び微生物を確実に排除する。支持フィルタ構造（たとえば、ケージ、コア、エンドキャップ及びアダプタ）の構成材料は、通常、ポリプロピレン又はポリスルホンである。
【００６３】
別の実施形態において、ヒアルロン酸を含む溶液の無菌化方法は高塩濃度ヒアルロン酸水溶液を調製することを含む。ヒアルロン酸は重量平均分子量が０．６ＭＤａ〜２．２ＭＤａであり、そしてヒアルロン酸の濃度が０．０８質量％〜０．５質量％である。ヒアルロン酸溶液は４％〜１８％の塩化ナトリウムの水性濃度に等価のイオン強度を有する。溶液の比較的高いイオン強度は、1種以上のイオン性塩、たとえば、塩化ナトリウム又はホウ酸ナトリウムを添加することによって提供される。高塩濃度ヒアルロン酸溶液を、少なくとも1時間で１８時間以下の間、５０℃〜７５℃の温度で加熱処理に付す。加熱処理された溶液を、その後、上記のとおりの除菌フィルタ媒体をとおしてろ過する。また、水中でのヒアルロン酸の溶解を促進するために、ヒアルロン酸は、好ましくは、塩、たとえば、ＮａＣlとドライブレンドされる。ドライブレンドされた塩／ヒアルロン酸混合物を、その後、ゆっくりと攪拌しながら水に添加する。
【００６４】
別の実施形態において、高塩濃度ヒアルロン酸溶液は０．１質量％〜０．４質量％のヒアルロン酸及び８質量％〜１６質量％の塩化ナトリウムを含む。その後、溶液を記載されたとおりに加熱処理に付す。また、維持温度が高いほど、短い維持時間が必要とされる。たとえば、高塩濃度ヒアルロン酸水溶液を５５℃〜６５℃の温度に維持するならば、少なくとも２時間で８時間以下の維持時間が推奨される。
【００６５】
ヒアルロン酸を含む水溶液のために記載されるフィルタ除菌プロセスは、重量平均分子量が０．６ＭＤａ〜３．６ＭＤａであるヒアルロン酸を０．０４質量％〜０．８質量％の量で含む無菌化された水溶液を調製するために使用されうる。その水溶液は塩化ナトリウム４質量％〜１８質量％の水性濃度に等価のイオン強度を有し、そして溶液はフィルタ除菌されている。
【００６６】
１つの実施形態において、フィルタ除菌された高塩濃度ヒアルロン酸溶液は１リットルの溶液中のヒアルロン酸１ｇ毎に塩化ナトリウム約２５ｇ〜６０ｇに等価のイオン強度を有するであろう。たとえば、０．１ｗｔ％のヒアルロン酸溶液は塩化ナトリウム約２５ｇ〜６０ｇに等価のイオン強度を含むであろう。同様に、０．２ｗｔ％のヒアルロン酸溶液は塩化ナトリウム約５０ｇ〜１２０ｇに等価のイオン強度を含むであろう。０．３ｗｔ％のヒアルロン酸溶液は塩化ナトリウム約７５ｇ〜１８０ｇに等価のイオン強度を含むであろう。
【００６７】
別の実施形態において、記載される無菌ろ過方法は商業規模製造バッチ量のコンタクトレンズケア溶液を調製するために使用されうる。その方法は、最終製剤がコンタクトレンズケア溶液に適した成分をも含んでいることを除いて上述したものと同様であろう。ヒアルロン酸に関してこれらの成分の幾つかは無菌ろ過により適するが、他の成分は加熱滅菌できそうである。５，０００Ｌ〜４０，０００Ｌの最終総溶液体積の製造バッチを調製することができる。
【００６８】
また、高塩濃度ヒアルロン酸水溶液を調製することから始めることができる。ヒアルロン酸は重量平均分子量が０．６ＭＤａ〜３．６ＭＤａであり、そしてヒアルロン酸の濃度が０．０４質量％〜０．８質量％であろう。ヒアルロン酸溶液は３％〜３０％の塩化ナトリウムの水性濃度に等価のイオン強度を有するであろう。溶液の比較的高いイオン強度は、1種以上のイオン性塩、たとえば、塩化ナトリウム又はホウ酸ナトリウムを添加することによって提供される。高塩濃度ヒアルロン酸溶液を、５５℃〜７５℃の温度で少なくとも1時間で１２時間以下の間、加熱処理する。加熱処理された溶液を、その後、上記のとおりの除菌フィルタ媒体をとおしてろ過する。
【００６９】
除菌された高塩濃度ヒアルロン酸溶液を、その後、バッファー成分、１種以上の界面活性剤、１種以上のキレート化剤及び１種以上の抗菌性成分などのコンタクトレンズケア溶液の残りの成分のほとんど又はすべてを含むことができる第二の水溶液と混合する。また、２つの水溶液を混合することにより、除菌された高塩濃度ヒアルロン酸溶液は少なくとも５倍又は、ある場合には、少なくとも１０倍に希釈される。
【００７０】
記載したとおり、レンズケア溶液は第四級アンモニウム化合物（小分子を含む）及びポリマーならびに低分子量及び高分子量ビグアニドから選ばれる1種以上の抗菌性成分をも含むであろう。たとえば、ビグアニドとしては、アレキシジン、クロルヘキシジン、ヘキサメチレンビグアニド及びそれらのポリマーの遊離塩基又は塩ならびにこれらの組み合わせが挙げられる。好ましい実施形態において、レンズケア溶液としては、ポリ（ヘキサメチレンビグアニド）（ＰＨＭＢ又はＰＡＰＢ）として知られているポリマービグアニドが挙げられ、それはCosmocil（商標）CQでZeneca, Wilmington, DEから市販されている。 ＰＨＭＢはレンズケア溶液中に０．２ｐｐｍ〜５ｐｐｍ又は０．５ｐｐｍ〜２ｐｐｍで存在する。
【００７１】
より一般的な第四級アンモニウム化合物の一つは、α-[４−トリス（２−ヒドロキシエチル）−アンモニウムクロリド−２−ブテニル]ポリ［１−ジメチルアンモニウムクロリド−２−ブテニル]−ω−トリス（２−ヒドロキシエチル）アンモニウムクロリドであり、それはポリクオタニウム-1とも当該技術分野において呼ばれている。第四級アンモニウム化合物は、一般に、「ポリクオタニウム」消毒剤と当該技術分野で呼ばれており、ポリクオタニウム-1、ポリクオタニウム-10又はポリクオタニウム-42などの指定に従う特定の番号で識別される。ポリクオタニウム-1は０．５ｐｐｍ〜３ｐｐｍでレンズケア溶液中に存在する。興味深いことに、溶液中のポリクオタニウム-1の濃度を３ｐｐｍを超える濃度に増加しようとすると、沈殿物が形成することになる。沈殿物はヒアルロン酸とポリクオタニウム-1の錯体生成物であると信じられる。
【００７２】
２つの抗菌性成分のより好ましい組み合わせの一つとしては、０．５ｐｐｍ〜１．５ｐｐｍの濃度のＰＨＭＢと０．５ｐｐｍ〜１．５ｐｐｍの濃度のポリクオタニウム-1との混合物が挙げられる。このような製剤中で、ヒアルロン酸は、０．００２ｗｔ％〜０．０４ｗｔ％で存在する。
【００７３】
コンタクトレンズケア溶液は、０．０１ｗｔ％〜１ｗｔ％の一般式Ｉの両性界面活性剤を含むことができる。一般式Ｉの特定のスルホベタインは他のものよりも好ましい。たとえば、スルホベタイン3-10（Ｒ１は１０個の炭素を含む直鎖飽和アルキルであり、Ｒ２及びＲ３はそれぞれメチルであり、Ｒ４は−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−（３個の炭素）である）である。眼科組成物において使用することができる他のベタインとしては、対応するスルホベタイン3-08（Ｒ１は８個の炭素を含む直鎖飽和アルキルである）、スルホベタイン3−12（Ｒ１は１２個の炭素を含む直鎖飽和アルキルである）、スルホベタイン3−14（Ｒ１は１４個の炭素を含む直鎖飽和アルキルである）及びスルホベタイン3−16（Ｒ１は１６個の炭素を含む直鎖飽和アルキルである）が挙げられる。したがって、より好ましい特定の眼科組成物としては、一般式Ｉ（Ｒ１はＣ８〜Ｃ１６アルキルであり、Ｒ２及びＲ３はメチルであり、そしてＲ４は−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−である）のスルホベタインが挙げられる。
【００７４】
【化１】
【００７５】
コンタクトレンズケア溶液中に含まれることができる他の成分は２００８年９月３日に出願された同時係属出願の米国特許出願第１２／２０３，３８４号に記載されている。
【００７６】
１つの実施形態において、一般式Ｉのスルホベタイン、ＰＨＭＢ及びポリクオタニウム−1の水溶液を調製し、高塩濃度ヒアルロン酸溶液を処理するために使用されるフィルタ媒体と同様の除菌フィルタをとおして通過させる。その後、各フィルタ除菌された溶液を共通の混合タンクに添加する。
【００７７】
例１２
コンタクトレンズの多目的洗浄及び消毒液の商業規模の製造バッチを、4つの別個の相（水溶液）として用意し、主要混合タンクにおいて混合する。
相Ｉ．
攪拌機を装備した適切なサイズの３１６ステンレススチールのジャケット付き圧力容器に、最大攪拌を達成するために十分な精製水を添加する。相Ｉの水の体積は総バッチ体積の約６０〜９６％とすべきである。水を７０℃以上の水温とし及び／又はその温度に維持するための水を加熱する。攪拌を開始し、バッチの全体の処理にわたって攪拌を維持する。記載の順序で、以下のバッチ量でエデト酸二ナトリウム、ホウ酸、ホウ酸ナトリウム及びポロキサミン１１０７を添加しそして溶解させる。ポロキサミン１１０７の完全な溶解を確保するために、２０分以上、溶液を混合する。溶液サンプルを抜き出し、そしてｐＨを決定する。必要ならば、1N NaOH又は1N HClによりｐＨを７．３〜７．７に調整する。プロセス及び文書化要件について、加圧下でのスチームによる溶液滅菌の一般手順を参照し、確証サイクルを用いて、反応器をシールし、相Ｉ溶液を１２１℃〜１２４℃で３０〜４５分間、加熱滅菌する。滅菌時間の完了時に、相Ｉ溶液を４０℃未満に冷却する。
【００７８】
相II．
相IIは、精製水、０．２６ｗｔ％ヒアルロン酸及び１３ｗｔ％塩化ナトリウムの水性混合物である。バッチ量のヒアルロン酸と塩化ナトリウムを混合しそしてドライブレンドする。適量の水を混合しながら、ゆっくりと混合タンクにＮａＣｌ/ヒアルロン酸のドライブレンド混合物を注ぐ。ＮａＣｌ／ヒアルロン酸溶液を６５〜７５℃の温度範囲に維持しながら、ヒアルロン酸が完全に溶解するまで混合する。懸濁したヒアルロン酸を視覚的に検査するために、必要に応じてミキサーを遅くして、溶液を視覚的に検査する。
ヒアルロン酸が完全に溶解したら、溶液を５０〜５５℃に冷却する。無菌化されたミリポアCVGLフィルタをとおしてＮａＣｌ／ヒアルロン酸溶液をろ過し、相Ｉコンパウンディングタンクに入れる。差圧は３０ｐｓｉを超えるべきでない。
【００７９】
相III
攪拌機を備えた適切な圧力容器に、４０℃未満の温度の、合計バッチ質量の０．５０％〜４．９５％の精製水及びバッチ量のスルホベタイン粉末を添加し、０．０５ｗｔ％〜１０．０ｗｔ％の溶液を製造する。溶液を最低で２０分間混合する。無菌０．２２μｍミリポアフィルタ（相IIの輸送に使用されるものとは異なるフィルタアセンブリ）をとおしてスルホベタイン溶液を無菌ろ過し、相Ｉ溶液中に入れる。相Ｉ溶液を１０分以上の時間混合する。
【００８０】
相IV
攪拌機を備えた適切な圧力容器に、合計バッチ質量の０．０７８〜１．９８％の冷たい（４０℃未満）の水及びバッチ量のポリ（ヘキサメチレンビグアニド）及びポリクオタニウム-1を添加し、０．０３〜１．００％溶液を製造する。溶液を最低で１０分間混合する。無菌ミリポア０．２２μｍフィルタをとおしてＰＨＭＢ／ＰＱ−１溶液を無菌ろ過し、相Ｉ溶液中に入れる。
【００８１】
例１３
コンタクトレンズ再湿潤点眼製剤は以下のように調製される。
３．０ｗｔ％のホウ酸ＮＦ、２．１ｗｔ％のＮａＣｌ ＵＳＰ、０．７ｗｔ％のＫＣｌ ＵＳＰ及び０．５ｗｔ％のヒアルロン酸溶液（約０．８ＭＤａの平均分子量）を含む高塩濃度ヒアルロン酸塩水溶液を調製する。ＨＡ及びＮａＣｌのドライブレンドした混合物を攪拌しながらステンレス容器中で約６８℃に維持された熱蒸留水に５分かけてゆっくりと添加する。ＨＡは約１００分後に完全に溶解した外観を有する。約８分で溶液を約５５℃に冷却し、約５５℃に３時間以上維持した。ＫＣｌ及びホウ酸を、冷却後の熱処理済みＨＡ溶液に添加し、そして溶液を１０分間攪拌する。５５℃の温度で、ＰＶＤＦ０．２２μｍフィルタ媒体をとおして溶液を通過させることによって溶液を無菌ろ過する。別個に、１．７５ｗｔ％のホウ酸ナトリウム十水和物、０．０３ｗｔ％の塩化カルシウム無水物ＵＳＰ、０．０３ｗｔ％の塩化マグネシウム六水和物及び０．０２５ｗｔ％の安定化オキシクロリド錯体（purite）を含む第二の無菌化された溶液を調製する。この第二の塩溶液は従来の加熱滅菌処理を用いて無菌化することができる。あるいは、この溶液は、ＨＡ溶液を調製するのに使用されるのと同一のフィルタを用いて除菌ろ過することができる。第二の塩溶液の無菌化の後に、第二の溶液を、加熱処理された高塩濃度ヒアルロネート溶液と、４：１の体積比で混合する。コンタクトレンズ再湿潤点眼製剤として使用することができる最終的眼科製剤を表7に提供する。
【００８２】
【表７】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
重量平均分子量が０．６ＭＤａ〜３．６ＭＤａであるヒアルロン酸の水溶液であって、該ヒアルロン酸の濃度が０．０４質量％〜０．８質量％である水溶液を提供すること、ここで、前記水溶液は高塩濃度ヒアルロン酸溶液を提供するようにイオン強度が２質量％〜３０質量％の塩化ナトリウムの水性濃度と等価である、
前記高塩濃度ヒアルロン酸水溶液を、少なくとも１時間で６日間以下の間、４０℃〜８０℃の温度に維持すること、及び、
加熱された高塩濃度ヒアルロン酸溶液を除菌フィルタ媒体をとおしてろ過すること、ここで、前記フィルタ媒体は平均孔サイズが０．２５μｍ以下であり、除菌された高塩濃度ヒアルロン酸溶液を提供する、
を含む、溶液の無菌化方法。
【請求項２】
前記ヒアルロン酸は重量平均分子量が０．８ＭＤａ〜２．２ＭＤａである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ヒアルロン酸の濃度は０．１質量％〜０．５質量％である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記高塩濃度ヒアルロン酸溶液を提供する工程は適切な乾燥質量の塩とヒアルロン酸とを合わせそして混合して、前記塩とヒアルロン酸とのドライブレンドを形成し、そして該ドライブレンドを適量の精製水に添加することを含む、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記精製水は４０℃〜７０℃の温度に予熱されている、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記高塩濃度ヒアルロン酸水溶液を水性高塩濃度に維持する工程は少なくとも１時間で１２時間以下の間、５０℃〜６５℃の温度に維持することを含む、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
除菌された高塩濃度ヒアルロン酸溶液を、バッファー成分を含む水溶液と混合し、ｐＨを６．４〜７．２に調節することをさらに含み、そしてその２つの水溶液を混合することにより、除菌された高塩濃度ヒアルロン酸溶液は少なくとも１０倍に希釈される、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記バッファー成分はホウ酸及びホウ酸ナトリウムを含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
除菌された高塩濃度ヒアルロン酸溶液はｐＨが６．４〜７．２である、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
除菌された高塩濃度ヒアルロン酸溶液はヒアルロン酸の濃度が０．１５質量％〜０．６質量％であり、そして塩化ナトリウムが４質量％〜１６質量％である、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
前記除菌フィルタ媒体はポリフッ化ビニリデンフィルタ媒体カートリッジである、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
除菌された高塩濃度ヒアルロン酸溶液を、ホウ酸、ホウ酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムからなる群より選ばれるバッファー成分を含む水溶液と混合し、ｐＨを６．４〜７．２に調節することをさらに含み、そしてその２つの水溶液を混合することにより、除菌された高塩濃度ヒアルロン酸溶液は少なくとも５倍に希釈される、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
混合された水溶液は防腐有効量で安定化塩素をさらに含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
混合された水溶液は０．５ｐｐｍ〜２．０ｐｐｍで存在するポリ（ヘキサメチレンビグアニド）、又は、０．５ｐｐｍ〜３ｐｐｍで存在するα−[４−トリス（２−ヒドロキシエチル）−アンモニウムクロリド−２−ブテニル]ポリ[１−ジメチルアンモニウムクロリド−２−ブテニル]−ω−トリス（２−ヒドロキシエチル）アンモニウムクロリドをさらに含む、請求項１２又は１３記載の方法。
【請求項１５】
重量平均分子量が０．６ＭＤａ〜３．６ＭＤａであるヒアルロン酸を０．０４質量％〜０．８質量％の量で含み、イオン強度が４質量％〜１８質量％の塩化ナトリウムである塩化ナトリウム水性濃度と等価であり、フィルタ除菌されている、無菌化水溶液。
【請求項１６】
０．１質量％〜０．４質量％のヒアルロン酸を含み、そして８質量％〜１６質量％の塩化ナトリウムを含む、請求項１５記載の水溶液。
【請求項１７】
前記ヒアルロン酸は重量平均分子量が０．８ＭＤａ〜２．２ＭＤａである、請求項１５又は１６記載の水溶液。
【請求項１】
重量平均分子量が０．６ＭＤａ〜３．６ＭＤａであるヒアルロン酸の水溶液であって、該ヒアルロン酸の濃度が０．０４質量％〜０．８質量％である水溶液を提供すること、ここで、前記水溶液は高塩濃度ヒアルロン酸溶液を提供するようにイオン強度が２質量％〜３０質量％の塩化ナトリウムの水性濃度と等価である、
前記高塩濃度ヒアルロン酸水溶液を、少なくとも１時間で６日間以下の間、４０℃〜８０℃の温度に維持すること、及び、
加熱された高塩濃度ヒアルロン酸溶液を除菌フィルタ媒体をとおしてろ過すること、ここで、前記フィルタ媒体は平均孔サイズが０．２５μｍ以下であり、除菌された高塩濃度ヒアルロン酸溶液を提供する、
を含む、溶液の無菌化方法。
【請求項２】
前記ヒアルロン酸は重量平均分子量が０．８ＭＤａ〜２．２ＭＤａである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ヒアルロン酸の濃度は０．１質量％〜０．５質量％である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記高塩濃度ヒアルロン酸溶液を提供する工程は適切な乾燥質量の塩とヒアルロン酸とを合わせそして混合して、前記塩とヒアルロン酸とのドライブレンドを形成し、そして該ドライブレンドを適量の精製水に添加することを含む、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記精製水は４０℃〜７０℃の温度に予熱されている、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記高塩濃度ヒアルロン酸水溶液を水性高塩濃度に維持する工程は少なくとも１時間で１２時間以下の間、５０℃〜６５℃の温度に維持することを含む、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
除菌された高塩濃度ヒアルロン酸溶液を、バッファー成分を含む水溶液と混合し、ｐＨを６．４〜７．２に調節することをさらに含み、そしてその２つの水溶液を混合することにより、除菌された高塩濃度ヒアルロン酸溶液は少なくとも１０倍に希釈される、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記バッファー成分はホウ酸及びホウ酸ナトリウムを含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
除菌された高塩濃度ヒアルロン酸溶液はｐＨが６．４〜７．２である、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
除菌された高塩濃度ヒアルロン酸溶液はヒアルロン酸の濃度が０．１５質量％〜０．６質量％であり、そして塩化ナトリウムが４質量％〜１６質量％である、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
前記除菌フィルタ媒体はポリフッ化ビニリデンフィルタ媒体カートリッジである、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
除菌された高塩濃度ヒアルロン酸溶液を、ホウ酸、ホウ酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムからなる群より選ばれるバッファー成分を含む水溶液と混合し、ｐＨを６．４〜７．２に調節することをさらに含み、そしてその２つの水溶液を混合することにより、除菌された高塩濃度ヒアルロン酸溶液は少なくとも５倍に希釈される、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
混合された水溶液は防腐有効量で安定化塩素をさらに含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
混合された水溶液は０．５ｐｐｍ〜２．０ｐｐｍで存在するポリ（ヘキサメチレンビグアニド）、又は、０．５ｐｐｍ〜３ｐｐｍで存在するα−[４−トリス（２−ヒドロキシエチル）−アンモニウムクロリド−２−ブテニル]ポリ[１−ジメチルアンモニウムクロリド−２−ブテニル]−ω−トリス（２−ヒドロキシエチル）アンモニウムクロリドをさらに含む、請求項１２又は１３記載の方法。
【請求項１５】
重量平均分子量が０．６ＭＤａ〜３．６ＭＤａであるヒアルロン酸を０．０４質量％〜０．８質量％の量で含み、イオン強度が４質量％〜１８質量％の塩化ナトリウムである塩化ナトリウム水性濃度と等価であり、フィルタ除菌されている、無菌化水溶液。
【請求項１６】
０．１質量％〜０．４質量％のヒアルロン酸を含み、そして８質量％〜１６質量％の塩化ナトリウムを含む、請求項１５記載の水溶液。
【請求項１７】
前記ヒアルロン酸は重量平均分子量が０．８ＭＤａ〜２．２ＭＤａである、請求項１５又は１６記載の水溶液。
【図１】
【公表番号】特表２０１３−５１８９２６（Ｐ２０１３−５１８９２６Ａ）
【公表日】平成２５年５月２３日（２０１３．５．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５５２８９３（Ｐ２０１２−５５２８９３）
【出願日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２２６５６
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／１００１１４
【国際公開日】平成２３年８月１８日（２０１１．８．１８）
【出願人】（５０６０７６６４０）ボーシュ アンド ローム インコーポレイティド (99)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年５月２３日（２０１３．５．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２２６５６
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／１００１１４
【国際公開日】平成２３年８月１８日（２０１１．８．１８）
【出願人】（５０６０７６６４０）ボーシュ アンド ローム インコーポレイティド (99)
【Ｆターム（参考）】
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