特定微生物の検出及び定量方法
材料の試料における特定の種類の微生物の存在を確認して定量するための方法および組成物を開示する。最確数および連続希釈法において増殖した培養物中の特定の微生物の存在を確認するために、ハイブリダイゼーションおよびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の手法を、ブランクおよび対照試料を用いた手法のカリブレーションの後に、適用する。例えば、飼料中に存在する特定のプロバイオティック微生物の量を決定するために、動物飼料の試料を培養し、分析することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は参照により本明細書に組み込まれる「動物飼料中の微生物の検出方法」と題された２００３年８月２９日出願の米国特許仮出願第６０／４８１３１２号の利益を主張する。本出願は「動物飼料中のプロバイオテクスの分析」と題された２００３年４月１５日に受領された開示文書５２９７３３に関連する。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、動物飼料のような材料の試料における特定の微生物の検出および定量のために有用な材料および方法に関する。本方法は微生物を培養すること、および、目的の特定の微生物を検出するためにオリゴヌクレオチドプライマーを使用することを含む。
【０００３】
（背景技術）
微生物はしばしば、栄養補給のため、消化改善のため、所望の栄養分の取り込みを増大させるため、望ましくない、または有害な微生物と競合するため、および種々の他の理由のために動物飼料に添加される。典型的には、肥育場または乳製品製造所のような動物飼料が動物により消費される場所において、微生物を動物飼料に添加する。例えば参照により本明細書に組み込まれる「反芻動物による食糧の利用性を改善するための方法」と題された１９９６年７月９日登録のＷａｒｅらへの米国特許第５，５３４，２７１号、および参照により本明細書に組み込まれる「反芻動物による食糧の利用性を改善するための組成物」と題された１９９６年６月２５日登録のＧａｒｎｅｒらへの米国特許第５，５２９，７９３号を参考にできる。「プロバイオティック（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ）」および「直接供給微生物（ＤＦＭ）」という用語は動物飼料に添加される有益微生物に言及する場合に使用される場合が多い。
【０００４】
関連する問題点の１つは、添加した微生物の存在を確認又はその濃度を定量する必要性である。殆どの既存の方法は処理した飼料から得られた試料の直接または間接的な培養に依存している。これらの方法は、多くは極めて高濃度の他の微生物の存在により妥協を余儀なくされる場合が多い。更にまた、多くの微生物は伝統的な培地中で培養されると外観が同様になり、同定と定量を更に複雑化している。
【０００５】
即ち、処理した動物飼料を分析する進歩した方法、すなわち理想的には、所望の微生物の特定の菌株の存在を確認できる方法が必要とされている。
【０００６】
（発明の開示）
試料の培養とオリゴヌクレオチドプライマーの使用を組み合わせた方法を開示する。オリゴヌクレオチドプライマーは直接の検出方法において使用できるか、または、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような方法において使用できる。これらの方法は、動物飼料中の所望のプロバイオティック微生物を確認し、定量するために有用である。
【０００７】
１つの態様によれば、本発明は材料の試料における特定の種類の微生物の存在を定量する方法を提供する。この方法は、（ａ）特定の種類の微生物の培養物が増殖するのに適した条件下で試料を培養する工程；（ｂ）培養した試料の各区分における特定の種類の微生物の存在または非存在を検出するために、少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドを使用する工程；および、（ｃ）培養した試料の各区分における特定の種類の微生物の検出された存在または非存在から、材料の試料中の特定の種類の微生物の存在を定量する工程、を含む。
【０００８】
別の態様によれば、本発明は材料の試料における特定の種類の微生物の存在を定量する方法を提供する。この方法は、（ａ）試料を複数の区分に分割する工程；（ｂ）特定の種類の微生物が増殖するのに適した条件下で試料の各区分を培養する工程；（ｃ）特定の種類の微生物の核酸と選択的にハイブリダイズする２種類のオリゴヌクレオチドプライマーに試料の各培養した区分を順次反応させてポリメラーゼ連鎖反応過程を実施することにより、試料の各培養した区分から各反応産物を産生する工程；（ｄ）試料の各培養した区分の反応から特徴的な長さを有する反応産物の存在または非存在を検出する工程；および、（ｅ）試料の各培養した区分の反応から特徴的な長さを有する反応産物の検出された存在または非存在から、材料の試料における特定の種類の微生物の存在を定量する工程、を含む。
【０００９】
更に別の態様によれば、本発明は動物飼料中のプロバイオティック微生物の検出のための方法を提供する。この方法は、動物飼料とプロバイオティック微生物とを接触させることにより処理した動物飼料を作製する工程；処理した動物飼料の試料を採取する工程；プロバイオティック微生物が増殖するのに適した条件下で試料を培養する工程；２種類のＰＣＲプライマーを用いながら培養した試料に対してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施して、ＰＣＲ産物を生成する工程；ＰＣＲ産物を分析してＰＣＲ反応の結果を得る工程；および、ＰＣＲ反応の結果を動物飼料中のプロバイオティック微生物の存在または非存在と相関付ける工程、を含む。
【００１０】
更に別の態様によれば、本発明は動物飼料中のプロバイオティック微生物の検出のための方法を提供する。この方法は、動物飼料とプロバイオティック微生物とを接触させることにより、処理した動物飼料を作製する工程；処理した動物飼料の試料を採取する工程；プロバイオティック微生物が増殖するのに適した条件下で、試料を培養することにより培養物を作製する工程；培養物から核酸を得る工程；ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド−核酸の形成のために適する条件下でオリゴヌクレオチドに核酸を接触させること；ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド−核酸を検出して、ハイブリダイゼーションの結果を得る工程；および、ハイブリダイゼーションの結果を動物飼料中のプロバイオティック微生物の存在または非存在と相関付ける工程、を含む。
【００１１】
（配列の簡単な説明）
以下の詳細な説明の後の配列リストは本明細書の部分を構成し、そして本発明の特定の態様を更に明らかにするために含まれる。本発明は本明細書に示した特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせてこれらの配列１つ以上を参考にすることにより、更に良好に理解される。
【００１２】
配列番号１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）は、オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーＬａｃｔｏＧ５Ｒ（１８ヌクレオチド（ｎｔ））である。
【００１３】
配列番号２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）は、オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーＬＡ５１特異的Ｇ４Ｒ（１８ヌクレオチド）である。
【００１４】
配列番号３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）は、配列番号２がハイブリダイズするオペロンＩＴＳ標的ｒＲＮＡ配列である。
【００１５】
（発明を実施するための最良の形態）
動物飼料に添加されている望ましい微生物の存在を確認して定量する現在使用されている方法は、「プレート計数」または「ｃｆｕ（コロニー形成単位）」計数の計算をもたらすペトリ皿上に産生された培養物のみに依存している。これらの方法は不正確であり、ペトリ皿上に増殖すると目視上は同様または同一に見える同様の型の微生物を識別できない。
【００１６】
本発明の種々の実施形態は、動物飼料中の微生物を直接または間接的に検出して定量するためにオリゴヌクレオチドを使用する。
【００１７】
本発明の態様は、動物飼料中の望ましい微生物の存在を正確に確認して定量するためのＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法の使用に関する。本発明の別の態様は、目的の微生物１またはそれ以上に由来する特徴的なＤＮＡまたはＲＮＡ配列へのオリゴヌクレオチドプライマーのハイブリダイゼーションと、その後のハイブリダイズしたプライマーの検出および／または定量に関する。
【００１８】
本発明の１つの実施形態は、動物飼料中のプロバイオティック微生物の検出のための方法に関し、その方法は、動物飼料とプロバイオティック微生物とを接触させることにより処理した動物飼料を作製する工程；処理した動物飼料の試料を採取する工程；プロバイオティック微生物が増殖するのに適した条件下で液体培地中で試料を培養する工程；培養した試料から核酸を得る工程；ハイブリダイゼーションに適する条件下で核酸にオリゴヌクレオチドを接触させる工程；ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド−核酸の存在または非存在を検出してハイブリダイゼーションの結果を得る工程；および、ハイブリダイゼーションの結果を動物飼料中のプロバイオティック微生物の存在または非存在と相関付ける工程、を含む。ハイブリダイゼーションの結果は定性的または定量的でありえる。この方法は更に、ハイブリダイゼーション工程の前に、核酸を増幅することを含む。オリゴヌクレオチドは、検出されるべきために放射性、蛍光性であり、レポーター酵素、またはその他の適用物と共有結合であり得る。前記オリゴヌクレオチドは、好ましくは、他の微生物には存在しないがプロバイオティック微生物中には存在する特徴的な核酸配列に、ハイブリダイズする。前記核酸は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡでありえる。前記オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡまたは他のＤＮＡ合成類縁体でありえる。
【００１９】
本発明の別の実施形態は、動物飼料中のプロバイオティック微生物の検出のための方法に関し、その方法は、動物飼料とプロバイオティック微生物とを接触させることにより処理した動物飼料を作製する工程；処理した動物飼料の試料を採取する工程；プロバイオティック微生物が増殖するのに適した条件下で液体培地中の試料を培養する工程；第１のＰＣＲプライマーおよび第２のＰＣＲプライマーを用いながら培養した試料に対してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施することにより、ＰＣＲ産物を生成する工程；ＰＣＲ産物を分析してＰＣＲ反応の結果を得ること；および、前記ＰＣＲ反応の結果を、動物飼料中のプロバイオティック微生物の存在または非存在と相関付ける工程、を含む。
【００２０】
前記動物飼料は一般的に何れかの型の動物飼料であってよい。動物飼料の例は、乳牛用飼料、肉牛用飼料、肥育用ウシ、ドッグフード、キャットフード、ラビットフード、動物園用動物飼料、雌ウシ用飼料、ニワトリ飼料、ウマ飼料、ブタ飼料、シチメンチョウ飼料、ラム飼料、シカ飼料、バッファロー飼料、ワニ飼料、ヘビ飼料および魚類用飼料を含む。
【００２１】
プロバイオティック微生物は、一般的に、動物飼料に添加するか、または直接もしくは他の手段により動物に投与することが望まれる何れかのプロバイオティック微生物であってよい。このようなプロバイオティック微生物の例は、バチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・アニマリス(Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｉｍａｌｉｓ)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｕｄｕｍ)、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ)、ビフィドバクテリウム・サーモフィラム(Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ)、ラクトバチルス・アシドフィルス(Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ)、ラクトバチルス・アギリス(Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｇｉｌｉｓ)、ラクトバチルス・アラクトサス(Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌａｃｔｏｓｕｓ)、ラクトバチルス・アリメンタリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｉｍｅｎｔａｒｉｕｓ）、ラクトバチルス・アミロフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・アミロボランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｖｏｒａｎｓ）、ラクトバチルス・アミロボルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ）、ラクトバチルス・アニマリス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｉｍａｌｉｓ）、ラクトバチルス・バタタス(Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｔａｔａｓ)、ラクトバチルス・ババリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｖａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・ビフェルメンタンス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、ラクトバチルス・ビフィダス(Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｉｆｉｄｕｓ)、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・ブクネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉｉ）、ラクトバチルス・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・カテナフォルメ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｔｅｎａｆｏｒｍｅ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・セロビサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・コリノイデス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｌｌｉｎｏｉｄｅｓ）、ラクトバチルス・コンフサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｎｆｕｓｕｓ）、ラクトバチルス・コプロフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｐｒｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・コリニフォルミス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ）、ラクトバチルス・コリノイデス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｒｙｎｏｉｄｅｓ）、ラクトバチルス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバチルス・クルバタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ）、ラクトバチルス・デルブルエキ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・デシジオサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｓｉｄｉｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・ダイバージェンス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ）、ラクトバチルス・エンテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｅｎｔｅｒｉｉ）、ラクトバチルス・ファルシミニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ）、ラクトバチルス・フェルメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・フリギダス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｉｇｉｄｕｓ）、ラクトバチルス・フルクチボランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｉｖｏｒａｎｓ）、ラクトバチルス・フルクトサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス・ハロトレランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ラクトバチルス・ヘルベチカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・ヘテロヒオキ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｔｅｒｏｈｉｏｃｈｉｉ）、ラクトバチルス・ヒルガルディ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｉｌｇａｒｄｉｉ）、ラクトバチルス・ホルドニエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｏｒｄｎｉａｅ）、ラクトバチルス・イヌリナス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｕｌｉｎｕｓ）、ラクトバチルス・ジェンセニ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｅｎｓｅｎｉｉ）、ラクトバチルス・ジュグルチ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｕｇｕｒｔｉ）、ラクトバチルス・カンドレリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋａｎｄｌｅｒｉ）、ラクトバチルス・ケフィア（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒ）、ラクトバチルス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチルス・レイヒマニ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｉｃｈｍａｎｎｉｉ）、ラクトバチルス・リンドネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｎｄｎｅｒｉ）、ラクトバチルス・マレフェルメンタンス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｌｅｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、ラクトバチルス・マリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｌｉ）、ラクトバチルス・マルタロミカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｌｔａｒｏｍｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・ミナー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｉｎｏｒ）、ラクトバチルス・ミナツス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｉｎｕｔｕｓ）、ラクトバチルス・モビリス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）、ラクトバチルス・ムリナス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｕｒｉｎｕｓ）、ラクトバチルス・ペントサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｎｔｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・シュードプランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ルテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・ロゴサ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｏｇｏｓａｅ）、ラクトバチルス・トレランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｏｌｅｒａｎｓ）、ラクトバチルス・トルケンス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｏｒｑｕｅｎｓ）、ラクトバチルス・ラミニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｕｍｉｎｉｓ）、ラクトバチルス・サケ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトバチルス・サンフランシスコ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｏ）、ラクトバチルス・シャーピー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｈａｒｐｅａｅ）、ラクトバチルス・トリコデス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｄｅｓ）、ラクトバチルス・バクシノステルカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖａｃｃｉｎｏｓｔｅｒｃｕｓ）、ラクトバチルス・ビリデセンス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｉｒｉｄｅｓｃｅｎｓ）、ラクトバチルス・ビツリナス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｉｔｕｌｉｎｕｓ）、ラクトバチルス・キシロサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｙｌｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・ヤマナシエンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｙａｍａｎａｓｈｉｅｎｓｉｓ）、ラクトバチルス・ザエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｚｅａｅ）、ペジオコッカス・アシドラクチシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｌａｃｔｉｃｉ）、ピデオコッカス・ペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）、ストレプトコッカス・クレモリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、ストレプトコッカス・ジセチラクチス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｉｓｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ）、ストレプトコッカス・フェシウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、ストレプトコッカス・インタメヂウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）、ストレプトコッカス・ラクティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトコッカスおよび大腸菌を含む。乳酸利用微生物の別の群はプロピオニバクテリウム・フロインデンライヒ(Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ)、プロピオニバクテリウム・シェルマニ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｈｅｒｍａｎｉｉ）、プロピオニバクテリウム・ジェンセニ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｊｅｎｓｅｎｉｉ）、プロピオニバクテリウム・アシジプロピオニシ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉ）、プロピオニバクテリウム・ソエニ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｏｅｎｉｉ）、プロピオニバクテリウム、メガスフェラ・エルスデニ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｅｌｓｄｅｎｉｉ）、セレノモナス・ルミナチウム（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ ｒｕｍｉｎａｔｉｕｍ）およびペプトストレプトコッカス・アサッカロリティカス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）を包含する。プロバイオティック微生物の１つの特定の例は、ラクトバチルスの種、例えばラクトバチルス・アシドフィルスまたはラクトバチルス・ＬＡ５１である。ＬＡ５１株は天然に存在する菌株である。ＬＡ５１株の供給はオクラホマ大学のＳｔａｎｌｅｙ Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ教授により維持されており、試料はオクラホマ大学の許託のもとに供与されている。
【００２２】
本明細書に記載した方法はまた、動物飼料、人間が消費する食品、土壌、水、植物、動物の皮革および皮膚、動物の消化管、堆肥および糞中の有害または望ましくない微生物の存在を検出して定量するためにも使用できる。有害または望ましくない微生物は、大腸菌属、サルモネラ属、赤痢菌属、カンピロバクター属、クロストリジウム属、ミコバクテリウム属、エルシニ属、バチルス属、ビブリオ属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、アエロモナス属、クレブシエラ属、エンテロバクター属、プロテウス属、シトロバクター属、アエロバクター属、およびセラチア属を含む。
【００２３】
培養工程は、好ましくは目的のプロバイオティック微生物の増殖に好都合な条件下で実施する。異なる微生物は異なる最適温度、培地およびｐＨ条件を有する。例えばラクトバチルス・アシドフィルスは約３５℃およびｐＨ約５．５の嫌気性環境下で良好に増殖する。
【００２４】
第１のＰＣＲプライマーおよび第２のＰＣＲプライマーは、好ましくはプロバイオティック微生物中に存在する唯一の特定の核酸配列にハイブリダイズするように選択される。前記特定の核酸配列は、好ましくは動物飼料中に通常見られる他の微生物中には存在しない。特定のＰＣＲプライマー長および配列は核酸配列により異なる。一般的に、ＰＣＲプライマーは約１０ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチド長である。例えばプライマーは１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５またはそれ以上のヌクレオチド長、少なくとも３５ヌクレオチドであってよい。第１および第２のＰＣＲプライマーは、同じ長さを有することができ、或いは、異なる長さである。ＰＣＲプライマーは好ましくは特定の核酸配列へのハイブリダイゼーションを妨害する可能性がある明らかな二次構造は有さない。また、ＰＣＲプライマーは好ましくは誤ハイブリダイゼーションをもたらす可能性のある多数の繰り返し配列を有しない。第１のＰＣＲプライマーおよび第２のＰＣＲプライマーは、特定の核酸配列に対するよりもむしろそれらが相互にハイブリダイズするような相補性の領域を有しないことが好ましい。
【００２５】
分析工程は、様々なよく知られた分子生物学的手法により実施してよい。これらの方法はアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動および液体クロマトグラフィーを包含する。これらの方法は電気泳動結果の顕微鏡画像化のような画像化技術を含んでよい。
【００２６】
相関付けの工程は動物飼料の試料をプロバイオティック微生物の既知量を投与してある試料と比較することを含む。相関付け工程はまた、対照「ブランク」試料に動物飼料試料を比較することも包含できる。相関付け工程は、「有／無」結果を与える定性的なもの、または動物飼料中に存在するプロバイオティック微生物の濃度を計算する定量的なものであることができる。
【００２７】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を説明するために記載した。当業者の知る通り、以下の実施例に開示する手法は本発明の実施において良好に機能することを本発明者等が発見した手法を示しており、従って、その実施のための好ましい様式を構成するものと考える。しかしながら、当業者の知る通り、本発明の開示に鑑みれば、本発明の範囲を外れることなく多くの変更が開示された特定の実施形態において可能であり、そしてなお同様の結果が得られる。
【００２８】
（実施例）
実施例１：動物飼料の採取
動物飼料の分析において重要な最初の工程は、具体的な試料を採取することである。多くの適する方法が設計されている中で、以下のものが有効であることがわかっている。
【００２９】
各々約５００ｇの試料１０点を採取する。試料を滅菌ビニール袋内に入れ、密封する。前記袋に、試料採取の日付と時間および動物飼料に添加したプロバイオティックの量（典型的には飼料トン当たり）を記載する。試料を無作為に、飼料内に分散した材料から採取する。例えば飼料１０，０００ポンドの積荷は１回に各１０００ポンドを採取し合計１０試料とする。前記プロバイオティックが光、熱または空気に対して感受性であることがわかっているか、疑われる場合は、前記試料は飼料蓄積物の「内部」から採取しなければならない。
【００３０】
同じ数量の対照試料をプロバイオティックを投与していない同じ型の試料から採取する。対照試料は、生物のバックグラウンド量を測定するために有用である。試料の採取および取り扱いの装置が対照試料を汚染しないように留意する。
【００３１】
試料は隔離された冷却機内に保存し、可能な限り迅速に試験実験室に送達する。試料を輸送用培地、例えばＬＢＳブロスに入れ、試験実験室への輸送の間に微生物の増殖が抑制されるのに十分冷涼な温度、例えば４℃に維持する。
【００３２】
実施例２：培地
液体または固体の培地は、プロバイオティックの増殖に適するように選択しなければならない。例えばプロバイオティックであるラクトバチルスＬＡ５１について試験する場合は、ＬＢＳブロスおよびＬＢＳ寒天を製造元のプロトコルに従って使用してよい。ＬＢＳは広範な製造元、例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）およびＡｌｐｈａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）から入手できる。Ａｌｐｈａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手したＬＢＳは２５℃でｐＨ５．５±０．２であり、以下の成分、即ちカゼイン消化ペプトン（１０．０ｇ／ｌ）、デキストロース（２０．０ｇ／ｌ）、酵母エキス（５．０ｇ／ｌ）、酢酸ナトリウム（２５．０ｇ／ｌ）、リン酸１カリウム（６．０ｇ／ｌ）、ツイーン８０（１．０ｇ／ｌ）、硫酸第１鉄（０．０３４ｇ／ｌ）、クエン酸アンモニウム（２．０ｇ／ｌ）、硫酸マグネシウム（０．５７５ｇ／ｌ）、硫酸マンガン（０．１２ｇ／ｌ）および寒天（固体培地の場合、１５．０ｇ／ｌ）を含有する。
【００３３】
実施例３：プロバイオティックのＬＢＳプレーティング
試料１０ｇを蒸留水中０．１％ペプトン９０ｍｌに添加する。混合物を３０回混合シリンダー中で振とうする。前記混合物を１０分間放置する。これを１０１希釈（−１ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）とする。
【００３４】
複数の連続希釈は、ＬＢＳプレート上のコロニー増殖を計数するのに都合の良い数になるように、必要に応じて行なう。例えば１０１、１０２、１０３、１０４、１０５および１０６希釈を行うことができる。使用するプレートの大きさに応じて、少容量の希釈物を培養用プレート表面全体に均一に広げる。典型的には、０．１〜１ｍｌの液体を使用する。プレートは、単独または集計用に重複して調製できる。
【００３５】
プレートを被覆し、３５℃で４８時間嫌気性環境中で培養する。プレート上の菌数を測定する。典型的にはプレート当たり３０〜３００個が適当である。プレート由来の複数のコロニーを顕微鏡で観察してよい。典型的にはプレート当たり約５コロニーを観察する。コロニーの色および形状を記録する。プロバイオティックであるラクトバチルスＬＡ５１の場合は、コロニーは白色で丸型の外観を示すはずである。
【００３６】
グラム染色試験用のスライドを調製する。ＬＡ５１コロニーはグラム陽性と評価されなければならず、そして生物は丸まった棒状物の外観を呈する。
【００３７】
実施例４：動物飼料への標準物質の添加
対照飼料を自己溶解させ、室温に放冷する。処理した飼料への添加と同様に、同じ濃度のプロバイオティックを冷却した飼料に添加する。プロバイオティックを１０分間飼料中に浸積させる。処理した飼料１０ｇを前記実施例に記載した通り蒸留水中０．１％ペプトン９０ｍｌに添加する。これらの試料の連続希釈、培養、プレーティングおよび分析は実施例３に記載のものと同じ方法で実施する。
【００３８】
実施例５：処理した飼料由来のプロバイオティックの培養
蒸留水中０．１％ペプトン２．２５Ｌを混合シリンダーに添加する。２５ｇ飼料１０区分を１０試料袋の各々から１つずつ添加する。混合ボールを添加し、シリンダーを６０秒間振とうする。これを１０１希釈とする。混合物を１０分間放置する。これらの試料の連続希釈、培養、プレーティングおよび分析は実施例３に記載のものと同じ方法で実施する。
【００３９】
実施例６：対照飼料からのプロバイオティックの培養
実施例３の操作法を用いて対照飼料試料を処理する。これは未処理の飼料中に存在するバックグラウンド微生物の指標となる。
【００４０】
実施例７：試料のＰＣＲ分析
前記実施例を用いて動物飼料中に存在するプロバイオティックの「予測（ｐｒｅｓｕｍｅｄ）」ｃｆｕを得る。しかしながら多くの生物が、プロバイオティックと同様または同一の外観を有するため、プロバイオティックのｃｆｕが過剰計数されるかもしれない。更にまた、プロバイオティックまたは動物飼料投与物の他の成分の存在が非プロバイオティック生物の増殖を促進または抑制する場合があり、分析を更に複雑化している。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析の手法を用いることにより、動物飼料試料中の特定のプロバイオティックの存在の明確な証拠が得られる。
【００４１】
ＰＣＲは、試料中の特定のＤＮＡ配列の存在（または非存在）に関して試験するものである。ＰＣＲは、生存中の生物から得られたＤＮＡと死亡または非生存性の生物から得られたＤＮＡとの間を識別しない。従って、前記の実施例に記載した連続希釈培養は試料中の生存中生物から得られた「シグナル」を増幅するために使用することができる。非生存性の生物の量は潜伏期の後の生存性生物の僅かの比率となり、従って、その後のＰＣＲ分析において影響は小さい。
【００４２】
ＰＣＲはプレート上または液体培養物試料中に増殖している特定のコロニーに対して実施できる。少量のコロニーを、爪楊枝またはマイクロピペット先端を用いて、ＰＣＲ反応物に添加することができる。液体培地（例えば１μｌ）の少容量をＰＣＲ反応に直接添加できる。何れの型の試料も多量すぎるとＰＣＲ反応を抑制することがある。ＰＣＲ反応に添加するべき試料は、発酵産物を除去するために遠心分離および蒸留水洗浄を行なってよい。
【００４３】
実施例８：ＰＣＲ反応試料の調製
プロバイオティックのＤＮＡ配列をＰＣＲを用いて増幅できるように選択する。理想的には、特定のＤＮＡ配列は動物飼料中に通常見られる微生物のなかで独特のものであり、従ってその試料中のプロバイオティックの存在または非存在に対して特有の「マーカー」として作用するであろう。本実施例においては、オペロンＩＴＳ標的ｒＲＮＡ配列を選択した（配列番号３）。
【００４４】
各２５μｌの反応物について、以下の成分、即ち、Ｈｏｔｓｔａｒ Ｔａｑ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）１２．５μｌ、プライマーＬａｃｔｏ Ｇ４Ｒ １μｌ（μｌ当たり５０ｎｇ；５’−ＡＡＣ ＧＣＧ ＧＴＧ ＴＴＣ ＴＣＧ ＧＴＴ−３’（配列番号１））、ＬＡ５１特異的プライマー１μｌ（μｌ当たり５０ｎｇ；５’−ＣＣＴ ＧＣＡ ＣＴＴ ＴＡＴ ＣＴＡ ＴＣＧ−３’（配列番号２））および蒸留水９．５μｌを混合する。プライマー配列番号１はラクトバチルスに適合する一般化された配列であることから選択した。（配列番号１は配列番号３中のヌクレオチド５６３〜５４６の逆ヌクレオチド配列に相補である。）プライマー配列２は、ｒＲＮＡの１６Ｓと２３Ｓの領域の間に位置する内部転写スペーサー（ＩＴＳ）上のＬＡ５１配列にハイブリダイズするように設計されている。（配列番号２は配列番号３中の３４２〜３５９ヌクレオチド由来のヌクレオチド配列である。）
試料（１μｌの液体培養物、または、少量のコロニー物質）をＰＣＲ反応に添加し、混合する。陽性および陰性対照の試料も調製する。
【００４５】
ＰＣＲ反応試験管をサーモサイクラーＰＣＲ装置に入れ、適当な時間および温度プログラムを用いて処理する。前記プライマーについては、以下のプログラム、即ち、（９４℃の変性を３０秒間、５４℃のアニーリングを３０秒間、そして、７２℃の重合を１分間）を３２サイクル、次に７２℃で１０分、そして４℃保存が有効である。
【００４６】
ＰＣＲ産物は水平アガロースゲル電気泳動により容易に分析される。臭化エチジウムを１ｍｌ当たり０．１μｌ含有する１ｘＴＡＥ緩衝液中で調製した１．７５％アガロースゲルを用いてよい。前記したＰＣＲ反応のためには、反応混合物８μｌを５ｘローディング緩衝液（ブロモフェノールブルーマーカーを含有）２μｌと混合し、アガロースゲル中でウェル内に添加する。サイズ標準物質（例えば制限酵素ＨａｅＩＩＩで切断したｐｈｉＸ１７４ＤＮＡ）を前記ゲルの１レーンに添加する。ゲルを２５〜５０ボルトで泳動する。電気泳動の進行はゲル中のブロモフェノールブルーのバンドの目視検査によりモニタリングする。ＤＮＡバンドは、ＵＶ光源を用いて可視化する。プライマー配列番号１および２を用いたプロバイオティックであるラクトバチルスＬＡ５１由来のＤＮＡのＰＣＲ分析により、約２２５ｂｐの単一のバンドが得られる。
【００４７】
標準物質の種々の既知濃度を用いたＰＣＲ反応物を用いて、培養物中のプロバイオティックの濃度を定量することができる。これを連続希釈度と組み合わせて使用することにより、動物飼料中のプロバイオティックの濃度を定量することができる。
【００４８】
実施例９：試験結果の解釈
動物飼料をプロバイオティックであるラクトバチルスＬＡ５１の２．０ｘ１０１０〜２．６ｘ１０１０ｃｆｕ／ｇで処理することができる。以下の結果が、前記実施例に記載した方法を用いることにより推定される。最確数（Ｍｏｓｔ Ｐｒｏｂａｂｌｅ Ｎｕｍｂｅｒ）（ＭＰＮ）は連続希釈の観察に基づいて低濃度の生物を推定する方法である（Ｃｏｃｈｒａｎ，Ｗ．Ｇ．１９５０．Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｄｅｎｓｉｔｉｅｓ ｂｙ ｍｅａｎｓ ｏｆ ｔｈｅ “Ｍｏｓｔ Ｐｒｏｂａｂｌｅ Ｎｕｍｂｅｒ”， Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ ６：１０５−１１６；Ｊａｍｅｓ Ｔ．Ｐｅｅｌｅｒ ａｎｄ Ｆｏｓｔｅｒ Ｄ．Ｍｃｃｌｕｒｅ；Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ， ＵＳＦＤＡ，７版，１９９２）。
【表１】
【００４９】
ＬＡ５１を含有する対照飼料は大部分が汚染されているように観察された。
【００５０】
実施例１０：例示される試験結果
動物飼料をプロバイオティックであるラクトバチルスＬＡ５１の２．０ｘ１０１０ｃｆｕ／ｇで処理した。プロバイオティックを５．５時間飼料に接触させた後に試料を採取した。以下の計数値が求められ、これら全ては、推定された範囲内であることがわかった。
【表２】
【００５１】
次に試料を顕微鏡を用いて、グラム染色により観察した。
【表３】
【００５２】
対照飼料および処理した飼料は、同様の水準の推定ＬＡ５１計数値および同様の観察生物を含んでいた。しかしながら、増幅したＰＣＲ産物を観察することにより、処理した飼料のみがＬＡ５１を含んでいた。推定された生物の約４３％が混合ボールの使用により飼料から抽出された。これにより、ＬＡ５１の陽性識別が可能となり、そして生物の含量の推定範囲内の水準が確認された。推定生物の僅か４３％が低値であると思われるが、推定生存生物の１００％を得ることは幾分現実的ではない。前記１０％を超えた回収は、何れも測定を推定計数値の同じ対数内とするものである。
【００５３】
前記した実施例は、動物飼料中の特定の種類の微生物の検出および定量を示しているが、これらの実施例において使用された方法を、他の種の材料の試料における特定の微生物を検出および定量することに適合させることができることを、理解すべきである。前記方法は、動物飼料における特定の病原体を検出および定量するために用いることでき、または、動物の堆肥中または消化管中の特定の微生物を検出するために使用できる。前記方法は、食品、水および空気中の特定の微生物を検出および定量するために使用できる。前記方法は発芽または伝染のために特殊な条件を有する特定の微生物を検出および定量するために使用できる。前記方法はまた、他の点においては一般的または良性である微生物であって特定の有毒または接触伝染性である天然または生命工学による突然変異株を検出して定量するために使用される。
【００５４】
図１は前記実施例の多くにおいて適用された方法の概要を示している。この方法は、試料の自動化処理、および放射性のマーカーまたはプローブを使用しない目的の特定の種類の微生物の低濃度の定量に適している。第１工程１０１においては、材料の具体的な試料を採取する。前記試料は、使用または消費されるべき大部分の材料が典型的なものとなるように採取しなければならない。例えば動物飼料の場合、肥育場または乳製品製造所のような材料の大半が使用または消費される時間および場所に近似するように、前記試料を採取する。
【００５５】
工程１０２においては、後の工程（１０７）においてかなりの数量の試料培養区分が目的の特定の種類の微生物の非存在を示すように希釈する。工程１０２は特定の種類の微生物の初期濃度が十分低値である場合には省略してよい。
【００５６】
工程１０３においては、希釈試料を複数の区分に分割する。工程１０４においては、希釈試料の各区分をその微生物の増殖に適した条件下で培養する。工程１０５においては、ＰＣＲ過程は、微生物のＤＮＡと選択的にハイブリダイズする２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、各培養区分を順次反応させることにより実施される。
【００５７】
各培養区分に対して使用すべきＰＣＲ増幅サイクル数は、試料当たり少数の微生物を各々含有する標準試料を調製すること、および、広範なサイクル範囲にわたるそれぞれのサイクル数を用いて、標準試料に対してＰＣＲ増幅を実施することにより選択できる。（工程１０６のような電気泳動検出によって）陽性表示が得られる地点を最小サイクル数とすべきである。陽性表示がもはや無効となる地点を最大サイクル数としてよい。各培養区分に対して使用するサイクル数はこれらの最少数から最大数の間の平均でなければならない。ＰＣＲ過程のこのカリブレーションはまた、採取されるべき材料または採取されるべき材料中の競合微生物の作用を補うようＰＣＲサイクル数を調節するために、採取すべき滅菌されたか滅菌されていない多数の材料に、既知量の微生物を添加することにより調製された標準試料に対しても実施できる。
【００５８】
工程１０６においては、希釈試料の各区分に由来するＰＣＲ反応産物に対して電気泳動を実施することにより、特徴的長さを有する反応産物の存在または非存在を検出する。
【００５９】
工程１０７においては、希釈試料の各区分について、特徴的長さを有するＰＣＲ反応産物の存在または非存在が特定の種類の少なくとも１種類の微生物の存在または非存在を示すことを仮定することにより、試料中の特定の種類の微生物の最確数を決定する。特定の種類の少なくとも１種類の微生物を有すると示された希釈試料の区分の数は、培養前の試料の区分中の特定の種類の微生物の数の下限である。
【００６０】
試料中の特定の種類の微生物が試料の区分内で無作為に分布していると仮定することにより、特定の種類の少なくとも１つの微生物を有するものとして示された試料区分の数から、初期に試料中にあった特定の種類の微生物の最確数を決定することができる。更にまた、試料の採取元である大半の材料に由来する試料の無作為の変動を考慮した信頼限界を得ることもできる。
【００６１】
例えばＮ＝３、５、８および１０試料区分の場合につき陽性表示の特定の数を与えられた微生物の最確数および上および下の９５％信頼限界は、Ｒｏｂｅｒｔ ＢｌｏｄｇｅｔｔによるＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ Ｏｎｌｉｎｅ， Ｊａｎｕａｒｙ ２００１， 付録２， Ｍｏｓｔ Ｐｒｏｂａｂｌｅ Ｎｕｍｂｅｒ ｆｒｏｍ Ｓｅｒｉａｌ Ｄｉｌｕｔｉｏｎにおいて、合衆国連邦薬品管理局のＣｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｆｏｏｄ Ｓａｆｅｔｙ ＆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ のインターネットウエブサイト（ｃｆｓａｎ．ｆｄａ．ｇｏｖ）上に公開されている。
【表４】
【００６２】
連続希釈を工程１０２において実施し、そして工程１０３〜１０６は一連の希釈物の各々に対して実施し得る。試料中の特定の種類の微生物の最確数は、表からの一連の希釈物の各々に対して求めることができ、そして、最も良好な信頼限界を有する最確数を、試料中の特定の種類の微生物の最確数として選択できる。前記引用したＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ Ｏｎｌｉｎｅ， Ｊａｎｕａｒｙ ２００１， 付録２もまた一連の種々の連続希釈物からの表示の組み合わせに基づいて最確数を決定できるようにする。
【００６３】
前記した通り、試料について決定した特定の種類の微生物の最確数を、既知量の特定の微生物の試料について求めた数に対して、そして、特定の微生物を全く有さないことがわかっている対照試料と、対比させることができる。既知量の試料および対照試料はハイブリダイゼーションおよびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の手法が、実際に最確数および連続希釈法において増殖している特定の微生物の存在を検出していることを確認できる。
【００６４】
本明細書および請求項に開示した全ての組成物および／または方法は、本発明の開示を鑑みれば予定外の実験を行うことなく実施および完遂できる。本発明の組成物および方法は好ましい実施形態に関して記載してあるが、当業者の知る通り、本発明の概念および範囲から外れることなく本明細書に記載した組成物および／または方法および方法の工程または工程の順序に変更を適用してよい。より詳しくは、同じ、または、同様の結果を達成しつつ化学的および生理学的に関連する特定の薬剤で本明細書に記載した薬剤を置き換えてよい。当業者の知る全てのこのような同様の置き換えおよび修飾は本発明の範囲および概念に包含されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】材料の試料における特定の微生物の存在を定量するための方法のフローチャート形態の総括である。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は参照により本明細書に組み込まれる「動物飼料中の微生物の検出方法」と題された２００３年８月２９日出願の米国特許仮出願第６０／４８１３１２号の利益を主張する。本出願は「動物飼料中のプロバイオテクスの分析」と題された２００３年４月１５日に受領された開示文書５２９７３３に関連する。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、動物飼料のような材料の試料における特定の微生物の検出および定量のために有用な材料および方法に関する。本方法は微生物を培養すること、および、目的の特定の微生物を検出するためにオリゴヌクレオチドプライマーを使用することを含む。
【０００３】
（背景技術）
微生物はしばしば、栄養補給のため、消化改善のため、所望の栄養分の取り込みを増大させるため、望ましくない、または有害な微生物と競合するため、および種々の他の理由のために動物飼料に添加される。典型的には、肥育場または乳製品製造所のような動物飼料が動物により消費される場所において、微生物を動物飼料に添加する。例えば参照により本明細書に組み込まれる「反芻動物による食糧の利用性を改善するための方法」と題された１９９６年７月９日登録のＷａｒｅらへの米国特許第５，５３４，２７１号、および参照により本明細書に組み込まれる「反芻動物による食糧の利用性を改善するための組成物」と題された１９９６年６月２５日登録のＧａｒｎｅｒらへの米国特許第５，５２９，７９３号を参考にできる。「プロバイオティック（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ）」および「直接供給微生物（ＤＦＭ）」という用語は動物飼料に添加される有益微生物に言及する場合に使用される場合が多い。
【０００４】
関連する問題点の１つは、添加した微生物の存在を確認又はその濃度を定量する必要性である。殆どの既存の方法は処理した飼料から得られた試料の直接または間接的な培養に依存している。これらの方法は、多くは極めて高濃度の他の微生物の存在により妥協を余儀なくされる場合が多い。更にまた、多くの微生物は伝統的な培地中で培養されると外観が同様になり、同定と定量を更に複雑化している。
【０００５】
即ち、処理した動物飼料を分析する進歩した方法、すなわち理想的には、所望の微生物の特定の菌株の存在を確認できる方法が必要とされている。
【０００６】
（発明の開示）
試料の培養とオリゴヌクレオチドプライマーの使用を組み合わせた方法を開示する。オリゴヌクレオチドプライマーは直接の検出方法において使用できるか、または、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような方法において使用できる。これらの方法は、動物飼料中の所望のプロバイオティック微生物を確認し、定量するために有用である。
【０００７】
１つの態様によれば、本発明は材料の試料における特定の種類の微生物の存在を定量する方法を提供する。この方法は、（ａ）特定の種類の微生物の培養物が増殖するのに適した条件下で試料を培養する工程；（ｂ）培養した試料の各区分における特定の種類の微生物の存在または非存在を検出するために、少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドを使用する工程；および、（ｃ）培養した試料の各区分における特定の種類の微生物の検出された存在または非存在から、材料の試料中の特定の種類の微生物の存在を定量する工程、を含む。
【０００８】
別の態様によれば、本発明は材料の試料における特定の種類の微生物の存在を定量する方法を提供する。この方法は、（ａ）試料を複数の区分に分割する工程；（ｂ）特定の種類の微生物が増殖するのに適した条件下で試料の各区分を培養する工程；（ｃ）特定の種類の微生物の核酸と選択的にハイブリダイズする２種類のオリゴヌクレオチドプライマーに試料の各培養した区分を順次反応させてポリメラーゼ連鎖反応過程を実施することにより、試料の各培養した区分から各反応産物を産生する工程；（ｄ）試料の各培養した区分の反応から特徴的な長さを有する反応産物の存在または非存在を検出する工程；および、（ｅ）試料の各培養した区分の反応から特徴的な長さを有する反応産物の検出された存在または非存在から、材料の試料における特定の種類の微生物の存在を定量する工程、を含む。
【０００９】
更に別の態様によれば、本発明は動物飼料中のプロバイオティック微生物の検出のための方法を提供する。この方法は、動物飼料とプロバイオティック微生物とを接触させることにより処理した動物飼料を作製する工程；処理した動物飼料の試料を採取する工程；プロバイオティック微生物が増殖するのに適した条件下で試料を培養する工程；２種類のＰＣＲプライマーを用いながら培養した試料に対してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施して、ＰＣＲ産物を生成する工程；ＰＣＲ産物を分析してＰＣＲ反応の結果を得る工程；および、ＰＣＲ反応の結果を動物飼料中のプロバイオティック微生物の存在または非存在と相関付ける工程、を含む。
【００１０】
更に別の態様によれば、本発明は動物飼料中のプロバイオティック微生物の検出のための方法を提供する。この方法は、動物飼料とプロバイオティック微生物とを接触させることにより、処理した動物飼料を作製する工程；処理した動物飼料の試料を採取する工程；プロバイオティック微生物が増殖するのに適した条件下で、試料を培養することにより培養物を作製する工程；培養物から核酸を得る工程；ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド−核酸の形成のために適する条件下でオリゴヌクレオチドに核酸を接触させること；ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド−核酸を検出して、ハイブリダイゼーションの結果を得る工程；および、ハイブリダイゼーションの結果を動物飼料中のプロバイオティック微生物の存在または非存在と相関付ける工程、を含む。
【００１１】
（配列の簡単な説明）
以下の詳細な説明の後の配列リストは本明細書の部分を構成し、そして本発明の特定の態様を更に明らかにするために含まれる。本発明は本明細書に示した特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせてこれらの配列１つ以上を参考にすることにより、更に良好に理解される。
【００１２】
配列番号１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）は、オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーＬａｃｔｏＧ５Ｒ（１８ヌクレオチド（ｎｔ））である。
【００１３】
配列番号２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）は、オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーＬＡ５１特異的Ｇ４Ｒ（１８ヌクレオチド）である。
【００１４】
配列番号３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）は、配列番号２がハイブリダイズするオペロンＩＴＳ標的ｒＲＮＡ配列である。
【００１５】
（発明を実施するための最良の形態）
動物飼料に添加されている望ましい微生物の存在を確認して定量する現在使用されている方法は、「プレート計数」または「ｃｆｕ（コロニー形成単位）」計数の計算をもたらすペトリ皿上に産生された培養物のみに依存している。これらの方法は不正確であり、ペトリ皿上に増殖すると目視上は同様または同一に見える同様の型の微生物を識別できない。
【００１６】
本発明の種々の実施形態は、動物飼料中の微生物を直接または間接的に検出して定量するためにオリゴヌクレオチドを使用する。
【００１７】
本発明の態様は、動物飼料中の望ましい微生物の存在を正確に確認して定量するためのＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法の使用に関する。本発明の別の態様は、目的の微生物１またはそれ以上に由来する特徴的なＤＮＡまたはＲＮＡ配列へのオリゴヌクレオチドプライマーのハイブリダイゼーションと、その後のハイブリダイズしたプライマーの検出および／または定量に関する。
【００１８】
本発明の１つの実施形態は、動物飼料中のプロバイオティック微生物の検出のための方法に関し、その方法は、動物飼料とプロバイオティック微生物とを接触させることにより処理した動物飼料を作製する工程；処理した動物飼料の試料を採取する工程；プロバイオティック微生物が増殖するのに適した条件下で液体培地中で試料を培養する工程；培養した試料から核酸を得る工程；ハイブリダイゼーションに適する条件下で核酸にオリゴヌクレオチドを接触させる工程；ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド−核酸の存在または非存在を検出してハイブリダイゼーションの結果を得る工程；および、ハイブリダイゼーションの結果を動物飼料中のプロバイオティック微生物の存在または非存在と相関付ける工程、を含む。ハイブリダイゼーションの結果は定性的または定量的でありえる。この方法は更に、ハイブリダイゼーション工程の前に、核酸を増幅することを含む。オリゴヌクレオチドは、検出されるべきために放射性、蛍光性であり、レポーター酵素、またはその他の適用物と共有結合であり得る。前記オリゴヌクレオチドは、好ましくは、他の微生物には存在しないがプロバイオティック微生物中には存在する特徴的な核酸配列に、ハイブリダイズする。前記核酸は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡでありえる。前記オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡまたは他のＤＮＡ合成類縁体でありえる。
【００１９】
本発明の別の実施形態は、動物飼料中のプロバイオティック微生物の検出のための方法に関し、その方法は、動物飼料とプロバイオティック微生物とを接触させることにより処理した動物飼料を作製する工程；処理した動物飼料の試料を採取する工程；プロバイオティック微生物が増殖するのに適した条件下で液体培地中の試料を培養する工程；第１のＰＣＲプライマーおよび第２のＰＣＲプライマーを用いながら培養した試料に対してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施することにより、ＰＣＲ産物を生成する工程；ＰＣＲ産物を分析してＰＣＲ反応の結果を得ること；および、前記ＰＣＲ反応の結果を、動物飼料中のプロバイオティック微生物の存在または非存在と相関付ける工程、を含む。
【００２０】
前記動物飼料は一般的に何れかの型の動物飼料であってよい。動物飼料の例は、乳牛用飼料、肉牛用飼料、肥育用ウシ、ドッグフード、キャットフード、ラビットフード、動物園用動物飼料、雌ウシ用飼料、ニワトリ飼料、ウマ飼料、ブタ飼料、シチメンチョウ飼料、ラム飼料、シカ飼料、バッファロー飼料、ワニ飼料、ヘビ飼料および魚類用飼料を含む。
【００２１】
プロバイオティック微生物は、一般的に、動物飼料に添加するか、または直接もしくは他の手段により動物に投与することが望まれる何れかのプロバイオティック微生物であってよい。このようなプロバイオティック微生物の例は、バチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・アニマリス(Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｉｍａｌｉｓ)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｕｄｕｍ)、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ)、ビフィドバクテリウム・サーモフィラム(Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ)、ラクトバチルス・アシドフィルス(Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ)、ラクトバチルス・アギリス(Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｇｉｌｉｓ)、ラクトバチルス・アラクトサス(Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌａｃｔｏｓｕｓ)、ラクトバチルス・アリメンタリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｉｍｅｎｔａｒｉｕｓ）、ラクトバチルス・アミロフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・アミロボランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｖｏｒａｎｓ）、ラクトバチルス・アミロボルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ）、ラクトバチルス・アニマリス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｉｍａｌｉｓ）、ラクトバチルス・バタタス(Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｔａｔａｓ)、ラクトバチルス・ババリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｖａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・ビフェルメンタンス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、ラクトバチルス・ビフィダス(Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｉｆｉｄｕｓ)、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・ブクネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉｉ）、ラクトバチルス・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・カテナフォルメ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｔｅｎａｆｏｒｍｅ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・セロビサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・コリノイデス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｌｌｉｎｏｉｄｅｓ）、ラクトバチルス・コンフサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｎｆｕｓｕｓ）、ラクトバチルス・コプロフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｐｒｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・コリニフォルミス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ）、ラクトバチルス・コリノイデス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｒｙｎｏｉｄｅｓ）、ラクトバチルス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバチルス・クルバタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ）、ラクトバチルス・デルブルエキ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・デシジオサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｓｉｄｉｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・ダイバージェンス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ）、ラクトバチルス・エンテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｅｎｔｅｒｉｉ）、ラクトバチルス・ファルシミニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ）、ラクトバチルス・フェルメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・フリギダス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｉｇｉｄｕｓ）、ラクトバチルス・フルクチボランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｉｖｏｒａｎｓ）、ラクトバチルス・フルクトサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス・ハロトレランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ラクトバチルス・ヘルベチカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・ヘテロヒオキ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｔｅｒｏｈｉｏｃｈｉｉ）、ラクトバチルス・ヒルガルディ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｉｌｇａｒｄｉｉ）、ラクトバチルス・ホルドニエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｏｒｄｎｉａｅ）、ラクトバチルス・イヌリナス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｕｌｉｎｕｓ）、ラクトバチルス・ジェンセニ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｅｎｓｅｎｉｉ）、ラクトバチルス・ジュグルチ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｕｇｕｒｔｉ）、ラクトバチルス・カンドレリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋａｎｄｌｅｒｉ）、ラクトバチルス・ケフィア（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒ）、ラクトバチルス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチルス・レイヒマニ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｉｃｈｍａｎｎｉｉ）、ラクトバチルス・リンドネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｎｄｎｅｒｉ）、ラクトバチルス・マレフェルメンタンス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｌｅｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、ラクトバチルス・マリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｌｉ）、ラクトバチルス・マルタロミカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｌｔａｒｏｍｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・ミナー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｉｎｏｒ）、ラクトバチルス・ミナツス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｉｎｕｔｕｓ）、ラクトバチルス・モビリス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）、ラクトバチルス・ムリナス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｕｒｉｎｕｓ）、ラクトバチルス・ペントサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｎｔｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・シュードプランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ルテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・ロゴサ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｏｇｏｓａｅ）、ラクトバチルス・トレランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｏｌｅｒａｎｓ）、ラクトバチルス・トルケンス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｏｒｑｕｅｎｓ）、ラクトバチルス・ラミニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｕｍｉｎｉｓ）、ラクトバチルス・サケ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトバチルス・サンフランシスコ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｏ）、ラクトバチルス・シャーピー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｈａｒｐｅａｅ）、ラクトバチルス・トリコデス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｄｅｓ）、ラクトバチルス・バクシノステルカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖａｃｃｉｎｏｓｔｅｒｃｕｓ）、ラクトバチルス・ビリデセンス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｉｒｉｄｅｓｃｅｎｓ）、ラクトバチルス・ビツリナス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｉｔｕｌｉｎｕｓ）、ラクトバチルス・キシロサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｙｌｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・ヤマナシエンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｙａｍａｎａｓｈｉｅｎｓｉｓ）、ラクトバチルス・ザエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｚｅａｅ）、ペジオコッカス・アシドラクチシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｌａｃｔｉｃｉ）、ピデオコッカス・ペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）、ストレプトコッカス・クレモリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、ストレプトコッカス・ジセチラクチス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｉｓｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ）、ストレプトコッカス・フェシウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、ストレプトコッカス・インタメヂウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）、ストレプトコッカス・ラクティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトコッカスおよび大腸菌を含む。乳酸利用微生物の別の群はプロピオニバクテリウム・フロインデンライヒ(Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ)、プロピオニバクテリウム・シェルマニ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｈｅｒｍａｎｉｉ）、プロピオニバクテリウム・ジェンセニ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｊｅｎｓｅｎｉｉ）、プロピオニバクテリウム・アシジプロピオニシ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉ）、プロピオニバクテリウム・ソエニ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｏｅｎｉｉ）、プロピオニバクテリウム、メガスフェラ・エルスデニ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｅｌｓｄｅｎｉｉ）、セレノモナス・ルミナチウム（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ ｒｕｍｉｎａｔｉｕｍ）およびペプトストレプトコッカス・アサッカロリティカス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）を包含する。プロバイオティック微生物の１つの特定の例は、ラクトバチルスの種、例えばラクトバチルス・アシドフィルスまたはラクトバチルス・ＬＡ５１である。ＬＡ５１株は天然に存在する菌株である。ＬＡ５１株の供給はオクラホマ大学のＳｔａｎｌｅｙ Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ教授により維持されており、試料はオクラホマ大学の許託のもとに供与されている。
【００２２】
本明細書に記載した方法はまた、動物飼料、人間が消費する食品、土壌、水、植物、動物の皮革および皮膚、動物の消化管、堆肥および糞中の有害または望ましくない微生物の存在を検出して定量するためにも使用できる。有害または望ましくない微生物は、大腸菌属、サルモネラ属、赤痢菌属、カンピロバクター属、クロストリジウム属、ミコバクテリウム属、エルシニ属、バチルス属、ビブリオ属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、アエロモナス属、クレブシエラ属、エンテロバクター属、プロテウス属、シトロバクター属、アエロバクター属、およびセラチア属を含む。
【００２３】
培養工程は、好ましくは目的のプロバイオティック微生物の増殖に好都合な条件下で実施する。異なる微生物は異なる最適温度、培地およびｐＨ条件を有する。例えばラクトバチルス・アシドフィルスは約３５℃およびｐＨ約５．５の嫌気性環境下で良好に増殖する。
【００２４】
第１のＰＣＲプライマーおよび第２のＰＣＲプライマーは、好ましくはプロバイオティック微生物中に存在する唯一の特定の核酸配列にハイブリダイズするように選択される。前記特定の核酸配列は、好ましくは動物飼料中に通常見られる他の微生物中には存在しない。特定のＰＣＲプライマー長および配列は核酸配列により異なる。一般的に、ＰＣＲプライマーは約１０ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチド長である。例えばプライマーは１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５またはそれ以上のヌクレオチド長、少なくとも３５ヌクレオチドであってよい。第１および第２のＰＣＲプライマーは、同じ長さを有することができ、或いは、異なる長さである。ＰＣＲプライマーは好ましくは特定の核酸配列へのハイブリダイゼーションを妨害する可能性がある明らかな二次構造は有さない。また、ＰＣＲプライマーは好ましくは誤ハイブリダイゼーションをもたらす可能性のある多数の繰り返し配列を有しない。第１のＰＣＲプライマーおよび第２のＰＣＲプライマーは、特定の核酸配列に対するよりもむしろそれらが相互にハイブリダイズするような相補性の領域を有しないことが好ましい。
【００２５】
分析工程は、様々なよく知られた分子生物学的手法により実施してよい。これらの方法はアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動および液体クロマトグラフィーを包含する。これらの方法は電気泳動結果の顕微鏡画像化のような画像化技術を含んでよい。
【００２６】
相関付けの工程は動物飼料の試料をプロバイオティック微生物の既知量を投与してある試料と比較することを含む。相関付け工程はまた、対照「ブランク」試料に動物飼料試料を比較することも包含できる。相関付け工程は、「有／無」結果を与える定性的なもの、または動物飼料中に存在するプロバイオティック微生物の濃度を計算する定量的なものであることができる。
【００２７】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を説明するために記載した。当業者の知る通り、以下の実施例に開示する手法は本発明の実施において良好に機能することを本発明者等が発見した手法を示しており、従って、その実施のための好ましい様式を構成するものと考える。しかしながら、当業者の知る通り、本発明の開示に鑑みれば、本発明の範囲を外れることなく多くの変更が開示された特定の実施形態において可能であり、そしてなお同様の結果が得られる。
【００２８】
（実施例）
実施例１：動物飼料の採取
動物飼料の分析において重要な最初の工程は、具体的な試料を採取することである。多くの適する方法が設計されている中で、以下のものが有効であることがわかっている。
【００２９】
各々約５００ｇの試料１０点を採取する。試料を滅菌ビニール袋内に入れ、密封する。前記袋に、試料採取の日付と時間および動物飼料に添加したプロバイオティックの量（典型的には飼料トン当たり）を記載する。試料を無作為に、飼料内に分散した材料から採取する。例えば飼料１０，０００ポンドの積荷は１回に各１０００ポンドを採取し合計１０試料とする。前記プロバイオティックが光、熱または空気に対して感受性であることがわかっているか、疑われる場合は、前記試料は飼料蓄積物の「内部」から採取しなければならない。
【００３０】
同じ数量の対照試料をプロバイオティックを投与していない同じ型の試料から採取する。対照試料は、生物のバックグラウンド量を測定するために有用である。試料の採取および取り扱いの装置が対照試料を汚染しないように留意する。
【００３１】
試料は隔離された冷却機内に保存し、可能な限り迅速に試験実験室に送達する。試料を輸送用培地、例えばＬＢＳブロスに入れ、試験実験室への輸送の間に微生物の増殖が抑制されるのに十分冷涼な温度、例えば４℃に維持する。
【００３２】
実施例２：培地
液体または固体の培地は、プロバイオティックの増殖に適するように選択しなければならない。例えばプロバイオティックであるラクトバチルスＬＡ５１について試験する場合は、ＬＢＳブロスおよびＬＢＳ寒天を製造元のプロトコルに従って使用してよい。ＬＢＳは広範な製造元、例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）およびＡｌｐｈａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）から入手できる。Ａｌｐｈａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手したＬＢＳは２５℃でｐＨ５．５±０．２であり、以下の成分、即ちカゼイン消化ペプトン（１０．０ｇ／ｌ）、デキストロース（２０．０ｇ／ｌ）、酵母エキス（５．０ｇ／ｌ）、酢酸ナトリウム（２５．０ｇ／ｌ）、リン酸１カリウム（６．０ｇ／ｌ）、ツイーン８０（１．０ｇ／ｌ）、硫酸第１鉄（０．０３４ｇ／ｌ）、クエン酸アンモニウム（２．０ｇ／ｌ）、硫酸マグネシウム（０．５７５ｇ／ｌ）、硫酸マンガン（０．１２ｇ／ｌ）および寒天（固体培地の場合、１５．０ｇ／ｌ）を含有する。
【００３３】
実施例３：プロバイオティックのＬＢＳプレーティング
試料１０ｇを蒸留水中０．１％ペプトン９０ｍｌに添加する。混合物を３０回混合シリンダー中で振とうする。前記混合物を１０分間放置する。これを１０１希釈（−１ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）とする。
【００３４】
複数の連続希釈は、ＬＢＳプレート上のコロニー増殖を計数するのに都合の良い数になるように、必要に応じて行なう。例えば１０１、１０２、１０３、１０４、１０５および１０６希釈を行うことができる。使用するプレートの大きさに応じて、少容量の希釈物を培養用プレート表面全体に均一に広げる。典型的には、０．１〜１ｍｌの液体を使用する。プレートは、単独または集計用に重複して調製できる。
【００３５】
プレートを被覆し、３５℃で４８時間嫌気性環境中で培養する。プレート上の菌数を測定する。典型的にはプレート当たり３０〜３００個が適当である。プレート由来の複数のコロニーを顕微鏡で観察してよい。典型的にはプレート当たり約５コロニーを観察する。コロニーの色および形状を記録する。プロバイオティックであるラクトバチルスＬＡ５１の場合は、コロニーは白色で丸型の外観を示すはずである。
【００３６】
グラム染色試験用のスライドを調製する。ＬＡ５１コロニーはグラム陽性と評価されなければならず、そして生物は丸まった棒状物の外観を呈する。
【００３７】
実施例４：動物飼料への標準物質の添加
対照飼料を自己溶解させ、室温に放冷する。処理した飼料への添加と同様に、同じ濃度のプロバイオティックを冷却した飼料に添加する。プロバイオティックを１０分間飼料中に浸積させる。処理した飼料１０ｇを前記実施例に記載した通り蒸留水中０．１％ペプトン９０ｍｌに添加する。これらの試料の連続希釈、培養、プレーティングおよび分析は実施例３に記載のものと同じ方法で実施する。
【００３８】
実施例５：処理した飼料由来のプロバイオティックの培養
蒸留水中０．１％ペプトン２．２５Ｌを混合シリンダーに添加する。２５ｇ飼料１０区分を１０試料袋の各々から１つずつ添加する。混合ボールを添加し、シリンダーを６０秒間振とうする。これを１０１希釈とする。混合物を１０分間放置する。これらの試料の連続希釈、培養、プレーティングおよび分析は実施例３に記載のものと同じ方法で実施する。
【００３９】
実施例６：対照飼料からのプロバイオティックの培養
実施例３の操作法を用いて対照飼料試料を処理する。これは未処理の飼料中に存在するバックグラウンド微生物の指標となる。
【００４０】
実施例７：試料のＰＣＲ分析
前記実施例を用いて動物飼料中に存在するプロバイオティックの「予測（ｐｒｅｓｕｍｅｄ）」ｃｆｕを得る。しかしながら多くの生物が、プロバイオティックと同様または同一の外観を有するため、プロバイオティックのｃｆｕが過剰計数されるかもしれない。更にまた、プロバイオティックまたは動物飼料投与物の他の成分の存在が非プロバイオティック生物の増殖を促進または抑制する場合があり、分析を更に複雑化している。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析の手法を用いることにより、動物飼料試料中の特定のプロバイオティックの存在の明確な証拠が得られる。
【００４１】
ＰＣＲは、試料中の特定のＤＮＡ配列の存在（または非存在）に関して試験するものである。ＰＣＲは、生存中の生物から得られたＤＮＡと死亡または非生存性の生物から得られたＤＮＡとの間を識別しない。従って、前記の実施例に記載した連続希釈培養は試料中の生存中生物から得られた「シグナル」を増幅するために使用することができる。非生存性の生物の量は潜伏期の後の生存性生物の僅かの比率となり、従って、その後のＰＣＲ分析において影響は小さい。
【００４２】
ＰＣＲはプレート上または液体培養物試料中に増殖している特定のコロニーに対して実施できる。少量のコロニーを、爪楊枝またはマイクロピペット先端を用いて、ＰＣＲ反応物に添加することができる。液体培地（例えば１μｌ）の少容量をＰＣＲ反応に直接添加できる。何れの型の試料も多量すぎるとＰＣＲ反応を抑制することがある。ＰＣＲ反応に添加するべき試料は、発酵産物を除去するために遠心分離および蒸留水洗浄を行なってよい。
【００４３】
実施例８：ＰＣＲ反応試料の調製
プロバイオティックのＤＮＡ配列をＰＣＲを用いて増幅できるように選択する。理想的には、特定のＤＮＡ配列は動物飼料中に通常見られる微生物のなかで独特のものであり、従ってその試料中のプロバイオティックの存在または非存在に対して特有の「マーカー」として作用するであろう。本実施例においては、オペロンＩＴＳ標的ｒＲＮＡ配列を選択した（配列番号３）。
【００４４】
各２５μｌの反応物について、以下の成分、即ち、Ｈｏｔｓｔａｒ Ｔａｑ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）１２．５μｌ、プライマーＬａｃｔｏ Ｇ４Ｒ １μｌ（μｌ当たり５０ｎｇ；５’−ＡＡＣ ＧＣＧ ＧＴＧ ＴＴＣ ＴＣＧ ＧＴＴ−３’（配列番号１））、ＬＡ５１特異的プライマー１μｌ（μｌ当たり５０ｎｇ；５’−ＣＣＴ ＧＣＡ ＣＴＴ ＴＡＴ ＣＴＡ ＴＣＧ−３’（配列番号２））および蒸留水９．５μｌを混合する。プライマー配列番号１はラクトバチルスに適合する一般化された配列であることから選択した。（配列番号１は配列番号３中のヌクレオチド５６３〜５４６の逆ヌクレオチド配列に相補である。）プライマー配列２は、ｒＲＮＡの１６Ｓと２３Ｓの領域の間に位置する内部転写スペーサー（ＩＴＳ）上のＬＡ５１配列にハイブリダイズするように設計されている。（配列番号２は配列番号３中の３４２〜３５９ヌクレオチド由来のヌクレオチド配列である。）
試料（１μｌの液体培養物、または、少量のコロニー物質）をＰＣＲ反応に添加し、混合する。陽性および陰性対照の試料も調製する。
【００４５】
ＰＣＲ反応試験管をサーモサイクラーＰＣＲ装置に入れ、適当な時間および温度プログラムを用いて処理する。前記プライマーについては、以下のプログラム、即ち、（９４℃の変性を３０秒間、５４℃のアニーリングを３０秒間、そして、７２℃の重合を１分間）を３２サイクル、次に７２℃で１０分、そして４℃保存が有効である。
【００４６】
ＰＣＲ産物は水平アガロースゲル電気泳動により容易に分析される。臭化エチジウムを１ｍｌ当たり０．１μｌ含有する１ｘＴＡＥ緩衝液中で調製した１．７５％アガロースゲルを用いてよい。前記したＰＣＲ反応のためには、反応混合物８μｌを５ｘローディング緩衝液（ブロモフェノールブルーマーカーを含有）２μｌと混合し、アガロースゲル中でウェル内に添加する。サイズ標準物質（例えば制限酵素ＨａｅＩＩＩで切断したｐｈｉＸ１７４ＤＮＡ）を前記ゲルの１レーンに添加する。ゲルを２５〜５０ボルトで泳動する。電気泳動の進行はゲル中のブロモフェノールブルーのバンドの目視検査によりモニタリングする。ＤＮＡバンドは、ＵＶ光源を用いて可視化する。プライマー配列番号１および２を用いたプロバイオティックであるラクトバチルスＬＡ５１由来のＤＮＡのＰＣＲ分析により、約２２５ｂｐの単一のバンドが得られる。
【００４７】
標準物質の種々の既知濃度を用いたＰＣＲ反応物を用いて、培養物中のプロバイオティックの濃度を定量することができる。これを連続希釈度と組み合わせて使用することにより、動物飼料中のプロバイオティックの濃度を定量することができる。
【００４８】
実施例９：試験結果の解釈
動物飼料をプロバイオティックであるラクトバチルスＬＡ５１の２．０ｘ１０１０〜２．６ｘ１０１０ｃｆｕ／ｇで処理することができる。以下の結果が、前記実施例に記載した方法を用いることにより推定される。最確数（Ｍｏｓｔ Ｐｒｏｂａｂｌｅ Ｎｕｍｂｅｒ）（ＭＰＮ）は連続希釈の観察に基づいて低濃度の生物を推定する方法である（Ｃｏｃｈｒａｎ，Ｗ．Ｇ．１９５０．Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｄｅｎｓｉｔｉｅｓ ｂｙ ｍｅａｎｓ ｏｆ ｔｈｅ “Ｍｏｓｔ Ｐｒｏｂａｂｌｅ Ｎｕｍｂｅｒ”， Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ ６：１０５−１１６；Ｊａｍｅｓ Ｔ．Ｐｅｅｌｅｒ ａｎｄ Ｆｏｓｔｅｒ Ｄ．Ｍｃｃｌｕｒｅ；Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ， ＵＳＦＤＡ，７版，１９９２）。
【表１】
【００４９】
ＬＡ５１を含有する対照飼料は大部分が汚染されているように観察された。
【００５０】
実施例１０：例示される試験結果
動物飼料をプロバイオティックであるラクトバチルスＬＡ５１の２．０ｘ１０１０ｃｆｕ／ｇで処理した。プロバイオティックを５．５時間飼料に接触させた後に試料を採取した。以下の計数値が求められ、これら全ては、推定された範囲内であることがわかった。
【表２】
【００５１】
次に試料を顕微鏡を用いて、グラム染色により観察した。
【表３】
【００５２】
対照飼料および処理した飼料は、同様の水準の推定ＬＡ５１計数値および同様の観察生物を含んでいた。しかしながら、増幅したＰＣＲ産物を観察することにより、処理した飼料のみがＬＡ５１を含んでいた。推定された生物の約４３％が混合ボールの使用により飼料から抽出された。これにより、ＬＡ５１の陽性識別が可能となり、そして生物の含量の推定範囲内の水準が確認された。推定生物の僅か４３％が低値であると思われるが、推定生存生物の１００％を得ることは幾分現実的ではない。前記１０％を超えた回収は、何れも測定を推定計数値の同じ対数内とするものである。
【００５３】
前記した実施例は、動物飼料中の特定の種類の微生物の検出および定量を示しているが、これらの実施例において使用された方法を、他の種の材料の試料における特定の微生物を検出および定量することに適合させることができることを、理解すべきである。前記方法は、動物飼料における特定の病原体を検出および定量するために用いることでき、または、動物の堆肥中または消化管中の特定の微生物を検出するために使用できる。前記方法は、食品、水および空気中の特定の微生物を検出および定量するために使用できる。前記方法は発芽または伝染のために特殊な条件を有する特定の微生物を検出および定量するために使用できる。前記方法はまた、他の点においては一般的または良性である微生物であって特定の有毒または接触伝染性である天然または生命工学による突然変異株を検出して定量するために使用される。
【００５４】
図１は前記実施例の多くにおいて適用された方法の概要を示している。この方法は、試料の自動化処理、および放射性のマーカーまたはプローブを使用しない目的の特定の種類の微生物の低濃度の定量に適している。第１工程１０１においては、材料の具体的な試料を採取する。前記試料は、使用または消費されるべき大部分の材料が典型的なものとなるように採取しなければならない。例えば動物飼料の場合、肥育場または乳製品製造所のような材料の大半が使用または消費される時間および場所に近似するように、前記試料を採取する。
【００５５】
工程１０２においては、後の工程（１０７）においてかなりの数量の試料培養区分が目的の特定の種類の微生物の非存在を示すように希釈する。工程１０２は特定の種類の微生物の初期濃度が十分低値である場合には省略してよい。
【００５６】
工程１０３においては、希釈試料を複数の区分に分割する。工程１０４においては、希釈試料の各区分をその微生物の増殖に適した条件下で培養する。工程１０５においては、ＰＣＲ過程は、微生物のＤＮＡと選択的にハイブリダイズする２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、各培養区分を順次反応させることにより実施される。
【００５７】
各培養区分に対して使用すべきＰＣＲ増幅サイクル数は、試料当たり少数の微生物を各々含有する標準試料を調製すること、および、広範なサイクル範囲にわたるそれぞれのサイクル数を用いて、標準試料に対してＰＣＲ増幅を実施することにより選択できる。（工程１０６のような電気泳動検出によって）陽性表示が得られる地点を最小サイクル数とすべきである。陽性表示がもはや無効となる地点を最大サイクル数としてよい。各培養区分に対して使用するサイクル数はこれらの最少数から最大数の間の平均でなければならない。ＰＣＲ過程のこのカリブレーションはまた、採取されるべき材料または採取されるべき材料中の競合微生物の作用を補うようＰＣＲサイクル数を調節するために、採取すべき滅菌されたか滅菌されていない多数の材料に、既知量の微生物を添加することにより調製された標準試料に対しても実施できる。
【００５８】
工程１０６においては、希釈試料の各区分に由来するＰＣＲ反応産物に対して電気泳動を実施することにより、特徴的長さを有する反応産物の存在または非存在を検出する。
【００５９】
工程１０７においては、希釈試料の各区分について、特徴的長さを有するＰＣＲ反応産物の存在または非存在が特定の種類の少なくとも１種類の微生物の存在または非存在を示すことを仮定することにより、試料中の特定の種類の微生物の最確数を決定する。特定の種類の少なくとも１種類の微生物を有すると示された希釈試料の区分の数は、培養前の試料の区分中の特定の種類の微生物の数の下限である。
【００６０】
試料中の特定の種類の微生物が試料の区分内で無作為に分布していると仮定することにより、特定の種類の少なくとも１つの微生物を有するものとして示された試料区分の数から、初期に試料中にあった特定の種類の微生物の最確数を決定することができる。更にまた、試料の採取元である大半の材料に由来する試料の無作為の変動を考慮した信頼限界を得ることもできる。
【００６１】
例えばＮ＝３、５、８および１０試料区分の場合につき陽性表示の特定の数を与えられた微生物の最確数および上および下の９５％信頼限界は、Ｒｏｂｅｒｔ ＢｌｏｄｇｅｔｔによるＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ Ｏｎｌｉｎｅ， Ｊａｎｕａｒｙ ２００１， 付録２， Ｍｏｓｔ Ｐｒｏｂａｂｌｅ Ｎｕｍｂｅｒ ｆｒｏｍ Ｓｅｒｉａｌ Ｄｉｌｕｔｉｏｎにおいて、合衆国連邦薬品管理局のＣｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｆｏｏｄ Ｓａｆｅｔｙ ＆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ のインターネットウエブサイト（ｃｆｓａｎ．ｆｄａ．ｇｏｖ）上に公開されている。
【表４】
【００６２】
連続希釈を工程１０２において実施し、そして工程１０３〜１０６は一連の希釈物の各々に対して実施し得る。試料中の特定の種類の微生物の最確数は、表からの一連の希釈物の各々に対して求めることができ、そして、最も良好な信頼限界を有する最確数を、試料中の特定の種類の微生物の最確数として選択できる。前記引用したＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ Ｏｎｌｉｎｅ， Ｊａｎｕａｒｙ ２００１， 付録２もまた一連の種々の連続希釈物からの表示の組み合わせに基づいて最確数を決定できるようにする。
【００６３】
前記した通り、試料について決定した特定の種類の微生物の最確数を、既知量の特定の微生物の試料について求めた数に対して、そして、特定の微生物を全く有さないことがわかっている対照試料と、対比させることができる。既知量の試料および対照試料はハイブリダイゼーションおよびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の手法が、実際に最確数および連続希釈法において増殖している特定の微生物の存在を検出していることを確認できる。
【００６４】
本明細書および請求項に開示した全ての組成物および／または方法は、本発明の開示を鑑みれば予定外の実験を行うことなく実施および完遂できる。本発明の組成物および方法は好ましい実施形態に関して記載してあるが、当業者の知る通り、本発明の概念および範囲から外れることなく本明細書に記載した組成物および／または方法および方法の工程または工程の順序に変更を適用してよい。より詳しくは、同じ、または、同様の結果を達成しつつ化学的および生理学的に関連する特定の薬剤で本明細書に記載した薬剤を置き換えてよい。当業者の知る全てのこのような同様の置き換えおよび修飾は本発明の範囲および概念に包含されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】材料の試料における特定の微生物の存在を定量するための方法のフローチャート形態の総括である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
材料の試料における特定の種類の微生物の存在を定量する方法であって、前記方法が、
（ａ）前記特定の種類の微生物の培養物が増殖するのに適した条件下で前記試料を培養する工程；
（ｂ）培養した試料の各区分における前記特定の種類の微生物の存在または非存在を検出するために少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドを使用する工程；および、
（ｃ）前記培養した試料の各区分における前記特定の種類の微生物の検出された存在または非存在から、前記材料の試料における特定の種類の微生物の存在を定量する工程、
を含む方法。
【請求項２】
前記特定の種類の微生物は、処理した動物飼料を作製するために動物飼料に添加されている有益微生物の菌株であり、
前記材料の試料が、動物が前記動物飼料を消費する場合の前記動物飼料の典型的な状態であるように、前記方法が、前記処理した動物飼料を採取して前記材料の試料を得る工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記特定の種類の微生物は、処理した動物飼料を作製するために動物飼料に添加されている有益微生物の菌株であり、
前記方法が、動物に供されるべき前記特定の種類の微生物の存在を定量するために、動物が前記動物飼料を消費する場所において、前記処理した動物飼料を採取する工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記特定の種類の微生物はラクトバチルスの種である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記特定の種類の微生物はラクトバチルス・アシドフィルスである、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記特定の種類の微生物がラクトバチルス・ＬＡ−５１である請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドが前記特定の種類の微生物の種を示す核酸配列とハイブリダイズする、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記試料を培地のプレート上で培養し、前記培養した試料の各区分が、前記培地のプレート上に増殖したことが確認できる微生物の各コロニーから採取される、請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記試料を複数の区分に分割することおよび各区分を培養することにより前記試料が培養され、前記特定の種類の微生物の存在または非存在が各培養区分において検出される、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記試料を希釈すること、および、希釈試料を複数の区分に分割することにより、前記試料が複数の区分に分割される、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
液体に前記試料を混合して流体混合物を生成すること、および、前記流体混合物を複数の区分に分割することにより、前記試料が複数の区分に分割される、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
前記培養した試料の各区分における前記特定の種類の微生物の存在または非存在を検出するために、少なくとも１種類の前記オリゴヌクレオチドを使用する工程が、前記特定の種類の微生物を示す核酸配列との少なくとも１種類の前記オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション産物の存在または非存在を検出する工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
前記培養した試料の各区分における前記特定の種類の微生物の存在または非存在を検出するために、少なくとも１種類の前記オリゴヌクレオチドを使用する工程が、前記特定の種類の微生物の核材料の存在下にてポリメラーゼ連鎖反応を誘導する２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを使用する工程、および、前記特定の種類の微生物の核材料の存在下にて２種類の前記オリゴヌクレオチドプライマーのポリメラーゼ連鎖反応産物の存在または非存在を検出する工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前記オリゴヌクレオチドプライマーの一方が前記特定の種類の微生物の属を示す核酸配列とハイブリダイズし、前記オリゴヌクレオチドプライマーの他方が前記特定の種類の微生物の種を示す核酸配列とハイブリダイズする、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記特定の種類の微生物の核材料の存在下にて２種類の前記オリゴヌクレオチドプライマーのポリメラーゼ連鎖反応産物の存在または非存在を検出する工程が、前記特定の種類の微生物の核材料の存在下にて２種類の前記オリゴヌクレオチドプライマーのポリメラーゼ連鎖反応を示す特徴的分子長を有する反応産物を検出する、ポリメラーゼ連鎖反応産物の電気泳動を行うことを含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
前記材料の試料における前記特定の種類の微生物の存在が、前記特定の種類の微生物の最確数について定量される、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
材料の試料における特定の種類の微生物の存在を定量する方法であって、前記方法が、
（ａ）前記試料を複数の区分に分割する工程；
（ｂ）前記特定の種類の微生物の培養物が増殖するのに適した条件下で前記試料の各区分を培養する工程；
（ｃ）前記特定の種類の微生物の核酸と選択的にハイブリダイズする２種類のオリゴヌクレオチドプライマーに、前記試料の各培養した区分を順次反応させてポリメラーゼ連鎖反応過程を実施することにより、前記試料の各培養した区分から各反応産物を生産する工程；
（ｄ）前記試料の各培養した区分の前記反応から、特徴的な長さを有する反応産物の存在または非存在を検出する工程；および、
（ｅ）前記試料の各培養した区分の前記反応から得られた特徴的な長さを有する検出された反応産物の存在または非存在から、前記材料の試料における前記特定の種類の微生物の存在を定量する工程；
を含む方法。
【請求項１８】
前記材料の試料における前記特定の種類の微生物の存在が、前記材料の試料における前記特定の種類の微生物の最確数について定量される、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記試料の前記培養した多数の区分が前記特徴的な長さを有する反応産物を有しないように、前記試料の区分を培養する前に前記試料が希釈される請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
２種類の前記オリゴヌクレオチドプライマーが、前記特定の種類の微生物の属を示す核酸配列とハイブリダイズする一方のオリゴヌクレオチドプライマー、および前記特定の種類の微生物の種を示す核酸配列とハイブリダイズする他方のオリゴヌクレオチドプライマーを含む請求項１７記載の方法。
【請求項２１】
前記特定の種類の微生物はラクトバチルスの種である、請求項１７記載の方法。
【請求項２２】
前記特定の種類の微生物はラクトバチルス・アシドフィルスである、請求項１７記載の方法。
【請求項２３】
前記特定の種類の微生物はラクトバチルス・ＬＡ−５１である、請求項１７記載の方法。
【請求項２４】
前記特定の種類の微生物は処理した動物飼料を作製するために動物飼料に添加されている有益微生物の菌株であり、前記方法が、動物に供されるべき前記特定の種類の微生物の数を定量するための材料の試料を採取するために、動物が前記動物飼料を消費する場所において、前記処理した動物飼料を採取することを含む、請求項１７記載の方法。
【請求項２５】
動物飼料中のプロバイオティック微生物の検出のための方法であって、
動物飼料とプロバイオティック微生物とを接触させることにより処理した動物飼料を作製する工程；
処理した動物飼料の試料を採取する工程；
前記プロバイオティック微生物が増殖するのに適した条件下で前記試料を培養する工程；
２種類のＰＣＲプライマーを用いて、前記培養した試料にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施することにより、ＰＣＲ産物を生成する工程；
前記ＰＣＲ産物を分析してＰＣＲ反応の結果を得る工程；および、
前記ＰＣＲ反応の結果を、前記動物飼料中の前記プロバイオティック微生物の存在または非存在と相関付ける工程；
を含む方法。
【請求項２６】
動物が前記動物飼料を消費する場所において、前記処理した動物飼料の試料を採取する、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記プロバイオティック微生物はラクトバチルスの種である、請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
前記プロバイオティック微生物はラクトバチルス・アシドフィルスである、請求項２５記載の方法。
【請求項２９】
前記プロバイオティック微生物はラクトバチルス・ＬＡ−５１である、請求項２５記載の方法。
【請求項３０】
前記ポリメラーゼ連鎖反応が前記培養した試料の複数の区分に対して実施され、前記複数の区分からの前記ＰＣＲ産物を分析することにより、前記培養した試料の前記複数の区分の各反応結果が得られ、前記培養した試料の前記複数の区分の反応結果が相関付けられることにより、処理した動物飼料の前記試料における微生物の最確数を決定する、請求項２５記載の方法。
【請求項３１】
動物飼料中のプロバイオティック微生物の検出のための方法であって、
動物飼料とプロバイオティック微生物とを接触させることにより、処理した動物飼料を作製する工程；
処理した動物飼料の試料を採取する工程；
前記プロバイオティック微生物が増殖するのに適した条件下で前記試料を培養することにより培養物を作製する工程；
前記培養物から核酸を得る工程；
ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド−核酸の形成に適した条件下でオリゴヌクレオチドに前記核酸を接触させる工程；
前記ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド−核酸を検出して、ハイブリダイゼーションの結果を得る工程；および、
前記ハイブリダイゼーションの結果を前記動物飼料中の前記プロバイオティック微生物の存在または非存在と相関付ける工程；
を含む方法。
【請求項３２】
動物が前記動物飼料を消費する場所において、前記処理した動物飼料の前記試料が採取される、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
前記プロバイオティック微生物はラクトバチルスの種である、請求項３１記載の方法。
【請求項３４】
前記プロバイオティック微生物はラクトバチルス・アシドフィルスである、請求項３１記載の方法。
【請求項３５】
前記プロバイオティック微生物はラクトバチルス・ＬＡ−５１である、請求項３１記載の方法。
【請求項３６】
前記試料の複数の区分を培養し、前記試料の培養した区分について各ハイブリダイゼーションの結果が得られ、前記処理した動物飼料の前記試料における前記微生物の最確数を決定するために、前記各ハイブリダイゼーションの結果を相関付ける、請求項３１記載の方法。
【請求項１】
材料の試料における特定の種類の微生物の存在を定量する方法であって、前記方法が、
（ａ）前記特定の種類の微生物の培養物が増殖するのに適した条件下で前記試料を培養する工程；
（ｂ）培養した試料の各区分における前記特定の種類の微生物の存在または非存在を検出するために少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドを使用する工程；および、
（ｃ）前記培養した試料の各区分における前記特定の種類の微生物の検出された存在または非存在から、前記材料の試料における特定の種類の微生物の存在を定量する工程、
を含む方法。
【請求項２】
前記特定の種類の微生物は、処理した動物飼料を作製するために動物飼料に添加されている有益微生物の菌株であり、
前記材料の試料が、動物が前記動物飼料を消費する場合の前記動物飼料の典型的な状態であるように、前記方法が、前記処理した動物飼料を採取して前記材料の試料を得る工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記特定の種類の微生物は、処理した動物飼料を作製するために動物飼料に添加されている有益微生物の菌株であり、
前記方法が、動物に供されるべき前記特定の種類の微生物の存在を定量するために、動物が前記動物飼料を消費する場所において、前記処理した動物飼料を採取する工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記特定の種類の微生物はラクトバチルスの種である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記特定の種類の微生物はラクトバチルス・アシドフィルスである、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記特定の種類の微生物がラクトバチルス・ＬＡ−５１である請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドが前記特定の種類の微生物の種を示す核酸配列とハイブリダイズする、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記試料を培地のプレート上で培養し、前記培養した試料の各区分が、前記培地のプレート上に増殖したことが確認できる微生物の各コロニーから採取される、請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記試料を複数の区分に分割することおよび各区分を培養することにより前記試料が培養され、前記特定の種類の微生物の存在または非存在が各培養区分において検出される、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記試料を希釈すること、および、希釈試料を複数の区分に分割することにより、前記試料が複数の区分に分割される、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
液体に前記試料を混合して流体混合物を生成すること、および、前記流体混合物を複数の区分に分割することにより、前記試料が複数の区分に分割される、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
前記培養した試料の各区分における前記特定の種類の微生物の存在または非存在を検出するために、少なくとも１種類の前記オリゴヌクレオチドを使用する工程が、前記特定の種類の微生物を示す核酸配列との少なくとも１種類の前記オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション産物の存在または非存在を検出する工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
前記培養した試料の各区分における前記特定の種類の微生物の存在または非存在を検出するために、少なくとも１種類の前記オリゴヌクレオチドを使用する工程が、前記特定の種類の微生物の核材料の存在下にてポリメラーゼ連鎖反応を誘導する２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを使用する工程、および、前記特定の種類の微生物の核材料の存在下にて２種類の前記オリゴヌクレオチドプライマーのポリメラーゼ連鎖反応産物の存在または非存在を検出する工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前記オリゴヌクレオチドプライマーの一方が前記特定の種類の微生物の属を示す核酸配列とハイブリダイズし、前記オリゴヌクレオチドプライマーの他方が前記特定の種類の微生物の種を示す核酸配列とハイブリダイズする、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記特定の種類の微生物の核材料の存在下にて２種類の前記オリゴヌクレオチドプライマーのポリメラーゼ連鎖反応産物の存在または非存在を検出する工程が、前記特定の種類の微生物の核材料の存在下にて２種類の前記オリゴヌクレオチドプライマーのポリメラーゼ連鎖反応を示す特徴的分子長を有する反応産物を検出する、ポリメラーゼ連鎖反応産物の電気泳動を行うことを含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
前記材料の試料における前記特定の種類の微生物の存在が、前記特定の種類の微生物の最確数について定量される、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
材料の試料における特定の種類の微生物の存在を定量する方法であって、前記方法が、
（ａ）前記試料を複数の区分に分割する工程；
（ｂ）前記特定の種類の微生物の培養物が増殖するのに適した条件下で前記試料の各区分を培養する工程；
（ｃ）前記特定の種類の微生物の核酸と選択的にハイブリダイズする２種類のオリゴヌクレオチドプライマーに、前記試料の各培養した区分を順次反応させてポリメラーゼ連鎖反応過程を実施することにより、前記試料の各培養した区分から各反応産物を生産する工程；
（ｄ）前記試料の各培養した区分の前記反応から、特徴的な長さを有する反応産物の存在または非存在を検出する工程；および、
（ｅ）前記試料の各培養した区分の前記反応から得られた特徴的な長さを有する検出された反応産物の存在または非存在から、前記材料の試料における前記特定の種類の微生物の存在を定量する工程；
を含む方法。
【請求項１８】
前記材料の試料における前記特定の種類の微生物の存在が、前記材料の試料における前記特定の種類の微生物の最確数について定量される、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記試料の前記培養した多数の区分が前記特徴的な長さを有する反応産物を有しないように、前記試料の区分を培養する前に前記試料が希釈される請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
２種類の前記オリゴヌクレオチドプライマーが、前記特定の種類の微生物の属を示す核酸配列とハイブリダイズする一方のオリゴヌクレオチドプライマー、および前記特定の種類の微生物の種を示す核酸配列とハイブリダイズする他方のオリゴヌクレオチドプライマーを含む請求項１７記載の方法。
【請求項２１】
前記特定の種類の微生物はラクトバチルスの種である、請求項１７記載の方法。
【請求項２２】
前記特定の種類の微生物はラクトバチルス・アシドフィルスである、請求項１７記載の方法。
【請求項２３】
前記特定の種類の微生物はラクトバチルス・ＬＡ−５１である、請求項１７記載の方法。
【請求項２４】
前記特定の種類の微生物は処理した動物飼料を作製するために動物飼料に添加されている有益微生物の菌株であり、前記方法が、動物に供されるべき前記特定の種類の微生物の数を定量するための材料の試料を採取するために、動物が前記動物飼料を消費する場所において、前記処理した動物飼料を採取することを含む、請求項１７記載の方法。
【請求項２５】
動物飼料中のプロバイオティック微生物の検出のための方法であって、
動物飼料とプロバイオティック微生物とを接触させることにより処理した動物飼料を作製する工程；
処理した動物飼料の試料を採取する工程；
前記プロバイオティック微生物が増殖するのに適した条件下で前記試料を培養する工程；
２種類のＰＣＲプライマーを用いて、前記培養した試料にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施することにより、ＰＣＲ産物を生成する工程；
前記ＰＣＲ産物を分析してＰＣＲ反応の結果を得る工程；および、
前記ＰＣＲ反応の結果を、前記動物飼料中の前記プロバイオティック微生物の存在または非存在と相関付ける工程；
を含む方法。
【請求項２６】
動物が前記動物飼料を消費する場所において、前記処理した動物飼料の試料を採取する、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記プロバイオティック微生物はラクトバチルスの種である、請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
前記プロバイオティック微生物はラクトバチルス・アシドフィルスである、請求項２５記載の方法。
【請求項２９】
前記プロバイオティック微生物はラクトバチルス・ＬＡ−５１である、請求項２５記載の方法。
【請求項３０】
前記ポリメラーゼ連鎖反応が前記培養した試料の複数の区分に対して実施され、前記複数の区分からの前記ＰＣＲ産物を分析することにより、前記培養した試料の前記複数の区分の各反応結果が得られ、前記培養した試料の前記複数の区分の反応結果が相関付けられることにより、処理した動物飼料の前記試料における微生物の最確数を決定する、請求項２５記載の方法。
【請求項３１】
動物飼料中のプロバイオティック微生物の検出のための方法であって、
動物飼料とプロバイオティック微生物とを接触させることにより、処理した動物飼料を作製する工程；
処理した動物飼料の試料を採取する工程；
前記プロバイオティック微生物が増殖するのに適した条件下で前記試料を培養することにより培養物を作製する工程；
前記培養物から核酸を得る工程；
ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド−核酸の形成に適した条件下でオリゴヌクレオチドに前記核酸を接触させる工程；
前記ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド−核酸を検出して、ハイブリダイゼーションの結果を得る工程；および、
前記ハイブリダイゼーションの結果を前記動物飼料中の前記プロバイオティック微生物の存在または非存在と相関付ける工程；
を含む方法。
【請求項３２】
動物が前記動物飼料を消費する場所において、前記処理した動物飼料の前記試料が採取される、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
前記プロバイオティック微生物はラクトバチルスの種である、請求項３１記載の方法。
【請求項３４】
前記プロバイオティック微生物はラクトバチルス・アシドフィルスである、請求項３１記載の方法。
【請求項３５】
前記プロバイオティック微生物はラクトバチルス・ＬＡ−５１である、請求項３１記載の方法。
【請求項３６】
前記試料の複数の区分を培養し、前記試料の培養した区分について各ハイブリダイゼーションの結果が得られ、前記処理した動物飼料の前記試料における前記微生物の最確数を決定するために、前記各ハイブリダイゼーションの結果を相関付ける、請求項３１記載の方法。
【図１】
【公表番号】特表２００７−５１５１５３（Ｐ２００７−５１５１５３Ａ）
【公表日】平成１９年６月１４日（２００７．６．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２４９１４（Ｐ２００６−５２４９１４）
【出願日】平成１６年８月２７日（２００４．８．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２８０４９
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０２２１１９
【国際公開日】平成１７年３月１０日（２００５．３．１０）
【出願人】（５０５１１５０７２）ニュートリション フィジオロジィ コーポレイション (2)
【氏名又は名称原語表記】ＮＵＴＲＩＴＩＯＮ ＰＨＹＳＩＯＬＯＧＹ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【住所又は居所原語表記】７０２ Ｎ．Ｑｕｉｎｎ、Ｂｏｘ １７６６、Ｇｕｙｍｏｎ、ＯＫ ７３９４２ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年６月１４日（２００７．６．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年８月２７日（２００４．８．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２８０４９
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０２２１１９
【国際公開日】平成１７年３月１０日（２００５．３．１０）
【出願人】（５０５１１５０７２）ニュートリション フィジオロジィ コーポレイション (2)
【氏名又は名称原語表記】ＮＵＴＲＩＴＩＯＮ ＰＨＹＳＩＯＬＯＧＹ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【住所又は居所原語表記】７０２ Ｎ．Ｑｕｉｎｎ、Ｂｏｘ １７６６、Ｇｕｙｍｏｎ、ＯＫ ７３９４２ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【Ｆターム（参考）】
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