生体細胞におけるタンパク質相互作用の直接的可視化のための蛍光二重ハイブリッド（Ｆ２Ｈ）アッセイ
本発明は、タンパク質間相互作用を検出するための生体外の方法に関し、（ａ）（ｉ）細胞において発現する時に、細胞の核において別個の部位で蓄積する、または細胞の核において別個の部位で蓄積されるタンパク質性または非タンパク質性構造と相互作用する（ポリ）ペプチド、および（ｉｉ）ＧＦＰに特異的に結合する（ポリ）ペプチドを含む第１の融合タンパク質を真核細胞において発現させるステップと、（ｂ）同一細胞において、（ｉ）ＧＦＰと（ｉｉ）ベイト（ポリ）ペプチドとを含む第２の融合タンパク質を発現させるステップと、（ｃ）（ｉ）ＧＦＰのそれとは異なる励起および／または発光波長の蛍光（ポリ）ペプチドと、（ｉｉ）プレイ（ポリ）ペプチドとを含む第３の融合タンパク質を同一細胞において発現させるステップと、（ｄ）励起時に、細胞における第２および第３の融合タンパク質の蛍光部の蛍光発光を検出するステップと、を含み、細胞核における双方の融合タンパク質の蛍光発光の共局在は、ベイトおよびプレイ（ポリ）ペプチドの相互作用を示す。本発明は、タンパク質間相互作用を検出するための生体外の方法にも関し、（ａ）（ｉ）蛍光（ポリ）ペプチドと、（ｉｉ）細胞で発現する時に、細胞の核において別個の部位で蓄積する（ポリ）ペプチドと、（ｉｉｉ）ベイト（ポリ）ペプチドとを含む第１の融合タンパク質を真核細胞で発現させるステップと、（ｂ）（ｉ）該第１の融合タンパク質に含まれる蛍光（ポリ）ペプチドのそれとは異なる励起／発光波長の蛍光（ポリ）ペプチドと、（ｉｉ）プレイ（ポリ）ペプチドとを含む第２の融合タンパク質を同一細胞において発現させるステップと、（ｃ）励起時に、細胞において第１および第２の融合タンパク質の蛍光部の蛍光発光を検出するステップと、を含み、細胞核における双方の融合タンパク質の蛍光発光の共局在は、ベイトおよびプレイ（ポリ）ペプチドの相互作用を示す。さらに、本発明は、２つの（ポリ）ペプチドの相互作用を調節する化合物を同定するための方法、および２つのタンパク質の第３のタンパク質との相互作用の相対強度を判断するための方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質間相互作用を検出するための生体外の方法に関し、（ａ）（ｉ）細胞において発現する時に、細胞の核において別個の部位で蓄積する（ポリ）ペプチドと、（ｉｉ）ＧＦＰに特異的に結合する（ポリ）ペプチドとを含む第１の融合タンパク質を真核細胞において発現させるステップと、（ｂ）（ｉ）ＧＦＰと（ｉｉ）ベイト（ポリ）ペプチドとを含む第２の融合タンパク質を同一細胞において発現させるステップと、（ｃ）（ｉ）ＧＦＰのそれとは異なる励起および／または発光波長の蛍光（ポリ）ペプチドと、（ｉｉ）プレイ（ポリ）ペプチドとを含む第３の融合タンパク質を同一細胞において発現させるステップと、（ｄ）励起時に、細胞における第２および第３の融合タンパク質の蛍光部の蛍光発光を検出するステップと、を含み、細胞核における双方の融合タンパク質の蛍光発光の共局在は、ベイトおよびプレイ（ポリ）ペプチドの相互作用を示す。本発明は、タンパク質間相互作用を検出するための生体外の方法にも関し、（ａ）（ｉ）蛍光（ポリ）ペプチドと、（ｉｉ）細胞で発現する時に、細胞の核において別個の部位で蓄積する（ポリ）ペプチドと、（ｉｉｉ）ベイト（ポリ）ペプチドとを含む第１の融合タンパク質を真核細胞で発現させるステップと、（ｂ）（ｉ）該第１の融合タンパク質に含まれる蛍光（ポリ）ペプチドのそれとは異なる励起／発光波長の蛍光（ポリ）ペプチドと、（ｉｉ）プレイ（ポリ）ペプチドとを含む第２の融合タンパク質を同一細胞において発現されるステップと、（ｃ）励起時に、細胞において第１および第２の融合タンパク質の蛍光部の蛍光発光を検出するステップと、を含み、細胞核における双方の融合タンパク質の蛍光発光の共局在は、ベイトおよびプレイ（ポリ）ペプチドの相互作用を示す。さらに、本発明は、２つの（ポリ）ペプチドの相互作用を調節する化合物を同定するための方法、および２つのタンパク質の第３のタンパク質との相互作用の相対強度を判断するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書において、特許出願および製造業者のマニュアルを含む多くの文献を引用する。本発明の特許性に関係すると見なされないが、これらの文献の開示は、その全体において参照により本明細書に組み込まれる。より具体的には、全ての参考文献は、個々の文献のそれぞれが、参照により組み込まれることを具体的に、かつ個別に示されるかのように同様の範囲で参照により組み込まれる。
【０００３】
ヒトゲノムの配列決定後の次の課題は、今や、細胞機能の根底にある複雑なタンパク質ネットワークの分析である。過去１０年間で、生化学から遺伝または細胞ベースのアプローチに及ぶ、タンパク質間相互作用を研究するための広範な様々の方法が開発されてきた。親和性精製法または共免疫沈降法（Ｃｏ−ＩＰ）等の生化学的方法は、生体外のタンパク質複合体の検出を可能にする。酵母二重ハイブリッド（Ｙ２Ｈ）システム等の遺伝学的方法は、細胞環境内の相互作用の効果的な高スループットスクリーニングを可能にする。しかしながら、酵母における哺乳類タンパク質間相互作用の分析は、例えば、翻訳後修飾を通した、タンパク質間相互作用を調節する細胞因子の欠損または不十分な保護に見舞われ得る（Ｐａｒｒｉｓｈ ｅｔ ａｌ．，２００６）。さらに、本方法は、煩雑で、誤りが生じやすい。
【０００４】
近年、タンパク質間相互作用の細胞内可視化のための新規蛍光ベースの方法が導入された。蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）（Ｍｉｙａｗａｋｉ，２００３； Ｓｅｋａｒ ａｎｄ Ｐｅｒｉａｓａｍｙ，２００３）および２分子蛍光相補性（ＢｉＦＣ）（Ｋｅｒｐｐｏｌａ，２００６）の２つの確立された技術は、蛍光標識タンパク質またはその断片の発現に基づく。しかしながら、ＢｉＦＣが、非可逆的相補性、およびタンパク質間相互作用のリアルタイム検出ができないフルオロフォアの緩慢な成熟に基づく一方で、ＦＲＥＴは、高価な機器および高度な技術専門知識を必要とする（Ｋｅｒｐｐｏｌａ，２００６）。
【０００５】
これら全ての方法には、固有の弱点があり、典型的には、より信頼性のある結果を得るために組み合わせられる。
【０００６】
したがって、タンパク質間相互作用を検出するための改善された方法が必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｐａｒｒｉｓｈ， Ｊ．Ｒ．， Ｋ．Ｄ． Ｇｕｌｙａｓ， ａｎｄ Ｒ．Ｌ． Ｆｉｎｌｅｙ， Ｊｒ． ２００６． Ｙｅａｓｔ ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｔｏ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ ｍａｐｐｉｎｇ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７：３８７−９３
【非特許文献２】Ｍｉｙａｗａｋｉ， Ａ． ２００３． Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｐａｔｉａｌ ａｎｄ ｔｅｍｐｏｒａｌ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ． Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ． ４：２９５−３０５
【非特許文献３】Ｓｅｋａｒ， Ｒ．Ｂ．， ａｎｄ Ａ． Ｐｅｒｉａｓａｍｙ． ２００３． Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ （ＦＲＥＴ） ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｌｉｖｅ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｓ． Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １６０：６２９−３３．
【非特許文献４】Ｋｅｒｐｐｏｌａ， Ｔ．Ｋ． ２００６． Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｙ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ７：４４９−５６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記技術上の問題への解決策は、特許請求の範囲で特徴付けられる実施形態を提供することにより達成される。
【０００９】
したがって、本発明の第１の態様は、タンパク質間相互作用を検出するための生体外の方法に関し、（ａ）（ｉ）細胞において発現する時に、細胞の核において別個の部位で蓄積する（ポリ）ペプチドと、（ｉｉ）ＧＦＰに特異的に結合する（ポリ）ペプチドとを含む第１の融合タンパク質を真核細胞において発現させるステップと、（ｂ）（ｉ）ＧＦＰと（ｉｉ）ベイト（ポリ）ペプチドとを含む第２の融合タンパク質を同一細胞において発現させるステップと、（ｃ）（ｉ）ＧＦＰのそれとは異なる励起および／または発光波長の蛍光（ポリ）ペプチドと、（ｉｉ）プレイ（ポリ）ペプチドとを含む第３の融合タンパク質を同一細胞において発現させるステップと、（ｄ）励起時に、細胞における第２および第３の融合タンパク質の蛍光部の蛍光発光を検出するステップと、を含み、細胞核における双方の融合タンパク質の蛍光発光の共局在は、ベイトおよびプレイ（ポリ）ペプチドの相互作用を示す。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】蛍光二重ハイブリッド（Ｆ２Ｈ）アッセイの概略を示す。
【図２】ＤＮＡリガーゼＩＩＩのＸＲＣＣ１の特異的な相互作用を示す。
【図３】細胞周期の独立したＤｎｍｔ１のＰＣＮＡとの相互作用のＦ２Ｈ分析を示す。
【図４】Ｆ２Ｈによるハンチントン病関連の相互作用の分析を示す。
【図５】ミトコンドリアタンパク質間相互作用の分析、および難聴−ジストニア−視神経萎縮症候群に付随する変異の作用を示す。
【図６】ＸＲＣＣ１を伴うＤＮＡリガーゼＩＩＩのＢＲＣＴ媒介相互作用を示す。
【図７】ＸＲＣＣ１のＰＣＮＡ、ＰＡＲＰ−１およびＰＡＲＰ−２との相互作用を示す。
【図８】ＰＢＤ媒介された、ＤＮＡリガーゼＩのＰＣＮＡとの相互作用を示す。
【図９】様々な複製および修復タンパク質のＰＣＮＡとの相互作用を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
「タンパク質間相互作用」という用語は、２つ以上のタンパク質性化合物、すなわち、ポリ（ペプチド）またはタンパク質の特異的相互作用を指す。特異的相互作用は、最小結合強度または親和性により特徴付けられる。特異的相互作用の結合親和性は、概して、ｐＭからｍＭの範囲に達し、例えば、ｐＨ値、イオン強度、共因子の存在等の化学環境にも大きく依存する。本発明に照らして、該用語は、具体的には、生理学的条件下、すなわち、細胞において生じるタンパク質間相互作用を指す。
【００１２】
「真核細胞において発現」という用語は、選択された細胞において機能する適切な発現制御要素を使用する、本発明の融合タンパク質の転写および翻訳を指す。このように、個々の融合タンパク質の結合特性は、細胞発現系において試験されてもよい。このために、融合タンパク質をコードする核酸分子が、概して、発現系に依存する組成物である、適切な発現ベクターにクローン化されてもよい。本発明に関して、発現系は、真核生物、好ましくは、哺乳類である。典型的な哺乳類の発現ベクターは、ｍＲＮＡの転写の開始、タンパク質コード配列、および転写の中止および転写物のポリアデニル化に必要なシグナルを媒介するプロモータ要素を含む。追加要素は、エンハンサー、コザック配列、ならびにＲＮＡスプライシングのためのドナーおよびアクセプター部位が両端にある介在配列を含んでもよい。極めて効率的な転写は、ＳＶ４０からの初期および後期プロモータ、例えば、ＲＳＶ、ＨＴＬＶＩ、ＨＩＶＩ等のレトロウイルスからの長い末端反復配列（ＬＴＲ）、ならびにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモータを用いて達成され得る。しかしながら、細胞要素もまた使用され得る（例えば、ヒトアクチンプロモータ）。転写の開始を確実にする調節要素の可能な例には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、ＲＳＶプロモータ（ラウス肉腫ウイルス）、ｌａｃＺプロモータ、ｇａｌ１０プロモータ、ヒト延長因子１ａプロモータ、ＣＭＶエンハンサー、ＣａＭキナーゼプロモータ、オートグラファ・カルフォルニカ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）多角体プロモータ、またはＳＶ４０エンハンサーが含まれる。転写終結シグナルの例は、ＳＶ４０−ポリ−Ａ部位もしくはｔｋ−ポリ−Ａ部位、またはＳＶ４０、ｌａｃＺ、およびポリヌクレオチドの下流である、ＡｃＭＮＰＶ多角体ポリアデニル化シグナルである。さらに、複製の開始点、薬剤耐性遺伝子、制御因子（誘導性プロモータの一部として）、または内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）等の要素も含まれてもよい。
【００１３】
ショウジョウバエに好適な発現ベクターは、ショウジョウバエメタロチオネイン（ＭＴ）プロモータを使用する、ｐＭＴ ＤＥＳ系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（Ｂｕｎｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９８８）、またはショウジョウバエアクチン５Ｃプロモータを使用する、ｐＡＣ５．１に属するものである。ＧＡＬ４誘導性ＵＳＡプロモータを使用するベクターは、ｐＵＡＳＴである。酵母ベクターは、ｐＹＥｐベクター（Ｇａｌ１０プロモータを使用）、ｐＹＸ１４２（単一コピーベクター）、またはｐＹＸ２３２（ＴＰＩトリオースリン酸イソメラーゼプロモータを使用する２μプラスミド（双方ともＮｏｖａｇｅｎ）である。
【００１４】
使用され得る哺乳類の宿主細胞としては、限定されないが、ヒトＨｅｌａ、２９３、Ｈ９、ＳＨ−ＥＰ１、およびジャーカット細胞、マウスＮＩＨ３Ｔ３およびＣ２Ｃ１２細胞、Ｃｏｓ１、Ｃｏｓ７およびＣＶ１、ウズラＱＣ１−３細胞、マウスＬ細胞、シリアンゴールデンベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が挙げられる。代替的に、融合タンパク質は、染色体に組み込まれる遺伝子構築物を含む安定した細胞株で発現され得る。Ｄｈｆｒ、ｇｐｔ、ネオマイシン、ハイグロマイシン等の選択性マーカを用いた同時形質移入は、形質移入された細胞の同定および単離を可能にする。形質移入された核酸分子は、また、多量のコードされた融合タンパク質を発現するように、細胞で増幅され得る。ｄｈｆｒ（ジヒドロ葉酸還元酵素）マーカは、数百または数千の関心対象の遺伝子のコピーを保有する細胞株を発生させるために有用である。別の有用な選択マーカは、酵素グルタミンシンターゼ（ＧＳ）である（Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。これらのマーカを使用して、哺乳類細胞を、選択培地で増殖され、高抵抗性を有する細胞を選択する。上述の宿主細胞に適した培地および条件は、当該技術分野で既知である。
【００１５】
「融合タンパク質」という用語は、少なくとも２つの異なるタンパク質または（ポリ）ペプチドに由来する配列から成る、キメラタンパク質を指す。本発明の教示に従って、例示的な融合タンパク質において、ベイト（ポリ）ペプチドは、細胞で発現する時に、細胞の核において別個の部位で蓄積する、蛍光（ポリ）ペプチドおよび（ポリ）ペプチドに融合される。代替的に、プレイ（ポリ）ペプチドは、蛍光（ポリ）ペプチドに融合される。融合は、本発明の融合タンパク質の構成要素をコードする核酸分子のフレーム融合をもたらす限り、当業者に既知の任意の技術によって実施されてもよい。構成要素の融合は、任意の順番で達成されてもよい。従来、２つ以上の個別の（ポリ）ペプチドまたはドメインからの融合タンパク質の生成は、（Ｈｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９）に記述される「重複拡張による両側スプライシング」に基づく。単一（ポリ）ペプチドに対してコードする断片は、２つの個別の一次ＰＣＲ反応において生成される。一次ＰＣＲ反応における内部プライマーは、二次ＰＣＲにおいて、２つのドメイン断片の融合を可能にする、有意な約２０ｂｐの相補的領域を含む。代替的に、コード領域は、自然に発生するか、または組み換えＤＮＡ技術により導入されるかのいずれかであってもよい、制限部位を利用することにより融合されてもよい。
【００１６】
本明細書で使用される際、「（ポリ）ペプチド」という用語は、最大３０のアミノ酸からなるペプチド群、ならびに３０以上のアミノ酸からなるポリペプチド群を含む、分子群を説明する。また、定義に沿って、「（ポリ）ペプチド」という用語は、タンパク質の断片を説明する。（ポリ）ペプチドは、２量体、３量体、および高オリゴマーをさらに形成してもよい、すなわち、１つ以上の（ポリ）ペプチド分子からなってもよい。このような２量体、３量体等を形成する（ポリ）ペプチド分子は、同一、または異なってもよい。したがって、対応する高次構造は、ホモまたはヘテロ２量体、ホモまたはヘテロ３量体等と呼ばれる。「（ポリ）ペプチド」および「タンパク質」という用語は、また、自然に修飾された（ポリ）ペプチド／タンパク質を指し、該修飾は、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化等により達成される。このような修飾は、当該技術分野において公知である。
【００１７】
「蛍光（ポリ）ペプチド」または「蛍光タンパク質」という用語は、特定の波長での励起時に、蛍光光線を発光する（ポリ）ペプチドを指す。様々な蛍光タンパク質が本発明で使用され得る。このような蛍光タンパク質の一群としては、発光オワンクラゲから単離された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ならびにシアン蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質等の数多くのＧＦＰ変種が挙げられる（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｚｉｍｍｅｒ，２００２）。典型的には、これらの変種は、それぞれ、配列番号１のアミノ酸配列または配列番号２の核酸配列と約８０％またはそれ以上の配列同一性を共有する。色移動ＧＦＰ変異体は、青から黄緑の発光色の、増大した輝度、および光安定性を有する。（Ｔｓｉｅｎ，１９９８）。増強型黄色蛍光タンパク質と呼ばれるこのようなＧＦＰ変異体の１つは、５２９ｎｍで発光極大を示す。修飾された励起および発光スペクトル（Ｔｓｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許出願第２００２０１２３１ １３Ａ１号）、増強型蛍光強度および熱抵抗（Ｔｈａｓｔｒｕｐ ｅｔ ａｌ．，米国特許出願第２００２０１０７３６２Ａ１号；Ｂｊｏｒｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許出願第２００２０１７７１８９Ａ１号）、および減少された酸素レベル下の発色団形成（Ｆｉｓｈｅｒ，米国特許出願第６，４１４，１１９号）を有する追加のＧＦＰベース変異体も説明される。
【００１８】
別の蛍光タンパク質群としては、これに限定されないが、例えば、それぞれ、配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号４の核酸配列等、サンゴイソギンチャクモドキから単離された赤色蛍光タンパク質ＤｓＲｅｄ（Ｍａｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９９）を含む、花虫綱から単離された蛍光タンパク質が挙げられる（例えば、受け入れ番号ＡＦ１６８４１９を参照）。ＤｓＲｅｄおよび他の花虫綱蛍光タンパク質は、オワンクラゲの野生型ＧＦＰに約２６〜３０％のみのアミノ酸配列同一を共有するが、ＧＦＰの１１鎖βバレル構造特性の形成を示す、全ての重要なモチーフは保存される。ＤｓＲｅｄの結晶構造も解明され、ＧＦＰの１１鎖βバレル構造特性の保存を示す（ＭＭＤＢ Ｉｄ：５７４２）。
【００１９】
多くの長波長赤色蛍光タンパク質ＤｓＲｅｄの変異体も説明され、同様に、蛍光（ポリ）ペプチドを含む本発明の融合タンパク質の生成に使用されてもよい。例えば、近年説明される、さらに赤色に移動される発光スペクトルを伴うＤｓＲｅｄ変異体は、本発明の実施で使用されてもよい（Ｂａｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｔｅｒｓｋｉｋｈ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｗｉｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１）。
【００２０】
ＤｓＲｅｄのモノマー派生形は、例えば、ｍＲＦＰ（例えば、配列番号５のアミノ酸配列、または配列番号６の核酸配列を有する）、ｍＲＦＰ１（Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００２）、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＯｒａｎｇｅもしくはｍＰｌｕｍ（Ｓｈａｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４）、またはＴａｇＲＦＰ（Ｍｅｒｚｌｙａｋ ｅｔ ａｌ．，２００７）である。
【００２１】
つい最近、花虫綱のウミシイタケおよびレニラ・コレキリ由来のＧＦＰが説明された（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，米国特許出願第２００３００１３８４９号）。
【００２２】
多くの海洋生命由来のますます多くの他の蛍光タンパク質が、最近、説明され、タンパク質データバンクは、現在、多くのＧＦＰおよびＧＦＰ変異体結晶構造、ならびに様々なＧＦＰ類似体の結晶構造を一覧に記載している。サンゴ、ウミエラ、ホヤ、およびイソギンチャク由来のＧＦＰに類似すると推測される関連蛍光タンパク質が説明され、蛍光（ポリ）ペプチドを含む本発明の融合タンパク質の生成に使用されてもよい（概要については（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｚｉｍｍｅｒ，２００２）を参照のこと）。
【００２３】
アネモニア・マジャノ、スナギンチャク、ディスクコーラル、およびツツウミヅタ由来の蛍光タンパク質も報告されている（Ｍａｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９９）
。イシサンゴであるヒユサンゴからクローン化された蛍光タンパク質は、緑色、黄色、および赤色光を発光すること、およびＵＶ線に曝露されると、緑色光から赤色光発光に変換することが報告されている（Ａｎｄｏ ｅｔ ａｌ．，２００２）。近年説明されるイソギンチャク由来の蛍光タンパク質は、ヘビイソギンチャクからクローン化された緑色およびオレンジ色蛍光タンパク質（Ｗｉｅｄｅｎｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０００）、センジュイソギンチャクの触手からクローン化された自然増強型緑色蛍光タンパク質（Ｔｕ ｅｔ ａｌ．，２００３）、ヘビイソギンチャクからクローン化された弱い赤色蛍光を表す、一般的な非蛍光紫色素タンパク質、および遠赤色移動発光スペクトル（５９５ｎｍ）を示すその変異体（Ｌｕｋｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０００）を含む。
【００２４】
加えて、発色団および蛍光特性を有するＧＦＰ関連タンパク質の別のクラスが説明される。サンゴ派生タンパク質のこのような群の１つであるポシロポリン（ｐｏｃｉｌｌｏｐｏｒｉｎ）は、広範のスペクトルおよび蛍光特徴を示す（Ｄｏｖｅ ａｎｄ Ｈｏｅｇｈ−Ｇｕｌｄｂｅｒｇ，１９９９，ＰＣＴ出願第ＷＯ００１４６２３３号；（Ｄｏｖｅ ｅｔ ａｌ．，２００１））。近年、造礁サンゴであるシモコモンサンゴ由来のポシロポリン（ｐｏｃｉｌｌｏｐｏｒｉｎ）Ｒｔｍｓ５の精製および結晶化が説明されている（Ｂｅｄｄｏｅ ｅｔ ａｌ．，２００３）。Ｒｔｍｓ５は、色は藍色であるが、蛍光は弱い。しかしながら、Ｒｔｍｓ５ならびにＲｔｍｓ５に相同の配列を有する他の色素タンパク質は、単一アミノ酸置換基を介して遠赤色蛍光タンパク質に相互変換され得ることが報告されている（Ｂｅｄｄｏｅ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｂｕｌｉｎａ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｌｕｋｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０００）。
【００２５】
ポシロポリン（ｐｏｃｉｌｌｏｐｏｒｉｎ）に密接に関係する様々な他のサンゴ派生色素タンパク質も既知である（例えば、Ｇｕｒｓｋａｙａ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｌｕｋｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０００を参照のこと）。蛍光タンパク質のさらなる例は、ウミシイタケ由来のＧＦＰ、ヒラタクサビライシ由来のｍＫＯ、アザイサンゴ由来のアザミクリーン、またはハナキンチャク由来のｃＯＦＰである。蛍光もしくは発光団タンパク質、またはその蛍光もしくは発光団断片のうちのいずれかが、本発明の教示に従い、使用されてもよい。蛍光または発光団タンパク質の断片は、好ましくは、機能断片である。
【００２６】
細胞の核における別個の部位での（ポリ）ペプチドの蓄積は、細胞の核における別個の部位で既に蓄積されたタンパク質性または非タンパク質性構造と相互作用する（ポリ）ペプチドによって、または（ポリ）ペプチドの蓄積に適した環境を提供する別個の部位での蓄積によって、好ましくは、該部位への直接的または間接的結合によって引き起こされてもよい。
【００２７】
「核における蛍光発光の共局在」は、細胞核での２つの異なる蛍光の共局在を指す。共局在は、２つのタンパク質が互いに相互作用するとすぐに検出される。共局在は、核における２つの異なる蛍光（ポリ）ペプチドからの蛍光発光の一部または完全な空間重複として検出される。検出は、実験者により、または当業者に既知の特殊なソフトウエアにより達成され得る（例えば、ＩｍａｇｅＪ ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｐｌｕｇ−ｉｎｓ，ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）。
【００２８】
本発明は、生体真核細胞におけるタンパク質間相互作用の直接的可視化のための新規蛍光二重ハイブリッド（Ｆ２Ｈ）アッセイの開発に依存する。（Ｆ２Ｈ）アッセイの簡単な光学読出しは、リアルタイムでのタンパク質間相互作用の観察を可能にし、高スループットスクリーニングのために利用されてもよい。本発明の方法は、明確な核構造で蛍光標識されたベイト（ポリ）ペプチドの固定化に基づき、本所定構造で別々に標識されたプレイ（ポリ）ペプチドの共局在として、タンパク質間相互作用の検出を可能にする。本発明のＦ２Ｈアッセイは、関心対象の蛍光標識された（ポリ）ペプチド（ベイト（ポリ）ペプチド）に融合されるｌａｃリプレッサを固定化するために、ｌａｃオペレータアレイの安定した組み込みを備えた細胞株の例で試験された。容易に使用可能な細胞株は、ヒト、マウス、ハムスター、およびショウジョウバエにおいて既に説明されている（Ｄｉｅｔｚｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｊａｎｉｃｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｒｏｂｉｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｔｕｍｂａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｖａｚｑｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，２００１）。特異的な遺伝子導入細胞株から独立するために、本アッセイは、ベイト（ポリ）ペプチドを局所的に固定化するためのアンカー構造として、ラミナまたはセントロソームのような様々な細胞構造を使用することにより修正され得る。
【００２９】
他の遺伝子二重ハイブリッド法のように、本発明のＦ２Ｈアッセイも、調整される必要のある、偽陽性または偽陰性結果を生じる場合がある。ベイト（ポリ）ペプチドの不在下でｌａｃオペレータ配列に結合するプレイ（ポリ）ペプチドは、初期スクリーニングによって同定され得る。そのために、核内のプレイ（ポリ）ペプチドの局在化が、各ベイトタンパク質の不在下で、蛍光顕微鏡によって判断される。次いで、ｌａｃオペレータアレイでの蛍光プレイタンパク質のランダム蓄積が、本構造でのクラスター化蛍光によって判断され得る。本方法で同定された（ポリ）ペプチドは、偽陽性結果を避けるために、ベイト（ポリ）ペプチドとしてのみ使用され得る。異なる細胞内区画からの２０以上のタンパク質間相互作用が、本発明のＦ２Ｈアッセイを用いて分析され、他の遺伝子または生化学法を用いた前述と同一の結果が得られた。自身をｌａｃオペレータアレイ（例えば、実施例において記載されたＳＵＭＯ３等）に結合すると考えられるタンパク質は、ベイト（ポリ）ペプチドとしてのみ使用され得る。実施例で開示された結果は、本発明のＦ２Ｈアッセイが、タンパク質間相互作用の研究に信頼のある、広範囲に適用可能な方法であることを示す。
【００３０】
一部の例において、タンパク質は、核内中心で蓄積する場合があり、したがって、Ｆ２Ｈ分析を複雑にする。本問題を回避するために、ｌａｃオペレータアレイは可視化され、ＣＦＰ−ＬａｃＩのような第３の蛍光融合タンパク質を用いて同定され得る。
【００３１】
本発明は、細胞で発現する時に、細胞の核における別個の部位で蓄積する（ポリ）ペプチドを含む最小構造または融合タンパク質、およびＧＦＰに特異的に結合する（ポリ）ペプチドが、タンパク質相互作用の迅速で効率的な高スループットスクリーニングに役立ち得ることをさらに特徴とする。ＧＦＰおよびベイト（ポリ）ペプチドを含む第２の融合タンパク質の共局在時に、ＧＦＰの細胞の核において別個の部位で蓄積される（ポリ）ペプチドに結合されるＧＦＰ結合（ポリ）ペプチドとの相互作用が確立され、したがって、ベイト複合体を構成する。蛍光（ポリ）ペプチドおよびプレイ（ポリ）ペプチドを含む、さらなる第３の融合タンパク質の共局在時に、双方の蛍光（ポリ）ペプチドは、そこに融合されるベイトおよびプレイ（ポリ）ペプチドの相互作用時に共局在する。
【００３２】
ＧＦＰに融合されるタンパク質および後者をコードする核酸のライブラリが、今までに設計および確立され（Ｎｅｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００６）、これは、タンパク質の相互作用パートナーの高スループットスクリーニングを非常に容易にする。
【００３３】
国際特許出願第ＷＯ２００７／０６８３１３号において、本発明者は、ラクダＶＨＨドメイン派生のＧＦＰに特異的に結合する（ポリ）ペプチドを開示する。したがって、ＧＦＰに特異的に結合するタンパク質は、配列番号７もしくは９に示されるアミノ酸配列、または配列番号８もしくは１０に示される配列を含む核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含む。
【００３４】
要約すると、本新規Ｆ２Ｈアッセイは、タンパク質間相互作用の直接的な可視化を可能にし、生体細胞において、リアルタイムで、細胞周期または分化依存変化を調査するのに理想的には適しているはずである。他の細胞ベース技法に対するＦ２Ｈアッセイの優れた利点は、高価な機器または優れた専門知識のいずれも必要としない、その簡潔さである。Ｆ２Ｈアッセイの簡潔な光学読出しは、生細胞におけるタンパク質相互作用を系統的に分析するように、自動高スループットスクリーニングにおいて、本アッセイの使用可能性をさらに提供する。
【００３５】
細胞質でランダムに蓄積し、不規則で予見不能な構造を形成するウイルス構造に依存する、（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７）に記載される方法と比較すると、本発明で使用される核構造は、定義された、同定可能なスポットを形成する。反対に、Ｍｉｌｌｅｒらの方法は、意図的に過剰発現された融合タンパク質または細胞質小胞でしばしば認められる、非特異的な集合体から識別するのが困難な、多くのはっきり定義されていない大きな細胞質集合体に焦点を定め、それが得られる。ｌａｃオペレータ等の不活性構造を使用して、例えば、細胞における様々な数の集合体の存在下で、蛍光（ポリ）ペプチドの非特異的な集合体の検出を即時に可能にする。本発明の方法において、細胞の倍数性により、１〜２つのスポットは、検出可能である。
【００３６】
第２の態様において、本発明は、２つの（ポリ）ペプチドの相互作用を調節する化合物を同定するための生体外の方法に関し、（ａ）真核細胞で、（ｉ）細胞で発現される時に、細胞の核において別個の部位で蓄積する（ポリ）ペプチドと、（ｉｉ）ＧＦＰに特異的に結合する（ポリ）ペプチドとを含む、第１の融合タンパク質を発現するステップと、（ｂ）同一細胞で、（ｉ）ＧＦＰと、（ｉｉ）ベイト（ポリ）ペプチドとを含む、第２の融合タンパク質を発現するステップと、（ｃ）同一細胞で、（ｉ）ＧＦＰのそれとは異なる励起および／または発光波長である、蛍光（ポリ）ペプチドと、（ｉｉ）ベイト（ポリ）ペプチドと相互作用することが既知である、または推測されるプレイ（ポリ）ペプチドとを含む、第３の融合タンパク質を発現するステップと、（ｄ）細胞を試験化合物と接触させるステップと、（ｅ）励起時に、細胞で、前記第２および前記第３の融合タンパク質の蛍光部の蛍光発光を検出するステップとを含み、試験化合物と接触させない参照細胞の核において認められるそれと比較した、細胞核における第２および第３の融合タンパク質の蛍光部の蛍光発光の共局在の程度の変化は、該化合物がベイトおよびプレイ（ポリ）ペプチドの相互作用を調節できることを示す。
【００３７】
「２つの（ポリ）ペプチドの相互作用を調節する」とは、２つの（ポリ）ペプチドまたはタンパク質の相互作用に影響する特定の化合物の機能を指す。相互作用は、その完全な抑止まで強化され得るか、または弱化され得るかのいずれかである。弱化の形での調節は、例えば、同一結合部位への試験化合物の相互作用タンパク質との競合によって、または１つのタンパク質への結合によって行われ得、したがって、その３次元構造を変化させるため、２つのタンパク質間の相互作用は、該タンパク質での構造変化により、もはや不可能になる。一方、後者は、同様の理由で、タンパク質への結合親和性の増加につながり得る。
【００３８】
試験化合物は、これに限定されないが、例えば、核酸、（ポリ）ペプチド、ペプチドアプタマー、核酸ベースアプタマー、小分子、またはその断片に属する化合物であり得る。試験化合物は、任意の化学化合物であり得る。
【００３９】
核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはリボザイムであり得る。核酸は、化学的に合成されるか、または生体外もしくは生体内ででも生物学的発現によってプロモータと併用して生成され得る。
【００４０】
核酸は、適切な保護リボヌクレオシドホスホラミダイトおよび従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成器を使用して、化学的に合成され得る。ＲＮＡ合成試薬の供給元は、Ｐｒｏｌｉｇｏ（Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ，ＵＳＡ）、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（ｐａｒｔ ｏｆ Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ ，ＵＳＡ）、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ，ＵＳＡ）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（Ａｓｈｌａｎｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）、およびＣｒｕａｃｈｅｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ，ＵＫ）である。
【００４１】
リボザイム（リボ核酸酵素から、ＲＮＡ酵素または触媒ＲＮＡとも呼ばれる）は、化学反応を触媒するＲＮＡ分子である。多くの天然リボザイムは、自己切断または一方のＲＮＡの切断のいずれかを触媒するが、リボソームのアミノトランスフェラーゼ活性を触媒することも判明している。
【００４２】
明確な特徴をもつ、小型自己切断ＲＮＡの例は、ハンマーヘッド型、ヘアピン型、Ｄ型肝炎ウイルス、および生体外選択リード依存型リボザイムである。これらの小型触媒の組織は、第Ｉ群イントロン等の大型リボザイムのそれと対照的である。
【００４３】
アプタマーは、特定の標的分子を結合する、オリゴ核酸またはペプチド分子である。アプタマーは、通常、大きなランダム配列プールからアプタマーを選択することによって生成されるが、天然アプタマーもリボスイッチに存在する。アプタマーは、高分子薬剤として、基礎研究および臨床目的の双方に使用され得る。アプタマーは、リボザイムと混合され得、それらの標的分子の存在下で自己切断する。これらの化合物分子には、追加研究、工業および臨床用途がある。より具体的には、アプタマーは、ＤＮＡまたはＲＮＡアプタマー、もしくはペプチドアプタマーとして分類され得る。前者はオリゴヌクレオチドの（通常短）鎖から成るが、後者は、足場タンパク質の両端に付着する、短鎖可変ペプチドドメインから成る。
【００４４】
核酸アプタマーは、小型分子、タンパク質、核酸、さらには細胞、組織または生物等の様々な分子標的に結合するように、反復された多数の生体外選択、または同等にＳＥＬＥＸ（指数的濃縮によるリガンドの系統的進化）を通して操作された核酸種である。
【００４５】
ペプチドアプタマーは、細胞内の他のタンパク質相互作用と相互作用するように設計される（ポリ）ペプチドである。これらは、足場タンパク質の両端に付着される、可変ペプチドループから成る。本二重構造拘束は、抗体のそれ（ナノモル範囲）に相当するレベルに、ペプチドアプタマーの結合親和性を大幅に増加する。可変ループの長さは、典型的には、１０〜２０のアミノ酸から成り、足場は、良好な溶解特性を有する、任意のタンパク質であってもよい。
【００４６】
現在、細菌タンパク質のチオレドキシンＡは、最も頻繁に使用される足場タンパク質であり、可変ループは、野生型タンパク質において−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ループである、還元された活性部位内に挿入され、２つのシステイン側鎖は、ジスルフィド架橋を形成することが可能である。ペプチドアプタマー選択は、異なるシステムを使用して行われることが可能であるが、最も頻繁に使用されるシステムは、現在、酵母二重ハイブリッドシステムである。
【００４７】
抗体は、例えば、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得る。「抗体」という用語は、さらに結合特異性を保持する、その誘導体または断片も含む。抗体の生成技法は、当該技術分野では既知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ "Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ"，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８８およびＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ“Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９に記載されている。
【００４８】
抗体は、キメラ単鎖およびヒト化抗体、ならびに具体的には、Ｆａｂ断片のような抗体断片も含む。抗体断片または誘導体は、Ｆ（ａｂ'）2、ＦｖまたはｓｃＦｖ断片を
さらに含む。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）および（１９９９），ｌｏｃ．ｃｉｔを参照のこと。
【００４９】
本発明に従う小型分子は、有機または無機であり得、最大２０００ダルトン、好ましくは、１０００ダルトンを超えない、最も好ましくは、８００ダルトンを超えない分子量を有する。
【００５０】
本発明の本態様の好ましい実施形態において、試験化合物は、２つの（ポリ）ペプチドを弱化することができ、試験化合物と接触させない参照細胞の核において認められるそれと比較した、細胞核における双方の融合タンパク質の蛍光部の共局在の減少は、化合物がベイトおよびプレイ（ポリ）ペプチドを弱化することができることを示す。
【００５１】
本発明の内容において、「２つの（ポリ）ペプチドの相互作用を弱化することができる」とは、最初に、別の（ポリ）ペプチドへの（ポリ）ペプチドの結合親和性に対する化合物の影響が、相互作用または結合親和性の弱化または完全な破壊／抑止につながることを意味する。上述のように、これは、化合物の結合時に、１つの（ポリ）ペプチドに誘発された構造変化により行われてもよい。第２に、化合物は、他の（ポリ）ペプチドの結合部位に隣接する同一の、または異なる結合部位に対して、相互作用（ポリ）ペプチドと直接的に競合してもよい。相互作用の弱化または完全な抑止は、双方の蛍光シグナルの共局在の減少または完全に不在になると検出可能である。
【００５２】
本発明の内容における参照細胞は、試験化合物と接触させなかった細胞を指す。したがって、ベイトおよびプレイ（ポリ）ペプチドの相互作用挙動に対する化合物の影響は、直接的に比較され得る。
【００５３】
本発明の本態様の別の好適な実施形態において、試験化合物は、２つの（ポリ）ペプチドの相互作用を誘発または強化することができ、試験化合物と接触させない参照細胞の核において認められるものと比較した、細胞核における双方の融合タンパク質の蛍光部の共局在の増加は、ベイトおよびプレイ（ポリ）ペプチドの相互作用を誘発または強化することができることを示す。
【００５４】
「２つの（ポリ）ペプチドの相互作用を誘発することができる」とは、別の（ポリ）ペプチドへの（ポリ）ペプチドの結合親和性に対する化合物の影響が、結合親和性の増加につながることを意味する。例えば、ベイトおよびプレイ（ポリ）ペプチドの蛍光シグナルの共局在が、参照細胞において全くまたは少ししか検出されなかった場合、共局在における増加は、相互作用の強化を示す。
【００５５】
異なる態様において、本発明は、２つのペプチドの相互作用の相対強度を判断するための生体外の方法に関し、（ａ）真核細胞で、（ｉ）細胞で発現される時に、細胞の核において別個の部位で蓄積する（ポリ）ペプチドと、（ｉｉ）ＧＦＰに特異的に結合する（ポリ）ペプチドとを含む、第１の融合タンパク質を発現するステップと、（ｂ）同一細胞で、（ｉ）ＧＦＰと、（ｉｉ）ベイト（ポリ）ペプチドとを含む、第２の融合タンパク質を発現するステップと、（ｃ）同一細胞で、（ｉ）ＧＦＰのそれとは異なる励起および／または発光波長である、蛍光（ポリ）ペプチドと、（ｉｉ）第１のプレイ（ポリ）ペプチドとを含む、第３の融合タンパク質を発現するステップと、（ｄ）同一細胞で、（ｉ）ＧＦＰのそれとは異なる励起および／または発光波長である、蛍光（ポリ）ペプチドと、（ｉｉ）第２のプレイ（ポリ）ペプチドとを含む、第４の融合タンパク質を発現するステップと、（ｅ）励起時に、細胞で、前記第２および前記第３の融合タンパク質の蛍光部の蛍光発光を検出するステップとを含み、細胞核における第２および第４の融合タンパク質のそれと比較すると異なる、第２および第３の融合タンパク質の蛍光発光の共局在の程度は、ベイト（ポリ）ペプチドに対する第１および第２のプレイ（ポリ）ペプチドの異なる結合強度を示す。
【００５６】
本発明の本態様および以下の２つの態様は、２つの基礎構築物である、プレイおよびベイト構築物に依存し、ＧＦＰを含む核酸コードタンパク質のライブラリが利用不可能な場合に適用され得る。構築物は、２つの個別のベクターまたは１つのベクターに含まれてもよい。
【００５７】
さらなる態様において、本発明は、タンパク質間相互作用を検出するための生体外の方法に関し、（ａ）真核細胞で、（ｉ）蛍光（ポリ）ペプチドと、（ｉｉ）細胞で発現される時に、細胞の核において別個の部位で蓄積する（ポリ）ペプチドと、（ｉｉｉ）ベイト（ポリ）ペプチドとを含む、第１の融合タンパク質を発現するステップと、（ｂ）同一細胞で、（ｉ）該第１の融合タンパク質に含まれる蛍光（ポリ）ペプチドのそれとは異なる励起および／または発光波長である、蛍光（ポリ）ペプチドと、（ｉｉ）プレイ（ポリ）ペプチドとを含む、第２の融合タンパク質を発現するステップと、（ｃ）励起時に、細胞で、第１および第２の融合タンパク質の蛍光部の蛍光発光を検出するステップとを含み、細胞核における双方の融合タンパク質の蛍光発光の共局在は、ベイトおよびプレイ（ポリ）ペプチドの相互作用を示す。
【００５８】
異なる態様において、本発明は、２つのペプチドの相互作用を調節する化合物を同定するための生体外の方法に関し、（ａ）真核細胞で、（ｉ）蛍光（ポリ）ペプチドと、（ｉｉ）細胞で発現される時に、細胞の核において別個の部位で蓄積する（ポリ）ペプチドと、（ｉｉｉ）ベイト（ポリ）ペプチドとを含む第１の融合タンパク質を発現するステップと、（ｂ）同一細胞で、（ｉ）該第１の融合タンパク質に含まれる蛍光（ポリ）ペプチドのそれとは異なる励起および／または発光波長である、蛍光（ポリ）ペプチドと、（ｉｉ）ベイト（ポリ）ペプチドと相互作用することが既知である、または推測されるプレイ（ポリ）ペプチドとを含む、第２の融合タンパク質を発現するステップと、（ｃ）細胞を試験化合物と接触させるステップと、（ｄ）励起時に、細胞で、第１および第２の融合タンパク質の蛍光部の蛍光発光を検出するステップとを含み、試験化合物と接触させない参照細胞の核において認められるそれと比較した、細胞核における双方の融合タンパク質の蛍光部の蛍光発光の共局在の程度の変化は、化合物がベイトおよびプレイ（ポリ）ペプチドの前記相互作用を調節できることを示す。
【００５９】
さらなる態様において、本発明は、第３のタンパク質（または（ポリ）ペプチド）と２つのタンパク質（互換的に使用される用語「（ポリ）ペプチド」）の相互作用の相対強度を判断するための方法に関し、（ａ）真核細胞で、（ｉ）蛍光（ポリ）ペプチドと、（ｉｉ）細胞で発現される時に、細胞の核において別個の部位で蓄積する（ポリ）ペプチドと、（ｉｉｉ）ベイト（ポリ）ペプチドとを含む、第１の融合タンパク質を発現するステップと、（ｂ）同一細胞で、（ｉ）該第１の融合タンパク質に含まれる蛍光（ポリ）ペプチドのそれとは異なる励起および／または発光波長である、蛍光（ポリ）ペプチドと、（ｉｉ）第１のプレイ（ポリ）ペプチドとを含む、第２の融合タンパク質を発現するステップと、（ｃ）同一細胞で、（ｉ）該第１および該第２の融合タンパク質に含まれる蛍光（ポリ）ペプチドのそれとは異なる励起および／または発光波長である、蛍光（ポリ）ペプチドと、（ｉｉ）第２のプレイ（ポリ）ペプチドとを含む、第３の融合タンパク質を発現するステップと、（ｄ）励起時に、細胞で、第１、第２および第３の融合タンパク質の蛍光部の蛍光発光を検出するステップとを含み、細胞核における第１および第３の融合タンパク質のそれと比較すると異なる、第１および第２の融合タンパク質の蛍光発光の共局在の程度は、ベイト（ポリ）ペプチドに対する第１および第２のプレイタンパク質の異なる結合強度を示す。
【００６０】
タンパク質間相互作用を検出するための方法に関する、本発明の態様の好適な実施形態において、検出は、細胞プロセスにおけるタンパク質間相互作用の依存性を調査するために採用され、該方法は、（ｄ１）細胞における１つ以上のプロセスの過程で、細胞における第１および第２の融合タンパク質の蛍光部の蛍光発光を監視するステップをさらに含み、細胞における双方の融合タンパク質の蛍光部の蛍光発光の共局在の程度の変化は、１つ以上の細胞プロセスでの相互作用の依存性を示す。
【００６１】
「細胞プロセスにおける依存性」とは、ベイトまたはプレイ（ポリ）ペプチド、もしくは双方が、細胞周期等の細胞プロセスの過程における修飾のため、それらの相互作用挙動を変更する可能性を意味する。細胞周期にかかわるタンパク質は、他のタンパク質への結合親和性を変更する場合がある、リン酸化または脱リン酸化等の様々な修飾を受ける。この修飾が達成される細胞プロセス中の時間点または期間によって、（ポリ）ペプチドは、１つ以上の他の（ポリ）ペプチドへの結合親和性を緩和する、または増大する場合がある。
【００６２】
より好適な実施形態において、細胞プロセスは、細胞周期、分泌、転位、またはシグナル伝達である。
【００６３】
別の好適な実施形態において、検出は、タンパク質間相互作用の強度を判断するために採用され、該方法は、（ｄ２）双方の融合タンパク質の蛍光部の蛍光発光の共局在が検出された場合、該第２の融合タンパク質の蛍光の選択的減光、および経時的に双方の融合タンパク質の蛍光部の蛍光発光の共局在の回復を監視するステップをさらに含み、共局在を確立するために必要な時間は、タンパク質間相互作用の強度を示す。
【００６４】
一部において、本発明の本実施形態は、定評のあるＦＲＡＰ（蛍光退色後回復）法を利用する。本方法は、蛍光標識されたプローブの拡散および移動性を定量化できる光学技法を意味する。本技法は、タンパク質結合の生物学的研究において多大な有用性を提供し、一般的に、研究されるタンパク質が蛍光タンパク質（ＦＰ）と融合されるＦＰと併用して使用される。特定の光波長（典型的にはレーザビーム）によって励起される時に、タンパク質は蛍光を発する。研究されるタンパク質がＦＰで生成される時に、蛍光が追跡される。（典型的には、強い／激しいレーザパルスを有する）ＦＰの光破壊後、退色領域における蛍光回復の速度は、退色または退色されないＦＰの交換を阻害する、または低下させる、タンパク質相互作用の強度、細胞器官連続性、およびタンパク質輸送の情報を提供する。本観察は、タンパク質結合を調査するために、最近、利用されている。
【００６５】
本発明の別の好適な実施形態において、該第１の融合タンパク質の構成要素（ｉ）、（ｉｉ）および／もしくは（ｉｉｉ）、ならびに／または該第２の融合タンパク質の構成要素（ｉ）および（ｉｉ）、ならびに／または該第３の融合タンパク質の構成要素（ｉ）および（ｉｉ）は、リンカーを介して連結される。
【００６６】
「リンカー」という用語は、本発明の融合タンパク質の構成要素間の連結を指す。リンカーは、任意の順序で、融合タンパク質の構成要素間に配置されてもよい、少なくとも１つのアミノ酸残基を含むペプチド結合またはアミノ酸の伸長であり得る。このようなリンカーは、一部の例において、例えば、個々のドメインの個別の折り畳み構造を改善するために、または融合タンパク質の安定性を調整するために有用である場合がある。さらに、このようなリンカー残基は、輸送のためのシグナル、プロテアーゼ認識配列、または二次修飾のシグナルを含む場合がある。リンカーを形成するアミノ酸残基は、構造化または非構造化されてもよい。好ましくは、リンカーは、１つのアミノ酸残基ほど短い、または最大２、３、４、５、１０、２０もしくは５０の残基であってもよい。特定の例において、リンカーは、さらに、最大１００または１５０残基を含んでもよい。
【００６７】
本発明の別の好適な実施形態において、細胞で発現される時に、細胞の核において別個の部位で蓄積する（ポリ）ペプチドは、細胞の核において別個の部位で蓄積される、タンパク質性または非タンパク質性構造と直接的に相互作用する。
【００６８】
本発明の異なる好適な実施形態において、細胞で発現される時に、細胞の核において別個の部位で蓄積する（ポリ）ペプチドは、細胞の核において別個の部位で蓄積される、タンパク質性または非タンパク質性構造と間接的に相互作用する。
【００６９】
間接的な相互作用は、（ポリ）ペプチドまたは核酸等のタンパク質性または非タンパク質性分子を介して、再度、生じ得る。
【００７０】
異なる好適な実施形態において、プレイ（ポリ）ペプチドのうちのいずれかは、核局在化シグナルを含む。
【００７１】
核局在化シグナル（ＮＬＳ）は、細胞核に対する発現生成物を標的とする。ＮＬＳの例は、非相同タンパク質を核内に指示することができる、ＳＶ４０大型Ｔ抗原のペプチド配列ＰＫＫＫＲＫＶである（Ｋａｌｄｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４）。さらに、ＮＬＳは、例えば、偏在性二分シグナルの原型としてのヌクレオプラスミンのＮＬＳであるＫＲ［ＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡ］ＫＫＫＫ、または酵母転写リプレッサＭａｔα２のＮＬＳであるＫＩＰＩＫである。核局在化シグナルの多くの他の配列は、当業者に既知であり、文献に記載されている。
【００７２】
蛍光（ポリ）ペプチドに融合するプレイ（ポリ）ペプチドが、それ自体、核に転位できない場合、ＮＬＳが存在する必要がある。概して、最大６０ｋＤａの大きさの（ポリ）ペプチドは、核に転位されてもよい。さらに、（ポリ）ペプチドのアミノ酸組成が影響を与える、すなわち、（ポリ）ペプチドにおける連続した塩基性アミノ酸は、（ポリ）ペプチドの核内への転位を促進してもよい。プレイ（ポリ）ペプチドが、核に転位され、蓄積されるのを確実にするために、ＮＬＳが存在することが望ましい。核の別個の部位で蓄積する（ポリ）ペプチドに対して、同じことが言えるが、ＮＬＳが存在する場合にのみ、核へ転位される。このような（ポリ）ペプチドの例は、それ自体はＮＬＳを含まない、ｌａｃリプレッサである。
【００７３】
異なる好適な実施形態において、真核細胞における発現は、１つ以上のベクターにおいて、該第１および第２の融合タンパク質をコードする核酸分子を形質移入することにより達成される。
【００７４】
形質移入は、核酸分子の真核細胞への導入である。一般的に使用される方法は、これらに限定されないが、塩化カルシウム、ＪｅｔＰＥＩ（登録商標）（ＰｏｌｙＰｌｕｓ）、またはリポフェクチン（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用する形質移入を含む。
【００７５】
該第１および／もしくは第２および／もしくは第３および／もしくは第４の融合タンパク質をコードする核酸分子を含むベクターは、真核発現ベクター、好ましくは、哺乳類発現ベクターである。核酸分子のベクターへの取り込みは、核酸分子を効果的に細胞内、好ましくは、宿主細胞のＤＮＡに導入する可能性を提供する。宿主細胞は、細胞株からの細胞等、単一細胞であってもよい。このような基準は、発現ベクターが選択される場合、宿主細胞においてそれぞれの核酸分子を発現する可能性を与える。したがって、核酸分子の発現ベクターへの取り込みは、細胞または宿主細胞の選択された細胞のサブセットのうちのいずれかにおいて、コードされた（ポリ）ペプチドまたはタンパク質のレベルが持続的に上昇する方法を導く。
【００７６】
別の好適な実施形態において、細胞の核の別個の部位で蓄積される（ポリ）ペプチドは、細胞内に導入された。異なる好適な実施形態において、該（ポリ）ペプチドが、核において別個の部位で蓄積されるタンパク質性または非タンパク質性構造と相互作用する場合、該タンパク質性または非タンパク質性構造は、細胞内に導入され得る。
【００７７】
本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子を含むベクターと同様に、タンパク質性、または非タンパク質性構造をコードする核酸分子も、ベクターに導入され得る。核酸分子は、好ましくは、細胞の染色体内に、安定して組み込まれ、安定した細胞株の生成をもたらす。
【００７８】
異なる好適な実施形態において、細胞の別個の部位は、不活性構造を形成する。
【００７９】
より好適な実施形態において、不活性構造は、核ラミナまたは核スペックルである。
【００８０】
異なる好適な実施形態において、細胞で発現される時に、細胞の核において別個の部位で蓄積する（ポリ）ペプチドは、ＰＭＬ体（前骨髄球性白血病、ＰＭＬ核内小体またはＰＭＬ ＮＢとも呼ばれる）と相互作用する。
【００８１】
ＰＭＬ体は、転写、ＤＮＡ修復、ウイルス防御、ストレス、細胞周期制御、タンパク質分解、およびアポトーシスを含む、多くの核機能に関連している。平均的な哺乳類細胞は、１０〜３０のＰＭＬ核内小体を含む。ＰＭＬ体は、最初に、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）に関連する、染色体転位ｔ（１５，１７）におけるレチノイン酸受容体へのその融合によって同定される（Ｂｏｒｄｅｎ，２００２；Ｍａｕｌ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｍｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３）、ＰＭＬタンパク質の存在によって定義される。ＰＭＬタンパク質は、ＰＭＬ ＮＢの形成に不可欠であり、それが不在の場合、またはそのＲＩＮＧ（構造モチーフとしてＣ3ＨＣ4亜鉛フィンガーを含む）フィンガーが変異した場合、ＰＭＬ体は破壊される。
【００８２】
異なる好適な実施形態において、核の別個の部位で蓄積する（ポリ）ペプチド、または細胞の別個の部位で蓄積されるタンパク質性もしくは非タンパク質性構造は、非相同である。
【００８３】
本発明で使用される際、「非相同」とは、発現する細胞のそれとは異なるタンパク質性または非タンパク質性構造の起源、すなわち、異なる種を意味する。
【００８４】
別の好適な実施形態において、細胞で発現される時に、細胞の核において別個の部位で蓄積する（ポリ）ペプチドは、ＤＮＡと相互作用する。
【００８５】
より好適な実施形態において、ＤＮＡは、ｌａｃオペレータである。
【００８６】
さらにより好適な実施形態において、ｌａｃオペレータは、核に多コピー存在する。コピー数は、個々の実験、すなわち、使用される宿主細胞、またはベイト（ポリ）ペプチドおよび／もしくはプレイ（ポリ）ペプチドの種類に依存する。一般に適用されるコピー数は、２５６コピーのｌａｃオペレータ（すなわち、３８４００コピーのｌａｃオペレータ）を含む、少なくとも１５０コピーのプラスミドから約２０００コピーの該プラスミド（すなわち、５１２０００コピーのｌａｃオペレータ）に達する。高感度が必要な場合、コピー数はさらに多くなり、最大３０００コピーに達し得る。代替的に、異なるコピー数を含む任意の種類のプラスミドが、所望のｌａｃオペレータのコピー数を得るために利用され得る。ｌａｃオペレータは、各要素を分離する、核酸長を伴う、または伴わないタンデム型に配列され得る。要素は、ヘッド−テイルまたはテイル−ヘッドに配列され得る。核に安定して組み込まれるｌａｃオペレータの多コピーを有する細胞株は、当該技術分野において既知である（Ｊａｎｉｃｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０００）。
【００８７】
別の好適な実施形態において、該第１の融合タンパク質は、ＬａｃＩを含む。
【００８８】
ｌａｃリプレッサＬａｃＩは、同一サブユニットの４量体である。各サブユニットは、ＤＮＡに結合可能なヘリックス・ターン・ヘリックス（ＨＴＨ）モチーフを含む。リプレッサが結合するオペレータ部位は、逆方向反復対称のがＤＮＡ配列である。オペレータの２つのＤＮＡ半部位は、４量体リプレッサの２つのサブユニットに結合する。
【００８９】
ｌａｃオペレータおよびＬａｃＩの双方は、細菌のラクトース代謝の制御ユニットである、細菌ｌａｃオペロンの一部を形成する。ラクトースが増殖培地から欠けている場合、リプレッサは、プロモータの下流に位置するｌａｃオペレータに非常に強固に結合する。
【００９０】
本発明は、本発明の方法が好都合に実施され得る核において、非タンパク質性アンカー構造を形成するために、ＬａｃＩとｌａｃオペレータとの間の相互作用を利用する。概して、ＬａｃＩのｌａｃオペレータとの相互作用は、核において１つ別個の部位で検出される。
【００９１】
既知の方法、具体的に、（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７）の方法と比較した、本発明の本実施形態の重要な利点は、ｌａｃオペレータアレイを形成するｌａｃオペレータのコピー数が、システムをベイトおよびプレイ（ポリ）ペプチド双方の発現レベルに適応するために、変更され得ることである。例えば、１つの、または双方の（ポリ）ペプチドの発現が細胞において非常に高いことが分かり、したがって、例えば、細胞プロセスに干渉する、または蛍光シグナルを妨害する場合、低いｌａｃオペレータのコピー数を有する別の細胞が選択され、したがって、相互作用の検出の滴定を可能にする。
【００９２】
より好適な実施形態において、該第２の融合タンパク質はＧＦＰを含む。
【００９３】
別の好適な実施形態において、検出は、蛍光顕微鏡を使用して実施される。
【００９４】
蛍光顕微鏡は、反射および吸収の代わりに、またはそれに加えて、蛍光およびリン光の現象を使用して、有機物または無機物の特性を研究するために使用される光学顕微鏡である。検体が、フルオロフォラによって吸収される特定の波長（または複数の波長）の光で照射されることによって、検体に（吸収された光と異なる色の）より長い光波長を発光させる。光の照射は、発光フィルタの使用を通して、非常に弱い発光された蛍光から単離される。蛍光顕微鏡の典型的な構成要素は、光源（キセノンまたは水銀アーク放電ランプ）、励起フィルタ、二色性ミラー（または二色性ビームスプリッタ）、および発光フィルタである。フィルタおよび二色性ミラーは、検体を標識するために使用される、スペクトル励起およびフルオロフォラの発光特性に一致するように選択される。使用される多くの蛍光顕微鏡は、落射蛍光顕微鏡である（すなわち、蛍光の励起および観察は、検体の上（ｅｐｉ）からである）。これらの顕微鏡は、生物学の分野において重要な部分となり、共焦点レーザ走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）および全反射照明蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦ）等の、より高度な顕微鏡設計へのドアを開いた。これらの技術は、当業者に既知である。
【００９５】
別の好適な実施形態において、真核細胞は、生細胞である。
【００９６】
別の好適な実施形態において、本発明の方法は、細胞において、ベイトおよび／またはプレイ（ポリ）ペプチドを局在化させるステップをさらに含む。
【００９７】
本実施形態は、共局在が核において効率的に行われることを確実にし、ベイトおよびプレイ（ポリ）ペプチドの非特異的な相互作用を排除する働きをする。局在化は、実験者、または異なる細胞内区画を区別でき、当業者に既知の特殊なソフトウエアのいずれかにより検出される（例えば、ＩｍａｇｅＪ（バージョン１．３８，ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）。
【００９８】
異なる態様において、本発明は、融合タンパク質をコードする核酸分子に関し、（ｉ）蛍光（ポリ）ペプチドと、（ｉｉ）細胞で発現される時に、細胞の核において別個の部位で蓄積する（ポリ）ペプチドと、（ｉｉｉ）ベイト（ポリ）ペプチドとを含む。
【００９９】
別の態様において、本発明は、融合タンパク質をコードする核酸分子に関し、（ｉ）ｌａｃオペレータに結合する（ポリ）ペプチドと、（ｉｉ）該核酸と該核酸によってコードされるタンパク質とを含むベクターである、ＧＦＰに特異的に結合する（ポリ）ペプチドとを含む。
【０１００】
本発明の本態様に従う「核酸分子」は、双方ともセンスまたはアンチセンス鎖である、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ等のＤＮＡ、およびＲＮＡを含む。さらに、ＤＮＡまたはＲＮＡの合成または半合成誘導体、および混合重合体等、当該技術分野に既知の核酸模倣分子を含む。本発明に従う、このような核酸模倣分子または核酸誘導体は、ホスホロチオエート核酸、ホスホロアミド核酸、２’−Ｏ−メトキシエチルリボ核酸、モルフォリノ核酸、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、およびロックド核酸を含む（例えば、（Ｂｒａａｓｃｈ ａｎｄ Ｃｏｒｅｙ，２００１）を参照のこと）。ＬＮＡは、リボース環が２’−酸素と４’−炭素との間のメチレン結合によって拘束されるＲＮＡ誘導体である。当業者には容易に理解されるように、これらは、追加の非天然または誘導ヌクレオチド塩基を含む場合がある。
【０１０１】
本発明の本態様の好適な実施形態において、融合タンパク質は、ＬａｃＩを含む。
【０１０２】
別の態様において、本発明は、本発明の核酸分子によってコードされるタンパク質に関する。タンパク質または（ポリ）ペプチドの特徴は、本明細書の別項で定義される。
【０１０３】
好適な実施形態において、本発明のタンパク質は、ＬａｃＩを含む。
【０１０４】
代替的態様において、本発明は、本発明の核酸分子を含むベクターに関する。ベクターの特性は、本明細書の別項において説明される。既に説明された特徴に加え、本発明のベクターは、原核性ベクターであり得る。原核性ベクターおよびその特性は、当該技術分野において既知である。好ましくは、ベクターは、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、または例えば、遺伝子組み換えで慣習的に使用される別のベクターである。
【０１０５】
核酸分子は、いくつかの商業的に入手可能なベクターに挿入されてもよい。非制限的な例としては、ｐＲＥＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＢＰＶ−１、ｐｄＢＰＶＭＭＴｎｅｏ、ｐＲＳＶｇｐｔ、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＩＺＤ３５、ｐＬＸＩＮ、ｐＳＩＲ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＥＡＫ−１０（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）ｐＴｒｉＥｘ−Ｈｙｇｒｏ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ｐＣＩＮｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ ｃＤＮＡ発現ベクターｐｃＤＶ１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐＳＰＯＲＴ１（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）、ｐＧＥＭＨＥ（Ｐｒｏｍｅｇａ）またはｐＳＶＬおよびｐＭＳＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）等の哺乳類細胞における発現と適合性のあるベクターが挙げられる。
【０１０６】
ベクター修飾技法については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ； Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，２００１）を参照のこと。概して、ベクターは、クローン化または発現のための１つ以上の複写元（ｏｒｉ）および遺伝体系、例えば、抗生物質抵抗性等の宿主における選択のための１つ以上のマーカ、および１つ以上の発現カセットを含み得る。
【０１０７】
ベクターに挿入される核酸分子は、例えば、標準的な方法によって合成され得る、または自然源から単離され得る。コードされた配列の転写制御要素および／または配列をコードする他のアミノ酸への連結は、確立された方法を使用して実施され得る。
【０１０８】
本発明の本態様の好適な実施形態において、ベクターは、（ｉ）本発明の核酸分子によってコードされるタンパク質に含まれる蛍光（ポリ）ペプチドのそれとは異なる励起および／または発光波長である、蛍光（ポリ）ペプチドと、（ｉｉ）プレイ（ポリ）ペプチドとを含む、融合タンパク質をコードする核酸分子をさらに含む。
【０１０９】
異なる態様において、本発明は、本発明のベクターで形質移入される真核細胞に関する。
【０１１０】
真核細胞は、哺乳類細胞であることが好ましい。
【０１１１】
本発明の本態様の好適な実施形態において、真核細胞は、本発明の核酸分子を含むベクターと、（ｉ）本発明のタンパク質に含まれる蛍光（ポリ）ペプチドのそれとは異なる励起および／または発光波長である、蛍光（ポリ）ペプチドと、（ｉｉ）プレイ（ポリ）ペプチドとを含む、融合タンパク質をコードする核酸分子を含むベクターとで、形質移入される。
【０１１２】
本発明のプレイおよびベイト構築物は、発現レベルの比較を容易にする場合がある１つのベクターにのみ含まれ得る。
【０１１３】
別の態様において、本発明は、そのＤＮＡに安定して組み込まれるｌａｃオペレータの多コピーを有し、本発明のタンパク質を安定して発現する、真核細胞に関する。
【０１１４】
別の態様において、本発明は、そのＤＮＡに安定して組み込まれるｌａｃオペレータの多コピーを有し、（ｉ）ｌａｃオペレータに結合する（ポリ）ペプチドと、（ｉｉ）ＧＦＰに特異的に結合する（ポリ）ペプチドとを含むタンパク質を安定して発現する、真核細胞に関する。
【０１１５】
好適な実施形態において、ＧＦＰに特異的に結合する該（ポリ）ペプチドは、配列番号７もしくは９のアミノ酸配列を有する、または配列番号８もしくは１０の核酸配列によってコードされる（ポリ）ペプチドを含む。
【０１１６】
本発明は、（ｉ）細胞で発現される時に、細胞の核において別個の部位で蓄積する（ポリ）ペプチドと、（ｉｉ）ＧＦＰに特異的に結合する（ポリ）ペプチド、ならびに該核酸分子と、該核酸分子を含むベクターで形質移入される真核細胞とを含むベクターである、該核酸分子によってコードされるタンパク質を含む、融合タンパク質をコードする核酸分子にも関する。ベイトおよび少なくとも１つのプレイ構築物を含むＦ２Ｈシステムに関する本発明の態様において説明されるように、好適な実施形態および定義は、ＧＦＰに特異的な（ポリ）ペプチドを利用する本発明の上述の態様に同様に適用される。本発明の最初の３つの態様の第１、第２、または第３の融合タンパク質に関する全ての実施形態は、ＧＦＰに特異的な（ポリ）ペプチドを利用する本発明の態様の第４の融合タンパク質に、同様に適用される。
【０１１７】
図の説明
図１
蛍光二重ハイブリッド（Ｆ２Ｈ）アッセイの概略である。（ａ）Ｆ２Ｈアッセイに使用される蛍光標識されたプレイおよびベイトタンパク質をコードするｐＦ２ＨプレイおよびｐＦ２Ｈベイト発現ベクターの概要。（ｂ）ベイトタンパク質のＬａｃＩドメインは、形質移入された細胞の核において蛍光スポットとして可視であり、染色体性に組み込まれたｌａｃオペレータアレイへの結合を媒介する。差次的に標識されたプレイがベイトを相互作用する場合、同一スポットで濃縮されて、ｌａｃオペレータ（オーバーレイ画像で黄色いスポットとして可視となる）で蛍光シグナルの共局在を生じる。（ｃ）プレイがベイトタンパク質と相互作用しない場合、核で分散されたままであり、ｌａｃオペレータアレイは、ベイトタンパク質（赤色のスポット）によって可視化されるだけである。ＦＰ１およびＦＰ２は、２つの区別可能な蛍光タンパク質、例えば、ＧＦＰまたはＹＦＰ、およびｍＣｈｅｒｒｙまたはｍＲＦＰを指す。
【０１１８】
図２
ＤＮＡリガーゼＩＩＩのＸＲＣＣ１の特異的な相互作用が、Ｆ２Ｈによって明らかにされた。（ａ）染色体ｌａｃオペレータアレイを含む遺伝子導入ＢＨＫ細胞が、ＸＲＣＣ１−ＬａｃＩ−ＲＦＰおよびＧＦＰ−タグ付けされたＤＮＡリガーゼＩＩＩ、またはＤＮＡリガーゼＩ構築物と同時導入された。ＸＲＣＣ１−ＬａｃＩ−ＲＦＰ融合タンパク質のｌａｃリプレッサ部分は、ｌａｃオペレータアレイ（赤色スポットとして蛍光顕微鏡によって可視となる）への結合を媒介する。ＤＮＡリガーゼＩＩＩは、ＸＲＣＣ１との相互作用を通して、ｌａｃオペレータアレイへ補充される。高度に相同的なＤＮＡリガーゼＩは、ｌａｃオペレータアレイで蓄積せず、ＸＲＣＣ１と相互作用しないことを示すことに留意されたい。スケールバー５μｍ。（ｂ）Ｆ２Ｈ結果と共免疫沈降（Ｃｏ−ＩＰ）実験との比較。Ｃｏ−ＩＰは、それぞれ、ＲＦＰ−ＸＲＣＣ１およびＧＦＰリガーゼＩＩＩ、またはＧＦＰリガーゼＩを同時発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞で実施された。相互作用の位置付けのために、ＧＦＰタグ付けされたＤＮＡリガーゼＩＩＩのＢＲＣＴドメインと、ＢＲＣＴドメインが欠損する欠失構築物とが使用された。免疫沈降法が、ＧＦＰナノトラップで実施された（Ｒｏｔｈｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７）（前に示す通り（Ｍｏｒｔｕｓｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．， ２００６））。沈殿した融合タンパク質は、次いで、ウエスタンブロット上のＲＦＰおよびＧＦＰに対する特定の抗体で検出された。ＲＦＰ−ＸＲＣＣ１は、ＧＦＰリガーゼＩＩＩで共沈殿されたが、ＧＦＰリガーゼＩでは共沈殿されなかった。ＲＦＰ−ＸＲＣＣ１も、ＧＦＰリガーゼＩＩＩ ＢＲＣＴで共沈殿されたが、ＧＦＰ−ＮリガーゼＩＩＩDＢＲＣＴでは共沈殿されなかった。Ｆ２Ｈ結果の比較において、Ｃｏ−ＩＰからのインプット（左）および結合（右）バンドは、Ｆ２Ｈアッセイからの対応するシグナルとアライメントされた。赤色で示されるＸＲＣＣ１−ＬａｃＩ−ＲＦＰベイト構築物のＬａｃＩスポットおよび結合分画は、ＧＦＰタグ付けされたプレイ構築物のそれぞれのシグナルとアライメントされた。それぞれのＦ２Ｈの全細胞画像を（ａ）および図６に示す。
【０１１９】
図３
細胞周期の独立したＤｎｍｔ１のＰＣＮＡとの相互作用のＦ２Ｈ分析。（ａ）完全長マウスＤｎｍｔ１および融合タンパク質の概略。ＰＢＤ、ＰＣＮＡ結合ドメイン；ＮＬＳ、核局在化配列；ＴＳ、標的配列；ＺｎＦ、Ｚｎ2+結合領域；ＢＡＨ１および２、２つのブロモ隣接相同ドメイン。（ｂ）ｌａｃオペレータ（ｌａｃ ｏｐ）アレイで、および複製フォークでの融合タンパク質の結合可能性の概要。（ｃ）染色体ｌａｃオペレータアレイを含む遺伝子導入ＢＨＫ細胞が、ＰＢＤ−ＬａｃＩ−ＹＦＰおよびＲＦＰ−ＰＣＮＡ構築物と同時導入された。ＲＦＰ−ＰＣＮＡは、独特な細胞周期の依存分布を示す（非Ｓ相細胞（上段）での分散、およびＳ相（下段）での焦点パターン）。ＰＢＤ−ＬａｃＩ−ＹＦＰ融合タンパク質のｌａｃリプレッサ部分は、ｌａｃオペレータアレイへの結合を媒介し（緑色のスポットとして可視であり、矢印で強調される）、ＰＢＤは、複製部位でＰＣＮＡへの結合を媒介する（Ｓ相での焦点パターン）。ＲＦＰ−ＰＣＮＡは、Ｓおよび非Ｓ相細胞においてｌａｃオペレータアレイで局在化され、これは、細胞周期および複製機構の独立を通して、Ｄｎｍｔ１のＰＢＤのＰＣＮＡへの相互作用を示すことに留意されたい。（ｄ）ＢＨＫ細胞は、DＰＢＤ−ＬａｃＩ−ＹＦＰおよびＲＦＰ−ＰＣＮＡの発現ベクターで形質移入された。上述の通り、ＲＦＰ−ＰＣＮＡは、非Ｓ相（上段）での分散分布、Ｓ相（下段）での複製部位の再分布を示す。DＰＢＤ−ＬａｃＩ−ＹＦＰ融合タンパク質は、ｌａｃオペレータアレイ（矢印で印される緑色のスポット）に結合するが、ＰＢＤを欠損するため、Ｓ相において複製部位に結合しない。重要な点は、これらの細胞において、ＲＦＰ−ＰＣＮＡ（プレイ）は、ｌａｃオペレータアレイ（矢印で印される）で局在化されず、結合がDＰＢＤ−ＬａｃＩ−ＹＦＰ（ベイト）において不在であるＰＢＤの存在に依存することを示す。スケールバー５μｍ。
【０１２０】
図４
Ｆ２Ｈによるハンチントン病関連の相互作用の分析。Ｆ２Ｈによって認められた（ａ）ＳＵＭＯ３とＨＺＦＨ、および（ｂ）ＨＺＦＨとビメンチンとの間の報告された相互作用。（ｃ）Ｆ２Ｈ分析は、上述の通り、ＳＵＭＯ３とビメンチンとの間で相互作用がないことを示す（Ｇｏｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４）。（ｂ）では、核は点線で輪郭を描かれ、（ｃ）では、ｌａｃオペレータアレイが示される（矢印）。スケールバー５μｍ。
【０１２１】
図５
ミトコンドリアタンパク質間相互作用の分析、および難聴−ジストニア−視神経萎縮症候群に付随する変異の作用。（ａ）ミトコンドリアの内膜部分（ＩＭＳ）における６量体ＤＤＰ１−ＴＩＭＭ１３複合体の概略。（ｂ＋ｃ）ＧＦＰ−ＤＤＰ１（ｂ）または機能欠失変異体ＧＦＰ−ＤＤＰ１C66W（ｃ）のいずれかと共にベイトタンパク質ｍＣｈｅｒｒｙ−ＬａｃＩ−ＴＩＭＭ１３を発現するＢＨＫ細胞。機能的野生型融合ＧＦＰ−ＤＤＰ１は、ｌａｃオペレータアレイで蛍光シグナルの共局在によって認められたＴＩＭＭ１３との相互作用を示す（ｂ）一方、ＧＦＰ−ＤＤＰ１C66W変異体は、核にわたって分散して分布しており、相互作用を示さない（ｃ）。スケールバー５μｍ。
【０１２２】
図６
ＸＲＣＣ１を伴うＤＮＡリガーゼＩＩＩのＢＲＣＴ媒介相互作用が、Ｆ２Ｈアッセイによって明らかにされた。ｌａｃオペレータアレイを含む遺伝子導入ＢＨＫは、ＸＲＣＣ１−ＬａｃＩ−ＲＦＰおよび様々なＧＦＰタグ付けされたＤＮＡリガーゼＩＩＩ変異体と同時導入された。ＸＲＣＣ１−ＬａｃＩ−ＲＦＰ融合タンパク質のｌａｃリプレッサ部分は、ｌａｃオペレータアレイ（赤色スポットとして可視）への結合を媒介する。ＢＲＣＴドメインは、ＸＲＣＣ１との相互作用を通して、ＤＮＡリガーゼＩＩＩのｌａｃオペレータアレイへの標的のために必要かつ十分である。極めて相同なＤＮＡリガーゼＩは、ｌａｃオペレータアレイで蓄積せず、これは、ＸＲＣＣ１と相互作用しないことを示すことに留意されたい。スケールバー５μｍ。
【０１２３】
図７
Ｆ２Ｈアッセイは、ＸＲＣＣ１のＰＣＮＡ、ＰＡＲＰ−１およびＰＡＲＰ−２との相互作用を明らかにする。ｌａｃオペレータアレイを含むＢＨＫ細胞は、ＸＲＣＣ１−ＬａｃＩ−ＲＦＰ、およびＧＦＰ−ＰＡＲＰ−１、ＧＦＰ−ＰＡＲＰ−２、またはＧＦＰ−ＰＣＮＡのいずれかの発現ベクターで形質移入された。ＸＲＣＣ１−ＬａｃＩ−ＲＦＰ融合タンパク質のｌａｃリプレッサ部分は、ｌａｃオペレータアレイ（赤色スポットとして可視）への結合を媒介する。ＧＦＰ−ＰＡＲＰ−１、ＧＦＰ−ＰＡＲＰ−２およびＧＦＰ−ＰＣＮＡは、ｌａｃオペレータアレイを標的としており、ＸＲＣＣ１との相互作用を示す。スケールバー５μｍ。
【０１２４】
図８
Ｆ２Ｈアッセイは、ＰＢＤ媒介された、ＤＮＡリガーゼＩのＰＣＮＡとの相互作用を明らかにする。ｌａｃオペレータアレイを含む遺伝子導入Ｕ２ＯＳ細胞は、ＮＬＳ−ＰＣＮＡ−ＬａｃＩ−ＲＦＰおよび様々なＧＦＰタグ付けされたＤＮＡリガーゼＩ構築物と同時導入された。ＮＬＳ−ＰＣＮＡ−ＬａｃＩ−ＲＦＰ融合タンパク質のｌａｃリプレッサ部分は、ｌａｃオペレータアレイ（赤色スポットとして可視）への結合を媒介する。ＰＢＤは、ＰＣＮＡとの相互作用を通して、ＤＮＡリガーゼＩのｌａｃオペレータアレイへの標的のために必要かつ十分である。スケールバー５μｍ。
【０１２５】
図９
様々な複製および修復タンパク質のＰＣＮＡとの相互作用が、Ｆ２Ｈによって明らかにされた。ｌａｃオペレータアレイを含む遺伝子導入ＢＨＫ細胞は、ＮＬＳ−ＰＣＮＡ−ＬａｃＩ−ＲＦＰおよび様々なＧＦＰタグ付けされた複製および修復タンパク質を発現する。試験された全てのタンパク質は、ＰＣＮＡと相互作用する。スケールバー５μｍ。
【実施例】
【０１２６】
実施例１：材料および方法
発現構築物
ＬａｃＩコード配列は、以下のプライマーを使用したｐ３’ＳＳ ＥＧＦＰ−Ｌａｃ発現ベクターから増幅されたＰＣＲである（Ｒｏｂｉｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９６）：順方向プライマー５’−ＴＣＴ ＡＧＡ ＡＡＧ ＣＴＴ ＴＣＣ ＡＴＧ ＧＴＧ ＡＡＡ ＣＣＡ ＧＴＡ−３’および逆方向プライマー５’−ＣＣＡ ＴＧＣ ＣＣＧ ＧＧＡ ＣＡＧ ＧＣＴ ＧＣＴ ＴＣＧ ＧＧＡ ＡＡＣ−３’（制限部位はイタリック（下線）で示す）。本ＰＣＲ断片は、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｍａＩで消化され、２つのＤｎｍｔ１−ＹＦＰ発現ベクター（ＭＴＮＹ．２およびＰＢＨＤ−ＹＦＰ）の同一部位にクローン化され（Ｅａｓｗａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，２００４）、ＰＢＤ−ＬａｃＩ−ＹＦＰおよびDＰＢＤ−ＬａｃＩ−ＹＦＰを生成した。ＮＬＳ−ＰＣＮＡ−ＬａｃＩ−ＲＦＰおよびＸＲＣＣ１−ＬａｃＩ−ＲＦＰ構築物は、以下のプライマーを使用して、ＰＣＮＡおよびＸＲＣＣ１ ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅によって生成された（制限部位はイタリックで示す）。
【０１２７】
【表１】
【０１２８】
その後、ＰＣＲ断片は、ＮＬＳ−ＰＣＮＡ−ＬａｃＩ−ＲＦＰにはＸｈｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位を、そしてＸＲＣＣ１−ＬａｃＩ−ＲＦＰ発現ベクターにはＢｇｌＩＩ／ＥｃｏＲＩ部位を使用して、ＬａｃＩ−ＲＦＰ発現ベクター内にクローン化された。
【０１２９】
全ての他のＦ２Ｈ構築物は、ｃＤＮＡおよび後続の連結を図１ａに説明されるベイトおよびプレイ発現ベクター内にコードするＰＣＲ増幅によって生成された。以下のプライマーが使用され、制限部位はイタリックで示される。
【０１３０】
【表２】
【０１３１】
ヒトＤＮＭＴ１、ＤＮＡリガーゼＩ、ＤＮＡリガーゼＩＩＩ、ｐ２１、ＦＥＮ Ｉ、ポリメラーゼδｐ６６サブユニット、ＰＡＲＰ−１、ＰＡＲＰ−２、およびＰＣＮＡの翻訳融合をコードする哺乳類発現構築物は、前述される（Ｃａｚｚａｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｍａｅｄａ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｍｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｍｏｒｔｕｓｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｓｃｈｅｒｍｅｌｌｅｈ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｓｐｏｒｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２００５）。ＤＮＡリガーゼＩおよびＩＩＩの欠失構築物および単離ドメインは、Ｍｏｒｔｕｓｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ（Ｍｏｒｔｕｓｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．，２００６）で説明される。免疫沈降法は、前述の通り（Ｍｏｒｔｕｓｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．，２００６）、ＧＦＰナノトラップ（Ｒｏｔｈｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７）で実施された。全ての融合構築物は、正しい発現および局在化に関して試験した。
【０１３２】
細胞培養および形質移入
ｌａｃオペレータ反復を含む遺伝子導入ＢＨＫ細胞（クローン＃２）およびＵ２ＯＳ細胞（クローン２−６−３）は、（Ｊａｎｉｃｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０００）に説明される通り、１０％のウシ胎仔血清および１５０μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ（ＰＡＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で補われたＤＭＥＭにおいて、選択された条件下で培養された。顕微鏡において、細胞は、１８×１８ガラスカバースリップ上、またはμスライド（ｉｂｉｄｉ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のいずれかで、５０〜７０％のコンフルエンスに増殖され、次いで、製造業者の説明書に従い、ポリプラス形質移入試薬ｊｅｔＰＥＩ（登録商標）（ＢＩＯＭＯＬ ＧｍｂＨ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、示される発現構築物を同時導入した。６〜１０時間後、形質移入培地を新しい培養培地に交換し、次いで、細胞を、生体細胞顕微鏡、または室温で１０分間、ＰＢＳ中の３．７％のホルムアルデヒドでの固定前に、さらに１２〜２４時間、インキュベートした。固定された細胞を、３分間、ＰＢＳ中の０．２％のトリトンＸ−１００で透過処理し、ＤＡＰＩで対比染色し、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）に載置した。
【０１３３】
顕微鏡
蛍光タンパク質を発現する生細胞または固定細胞は、６３ｘ／１．４ＮＡ Ｐｌａｎ−Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ油浸対物レンズ装備のＬｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ２ ＡＯＢＳ共焦点顕微鏡を使用して分析された。フルオロフォアは、４０５ｎｍダイオードレーザ、４８８ｎｍおよび５１４ｎｍアルゴンレーザ、ならびに５６１ｎｍダイオード励起個体（ＤＰＳＳ）レーザで励起された。生細胞または固定細胞の共焦点画像スタックは、典型的に、５１２ｘ５１２ピクセルのフレームサイズ、５０〜１００ｎｍのピクセルサイズ、２５０ｎｍのｚステップサイズ、および１エアリー単位に設定されたピンホールで記録された。いくつかの中間ｚ断面の最大強度投影は、ＩｍａｇｅＪで生成した（バージョン１．３８，ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）。
【０１３４】
実施例２：タンパク質の相互作用を検出するための方法
リアルタイムで生細胞のタンパク質間相互作用を可視化するために、我々は、蛍光二重ハイブリッド（Ｆ２Ｈ）アッセイを開発した。Ｆ２Ｈアッセイの原理は、他の細胞構成要素との相互作用が特定の構造でタンパク質を固定化しなければ、タンパク質が細胞に自由に移動するという事実に基づく（Ｐｈａｉｒ ａｎｄ Ｍｉｓｔｅｌｉ，２０００）。
【０１３５】
我々は、双方が２５６コピーのｌａｃオペレータ配列を有する、約２００〜１０００コピーのプラスミドの安定した相互作用を持つ、上述のＢＨＫおよびＵ２ＯＳ細胞株を使用した（Ｊａｎｉｃｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０００）。我々は、三重融合タンパク質ＦＰ−ＬａｃＩ−Ｘ（図１ａ）またはＸ−ＬａｃＩ−ＦＰを生じる相互作用（ベイト）において試験される、蛍光タンパク質（ＦＰ）、ｌａｃリプレッサ（ＬａｃＩ）、およびタンパク質Ｘから成る蛍光ベイトタンパク質をコードする発現構築物を生成した。本融合タンパク質は、次いでＦＰシグナルの焦点強化のため可視になる、オペレータアレイに結合する。第２の、異なって標識された融合タンパク質（ＦＰ−Ｙ、プレイ）は、ベイトタンパク質と相互作用して、ＦＰシグナル（図１ｂ）の共局在をもたらすか、または相互作用せず、プレイ蛍光（図１ｃ）の分散された分布を生じるかのいずれかであり得る。
【０１３６】
実施例３：ＤＮＡ修復タンパク質間の相互作用の可視化
Ｆ２Ｈアッセイを試験するために、前述の、２つのＤＮＡ修復タンパク質ＤＮＡリガーゼＩＩＩとＸＲＣＣ１との間の相互作用を分析し（Ｃａｌｄｅｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｗｅｉ ｅｔ ａｌ．，１９９５）、結果をプルダウンアッセイから得たデータと比較した。我々は、本相互作用が、ＤＮＡ修復部位を標的とするＤＮＡリガーゼＩＩＩのＢＲＣＴドメインによって媒介されることを前に示した。我々は、ＸＲＣＣ１を含むベイト融合タンパク質、続いてＬａｃＩおよび低分子量赤色蛍光タンパク質ＲＦＰ（ｍＲＦＰ）を生成した。予測通り、本融合タンパク質は、一過性に形質移入されたＢＨＫ細胞において、ｌａｃオペレータアレイで局在化された（図２ａ）。完全長のＧＦＰタグ付けされたＤＮＡリガーゼＩＩＩならびに単離されたＧＦＰ標識ＢＲＣＴドメインの双方は、ｌａｃオペレータアレイでＸＲＣＣ１と共局在し、一方で、ＢＲＣＴドメインを欠損する融合タンパク質は、分散された分布を示す。特に、ＤＮＡリガーゼＩＩＩと同様の反応を触媒する、極めて相同なＤＮＡリガーゼＩは、ＸＲＣＣ１（図２ａおよび図６）に結合しない。Ｆ２ＨデータのＣｏ−ＩＰ実験から得たデータとの直接的な比較は、これら２つの方法で同様の結果を得たことを明らかにする（図２ｂ）。加えて、我々は、最近説明された、ＸＲＣＣ１のＰＣＮＡとの相互作用（Ｆａｎ ｅｔ ａｌ．，２００４）、および２つのＤＮＡ損傷依存性ＰＡＲＰのＰＡＲＰ−１およびＰＡＲＰ−２（Ｍａｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２）も認めた（図７）。これらの結果は、Ｆ２Ｈアッセイが生細胞においてタンパク質間相互作用を研究するのに好適であることを実証する。
【０１３７】
実施例４：タンパク質間相互作用の細胞周期依存性の分析
タンパク質間相互作用の分析における課題は、例えば、細胞周期の進行または他の外部刺激によって生じる一過性の変化を監視することである。我々は、前述のＤＮＡメチルトランスファーゼ１（Ｄｎｍｔ１）とＰＣＮＡ結合ドメイン（ＰＢＤ）によって媒介され、Ｓ相においてＤｎｍｔ１のＤＮＡ複製の部位を標的とするＰＣＮＡとの間の相互作用を分析した（Ｃｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｅａｓｗａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，２００４）。これらの見解は、本相互作用が、複製焦点でＳ相においてのみ生じるのか、または細胞周期を通してのみ生じるのかの疑問を提起した。我々は、ＬａｃＩおよびＹＦＰに融合するＤｎｍｔ１の一部を含む、２つのベイトタンパク質を生成した。１つのベイト（ＰＢＤ−ＬａｃＩ−ＹＦＰ）は、ＰＢＤを含む１１８〜４２７のＤｎｍｔ１を含み、一方、第２のベイト（ΔＰＢＤ−ＬａｃＩ−ＹＦＰ）は、ＰＢＤを欠損し、６２９〜１０８９のＤｎｍｔ１を含む（図３ａ）。プレイタンパク質のように、我々は、加えて、ＤＮＡ複製の部位に印を付けてＳ相での細胞の同定を可能にする、ＲＦＰ−ＰＣＮＡを使用した（Ｅａｓｗａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｓｐｏｒｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２００５）。ｌａｃオペレータアレイおよび複製フォークでの、これらの融合タンパク質の結合可能性は、図３ｂに要約される。
【０１３８】
非Ｓ相において、ベイトタンパク質のＬａｃＩ部は、細胞の倍数性による、核の１つまたは２つの蛍光スポットとして可視となる、染色体性に組み込まれるｌａｃオペレータアレイにのみ結合する。ＲＦＰ−ＰＣＮＡのベイトタンパク質のＰＢＤ部との相互作用は、ｌａｃオペレータアレイで蛍光シグナルの共局在を生じ（図３ｃ上部パネル）、一方で、ベイトタンパク質におけるＰＢＤの欠失は、非Ｓ相細胞においてＲＦＰ−ＰＣＮＡの分散した分布をもたらす（図３ｄ上部）。これは、Ｄｎｍｔ１のＰＣＮＡとのＰＢＤ依存性相互作用もＳ相の外側で生じることを明らかに例示する。
【０１３９】
Ｓ相細胞において、ＲＦＰ−ＰＣＮＡは、進行中のＤＮＡ複製の部位で局在化し、加えて、ＰＢＤ−ＬａｃＩ−ＹＦＰベイトタンパク質によってｌａｃオペレータアレイに補充される（図３ｃ下部パネル）。逆に、ＲＦＰ−ＰＣＮＡが機能的ＰＢＤ（ΔＰＢＤ−ＬａｃＩ−ＹＦＰ）を欠損するベイトタンパク質と共に共発現される時、ＲＦＰ−ＰＣＮＡは、ＤＮＡ複製部位で独占的に濃縮され、ΔＰＢＤ−ＬａｃＩ−ＹＦＰによって強調されるｌａｃオペレータアレイでは濃縮されない（図３ｄ下部パネル）。
【０１４０】
これらの結果は、ｌａｃオペレータアレイでのＲＦＰ−ＰＣＮＡ（プレイ）の局在化が、ベイト構築物におけるＰＢＤの存在に依存し、本相互作用がＳ相に制限されないことを明らかに示す。
【０１４１】
次に、我々は、他のＰＢＤ含有タンパク質のＰＣＮＡとの相互作用を分析した。我々は、追加のＮＬＳに融合するＰＣＮＡを含むベイト融合タンパク質、続いてＬａｃＩおよびＲＦＰ（ＮＬＳ−ＰＣＮＡ−ＬａｃＩ−ＲＦＰ）を生成した。ＧＦＰリガーゼＩと共発現する時に、ｌａｃオペレータアレイに局在化される双方の融合タンパク質は、ＰＣＮＡとＤＮＡリガーゼＩとの間の相互作用を示す。ＰＢＤの欠失は、ＤＮＡリガーゼＩの分散分布をもたらし、一方、ＤＮＡリガーゼＩのＰＢＤは、単独で、ｌａｃオペレータアレイでＰＣＮＡに結合するのに十分である（図８）。これは、ＤＮＡリガーゼＩのＰＢＤがＤＮＡ複製および修復部位を標的とするのに必要かつ十分である以前の研究と一致する（Ｃａｒｄｏｓｏ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｍｏｎｔｅｃｕｃｃｏ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｍｏｒｔｕｓｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．，２００６）。特に、Ｆ２Ｈアッセイを使用して、我々は、ＤＮＡリガーゼＩならびに単離されたＰＢＤがＳ相の外側でもＰＣＮＡに結合できることを実証することができた。同様に、我々は、Ｓ相細胞において、ＦＥＮ１、ｐ２１およびポリメラーゼδサブユニットｐ６６等の様々な追加の複製および修復タンパク質のＰＣＮＡへの結合を示すことができた（図９）。要約すると、我々は、複製タンパク質とＰＣＮＡとの間の相互作用は、Ｓ相に限定されないだけでなく、非Ｓ相細胞および複製機構の外側でも生じることを示すことができた。これは、Ｆ２Ｈアッセイが、生細胞におけるタンパク質間相互作用において細胞周期特異的変化を分析するための独特な可能性を提供することを例示する。
【０１４２】
実施例５：ハンチントン病に関連するタンパク質間相互作用の検出
Ｆ２Ｈアッセイが、他の細区画で起こるタンパク質間相互作用も検出するかどうかを調査するために、我々は、酵母二重ハイブリッド（Ｙ２Ｈ）アッセイによって、ハンチントン病の背景で同定されるタンパク質相互作用を用いて、Ｆ２Ｈアッセイを試験した（Ｇｏｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４）。我々は、１つの細胞質（ビメンチン）と２つの核（ＨＺＦＨおよびＳＵＭＯ３）タンパク質との相互作用を分析した。ビメンチンは、細胞骨格構成要素であるように表され、輸送プロセスに関与し、一方で、ＨＺＦＨおよびＳＵＭＯ３は、転写制御およびＤＮＡ維持に関与する（Ｇｏｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４）。これらのタンパク質は、赤色蛍光ｍＣｈｅｒｒｙ−ＬａｃＩ−ＮＬＳまたはＮＬＳ−ＧＦＰのいずれかと融合して、一連のベイトおよびプレイタンパク質を生成した。ｌａｃオペレータアレイを有するＢＨＫ細胞は、全ての可能な組み合わせの発現構築物を形質移入され、顕微鏡分析を受けた。我々は、これらの２つのタンパク質がベイトまたはプレイであるかどうかとは関係なく、ビメンチンとＨＺＦＨとの相互作用を検出できた（図４、データ示さず）。我々は、前述の通り、ビメンチンおよびＳＵＭＯ３が相互作用しない一方で、ＳＵＭＯ３とＨＺＦＨとの間の報告された相互作用も検出することができた（図４）（Ｇｏｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４）。これらの結果は、核および細胞質タンパク質の相互作用がＦ２Ｈアッセイを用いて研究され得ることを示す。
【０１４３】
実施例６：ミトコンドリア性タンパク質間の相互作用の検出
次に、我々は、Ｆ２Ｈアッセイが他の細胞小器官において生じるタンパク質間相互作用を検出するのにも適しているかどうかを調査した。そのために、我々は、２つのミトコンドリア性タンパク質であるＤＤＰ１（難聴ジストニアペプチド１）およびＴＩＭＭ１３との間の相互作用を分析した。双方のタンパク質は、６量体複合体を形成するように核コードされ、ミトコンドリア性内膜腔（ＩＭＳ）内に移入される（図５ａ）。ＩＭＳ内で、ＤＤＰ１−ＴＩＭＭ１３複合体は、ミトコンドリア性移入機構の疎水性タンパク質のミトコンドリア性内膜への移入を容易にする（Ｒｏｔｈｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１）。ＤＤＰ１遺伝子の変異は、進行性神経変性疾患である難聴−ジストニア−視神経萎縮症候群に関係した（Ｔｒａｎｅｂｊａｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。本Ｃ６６Ｗミスセンス変異は、末期の表現型を引き起こし、ＤＤＰ１の高度な保存Ｃｙｓ（４）モチーフに影響することが既知である。前の研究は、本アミノ酸交換がＩＭＳにおけるＤＤＰ１およびＴＩＭＭ１３との間の相互作用を破壊することを示した（Ｈｏｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２００２）。
【０１４４】
ＬａｃＩ−ＮＬＳ−ＴＩＭＭ１３およびＧＦＰタグ付けされた野生型（ＧＦＰ−ＤＤＰ１）または変異体ＤＤＰ１（ＧＦＰ−ＤＤＰ１C66W）プレイタンパク質を含む赤色蛍光ベイト融合タンパク質を使用して、我々は、Ｆ２Ｈアッセイを用いて、本特異的ミトコンドリア性タンパク質相互作用を分析した。我々は、ＧＦＰ−ＤＤＰ１がｌａｃオペレータアレイでＴＩＭＭ１３と共局在し（図５ｂ）、一方で、ＧＦＰ−ＤＤＰ１C66Wが均一に分散されたことを発見した（図５ｃ）。これらの結果は、Ｆ２Ｈアッセイが核の外側で生じるタンパク質間相互作用、およびこれらの相互作用を破壊する疾患関連点変異特徴付けの分析にも適していることを実証する。
【０１４５】
参考文献
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Ｇｏｅｈｌｅｒ， Ｈ．， Ｍ． Ｌａｌｏｗｓｋｉ， Ｕ． Ｓｔｅｌｚｌ， Ｓ． Ｗａｅｌｔｅｒ， Ｍ． Ｓｔｒｏｅｄｉｃｋｅ， Ｕ． Ｗｏｒｍ， Ａ． Ｄｒｏｅｇｅ， Ｋ．Ｓ． Ｌｉｎｄｅｎｂｅｒｇ， Ｍ． Ｋｎｏｂｌｉｃｈ， Ｃ． Ｈａｅｎｉｇ， Ｍ． Ｈｅｒｂｓｔ， Ｊ． Ｓｕｏｐａｎｋｉ， Ｅ． Ｓｃｈｅｒｚｉｎｇｅｒ， Ｃ． Ａｂｒａｈａｍ， Ｂ． Ｂａｕｅｒ， Ｒ． Ｈａｓｅｎｂａｎｋ， Ａ． Ｆｒｉｔｚｓｃｈｅ， Ａ．Ｈ． Ｌｕｄｅｗｉｇ， Ｋ． Ｂｕｓｓｏｗ， Ｓ．Ｈ． Ｃｏｌｅｍａｎ， Ｃ．Ａ． Ｇｕｔｅｋｕｎｓｔ， Ｂ．Ｇ． Ｌａｎｄｗｅｈｒｍｅｙｅｒ， Ｈ． Ｌｅｈｒａｃｈ， ａｎｄ Ｅ．Ｅ． Ｗａｎｋｅｒ． ２００４． Ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｎｅｔｗｏｒｋ ｌｉｎｋｓ ＧＩＴ１， ａｎ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｏｆ ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ， ｔｏ Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ
． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ． １５：８５３−６５．
Ｇｕｒｓｋａｙａ， Ｎ．Ｇ．， Ａ．Ｆ． Ｆｒａｄｋｏｖ， Ａ． Ｔｅｒｓｋｉｋｈ， Ｍ．Ｖ． Ｍａｔｚ， Ｙ．Ａ． Ｌａｂａｓ， Ｖ．Ｉ． Ｍａｒｔｙｎｏｖ， Ｙ．Ｇ． Ｙａｎｕｓｈｅｖｉｃｈ， Ｋ．Ａ． Ｌｕｋｙａｎｏｖ， ａｎｄ Ｓ．Ａ． Ｌｕｋｙａｎｏｖ． ２００１． ＧＦＰ−ｌｉｋｅ ｃｈｒｏｍｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｓ ａ ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ｆａｒ−ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ５０７：１６−２０．
Ｈｏｆｍａｎｎ， Ｓ．， Ｕ． Ｒｏｔｈｂａｕｅｒ， Ｎ． Ｍｕｈｌｅｎｂｅｉｎ， Ｗ． Ｎｅｕｐｅｒｔ， Ｋ．Ｄ． Ｇｅｒｂｉｔｚ， Ｍ． Ｂｒｕｎｎｅｒ， ａｎｄ Ｍ．Ｆ． Ｂａｕｅｒ． ２００２． Ｔｈｅ Ｃ６６Ｗ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅａｆｎｅｓｓ ｄｙｓｔｏｎｉａ ｐｅｐｔｉｄｅ １ （ＤＤＰ１） ａｆｆｅｃｔｓ ｔｈｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＤＤＰ１．ＴＩＭ１３ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｉｎｔｅｒｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｐａｃｅ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２７７：２３２８７−９３．
Ｈｏｒｔｏｎ， Ｒ．Ｍ．， Ｈ．Ｄ． Ｈｕｎｔ， Ｓ．Ｎ． Ｈｏ， Ｊ．Ｋ． Ｐｕｌｌｅｎ， ａｎｄ Ｌ．Ｒ． Ｐｅａｓｅ． １９８９． Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｈｙｂｒｉｄ ｇｅｎｅｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅｓ： ｇｅｎｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ． Ｇｅｎｅ． ７７：６１−８．
Ｊａｎｉｃｋｉ， Ｓ．Ｍ．， Ｔ． Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ， Ｓ．Ｅ． Ｓａｌｇｈｅｔｔｉ， Ｗ．Ｐ． Ｔａｎｓｅｙ， Ｒ． Ｓａｃｈｉｄａｎａｎｄａｍ， Ｋ．Ｖ． Ｐｒａｓａｎｔｈ， Ｔ． Ｒｉｅｄ， Ｙ． Ｓｈａｖ−Ｔａｌ， Ｅ． Ｂｅｒｔｒａｎｄ， Ｒ．Ｈ． Ｓｉｎｇｅｒ， ａｎｄ Ｄ．Ｌ． Ｓｐｅｃｔｏｒ． ２００４． Ｆｒｏｍ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｔｏ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ： ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ． Ｃｅｌｌ． １１６：６８３−９８．
Ｋａｌｄｅｒｏｎ， Ｄ．， Ｗ．Ｄ． Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ， Ａ．Ｆ． Ｍａｒｋｈａｍ， ａｎｄ Ａ．Ｅ． Ｓｍｉｔｈ． １９８４． Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ ４０ ｌａｒｇｅ−Ｔ ａｎｔｉｇｅｎ． Ｎａｔｕｒｅ． ３１１：３３−８．
Ｋｅｒｐｐｏｌａ， Ｔ．Ｋ． ２００６． Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｙ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ７：４４９−５６．
Ｌｕｋｙａｎｏｖ， Ｋ．Ａ．， Ａ．Ｆ． Ｆｒａｄｋｏｖ， Ｎ．Ｇ． Ｇｕｒｓｋａｙａ， Ｍ．Ｖ． Ｍａｔｚ， Ｙ．Ａ． Ｌａｂａｓ， Ａ．Ｐ． Ｓａｖｉｔｓｋｙ， Ｍ．Ｌ． Ｍａｒｋｅｌｏｖ， Ａ．Ｇ． Ｚａｒａｉｓｋｙ， Ｘ． Ｚｈａｏ， Ｙ． Ｆａｎｇ， Ｗ． Ｔａｎ， ａｎｄ Ｓ．Ａ． Ｌｕｋｙａｎｏｖ． ２０００． Ｎａｔｕｒａｌ ａｎｉｍａｌ ｃｏｌｏｒａｔｉｏｎ ｃａｎ Ｂｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ａ ｎｏｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２７５：２５８７９−８２．
Ｍａｅｄａ， Ｙ．， Ｔ．Ｃ． Ｈｕｎｔｅｒ， Ｄ．Ｅ． Ｌｏｕｄｙ， Ｖ． Ｄａｖｅ， Ｖ． Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ， ａｎｄ Ｊ．Ａ． Ｗｈｉｔｓｅｔｔ． ２００６． ＰＡＲＰ−２ ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｗｉｔｈ ＴＴＦ−１ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｂ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２８１：９６００−６．
Ｍａｓｓｏｎ， Ｍ．， Ｃ． Ｎｉｅｄｅｒｇａｎｇ， Ｖ． Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ， Ｓ． Ｍｕｌｌｅｒ， Ｊ． Ｍｅｎｉｓｓｉｅｒ−ｄｅ Ｍｕｒｃｉａ， ａｎｄ Ｇ． ｄｅ Ｍｕｒｃｉａ． １９９８． ＸＲＣＣ１ ｉｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ） ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ａｎｄ ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｉｔｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １８：３５６３−７１．
Ｍａｔｚ， Ｍ．Ｖ．， Ａ．Ｆ． Ｆｒａｄｋｏｖ， Ｙ．Ａ． Ｌａｂａｓ， Ａ．Ｐ． Ｓａｖｉｔｓｋｙ， Ａ．Ｇ． Ｚａｒａｉｓｋｙ， Ｍ．Ｌ． Ｍａｒｋｅｌｏｖ， ａｎｄ Ｓ．Ａ． Ｌｕｋｙａｎｏｖ． １９９９． Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｎｏｎｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ａｎｔｈｏｚｏａ ｓｐｅｃｉｅｓ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７：９６９−７３．
Ｍａｕｌ， Ｇ．Ｇ．， Ｄ． Ｎｅｇｏｒｅｖ， Ｐ． Ｂｅｌｌ， ａｎｄ Ａ．Ｍ． Ｉｓｈｏｖ． ２０００． Ｒｅｖｉｅｗ： ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ＮＤ１０， ＰＭＬ ｂｏｄｉｅｓ， ｏｒ ＰＯＤｓ． Ｊ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ． １２９：２７８−８７．
Ｍｅｄｅｒ， Ｖ．Ｓ．， Ｍ． Ｂｏｅｇｌｉｎ， Ｇ． ｄｅ Ｍｕｒｃｉａ， ａｎｄ Ｖ． Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ． ２００５． ＰＡＲＰ−１ ａｎｄ ＰＡＲＰ−２ ｉｎｔｅｒａｃｔ ｗｉｔｈ ｎｕｃｌｅｏｐｈｏｓｍｉｎ／Ｂ２３ ａｎｄ ａｃｃｕｍｕｌａｔｅ ｉｎ 転写ａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｎｕｃｌｅｏｌｉ． Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ． １１８：２１１−２２．
Ｍｅｒｚｌｙａｋ， Ｅ．Ｍ．， Ｊ． Ｇｏｅｄｈａｒｔ， Ｄ． Ｓｈｃｈｅｒｂｏ， Ｍ．Ｅ． Ｂｕｌｉｎａ， Ａ．Ｓ． Ｓｈｃｈｅｇｌｏｖ， Ａ．Ｆ． Ｆｒａｄｋｏｖ， Ａ． Ｇａｉｎｔｚｅｖａ， Ｋ．Ａ． Ｌｕｋｙａｎｏｖ， Ｓ． Ｌｕｋｙａｎｏｖ， Ｔ．Ｗ． Ｇａｄｅｌｌａ， ａｎｄ Ｄ．Ｍ． Ｃｈｕｄａｋｏｖ． ２００７． Ｂｒｉｇｈｔ ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ａｎ ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｌｉｆｅｔｉｍｅ． Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ． ４：５５５−７．
Ｍｉｌｌｅｒ， Ｃ．Ｌ．， Ｍ．Ｍ． Ａｒｎｏｌｄ， Ｔ．Ｊ． Ｂｒｏｅｒｉｎｇ， Ｃ． Ｅｉｃｈｗａｌｄ， Ｊ． Ｋｉｍ， Ｊ．Ｂ． Ｄｉｎｏｓｏ， ａｎｄ Ｍ．Ｌ． Ｎｉｂｅｒｔ． ２００７． Ｖｉｒｕｓ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｌａｔｆｏｒｍｓ ｆｏｒ ｖｉｓｕａｌｉｚｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓ ｉｎｓｉｄｅ ｃｅｌｌｓ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ． ６：１０２７−３８．
Ｍｉｙａｗａｋｉ， Ａ． ２００３． Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｐａｔｉａｌ ａｎｄ ｔｅｍｐｏｒａｌ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ． Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ． ４：２９５−３０５．
Ｍｏｌｌｅｒ， Ａ．， Ｈ． Ｓｉｒｍａ， Ｔ．Ｇ． Ｈｏｆｍａｎｎ， Ｓ． Ｒｕｅｆｆｅｒ， Ｅ． Ｋｌｉｍｃｚａｋ， Ｗ． Ｄｒｏｇｅ， Ｈ． Ｗｉｌｌ， ａｎｄ Ｍ．Ｌ． Ｓｃｈｍｉｔｚ． ２００３． ＰＭＬ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ２ （ＨＩＰＫ２）−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐ５３ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ａｒｒｅｓｔ ｂｕｔ ｉｓ ｄｉｓｐｅｎｓａｂｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ＨＩＰＫ ｄｏｍａｉｎｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６３：４３１０−４．
Ｍｏｎｔｅｃｕｃｃｏ， Ａ．， Ｅ． Ｓａｖｉｎｉ， Ｆ． Ｗｅｉｇｈａｒｄｔ， Ｒ． Ｒｏｓｓｉ， Ｇ． Ｃｉａｒｒｏｃｃｈｉ， Ａ． Ｖｉｌｌａ， ａｎｄ Ｇ． Ｂｉａｍｏｎｔｉ． １９９５． Ｔｈｅ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ Ｉ ｃｏｎｔａｉｎｓ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｒｅｃｔｓ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ｔｏ ｓｉｔｅｓ ｏｆ ＤＮＡ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ． Ｅｍｂｏ Ｊ． １４：５３７９−８６．
Ｍｏｒｔｕｓｅｗｉｃｚ， Ｏ．， Ｕ． Ｒｏｔｈｂａｕｅｒ， Ｍ．Ｃ． Ｃａｒｄｏｓｏ， ａｎｄ Ｈ． Ｌｅｏｎｈａｒｄｔ． ２００６． Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ｏｆ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ Ｉ ａｎｄ ＩＩＩ ｔｏ ＤＮＡ ｒｅｐａｉｒ ｓｉｔｅｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３４：３５２３−３２．
Ｍｏｒｔｕｓｅｗｉｃｚ， Ｏ．， Ｌ． Ｓｃｈｅｒｍｅｌｌｅｈ， Ｊ． Ｗａｌｔｅｒ， Ｍ．Ｃ． Ｃａｒｄｏｓｏ， ａｎｄ Ｈ． Ｌｅｏｎｈａｒｄｔ． ２００５． Ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ｏｆ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｉ ｔｏ ＤＮＡ ｒｅｐａｉｒ ｓｉｔｅｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．
Ｍｕｒｐｈｙ， Ｇ．， Ｍ．Ｉ． Ｃｏｃｋｅｔｔ， Ｒ．Ｖ． Ｗａｒｄ， ａｎｄ Ａ．Ｊ． Ｄｏｃｈｅｒｔｙ． １９９１． Ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｌａｓｔｉｎ， ｔｙｐｅ ＩＶ ｃｏｌｌａｇｅｎ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ． Ａ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ９５ ｋＤａ ａｎｄ ７２ ｋＤａ ｇｅｌａｔｉｎａｓｅｓ， ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎｓ−１ ａｎｄ −２ ａｎｄ ｐｕｎｃｔｕａｔｅｄ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ （ＰＵＭＰ）． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ． ２７７ （ Ｐｔ １）：２７７−９．
Ｎｅｗｍａｎ， Ｊ．Ｒ．， Ｓ． Ｇｈａｅｍｍａｇｈａｍｉ， Ｊ． Ｉｈｍｅｌｓ， Ｄ．Ｋ． Ｂｒｅｓｌｏｗ， Ｍ． Ｎｏｂｌｅ， Ｊ．Ｌ． ＤｅＲｉｓｉ， ａｎｄ Ｊ．Ｓ． Ｗｅｉｓｓｍａｎ． ２００６． Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｒｅｖｅａｌｓ ｔｈｅ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｎｏｉｓｅ． Ｎａｔｕｒｅ． ４４１：８４０−６．
Ｐａｒｒｉｓｈ， Ｊ．Ｒ．， Ｋ．Ｄ． Ｇｕｌｙａｓ， ａｎｄ Ｒ．Ｌ． Ｆｉｎｌｅｙ， Ｊｒ． ２００６． Ｙｅａｓｔ ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｔｏ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ ｍａｐｐｉｎｇ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７：３８７−９３．
Ｐｈａｉｒ， Ｒ．Ｄ．， ａｎｄ Ｔ． Ｍｉｓｔｅｌｉ． ２０００． Ｈｉｇｈ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅｕｓ． Ｎａｔｕｒｅ． ４０４：６０４−９．
Ｒｏｂｉｎｅｔｔ， Ｃ．Ｃ．， Ａ． Ｓｔｒａｉｇｈｔ， Ｇ． Ｌｉ， Ｃ． Ｗｉｌｌｈｅｌｍ， Ｇ． Ｓｕｄｌｏｗ， Ａ． Ｍｕｒｒａｙ， ａｎｄ Ａ．Ｓ． Ｂｅｌｍｏｎｔ． １９９６． Ｉｎ ｖｉｖｏ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｌａｃ ｏｐｅｒａｔｏｒ／ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ． Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １３５：１６８５−７００．
Ｒｏｔｈｂａｕｅｒ， Ｕ．， Ｓ． Ｈｏｆｍａｎｎ， Ｎ． Ｍｕｈｌｅｎｂｅｉｎ， Ｓ．Ａ． Ｐａｓｃｈｅｎ， Ｋ．Ｄ． Ｇｅｒｂｉｔｚ， Ｗ． Ｎｅｕｐｅｒｔ， Ｍ． Ｂｒｕｎｎｅｒ， ａｎｄ Ｍ．Ｆ． Ｂａｕｅｒ． ２００１． Ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅａｆｎｅｓｓ ｄｙｓｔｏｎｉａ ｐｅｐｔｉｄｅ １ （ＤＤＰ１） ｉｎ ｉｍｐｏｒｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｔｉｍ２３ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｉｎｎｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２７６：３７３２７−３４．
Ｒｏｔｈｂａｕｅｒ， Ｕ．， Ｋ． Ｚｏｌｇｈａｄｒ， Ｓ． Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ， Ａ． Ｓｃｈｅｐｅｒｓ， Ｍ．Ｃ． Ｃａｒｄｏｓｏ， ａｎｄ Ｈ． Ｌｅｏｎｈａｒｄｔ． ２００７． Ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｎａｎｏｔｒａｐ ｆｏｒ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ ｗｉｔｈ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．
Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ， Ｄ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ； Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ２００１．
Ｓｃｈｅｒｍｅｌｌｅｈ， Ｌ．， Ｆ． Ｓｐａｄａ， Ｈ．Ｐ． Ｅａｓｗａｒａｎ， Ｋ． Ｚｏｌｇｈａｄｒ， Ｊ．Ｂ． Ｍａｒｇｏｔ， Ｍ．Ｃ． Ｃａｒｄｏｓｏ， ａｎｄ Ｈ． Ｌｅｏｎｈａｒｄｔ． ２００５． Ｔｒａｐｐｅｄ ｉｎ ａｃｔｉｏｎ： ｄｉｒｅｃｔ ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ． Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ． ２：７５１−７５６．
Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ， Ｖ．， Ｊ．Ｃ． Ａｍｅ， Ｐ． Ｄｏｌｌｅ， Ｉ． Ｓｃｈｕｌｔｚ， Ｂ． Ｒｉｎａｌｄｉ， Ｖ． Ｆｒａｕｌｏｂ， Ｊ． Ｍｅｎｉｓｓｉｅｒ−ｄｅ Ｍｕｒｃｉａ， ａｎｄ Ｇ． ｄｅ Ｍｕｒｃｉａ． ２００２． Ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ） ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−２ （ＰＡＲＰ−２） ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｂａｓｅ ｅｘｃｉｓｉｏｎ ＤＮＡ ｒｅｐａｉｒ ｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＰＡＲＰ−１ ａｎｄ ＸＲＣＣ１． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２７７：２３０２８−３６．
Ｓｅｋａｒ， Ｒ．Ｂ．， ａｎｄ Ａ． Ｐｅｒｉａｓａｍｙ． ２００３． Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ （ＦＲＥＴ） ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｌｉｖｅ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｓ． Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １６０：６２９−３３．
Ｓｈａｎｅｒ， Ｎ．Ｃ．， Ｒ．Ｅ． Ｃａｍｐｂｅｌｌ， Ｐ．Ａ． Ｓｔｅｉｎｂａｃｈ， Ｂ．Ｎ． Ｇｉｅｐｍａｎｓ， Ａ．Ｅ． Ｐａｌｍｅｒ， ａｎｄ Ｒ．Ｙ． Ｔｓｉｅｎ． ２００４． Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ ｒｅｄ， ｏｒａｎｇｅ ａｎｄ ｙｅｌｌｏｗ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ ｓｐ． ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２２：１５６７−７２．
Ｓｐｏｒｂｅｒｔ， Ａ．， Ｐ． Ｄｏｍａｉｎｇ， Ｈ． Ｌｅｏｎｈａｒｄｔ， ａｎｄ Ｍ．Ｃ． Ｃａｒｄｏｓｏ． ２００５． ＰＣＮＡ ａｃｔｓ ａｓ ａ ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ ｌｏａｄｉｎｇ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｉｅｎｔｌｙ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ Ｏｋａｚａｋｉ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３３：３５２１−８．
Ｔｅｒｓｋｉｋｈ， Ａ．， Ａ． Ｆｒａｄｋｏｖ， Ｇ． Ｅｒｍａｋｏｖａ， Ａ． Ｚａｒａｉｓｋｙ， Ｐ． Ｔａｎ， Ａ．Ｖ． Ｋａｊａｖａ， Ｘ． Ｚｈａｏ， Ｓ． Ｌｕｋｙａｎｏｖ， Ｍ． Ｍａｔｚ， Ｓ． Ｋｉｍ， Ｉ． Ｗｅｉｓｓｍａｎ， ａｎｄ Ｐ． Ｓｉｅｂｅｒｔ． ２０００． ”Ｆｌｕｏｒｅｓｃ
ｅｎｔ ｔｉｍｅｒ”： ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈａｔ ｃｈａｎｇｅｓ ｃｏｌｏｒ
ｗｉｔｈ ｔｉｍｅ． Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２９０：１５８５−８．
Ｔｒａｎｅｂｊａｅｒｇ， Ｌ．， Ｃ． Ｓｃｈｗａｒｔｚ， Ｈ． Ｅｒｉｋｓｅｎ， Ｓ． Ａｎｄｒｅａｓｓｏｎ， Ｖ． Ｐｏｎｊａｖｉｃ， Ａ． Ｄａｈｌ， Ｒ．Ｅ． Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ， Ｍ． Ｍａｙ， Ｆ． Ａｒｅｎａ， Ｄ． Ｂａｒｋｅｒ， ａｎｄ ｅｔ ａｌ． １９９５． Ａ ｎｅｗ Ｘ ｌｉｎｋｅｄ ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ ｄｅａｆｎｅｓｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｗｉｔｈ ｂｌｉｎｄｎｅｓｓ， ｄｙｓｔｏｎｉａ， ｆｒａｃｔｕｒｅｓ， ａｎｄ ｍｅｎｔａｌ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｓ ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ Ｘｑ２２． Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ． ３２：２５７−６３．
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【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質間相互作用を検出するための生体外の方法に関し、（ａ）（ｉ）細胞において発現する時に、細胞の核において別個の部位で蓄積する（ポリ）ペプチドと、（ｉｉ）ＧＦＰに特異的に結合する（ポリ）ペプチドとを含む第１の融合タンパク質を真核細胞において発現させるステップと、（ｂ）（ｉ）ＧＦＰと（ｉｉ）ベイト（ポリ）ペプチドとを含む第２の融合タンパク質を同一細胞において発現させるステップと、（ｃ）（ｉ）ＧＦＰのそれとは異なる励起および／または発光波長の蛍光（ポリ）ペプチドと、（ｉｉ）プレイ（ポリ）ペプチドとを含む第３の融合タンパク質を同一細胞において発現させるステップと、（ｄ）励起時に、細胞における第２および第３の融合タンパク質の蛍光部の蛍光発光を検出するステップと、を含み、細胞核における双方の融合タンパク質の蛍光発光の共局在は、ベイトおよびプレイ（ポリ）ペプチドの相互作用を示す。本発明は、タンパク質間相互作用を検出するための生体外の方法にも関し、（ａ）（ｉ）蛍光（ポリ）ペプチドと、（ｉｉ）細胞で発現する時に、細胞の核において別個の部位で蓄積する（ポリ）ペプチドと、（ｉｉｉ）ベイト（ポリ）ペプチドとを含む第１の融合タンパク質を真核細胞で発現させるステップと、（ｂ）（ｉ）該第１の融合タンパク質に含まれる蛍光（ポリ）ペプチドのそれとは異なる励起／発光波長の蛍光（ポリ）ペプチドと、（ｉｉ）プレイ（ポリ）ペプチドとを含む第２の融合タンパク質を同一細胞において発現されるステップと、（ｃ）励起時に、細胞において第１および第２の融合タンパク質の蛍光部の蛍光発光を検出するステップと、を含み、細胞核における双方の融合タンパク質の蛍光発光の共局在は、ベイトおよびプレイ（ポリ）ペプチドの相互作用を示す。さらに、本発明は、２つの（ポリ）ペプチドの相互作用を調節する化合物を同定するための方法、および２つのタンパク質の第３のタンパク質との相互作用の相対強度を判断するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書において、特許出願および製造業者のマニュアルを含む多くの文献を引用する。本発明の特許性に関係すると見なされないが、これらの文献の開示は、その全体において参照により本明細書に組み込まれる。より具体的には、全ての参考文献は、個々の文献のそれぞれが、参照により組み込まれることを具体的に、かつ個別に示されるかのように同様の範囲で参照により組み込まれる。
【０００３】
ヒトゲノムの配列決定後の次の課題は、今や、細胞機能の根底にある複雑なタンパク質ネットワークの分析である。過去１０年間で、生化学から遺伝または細胞ベースのアプローチに及ぶ、タンパク質間相互作用を研究するための広範な様々の方法が開発されてきた。親和性精製法または共免疫沈降法（Ｃｏ−ＩＰ）等の生化学的方法は、生体外のタンパク質複合体の検出を可能にする。酵母二重ハイブリッド（Ｙ２Ｈ）システム等の遺伝学的方法は、細胞環境内の相互作用の効果的な高スループットスクリーニングを可能にする。しかしながら、酵母における哺乳類タンパク質間相互作用の分析は、例えば、翻訳後修飾を通した、タンパク質間相互作用を調節する細胞因子の欠損または不十分な保護に見舞われ得る（Ｐａｒｒｉｓｈ ｅｔ ａｌ．，２００６）。さらに、本方法は、煩雑で、誤りが生じやすい。
【０００４】
近年、タンパク質間相互作用の細胞内可視化のための新規蛍光ベースの方法が導入された。蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）（Ｍｉｙａｗａｋｉ，２００３； Ｓｅｋａｒ ａｎｄ Ｐｅｒｉａｓａｍｙ，２００３）および２分子蛍光相補性（ＢｉＦＣ）（Ｋｅｒｐｐｏｌａ，２００６）の２つの確立された技術は、蛍光標識タンパク質またはその断片の発現に基づく。しかしながら、ＢｉＦＣが、非可逆的相補性、およびタンパク質間相互作用のリアルタイム検出ができないフルオロフォアの緩慢な成熟に基づく一方で、ＦＲＥＴは、高価な機器および高度な技術専門知識を必要とする（Ｋｅｒｐｐｏｌａ，２００６）。
【０００５】
これら全ての方法には、固有の弱点があり、典型的には、より信頼性のある結果を得るために組み合わせられる。
【０００６】
したがって、タンパク質間相互作用を検出するための改善された方法が必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｐａｒｒｉｓｈ， Ｊ．Ｒ．， Ｋ．Ｄ． Ｇｕｌｙａｓ， ａｎｄ Ｒ．Ｌ． Ｆｉｎｌｅｙ， Ｊｒ． ２００６． Ｙｅａｓｔ ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｔｏ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ ｍａｐｐｉｎｇ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７：３８７−９３
【非特許文献２】Ｍｉｙａｗａｋｉ， Ａ． ２００３． Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｐａｔｉａｌ ａｎｄ ｔｅｍｐｏｒａｌ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ． Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ． ４：２９５−３０５
【非特許文献３】Ｓｅｋａｒ， Ｒ．Ｂ．， ａｎｄ Ａ． Ｐｅｒｉａｓａｍｙ． ２００３． Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ （ＦＲＥＴ） ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｌｉｖｅ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｓ． Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １６０：６２９−３３．
【非特許文献４】Ｋｅｒｐｐｏｌａ， Ｔ．Ｋ． ２００６． Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｙ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ７：４４９−５６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記技術上の問題への解決策は、特許請求の範囲で特徴付けられる実施形態を提供することにより達成される。
【０００９】
したがって、本発明の第１の態様は、タンパク質間相互作用を検出するための生体外の方法に関し、（ａ）（ｉ）細胞において発現する時に、細胞の核において別個の部位で蓄積する（ポリ）ペプチドと、（ｉｉ）ＧＦＰに特異的に結合する（ポリ）ペプチドとを含む第１の融合タンパク質を真核細胞において発現させるステップと、（ｂ）（ｉ）ＧＦＰと（ｉｉ）ベイト（ポリ）ペプチドとを含む第２の融合タンパク質を同一細胞において発現させるステップと、（ｃ）（ｉ）ＧＦＰのそれとは異なる励起および／または発光波長の蛍光（ポリ）ペプチドと、（ｉｉ）プレイ（ポリ）ペプチドとを含む第３の融合タンパク質を同一細胞において発現させるステップと、（ｄ）励起時に、細胞における第２および第３の融合タンパク質の蛍光部の蛍光発光を検出するステップと、を含み、細胞核における双方の融合タンパク質の蛍光発光の共局在は、ベイトおよびプレイ（ポリ）ペプチドの相互作用を示す。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】蛍光二重ハイブリッド（Ｆ２Ｈ）アッセイの概略を示す。
【図２】ＤＮＡリガーゼＩＩＩのＸＲＣＣ１の特異的な相互作用を示す。
【図３】細胞周期の独立したＤｎｍｔ１のＰＣＮＡとの相互作用のＦ２Ｈ分析を示す。
【図４】Ｆ２Ｈによるハンチントン病関連の相互作用の分析を示す。
【図５】ミトコンドリアタンパク質間相互作用の分析、および難聴−ジストニア−視神経萎縮症候群に付随する変異の作用を示す。
【図６】ＸＲＣＣ１を伴うＤＮＡリガーゼＩＩＩのＢＲＣＴ媒介相互作用を示す。
【図７】ＸＲＣＣ１のＰＣＮＡ、ＰＡＲＰ−１およびＰＡＲＰ−２との相互作用を示す。
【図８】ＰＢＤ媒介された、ＤＮＡリガーゼＩのＰＣＮＡとの相互作用を示す。
【図９】様々な複製および修復タンパク質のＰＣＮＡとの相互作用を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
「タンパク質間相互作用」という用語は、２つ以上のタンパク質性化合物、すなわち、ポリ（ペプチド）またはタンパク質の特異的相互作用を指す。特異的相互作用は、最小結合強度または親和性により特徴付けられる。特異的相互作用の結合親和性は、概して、ｐＭからｍＭの範囲に達し、例えば、ｐＨ値、イオン強度、共因子の存在等の化学環境にも大きく依存する。本発明に照らして、該用語は、具体的には、生理学的条件下、すなわち、細胞において生じるタンパク質間相互作用を指す。
【００１２】
「真核細胞において発現」という用語は、選択された細胞において機能する適切な発現制御要素を使用する、本発明の融合タンパク質の転写および翻訳を指す。このように、個々の融合タンパク質の結合特性は、細胞発現系において試験されてもよい。このために、融合タンパク質をコードする核酸分子が、概して、発現系に依存する組成物である、適切な発現ベクターにクローン化されてもよい。本発明に関して、発現系は、真核生物、好ましくは、哺乳類である。典型的な哺乳類の発現ベクターは、ｍＲＮＡの転写の開始、タンパク質コード配列、および転写の中止および転写物のポリアデニル化に必要なシグナルを媒介するプロモータ要素を含む。追加要素は、エンハンサー、コザック配列、ならびにＲＮＡスプライシングのためのドナーおよびアクセプター部位が両端にある介在配列を含んでもよい。極めて効率的な転写は、ＳＶ４０からの初期および後期プロモータ、例えば、ＲＳＶ、ＨＴＬＶＩ、ＨＩＶＩ等のレトロウイルスからの長い末端反復配列（ＬＴＲ）、ならびにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモータを用いて達成され得る。しかしながら、細胞要素もまた使用され得る（例えば、ヒトアクチンプロモータ）。転写の開始を確実にする調節要素の可能な例には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、ＲＳＶプロモータ（ラウス肉腫ウイルス）、ｌａｃＺプロモータ、ｇａｌ１０プロモータ、ヒト延長因子１ａプロモータ、ＣＭＶエンハンサー、ＣａＭキナーゼプロモータ、オートグラファ・カルフォルニカ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）多角体プロモータ、またはＳＶ４０エンハンサーが含まれる。転写終結シグナルの例は、ＳＶ４０−ポリ−Ａ部位もしくはｔｋ−ポリ−Ａ部位、またはＳＶ４０、ｌａｃＺ、およびポリヌクレオチドの下流である、ＡｃＭＮＰＶ多角体ポリアデニル化シグナルである。さらに、複製の開始点、薬剤耐性遺伝子、制御因子（誘導性プロモータの一部として）、または内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）等の要素も含まれてもよい。
【００１３】
ショウジョウバエに好適な発現ベクターは、ショウジョウバエメタロチオネイン（ＭＴ）プロモータを使用する、ｐＭＴ ＤＥＳ系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（Ｂｕｎｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９８８）、またはショウジョウバエアクチン５Ｃプロモータを使用する、ｐＡＣ５．１に属するものである。ＧＡＬ４誘導性ＵＳＡプロモータを使用するベクターは、ｐＵＡＳＴである。酵母ベクターは、ｐＹＥｐベクター（Ｇａｌ１０プロモータを使用）、ｐＹＸ１４２（単一コピーベクター）、またはｐＹＸ２３２（ＴＰＩトリオースリン酸イソメラーゼプロモータを使用する２μプラスミド（双方ともＮｏｖａｇｅｎ）である。
【００１４】
使用され得る哺乳類の宿主細胞としては、限定されないが、ヒトＨｅｌａ、２９３、Ｈ９、ＳＨ−ＥＰ１、およびジャーカット細胞、マウスＮＩＨ３Ｔ３およびＣ２Ｃ１２細胞、Ｃｏｓ１、Ｃｏｓ７およびＣＶ１、ウズラＱＣ１−３細胞、マウスＬ細胞、シリアンゴールデンベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が挙げられる。代替的に、融合タンパク質は、染色体に組み込まれる遺伝子構築物を含む安定した細胞株で発現され得る。Ｄｈｆｒ、ｇｐｔ、ネオマイシン、ハイグロマイシン等の選択性マーカを用いた同時形質移入は、形質移入された細胞の同定および単離を可能にする。形質移入された核酸分子は、また、多量のコードされた融合タンパク質を発現するように、細胞で増幅され得る。ｄｈｆｒ（ジヒドロ葉酸還元酵素）マーカは、数百または数千の関心対象の遺伝子のコピーを保有する細胞株を発生させるために有用である。別の有用な選択マーカは、酵素グルタミンシンターゼ（ＧＳ）である（Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。これらのマーカを使用して、哺乳類細胞を、選択培地で増殖され、高抵抗性を有する細胞を選択する。上述の宿主細胞に適した培地および条件は、当該技術分野で既知である。
【００１５】
「融合タンパク質」という用語は、少なくとも２つの異なるタンパク質または（ポリ）ペプチドに由来する配列から成る、キメラタンパク質を指す。本発明の教示に従って、例示的な融合タンパク質において、ベイト（ポリ）ペプチドは、細胞で発現する時に、細胞の核において別個の部位で蓄積する、蛍光（ポリ）ペプチドおよび（ポリ）ペプチドに融合される。代替的に、プレイ（ポリ）ペプチドは、蛍光（ポリ）ペプチドに融合される。融合は、本発明の融合タンパク質の構成要素をコードする核酸分子のフレーム融合をもたらす限り、当業者に既知の任意の技術によって実施されてもよい。構成要素の融合は、任意の順番で達成されてもよい。従来、２つ以上の個別の（ポリ）ペプチドまたはドメインからの融合タンパク質の生成は、（Ｈｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９）に記述される「重複拡張による両側スプライシング」に基づく。単一（ポリ）ペプチドに対してコードする断片は、２つの個別の一次ＰＣＲ反応において生成される。一次ＰＣＲ反応における内部プライマーは、二次ＰＣＲにおいて、２つのドメイン断片の融合を可能にする、有意な約２０ｂｐの相補的領域を含む。代替的に、コード領域は、自然に発生するか、または組み換えＤＮＡ技術により導入されるかのいずれかであってもよい、制限部位を利用することにより融合されてもよい。
【００１６】
本明細書で使用される際、「（ポリ）ペプチド」という用語は、最大３０のアミノ酸からなるペプチド群、ならびに３０以上のアミノ酸からなるポリペプチド群を含む、分子群を説明する。また、定義に沿って、「（ポリ）ペプチド」という用語は、タンパク質の断片を説明する。（ポリ）ペプチドは、２量体、３量体、および高オリゴマーをさらに形成してもよい、すなわち、１つ以上の（ポリ）ペプチド分子からなってもよい。このような２量体、３量体等を形成する（ポリ）ペプチド分子は、同一、または異なってもよい。したがって、対応する高次構造は、ホモまたはヘテロ２量体、ホモまたはヘテロ３量体等と呼ばれる。「（ポリ）ペプチド」および「タンパク質」という用語は、また、自然に修飾された（ポリ）ペプチド／タンパク質を指し、該修飾は、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化等により達成される。このような修飾は、当該技術分野において公知である。
【００１７】
「蛍光（ポリ）ペプチド」または「蛍光タンパク質」という用語は、特定の波長での励起時に、蛍光光線を発光する（ポリ）ペプチドを指す。様々な蛍光タンパク質が本発明で使用され得る。このような蛍光タンパク質の一群としては、発光オワンクラゲから単離された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ならびにシアン蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質等の数多くのＧＦＰ変種が挙げられる（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｚｉｍｍｅｒ，２００２）。典型的には、これらの変種は、それぞれ、配列番号１のアミノ酸配列または配列番号２の核酸配列と約８０％またはそれ以上の配列同一性を共有する。色移動ＧＦＰ変異体は、青から黄緑の発光色の、増大した輝度、および光安定性を有する。（Ｔｓｉｅｎ，１９９８）。増強型黄色蛍光タンパク質と呼ばれるこのようなＧＦＰ変異体の１つは、５２９ｎｍで発光極大を示す。修飾された励起および発光スペクトル（Ｔｓｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許出願第２００２０１２３１ １３Ａ１号）、増強型蛍光強度および熱抵抗（Ｔｈａｓｔｒｕｐ ｅｔ ａｌ．，米国特許出願第２００２０１０７３６２Ａ１号；Ｂｊｏｒｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許出願第２００２０１７７１８９Ａ１号）、および減少された酸素レベル下の発色団形成（Ｆｉｓｈｅｒ，米国特許出願第６，４１４，１１９号）を有する追加のＧＦＰベース変異体も説明される。
【００１８】
別の蛍光タンパク質群としては、これに限定されないが、例えば、それぞれ、配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号４の核酸配列等、サンゴイソギンチャクモドキから単離された赤色蛍光タンパク質ＤｓＲｅｄ（Ｍａｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９９）を含む、花虫綱から単離された蛍光タンパク質が挙げられる（例えば、受け入れ番号ＡＦ１６８４１９を参照）。ＤｓＲｅｄおよび他の花虫綱蛍光タンパク質は、オワンクラゲの野生型ＧＦＰに約２６〜３０％のみのアミノ酸配列同一を共有するが、ＧＦＰの１１鎖βバレル構造特性の形成を示す、全ての重要なモチーフは保存される。ＤｓＲｅｄの結晶構造も解明され、ＧＦＰの１１鎖βバレル構造特性の保存を示す（ＭＭＤＢ Ｉｄ：５７４２）。
【００１９】
多くの長波長赤色蛍光タンパク質ＤｓＲｅｄの変異体も説明され、同様に、蛍光（ポリ）ペプチドを含む本発明の融合タンパク質の生成に使用されてもよい。例えば、近年説明される、さらに赤色に移動される発光スペクトルを伴うＤｓＲｅｄ変異体は、本発明の実施で使用されてもよい（Ｂａｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｔｅｒｓｋｉｋｈ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｗｉｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１）。
【００２０】
ＤｓＲｅｄのモノマー派生形は、例えば、ｍＲＦＰ（例えば、配列番号５のアミノ酸配列、または配列番号６の核酸配列を有する）、ｍＲＦＰ１（Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００２）、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＯｒａｎｇｅもしくはｍＰｌｕｍ（Ｓｈａｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４）、またはＴａｇＲＦＰ（Ｍｅｒｚｌｙａｋ ｅｔ ａｌ．，２００７）である。
【００２１】
つい最近、花虫綱のウミシイタケおよびレニラ・コレキリ由来のＧＦＰが説明された（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，米国特許出願第２００３００１３８４９号）。
【００２２】
多くの海洋生命由来のますます多くの他の蛍光タンパク質が、最近、説明され、タンパク質データバンクは、現在、多くのＧＦＰおよびＧＦＰ変異体結晶構造、ならびに様々なＧＦＰ類似体の結晶構造を一覧に記載している。サンゴ、ウミエラ、ホヤ、およびイソギンチャク由来のＧＦＰに類似すると推測される関連蛍光タンパク質が説明され、蛍光（ポリ）ペプチドを含む本発明の融合タンパク質の生成に使用されてもよい（概要については（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｚｉｍｍｅｒ，２００２）を参照のこと）。
【００２３】
アネモニア・マジャノ、スナギンチャク、ディスクコーラル、およびツツウミヅタ由来の蛍光タンパク質も報告されている（Ｍａｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９９）
。イシサンゴであるヒユサンゴからクローン化された蛍光タンパク質は、緑色、黄色、および赤色光を発光すること、およびＵＶ線に曝露されると、緑色光から赤色光発光に変換することが報告されている（Ａｎｄｏ ｅｔ ａｌ．，２００２）。近年説明されるイソギンチャク由来の蛍光タンパク質は、ヘビイソギンチャクからクローン化された緑色およびオレンジ色蛍光タンパク質（Ｗｉｅｄｅｎｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０００）、センジュイソギンチャクの触手からクローン化された自然増強型緑色蛍光タンパク質（Ｔｕ ｅｔ ａｌ．，２００３）、ヘビイソギンチャクからクローン化された弱い赤色蛍光を表す、一般的な非蛍光紫色素タンパク質、および遠赤色移動発光スペクトル（５９５ｎｍ）を示すその変異体（Ｌｕｋｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０００）を含む。
【００２４】
加えて、発色団および蛍光特性を有するＧＦＰ関連タンパク質の別のクラスが説明される。サンゴ派生タンパク質のこのような群の１つであるポシロポリン（ｐｏｃｉｌｌｏｐｏｒｉｎ）は、広範のスペクトルおよび蛍光特徴を示す（Ｄｏｖｅ ａｎｄ Ｈｏｅｇｈ−Ｇｕｌｄｂｅｒｇ，１９９９，ＰＣＴ出願第ＷＯ００１４６２３３号；（Ｄｏｖｅ ｅｔ ａｌ．，２００１））。近年、造礁サンゴであるシモコモンサンゴ由来のポシロポリン（ｐｏｃｉｌｌｏｐｏｒｉｎ）Ｒｔｍｓ５の精製および結晶化が説明されている（Ｂｅｄｄｏｅ ｅｔ ａｌ．，２００３）。Ｒｔｍｓ５は、色は藍色であるが、蛍光は弱い。しかしながら、Ｒｔｍｓ５ならびにＲｔｍｓ５に相同の配列を有する他の色素タンパク質は、単一アミノ酸置換基を介して遠赤色蛍光タンパク質に相互変換され得ることが報告されている（Ｂｅｄｄｏｅ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｂｕｌｉｎａ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｌｕｋｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０００）。
【００２５】
ポシロポリン（ｐｏｃｉｌｌｏｐｏｒｉｎ）に密接に関係する様々な他のサンゴ派生色素タンパク質も既知である（例えば、Ｇｕｒｓｋａｙａ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｌｕｋｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０００を参照のこと）。蛍光タンパク質のさらなる例は、ウミシイタケ由来のＧＦＰ、ヒラタクサビライシ由来のｍＫＯ、アザイサンゴ由来のアザミクリーン、またはハナキンチャク由来のｃＯＦＰである。蛍光もしくは発光団タンパク質、またはその蛍光もしくは発光団断片のうちのいずれかが、本発明の教示に従い、使用されてもよい。蛍光または発光団タンパク質の断片は、好ましくは、機能断片である。
【００２６】
細胞の核における別個の部位での（ポリ）ペプチドの蓄積は、細胞の核における別個の部位で既に蓄積されたタンパク質性または非タンパク質性構造と相互作用する（ポリ）ペプチドによって、または（ポリ）ペプチドの蓄積に適した環境を提供する別個の部位での蓄積によって、好ましくは、該部位への直接的または間接的結合によって引き起こされてもよい。
【００２７】
「核における蛍光発光の共局在」は、細胞核での２つの異なる蛍光の共局在を指す。共局在は、２つのタンパク質が互いに相互作用するとすぐに検出される。共局在は、核における２つの異なる蛍光（ポリ）ペプチドからの蛍光発光の一部または完全な空間重複として検出される。検出は、実験者により、または当業者に既知の特殊なソフトウエアにより達成され得る（例えば、ＩｍａｇｅＪ ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｐｌｕｇ−ｉｎｓ，ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）。
【００２８】
本発明は、生体真核細胞におけるタンパク質間相互作用の直接的可視化のための新規蛍光二重ハイブリッド（Ｆ２Ｈ）アッセイの開発に依存する。（Ｆ２Ｈ）アッセイの簡単な光学読出しは、リアルタイムでのタンパク質間相互作用の観察を可能にし、高スループットスクリーニングのために利用されてもよい。本発明の方法は、明確な核構造で蛍光標識されたベイト（ポリ）ペプチドの固定化に基づき、本所定構造で別々に標識されたプレイ（ポリ）ペプチドの共局在として、タンパク質間相互作用の検出を可能にする。本発明のＦ２Ｈアッセイは、関心対象の蛍光標識された（ポリ）ペプチド（ベイト（ポリ）ペプチド）に融合されるｌａｃリプレッサを固定化するために、ｌａｃオペレータアレイの安定した組み込みを備えた細胞株の例で試験された。容易に使用可能な細胞株は、ヒト、マウス、ハムスター、およびショウジョウバエにおいて既に説明されている（Ｄｉｅｔｚｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｊａｎｉｃｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｒｏｂｉｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｔｕｍｂａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｖａｚｑｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，２００１）。特異的な遺伝子導入細胞株から独立するために、本アッセイは、ベイト（ポリ）ペプチドを局所的に固定化するためのアンカー構造として、ラミナまたはセントロソームのような様々な細胞構造を使用することにより修正され得る。
【００２９】
他の遺伝子二重ハイブリッド法のように、本発明のＦ２Ｈアッセイも、調整される必要のある、偽陽性または偽陰性結果を生じる場合がある。ベイト（ポリ）ペプチドの不在下でｌａｃオペレータ配列に結合するプレイ（ポリ）ペプチドは、初期スクリーニングによって同定され得る。そのために、核内のプレイ（ポリ）ペプチドの局在化が、各ベイトタンパク質の不在下で、蛍光顕微鏡によって判断される。次いで、ｌａｃオペレータアレイでの蛍光プレイタンパク質のランダム蓄積が、本構造でのクラスター化蛍光によって判断され得る。本方法で同定された（ポリ）ペプチドは、偽陽性結果を避けるために、ベイト（ポリ）ペプチドとしてのみ使用され得る。異なる細胞内区画からの２０以上のタンパク質間相互作用が、本発明のＦ２Ｈアッセイを用いて分析され、他の遺伝子または生化学法を用いた前述と同一の結果が得られた。自身をｌａｃオペレータアレイ（例えば、実施例において記載されたＳＵＭＯ３等）に結合すると考えられるタンパク質は、ベイト（ポリ）ペプチドとしてのみ使用され得る。実施例で開示された結果は、本発明のＦ２Ｈアッセイが、タンパク質間相互作用の研究に信頼のある、広範囲に適用可能な方法であることを示す。
【００３０】
一部の例において、タンパク質は、核内中心で蓄積する場合があり、したがって、Ｆ２Ｈ分析を複雑にする。本問題を回避するために、ｌａｃオペレータアレイは可視化され、ＣＦＰ−ＬａｃＩのような第３の蛍光融合タンパク質を用いて同定され得る。
【００３１】
本発明は、細胞で発現する時に、細胞の核における別個の部位で蓄積する（ポリ）ペプチドを含む最小構造または融合タンパク質、およびＧＦＰに特異的に結合する（ポリ）ペプチドが、タンパク質相互作用の迅速で効率的な高スループットスクリーニングに役立ち得ることをさらに特徴とする。ＧＦＰおよびベイト（ポリ）ペプチドを含む第２の融合タンパク質の共局在時に、ＧＦＰの細胞の核において別個の部位で蓄積される（ポリ）ペプチドに結合されるＧＦＰ結合（ポリ）ペプチドとの相互作用が確立され、したがって、ベイト複合体を構成する。蛍光（ポリ）ペプチドおよびプレイ（ポリ）ペプチドを含む、さらなる第３の融合タンパク質の共局在時に、双方の蛍光（ポリ）ペプチドは、そこに融合されるベイトおよびプレイ（ポリ）ペプチドの相互作用時に共局在する。
【００３２】
ＧＦＰに融合されるタンパク質および後者をコードする核酸のライブラリが、今までに設計および確立され（Ｎｅｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００６）、これは、タンパク質の相互作用パートナーの高スループットスクリーニングを非常に容易にする。
【００３３】
国際特許出願第ＷＯ２００７／０６８３１３号において、本発明者は、ラクダＶＨＨドメイン派生のＧＦＰに特異的に結合する（ポリ）ペプチドを開示する。したがって、ＧＦＰに特異的に結合するタンパク質は、配列番号７もしくは９に示されるアミノ酸配列、または配列番号８もしくは１０に示される配列を含む核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含む。
【００３４】
要約すると、本新規Ｆ２Ｈアッセイは、タンパク質間相互作用の直接的な可視化を可能にし、生体細胞において、リアルタイムで、細胞周期または分化依存変化を調査するのに理想的には適しているはずである。他の細胞ベース技法に対するＦ２Ｈアッセイの優れた利点は、高価な機器または優れた専門知識のいずれも必要としない、その簡潔さである。Ｆ２Ｈアッセイの簡潔な光学読出しは、生細胞におけるタンパク質相互作用を系統的に分析するように、自動高スループットスクリーニングにおいて、本アッセイの使用可能性をさらに提供する。
【００３５】
細胞質でランダムに蓄積し、不規則で予見不能な構造を形成するウイルス構造に依存する、（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７）に記載される方法と比較すると、本発明で使用される核構造は、定義された、同定可能なスポットを形成する。反対に、Ｍｉｌｌｅｒらの方法は、意図的に過剰発現された融合タンパク質または細胞質小胞でしばしば認められる、非特異的な集合体から識別するのが困難な、多くのはっきり定義されていない大きな細胞質集合体に焦点を定め、それが得られる。ｌａｃオペレータ等の不活性構造を使用して、例えば、細胞における様々な数の集合体の存在下で、蛍光（ポリ）ペプチドの非特異的な集合体の検出を即時に可能にする。本発明の方法において、細胞の倍数性により、１〜２つのスポットは、検出可能である。
【００３６】
第２の態様において、本発明は、２つの（ポリ）ペプチドの相互作用を調節する化合物を同定するための生体外の方法に関し、（ａ）真核細胞で、（ｉ）細胞で発現される時に、細胞の核において別個の部位で蓄積する（ポリ）ペプチドと、（ｉｉ）ＧＦＰに特異的に結合する（ポリ）ペプチドとを含む、第１の融合タンパク質を発現するステップと、（ｂ）同一細胞で、（ｉ）ＧＦＰと、（ｉｉ）ベイト（ポリ）ペプチドとを含む、第２の融合タンパク質を発現するステップと、（ｃ）同一細胞で、（ｉ）ＧＦＰのそれとは異なる励起および／または発光波長である、蛍光（ポリ）ペプチドと、（ｉｉ）ベイト（ポリ）ペプチドと相互作用することが既知である、または推測されるプレイ（ポリ）ペプチドとを含む、第３の融合タンパク質を発現するステップと、（ｄ）細胞を試験化合物と接触させるステップと、（ｅ）励起時に、細胞で、前記第２および前記第３の融合タンパク質の蛍光部の蛍光発光を検出するステップとを含み、試験化合物と接触させない参照細胞の核において認められるそれと比較した、細胞核における第２および第３の融合タンパク質の蛍光部の蛍光発光の共局在の程度の変化は、該化合物がベイトおよびプレイ（ポリ）ペプチドの相互作用を調節できることを示す。
【００３７】
「２つの（ポリ）ペプチドの相互作用を調節する」とは、２つの（ポリ）ペプチドまたはタンパク質の相互作用に影響する特定の化合物の機能を指す。相互作用は、その完全な抑止まで強化され得るか、または弱化され得るかのいずれかである。弱化の形での調節は、例えば、同一結合部位への試験化合物の相互作用タンパク質との競合によって、または１つのタンパク質への結合によって行われ得、したがって、その３次元構造を変化させるため、２つのタンパク質間の相互作用は、該タンパク質での構造変化により、もはや不可能になる。一方、後者は、同様の理由で、タンパク質への結合親和性の増加につながり得る。
【００３８】
試験化合物は、これに限定されないが、例えば、核酸、（ポリ）ペプチド、ペプチドアプタマー、核酸ベースアプタマー、小分子、またはその断片に属する化合物であり得る。試験化合物は、任意の化学化合物であり得る。
【００３９】
核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはリボザイムであり得る。核酸は、化学的に合成されるか、または生体外もしくは生体内ででも生物学的発現によってプロモータと併用して生成され得る。
【００４０】
核酸は、適切な保護リボヌクレオシドホスホラミダイトおよび従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成器を使用して、化学的に合成され得る。ＲＮＡ合成試薬の供給元は、Ｐｒｏｌｉｇｏ（Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ，ＵＳＡ）、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（ｐａｒｔ ｏｆ Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ ，ＵＳＡ）、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ，ＵＳＡ）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（Ａｓｈｌａｎｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）、およびＣｒｕａｃｈｅｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ，ＵＫ）である。
【００４１】
リボザイム（リボ核酸酵素から、ＲＮＡ酵素または触媒ＲＮＡとも呼ばれる）は、化学反応を触媒するＲＮＡ分子である。多くの天然リボザイムは、自己切断または一方のＲＮＡの切断のいずれかを触媒するが、リボソームのアミノトランスフェラーゼ活性を触媒することも判明している。
【００４２】
明確な特徴をもつ、小型自己切断ＲＮＡの例は、ハンマーヘッド型、ヘアピン型、Ｄ型肝炎ウイルス、および生体外選択リード依存型リボザイムである。これらの小型触媒の組織は、第Ｉ群イントロン等の大型リボザイムのそれと対照的である。
【００４３】
アプタマーは、特定の標的分子を結合する、オリゴ核酸またはペプチド分子である。アプタマーは、通常、大きなランダム配列プールからアプタマーを選択することによって生成されるが、天然アプタマーもリボスイッチに存在する。アプタマーは、高分子薬剤として、基礎研究および臨床目的の双方に使用され得る。アプタマーは、リボザイムと混合され得、それらの標的分子の存在下で自己切断する。これらの化合物分子には、追加研究、工業および臨床用途がある。より具体的には、アプタマーは、ＤＮＡまたはＲＮＡアプタマー、もしくはペプチドアプタマーとして分類され得る。前者はオリゴヌクレオチドの（通常短）鎖から成るが、後者は、足場タンパク質の両端に付着する、短鎖可変ペプチドドメインから成る。
【００４４】
核酸アプタマーは、小型分子、タンパク質、核酸、さらには細胞、組織または生物等の様々な分子標的に結合するように、反復された多数の生体外選択、または同等にＳＥＬＥＸ（指数的濃縮によるリガンドの系統的進化）を通して操作された核酸種である。
【００４５】
ペプチドアプタマーは、細胞内の他のタンパク質相互作用と相互作用するように設計される（ポリ）ペプチドである。これらは、足場タンパク質の両端に付着される、可変ペプチドループから成る。本二重構造拘束は、抗体のそれ（ナノモル範囲）に相当するレベルに、ペプチドアプタマーの結合親和性を大幅に増加する。可変ループの長さは、典型的には、１０〜２０のアミノ酸から成り、足場は、良好な溶解特性を有する、任意のタンパク質であってもよい。
【００４６】
現在、細菌タンパク質のチオレドキシンＡは、最も頻繁に使用される足場タンパク質であり、可変ループは、野生型タンパク質において−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ループである、還元された活性部位内に挿入され、２つのシステイン側鎖は、ジスルフィド架橋を形成することが可能である。ペプチドアプタマー選択は、異なるシステムを使用して行われることが可能であるが、最も頻繁に使用されるシステムは、現在、酵母二重ハイブリッドシステムである。
【００４７】
抗体は、例えば、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得る。「抗体」という用語は、さらに結合特異性を保持する、その誘導体または断片も含む。抗体の生成技法は、当該技術分野では既知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ "Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ"，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８８およびＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ“Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９に記載されている。
【００４８】
抗体は、キメラ単鎖およびヒト化抗体、ならびに具体的には、Ｆａｂ断片のような抗体断片も含む。抗体断片または誘導体は、Ｆ（ａｂ'）2、ＦｖまたはｓｃＦｖ断片を
さらに含む。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）および（１９９９），ｌｏｃ．ｃｉｔを参照のこと。
【００４９】
本発明に従う小型分子は、有機または無機であり得、最大２０００ダルトン、好ましくは、１０００ダルトンを超えない、最も好ましくは、８００ダルトンを超えない分子量を有する。
【００５０】
本発明の本態様の好ましい実施形態において、試験化合物は、２つの（ポリ）ペプチドを弱化することができ、試験化合物と接触させない参照細胞の核において認められるそれと比較した、細胞核における双方の融合タンパク質の蛍光部の共局在の減少は、化合物がベイトおよびプレイ（ポリ）ペプチドを弱化することができることを示す。
【００５１】
本発明の内容において、「２つの（ポリ）ペプチドの相互作用を弱化することができる」とは、最初に、別の（ポリ）ペプチドへの（ポリ）ペプチドの結合親和性に対する化合物の影響が、相互作用または結合親和性の弱化または完全な破壊／抑止につながることを意味する。上述のように、これは、化合物の結合時に、１つの（ポリ）ペプチドに誘発された構造変化により行われてもよい。第２に、化合物は、他の（ポリ）ペプチドの結合部位に隣接する同一の、または異なる結合部位に対して、相互作用（ポリ）ペプチドと直接的に競合してもよい。相互作用の弱化または完全な抑止は、双方の蛍光シグナルの共局在の減少または完全に不在になると検出可能である。
【００５２】
本発明の内容における参照細胞は、試験化合物と接触させなかった細胞を指す。したがって、ベイトおよびプレイ（ポリ）ペプチドの相互作用挙動に対する化合物の影響は、直接的に比較され得る。
【００５３】
本発明の本態様の別の好適な実施形態において、試験化合物は、２つの（ポリ）ペプチドの相互作用を誘発または強化することができ、試験化合物と接触させない参照細胞の核において認められるものと比較した、細胞核における双方の融合タンパク質の蛍光部の共局在の増加は、ベイトおよびプレイ（ポリ）ペプチドの相互作用を誘発または強化することができることを示す。
【００５４】
「２つの（ポリ）ペプチドの相互作用を誘発することができる」とは、別の（ポリ）ペプチドへの（ポリ）ペプチドの結合親和性に対する化合物の影響が、結合親和性の増加につながることを意味する。例えば、ベイトおよびプレイ（ポリ）ペプチドの蛍光シグナルの共局在が、参照細胞において全くまたは少ししか検出されなかった場合、共局在における増加は、相互作用の強化を示す。
【００５５】
異なる態様において、本発明は、２つのペプチドの相互作用の相対強度を判断するための生体外の方法に関し、（ａ）真核細胞で、（ｉ）細胞で発現される時に、細胞の核において別個の部位で蓄積する（ポリ）ペプチドと、（ｉｉ）ＧＦＰに特異的に結合する（ポリ）ペプチドとを含む、第１の融合タンパク質を発現するステップと、（ｂ）同一細胞で、（ｉ）ＧＦＰと、（ｉｉ）ベイト（ポリ）ペプチドとを含む、第２の融合タンパク質を発現するステップと、（ｃ）同一細胞で、（ｉ）ＧＦＰのそれとは異なる励起および／または発光波長である、蛍光（ポリ）ペプチドと、（ｉｉ）第１のプレイ（ポリ）ペプチドとを含む、第３の融合タンパク質を発現するステップと、（ｄ）同一細胞で、（ｉ）ＧＦＰのそれとは異なる励起および／または発光波長である、蛍光（ポリ）ペプチドと、（ｉｉ）第２のプレイ（ポリ）ペプチドとを含む、第４の融合タンパク質を発現するステップと、（ｅ）励起時に、細胞で、前記第２および前記第３の融合タンパク質の蛍光部の蛍光発光を検出するステップとを含み、細胞核における第２および第４の融合タンパク質のそれと比較すると異なる、第２および第３の融合タンパク質の蛍光発光の共局在の程度は、ベイト（ポリ）ペプチドに対する第１および第２のプレイ（ポリ）ペプチドの異なる結合強度を示す。
【００５６】
本発明の本態様および以下の２つの態様は、２つの基礎構築物である、プレイおよびベイト構築物に依存し、ＧＦＰを含む核酸コードタンパク質のライブラリが利用不可能な場合に適用され得る。構築物は、２つの個別のベクターまたは１つのベクターに含まれてもよい。
【００５７】
さらなる態様において、本発明は、タンパク質間相互作用を検出するための生体外の方法に関し、（ａ）真核細胞で、（ｉ）蛍光（ポリ）ペプチドと、（ｉｉ）細胞で発現される時に、細胞の核において別個の部位で蓄積する（ポリ）ペプチドと、（ｉｉｉ）ベイト（ポリ）ペプチドとを含む、第１の融合タンパク質を発現するステップと、（ｂ）同一細胞で、（ｉ）該第１の融合タンパク質に含まれる蛍光（ポリ）ペプチドのそれとは異なる励起および／または発光波長である、蛍光（ポリ）ペプチドと、（ｉｉ）プレイ（ポリ）ペプチドとを含む、第２の融合タンパク質を発現するステップと、（ｃ）励起時に、細胞で、第１および第２の融合タンパク質の蛍光部の蛍光発光を検出するステップとを含み、細胞核における双方の融合タンパク質の蛍光発光の共局在は、ベイトおよびプレイ（ポリ）ペプチドの相互作用を示す。
【００５８】
異なる態様において、本発明は、２つのペプチドの相互作用を調節する化合物を同定するための生体外の方法に関し、（ａ）真核細胞で、（ｉ）蛍光（ポリ）ペプチドと、（ｉｉ）細胞で発現される時に、細胞の核において別個の部位で蓄積する（ポリ）ペプチドと、（ｉｉｉ）ベイト（ポリ）ペプチドとを含む第１の融合タンパク質を発現するステップと、（ｂ）同一細胞で、（ｉ）該第１の融合タンパク質に含まれる蛍光（ポリ）ペプチドのそれとは異なる励起および／または発光波長である、蛍光（ポリ）ペプチドと、（ｉｉ）ベイト（ポリ）ペプチドと相互作用することが既知である、または推測されるプレイ（ポリ）ペプチドとを含む、第２の融合タンパク質を発現するステップと、（ｃ）細胞を試験化合物と接触させるステップと、（ｄ）励起時に、細胞で、第１および第２の融合タンパク質の蛍光部の蛍光発光を検出するステップとを含み、試験化合物と接触させない参照細胞の核において認められるそれと比較した、細胞核における双方の融合タンパク質の蛍光部の蛍光発光の共局在の程度の変化は、化合物がベイトおよびプレイ（ポリ）ペプチドの前記相互作用を調節できることを示す。
【００５９】
さらなる態様において、本発明は、第３のタンパク質（または（ポリ）ペプチド）と２つのタンパク質（互換的に使用される用語「（ポリ）ペプチド」）の相互作用の相対強度を判断するための方法に関し、（ａ）真核細胞で、（ｉ）蛍光（ポリ）ペプチドと、（ｉｉ）細胞で発現される時に、細胞の核において別個の部位で蓄積する（ポリ）ペプチドと、（ｉｉｉ）ベイト（ポリ）ペプチドとを含む、第１の融合タンパク質を発現するステップと、（ｂ）同一細胞で、（ｉ）該第１の融合タンパク質に含まれる蛍光（ポリ）ペプチドのそれとは異なる励起および／または発光波長である、蛍光（ポリ）ペプチドと、（ｉｉ）第１のプレイ（ポリ）ペプチドとを含む、第２の融合タンパク質を発現するステップと、（ｃ）同一細胞で、（ｉ）該第１および該第２の融合タンパク質に含まれる蛍光（ポリ）ペプチドのそれとは異なる励起および／または発光波長である、蛍光（ポリ）ペプチドと、（ｉｉ）第２のプレイ（ポリ）ペプチドとを含む、第３の融合タンパク質を発現するステップと、（ｄ）励起時に、細胞で、第１、第２および第３の融合タンパク質の蛍光部の蛍光発光を検出するステップとを含み、細胞核における第１および第３の融合タンパク質のそれと比較すると異なる、第１および第２の融合タンパク質の蛍光発光の共局在の程度は、ベイト（ポリ）ペプチドに対する第１および第２のプレイタンパク質の異なる結合強度を示す。
【００６０】
タンパク質間相互作用を検出するための方法に関する、本発明の態様の好適な実施形態において、検出は、細胞プロセスにおけるタンパク質間相互作用の依存性を調査するために採用され、該方法は、（ｄ１）細胞における１つ以上のプロセスの過程で、細胞における第１および第２の融合タンパク質の蛍光部の蛍光発光を監視するステップをさらに含み、細胞における双方の融合タンパク質の蛍光部の蛍光発光の共局在の程度の変化は、１つ以上の細胞プロセスでの相互作用の依存性を示す。
【００６１】
「細胞プロセスにおける依存性」とは、ベイトまたはプレイ（ポリ）ペプチド、もしくは双方が、細胞周期等の細胞プロセスの過程における修飾のため、それらの相互作用挙動を変更する可能性を意味する。細胞周期にかかわるタンパク質は、他のタンパク質への結合親和性を変更する場合がある、リン酸化または脱リン酸化等の様々な修飾を受ける。この修飾が達成される細胞プロセス中の時間点または期間によって、（ポリ）ペプチドは、１つ以上の他の（ポリ）ペプチドへの結合親和性を緩和する、または増大する場合がある。
【００６２】
より好適な実施形態において、細胞プロセスは、細胞周期、分泌、転位、またはシグナル伝達である。
【００６３】
別の好適な実施形態において、検出は、タンパク質間相互作用の強度を判断するために採用され、該方法は、（ｄ２）双方の融合タンパク質の蛍光部の蛍光発光の共局在が検出された場合、該第２の融合タンパク質の蛍光の選択的減光、および経時的に双方の融合タンパク質の蛍光部の蛍光発光の共局在の回復を監視するステップをさらに含み、共局在を確立するために必要な時間は、タンパク質間相互作用の強度を示す。
【００６４】
一部において、本発明の本実施形態は、定評のあるＦＲＡＰ（蛍光退色後回復）法を利用する。本方法は、蛍光標識されたプローブの拡散および移動性を定量化できる光学技法を意味する。本技法は、タンパク質結合の生物学的研究において多大な有用性を提供し、一般的に、研究されるタンパク質が蛍光タンパク質（ＦＰ）と融合されるＦＰと併用して使用される。特定の光波長（典型的にはレーザビーム）によって励起される時に、タンパク質は蛍光を発する。研究されるタンパク質がＦＰで生成される時に、蛍光が追跡される。（典型的には、強い／激しいレーザパルスを有する）ＦＰの光破壊後、退色領域における蛍光回復の速度は、退色または退色されないＦＰの交換を阻害する、または低下させる、タンパク質相互作用の強度、細胞器官連続性、およびタンパク質輸送の情報を提供する。本観察は、タンパク質結合を調査するために、最近、利用されている。
【００６５】
本発明の別の好適な実施形態において、該第１の融合タンパク質の構成要素（ｉ）、（ｉｉ）および／もしくは（ｉｉｉ）、ならびに／または該第２の融合タンパク質の構成要素（ｉ）および（ｉｉ）、ならびに／または該第３の融合タンパク質の構成要素（ｉ）および（ｉｉ）は、リンカーを介して連結される。
【００６６】
「リンカー」という用語は、本発明の融合タンパク質の構成要素間の連結を指す。リンカーは、任意の順序で、融合タンパク質の構成要素間に配置されてもよい、少なくとも１つのアミノ酸残基を含むペプチド結合またはアミノ酸の伸長であり得る。このようなリンカーは、一部の例において、例えば、個々のドメインの個別の折り畳み構造を改善するために、または融合タンパク質の安定性を調整するために有用である場合がある。さらに、このようなリンカー残基は、輸送のためのシグナル、プロテアーゼ認識配列、または二次修飾のシグナルを含む場合がある。リンカーを形成するアミノ酸残基は、構造化または非構造化されてもよい。好ましくは、リンカーは、１つのアミノ酸残基ほど短い、または最大２、３、４、５、１０、２０もしくは５０の残基であってもよい。特定の例において、リンカーは、さらに、最大１００または１５０残基を含んでもよい。
【００６７】
本発明の別の好適な実施形態において、細胞で発現される時に、細胞の核において別個の部位で蓄積する（ポリ）ペプチドは、細胞の核において別個の部位で蓄積される、タンパク質性または非タンパク質性構造と直接的に相互作用する。
【００６８】
本発明の異なる好適な実施形態において、細胞で発現される時に、細胞の核において別個の部位で蓄積する（ポリ）ペプチドは、細胞の核において別個の部位で蓄積される、タンパク質性または非タンパク質性構造と間接的に相互作用する。
【００６９】
間接的な相互作用は、（ポリ）ペプチドまたは核酸等のタンパク質性または非タンパク質性分子を介して、再度、生じ得る。
【００７０】
異なる好適な実施形態において、プレイ（ポリ）ペプチドのうちのいずれかは、核局在化シグナルを含む。
【００７１】
核局在化シグナル（ＮＬＳ）は、細胞核に対する発現生成物を標的とする。ＮＬＳの例は、非相同タンパク質を核内に指示することができる、ＳＶ４０大型Ｔ抗原のペプチド配列ＰＫＫＫＲＫＶである（Ｋａｌｄｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４）。さらに、ＮＬＳは、例えば、偏在性二分シグナルの原型としてのヌクレオプラスミンのＮＬＳであるＫＲ［ＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡ］ＫＫＫＫ、または酵母転写リプレッサＭａｔα２のＮＬＳであるＫＩＰＩＫである。核局在化シグナルの多くの他の配列は、当業者に既知であり、文献に記載されている。
【００７２】
蛍光（ポリ）ペプチドに融合するプレイ（ポリ）ペプチドが、それ自体、核に転位できない場合、ＮＬＳが存在する必要がある。概して、最大６０ｋＤａの大きさの（ポリ）ペプチドは、核に転位されてもよい。さらに、（ポリ）ペプチドのアミノ酸組成が影響を与える、すなわち、（ポリ）ペプチドにおける連続した塩基性アミノ酸は、（ポリ）ペプチドの核内への転位を促進してもよい。プレイ（ポリ）ペプチドが、核に転位され、蓄積されるのを確実にするために、ＮＬＳが存在することが望ましい。核の別個の部位で蓄積する（ポリ）ペプチドに対して、同じことが言えるが、ＮＬＳが存在する場合にのみ、核へ転位される。このような（ポリ）ペプチドの例は、それ自体はＮＬＳを含まない、ｌａｃリプレッサである。
【００７３】
異なる好適な実施形態において、真核細胞における発現は、１つ以上のベクターにおいて、該第１および第２の融合タンパク質をコードする核酸分子を形質移入することにより達成される。
【００７４】
形質移入は、核酸分子の真核細胞への導入である。一般的に使用される方法は、これらに限定されないが、塩化カルシウム、ＪｅｔＰＥＩ（登録商標）（ＰｏｌｙＰｌｕｓ）、またはリポフェクチン（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用する形質移入を含む。
【００７５】
該第１および／もしくは第２および／もしくは第３および／もしくは第４の融合タンパク質をコードする核酸分子を含むベクターは、真核発現ベクター、好ましくは、哺乳類発現ベクターである。核酸分子のベクターへの取り込みは、核酸分子を効果的に細胞内、好ましくは、宿主細胞のＤＮＡに導入する可能性を提供する。宿主細胞は、細胞株からの細胞等、単一細胞であってもよい。このような基準は、発現ベクターが選択される場合、宿主細胞においてそれぞれの核酸分子を発現する可能性を与える。したがって、核酸分子の発現ベクターへの取り込みは、細胞または宿主細胞の選択された細胞のサブセットのうちのいずれかにおいて、コードされた（ポリ）ペプチドまたはタンパク質のレベルが持続的に上昇する方法を導く。
【００７６】
別の好適な実施形態において、細胞の核の別個の部位で蓄積される（ポリ）ペプチドは、細胞内に導入された。異なる好適な実施形態において、該（ポリ）ペプチドが、核において別個の部位で蓄積されるタンパク質性または非タンパク質性構造と相互作用する場合、該タンパク質性または非タンパク質性構造は、細胞内に導入され得る。
【００７７】
本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子を含むベクターと同様に、タンパク質性、または非タンパク質性構造をコードする核酸分子も、ベクターに導入され得る。核酸分子は、好ましくは、細胞の染色体内に、安定して組み込まれ、安定した細胞株の生成をもたらす。
【００７８】
異なる好適な実施形態において、細胞の別個の部位は、不活性構造を形成する。
【００７９】
より好適な実施形態において、不活性構造は、核ラミナまたは核スペックルである。
【００８０】
異なる好適な実施形態において、細胞で発現される時に、細胞の核において別個の部位で蓄積する（ポリ）ペプチドは、ＰＭＬ体（前骨髄球性白血病、ＰＭＬ核内小体またはＰＭＬ ＮＢとも呼ばれる）と相互作用する。
【００８１】
ＰＭＬ体は、転写、ＤＮＡ修復、ウイルス防御、ストレス、細胞周期制御、タンパク質分解、およびアポトーシスを含む、多くの核機能に関連している。平均的な哺乳類細胞は、１０〜３０のＰＭＬ核内小体を含む。ＰＭＬ体は、最初に、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）に関連する、染色体転位ｔ（１５，１７）におけるレチノイン酸受容体へのその融合によって同定される（Ｂｏｒｄｅｎ，２００２；Ｍａｕｌ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｍｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３）、ＰＭＬタンパク質の存在によって定義される。ＰＭＬタンパク質は、ＰＭＬ ＮＢの形成に不可欠であり、それが不在の場合、またはそのＲＩＮＧ（構造モチーフとしてＣ3ＨＣ4亜鉛フィンガーを含む）フィンガーが変異した場合、ＰＭＬ体は破壊される。
【００８２】
異なる好適な実施形態において、核の別個の部位で蓄積する（ポリ）ペプチド、または細胞の別個の部位で蓄積されるタンパク質性もしくは非タンパク質性構造は、非相同である。
【００８３】
本発明で使用される際、「非相同」とは、発現する細胞のそれとは異なるタンパク質性または非タンパク質性構造の起源、すなわち、異なる種を意味する。
【００８４】
別の好適な実施形態において、細胞で発現される時に、細胞の核において別個の部位で蓄積する（ポリ）ペプチドは、ＤＮＡと相互作用する。
【００８５】
より好適な実施形態において、ＤＮＡは、ｌａｃオペレータである。
【００８６】
さらにより好適な実施形態において、ｌａｃオペレータは、核に多コピー存在する。コピー数は、個々の実験、すなわち、使用される宿主細胞、またはベイト（ポリ）ペプチドおよび／もしくはプレイ（ポリ）ペプチドの種類に依存する。一般に適用されるコピー数は、２５６コピーのｌａｃオペレータ（すなわち、３８４００コピーのｌａｃオペレータ）を含む、少なくとも１５０コピーのプラスミドから約２０００コピーの該プラスミド（すなわち、５１２０００コピーのｌａｃオペレータ）に達する。高感度が必要な場合、コピー数はさらに多くなり、最大３０００コピーに達し得る。代替的に、異なるコピー数を含む任意の種類のプラスミドが、所望のｌａｃオペレータのコピー数を得るために利用され得る。ｌａｃオペレータは、各要素を分離する、核酸長を伴う、または伴わないタンデム型に配列され得る。要素は、ヘッド−テイルまたはテイル−ヘッドに配列され得る。核に安定して組み込まれるｌａｃオペレータの多コピーを有する細胞株は、当該技術分野において既知である（Ｊａｎｉｃｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０００）。
【００８７】
別の好適な実施形態において、該第１の融合タンパク質は、ＬａｃＩを含む。
【００８８】
ｌａｃリプレッサＬａｃＩは、同一サブユニットの４量体である。各サブユニットは、ＤＮＡに結合可能なヘリックス・ターン・ヘリックス（ＨＴＨ）モチーフを含む。リプレッサが結合するオペレータ部位は、逆方向反復対称のがＤＮＡ配列である。オペレータの２つのＤＮＡ半部位は、４量体リプレッサの２つのサブユニットに結合する。
【００８９】
ｌａｃオペレータおよびＬａｃＩの双方は、細菌のラクトース代謝の制御ユニットである、細菌ｌａｃオペロンの一部を形成する。ラクトースが増殖培地から欠けている場合、リプレッサは、プロモータの下流に位置するｌａｃオペレータに非常に強固に結合する。
【００９０】
本発明は、本発明の方法が好都合に実施され得る核において、非タンパク質性アンカー構造を形成するために、ＬａｃＩとｌａｃオペレータとの間の相互作用を利用する。概して、ＬａｃＩのｌａｃオペレータとの相互作用は、核において１つ別個の部位で検出される。
【００９１】
既知の方法、具体的に、（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７）の方法と比較した、本発明の本実施形態の重要な利点は、ｌａｃオペレータアレイを形成するｌａｃオペレータのコピー数が、システムをベイトおよびプレイ（ポリ）ペプチド双方の発現レベルに適応するために、変更され得ることである。例えば、１つの、または双方の（ポリ）ペプチドの発現が細胞において非常に高いことが分かり、したがって、例えば、細胞プロセスに干渉する、または蛍光シグナルを妨害する場合、低いｌａｃオペレータのコピー数を有する別の細胞が選択され、したがって、相互作用の検出の滴定を可能にする。
【００９２】
より好適な実施形態において、該第２の融合タンパク質はＧＦＰを含む。
【００９３】
別の好適な実施形態において、検出は、蛍光顕微鏡を使用して実施される。
【００９４】
蛍光顕微鏡は、反射および吸収の代わりに、またはそれに加えて、蛍光およびリン光の現象を使用して、有機物または無機物の特性を研究するために使用される光学顕微鏡である。検体が、フルオロフォラによって吸収される特定の波長（または複数の波長）の光で照射されることによって、検体に（吸収された光と異なる色の）より長い光波長を発光させる。光の照射は、発光フィルタの使用を通して、非常に弱い発光された蛍光から単離される。蛍光顕微鏡の典型的な構成要素は、光源（キセノンまたは水銀アーク放電ランプ）、励起フィルタ、二色性ミラー（または二色性ビームスプリッタ）、および発光フィルタである。フィルタおよび二色性ミラーは、検体を標識するために使用される、スペクトル励起およびフルオロフォラの発光特性に一致するように選択される。使用される多くの蛍光顕微鏡は、落射蛍光顕微鏡である（すなわち、蛍光の励起および観察は、検体の上（ｅｐｉ）からである）。これらの顕微鏡は、生物学の分野において重要な部分となり、共焦点レーザ走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）および全反射照明蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦ）等の、より高度な顕微鏡設計へのドアを開いた。これらの技術は、当業者に既知である。
【００９５】
別の好適な実施形態において、真核細胞は、生細胞である。
【００９６】
別の好適な実施形態において、本発明の方法は、細胞において、ベイトおよび／またはプレイ（ポリ）ペプチドを局在化させるステップをさらに含む。
【００９７】
本実施形態は、共局在が核において効率的に行われることを確実にし、ベイトおよびプレイ（ポリ）ペプチドの非特異的な相互作用を排除する働きをする。局在化は、実験者、または異なる細胞内区画を区別でき、当業者に既知の特殊なソフトウエアのいずれかにより検出される（例えば、ＩｍａｇｅＪ（バージョン１．３８，ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）。
【００９８】
異なる態様において、本発明は、融合タンパク質をコードする核酸分子に関し、（ｉ）蛍光（ポリ）ペプチドと、（ｉｉ）細胞で発現される時に、細胞の核において別個の部位で蓄積する（ポリ）ペプチドと、（ｉｉｉ）ベイト（ポリ）ペプチドとを含む。
【００９９】
別の態様において、本発明は、融合タンパク質をコードする核酸分子に関し、（ｉ）ｌａｃオペレータに結合する（ポリ）ペプチドと、（ｉｉ）該核酸と該核酸によってコードされるタンパク質とを含むベクターである、ＧＦＰに特異的に結合する（ポリ）ペプチドとを含む。
【０１００】
本発明の本態様に従う「核酸分子」は、双方ともセンスまたはアンチセンス鎖である、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ等のＤＮＡ、およびＲＮＡを含む。さらに、ＤＮＡまたはＲＮＡの合成または半合成誘導体、および混合重合体等、当該技術分野に既知の核酸模倣分子を含む。本発明に従う、このような核酸模倣分子または核酸誘導体は、ホスホロチオエート核酸、ホスホロアミド核酸、２’−Ｏ−メトキシエチルリボ核酸、モルフォリノ核酸、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、およびロックド核酸を含む（例えば、（Ｂｒａａｓｃｈ ａｎｄ Ｃｏｒｅｙ，２００１）を参照のこと）。ＬＮＡは、リボース環が２’−酸素と４’−炭素との間のメチレン結合によって拘束されるＲＮＡ誘導体である。当業者には容易に理解されるように、これらは、追加の非天然または誘導ヌクレオチド塩基を含む場合がある。
【０１０１】
本発明の本態様の好適な実施形態において、融合タンパク質は、ＬａｃＩを含む。
【０１０２】
別の態様において、本発明は、本発明の核酸分子によってコードされるタンパク質に関する。タンパク質または（ポリ）ペプチドの特徴は、本明細書の別項で定義される。
【０１０３】
好適な実施形態において、本発明のタンパク質は、ＬａｃＩを含む。
【０１０４】
代替的態様において、本発明は、本発明の核酸分子を含むベクターに関する。ベクターの特性は、本明細書の別項において説明される。既に説明された特徴に加え、本発明のベクターは、原核性ベクターであり得る。原核性ベクターおよびその特性は、当該技術分野において既知である。好ましくは、ベクターは、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、または例えば、遺伝子組み換えで慣習的に使用される別のベクターである。
【０１０５】
核酸分子は、いくつかの商業的に入手可能なベクターに挿入されてもよい。非制限的な例としては、ｐＲＥＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＢＰＶ−１、ｐｄＢＰＶＭＭＴｎｅｏ、ｐＲＳＶｇｐｔ、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＩＺＤ３５、ｐＬＸＩＮ、ｐＳＩＲ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＥＡＫ−１０（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）ｐＴｒｉＥｘ−Ｈｙｇｒｏ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ｐＣＩＮｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ ｃＤＮＡ発現ベクターｐｃＤＶ１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐＳＰＯＲＴ１（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）、ｐＧＥＭＨＥ（Ｐｒｏｍｅｇａ）またはｐＳＶＬおよびｐＭＳＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）等の哺乳類細胞における発現と適合性のあるベクターが挙げられる。
【０１０６】
ベクター修飾技法については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ； Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，２００１）を参照のこと。概して、ベクターは、クローン化または発現のための１つ以上の複写元（ｏｒｉ）および遺伝体系、例えば、抗生物質抵抗性等の宿主における選択のための１つ以上のマーカ、および１つ以上の発現カセットを含み得る。
【０１０７】
ベクターに挿入される核酸分子は、例えば、標準的な方法によって合成され得る、または自然源から単離され得る。コードされた配列の転写制御要素および／または配列をコードする他のアミノ酸への連結は、確立された方法を使用して実施され得る。
【０１０８】
本発明の本態様の好適な実施形態において、ベクターは、（ｉ）本発明の核酸分子によってコードされるタンパク質に含まれる蛍光（ポリ）ペプチドのそれとは異なる励起および／または発光波長である、蛍光（ポリ）ペプチドと、（ｉｉ）プレイ（ポリ）ペプチドとを含む、融合タンパク質をコードする核酸分子をさらに含む。
【０１０９】
異なる態様において、本発明は、本発明のベクターで形質移入される真核細胞に関する。
【０１１０】
真核細胞は、哺乳類細胞であることが好ましい。
【０１１１】
本発明の本態様の好適な実施形態において、真核細胞は、本発明の核酸分子を含むベクターと、（ｉ）本発明のタンパク質に含まれる蛍光（ポリ）ペプチドのそれとは異なる励起および／または発光波長である、蛍光（ポリ）ペプチドと、（ｉｉ）プレイ（ポリ）ペプチドとを含む、融合タンパク質をコードする核酸分子を含むベクターとで、形質移入される。
【０１１２】
本発明のプレイおよびベイト構築物は、発現レベルの比較を容易にする場合がある１つのベクターにのみ含まれ得る。
【０１１３】
別の態様において、本発明は、そのＤＮＡに安定して組み込まれるｌａｃオペレータの多コピーを有し、本発明のタンパク質を安定して発現する、真核細胞に関する。
【０１１４】
別の態様において、本発明は、そのＤＮＡに安定して組み込まれるｌａｃオペレータの多コピーを有し、（ｉ）ｌａｃオペレータに結合する（ポリ）ペプチドと、（ｉｉ）ＧＦＰに特異的に結合する（ポリ）ペプチドとを含むタンパク質を安定して発現する、真核細胞に関する。
【０１１５】
好適な実施形態において、ＧＦＰに特異的に結合する該（ポリ）ペプチドは、配列番号７もしくは９のアミノ酸配列を有する、または配列番号８もしくは１０の核酸配列によってコードされる（ポリ）ペプチドを含む。
【０１１６】
本発明は、（ｉ）細胞で発現される時に、細胞の核において別個の部位で蓄積する（ポリ）ペプチドと、（ｉｉ）ＧＦＰに特異的に結合する（ポリ）ペプチド、ならびに該核酸分子と、該核酸分子を含むベクターで形質移入される真核細胞とを含むベクターである、該核酸分子によってコードされるタンパク質を含む、融合タンパク質をコードする核酸分子にも関する。ベイトおよび少なくとも１つのプレイ構築物を含むＦ２Ｈシステムに関する本発明の態様において説明されるように、好適な実施形態および定義は、ＧＦＰに特異的な（ポリ）ペプチドを利用する本発明の上述の態様に同様に適用される。本発明の最初の３つの態様の第１、第２、または第３の融合タンパク質に関する全ての実施形態は、ＧＦＰに特異的な（ポリ）ペプチドを利用する本発明の態様の第４の融合タンパク質に、同様に適用される。
【０１１７】
図の説明
図１
蛍光二重ハイブリッド（Ｆ２Ｈ）アッセイの概略である。（ａ）Ｆ２Ｈアッセイに使用される蛍光標識されたプレイおよびベイトタンパク質をコードするｐＦ２ＨプレイおよびｐＦ２Ｈベイト発現ベクターの概要。（ｂ）ベイトタンパク質のＬａｃＩドメインは、形質移入された細胞の核において蛍光スポットとして可視であり、染色体性に組み込まれたｌａｃオペレータアレイへの結合を媒介する。差次的に標識されたプレイがベイトを相互作用する場合、同一スポットで濃縮されて、ｌａｃオペレータ（オーバーレイ画像で黄色いスポットとして可視となる）で蛍光シグナルの共局在を生じる。（ｃ）プレイがベイトタンパク質と相互作用しない場合、核で分散されたままであり、ｌａｃオペレータアレイは、ベイトタンパク質（赤色のスポット）によって可視化されるだけである。ＦＰ１およびＦＰ２は、２つの区別可能な蛍光タンパク質、例えば、ＧＦＰまたはＹＦＰ、およびｍＣｈｅｒｒｙまたはｍＲＦＰを指す。
【０１１８】
図２
ＤＮＡリガーゼＩＩＩのＸＲＣＣ１の特異的な相互作用が、Ｆ２Ｈによって明らかにされた。（ａ）染色体ｌａｃオペレータアレイを含む遺伝子導入ＢＨＫ細胞が、ＸＲＣＣ１−ＬａｃＩ−ＲＦＰおよびＧＦＰ−タグ付けされたＤＮＡリガーゼＩＩＩ、またはＤＮＡリガーゼＩ構築物と同時導入された。ＸＲＣＣ１−ＬａｃＩ−ＲＦＰ融合タンパク質のｌａｃリプレッサ部分は、ｌａｃオペレータアレイ（赤色スポットとして蛍光顕微鏡によって可視となる）への結合を媒介する。ＤＮＡリガーゼＩＩＩは、ＸＲＣＣ１との相互作用を通して、ｌａｃオペレータアレイへ補充される。高度に相同的なＤＮＡリガーゼＩは、ｌａｃオペレータアレイで蓄積せず、ＸＲＣＣ１と相互作用しないことを示すことに留意されたい。スケールバー５μｍ。（ｂ）Ｆ２Ｈ結果と共免疫沈降（Ｃｏ−ＩＰ）実験との比較。Ｃｏ−ＩＰは、それぞれ、ＲＦＰ−ＸＲＣＣ１およびＧＦＰリガーゼＩＩＩ、またはＧＦＰリガーゼＩを同時発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞で実施された。相互作用の位置付けのために、ＧＦＰタグ付けされたＤＮＡリガーゼＩＩＩのＢＲＣＴドメインと、ＢＲＣＴドメインが欠損する欠失構築物とが使用された。免疫沈降法が、ＧＦＰナノトラップで実施された（Ｒｏｔｈｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７）（前に示す通り（Ｍｏｒｔｕｓｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．， ２００６））。沈殿した融合タンパク質は、次いで、ウエスタンブロット上のＲＦＰおよびＧＦＰに対する特定の抗体で検出された。ＲＦＰ−ＸＲＣＣ１は、ＧＦＰリガーゼＩＩＩで共沈殿されたが、ＧＦＰリガーゼＩでは共沈殿されなかった。ＲＦＰ−ＸＲＣＣ１も、ＧＦＰリガーゼＩＩＩ ＢＲＣＴで共沈殿されたが、ＧＦＰ−ＮリガーゼＩＩＩDＢＲＣＴでは共沈殿されなかった。Ｆ２Ｈ結果の比較において、Ｃｏ−ＩＰからのインプット（左）および結合（右）バンドは、Ｆ２Ｈアッセイからの対応するシグナルとアライメントされた。赤色で示されるＸＲＣＣ１−ＬａｃＩ−ＲＦＰベイト構築物のＬａｃＩスポットおよび結合分画は、ＧＦＰタグ付けされたプレイ構築物のそれぞれのシグナルとアライメントされた。それぞれのＦ２Ｈの全細胞画像を（ａ）および図６に示す。
【０１１９】
図３
細胞周期の独立したＤｎｍｔ１のＰＣＮＡとの相互作用のＦ２Ｈ分析。（ａ）完全長マウスＤｎｍｔ１および融合タンパク質の概略。ＰＢＤ、ＰＣＮＡ結合ドメイン；ＮＬＳ、核局在化配列；ＴＳ、標的配列；ＺｎＦ、Ｚｎ2+結合領域；ＢＡＨ１および２、２つのブロモ隣接相同ドメイン。（ｂ）ｌａｃオペレータ（ｌａｃ ｏｐ）アレイで、および複製フォークでの融合タンパク質の結合可能性の概要。（ｃ）染色体ｌａｃオペレータアレイを含む遺伝子導入ＢＨＫ細胞が、ＰＢＤ−ＬａｃＩ−ＹＦＰおよびＲＦＰ−ＰＣＮＡ構築物と同時導入された。ＲＦＰ−ＰＣＮＡは、独特な細胞周期の依存分布を示す（非Ｓ相細胞（上段）での分散、およびＳ相（下段）での焦点パターン）。ＰＢＤ−ＬａｃＩ−ＹＦＰ融合タンパク質のｌａｃリプレッサ部分は、ｌａｃオペレータアレイへの結合を媒介し（緑色のスポットとして可視であり、矢印で強調される）、ＰＢＤは、複製部位でＰＣＮＡへの結合を媒介する（Ｓ相での焦点パターン）。ＲＦＰ−ＰＣＮＡは、Ｓおよび非Ｓ相細胞においてｌａｃオペレータアレイで局在化され、これは、細胞周期および複製機構の独立を通して、Ｄｎｍｔ１のＰＢＤのＰＣＮＡへの相互作用を示すことに留意されたい。（ｄ）ＢＨＫ細胞は、DＰＢＤ−ＬａｃＩ−ＹＦＰおよびＲＦＰ−ＰＣＮＡの発現ベクターで形質移入された。上述の通り、ＲＦＰ−ＰＣＮＡは、非Ｓ相（上段）での分散分布、Ｓ相（下段）での複製部位の再分布を示す。DＰＢＤ−ＬａｃＩ−ＹＦＰ融合タンパク質は、ｌａｃオペレータアレイ（矢印で印される緑色のスポット）に結合するが、ＰＢＤを欠損するため、Ｓ相において複製部位に結合しない。重要な点は、これらの細胞において、ＲＦＰ−ＰＣＮＡ（プレイ）は、ｌａｃオペレータアレイ（矢印で印される）で局在化されず、結合がDＰＢＤ−ＬａｃＩ−ＹＦＰ（ベイト）において不在であるＰＢＤの存在に依存することを示す。スケールバー５μｍ。
【０１２０】
図４
Ｆ２Ｈによるハンチントン病関連の相互作用の分析。Ｆ２Ｈによって認められた（ａ）ＳＵＭＯ３とＨＺＦＨ、および（ｂ）ＨＺＦＨとビメンチンとの間の報告された相互作用。（ｃ）Ｆ２Ｈ分析は、上述の通り、ＳＵＭＯ３とビメンチンとの間で相互作用がないことを示す（Ｇｏｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４）。（ｂ）では、核は点線で輪郭を描かれ、（ｃ）では、ｌａｃオペレータアレイが示される（矢印）。スケールバー５μｍ。
【０１２１】
図５
ミトコンドリアタンパク質間相互作用の分析、および難聴−ジストニア−視神経萎縮症候群に付随する変異の作用。（ａ）ミトコンドリアの内膜部分（ＩＭＳ）における６量体ＤＤＰ１−ＴＩＭＭ１３複合体の概略。（ｂ＋ｃ）ＧＦＰ−ＤＤＰ１（ｂ）または機能欠失変異体ＧＦＰ−ＤＤＰ１C66W（ｃ）のいずれかと共にベイトタンパク質ｍＣｈｅｒｒｙ−ＬａｃＩ−ＴＩＭＭ１３を発現するＢＨＫ細胞。機能的野生型融合ＧＦＰ−ＤＤＰ１は、ｌａｃオペレータアレイで蛍光シグナルの共局在によって認められたＴＩＭＭ１３との相互作用を示す（ｂ）一方、ＧＦＰ−ＤＤＰ１C66W変異体は、核にわたって分散して分布しており、相互作用を示さない（ｃ）。スケールバー５μｍ。
【０１２２】
図６
ＸＲＣＣ１を伴うＤＮＡリガーゼＩＩＩのＢＲＣＴ媒介相互作用が、Ｆ２Ｈアッセイによって明らかにされた。ｌａｃオペレータアレイを含む遺伝子導入ＢＨＫは、ＸＲＣＣ１−ＬａｃＩ−ＲＦＰおよび様々なＧＦＰタグ付けされたＤＮＡリガーゼＩＩＩ変異体と同時導入された。ＸＲＣＣ１−ＬａｃＩ−ＲＦＰ融合タンパク質のｌａｃリプレッサ部分は、ｌａｃオペレータアレイ（赤色スポットとして可視）への結合を媒介する。ＢＲＣＴドメインは、ＸＲＣＣ１との相互作用を通して、ＤＮＡリガーゼＩＩＩのｌａｃオペレータアレイへの標的のために必要かつ十分である。極めて相同なＤＮＡリガーゼＩは、ｌａｃオペレータアレイで蓄積せず、これは、ＸＲＣＣ１と相互作用しないことを示すことに留意されたい。スケールバー５μｍ。
【０１２３】
図７
Ｆ２Ｈアッセイは、ＸＲＣＣ１のＰＣＮＡ、ＰＡＲＰ−１およびＰＡＲＰ−２との相互作用を明らかにする。ｌａｃオペレータアレイを含むＢＨＫ細胞は、ＸＲＣＣ１−ＬａｃＩ−ＲＦＰ、およびＧＦＰ−ＰＡＲＰ−１、ＧＦＰ−ＰＡＲＰ−２、またはＧＦＰ−ＰＣＮＡのいずれかの発現ベクターで形質移入された。ＸＲＣＣ１−ＬａｃＩ−ＲＦＰ融合タンパク質のｌａｃリプレッサ部分は、ｌａｃオペレータアレイ（赤色スポットとして可視）への結合を媒介する。ＧＦＰ−ＰＡＲＰ−１、ＧＦＰ−ＰＡＲＰ−２およびＧＦＰ−ＰＣＮＡは、ｌａｃオペレータアレイを標的としており、ＸＲＣＣ１との相互作用を示す。スケールバー５μｍ。
【０１２４】
図８
Ｆ２Ｈアッセイは、ＰＢＤ媒介された、ＤＮＡリガーゼＩのＰＣＮＡとの相互作用を明らかにする。ｌａｃオペレータアレイを含む遺伝子導入Ｕ２ＯＳ細胞は、ＮＬＳ−ＰＣＮＡ−ＬａｃＩ−ＲＦＰおよび様々なＧＦＰタグ付けされたＤＮＡリガーゼＩ構築物と同時導入された。ＮＬＳ−ＰＣＮＡ−ＬａｃＩ−ＲＦＰ融合タンパク質のｌａｃリプレッサ部分は、ｌａｃオペレータアレイ（赤色スポットとして可視）への結合を媒介する。ＰＢＤは、ＰＣＮＡとの相互作用を通して、ＤＮＡリガーゼＩのｌａｃオペレータアレイへの標的のために必要かつ十分である。スケールバー５μｍ。
【０１２５】
図９
様々な複製および修復タンパク質のＰＣＮＡとの相互作用が、Ｆ２Ｈによって明らかにされた。ｌａｃオペレータアレイを含む遺伝子導入ＢＨＫ細胞は、ＮＬＳ−ＰＣＮＡ−ＬａｃＩ−ＲＦＰおよび様々なＧＦＰタグ付けされた複製および修復タンパク質を発現する。試験された全てのタンパク質は、ＰＣＮＡと相互作用する。スケールバー５μｍ。
【実施例】
【０１２６】
実施例１：材料および方法
発現構築物
ＬａｃＩコード配列は、以下のプライマーを使用したｐ３’ＳＳ ＥＧＦＰ−Ｌａｃ発現ベクターから増幅されたＰＣＲである（Ｒｏｂｉｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９６）：順方向プライマー５’−ＴＣＴ ＡＧＡ ＡＡＧ ＣＴＴ ＴＣＣ ＡＴＧ ＧＴＧ ＡＡＡ ＣＣＡ ＧＴＡ−３’および逆方向プライマー５’−ＣＣＡ ＴＧＣ ＣＣＧ ＧＧＡ ＣＡＧ ＧＣＴ ＧＣＴ ＴＣＧ ＧＧＡ ＡＡＣ−３’（制限部位はイタリック（下線）で示す）。本ＰＣＲ断片は、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｍａＩで消化され、２つのＤｎｍｔ１−ＹＦＰ発現ベクター（ＭＴＮＹ．２およびＰＢＨＤ−ＹＦＰ）の同一部位にクローン化され（Ｅａｓｗａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，２００４）、ＰＢＤ−ＬａｃＩ−ＹＦＰおよびDＰＢＤ−ＬａｃＩ−ＹＦＰを生成した。ＮＬＳ−ＰＣＮＡ−ＬａｃＩ−ＲＦＰおよびＸＲＣＣ１−ＬａｃＩ−ＲＦＰ構築物は、以下のプライマーを使用して、ＰＣＮＡおよびＸＲＣＣ１ ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅によって生成された（制限部位はイタリックで示す）。
【０１２７】
【表１】
【０１２８】
その後、ＰＣＲ断片は、ＮＬＳ−ＰＣＮＡ−ＬａｃＩ−ＲＦＰにはＸｈｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位を、そしてＸＲＣＣ１−ＬａｃＩ−ＲＦＰ発現ベクターにはＢｇｌＩＩ／ＥｃｏＲＩ部位を使用して、ＬａｃＩ−ＲＦＰ発現ベクター内にクローン化された。
【０１２９】
全ての他のＦ２Ｈ構築物は、ｃＤＮＡおよび後続の連結を図１ａに説明されるベイトおよびプレイ発現ベクター内にコードするＰＣＲ増幅によって生成された。以下のプライマーが使用され、制限部位はイタリックで示される。
【０１３０】
【表２】
【０１３１】
ヒトＤＮＭＴ１、ＤＮＡリガーゼＩ、ＤＮＡリガーゼＩＩＩ、ｐ２１、ＦＥＮ Ｉ、ポリメラーゼδｐ６６サブユニット、ＰＡＲＰ−１、ＰＡＲＰ−２、およびＰＣＮＡの翻訳融合をコードする哺乳類発現構築物は、前述される（Ｃａｚｚａｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｍａｅｄａ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｍｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｍｏｒｔｕｓｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｓｃｈｅｒｍｅｌｌｅｈ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｓｐｏｒｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２００５）。ＤＮＡリガーゼＩおよびＩＩＩの欠失構築物および単離ドメインは、Ｍｏｒｔｕｓｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ（Ｍｏｒｔｕｓｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．，２００６）で説明される。免疫沈降法は、前述の通り（Ｍｏｒｔｕｓｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．，２００６）、ＧＦＰナノトラップ（Ｒｏｔｈｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７）で実施された。全ての融合構築物は、正しい発現および局在化に関して試験した。
【０１３２】
細胞培養および形質移入
ｌａｃオペレータ反復を含む遺伝子導入ＢＨＫ細胞（クローン＃２）およびＵ２ＯＳ細胞（クローン２−６−３）は、（Ｊａｎｉｃｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０００）に説明される通り、１０％のウシ胎仔血清および１５０μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ（ＰＡＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で補われたＤＭＥＭにおいて、選択された条件下で培養された。顕微鏡において、細胞は、１８×１８ガラスカバースリップ上、またはμスライド（ｉｂｉｄｉ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のいずれかで、５０〜７０％のコンフルエンスに増殖され、次いで、製造業者の説明書に従い、ポリプラス形質移入試薬ｊｅｔＰＥＩ（登録商標）（ＢＩＯＭＯＬ ＧｍｂＨ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、示される発現構築物を同時導入した。６〜１０時間後、形質移入培地を新しい培養培地に交換し、次いで、細胞を、生体細胞顕微鏡、または室温で１０分間、ＰＢＳ中の３．７％のホルムアルデヒドでの固定前に、さらに１２〜２４時間、インキュベートした。固定された細胞を、３分間、ＰＢＳ中の０．２％のトリトンＸ−１００で透過処理し、ＤＡＰＩで対比染色し、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）に載置した。
【０１３３】
顕微鏡
蛍光タンパク質を発現する生細胞または固定細胞は、６３ｘ／１．４ＮＡ Ｐｌａｎ−Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ油浸対物レンズ装備のＬｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ２ ＡＯＢＳ共焦点顕微鏡を使用して分析された。フルオロフォアは、４０５ｎｍダイオードレーザ、４８８ｎｍおよび５１４ｎｍアルゴンレーザ、ならびに５６１ｎｍダイオード励起個体（ＤＰＳＳ）レーザで励起された。生細胞または固定細胞の共焦点画像スタックは、典型的に、５１２ｘ５１２ピクセルのフレームサイズ、５０〜１００ｎｍのピクセルサイズ、２５０ｎｍのｚステップサイズ、および１エアリー単位に設定されたピンホールで記録された。いくつかの中間ｚ断面の最大強度投影は、ＩｍａｇｅＪで生成した（バージョン１．３８，ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）。
【０１３４】
実施例２：タンパク質の相互作用を検出するための方法
リアルタイムで生細胞のタンパク質間相互作用を可視化するために、我々は、蛍光二重ハイブリッド（Ｆ２Ｈ）アッセイを開発した。Ｆ２Ｈアッセイの原理は、他の細胞構成要素との相互作用が特定の構造でタンパク質を固定化しなければ、タンパク質が細胞に自由に移動するという事実に基づく（Ｐｈａｉｒ ａｎｄ Ｍｉｓｔｅｌｉ，２０００）。
【０１３５】
我々は、双方が２５６コピーのｌａｃオペレータ配列を有する、約２００〜１０００コピーのプラスミドの安定した相互作用を持つ、上述のＢＨＫおよびＵ２ＯＳ細胞株を使用した（Ｊａｎｉｃｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０００）。我々は、三重融合タンパク質ＦＰ−ＬａｃＩ−Ｘ（図１ａ）またはＸ−ＬａｃＩ−ＦＰを生じる相互作用（ベイト）において試験される、蛍光タンパク質（ＦＰ）、ｌａｃリプレッサ（ＬａｃＩ）、およびタンパク質Ｘから成る蛍光ベイトタンパク質をコードする発現構築物を生成した。本融合タンパク質は、次いでＦＰシグナルの焦点強化のため可視になる、オペレータアレイに結合する。第２の、異なって標識された融合タンパク質（ＦＰ−Ｙ、プレイ）は、ベイトタンパク質と相互作用して、ＦＰシグナル（図１ｂ）の共局在をもたらすか、または相互作用せず、プレイ蛍光（図１ｃ）の分散された分布を生じるかのいずれかであり得る。
【０１３６】
実施例３：ＤＮＡ修復タンパク質間の相互作用の可視化
Ｆ２Ｈアッセイを試験するために、前述の、２つのＤＮＡ修復タンパク質ＤＮＡリガーゼＩＩＩとＸＲＣＣ１との間の相互作用を分析し（Ｃａｌｄｅｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｗｅｉ ｅｔ ａｌ．，１９９５）、結果をプルダウンアッセイから得たデータと比較した。我々は、本相互作用が、ＤＮＡ修復部位を標的とするＤＮＡリガーゼＩＩＩのＢＲＣＴドメインによって媒介されることを前に示した。我々は、ＸＲＣＣ１を含むベイト融合タンパク質、続いてＬａｃＩおよび低分子量赤色蛍光タンパク質ＲＦＰ（ｍＲＦＰ）を生成した。予測通り、本融合タンパク質は、一過性に形質移入されたＢＨＫ細胞において、ｌａｃオペレータアレイで局在化された（図２ａ）。完全長のＧＦＰタグ付けされたＤＮＡリガーゼＩＩＩならびに単離されたＧＦＰ標識ＢＲＣＴドメインの双方は、ｌａｃオペレータアレイでＸＲＣＣ１と共局在し、一方で、ＢＲＣＴドメインを欠損する融合タンパク質は、分散された分布を示す。特に、ＤＮＡリガーゼＩＩＩと同様の反応を触媒する、極めて相同なＤＮＡリガーゼＩは、ＸＲＣＣ１（図２ａおよび図６）に結合しない。Ｆ２ＨデータのＣｏ−ＩＰ実験から得たデータとの直接的な比較は、これら２つの方法で同様の結果を得たことを明らかにする（図２ｂ）。加えて、我々は、最近説明された、ＸＲＣＣ１のＰＣＮＡとの相互作用（Ｆａｎ ｅｔ ａｌ．，２００４）、および２つのＤＮＡ損傷依存性ＰＡＲＰのＰＡＲＰ−１およびＰＡＲＰ−２（Ｍａｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２）も認めた（図７）。これらの結果は、Ｆ２Ｈアッセイが生細胞においてタンパク質間相互作用を研究するのに好適であることを実証する。
【０１３７】
実施例４：タンパク質間相互作用の細胞周期依存性の分析
タンパク質間相互作用の分析における課題は、例えば、細胞周期の進行または他の外部刺激によって生じる一過性の変化を監視することである。我々は、前述のＤＮＡメチルトランスファーゼ１（Ｄｎｍｔ１）とＰＣＮＡ結合ドメイン（ＰＢＤ）によって媒介され、Ｓ相においてＤｎｍｔ１のＤＮＡ複製の部位を標的とするＰＣＮＡとの間の相互作用を分析した（Ｃｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｅａｓｗａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，２００４）。これらの見解は、本相互作用が、複製焦点でＳ相においてのみ生じるのか、または細胞周期を通してのみ生じるのかの疑問を提起した。我々は、ＬａｃＩおよびＹＦＰに融合するＤｎｍｔ１の一部を含む、２つのベイトタンパク質を生成した。１つのベイト（ＰＢＤ−ＬａｃＩ−ＹＦＰ）は、ＰＢＤを含む１１８〜４２７のＤｎｍｔ１を含み、一方、第２のベイト（ΔＰＢＤ−ＬａｃＩ−ＹＦＰ）は、ＰＢＤを欠損し、６２９〜１０８９のＤｎｍｔ１を含む（図３ａ）。プレイタンパク質のように、我々は、加えて、ＤＮＡ複製の部位に印を付けてＳ相での細胞の同定を可能にする、ＲＦＰ−ＰＣＮＡを使用した（Ｅａｓｗａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｓｐｏｒｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２００５）。ｌａｃオペレータアレイおよび複製フォークでの、これらの融合タンパク質の結合可能性は、図３ｂに要約される。
【０１３８】
非Ｓ相において、ベイトタンパク質のＬａｃＩ部は、細胞の倍数性による、核の１つまたは２つの蛍光スポットとして可視となる、染色体性に組み込まれるｌａｃオペレータアレイにのみ結合する。ＲＦＰ−ＰＣＮＡのベイトタンパク質のＰＢＤ部との相互作用は、ｌａｃオペレータアレイで蛍光シグナルの共局在を生じ（図３ｃ上部パネル）、一方で、ベイトタンパク質におけるＰＢＤの欠失は、非Ｓ相細胞においてＲＦＰ−ＰＣＮＡの分散した分布をもたらす（図３ｄ上部）。これは、Ｄｎｍｔ１のＰＣＮＡとのＰＢＤ依存性相互作用もＳ相の外側で生じることを明らかに例示する。
【０１３９】
Ｓ相細胞において、ＲＦＰ−ＰＣＮＡは、進行中のＤＮＡ複製の部位で局在化し、加えて、ＰＢＤ−ＬａｃＩ−ＹＦＰベイトタンパク質によってｌａｃオペレータアレイに補充される（図３ｃ下部パネル）。逆に、ＲＦＰ−ＰＣＮＡが機能的ＰＢＤ（ΔＰＢＤ−ＬａｃＩ−ＹＦＰ）を欠損するベイトタンパク質と共に共発現される時、ＲＦＰ−ＰＣＮＡは、ＤＮＡ複製部位で独占的に濃縮され、ΔＰＢＤ−ＬａｃＩ−ＹＦＰによって強調されるｌａｃオペレータアレイでは濃縮されない（図３ｄ下部パネル）。
【０１４０】
これらの結果は、ｌａｃオペレータアレイでのＲＦＰ−ＰＣＮＡ（プレイ）の局在化が、ベイト構築物におけるＰＢＤの存在に依存し、本相互作用がＳ相に制限されないことを明らかに示す。
【０１４１】
次に、我々は、他のＰＢＤ含有タンパク質のＰＣＮＡとの相互作用を分析した。我々は、追加のＮＬＳに融合するＰＣＮＡを含むベイト融合タンパク質、続いてＬａｃＩおよびＲＦＰ（ＮＬＳ−ＰＣＮＡ−ＬａｃＩ−ＲＦＰ）を生成した。ＧＦＰリガーゼＩと共発現する時に、ｌａｃオペレータアレイに局在化される双方の融合タンパク質は、ＰＣＮＡとＤＮＡリガーゼＩとの間の相互作用を示す。ＰＢＤの欠失は、ＤＮＡリガーゼＩの分散分布をもたらし、一方、ＤＮＡリガーゼＩのＰＢＤは、単独で、ｌａｃオペレータアレイでＰＣＮＡに結合するのに十分である（図８）。これは、ＤＮＡリガーゼＩのＰＢＤがＤＮＡ複製および修復部位を標的とするのに必要かつ十分である以前の研究と一致する（Ｃａｒｄｏｓｏ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｍｏｎｔｅｃｕｃｃｏ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｍｏｒｔｕｓｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．，２００６）。特に、Ｆ２Ｈアッセイを使用して、我々は、ＤＮＡリガーゼＩならびに単離されたＰＢＤがＳ相の外側でもＰＣＮＡに結合できることを実証することができた。同様に、我々は、Ｓ相細胞において、ＦＥＮ１、ｐ２１およびポリメラーゼδサブユニットｐ６６等の様々な追加の複製および修復タンパク質のＰＣＮＡへの結合を示すことができた（図９）。要約すると、我々は、複製タンパク質とＰＣＮＡとの間の相互作用は、Ｓ相に限定されないだけでなく、非Ｓ相細胞および複製機構の外側でも生じることを示すことができた。これは、Ｆ２Ｈアッセイが、生細胞におけるタンパク質間相互作用において細胞周期特異的変化を分析するための独特な可能性を提供することを例示する。
【０１４２】
実施例５：ハンチントン病に関連するタンパク質間相互作用の検出
Ｆ２Ｈアッセイが、他の細区画で起こるタンパク質間相互作用も検出するかどうかを調査するために、我々は、酵母二重ハイブリッド（Ｙ２Ｈ）アッセイによって、ハンチントン病の背景で同定されるタンパク質相互作用を用いて、Ｆ２Ｈアッセイを試験した（Ｇｏｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４）。我々は、１つの細胞質（ビメンチン）と２つの核（ＨＺＦＨおよびＳＵＭＯ３）タンパク質との相互作用を分析した。ビメンチンは、細胞骨格構成要素であるように表され、輸送プロセスに関与し、一方で、ＨＺＦＨおよびＳＵＭＯ３は、転写制御およびＤＮＡ維持に関与する（Ｇｏｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４）。これらのタンパク質は、赤色蛍光ｍＣｈｅｒｒｙ−ＬａｃＩ−ＮＬＳまたはＮＬＳ−ＧＦＰのいずれかと融合して、一連のベイトおよびプレイタンパク質を生成した。ｌａｃオペレータアレイを有するＢＨＫ細胞は、全ての可能な組み合わせの発現構築物を形質移入され、顕微鏡分析を受けた。我々は、これらの２つのタンパク質がベイトまたはプレイであるかどうかとは関係なく、ビメンチンとＨＺＦＨとの相互作用を検出できた（図４、データ示さず）。我々は、前述の通り、ビメンチンおよびＳＵＭＯ３が相互作用しない一方で、ＳＵＭＯ３とＨＺＦＨとの間の報告された相互作用も検出することができた（図４）（Ｇｏｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４）。これらの結果は、核および細胞質タンパク質の相互作用がＦ２Ｈアッセイを用いて研究され得ることを示す。
【０１４３】
実施例６：ミトコンドリア性タンパク質間の相互作用の検出
次に、我々は、Ｆ２Ｈアッセイが他の細胞小器官において生じるタンパク質間相互作用を検出するのにも適しているかどうかを調査した。そのために、我々は、２つのミトコンドリア性タンパク質であるＤＤＰ１（難聴ジストニアペプチド１）およびＴＩＭＭ１３との間の相互作用を分析した。双方のタンパク質は、６量体複合体を形成するように核コードされ、ミトコンドリア性内膜腔（ＩＭＳ）内に移入される（図５ａ）。ＩＭＳ内で、ＤＤＰ１−ＴＩＭＭ１３複合体は、ミトコンドリア性移入機構の疎水性タンパク質のミトコンドリア性内膜への移入を容易にする（Ｒｏｔｈｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１）。ＤＤＰ１遺伝子の変異は、進行性神経変性疾患である難聴−ジストニア−視神経萎縮症候群に関係した（Ｔｒａｎｅｂｊａｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。本Ｃ６６Ｗミスセンス変異は、末期の表現型を引き起こし、ＤＤＰ１の高度な保存Ｃｙｓ（４）モチーフに影響することが既知である。前の研究は、本アミノ酸交換がＩＭＳにおけるＤＤＰ１およびＴＩＭＭ１３との間の相互作用を破壊することを示した（Ｈｏｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２００２）。
【０１４４】
ＬａｃＩ−ＮＬＳ−ＴＩＭＭ１３およびＧＦＰタグ付けされた野生型（ＧＦＰ−ＤＤＰ１）または変異体ＤＤＰ１（ＧＦＰ−ＤＤＰ１C66W）プレイタンパク質を含む赤色蛍光ベイト融合タンパク質を使用して、我々は、Ｆ２Ｈアッセイを用いて、本特異的ミトコンドリア性タンパク質相互作用を分析した。我々は、ＧＦＰ−ＤＤＰ１がｌａｃオペレータアレイでＴＩＭＭ１３と共局在し（図５ｂ）、一方で、ＧＦＰ−ＤＤＰ１C66Wが均一に分散されたことを発見した（図５ｃ）。これらの結果は、Ｆ２Ｈアッセイが核の外側で生じるタンパク質間相互作用、およびこれらの相互作用を破壊する疾患関連点変異特徴付けの分析にも適していることを実証する。
【０１４５】
参考文献
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Ｃｈｕａｎｇ， Ｌ．Ｓ．， Ｈ．Ｉ． Ｉａｎ， Ｔ．Ｗ． Ｋｏｈ， Ｈ．Ｈ． Ｎｇ， Ｇ． Ｘｕ， ａｎｄ Ｂ．Ｆ． Ｌｉ． １９９７． Ｈｕｍａｎ ＤＮＡ−（ｃｙｔｏｓｉｎｅ−５） ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−ＰＣＮＡ ｃｏｍｐｌｅｘ ａｓ ａ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｐ２１ＷＡＦ１． Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２７７：１９９６−２０００．
Ｄｉｅｔｚｅｌ， Ｓ．， Ｋ． Ｚｏｌｇｈａｄｒ， Ｃ． Ｈｅｐｐｅｒｇｅｒ， ａｎｄ Ａ．Ｓ． Ｂｅｌｍｏｎｔ． ２００４． Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｃｏｍｐａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｔｒａｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｖｅｒｓｕｓ ｎｏｎ−ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ａｒｒａｙｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｛ｂｅｔａ｝−ｇｌｏｂｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ． Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ． １１７：４６０３−４６１４．
Ｄｏｖｅ， Ｓ．Ｇ．， Ｏ． Ｈｏｅｇｈ−Ｇｕｌｄｂｅｒｇ， ａｎｄ Ｓ． Ｒａｎｇａｎａｔｈａｎ． ２００１． Ｍａｊｏｒ ｃｏｌｏｕｒ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｒｅｅｆ−ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｃｏｒａｌｓ ａｒｅ ｄｕｅ ｔｏ ａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ＧＦＰ−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｃｏｒａｌ Ｒｅｅｆｓ． １９：１９７−２０４．
Ｅａｓｗａｒａｎ， Ｈ．Ｐ．， Ｈ． Ｌｅｏｎｈａｒｄｔ， ａｎｄ Ｍ．Ｃ． Ｃａｒｄｏｓｏ． ２００５． Ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ Ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ Ｌｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ． Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ． ４．
Ｅａｓｗａｒａｎ， Ｈ．Ｐ．， Ｌ． Ｓｃｈｅｒｍｅｌｌｅｈ， Ｈ． Ｌｅｏｎｈａｒｄｔ， ａｎｄ Ｍ．Ｃ． Ｃａｒｄｏｓｏ． ２００４． Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｌｏａｄｉｎｇ ｏｆ Ｄｎｍｔ１ ｄｕｒｉｎｇ Ｇ２ ａｎｄ Ｍ ｐｈａｓｅｓ． ＥＭＢＯ Ｒｅｐ． ５：１１８１−６．
Ｆａｎ， Ｊ．， Ｍ． Ｏｔｔｅｒｌｅｉ， Ｈ．Ｋ． Ｗｏｎｇ， Ａ．Ｅ． Ｔｏｍｋｉｎｓｏｎ， ａｎｄ Ｄ．Ｍ． Ｗｉｌｓｏｎ， ３ｒｄ． ２００４． ＸＲＣＣ１ ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚｅｓ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｃａｌｌｙ ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｗｉｔｈ ＰＣＮＡ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３２：２１９３−２０１．
Ｇｏｅｈｌｅｒ， Ｈ．， Ｍ． Ｌａｌｏｗｓｋｉ， Ｕ． Ｓｔｅｌｚｌ， Ｓ． Ｗａｅｌｔｅｒ， Ｍ． Ｓｔｒｏｅｄｉｃｋｅ， Ｕ． Ｗｏｒｍ， Ａ． Ｄｒｏｅｇｅ， Ｋ．Ｓ． Ｌｉｎｄｅｎｂｅｒｇ， Ｍ． Ｋｎｏｂｌｉｃｈ， Ｃ． Ｈａｅｎｉｇ， Ｍ． Ｈｅｒｂｓｔ， Ｊ． Ｓｕｏｐａｎｋｉ， Ｅ． Ｓｃｈｅｒｚｉｎｇｅｒ， Ｃ． Ａｂｒａｈａｍ， Ｂ． Ｂａｕｅｒ， Ｒ． Ｈａｓｅｎｂａｎｋ， Ａ． Ｆｒｉｔｚｓｃｈｅ， Ａ．Ｈ． Ｌｕｄｅｗｉｇ， Ｋ． Ｂｕｓｓｏｗ， Ｓ．Ｈ． Ｃｏｌｅｍａｎ， Ｃ．Ａ． Ｇｕｔｅｋｕｎｓｔ， Ｂ．Ｇ． Ｌａｎｄｗｅｈｒｍｅｙｅｒ， Ｈ． Ｌｅｈｒａｃｈ， ａｎｄ Ｅ．Ｅ． Ｗａｎｋｅｒ． ２００４． Ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｎｅｔｗｏｒｋ ｌｉｎｋｓ ＧＩＴ１， ａｎ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｏｆ ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ， ｔｏ Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ
． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ． １５：８５３−６５．
Ｇｕｒｓｋａｙａ， Ｎ．Ｇ．， Ａ．Ｆ． Ｆｒａｄｋｏｖ， Ａ． Ｔｅｒｓｋｉｋｈ， Ｍ．Ｖ． Ｍａｔｚ， Ｙ．Ａ． Ｌａｂａｓ， Ｖ．Ｉ． Ｍａｒｔｙｎｏｖ， Ｙ．Ｇ． Ｙａｎｕｓｈｅｖｉｃｈ， Ｋ．Ａ． Ｌｕｋｙａｎｏｖ， ａｎｄ Ｓ．Ａ． Ｌｕｋｙａｎｏｖ． ２００１． ＧＦＰ−ｌｉｋｅ ｃｈｒｏｍｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｓ ａ ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ｆａｒ−ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ５０７：１６−２０．
Ｈｏｆｍａｎｎ， Ｓ．， Ｕ． Ｒｏｔｈｂａｕｅｒ， Ｎ． Ｍｕｈｌｅｎｂｅｉｎ， Ｗ． Ｎｅｕｐｅｒｔ， Ｋ．Ｄ． Ｇｅｒｂｉｔｚ， Ｍ． Ｂｒｕｎｎｅｒ， ａｎｄ Ｍ．Ｆ． Ｂａｕｅｒ． ２００２． Ｔｈｅ Ｃ６６Ｗ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅａｆｎｅｓｓ ｄｙｓｔｏｎｉａ ｐｅｐｔｉｄｅ １ （ＤＤＰ１） ａｆｆｅｃｔｓ ｔｈｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＤＤＰ１．ＴＩＭ１３ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｉｎｔｅｒｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｐａｃｅ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２７７：２３２８７−９３．
Ｈｏｒｔｏｎ， Ｒ．Ｍ．， Ｈ．Ｄ． Ｈｕｎｔ， Ｓ．Ｎ． Ｈｏ， Ｊ．Ｋ． Ｐｕｌｌｅｎ， ａｎｄ Ｌ．Ｒ． Ｐｅａｓｅ． １９８９． Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｈｙｂｒｉｄ ｇｅｎｅｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅｓ： ｇｅｎｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ． Ｇｅｎｅ． ７７：６１−８．
Ｊａｎｉｃｋｉ， Ｓ．Ｍ．， Ｔ． Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ， Ｓ．Ｅ． Ｓａｌｇｈｅｔｔｉ， Ｗ．Ｐ． Ｔａｎｓｅｙ， Ｒ． Ｓａｃｈｉｄａｎａｎｄａｍ， Ｋ．Ｖ． Ｐｒａｓａｎｔｈ， Ｔ． Ｒｉｅｄ， Ｙ． Ｓｈａｖ−Ｔａｌ， Ｅ． Ｂｅｒｔｒａｎｄ， Ｒ．Ｈ． Ｓｉｎｇｅｒ， ａｎｄ Ｄ．Ｌ． Ｓｐｅｃｔｏｒ． ２００４． Ｆｒｏｍ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｔｏ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ： ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ． Ｃｅｌｌ． １１６：６８３−９８．
Ｋａｌｄｅｒｏｎ， Ｄ．， Ｗ．Ｄ． Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ， Ａ．Ｆ． Ｍａｒｋｈａｍ， ａｎｄ Ａ．Ｅ． Ｓｍｉｔｈ． １９８４． Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ ４０ ｌａｒｇｅ−Ｔ ａｎｔｉｇｅｎ． Ｎａｔｕｒｅ． ３１１：３３−８．
Ｋｅｒｐｐｏｌａ， Ｔ．Ｋ． ２００６． Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｙ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ７：４４９−５６．
Ｌｕｋｙａｎｏｖ， Ｋ．Ａ．， Ａ．Ｆ． Ｆｒａｄｋｏｖ， Ｎ．Ｇ． Ｇｕｒｓｋａｙａ， Ｍ．Ｖ． Ｍａｔｚ， Ｙ．Ａ． Ｌａｂａｓ， Ａ．Ｐ． Ｓａｖｉｔｓｋｙ， Ｍ．Ｌ． Ｍａｒｋｅｌｏｖ， Ａ．Ｇ． Ｚａｒａｉｓｋｙ， Ｘ． Ｚｈａｏ， Ｙ． Ｆａｎｇ， Ｗ． Ｔａｎ， ａｎｄ Ｓ．Ａ． Ｌｕｋｙａｎｏｖ． ２０００． Ｎａｔｕｒａｌ ａｎｉｍａｌ ｃｏｌｏｒａｔｉｏｎ ｃａｎ Ｂｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ａ ｎｏｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２７５：２５８７９−８２．
Ｍａｅｄａ， Ｙ．， Ｔ．Ｃ． Ｈｕｎｔｅｒ， Ｄ．Ｅ． Ｌｏｕｄｙ， Ｖ． Ｄａｖｅ， Ｖ． Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ， ａｎｄ Ｊ．Ａ． Ｗｈｉｔｓｅｔｔ． ２００６． ＰＡＲＰ−２ ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｗｉｔｈ ＴＴＦ−１ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｂ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２８１：９６００−６．
Ｍａｓｓｏｎ， Ｍ．， Ｃ． Ｎｉｅｄｅｒｇａｎｇ， Ｖ． Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ， Ｓ． Ｍｕｌｌｅｒ， Ｊ． Ｍｅｎｉｓｓｉｅｒ−ｄｅ Ｍｕｒｃｉａ， ａｎｄ Ｇ． ｄｅ Ｍｕｒｃｉａ． １９９８． ＸＲＣＣ１ ｉｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ） ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ａｎｄ ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｉｔｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １８：３５６３−７１．
Ｍａｔｚ， Ｍ．Ｖ．， Ａ．Ｆ． Ｆｒａｄｋｏｖ， Ｙ．Ａ． Ｌａｂａｓ， Ａ．Ｐ． Ｓａｖｉｔｓｋｙ， Ａ．Ｇ． Ｚａｒａｉｓｋｙ， Ｍ．Ｌ． Ｍａｒｋｅｌｏｖ， ａｎｄ Ｓ．Ａ． Ｌｕｋｙａｎｏｖ． １９９９． Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｎｏｎｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ａｎｔｈｏｚｏａ ｓｐｅｃｉｅｓ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７：９６９−７３．
Ｍａｕｌ， Ｇ．Ｇ．， Ｄ． Ｎｅｇｏｒｅｖ， Ｐ． Ｂｅｌｌ， ａｎｄ Ａ．Ｍ． Ｉｓｈｏｖ． ２０００． Ｒｅｖｉｅｗ： ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ＮＤ１０， ＰＭＬ ｂｏｄｉｅｓ， ｏｒ ＰＯＤｓ． Ｊ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ． １２９：２７８−８７．
Ｍｅｄｅｒ， Ｖ．Ｓ．， Ｍ． Ｂｏｅｇｌｉｎ， Ｇ． ｄｅ Ｍｕｒｃｉａ， ａｎｄ Ｖ． Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ． ２００５． ＰＡＲＰ−１ ａｎｄ ＰＡＲＰ−２ ｉｎｔｅｒａｃｔ ｗｉｔｈ ｎｕｃｌｅｏｐｈｏｓｍｉｎ／Ｂ２３ ａｎｄ ａｃｃｕｍｕｌａｔｅ ｉｎ 転写ａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｎｕｃｌｅｏｌｉ． Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ． １１８：２１１−２２．
Ｍｅｒｚｌｙａｋ， Ｅ．Ｍ．， Ｊ． Ｇｏｅｄｈａｒｔ， Ｄ． Ｓｈｃｈｅｒｂｏ， Ｍ．Ｅ． Ｂｕｌｉｎａ， Ａ．Ｓ． Ｓｈｃｈｅｇｌｏｖ， Ａ．Ｆ． Ｆｒａｄｋｏｖ， Ａ． Ｇａｉｎｔｚｅｖａ， Ｋ．Ａ． Ｌｕｋｙａｎｏｖ， Ｓ． Ｌｕｋｙａｎｏｖ， Ｔ．Ｗ． Ｇａｄｅｌｌａ， ａｎｄ Ｄ．Ｍ． Ｃｈｕｄａｋｏｖ． ２００７． Ｂｒｉｇｈｔ ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ａｎ ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｌｉｆｅｔｉｍｅ． Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ． ４：５５５−７．
Ｍｉｌｌｅｒ， Ｃ．Ｌ．， Ｍ．Ｍ． Ａｒｎｏｌｄ， Ｔ．Ｊ． Ｂｒｏｅｒｉｎｇ， Ｃ． Ｅｉｃｈｗａｌｄ， Ｊ． Ｋｉｍ， Ｊ．Ｂ． Ｄｉｎｏｓｏ， ａｎｄ Ｍ．Ｌ． Ｎｉｂｅｒｔ． ２００７． Ｖｉｒｕｓ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｌａｔｆｏｒｍｓ ｆｏｒ ｖｉｓｕａｌｉｚｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓ ｉｎｓｉｄｅ ｃｅｌｌｓ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ． ６：１０２７−３８．
Ｍｉｙａｗａｋｉ， Ａ． ２００３． Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｐａｔｉａｌ ａｎｄ ｔｅｍｐｏｒａｌ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ． Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ． ４：２９５−３０５．
Ｍｏｌｌｅｒ， Ａ．， Ｈ． Ｓｉｒｍａ， Ｔ．Ｇ． Ｈｏｆｍａｎｎ， Ｓ． Ｒｕｅｆｆｅｒ， Ｅ． Ｋｌｉｍｃｚａｋ， Ｗ． Ｄｒｏｇｅ， Ｈ． Ｗｉｌｌ， ａｎｄ Ｍ．Ｌ． Ｓｃｈｍｉｔｚ． ２００３． ＰＭＬ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ２ （ＨＩＰＫ２）−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐ５３ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ａｒｒｅｓｔ ｂｕｔ ｉｓ ｄｉｓｐｅｎｓａｂｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ＨＩＰＫ ｄｏｍａｉｎｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６３：４３１０−４．
Ｍｏｎｔｅｃｕｃｃｏ， Ａ．， Ｅ． Ｓａｖｉｎｉ， Ｆ． Ｗｅｉｇｈａｒｄｔ， Ｒ． Ｒｏｓｓｉ， Ｇ． Ｃｉａｒｒｏｃｃｈｉ， Ａ． Ｖｉｌｌａ， ａｎｄ Ｇ． Ｂｉａｍｏｎｔｉ． １９９５． Ｔｈｅ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ Ｉ ｃｏｎｔａｉｎｓ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｒｅｃｔｓ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ｔｏ ｓｉｔｅｓ ｏｆ ＤＮＡ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ． Ｅｍｂｏ Ｊ． １４：５３７９−８６．
Ｍｏｒｔｕｓｅｗｉｃｚ， Ｏ．， Ｕ． Ｒｏｔｈｂａｕｅｒ， Ｍ．Ｃ． Ｃａｒｄｏｓｏ， ａｎｄ Ｈ． Ｌｅｏｎｈａｒｄｔ． ２００６． Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ｏｆ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ Ｉ ａｎｄ ＩＩＩ ｔｏ ＤＮＡ ｒｅｐａｉｒ ｓｉｔｅｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３４：３５２３−３２．
Ｍｏｒｔｕｓｅｗｉｃｚ， Ｏ．， Ｌ． Ｓｃｈｅｒｍｅｌｌｅｈ， Ｊ． Ｗａｌｔｅｒ， Ｍ．Ｃ． Ｃａｒｄｏｓｏ， ａｎｄ Ｈ． Ｌｅｏｎｈａｒｄｔ． ２００５． Ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ｏｆ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｉ ｔｏ ＤＮＡ ｒｅｐａｉｒ ｓｉｔｅｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．
Ｍｕｒｐｈｙ， Ｇ．， Ｍ．Ｉ． Ｃｏｃｋｅｔｔ， Ｒ．Ｖ． Ｗａｒｄ， ａｎｄ Ａ．Ｊ． Ｄｏｃｈｅｒｔｙ． １９９１． Ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｌａｓｔｉｎ， ｔｙｐｅ ＩＶ ｃｏｌｌａｇｅｎ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ． Ａ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ９５ ｋＤａ ａｎｄ ７２ ｋＤａ ｇｅｌａｔｉｎａｓｅｓ， ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎｓ−１ ａｎｄ −２ ａｎｄ ｐｕｎｃｔｕａｔｅｄ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ （ＰＵＭＰ）． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ． ２７７ （ Ｐｔ １）：２７７−９．
Ｎｅｗｍａｎ， Ｊ．Ｒ．， Ｓ． Ｇｈａｅｍｍａｇｈａｍｉ， Ｊ． Ｉｈｍｅｌｓ， Ｄ．Ｋ． Ｂｒｅｓｌｏｗ， Ｍ． Ｎｏｂｌｅ， Ｊ．Ｌ． ＤｅＲｉｓｉ， ａｎｄ Ｊ．Ｓ． Ｗｅｉｓｓｍａｎ． ２００６． Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｒｅｖｅａｌｓ ｔｈｅ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｎｏｉｓｅ． Ｎａｔｕｒｅ． ４４１：８４０−６．
Ｐａｒｒｉｓｈ， Ｊ．Ｒ．， Ｋ．Ｄ． Ｇｕｌｙａｓ， ａｎｄ Ｒ．Ｌ． Ｆｉｎｌｅｙ， Ｊｒ． ２００６． Ｙｅａｓｔ ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｔｏ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ ｍａｐｐｉｎｇ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７：３８７−９３．
Ｐｈａｉｒ， Ｒ．Ｄ．， ａｎｄ Ｔ． Ｍｉｓｔｅｌｉ． ２０００． Ｈｉｇｈ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅｕｓ． Ｎａｔｕｒｅ． ４０４：６０４−９．
Ｒｏｂｉｎｅｔｔ， Ｃ．Ｃ．， Ａ． Ｓｔｒａｉｇｈｔ， Ｇ． Ｌｉ， Ｃ． Ｗｉｌｌｈｅｌｍ， Ｇ． Ｓｕｄｌｏｗ， Ａ． Ｍｕｒｒａｙ， ａｎｄ Ａ．Ｓ． Ｂｅｌｍｏｎｔ． １９９６． Ｉｎ ｖｉｖｏ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｌａｃ ｏｐｅｒａｔｏｒ／ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ． Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １３５：１６８５−７００．
Ｒｏｔｈｂａｕｅｒ， Ｕ．， Ｓ． Ｈｏｆｍａｎｎ， Ｎ． Ｍｕｈｌｅｎｂｅｉｎ， Ｓ．Ａ． Ｐａｓｃｈｅｎ， Ｋ．Ｄ． Ｇｅｒｂｉｔｚ， Ｗ． Ｎｅｕｐｅｒｔ， Ｍ． Ｂｒｕｎｎｅｒ， ａｎｄ Ｍ．Ｆ． Ｂａｕｅｒ． ２００１． Ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅａｆｎｅｓｓ ｄｙｓｔｏｎｉａ ｐｅｐｔｉｄｅ １ （ＤＤＰ１） ｉｎ ｉｍｐｏｒｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｔｉｍ２３ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｉｎｎｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２７６：３７３２７−３４．
Ｒｏｔｈｂａｕｅｒ， Ｕ．， Ｋ． Ｚｏｌｇｈａｄｒ， Ｓ． Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ， Ａ． Ｓｃｈｅｐｅｒｓ， Ｍ．Ｃ． Ｃａｒｄｏｓｏ， ａｎｄ Ｈ． Ｌｅｏｎｈａｒｄｔ． ２００７． Ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｎａｎｏｔｒａｐ ｆｏｒ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ ｗｉｔｈ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．
Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ， Ｄ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ； Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ２００１．
Ｓｃｈｅｒｍｅｌｌｅｈ， Ｌ．， Ｆ． Ｓｐａｄａ， Ｈ．Ｐ． Ｅａｓｗａｒａｎ， Ｋ． Ｚｏｌｇｈａｄｒ， Ｊ．Ｂ． Ｍａｒｇｏｔ， Ｍ．Ｃ． Ｃａｒｄｏｓｏ， ａｎｄ Ｈ． Ｌｅｏｎｈａｒｄｔ． ２００５． Ｔｒａｐｐｅｄ ｉｎ ａｃｔｉｏｎ： ｄｉｒｅｃｔ ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ． Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ． ２：７５１−７５６．
Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ， Ｖ．， Ｊ．Ｃ． Ａｍｅ， Ｐ． Ｄｏｌｌｅ， Ｉ． Ｓｃｈｕｌｔｚ， Ｂ． Ｒｉｎａｌｄｉ， Ｖ． Ｆｒａｕｌｏｂ， Ｊ． Ｍｅｎｉｓｓｉｅｒ−ｄｅ Ｍｕｒｃｉａ， ａｎｄ Ｇ． ｄｅ Ｍｕｒｃｉａ． ２００２． Ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ） ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−２ （ＰＡＲＰ−２） ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｂａｓｅ ｅｘｃｉｓｉｏｎ ＤＮＡ ｒｅｐａｉｒ ｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＰＡＲＰ−１ ａｎｄ ＸＲＣＣ１． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２７７：２３０２８−３６．
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質間相互作用を検出するための生体外の方法であって、
（ａ）真核細胞で、
（ｉ）細胞で発現される時に、前記細胞の核において別個の部位で蓄積する（ポリ）ペプチドと、
（ｉｉ）ＧＦＰに特異的に結合する（ポリ）ペプチドと、
を含む、第１の融合タンパク質を発現するステップと、
（ｂ）同一細胞で、
（ｉ）ＧＦＰと、
（ｉｉ）ベイト（ポリ）ペプチドと、
を含む、第２の融合タンパク質を発現するステップと、
（ｃ）同一細胞で、
（ｉ）ＧＦＰのそれとは異なる励起および／または発光波長である、蛍光（ポリ）ペプチドと、
（ｉｉ）プレイ（ポリ）ペプチドと、
を含む、第３の融合タンパク質を発現するステップと、
（ｄ）励起時に、前記細胞で、前記第２および前記第３の融合タンパク質の蛍光部の蛍光発光を検出するステップと、を含み、
前記細胞核における双方の融合タンパク質の蛍光発光の共局在は、ベイトおよびプレイ（ポリ）ペプチドの相互作用を示す、方法。
【請求項２】
２つの（ポリ）ペプチドの相互作用を調節する化合物を同定するための生体外の方法であって、
（ａ）真核細胞で、
（ｉ）細胞で発現される時に、前記細胞の核において別個の部位で蓄積する（ポリ）ペプチドと、
（ｉｉ）ＧＦＰに特異的に結合する（ポリ）ペプチドと、
を含む、第１の融合タンパク質を発現するステップと、
（ｂ）同一細胞で、
（ｉ）ＧＦＰと、
（ｉｉ）ベイト（ポリ）ペプチドと、
を含む、第２の融合タンパク質を発現するステップと、
（ｃ）同一細胞で、
（ｉ）ＧＦＰのそれとは異なる励起および／または発光波長である、蛍光（ポリ）ペプチドと、
（ｉｉ）前記ベイト（ポリ）ペプチドと相互作用することが既知である、または推測されるプレイ（ポリ）ペプチドと、
を含む、第３の融合タンパク質を発現するステップと、
（ｄ）前記細胞を試験化合物と接触させるステップと、
（ｅ）励起時に、前記細胞で、前記第２および前記第３の融合タンパク質の蛍光部の蛍光発光を検出するステップと、を含み、
前記試験化合物と接触させない参照細胞の核において認められるそれと比較した、前記細胞核における前記第２および前記第３の融合タンパク質の蛍光部の蛍光発光の共局在の程度の変化は、前記化合物が前記ベイトおよび前記プレイ（ポリ）ペプチドの前記相互作用を調節できることを示す、方法。
【請求項３】
２つのタンパク質の第３のタンパク質との相互作用の相対強度を判断するための生体外の方法であって、
（ａ）真核細胞で、
（ｉ）細胞で発現される時に、前記細胞の核において別個の部位で蓄積する（ポリ）ペプチドと、
（ｉｉ）ＧＦＰに特異的に結合する（ポリ）ペプチドと、
を含む、第１の融合タンパク質を発現するステップと、
（ｂ）同一細胞で、
（ｉ）ＧＦＰと、
（ｉｉ）ベイト（ポリ）ペプチドと、
を含む、第２の融合タンパク質を発現するステップと、
（ｃ）同一細胞で、
（ｉ）ＧＦＰのそれとは異なる励起および／または発光波長である、蛍光（ポリ）ペプチドと、
（ｉｉ）第１のプレイ（ポリ）ペプチドと、
を含む、第３の融合タンパク質を発現するステップと、
（ｄ）同一細胞で、
（ｉ）ＧＦＰのそれ、および前記第３の融合タンパク質の蛍光（ポリ）ペプチドのそれとは異なる励起および／または発光波長である、蛍光（ポリ）ペプチドと、
（ｉｉ）第２のプレイ（ポリ）ペプチドと、
を含む、第４の融合タンパク質を発現するステップと、
（ｅ）励起時に、前記細胞で、前記第２および前記第３の融合タンパク質の蛍光部の蛍光発光を検出するステップと、を含み、
前記細胞核における前記第２および前記第４の融合タンパク質のそれと比較すると異なる、前記第２および前記第３の融合タンパク質の蛍光発光の共局在の程度の変化は、前記ベイト（ポリ）ペプチドに対する前記第１および前記第２のプレイ（ポリ）ペプチドの異なる結合強度を示す、方法。
【請求項４】
タンパク質間相互作用を検出するための生体外の方法であって、
（ａ）真核細胞で、
（ｉ）蛍光（ポリ）ペプチドと、
（ｉｉ）細胞で発現される時に、前記細胞の核において別個の部位で蓄積する（ポリ）ペプチドと、
（ｉｉｉ）ベイト（ポリ）ペプチドと、
を含む、第１の融合タンパク質を発現するステップと、
（ｂ）同一細胞で、
（ｉ）前記第１の融合タンパク質に含まれる前記蛍光（ポリ）ペプチドのそれとは異なる励起および／または発光波長である、蛍光（ポリ）ペプチドと、
（ｉｉ）プレイ（ポリ）ペプチドと、
を含む、第２の融合タンパク質を発現するステップと、
（ｃ）励起時に、前記細胞で、前記第１および前記第２の融合タンパク質の蛍光部の蛍光発光を検出するステップと、を含み、
前記細胞核における双方の融合タンパク質の蛍光発光の共局在は、前記ベイトおよび前記プレイ（ポリ）ペプチドの相互作用を示す、方法。
【請求項５】
２つの（ポリ）ペプチドの相互作用を調節する化合物を同定するための生体外の方法であって、
（ａ）真核細胞で、
（ｉ）蛍光（ポリ）ペプチドと、
（ｉｉ）細胞で発現される時に、前記細胞の核において別個の部位で蓄積する（ポリ）ペプチドと、
（ｉｉｉ）ベイト（ポリ）ペプチドと、
を含む、第１の融合タンパク質を発現するステップと、
（ｂ）同一細胞で、
（ｉ）前記第１の融合タンパク質に含まれる前記蛍光（ポリ）ペプチドのそれとは異なる励起および／または発光波長である、蛍光（ポリ）ペプチドと、
（ｉｉ）前記ベイト（ポリ）ペプチドと相互作用することが既知である、または推測されるプレイ（ポリ）ペプチドと、
を含む、第２の融合タンパク質を発現するステップと、
（ｃ）前記細胞を試験化合物と接触させるステップと、
（ｄ）励起時に、前記細胞で、前記第１および前記第２の融合タンパク質の蛍光部の蛍光発光を検出するステップと、を含み、
前記試験化合物と接触させない参照細胞の核において認められるそれと比較した、前記細胞核における双方の融合タンパク質の蛍光部の蛍光発光の共局在の程度の変化は、前記化合物が前記ベイトおよび前記プレイ（ポリ）ペプチドの前記相互作用を調節できることを示す、方法。
【請求項６】
２つのタンパク質の第３のタンパク質との相互作用の相対強度を判断するための生体外の方法であって、
（ａ）真核細胞で、
（ｉ）蛍光（ポリ）ペプチドと、
（ｉｉ）細胞で発現される時に、前記細胞の核において別個の部位で蓄積する（ポリ）ペプチドと、
（ｉｉｉ）ベイト（ポリ）ペプチドと、
を含む、第１の融合タンパク質を発現するステップと、
（ｂ）同一細胞で、
（ｉ）前記第１の融合タンパク質に含まれる前記蛍光（ポリ）ペプチドのそれとは異なる励起および／または発光波長である、蛍光（ポリ）ペプチドと、
（ｉｉ）第１のプレイ（ポリ）ペプチドと、
を含む、第２の融合タンパク質を発現するステップと、
（ｃ）同一細胞で、
（ｉ）前記第１および第２の融合タンパク質に含まれる前記蛍光（ポリ）ペプチドのそれとは異なる励起および／または発光波長である、蛍光（ポリ）ペプチドと、
（ｉｉ）第２のプレイ（ポリ）ペプチドと、
を含む、第３の融合タンパク質を発現するステップと、
（ｄ）励起時に、前記細胞で、前記第１、前記第２および前記第３の融合タンパク質の蛍光部の蛍光発光を検出するステップと、を含み、
前記細胞核における前記第１および前記第３の融合タンパク質のそれと比較すると異なる、前記第１および前記第２の融合タンパク質の蛍光発光の共局在の程度は、前記ベイト（ポリ）ペプチドに対する前記第１および前記第２のプレイ（ポリ）ペプチドの異なる結合強度を示す、方法。
【請求項７】
前記試験化合物と接触されない参照細胞の核において認められるそれと比較した、前記細胞核における双方の融合タンパク質の前記蛍光部の共局在の減少は、前記化合物が前記ベイトおよび前記プレイ（ポリ）ペプチドの前記相互作用を弱化することができることを示す、請求項２または５に記載の方法。
【請求項８】
前記試験化合物と接触されない参照細胞の核において認められるそれと比較した、前記細胞核における双方の融合タンパク質の前記蛍光部の共局在の増加は、前記化合物が前記ベイトおよび前記プレイ（ポリ）ペプチドの前記相互作用を誘発または強化できることを示す、請求項２または５に記載の方法。
【請求項９】
前記検出は、細胞プロセスでのタンパク質間相互作用の依存性を調査するために採用され、前記方法は、（ｄ１）前記細胞における１つ以上のプロセスの過程で、前記細胞における前記第１および前記第２の融合タンパク質の前記蛍光部の蛍光発光を監視するステップをさらに含み、前記細胞における双方の融合タンパク質の前記蛍光部の前記蛍光発光の共局在の程度の変化は、１つ以上の細胞プロセスでの前記相互作用の依存性を示す、請求項１または４に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞プロセスは、細胞周期、分泌、転位、またはシグナル伝達である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記検出は、タンパク質間相互作用の強度を判断するために採用され、前記方法は、双方の融合タンパク質の前記蛍光部の前記蛍光発光の共局在が検出された場合（ｄ２）、前記第２の融合タンパク質の前記蛍光の選択的減光、および経時的に双方の融合タンパク質の前記蛍光部の前記蛍光発光の共局在の回復を監視するステップをさらに含み、共局在を確立するために必要な時間は、前記タンパク質間相互作用の強度を示す、請求項１または４に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１の融合タンパク質の構成要素（ｉ）、（ｉｉ）および／もしくは（ｉｉｉ）、ならびに／または前記第２の融合タンパク質の構成要素（ｉ）および（ｉｉ）、ならびに／または前記第３の融合タンパク質の構成要素（ｉ）および（ｉｉ）は、リンカーを介して連結される、請求項４〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
細胞で発現する時に、前記細胞の前記核において別個の部位で蓄積する前記（ポリ）ペプチドは、前記細胞の前記核において別個の部位で蓄積されるタンパク質性または非タンパク質性構造と直接的に相互作用する、請求項４〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
細胞で発現する時に、前記細胞の前記核において別個の部位で蓄積する前記（ポリ）ペプチドは、前記細胞の前記核において別個の部位で蓄積されるタンパク質性または非タンパク質性構造と間接的に相互作用する、請求項４〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１の融合タンパク質の構成要素（ｉ）および（ｉｉ）、ならびに／または前記第２の融合タンパク質の構成要素（ｉ）および（ｉｉ）、ならびに／または前記第３の融合タンパク質の構成要素（ｉ）および（ｉｉ）、ならびに／または前記第４の融合タンパク質の構成要素（ｉ）および（ｉｉ）は、リンカーを介して連結される、請求項１〜３および７〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記プレイ（ポリ）ペプチドのうちのいずれかは、核局在化シグナルを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記第２および／または第３および／または第４融合タンパク質は、核局在化シグナルを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記真核細胞における発現は、１つ以上のベクターにおいて、前記第１および第２の融合タンパク質をコードする核酸分子を形質移入することにより達成される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞の前記核の別個の部位で蓄積される前記（ポリ）ペプチドは、前記細胞に導入される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞の前記別個の部位は、不活性構造を形成する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記不活性構造は、核ラミナまたは核スペックルである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
細胞で発現する時に、前記細胞の前記核における別個の部位で蓄積する前記（ポリ）ペプチドは、ＰＭＬ体と相互作用する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記核における別個の部位で蓄積される前記（ポリ）ペプチドは、前記細胞に対して非相同である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
細胞で発現する時に、前記細胞の前記核における別個の部位で蓄積する前記（ポリ）ペプチドは、ＤＮＡと相互作用する、請求項１〜８および２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＤＮＡは、ｌａｃオペレータである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ｌａｃオペレータは、前記核に多コピー存在する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記第１の融合タンパク質は、ＬａｃＩを含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記検出は、蛍光顕微鏡を使用して実施される、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記真核細胞は、生体細胞である、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞における前記ベイトおよび／またはプレイ（ポリ）ペプチドを局在化させるステップをさらに含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
融合タンパク質をコードする核酸分子であって、
（ｉ）蛍光（ポリ）ペプチドと、
（ｉｉ）細胞で発現する時に、前記細胞の前記核における別個の部位で蓄積する前記（ポリ）ペプチドと、
（ｉｉｉ）ベイト（ポリ）ペプチドと、
を含む、核酸分子。
【請求項３２】
前記融合タンパク質は、ＬａｃＩを含む、請求項３１に記載の核酸分子。
【請求項３３】
請求項３１または３２に記載の核酸分子によりコードされるタンパク質。
【請求項３４】
請求項３１または３２に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項３５】
（ｉ）請求項３１に記載のタンパク質に含まれる前記蛍光（ポリ）ペプチドのそれとは異なる励起および／または発光波長の蛍光（ポリ）ペプチドと、
（ｉｉ）プレイ（ポリ）ペプチドと、
を含む、融合タンパク質をコードする核酸分子をさらに含む、請求項３４に記載のベクター。
【請求項３６】
請求項３４または３５のいずれか１項に記載のベクターで形質移入される真核細胞。
【請求項３７】
請求項３４に記載の前記ベクター、ならびに
（ｉ）請求項３３に記載のタンパク質に含まれる前記蛍光（ポリ）ペプチドのそれとは異なる励起および／または発光波長の蛍光（ポリ）ペプチドと、
（ｉｉ）プレイ（ポリ）ペプチドと、
を含む、融合タンパク質をコードする核酸分子を含むベクターで形質移入される、請求項３６に記載の真核細胞。
【請求項３８】
そのＤＮＡに安定して組み込まれるｌａｃオペレータの多コピーを有し、請求項３３に記載のタンパク質を安定して発現する、真核細胞。
【請求項３９】
そのＤＮＡに安定して組み込まれるｌａｃオペレータの多コピーを有し、（ｉ）前記ｌａｃオペレータに結合する（ポリ）ペプチドと、（ｉｉ）ＧＦＰに特異的に結合する（ポリ）ペプチドと、を含むタンパク質を安定して発現する、真核細胞。
【請求項４０】
ＧＦＰに特異的に結合する前記（ポリ）ペプチドは、配列番号７または９のアミノ酸配列を有する（ポリ）ペプチドを含む、請求項１〜３、７〜１１、および１３〜３０のいずれか１項に記載の方法、または請求項３９に記載の真核細胞。
【請求項１】
タンパク質間相互作用を検出するための生体外の方法であって、
（ａ）真核細胞で、
（ｉ）細胞で発現される時に、前記細胞の核において別個の部位で蓄積する（ポリ）ペプチドと、
（ｉｉ）ＧＦＰに特異的に結合する（ポリ）ペプチドと、
を含む、第１の融合タンパク質を発現するステップと、
（ｂ）同一細胞で、
（ｉ）ＧＦＰと、
（ｉｉ）ベイト（ポリ）ペプチドと、
を含む、第２の融合タンパク質を発現するステップと、
（ｃ）同一細胞で、
（ｉ）ＧＦＰのそれとは異なる励起および／または発光波長である、蛍光（ポリ）ペプチドと、
（ｉｉ）プレイ（ポリ）ペプチドと、
を含む、第３の融合タンパク質を発現するステップと、
（ｄ）励起時に、前記細胞で、前記第２および前記第３の融合タンパク質の蛍光部の蛍光発光を検出するステップと、を含み、
前記細胞核における双方の融合タンパク質の蛍光発光の共局在は、ベイトおよびプレイ（ポリ）ペプチドの相互作用を示す、方法。
【請求項２】
２つの（ポリ）ペプチドの相互作用を調節する化合物を同定するための生体外の方法であって、
（ａ）真核細胞で、
（ｉ）細胞で発現される時に、前記細胞の核において別個の部位で蓄積する（ポリ）ペプチドと、
（ｉｉ）ＧＦＰに特異的に結合する（ポリ）ペプチドと、
を含む、第１の融合タンパク質を発現するステップと、
（ｂ）同一細胞で、
（ｉ）ＧＦＰと、
（ｉｉ）ベイト（ポリ）ペプチドと、
を含む、第２の融合タンパク質を発現するステップと、
（ｃ）同一細胞で、
（ｉ）ＧＦＰのそれとは異なる励起および／または発光波長である、蛍光（ポリ）ペプチドと、
（ｉｉ）前記ベイト（ポリ）ペプチドと相互作用することが既知である、または推測されるプレイ（ポリ）ペプチドと、
を含む、第３の融合タンパク質を発現するステップと、
（ｄ）前記細胞を試験化合物と接触させるステップと、
（ｅ）励起時に、前記細胞で、前記第２および前記第３の融合タンパク質の蛍光部の蛍光発光を検出するステップと、を含み、
前記試験化合物と接触させない参照細胞の核において認められるそれと比較した、前記細胞核における前記第２および前記第３の融合タンパク質の蛍光部の蛍光発光の共局在の程度の変化は、前記化合物が前記ベイトおよび前記プレイ（ポリ）ペプチドの前記相互作用を調節できることを示す、方法。
【請求項３】
２つのタンパク質の第３のタンパク質との相互作用の相対強度を判断するための生体外の方法であって、
（ａ）真核細胞で、
（ｉ）細胞で発現される時に、前記細胞の核において別個の部位で蓄積する（ポリ）ペプチドと、
（ｉｉ）ＧＦＰに特異的に結合する（ポリ）ペプチドと、
を含む、第１の融合タンパク質を発現するステップと、
（ｂ）同一細胞で、
（ｉ）ＧＦＰと、
（ｉｉ）ベイト（ポリ）ペプチドと、
を含む、第２の融合タンパク質を発現するステップと、
（ｃ）同一細胞で、
（ｉ）ＧＦＰのそれとは異なる励起および／または発光波長である、蛍光（ポリ）ペプチドと、
（ｉｉ）第１のプレイ（ポリ）ペプチドと、
を含む、第３の融合タンパク質を発現するステップと、
（ｄ）同一細胞で、
（ｉ）ＧＦＰのそれ、および前記第３の融合タンパク質の蛍光（ポリ）ペプチドのそれとは異なる励起および／または発光波長である、蛍光（ポリ）ペプチドと、
（ｉｉ）第２のプレイ（ポリ）ペプチドと、
を含む、第４の融合タンパク質を発現するステップと、
（ｅ）励起時に、前記細胞で、前記第２および前記第３の融合タンパク質の蛍光部の蛍光発光を検出するステップと、を含み、
前記細胞核における前記第２および前記第４の融合タンパク質のそれと比較すると異なる、前記第２および前記第３の融合タンパク質の蛍光発光の共局在の程度の変化は、前記ベイト（ポリ）ペプチドに対する前記第１および前記第２のプレイ（ポリ）ペプチドの異なる結合強度を示す、方法。
【請求項４】
タンパク質間相互作用を検出するための生体外の方法であって、
（ａ）真核細胞で、
（ｉ）蛍光（ポリ）ペプチドと、
（ｉｉ）細胞で発現される時に、前記細胞の核において別個の部位で蓄積する（ポリ）ペプチドと、
（ｉｉｉ）ベイト（ポリ）ペプチドと、
を含む、第１の融合タンパク質を発現するステップと、
（ｂ）同一細胞で、
（ｉ）前記第１の融合タンパク質に含まれる前記蛍光（ポリ）ペプチドのそれとは異なる励起および／または発光波長である、蛍光（ポリ）ペプチドと、
（ｉｉ）プレイ（ポリ）ペプチドと、
を含む、第２の融合タンパク質を発現するステップと、
（ｃ）励起時に、前記細胞で、前記第１および前記第２の融合タンパク質の蛍光部の蛍光発光を検出するステップと、を含み、
前記細胞核における双方の融合タンパク質の蛍光発光の共局在は、前記ベイトおよび前記プレイ（ポリ）ペプチドの相互作用を示す、方法。
【請求項５】
２つの（ポリ）ペプチドの相互作用を調節する化合物を同定するための生体外の方法であって、
（ａ）真核細胞で、
（ｉ）蛍光（ポリ）ペプチドと、
（ｉｉ）細胞で発現される時に、前記細胞の核において別個の部位で蓄積する（ポリ）ペプチドと、
（ｉｉｉ）ベイト（ポリ）ペプチドと、
を含む、第１の融合タンパク質を発現するステップと、
（ｂ）同一細胞で、
（ｉ）前記第１の融合タンパク質に含まれる前記蛍光（ポリ）ペプチドのそれとは異なる励起および／または発光波長である、蛍光（ポリ）ペプチドと、
（ｉｉ）前記ベイト（ポリ）ペプチドと相互作用することが既知である、または推測されるプレイ（ポリ）ペプチドと、
を含む、第２の融合タンパク質を発現するステップと、
（ｃ）前記細胞を試験化合物と接触させるステップと、
（ｄ）励起時に、前記細胞で、前記第１および前記第２の融合タンパク質の蛍光部の蛍光発光を検出するステップと、を含み、
前記試験化合物と接触させない参照細胞の核において認められるそれと比較した、前記細胞核における双方の融合タンパク質の蛍光部の蛍光発光の共局在の程度の変化は、前記化合物が前記ベイトおよび前記プレイ（ポリ）ペプチドの前記相互作用を調節できることを示す、方法。
【請求項６】
２つのタンパク質の第３のタンパク質との相互作用の相対強度を判断するための生体外の方法であって、
（ａ）真核細胞で、
（ｉ）蛍光（ポリ）ペプチドと、
（ｉｉ）細胞で発現される時に、前記細胞の核において別個の部位で蓄積する（ポリ）ペプチドと、
（ｉｉｉ）ベイト（ポリ）ペプチドと、
を含む、第１の融合タンパク質を発現するステップと、
（ｂ）同一細胞で、
（ｉ）前記第１の融合タンパク質に含まれる前記蛍光（ポリ）ペプチドのそれとは異なる励起および／または発光波長である、蛍光（ポリ）ペプチドと、
（ｉｉ）第１のプレイ（ポリ）ペプチドと、
を含む、第２の融合タンパク質を発現するステップと、
（ｃ）同一細胞で、
（ｉ）前記第１および第２の融合タンパク質に含まれる前記蛍光（ポリ）ペプチドのそれとは異なる励起および／または発光波長である、蛍光（ポリ）ペプチドと、
（ｉｉ）第２のプレイ（ポリ）ペプチドと、
を含む、第３の融合タンパク質を発現するステップと、
（ｄ）励起時に、前記細胞で、前記第１、前記第２および前記第３の融合タンパク質の蛍光部の蛍光発光を検出するステップと、を含み、
前記細胞核における前記第１および前記第３の融合タンパク質のそれと比較すると異なる、前記第１および前記第２の融合タンパク質の蛍光発光の共局在の程度は、前記ベイト（ポリ）ペプチドに対する前記第１および前記第２のプレイ（ポリ）ペプチドの異なる結合強度を示す、方法。
【請求項７】
前記試験化合物と接触されない参照細胞の核において認められるそれと比較した、前記細胞核における双方の融合タンパク質の前記蛍光部の共局在の減少は、前記化合物が前記ベイトおよび前記プレイ（ポリ）ペプチドの前記相互作用を弱化することができることを示す、請求項２または５に記載の方法。
【請求項８】
前記試験化合物と接触されない参照細胞の核において認められるそれと比較した、前記細胞核における双方の融合タンパク質の前記蛍光部の共局在の増加は、前記化合物が前記ベイトおよび前記プレイ（ポリ）ペプチドの前記相互作用を誘発または強化できることを示す、請求項２または５に記載の方法。
【請求項９】
前記検出は、細胞プロセスでのタンパク質間相互作用の依存性を調査するために採用され、前記方法は、（ｄ１）前記細胞における１つ以上のプロセスの過程で、前記細胞における前記第１および前記第２の融合タンパク質の前記蛍光部の蛍光発光を監視するステップをさらに含み、前記細胞における双方の融合タンパク質の前記蛍光部の前記蛍光発光の共局在の程度の変化は、１つ以上の細胞プロセスでの前記相互作用の依存性を示す、請求項１または４に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞プロセスは、細胞周期、分泌、転位、またはシグナル伝達である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記検出は、タンパク質間相互作用の強度を判断するために採用され、前記方法は、双方の融合タンパク質の前記蛍光部の前記蛍光発光の共局在が検出された場合（ｄ２）、前記第２の融合タンパク質の前記蛍光の選択的減光、および経時的に双方の融合タンパク質の前記蛍光部の前記蛍光発光の共局在の回復を監視するステップをさらに含み、共局在を確立するために必要な時間は、前記タンパク質間相互作用の強度を示す、請求項１または４に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１の融合タンパク質の構成要素（ｉ）、（ｉｉ）および／もしくは（ｉｉｉ）、ならびに／または前記第２の融合タンパク質の構成要素（ｉ）および（ｉｉ）、ならびに／または前記第３の融合タンパク質の構成要素（ｉ）および（ｉｉ）は、リンカーを介して連結される、請求項４〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
細胞で発現する時に、前記細胞の前記核において別個の部位で蓄積する前記（ポリ）ペプチドは、前記細胞の前記核において別個の部位で蓄積されるタンパク質性または非タンパク質性構造と直接的に相互作用する、請求項４〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
細胞で発現する時に、前記細胞の前記核において別個の部位で蓄積する前記（ポリ）ペプチドは、前記細胞の前記核において別個の部位で蓄積されるタンパク質性または非タンパク質性構造と間接的に相互作用する、請求項４〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１の融合タンパク質の構成要素（ｉ）および（ｉｉ）、ならびに／または前記第２の融合タンパク質の構成要素（ｉ）および（ｉｉ）、ならびに／または前記第３の融合タンパク質の構成要素（ｉ）および（ｉｉ）、ならびに／または前記第４の融合タンパク質の構成要素（ｉ）および（ｉｉ）は、リンカーを介して連結される、請求項１〜３および７〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記プレイ（ポリ）ペプチドのうちのいずれかは、核局在化シグナルを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記第２および／または第３および／または第４融合タンパク質は、核局在化シグナルを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記真核細胞における発現は、１つ以上のベクターにおいて、前記第１および第２の融合タンパク質をコードする核酸分子を形質移入することにより達成される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞の前記核の別個の部位で蓄積される前記（ポリ）ペプチドは、前記細胞に導入される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞の前記別個の部位は、不活性構造を形成する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記不活性構造は、核ラミナまたは核スペックルである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
細胞で発現する時に、前記細胞の前記核における別個の部位で蓄積する前記（ポリ）ペプチドは、ＰＭＬ体と相互作用する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記核における別個の部位で蓄積される前記（ポリ）ペプチドは、前記細胞に対して非相同である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
細胞で発現する時に、前記細胞の前記核における別個の部位で蓄積する前記（ポリ）ペプチドは、ＤＮＡと相互作用する、請求項１〜８および２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＤＮＡは、ｌａｃオペレータである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ｌａｃオペレータは、前記核に多コピー存在する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記第１の融合タンパク質は、ＬａｃＩを含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記検出は、蛍光顕微鏡を使用して実施される、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記真核細胞は、生体細胞である、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞における前記ベイトおよび／またはプレイ（ポリ）ペプチドを局在化させるステップをさらに含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
融合タンパク質をコードする核酸分子であって、
（ｉ）蛍光（ポリ）ペプチドと、
（ｉｉ）細胞で発現する時に、前記細胞の前記核における別個の部位で蓄積する前記（ポリ）ペプチドと、
（ｉｉｉ）ベイト（ポリ）ペプチドと、
を含む、核酸分子。
【請求項３２】
前記融合タンパク質は、ＬａｃＩを含む、請求項３１に記載の核酸分子。
【請求項３３】
請求項３１または３２に記載の核酸分子によりコードされるタンパク質。
【請求項３４】
請求項３１または３２に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項３５】
（ｉ）請求項３１に記載のタンパク質に含まれる前記蛍光（ポリ）ペプチドのそれとは異なる励起および／または発光波長の蛍光（ポリ）ペプチドと、
（ｉｉ）プレイ（ポリ）ペプチドと、
を含む、融合タンパク質をコードする核酸分子をさらに含む、請求項３４に記載のベクター。
【請求項３６】
請求項３４または３５のいずれか１項に記載のベクターで形質移入される真核細胞。
【請求項３７】
請求項３４に記載の前記ベクター、ならびに
（ｉ）請求項３３に記載のタンパク質に含まれる前記蛍光（ポリ）ペプチドのそれとは異なる励起および／または発光波長の蛍光（ポリ）ペプチドと、
（ｉｉ）プレイ（ポリ）ペプチドと、
を含む、融合タンパク質をコードする核酸分子を含むベクターで形質移入される、請求項３６に記載の真核細胞。
【請求項３８】
そのＤＮＡに安定して組み込まれるｌａｃオペレータの多コピーを有し、請求項３３に記載のタンパク質を安定して発現する、真核細胞。
【請求項３９】
そのＤＮＡに安定して組み込まれるｌａｃオペレータの多コピーを有し、（ｉ）前記ｌａｃオペレータに結合する（ポリ）ペプチドと、（ｉｉ）ＧＦＰに特異的に結合する（ポリ）ペプチドと、を含むタンパク質を安定して発現する、真核細胞。
【請求項４０】
ＧＦＰに特異的に結合する前記（ポリ）ペプチドは、配列番号７または９のアミノ酸配列を有する（ポリ）ペプチドを含む、請求項１〜３、７〜１１、および１３〜３０のいずれか１項に記載の方法、または請求項３９に記載の真核細胞。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２０１１−５０９６５５（Ｐ２０１１−５０９６５５Ａ）
【公表日】平成２３年３月３１日（２０１１．３．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５４１７５０（Ｐ２０１０−５４１７５０）
【出願日】平成２１年１月８日（２００９．１．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／００００６７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０８７０９７
【国際公開日】平成２１年７月１６日（２００９．７．１６）
【出願人】（５１０１８４７０４）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年３月３１日（２０１１．３．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１月８日（２００９．１．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／００００６７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０８７０９７
【国際公開日】平成２１年７月１６日（２００９．７．１６）
【出願人】（５１０１８４７０４）
【Ｆターム（参考）】
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