疾患モデル動物、細胞、組織、精巣、交配用動物、生殖細胞生産方法、生殖細胞、培養細胞、スクリーニング方法、医薬組成物、妊孕性診断キット、検出方法、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び抗体
【課題】低妊孕性又は不妊症の病態や治療法を研究する上で有用なツールを提供する。
【解決手段】ジーンターゲッティング技術によりＭｅｉｃｈｒｏａｃｉｄｉｎ（ＭＣＡ）遺伝子の第１エクソンを欠失させたＭＣＡホモ欠損マウスは、精巣内では精細胞が見られるものの、副精巣において精子が見られず無精子症を呈する。従って、このＭＣＡホモ欠損マウスは、無精子症のモデル動物として有用である。
【解決手段】ジーンターゲッティング技術によりＭｅｉｃｈｒｏａｃｉｄｉｎ（ＭＣＡ）遺伝子の第１エクソンを欠失させたＭＣＡホモ欠損マウスは、精巣内では精細胞が見られるものの、副精巣において精子が見られず無精子症を呈する。従って、このＭＣＡホモ欠損マウスは、無精子症のモデル動物として有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は疾患の現象解明や治療法の確立に有用な疾患モデル動物などのツールに関するものである。また、本発明は、妊孕可能性の推定及び不妊症の原因の同定を可能にする技術に関するものでもある。
【背景技術】
【０００２】
近年、少子化の問題が頻繁に取り上げられ、この問題を解消するために様々な対策が模索されている。少子化の対策として、不妊症により子供を授からない夫婦を救済することが重要であることは言うまでもない。
【０００３】
非特許文献１では、子供を望む夫婦のうちの約１５％が２年たっても妊娠できないことが報告されている。近年では、体外受精（ＩＶＦ；In Vitro Fertilization）の技術発展により、精子の活動能が低い場合においても妊娠出産が可能になっているが、不妊の背後にある分子メカニズムは依然として明らかになっていない。
【０００４】
非特許文献２によると、マウスにおける雄性不妊の研究により、妊孕性に影響を与える多くの遺伝子の存在が明らかになっており、これらの遺伝子の変異がヒトにおいても男性不妊を引き起こす一因となっている可能性がある。
【０００５】
哺乳類の雄性生殖細胞の成熟は、数々の構造的及び機能的変化を経てなされる。その過程は精子形成と呼ばれ、主として（１）精原細胞の増殖及び分化、（２）精母細胞の前期段階における減数分裂、及び（３）半数体円形精子細胞から精子への分化の際の急激な形態変化、の３つの段階を含んでいる。
【０００６】
上記の（２）の減数分裂期に特異的に発現するタンパク質として、Ｍｅｉｃｈｒｏａｃｉｄｉｎ（以下「ＭＣＡ」という）が知られている。ＭＣＡ遺伝子は、最初にマウスにおいて単離された（非特許文献３）。その遺伝子産物は、パキテン期精母細胞の細胞質に発現し、減数分裂期に核膜が消失すると染色体や紡錘体に結合することが分かっている。このことから、上記の遺伝子産物はMale Meiotic Metaphase Chromosome-Associated Acidic Proteinの頭文字をとってＭｅｉｃｈｒｏａｃｉｄｉｎと名付けられた。ＭＣＡタンパク質は特異的なアミノ酸の反復配列を含んでおり、後にこの反復配列はＭＯＲＮモチーフと名付けられた（非特許文献４）。
【０００７】
その後、ヒトＭＣＡ遺伝子も単離され、解析の結果、ヒトＭＣＡタンパク質は精子の鞭毛、基底小体及びアクロソームにおいて発現していることが明らかになった（非特許文献５）。また、マウスにおいてＭＣＡタンパク質が精子の鞭毛にも発現していることも明らかになった。
【０００８】
なお、ＭＣＡタンパク質は、ヒトやマウスなどの哺乳動物だけでなく、コイやホヤの精子の鞭毛にも発現していることが知られている（非特許文献６，７）。
【非特許文献１】de Kretser DM et al., J Clin Endocrinol Metab. 1999; 84: 3443-3450.
【非特許文献２】Matzuk MM et al., Nat Cell Biol. 2002; 4(Supp1): S41-S49 / Nat Med. 2002; 8 (Supp1): S33-S40.
【非特許文献３】Tsuchida J et al., Dev Biol. 1998 May 1;197(1):67-76.
【非特許文献４】Takeshima H et al., Mol Cell. 2000 July ;6(1):11-22.
【非特許文献５】Yasuhiro M et al., Reproductive Medicine and Biology. 2005; 4: 213-219.
【非特許文献６】Ju TK and Huang FL., Biol Reprod. 2004 Nov; 71(5):1419-1429. Epub 2004 Jun 23.
【非特許文献７】Satouh Y et al., Mol Biol Cell. 2005 Feb; 16(2):626-636. Epub 2004 Nov 24.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、男性不妊の病態や治療法を研究する際に有用なツールとなる疾患モデル動物は未だ十分に得られていない。一口に男性不妊といっても、その原因は、生殖細胞自体の欠失から精子の受精不全まで多岐に渡る。従って、病態に応じた有効な治療法を確立するためには、様々な男性不妊モデル動物を得ることが望まれている。
【００１０】
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、その第１の目的は、低妊孕性又は不妊症の病態や治療法を研究する上で有用なツールを提供することにある。
【００１１】
また、男性不妊を診断するための有効な遺伝子診断方法も、未だ十分に確立されていない。
【００１２】
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、その第２の目的は、妊孕可能性の推定及び不妊症の原因の同定を可能にすることにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本願発明者は、後述する実施例に示すように、ＭＣＡ遺伝子が欠損し、ＭＣＡを発現しないＭＣＡ欠損マウスを作製した結果、このマウスが不妊症になることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１４】
すなわち、上記第１の目的を達成するために、本発明に係る疾患モデル動物は、正常なＭＣＡタンパク質の発現が低下し、低妊孕性又は不妊症を呈するオスの非ヒト哺乳動物であることを特徴とする。
【００１５】
或いは、本発明に係る疾患モデル動物は、正常なＭＣＡタンパク質が発現しないオスの非ヒト哺乳動物であることを特徴とするものであってもよい。
【００１６】
さらに或いは、本発明に係る疾患モデル動物は、ＭＣＡ遺伝子が欠損したオスの非ヒト哺乳動物であることを特徴とするものであってもよい。
【００１７】
これにより、低妊孕性又は不妊症の新規のモデル動物が提供される。
【００１８】
また、上記疾患モデル動物は、低妊孕性又は不妊症を呈することが好ましい。また、上記非ヒト哺乳動物はマウスであることが好ましい。また、上記疾患モデル動物は無精子症を呈することが好ましい。
【００１９】
本発明に係る細胞は、上述した疾患モデル動物から単離されたものであることを特徴とする。また、本発明に係る別の細胞は、ＭＣＡ遺伝子が欠損又は変異し、低妊孕性又は不妊症を呈するヒト男性から単離されたものであることを特徴とする。なお、上記細胞は、生殖細胞であることが好ましい。
【００２０】
本発明に係る精巣内の組織又は精巣は、上述した疾患モデル動物又は上述したヒト男性から単離されたものであることを特徴とする。
【００２１】
本発明に係る交配用動物は、上述した疾患モデル動物を作製するための交配に用いられ、ＭＣＡ遺伝子の一部又は全部が欠損している非ヒト哺乳動物であることを特徴とする。この交配用動物を用いれば、上述した疾患モデル動物を容易に作製することができる。
【００２２】
本発明に係る生殖細胞生産方法は、低妊孕性又は不妊の雄性生殖細胞を生産するための生殖細胞生産方法であって、オスの哺乳動物由来の培養細胞又はオスの哺乳動物から単離された細胞である哺乳動物細胞が有するＭＣＡ遺伝子を欠損させる遺伝子欠損工程と、上記遺伝子欠損工程によってＭＣＡ遺伝子が欠損した哺乳動物細胞を生殖細胞へ分化させる分化誘導工程とを含んでいることを特徴とする。
【００２３】
本発明に係る生殖細胞は、オスの非ヒト哺乳動物の生殖細胞であって、ＭＣＡ遺伝子が欠損し、低妊孕性又は不妊を呈することを特徴とする。
【００２４】
本発明に係る培養細胞は、ヒト男性由来の培養細胞であって、ＭＣＡ遺伝子が欠損し、低妊孕性又は不妊を呈する生殖細胞であることを特徴とする。
【００２５】
本発明に係るスクリーニング方法は、低妊孕性又は不妊症の治療薬の候補化合物をスクリーニングするためのスクリーニング方法であって、上述した疾患モデル動物、細胞、組織若しくは精巣、雄性生殖細胞、生殖細胞、又は培養細胞に対して上記候補化合物を作用させ、その結果を評価する工程を含んでいることを特徴とする。
【００２６】
本発明に係る低妊孕性又は不妊症の治療及び／又は予防用医薬組成物は、上述したスクリーニング方法によって得られた化合物を主成分として含むことを特徴とする。
【００２７】
また、上記第２の目的を達成するために、本発明に係る妊孕性診断キットは、ヒトＭＣＡ遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬を含んでいることを特徴とする。
【００２８】
上記試薬は、翻訳開始コドンをコードするアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒトＭＣＡ遺伝子の翻訳領域の第９２位の塩基および第１２１位の塩基のうちの少なくとも一方の塩基の変異の有無を検出するものであることが好ましい。
【００２９】
具体的には、上記試薬は、ヒトＭＣＡ遺伝子の上記第９２位の塩基および第１２１位の塩基のうちの少なくとも一方の塩基を含む領域を増幅させるためのプライマーの組と、上記領域の塩基配列を決定するための塩基配列決定試薬とを含んでいてもよい。
【００３０】
或いは、上記試薬は、上記変異の有無をインベーダー法によって検出するものであってもよい。
【００３１】
さらに或いは、上記試薬は、上記変異の有無をＳＭＭＤ法によって検出するものであってもよい。
【００３２】
また、上記第２の目的を達成するために、本発明に係る検出方法は、ヒトから単離された生体サンプルを用いて上記ヒトにおける遺伝子の欠損又は変異を検出する検出方法であって、ヒトＭＣＡ遺伝子の欠損又は変異の有無を検出する工程を含んでいることを特徴とする。
【００３３】
ＭＣＡ遺伝子の欠損又は変異は男性の妊孕性に影響を与えるため、上記妊孕性診断キット又は検出方法により、妊孕可能性の推定及び不妊症の原因の同定が可能になる。
【００３４】
また、上記第１の目的を達成するために、本発明に係るポリヌクレオチドは、翻訳開始コドンをコードするアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒト野生型ＭＣＡ遺伝子の翻訳領域の塩基配列において第９２位の塩基がシトシンに置換した塩基配列からなることを特徴とする。
【００３５】
また、上記第１の目的を達成するために、本発明に係る別のポリヌクレオチドは、翻訳開始コドンをコードするアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒト野生型ＭＣＡ遺伝子の翻訳領域の塩基配列において第１２１位の塩基がアデニンに置換した塩基配列からなることを特徴とする。
【００３６】
また、上記第１の目的を達成するために、本発明に係るさらに別のポリヌクレオチドは、翻訳開始コドンをコードするアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒト野生型ＭＣＡ遺伝子の翻訳領域の塩基配列において第９２位の塩基がシトシンに置換し、さらに第１２１位の塩基がアデニンに置換した塩基配列からなることを特徴とする。
【００３７】
なお、上記ポリヌクレオチドは、低妊孕性又は不妊症に関与するものであることが好ましい。
【００３８】
また、本発明に係るポリペプチドは、上述した何れかのポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなることを特徴とする。
【００３９】
上記のポリヌクレオチド又はポリペプチドは、低妊孕性又は不妊症の病態や治療法を研究する上で有用なツールとして利用することができる。
【００４０】
また、上記第２の目的を達成するために、本発明に係る抗体は、上述したポリペプチドと結合し、かつ、ヒト野生型ＭＣＡポリペプチドと結合しないことを特徴とする。
【００４１】
また、上記第２の目的を達成するために、本発明に係る検出方法は、ヒトから採取された生体サンプルを用いて上記ヒトにおいて発現しているＭＣＡポリペプチドの変異を検出する検出方法であって、上述した抗体によってＭＣＡポリペプチドの変異を検出する工程を含んでいることを特徴とする。
【００４２】
また、上記第２の目的を達成するために、本発明に係る別の妊孕性診断キットは、抗ヒトＭＣＡ抗体を含んでいることを特徴とする。
【発明の効果】
【００４３】
以上のように、本発明に係る疾患モデル動物は低妊孕性又は不妊症を呈するので、その個体、細胞、組織及び精巣は、低妊孕性又は不妊症の病態や治療法を研究する上で有用なツールとして利用することができる。
【００４４】
また、本発明に係る生殖細胞生産方法、生殖細胞又は培養細胞によれば、低妊孕性又は不妊のオスの生殖細胞が提供されるので、これを低妊孕性又は不妊症の病態や治療法を研究する上で有用なツールとして利用することができる。
【００４５】
また、ＭＣＡ遺伝子が欠損又は変異し、低妊孕性又は不妊症を呈するヒト男性から得られた細胞、組織及び精巣も、低妊孕性又は不妊症の病態や治療法を研究する上で有用なツールとして利用することができる。
【００４６】
また、本発明に係るポリヌクレオチドは、実際にヒトの不妊症患者に見られる変異を有しているので、本発明に係るポリヌクレオチド又はポリペプチドは、低妊孕性又は不妊症の病態や治療法を研究する上で有用なツールとして利用することができる。
【００４７】
また、本発明に係る妊孕性診断キット、検出方法又は抗体によれば、妊孕可能性の推定及び不妊症の原因の同定を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４８】
本発明の一実施形態について以下に詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定されるものではない。本実施形態では、本発明に係る疾患モデル動物、その生産方法、その利用の順に詳細に説明する。
【００４９】
（１）本発明に係る疾患モデル動物
本発明に係る疾患モデル動物は、低妊孕性又は不妊症を呈するオスの動物であり、正常なＭＣＡタンパク質の発現が低下していることを特徴とする。
【００５０】
疾患モデル動物として用いられる動物の種類としては、ヒト以外の哺乳類（非ヒト哺乳動物）が挙げられる。具体的には、ラット、マウス（Mus musculus, Mus spretusなどのMus属に属する動物）、モルモット、ハムスター、ウサギなどの各種実験動物であり、より好ましくは、ラット及びマウスであり、特に好ましいものとしては、マウスを挙げることができる。これらの動物が好ましい理由は、飼育が容易で、現在までの研究の積み重ねを利用できるからである。次にＭＣＡについて説明する。
【００５１】
マウスＭＣＡの推定アミノ酸配列は２８４残基からなり、ＭＯＲＮモチーフを有している（非特許文献３）。マウスＭＣＡの転写産物は、出生後１４日齢から検出され、主として精巣に発現する。同様に、タンパク質も主として精巣に発現する。組織免疫染色により、タンパク質は、パキテン期の精母細胞から円形精子細胞までの間には細胞質に見られ、さらに、第１及び第２減数分裂期に核膜が消失する間には、Ｍ期の染色体及び紡錘体周辺に局在することが明らかになっている。また、その後の研究により、マウスＭＣＡは精子の鞭毛等に存在することも分かっている。
【００５２】
ＭＣＡはヒトにも存在し、そのアミノ酸配列はマウスのものと７９．８％の同一性を有し、ＭＯＲＮモチーフも保存されている（非特許文献５）。また、ヒトＭＣＡタンパク質は、精子の鞭毛、基底小体及びアクロソームに局在している。以上のことから、ＭＣＡは精子の鞭毛の発達に重要な役割を果たすタンパク質であると考えられている。また、ＭＣＡ遺伝子は、上述したように魚類であるコイや無脊椎動物であるホヤにも有ることから（非特許文献６，７）、哺乳動物全てに保存されていると考えられる。なお、当業者は、必要であればこれらの非特許文献からＭＣＡの詳細について知ることができるので、本明細書ではＭＣＡについての詳細な説明を省略する。
【００５３】
本発明に係る疾患モデル動物は、ＭＣＡタンパク質の発現量の低下に起因して低妊孕性或いは不妊を呈するので、低妊孕性モデル動物又は不妊症モデル動物として、不妊症の病態解明や治療法確立といった様々な用途に利用できる。本発明に係る疾患モデル動物は、特に、ＭＣＡ遺伝子に異常があるヒトの患者に対する有効な治療法を確立するための有用なツールとなる。
【００５４】
なお、本発明に係る疾患モデル動物は、正常なＭＣＡタンパク質が発現しないことが好ましい。これにより、疾患モデル動物が一層確実に低妊孕性又は不妊症を呈するようになる。
【００５５】
また、本発明に係る疾患モデル動物は、ＭＣＡ遺伝子が欠損したオスの非ヒト哺乳動物であってもよい。ＭＣＡ遺伝子が欠損していれば、正常なＭＣＡタンパク質の発現が低下し、モデル動物が低妊孕性又は不妊症を呈するので、低妊孕性や不妊症のモデル動物として好適に用いることができる。
【００５６】
なお、ＭＣＡ遺伝子の欠失は遺伝子全体の一部であってもよいが、正常なＭＣＡタンパク質の発現が著しく低下するように、或いは正常なＭＣＡタンパク質のアミノ酸配列が少なくなるように、上流のエクソン（例えば第１エクソン）が欠失していることが好ましい。もちろん、ＭＣＡ遺伝子の欠損は、双方のアレルにおいて起こっていることが好ましい。
【００５７】
後述する実施例に示すように、ＭＣＡ遺伝子が双方のアレルにおいて欠損し、正常なＭＣＡタンパク質を発現しないＭＣＡホモ欠損マウスは、本発明の疾患モデル動物として特に好ましい。ＭＣＡホモ欠損マウスは、精子の形態が異常であり、それゆえ、精巣内では精母細胞や精子細胞などの生殖細胞の量にほとんど変化はないが、副精巣に精子が全く見られず無精子症になるという興味深い症状を呈する。従って、ＭＣＡホモ欠損マウスは、精子の鞭毛の形態異常等に起因する無精子症を治療する治療薬、例えば精子の形態異常を回復させる薬剤や、精子の鞭毛運動を活性化させる薬剤の開発などに極めて有用である。
【００５８】
なお、哺乳動物において大多数の遺伝子の役割は共通しているため、疾患モデル動物としてマウス以外の他の哺乳動物を用いた場合でも、同様の症状を呈することが予想される。従って、正常なＭＣＡタンパク質を発現しないマウス以外の哺乳動物であっても、低妊孕性や不妊症（詳細には無精子症）のモデル動物として有用である。
【００５９】
また、本発明に係る疾患モデル動物では、ＭＣＡ遺伝子が欠損する代わりに、ＭＣＡ遺伝子に変異が生じていてもよい。もちろん、ＭＣＡ遺伝子の変異は、双方のアレルにおいて起こっていることが好ましい。
【００６０】
（２）本発明に係る疾患モデル動物の作製方法
本発明に係る疾患モデル動物を作製する方法のうち、典型的なものとしては、ジーンターゲッティング技術によりＭＣＡ遺伝子を欠損させる方法が挙げられる。ジーンターゲッティング技術としては公知の手法を用いることができる。この場合、ＭＣＡ遺伝子の全部を欠失させてもよいが、ＭＣＡ遺伝子の一部のエクソン（特に第１エクソン）を欠失させる方法が簡便で好ましい。
【００６１】
ジーンターゲッティング技術により疾患モデル動物（ここではマウス）を作製する方法の一例を述べると次の通りである。まず、薬剤耐性遺伝子カセットの前後に、欠失させたい領域よりも上流の配列、下流の配列がそれぞれ連結されたターゲッティングベクターを作製する。なお、ＭＣＡ遺伝子やその周辺の塩基配列は、当業者であれば必要に応じて公開データベース（ＧｅｎＢａｎｋなど）から入手することができる。そして、このターゲッティングベクターをマウス胚性幹細胞（ＥＳ細胞）に導入し、薬剤を用いてＥＳ細胞をスクリーニングすることにより、相同組換えが起こったＥＳ細胞を選出する。そして、選出したＥＳ細胞を胚盤胞に注入し、キメラマウスを得る。
【００６２】
このキメラマウスにおいて、ＥＳ細胞が生殖細胞に分化すれば、ＭＣＡ遺伝子が片方のアレルにおいて欠損した生殖細胞が増殖するので、キメラマウスを野生型マウスと交配させることにより、ＭＣＡ遺伝子が片方のアレルにおいて欠損したＦ１マウス（以下「ＭＣＡヘテロ欠損マウス」という）を得ることができる。こうして得られるＭＣＡヘテロ欠損マウス同士をさらに交配させることにより、ＭＣＡ遺伝子が両方のアレルにおいて欠損したマウス（以下「ＭＣＡホモ欠損マウス」という）を得ることができる。
【００６３】
以降は、メスのＭＣＡホモ欠損マウスや、オス又はメスのＭＣＡヘテロ欠損マウスを維持しておけば、交配により再びＭＣＡホモ欠損マウスをいつでも容易に得ることができる。従って、ＭＣＡホモ欠損マウスを作製するためのこれらのマウス、すなわち、ＭＣＡ遺伝子の一部又は全部が片方又は両方のアレルにおいて欠失している交配用マウスもまた、本発明に含まれる。
【００６４】
ところで、上記ではマウスを例にとって説明したが、本発明はこれに限定されず、マウス以外の他の哺乳動物であってもよい。マウス以外の他の哺乳動物におけるＭＣＡ遺伝子及びその周辺の塩基配列は、公開されているゲノムデータベースから、マウスやヒトのＭＣＡ遺伝子の塩基配列を用いたホモロジー検索等によって取得することができる。なお、ジーンターゲッティング技術が確立されていない動物を用いて本発明に係る疾患モデル動物を作製する場合には、ゲノムＤＮＡ中にランダムに変異を発生させる公知の手法（例えばＥＮＵミュータジェネシスなど）を用いてもよい。この場合、ＥＮＵ処理などにより標的動物のゲノムＤＮＡに変異を起こさせ、ＭＣＡ遺伝子が欠損している個体をスクリーニングにより選出する。
【００６５】
また、ジーンターゲッティング技術の代わりに、ジーンサイレンシング技術によって本発明に係る疾患モデル動物を作製してもよい。この場合、ＭＣＡを標的とするｓｉＲＮＡを設計・合成し、これを標的となる動物の精巣などに導入すればよい。さらには、トランスジェニック技術を用いて、このｓｉＲＮＡの発現に必要な核酸塩基配列を標的となる動物の染色体に組込み、ＲＮＡｉトランスジェニック動物を作製してもよい。これにより、ｓｉＲＮＡが恒常的に発現し、ＲＮＡｉによるＭＣＡの抑制効果が長期間持続する。
【００６６】
（３）本発明に係る疾患モデル動物の利用（有用性）
本発明に係る疾患モデル動物は、低妊孕性や不妊症（詳細には無精子症）を発症する新規の疾患モデル動物である。無精子症はヒトにおいても数多く報告されているが、現在までに有用なモデル動物は得られていなかった。本発明に係る疾患モデル動物は、低妊孕性や不妊症（特に無精子症）の病態解明や治療法の確立に特に有用である。
【００６７】
本発明に係る疾患モデル動物を素材（或いは実験材料）として見た場合、個体そのものだけでなく、それから単離される細胞や組織、器官等もまた、上述した用途に用いることができる。細胞の単離方法は特に限定されるものではなく、公知の方法を用いることができ、公知の方法で培養することができる。同様に、組織、器官についても公知の方法で摘出することができ、公知の方法で培養することができる。
【００６８】
なお、上記の細胞としては雄性生殖細胞であることが好ましく、分化段階が精母細胞以降の雄性生殖細胞であることがより好ましい。また、上記の器官としては少なくとも精巣を含む雄性生殖器官であることが好ましく、上記雄性生殖器官には精巣に加え副精巣も含まれていることがより好ましい。また、上記組織としては、上記雄性生殖器官に含まれる組織であることが好ましく、精巣に含まれる器官であることがより好ましい。これらの素材は、不妊症の原因究明や治療法の開発に一層適している。
【００６９】
また、上記の細胞、組織及び器官は、マウスであれば出生後１４日齢以降の個体から単離されたものであることが好ましい。ＭＣＡの転写産物は、マウスにおいて出生後１４日齢以降に検出されるので、１４日齢以降のマウスから単離された上記の素材は、低妊孕性又は不妊症になっている状態か、低妊孕性又は不妊症を発症しかけている状態であると考えられる。従って、出生後１４日齢以降の個体から単離された上記の素材は、長期間培養することなく、上述した用途にすぐに用いることができる。
【００７０】
以下では雄性生殖細胞の単離方法の一例について説明する。雄性生殖細胞は、例えばKita K et al., Biol Reprod. 2007 Feb;76(2):211-7. Epub 2006 Oct 25に記載された方法によって単離及び培養することができる。
【００７１】
この方法では、まず、精巣の薄膜を剥離して精細管を露出させる。そして、ＰＢＳ中にコラゲナーゼ・タイプ２（２ｍｇ／ｍｌ）とＤＮＡｓｅ（１０μｇ／ｍｌ）とを含む第１消化液で精巣組織を３７℃２０分間処理する。そして、処理液を遠心して精巣組織を沈殿させ、ＤＭＥＭ（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium）中にコラゲナーゼ・タイプ２（２ｍｇ／ｍｌ）とＤＮＡｓｅ（１０μｇ／ｍｌ）とヒアルロニダーゼ（２ｍｇ／ｍｌ）とを含む第２消化液で精巣組織を３７℃５分間処理する。そして細胞懸濁液をＰＢＳで２度洗浄した後、孔径４０μｍのメッシュフィルターに通すことによって、雄性生殖細胞を回収する。
【００７２】
上記の方法は、マウスやラットに好適な方法の一例であるが、もちろん上記の単離方法に限定されず、細胞を単離する動物に応じて様々な改変を施してもよい。
【００７３】
（４）ヒトの細胞、組織及び精巣
マウスとヒトとでは、殆ど全ての遺伝子が同じ役割を果たすことから、ヒトＭＣＡタンパク質もマウスＭＣＡタンパク質と同様の役割を果たすことが強く示唆される。従って、ヒトにおいてＭＣＡ遺伝子が欠損又は変異し、ＭＣＡタンパク質の発現量が低下したり、ＭＣＡタンパク質が発現しなくなったりすると、マウスと同様に低妊孕性又は不妊症を呈すると考えられる。それゆえ、ＭＣＡ遺伝子が欠損又は変異し、低妊孕性又は不妊症を呈するヒト男性から単離された細胞、精巣の組織及び精巣もまた、マウスのそれらと同様に有用であると考えられる。従って、これらの細胞、精巣の組織、精巣もまた、本発明の範囲に含まれる。もちろん、上記細胞は、生殖細胞であることが好ましい。
【００７４】
上記の細胞、精巣の組織又は精巣は、低妊孕性又は不妊症を呈しているヒト男性患者の中から、遺伝子診断を行うことによってＭＣＡ遺伝子に欠損又は変異が生じている患者を見つけ出し、その患者から細胞、精巣の組織又は精巣を外科的手法により単離することによって取得することができる。なお、患者は、無精子症であることが確認されていることが好ましく、精子の鞭毛や核などに形態異常が認められていることがより好ましい。また、上記の細胞は、患者より摘出した精巣から、上述した非ヒト哺乳動物と同様の方法によって単離してもよい。これらのヒトの細胞、精巣の組織又は精巣もまた、基本的に非ヒト哺乳動物と同様の方法で培養することができる。
【００７５】
（５）疾患モデル細胞
ＭＣＡ遺伝子が欠損し、低妊孕性又は不妊の症状を呈するヒト又は非ヒト哺乳動物の雄性生殖細胞（特に精子細胞及び精子）が低妊孕性や不妊症の研究に重要なツールとなることは既に述べたが、このような生殖細胞は、以下の方法によっても生産することができる。
【００７６】
すなわち、本発明に係る生殖細胞生産方法は、低妊孕性又は不妊の雄性生殖細胞を生産するための生殖細胞生産方法であって、オスの哺乳動物由来の培養細胞又はオスの哺乳動物から単離された細胞である哺乳動物細胞が有するＭＣＡ遺伝子を欠損させる遺伝子欠損工程と、上記遺伝子欠損工程によってＭＣＡ遺伝子が欠損した哺乳動物細胞を生殖細胞へ分化させる分化誘導工程とを含んでいる。なお、上記生殖細胞生産方法において、哺乳動物とは、ヒト及び非ヒト哺乳動物の双方を含む。
【００７７】
上記遺伝子欠損工程において、ＭＣＡ遺伝子を欠損させる対象となる細胞としては、培養細胞の場合、ヒト又はマウス由来のオスのＥＳ細胞を用いることが好ましい。ＥＳ細胞は全能性を有しているため、生殖細胞にも容易に分化させることができる。以下では、オスのＥＳ細胞を用いた例について説明する。
【００７８】
まず、遺伝子欠損工程では、上述したジーンターゲッティング技術により、オスのＥＳ細胞が有するＭＣＡ遺伝子を欠損させることができる。このとき、ＭＣＡ遺伝子を双方のアレルにおいて欠損させたい場合は、片方のアレルにおいてＭＣＡ遺伝子が欠損しているＥＳ細胞に対し、上述したターゲッティングベクターの導入及びスクリーニングをさらに行えばよい。
【００７９】
そして、分化誘導工程では、ＭＣＡ遺伝子が欠損したＥＳ細胞を、例えばNayernia et al., Developmental Cell, 2006, 11, 125-132などに記載されている方法によって、生殖細胞（精原細胞や配偶子）へと分化させることができる。この方法では、Ｓｔｒａ８遺伝子のプロモーター、プロタミン１遺伝子のプロモーターにそれぞれレポーター遺伝子（緑色蛍光タンパク質や赤色蛍光タンパク質の遺伝子）を連結したコンストラクトをマウスＥＳ細胞に導入し、ＥＳ細胞を分化させつつ、生殖細胞系列に分化したもののみをＦＡＣＳで選別する。なお、この文献ではマウスについて記載されているが、ヒトについても同様の手法で分化誘導できることが予想される。
【００８０】
なお、上記では、ＥＳ細胞を用いた例について説明したが、ＥＳ細胞の代わりに多能性を有する各種幹細胞や分化細胞を用いてもよい。これらの幹細胞や分化細胞は、株化された培養細胞であってもよいし、ヒトや非ヒト哺乳動物から得られた初代培養細胞であってもよい。これらの細胞についても、上述したジーンターゲッティング技術を用いてＭＣＡ遺伝子を欠損させることができる。そして、ＭＣＡ遺伝子を欠損させたこれらの細胞を一旦脱分化させて未分化状態にし、その後生殖細胞へと分化させることによっても、低妊孕性又は不妊の雄性生殖細胞を得ることができる。
【００８１】
以上のようにして、ＭＣＡ遺伝子が欠損し、低妊孕性又は不妊を呈するヒト又はマウスの雄性生殖細胞を得ることができる。このようにして得られる雄性生殖細胞もまた、本発明に係る疾患モデル動物から得られた生殖細胞と同様の形質を示し、低妊孕性や不妊症を研究する際の有用なツールになると考えられる。
【００８２】
以上に述べたように、（ｉ）オスの非ヒト哺乳動物の生殖細胞であって、ＭＣＡ遺伝子が欠損し、低妊孕性又は不妊を呈する生殖細胞や、（ｉｉ）ヒト男性由来の培養細胞であって、ＭＣＡ遺伝子が欠損し、低妊孕性又は不妊を呈する生殖細胞である培養細胞は、様々な方法で生産することができるが、生産方法に関らずこれらの細胞は本発明の範囲に含まれる。
【００８３】
（６）治療薬の候補化合物のスクリーニング方法又は候補化合物の薬理作用の評価方法
次に、本発明に係る疾患モデル動物の具体的な利用例について説明する。
【００８４】
＜利用例１：薬剤のスクリーニング方法＞
本発明に係る疾患モデル動物の代表的な利用例としては、不妊症治療薬の候補化合物のスクリーニングへの利用を挙げることができる。本発明に係る疾患モデル動物では、精子の鞭毛異常に起因する無精子症を発症しているため、無精子症の治療薬のスクリーニングに好適に用いることが可能である。
【００８５】
スクリーニング方法の具体的な構成は特に限定されるものではなく、公知の手法を好適に用いることができる。具体的には、本発明に係るスクリーニング方法は、（ａ）本発明に係る疾患モデル動物に対して候補化合物を投与する工程と、（ｂ）候補化合物を投与した疾患モデル動物における不妊症（詳細には無精子症や精子の形態異常）の症状の変化を評価する工程と、（ｃ）評価結果に基づいて疾患モデル動物の不妊症（詳細には無精子症や精子の形態異常）を緩和する化合物を選択する工程とを含んでいてもよい。もちろん、必要に応じて他の工程を含めてもよい。
【００８６】
＜利用例２：薬理作用の評価方法＞
本発明に係る疾患モデル動物は、不妊症治療薬の候補化合物の薬理作用の評価の際にも利用することができる。すなわち、上記スクリーニング方法又は他の方法で候補化合物が見出されたとしても、その候補化合物が実用に耐え得るか否かを評価する必要があるが、本発明に係る疾患モデル動物はそのような用途にも好適に用いることができる。
【００８７】
評価方法の具体的な構成は特に限定されるものではなく、公知の手法を好適に用いることができる。具体的には、例えば、（ａ）本発明に係る疾患モデル動物に候補化合物を投与し、（ｂ）候補化合物を投与した疾患モデル動物における不妊症（詳細には無精子症や精子の形態異常）の症状の変化を観察し、薬理作用の有効性や副作用の有無等を確認するという各工程を経ればよい。また、必要に応じて他の工程を含めてもよい。
【００８８】
なお、上記利用例１・２ともに、本発明に係る疾患モデル動物の個体を用いてもよいし、必要に応じてこの個体から単離した細胞、組織又は器官等を用いてもよい。また、上述したヒトＭＣＡ欠損患者から単離した細胞、組織又は器官を用いてもよいし、ジーンターゲッティング技術などによりＩｎ Ｖｉｔｒｏで生産され、ＭＣＡ遺伝子の欠損した生殖細胞を用いてもよい。ヒトの細胞、組織又は器官を用いることによって、候補化合物のスクリーニング及び薬理作用の評価は一層信頼できるものとなる。
【００８９】
なお、非ヒト哺乳動物やヒトの精子を用いて上述した候補化合物のスクリーニング又は薬理作用の評価を行う場合、精子の形態異常が回復するか否かに基づいて評価を行ってもよいが、精子の運動能が向上するか否かに基づいて評価を行ってもよい。
【００９０】
このように、本発明に係る疾患モデル動物（若しくはその細胞、組織、器官）、又は、ヒトＭＣＡ欠損患者から単離した細胞、組織若しくは器官、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏで生産した生殖細胞などを用いてスクリーニングされ、評価された化合物を主成分とすれば、不妊症（特に精子の形態異常に起因する無精子症）の治療及び／又は予防用医薬組成物を製造することが可能になる。
【００９１】
（７）本発明に係る検出方法及び妊孕性診断キット
上述したように、ＭＣＡ遺伝子の欠損又は変異は、ヒトにおいても低妊孕性又は不妊症の原因になると考えられる。従って、被験者から生体サンプルを採取し、この生体サンプルを用いて被験者のＭＣＡ遺伝子に欠損又は変異があるか否かを調べることにより、妊孕可能性の推定及び不妊症の原因の同定が可能になる。
【００９２】
すなわち、本発明に係る検出方法は、ヒトから採取された生体サンプルを用いて上記ヒトにおける遺伝子の欠損又は変異を検出する検出方法であって、ヒトＭＣＡ遺伝子の欠損又は変異の有無を検出する工程を含んでいることを特徴とする。
【００９３】
また、本発明に係る妊孕性診断キットは、上記検出方法に用いられる試薬を含んでいる。なお、妊孕性診断キットには、使用方法が記載された取扱説明書が含まれていてもよい。
【００９４】
被験者から採取する生体サンプルは特に限定されず、例えば血液や頬の内側の粘膜などを挙げることができる。また、ヒトＭＣＡ遺伝子の欠損又は変異を検出する方法としては特に限定されず、公知の各種手法、例えば、サンガー法を基礎とする塩基配列決定法、インベーダー法、ＳＭＭＤ法（simultaneous multiple mutation detection system）、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法、ＭＡＳＡ法、塩基伸長法、Ｔａｑｍａｎプローブ法や、それらを改変した方法などを用いることができる。
【００９５】
ヒトＭＣＡ遺伝子及びその周辺の塩基配列は、例えばＮＣＢＩヒトゲノムリソース（NCBI Human Genome Resources: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/human/）から当業者であれば容易に入手することができる。なお、ＮＣＢＩヒトゲノムリソースにおいて、ＭＣＡはＴＳＧＡ２とも称される。ヒトＭＣＡ遺伝子の欠損又は変異を検出するためのプライマーやプローブなどは、ヒトＭＣＡ遺伝子及びその周辺の塩基配列を基に設計することができる。
【００９６】
上記検出方法又は妊孕性診断キットによってＭＣＡ遺伝子に変異が見出された場合、その被験者は、妊孕可能性が低いと推定される。また、被験者が不妊症患者であれば、その原因がＭＣＡ遺伝子の欠損又は変異であることが分かる。従って、そのような被験者に対して適切な処置を施すことにより、早期に疾患を治癒することができる。つまり、本発明の検出方法は、妊孕可能性の推定及び不妊症の原因の同定を目的とした診断方法ともいえる。
【００９７】
配列番号８は、ジーンバンク（GenBank）にアクセッション番号AB006536で登録されている野生型ヒトＭＣＡ遺伝子の転写産物の塩基配列の中から、翻訳領域のみを抽出したものである。配列番号８に示すように、野生型ヒトＭＣＡ遺伝子は、９３０ｂｐからなる翻訳領域を有している。また、配列番号９は、野生型ヒトＭＣＡタンパク質の推定アミノ酸配列を示すものである。
【００９８】
野生型ヒトＭＣＡタンパク質は、上述したように、成熟した男性の精巣の生殖細胞において特に強く発現することが報告されている。図８は、野生型ヒトＭＣＡ遺伝子の構造を示す模式図である。ヒトゲノムプロジェクトによって構築されたヒトゲノムリソースによれば、ヒトＭＣＡ遺伝子は、ヒト２１番染色体長腕に位置している。この遺伝子の転写産物は約１．４ｋｂである。
【００９９】
本願発明者らは、後述する実施例に示す調査の結果、男性不妊症患者からなる集団の中に、配列番号８に示すヒトＭＣＡ遺伝子の翻訳領域における第９２位のアデニン（以下、単に「Ａ」という）が片方のアレルにおいてシトシン（以下、単に「Ｃ」という）に置換している患者、および、第１２１位のグアニン（以下、単に「Ｇ」という）が片方のアレルにおいてＡに置換している患者がいることを見出した。一方、この第９２位および第１２１位の塩基置換は、妊孕性が確認されている男性からなる集団では全く見られなかった。なお、これらの置換部位は、図８に示すようにいずれもＭＣＡ遺伝子の第２エクソン内にある。
【０１００】
ヒトＭＣＡ遺伝子に上記の置換変異が起こると、元々ヒスチジン、グリシンをコードしていたこれらの部位がプロリン、アルギニンをコードするようになるため、正常なタンパク質が発現しなくなってしまう。それゆえ、ヒトＭＣＡ遺伝子の上記第９２位および第１２１位における置換変異は、たとえ片方のアレルのみに起こっている場合であっても、正常なＭＣＡタンパク質の翻訳量が低下することにより、或いは、変異型ＭＣＡタンパク質がドミナントネガティブに作用することにより、不妊症を引き起こす可能性が高いと推測される。
【０１０１】
以上のことから、本発明に係る検出方法は、被験者（ヒト）から採取された生体サンプル（血液や頬の内側の粘膜など）に含まれるゲノムＤＮＡ、または、被験者の生体サンプルから単離されたゲノムＤＮＡにおいて、ヒトＭＣＡ遺伝子の機能欠損を引き起こす変異の有無を検出する工程を含んでいる。
【０１０２】
また、本発明に係る妊孕性診断キットは、被験者から採取された生体サンプルに含まれるゲノムＤＮＡ、または、被験者の生体サンプルから単離されたゲノムＤＮＡにおいて、ヒトＭＣＡ遺伝子の機能欠損を引き起こす変異の有無を検出する試薬を含んでいる。
【０１０３】
上記検出方法及び妊孕性診断キットは、ヒトＭＣＡ遺伝子の機能欠損を引き起こす変異の有無を検出するものであれば、その態様は特に限定されるものではない。例えば、検出方法及び妊孕性診断キットは、被験者のヒトＭＣＡ遺伝子に、該遺伝子の機能欠損を引き起こす変異が含まれていることを検出するものであってもよいし、被験者のヒトＭＣＡ遺伝子に、該遺伝子の機能欠損を引き起こす変異が含まれていないことを検出するものであってもよい。
【０１０４】
例えば、上記変異の存在を検出するものである場合、上記検出方法および妊孕性診断キットは、上記の機能欠損を引き起こす変異が少なくとも一方のアレルにおいて起こっていることを検出できればよい。一方、上記変異の非存在を検出するものである場合、上記検出方法および妊孕性診断キットは、上記の機能欠損を引き起こす変異が双方のアレルにおいて起こっていないことを検出することが好ましい。
【０１０５】
上記検出方法又は妊孕性診断キットにより、上記変異の有無を調べ、その結果、変異が検出されなかった場合は、妊孕性に問題がない可能性が高いと推定できる。また、被験者が不妊症患者である場合は、不妊症の原因が、ＭＣＡ遺伝子の機能欠損以外のものによる可能性が高いと判定できる。
【０１０６】
一方、変異が検出された場合は、低妊孕性又は不妊症でない可能性が高いと推定できる。また、被験者が不妊症患者である場合は、不妊症の原因がＭＣＡ遺伝子の機能欠損による可能性が高いと判定できる。よって、この場合は、ＴＥＳＥ−ＩＣＳＩ（Testicular sperm extraction - Intracytoplasmic sperm injection；精巣生検−顕微授精）などの現存の治療法の適格な選択を提示することができる。
【０１０７】
このように、上記検出方法及び妊孕性診断キットによれば、妊孕可能性の推定及び不妊症の原因の同定を行うことができる。すなわち、上記検出方法又は妊孕性診断キットによれば、不妊症の診断を行う上で有用な情報が提供される。それゆえ、上記検出方法における変異の有無を検出する工程は、低妊孕性又は不妊症の診断方法において用いられることが好ましいといえる。
【０１０８】
なお、上記検出方法および妊孕性診断キットは、翻訳開始コドンをコードするアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒトＭＣＡ遺伝子の翻訳領域の上記の第９２位および第１２１位のうちの少なくとも一方の塩基の置換変異の有無を検出することが好ましい。
【０１０９】
さらに、上記検出方法及び妊孕性診断キットは、ヒトＭＣＡ遺伝子の上記の第９２位の塩基がシトシンに置換していること、或いは、上記の第１２１位の塩基がアデニンに置換していることを検出するものであることが好ましい。このように、変異を検出する箇所や検出する変異の種類を絞ることにより、低妊孕性又は不妊症の原因となる変異の有無を効率よく調べることができる。
【０１１０】
ただし、上記の第９２位または第１２１位の置換変異以外であっても、ヒトＭＣＡ遺伝子に起こった変異（置換変異、挿入変異および欠失変異を含む）は、不妊症を引き起こす可能性が高いと推測されるので、本発明は、上記の第９２位または第１２１位の置換変異を検出するものに限定されない。
【０１１１】
一実施形態において、上記検出方法及び妊孕性診断キットは、ヒトＭＣＡ遺伝子内の領域のうち、上記の第９２位および第１２１位のうちの少なくとも一方（以下、「変異検出部位」という）の塩基を含む領域の塩基配列を決定することにより、上記の置換変異の有無を検出するものであってもよい。塩基配列の決定には、サンガー法やこれを応用した公知の各種手法を用いることができる。
【０１１２】
この場合、妊孕性診断キットには、ヒトＭＣＡ遺伝子の上記の変異検出部位を含む領域を増幅させるために、変異検出部位を挟むようにして設計されたプライマーの組が含まれることが好ましい。このプライマーの組には、より詳細には、ヒトＭＣＡ遺伝子の変異検出部位よりも上流の塩基配列の一部または全部を有するプライマーと、ヒトＭＣＡ遺伝子の変異検出部位よりも下流の塩基配列の一部又は全部と相補的な塩基配列を有するプライマーとが含まれる。
【０１１３】
被験者から採取された生体サンプルに含まれるゲノムＤＮＡを鋳型として上記のプライマーの組を用いてＰＣＲ（polymerase chain reaction）を行えば、ヒトＭＣＡ遺伝子の変異検出部位の塩基を含む領域がＤＮＡフラグメントとして増幅され、さらに、上記のプライマーの組の一方又は両方のプライマーを用いて塩基配列の決定を行えば、置換変異の有無を確実かつ簡便に検出することができる。塩基配列の決定は、例えばＡＢＩ−ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Applied Biosystems Inc.）などを取扱説明書に従って使用することにより、簡単に実施することができる。なお、塩基配列の決定に用いられるプライマーは、ＤＮＡフラグメントの増幅のためのＰＣＲに用いられるプライマーとは別のものであってもよい。
【０１１４】
なお、それぞれのプライマーは、ＭＣＡ遺伝子又はその周辺と同一の塩基配列、或いは相補的な塩基配列を少なくとも１０塩基以上有することが好ましく、１５塩基以上有することがより好ましく、１８塩基以上有することがさらに好ましく、２０塩基以上有することが特に好ましい。ＭＣＡ遺伝子又はその周辺と同一の（或いは相補的な）塩基配列の長さを長くすることにより、ＭＣＡ遺伝子の第９２位および第１２１位のうちの少なくとも一方を含む目的の領域のみを確実に増幅させることができる。
【０１１５】
また、上記のプライマーの組は、互いのプライマーによって挟まれる領域の長さが５ｋｂ以下であることが好ましく、３ｋｂ以下であることがより好ましく、２ｋｂ以下であることがさらに好ましく、１．５ｋｂ以下であることが特に好ましい。互いのプライマーによって挟まれる領域の長さを短くすることによって、上記の変異検出部位の塩基を含む領域の増幅を効果的に行うことができる。
【０１１６】
また、塩基配列の決定に用いるプライマーは、上記の変異検出部位の塩基から２ｋｂ以内の位置に設定されることが好ましく、１．５ｋｂ以内の位置に設定されることが好ましく、１．０ｋｂ以内の位置に設定されることがより好ましく、０．７ｋｂ以内の位置に設定されることが特に好ましい。上記の構成により、塩基配列の決定を正確に行うことができる。
【０１１７】
さらに、塩基配列の決定に用いるプライマーは、上記の変異検出部位の塩基から２０ｂｐ以上離れた位置に設定されることが好ましく、３０ｂｐ以上離れた位置に設定されることがより好ましく、４０ｂｐ以上離れた位置に設定されることがさらに好ましく、５０ｂｐ以上離れた位置に設定されることが特に好ましい。また、上記プライマーの組は、ヒトＭＣＡ遺伝子の変異検出部位の塩基を含む２０ｂｐ以上の領域を増幅させるものであることが好ましい。プライマーの近傍は、塩基配列の決定結果が不正確になる傾向にあるが、上記の構成により、塩基配列の決定を正確に行うことができる。
【０１１８】
上記のプライマーの組としては、例えば、それぞれ配列番号１６，１７に示す塩基配列からなるプライマー（図１のＭＣＡ−Ｐ３及びＭＣＡ−Ｐ４Ｒ）を用いることができるが、本発明に用いることのできるプライマーの塩基配列がこの配列に限定されないことはいうまでもない。ヒトＭＣＡ遺伝子の塩基配列及びその周辺の塩基配列は、当業者であれば上述したヒトゲノムリソースやジーンバンク（GenBank）から容易に入手することができるので、入手した塩基配列を基に、Ｏｌｉｇｏ（登録商標、National Bioscience Inc.）又はＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウェア開発）などを用いてプライマーを設計することができる。
【０１１９】
各プライマーは、例えばホスホロアミダイト法などの公知の方法によって合成することができ、例えばApplied Biosystems Inc.の３９２型シンセサイザーなどを取扱説明書に従って使用することによって簡単に合成することができる。
【０１２０】
なお、上記の各プライマーには、蛍光標識が付されていてもよい。プライマーに蛍光標識が付されている場合、ダイプライマー法によって、放射性同位元素を用いることなく増幅領域の塩基配列を決定することができる。
【０１２１】
一方、各プライマーに蛍光標識が付されていない場合、ダイターミネータ法によって塩基配列を決定することができる。この場合、上記妊孕性診断キットには、上記のプライマーの組に加えて、Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃの各単量体からなるデオキシリボ核酸、蛍光標識されＡ，Ｔ，Ｇ，Ｃの各単量体からなるジデオキシリボ核酸（所謂ダイターミネータ）、及びポリメラーゼなどがさらに含まれていてもよい。
【０１２２】
一実施形態において、上記検出方法及び妊孕性診断キットは、ヒトＭＣＡ遺伝子の上記の変異検出部位における塩基の置換変異の有無をインベーダー法によって検出するものであってもよい。インベーダー法の詳細については、Ｌｙａｍｉｃｈｅｖらによる論文（Lyamichev V et al., Nat biotechnol. 17, 292, 1999）に記載されており、本明細書ではこれを援用する。
【０１２３】
図９は、インベーダー法の原理を説明する模式図である。インベーダー法では、非蛍光標識プローブのインベーダープローブ２及びシグナルプローブ３と、蛍光標識プローブのフレットプローブ５とが用いられる。
【０１２４】
インベーダープローブ２は、ターゲット遺伝子１と相補的な塩基配列を有し、かつ、３’末端の塩基がターゲット遺伝子１の変異（又は一塩基多型）検出部位１ａと対応するように設計される。一方、シグナルプローブ３は、ターゲット遺伝子１とは無関係な塩基配列であるフラップ３ｂと、ターゲット遺伝子１と相補的な塩基配列を有し、かつ、５’末端の塩基がターゲット遺伝子１の変異（又は一塩基多型）検出部位１ａに対応するように設計されたヌクレオチド３ａとが連結したものである。ここで、フラップ３ｂは、ヌクレオチド３ａの５’末端側に連結されている。
【０１２５】
このように設計されたプローブ２・３をターゲット遺伝子１とハイブリダイゼーションさせると、変異検出部位１ａでは、ターゲット遺伝子１、インベーダープローブ２及びシグナルプローブ３が３重鎖を形成する。すると、フラップエンドヌクレアーゼ（「クリアベース（cleavase）」ともいう）４がこの３重鎖を認識し、シグナルプローブ３を３重鎖の３’側で切断する。その結果、フラップ３ｂと変異検出部位とが連結したフラップ遊離体３ｃが生成される。
【０１２６】
フレットプローブ５は、５’末端側が自身とハイブリダイゼーションでき、かつ、３’末端側がフラップ３ｂとハイブリダイゼーションできるヌクレオチド５ａと、蛍光色素５ｂと、クエンチャー（発光抑制体）５ｃとからなる。ここで、ヌクレオチド５ａは、５’末端がフラップ遊離体３ｃの変異検出部位と相補的な塩基配列となっている。また、蛍光色素５ｂは、ヌクレオチド５ａの５’末端に結合している。ただし、フレットプローブ５においては、クエンチャー５ｃにより蛍光色素５ｂの蛍光が抑制されている。
【０１２７】
このようなフレットプローブ５に対してフラップ遊離体３ｃがハイブリダイゼーションすると、フラップ遊離体３ｃの変異検出部位について、再び３重鎖が形成される。その結果、上述のフラップエンドヌクレアーゼ４がこの３重鎖を再び認識し、フレットプローブ５の５’末端部分が切断される。その結果、フレットプローブ５の５’末端に結合していた蛍光色素５ｂが遊離し、蛍光が生じる。
【０１２８】
従って、妊孕性診断キットがインベーダー法により上記の置換変異の有無を検出するものである場合、妊孕性診断キットには、インベーダープローブ２、シグナルプローブ３及びフレットプローブ５などが含まれることが好ましい。
【０１２９】
置換変異が有る場合に蛍光が生じるようにする場合、インベーダープローブ２は、ヒトＭＣＡ遺伝子と相補的な塩基配列を有し、かつ、３’末端の塩基が変異型ＭＣＡ遺伝子の上記の第９２位の塩基（Ｃ）又は第１２１位の塩基（Ａ）と対応するように設計される。また、シグナルプローブ３のヌクレオチド３ａは、ヒトＭＣＡ遺伝子と相補的な塩基配列を有し、かつ、５’末端の塩基が変異型ＭＣＡ遺伝子の上記の第９２位の塩基（Ｃ）又は第１２１位の塩基（Ａ）と対応するように設計される。そして、フレットプローブ５は、上記インベーダープローブ２及び上記シグナルプローブ３が変異型ＭＣＡ遺伝子とハイブリダイズして３重鎖構造が形成された場合にフラップエンドヌクレアーゼ４によって切断されるフラップ遊離体３ｃを検出できるように設計される。
【０１３０】
上記の構成により、被験者のＭＣＡ遺伝子の上記の第９２位又は第１２１位の塩基が置換している場合は、ヌクレオチド３ａの３’末端とインベーダープローブ２の５’末端とがオーバーラップすることにより３重鎖が形成されて蛍光が生じる。一方、被験者のＭＣＡ遺伝子が野生型である場合は、インベーダープローブ２の末端部分で３重鎖が形成されないので蛍光が生じない。
【０１３１】
また、上記の例では、被験者の有するＭＣＡ遺伝子が置換変異型の場合に蛍光が生じる構成としたが、本発明はこれに限定されず、被験者の有するＭＣＡ遺伝子が野生型の場合に蛍光が生じ、置換変異型の場合に蛍光が抑制される構成としてもよく、様々に改変することができる。
【０１３２】
一実施形態において、上記検出方法及び妊孕性診断キットは、ヒトＭＣＡ遺伝子の上記変異検出部位における塩基の置換変異の有無をＳＭＭＤ法によって検出するものであってもよい。ＳＭＭＤ法の詳細については、Ｗａｋａｉらによる論文（Wakai J et al., Nucleic Acids Res., 2004. 32(18), e141.）に記載されており、本明細書ではこれを援用する。
【０１３３】
図１０は、ＳＭＭＤ法の原理を説明する模式図である。なお、この図は、ヒトＭＣＡ遺伝子における変異のうち、上記の第９２位の塩基の置換変異の有無を検出する場合の例を示している。ＳＭＭＤ法は、電気化学的反応を利用して一塩基多型、置換変異、欠失変異、又は挿入変異などを検出するものである。まず、図１０に示すように、被験者のゲノムＤＮＡ１１を鋳型として変異検出部位を含む領域をＰＣＲによって増幅させるため、カウンタープライマー１３と特別プライマー１２とを１：４の割合で用いて非対称ＰＣＲを行う（工程Ａ）。ここで、特別プライマー１２は、変異を検出したい遺伝子１１の変異検出部位１１ａよりも下流の領域と相補的な塩基配列からなるオリゴマー１２ａと、タグ１２ｂとからなる。タグ１２ｂは、遺伝子１１の変異検出部位１１ａよりも１塩基下流の塩基から、オリゴマー１２ａがハイブリダイゼーションする塩基よりも１塩基上流の塩基までの領域と相補的な塩基配列を有しており、オリゴマー１２ａの５’末端に連結されている。
【０１３４】
上記の非対称ＰＣＲの結果、工程Ｂに示すＰＣＲ産物１４が生成される（工程Ｂ）。このＰＣＲ産物１４のうち、特別プライマー１２を含む一本鎖の非対称ＰＣＲ産物１４は、タグ１２ｂを含んでいるため、自己ループを形成して特別ターゲットを形成する（工程Ｃ・Ｄ）。
【０１３５】
次に、変異型プローブ２０及び野生型プローブ３０を用意する。プローブ２０・３０は、ともに、変異を検出したい遺伝子１１と同一の塩基配列を有し、かつ、変異検出部位１１ａ・１１ｂを３’末端とするオリゴマーをその５’末端側で金電極２５に固定したものである。ここで、変異型プローブ２０はオリゴマーの３’末端が変異型の塩基（Ｃ）となっているのに対して、野生型プローブ３０はオリゴマーの３’末端が野生型の塩基（Ａ）となっている。これらの変異型プローブ２０及び野生型プローブ３０は、オリゴマーが上述した特別ターゲット１５の３’末端側と相補的な塩基配列を有しているため、特別ターゲット１５とハイブリダイゼーションすることができる。なお、金電極２５にオリゴマーを固定するための詳細な方法は、Ｔａｋｅｎａｋａらによる論文（Takenaka S et al., Anal Chem., 2000, 72, 1334-1341）に記載されており、本明細書ではこれを援用する。
【０１３６】
プローブ２０・３０を特別ターゲット１５とハイブリダイゼーションさせる前に、フェロセニルナフタレンジイミド（ferrocenylnaphtalene diimide；以下「ＦＮＤ」と略称する）を含む溶液中で、予めバックグラウンド応答を行い、電流Ｉ０を測定しておく（工程Ｅ）。
【０１３７】
そして、特別ターゲット１５と変異型プローブ２０及び野生型プローブ３０とのハイブリダイゼーション及びライゲーションを行う。ここで、特別ターゲット１５が変異型のものである場合（すなわち、被験者が変異型遺伝子を有している場合）、特別ターゲット１５は変異型プローブ２０と塩基配列が完全に一致するのでライゲーションが行われる一方で、野生型プローブ３０とは塩基配列が末端部分で相違するのでライゲーションが行われない（工程Ｆ）。
【０１３８】
その後、変性処理を行うと、野生型プローブ３０と変異型の特別ターゲット１５との組では、野生型プローブ３０から変異型特別ターゲット１５が解離する。一方、変異型プローブ２０と変異型の特別ターゲット１５との組では、ライゲーションが行われているので、解離が起こらない（工程Ｇ）。
【０１３９】
そして、それぞれのサンプルを洗浄して余剰のＤＮＡを除去し、ＦＮＤを添加して、ＦＮＤ分子の電気化学的電流Ｉ１を測定する（工程Ｈ）。ここで、２本鎖ＤＮＡを有する電極では、１本鎖ＤＮＡを有する電極に比べて電流Ｉ１が大きくなる（工程Ｉ）。
【０１４０】
これにより、被験者のゲノムＤＮＡが変異型であるか野生型であるかを測定した電流値に基づいて判定することができる。なお、ＳＭＭＤ法では、上記の変異型プローブ２０及び野生型プローブ３０をＥＣＡ（Electrochemical array）チップとしてアレイ状に形成することにより、多数の変異を同時進行的に検出することができる。
【０１４１】
従って、本発明に係る妊孕性診断キットがＳＭＭＤ法により上記の置換変異の有無を検出するものである場合、妊孕性診断キットには、特別プライマー１２、カウンタープライマー１３、変異型プローブ２０及び野生型プローブ３０などが含まれていることが好ましい。なお、変異型プローブ２０及び野生型プローブ３０は、何れか一方のみでもよい。
【０１４２】
上記特別プライマー１２は、ヒトＭＣＡ遺伝子の変異検出部位よりも下流の所定領域と相補的な塩基配列からなるオリゴマー１２ａと、タグ１２ｂとからなる。タグ１２ｂは、ヒトＭＣＡ遺伝子の変異検出部位から、オリゴマー１２ａがハイブリダイゼーションする部位までの領域と相補的な塩基配列を有しており、オリゴマー１２ａの５’末端に連結される。一方、上記カウンタープライマー１３は、ヒトＭＣＡ遺伝子の変異検出部位よりも上流の所定領域と同一の塩基配列からなる。
【０１４３】
また、上記変異型プローブ２０は、ヒト変異型ＭＣＡ遺伝子と同一の塩基配列からなり、かつ、上記の第９２位の塩基（Ｃ）または第１２１位の塩基（Ａ）が３’末端になるオリゴマーを有するように設計される。また、上記野生型プローブ３０は、ヒト野生型ＭＣＡ遺伝子と同一の塩基配列からなり、かつ、上記の第９２位の塩基（Ａ）または第１２１位の塩基（Ｇ）が３’末端になるオリゴマーを有するように設計される。
【０１４４】
上記の構成によれば、被験者のＭＣＡ遺伝子が置換変異型の場合、特別ターゲット１５は、変異型プローブ２０とライゲーションできるが、野生型プローブ３０とはライゲーションできない。一方、被験者のＭＣＡ遺伝子が野生型の場合、特別ターゲット１５は、野生型プローブ３０とライゲーションできるが、変異型プローブ２０とはライゲーションできない。
【０１４５】
なお、上記の各方法において、ＭＣＡ遺伝子のセンス鎖（コドンをコードする側の鎖）を調べることによって置換変異の有無を判定する構成について詳細に説明したが、アンチセンス鎖を調べることによっても同様に判定することができるのはいうまでもない。
【０１４６】
（８）本発明に係る検出方法及び妊孕性診断キットの変形例
上記では、ヒトから採取したサンプルのゲノムＤＮＡを調べることによって妊孕可能性の推定および不妊症の原因の同定を行ったが、タンパク質レベルでも同様に妊孕可能性の推定および不妊症の原因の同定を行うことは可能である。
【０１４７】
すなわち、一実施形態において、本発明に係る検出方法および妊孕性診断キットは、ヒトにおいて正常なヒトＭＣＡタンパク質が発現しているか否かを判定するものであってもよい。より具体的には、上記検出方法は、ヒトＭＣＡタンパク質と結合する抗ヒトＭＣＡ抗体を用いて、ヒトから採取された生体サンプル中にヒトＭＣＡタンパク質が発現しているか否かを判定する工程を含んでいてもよい。また、上記妊孕性診断キットは、試薬として抗ヒトＭＣＡ抗体を含んでいてもよい。
【０１４８】
上記検出方法および妊孕性診断キットにおいて、抗ヒトＭＣＡ抗体を用いてヒトＭＣＡタンパク質の発現の有無を判定する手法は特に限定されず、公知のウェスタンブロッティングおよびＥＬＩＳＡ（Enzyme-linked Immunosorbent Assay）などが挙げられる。また、ヒトから採取する生体サンプルとしては、精巣生検によって被験者から採取した精巣内の組織（例えば精細管）、精子細胞または精漿などが挙げられる。精漿は、たとえ精子細胞を含んでいなくても、精子細胞が破壊などされることにより放出された、精子細胞で発現するタンパク質を含んでいると考えられている。また、抗ヒトＭＣＡ抗体としては、例えば上述した非特許文献３に開示されたポリクローナル抗体などを用いることができる。上記文献のポリクローナル抗体は、マウスの抗原を用いて作製したものであるが、ヒトＭＣＡタンパク質と結合することも確認されている。もちろん、それ以外の抗ヒトＭＣＡ抗体を用いてもよい。
【０１４９】
妊孕性診断キットがウェスタンブロッティングまたはＥＬＩＳＡを利用するものである場合、妊孕性診断キットには、抗ヒトＭＣＡ抗体に加えて、発色反応に必要なペルオキシダーゼなどの特異的酵素で標識した抗グロブリン抗体が含まれていてもよい。
【０１５０】
抗ヒトＭＣＡ抗体を用いてヒトＭＣＡタンパク質が発現しているか否かを調べ、被験者においてヒトＭＣＡタンパク質が発現していないと判定された場合は、ヒトＭＣＡ遺伝子が欠失または変異していることが示唆され、同時に、その被験者は、妊孕可能性が低い、あるいは不妊症の可能性が高いと推定することができる。また、被験者が不妊症の場合には、不妊症の原因が正常なヒトＭＣＡタンパク質が発現していないことによるものと推定することができる。
【０１５１】
また、他の実施形態において、本発明に係る検出方法および妊孕性診断キットは、上述した第９２位および第１２１位のうちの少なくとも一方の塩基置換を含むヒト変異型ＭＣＡ遺伝子によってコードされるヒト変異型ＭＣＡタンパク質と結合し、かつ、ヒト野生型ＭＣＡタンパク質と結合しない抗体を用いて、ヒトから採取された生体サンプル中にヒト変異型ＭＣＡタンパク質が発現しているか否かを判定するものであってもよい。この場合に用いられる抗体の詳細については後述する。
【０１５２】
上記抗体を用いてヒト変異型ＭＣＡタンパク質が発現しているか否かを調べ、被験者においてヒト変異型ＭＣＡタンパク質が発現していると判定された場合は、ヒトＭＣＡ遺伝子に上述した置換変異が生じていることが強く示唆され、同時に、その被験者は、妊孕可能性が低い、あるいは不妊症の可能性が高いと推定することができる。また、被験者が不妊症の場合は、不妊症の原因がヒトＭＣＡ遺伝子の異常に起因していると推定することができる。
【０１５３】
（９）本発明に係るポリヌクレオチド、ポリペプチド、発現ベクター及び発現キット
次に、本発明に係るポリヌクレオチドについて説明する。本発明に係るポリヌクレオチドは、翻訳開始コドンをコードするアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒト野生型ＭＣＡ遺伝子の翻訳領域の塩基配列において第９２位の塩基がＣに置換した塩基配列からなるものである。また、本発明に係る別のポリヌクレオチドは、翻訳開始コドンをコードするアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒト野生型ＭＣＡ遺伝子の翻訳領域の塩基配列において第１２１位の塩基がＡに置換した塩基配列からなるものである。また、本発明に係るさらに別のポリヌクレオチドは、翻訳開始コドンをコードするアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒト野生型ＭＣＡ遺伝子の翻訳領域の塩基配列において第９２位の塩基がＣに置換し、さらに第１２１位の塩基がＡに置換した塩基配列からなるものである。
【０１５４】
一実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号１０から１２の何れかに示す塩基配列からなるものであってもよい。ただし、本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号１０から１２の何れかに示す塩基配列のものに限定されない。本発明に係るポリヌクレオチドには、配列番号１０から１２の何れかに示される塩基配列のみならず、配列番号１０から１２の何れかに示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されたポリヌクレオチドからなり、かつ低妊孕性又は不妊症に関与するポリヌクレオチドも含まれ、特に、配列番号１０から１２の何れかに示される塩基配列において一塩基多型により１又は数個の塩基が置換された塩基配列のものも含まれる。
【０１５５】
ここで、数個とは、当業者に期待しうる程度を超える試行錯誤や複雑高度な実験を行うことなく当業者が作ることができる程度の数を意図し、例えば、２０個以下が好ましく、より好ましくは１０個以下、さらに好ましくは５個以下を意図する。
【０１５６】
本明細書において、「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」、または「核酸分子」と同義であり、ヌクレオチドの重合体を指す。本明細書において、「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と同義であり、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。
【０１５７】
上記ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、ＤＮＡの形態（例えば、合成ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）の何れであってもよい。さらに、ＤＮＡの場合、二本鎖、一本鎖の何れであってもよい。さらに、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）でもよいし、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）でもよい。
【０１５８】
なお、上記ポリヌクレオチドは、その５’末端又は３’末端に、タグ標識（タグ配列又はマーカー配列）をコードするポリヌクレオチドが連結されていてもよい。
【０１５９】
上記ポリヌクレオチドを取得する方法としては、ＰＣＲを用いる方法が挙げられる。具体的には、変異型ＭＣＡ遺伝子を有している人のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲによって得ることもできるし、また、変異を入れたプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、野生型ＭＣＡ遺伝子から得ることもできる。
【０１６０】
また、上記ポリヌクレオチドは、組換えベクターに挿入されていてもよい。この組換えベクターは、インビトロ翻訳に用いるベクターであってもよいし、組換え発現に用いるベクターであってもよい。
【０１６１】
ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターが適宜選択できる。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に上記ポリヌクレオチドからヒト変異型ＭＣＡタンパク質を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと上記ポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。
【０１６２】
上記発現ベクターは、導入されるべき宿主の種類に応じた発現制御領域（例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、および／または複製起点等）を含有する。細菌用発現ベクターのプロモーターとしては、慣用的なプロモーター（例えば、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター等）が使用され、酵母用プロモーターとしては、例えば、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ＰＨ０５プロモーター等が挙げられ、糸状菌用プロモーターとしては、例えば、アミラーゼ、ｔｒｐＣ等が挙げられる。また動物細胞宿主用プロモーターとしては、ウイルス性プロモーター（例えば、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター等）が挙げられる。発現ベクターの作製は、制限酵素および／またはリガーゼ等を用いる慣用的な手法に従って行うことができる。発現ベクターによる宿主の形質転換もまた、慣用的な手法に従って行うことができる。
【０１６３】
上記発現ベクターを用いて形質転換された宿主を、培養、栽培または飼育した後、培養物等から慣用的な手法（例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等）に従って、変異型ＭＣＡタンパク質を回収・精製することができる。
【０１６４】
上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。また、例えば、上記ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを昆虫で発現させる場合には、バキュロウイルスを用いた発現系を用いればよい。
【０１６５】
上記組換えベクターを使用すれば、上記ポリヌクレオチドを生物または細胞に導入することができ、結果として当該生物または細胞中に変異型ＭＣＡタンパク質を発現させることができる。さらに、上記組換えベクターを無細胞タンパク質合成系に用いれば、変異型ＭＣＡタンパク質を選択的に合成することができる。
【０１６６】
また、上述した組換えベクターを含み、かつ、上述した変異型ＭＣＡタンパク質を細胞に発現させるために用いられる発現キットの形態にしてもよい。
【０１６７】
上記発現キットには、上記の組換えベクター以外の他の試薬を含んでいてもよい。他の試薬としては、例えば、組換えベクターを宿主細胞に導入するための導入用試薬、その宿主細胞、組換えベクターが宿主細胞内に導入されているかどうかを検定するためのプローブ群などが挙げられるがこれに限定されない。つまり、変異型ＭＣＡタンパク質の発現実験を、確実かつ簡便にできるように支援する試薬であればどのようなものが含まれていてもよい。上記発現キットを用いることにより、目的の宿主細胞において、確実に、かつ簡便に、変異型ＭＣＡタンパク質を発現させることができる。
【０１６８】
また、本発明に係るポリペプチドは、上述したポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなるものである。
【０１６９】
一実施形態において、上記ポリペプチドは、配列番号１３から１５の何れかに示すアミノ酸配列からなるものであってもよい。ただし、本発明に係るポリペプチドは、配列番号１３から１５の何れかに示すアミノ酸配列に限定されない。本発明に係るポリペプチドには、配列番号１３から１５の何れかに示されるアミノ酸配列のみならず、配列番号１３から１５の何れかに示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ低妊孕性又は不妊症に関与するポリペプチドも含まれ、特に、配列番号１３から１５の何れかに示されるアミノ酸配列において一塩基多型により１又は複数のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列のものも含まれる。
【０１７０】
ここで、数個とは、当業者に期待しうる程度を超える試行錯誤や複雑高度な実験を行うことなく当業者が作ることができる程度の数を意図し、例えば、２０個以下が好ましく、より好ましくは１０個以下、さらに好ましくは５個以下を意図する。
【０１７１】
本明細書において、「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と同義である。また、本発明に係るポリペプチドは、天然供給源より単離したものであっても、化学合成したものであってもよい。
【０１７２】
「単離した」ポリペプチドとは、天然の環境から取り出されたポリペプチドを指す。例えば、宿主細胞中で発現された組換え産生ポリペプチドは、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然または組換えのポリペプチドと同様に、単離されていると考えられる。本発明に係るポリペプチドは、上述した本発明に係るポリヌクレオチドの利用方法に従って取得することができる。
【０１７３】
本発明に係るポリペプチドは、天然の精製産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）において組換え技術によって産生された産物を含む。なお、上記ポリペプチドは、組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、グリコシル化されたり、非グリコシル化されたりしたものであってもよい。さらに、上記ポリペプチドは、宿主媒介プロセスの結果として、翻訳開始を示すメチオニン残基が改変されたものであってもよい。
【０１７４】
本発明に係るポリヌクレオチド、発現ベクター、又はポリペプチドによれば、ヒトの不妊症患者に見られる変異型ＭＣＡタンパク質が得られる。従って、これらの発明は、ヒトＭＣＡ遺伝子の第９２位および第１２１位の少なくとも一方の塩基の置換変異に起因する低妊孕性又は不妊症の治療を目的とした薬剤及び治療方法を開発する上で極めて有用なツールであり、研究現場へ販売することができる。また、これらをキット化することにより、産業上の利用可能性が一層向上する。
【０１７５】
（１０）本発明に係る抗体
本発明に係る抗体は、ヒト変異型ＭＣＡポリペプチド（すなわち上述した本発明に係るポリペプチド）と結合し、かつ、ヒト野生型ＭＣＡポリペプチドと結合しないものである。本発明に係る抗体を用いれば、上述したように、妊孕可能性の推定及び不妊症の原因の同定をタンパク質レベルで検出することができる。
【０１７６】
一実施形態において、本発明に係る抗体は、配列番号１０から１２の何れかに示す塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと特異的に結合するものであることが好ましい。換言すれば、本発明に係る抗体は、配列番号１３から１５の何れかに示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと特異的に結合するものであることが好ましい。
【０１７７】
本発明に係る抗体は、上述したアミノ酸の置換変異を含むヒト変異型ＭＣＡポリペプチドまたは変異部分を含むそのフラグメントを抗原として実験動物を免疫処置することによって生産することができる。具体的な抗体の生産手順には、従来公知の方法を用いることができる。例えば、Chow, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 910-914；及びBittle, F. J. et al, J. Gen. Virol. 66: 2347-2354 (1985)を参照のこと。
【０１７８】
一般的に、動物は遊離ペプチドによって免疫化することができる。ただし、遊離ペプチドを高分子キャリア（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または破傷風トキソイド）にカップリングすることによって効率的に免疫化できるようになる場合もある。例えば、システインを含有するペプチドは、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）のようなリンカーによってキャリアにカップリングすることができる。一方、他のペプチドは、グルタルアルデヒドのようなより一般的な連結剤を使用してキャリアにカップリングすることができる。
【０１７９】
ウサギ、ラット及びマウスのような動物は、遊離ペプチド又はキャリア−カップリングペプチドと、Ｆｒｅｕｎｄのアジュバントとを含むエマルジョンを、腹腔内および／または皮内に注射することにより免疫化することができる。ＥＬＩＳＡにより検出できる程度に有用な力価の抗ペプチド抗体を得るためには、約２週間の間隔で追加免疫注射を行うことが好ましい。
【０１８０】
そして、免疫化された動物から血液を採取し、血清からＩｇＧ画分を抽出することにより抗体を得ることができる。また、抗体を公知の技術によって精製することにより、抗体の力価が向上する。
【０１８１】
本発明に係る抗体は、上述したヒト変異型ＭＣＡポリペプチドに結合する一方で、ヒト野生型ＭＣＡポリペプチドには結合しないものである。それゆえ、上記の手順によって得られた抗体のうち、ヒト野生型ＭＣＡタンパク質と結合しないものを選出することによって、本発明に係る抗体を得ることができる。上記の選出を容易にするためには、動物に注射する抗原ペプチドとして、ヒト変異型ＭＣＡポリペプチドの変異部分とその周辺のアミノ酸配列からなる１０残基程度のオリゴペプチドを選択することが好ましい。
【０１８２】
なお、本明細書では、ヒト野生型ＭＣＡ遺伝子の翻訳領域の代表的な塩基配列として、配列番号８に示す塩基配列を例示したが、特許請求の範囲に記載の「ヒトＭＣＡ遺伝子」及び「ヒト野生型ＭＣＡ遺伝子」の翻訳領域は、配列番号８に示された塩基配列のもののみに限定されない。なぜならば、ヒト遺伝子には多くの一塩基多型が存在し、ヒトＭＣＡ遺伝子においても例外ではないからである。従って、特許請求の範囲に記載の「ヒトＭＣＡ遺伝子」及び「ヒト野生型ＭＣＡ遺伝子」には、配列番号８に示される塩基配列のみならず、配列番号８に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された翻訳領域を有し、かつ妊孕性に関与するもの（すなわち、自身のコードするポリペプチドが配列番号９に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド）も含まれ、特に、配列番号８に示される塩基配列において一塩基多型により１又は数個の塩基が置換された塩基配列を翻訳領域として有するものも含まれる。
【０１８３】
ここで、数個とは、当業者に期待しうる程度を超える試行錯誤や複雑高度な実験を行うことなく当業者が作ることができる程度の数を意図し、例えば、２０個以下が好ましく、より好ましくは１０個以下、さらに好ましくは５個以下を意図する。このことは、ヒト変異型ＭＣＡ遺伝子についても同様である。
【実施例１】
【０１８４】
以下では、本発明の一実施例について図２から図５に基づいて説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。本実施例では、マウス（Mus musculus）のＭＣＡ遺伝子を欠損させることにより本発明に係る疾患モデル動物を作製した。なお、以下の各工程では、特に断りがない限り、常法又はキットに添付されている取扱説明書に従って処理を行った。
【０１８５】
〔ＭＣＡホモ欠損マウスの作製〕
図１は、マウスＭＣＡ遺伝子の第１エクソン及びその周辺の物理地図である。図１に示す領域に対応する塩基配列を配列番号１に示す。配列番号１に示す塩基配列は、ＮＣＢＩマウスゲノムリソース（NCBI Mouse Genome Resource）に登録されている第１７番染色体の第１７５８２３１７位から第１７６２２３１６位までの塩基配列である。なお、ＮＣＢＩ Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｏｕｒｃｅにおいて、ＭＣＡはＴｓｇａ２とも称される。図中において、「第１エクソン」と標記されている領域（配列番号１の第１７８４８位から第１７９９１位の塩基配列に相当）が、ＭＣＡ遺伝子の第１エクソンに相当し、右側がＭＣＡ遺伝子の上流で左側が下流となっている。本実施例では、この第１エクソンをネオマイシン耐性遺伝子カセット（プロモータ及び翻訳領域を含む）で置換することによって、正常なＭＣＡタンパク質が発現しないようにした。
【０１８６】
ターゲッティングベクターには、（ａ）配列番号１の第１９２１８位から第２３０００位までの塩基配列からなる５’アーム配列と、（ｂ）配列番号１の第１００２１位から第１６２５０位までの塩基配列からなる３’アーム配列と、（ｃ）５’アーム配列と３’アーム配列との間に挟まれたネオマイシン耐性遺伝子カセット（ｎｅｏカセット）とを含めた。なお、ｎｅｏカセットは、図中の左側が上流、右側が下流になる向き（つまりＭＣＡ遺伝子と逆向き）に挿入した。図２は、ターゲッティングベクターの構造を示す模式図である。
【０１８７】
次に、作製した図２のターゲッティングベクターを制限酵素で消化し、ターゲッティングベクターを環状から線状にした。そして、線状にしたターゲッティングベクターをエレクトロポレーションによりＷ９．５ ＥＳ細胞に導入した。導入後、Ｇ４１８ガンシクロビルを添加した培養液でターゲッティングベクターを導入したＥＳ細胞を培養し、Ｇ４１８ガンシクロビル耐性クローンを得た。
【０１８８】
そして、得られた耐性クローンについて、相同組換えが問題なく行われているか否か（ターゲッティングが行われているか否か）を次の３つの方法で調べた。第１の方法では、ネオマイシン耐性遺伝子の３’末端領域に存在する塩基配列からなるｎｅｏ１７４６ｆプライマー（配列番号２：５’−ｃｃｔｇｃｃａｔａｇｃｃｔｃａｇｇｔｔａｃｔｃ−３’）と、図１に示す５’アーム配列の外側の２３２５０ｒプライマー（配列番号３：５’−ｇｃａｇａｇｇｇａｇｃｇａｇｇｃｔｃａｇｃａｃａｔｇｇ−３’）との組を用いてＰＣＲを行い、５’末端側のターゲッティングが正常に行われているか否かを調べた。このとき、試薬にはロシュ社のＴｈｅ Ｅｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを用い、反応条件は次の通りとした。
（１）９４℃で５分
（２）９４℃で３０分、５８〜６１℃で１分、６８℃で５分を１サイクルとして３５サイクル
（３）６８℃で１０分
これにより、ターゲッティングが行われているクローンのサンプルでは、約４．２ｋｂのフラグメントが検出された。
【０１８９】
また、第２の方法では、サザン解析によってターゲッティングが正常に行われているか否かを調べた。このとき、クローンのゲノムＤＮＡはＸｂａＩで消化し、プローブには、配列番号１の第２３０５１位から第２３７５０位までの塩基配列からなる５’プローブ（図１参照）を用いた。この５’プローブは、野生型マウスのゲノムＤＮＡを鋳型とし、２３０５１Ｆプライマー（配列番号４：５’−ｇｔｔｇｇｃｃａｇｇｇａａｇａａｃｔｃｔｔｔｃｔｃ−３’）と２３７５０Ｒプライマー（配列番号５：５’−ｔａｃａｃｇｃｔｇｔｔａｇｃｃａａａｔａｇｇ−３’）とを用いてＰＣＲを行うことにより作製した。サザン解析の結果、野生型クローンのサンプルでは約１２．６ｋｂのバンドが検出され、ターゲッティングが行われているクローンのサンプルでは約１６．５ｋｂのバンドが検出された。
【０１９０】
第３の方法では、図１に示す３’アーム配列の外側の９７２５ｆプライマー（配列番号６：５’−ｔｃｃｔｇｃｃｔｃａｔｃｃｔｇｔｔｔｔａａｔｇｇ−３’）と、ネオマイシン耐性遺伝子の５’末端領域に存在する塩基配列からなるｎｅｏ６ｒプライマー（配列番号７：５’−ｃａｔａｇｃｃｇａａｔａｇｃｃｔｃｔｃｃ−３’）との組を用いてＰＣＲを行い、３’末端側のターゲッティングが正常に行われているかを調べた。なお、ＰＣＲの条件は、基本的には上述した第１の方法と同じであるが、伸長ステップ（（２）の６８℃での処理）の時間を７分にした。これにより、ターゲッティングが行われているクローンからは、約７．１ｋｂのフラグメントが検出された。
【０１９１】
以上のようにして、ターゲッティングが行われていることが確認されたＥＳ細胞クローンをＣ５７ＢＬ／６Ｊの胚盤胞に注入し、オスのキメラマウスを得た。そして、得られたキメラマウスを野生型のメスのマウスと交配させ、ＭＣＡヘテロ欠損マウス（Ｆ１）を得た。なお、ＭＣＡヘテロ欠損マウスの同定は、ＰＣＲを用いる上述の第１の方法によって行った。図３は、代表的なスクリーニング結果を示す図である。図中に矢印で示すように、一部のレーン（レーン１１，１２，１５）では、ＭＣＡヘテロ欠損マウスが得られたことを示す約４．２ｋｂのバンドが検出された。そして、得られたＭＣＡヘテロ欠損マウス同士を交配し、ＭＣＡホモ欠損マウスを得た。
【０１９２】
次に、精巣でのＭＣＡタンパク質の発現を調べるためにウエスタンブロットを行った。ウエスタンブロットには、非特許文献３に記載の抗ＭＣＡ抗体を用いた。この抗体は、非特許文献３に記載されている、マウスのＭＣＡタンパク質全長とＧＳＴタンパク質との融合タンパク質をラビットに免役して得られたもので、哺乳類細胞においてＭＣＡ特異的に反応することが分かっているものである。ウエスタンブロットの詳細な手順は次の通りである。
【０１９３】
まず、約４０μｇの精巣のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって展開した後、セミドライ法によってポリビニルジフルオライド（ＰＶＤＦ）フィルターにトランスファー（1ｍＡ/ｃｍ２で８０分）した。そして、フィルターを５％スキムミルクでブロッキングし、ＴＢＳ（25mM Tris-HCl pH=7.4, 150mMNaCl, 50mM KCl）で１０００倍に希釈した上記抗ＭＣＡ抗体によって４℃で１晩処理を行った。次に、フィルターをＴＢＳにより５分間洗浄する処理を３回繰り返し、ＴＢＳで７５０倍に希釈したペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）をコンジュゲートした抗ラビット抗体(DAKO, A/S, Denmark)によってフィルターを室温で３時間処理した。処理後、フィルターをＴＢＳで５分間洗浄する処理を３回繰り返し、ＰＯＤイムノステインセット（Wako, Osaka, Japan）でシグナルの検出を行った。
【０１９４】
図４は、ウエスタンブロットの結果を示す図である。図中において、「＋／＋」は野生型マウスを示し、「＋／−」はＭＣＡヘテロ欠損マウスを示し、「−／−」はＭＣＡホモ欠損マウスを示す。図４に示すように、ＭＣＡホモ欠損マウスでは、ＭＣＡタンパク質が全く発現していないことが示された。
【０１９５】
また、精巣でのＭＣＡ転写産物の発現を調べるためにノーザンブロットを行った。ノーザンブロットは、ＭＣＡ ｃＤＮＡ全長をプローブとして用い、次の手順で行った。
【０１９６】
成熟マウスから摘出した約５ｍｍ四方の各組織(脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、脾臓、精巣、唾液腺)を１．５ｍＬマイクロチューブに入れ、１ｍｌのＴＲＩＳＯＬ（登録商標） ｒｅａｇｅｎｔ（GIBCO BRL, NY, USA）を加え、氷上でホモジナイズして５分間室温で静置した。その後、２００μｌのクロロホルムを加えて激しく撹拌し、５分間室温で静置した後、４℃、１３５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。次に、上層を新しいチューブに移し、１００％エタノールを１ｍｌ加えて撹拌し、４℃、１３５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。そして上清を捨て、７０％エタノールを１ｍｌ加えて撹拌し、４℃、１３５００ｒｐｍで１０分間遠心分離して再び上清を捨て、沈殿物を軽く乾燥させた後にＤＥＰＣ処理水に溶かした。これにより、全ＲＮＡを得た。
【０１９７】
次に、２０μｇ分の全ＲＮＡを６５℃で２０分間変性処理した後、０．６６Ｍホルムアルデヒドを含む１％アガロースゲルで電気泳動した。そして、ゲルをアクリジンオレンジで染色して１８Ｓ及び２８ＳリボソームＲＮＡを確認した後、キャピラリートランスファー法によってＺｅｔａ−Ｐｌｏｂｅ（登録商標） Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｍｅｍｂｒｅｎｅｓフィルター（BIO-RAD, CA, USA）にＲＮＡをトランスファーした。その後、フィルターを２×ＳＳＣで５分間処理し、８０℃でベーキングすることによりＲＮＡをフィルターに固定した。
【０１９８】
続いて、フィルターを６５℃のＰｅｒｆｅｃｔＨｙｂ（登録商標） Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（TOYOBO, Osaka, Japan）中で１時間プレハイブリダイゼーションした。その後、全長ＭＣＡフラグメントをＢｃａＢｅｓｔ（登録商標） ｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒ ｋｉｔ（Takara, Osaka, Japan）を用いて３２Ｐでラベルしてプローブを調製し、そのプローブをＰｅｒｆｅｃｔＨｙｂ（登録商標） Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎに加えた６０℃のハイブリダイゼーション溶液にフィルターを浸漬し、２時間ハイブリダイゼーションを行った。そして、１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣによりフィルターを室温で１０分間洗浄した。その後、０．１％ＳＤＳを含む０．２％ＳＳＣによりフィルターを６０℃で３０分間洗浄する処理を２回行い、バイオイメージングアナライザーシステムＢＡＳ１０００（Fuji Film, Japan）でシグナルを検出した。
【０１９９】
図５は、精巣サンプルについてのノーザンブロットの結果を示す図である。図中における「＋／＋」、「＋／−」、「−／−」は、図４のウエスタンブロットと同様である。図５に示すように、ＭＣＡホモ欠損マウスでは、ＭＣＡの転写産物が全く見られず、遺伝子が確実に欠損していることが確かめられた。
【０２００】
〔ＭＣＡ欠損マウスの解析〕
次に、得られたＭＣＡ欠損マウスの形質の解析を行った。具体的には、ＭＣＡヘテロ欠損マウス、ＭＣＡホモ欠損マウスのそれぞれから精巣及び副精巣を摘出し、切片標本を作製した。そして、作製した切片標本を染色し、顕微鏡で観察した。切片標本の作製及び染色の方法は次の通りである。
【０２０１】
成熟マウスから精巣及び副精巣を摘出し、摘出した組織をブアン溶液により４℃で一晩固定してパラフィンに包埋したもの、及び、摘出した組織を固定せずにＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ（Sakura Finetechnical Co.Ltd, Tokyo, Japan）で包埋し−２０℃に冷やしたものから、厚さ７μｍの切片を作製した。次に、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ Ｃｏｍｐｏｕｎｄに包埋した未固定の組織について、１００％アルコール若しくはパラホルムアルデヒドで固定した後、抗体反応を行った。具体的には、ＰＢＳで１０００倍希釈した抗ＭＣＡ抗体によって４℃で一晩処理し、ＰＢＳによる室温での５分間の洗浄を３回繰り返した。その後、ＰＢＳで７５０倍希釈したＰＯＤコンジュゲートした抗ウサギ抗体（Amersham）によって、室温で４時間処理した。最後にＰＢＳによる室温での５分間の洗浄を３回繰り返した後、ジアミノベンジミド（ＤＡＢ）による発色を行い、ヘマトキシリンによるカウンター染色を行った。
【０２０２】
図６は、ＭＣＡヘテロ欠損マウスから摘出した精巣、副精巣尾、副精巣頭の顕微鏡像を示す図であり、図７は、ＭＣＡホモ欠損マウスから摘出した精巣、副精巣尾、副精巣頭の顕微鏡像を示す図である。図６に示すように、ＭＣＡヘテロ欠損マウスでは、精巣、副精巣尾、副精巣頭の何れにも異常が見られなかった。また、ＭＣＡヘテロ欠損マウスの妊孕性にも特に問題はなかった。これに対し、ＭＣＡホモ欠損マウスでは、図７に示すように、精巣には目立った異常が見られなかったものの、副精巣尾及び副精巣頭において精子が存在しなかった。このため、ＭＣＡホモ欠損マウスは無精子症を示し、不妊であった。
【０２０３】
ＭＣＡホモ欠損マウスの精巣重量を調べた結果、野生型と比べて大きな変化はなかったため、減数分裂後の精子細胞分化は進んでいることが示唆された。精巣の精子細胞を詳細に観察した結果、減数分裂後の精子細胞の数は、野性型マウスと比べてほとんど量的な差がなかった。しかしながら、精子鞭毛の折れ曲がりや、核が野性型マウスのように棒状に伸びず、不均一な円形のままであったことから、精巣における精子細胞の形態形成不全が生じていることが明らかになった。このことから、精巣内での鞭毛形成が不完全である精細胞は、精子形成後に副精巣へとうまく移動できなかったために、副精巣において精子が見られなかったものと考えられる。なお、精子の形態については、現在電子顕微鏡によりさらなる解析を進めている。
【０２０４】
ＭＣＡタンパク質は、上述したように減数分裂期に発現することが報告されている。そこで、ＭＣＡホモ欠損マウスについて、精巣で減数分裂期に異常が生じ、アポトーシスを起こす精細胞が増加していないかを調べた。その結果、アポトーシスを起こす精細胞が増えていることが明らかになった。しかしながら、精子形成が見られ、精巣重量にも大きな差がなかったことから、精子形成期における鞭毛形成障害に起因して正常な精巣半数体精子細胞が形成されず、セルトリ細胞に精細胞が貪食され、その結果として副精巣に精子が存在せずに無精子症になったと考えられる。
【実施例２】
【０２０５】
以下では、本発明の別の実施例について説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。本実施例では、ヒトＭＣＡ遺伝子における置換変異の解析を行った。なお、以下の各工程では、特に断りがない限り、常法又はキットに添付されている取扱説明書に従って各処理を行った。
【０２０６】
〔参加者〕
不妊症の日本人男性被験者（Ｎ＝２４５）を精子形成の欠損の程度に基づいてサブグループに分割した。これらの不妊症被験者のうち、９７人（４０％）は非閉塞性無精子症であり、１４８人（６０％）は非閉塞性重症精子過少症（＜５×１０６細胞／ｍＬ）であった。遺伝的要因を調べたところ、これらの被験者は何れも原発性特発性不妊症であった（Birmingham A et al. Fertil Steril 2004; 9: 2313-2317）。
【０２０７】
一方、妊孕性が確認された男性のコントロールグループ（Ｎ＝１７２）として、産婦人科医院にいる妊婦のもとに生まれた子供の父親を選択した。
【０２０８】
なお、ドナーは、本研究において血液をゲノムＤＮＡの解析に使用することに同意した。
【０２０９】
〔ＰＣＲ増幅ＤＮＡのダイレクトシーケンシングによるＭＣＡ遺伝子の変異の同定〕
以下の各工程では、特に断りがない限り、常法又はキットに添付されている取扱説明書に従って処理を行った。ゲノムＤＮＡは、プロテアーゼ処理及びフェノール抽出により血液サンプルから単離した（Sambrook J et al., Isolation of DNA from Mammalian Cells. New York: Cold Spring Harbor Press. 1989: pp. 9.16-9.21）。また、ＭＣＡ遺伝子の第２エクソン及び第３エクソンを含む領域を増幅させるために、ＰＣＲに用いるプライマーの組として、ＭＣＡ−Ｐ３及びＭＣＡ−Ｐ４Ｒを設計した（図８参照）。ＭＣＡ−Ｐ３は、図８に示すように、ＭＣＡ遺伝子の第２エクソンの上流領域と同一の塩基配列（配列番号１６：５’−ＴＡＧＣＡＴＡＧＴＧＧＧＡＴＧＡＣＴＣＡＡＧＧＧ−３’）からなる。また、ＭＣＡ−Ｐ４Ｒは、ＭＣＡ遺伝子の第３エクソンの下流領域と相補的な塩基配列（配列番号１７：５’−ＡＡＣＴＴＣＴＧＴＡＡＣＡＣＧＡＡＡＡＴＣＴＧＣ−３’）からなる。
【０２１０】
ＰＣＲは以下の条件で行った：９８℃で１０秒間変性、６０℃で５秒間アニーリング、及び７２℃で３０秒間伸長を１サイクルとして、これを４０サイクル。ＰＣＲ増幅フラグメントはＳＵＰＲＥＣ ＰＣＲスピンカラム（タカラバイオ）を用いて精製した。
【０２１１】
ＭＣＡ−Ｐ３及びＭＣＡ−Ｐ４Ｒからなるプライマーの組によって増幅したフラグメントについて、同じＭＣＡ−Ｐ３及びＭＣＡ−Ｐ４Ｒのそれぞれを用いてシーケンシングを行った。このとき、サーマルサイクルシーケンシングキット（アプライドバイオシステムズ）を用いて反応を行い、反応産物をＡＢＩ−ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ）によって解析した。両方向の決定結果を比較し、塩基配列を決定した。
【０２１２】
〔結果〕
不妊症被験者及び妊孕性確認被験者のそれぞれについてＭＣＡ遺伝子の第２エクソン及び第３エクソンの塩基配列を解析したところ、ＭＣＡ遺伝子の翻訳領域の第９２位のアデニンが片方のアレルにおいてシトシンに置換している被験者が、不妊症被験者２４５人
の中に３人見出された。この被験者のうち、２人は無精子症であり、１人は重症精子過少症であった。一方、妊孕性確認被験者からは、この置換変異が全く見出されなかった。
【０２１３】
さらに、ＭＣＡ遺伝子の翻訳領域の第１２１位のグアニンが片方のアレルにおいてアデニンに置換している被験者が、不妊症被験者２４５人の中に１人見出された。この被験者は、重症精子過少症であった。一方、妊孕性確認被験者からは、この置換変異が全く見出されなかった。
【０２１４】
配列番号８に示すヒトＭＣＡ遺伝子の翻訳領域の第９２位のアデニン塩基がシトシン塩基に置換すると、この部位がプロリンをコードするようになる。また、第１２１位のグアニン塩基がアデニン塩基に置換すると、この部位がアルギニンをコードするようになる。
【０２１５】
ＭＣＡ遺伝子は哺乳類に広く保存されていること、並びに、そのタンパク質が精巣の半数体生殖細胞に特に強く発現することから、ＭＣＡタンパク質の変異は、男性不妊を引き起こす（或いは引き起こしやすい）と考えられる。上記の置換変異が見出された被験者は、正常なＭＣＡタンパク質の翻訳量が低減したことにより、或いは、変異型ＭＣＡタンパク質がドミナントネガティブに作用することにより、ＭＣＡタンパク質の働きが不十分になって不妊症になったものと推測された。
【０２１６】
なお、本研究により、上記の置換変異以外にも一塩基多型がＭＣＡ遺伝子内に見出されたが、これらの一塩基多型は、そのパターンが不妊症被験者と妊孕性確認被験者との間で有意な相違を見せず、特に妊孕性に影響を与えるものとは認められなかった。
【０２１７】
本発明は上述した実施形態及び実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。すなわち、請求項に示した範囲で適宜変更した技術的手段を組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【０２１８】
本発明によれば、不妊症の現象解明や治療法の確立並びに不妊症の診断に有用なツールが提供されるので、製薬分野や医療分野において本発明を好適に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０２１９】
【図１】マウスにおけるＭＣＡ遺伝子の第１エクソン及びその周辺の物理地図を示す図である。
【図２】ＭＣＡ欠損マウスの作製に用いたターゲッティングベクターの構造を示す図である。
【図３】マウスのジェノタイプを調べるために行ったＰＣＲの結果の例を示す図である。
【図４】ＭＣＡタンパク質の発現を確認するために行ったウエスタンブロットの結果を示す図である。
【図５】ＭＣＡ転写産物の発現を確認するために行ったノーザンブロットの結果を示す図である。
【図６】ＭＣＡへテロ欠損マウスの精巣、副精巣尾及び副精巣頭の顕微鏡像を示す図である。
【図７】ＭＣＡホモ欠損マウスの精巣、副精巣尾及び副精巣頭の顕微鏡像を示す図である。
【図８】ヒトＭＣＡ遺伝子の構造を示す物理地図である。
【図９】インベーダー法の原理を説明する図である。
【図１０】ＳＭＭＤ法の原理を説明する図である。
【符号の説明】
【０２２０】
１ ターゲット遺伝子
１ａ 変異検出部位
２ インベーダープローブ
３ シグナルプローブ
３ａ ヌクレオチド
３ｂ フラップ
３ｃ フラップ遊離体
４ フラップエンドヌクレアーゼ
５ フレットプローブ
５ａ ヌクレオチド
５ｂ 蛍光色素
５ｃ クエンチャー
１１ 遺伝子
１１ａ・１１ｂ 変異検出部位
１２ 特別プライマー
１２ａ オリゴマー
１２ｂ タグ
１３ カウンタープライマー
１４ ＰＣＲ産物
１５ 特別ターゲット
２０ 変異型プローブ
２５ 金電極
３０ 野生型プローブ
【技術分野】
【０００１】
本発明は疾患の現象解明や治療法の確立に有用な疾患モデル動物などのツールに関するものである。また、本発明は、妊孕可能性の推定及び不妊症の原因の同定を可能にする技術に関するものでもある。
【背景技術】
【０００２】
近年、少子化の問題が頻繁に取り上げられ、この問題を解消するために様々な対策が模索されている。少子化の対策として、不妊症により子供を授からない夫婦を救済することが重要であることは言うまでもない。
【０００３】
非特許文献１では、子供を望む夫婦のうちの約１５％が２年たっても妊娠できないことが報告されている。近年では、体外受精（ＩＶＦ；In Vitro Fertilization）の技術発展により、精子の活動能が低い場合においても妊娠出産が可能になっているが、不妊の背後にある分子メカニズムは依然として明らかになっていない。
【０００４】
非特許文献２によると、マウスにおける雄性不妊の研究により、妊孕性に影響を与える多くの遺伝子の存在が明らかになっており、これらの遺伝子の変異がヒトにおいても男性不妊を引き起こす一因となっている可能性がある。
【０００５】
哺乳類の雄性生殖細胞の成熟は、数々の構造的及び機能的変化を経てなされる。その過程は精子形成と呼ばれ、主として（１）精原細胞の増殖及び分化、（２）精母細胞の前期段階における減数分裂、及び（３）半数体円形精子細胞から精子への分化の際の急激な形態変化、の３つの段階を含んでいる。
【０００６】
上記の（２）の減数分裂期に特異的に発現するタンパク質として、Ｍｅｉｃｈｒｏａｃｉｄｉｎ（以下「ＭＣＡ」という）が知られている。ＭＣＡ遺伝子は、最初にマウスにおいて単離された（非特許文献３）。その遺伝子産物は、パキテン期精母細胞の細胞質に発現し、減数分裂期に核膜が消失すると染色体や紡錘体に結合することが分かっている。このことから、上記の遺伝子産物はMale Meiotic Metaphase Chromosome-Associated Acidic Proteinの頭文字をとってＭｅｉｃｈｒｏａｃｉｄｉｎと名付けられた。ＭＣＡタンパク質は特異的なアミノ酸の反復配列を含んでおり、後にこの反復配列はＭＯＲＮモチーフと名付けられた（非特許文献４）。
【０００７】
その後、ヒトＭＣＡ遺伝子も単離され、解析の結果、ヒトＭＣＡタンパク質は精子の鞭毛、基底小体及びアクロソームにおいて発現していることが明らかになった（非特許文献５）。また、マウスにおいてＭＣＡタンパク質が精子の鞭毛にも発現していることも明らかになった。
【０００８】
なお、ＭＣＡタンパク質は、ヒトやマウスなどの哺乳動物だけでなく、コイやホヤの精子の鞭毛にも発現していることが知られている（非特許文献６，７）。
【非特許文献１】de Kretser DM et al., J Clin Endocrinol Metab. 1999; 84: 3443-3450.
【非特許文献２】Matzuk MM et al., Nat Cell Biol. 2002; 4(Supp1): S41-S49 / Nat Med. 2002; 8 (Supp1): S33-S40.
【非特許文献３】Tsuchida J et al., Dev Biol. 1998 May 1;197(1):67-76.
【非特許文献４】Takeshima H et al., Mol Cell. 2000 July ;6(1):11-22.
【非特許文献５】Yasuhiro M et al., Reproductive Medicine and Biology. 2005; 4: 213-219.
【非特許文献６】Ju TK and Huang FL., Biol Reprod. 2004 Nov; 71(5):1419-1429. Epub 2004 Jun 23.
【非特許文献７】Satouh Y et al., Mol Biol Cell. 2005 Feb; 16(2):626-636. Epub 2004 Nov 24.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、男性不妊の病態や治療法を研究する際に有用なツールとなる疾患モデル動物は未だ十分に得られていない。一口に男性不妊といっても、その原因は、生殖細胞自体の欠失から精子の受精不全まで多岐に渡る。従って、病態に応じた有効な治療法を確立するためには、様々な男性不妊モデル動物を得ることが望まれている。
【００１０】
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、その第１の目的は、低妊孕性又は不妊症の病態や治療法を研究する上で有用なツールを提供することにある。
【００１１】
また、男性不妊を診断するための有効な遺伝子診断方法も、未だ十分に確立されていない。
【００１２】
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、その第２の目的は、妊孕可能性の推定及び不妊症の原因の同定を可能にすることにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本願発明者は、後述する実施例に示すように、ＭＣＡ遺伝子が欠損し、ＭＣＡを発現しないＭＣＡ欠損マウスを作製した結果、このマウスが不妊症になることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１４】
すなわち、上記第１の目的を達成するために、本発明に係る疾患モデル動物は、正常なＭＣＡタンパク質の発現が低下し、低妊孕性又は不妊症を呈するオスの非ヒト哺乳動物であることを特徴とする。
【００１５】
或いは、本発明に係る疾患モデル動物は、正常なＭＣＡタンパク質が発現しないオスの非ヒト哺乳動物であることを特徴とするものであってもよい。
【００１６】
さらに或いは、本発明に係る疾患モデル動物は、ＭＣＡ遺伝子が欠損したオスの非ヒト哺乳動物であることを特徴とするものであってもよい。
【００１７】
これにより、低妊孕性又は不妊症の新規のモデル動物が提供される。
【００１８】
また、上記疾患モデル動物は、低妊孕性又は不妊症を呈することが好ましい。また、上記非ヒト哺乳動物はマウスであることが好ましい。また、上記疾患モデル動物は無精子症を呈することが好ましい。
【００１９】
本発明に係る細胞は、上述した疾患モデル動物から単離されたものであることを特徴とする。また、本発明に係る別の細胞は、ＭＣＡ遺伝子が欠損又は変異し、低妊孕性又は不妊症を呈するヒト男性から単離されたものであることを特徴とする。なお、上記細胞は、生殖細胞であることが好ましい。
【００２０】
本発明に係る精巣内の組織又は精巣は、上述した疾患モデル動物又は上述したヒト男性から単離されたものであることを特徴とする。
【００２１】
本発明に係る交配用動物は、上述した疾患モデル動物を作製するための交配に用いられ、ＭＣＡ遺伝子の一部又は全部が欠損している非ヒト哺乳動物であることを特徴とする。この交配用動物を用いれば、上述した疾患モデル動物を容易に作製することができる。
【００２２】
本発明に係る生殖細胞生産方法は、低妊孕性又は不妊の雄性生殖細胞を生産するための生殖細胞生産方法であって、オスの哺乳動物由来の培養細胞又はオスの哺乳動物から単離された細胞である哺乳動物細胞が有するＭＣＡ遺伝子を欠損させる遺伝子欠損工程と、上記遺伝子欠損工程によってＭＣＡ遺伝子が欠損した哺乳動物細胞を生殖細胞へ分化させる分化誘導工程とを含んでいることを特徴とする。
【００２３】
本発明に係る生殖細胞は、オスの非ヒト哺乳動物の生殖細胞であって、ＭＣＡ遺伝子が欠損し、低妊孕性又は不妊を呈することを特徴とする。
【００２４】
本発明に係る培養細胞は、ヒト男性由来の培養細胞であって、ＭＣＡ遺伝子が欠損し、低妊孕性又は不妊を呈する生殖細胞であることを特徴とする。
【００２５】
本発明に係るスクリーニング方法は、低妊孕性又は不妊症の治療薬の候補化合物をスクリーニングするためのスクリーニング方法であって、上述した疾患モデル動物、細胞、組織若しくは精巣、雄性生殖細胞、生殖細胞、又は培養細胞に対して上記候補化合物を作用させ、その結果を評価する工程を含んでいることを特徴とする。
【００２６】
本発明に係る低妊孕性又は不妊症の治療及び／又は予防用医薬組成物は、上述したスクリーニング方法によって得られた化合物を主成分として含むことを特徴とする。
【００２７】
また、上記第２の目的を達成するために、本発明に係る妊孕性診断キットは、ヒトＭＣＡ遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬を含んでいることを特徴とする。
【００２８】
上記試薬は、翻訳開始コドンをコードするアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒトＭＣＡ遺伝子の翻訳領域の第９２位の塩基および第１２１位の塩基のうちの少なくとも一方の塩基の変異の有無を検出するものであることが好ましい。
【００２９】
具体的には、上記試薬は、ヒトＭＣＡ遺伝子の上記第９２位の塩基および第１２１位の塩基のうちの少なくとも一方の塩基を含む領域を増幅させるためのプライマーの組と、上記領域の塩基配列を決定するための塩基配列決定試薬とを含んでいてもよい。
【００３０】
或いは、上記試薬は、上記変異の有無をインベーダー法によって検出するものであってもよい。
【００３１】
さらに或いは、上記試薬は、上記変異の有無をＳＭＭＤ法によって検出するものであってもよい。
【００３２】
また、上記第２の目的を達成するために、本発明に係る検出方法は、ヒトから単離された生体サンプルを用いて上記ヒトにおける遺伝子の欠損又は変異を検出する検出方法であって、ヒトＭＣＡ遺伝子の欠損又は変異の有無を検出する工程を含んでいることを特徴とする。
【００３３】
ＭＣＡ遺伝子の欠損又は変異は男性の妊孕性に影響を与えるため、上記妊孕性診断キット又は検出方法により、妊孕可能性の推定及び不妊症の原因の同定が可能になる。
【００３４】
また、上記第１の目的を達成するために、本発明に係るポリヌクレオチドは、翻訳開始コドンをコードするアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒト野生型ＭＣＡ遺伝子の翻訳領域の塩基配列において第９２位の塩基がシトシンに置換した塩基配列からなることを特徴とする。
【００３５】
また、上記第１の目的を達成するために、本発明に係る別のポリヌクレオチドは、翻訳開始コドンをコードするアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒト野生型ＭＣＡ遺伝子の翻訳領域の塩基配列において第１２１位の塩基がアデニンに置換した塩基配列からなることを特徴とする。
【００３６】
また、上記第１の目的を達成するために、本発明に係るさらに別のポリヌクレオチドは、翻訳開始コドンをコードするアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒト野生型ＭＣＡ遺伝子の翻訳領域の塩基配列において第９２位の塩基がシトシンに置換し、さらに第１２１位の塩基がアデニンに置換した塩基配列からなることを特徴とする。
【００３７】
なお、上記ポリヌクレオチドは、低妊孕性又は不妊症に関与するものであることが好ましい。
【００３８】
また、本発明に係るポリペプチドは、上述した何れかのポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなることを特徴とする。
【００３９】
上記のポリヌクレオチド又はポリペプチドは、低妊孕性又は不妊症の病態や治療法を研究する上で有用なツールとして利用することができる。
【００４０】
また、上記第２の目的を達成するために、本発明に係る抗体は、上述したポリペプチドと結合し、かつ、ヒト野生型ＭＣＡポリペプチドと結合しないことを特徴とする。
【００４１】
また、上記第２の目的を達成するために、本発明に係る検出方法は、ヒトから採取された生体サンプルを用いて上記ヒトにおいて発現しているＭＣＡポリペプチドの変異を検出する検出方法であって、上述した抗体によってＭＣＡポリペプチドの変異を検出する工程を含んでいることを特徴とする。
【００４２】
また、上記第２の目的を達成するために、本発明に係る別の妊孕性診断キットは、抗ヒトＭＣＡ抗体を含んでいることを特徴とする。
【発明の効果】
【００４３】
以上のように、本発明に係る疾患モデル動物は低妊孕性又は不妊症を呈するので、その個体、細胞、組織及び精巣は、低妊孕性又は不妊症の病態や治療法を研究する上で有用なツールとして利用することができる。
【００４４】
また、本発明に係る生殖細胞生産方法、生殖細胞又は培養細胞によれば、低妊孕性又は不妊のオスの生殖細胞が提供されるので、これを低妊孕性又は不妊症の病態や治療法を研究する上で有用なツールとして利用することができる。
【００４５】
また、ＭＣＡ遺伝子が欠損又は変異し、低妊孕性又は不妊症を呈するヒト男性から得られた細胞、組織及び精巣も、低妊孕性又は不妊症の病態や治療法を研究する上で有用なツールとして利用することができる。
【００４６】
また、本発明に係るポリヌクレオチドは、実際にヒトの不妊症患者に見られる変異を有しているので、本発明に係るポリヌクレオチド又はポリペプチドは、低妊孕性又は不妊症の病態や治療法を研究する上で有用なツールとして利用することができる。
【００４７】
また、本発明に係る妊孕性診断キット、検出方法又は抗体によれば、妊孕可能性の推定及び不妊症の原因の同定を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４８】
本発明の一実施形態について以下に詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定されるものではない。本実施形態では、本発明に係る疾患モデル動物、その生産方法、その利用の順に詳細に説明する。
【００４９】
（１）本発明に係る疾患モデル動物
本発明に係る疾患モデル動物は、低妊孕性又は不妊症を呈するオスの動物であり、正常なＭＣＡタンパク質の発現が低下していることを特徴とする。
【００５０】
疾患モデル動物として用いられる動物の種類としては、ヒト以外の哺乳類（非ヒト哺乳動物）が挙げられる。具体的には、ラット、マウス（Mus musculus, Mus spretusなどのMus属に属する動物）、モルモット、ハムスター、ウサギなどの各種実験動物であり、より好ましくは、ラット及びマウスであり、特に好ましいものとしては、マウスを挙げることができる。これらの動物が好ましい理由は、飼育が容易で、現在までの研究の積み重ねを利用できるからである。次にＭＣＡについて説明する。
【００５１】
マウスＭＣＡの推定アミノ酸配列は２８４残基からなり、ＭＯＲＮモチーフを有している（非特許文献３）。マウスＭＣＡの転写産物は、出生後１４日齢から検出され、主として精巣に発現する。同様に、タンパク質も主として精巣に発現する。組織免疫染色により、タンパク質は、パキテン期の精母細胞から円形精子細胞までの間には細胞質に見られ、さらに、第１及び第２減数分裂期に核膜が消失する間には、Ｍ期の染色体及び紡錘体周辺に局在することが明らかになっている。また、その後の研究により、マウスＭＣＡは精子の鞭毛等に存在することも分かっている。
【００５２】
ＭＣＡはヒトにも存在し、そのアミノ酸配列はマウスのものと７９．８％の同一性を有し、ＭＯＲＮモチーフも保存されている（非特許文献５）。また、ヒトＭＣＡタンパク質は、精子の鞭毛、基底小体及びアクロソームに局在している。以上のことから、ＭＣＡは精子の鞭毛の発達に重要な役割を果たすタンパク質であると考えられている。また、ＭＣＡ遺伝子は、上述したように魚類であるコイや無脊椎動物であるホヤにも有ることから（非特許文献６，７）、哺乳動物全てに保存されていると考えられる。なお、当業者は、必要であればこれらの非特許文献からＭＣＡの詳細について知ることができるので、本明細書ではＭＣＡについての詳細な説明を省略する。
【００５３】
本発明に係る疾患モデル動物は、ＭＣＡタンパク質の発現量の低下に起因して低妊孕性或いは不妊を呈するので、低妊孕性モデル動物又は不妊症モデル動物として、不妊症の病態解明や治療法確立といった様々な用途に利用できる。本発明に係る疾患モデル動物は、特に、ＭＣＡ遺伝子に異常があるヒトの患者に対する有効な治療法を確立するための有用なツールとなる。
【００５４】
なお、本発明に係る疾患モデル動物は、正常なＭＣＡタンパク質が発現しないことが好ましい。これにより、疾患モデル動物が一層確実に低妊孕性又は不妊症を呈するようになる。
【００５５】
また、本発明に係る疾患モデル動物は、ＭＣＡ遺伝子が欠損したオスの非ヒト哺乳動物であってもよい。ＭＣＡ遺伝子が欠損していれば、正常なＭＣＡタンパク質の発現が低下し、モデル動物が低妊孕性又は不妊症を呈するので、低妊孕性や不妊症のモデル動物として好適に用いることができる。
【００５６】
なお、ＭＣＡ遺伝子の欠失は遺伝子全体の一部であってもよいが、正常なＭＣＡタンパク質の発現が著しく低下するように、或いは正常なＭＣＡタンパク質のアミノ酸配列が少なくなるように、上流のエクソン（例えば第１エクソン）が欠失していることが好ましい。もちろん、ＭＣＡ遺伝子の欠損は、双方のアレルにおいて起こっていることが好ましい。
【００５７】
後述する実施例に示すように、ＭＣＡ遺伝子が双方のアレルにおいて欠損し、正常なＭＣＡタンパク質を発現しないＭＣＡホモ欠損マウスは、本発明の疾患モデル動物として特に好ましい。ＭＣＡホモ欠損マウスは、精子の形態が異常であり、それゆえ、精巣内では精母細胞や精子細胞などの生殖細胞の量にほとんど変化はないが、副精巣に精子が全く見られず無精子症になるという興味深い症状を呈する。従って、ＭＣＡホモ欠損マウスは、精子の鞭毛の形態異常等に起因する無精子症を治療する治療薬、例えば精子の形態異常を回復させる薬剤や、精子の鞭毛運動を活性化させる薬剤の開発などに極めて有用である。
【００５８】
なお、哺乳動物において大多数の遺伝子の役割は共通しているため、疾患モデル動物としてマウス以外の他の哺乳動物を用いた場合でも、同様の症状を呈することが予想される。従って、正常なＭＣＡタンパク質を発現しないマウス以外の哺乳動物であっても、低妊孕性や不妊症（詳細には無精子症）のモデル動物として有用である。
【００５９】
また、本発明に係る疾患モデル動物では、ＭＣＡ遺伝子が欠損する代わりに、ＭＣＡ遺伝子に変異が生じていてもよい。もちろん、ＭＣＡ遺伝子の変異は、双方のアレルにおいて起こっていることが好ましい。
【００６０】
（２）本発明に係る疾患モデル動物の作製方法
本発明に係る疾患モデル動物を作製する方法のうち、典型的なものとしては、ジーンターゲッティング技術によりＭＣＡ遺伝子を欠損させる方法が挙げられる。ジーンターゲッティング技術としては公知の手法を用いることができる。この場合、ＭＣＡ遺伝子の全部を欠失させてもよいが、ＭＣＡ遺伝子の一部のエクソン（特に第１エクソン）を欠失させる方法が簡便で好ましい。
【００６１】
ジーンターゲッティング技術により疾患モデル動物（ここではマウス）を作製する方法の一例を述べると次の通りである。まず、薬剤耐性遺伝子カセットの前後に、欠失させたい領域よりも上流の配列、下流の配列がそれぞれ連結されたターゲッティングベクターを作製する。なお、ＭＣＡ遺伝子やその周辺の塩基配列は、当業者であれば必要に応じて公開データベース（ＧｅｎＢａｎｋなど）から入手することができる。そして、このターゲッティングベクターをマウス胚性幹細胞（ＥＳ細胞）に導入し、薬剤を用いてＥＳ細胞をスクリーニングすることにより、相同組換えが起こったＥＳ細胞を選出する。そして、選出したＥＳ細胞を胚盤胞に注入し、キメラマウスを得る。
【００６２】
このキメラマウスにおいて、ＥＳ細胞が生殖細胞に分化すれば、ＭＣＡ遺伝子が片方のアレルにおいて欠損した生殖細胞が増殖するので、キメラマウスを野生型マウスと交配させることにより、ＭＣＡ遺伝子が片方のアレルにおいて欠損したＦ１マウス（以下「ＭＣＡヘテロ欠損マウス」という）を得ることができる。こうして得られるＭＣＡヘテロ欠損マウス同士をさらに交配させることにより、ＭＣＡ遺伝子が両方のアレルにおいて欠損したマウス（以下「ＭＣＡホモ欠損マウス」という）を得ることができる。
【００６３】
以降は、メスのＭＣＡホモ欠損マウスや、オス又はメスのＭＣＡヘテロ欠損マウスを維持しておけば、交配により再びＭＣＡホモ欠損マウスをいつでも容易に得ることができる。従って、ＭＣＡホモ欠損マウスを作製するためのこれらのマウス、すなわち、ＭＣＡ遺伝子の一部又は全部が片方又は両方のアレルにおいて欠失している交配用マウスもまた、本発明に含まれる。
【００６４】
ところで、上記ではマウスを例にとって説明したが、本発明はこれに限定されず、マウス以外の他の哺乳動物であってもよい。マウス以外の他の哺乳動物におけるＭＣＡ遺伝子及びその周辺の塩基配列は、公開されているゲノムデータベースから、マウスやヒトのＭＣＡ遺伝子の塩基配列を用いたホモロジー検索等によって取得することができる。なお、ジーンターゲッティング技術が確立されていない動物を用いて本発明に係る疾患モデル動物を作製する場合には、ゲノムＤＮＡ中にランダムに変異を発生させる公知の手法（例えばＥＮＵミュータジェネシスなど）を用いてもよい。この場合、ＥＮＵ処理などにより標的動物のゲノムＤＮＡに変異を起こさせ、ＭＣＡ遺伝子が欠損している個体をスクリーニングにより選出する。
【００６５】
また、ジーンターゲッティング技術の代わりに、ジーンサイレンシング技術によって本発明に係る疾患モデル動物を作製してもよい。この場合、ＭＣＡを標的とするｓｉＲＮＡを設計・合成し、これを標的となる動物の精巣などに導入すればよい。さらには、トランスジェニック技術を用いて、このｓｉＲＮＡの発現に必要な核酸塩基配列を標的となる動物の染色体に組込み、ＲＮＡｉトランスジェニック動物を作製してもよい。これにより、ｓｉＲＮＡが恒常的に発現し、ＲＮＡｉによるＭＣＡの抑制効果が長期間持続する。
【００６６】
（３）本発明に係る疾患モデル動物の利用（有用性）
本発明に係る疾患モデル動物は、低妊孕性や不妊症（詳細には無精子症）を発症する新規の疾患モデル動物である。無精子症はヒトにおいても数多く報告されているが、現在までに有用なモデル動物は得られていなかった。本発明に係る疾患モデル動物は、低妊孕性や不妊症（特に無精子症）の病態解明や治療法の確立に特に有用である。
【００６７】
本発明に係る疾患モデル動物を素材（或いは実験材料）として見た場合、個体そのものだけでなく、それから単離される細胞や組織、器官等もまた、上述した用途に用いることができる。細胞の単離方法は特に限定されるものではなく、公知の方法を用いることができ、公知の方法で培養することができる。同様に、組織、器官についても公知の方法で摘出することができ、公知の方法で培養することができる。
【００６８】
なお、上記の細胞としては雄性生殖細胞であることが好ましく、分化段階が精母細胞以降の雄性生殖細胞であることがより好ましい。また、上記の器官としては少なくとも精巣を含む雄性生殖器官であることが好ましく、上記雄性生殖器官には精巣に加え副精巣も含まれていることがより好ましい。また、上記組織としては、上記雄性生殖器官に含まれる組織であることが好ましく、精巣に含まれる器官であることがより好ましい。これらの素材は、不妊症の原因究明や治療法の開発に一層適している。
【００６９】
また、上記の細胞、組織及び器官は、マウスであれば出生後１４日齢以降の個体から単離されたものであることが好ましい。ＭＣＡの転写産物は、マウスにおいて出生後１４日齢以降に検出されるので、１４日齢以降のマウスから単離された上記の素材は、低妊孕性又は不妊症になっている状態か、低妊孕性又は不妊症を発症しかけている状態であると考えられる。従って、出生後１４日齢以降の個体から単離された上記の素材は、長期間培養することなく、上述した用途にすぐに用いることができる。
【００７０】
以下では雄性生殖細胞の単離方法の一例について説明する。雄性生殖細胞は、例えばKita K et al., Biol Reprod. 2007 Feb;76(2):211-7. Epub 2006 Oct 25に記載された方法によって単離及び培養することができる。
【００７１】
この方法では、まず、精巣の薄膜を剥離して精細管を露出させる。そして、ＰＢＳ中にコラゲナーゼ・タイプ２（２ｍｇ／ｍｌ）とＤＮＡｓｅ（１０μｇ／ｍｌ）とを含む第１消化液で精巣組織を３７℃２０分間処理する。そして、処理液を遠心して精巣組織を沈殿させ、ＤＭＥＭ（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium）中にコラゲナーゼ・タイプ２（２ｍｇ／ｍｌ）とＤＮＡｓｅ（１０μｇ／ｍｌ）とヒアルロニダーゼ（２ｍｇ／ｍｌ）とを含む第２消化液で精巣組織を３７℃５分間処理する。そして細胞懸濁液をＰＢＳで２度洗浄した後、孔径４０μｍのメッシュフィルターに通すことによって、雄性生殖細胞を回収する。
【００７２】
上記の方法は、マウスやラットに好適な方法の一例であるが、もちろん上記の単離方法に限定されず、細胞を単離する動物に応じて様々な改変を施してもよい。
【００７３】
（４）ヒトの細胞、組織及び精巣
マウスとヒトとでは、殆ど全ての遺伝子が同じ役割を果たすことから、ヒトＭＣＡタンパク質もマウスＭＣＡタンパク質と同様の役割を果たすことが強く示唆される。従って、ヒトにおいてＭＣＡ遺伝子が欠損又は変異し、ＭＣＡタンパク質の発現量が低下したり、ＭＣＡタンパク質が発現しなくなったりすると、マウスと同様に低妊孕性又は不妊症を呈すると考えられる。それゆえ、ＭＣＡ遺伝子が欠損又は変異し、低妊孕性又は不妊症を呈するヒト男性から単離された細胞、精巣の組織及び精巣もまた、マウスのそれらと同様に有用であると考えられる。従って、これらの細胞、精巣の組織、精巣もまた、本発明の範囲に含まれる。もちろん、上記細胞は、生殖細胞であることが好ましい。
【００７４】
上記の細胞、精巣の組織又は精巣は、低妊孕性又は不妊症を呈しているヒト男性患者の中から、遺伝子診断を行うことによってＭＣＡ遺伝子に欠損又は変異が生じている患者を見つけ出し、その患者から細胞、精巣の組織又は精巣を外科的手法により単離することによって取得することができる。なお、患者は、無精子症であることが確認されていることが好ましく、精子の鞭毛や核などに形態異常が認められていることがより好ましい。また、上記の細胞は、患者より摘出した精巣から、上述した非ヒト哺乳動物と同様の方法によって単離してもよい。これらのヒトの細胞、精巣の組織又は精巣もまた、基本的に非ヒト哺乳動物と同様の方法で培養することができる。
【００７５】
（５）疾患モデル細胞
ＭＣＡ遺伝子が欠損し、低妊孕性又は不妊の症状を呈するヒト又は非ヒト哺乳動物の雄性生殖細胞（特に精子細胞及び精子）が低妊孕性や不妊症の研究に重要なツールとなることは既に述べたが、このような生殖細胞は、以下の方法によっても生産することができる。
【００７６】
すなわち、本発明に係る生殖細胞生産方法は、低妊孕性又は不妊の雄性生殖細胞を生産するための生殖細胞生産方法であって、オスの哺乳動物由来の培養細胞又はオスの哺乳動物から単離された細胞である哺乳動物細胞が有するＭＣＡ遺伝子を欠損させる遺伝子欠損工程と、上記遺伝子欠損工程によってＭＣＡ遺伝子が欠損した哺乳動物細胞を生殖細胞へ分化させる分化誘導工程とを含んでいる。なお、上記生殖細胞生産方法において、哺乳動物とは、ヒト及び非ヒト哺乳動物の双方を含む。
【００７７】
上記遺伝子欠損工程において、ＭＣＡ遺伝子を欠損させる対象となる細胞としては、培養細胞の場合、ヒト又はマウス由来のオスのＥＳ細胞を用いることが好ましい。ＥＳ細胞は全能性を有しているため、生殖細胞にも容易に分化させることができる。以下では、オスのＥＳ細胞を用いた例について説明する。
【００７８】
まず、遺伝子欠損工程では、上述したジーンターゲッティング技術により、オスのＥＳ細胞が有するＭＣＡ遺伝子を欠損させることができる。このとき、ＭＣＡ遺伝子を双方のアレルにおいて欠損させたい場合は、片方のアレルにおいてＭＣＡ遺伝子が欠損しているＥＳ細胞に対し、上述したターゲッティングベクターの導入及びスクリーニングをさらに行えばよい。
【００７９】
そして、分化誘導工程では、ＭＣＡ遺伝子が欠損したＥＳ細胞を、例えばNayernia et al., Developmental Cell, 2006, 11, 125-132などに記載されている方法によって、生殖細胞（精原細胞や配偶子）へと分化させることができる。この方法では、Ｓｔｒａ８遺伝子のプロモーター、プロタミン１遺伝子のプロモーターにそれぞれレポーター遺伝子（緑色蛍光タンパク質や赤色蛍光タンパク質の遺伝子）を連結したコンストラクトをマウスＥＳ細胞に導入し、ＥＳ細胞を分化させつつ、生殖細胞系列に分化したもののみをＦＡＣＳで選別する。なお、この文献ではマウスについて記載されているが、ヒトについても同様の手法で分化誘導できることが予想される。
【００８０】
なお、上記では、ＥＳ細胞を用いた例について説明したが、ＥＳ細胞の代わりに多能性を有する各種幹細胞や分化細胞を用いてもよい。これらの幹細胞や分化細胞は、株化された培養細胞であってもよいし、ヒトや非ヒト哺乳動物から得られた初代培養細胞であってもよい。これらの細胞についても、上述したジーンターゲッティング技術を用いてＭＣＡ遺伝子を欠損させることができる。そして、ＭＣＡ遺伝子を欠損させたこれらの細胞を一旦脱分化させて未分化状態にし、その後生殖細胞へと分化させることによっても、低妊孕性又は不妊の雄性生殖細胞を得ることができる。
【００８１】
以上のようにして、ＭＣＡ遺伝子が欠損し、低妊孕性又は不妊を呈するヒト又はマウスの雄性生殖細胞を得ることができる。このようにして得られる雄性生殖細胞もまた、本発明に係る疾患モデル動物から得られた生殖細胞と同様の形質を示し、低妊孕性や不妊症を研究する際の有用なツールになると考えられる。
【００８２】
以上に述べたように、（ｉ）オスの非ヒト哺乳動物の生殖細胞であって、ＭＣＡ遺伝子が欠損し、低妊孕性又は不妊を呈する生殖細胞や、（ｉｉ）ヒト男性由来の培養細胞であって、ＭＣＡ遺伝子が欠損し、低妊孕性又は不妊を呈する生殖細胞である培養細胞は、様々な方法で生産することができるが、生産方法に関らずこれらの細胞は本発明の範囲に含まれる。
【００８３】
（６）治療薬の候補化合物のスクリーニング方法又は候補化合物の薬理作用の評価方法
次に、本発明に係る疾患モデル動物の具体的な利用例について説明する。
【００８４】
＜利用例１：薬剤のスクリーニング方法＞
本発明に係る疾患モデル動物の代表的な利用例としては、不妊症治療薬の候補化合物のスクリーニングへの利用を挙げることができる。本発明に係る疾患モデル動物では、精子の鞭毛異常に起因する無精子症を発症しているため、無精子症の治療薬のスクリーニングに好適に用いることが可能である。
【００８５】
スクリーニング方法の具体的な構成は特に限定されるものではなく、公知の手法を好適に用いることができる。具体的には、本発明に係るスクリーニング方法は、（ａ）本発明に係る疾患モデル動物に対して候補化合物を投与する工程と、（ｂ）候補化合物を投与した疾患モデル動物における不妊症（詳細には無精子症や精子の形態異常）の症状の変化を評価する工程と、（ｃ）評価結果に基づいて疾患モデル動物の不妊症（詳細には無精子症や精子の形態異常）を緩和する化合物を選択する工程とを含んでいてもよい。もちろん、必要に応じて他の工程を含めてもよい。
【００８６】
＜利用例２：薬理作用の評価方法＞
本発明に係る疾患モデル動物は、不妊症治療薬の候補化合物の薬理作用の評価の際にも利用することができる。すなわち、上記スクリーニング方法又は他の方法で候補化合物が見出されたとしても、その候補化合物が実用に耐え得るか否かを評価する必要があるが、本発明に係る疾患モデル動物はそのような用途にも好適に用いることができる。
【００８７】
評価方法の具体的な構成は特に限定されるものではなく、公知の手法を好適に用いることができる。具体的には、例えば、（ａ）本発明に係る疾患モデル動物に候補化合物を投与し、（ｂ）候補化合物を投与した疾患モデル動物における不妊症（詳細には無精子症や精子の形態異常）の症状の変化を観察し、薬理作用の有効性や副作用の有無等を確認するという各工程を経ればよい。また、必要に応じて他の工程を含めてもよい。
【００８８】
なお、上記利用例１・２ともに、本発明に係る疾患モデル動物の個体を用いてもよいし、必要に応じてこの個体から単離した細胞、組織又は器官等を用いてもよい。また、上述したヒトＭＣＡ欠損患者から単離した細胞、組織又は器官を用いてもよいし、ジーンターゲッティング技術などによりＩｎ Ｖｉｔｒｏで生産され、ＭＣＡ遺伝子の欠損した生殖細胞を用いてもよい。ヒトの細胞、組織又は器官を用いることによって、候補化合物のスクリーニング及び薬理作用の評価は一層信頼できるものとなる。
【００８９】
なお、非ヒト哺乳動物やヒトの精子を用いて上述した候補化合物のスクリーニング又は薬理作用の評価を行う場合、精子の形態異常が回復するか否かに基づいて評価を行ってもよいが、精子の運動能が向上するか否かに基づいて評価を行ってもよい。
【００９０】
このように、本発明に係る疾患モデル動物（若しくはその細胞、組織、器官）、又は、ヒトＭＣＡ欠損患者から単離した細胞、組織若しくは器官、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏで生産した生殖細胞などを用いてスクリーニングされ、評価された化合物を主成分とすれば、不妊症（特に精子の形態異常に起因する無精子症）の治療及び／又は予防用医薬組成物を製造することが可能になる。
【００９１】
（７）本発明に係る検出方法及び妊孕性診断キット
上述したように、ＭＣＡ遺伝子の欠損又は変異は、ヒトにおいても低妊孕性又は不妊症の原因になると考えられる。従って、被験者から生体サンプルを採取し、この生体サンプルを用いて被験者のＭＣＡ遺伝子に欠損又は変異があるか否かを調べることにより、妊孕可能性の推定及び不妊症の原因の同定が可能になる。
【００９２】
すなわち、本発明に係る検出方法は、ヒトから採取された生体サンプルを用いて上記ヒトにおける遺伝子の欠損又は変異を検出する検出方法であって、ヒトＭＣＡ遺伝子の欠損又は変異の有無を検出する工程を含んでいることを特徴とする。
【００９３】
また、本発明に係る妊孕性診断キットは、上記検出方法に用いられる試薬を含んでいる。なお、妊孕性診断キットには、使用方法が記載された取扱説明書が含まれていてもよい。
【００９４】
被験者から採取する生体サンプルは特に限定されず、例えば血液や頬の内側の粘膜などを挙げることができる。また、ヒトＭＣＡ遺伝子の欠損又は変異を検出する方法としては特に限定されず、公知の各種手法、例えば、サンガー法を基礎とする塩基配列決定法、インベーダー法、ＳＭＭＤ法（simultaneous multiple mutation detection system）、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法、ＭＡＳＡ法、塩基伸長法、Ｔａｑｍａｎプローブ法や、それらを改変した方法などを用いることができる。
【００９５】
ヒトＭＣＡ遺伝子及びその周辺の塩基配列は、例えばＮＣＢＩヒトゲノムリソース（NCBI Human Genome Resources: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/human/）から当業者であれば容易に入手することができる。なお、ＮＣＢＩヒトゲノムリソースにおいて、ＭＣＡはＴＳＧＡ２とも称される。ヒトＭＣＡ遺伝子の欠損又は変異を検出するためのプライマーやプローブなどは、ヒトＭＣＡ遺伝子及びその周辺の塩基配列を基に設計することができる。
【００９６】
上記検出方法又は妊孕性診断キットによってＭＣＡ遺伝子に変異が見出された場合、その被験者は、妊孕可能性が低いと推定される。また、被験者が不妊症患者であれば、その原因がＭＣＡ遺伝子の欠損又は変異であることが分かる。従って、そのような被験者に対して適切な処置を施すことにより、早期に疾患を治癒することができる。つまり、本発明の検出方法は、妊孕可能性の推定及び不妊症の原因の同定を目的とした診断方法ともいえる。
【００９７】
配列番号８は、ジーンバンク（GenBank）にアクセッション番号AB006536で登録されている野生型ヒトＭＣＡ遺伝子の転写産物の塩基配列の中から、翻訳領域のみを抽出したものである。配列番号８に示すように、野生型ヒトＭＣＡ遺伝子は、９３０ｂｐからなる翻訳領域を有している。また、配列番号９は、野生型ヒトＭＣＡタンパク質の推定アミノ酸配列を示すものである。
【００９８】
野生型ヒトＭＣＡタンパク質は、上述したように、成熟した男性の精巣の生殖細胞において特に強く発現することが報告されている。図８は、野生型ヒトＭＣＡ遺伝子の構造を示す模式図である。ヒトゲノムプロジェクトによって構築されたヒトゲノムリソースによれば、ヒトＭＣＡ遺伝子は、ヒト２１番染色体長腕に位置している。この遺伝子の転写産物は約１．４ｋｂである。
【００９９】
本願発明者らは、後述する実施例に示す調査の結果、男性不妊症患者からなる集団の中に、配列番号８に示すヒトＭＣＡ遺伝子の翻訳領域における第９２位のアデニン（以下、単に「Ａ」という）が片方のアレルにおいてシトシン（以下、単に「Ｃ」という）に置換している患者、および、第１２１位のグアニン（以下、単に「Ｇ」という）が片方のアレルにおいてＡに置換している患者がいることを見出した。一方、この第９２位および第１２１位の塩基置換は、妊孕性が確認されている男性からなる集団では全く見られなかった。なお、これらの置換部位は、図８に示すようにいずれもＭＣＡ遺伝子の第２エクソン内にある。
【０１００】
ヒトＭＣＡ遺伝子に上記の置換変異が起こると、元々ヒスチジン、グリシンをコードしていたこれらの部位がプロリン、アルギニンをコードするようになるため、正常なタンパク質が発現しなくなってしまう。それゆえ、ヒトＭＣＡ遺伝子の上記第９２位および第１２１位における置換変異は、たとえ片方のアレルのみに起こっている場合であっても、正常なＭＣＡタンパク質の翻訳量が低下することにより、或いは、変異型ＭＣＡタンパク質がドミナントネガティブに作用することにより、不妊症を引き起こす可能性が高いと推測される。
【０１０１】
以上のことから、本発明に係る検出方法は、被験者（ヒト）から採取された生体サンプル（血液や頬の内側の粘膜など）に含まれるゲノムＤＮＡ、または、被験者の生体サンプルから単離されたゲノムＤＮＡにおいて、ヒトＭＣＡ遺伝子の機能欠損を引き起こす変異の有無を検出する工程を含んでいる。
【０１０２】
また、本発明に係る妊孕性診断キットは、被験者から採取された生体サンプルに含まれるゲノムＤＮＡ、または、被験者の生体サンプルから単離されたゲノムＤＮＡにおいて、ヒトＭＣＡ遺伝子の機能欠損を引き起こす変異の有無を検出する試薬を含んでいる。
【０１０３】
上記検出方法及び妊孕性診断キットは、ヒトＭＣＡ遺伝子の機能欠損を引き起こす変異の有無を検出するものであれば、その態様は特に限定されるものではない。例えば、検出方法及び妊孕性診断キットは、被験者のヒトＭＣＡ遺伝子に、該遺伝子の機能欠損を引き起こす変異が含まれていることを検出するものであってもよいし、被験者のヒトＭＣＡ遺伝子に、該遺伝子の機能欠損を引き起こす変異が含まれていないことを検出するものであってもよい。
【０１０４】
例えば、上記変異の存在を検出するものである場合、上記検出方法および妊孕性診断キットは、上記の機能欠損を引き起こす変異が少なくとも一方のアレルにおいて起こっていることを検出できればよい。一方、上記変異の非存在を検出するものである場合、上記検出方法および妊孕性診断キットは、上記の機能欠損を引き起こす変異が双方のアレルにおいて起こっていないことを検出することが好ましい。
【０１０５】
上記検出方法又は妊孕性診断キットにより、上記変異の有無を調べ、その結果、変異が検出されなかった場合は、妊孕性に問題がない可能性が高いと推定できる。また、被験者が不妊症患者である場合は、不妊症の原因が、ＭＣＡ遺伝子の機能欠損以外のものによる可能性が高いと判定できる。
【０１０６】
一方、変異が検出された場合は、低妊孕性又は不妊症でない可能性が高いと推定できる。また、被験者が不妊症患者である場合は、不妊症の原因がＭＣＡ遺伝子の機能欠損による可能性が高いと判定できる。よって、この場合は、ＴＥＳＥ−ＩＣＳＩ（Testicular sperm extraction - Intracytoplasmic sperm injection；精巣生検−顕微授精）などの現存の治療法の適格な選択を提示することができる。
【０１０７】
このように、上記検出方法及び妊孕性診断キットによれば、妊孕可能性の推定及び不妊症の原因の同定を行うことができる。すなわち、上記検出方法又は妊孕性診断キットによれば、不妊症の診断を行う上で有用な情報が提供される。それゆえ、上記検出方法における変異の有無を検出する工程は、低妊孕性又は不妊症の診断方法において用いられることが好ましいといえる。
【０１０８】
なお、上記検出方法および妊孕性診断キットは、翻訳開始コドンをコードするアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒトＭＣＡ遺伝子の翻訳領域の上記の第９２位および第１２１位のうちの少なくとも一方の塩基の置換変異の有無を検出することが好ましい。
【０１０９】
さらに、上記検出方法及び妊孕性診断キットは、ヒトＭＣＡ遺伝子の上記の第９２位の塩基がシトシンに置換していること、或いは、上記の第１２１位の塩基がアデニンに置換していることを検出するものであることが好ましい。このように、変異を検出する箇所や検出する変異の種類を絞ることにより、低妊孕性又は不妊症の原因となる変異の有無を効率よく調べることができる。
【０１１０】
ただし、上記の第９２位または第１２１位の置換変異以外であっても、ヒトＭＣＡ遺伝子に起こった変異（置換変異、挿入変異および欠失変異を含む）は、不妊症を引き起こす可能性が高いと推測されるので、本発明は、上記の第９２位または第１２１位の置換変異を検出するものに限定されない。
【０１１１】
一実施形態において、上記検出方法及び妊孕性診断キットは、ヒトＭＣＡ遺伝子内の領域のうち、上記の第９２位および第１２１位のうちの少なくとも一方（以下、「変異検出部位」という）の塩基を含む領域の塩基配列を決定することにより、上記の置換変異の有無を検出するものであってもよい。塩基配列の決定には、サンガー法やこれを応用した公知の各種手法を用いることができる。
【０１１２】
この場合、妊孕性診断キットには、ヒトＭＣＡ遺伝子の上記の変異検出部位を含む領域を増幅させるために、変異検出部位を挟むようにして設計されたプライマーの組が含まれることが好ましい。このプライマーの組には、より詳細には、ヒトＭＣＡ遺伝子の変異検出部位よりも上流の塩基配列の一部または全部を有するプライマーと、ヒトＭＣＡ遺伝子の変異検出部位よりも下流の塩基配列の一部又は全部と相補的な塩基配列を有するプライマーとが含まれる。
【０１１３】
被験者から採取された生体サンプルに含まれるゲノムＤＮＡを鋳型として上記のプライマーの組を用いてＰＣＲ（polymerase chain reaction）を行えば、ヒトＭＣＡ遺伝子の変異検出部位の塩基を含む領域がＤＮＡフラグメントとして増幅され、さらに、上記のプライマーの組の一方又は両方のプライマーを用いて塩基配列の決定を行えば、置換変異の有無を確実かつ簡便に検出することができる。塩基配列の決定は、例えばＡＢＩ−ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Applied Biosystems Inc.）などを取扱説明書に従って使用することにより、簡単に実施することができる。なお、塩基配列の決定に用いられるプライマーは、ＤＮＡフラグメントの増幅のためのＰＣＲに用いられるプライマーとは別のものであってもよい。
【０１１４】
なお、それぞれのプライマーは、ＭＣＡ遺伝子又はその周辺と同一の塩基配列、或いは相補的な塩基配列を少なくとも１０塩基以上有することが好ましく、１５塩基以上有することがより好ましく、１８塩基以上有することがさらに好ましく、２０塩基以上有することが特に好ましい。ＭＣＡ遺伝子又はその周辺と同一の（或いは相補的な）塩基配列の長さを長くすることにより、ＭＣＡ遺伝子の第９２位および第１２１位のうちの少なくとも一方を含む目的の領域のみを確実に増幅させることができる。
【０１１５】
また、上記のプライマーの組は、互いのプライマーによって挟まれる領域の長さが５ｋｂ以下であることが好ましく、３ｋｂ以下であることがより好ましく、２ｋｂ以下であることがさらに好ましく、１．５ｋｂ以下であることが特に好ましい。互いのプライマーによって挟まれる領域の長さを短くすることによって、上記の変異検出部位の塩基を含む領域の増幅を効果的に行うことができる。
【０１１６】
また、塩基配列の決定に用いるプライマーは、上記の変異検出部位の塩基から２ｋｂ以内の位置に設定されることが好ましく、１．５ｋｂ以内の位置に設定されることが好ましく、１．０ｋｂ以内の位置に設定されることがより好ましく、０．７ｋｂ以内の位置に設定されることが特に好ましい。上記の構成により、塩基配列の決定を正確に行うことができる。
【０１１７】
さらに、塩基配列の決定に用いるプライマーは、上記の変異検出部位の塩基から２０ｂｐ以上離れた位置に設定されることが好ましく、３０ｂｐ以上離れた位置に設定されることがより好ましく、４０ｂｐ以上離れた位置に設定されることがさらに好ましく、５０ｂｐ以上離れた位置に設定されることが特に好ましい。また、上記プライマーの組は、ヒトＭＣＡ遺伝子の変異検出部位の塩基を含む２０ｂｐ以上の領域を増幅させるものであることが好ましい。プライマーの近傍は、塩基配列の決定結果が不正確になる傾向にあるが、上記の構成により、塩基配列の決定を正確に行うことができる。
【０１１８】
上記のプライマーの組としては、例えば、それぞれ配列番号１６，１７に示す塩基配列からなるプライマー（図１のＭＣＡ−Ｐ３及びＭＣＡ−Ｐ４Ｒ）を用いることができるが、本発明に用いることのできるプライマーの塩基配列がこの配列に限定されないことはいうまでもない。ヒトＭＣＡ遺伝子の塩基配列及びその周辺の塩基配列は、当業者であれば上述したヒトゲノムリソースやジーンバンク（GenBank）から容易に入手することができるので、入手した塩基配列を基に、Ｏｌｉｇｏ（登録商標、National Bioscience Inc.）又はＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウェア開発）などを用いてプライマーを設計することができる。
【０１１９】
各プライマーは、例えばホスホロアミダイト法などの公知の方法によって合成することができ、例えばApplied Biosystems Inc.の３９２型シンセサイザーなどを取扱説明書に従って使用することによって簡単に合成することができる。
【０１２０】
なお、上記の各プライマーには、蛍光標識が付されていてもよい。プライマーに蛍光標識が付されている場合、ダイプライマー法によって、放射性同位元素を用いることなく増幅領域の塩基配列を決定することができる。
【０１２１】
一方、各プライマーに蛍光標識が付されていない場合、ダイターミネータ法によって塩基配列を決定することができる。この場合、上記妊孕性診断キットには、上記のプライマーの組に加えて、Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃの各単量体からなるデオキシリボ核酸、蛍光標識されＡ，Ｔ，Ｇ，Ｃの各単量体からなるジデオキシリボ核酸（所謂ダイターミネータ）、及びポリメラーゼなどがさらに含まれていてもよい。
【０１２２】
一実施形態において、上記検出方法及び妊孕性診断キットは、ヒトＭＣＡ遺伝子の上記の変異検出部位における塩基の置換変異の有無をインベーダー法によって検出するものであってもよい。インベーダー法の詳細については、Ｌｙａｍｉｃｈｅｖらによる論文（Lyamichev V et al., Nat biotechnol. 17, 292, 1999）に記載されており、本明細書ではこれを援用する。
【０１２３】
図９は、インベーダー法の原理を説明する模式図である。インベーダー法では、非蛍光標識プローブのインベーダープローブ２及びシグナルプローブ３と、蛍光標識プローブのフレットプローブ５とが用いられる。
【０１２４】
インベーダープローブ２は、ターゲット遺伝子１と相補的な塩基配列を有し、かつ、３’末端の塩基がターゲット遺伝子１の変異（又は一塩基多型）検出部位１ａと対応するように設計される。一方、シグナルプローブ３は、ターゲット遺伝子１とは無関係な塩基配列であるフラップ３ｂと、ターゲット遺伝子１と相補的な塩基配列を有し、かつ、５’末端の塩基がターゲット遺伝子１の変異（又は一塩基多型）検出部位１ａに対応するように設計されたヌクレオチド３ａとが連結したものである。ここで、フラップ３ｂは、ヌクレオチド３ａの５’末端側に連結されている。
【０１２５】
このように設計されたプローブ２・３をターゲット遺伝子１とハイブリダイゼーションさせると、変異検出部位１ａでは、ターゲット遺伝子１、インベーダープローブ２及びシグナルプローブ３が３重鎖を形成する。すると、フラップエンドヌクレアーゼ（「クリアベース（cleavase）」ともいう）４がこの３重鎖を認識し、シグナルプローブ３を３重鎖の３’側で切断する。その結果、フラップ３ｂと変異検出部位とが連結したフラップ遊離体３ｃが生成される。
【０１２６】
フレットプローブ５は、５’末端側が自身とハイブリダイゼーションでき、かつ、３’末端側がフラップ３ｂとハイブリダイゼーションできるヌクレオチド５ａと、蛍光色素５ｂと、クエンチャー（発光抑制体）５ｃとからなる。ここで、ヌクレオチド５ａは、５’末端がフラップ遊離体３ｃの変異検出部位と相補的な塩基配列となっている。また、蛍光色素５ｂは、ヌクレオチド５ａの５’末端に結合している。ただし、フレットプローブ５においては、クエンチャー５ｃにより蛍光色素５ｂの蛍光が抑制されている。
【０１２７】
このようなフレットプローブ５に対してフラップ遊離体３ｃがハイブリダイゼーションすると、フラップ遊離体３ｃの変異検出部位について、再び３重鎖が形成される。その結果、上述のフラップエンドヌクレアーゼ４がこの３重鎖を再び認識し、フレットプローブ５の５’末端部分が切断される。その結果、フレットプローブ５の５’末端に結合していた蛍光色素５ｂが遊離し、蛍光が生じる。
【０１２８】
従って、妊孕性診断キットがインベーダー法により上記の置換変異の有無を検出するものである場合、妊孕性診断キットには、インベーダープローブ２、シグナルプローブ３及びフレットプローブ５などが含まれることが好ましい。
【０１２９】
置換変異が有る場合に蛍光が生じるようにする場合、インベーダープローブ２は、ヒトＭＣＡ遺伝子と相補的な塩基配列を有し、かつ、３’末端の塩基が変異型ＭＣＡ遺伝子の上記の第９２位の塩基（Ｃ）又は第１２１位の塩基（Ａ）と対応するように設計される。また、シグナルプローブ３のヌクレオチド３ａは、ヒトＭＣＡ遺伝子と相補的な塩基配列を有し、かつ、５’末端の塩基が変異型ＭＣＡ遺伝子の上記の第９２位の塩基（Ｃ）又は第１２１位の塩基（Ａ）と対応するように設計される。そして、フレットプローブ５は、上記インベーダープローブ２及び上記シグナルプローブ３が変異型ＭＣＡ遺伝子とハイブリダイズして３重鎖構造が形成された場合にフラップエンドヌクレアーゼ４によって切断されるフラップ遊離体３ｃを検出できるように設計される。
【０１３０】
上記の構成により、被験者のＭＣＡ遺伝子の上記の第９２位又は第１２１位の塩基が置換している場合は、ヌクレオチド３ａの３’末端とインベーダープローブ２の５’末端とがオーバーラップすることにより３重鎖が形成されて蛍光が生じる。一方、被験者のＭＣＡ遺伝子が野生型である場合は、インベーダープローブ２の末端部分で３重鎖が形成されないので蛍光が生じない。
【０１３１】
また、上記の例では、被験者の有するＭＣＡ遺伝子が置換変異型の場合に蛍光が生じる構成としたが、本発明はこれに限定されず、被験者の有するＭＣＡ遺伝子が野生型の場合に蛍光が生じ、置換変異型の場合に蛍光が抑制される構成としてもよく、様々に改変することができる。
【０１３２】
一実施形態において、上記検出方法及び妊孕性診断キットは、ヒトＭＣＡ遺伝子の上記変異検出部位における塩基の置換変異の有無をＳＭＭＤ法によって検出するものであってもよい。ＳＭＭＤ法の詳細については、Ｗａｋａｉらによる論文（Wakai J et al., Nucleic Acids Res., 2004. 32(18), e141.）に記載されており、本明細書ではこれを援用する。
【０１３３】
図１０は、ＳＭＭＤ法の原理を説明する模式図である。なお、この図は、ヒトＭＣＡ遺伝子における変異のうち、上記の第９２位の塩基の置換変異の有無を検出する場合の例を示している。ＳＭＭＤ法は、電気化学的反応を利用して一塩基多型、置換変異、欠失変異、又は挿入変異などを検出するものである。まず、図１０に示すように、被験者のゲノムＤＮＡ１１を鋳型として変異検出部位を含む領域をＰＣＲによって増幅させるため、カウンタープライマー１３と特別プライマー１２とを１：４の割合で用いて非対称ＰＣＲを行う（工程Ａ）。ここで、特別プライマー１２は、変異を検出したい遺伝子１１の変異検出部位１１ａよりも下流の領域と相補的な塩基配列からなるオリゴマー１２ａと、タグ１２ｂとからなる。タグ１２ｂは、遺伝子１１の変異検出部位１１ａよりも１塩基下流の塩基から、オリゴマー１２ａがハイブリダイゼーションする塩基よりも１塩基上流の塩基までの領域と相補的な塩基配列を有しており、オリゴマー１２ａの５’末端に連結されている。
【０１３４】
上記の非対称ＰＣＲの結果、工程Ｂに示すＰＣＲ産物１４が生成される（工程Ｂ）。このＰＣＲ産物１４のうち、特別プライマー１２を含む一本鎖の非対称ＰＣＲ産物１４は、タグ１２ｂを含んでいるため、自己ループを形成して特別ターゲットを形成する（工程Ｃ・Ｄ）。
【０１３５】
次に、変異型プローブ２０及び野生型プローブ３０を用意する。プローブ２０・３０は、ともに、変異を検出したい遺伝子１１と同一の塩基配列を有し、かつ、変異検出部位１１ａ・１１ｂを３’末端とするオリゴマーをその５’末端側で金電極２５に固定したものである。ここで、変異型プローブ２０はオリゴマーの３’末端が変異型の塩基（Ｃ）となっているのに対して、野生型プローブ３０はオリゴマーの３’末端が野生型の塩基（Ａ）となっている。これらの変異型プローブ２０及び野生型プローブ３０は、オリゴマーが上述した特別ターゲット１５の３’末端側と相補的な塩基配列を有しているため、特別ターゲット１５とハイブリダイゼーションすることができる。なお、金電極２５にオリゴマーを固定するための詳細な方法は、Ｔａｋｅｎａｋａらによる論文（Takenaka S et al., Anal Chem., 2000, 72, 1334-1341）に記載されており、本明細書ではこれを援用する。
【０１３６】
プローブ２０・３０を特別ターゲット１５とハイブリダイゼーションさせる前に、フェロセニルナフタレンジイミド（ferrocenylnaphtalene diimide；以下「ＦＮＤ」と略称する）を含む溶液中で、予めバックグラウンド応答を行い、電流Ｉ０を測定しておく（工程Ｅ）。
【０１３７】
そして、特別ターゲット１５と変異型プローブ２０及び野生型プローブ３０とのハイブリダイゼーション及びライゲーションを行う。ここで、特別ターゲット１５が変異型のものである場合（すなわち、被験者が変異型遺伝子を有している場合）、特別ターゲット１５は変異型プローブ２０と塩基配列が完全に一致するのでライゲーションが行われる一方で、野生型プローブ３０とは塩基配列が末端部分で相違するのでライゲーションが行われない（工程Ｆ）。
【０１３８】
その後、変性処理を行うと、野生型プローブ３０と変異型の特別ターゲット１５との組では、野生型プローブ３０から変異型特別ターゲット１５が解離する。一方、変異型プローブ２０と変異型の特別ターゲット１５との組では、ライゲーションが行われているので、解離が起こらない（工程Ｇ）。
【０１３９】
そして、それぞれのサンプルを洗浄して余剰のＤＮＡを除去し、ＦＮＤを添加して、ＦＮＤ分子の電気化学的電流Ｉ１を測定する（工程Ｈ）。ここで、２本鎖ＤＮＡを有する電極では、１本鎖ＤＮＡを有する電極に比べて電流Ｉ１が大きくなる（工程Ｉ）。
【０１４０】
これにより、被験者のゲノムＤＮＡが変異型であるか野生型であるかを測定した電流値に基づいて判定することができる。なお、ＳＭＭＤ法では、上記の変異型プローブ２０及び野生型プローブ３０をＥＣＡ（Electrochemical array）チップとしてアレイ状に形成することにより、多数の変異を同時進行的に検出することができる。
【０１４１】
従って、本発明に係る妊孕性診断キットがＳＭＭＤ法により上記の置換変異の有無を検出するものである場合、妊孕性診断キットには、特別プライマー１２、カウンタープライマー１３、変異型プローブ２０及び野生型プローブ３０などが含まれていることが好ましい。なお、変異型プローブ２０及び野生型プローブ３０は、何れか一方のみでもよい。
【０１４２】
上記特別プライマー１２は、ヒトＭＣＡ遺伝子の変異検出部位よりも下流の所定領域と相補的な塩基配列からなるオリゴマー１２ａと、タグ１２ｂとからなる。タグ１２ｂは、ヒトＭＣＡ遺伝子の変異検出部位から、オリゴマー１２ａがハイブリダイゼーションする部位までの領域と相補的な塩基配列を有しており、オリゴマー１２ａの５’末端に連結される。一方、上記カウンタープライマー１３は、ヒトＭＣＡ遺伝子の変異検出部位よりも上流の所定領域と同一の塩基配列からなる。
【０１４３】
また、上記変異型プローブ２０は、ヒト変異型ＭＣＡ遺伝子と同一の塩基配列からなり、かつ、上記の第９２位の塩基（Ｃ）または第１２１位の塩基（Ａ）が３’末端になるオリゴマーを有するように設計される。また、上記野生型プローブ３０は、ヒト野生型ＭＣＡ遺伝子と同一の塩基配列からなり、かつ、上記の第９２位の塩基（Ａ）または第１２１位の塩基（Ｇ）が３’末端になるオリゴマーを有するように設計される。
【０１４４】
上記の構成によれば、被験者のＭＣＡ遺伝子が置換変異型の場合、特別ターゲット１５は、変異型プローブ２０とライゲーションできるが、野生型プローブ３０とはライゲーションできない。一方、被験者のＭＣＡ遺伝子が野生型の場合、特別ターゲット１５は、野生型プローブ３０とライゲーションできるが、変異型プローブ２０とはライゲーションできない。
【０１４５】
なお、上記の各方法において、ＭＣＡ遺伝子のセンス鎖（コドンをコードする側の鎖）を調べることによって置換変異の有無を判定する構成について詳細に説明したが、アンチセンス鎖を調べることによっても同様に判定することができるのはいうまでもない。
【０１４６】
（８）本発明に係る検出方法及び妊孕性診断キットの変形例
上記では、ヒトから採取したサンプルのゲノムＤＮＡを調べることによって妊孕可能性の推定および不妊症の原因の同定を行ったが、タンパク質レベルでも同様に妊孕可能性の推定および不妊症の原因の同定を行うことは可能である。
【０１４７】
すなわち、一実施形態において、本発明に係る検出方法および妊孕性診断キットは、ヒトにおいて正常なヒトＭＣＡタンパク質が発現しているか否かを判定するものであってもよい。より具体的には、上記検出方法は、ヒトＭＣＡタンパク質と結合する抗ヒトＭＣＡ抗体を用いて、ヒトから採取された生体サンプル中にヒトＭＣＡタンパク質が発現しているか否かを判定する工程を含んでいてもよい。また、上記妊孕性診断キットは、試薬として抗ヒトＭＣＡ抗体を含んでいてもよい。
【０１４８】
上記検出方法および妊孕性診断キットにおいて、抗ヒトＭＣＡ抗体を用いてヒトＭＣＡタンパク質の発現の有無を判定する手法は特に限定されず、公知のウェスタンブロッティングおよびＥＬＩＳＡ（Enzyme-linked Immunosorbent Assay）などが挙げられる。また、ヒトから採取する生体サンプルとしては、精巣生検によって被験者から採取した精巣内の組織（例えば精細管）、精子細胞または精漿などが挙げられる。精漿は、たとえ精子細胞を含んでいなくても、精子細胞が破壊などされることにより放出された、精子細胞で発現するタンパク質を含んでいると考えられている。また、抗ヒトＭＣＡ抗体としては、例えば上述した非特許文献３に開示されたポリクローナル抗体などを用いることができる。上記文献のポリクローナル抗体は、マウスの抗原を用いて作製したものであるが、ヒトＭＣＡタンパク質と結合することも確認されている。もちろん、それ以外の抗ヒトＭＣＡ抗体を用いてもよい。
【０１４９】
妊孕性診断キットがウェスタンブロッティングまたはＥＬＩＳＡを利用するものである場合、妊孕性診断キットには、抗ヒトＭＣＡ抗体に加えて、発色反応に必要なペルオキシダーゼなどの特異的酵素で標識した抗グロブリン抗体が含まれていてもよい。
【０１５０】
抗ヒトＭＣＡ抗体を用いてヒトＭＣＡタンパク質が発現しているか否かを調べ、被験者においてヒトＭＣＡタンパク質が発現していないと判定された場合は、ヒトＭＣＡ遺伝子が欠失または変異していることが示唆され、同時に、その被験者は、妊孕可能性が低い、あるいは不妊症の可能性が高いと推定することができる。また、被験者が不妊症の場合には、不妊症の原因が正常なヒトＭＣＡタンパク質が発現していないことによるものと推定することができる。
【０１５１】
また、他の実施形態において、本発明に係る検出方法および妊孕性診断キットは、上述した第９２位および第１２１位のうちの少なくとも一方の塩基置換を含むヒト変異型ＭＣＡ遺伝子によってコードされるヒト変異型ＭＣＡタンパク質と結合し、かつ、ヒト野生型ＭＣＡタンパク質と結合しない抗体を用いて、ヒトから採取された生体サンプル中にヒト変異型ＭＣＡタンパク質が発現しているか否かを判定するものであってもよい。この場合に用いられる抗体の詳細については後述する。
【０１５２】
上記抗体を用いてヒト変異型ＭＣＡタンパク質が発現しているか否かを調べ、被験者においてヒト変異型ＭＣＡタンパク質が発現していると判定された場合は、ヒトＭＣＡ遺伝子に上述した置換変異が生じていることが強く示唆され、同時に、その被験者は、妊孕可能性が低い、あるいは不妊症の可能性が高いと推定することができる。また、被験者が不妊症の場合は、不妊症の原因がヒトＭＣＡ遺伝子の異常に起因していると推定することができる。
【０１５３】
（９）本発明に係るポリヌクレオチド、ポリペプチド、発現ベクター及び発現キット
次に、本発明に係るポリヌクレオチドについて説明する。本発明に係るポリヌクレオチドは、翻訳開始コドンをコードするアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒト野生型ＭＣＡ遺伝子の翻訳領域の塩基配列において第９２位の塩基がＣに置換した塩基配列からなるものである。また、本発明に係る別のポリヌクレオチドは、翻訳開始コドンをコードするアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒト野生型ＭＣＡ遺伝子の翻訳領域の塩基配列において第１２１位の塩基がＡに置換した塩基配列からなるものである。また、本発明に係るさらに別のポリヌクレオチドは、翻訳開始コドンをコードするアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒト野生型ＭＣＡ遺伝子の翻訳領域の塩基配列において第９２位の塩基がＣに置換し、さらに第１２１位の塩基がＡに置換した塩基配列からなるものである。
【０１５４】
一実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号１０から１２の何れかに示す塩基配列からなるものであってもよい。ただし、本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号１０から１２の何れかに示す塩基配列のものに限定されない。本発明に係るポリヌクレオチドには、配列番号１０から１２の何れかに示される塩基配列のみならず、配列番号１０から１２の何れかに示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されたポリヌクレオチドからなり、かつ低妊孕性又は不妊症に関与するポリヌクレオチドも含まれ、特に、配列番号１０から１２の何れかに示される塩基配列において一塩基多型により１又は数個の塩基が置換された塩基配列のものも含まれる。
【０１５５】
ここで、数個とは、当業者に期待しうる程度を超える試行錯誤や複雑高度な実験を行うことなく当業者が作ることができる程度の数を意図し、例えば、２０個以下が好ましく、より好ましくは１０個以下、さらに好ましくは５個以下を意図する。
【０１５６】
本明細書において、「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」、または「核酸分子」と同義であり、ヌクレオチドの重合体を指す。本明細書において、「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と同義であり、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。
【０１５７】
上記ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、ＤＮＡの形態（例えば、合成ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）の何れであってもよい。さらに、ＤＮＡの場合、二本鎖、一本鎖の何れであってもよい。さらに、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）でもよいし、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）でもよい。
【０１５８】
なお、上記ポリヌクレオチドは、その５’末端又は３’末端に、タグ標識（タグ配列又はマーカー配列）をコードするポリヌクレオチドが連結されていてもよい。
【０１５９】
上記ポリヌクレオチドを取得する方法としては、ＰＣＲを用いる方法が挙げられる。具体的には、変異型ＭＣＡ遺伝子を有している人のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲによって得ることもできるし、また、変異を入れたプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、野生型ＭＣＡ遺伝子から得ることもできる。
【０１６０】
また、上記ポリヌクレオチドは、組換えベクターに挿入されていてもよい。この組換えベクターは、インビトロ翻訳に用いるベクターであってもよいし、組換え発現に用いるベクターであってもよい。
【０１６１】
ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターが適宜選択できる。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に上記ポリヌクレオチドからヒト変異型ＭＣＡタンパク質を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと上記ポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。
【０１６２】
上記発現ベクターは、導入されるべき宿主の種類に応じた発現制御領域（例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、および／または複製起点等）を含有する。細菌用発現ベクターのプロモーターとしては、慣用的なプロモーター（例えば、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター等）が使用され、酵母用プロモーターとしては、例えば、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ＰＨ０５プロモーター等が挙げられ、糸状菌用プロモーターとしては、例えば、アミラーゼ、ｔｒｐＣ等が挙げられる。また動物細胞宿主用プロモーターとしては、ウイルス性プロモーター（例えば、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター等）が挙げられる。発現ベクターの作製は、制限酵素および／またはリガーゼ等を用いる慣用的な手法に従って行うことができる。発現ベクターによる宿主の形質転換もまた、慣用的な手法に従って行うことができる。
【０１６３】
上記発現ベクターを用いて形質転換された宿主を、培養、栽培または飼育した後、培養物等から慣用的な手法（例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等）に従って、変異型ＭＣＡタンパク質を回収・精製することができる。
【０１６４】
上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。また、例えば、上記ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを昆虫で発現させる場合には、バキュロウイルスを用いた発現系を用いればよい。
【０１６５】
上記組換えベクターを使用すれば、上記ポリヌクレオチドを生物または細胞に導入することができ、結果として当該生物または細胞中に変異型ＭＣＡタンパク質を発現させることができる。さらに、上記組換えベクターを無細胞タンパク質合成系に用いれば、変異型ＭＣＡタンパク質を選択的に合成することができる。
【０１６６】
また、上述した組換えベクターを含み、かつ、上述した変異型ＭＣＡタンパク質を細胞に発現させるために用いられる発現キットの形態にしてもよい。
【０１６７】
上記発現キットには、上記の組換えベクター以外の他の試薬を含んでいてもよい。他の試薬としては、例えば、組換えベクターを宿主細胞に導入するための導入用試薬、その宿主細胞、組換えベクターが宿主細胞内に導入されているかどうかを検定するためのプローブ群などが挙げられるがこれに限定されない。つまり、変異型ＭＣＡタンパク質の発現実験を、確実かつ簡便にできるように支援する試薬であればどのようなものが含まれていてもよい。上記発現キットを用いることにより、目的の宿主細胞において、確実に、かつ簡便に、変異型ＭＣＡタンパク質を発現させることができる。
【０１６８】
また、本発明に係るポリペプチドは、上述したポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなるものである。
【０１６９】
一実施形態において、上記ポリペプチドは、配列番号１３から１５の何れかに示すアミノ酸配列からなるものであってもよい。ただし、本発明に係るポリペプチドは、配列番号１３から１５の何れかに示すアミノ酸配列に限定されない。本発明に係るポリペプチドには、配列番号１３から１５の何れかに示されるアミノ酸配列のみならず、配列番号１３から１５の何れかに示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ低妊孕性又は不妊症に関与するポリペプチドも含まれ、特に、配列番号１３から１５の何れかに示されるアミノ酸配列において一塩基多型により１又は複数のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列のものも含まれる。
【０１７０】
ここで、数個とは、当業者に期待しうる程度を超える試行錯誤や複雑高度な実験を行うことなく当業者が作ることができる程度の数を意図し、例えば、２０個以下が好ましく、より好ましくは１０個以下、さらに好ましくは５個以下を意図する。
【０１７１】
本明細書において、「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と同義である。また、本発明に係るポリペプチドは、天然供給源より単離したものであっても、化学合成したものであってもよい。
【０１７２】
「単離した」ポリペプチドとは、天然の環境から取り出されたポリペプチドを指す。例えば、宿主細胞中で発現された組換え産生ポリペプチドは、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然または組換えのポリペプチドと同様に、単離されていると考えられる。本発明に係るポリペプチドは、上述した本発明に係るポリヌクレオチドの利用方法に従って取得することができる。
【０１７３】
本発明に係るポリペプチドは、天然の精製産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）において組換え技術によって産生された産物を含む。なお、上記ポリペプチドは、組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、グリコシル化されたり、非グリコシル化されたりしたものであってもよい。さらに、上記ポリペプチドは、宿主媒介プロセスの結果として、翻訳開始を示すメチオニン残基が改変されたものであってもよい。
【０１７４】
本発明に係るポリヌクレオチド、発現ベクター、又はポリペプチドによれば、ヒトの不妊症患者に見られる変異型ＭＣＡタンパク質が得られる。従って、これらの発明は、ヒトＭＣＡ遺伝子の第９２位および第１２１位の少なくとも一方の塩基の置換変異に起因する低妊孕性又は不妊症の治療を目的とした薬剤及び治療方法を開発する上で極めて有用なツールであり、研究現場へ販売することができる。また、これらをキット化することにより、産業上の利用可能性が一層向上する。
【０１７５】
（１０）本発明に係る抗体
本発明に係る抗体は、ヒト変異型ＭＣＡポリペプチド（すなわち上述した本発明に係るポリペプチド）と結合し、かつ、ヒト野生型ＭＣＡポリペプチドと結合しないものである。本発明に係る抗体を用いれば、上述したように、妊孕可能性の推定及び不妊症の原因の同定をタンパク質レベルで検出することができる。
【０１７６】
一実施形態において、本発明に係る抗体は、配列番号１０から１２の何れかに示す塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと特異的に結合するものであることが好ましい。換言すれば、本発明に係る抗体は、配列番号１３から１５の何れかに示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと特異的に結合するものであることが好ましい。
【０１７７】
本発明に係る抗体は、上述したアミノ酸の置換変異を含むヒト変異型ＭＣＡポリペプチドまたは変異部分を含むそのフラグメントを抗原として実験動物を免疫処置することによって生産することができる。具体的な抗体の生産手順には、従来公知の方法を用いることができる。例えば、Chow, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 910-914；及びBittle, F. J. et al, J. Gen. Virol. 66: 2347-2354 (1985)を参照のこと。
【０１７８】
一般的に、動物は遊離ペプチドによって免疫化することができる。ただし、遊離ペプチドを高分子キャリア（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または破傷風トキソイド）にカップリングすることによって効率的に免疫化できるようになる場合もある。例えば、システインを含有するペプチドは、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）のようなリンカーによってキャリアにカップリングすることができる。一方、他のペプチドは、グルタルアルデヒドのようなより一般的な連結剤を使用してキャリアにカップリングすることができる。
【０１７９】
ウサギ、ラット及びマウスのような動物は、遊離ペプチド又はキャリア−カップリングペプチドと、Ｆｒｅｕｎｄのアジュバントとを含むエマルジョンを、腹腔内および／または皮内に注射することにより免疫化することができる。ＥＬＩＳＡにより検出できる程度に有用な力価の抗ペプチド抗体を得るためには、約２週間の間隔で追加免疫注射を行うことが好ましい。
【０１８０】
そして、免疫化された動物から血液を採取し、血清からＩｇＧ画分を抽出することにより抗体を得ることができる。また、抗体を公知の技術によって精製することにより、抗体の力価が向上する。
【０１８１】
本発明に係る抗体は、上述したヒト変異型ＭＣＡポリペプチドに結合する一方で、ヒト野生型ＭＣＡポリペプチドには結合しないものである。それゆえ、上記の手順によって得られた抗体のうち、ヒト野生型ＭＣＡタンパク質と結合しないものを選出することによって、本発明に係る抗体を得ることができる。上記の選出を容易にするためには、動物に注射する抗原ペプチドとして、ヒト変異型ＭＣＡポリペプチドの変異部分とその周辺のアミノ酸配列からなる１０残基程度のオリゴペプチドを選択することが好ましい。
【０１８２】
なお、本明細書では、ヒト野生型ＭＣＡ遺伝子の翻訳領域の代表的な塩基配列として、配列番号８に示す塩基配列を例示したが、特許請求の範囲に記載の「ヒトＭＣＡ遺伝子」及び「ヒト野生型ＭＣＡ遺伝子」の翻訳領域は、配列番号８に示された塩基配列のもののみに限定されない。なぜならば、ヒト遺伝子には多くの一塩基多型が存在し、ヒトＭＣＡ遺伝子においても例外ではないからである。従って、特許請求の範囲に記載の「ヒトＭＣＡ遺伝子」及び「ヒト野生型ＭＣＡ遺伝子」には、配列番号８に示される塩基配列のみならず、配列番号８に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された翻訳領域を有し、かつ妊孕性に関与するもの（すなわち、自身のコードするポリペプチドが配列番号９に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド）も含まれ、特に、配列番号８に示される塩基配列において一塩基多型により１又は数個の塩基が置換された塩基配列を翻訳領域として有するものも含まれる。
【０１８３】
ここで、数個とは、当業者に期待しうる程度を超える試行錯誤や複雑高度な実験を行うことなく当業者が作ることができる程度の数を意図し、例えば、２０個以下が好ましく、より好ましくは１０個以下、さらに好ましくは５個以下を意図する。このことは、ヒト変異型ＭＣＡ遺伝子についても同様である。
【実施例１】
【０１８４】
以下では、本発明の一実施例について図２から図５に基づいて説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。本実施例では、マウス（Mus musculus）のＭＣＡ遺伝子を欠損させることにより本発明に係る疾患モデル動物を作製した。なお、以下の各工程では、特に断りがない限り、常法又はキットに添付されている取扱説明書に従って処理を行った。
【０１８５】
〔ＭＣＡホモ欠損マウスの作製〕
図１は、マウスＭＣＡ遺伝子の第１エクソン及びその周辺の物理地図である。図１に示す領域に対応する塩基配列を配列番号１に示す。配列番号１に示す塩基配列は、ＮＣＢＩマウスゲノムリソース（NCBI Mouse Genome Resource）に登録されている第１７番染色体の第１７５８２３１７位から第１７６２２３１６位までの塩基配列である。なお、ＮＣＢＩ Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｏｕｒｃｅにおいて、ＭＣＡはＴｓｇａ２とも称される。図中において、「第１エクソン」と標記されている領域（配列番号１の第１７８４８位から第１７９９１位の塩基配列に相当）が、ＭＣＡ遺伝子の第１エクソンに相当し、右側がＭＣＡ遺伝子の上流で左側が下流となっている。本実施例では、この第１エクソンをネオマイシン耐性遺伝子カセット（プロモータ及び翻訳領域を含む）で置換することによって、正常なＭＣＡタンパク質が発現しないようにした。
【０１８６】
ターゲッティングベクターには、（ａ）配列番号１の第１９２１８位から第２３０００位までの塩基配列からなる５’アーム配列と、（ｂ）配列番号１の第１００２１位から第１６２５０位までの塩基配列からなる３’アーム配列と、（ｃ）５’アーム配列と３’アーム配列との間に挟まれたネオマイシン耐性遺伝子カセット（ｎｅｏカセット）とを含めた。なお、ｎｅｏカセットは、図中の左側が上流、右側が下流になる向き（つまりＭＣＡ遺伝子と逆向き）に挿入した。図２は、ターゲッティングベクターの構造を示す模式図である。
【０１８７】
次に、作製した図２のターゲッティングベクターを制限酵素で消化し、ターゲッティングベクターを環状から線状にした。そして、線状にしたターゲッティングベクターをエレクトロポレーションによりＷ９．５ ＥＳ細胞に導入した。導入後、Ｇ４１８ガンシクロビルを添加した培養液でターゲッティングベクターを導入したＥＳ細胞を培養し、Ｇ４１８ガンシクロビル耐性クローンを得た。
【０１８８】
そして、得られた耐性クローンについて、相同組換えが問題なく行われているか否か（ターゲッティングが行われているか否か）を次の３つの方法で調べた。第１の方法では、ネオマイシン耐性遺伝子の３’末端領域に存在する塩基配列からなるｎｅｏ１７４６ｆプライマー（配列番号２：５’−ｃｃｔｇｃｃａｔａｇｃｃｔｃａｇｇｔｔａｃｔｃ−３’）と、図１に示す５’アーム配列の外側の２３２５０ｒプライマー（配列番号３：５’−ｇｃａｇａｇｇｇａｇｃｇａｇｇｃｔｃａｇｃａｃａｔｇｇ−３’）との組を用いてＰＣＲを行い、５’末端側のターゲッティングが正常に行われているか否かを調べた。このとき、試薬にはロシュ社のＴｈｅ Ｅｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを用い、反応条件は次の通りとした。
（１）９４℃で５分
（２）９４℃で３０分、５８〜６１℃で１分、６８℃で５分を１サイクルとして３５サイクル
（３）６８℃で１０分
これにより、ターゲッティングが行われているクローンのサンプルでは、約４．２ｋｂのフラグメントが検出された。
【０１８９】
また、第２の方法では、サザン解析によってターゲッティングが正常に行われているか否かを調べた。このとき、クローンのゲノムＤＮＡはＸｂａＩで消化し、プローブには、配列番号１の第２３０５１位から第２３７５０位までの塩基配列からなる５’プローブ（図１参照）を用いた。この５’プローブは、野生型マウスのゲノムＤＮＡを鋳型とし、２３０５１Ｆプライマー（配列番号４：５’−ｇｔｔｇｇｃｃａｇｇｇａａｇａａｃｔｃｔｔｔｃｔｃ−３’）と２３７５０Ｒプライマー（配列番号５：５’−ｔａｃａｃｇｃｔｇｔｔａｇｃｃａａａｔａｇｇ−３’）とを用いてＰＣＲを行うことにより作製した。サザン解析の結果、野生型クローンのサンプルでは約１２．６ｋｂのバンドが検出され、ターゲッティングが行われているクローンのサンプルでは約１６．５ｋｂのバンドが検出された。
【０１９０】
第３の方法では、図１に示す３’アーム配列の外側の９７２５ｆプライマー（配列番号６：５’−ｔｃｃｔｇｃｃｔｃａｔｃｃｔｇｔｔｔｔａａｔｇｇ−３’）と、ネオマイシン耐性遺伝子の５’末端領域に存在する塩基配列からなるｎｅｏ６ｒプライマー（配列番号７：５’−ｃａｔａｇｃｃｇａａｔａｇｃｃｔｃｔｃｃ−３’）との組を用いてＰＣＲを行い、３’末端側のターゲッティングが正常に行われているかを調べた。なお、ＰＣＲの条件は、基本的には上述した第１の方法と同じであるが、伸長ステップ（（２）の６８℃での処理）の時間を７分にした。これにより、ターゲッティングが行われているクローンからは、約７．１ｋｂのフラグメントが検出された。
【０１９１】
以上のようにして、ターゲッティングが行われていることが確認されたＥＳ細胞クローンをＣ５７ＢＬ／６Ｊの胚盤胞に注入し、オスのキメラマウスを得た。そして、得られたキメラマウスを野生型のメスのマウスと交配させ、ＭＣＡヘテロ欠損マウス（Ｆ１）を得た。なお、ＭＣＡヘテロ欠損マウスの同定は、ＰＣＲを用いる上述の第１の方法によって行った。図３は、代表的なスクリーニング結果を示す図である。図中に矢印で示すように、一部のレーン（レーン１１，１２，１５）では、ＭＣＡヘテロ欠損マウスが得られたことを示す約４．２ｋｂのバンドが検出された。そして、得られたＭＣＡヘテロ欠損マウス同士を交配し、ＭＣＡホモ欠損マウスを得た。
【０１９２】
次に、精巣でのＭＣＡタンパク質の発現を調べるためにウエスタンブロットを行った。ウエスタンブロットには、非特許文献３に記載の抗ＭＣＡ抗体を用いた。この抗体は、非特許文献３に記載されている、マウスのＭＣＡタンパク質全長とＧＳＴタンパク質との融合タンパク質をラビットに免役して得られたもので、哺乳類細胞においてＭＣＡ特異的に反応することが分かっているものである。ウエスタンブロットの詳細な手順は次の通りである。
【０１９３】
まず、約４０μｇの精巣のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって展開した後、セミドライ法によってポリビニルジフルオライド（ＰＶＤＦ）フィルターにトランスファー（1ｍＡ/ｃｍ２で８０分）した。そして、フィルターを５％スキムミルクでブロッキングし、ＴＢＳ（25mM Tris-HCl pH=7.4, 150mMNaCl, 50mM KCl）で１０００倍に希釈した上記抗ＭＣＡ抗体によって４℃で１晩処理を行った。次に、フィルターをＴＢＳにより５分間洗浄する処理を３回繰り返し、ＴＢＳで７５０倍に希釈したペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）をコンジュゲートした抗ラビット抗体(DAKO, A/S, Denmark)によってフィルターを室温で３時間処理した。処理後、フィルターをＴＢＳで５分間洗浄する処理を３回繰り返し、ＰＯＤイムノステインセット（Wako, Osaka, Japan）でシグナルの検出を行った。
【０１９４】
図４は、ウエスタンブロットの結果を示す図である。図中において、「＋／＋」は野生型マウスを示し、「＋／−」はＭＣＡヘテロ欠損マウスを示し、「−／−」はＭＣＡホモ欠損マウスを示す。図４に示すように、ＭＣＡホモ欠損マウスでは、ＭＣＡタンパク質が全く発現していないことが示された。
【０１９５】
また、精巣でのＭＣＡ転写産物の発現を調べるためにノーザンブロットを行った。ノーザンブロットは、ＭＣＡ ｃＤＮＡ全長をプローブとして用い、次の手順で行った。
【０１９６】
成熟マウスから摘出した約５ｍｍ四方の各組織(脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、脾臓、精巣、唾液腺)を１．５ｍＬマイクロチューブに入れ、１ｍｌのＴＲＩＳＯＬ（登録商標） ｒｅａｇｅｎｔ（GIBCO BRL, NY, USA）を加え、氷上でホモジナイズして５分間室温で静置した。その後、２００μｌのクロロホルムを加えて激しく撹拌し、５分間室温で静置した後、４℃、１３５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。次に、上層を新しいチューブに移し、１００％エタノールを１ｍｌ加えて撹拌し、４℃、１３５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。そして上清を捨て、７０％エタノールを１ｍｌ加えて撹拌し、４℃、１３５００ｒｐｍで１０分間遠心分離して再び上清を捨て、沈殿物を軽く乾燥させた後にＤＥＰＣ処理水に溶かした。これにより、全ＲＮＡを得た。
【０１９７】
次に、２０μｇ分の全ＲＮＡを６５℃で２０分間変性処理した後、０．６６Ｍホルムアルデヒドを含む１％アガロースゲルで電気泳動した。そして、ゲルをアクリジンオレンジで染色して１８Ｓ及び２８ＳリボソームＲＮＡを確認した後、キャピラリートランスファー法によってＺｅｔａ−Ｐｌｏｂｅ（登録商標） Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｍｅｍｂｒｅｎｅｓフィルター（BIO-RAD, CA, USA）にＲＮＡをトランスファーした。その後、フィルターを２×ＳＳＣで５分間処理し、８０℃でベーキングすることによりＲＮＡをフィルターに固定した。
【０１９８】
続いて、フィルターを６５℃のＰｅｒｆｅｃｔＨｙｂ（登録商標） Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（TOYOBO, Osaka, Japan）中で１時間プレハイブリダイゼーションした。その後、全長ＭＣＡフラグメントをＢｃａＢｅｓｔ（登録商標） ｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒ ｋｉｔ（Takara, Osaka, Japan）を用いて３２Ｐでラベルしてプローブを調製し、そのプローブをＰｅｒｆｅｃｔＨｙｂ（登録商標） Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎに加えた６０℃のハイブリダイゼーション溶液にフィルターを浸漬し、２時間ハイブリダイゼーションを行った。そして、１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣによりフィルターを室温で１０分間洗浄した。その後、０．１％ＳＤＳを含む０．２％ＳＳＣによりフィルターを６０℃で３０分間洗浄する処理を２回行い、バイオイメージングアナライザーシステムＢＡＳ１０００（Fuji Film, Japan）でシグナルを検出した。
【０１９９】
図５は、精巣サンプルについてのノーザンブロットの結果を示す図である。図中における「＋／＋」、「＋／−」、「−／−」は、図４のウエスタンブロットと同様である。図５に示すように、ＭＣＡホモ欠損マウスでは、ＭＣＡの転写産物が全く見られず、遺伝子が確実に欠損していることが確かめられた。
【０２００】
〔ＭＣＡ欠損マウスの解析〕
次に、得られたＭＣＡ欠損マウスの形質の解析を行った。具体的には、ＭＣＡヘテロ欠損マウス、ＭＣＡホモ欠損マウスのそれぞれから精巣及び副精巣を摘出し、切片標本を作製した。そして、作製した切片標本を染色し、顕微鏡で観察した。切片標本の作製及び染色の方法は次の通りである。
【０２０１】
成熟マウスから精巣及び副精巣を摘出し、摘出した組織をブアン溶液により４℃で一晩固定してパラフィンに包埋したもの、及び、摘出した組織を固定せずにＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ（Sakura Finetechnical Co.Ltd, Tokyo, Japan）で包埋し−２０℃に冷やしたものから、厚さ７μｍの切片を作製した。次に、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ Ｃｏｍｐｏｕｎｄに包埋した未固定の組織について、１００％アルコール若しくはパラホルムアルデヒドで固定した後、抗体反応を行った。具体的には、ＰＢＳで１０００倍希釈した抗ＭＣＡ抗体によって４℃で一晩処理し、ＰＢＳによる室温での５分間の洗浄を３回繰り返した。その後、ＰＢＳで７５０倍希釈したＰＯＤコンジュゲートした抗ウサギ抗体（Amersham）によって、室温で４時間処理した。最後にＰＢＳによる室温での５分間の洗浄を３回繰り返した後、ジアミノベンジミド（ＤＡＢ）による発色を行い、ヘマトキシリンによるカウンター染色を行った。
【０２０２】
図６は、ＭＣＡヘテロ欠損マウスから摘出した精巣、副精巣尾、副精巣頭の顕微鏡像を示す図であり、図７は、ＭＣＡホモ欠損マウスから摘出した精巣、副精巣尾、副精巣頭の顕微鏡像を示す図である。図６に示すように、ＭＣＡヘテロ欠損マウスでは、精巣、副精巣尾、副精巣頭の何れにも異常が見られなかった。また、ＭＣＡヘテロ欠損マウスの妊孕性にも特に問題はなかった。これに対し、ＭＣＡホモ欠損マウスでは、図７に示すように、精巣には目立った異常が見られなかったものの、副精巣尾及び副精巣頭において精子が存在しなかった。このため、ＭＣＡホモ欠損マウスは無精子症を示し、不妊であった。
【０２０３】
ＭＣＡホモ欠損マウスの精巣重量を調べた結果、野生型と比べて大きな変化はなかったため、減数分裂後の精子細胞分化は進んでいることが示唆された。精巣の精子細胞を詳細に観察した結果、減数分裂後の精子細胞の数は、野性型マウスと比べてほとんど量的な差がなかった。しかしながら、精子鞭毛の折れ曲がりや、核が野性型マウスのように棒状に伸びず、不均一な円形のままであったことから、精巣における精子細胞の形態形成不全が生じていることが明らかになった。このことから、精巣内での鞭毛形成が不完全である精細胞は、精子形成後に副精巣へとうまく移動できなかったために、副精巣において精子が見られなかったものと考えられる。なお、精子の形態については、現在電子顕微鏡によりさらなる解析を進めている。
【０２０４】
ＭＣＡタンパク質は、上述したように減数分裂期に発現することが報告されている。そこで、ＭＣＡホモ欠損マウスについて、精巣で減数分裂期に異常が生じ、アポトーシスを起こす精細胞が増加していないかを調べた。その結果、アポトーシスを起こす精細胞が増えていることが明らかになった。しかしながら、精子形成が見られ、精巣重量にも大きな差がなかったことから、精子形成期における鞭毛形成障害に起因して正常な精巣半数体精子細胞が形成されず、セルトリ細胞に精細胞が貪食され、その結果として副精巣に精子が存在せずに無精子症になったと考えられる。
【実施例２】
【０２０５】
以下では、本発明の別の実施例について説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。本実施例では、ヒトＭＣＡ遺伝子における置換変異の解析を行った。なお、以下の各工程では、特に断りがない限り、常法又はキットに添付されている取扱説明書に従って各処理を行った。
【０２０６】
〔参加者〕
不妊症の日本人男性被験者（Ｎ＝２４５）を精子形成の欠損の程度に基づいてサブグループに分割した。これらの不妊症被験者のうち、９７人（４０％）は非閉塞性無精子症であり、１４８人（６０％）は非閉塞性重症精子過少症（＜５×１０６細胞／ｍＬ）であった。遺伝的要因を調べたところ、これらの被験者は何れも原発性特発性不妊症であった（Birmingham A et al. Fertil Steril 2004; 9: 2313-2317）。
【０２０７】
一方、妊孕性が確認された男性のコントロールグループ（Ｎ＝１７２）として、産婦人科医院にいる妊婦のもとに生まれた子供の父親を選択した。
【０２０８】
なお、ドナーは、本研究において血液をゲノムＤＮＡの解析に使用することに同意した。
【０２０９】
〔ＰＣＲ増幅ＤＮＡのダイレクトシーケンシングによるＭＣＡ遺伝子の変異の同定〕
以下の各工程では、特に断りがない限り、常法又はキットに添付されている取扱説明書に従って処理を行った。ゲノムＤＮＡは、プロテアーゼ処理及びフェノール抽出により血液サンプルから単離した（Sambrook J et al., Isolation of DNA from Mammalian Cells. New York: Cold Spring Harbor Press. 1989: pp. 9.16-9.21）。また、ＭＣＡ遺伝子の第２エクソン及び第３エクソンを含む領域を増幅させるために、ＰＣＲに用いるプライマーの組として、ＭＣＡ−Ｐ３及びＭＣＡ−Ｐ４Ｒを設計した（図８参照）。ＭＣＡ−Ｐ３は、図８に示すように、ＭＣＡ遺伝子の第２エクソンの上流領域と同一の塩基配列（配列番号１６：５’−ＴＡＧＣＡＴＡＧＴＧＧＧＡＴＧＡＣＴＣＡＡＧＧＧ−３’）からなる。また、ＭＣＡ−Ｐ４Ｒは、ＭＣＡ遺伝子の第３エクソンの下流領域と相補的な塩基配列（配列番号１７：５’−ＡＡＣＴＴＣＴＧＴＡＡＣＡＣＧＡＡＡＡＴＣＴＧＣ−３’）からなる。
【０２１０】
ＰＣＲは以下の条件で行った：９８℃で１０秒間変性、６０℃で５秒間アニーリング、及び７２℃で３０秒間伸長を１サイクルとして、これを４０サイクル。ＰＣＲ増幅フラグメントはＳＵＰＲＥＣ ＰＣＲスピンカラム（タカラバイオ）を用いて精製した。
【０２１１】
ＭＣＡ−Ｐ３及びＭＣＡ−Ｐ４Ｒからなるプライマーの組によって増幅したフラグメントについて、同じＭＣＡ−Ｐ３及びＭＣＡ−Ｐ４Ｒのそれぞれを用いてシーケンシングを行った。このとき、サーマルサイクルシーケンシングキット（アプライドバイオシステムズ）を用いて反応を行い、反応産物をＡＢＩ−ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ）によって解析した。両方向の決定結果を比較し、塩基配列を決定した。
【０２１２】
〔結果〕
不妊症被験者及び妊孕性確認被験者のそれぞれについてＭＣＡ遺伝子の第２エクソン及び第３エクソンの塩基配列を解析したところ、ＭＣＡ遺伝子の翻訳領域の第９２位のアデニンが片方のアレルにおいてシトシンに置換している被験者が、不妊症被験者２４５人
の中に３人見出された。この被験者のうち、２人は無精子症であり、１人は重症精子過少症であった。一方、妊孕性確認被験者からは、この置換変異が全く見出されなかった。
【０２１３】
さらに、ＭＣＡ遺伝子の翻訳領域の第１２１位のグアニンが片方のアレルにおいてアデニンに置換している被験者が、不妊症被験者２４５人の中に１人見出された。この被験者は、重症精子過少症であった。一方、妊孕性確認被験者からは、この置換変異が全く見出されなかった。
【０２１４】
配列番号８に示すヒトＭＣＡ遺伝子の翻訳領域の第９２位のアデニン塩基がシトシン塩基に置換すると、この部位がプロリンをコードするようになる。また、第１２１位のグアニン塩基がアデニン塩基に置換すると、この部位がアルギニンをコードするようになる。
【０２１５】
ＭＣＡ遺伝子は哺乳類に広く保存されていること、並びに、そのタンパク質が精巣の半数体生殖細胞に特に強く発現することから、ＭＣＡタンパク質の変異は、男性不妊を引き起こす（或いは引き起こしやすい）と考えられる。上記の置換変異が見出された被験者は、正常なＭＣＡタンパク質の翻訳量が低減したことにより、或いは、変異型ＭＣＡタンパク質がドミナントネガティブに作用することにより、ＭＣＡタンパク質の働きが不十分になって不妊症になったものと推測された。
【０２１６】
なお、本研究により、上記の置換変異以外にも一塩基多型がＭＣＡ遺伝子内に見出されたが、これらの一塩基多型は、そのパターンが不妊症被験者と妊孕性確認被験者との間で有意な相違を見せず、特に妊孕性に影響を与えるものとは認められなかった。
【０２１７】
本発明は上述した実施形態及び実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。すなわち、請求項に示した範囲で適宜変更した技術的手段を組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【０２１８】
本発明によれば、不妊症の現象解明や治療法の確立並びに不妊症の診断に有用なツールが提供されるので、製薬分野や医療分野において本発明を好適に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０２１９】
【図１】マウスにおけるＭＣＡ遺伝子の第１エクソン及びその周辺の物理地図を示す図である。
【図２】ＭＣＡ欠損マウスの作製に用いたターゲッティングベクターの構造を示す図である。
【図３】マウスのジェノタイプを調べるために行ったＰＣＲの結果の例を示す図である。
【図４】ＭＣＡタンパク質の発現を確認するために行ったウエスタンブロットの結果を示す図である。
【図５】ＭＣＡ転写産物の発現を確認するために行ったノーザンブロットの結果を示す図である。
【図６】ＭＣＡへテロ欠損マウスの精巣、副精巣尾及び副精巣頭の顕微鏡像を示す図である。
【図７】ＭＣＡホモ欠損マウスの精巣、副精巣尾及び副精巣頭の顕微鏡像を示す図である。
【図８】ヒトＭＣＡ遺伝子の構造を示す物理地図である。
【図９】インベーダー法の原理を説明する図である。
【図１０】ＳＭＭＤ法の原理を説明する図である。
【符号の説明】
【０２２０】
１ ターゲット遺伝子
１ａ 変異検出部位
２ インベーダープローブ
３ シグナルプローブ
３ａ ヌクレオチド
３ｂ フラップ
３ｃ フラップ遊離体
４ フラップエンドヌクレアーゼ
５ フレットプローブ
５ａ ヌクレオチド
５ｂ 蛍光色素
５ｃ クエンチャー
１１ 遺伝子
１１ａ・１１ｂ 変異検出部位
１２ 特別プライマー
１２ａ オリゴマー
１２ｂ タグ
１３ カウンタープライマー
１４ ＰＣＲ産物
１５ 特別ターゲット
２０ 変異型プローブ
２５ 金電極
３０ 野生型プローブ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
正常なＭＣＡタンパク質の発現が低下し、低妊孕性又は不妊症を呈するオスの非ヒト哺乳動物であることを特徴とする疾患モデル動物。
【請求項２】
正常なＭＣＡタンパク質が発現しないオスの非ヒト哺乳動物であることを特徴とする疾患モデル動物。
【請求項３】
ＭＣＡ遺伝子が欠損したオスの非ヒト哺乳動物であることを特徴とする疾患モデル動物。
【請求項４】
上記非ヒト哺乳動物がマウスであることを特徴とする請求項１から３の何れか１項に記載の疾患モデル動物。
【請求項５】
請求項１から３の何れか１項に記載の疾患モデル動物から単離されたことを特徴とする細胞。
【請求項６】
ＭＣＡ遺伝子が欠損又は変異し、低妊孕性又は不妊症を呈するヒト男性から単離されたことを特徴とする細胞。
【請求項７】
請求項１から３の何れか１項に記載の疾患モデル動物又は請求項６に記載のヒト男性から単離された精巣内の組織又は精巣。
【請求項８】
請求項１から３の何れか１項に記載の疾患モデル動物を作製するための交配に用いられ、ＭＣＡ遺伝子の一部又は全部が欠損している非ヒト哺乳動物であることを特徴とする交配用動物。
【請求項９】
低妊孕性又は不妊の雄性生殖細胞を生産するための生殖細胞生産方法であって、
オスの哺乳動物由来の培養細胞又はオスの哺乳動物から単離された細胞である哺乳動物細胞が有するＭＣＡ遺伝子を欠損させる遺伝子欠損工程と、
上記遺伝子欠損工程によってＭＣＡ遺伝子が欠損した哺乳動物細胞を生殖細胞へ分化させる分化誘導工程とを含んでいることを特徴とする生殖細胞生産方法。
【請求項１０】
オスの非ヒト哺乳動物の生殖細胞であって、
ＭＣＡ遺伝子が欠損し、低妊孕性又は不妊を呈することを特徴とする生殖細胞。
【請求項１１】
ヒト男性由来の培養細胞であって、
ＭＣＡ遺伝子が欠損し、低妊孕性又は不妊を呈する生殖細胞であることを特徴とする培養細胞。
【請求項１２】
低妊孕性又は不妊症の治療薬の候補化合物をスクリーニングするためのスクリーニング方法であって、
請求項１から３の何れか１項に記載の疾患モデル動物、請求項５若しくは６に記載の細胞、請求項７に記載の組織若しくは精巣、請求項９に記載の生殖細胞生産方法によって得られた雄性生殖細胞、請求項１０に記載の生殖細胞、又は請求項１１に記載の培養細胞に対して上記候補化合物を作用させ、その結果を評価する工程を含んでいることを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項１３】
ヒトＭＣＡ遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬を含んでいることを特徴とする妊孕性診断キット。
【請求項１４】
上記試薬は、翻訳開始コドンをコードするアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒトＭＣＡ遺伝子の翻訳領域の第９２位の塩基の変異の有無を検出するものであることを特徴とする請求項１３に記載の妊孕性診断キット。
【請求項１５】
上記試薬は、翻訳開始コドンをコードするアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒトＭＣＡ遺伝子の翻訳領域の第１２１位の塩基の変異の有無を検出するものであることを特徴とする請求項１３に記載の妊孕性診断キット。
【請求項１６】
ヒトから採取された生体サンプルを用いて上記ヒトにおける遺伝子の欠損又は変異を検出する検出方法であって、
ヒトＭＣＡ遺伝子の欠損又は変異の有無を検出する工程を含んでいることを特徴とする検出方法。
【請求項１７】
翻訳開始コドンをコードするアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒト野生型ＭＣＡ遺伝子の翻訳領域の塩基配列において第９２位の塩基がシトシンに置換した塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項１８】
翻訳開始コドンをコードするアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒト野生型ＭＣＡ遺伝子の翻訳領域の塩基配列において第１２１位の塩基がアデニンに置換した塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項１９】
翻訳開始コドンをコードするアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒト野生型ＭＣＡ遺伝子の翻訳領域の塩基配列において第９２位の塩基がシトシンに置換し、さらに第１２１位の塩基がアデニンに置換した塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項２０】
請求項１７から１９の何れか１項に記載のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチド。
【請求項２１】
請求項２０に記載のポリペプチドと結合し、かつ、ヒト野生型ＭＣＡポリペプチドと結合しないことを特徴とする抗体。
【請求項２２】
ヒトから採取された生体サンプルを用いて上記ヒトにおいて発現しているＭＣＡポリペプチドの変異を検出する検出方法であって、
請求項２１に記載の抗体によってＭＣＡポリペプチドの変異を検出する工程を含んでいることを特徴とする検出方法。
【請求項２３】
抗ヒトＭＣＡ抗体を含んでいることを特徴とする妊孕性診断キット。
【請求項１】
正常なＭＣＡタンパク質の発現が低下し、低妊孕性又は不妊症を呈するオスの非ヒト哺乳動物であることを特徴とする疾患モデル動物。
【請求項２】
正常なＭＣＡタンパク質が発現しないオスの非ヒト哺乳動物であることを特徴とする疾患モデル動物。
【請求項３】
ＭＣＡ遺伝子が欠損したオスの非ヒト哺乳動物であることを特徴とする疾患モデル動物。
【請求項４】
上記非ヒト哺乳動物がマウスであることを特徴とする請求項１から３の何れか１項に記載の疾患モデル動物。
【請求項５】
請求項１から３の何れか１項に記載の疾患モデル動物から単離されたことを特徴とする細胞。
【請求項６】
ＭＣＡ遺伝子が欠損又は変異し、低妊孕性又は不妊症を呈するヒト男性から単離されたことを特徴とする細胞。
【請求項７】
請求項１から３の何れか１項に記載の疾患モデル動物又は請求項６に記載のヒト男性から単離された精巣内の組織又は精巣。
【請求項８】
請求項１から３の何れか１項に記載の疾患モデル動物を作製するための交配に用いられ、ＭＣＡ遺伝子の一部又は全部が欠損している非ヒト哺乳動物であることを特徴とする交配用動物。
【請求項９】
低妊孕性又は不妊の雄性生殖細胞を生産するための生殖細胞生産方法であって、
オスの哺乳動物由来の培養細胞又はオスの哺乳動物から単離された細胞である哺乳動物細胞が有するＭＣＡ遺伝子を欠損させる遺伝子欠損工程と、
上記遺伝子欠損工程によってＭＣＡ遺伝子が欠損した哺乳動物細胞を生殖細胞へ分化させる分化誘導工程とを含んでいることを特徴とする生殖細胞生産方法。
【請求項１０】
オスの非ヒト哺乳動物の生殖細胞であって、
ＭＣＡ遺伝子が欠損し、低妊孕性又は不妊を呈することを特徴とする生殖細胞。
【請求項１１】
ヒト男性由来の培養細胞であって、
ＭＣＡ遺伝子が欠損し、低妊孕性又は不妊を呈する生殖細胞であることを特徴とする培養細胞。
【請求項１２】
低妊孕性又は不妊症の治療薬の候補化合物をスクリーニングするためのスクリーニング方法であって、
請求項１から３の何れか１項に記載の疾患モデル動物、請求項５若しくは６に記載の細胞、請求項７に記載の組織若しくは精巣、請求項９に記載の生殖細胞生産方法によって得られた雄性生殖細胞、請求項１０に記載の生殖細胞、又は請求項１１に記載の培養細胞に対して上記候補化合物を作用させ、その結果を評価する工程を含んでいることを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項１３】
ヒトＭＣＡ遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬を含んでいることを特徴とする妊孕性診断キット。
【請求項１４】
上記試薬は、翻訳開始コドンをコードするアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒトＭＣＡ遺伝子の翻訳領域の第９２位の塩基の変異の有無を検出するものであることを特徴とする請求項１３に記載の妊孕性診断キット。
【請求項１５】
上記試薬は、翻訳開始コドンをコードするアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒトＭＣＡ遺伝子の翻訳領域の第１２１位の塩基の変異の有無を検出するものであることを特徴とする請求項１３に記載の妊孕性診断キット。
【請求項１６】
ヒトから採取された生体サンプルを用いて上記ヒトにおける遺伝子の欠損又は変異を検出する検出方法であって、
ヒトＭＣＡ遺伝子の欠損又は変異の有無を検出する工程を含んでいることを特徴とする検出方法。
【請求項１７】
翻訳開始コドンをコードするアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒト野生型ＭＣＡ遺伝子の翻訳領域の塩基配列において第９２位の塩基がシトシンに置換した塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項１８】
翻訳開始コドンをコードするアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒト野生型ＭＣＡ遺伝子の翻訳領域の塩基配列において第１２１位の塩基がアデニンに置換した塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項１９】
翻訳開始コドンをコードするアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒト野生型ＭＣＡ遺伝子の翻訳領域の塩基配列において第９２位の塩基がシトシンに置換し、さらに第１２１位の塩基がアデニンに置換した塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項２０】
請求項１７から１９の何れか１項に記載のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチド。
【請求項２１】
請求項２０に記載のポリペプチドと結合し、かつ、ヒト野生型ＭＣＡポリペプチドと結合しないことを特徴とする抗体。
【請求項２２】
ヒトから採取された生体サンプルを用いて上記ヒトにおいて発現しているＭＣＡポリペプチドの変異を検出する検出方法であって、
請求項２１に記載の抗体によってＭＣＡポリペプチドの変異を検出する工程を含んでいることを特徴とする検出方法。
【請求項２３】
抗ヒトＭＣＡ抗体を含んでいることを特徴とする妊孕性診断キット。
【図１】
【図２】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００８−２３７２０４（Ｐ２００８−２３７２０４Ａ）
【公開日】平成２０年１０月９日（２００８．１０．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１８４９４６（Ｐ２００７−１８４９４６）
【出願日】平成１９年７月１３日（２００７．７．１３）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１８年度、独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構、受託研究「男性不妊症患者のＳＮＰｓライブラリー及びマイクロアレー作成」、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１０月９日（２００８．１０．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年７月１３日（２００７．７．１３）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１８年度、独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構、受託研究「男性不妊症患者のＳＮＰｓライブラリー及びマイクロアレー作成」、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【Ｆターム（参考）】
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