病原体を検出するためのマイクロアレイ又はそれを含むキット
【課題】ヒト、家畜、家禽等の臨床検体や野外検体、食品、水等において、病原性を示すウイルス、細菌、真菌、古細菌、原虫、タンパク質毒素等の病原体を一括、簡単、網羅的に同時検出するためのマイクロアレイを提供する。
【解決手段】古細菌、原虫、細菌、真菌、ウイルス、及びタンパク質毒素から選ばれる少なくとも一株に由来する既知の核酸塩基配列（センス）又は相補的（アンチセンス）な塩基配列を有し、この塩基配列において互いに異なる少なくとも３個の群からなるプローブであって、その各プローブ長が５０〜７０ｍｅｒであり、Ｔｍが７０〜８０℃であり、−３．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のヘアピンループ及び−３．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のセルフダイマーを避け、ホモロジーから推測される非特異性を確保するように設計されたプローブの群が担体上に固定化されている、病原体を検出するためのマイクロアレイ又はそれを含むキット。
【解決手段】古細菌、原虫、細菌、真菌、ウイルス、及びタンパク質毒素から選ばれる少なくとも一株に由来する既知の核酸塩基配列（センス）又は相補的（アンチセンス）な塩基配列を有し、この塩基配列において互いに異なる少なくとも３個の群からなるプローブであって、その各プローブ長が５０〜７０ｍｅｒであり、Ｔｍが７０〜８０℃であり、−３．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のヘアピンループ及び−３．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のセルフダイマーを避け、ホモロジーから推測される非特異性を確保するように設計されたプローブの群が担体上に固定化されている、病原体を検出するためのマイクロアレイ又はそれを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、臨床検体、野外検体、食品その他の検体から、ウイルス、細菌、タンパク質毒素等の病原体を一括、簡単、網羅的に同時検出するためのマイクロアレイ、及びそのマイクロアレイを使用した病原体の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
各種の感染症の診断にあたっては、感染症の臨床的診断とともに、迅速かつ正確な実験室検査が必要である。従来、培養増殖された病原体は主に生化学的手法を用いて判定されていた。このような検査手法は、時間と労力がかかるため、現在、病原体タンパク質に対する抗体を用いて検出する方法（例えばＥＬＩＳＡ）、及び病原体核酸をＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション）反応で増幅する手法（例えばリアルタイムＰＣＲ）が主流である。ウイルスゲノム等の病原体核酸をＰＣＲ反応で増幅して検出する方法は、特異性及び検出感度で優れている。
【０００３】
しかし、ＰＣＲ反応では病原体毎に特異的プライマーを設計しなければならず、標的が絞られていない場合や病原体が遺伝子突然変異を伴う場合、ＰＣＲ反応の適用に困難を伴う。
【０００４】
多種類の病原体が関わる感染症や特定不能な感染症の病原体検査では、複数の病原体核酸を一括して同定できることが望ましい。その手法として、マイクロアレイを用いた検出法がある。マイクロアレイは、数十から数十万遺伝子の標的核酸に対して相補的な核酸プローブ（ＰＣＲ増幅産物やオリゴヌクレオチド）を固定化したスライドガラスに、蛍光色素等で標識した核酸試料を会合させ、目的遺伝子の有無を判別し、また、目的遺伝子を定量する方法である。従来から用いられるＰＣＲ反応を用いた検出試験では同時に行える検出数に限界があるので、１検体から同時多検出試験を行えるプラットフォームとしてのマイクロアレイは、病原体核酸検出法として有望である。現在、目的別に多種多様な核酸プローブを固定化したマイクロアレイ及びそれを含むキットが市販されている。
【０００５】
発売当初は高価であったマイクロアレイは、近年、非常に安価に製造できるようになり、通常の臨床検査レベルでの普及に現実味を帯びてきた。今後の本格的な普及を前に、ヒト、家畜、家禽等に対して病原性のウイルス、細菌、真菌、原虫等を１回の検査で一括、簡単、網羅的に同時検出可能なマイクロアレイの開発が期待される。
【０００６】
微生物の検出を目的としたオリゴヌクレオチドプローブを利用した例として、短時間で多数の種類のレジオネラ属細菌を一種類のプローブで特異的に高精度に検出可能な技術が知られている（特許文献１）。これらをはじめとする既存のプローブを用いた検出方法では、ゲノム上の保存領域の塩基配列を使用することが多い。例えば細菌を含む原核生物のｒＲＮＡがコードされているゲノム上の配列（ｒＤＮＡ）は、多岐にわたる種間で塩基配列の保存性が高く、プライマー設計、及びＰＣＲ反応による多種間の当該遺伝子増幅が容易である。更に、ｒＤＮＡは各々菌特有の塩基多型が見られる。上記２つの理由から、菌種判定に利用されやすい。
【０００７】
しかし、多種間保存性が高い塩基配列をプローブとして用いた場合、例えば大腸菌と赤痢菌のように２種間ｒＤＮＡ相同性が９９．３％ある場合に、両者を区別できないことがあるという問題がある。
【０００８】
ｒＤＮＡ以外の塩基配列をプローブとして採用する方法として、担体面上に固定化された互いにＧＣ含量の異なる複数の既知微生物由来染色体ＤＮＡと、検体中に未知微生物由来染色体ＤＮＡとを反応させ、生じたハイブリダイゼーション複合体を検出することを特徴とする微生物の同定方法、及びＧＣ含量の異なる多数の既知微生物由来染色体ＤＮＡが同一面上に固定された担体を含んでなる、微生物固定用キットが知られている（特許文献２）。種や属間の大まかな相違を検出できる可能性はあるが、前述同様に相同性の高い種間の分別は困難になることが予想される。
【０００９】
本発明者等は、食品中に含まれる多種類の病原体を同時に検出するためのマイクロアレイの開発を続け、マイクロアレイ用に好適な核酸増幅法を確立した（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００１−２９９３９６
【特許文献２】特開平１０−１９１９８２
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｕｄａ Ａ， Ｔａｎａｂａｙａｓｈｉ Ｋ， Ｆｕｊｉｔａ Ｏ， Ｈｏｔｔａ Ａ， Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｙ， Ｙａｍａｄａ Ａ． Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｕｓｉｎｇ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ． Ｊｐｎ Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．２００７ ６０：３５５−６１．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、上記知見をさらに発展させ、臨床検体、野外検体、その他の検体（食品、水等）において、ヒト、家畜、家禽に対して病原性を示すウイルス、細菌、真菌、古細菌、原虫、タンパク質毒素等を一括、簡単、網羅的に同時検出するためのマイクロアレイを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、多種多様な病原体を同時に一括検出するために、マイクロアレイへの応用を試みた。ゲノムプロジェクトが終了又は途中の古細菌３０株、原虫９株、細菌４２２株、真菌５９株、ウイルス６７２株の合計１１９２株の全長ゲノム配列並びにタンパク毒素等７４遺伝子からマイクロアレイに最適なプローブを５万種類以上設計した。設計した全てのプローブのホモロジー検索（ＢＬＡＳＴ検索）を行い、各病原体に対する特異的検出に有効であると推測された３８，９８６プローブを選定し、これらのプローブを搭載したマイクロアレイＭｉｃｒｏａｒｒａｙ ｆｏｒ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ａｇｅｎｔｓ（以下、ＭＭＰＤＡと略す）を開発した。ＭＭＰＤＡは、病原体検出用プローブの特異性の確認及び統計学的手法を用いた検出病原体の絞込みにおいて、予想を上回る成果を収めた。上記成果に基づいて、本発明者等は、病原体一株あたり４〜６０種類（平均３０種類）を超えるセンス及びアンチセンスオリゴＤＮＡプローブをマイクロアレイに搭載させることで、遺伝子突然変異による一部未検出プローブの相互補完を行う事を可能であることを見出した。同時に、病原体由来の蛍光シグナル強度に対する統計学的有意差を求めることで高精度な病原体検出が可能であることも見出した。これらの知見をもとに、本発明者等は、以下の発明を完成させた。本発明は、古細菌、原虫、細菌、真菌、ウイルス、及びタンパク質毒素から選ばれる少なくとも一株に由来する既知の核酸塩基配列（センス）、又は相補的な配列（アンチセンス）を有し、該塩基配列において互いに異なる少なくとも３個の群からなるオリゴＤＮＡプローブであって、その各プローブ長が５０〜７０ｍｅｒであり、Ｔｍ（ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ、融解温度）が７０〜８０℃であり、−３．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のヘアピンループ（ｈａｉｒｐｉｎ ｌｏｏｐｓ）及び−３．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のセルフダイマー（ｓｅｌｆ−ｄｉｍｅｒ）を避け、ホモロジーから推測される特異性を確保するように設計された前記プローブの群が担体上に固定化されている、病原体を検出するためのマイクロアレイ又はそれを含むキットを提供する。ここで、キットとは、マイクロアレイの使用に必要な試薬及び／又は器具を含む。本明細書において、上記「オリゴＤＮＡプローブ」は核酸プローブに含まれる。
【００１４】
前記プローブは、多種間保存領域以外の場所、すなわち、多種間保存性が高い塩基配列以外の領域の塩基配列を含むことが好ましい。
【００１５】
本発明は、古細菌、原虫、細菌、真菌、ウイルス、及びタンパク質毒素から選ばれる少なくとも一株に由来する既知の核酸塩基配列（センス）、又は相補的な配列（アンチセンス）を有し、該塩基配列において互いに異なる少なくとも３個の群からなるプローブであって、その各プローブ長が５０〜７０ｍｅｒであり、Ｔｍが７０〜８０℃であり、−３．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のヘアピンループ（ｈａｉｒｐｉｎ ｌｏｏｐｓ）及び−３．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のセルフダイマー（ｓｅｌｆ−ｄｉｍｅｒ）を避け、ホモロジーから推測される非特異性を確保するように設計された前記プローブの群が担体上に固定化されているマイクロアレイに、検体から取得した核酸をハイブリダイゼーションさせることを含む病原体の検出方法を提供する。
【００１６】
前記検体を含むと思われる試料から抽出した核酸ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを、そのまま或いは全ゲノム増幅（ＷＧＡ：Ｗｈｏｌｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）後、制限酵素又は超音波で断片化処理、蛍光標識後、ハイブリダイゼーションさせることが好ましい。その後、マイクロアレイスキャン、各スポットの蛍光シグナル強度数値化、統計処理して、病原体を検出する。
【００１７】
前記プローブは、アクセッションＮｏ．毎に２〜３０個のセンスプローブと同数のアンチセンスプローブが計４〜６０個設計されており、アクセッションＮｏ．毎に複数プローブの蛍光シグナル強度を解析することにより、病原体の遺伝子突然変異、及び機械的又は手技的誤差の影響を可能な限り排除することが好ましい。
【００１８】
前記検出方法において、特に前記数値化されたスポットの蛍光シグナル強度は病原体株アクセッションＮｏ．のセンス又はアンチセンス毎にまとめられ、各スポット群蛍光シグナル強度から算出される中央値がバックグランドと比較して明らかに高く、該蛍光シグナル強度のｐ値が０．００１よりも小さい値であり、かつＺ値が３．０９より大きい値であるとき、有意に強い蛍光シグナル強度であるとし、サンプル中に病原体が含まれたと判定することを含む。
【００１９】
本発明の検出方法は、特に、病原体が含まれる食品等の前記検体からＤＮＡ及びＲＮＡの両核酸を含む核酸溶液を核酸抽出剤（ＳｅｐａＧｅｎｅ；Ｓａｎｋｏｊｕｎｙａｋｕ Ｃｏ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）等で抽出し、前記手法を用いて試験した場合に、ＤＮＡ及びＲＮＡの核酸種を問わず病原体の有無を判定することを含む。
【発明の効果】
【００２０】
本発明のマイクロアレイによれば、インフルエンザウイルス、Ｑ熱の原因菌（Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ）、大腸菌（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）等の病原体を漏れなく特異的に検出可能である。本発明のマイクロアレイは、例えばインフルエンザウイルスの同種の亜型（Ｈ１〜Ｈ１６、Ｎ１〜Ｎ９等）を区別できる特異性と、同亜型内での変異は吸収できるほど寛容性という性質を兼ね備える。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、本発明のマイクロアレイを用いた病原体の検出方法の概要を示したモデル図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
（検出対象）
以下に、本発明のマイクロアレイの一実施の態様を詳述する。本発明のマイクロアレイには、古細菌、原虫、細菌、真菌、ウイルス、及びタンパク質毒素から選ばれる少なくとも一株に由来する既知の核酸塩基配列（センス）又は相補的な配列（アンチセンス）を有するオリゴＤＮＡプローブがスポットされる。古細菌、原虫、細菌、真菌、ウイルス、及びタンパク質毒素は、その全部又は一部の核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）が含まれているものであればよく、病原体の種や属に関係なく用いることができる。マイクロアレイ製造の技術進歩とコスト低下により、マイクロアレイ上に１万個以上のプローブを固定することが極めて容易となった。したがって、本発明のマイクロアレイに搭載するプローブの数は、ヒトを含む動物に病原性の微生物等の核酸をできるだけ多く搭載することが好ましい。表８〜１３には、実施例で使用した古細菌３０株、原虫９株、細菌４２２株、真菌５９株、ウイルス６７２株の合計１１９２株とタンパク質毒素７４遺伝子の名称をそのアクセッションＮｏ．とともに示す。好ましくは、本発明のマイクロアレイは、これらの少なくとも１割、より好ましくは少なくとも５割、さらに好ましくは少なくとも７割を搭載し、病原体検出判定に統計解析を活用する。
【００２３】
（核酸プローブの設計条件）
上記病原体の塩基配列に基づく核酸プローブの設計には、汎用のソフトウエア、例えばＡｒｒａｙ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ（Ｐｒｅｍｉｅｒ Ｂｉｏｓｏｆｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いることができる。核酸プローブの設計条件の一つとして、プローブ長は５０〜７０ｍｅｒであり、好ましくは５５〜６５ｍｅｒである。プローブ長が５０ｍｅｒより短いと、特異性と検出能力の低下を招き、誤認識の可能性を生じる。逆に、７０ｍｅｒより長いと、目的外の標識核酸のクロスハイブリダイゼーションにより非特異反応の増大し、結果的に検出シグナルが非特異シグナルと判別できなくなる可能性を生じる。
【００２４】
核酸プローブのＴｍは、７０〜８０℃である。Ｔｍが７０℃より低いと、ＧＣ含量が極度に低くなり、プローブの性能低下及び標的特異性の低下を生じる。また、高いＧＣ含量ゲノムを持つ病原体のプローブ作成に困難が伴う。逆に、８０℃より高い場合、標的特異性の低下と、低いＧＣ含量ゲノムを持つ病原体プローブの作成が困難である。
【００２５】
核酸プローブのエネルギーが−３．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のヘアピンループ及びエネルギーが−３．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のセルフダイマーを避ける。
【００２６】
核酸プローブは、クロスホモロジーもまた避ける。ホモロジーから推測される非特異性を確保するために、設計した全てのマイクロアレイプローブをＢＬＡＳＴ検索にて他のバクテリアとホモロジーが低いことを確認することが好ましい。
【００２７】
（核酸プローブ数）
古細菌、原虫、細菌、真菌、ウイルス、及びタンパク質毒素から選ばれる少なくとも一株の核酸配列から、互いに異なるプローブを少なくとも３個、好ましくは少なくとも２０個、特に好ましくは少なくとも３０個設計して、それを担体上にスポットする。さらに、塩基配列の比較的短いウイルス及びタンパク質毒素では、少なくとも３個として、塩基配列の比較的長い古細菌、原虫、細菌、及び真菌では、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個とすることもできる。マイクロアレイは、製造工程及び作業工程で生じた視認できない傷、洗浄不足による塩類析出による結晶残存、作業中に付着した塵等はレーザーを乱反射させ誤った強い蛍光シグナルを引き起こすことがある。病原体核酸をマイクロアレイで同定検出するためには、強い蛍光シグナルを発するスポットのみで同定することは不可能である。そこで、菌、ウイルス等の病原体株（同じアクセッションＮｏ．）あたり上記複数のプローブを搭載させ、エラー耐性を高める。また、アクセッションＮｏ．毎に多数のプローブを搭載することにより、変異しやすい病原体をハイブリダイゼーションさせた時の検出漏れを防ぐことができる。さらに、複数のプローブは、例えばインフルエンザウイルスの同種の亜型（Ｈ１〜Ｈ１６、Ｎ１〜Ｎ９等）を区別できる特異性と、亜型内での変異を吸収できるほど寛容性という相反する性質を付与するのに役立つ。
【００２８】
前記核酸プローブは、アクセッションＮｏ．毎に２〜３０個のセンスプローブと同数のアンチセンスプローブが計４〜６０個設計されることがより好ましい。アクセッションＮｏ．毎に上記複数のプローブの蛍光シグナル強度を解析することで、病原体の遺伝子突然変異、及び機械的又は手技的誤差の影響を、可能な限り排除することができる。
【００２９】
前記核酸プローブは、多種間ゲノム保存領域以外の塩基配列を含むことが好ましい。この多種間ゲノム保存領域以外の場所の塩基配列を含むことによって、進化的に近縁種のもの同士をより確実に区別可能となる。
【００３０】
（核酸プローブ）
上記で設計された核酸プローブは、市販品、市販の微生物や採種した微生物から常法により抽出したもの、あるいは合成したものでよい。これらのいずれかを担体に固定化する。プローブ用に抽出された核酸が二本鎖の場合、公知の加熱変性、アルカリ変性法により一本鎖にされる。一本鎖は、ＲＮＡ又はＤＮＡのセンス（＋）鎖、アンチセンス（−）鎖のいずれでもよい。また、固定化するプローブ用は光リソグラフ法やＩｎ ｓｉｔｕ合成法を用いて担体上でプローブを直接合成してもよい。
【００３１】
（担体）
上記核酸プローブを固定化するための担体は、汎用のものを特に制限なく使用可能である。担体の材質は、例えばガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、アクリル樹脂、ナイロン、ニトロセルロース、ポリフッ化ビニリデン、ポリメチルメタクリレート、シリコーン、金属等が挙げられる。担体をカチオン性化合物、アニオン性化合物、ダイヤモンド、アミノシラン、ポリリジン等でコートし、あるいはアミノ基、カルボキシル基、カルボジイミド基、イソシアネート基等で修飾することにより、プローブの固定を強化することも可能である。担体の形態は、例えば板状、フィルム状、膜状、円柱状等である。担体の大きさは、検出機器に対応して適宜決定される。また、プローブを担体に固定する際、プローブ５’末端あるいは３’末端の固定方向を問わない。
【００３２】
（固定化方法）
上記担体へのプローブの固定化方法は、当業分野で公知の方法でよく、物理吸着、化学吸着、市販のスタンピングマシンを用いる固定化方法等が挙げられる。
【００３３】
（コントロール）
増幅反応及びハイブリダイゼーションの確認のためのポジティブコントロール及び非特異的ハイブリダイゼーション有無の確認のためのネガティブコントロールとなる核酸もまた担体上にスポットすることが好ましい。
【００３４】
以下に、設計したマイクロアレイプローブを、スライドガラスへスポットする手順の一例を示す。まず、５’アミノ化されたオリゴＤＮＡを、ＧｅｎｅＳｌｉｄｅ（Ｔｏｙｏｋｏｈａｎ Ｃｏ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）上に、スポッティングマシンでスポットする。ポジションコントロールとして、Ｃｙ３及びＣｙ５で標識済オリゴＤＮＡを１０μＭの濃度でスポットする。スポットされたスライドは、８０℃で１時間固定化処理した後、０．５％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ溶液で洗浄する。洗浄後のスライドを、０．５％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ沸騰溶液で１０分間処理した後、ＤＷでリンスし、遠心乾燥する。
【００３５】
（キット）
上記で得られるマイクロアレイは、マイクロアレイの使用に必要な試薬及び／又は器具を含むキットとしてもよい。同梱する試薬の例としては、核酸抽出溶液、マイクロアレイ−サンプル核酸ハイブリダイゼーション溶液、洗浄溶液、核酸標識物質、ハイブリダイゼーションコントロール用標識済核酸が挙げられる。
【００３６】
（検体の由来）
以下に、本発明のマイクロアレイを用いた病原体の検出方法を説明する。本発明のマイクロアレイでは、特にインフルエンザウイルス、Ｑ熱の原因菌、大腸菌、エルシニア、及び野兎病菌等の病原体の検知に有効である。したがって、本発明のマイクロアレイにかける検体の出所は、水、清涼飲料水、井戸水、地下水等の飲料、食品、ヒトを含む動物の体液（血液、血清、血漿、髄液、胃液、胆汁等）、尿・糞、たん・膿等の生体由来試料、培養済み病原体等が挙げられる。
【００３７】
（核酸の抽出）
上記検体を本発明のマイクロアレイのプローブで検査するに際し、上記検体から病原体の核酸（ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）を抽出する必要がある。前記検体からＤＮＡ及びＲＮＡの両核酸を含む核酸溶液を核酸抽出剤で抽出し、ＤＮＡ及びＲＮＡの核酸種を問わず病原体の有無を判定してもよい。核酸を抽出する方法は、公知の方法を用いることができる。培養したバクテリアからのＤＮＡ抽出は、例えばＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ（Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＳｅｐａＧｅｎｅ（Ｓａｎｋｏ−ｊｕｎｙａｋｕ，Ｔｏｋｙｏ）等の市販のキットが使用できる。
【００３８】
（核酸の増幅）
マイクロアレイを用いた標的遺伝子の検出には、大量の核酸（例えば１μｇ以上）が要求される。ほとんどの場合、検体核酸を５０μｇ以上用意することは容易であるが、抽出した核酸が微量の場合は、図１に示すように、何らかの遺伝子増幅法で増殖させる必要がある。本発明のマイクロアレイは、病原体一株のゲノム上に分散する少なくとも３領域の互いに異なるプローブを搭載するので、ハイブリダイゼーションにかける核酸の増幅もまた、全ゲノムの増幅、すなわち、ＷＧＡ法を採用することが好ましい。ＷＧＡ法の具体例としては、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼを用いた増幅法、ＯｍｎｉＰｌｅｘ ＷＧＡ法、ＤＯＰ−ＰＣＲ（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｉｍｅｒ−ＰＣＲ）等が挙げられる。特に、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼを用いた増幅法及びＯｍｎｉｐｌｅｘ ＷＧＡがゲノムＤＮＡを均一に増幅する点で好ましい。ＯｍｎｉＰｌｅｘ ＷＧＡ法による増幅産物は、標的遺伝子に対する蛍光シグナル強度及びシグナルの均一性に優れる点でも好ましい。
【００３９】
ＯｍｎｉＰｌｅｘ ＷＧＡ法を用いた増幅には、市販のＧｅｎｏｍｅＰｌｅｘ Ｗｈｏｌｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ，Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）を使用可能である。鋳型ＤＮＡとして、１０ｎｇ程度のゲノムＤＮＡにＦｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを添加し、９５℃で４分間の断片化処理を行った後、急冷する。Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ及びＬｉｂｒａｒｙ Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを添加した後、９５℃で２分間サンプルＤＮＡを更に変性させる。変性したＤＮＡサンプルに、Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｅｎｚｙｍｅを添加し、１６℃で２０分間、２４℃で２０分間、３７℃で２０分間、７５℃で５分間インキュベートする。インキュベート後のサンプルに、１２．５ユニットのＴａｋａｒａ ＥｘＴａｑを含むＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを更に添加し、９５℃３分、１４サイクル（９５℃１５秒、６５℃５分）で鋳型ＤＮＡを増幅する。
【００４０】
Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼを用いた増幅には、市販のＧｅｎｏｍｉＰｈｉ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用可能である。鋳型ＤＮＡとして、例えばＥ．ｃｏｌｉ株（１０ｎｇ）のゲノムＤＮＡ溶液１μｌを、キットに添付されていたサンプル溶液９μｌへ添加し、９５℃で５分間熱処理を行った後、氷上で５分間静置する。熱変性処理を行ったサンプルにＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼを含む溶液を１０μｌ添加し、３０℃で２〜２０時間増幅した後、６５℃で１０分間、ポリメラーゼの変性処理を行う。増幅後のサンプルは、使用するまで低温（例えば−３０℃）で保存する。
【００４１】
微量のウイルスＲＮＡは、逆転写酵素でＤＮＡを増殖させる。ウイルスＲＮＡがすでに多量に存在する場合は、ＱＩＡａｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）等でゲノムＲＮＡを精製する。
【００４２】
なお、本発明のマイクロアレイにかける核酸は、菌等を培養して増殖させ、コロニーを形成した菌等から、熱水抽出法、酵素溶菌―ＳＤＳ処理、フェノール・クロロホルム法等を用いてゲノムＤＮＡやＲＮＡを抽出したものでもよい。
【００４３】
（核酸の断片化）
未処理のゲノム核酸やＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ等を用いた増幅産物は、通常、１００ｂｐ〜１０ｋｂｐの断片長のものが得られる。そこで、標識化前に、ＲｓａＩ、ＡｌｕＩ等の制限酵素や超音波処理で断片化する。なお、増幅産物が０．５ｋｂｐ程度以下であれば、断片化処理を行わなくてもよい。
【００４４】
（標識化）
検体中の核酸をハイブリダイゼーション後に検出するために、断片化した核酸を標識物質で標識する。標識物質は、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ローダミン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ダンシル、フルオレスカミン、クマリン、ナフチルアミン、ユウロピウム等の蛍光色素；ジゴキシン、ジゴキシゲニン、ビオチン、ペニシリン、トリニトロフェニル、ジニトロフェニル等のハプテン；ビオチン／ストレプトアビジンアルカリフォスファターゼ等の化学発色系；アルカリホスファターゼ、西洋わさびパーオキシダーゼ、マイクロパーオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ルシフェラーゼ等の酵素；３２Ｐ、３５Ｓ、９９ｍＴｃ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、１４Ｃ、３Ｈ等の放射性同位元素；ルシフェリン、イソルミノール、ルミノール、ビス（２，４，６−トリフロロフェニル）オキザレーロ等の発光物質；フェノール、ナフトール、アントラセン等の紫外吸収物質；並びに４−アミノ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル、３−アミノ−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル、２，６−ジ−ｔ−ブチル−α−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−オキソ−２，５−シクロヘキサジエン−１−イリデン）−ｐ−トリルオキシル等のスピン標識化剤が挙げられる。これらの標識物質を含む市販のキット、例えば蛍光色素としてＵｌｙｓｉｓ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いてよい。
【００４５】
（変性）
上記で抽出及び増幅させた核酸は、公知の加熱変性させ、ハイブリダイゼーションバッファーに溶解される。具体的には、標識化したサンプルをエタノール沈殿してハイブリダイゼーション溶液に溶解する。標識化サンプルを９５℃で３分間、氷上で３分間静置し変性処理を行い、以下に示すようにマイクロアレイにハイブリダイゼーションさせる。
【００４６】
（ハイブリダイゼーション）
上記で標識した検体核酸をマイクロアレイとハイブリダイゼーションさせるには、ハイブリダイゼーション溶液をガスケットスライド上に拡げ、マイクロアレイスライドと張り合わせ、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｏｖｅｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ）等で加熱する。Ｔｈ（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ、ハイブリダイゼーション温度）は好ましくは５０℃近辺の温度である。５０℃より高過ぎると、感度が下がり、逆に、５０℃より低過ぎると非特異吸着によるノイズが増える可能性がある。ハイブリダイゼーションの時間は、通常、１〜２４時間である。
【００４７】
ハイブリダイゼーション後のスライドは、バッファーで洗浄し、非特異的に結合した検体標識核酸を除去する。これを２〜３回繰り返した後、ＤＷでリンスする。なお、洗浄時の温度は、十分な感度を保つ温度で行うのが好ましく、通常、Ｔｈ温度かそれよりも低く（例えば５０℃）設定される。
【００４８】
（解析）
ハイブリダイゼーション後の検出は、標識物質に応じて公知の方法により行うことができる。蛍光物質の場合は蛍光スキャナーにより光量を測定する。放射性元素の場合は放射能カウンター、バイオイメージアナライザー等で測定する。酵素の場合は公知の方法で酵素活性を測定する。抗原、抗体で標識した場合は、標識した抗原又は抗体と特異的に反応する抗体又は抗原を用いて抗原抗体反応させ、反応生成物を公知の方法により測定する。
【００４９】
以下に、蛍光色素を使用した場合を説明する。遠心乾燥したマイクロアレイスライドを、色素に応じて例えば赤色レーザー（Ｃｙ５検出用）や緑色レーザー（Ｃｙ３検出用）に当て、スキャナーで読み込む。得られた画像ファイルを、例えばＳｃａｎＡｒｒａｙ Ｅｘｐｒｅｓｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、Ａｇｉｌｅｎｔ ＤＮＡマイクロアレイスキャナ等で取得したスキャンイメージからスポット毎の蛍光シグナル強度を算出し、病原体株毎の蛍光シグナル強度の中央値、平均値、ｐ値、及びＺ値を算出する。
【００５０】
本発明のマイクロアレイに搭載されたプローブは特異性が高く、検体に含まれる病原体に該当するスポットのみが高い蛍光シグナルを発するため、平均値や中央値のみでも標的サンプルの検出が充分に可能である。しかし、臨床サンプル、野外サンプル等のように雑多な核酸が含まれている検体では、該当するスポット以外にも非特異的に蛍光を発するスポットが出現する可能性がある。そこで、これらのサンプルで想定病原体が偶然検出されたのか否かを検証するためには、ｐ値及びＺ値を算出して統計学的な裏付けとする。
【００５１】
「標的スポット群」及び、「全スポットから標的スポットを除いた群」を形成するシグナル蛍光シグナル強度の分散状態に統計学的有意差が観察されるかを見極めるため、有意水準（α）＝０．００１（すなわち、０．１％の確率で偶然有意差があると判定される水準）でｐ値を算出する。算出されたｐ値は、帰無仮説（すなわち、母集団の分散状態に差は無いと言う仮説）が棄却可能か、つまり対立仮説（すなわち、母集団の分散状態に差は有ると言う仮説）が成立するかを検証する。Ｚ値は、同様の水準である限界値＝３．０９に設定し、帰無仮説（母集団の平均値が等しい）が棄却できるか、つまり対立仮説（母集団の平均値が等しくない）が成立するかを検証する。ｐ値が０．００１よりも小さい値であるとき、Ｚ値が３．０９より大きい値であったとき、帰無仮説が棄却できる。
【実施例】
【００５２】
本発明のマイクロアレイの作成とその使用を、実施例を用いて詳細に説明する。しかし、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
（マイクロアレイプローブの設計と作成）
ゲノムプロジェクトが終了又は進行中の古細菌３０株、原虫９株、細菌４２２株、真菌５９株、ウイルス６７２株の合計１１９２株、タンパク毒素等７４遺伝子の全長ゲノム配列又は一部の塩基配列をＤＤＢＪ（ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ）又はＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）から入手した。上記遺伝子のアクセッションＮｏ．を表８〜１３に示す。
【００５３】
上記塩基配列を、Ａｒｒａｙ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ（Ｐｒｅｍｉｅｒ Ｂｉｏｓｏｆｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）へ読み込み、アクセッションＮｏ．ごとに１０〜５００種類のセンス鎖マイクロアレイプローブを設計した。プローブの設計条件は、プローブ長６０ｍｅｒ、Ｔｍ ７５℃±５．０℃とし、ヘアピンループ（＜−３．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ）及びセルフダイマー（＜−３．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ）、並びにクロスホモロジーを極力回避した。
【００５４】
総計５万を超える全てのセンス鎖プローブ候補をＰｒｏｂｅＭｏｗｅｒ（Ｓｙｍｐｌｕｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いてホモロジー検索（ＢＬＡＳＴ検索）を行い、十分な特異性を持つ１９，４９３種類のセンス鎖プローブを選定した。更に、そのアンチセンス鎖プローブとの合計３８，９８６種類のプローブ（アクセッションＮｏ．あたり平均３０個）をマイクロアレイに搭載させた。ハイブリダイゼーションダイゼージョンの外部評価用に別途４００種類のコントロールスポットを１０連でマイクロアレイスライドにプリントした。全てのマイクロアレイスライドを、４４，０００プローブ×４アレイ／スライドのレイアウトで作成した。
【００５５】
（ウイルス及びバクテリアからの核酸抽出）
上記で作成したマイクロアレイにハイブリダイゼーションさせる核酸を、以下の手順で準備した。インフルエンザウイルスの３種類の株（ＰＲ８、ＷＳＮ、及びＡ／ｄｕｃｋ／Ｈｙｏｇｏ／３５／０１（Ｈ５Ｎ１））については、ＱＩＡａｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて、ゲノムＲＮＡを精製した。ゲノムＲＮＡは、それぞれ、超音波処理にて断片化した。断片を標識し、後述のハイブリダイゼーションに供した。
【００５６】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＥＲ２９２５株を、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（ＮＥＢ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）から入手し、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地にて３７℃で一晩培養した。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉからのＤＮＡ抽出を、ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ（Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で行った。
【００５７】
Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ Ｏｈｉｏ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ＳＣＨＵ、及びＹｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ Ｐａ １７７（Ｏ９：Ｂ２）のゲノムＤＮＡは、国立感染症研究所獣医科学部所有の核酸抽出溶液を使用した。
【００５８】
（微量バクテリア由来ゲノムＤＮＡの増幅）
Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼを用いた増幅に、ｉｌｌｕｓｔｒａ ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ Ｖ２キット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用した。鋳型ＤＮＡとして、１０ｎｇのＣｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、及びＹｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃの核酸を用いた。１μｌのサンプＤＮＡ溶液を、前記キットに添付されたサンプル溶液９μｌへ添加し、９５℃で５分間熱処理を行った後、氷上で５分間静置した。熱変性処理を行ったサンプルにＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼを含む反応溶液を１０μｌ添加し、３０℃で２時間増幅した後、６５℃で１０分間ポリメラーゼの熱変性処理を行った。増幅後のサンプルは、使用するまで−３０℃で保存した。
【００５９】
（断片化）
未処理のゲノムＤＮＡやＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅した上記産物やゲノムＲＮＡは、Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ（Ｃｏｓｍｏ Ｂｉｏ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で２５０Ｗ、３０秒インターバルで３０分間、超音波断片化処理した。
（熱変性）
【００６０】
断片化処理を行った核酸サンプルを、熱変性処理後、Ｕｌｙｓｉｓ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて８０℃で１５分間、標識化処理した。標識化処理を行ったサンプルは、公知のエタノール沈澱法、又はＤＮＡの場合ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＥｘｔｒａｃｔＩＩ （ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ，ＵＳＡ）で、ＲＮＡの場合Ｒｎｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。
【００６１】
サンプルは、１００μｌのハイブリダイゼーションバッファー（終濃度：核酸、６×ＳＳＣ，５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ，５０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，０．５％ＳＤＳ，２０％ｆｏｒｍａｍｉｄｅ，５％Ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ，５０μｇ／ｍｌ Ｙｅａｓｔ ｔＲＮＡ）に調整し、９５℃で３分間熱処理を行い、２分間氷上で静置し、使用するまで５０℃で保温した。
【００６２】
（ハイブリダイゼーション）
１００μｌのハイブリダイゼーションサンプル溶液を、ガスケットスライド（Ａｇｉｌｅｎｔ）上に拡げ、マイクロアレイスライドと張り合わせホルダーにセットした。ハイブリダイゼーションは、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｏｖｅｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて５０℃、毎分１０回転で一晩行った。
【００６３】
ハイブリダイゼーション後のスライドは、０．５％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣで５０℃、５分間１回、１×ＳＳＣで５０℃、５分間２回洗浄した。さらに、ミリＱ水でリンスし、遠心乾燥したスライドを、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｓｃａｎｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて、１００％出力の緑色レーザー（Ａｌｅｘａ５４６及びＣｙ３検出用）、１００％ＰＭＴ、解像度５μｍ、ダイナミックレンジＯＦＦの設定でスキャンした。得られた画像ファイルから、Ｆｅａｔｕｒｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて各スポットの蛍光シグナル強度を数値化した。
【００６４】
（解析）
Ｆｅａｔｕｒｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｎｅｔ）によって出力されたデータテキストファイルを、Ｇｅｎｅ Ａｒｒａｙ Ｕｔｉｌｉｔｙ（ＧＡＵ；Ｓｙｍｐｌｕｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）に読み込み、各種解析を行った。
【００６５】
データテキストファイルに含まれる３８，９８６病原体検出プローブ由来スポットの６２項目のデータ中から、アクセッションＮｏ．、プローブ名、遺伝子名、及びシグナル蛍光シグナル強度の４項目を抽出した。
【００６６】
抽出したデータは、アクセッションＮｏ．毎にまとめ、さらにセンス又はアンチセンス鎖に細分し「群」とした。一群内のシグナル平均値及び中央値を算出し、シグナル蛍光シグナル強度中央値の高い順に該当候補として順位を付けた。
【００６７】
（インフルエンザウイルスゲノムのＭＭＰＤＡ解析結果）
インフルエンザウイルスＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４株（Ｈ１Ｎ１）のＭＭＰＤＡ解析結果を表１Ａに示す。そして、最も強いシグナルとして検出されたＩｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ Ｎ１ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ（ＮＡ）ｇｅｎｅ（アクセッションＮｏ．ＡＹ１２２３２６）の塩基配列（６０ｍｅｒ、７領域）を、アクセッションＮｏ．と５‘末端側出発位置との組み合わせとして表１Ｂに列記する。ここで、ｓはセンス鎖を意味する。
【００６８】
【表１Ａ】
【００６９】
【表１Ｂ】
【００７０】
表１ＡのインフルエンザウイルスＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）株のサンプルでは、期待したどおり、サンプルと同亜型（Ｈ１Ｎ１）のインフルエンザウイルスＡ／Ｍａｒｔｏｎ／４３（Ｈ１Ｎ１）ＮＡ株が最も強いシグナルとして検出された。検出された７スポット由来の核酸プローブの塩基配列は、表１Ｂに示すとおり、アクセッションＮｏ．ＡＹ１２２３２６（全長１４１１ｂｐ）の配列全般にわたって設計されたプローブである。これらの７つのスポットは、ｐ＝２．６２ｅ−１３、Ｚ＝３．１９であり、統計学的にも帰無仮説が十分に棄却できる水準であった。
【００７１】
このサンプルで２番目に強いシグナルを発していたのは、（Ａ／Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ／３２／２００３（Ｈ３Ｎ２）ＮＡであったが、蛍光シグナルの強さは１番目の候補と比較して５割の水準であった。さらに、このシグナルのｐ値に有意差が確認できるものの、Ｚ値に有意差が確認できるレベルでなかった。よって、Ｈ１Ｎ１型インフルエンザウイルスを特異的に検出できたと考える。
【００７２】
ＡＹ１２２３２６を検出する核酸プローブ７個と検体のＨ１Ｎ１型インフルエンザウイルスは、塩基の違いに由来すると思われる蛍光シグナル強度のバラつきも検出された。
【００７３】
他のインフルエンザウイルスＡ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）株のゲノムＲＮＡのＭＭＰＤＡ解析結果を表２Ａに示す。そして、最も強いシグナルとして検出されたＩｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ Ｎ１ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ（ＮＡ）ｇｅｎｅ（アクセッションＮｏ．ＡＹ１２２３２６）の塩基配列（６０ｍｅｒ、７領域）を、アクセッションＮｏ．と５‘末端側出発位置との組み合わせとして表２Ｂに列記する。ここで、ｓはセンス鎖を意味する。
【００７４】
【表２Ａ】
【００７５】
【表２Ｂ】
【００７６】
表２Ａに示すとおり、検体と同亜型のＨ１Ｎ１型インフルエンザウイルスが特異性と信頼性をもって検出された。
【００７７】
さらに他のインフルエンザウイルスＡ／ｄｕｃｋ／Ｈｙｏｇｏ／３５／０１（Ｈ５Ｎ１）株のゲノムＲＮＡのＭＭＰＤＡ解析結果を表３Ａに示す。そして、最も強いシグナルとして検出されたＩｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ Ｈ５Ｎ１ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ（ＮＡ）ｇｅｎｅ（アクセッションＮｏ．ＡＢ１６６８６４）の塩基配列（６０ｍｅｒ、１１領域）を、アクセッションＮｏ．と５‘末端側出発位置との組み合わせとして表３Ｂに列記する。ここで、ｓはセンス鎖を意味する。
【００７８】
【表３Ａ】
【００７９】
【表３Ｂ】
【００８０】
表３Ａに示すとおり、検体中に含まれるＨ５Ｎ１型のＮＡ遺伝子が特異性と信頼性をもって検出できた。検出された１１スポットの塩基配列は、表３Ｂに示すとおり、アクセッションＮｏ．ＡＢ１６６８６４（全長１３５０ｂｐ）の配列全般にわたって設計されたプローブである。
【００８１】
（バクテリアゲノムのＭＭＤＰＡ解析結果）
４種類のバクテリアからゲノムＤＮＡを精製、増幅、断片化、標識化したものとのハイブリダイゼーション結果を、以下に示す。
【００８２】
〔Ｑ熱原因菌ゲノムのＭＭＤＰＡ解析結果〕
Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ Ｏｈｉｏのハイブリダイゼーション結果を表４Ａに示す。そして、最も強いシグナルとして検出されたＣｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ ＲＳＡ ４９３，ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ（アクセッションＮｏ．ＡＥ０１６８２８）の塩基配列（６０ｍｅｒ、３０領域）を、アクセッションＮｏ．と５‘末端側出発位置との組み合わせとして表４Ｂに列記する。ここで、ｓはセンス鎖を意味する。
【００８３】
【表４Ａ】
【００８４】
【表４Ｂ】
【００８５】
表４において、ｐ値及びＺ値は、同種のＣｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ ＲＳＡ ４９３（アクセッションＮｏ．ＡＥ０１６８２８）が最も高い値を示した。検出されたプローブは、表４Ａに示すとおり、ＡＥ０１６８２８（１９９５２８１ｂｐ）のゲノム全般にわたって設計されたものである。検体に含まれるＣｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉは、Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ ＲＳＡ ４９３（アクセッションＮｏ．ＡＥ０１６８２８）を標的にして設計されたプローブに非常に近いと考えられた。二番目の強度を示したものは、Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ ＲＳＡ ４９３のアンチセンス鎖であった。３番目に高い蛍光シグナル強度を示したものは、Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｉｎｅ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ１６である。それはＣｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉの４割程度の蛍光シグナル強度であり、ｐ値及びＺ値で帰無仮説が棄却できない水準であった。よって、Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ Ｏｈｉｏを含む検体に対して、同種のＣｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ ＲＳＡ ４９３により特異的に検出できたといえる。
【００８６】
〔大腸菌ゲノムのＭＭＤＰＡ解析結果〕
Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ゲノムＤＮＡを同様に解析した結果を表５Ａに示す。この結果、最も強いシグナルとして検出されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ ＤＮＡ，ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ（アクセッションＮｏ．ＡＣ＿００００９１）の塩基配列（６０ｍｅｒ、１７領域）を、アクセッションＮｏ．と５‘末端側出発位置との組み合わせとして表５Ｂに列記する。ここで、ｓはセンス鎖を意味する。
【００８７】
【表５Ａ】
【００８８】
【表５Ｂ】
【００８９】
表５Ａにおいて、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉが、最も高い蛍光シグナルを発していた。検出に用いた１７スポットは、表５Ｂに示すとおり、ゲノムの全般にわたって設計されたものである。病原体検出候補の３番目〜１２番目に含まれる蛍光シグナル強度中央値が高かった多くのＳｈｉｇｅｌｌａ属（赤痢菌）は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属（大腸菌）との遺伝子相同性が非常に高いため、本来、塩基配列で分別する事は困難である。しかし、表５に示した結果では、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのシグナルがＳｈｉｇｅｌｌａ属よりも高い候補順位を付けられたことから、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを特異的に同定できたと考えられる。
【００９０】
〔エルシニアゲノムのＭＭＤＰＡ解析結果〕
Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ Ｐａ １７７（Ｏ９：Ｂ２）ゲノムを検体とした時の解析結果を表６Ａに示す。そして、最も強いシグナルとして検出されたＹｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ ｓｕｂｓｐ． ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ ８０８１ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ（アクセッションＮｏ．ＡＭ２８６４１５）の塩基配列（６０ｍｅｒ、２１領域）を、アクセッションＮｏ．と５‘末端側出発位置との組み合わせとして表６Ｂに列記する。ここで、ａはアンチセンス鎖を意味する。
【００９１】
【表６Ａ】
【００９２】
【表６Ｂ】
【００９３】
表６Ａにおいて、最も蛍光シグナル強度の高いスポットｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ ｓｕｂｓｐ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ ８０８１ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅであった。検出に用いたプローブの位置は、表６Ｂに示すとおり、ゲノムの全領域に渡っていた。よって、本発明のマイクロアレイにより検体に含まれる病原体を特異的に同定できたと考える。
【００９４】
〔野兎病菌ゲノムのＭＭＤＰＡ解析結果〕
Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ＳＣＨＵ核酸抽出物の検査結果を表７Ａに示す。最も強いシグナルとして検出されたＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ＷＹ９６−３４１８， ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ（アクセッションＮｏ．ＣＰ０００６０８）の塩基配列（６０ｍｅｒ、２９領域）を、アクセッションＮｏ．と５‘末端側出発位置との組み合わせとして表７Ｂに列記する。ここで、ａはアンチセンス鎖を意味する。
【００９５】
【表７Ａ】
【００９６】
【表７Ｂ】
【００９７】
表７Ａにおいて、候補順位１−７までＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ由来のアクセッションＮｏ．がランキングされ、他病原体の蛍光シグナル強度と比較して強い蛍光シグナル強度と有意差が検出された。この結果からも、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓが特異的に検出可能であることが示された。
【００９８】
（実施例に用いた古細菌３０株）
【表８】
【００９９】
（実施例に用いた原虫９株）
【表９】
【０１００】
（実施例に用いた細菌）
【表１０Ａ】
【０１０１】
【表１０Ｂ】
【０１０２】
【表１０Ｃ】
【０１０３】
【表１０Ｄ】
【０１０４】
【表１０Ｅ】
【０１０５】
【表１０Ｆ】
【０１０６】
【表１０Ｇ】
【０１０７】
【表１０Ｈ】
【０１０８】
【表１０Ｉ】
【０１０９】
【表１０Ｊ】
【０１１０】
【表１０Ｋ】
【０１１１】
【表１０Ｌ】
【０１１２】
（実施例に用いたウイルス）
【表１１Ａ】
【０１１３】
【表１１Ｂ】
【０１１４】
【表１１Ｃ】
【０１１５】
【表１１Ｄ】
【０１１６】
【表１１Ｅ】
【０１１７】
【表１１Ｆ】
【０１１８】
【表１１Ｇ】
【０１１９】
【表１１Ｈ】
【０１２０】
【表１１Ｉ】
【０１２１】
【表１１Ｊ】
【０１２２】
【表１１Ｋ】
【０１２３】
【表１１Ｌ】
【０１２４】
【表１１Ｍ】
【０１２５】
【表１１Ｎ】
【０１２６】
【表１１Ｏ】
【０１２７】
【表１１Ｐ】
【０１２８】
【表１１Ｑ】
【０１２９】
【表１１Ｒ】
【０１３０】
【表１１Ｓ】
【０１３１】
（実施例に用いた真菌５９株）
【表１２Ａ】
【０１３２】
【表１２Ｂ】
【０１３３】
（実施例に用いたタンパク毒素等７４遺伝子）
【表１３Ａ】
【０１３４】
【表１３Ｂ】
【０１３５】
【表１３Ｃ】
【産業上の利用可能性】
【０１３６】
本発明のマイクロアレイは、病原体同定不能な臨床検体から、病原体、その他の微生物やウイルスを一括、簡単、網羅的に同時検出するのに有用である。また、野外検体、食品、家畜から、病原体、その他の微生物やウイルスを一括、簡単、網羅的に同時検出するのに有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、臨床検体、野外検体、食品その他の検体から、ウイルス、細菌、タンパク質毒素等の病原体を一括、簡単、網羅的に同時検出するためのマイクロアレイ、及びそのマイクロアレイを使用した病原体の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
各種の感染症の診断にあたっては、感染症の臨床的診断とともに、迅速かつ正確な実験室検査が必要である。従来、培養増殖された病原体は主に生化学的手法を用いて判定されていた。このような検査手法は、時間と労力がかかるため、現在、病原体タンパク質に対する抗体を用いて検出する方法（例えばＥＬＩＳＡ）、及び病原体核酸をＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション）反応で増幅する手法（例えばリアルタイムＰＣＲ）が主流である。ウイルスゲノム等の病原体核酸をＰＣＲ反応で増幅して検出する方法は、特異性及び検出感度で優れている。
【０００３】
しかし、ＰＣＲ反応では病原体毎に特異的プライマーを設計しなければならず、標的が絞られていない場合や病原体が遺伝子突然変異を伴う場合、ＰＣＲ反応の適用に困難を伴う。
【０００４】
多種類の病原体が関わる感染症や特定不能な感染症の病原体検査では、複数の病原体核酸を一括して同定できることが望ましい。その手法として、マイクロアレイを用いた検出法がある。マイクロアレイは、数十から数十万遺伝子の標的核酸に対して相補的な核酸プローブ（ＰＣＲ増幅産物やオリゴヌクレオチド）を固定化したスライドガラスに、蛍光色素等で標識した核酸試料を会合させ、目的遺伝子の有無を判別し、また、目的遺伝子を定量する方法である。従来から用いられるＰＣＲ反応を用いた検出試験では同時に行える検出数に限界があるので、１検体から同時多検出試験を行えるプラットフォームとしてのマイクロアレイは、病原体核酸検出法として有望である。現在、目的別に多種多様な核酸プローブを固定化したマイクロアレイ及びそれを含むキットが市販されている。
【０００５】
発売当初は高価であったマイクロアレイは、近年、非常に安価に製造できるようになり、通常の臨床検査レベルでの普及に現実味を帯びてきた。今後の本格的な普及を前に、ヒト、家畜、家禽等に対して病原性のウイルス、細菌、真菌、原虫等を１回の検査で一括、簡単、網羅的に同時検出可能なマイクロアレイの開発が期待される。
【０００６】
微生物の検出を目的としたオリゴヌクレオチドプローブを利用した例として、短時間で多数の種類のレジオネラ属細菌を一種類のプローブで特異的に高精度に検出可能な技術が知られている（特許文献１）。これらをはじめとする既存のプローブを用いた検出方法では、ゲノム上の保存領域の塩基配列を使用することが多い。例えば細菌を含む原核生物のｒＲＮＡがコードされているゲノム上の配列（ｒＤＮＡ）は、多岐にわたる種間で塩基配列の保存性が高く、プライマー設計、及びＰＣＲ反応による多種間の当該遺伝子増幅が容易である。更に、ｒＤＮＡは各々菌特有の塩基多型が見られる。上記２つの理由から、菌種判定に利用されやすい。
【０００７】
しかし、多種間保存性が高い塩基配列をプローブとして用いた場合、例えば大腸菌と赤痢菌のように２種間ｒＤＮＡ相同性が９９．３％ある場合に、両者を区別できないことがあるという問題がある。
【０００８】
ｒＤＮＡ以外の塩基配列をプローブとして採用する方法として、担体面上に固定化された互いにＧＣ含量の異なる複数の既知微生物由来染色体ＤＮＡと、検体中に未知微生物由来染色体ＤＮＡとを反応させ、生じたハイブリダイゼーション複合体を検出することを特徴とする微生物の同定方法、及びＧＣ含量の異なる多数の既知微生物由来染色体ＤＮＡが同一面上に固定された担体を含んでなる、微生物固定用キットが知られている（特許文献２）。種や属間の大まかな相違を検出できる可能性はあるが、前述同様に相同性の高い種間の分別は困難になることが予想される。
【０００９】
本発明者等は、食品中に含まれる多種類の病原体を同時に検出するためのマイクロアレイの開発を続け、マイクロアレイ用に好適な核酸増幅法を確立した（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００１−２９９３９６
【特許文献２】特開平１０−１９１９８２
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｕｄａ Ａ， Ｔａｎａｂａｙａｓｈｉ Ｋ， Ｆｕｊｉｔａ Ｏ， Ｈｏｔｔａ Ａ， Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｙ， Ｙａｍａｄａ Ａ． Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｕｓｉｎｇ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ． Ｊｐｎ Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．２００７ ６０：３５５−６１．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、上記知見をさらに発展させ、臨床検体、野外検体、その他の検体（食品、水等）において、ヒト、家畜、家禽に対して病原性を示すウイルス、細菌、真菌、古細菌、原虫、タンパク質毒素等を一括、簡単、網羅的に同時検出するためのマイクロアレイを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、多種多様な病原体を同時に一括検出するために、マイクロアレイへの応用を試みた。ゲノムプロジェクトが終了又は途中の古細菌３０株、原虫９株、細菌４２２株、真菌５９株、ウイルス６７２株の合計１１９２株の全長ゲノム配列並びにタンパク毒素等７４遺伝子からマイクロアレイに最適なプローブを５万種類以上設計した。設計した全てのプローブのホモロジー検索（ＢＬＡＳＴ検索）を行い、各病原体に対する特異的検出に有効であると推測された３８，９８６プローブを選定し、これらのプローブを搭載したマイクロアレイＭｉｃｒｏａｒｒａｙ ｆｏｒ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ａｇｅｎｔｓ（以下、ＭＭＰＤＡと略す）を開発した。ＭＭＰＤＡは、病原体検出用プローブの特異性の確認及び統計学的手法を用いた検出病原体の絞込みにおいて、予想を上回る成果を収めた。上記成果に基づいて、本発明者等は、病原体一株あたり４〜６０種類（平均３０種類）を超えるセンス及びアンチセンスオリゴＤＮＡプローブをマイクロアレイに搭載させることで、遺伝子突然変異による一部未検出プローブの相互補完を行う事を可能であることを見出した。同時に、病原体由来の蛍光シグナル強度に対する統計学的有意差を求めることで高精度な病原体検出が可能であることも見出した。これらの知見をもとに、本発明者等は、以下の発明を完成させた。本発明は、古細菌、原虫、細菌、真菌、ウイルス、及びタンパク質毒素から選ばれる少なくとも一株に由来する既知の核酸塩基配列（センス）、又は相補的な配列（アンチセンス）を有し、該塩基配列において互いに異なる少なくとも３個の群からなるオリゴＤＮＡプローブであって、その各プローブ長が５０〜７０ｍｅｒであり、Ｔｍ（ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ、融解温度）が７０〜８０℃であり、−３．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のヘアピンループ（ｈａｉｒｐｉｎ ｌｏｏｐｓ）及び−３．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のセルフダイマー（ｓｅｌｆ−ｄｉｍｅｒ）を避け、ホモロジーから推測される特異性を確保するように設計された前記プローブの群が担体上に固定化されている、病原体を検出するためのマイクロアレイ又はそれを含むキットを提供する。ここで、キットとは、マイクロアレイの使用に必要な試薬及び／又は器具を含む。本明細書において、上記「オリゴＤＮＡプローブ」は核酸プローブに含まれる。
【００１４】
前記プローブは、多種間保存領域以外の場所、すなわち、多種間保存性が高い塩基配列以外の領域の塩基配列を含むことが好ましい。
【００１５】
本発明は、古細菌、原虫、細菌、真菌、ウイルス、及びタンパク質毒素から選ばれる少なくとも一株に由来する既知の核酸塩基配列（センス）、又は相補的な配列（アンチセンス）を有し、該塩基配列において互いに異なる少なくとも３個の群からなるプローブであって、その各プローブ長が５０〜７０ｍｅｒであり、Ｔｍが７０〜８０℃であり、−３．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のヘアピンループ（ｈａｉｒｐｉｎ ｌｏｏｐｓ）及び−３．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のセルフダイマー（ｓｅｌｆ−ｄｉｍｅｒ）を避け、ホモロジーから推測される非特異性を確保するように設計された前記プローブの群が担体上に固定化されているマイクロアレイに、検体から取得した核酸をハイブリダイゼーションさせることを含む病原体の検出方法を提供する。
【００１６】
前記検体を含むと思われる試料から抽出した核酸ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを、そのまま或いは全ゲノム増幅（ＷＧＡ：Ｗｈｏｌｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）後、制限酵素又は超音波で断片化処理、蛍光標識後、ハイブリダイゼーションさせることが好ましい。その後、マイクロアレイスキャン、各スポットの蛍光シグナル強度数値化、統計処理して、病原体を検出する。
【００１７】
前記プローブは、アクセッションＮｏ．毎に２〜３０個のセンスプローブと同数のアンチセンスプローブが計４〜６０個設計されており、アクセッションＮｏ．毎に複数プローブの蛍光シグナル強度を解析することにより、病原体の遺伝子突然変異、及び機械的又は手技的誤差の影響を可能な限り排除することが好ましい。
【００１８】
前記検出方法において、特に前記数値化されたスポットの蛍光シグナル強度は病原体株アクセッションＮｏ．のセンス又はアンチセンス毎にまとめられ、各スポット群蛍光シグナル強度から算出される中央値がバックグランドと比較して明らかに高く、該蛍光シグナル強度のｐ値が０．００１よりも小さい値であり、かつＺ値が３．０９より大きい値であるとき、有意に強い蛍光シグナル強度であるとし、サンプル中に病原体が含まれたと判定することを含む。
【００１９】
本発明の検出方法は、特に、病原体が含まれる食品等の前記検体からＤＮＡ及びＲＮＡの両核酸を含む核酸溶液を核酸抽出剤（ＳｅｐａＧｅｎｅ；Ｓａｎｋｏｊｕｎｙａｋｕ Ｃｏ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）等で抽出し、前記手法を用いて試験した場合に、ＤＮＡ及びＲＮＡの核酸種を問わず病原体の有無を判定することを含む。
【発明の効果】
【００２０】
本発明のマイクロアレイによれば、インフルエンザウイルス、Ｑ熱の原因菌（Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ）、大腸菌（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）等の病原体を漏れなく特異的に検出可能である。本発明のマイクロアレイは、例えばインフルエンザウイルスの同種の亜型（Ｈ１〜Ｈ１６、Ｎ１〜Ｎ９等）を区別できる特異性と、同亜型内での変異は吸収できるほど寛容性という性質を兼ね備える。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、本発明のマイクロアレイを用いた病原体の検出方法の概要を示したモデル図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
（検出対象）
以下に、本発明のマイクロアレイの一実施の態様を詳述する。本発明のマイクロアレイには、古細菌、原虫、細菌、真菌、ウイルス、及びタンパク質毒素から選ばれる少なくとも一株に由来する既知の核酸塩基配列（センス）又は相補的な配列（アンチセンス）を有するオリゴＤＮＡプローブがスポットされる。古細菌、原虫、細菌、真菌、ウイルス、及びタンパク質毒素は、その全部又は一部の核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）が含まれているものであればよく、病原体の種や属に関係なく用いることができる。マイクロアレイ製造の技術進歩とコスト低下により、マイクロアレイ上に１万個以上のプローブを固定することが極めて容易となった。したがって、本発明のマイクロアレイに搭載するプローブの数は、ヒトを含む動物に病原性の微生物等の核酸をできるだけ多く搭載することが好ましい。表８〜１３には、実施例で使用した古細菌３０株、原虫９株、細菌４２２株、真菌５９株、ウイルス６７２株の合計１１９２株とタンパク質毒素７４遺伝子の名称をそのアクセッションＮｏ．とともに示す。好ましくは、本発明のマイクロアレイは、これらの少なくとも１割、より好ましくは少なくとも５割、さらに好ましくは少なくとも７割を搭載し、病原体検出判定に統計解析を活用する。
【００２３】
（核酸プローブの設計条件）
上記病原体の塩基配列に基づく核酸プローブの設計には、汎用のソフトウエア、例えばＡｒｒａｙ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ（Ｐｒｅｍｉｅｒ Ｂｉｏｓｏｆｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いることができる。核酸プローブの設計条件の一つとして、プローブ長は５０〜７０ｍｅｒであり、好ましくは５５〜６５ｍｅｒである。プローブ長が５０ｍｅｒより短いと、特異性と検出能力の低下を招き、誤認識の可能性を生じる。逆に、７０ｍｅｒより長いと、目的外の標識核酸のクロスハイブリダイゼーションにより非特異反応の増大し、結果的に検出シグナルが非特異シグナルと判別できなくなる可能性を生じる。
【００２４】
核酸プローブのＴｍは、７０〜８０℃である。Ｔｍが７０℃より低いと、ＧＣ含量が極度に低くなり、プローブの性能低下及び標的特異性の低下を生じる。また、高いＧＣ含量ゲノムを持つ病原体のプローブ作成に困難が伴う。逆に、８０℃より高い場合、標的特異性の低下と、低いＧＣ含量ゲノムを持つ病原体プローブの作成が困難である。
【００２５】
核酸プローブのエネルギーが−３．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のヘアピンループ及びエネルギーが−３．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のセルフダイマーを避ける。
【００２６】
核酸プローブは、クロスホモロジーもまた避ける。ホモロジーから推測される非特異性を確保するために、設計した全てのマイクロアレイプローブをＢＬＡＳＴ検索にて他のバクテリアとホモロジーが低いことを確認することが好ましい。
【００２７】
（核酸プローブ数）
古細菌、原虫、細菌、真菌、ウイルス、及びタンパク質毒素から選ばれる少なくとも一株の核酸配列から、互いに異なるプローブを少なくとも３個、好ましくは少なくとも２０個、特に好ましくは少なくとも３０個設計して、それを担体上にスポットする。さらに、塩基配列の比較的短いウイルス及びタンパク質毒素では、少なくとも３個として、塩基配列の比較的長い古細菌、原虫、細菌、及び真菌では、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個とすることもできる。マイクロアレイは、製造工程及び作業工程で生じた視認できない傷、洗浄不足による塩類析出による結晶残存、作業中に付着した塵等はレーザーを乱反射させ誤った強い蛍光シグナルを引き起こすことがある。病原体核酸をマイクロアレイで同定検出するためには、強い蛍光シグナルを発するスポットのみで同定することは不可能である。そこで、菌、ウイルス等の病原体株（同じアクセッションＮｏ．）あたり上記複数のプローブを搭載させ、エラー耐性を高める。また、アクセッションＮｏ．毎に多数のプローブを搭載することにより、変異しやすい病原体をハイブリダイゼーションさせた時の検出漏れを防ぐことができる。さらに、複数のプローブは、例えばインフルエンザウイルスの同種の亜型（Ｈ１〜Ｈ１６、Ｎ１〜Ｎ９等）を区別できる特異性と、亜型内での変異を吸収できるほど寛容性という相反する性質を付与するのに役立つ。
【００２８】
前記核酸プローブは、アクセッションＮｏ．毎に２〜３０個のセンスプローブと同数のアンチセンスプローブが計４〜６０個設計されることがより好ましい。アクセッションＮｏ．毎に上記複数のプローブの蛍光シグナル強度を解析することで、病原体の遺伝子突然変異、及び機械的又は手技的誤差の影響を、可能な限り排除することができる。
【００２９】
前記核酸プローブは、多種間ゲノム保存領域以外の塩基配列を含むことが好ましい。この多種間ゲノム保存領域以外の場所の塩基配列を含むことによって、進化的に近縁種のもの同士をより確実に区別可能となる。
【００３０】
（核酸プローブ）
上記で設計された核酸プローブは、市販品、市販の微生物や採種した微生物から常法により抽出したもの、あるいは合成したものでよい。これらのいずれかを担体に固定化する。プローブ用に抽出された核酸が二本鎖の場合、公知の加熱変性、アルカリ変性法により一本鎖にされる。一本鎖は、ＲＮＡ又はＤＮＡのセンス（＋）鎖、アンチセンス（−）鎖のいずれでもよい。また、固定化するプローブ用は光リソグラフ法やＩｎ ｓｉｔｕ合成法を用いて担体上でプローブを直接合成してもよい。
【００３１】
（担体）
上記核酸プローブを固定化するための担体は、汎用のものを特に制限なく使用可能である。担体の材質は、例えばガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、アクリル樹脂、ナイロン、ニトロセルロース、ポリフッ化ビニリデン、ポリメチルメタクリレート、シリコーン、金属等が挙げられる。担体をカチオン性化合物、アニオン性化合物、ダイヤモンド、アミノシラン、ポリリジン等でコートし、あるいはアミノ基、カルボキシル基、カルボジイミド基、イソシアネート基等で修飾することにより、プローブの固定を強化することも可能である。担体の形態は、例えば板状、フィルム状、膜状、円柱状等である。担体の大きさは、検出機器に対応して適宜決定される。また、プローブを担体に固定する際、プローブ５’末端あるいは３’末端の固定方向を問わない。
【００３２】
（固定化方法）
上記担体へのプローブの固定化方法は、当業分野で公知の方法でよく、物理吸着、化学吸着、市販のスタンピングマシンを用いる固定化方法等が挙げられる。
【００３３】
（コントロール）
増幅反応及びハイブリダイゼーションの確認のためのポジティブコントロール及び非特異的ハイブリダイゼーション有無の確認のためのネガティブコントロールとなる核酸もまた担体上にスポットすることが好ましい。
【００３４】
以下に、設計したマイクロアレイプローブを、スライドガラスへスポットする手順の一例を示す。まず、５’アミノ化されたオリゴＤＮＡを、ＧｅｎｅＳｌｉｄｅ（Ｔｏｙｏｋｏｈａｎ Ｃｏ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）上に、スポッティングマシンでスポットする。ポジションコントロールとして、Ｃｙ３及びＣｙ５で標識済オリゴＤＮＡを１０μＭの濃度でスポットする。スポットされたスライドは、８０℃で１時間固定化処理した後、０．５％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ溶液で洗浄する。洗浄後のスライドを、０．５％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ沸騰溶液で１０分間処理した後、ＤＷでリンスし、遠心乾燥する。
【００３５】
（キット）
上記で得られるマイクロアレイは、マイクロアレイの使用に必要な試薬及び／又は器具を含むキットとしてもよい。同梱する試薬の例としては、核酸抽出溶液、マイクロアレイ−サンプル核酸ハイブリダイゼーション溶液、洗浄溶液、核酸標識物質、ハイブリダイゼーションコントロール用標識済核酸が挙げられる。
【００３６】
（検体の由来）
以下に、本発明のマイクロアレイを用いた病原体の検出方法を説明する。本発明のマイクロアレイでは、特にインフルエンザウイルス、Ｑ熱の原因菌、大腸菌、エルシニア、及び野兎病菌等の病原体の検知に有効である。したがって、本発明のマイクロアレイにかける検体の出所は、水、清涼飲料水、井戸水、地下水等の飲料、食品、ヒトを含む動物の体液（血液、血清、血漿、髄液、胃液、胆汁等）、尿・糞、たん・膿等の生体由来試料、培養済み病原体等が挙げられる。
【００３７】
（核酸の抽出）
上記検体を本発明のマイクロアレイのプローブで検査するに際し、上記検体から病原体の核酸（ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）を抽出する必要がある。前記検体からＤＮＡ及びＲＮＡの両核酸を含む核酸溶液を核酸抽出剤で抽出し、ＤＮＡ及びＲＮＡの核酸種を問わず病原体の有無を判定してもよい。核酸を抽出する方法は、公知の方法を用いることができる。培養したバクテリアからのＤＮＡ抽出は、例えばＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ（Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＳｅｐａＧｅｎｅ（Ｓａｎｋｏ−ｊｕｎｙａｋｕ，Ｔｏｋｙｏ）等の市販のキットが使用できる。
【００３８】
（核酸の増幅）
マイクロアレイを用いた標的遺伝子の検出には、大量の核酸（例えば１μｇ以上）が要求される。ほとんどの場合、検体核酸を５０μｇ以上用意することは容易であるが、抽出した核酸が微量の場合は、図１に示すように、何らかの遺伝子増幅法で増殖させる必要がある。本発明のマイクロアレイは、病原体一株のゲノム上に分散する少なくとも３領域の互いに異なるプローブを搭載するので、ハイブリダイゼーションにかける核酸の増幅もまた、全ゲノムの増幅、すなわち、ＷＧＡ法を採用することが好ましい。ＷＧＡ法の具体例としては、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼを用いた増幅法、ＯｍｎｉＰｌｅｘ ＷＧＡ法、ＤＯＰ−ＰＣＲ（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｉｍｅｒ−ＰＣＲ）等が挙げられる。特に、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼを用いた増幅法及びＯｍｎｉｐｌｅｘ ＷＧＡがゲノムＤＮＡを均一に増幅する点で好ましい。ＯｍｎｉＰｌｅｘ ＷＧＡ法による増幅産物は、標的遺伝子に対する蛍光シグナル強度及びシグナルの均一性に優れる点でも好ましい。
【００３９】
ＯｍｎｉＰｌｅｘ ＷＧＡ法を用いた増幅には、市販のＧｅｎｏｍｅＰｌｅｘ Ｗｈｏｌｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ，Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）を使用可能である。鋳型ＤＮＡとして、１０ｎｇ程度のゲノムＤＮＡにＦｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを添加し、９５℃で４分間の断片化処理を行った後、急冷する。Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ及びＬｉｂｒａｒｙ Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを添加した後、９５℃で２分間サンプルＤＮＡを更に変性させる。変性したＤＮＡサンプルに、Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｅｎｚｙｍｅを添加し、１６℃で２０分間、２４℃で２０分間、３７℃で２０分間、７５℃で５分間インキュベートする。インキュベート後のサンプルに、１２．５ユニットのＴａｋａｒａ ＥｘＴａｑを含むＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを更に添加し、９５℃３分、１４サイクル（９５℃１５秒、６５℃５分）で鋳型ＤＮＡを増幅する。
【００４０】
Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼを用いた増幅には、市販のＧｅｎｏｍｉＰｈｉ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用可能である。鋳型ＤＮＡとして、例えばＥ．ｃｏｌｉ株（１０ｎｇ）のゲノムＤＮＡ溶液１μｌを、キットに添付されていたサンプル溶液９μｌへ添加し、９５℃で５分間熱処理を行った後、氷上で５分間静置する。熱変性処理を行ったサンプルにＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼを含む溶液を１０μｌ添加し、３０℃で２〜２０時間増幅した後、６５℃で１０分間、ポリメラーゼの変性処理を行う。増幅後のサンプルは、使用するまで低温（例えば−３０℃）で保存する。
【００４１】
微量のウイルスＲＮＡは、逆転写酵素でＤＮＡを増殖させる。ウイルスＲＮＡがすでに多量に存在する場合は、ＱＩＡａｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）等でゲノムＲＮＡを精製する。
【００４２】
なお、本発明のマイクロアレイにかける核酸は、菌等を培養して増殖させ、コロニーを形成した菌等から、熱水抽出法、酵素溶菌―ＳＤＳ処理、フェノール・クロロホルム法等を用いてゲノムＤＮＡやＲＮＡを抽出したものでもよい。
【００４３】
（核酸の断片化）
未処理のゲノム核酸やＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ等を用いた増幅産物は、通常、１００ｂｐ〜１０ｋｂｐの断片長のものが得られる。そこで、標識化前に、ＲｓａＩ、ＡｌｕＩ等の制限酵素や超音波処理で断片化する。なお、増幅産物が０．５ｋｂｐ程度以下であれば、断片化処理を行わなくてもよい。
【００４４】
（標識化）
検体中の核酸をハイブリダイゼーション後に検出するために、断片化した核酸を標識物質で標識する。標識物質は、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ローダミン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ダンシル、フルオレスカミン、クマリン、ナフチルアミン、ユウロピウム等の蛍光色素；ジゴキシン、ジゴキシゲニン、ビオチン、ペニシリン、トリニトロフェニル、ジニトロフェニル等のハプテン；ビオチン／ストレプトアビジンアルカリフォスファターゼ等の化学発色系；アルカリホスファターゼ、西洋わさびパーオキシダーゼ、マイクロパーオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ルシフェラーゼ等の酵素；３２Ｐ、３５Ｓ、９９ｍＴｃ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、１４Ｃ、３Ｈ等の放射性同位元素；ルシフェリン、イソルミノール、ルミノール、ビス（２，４，６−トリフロロフェニル）オキザレーロ等の発光物質；フェノール、ナフトール、アントラセン等の紫外吸収物質；並びに４−アミノ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル、３−アミノ−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル、２，６−ジ−ｔ−ブチル−α−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−オキソ−２，５−シクロヘキサジエン−１−イリデン）−ｐ−トリルオキシル等のスピン標識化剤が挙げられる。これらの標識物質を含む市販のキット、例えば蛍光色素としてＵｌｙｓｉｓ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いてよい。
【００４５】
（変性）
上記で抽出及び増幅させた核酸は、公知の加熱変性させ、ハイブリダイゼーションバッファーに溶解される。具体的には、標識化したサンプルをエタノール沈殿してハイブリダイゼーション溶液に溶解する。標識化サンプルを９５℃で３分間、氷上で３分間静置し変性処理を行い、以下に示すようにマイクロアレイにハイブリダイゼーションさせる。
【００４６】
（ハイブリダイゼーション）
上記で標識した検体核酸をマイクロアレイとハイブリダイゼーションさせるには、ハイブリダイゼーション溶液をガスケットスライド上に拡げ、マイクロアレイスライドと張り合わせ、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｏｖｅｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ）等で加熱する。Ｔｈ（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ、ハイブリダイゼーション温度）は好ましくは５０℃近辺の温度である。５０℃より高過ぎると、感度が下がり、逆に、５０℃より低過ぎると非特異吸着によるノイズが増える可能性がある。ハイブリダイゼーションの時間は、通常、１〜２４時間である。
【００４７】
ハイブリダイゼーション後のスライドは、バッファーで洗浄し、非特異的に結合した検体標識核酸を除去する。これを２〜３回繰り返した後、ＤＷでリンスする。なお、洗浄時の温度は、十分な感度を保つ温度で行うのが好ましく、通常、Ｔｈ温度かそれよりも低く（例えば５０℃）設定される。
【００４８】
（解析）
ハイブリダイゼーション後の検出は、標識物質に応じて公知の方法により行うことができる。蛍光物質の場合は蛍光スキャナーにより光量を測定する。放射性元素の場合は放射能カウンター、バイオイメージアナライザー等で測定する。酵素の場合は公知の方法で酵素活性を測定する。抗原、抗体で標識した場合は、標識した抗原又は抗体と特異的に反応する抗体又は抗原を用いて抗原抗体反応させ、反応生成物を公知の方法により測定する。
【００４９】
以下に、蛍光色素を使用した場合を説明する。遠心乾燥したマイクロアレイスライドを、色素に応じて例えば赤色レーザー（Ｃｙ５検出用）や緑色レーザー（Ｃｙ３検出用）に当て、スキャナーで読み込む。得られた画像ファイルを、例えばＳｃａｎＡｒｒａｙ Ｅｘｐｒｅｓｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、Ａｇｉｌｅｎｔ ＤＮＡマイクロアレイスキャナ等で取得したスキャンイメージからスポット毎の蛍光シグナル強度を算出し、病原体株毎の蛍光シグナル強度の中央値、平均値、ｐ値、及びＺ値を算出する。
【００５０】
本発明のマイクロアレイに搭載されたプローブは特異性が高く、検体に含まれる病原体に該当するスポットのみが高い蛍光シグナルを発するため、平均値や中央値のみでも標的サンプルの検出が充分に可能である。しかし、臨床サンプル、野外サンプル等のように雑多な核酸が含まれている検体では、該当するスポット以外にも非特異的に蛍光を発するスポットが出現する可能性がある。そこで、これらのサンプルで想定病原体が偶然検出されたのか否かを検証するためには、ｐ値及びＺ値を算出して統計学的な裏付けとする。
【００５１】
「標的スポット群」及び、「全スポットから標的スポットを除いた群」を形成するシグナル蛍光シグナル強度の分散状態に統計学的有意差が観察されるかを見極めるため、有意水準（α）＝０．００１（すなわち、０．１％の確率で偶然有意差があると判定される水準）でｐ値を算出する。算出されたｐ値は、帰無仮説（すなわち、母集団の分散状態に差は無いと言う仮説）が棄却可能か、つまり対立仮説（すなわち、母集団の分散状態に差は有ると言う仮説）が成立するかを検証する。Ｚ値は、同様の水準である限界値＝３．０９に設定し、帰無仮説（母集団の平均値が等しい）が棄却できるか、つまり対立仮説（母集団の平均値が等しくない）が成立するかを検証する。ｐ値が０．００１よりも小さい値であるとき、Ｚ値が３．０９より大きい値であったとき、帰無仮説が棄却できる。
【実施例】
【００５２】
本発明のマイクロアレイの作成とその使用を、実施例を用いて詳細に説明する。しかし、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
（マイクロアレイプローブの設計と作成）
ゲノムプロジェクトが終了又は進行中の古細菌３０株、原虫９株、細菌４２２株、真菌５９株、ウイルス６７２株の合計１１９２株、タンパク毒素等７４遺伝子の全長ゲノム配列又は一部の塩基配列をＤＤＢＪ（ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ）又はＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）から入手した。上記遺伝子のアクセッションＮｏ．を表８〜１３に示す。
【００５３】
上記塩基配列を、Ａｒｒａｙ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ（Ｐｒｅｍｉｅｒ Ｂｉｏｓｏｆｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）へ読み込み、アクセッションＮｏ．ごとに１０〜５００種類のセンス鎖マイクロアレイプローブを設計した。プローブの設計条件は、プローブ長６０ｍｅｒ、Ｔｍ ７５℃±５．０℃とし、ヘアピンループ（＜−３．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ）及びセルフダイマー（＜−３．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ）、並びにクロスホモロジーを極力回避した。
【００５４】
総計５万を超える全てのセンス鎖プローブ候補をＰｒｏｂｅＭｏｗｅｒ（Ｓｙｍｐｌｕｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いてホモロジー検索（ＢＬＡＳＴ検索）を行い、十分な特異性を持つ１９，４９３種類のセンス鎖プローブを選定した。更に、そのアンチセンス鎖プローブとの合計３８，９８６種類のプローブ（アクセッションＮｏ．あたり平均３０個）をマイクロアレイに搭載させた。ハイブリダイゼーションダイゼージョンの外部評価用に別途４００種類のコントロールスポットを１０連でマイクロアレイスライドにプリントした。全てのマイクロアレイスライドを、４４，０００プローブ×４アレイ／スライドのレイアウトで作成した。
【００５５】
（ウイルス及びバクテリアからの核酸抽出）
上記で作成したマイクロアレイにハイブリダイゼーションさせる核酸を、以下の手順で準備した。インフルエンザウイルスの３種類の株（ＰＲ８、ＷＳＮ、及びＡ／ｄｕｃｋ／Ｈｙｏｇｏ／３５／０１（Ｈ５Ｎ１））については、ＱＩＡａｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて、ゲノムＲＮＡを精製した。ゲノムＲＮＡは、それぞれ、超音波処理にて断片化した。断片を標識し、後述のハイブリダイゼーションに供した。
【００５６】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＥＲ２９２５株を、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（ＮＥＢ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）から入手し、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地にて３７℃で一晩培養した。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉからのＤＮＡ抽出を、ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ（Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で行った。
【００５７】
Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ Ｏｈｉｏ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ＳＣＨＵ、及びＹｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ Ｐａ １７７（Ｏ９：Ｂ２）のゲノムＤＮＡは、国立感染症研究所獣医科学部所有の核酸抽出溶液を使用した。
【００５８】
（微量バクテリア由来ゲノムＤＮＡの増幅）
Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼを用いた増幅に、ｉｌｌｕｓｔｒａ ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ Ｖ２キット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用した。鋳型ＤＮＡとして、１０ｎｇのＣｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、及びＹｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃの核酸を用いた。１μｌのサンプＤＮＡ溶液を、前記キットに添付されたサンプル溶液９μｌへ添加し、９５℃で５分間熱処理を行った後、氷上で５分間静置した。熱変性処理を行ったサンプルにＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼを含む反応溶液を１０μｌ添加し、３０℃で２時間増幅した後、６５℃で１０分間ポリメラーゼの熱変性処理を行った。増幅後のサンプルは、使用するまで−３０℃で保存した。
【００５９】
（断片化）
未処理のゲノムＤＮＡやＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅した上記産物やゲノムＲＮＡは、Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ（Ｃｏｓｍｏ Ｂｉｏ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で２５０Ｗ、３０秒インターバルで３０分間、超音波断片化処理した。
（熱変性）
【００６０】
断片化処理を行った核酸サンプルを、熱変性処理後、Ｕｌｙｓｉｓ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて８０℃で１５分間、標識化処理した。標識化処理を行ったサンプルは、公知のエタノール沈澱法、又はＤＮＡの場合ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＥｘｔｒａｃｔＩＩ （ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ，ＵＳＡ）で、ＲＮＡの場合Ｒｎｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。
【００６１】
サンプルは、１００μｌのハイブリダイゼーションバッファー（終濃度：核酸、６×ＳＳＣ，５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ，５０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，０．５％ＳＤＳ，２０％ｆｏｒｍａｍｉｄｅ，５％Ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ，５０μｇ／ｍｌ Ｙｅａｓｔ ｔＲＮＡ）に調整し、９５℃で３分間熱処理を行い、２分間氷上で静置し、使用するまで５０℃で保温した。
【００６２】
（ハイブリダイゼーション）
１００μｌのハイブリダイゼーションサンプル溶液を、ガスケットスライド（Ａｇｉｌｅｎｔ）上に拡げ、マイクロアレイスライドと張り合わせホルダーにセットした。ハイブリダイゼーションは、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｏｖｅｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて５０℃、毎分１０回転で一晩行った。
【００６３】
ハイブリダイゼーション後のスライドは、０．５％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣで５０℃、５分間１回、１×ＳＳＣで５０℃、５分間２回洗浄した。さらに、ミリＱ水でリンスし、遠心乾燥したスライドを、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｓｃａｎｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて、１００％出力の緑色レーザー（Ａｌｅｘａ５４６及びＣｙ３検出用）、１００％ＰＭＴ、解像度５μｍ、ダイナミックレンジＯＦＦの設定でスキャンした。得られた画像ファイルから、Ｆｅａｔｕｒｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて各スポットの蛍光シグナル強度を数値化した。
【００６４】
（解析）
Ｆｅａｔｕｒｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｎｅｔ）によって出力されたデータテキストファイルを、Ｇｅｎｅ Ａｒｒａｙ Ｕｔｉｌｉｔｙ（ＧＡＵ；Ｓｙｍｐｌｕｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）に読み込み、各種解析を行った。
【００６５】
データテキストファイルに含まれる３８，９８６病原体検出プローブ由来スポットの６２項目のデータ中から、アクセッションＮｏ．、プローブ名、遺伝子名、及びシグナル蛍光シグナル強度の４項目を抽出した。
【００６６】
抽出したデータは、アクセッションＮｏ．毎にまとめ、さらにセンス又はアンチセンス鎖に細分し「群」とした。一群内のシグナル平均値及び中央値を算出し、シグナル蛍光シグナル強度中央値の高い順に該当候補として順位を付けた。
【００６７】
（インフルエンザウイルスゲノムのＭＭＰＤＡ解析結果）
インフルエンザウイルスＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４株（Ｈ１Ｎ１）のＭＭＰＤＡ解析結果を表１Ａに示す。そして、最も強いシグナルとして検出されたＩｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ Ｎ１ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ（ＮＡ）ｇｅｎｅ（アクセッションＮｏ．ＡＹ１２２３２６）の塩基配列（６０ｍｅｒ、７領域）を、アクセッションＮｏ．と５‘末端側出発位置との組み合わせとして表１Ｂに列記する。ここで、ｓはセンス鎖を意味する。
【００６８】
【表１Ａ】
【００６９】
【表１Ｂ】
【００７０】
表１ＡのインフルエンザウイルスＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）株のサンプルでは、期待したどおり、サンプルと同亜型（Ｈ１Ｎ１）のインフルエンザウイルスＡ／Ｍａｒｔｏｎ／４３（Ｈ１Ｎ１）ＮＡ株が最も強いシグナルとして検出された。検出された７スポット由来の核酸プローブの塩基配列は、表１Ｂに示すとおり、アクセッションＮｏ．ＡＹ１２２３２６（全長１４１１ｂｐ）の配列全般にわたって設計されたプローブである。これらの７つのスポットは、ｐ＝２．６２ｅ−１３、Ｚ＝３．１９であり、統計学的にも帰無仮説が十分に棄却できる水準であった。
【００７１】
このサンプルで２番目に強いシグナルを発していたのは、（Ａ／Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ／３２／２００３（Ｈ３Ｎ２）ＮＡであったが、蛍光シグナルの強さは１番目の候補と比較して５割の水準であった。さらに、このシグナルのｐ値に有意差が確認できるものの、Ｚ値に有意差が確認できるレベルでなかった。よって、Ｈ１Ｎ１型インフルエンザウイルスを特異的に検出できたと考える。
【００７２】
ＡＹ１２２３２６を検出する核酸プローブ７個と検体のＨ１Ｎ１型インフルエンザウイルスは、塩基の違いに由来すると思われる蛍光シグナル強度のバラつきも検出された。
【００７３】
他のインフルエンザウイルスＡ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）株のゲノムＲＮＡのＭＭＰＤＡ解析結果を表２Ａに示す。そして、最も強いシグナルとして検出されたＩｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ Ｎ１ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ（ＮＡ）ｇｅｎｅ（アクセッションＮｏ．ＡＹ１２２３２６）の塩基配列（６０ｍｅｒ、７領域）を、アクセッションＮｏ．と５‘末端側出発位置との組み合わせとして表２Ｂに列記する。ここで、ｓはセンス鎖を意味する。
【００７４】
【表２Ａ】
【００７５】
【表２Ｂ】
【００７６】
表２Ａに示すとおり、検体と同亜型のＨ１Ｎ１型インフルエンザウイルスが特異性と信頼性をもって検出された。
【００７７】
さらに他のインフルエンザウイルスＡ／ｄｕｃｋ／Ｈｙｏｇｏ／３５／０１（Ｈ５Ｎ１）株のゲノムＲＮＡのＭＭＰＤＡ解析結果を表３Ａに示す。そして、最も強いシグナルとして検出されたＩｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ Ｈ５Ｎ１ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ（ＮＡ）ｇｅｎｅ（アクセッションＮｏ．ＡＢ１６６８６４）の塩基配列（６０ｍｅｒ、１１領域）を、アクセッションＮｏ．と５‘末端側出発位置との組み合わせとして表３Ｂに列記する。ここで、ｓはセンス鎖を意味する。
【００７８】
【表３Ａ】
【００７９】
【表３Ｂ】
【００８０】
表３Ａに示すとおり、検体中に含まれるＨ５Ｎ１型のＮＡ遺伝子が特異性と信頼性をもって検出できた。検出された１１スポットの塩基配列は、表３Ｂに示すとおり、アクセッションＮｏ．ＡＢ１６６８６４（全長１３５０ｂｐ）の配列全般にわたって設計されたプローブである。
【００８１】
（バクテリアゲノムのＭＭＤＰＡ解析結果）
４種類のバクテリアからゲノムＤＮＡを精製、増幅、断片化、標識化したものとのハイブリダイゼーション結果を、以下に示す。
【００８２】
〔Ｑ熱原因菌ゲノムのＭＭＤＰＡ解析結果〕
Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ Ｏｈｉｏのハイブリダイゼーション結果を表４Ａに示す。そして、最も強いシグナルとして検出されたＣｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ ＲＳＡ ４９３，ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ（アクセッションＮｏ．ＡＥ０１６８２８）の塩基配列（６０ｍｅｒ、３０領域）を、アクセッションＮｏ．と５‘末端側出発位置との組み合わせとして表４Ｂに列記する。ここで、ｓはセンス鎖を意味する。
【００８３】
【表４Ａ】
【００８４】
【表４Ｂ】
【００８５】
表４において、ｐ値及びＺ値は、同種のＣｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ ＲＳＡ ４９３（アクセッションＮｏ．ＡＥ０１６８２８）が最も高い値を示した。検出されたプローブは、表４Ａに示すとおり、ＡＥ０１６８２８（１９９５２８１ｂｐ）のゲノム全般にわたって設計されたものである。検体に含まれるＣｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉは、Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ ＲＳＡ ４９３（アクセッションＮｏ．ＡＥ０１６８２８）を標的にして設計されたプローブに非常に近いと考えられた。二番目の強度を示したものは、Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ ＲＳＡ ４９３のアンチセンス鎖であった。３番目に高い蛍光シグナル強度を示したものは、Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｉｎｅ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ１６である。それはＣｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉの４割程度の蛍光シグナル強度であり、ｐ値及びＺ値で帰無仮説が棄却できない水準であった。よって、Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ Ｏｈｉｏを含む検体に対して、同種のＣｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ ＲＳＡ ４９３により特異的に検出できたといえる。
【００８６】
〔大腸菌ゲノムのＭＭＤＰＡ解析結果〕
Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ゲノムＤＮＡを同様に解析した結果を表５Ａに示す。この結果、最も強いシグナルとして検出されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ ＤＮＡ，ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ（アクセッションＮｏ．ＡＣ＿００００９１）の塩基配列（６０ｍｅｒ、１７領域）を、アクセッションＮｏ．と５‘末端側出発位置との組み合わせとして表５Ｂに列記する。ここで、ｓはセンス鎖を意味する。
【００８７】
【表５Ａ】
【００８８】
【表５Ｂ】
【００８９】
表５Ａにおいて、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉが、最も高い蛍光シグナルを発していた。検出に用いた１７スポットは、表５Ｂに示すとおり、ゲノムの全般にわたって設計されたものである。病原体検出候補の３番目〜１２番目に含まれる蛍光シグナル強度中央値が高かった多くのＳｈｉｇｅｌｌａ属（赤痢菌）は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属（大腸菌）との遺伝子相同性が非常に高いため、本来、塩基配列で分別する事は困難である。しかし、表５に示した結果では、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのシグナルがＳｈｉｇｅｌｌａ属よりも高い候補順位を付けられたことから、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを特異的に同定できたと考えられる。
【００９０】
〔エルシニアゲノムのＭＭＤＰＡ解析結果〕
Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ Ｐａ １７７（Ｏ９：Ｂ２）ゲノムを検体とした時の解析結果を表６Ａに示す。そして、最も強いシグナルとして検出されたＹｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ ｓｕｂｓｐ． ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ ８０８１ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ（アクセッションＮｏ．ＡＭ２８６４１５）の塩基配列（６０ｍｅｒ、２１領域）を、アクセッションＮｏ．と５‘末端側出発位置との組み合わせとして表６Ｂに列記する。ここで、ａはアンチセンス鎖を意味する。
【００９１】
【表６Ａ】
【００９２】
【表６Ｂ】
【００９３】
表６Ａにおいて、最も蛍光シグナル強度の高いスポットｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ ｓｕｂｓｐ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ ８０８１ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅであった。検出に用いたプローブの位置は、表６Ｂに示すとおり、ゲノムの全領域に渡っていた。よって、本発明のマイクロアレイにより検体に含まれる病原体を特異的に同定できたと考える。
【００９４】
〔野兎病菌ゲノムのＭＭＤＰＡ解析結果〕
Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ＳＣＨＵ核酸抽出物の検査結果を表７Ａに示す。最も強いシグナルとして検出されたＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ＷＹ９６−３４１８， ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ（アクセッションＮｏ．ＣＰ０００６０８）の塩基配列（６０ｍｅｒ、２９領域）を、アクセッションＮｏ．と５‘末端側出発位置との組み合わせとして表７Ｂに列記する。ここで、ａはアンチセンス鎖を意味する。
【００９５】
【表７Ａ】
【００９６】
【表７Ｂ】
【００９７】
表７Ａにおいて、候補順位１−７までＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ由来のアクセッションＮｏ．がランキングされ、他病原体の蛍光シグナル強度と比較して強い蛍光シグナル強度と有意差が検出された。この結果からも、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓが特異的に検出可能であることが示された。
【００９８】
（実施例に用いた古細菌３０株）
【表８】
【００９９】
（実施例に用いた原虫９株）
【表９】
【０１００】
（実施例に用いた細菌）
【表１０Ａ】
【０１０１】
【表１０Ｂ】
【０１０２】
【表１０Ｃ】
【０１０３】
【表１０Ｄ】
【０１０４】
【表１０Ｅ】
【０１０５】
【表１０Ｆ】
【０１０６】
【表１０Ｇ】
【０１０７】
【表１０Ｈ】
【０１０８】
【表１０Ｉ】
【０１０９】
【表１０Ｊ】
【０１１０】
【表１０Ｋ】
【０１１１】
【表１０Ｌ】
【０１１２】
（実施例に用いたウイルス）
【表１１Ａ】
【０１１３】
【表１１Ｂ】
【０１１４】
【表１１Ｃ】
【０１１５】
【表１１Ｄ】
【０１１６】
【表１１Ｅ】
【０１１７】
【表１１Ｆ】
【０１１８】
【表１１Ｇ】
【０１１９】
【表１１Ｈ】
【０１２０】
【表１１Ｉ】
【０１２１】
【表１１Ｊ】
【０１２２】
【表１１Ｋ】
【０１２３】
【表１１Ｌ】
【０１２４】
【表１１Ｍ】
【０１２５】
【表１１Ｎ】
【０１２６】
【表１１Ｏ】
【０１２７】
【表１１Ｐ】
【０１２８】
【表１１Ｑ】
【０１２９】
【表１１Ｒ】
【０１３０】
【表１１Ｓ】
【０１３１】
（実施例に用いた真菌５９株）
【表１２Ａ】
【０１３２】
【表１２Ｂ】
【０１３３】
（実施例に用いたタンパク毒素等７４遺伝子）
【表１３Ａ】
【０１３４】
【表１３Ｂ】
【０１３５】
【表１３Ｃ】
【産業上の利用可能性】
【０１３６】
本発明のマイクロアレイは、病原体同定不能な臨床検体から、病原体、その他の微生物やウイルスを一括、簡単、網羅的に同時検出するのに有用である。また、野外検体、食品、家畜から、病原体、その他の微生物やウイルスを一括、簡単、網羅的に同時検出するのに有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
古細菌、原虫、細菌、真菌、ウイルス、及びタンパク質毒素から選ばれる少なくとも一株に由来する既知の核酸塩基配列（センス）又は相補的（アンチセンス）な塩基配列を有し、該塩基配列において互いに異なる少なくとも３個の群からなるオリゴＤＮＡプローブであって、その各プローブ長が５０〜７０ｍｅｒであり、Ｔｍが７０〜８０℃であり、−３．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のヘアピンループ及び−３．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のセルフダイマーを避け、ホモロジーから推測される非特異性を確保するように設計された前記プローブの群が担体上に固定化されている、病原体を検出するためのマイクロアレイ又はそれを含むキット。
【請求項２】
前記プローブは、多種間保存領域以外の場所を含むことを特徴とする、請求項１に記載の病原体を検出するためのマイクロアレイ又はそれを含むキット。
【請求項３】
古細菌、原虫、細菌、真菌、ウイルス、及びタンパク質毒素から選ばれる少なくとも一種に由来する既知の核酸塩基配列に相補的な配列を有し、該塩基配列において互いに異なる少なくとも３個の群からなるオリゴＤＮＡプローブであって、その各プローブ長が５０〜７０ｍｅｒであり、Ｔｍが７０〜８０℃であり、−３．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のヘアピンループ及び−３．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のセルフダイマーを避け、ホモロジーから推測される非特異性を確保するように設計された前記プローブの群が担体上に固定化されているマイクロアレイに、検体から取得した核酸をハイブリダイゼーションさせることを含む病原体の検出方法。
【請求項４】
前記検体や含むと思われる試料から抽出した核酸ＤＮＡ及び／又はＲＮＡをそのまま或いは全ゲノム増幅後、断片化処理、蛍光標識処理、及びハイブリダイゼーションさせることを特徴とする、請求項３に記載の病原体の検出方法。
【請求項５】
前記プローブは、アクセッションＮｏ．毎に２〜３０個のセンスプローブと同数のアンチセンスプローブが計４〜６０個設計されており、アクセッションＮｏ．毎に複数プローブの蛍光シグナル強度を解析することにより、病原体の遺伝子突然変異、及び機械的又は手技的誤差の影響を可能な限り排除したことを特徴とする、請求項３又は４に記載の病原体の検出方法。
【請求項６】
前記ハイブリダイゼーションで検出されたスポットの蛍光シグナル強度はアクセッションＮｏ．毎に一群を形成させ、その群の蛍光シグナル強度から算出される中央値がバックグランドと比較して明らかに高く、該蛍光シグナル強度のｐ値が０．００１よりも小さい値であるとき、かつＺ値が３．０９より大きい値であるとき、統計的有意であると判定することを特徴とする、請求項３〜５のいずれかに記載の病原体の検出方法。
【請求項７】
前記検体からＤＮＡ及びＲＮＡの両核酸を含む核酸溶液を核酸抽出剤で抽出し、ＤＮＡ及びＲＮＡの核酸種を問わず病原体の有無を判定することを含む、請求項３〜６のいずれかに記載の病原体の検出方法。
【請求項１】
古細菌、原虫、細菌、真菌、ウイルス、及びタンパク質毒素から選ばれる少なくとも一株に由来する既知の核酸塩基配列（センス）又は相補的（アンチセンス）な塩基配列を有し、該塩基配列において互いに異なる少なくとも３個の群からなるオリゴＤＮＡプローブであって、その各プローブ長が５０〜７０ｍｅｒであり、Ｔｍが７０〜８０℃であり、−３．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のヘアピンループ及び−３．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のセルフダイマーを避け、ホモロジーから推測される非特異性を確保するように設計された前記プローブの群が担体上に固定化されている、病原体を検出するためのマイクロアレイ又はそれを含むキット。
【請求項２】
前記プローブは、多種間保存領域以外の場所を含むことを特徴とする、請求項１に記載の病原体を検出するためのマイクロアレイ又はそれを含むキット。
【請求項３】
古細菌、原虫、細菌、真菌、ウイルス、及びタンパク質毒素から選ばれる少なくとも一種に由来する既知の核酸塩基配列に相補的な配列を有し、該塩基配列において互いに異なる少なくとも３個の群からなるオリゴＤＮＡプローブであって、その各プローブ長が５０〜７０ｍｅｒであり、Ｔｍが７０〜８０℃であり、−３．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のヘアピンループ及び−３．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のセルフダイマーを避け、ホモロジーから推測される非特異性を確保するように設計された前記プローブの群が担体上に固定化されているマイクロアレイに、検体から取得した核酸をハイブリダイゼーションさせることを含む病原体の検出方法。
【請求項４】
前記検体や含むと思われる試料から抽出した核酸ＤＮＡ及び／又はＲＮＡをそのまま或いは全ゲノム増幅後、断片化処理、蛍光標識処理、及びハイブリダイゼーションさせることを特徴とする、請求項３に記載の病原体の検出方法。
【請求項５】
前記プローブは、アクセッションＮｏ．毎に２〜３０個のセンスプローブと同数のアンチセンスプローブが計４〜６０個設計されており、アクセッションＮｏ．毎に複数プローブの蛍光シグナル強度を解析することにより、病原体の遺伝子突然変異、及び機械的又は手技的誤差の影響を可能な限り排除したことを特徴とする、請求項３又は４に記載の病原体の検出方法。
【請求項６】
前記ハイブリダイゼーションで検出されたスポットの蛍光シグナル強度はアクセッションＮｏ．毎に一群を形成させ、その群の蛍光シグナル強度から算出される中央値がバックグランドと比較して明らかに高く、該蛍光シグナル強度のｐ値が０．００１よりも小さい値であるとき、かつＺ値が３．０９より大きい値であるとき、統計的有意であると判定することを特徴とする、請求項３〜５のいずれかに記載の病原体の検出方法。
【請求項７】
前記検体からＤＮＡ及びＲＮＡの両核酸を含む核酸溶液を核酸抽出剤で抽出し、ＤＮＡ及びＲＮＡの核酸種を問わず病原体の有無を判定することを含む、請求項３〜６のいずれかに記載の病原体の検出方法。
【図１】
【公開番号】特開２０１０−１７８６８７（Ｐ２０１０−１７８６８７Ａ）
【公開日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２５８１８（Ｐ２００９−２５８１８）
【出願日】平成２１年２月６日（２００９．２．６）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２０年８月１１日 国立国会図書館に文書「厚生労働科学研究費補助金 食品の安心・安全確保推進研究事業 食肉における家畜・家禽のウイルス疾病に関する研究 平成１９年度 総括・分担研究報告書 平成２０年３月」をもって受け入れ
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年２月６日（２００９．２．６）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２０年８月１１日 国立国会図書館に文書「厚生労働科学研究費補助金 食品の安心・安全確保推進研究事業 食肉における家畜・家禽のウイルス疾病に関する研究 平成１９年度 総括・分担研究報告書 平成２０年３月」をもって受け入れ
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【Ｆターム（参考）】
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