病原菌を検出するための組成物およびアッセイ方法
微生物を早く成長させ素早く検出するための組成物および方法。本発明は、試験サンプル中の微生物、特に病原微生物に由来するコアオリゴ糖などの特定物質の検出に使用するためのアッセイ方法に関する。本発明はさらに、そのような微生物を素早く成長させることにより、現在よりも著しく早く検出することを可能にするための組成物および方法に関する。特定の実施の形態では、本発明はサルモネラ菌、赤痢菌またはリステリア菌を素早い成長および／または検出を目的とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物、特に試験サンプルにおける病原微生物に由来する特定物質の検出に使用されるアッセイ方法に関する。本発明はさらに、そのような微生物を素早く成長させることにより、現在よりも著しく早く検出することを可能にするための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品は本質的に生物に由来するものなので、様々な汚染微生物の成長を手助けすることができる。米国では、推定年間７６００万件の食中毒が発生し、医療に６５億ドル〜３４９億ドルか費やされ、生産性を喪失している（ＢｕｚｂｙおよびＲｏｂｅｒｔｓ（１９９７年）、Ｍｅａｄら（１９９９年））。欧州では、サルモネラ菌に対する経済コストおよび健康管理コストは、６億２０００万〜３０億ユーロであると推定されている（Ｄａｖｉｄ Ｂｙｒｎｅ、 Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｆｏｒ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｃｏｎｓｕｍｅｒ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ、２０００年）。
【０００３】
サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、カンピロバクター菌（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、病原性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｏ１５７：Ｈ７および赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）は、食中毒の大部分の事例に関与している。例えば、サルモネラ菌およびリステリア菌は単独で、食品に関連した死亡のうちそれぞれ３１％および２８％に関与している（Ｍｅａｄら、１９９９年）。また、日本ではサルモネラ中毒が１９８１〜１９９５年に発生した全食中毒の原因の１４％超を占める（Ｌｅｅら、２００１年）。実際、入院が必要な食中毒の症例のうち６０％もの原因因子が細菌であると推定されている。結果として、衰弱の最大の原因の１つは、食品の微生物汚染に対する効果的でなくもたもたした検査により生じる遅延である。現在の試験方法では、製造会社は微生物培養の結果が出るまで３〜７日間待たなければならない。そのような遅延に起因するコストは甚大である。つまり、供給プロセスの効率を低下させ、在庫を止め、腐敗を増加させる。
【０００４】
不適切または不十分な試験のコストは、少なくとも大きな代償を支払う必要性が生じうる。たとえば、１９９９年にそのような試験によってサラ・リー社は、Ｂｉｌ Ｍａｒ食品課における３５００万ポンドのホットドッグおよびデリ・ミートのリコールに関連して、それらの食品がリステリア菌の発生と関連づけられた後に、推定７６００万ドルの代償を支払った。ザ・スコッツマン新聞社によると、２００６年にサルモネラ菌がチョコレートに雑菌混入したことにより、キャドベリー・シュウェップス社はリコールの代償や広告、収益の喪失、その後の製造作業の改善に対して、推定２０００万ユーロを支払った。つい最近の２００９年には、２００８年に推定２５００万ドルを売り上げた米国のピーナッツ社は、米国でピーナッツにおける主なサルモネラ菌の発生源であると認定された後に、破産申請をした。
【０００５】
したがって、食品、飼料および環境サンプル中で、サルモネラ菌、赤痢菌およびリステリア菌などの病原微生物の存在を検出することは、経済的に非常に重要である。しかし、そのような微生物を検出するための従来の培養方法は、骨が折れるし時間がかかっていた。そのような従来の方法は、５０年以上も使用されてきた標準プロセスに依存することが多かった。
【０００６】
加えて、病原微生物は「生存可能だが培養不可能な状態（ＶＮＣ）」または「すぐに培養することはできない状態（ＮＩＣ）」として知られる非常にストレスのかかった環境下で長期間生存することができる。そのように非常にストレスのかかった微生物は非常に弱い代謝活性しか示さない。代謝活性は検出限界に満たないことが多い。そのような微生物は非選択プレート培地上でコロニーを形成する能力または非選択液体培地中で増殖する能力を失っている（Ｒｅｉｓｓｂｒｏｄｔら、２００２年）。しかし、そのような培養不能なコロニーは、食品や動物の飼料中に存在した場合、体内に取り込まれれば依然として病気を引き起こしうる。これは検出に関して特殊な問題を提起する。それは、そのようなストレスを受けた微生物は検出可能なほど十分には復活しない可能性があるからである。
【０００７】
その結果、さらなる培養、プレートへの塗布（ｐｌａｔｉｎｇ）および検出に先立ち、そのような細胞を復活させる目的で、追加的な細胞培養ステップがあらゆる診断に含められることが多い。したがって非選択培地中であらかじめ濃縮しておくことは従来方法の必須要素である（Ｓｔｅｐｈｅｎｓら、２０００年）。例えば、サルモネラ菌の検出には５日間も塗布しなければならいいくつかの培養段階を要する。つまり、「病気の」細菌を再生させるために濃縮ステップが解析に含められることが多い。また、検出はそのような濃縮培養液および培養物の特性によって制限されることが多い。
【０００８】
したがって、細菌の外来集団に棲み家を提供する可能性のある臨床材料、食品およびその他の製品から微生物を再生させる目的で、３つの一般的なタイプの培地が入手可能である。つまり、（１）初期の単離用の非選択培地、（２）濃縮培養液、および（３）選択用寒天培地および／または識別用寒天培地、である。
【０００９】
そのような培地の配合は通常複雑であり、特定の細菌種の成長を阻害する、つまり選択的な成分を含むと同時に、試料中に存在する微生物の予備的確認を行う、つまり識別する際に重要な生化学的特性を検出する成分も含む。合理的な選択をするためには、微生物学者は各配合の組成物、用途および含有される各化合物の相対濃度を知らなければならない。あいにく入手可能な培地は過度に複雑であることが多く、様々な成分の影響および量は通常ほとんど理解されていない。使用される培地は何１０年も使用されてきた培地と同じものであることが多い。また、培地は本来全く異なる生物用に開発されたものであるかもしれない。たとえば、そのような非効率性ゆえ、サルモネラ菌の現在の検出率は、１５日以内では５０％未満であり、２８日以内では９０％未満である（Ｋｉｎｇ、２００９年）。
【００１０】
したがって、明確で、ほとんどまたは全く効果がないか、悪影響を及ぼしさえする余計な含有物が含まれておらず、かつストレスを受けた微生物でさえ成長および迅速な培養が可能な最適な培地が求められている。そのような培地は、二次的／追加的な培養ステップの必要性を否定する必要がある。また、個体数が非常に少なく不均一な微生物環境に存在する病原微生物の単離および／または同定を可能とする、新たなより良い検出方法も必要とされている。さらに、そのような任意の方法は、化粧品、冷凍食品、凍結乾燥製剤、および液体の製品を含む食品、尿や排泄物などの臨床サンプル、または血液サンプルおよび環境サンプルなどの多様な供給源に由来する微生物の検出に、等しく適用できる必要がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｂｕｚｂｙ，Ｊ．Ｃ．およびＲｏｂｅｒｔｓ，Ｔ．（１９９７年）“Ｅｃｏｎｏｍｉｃ ｃｏｓｔｓ ａｎｄ ｔｒａｄｅ ｉｍｐａｃｔｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｆｏｏｄｂｏｒｎｅ ｉｌｌｎｅｓｓ．”Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｔａｔ．Ｑ．第５０巻（第１〜２号）：第５７〜６６頁
【非特許文献２】Ｄａｖｉｄ Ｂｙｒｎｅ、 Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｆｏｒ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｃｏｎｓｕｍｅｒ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ、２０００年
【非特許文献３】Ｍｅａｄｅ，Ｐ．Ｓ．，Ｓｌｕｔｓｋｅｒ，Ｌ．，Ｄｉｅｔｚ，Ｖ．，ＭｃＣａｉｇ，Ｌ．Ｆ．，Ｂｒｅｓｅｅ，Ｊ．Ｓ．，Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｃ．，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｐ．Ｍ．およびＴａｕｘｅ，Ｒ．Ｖ．（１９９９年）“Ｆｏｏｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｉｌｌｎｅｓｓ ａｎｄ ｄｅａｔｈ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ．”Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．第５巻：第６０７〜６２５頁
【非特許文献４】Ｌｅｅ，Ｗ．Ｃ，Ｌｅｅ，ＭＪ．，Ｋｉｍ，Ｊ．Ｓ．およびＰａｒｋ，Ｓ．Ｙ．（２００１年）“Ｆｏｏｄｂｏｒｎｅ ｉｌｌｎｅｓｓ ｏｕｔｂｒｅａｋｓ ｉｎ Ｋｏｒｅａ ａｎｄ Ｊａｐａｎ ｓｔｕｄｉｅｄ ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．”Ｊ．Ｆｏｏｄ．Ｐｒｏｔ．第６４巻：第８９９〜９０２頁
【非特許文献５】Ｒｅｉｓｓｂｒｏｄｔ，Ｒ．，Ｒｉｅｎａｅｃｋｅｒ，Ｉ．，Ｒｏｍａｎｏｖａ，Ｊ．Ｍ．，Ｆｒｅｅｓｔｏｎｅ，Ｐ．Ｐ．Ｅ．，Ｈａｉｇｈ，Ｒ．Ｄ．，Ｌｙｔｅ，Ｍ．，Ｔｓｃｈａｐｅ，Ｈ．およびＷｉｌｌｉａｍｓ，Ｐ．Ｈ．（２００２年）“Ｒｅｓｕｓｃｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ａｎｄ ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｖｉａｂｌｅ ｂｕｔ ｎｏｎｃｕｌｔｕｒａｂｌｅ ｓｔａｔｅ ｂｙ ｈｅａｔ ｓｔａｂｌｅ ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｕｔｏｉｎｄｕｃｅｒ．”Ａｐｐ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．第６８巻（第１０号）：第４７８８〜４７９４頁
【非特許文献６】Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，Ｐ．Ｊ．，Ｄｒｕｇｇａｎ，Ｐ．およびＮｅｂｅ−ｖｏｎ Ｃａｒｏｎ，Ｇ．（２０００年）“Ｓｔｒｅｓｓｅｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ａｒｅ ｅｘｐｏｓｅｄ ｔｏ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ｆｒｏｍ ｔｗｏ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｏｕｒｃｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｉｎ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ．”Ｉｎｔ．Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．第６０巻：第２６９〜２８５頁
【非特許文献７】Ｋｉｎｇ，Ｌ．（２００９年）“Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎｔｅｒａｇｅｎｃｙ ｇｒｏｕｐ ｍｅｅｔｉｎｇ．”ＦＤＡ ｅｘｅｃｕｔｉｖｅ ｓｕｍｍａｒｙ（２００９年１月３０日）
【発明の概要】
【００１２】
本発明の第１の態様では、実質的に以下の成分から構成される少なくとも１つの微生物を成長させるための培地が提供される。
（ｉ）基礎培養液と、
（ｉｉ）ブリリアントグリーン、ナリジクス酸および塩化リチウムから構成される群から選択される少なくとも１つの増殖抑制剤と、
（ｉｉｉ）任意成分として、テトラチオン酸ナトリウム、テトラチオン酸カリウム塩、クエン酸第二鉄アンモニウムおよびクエン酸ナトリウムから構成される群から選択される少なくとも１つの成長促進物質。
【００１３】
疑義を避けるため、本明細書で使用される「実質的に構成される」という用語には、特定の物質またはステップのみの場合も含まれるが、本発明の基本的な特性および新規な特性に実質的に影響を及ぼさない限り、追加的な成分または分子も含まれる。
【００１４】
培地は単純、複雑、または明確なものに分類することができる。基礎液体培地または基礎培地は基本的に単純な培地であり、最小限の追加成分で細菌を生育させる。通常、そのような基礎培養液は単にエネルギー源を供給し、正確な浸透圧を維持しさえすればよい。ペプトン、トリプトン、栄養液体培地（ペプトン、肉抽出物、任意的に酵母抽出物および塩化ナトリウム）、Ｌ−液体培地（トリプトン、酵母抽出物および塩化ナトリウム）、グラム陰性液体培地、トリプシン大豆培養液、酵母含有トリプシン大豆培養液、ならびに改良トリプシン大豆培養液は、先行技術で知られている好適な基本成分である。ペプトンは、消化中に酸または酵素によるタンパク質の部分加水分解によって得られる様々な水溶性のタンパク質誘導体である。トリプシン大豆培養液は通常、たとえばトリプトン（カゼインの膵液消化）、ソイトン（大豆ミールのパパイン消化）および塩化ナトリウムを含む。改良トリプシン大豆培養液は、さらにＤ形グルコース、胆汁塩およびリン酸二カリウムを含んでもよい。特に、基礎培養液は、トリプトン、栄養液体培地、Ｌ−液体培地、グラム陰性液体培地、ペプトン、トリプシン大豆培養液、酵母含有トリプシン大豆培養液、および改良トリプシン大豆培養液から構成される群から選択される。より具体的には、基礎培養液は、ペプトン、トリプシン大豆培養液、酵母含有トリプシン大豆培養液、および改良トリプシン大豆培養液から構成される群から選択される。
【００１５】
特定の実施の形態では、増殖抑制剤はブリリアントグリーン、トリアリルメタン色素（ＣＡＳ番号６３３−０３−４）である。
【００１６】
ブリリアントグリーンはグラム陽性細菌および大部分のグラム陰性細菌の成長を抑制することが知られている色素である。ブリリアントグリーンは、先行技術では様々な量、たとえばＤｉｆｃｏ（登録商標）ｍブリリアントグリーン液体培地中に２５ｍｇ／Ｌ、ブリリアントグリーンテトラチオン酸塩胆汁液体培地中に７０ｍｇ／Ｌ、ＭＬＣＢ寒天培地中に４．５〜６ｍｇ／Ｌ、およびＭｕｌｌｅｒ Ｋａｕｆｆｍａｎｎテトラチオン酸塩液体培地中に１０ｍｇ／Ｌ使用される。何１０年も使用されてきたが、本発明者らは驚くべきことに、ブリリアントグリーンのそのような濃度は、たとえばサルモネラ菌および赤痢菌を成長させるために最適ではないということを見出した。実際にそのような高濃度は、サルモネラ菌および赤痢菌を効率的かつ素早く成長させるためには有害であると信じられている。また、「病気の」または「ストレスを受けた」細菌を再生する妨げになる可能性もある。サルモネラ菌の特定の株、たとえばサルモネラ菌ｔｙｐｈｉ種またはｐａｒａｔｙｐｈｉ種は特に、ブリリアントグリーン感受性株であることが知られている。また現在、株間で識別（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）阻害作用を示さない適切な培地が存在しない（ＣｈａｕおよびＬｅｕｎｇ、２００８年）。
【００１７】
本発明者らはここで、たとえばグラム陽性細菌に対する阻害作用を有す一方で、サルモネラ菌（ｔｙｐｈｉ種およびｐａｒａｔｙｐｈｉ種を含む）の迅速な再生および成長を可能にするブリリアントグリーンの濃度の範囲を見出した。したがって、特定の実施の形態では、本培地は約０．０５ｍｇ／Ｌ〜約０．２５ｍｇ／Ｌまたは約０．１ｍｇ／Ｌ〜約０．２５ｍｇ／Ｌ、より具体的には０．１５ｍｇ／Ｌのブリリアントグリーンを含む。
【００１８】
これらの「低濃度」は、既に先行技術で知られている培地中の濃度から考えると驚くべき濃度である。先行技術で知られている培養方法は長時間持続的であるため、競合する微生物の成長を阻害するために、４８時間にも及ぶ培養を持続させるために、高濃度のブリリアントグリーンを利用する必要があると以前は信じられてきた。しかし、本発明の培地中では成長効率が良いため、単一の培地中で２０時間以内、具体的には約４〜１５時間以内、より具体的には約４〜８時間以内、さらにより具体的には約４〜６時間以内に、検出に適したレベルまで微生物を培養できる。別の実施の形態では、たとえばスワブ（ｓｗａｂ：表面拭い）試験を使用する場合には、この時間はさらに約３０分間〜約４時間、具体的には約１、１．５、２、２．５または３時間にまでさらに減少させられる可能性がある。結果として、ブリリアントグリーンを極めて低濃度で使用することが可能となる。ブリリアントグリーンはこの低濃度でも依然として、２０時間まで特定の競合微生物の成長を阻害する機能を有する。しかし、ブリリアントグリーンはたとえばサルモネラ菌および／または赤痢菌などの目的とする微生物の成長に全く影響を及ぼさない程度に、十分に低濃度である。
【００１９】
含有量は通常、ｍｇ／Ｌまたはｇ／Ｌで表されるが、水に単独でまたは連続的に添加されるために、たとえばタブレット、粉末、顆粒またはその他任意の所望の乾燥した形態にてあらかじめ混合された状態で、組成物が供給されてもよいことを理解する必要がある。また組成物は、所望の場合には多包装システムの別々の成分として提供されてもよい。この場合、含有量は成分の最終濃度に注意する必要がある。成分の最終濃度は、適量の水で希釈した時点で得られる。たとえば、０．５ｍｇのブリリアントグリーンを含む乾燥粉末の小包が２Ｌの水に希釈されると、得られる濃度は０．２５ｍｇ／Ｌである。
【００２０】
別の実施の形態では、本培地はナリジクス酸および／または塩化リチウムを増殖抑制剤として含む。
【００２１】
ナリジクス酸（ＣＡＳ番号：３８９−０８−２）はグラム陽性細菌とグラム陰性細菌の両方に対して有効である。低濃度では、ナリジクス酸は静菌性を有する。つまり、ナリジクス酸は細菌の成長と繁殖を阻害する。高濃度では、ナリジクス酸は殺菌性を有する。つまり、単に成長を阻害するのではなく、ナリジクス酸は細菌を死滅させる。特定の実施の形態では、本培地はナリジクス酸を約１〜３ｍｇ／Ｌ、より具体的には約２ｍｇ／Ｌ含む。
【００２２】
塩化リチウム（ＣＡＳ番号７４４７−４１−８）は、グラム陽性細菌の成長に影響を与えることなくグラム陰性細菌の成長を阻害する。特定の実施の形態では、本培地は約１〜３ｇ／Ｌ、より具体的には約２ｇ／Ｌの塩化リチウムを含む。
【００２３】
リステリア菌種の成長用の培地中に、ナリジクス酸および／または塩化リチウムを増殖抑制剤として使用することは有益である。
【００２４】
特定の実施の形態では、培地は任意的に成長促進物質を含んでいてもよい。
【００２５】
サルモネラ菌種に対しては、基礎培養液がペプトンを含む場合、テトラチオン酸ナトリウムまたはその塩を含むことが有益であることが見出されている。驚くべきことに本発明者らは、培地中のテトラチオン酸ナトリウムの濃度が約２０ｇ／Ｌよりも高ければサルモネラ菌種の成長を著しく阻害することを見出した。これが驚くべきことであるのは、２０ｇ／Ｌよりも高い濃度は、ポジティブセレクション用やサルモネラ菌種の成長用に、従来技術で日常的に使用されているからである。したがって、テトラチオン酸ナトリウムは約１〜約２０ｇ／Ｌ、より具体的には約４〜約１５ｇ／Ｌ、約６〜約１５ｇ／Ｌ、さらにより具体的には約７〜１５ｇ／Ｌ、約８〜１２ｇ／Ｌまたは約８ｇ／Ｌの濃度で含有されることが好ましい。
【００２６】
代替の実施形態では、本発明の精神から逸脱しない範囲で、テトラチオン酸ナトリウムに代えて適量のチオ硫酸ナトリウムおよびヨウ素が使用されてもよい。これは、ヨウ素が生体内でチオ硫酸ナトリウムと反応することにより、テトラチオン酸ナトリウム（およびヨウ化ナトリウム）が生成される可能性があるからである。別の実施の形態では、テトラチオン酸塩アニオン（Ｓ４Ｏ６２−）を放出するテトラチオン酸カリウム塩、バリウムのジチオン酸塩の無水物、それらの塩または化合物もしくは化合物の混合物が利用されてもよい。
【００２７】
別の実施の形態では、本培地は、成長促進物質を含む。この場合、成長促進物質はクエン酸第二鉄アンモニウムである。
【００２８】
特定の実施の形態では、クエン酸第二鉄アンモニウム（ＣＡＳ番号：１１８５−５７−５）が約２００〜１０００ｍｇ／Ｌ、より具体的には約２００〜約５００ｍｇ／Ｌ、さらにより具体的には２００ｍｇ／Ｌ〜約３００ｍｇ／Ｌ、およびさらにより具体的には約２５０ｍｇ／Ｌの濃度で使用される。
【００２９】
さらに別の実施の形態では、本培地は成長促進物質であるクエン酸ナトリウムをさらに含む。
【００３０】
特定の実施の形態では、トリクエン酸ナトリウム（ＣＡＳ番号：６８−０４−２）が約１０〜約２０ｇ／Ｌ、約１２〜１８ｇ／Ｌ、より具体的には約１５ｇ／Ｌの濃度で使用される。
【００３１】
特定の実施の形態では、本培地はサルモネラ菌種の成長用の培地である。別の実施の形態では、本培地は赤痢菌種の成長用の培地である。さらに別の実施の形態では、本培地はリステリア菌種の成長用の培地である。
【００３２】
本発明の第２の態様により提供されるのは、微生物の細胞からコアオリゴ糖モノマーを放出するための以下のステップを含む方法である。
（ｉ）洗浄剤を前記微生物を含む少なくとも１つの培養サンプルに添加することにより、洗浄剤−培養液を供給するステップと、
（ｉｉ）洗浄剤−培養液をコアオリゴ糖を放出するのに十分な温度にまで加熱するステップ。
【００３３】
細菌のリポ多糖類（ＬＰＳ）は、すべてのグラム陰性細菌およびある種のグラム陽性細菌の外膜の必須成分である。ＬＰＳは、そのような細菌に感染した患者の炎症性反応に関与する主要因子であると信じられている。グラム陰性細菌の例としては、病原性大腸菌、サルモネラ菌、赤痢菌およびカンピロバクター菌が含まれる。リステリア菌はグラム陽性細菌である。
【００３４】
特定されたＬＰＳの大部分は、同じ主要構造を有する。つまり、ＬＰＳの構造は３つの異なる領域である脂質Ａ領域、コアオリゴ糖、およびｏ−多糖鎖から構成されることが解明されている（図１２ａ）。この構造は、特にＬＰＳの脂質Ａ領域および内側のコア部において保存されている。この構造が保存されているため、脂質Ａ領域に結合する抗体のような結合分子は、特定の種に特異的ではない可能性がある。これにより、あらゆる分子検出ステップにおいて偽陽性が生じてしまう。さらに、たとえばコア領域に対して複数の結合分子を使用することは不十分である。それは、そのような結合分子は同じエピトープを求めて競合する可能性があるため、またはエピトープが近接していることによりそれぞれの結合反応が妨げられる可能性があるからである。したがって、先行技術の検出方法は、それらのエピトープが容易に接近できるため、細胞表面またはたとえばサルモネラ菌などの細菌に特異的な結合分子に依存していた。
【００３５】
ＬＰＳは通常、含水フェノール抽出と続く精製によって、細菌から単離される。単離されたＬＰＳは、続いてたとえばＳＤＳ−ＰＡＧＥ、質量分析およびＮＭＲによって特定することができる（Ｒａｅｔｚ、１９９６年）。本発明者らは、洗浄剤と熱の適用を利用する迅速な方法の使用を通じて、コアオリゴ糖領域が開放されるか、接近可能になるか、たとえば抗体結合技術による検出に使用できるようになる可能性があることを見出した。そのような単純な手順を使用することは、たとえば細胞表面の抗原または細菌の検出には適していないであろう。それは、洗浄剤が脂質と相互作用することが知られており、結合分子が相互作用する可能性がある脂質Ａエピトープを破壊または崩壊させるからである。洗浄剤を単独でも使用できるが、熱を使用するとさらに有利である。それは、熱がＬＰＳを検出可能なモノマーに分解するとともに、病原性細菌を死滅させるという追加的な利点も有するからである。
【００３６】
洗浄剤は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）またはＴＷＥＥＮ ２０、４０、６０または８０であることが好ましい。
【００３７】
驚くべきことに、本発明者らはＳＤＳを使用すると抗体などの結合分子とエピトープとの結合を、後述する直接アッセイにおいて１０倍も強くすることができることを見い出した。同様に、他の洗浄剤は直接アッセイ（後述）において抗体結合を干渉したり阻害したりするが、驚くべきことに本発明者らは、ＴＷＥＥＮ ２０、４０、６０または８０は、たとえば競合アッセイにおいて、そのような影響をほとんど及ぼさないか全く及ぼさないことを見い出した。これはたとえばＱｕａｌｔｉｅｒｅら（１９７７年）のような技術による確立された教示とは正反対である。
【００３８】
洗浄剤は、たとえば水などの溶媒に溶かして培養サンプルに液体として加えられてもよいし、ＳＤＳの場合は固体として加えられてもよい。本方法で使用される洗浄剤の具体的な濃度は、約０．１％〜約２％、特に約０．５％〜約１％である（ｗ／ｖまたはｖ／ｖ）。
【００３９】
洗浄剤を水に溶解または希釈させ、上述の濃度になるように液体として添加されることが好ましい。洗浄剤溶液は、バッファなどのさらなる成分を含まないことが好ましい。したがって、好ましい実施の形態では、本洗浄剤溶液は、水に溶解した洗浄剤であるドデシル硫酸ナトリウム、またはＴＷＥＥＮ ２０、４０、６０もしくは８０から実質的に構成される。
【００４０】
本方法の次のステップでは、洗浄剤−培養液はコアオリゴ糖を放出するのに十分な温度にまで加熱される。サンプル中に存在する可能性のある細菌、特にサルモネラ菌、赤痢菌またはリステリア菌を死滅させるのに十分な温度にまで溶液を加熱することが好ましい。具体的な温度には、約６０℃〜約１００℃、特には約６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５〜約１００℃が含まれる。ステップ（ｉ）および（ｉｉ）が連続的または同時に行われれてもよいことは、当業者には明らかであろう。培養サンプルおよび／または洗浄剤が混合前に加熱されてもよいことも当業者には明らかであろう。洗浄剤−培養液は、約３０秒間〜約２０分間、具体的には約２分間〜約１５分間、より具体的には約２、３、４、５、６、７、８、９または約１０分間加熱されてもよい。
【００４１】
本発明の第３の実施の形態では、試験サンプル中で目的とする微生物の存在または不存在を検出するための以下のステップを含むアッセイ方法が提供される。
（ｉ）試験サンプルを培地中で培養することにより、目的とする微生物の増殖を可能とするステップと、
（ｉｉ）試験サンプル中に存在する任意の微生物から１つ以上のコアオリゴ糖を放出するのに十分な程度に、試験サンプルを処理するステップと、
（ｉｉｉ）目的とする微生物のコアオリゴ糖に対する結合特異性を有する少なくとも１つの結合分子に、試験サンプルを接触させるステップと、
（ｉｖ）少なくとも１つの結合分子と目的とする微生物のコアオリゴ糖との任意の結合を検出するステップ。
【００４２】
本アッセイ方法は、直接的であってもよいし、間接的であってもよい。「サンドイッチアッセイ」とも呼ばれる直接結合アッセイ、つまり非競合アッセイ（直接的または間接的）では、抗体が目的とする微生物の任意のコアオリゴ糖と反応するように、コアオリゴ糖は表面および結合分子に結合することが好ましい。結合分子は標識結合分子であることが好ましい。次に、表面の標識結合分子の量が測定される。
【００４３】
直接アッセイ方法の結果は通常、サンプル中のコアオリゴ糖の濃度に正比例する。コアオリゴ糖がサンプル中に存在しない場合、標識結合分子が結合しないのは明らかである。
【００４４】
競合アッセイでは、試験サンプル中のコアオリゴ糖は、結合分子に結合しようとして標識コアオリゴ糖と競合する。次に、コアオリゴ糖に結合した標識結合分子の量が測定される。この方法では、反応はサンプル中のコアオリゴ糖の濃度に反比例する。これは、反応の程度が大きいほど、「未知の」サンプル、つまり試験サンプル中で標識コアオリゴ糖と競合するために使用可能なコアオリゴ糖が少なくなるからである。
【００４５】
アッセイが直接的であるか間接的であるかにかかわらず、検出のためにコアオリゴ糖または標識コアオリゴ糖がそれぞれ表面に結合することが好ましい。
【００４６】
コアオリゴ糖が結合する表面は、先行技術で知られている材料、たとえば樹脂、ガラス、セラミックスなどの有機ポリマーで形成されていてもよい。特定の有機ポリマーには、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、セルロースおよびニトロセルロースが含まれる。好ましいポリマーはポリスチレンであり、より具体的にはガンマ線を照射したポリスチレンである。その表面自体は、シート、マイクロプレートまたはマイクロタイタープレート、トレイ、メンブレン、ウェル、ペレット、竿、棒、チューブ、ビーズなどの形態またはその一部であってもよい。
【００４７】
特定の実施の形態では、ＬＰＳまたはコアオリゴ糖を含むモノマーは、修飾されることなく表面に固定化される。たとえば、分子の疎水性の脂質Ａ部分は、非共有の疎水性相互作用を介して、ガンマ線を照射したポリスチレン表面のような表面に結合してもよい。そのような結合は、コアオリゴ糖領域を抗体などの結合分子と相互作用をするために接近可能なままに留める。
【００４８】
代替の実施形態では、ＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖は、抗体、複合体、または他の結合などの結合仲介分子を用いることによって、表面に固定化される。好適な代替物は、国際特許出願第ＷＯ０３／３６４１９号に開示されている。
【００４９】
本方法の第１のステップは、試験サンプルを培地中で培養することにより、目的とする微生物の増殖を可能とするステップを含む。
【００５０】
ある実施の形態では、本方法は食物または食品中に存在する微生物タンパク質またはフラグメントを検出するために使用される。別の実施の形態では、サンプルは環境サンプル、農産物サンプル、医療品、または製造サンプルである。試験サンプルは、加工食品、乾燥食品、冷凍食品、または冷蔵食品を含む、肉、ミンチを含む肉製品、卵、チーズ、ミルク、野菜、チョコレート、ピーナッツバターなどの食品であってもよい。または、試験サンプルは、生検サンプル、糞便、唾液、水和液、栄養液、血液、血液製剤、組織抽出物、ワクチン、麻酔、薬理活性のある薬剤、造影剤または尿サンプルなどの臨床サンプルであってもよい。試験サンプルはまた、肌のスワブ、盲腸のスワブ、糞便のスワブ、排せつ物のスワブ、もしくは直腸のスワブ、または床、ドアおよび壁などの表面のスワブ、または動物の死体スワブを含む、食品から得られたスワブなどのスワブ（ｓｗａｂｓ：ぬぐい液）を含んでいてもよい。試験サンプルはまた、ファンデーション化粧品、口紅、ローション、クリーム、シャンプーなどの化粧品サンプルを含んでいてもよい。
【００５１】
試験サンプルは、本発明の第１の態様に従った培地中で培養されることが好ましい。
【００５２】
特定の実施の形態では、試験サンプルは培地中で約３０℃〜約４４℃、具体的には約３７℃〜４２℃、より具体的には約３７℃にて培養される。試験サンプルは培地中で、約４〜１５時間、より具体的には約４〜８時間、さらにより具体的には約４〜６時間培養されてもよい。別の実施の形態では、試験サンプルは培地中で、約３０分間〜約４時間、具体的には約１、１．５、２、２．５または３時間培養されてもよい。
【００５３】
本方法の第２のステップには、試験サンプル中に存在する任意の微生物から１つ以上のコアオリゴ糖を放出するのに十分な程度に、試験サンプルを処理するステップを含む。
【００５４】
試験サンプルは、細菌のＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖を微生物の細胞膜から放出させるのに適した任意の方法で処理されてもよい。試験サンプルは、本発明の第２の態様に従って処理されるのが好ましい。
【００５５】
他の好適ではあるがおそらく効率が低い抽出方法が従来技術には存在する。超音波処理、加圧型細胞破壊装置の使用、酵素の使用、「ビーズビート法（ｂｅａｄ ｂｅａｔｉｎｇ）」などを含むそれらの方法もまた使用することができる。しかし、サルモネラ菌などの病原性細菌を扱う場合、高温の洗浄剤（煮沸したものまたは上述のもの）を使用することが特に有用である。なぜなら、高温により確実にすべての細菌が死滅するからである。より具体的には、アッセイが直接結合アッセイの場合、ＳＤＳが好適に利用される。一方、アッセイが競合型の場合、プレートに塗布する抗原を調整するためにＳＤＳが使用される。ただし、残りの手順の間は、ＴＷＥＥＮ ２０、ＴＷＥＥＮ ４０、ＴＷＥＥＮ ６０またはＴＷＥＥＮ ８０のいずれか、特にＴＷＥＥＮ ２０が使用される。上述の第１の態様との関係で、適切な加熱／処理時間の長さが規定される。目的とする微生物が試験サンプル中に存在しなくてもよいことは明らかであろう。その場合、目的とする微生物のＬＰＳおよびコアオリゴ糖も存在しないであろう。
【００５６】
本方法の第３のステップでは、目的とする微生物のコアオリゴ糖に対する結合特異性を有する少なくとも１つの結合分子に、試験サンプルが接触させられる。
【００５７】
特定の実施の形態では、処理した試験サンプル中のコアオリゴ糖、ＬＰＳまたはモノマーは、ステップ（ｉｉｉ）の前に、表面に固定化される。コアオリゴ糖、ＬＰＳまたはモノマーは、目的とする微生物のコアオリゴ糖に結合特異性を有する、少なくとも１つの結合分子に曝されている。そのような実施の形態では、サンプル中のコアオリゴ糖、ＬＰＳまたはモノマーは、処理された試験サンプルを表面に接触させ、接触させた状態で約１０分間、２０分間、３０分間、４０分間、５０分間、もしくは約６０分間インキュベートおよび／または維持することによって、固定化されてもよい。
【００５８】
別の実施の形態、たとえば競合アッセイでは、試験サンプルは表面に塗布されるか接触させられる。表面には、既に固定化された既知量または標準量のコアオリゴ糖、ＬＰＳまたはモノマーが存在する。既知量または標準量両方のコアオリゴ糖、ＬＰＳまたはモノマーが、少なくとも１つの結合分子と結合しようとして、試験サンプルから得られたコアオリゴ糖、ＬＰＳまたはモノマーと競合する。
【００５９】
コアオリゴ糖、ＬＰＳまたはモノマーは、たとえば非共有の疎水性相互作用によって前記表面に直接固定化されてもよいし、上述のように間接的に固定化されてもよい。
【００６０】
試験サンプルを少なくとも１つの結合分子に十分な時間接触させることにより、コアオリゴ糖、ＬＰＳまたはモノマーが少なくとも１つの結合分子に結合できるようにして、たとえばコアオリゴ糖／結合分子複合体のような複合体を形成するべきである。適切な時間には、約１分間〜約４時間、特に約３０分間〜約２時間、特に約４５分間、１時間および１．５時間が含まれる。
【００６１】
ある実施の形態では、本方法の任意のステップにおいて、複合体は、少なくとも１つの結合分子に対し結合特異性を有する第２の結合分子に十分な時間接触させられる。これにより、第２の結合分子は二次的な複合体、たとえばコアオリゴ糖／結合分子／第２の結合分子複合体を形成することができる。
【００６２】
結合分子は、抗体、より具体的には親和性により精製された抗体、さらにより具体的にはモノクローナル抗体であることが好ましい。
【００６３】
本発明のアッセイに使用される抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体であってもよい。そのような抗体は一本鎖で構成されてもよいが、少なくともＬ鎖またはＨ鎖で構成されることが好ましい。しかし、抗体が結合特異性を有するコアオリゴ糖または汚染微生物などの標的に結合するために、少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）が必要であることは理解されるであろう。
【００６４】
抗体を作製する方法は、先行技術で知られている。たとえば、ポリクローナル抗体が望ましい場合、マウス、ウサギ、ヤギまたはウマなどの選択された哺乳類が、細菌のエンドトキシンなどの選択された抗原によって免疫されてもよい。次に、免疫された動物から得られた血清が集められ、たとえば免疫親和性クロマトグラフィーによって、抗体を得るように処理される。
【００６５】
モノクローナル抗体は、先行技術で知られており通常行われている方法によって製造されてもよい。ハイブリドーマ技術を用いてモノクローナル抗体を製造するための通常の方法は、よく知られている（たとえば、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ，Ｎａｔｕｒｅ、第２５６巻：第４９５〜４９７頁（１９７５年）；Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ、第４巻：第７２頁（１９８３年）；Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．第７７〜９６頁（１９８５年）を参照）。
【００６６】
後述のとおり抗体は、ＣＤＲなどのエピトープ−結合領域で構成されている必要がある。抗体は、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよび特にＩｇＧを含む、任意の適切なクラスであればよい。また、それらの抗体の様々なサブクラスも想定される。ここで用いられるように、「抗体結合フラグメント」という用語は、抗体のフラグメント、つまり抗体から得られたポリペプチドをいう。このポリペプチドは、抗体の結合特異性を有する。そのようなフラグメントには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖなどの抗体フラグメントが含まれるが、これらには限られない。これらのフラグメントはすべて、エピトープに結合することができる。
【００６７】
また、「抗体」という用語は、入手可能な様々な任意の自然抗体、人工抗体、および抗体由来のタンパク質、ならびにそれらの派生物に及ぶ。派生物としては、たとえばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体，単一ドメイン抗体、抗体全体、Ｆ（ａｂ’）２およびＦ（ａｂ）フラグメントなどの抗体フラグメント、Ｆｖフラグメント（非共有のヘテロ二量体），一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）などの一本鎖抗体、小体（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）、オリゴ体（ｏｌｉｇｏｂｏｄｉｅｓ）、二量体または三量体の抗体フラグメント、あるいはコンストラクトなどが含まれるが、これらには限られない。「抗体」という用語は、何ら特定の由来を意味するものではなく、ファージ提示法など、従来の方法ではない方法によって得られた抗体も含む。本発明の抗体は、任意のアイソタイプ（たとえばＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、つまりα、γまたはμのＨ鎖）とすることができ、Ｋ（カッパ）またはλ（ラムダ）のＬ鎖を有してもよい。
【００６８】
したがって、本発明は、本発明で使用されるコアオリゴ糖に対する結合特異性を有する抗体および抗体から得られた結合フラグメントの使用にまで及ぶ。
【００６９】
「特異的に結合する」または「結合特異性」という用語は、抗体またはそのフラグメントが、標的ではないエピトープに対するよりも高い親和性で、標的となる微生物病原体に結合する能力をいう。たとえば標的エピトープに対する抗体の結合は、標的ではないエピトープに対する結合親和性よりも、少なくとも１０倍、５０倍、１００倍、２５０倍、５００倍、または１０００倍を超える結合親和性をもたらしてもよい。ある実施の形態では、結合親和性は親和性ＥＬＩＳＡアッセイによって決定される。代替の実施形態では、親和性はＢＩＡｃｏｒｅアッセイによって決定される。代わりに、結合親和性は速度論的方法によって決定されてもよい。
【００７０】
ある実施の形態では、抗体などの結合分子が表面上に固定されてもよい。そして任意的な洗浄ステップの後、目的とするコアオリゴ糖または汚染微生物を含みうる試験サンプルを、表面に結合した抗体に、結合が起きて表面に結合した第１の結合分子ーコア複合体が形成されるように、十分な時間接触させることができる。本アッセイは次に、第１の結合分子ーコア複合体が結合した表面を、抗体などの第２の結合分子に接触させるステップを含んでもよい。第２の結合分子は、たとえばアクリジニウムエステルなどの発光手段と共有結合していてもよい。そのような場合、第２の結合分子は、第１の結合分子、コアオリゴ糖または汚染微生物に存在するエピトープに対する結合特異性を有する。それにより、生成されたシグナルの量は、第１の結合分子または第２の結合分子が結合したコアオリゴ糖または汚染微生物の量に対応する。
【００７１】
典型的には、抗体は精製されることにより凝集が抑制される。
【００７２】
ある実施の形態では、表面は、例えば従来型設計のマイクロタイタープレートである。しかし、たとえば暗い側壁と（底面などに）白色または透明な部分とを有する改良表面を使用すれば、利点を得ることができる。これにより、測定時において、生成された任意のシグナルを増幅し、背景光を低減することができる。白色の部分が光を反射させることにより、生成されたシグナルを増幅することができる。したがって、特定の実施の形態では、表面は複数のウェルを含むマルチウェルプレートである。この場合、各ウェルの底面は透明または実質的に透明である。一方、ウェルの側壁は、光の透過を防止するために不透明もしくは暗くされるか、またはウェルの底面部に対してコントラストを与えることにより光が底面部で通過できるようにするために着色されている。
【００７３】
さらにより具体的には、本抗体は種特異的なモノクローナル抗体である。
【００７４】
「種特異的な」という用語を使うことによって、交差反応がほんんどないか全くない程度に、例えばサルモネラ菌、赤痢菌およびリステリア菌の間でそのような抗体が異なることを意味することを目的としている。
【００７５】
特定の実施の形態では、結合分子は以下のＬＰＳコアオリゴ糖のエピトープと反応して結合する。
【００７６】
【化１】
このエピトープは種特異的であり、サルモネラ菌を他の細菌から識別する。他の細菌としては、赤痢菌、リステリア菌、病原性大腸菌などがあるが、これらには限定されない。特定の実施の形態では、本アッセイ方法は、サルモネラ菌を定量的に検出するための方法である。本アッセイ方法は、サルモネラ菌の存在または不存在を検出するために利用されてもよい。特定の実施の形態では、結合分子は、たとえば化学発光性または蛍光性の化合物に対する結合により標識された標識結合分子である。
【００７７】
しかし、本発明の方法は、様々な標的汚染微生物の同定および定量に使用できることは明らかであろう。本発明のアッセイ方法は、存在性に関するサンプルの分析または汚染微生物量の分析を含む。本発明の方法を用いて試験されるサンプルのすべてが汚染微生物を含むわけではないということは理解されるであろう。ある実施の形態では、汚染微生物は病原性微生物から得られたタンパク質またはそのフラグメントである。あるさらなる実施の形態では、汚染微生物は、細胞壁のフラグメント、ペプチドグリカン、糖タンパク質、リポタンパク質、糖脂質タンパク質、小ペプチド、糖配列および脂質配列から構成される群のうちの少なくとも１つであってもよいが、これらに限られるわけではない。本発明の方法は、細菌、ウイルスおよび菌類から得られた構造タンパク質および／または毒素を含む微生物タンパク質を検出するのに特に適している。
【００７８】
本方法の第４のステップは、目的とする微生物のコアオリゴ糖または汚染微生物に対する、少なくとも１つの結合分子の任意の結合を検出するステップを含む。
【００７９】
本検出方法は、蛍光測定、比色定量、フローサイトメトリー、化学発光などの先行技術で知られている任意の適切な方法によるものであってもよい。好適な実施の形態では、結合の検出は、たとえば化学発光性の化合物が発する化学発光性の光の発光シグナルの測定／検出による。適切な化学発光性の化合物には、アクリジニウムエステル、アクリジニウムスルホンアミド、フェナントリジニウム（ｐｈｅｎａｎｔｈｒｉｄｉｎｉｕｍｓ）、１，２−ジオキシエタン、ルミノール、または化学発光性の基質を触媒する酵素などが含まれる。
【００８０】
ある実施の形態では、結合分子は発光部と直接結合してもよい。ある実施の形態では、結合分子はアクリジニウム化合物またはその派生物と結合する。派生物には、アクリジニウムエステル分子または発光ラベルとして機能するアクリジニウムスルホンアミドがある。抗体または結合フラグメントがアクリジニウムエステルまたはアクリジニウムスルホンアミドと結合する実施の形態では、本アッセイ方法はＡＭＰＰＤを試験サンプルに添加するステップをさらに含んでもよい。
【００８１】
ＡＭＰＰＤは、以下の同義語によって知られているかもしれない：３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３”−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキシエタン；３−（４−メトキシスピロ（１，２−ジオキシエタン−３，２’−トリシクロ（３．３．１．１（３，７））デカン）−４−ｙｌ）フェニルリン酸塩；４−メトキシ−４−（３−リン酸塩フェニル）スピロ（１，２−ジオキシエタン）−３，２’−アダマンタン。
【００８２】
ある別の実施の形態では、抗体は間接的に発光部と関連してもよい。たとえば、アクリジニウムエステル分子は、第１の抗体と結合可能な第２の抗体と結合してもよい。ある実施の形態では、１つ以上の発光性または蛍光性の部分がアビジン／ストレプトアビジンに結合してもよい。同様にアビジン／ストレプトアビジンは、抗体に化学的に結合したビオチンに結合してもよい。ある別の実施の形態では、レクチン（プロテインＡ／Ｇ／Ｌ）は発光性または蛍光性の分子と結合しうる。また、発光性または蛍光性の分子は、抗体または他のタンパク質複合体に取り付けられていてもよい。
【００８３】
検出可能なシグナルを生成する刺激は、光、たとえば紫外線光などの特定の波長の光であってもよいし、電気的刺激または放射性刺激、化学反応または酵素−基質反応など、他の何らかの刺激であってもよい。
【００８４】
本検出方法は、１００００ｃｆｕもの病原性大腸菌など他の微生物の存在下で、またはたとえばスワブもしくは開始サンプルあたり、サルモネラ菌、赤痢菌またはリステリア菌の１コロニー形成単位（ｃｆｕ）を好ましくは検出／識別できるべきである。特定の検出限界は、サンプルサイズ（ｍｇ，ｇなど）または体積（ｍｌ，Ｌなど）の単位あたり約１０００ｃｆｕ、具体的には約５００ｃｆｕ、より具体的には約２５０ｃｆｕ、２００ｃｆｕ、１５０ｃｆｕ、１００ｃｆｕ、５０ｃｆｕ、１０ｃｆｕ、および約１ｃｆｕである。液体培養では、特定の検出限界は約５００ｃｆｕ／ｍｌである。
【００８５】
別の実施の形態では、抗体はそのような発光部と間接的に関係があってもよい。例えば、アクリジニウムエステル分子は、第１の結合分子と結合することができる第２の結合分子と共役してもよい。
【００８６】
本アッセイ方法は、定性的であってもよいし、定量的であってもよい。また、標準コントロールを流すことにより、生成された平均シグナルを既知量の例えばコアオリゴ糖と関連づけてもよい。
【００８７】
ある実施の形態では、本方法は複数のコアオリゴ糖または汚染微生物のサンプルにおける決定用に使用されてもよい。これは、異なるエピトープまたは汚染微生物に対してそれぞれ結合特異性を有する抗体のような、複数の結合分子を提供することにより実現される。ある実施の形態では、二重特異性の抗体が使用されてもよい。
【００８８】
本方法の各段階の間または各段階において、任意の洗浄ステップ、乾燥ステップ、および／または培養ステップが含められてもよいことは明らかであろう。また、本方法は「ブロッキングステップ」を本方法の１つ以上のステップ間に任意的に含んでもよい。この場合、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはカゼインなどの非反応性タンパク質の濃縮液が、たとえばマイクロタイタープレートのすべてのウェルに対して添加される。特定のブロッキング薬剤もまた、ミルク粉末などの溶液を含む。そのようなタンパク質が、他のタンパク質がプレートに非特異的に吸着することを阻止する。また、そのようなタンパク質は、アッセイの感度を妨げうる「バックグラントの」ノイズを低減させるために有益であってもよい。
【００８９】
本発明の第６の実施の形態によると、サルモネラ菌、赤痢菌およびリステリア菌から構成される群から選択される微生物を特異的に検出するための、コアオリゴ糖に対して結合特異性を有する結合分子の使用が提供される。
【００９０】
本発明の第５の実施の形態によると、本発明の第１、２、３、４および／または５の実施に従って本発明を実行するためのキットが提供される。そのようなキットは、（即使用可能なまたは希釈用に濃縮された）液体状態もしくは（たとえば粉末、顆粒、タブレットなどの）乾燥状態の培地、洗浄剤もしくは洗浄剤溶液、洗浄バッファ、希釈剤、調整済プレート、調整済チューブまたはビーズ、１つ以上の（１次、２次）抗体、検出試薬、手袋、ピペット用チップ、取扱説明書などを含んでいてもよい。調整済プレートまたはチューブのウェルは、既知または標準量のコアオリゴ糖、ＬＰＳもしくはモノマー、または抗体などの結合分子によって被覆済であってもよい。そのような調整済の表面は、凍結乾燥されていてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】図１（ａ）および図１（ｂ）は、直接結合アッセイの概略図である。黒塗りの菱形は、サルモネラ菌などの細菌のコアオリゴ糖、ＬＰＳまたはモノマーを表す。図１（ａ）は直接免疫アッセイを示し、図１（ｂ）は間接免疫アッセイを示す。
【図２】図２（ａ）および図２（ｂ）は、結合タンパク競合アッセイの概略図である。黒塗りの菱形は、サルモネラ菌などの細菌のコアオリゴ糖、ＬＰＳまたはモノマーを表す。図２（ａ）は直接競合免疫アッセイを示し、図２（ｂ）は間接競合免疫アッセイを示す。
【図３】図３は、テトラチオン酸塩はサルモネラ菌に対して正の成長効果を及ぼすが、他の細菌の成長は抑制されることを示すグラフである。
【図４】図４は、ブリリアントグリーンがサルモネラ菌、赤痢菌、病原性大腸菌およびブドウ球菌の成長に及ぼす影響を示すグラフである。本グラフは、特に０．１５ｍｇ／Ｌのブリリアントグリーン濃度で競合する細菌を阻害することによりサルモネラ菌を成長させるためのブリリアントグリーンの最適な濃度範囲を実証する。
【図５】図５は、クエン酸第二鉄アンモニウムがサルモネラ菌、赤痢菌、病原性大腸菌およびブドウ球菌の成長に及ぼす影響を示すグラフである。本グラフは、特に０．２５ｇ／Ｌの濃度で赤痢菌を成長させるためのクエン酸第二鉄アンモニウムの最適な濃度範囲を実証する。０．２５ｇ／Ｌを上回る濃度では、サルモネラ菌の成長は影響を受けない。
【図６】図６は、クエン酸ナトリウムがサルモネラ菌、赤痢菌、病原性大腸菌およびブドウ球菌の成長に及ぼす影響を示すグラフである。サルモネラ菌および赤痢菌の成長は助長されるが、競合する細菌の成長は阻害される。
【図７】図７は、グラム陰性液体培地中での細菌の成長を示すグラフである。
【図８】図８は、デオキシコール酸塩ークエン酸塩ーラクトースースクロース液体培地中での細菌の成長を示すグラフである。
【図９】図９は、ペプトン液体培地中での細菌の成長を示すグラフである。
【図１０】図１０は、改良トリプシン大豆培養液中での細菌の成長を示すグラフである。サルモネラ菌および赤痢菌の両方の成長が助長され、約３０分間という倍増時間を示す。
【図１１】図１１は、本発明の液体培地中で競合する細菌を阻害した場合の、リステリア菌種の成長の速さを説明するためのグラフである。
【図１２（ａ）】図１２（ａ）は、目的とするある細菌のＬＰＳの一般的な構造を示す（Ｏ−抗原、コア多糖（オリゴ糖）、脂質Ａ）。
【図１２（ｂ）】図１２（ｂ）は、種特異的な抗体結合エピトープを含むサルモネラ菌のＬＰＳモノマーの詳細な説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００９２】
本発明のアッセイは、あるサンプル中で、細菌のＬＰＳのコアオリゴ糖の存在または不存在を特定するために利用されることが好ましい。本発明のアッセイは、サルモネラ菌、赤痢菌、もしくはリステリア菌などの細菌を含むか、または細菌に汚染されたサンプルを特定することができる。これらの細菌は、種特異的なエピトープをＬＰＳのコアオリゴ糖領域中に有する。本発明の方法を説明することを目的とする以下の説明と例を参照すれば、本発明をより理解できるかもしれない。
【００９３】
図１（ａ）は、標識一次抗体を利用する直接結合アッセイのステップを示す。図１（ｂ）は、標識一次抗体と標識された二次抗体とを利用する直接結合アッセイを示す。動物の死体や食料品中においてサルモネラ菌種を検出するための直接結合（直接的または間接的な抗体結合）による化学発光に基づく免疫吸着アッセイは、後述のように実行されてもよい。
【００９４】
本発明の第１の態様に従い、２５ｇの食品サンプルが２２５ｍｌの培地に添加された。これに代えて、死骸において表面スワブが１０×１０ｃｍの領域から採取され、本発明の第１の態様に従って、２〜５ｍｌの培地中で培養されてもよい。具体的には、本培地は１％のペプトン、８ｇ／Ｌのテトラチオン酸ナトリウム、および０．１５ｍｇ／Ｌのブリリアントグリーンを含有していた。サンプルは３７℃で５時間培養された。
【００９５】
５時間の培養後、サンプルのうち２ｍｌの一定分量が取り出され、最終濃度が０．５％（ｗ／ｖ）となるようにＳＤＳが添加された。そのサンプルは１００℃で５分間加熱された後、冷却された。１００μｌの各試験サンプルが、硬質で白色の９６ウェル高結合性マイクロタイタープレート（グライナーバイオワン社）のウェルに直接添加され、３７℃で３０分間インキュベートされた。インキュベート中、ＬＰＳの脂質Ａ部分が非共有の疎水性相互作用によってプレートの表面に結合する（図１ａ（１）、図１ｂ（１））。インキュベートに続き、プレートの溶液を捨て、０．０１Ｍのリン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ７．４）、０．１４７ＭのＮａＣｌおよび０．０５（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ ２０を含む洗浄バッファを用いてウェルが３回洗浄された。
【００９６】
０．１４７ＭのＮａＣｌを含む０．０１Ｍのリン酸バッファ（ｐＨ７．４）中での濃度が５００ｎｇ／ｍｌの抗サルモネラ菌抗体複合体１００μｌが各ウェルに添加された。ウェルあたりの抗体の最終濃度は５０ｎｇであった。プレートに結合したサンプル（サルモネラ菌ＬＰＳ／コアオリゴ糖）および抗体が被覆されたウェル中で３０分間、３７℃にてインキュベートされた。インキュベートに続き、プレートが洗浄バッファ中で３回洗浄され、検出の前に完全に乾燥させられた（図１ａ（２）、図１ｂ（２））。
【００９７】
抗サルモネラ菌抗体がアクリジニウムエステルで直接標識された場合、プレートが照度計の中に配置される。３０μｌの誘因溶液Ａと６０μｌの誘因溶液Ｂがマイクロタイタープレートの各ウェルに添加されることにより、結合したアクリジニウムエステルから光出力が開始される（図１ａ（３））。照度計の設定は以下のとおりである。
【００９８】
遅延注入Ｐ（溶液Ａ用） − １．６秒
測定時間間隔１ − ０．０秒
遅延注入Ｍ（溶液Ｂ用） − ０．０秒
測定時間間隔２ − １．０秒
【００９９】
誘因溶液Ａは、６３μｌの７０％（ｗ／ｗ）硝酸と１６５μｌの３０％（ｖ／ｖ）Ｈ２Ｏ２とを全容積が１０ｍｌの蒸留水中に含んでいた。誘因溶液Ｂは、０．１ｇのＮａＯＨと７５ｍｇのＣＴＡＣとを１０ｍｌの蒸留水中に含んでいた。
【０１００】
ヤギの抗マウスＩｇＧ２ｂアクリジニウム複合体の添加（抗サルモネラ菌モノクローナル抗体が結合しない場合）
抗サルモネラ菌抗体が標識されていない場合、第２の結合分子であるヤギの抗マウスＩｇＧ２ｂ複合体が使用される。カラム処理後のＩｇＧ２ｂが、３％（ｗ／ｖ）の無脂肪ミルク粉末および０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ ２０を含む希釈剤中で１：１００に希釈された。希釈後の溶液１００μｌがプレートの各ウェルに添加された。（図１ｂ（３））。３７℃における６０分間のインキュベートに続き、プレートが洗浄バッファで４回洗浄され、乾燥され、上述のように測定された（図１ｂ（４））。
【０１０１】
食料品中のサルモネラ菌種を検出するための競合（直接的または間接的）化学発光結合性免疫吸着アッセイを後述のように行ってもよい。サルモネラ菌エンテリティディス種のＬＰＳを被覆したマイクロタイタープレートは、以下のように調整された。サルモネラ菌エンテリティディス種が標準液体培地（２％（ｗ／ｖ）の緩衝化ペプトン水（オキソイド社））中で本発明の第１の態様に従わずに１８時間かけて培養された。コロニー形成単位数が定量され、蓋がされているが密封はされておらず、最終濃度がそれぞれ１０ｍＭおよび０．５％（ｗ／ｖ）となるＮａＥＤＴＡおよびＳＤＳを含むポリプロピレン試験管中に、約１０８ｃｆｕ／ｍｌ分が入れられた。この培養液が１００℃で２分間煮沸されることにより、細菌を死滅させ（そしてあらゆる関連有害物質を中和させ）、さらにまた細菌のＬＰＳコアオリゴ糖つまりモノマーエピトープを露出させた（たとえば図１２ｂを参照）。煮沸されたストックは、２％の緩衝化ペプトン水（ＢＰＷ社）を含む希釈剤を添加することによって、１０６ｃｆｕ／ｍｌの濃度にまでさらに希釈された。
【０１０２】
希釈され煮沸されたストックのうち１００μｌが硬質で白色の９６ウェル高結合性マイクロタイタープレート（グライナーバイオワン社）の各ウェルに添加され、３７℃で６０分間インキュベートされた。インキュベート中、ＬＰＳの脂質Ａ部分は、非共有の疎水性相互作用によりプレートの表面に結合する。インキュベートに続き、プレートの溶液が捨てられ、ウェルが０．０１Ｍのリン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ７．４）、０．１４７ＭのＮａＣｌおよび０．０５（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ ２０を含む洗浄バッファによって３回洗浄された。洗浄された被覆プレートは、すぐに使用されるか保存用に凍結乾燥された（図２ａ（１）、図２ｂ（１））。
【０１０３】
１０ｃｆｕのサルモネラ菌に曝されたひき肉の試験サンプル２５ｇが、本発明の第１の態様に従って２００ｍｌの培地中に添加された。具体的には、本培地は１％のペプトン、８ｇ／Ｌのテトラチオン酸ナトリウムおよび１５ｍｇ／Ｌのブリリアントグリーンを含有していた。本サンプルは３７℃で５時間インキュベートされた。５時間のインキュベート後、本サンプルの一定分量である５ｍｌが取り出され、最終濃度が２％（ｖ／ｖ）となるようにＴＷＥＥＮ ２０が添加された。このサンプルは１００℃で２分間加熱された後、冷却された。煮沸後のサンプルの一定分量である８０μｌが被覆マイクロタイタープレートの各ウェルに添加された。
【０１０４】
０．１４７ＭのＮａＣｌを含む０．０１Ｍのリン酸バッファ（ｐＨ７．４）中での濃度が１２５ｎｇ／ｍｌである２０μｌの抗サルモネラ菌抗体複合体が各ウェルに添加された（図２ａ（２），図２ｂ（２））。ウェルあたりの抗体の最終濃度は２５ｎｇ／ｍｌであった。競合サンプルＬＰＳ／コアオリゴ糖および抗体は、被覆ウェル中で３７℃で６０分間インキュベートされた。インキュベートに続き、プレートが洗浄バッファで３回洗浄され、検出の前に完全に乾燥させられた（図２ａ（３）、図２ｂ（３））。
【０１０５】
抗サルモネラ菌抗体がアクリジニウムエステルを用いて直接標識された場合、プレートは照度計中に配置された．３０μｌの誘因溶液Ａおよび６０μｌの誘因溶液Ｂがマイクロタイタープレートの各ウェルに添加されることにより、結合したアクリジニウムエステルから光出力が開始された（図２ａ（４））。照度計の設定は以下のとおりであった。
【０１０６】
遅延注入Ｐ（溶液Ａ用） − １．６秒
測定時間間隔１ − ０．０秒
遅延注入Ｍ（溶液Ｂ用） − ０．０秒
測定時間間隔２ − １．０秒
【０１０７】
誘因溶液Ａは、６３μｌの７０％（ｗ／ｗ）硝酸（ＨＮＯ３）と１６５μｌの３０％（ｖ／ｖ）Ｈ２Ｏ２とを全容積が１０ｍｌの蒸留水中に含んでいた。誘因溶液Ｂは、０．１ｇのＮａＯＨと７５ｍｇのＣＴＡＣとを全容積が１０ｍｌの蒸留水中に含んでいた。
【０１０８】
ヤギの抗マウスＩｇＧ２ｂアクリジニウム複合体の添加（抗サルモネラ菌モノクローナル抗体が結合しない場合）
抗サルモネラ菌抗体が標識されない場合、第２の結合分子であるヤギの抗マウスＩｇＧ２ｂ複合体が使用される。カラム処理後のＩｇＧ２ｂが３％（ｗ／ｖ）の無脂肪ミルク粉末および０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ ２０を含む希釈剤中に１：１００で希釈され、１００μｌのこの溶液がプレートの各ウェルに添加された（図２ｂ（４））。３７℃で６０分間のインキュベート後、プレートは洗浄バッファ中で４回洗浄され、乾燥され、上述のように読み取られた（図２ｂ（５））。
【実施例】
【０１０９】
（実施例１）サルモネラ菌を成長させるための培地の調製
図３は、０〜１６ｇ／Ｌの濃度のテトラチオン酸ナトリウムがサルモネラ菌アバディーン種、フレキシナ赤痢菌、ブドウ球菌アウレウス種および病原性大腸菌の成長に及ぼす影響を示す。０．１ｍｌの接種材料（１０３細胞／ｍｌ）が、０〜１６ｇ／Ｌのテトラチオン酸ナトリウムを含むトリプシン大豆培養液の入った１００ｍｌ三角フラスコに添加された。フラスコは３７℃で１８時間培養された。この後、Ａ６２０の値が測定された。各値は、３回の独立した実験の平均±標準偏差を表す。＊はｐ＜０．０５を示す。濃度が２〜１６ｇ／Ｌの場合、赤痢菌、ブドウ球菌および病原性大腸菌の成長が抑制された。一方、サルモネラ菌の成長は影響を受けないかまたは促進された。
【０１１０】
【表１】
【０１１１】
テトラチオン酸塩は、４ｇ／Ｌより高い濃度で病原性大腸菌の成長を阻害するだけでなく、８ｇ／Ｌの濃度ではサルモネラ菌の成長を明らかに増長する効果を有する。Ａ６２０は濁りを測定するため、この値が高くなるほど、細菌の成長が速いということに留意する。約１６ｇ／Ｌより高い濃度では、サルモネラ菌の成長は阻害される。
【０１１２】
図４は、ブリリアントグリーンに対する細菌の生育反応を示す。０．１ｍｌの接種材料（１０３細胞／ｍｌ）が、０．０５ｇ〜５ｇ／Ｌのブリリアントグリーンを含むトリプシン大豆培養液の入った１００ｍｌ三角フラスコに添加された。フラスコは３７℃で１８時間培養された。この後、Ａ６２０の値が測定された。各値は、３回の独立した実験の平均±標準偏差を表す。＊はｐ＜０．０５を示す。”はｐ＜０．０１を示す。
【０１１３】
【表２】
【０１１４】
比濁法による細菌数の尺度としてＡ６２０を採用した。＊ブリリアントグリーンの吸光度による高い吸光度値を示す。これらの濃度において、ブリリアントグリーン溶液に対して分光計をブランクにすることはできなかった。ブリリアントグリーンの濃度が０．３ｍｇ／Ｌ以上の場合、サルモネラ菌および病原性大腸菌の両方の成長が抑制された。しかし、０．１５ｍｇ／Ｌの濃度では、ブリリアントグリーンは病原性大腸菌に対しては阻害作用を示したが、サルモネラ菌に対しては示さなかった。
【０１１５】
（実施例２）赤痢菌を成長させるための培地の調製
図５は、クエン酸第二鉄アンモニウムに対する細菌の生育反応を示す。０．１ｍｌの接種材料（１０３細胞／ｍｌ）が、０．２５〜１．５ｇ／Ｌのクエン酸第二鉄アンモニウムを含むトリプシン大豆培養液の入った１００ｍｌ三角フラスコに添加された。フラスコは３７℃で１８時間インキュベートされた。この後、Ａ６２０が測定された。各値は、３回の独立した実験の平均±標準偏差を表す。＊はｐ＜０．０５を示す。クエン酸第二鉄アンモニウムの濃度が０．２５ｇ／Ｌ以上の場合、ブドウ球菌および病原性大腸菌の両方の成長が抑制される。
【０１１６】
図６は、クエン酸ナトリウムに対する細菌の生育反応を示す。０．１ｍｌの接種材料（１０３細胞／ｍｌ）が、５〜２５ｇ／Ｌのクエン酸ナトリウムを含むトリプシン大豆培養液の入った１００ｍｌ三角フラスコに添加された。フラスコは３７℃で１８時間培養された。この後、Ａ６２０が測定された。各値は、３回の独立した実験の平均±標準偏差を表す。＊はｐ＜０．０５を示す。クエン酸ナトリウムの濃度が５ｇ／Ｌ以上の場合、ブドウ球菌および病原性大腸菌の両方の成長が抑制された。クエン酸ナトリウムの濃度が１５ｇ／Ｌの場合、赤痢菌の生育反応はブドウ球菌および病原性大腸菌の生育反応に比べ、著しく増長された。
【０１１７】
（実施例３）ペプトン、トリプシン大豆培養液および改良トリプシン大豆液体培地中における異なる細菌の世代試験
赤痢菌の３つの株とサルモネラ菌アバディーン種、病原性大腸菌およびブドウ球菌アウレウス種を含む他の細菌とを、従来の液体培地培養液中で培養することにより、世代時間が調べられた。ペプトン（図７）、トリプシン大豆液体培地（ＴＳＢ）（図８）、改良トリプシン大豆培養液（ｍＴＳＢ）（図９）またはグラム陰性液体培地（図１０）のいずれかを含む１００ｍｌ三角フラスコに、０．１ｍｌの接種材料（１０３細胞／ｍｌ）が添加された。
【０１１８】
各フラスコは３７０Ｃで１８時間培養された。この後、生存細胞の数が栄養寒天培地上でドロッププレート法により決定された。かっこ内の値は世代時間である。各値は３回の独立した実験の平均±標準偏差を表す。＊はｐ＜０．０５を表す。倍増時間がペプトン、トリプシン大豆および改良トリプシン大豆培養液中で調べられた。グラム陰性液体培地中で培養された場合、フレキシナ赤痢菌、サルモネラ菌アバディーン種、病原性大腸菌およびブドウ球菌アウレウス種の世代時間は、それぞれ３６、５７、４１および４４分であった。
【０１１９】
すべての細菌の増殖速度がＴＳＢ中では増大した。その結果、赤痢菌が選択的に成長できるようにするために、従来の他の選択剤とともに、ＴＳＢが基礎成長培地として単独でまたは組み合わせて使用された。フレキシナ赤痢菌、サルモネラ菌アバディーン種、病原性大腸菌およびブドウ球菌アウレウス種の倍増時間は、ＴＳＢ中では４８、４６、２８および３３分であった。フレキシナ赤痢菌およびサルモネラ菌アバディーン種はｍＴＳＢ中では有意に速く成長した（ｐ＜０．０１）。一方、この基礎培養液中では、病原性大腸菌およびブドウ球菌アウレウス種は増殖するのにより長い時間がかかった。改良ＴＳＢ中で培養した場合、病原性大腸菌の増殖速度は６８分まで遅らせることができた。改良ＴＳＢ中では、フレキシナ赤痢菌の世代時間は４６分間にまで短縮することができた。
【０１２０】
（実施例４）リステリア菌を成長させるための培地の調製
塩化リチウムとナリジクス酸との組み合わせを含むリステリア菌の成長培地が調整された。０．１ｍｌの接種材料（１０３細胞／ｍｌ）が、以下のレシピの培地を含む１００ｍｌ三角フラスコに添加された：３．３％のＴＳＢＹＥ、０．５％酵母抽出物を含むトリプシン大豆培養液、２ｇ／ＬのＬｉＣｌ、２ｍｇ／Ｌのナリジクス酸、および２５０ｍｇ／Ｌのクエン酸第二鉄アンモニウム。フラスコは３７℃で２０時間培養された。この後、Ａ６２０の値が測定された（図１１）。各値は、３回の独立した実験の平均±標準偏差を表す。リステリア菌モノサイトゲネス種およびリステリア菌イノキュア種は、本培地中で効率的に成長できた。病原性大腸菌、アシドフィルス菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）およびブタ丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）の成長はすべて著しく阻害された。
【０１２１】
（実施例５）サルモネラ菌、赤痢菌またはリステリア菌を選択的に成長させるための培地の調製
上述のデータを利用して、以下のレシピに従って選択培地が調整された。
【０１２２】
サルモネラ菌１
・２％のペプトン
・０．１５ｍｇ／Ｌのブリリアントグリーン
・４〜８ｇ／Ｌのテトラチオン酸塩（すべての型）
【０１２３】
サルモネラ菌２
・３．３％（ｗ／ｖ）のｍＴＳＢ
・０．１５ｍｇ／ＬのＢＧ
・１ｇ／Ｌのクエン酸第二鉄アンモニウム
【０１２４】
赤痢菌１３．３％のｍＴＳＢ
・０．１ｍｇ／Ｌのブリリアントグリーン
・２５０ｍｇ／Ｌのクエン酸第二鉄アンモニウム
・１５ｇ／Ｌのトリクエン酸ナトリウム
【０１２５】
リステリア菌１ＴＳＢＹＥ−０．５％酵母抽出物を含有する３．３％トリプシン大豆培養液
・２ｇ／Ｌの塩化リチウム
・２ｍｇ／Ｌのナリジクス酸
・２５０ｍｇ／Ｌのクエン酸第二鉄アンモニウム
【０１２６】
（実施例６）免疫アッセイに使用するためにアクリジニウムエステルと結合させるための抗体および抗体フラグメントの調整
腹水からプロテインＡのクロマトグラフィーを用いて純粋なＩｇＧを調整し、次にＩｇＧを消化することによってＦａｂフラグメントを生じさせ、そのフラグメントまたは抗体全体をエステルに結合させ、続いて精製を行う任意のステップによって、抗体の改善された調製を行うことができる。代わりに、抗体の他のアイソタイプまたはアイソフォームを精製されていない状態で使用することもできる。
【０１２７】
プロテインＡ／Ｇの分離
（ｉ）バッファおよび溶液
・ＰＢＳ：０．１５ＭのＮａＣｌを含む０．１Ｍのリン酸バッファ（ｐＨ８）
・０．１Ｍのクエン酸酸性バッファ（ｐＨ６およびｐＨ４．５）：２９ｇの乾燥したクエン酸ナトリウムを８００ｍｌの蒸留水に溶解させる。それぞれｐＨが６および４．５となるまで１Ｍのクエン酸溶液（２１０ｇ／Ｌ）を添加する。１Ｌにメスアップする。
・０．１５ＭのＮａＣｌを含有する０．１Ｍの酢酸バッファ（ｐＨ３）：８００ｍｌの蒸留水に１Ｍの酢酸１００ｍｌと１．５ＭのＮａＣｌ１００ｍｌとを添加する。
３ＭのＮａＣｌを含有する１．５Ｍのグリシンバッファ（ｐＨ８．９）：１１２ｇのグリシンおよび１７４ｇのＮａＣｌを７００ｍｌの蒸留水に溶解させる。５Ｍの水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨを８．９に調整し、蒸留水を用いて１Ｌにメスアップする。
【０１２８】
（ｉｉ）手順
０．１Ｍのリン酸バッファ（ｐＨ８）中で３０分間、１．５ｇのプロテインＡ−セファロース（ＣＬ−４Ｂ、ファルマシア社）（プロテインＧも使用されてもよい）が膨張できるようにする（１．５ｇのビーズから５ｍｌのゲル得られる）。２０×２ｃｍのカラムをこのゲルで充填し、開始バッファでリンスする。開始バッファに対して透析した後、４０％（ｖ／ｖ）にて飽和状態の硫酸アンモニウムにより前もって脱脂しておいた腹水を１ｍｌ、カラムにアプライする。腹水が使用される場合、腹水の脱脂は１０００００ｇで４５分間遠心分離することにより行われる。形成されたあらゆるペレット、つまり浮かんだ「脂質」が捨てられる。Ａ２８０が０．０５０未満となるまで０．１Ｍのリン酸バッファ（ｐＨ８）を用いてカラムを洗浄する。クエン酸塩バッファ（ｐＨ６）を添加し、Ａ２８０が０．０５０未満となるまで洗浄する。引き続いてｐＨ４．５とｐＨ３のバッファを用いることにより、他の免疫グロブリンを同様にして溶出させる。０．０２％のアジ化ナトリウムを含むリン酸バッファ（ｐＨ８）を用いて中和させ、プロテインＡ−セファロースをこのバッファ中で保存する。溶出後、１Ｍのリン酸バッファ（ｐＨ８）を数滴用いて抗体を中和させ、ＰＢＳに対して透析させる。
【０１２９】
（ｉｉｉ）Ｆａｂフラグメントの調整
酵素消化が完全に進行することはない。そのため、パパインがＩｇＧに作用した場合、ＦａｂフラグメントおよびＦｃフラグメントに加え、１０％の未消化ＩｇＧが生じる。ＦａｂフラグメントとＦｃフラグメントは同一の分子量を有するため、分離するのが困難である。それらの精製を容易にするために、プロテインＡが使用される。最初のステップで抗体がパパインを用いて処理される。次に、その混合物がＩｇＧおよびＦａｂを分離するためにプロテインＡに通される。次に、ＳｅｐｈａｄｅｘまたはプロテインＡ−セファロースを用いたろ過によって、Ｆａｂフラグメントが未消化のＩｇＧから分離される。
【０１３０】
（材料）
・クロマトグラフィーカラム（２．５ｃｍ×８０ｃｍ）
・パパイン：ベーリンガー社製
・Ｌ−塩酸システイン：メルク社製
・ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）：メルク社製
・ヨードアセトアミド：メルク社製
【０１３１】
（バッファおよび溶液）
・リン酸塩−緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）
・０．１Ｍのリン酸バッファ（ｐＨ７．４）
・市販の原液から調整された１ｍｇ／ｍｌのパパイン溶液
・０．２ＭのＬ−システイン：３５ｍｇ／ｍｌの０．１Ｍリン酸バッファ（ｐＨ７．４）
・０．１ＭのＥＤＴＡ：３．６ｇのＥＤＴＡを１００ｍｌの０．２ＭのＮａＯＨ溶液に溶解させる。ＥＤＴＡはｐＨが約８の場合にのみ著しく溶解する。そのため、溶液のｐＨを調整してＥＤＴＡを完全に溶解させるために、１ＭのＮａＯＨを数滴添加する必要があるかもしれない。
・０．４Ｍのヨードアセトアミド：０．１Ｍのリン酸バッファ（ｐＨ７．４）中に７４ｍｇ／ｍｌの濃度
【０１３２】
（手順）
４０％（ｖ／ｖ）の飽和硫酸アンモニウム溶液とともに沈殿させることにより、免疫グロブリン画分が抗血清から調整された。免疫グロブリンはｐＨ７．４の０．１Ｍリン酸バッファに対して透析された。おおよそのタンパク濃度が決定された（ＩｇＧの１ｍｇ／ｍｌ溶液のＡ２８０の値は１．４である）。
【０１３３】
ＩｇＧの濃度を３０ｍｇ／ｍｌに調整し、２０ｍｇ／ｍｌのタンパク濃度を得るために必要な最終的な体積（Ｖ）が計算された。親和性の観点から、最終濃度が２．５ｍｇ／ｍｌの精製された抗体が使用された。最終的な体積（Ｖ）の１／２０量の０．０４ＭのＥＤＴＡが添加された（最終濃度：０．００２Ｍ）。次に、最終的な体積（Ｖ）の１／２０量の０．２ＭのＬ−システイン溶液が添加された（最終濃度：０．０１Ｍ）。１００ｍｇのグロブリンあたり１ｍｇのパパインとなるように、１ｍｇ／ｍｌのパパイン溶液が添加された。０．１Ｍのリン酸バッファ（ｐＨ７．４）を用いて体積がＶｍｌに調整された。反応は３７℃で２時間行われた。最終的な体積（Ｖ）の１／１０量の０．４Ｍのヨードアセトアミド溶液が添加された（最終濃度：０．０４Ｍ）。この状態で３０分間放置された。次に調整液がＰＢＳに対して４℃で一晩透析された。
【０１３４】
プロテインＡクロマトグラフィーにより、ＧｌｃＮＡｃ−Ｇｌｃ−Ｇａｌエピトープ（図１２）に結合するＩｇＧ抗体およびＦａｂフラグメントが単離された。Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００カラム（２．５×８０ｃｍ）上で混合物が分画され、ＰＢＳで平衡化された。第１のピークがＩｇＧに対応し、第２のピークがＦａｂフラグメントに対応した。Ｆａｂピークは５ｍｇ／ｍｌに濃縮された。
【０１３５】
（実施例７）抗体または抗体フラグメントとアクリジニウムエステルとの結合
ａ）調整
ｉ）（４−（２−スクシンイミドイルオキシカルボニルエチル）フェニル−１０−ジメチルアクリジニウム−９−カルボキシレートフルオロ硫酸などのアクリジニウムエステルが、綺麗な乾燥したホウケイ酸の瓶の中で秤量された。乾燥したジメチルホルムアミドが添加された（体積は使用可能なアクリジニウムエステルの量による）。また、その溶液が通常１瓶あたり５ｍｇの量で瓶の中に等分に分注された。
ｉｉ）０．５ｍｇのＩｇＧ／ｍｌの濃度で、抗体が０．２Ｍのリン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ８．０）に溶解される。
ｉｉｉ）５ｍｇのアクリジニウムエステル溶液を２００ｍｌの抗体溶液に加え、十分に攪拌する。
ｉｖ）室温で１５分間インキュベートする。次に、１０％（ｗ／ｖ）のリシン一塩酸塩を１００ｍｌ添加することにより、反応を停止させる。続いて室温にて暗所で５分間さらにインキュベートする。
ｖ）後述の（ｂ）に従って精製する。
【０１３６】
ｂ）複合体の精製
（ｉ）複合体を精製するためにゲルろ過カラムが使用されてもよい。
０．１４７ＭのＮａＣｌおよび０．５％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン（シグマ社）を含む０．１Ｍのリン酸バッファ（ｐＨ７．４）を用いて、１．６×１００ｃｍのＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２００カラム（ファルマシア社）が平衡化される。１．５ｍｌ以下の複合体がカラム上にアプライされ、１８時間かけて流速９ｍｌ／ｈで分離される。流出物がＡ２８０にてモニタされ、４５〜５５キロダルトンに対応するピークがＦａｂフラグメントとして集められ、１４０〜１７０キロダルトンに対応するピークが完全な抗体として集められる。この完全な抗体が複合体であり、複合体は使用前に使用される濃度に希釈される必要がある。
【０１３７】
（ｉｉ）好ましい代替的な手順では、ＦＰＬＣが使用される。複合体はＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ＨＲ １０／３０カラム（ファルマシア社）を用いて精製される。０．００７ｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液５０ｍｌが複合体に添加される（複合体のＢＳＡ濃度が溶出バッファのＢＳＡ濃度にまで高められる）。
【０１３８】
サンプルをアプライする前に、カラムの容積の２倍量（５０ｍｌ）の溶出バッファでカラムが平衡化される。次に、複合体溶液を１００００ｇにて１０分間遠心することにより、あらゆる粒子状物質が除去される。そしてＦＰＬＣカラムにアプライされる。０．５ｍｌ／分の流速で溶出バッファおよび保存バッファ中で、抗体がカラムから溶出される。最初の５ｍｌがカラムを通過した後、０．５ｍｌの画分が収集される。
【０１３９】
紫外線（ＵＶ）モニタを使用することによって、抗体の存在が検出される。抗体ピークをカバーする画分が収集され、発光活性が解析される（通常は画分１６〜２１である）。
【０１４０】
（発光活性のチェック）
抗体画分が生理食塩水と各画分のアッセイ用プレートのウェルにスポットされたサンプル５μｌにより１：５００で希釈される。次にその画分の発光活性が、活性化試薬１および２との反応によってテストされる。最初に１５μｌの活性化試薬１がサンプルウェルに添加され、続いて３０μｌの活性化試薬２が添加される。これは、照度計中における自動注入により通常行われる。次に、問題としているウェルから発せられる光の放出を計測するために、照度計が動かされる。その結果が、各サンプルとも複数回繰り返して記録される。次に、高強度の発光活性を有するサンプルを、微生物アッセイ、この例ではサルモネラ菌アッセイにおいて確認することができる。
【０１４１】
（実施例８）ＡＭＰＰＤとアルカリホスファターゼが結合した抗サルモネラ菌抗体の使用
十分な発光シグナルを生成するために、免疫アッセイで使用される酵素アルカリホスファターゼおよび基質ＡＭＰＰＤに抗体を結合させてもよい。ＡＭＰＰＤは、３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３”−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキシエタン；３−（４−メトキシスピロ（１，２−ジオキシエタン−３，２’−トリシクロ（３．３．１．１（３，７））デカン）−４−ｙｌ）フェニルリン酸塩である。この基質用の希釈剤は、０．９ｇのＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウム臭化物）、１．９ｍｌのＡＭＰ（２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール）、１４．５ｍｇの塩化マグネシウム６水和物を、１ｍＭ、ｐＨ９．６となるように１００ｍｌの蒸留水で調整した水溶液である。
【０１４２】
（試薬）
洗浄バッファ
・０．２ＭのＴｒｉｓ（２４．２２８ｇ／Ｌ）、０．２ＭのＮａＣｌ（１１．６８８ｇ／Ｌ）および０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ（０．５ｍｌ／Ｌ）
・２４．２２８ｇのＴｒｉｓと１１．６８８ｇのＮａＣｌを９００ｍｌの蒸留水に溶解させる。０．５ｍｌのＴｗｅｅｎ ２０を添加する。ＨＣｌを用いてｐＨを７．４に調整し、１Ｌにメスアップし、室温で保存する。
・１０×洗浄バッファ濃縮液（防腐剤アジ化ナトリウムを含む）
・２ＭのＴｒｉｓ（２４．２２８ｇ／１００ｍｌ）、２ＭのＮａＣｌ（１１．６８８ｇ／１００ｍｌ）および０．５％のＴｗｅｅｎ （０．５ｍｌ／１００ｍｌ）：２４．２２８ｇのＴｒｉｓおよび１１．６８８ｇのＮａＣｌを８０ｍｌの蒸留水に溶解させる。０．５ｍｌのＴｗｅｅｎ ２０を添加し、濃縮ＨＣｌを用いてｐＨを７．４に調整する。蒸留水で１００ｍｌにメスアップし、室温で保存する。洗浄バッファに戻すためには、１００ｍｌの濃縮液を９００ｍｌの蒸留水に添加し、室温で保存する。
【０１４３】
溶出用バッファおよび保存用バッファ
・０．１５ＭのＮａＣｌ、０．１％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．０５％のＮａＮ３を含む０．１Ｍのリン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ６．３）
・０．１ＭのＮａＨ２ＰＯ４と０．１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡを含む０．１５ＭのＮａＣｌとの溶液（Ａ）と、０．１ＭのＮａ２ＨＰＯ４と０．１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡを含む０．１５ＭのＮａＣｌとの溶液（Ｂ）を作る。１００ｍｌのＡを５０ｍｌのＢに添加する。０．０５％のＮａＮ３を添加し、０．２２ｍＭのフィルタに通し、４℃で保存する。
【０１４４】
アッセイ用バッファ
・０．１％（ｗ／ｖ）のＮａＮ３と０．２５％（ｗ／ｖ）のＢＳＡとを含む０．０１ＭのＮａＨ２ＰＯ４（１．２ｇ／Ｌ）および０．１５ＭのＮａＣｌ（８．７５ｇ／Ｌ）の溶液
・１．２ｇのＮａＨ２ＰＯ４と８．７５ｇのＮａＣｌとを９００ｍｌの蒸留水に溶解させる。１．０ｇのＮａＮ３と２．５ｇのＢＳＡとを添加する。完全に溶解させ、１．０ＭのＮａＯＨを用いてｐＨを７．４に調整する。蒸留水を用いて１０００ｍｌにメスアップする。０．２２μＭのフィルタに通し、４℃で保存する。
【０１４５】
洗浄剤溶液
２０％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ溶液：５ｇのＳＤＳを２５ｍｌの蒸留水中に溶解させる。室温で保存する。
【０１４６】
成長促進剤
８ｇのテトラチオン酸ナトリウムと０．１５ｍｇのブリリアントグリーンとを１Ｌの滅菌ペプトン液体培地に添加する。均一に混合されるまで穏やかに攪拌する。
【０１４７】
活性化試薬１（１Ｌ）
６．３ｍｌの７０％硝酸、１６．５ｍｌの３０％過酸化水素、および９７７ｍｌの蒸留水。
【０１４８】
活性化試薬２（１Ｌ）
１０．０ｇのＮａＯＨ、７．５ｍｌのセチルトリメチルアンモニウムクロライド、および９８３ｍｌの蒸留水。
【０１４９】
（サルモネラ菌結合用の試験画分）
アッセイ用プレートのウェルは、標準濃度の細菌によって３７℃で１時間被覆される。これらの標準濃度は、１０６、１０５、５×１０４、２．５×１０４、１０４および５×１０３ならびに１０６の病原性大腸菌を含むブランクのウェルである。試験される画分は、アッセイバッファ中で１：１００に希釈され、５０ｍｌが各ウェルに添加され、３７℃で２０分間インキュベートされる。次に各ウェルが照度計上で上述のように計測される。アッセイにおいて高い結合を示した画分がプールされる。プールされた複合体に対する最適な希釈は、通常１：１００〜１：１０００である。
【０１５０】
（直接結合サルモネラ菌アッセイにおける洗浄剤の影響）
洗浄剤であるドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いて、新しい黒白プレート（Ｗａｌｌａｃ社）がチューブ照度計（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ ＬＢ９５０９）によって読み取られる。
【０１５１】
【表３】
【０１５２】
【表４】
【０１５３】
【表５】
【０１５４】
白色プレート（Ｗａｌｌａｃ社）、ルーシー１プレート照度計を用いた読み取り（複合体を１：１００で希釈）
【０１５５】
【表６】
【０１５６】
【表７】
【０１５７】
黒白プレートを用いた直接結合サルモネラ菌アッセイにおける様々な濃度のＳＤＳの影響（複合体を１：１００で希釈）
【０１５８】
【表８】
【０１５９】
【表９】
【０１６０】
黒白プレートを用いた競合結合サルモネラ菌アッセイにおける様々な濃度のＴＷＥＥＮ ２０の影響（複合体を１：１００で希釈）
【０１６１】
【表１０】
【０１６２】
１：１００に希釈した抗２ｂ複合体を用いた抗サルモネラ菌モノクローナル抗体のインキュベート時間の影響
最適なインキュベート時間を決定するために、サルモネラ菌またはリステリア菌のいずれかとともにモノクローナル抗体（１：１００に希釈）がインキュベートされた。
【０１６３】
【表１１】
【０１６４】
１：２００に希釈した抗２ｂ複合体を用いた抗サルモネラ菌モノクローナル抗体のインキュベート時間の影響
最適なインキュベート時間を決定するために、サルモネラ菌またはリステリア菌のいずれかとともにモノクローナル抗体（１：２００に希釈）がインキュベートされた。
【０１６５】
【表１２】
【０１６６】
食品培養物に対するＳＤＳ濃度の影響
【０１６７】
【表１３】
【０１６８】
コアオリゴ糖の放出および検出における異なる洗浄剤の影響
【０１６９】
【表１４】
【０１７０】
ＳＤＳは、食品サンプルを用いたサルモネラ菌ＬＰＳのモノマーへの分解において最も信頼性および再現性のある結果をもたらす。しかし、競合アッセイではこの目的にはＴＷＥＥＮのみが使用可能である。それは、タンパク質−洗浄剤が他の洗浄剤と相互作用するからである。
【０１７１】
競合アッセイのサルモネラ菌の検出における様々な抗サルモネラ菌抗体の濃度の影響
【０１７２】
【表１５】
【０１７３】
（参考文献）
Ｂｕｚｂｙ，Ｊ．Ｃ．およびＲｏｂｅｒｔｓ，Ｔ．（１９９７年）“Ｅｃｏｎｏｍｉｃ ｃｏｓｔｓ ａｎｄ ｔｒａｄｅ ｉｍｐａｃｔｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｆｏｏｄｂｏｒｎｅ ｉｌｌｎｅｓｓ．”Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｔａｔ．Ｑ．第５０巻（第１〜２号）：第５７〜６６頁。
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Ｒａｅｔｚ，Ｃ．Ｒ．Ｈ．（１９９６年）“Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ：ａ ｒｅｍａｒｋａｂｌｅ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ｍａｃｒｏａｍｐｈｉｐｈｉｌｅｓ， ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ．”第１巻（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，Ｆ．編集）第２版、第１０３５〜１０６３頁、ＡＳＭ出版（ワシントンＤＣ）。
Ｒｅｉｓｓｂｒｏｄｔ，Ｒ．，Ｒｉｅｎａｅｃｋｅｒ，Ｉ．，Ｒｏｍａｎｏｖａ，Ｊ．Ｍ．，Ｆｒｅｅｓｔｏｎｅ，Ｐ．Ｐ．Ｅ．，Ｈａｉｇｈ，Ｒ．Ｄ．，Ｌｙｔｅ，Ｍ．，Ｔｓｃｈａｐｅ，Ｈ．およびＷｉｌｌｉａｍｓ，Ｐ．Ｈ．（２００２年）“Ｒｅｓｕｓｃｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ａｎｄ ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｖｉａｂｌｅ ｂｕｔ ｎｏｎｃｕｌｔｕｒａｂｌｅ ｓｔａｔｅ ｂｙ ｈｅａｔ ｓｔａｂｌｅ ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｕｔｏｉｎｄｕｃｅｒ．”Ａｐｐ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．第６８巻（第１０号）：第４７８８〜４７９４頁。
Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，Ｐ．Ｊ．，Ｄｒｕｇｇａｎ，Ｐ．およびＮｅｂｅ−ｖｏｎ Ｃａｒｏｎ，Ｇ．（２０００年）“Ｓｔｒｅｓｓｅｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ａｒｅ ｅｘｐｏｓｅｄ ｔｏ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ｆｒｏｍ ｔｗｏ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｏｕｒｃｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｉｎ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ．”Ｉｎｔ．Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．第６０巻：第２６９〜２８５頁。
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物、特に試験サンプルにおける病原微生物に由来する特定物質の検出に使用されるアッセイ方法に関する。本発明はさらに、そのような微生物を素早く成長させることにより、現在よりも著しく早く検出することを可能にするための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品は本質的に生物に由来するものなので、様々な汚染微生物の成長を手助けすることができる。米国では、推定年間７６００万件の食中毒が発生し、医療に６５億ドル〜３４９億ドルか費やされ、生産性を喪失している（ＢｕｚｂｙおよびＲｏｂｅｒｔｓ（１９９７年）、Ｍｅａｄら（１９９９年））。欧州では、サルモネラ菌に対する経済コストおよび健康管理コストは、６億２０００万〜３０億ユーロであると推定されている（Ｄａｖｉｄ Ｂｙｒｎｅ、 Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｆｏｒ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｃｏｎｓｕｍｅｒ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ、２０００年）。
【０００３】
サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、カンピロバクター菌（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、病原性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｏ１５７：Ｈ７および赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）は、食中毒の大部分の事例に関与している。例えば、サルモネラ菌およびリステリア菌は単独で、食品に関連した死亡のうちそれぞれ３１％および２８％に関与している（Ｍｅａｄら、１９９９年）。また、日本ではサルモネラ中毒が１９８１〜１９９５年に発生した全食中毒の原因の１４％超を占める（Ｌｅｅら、２００１年）。実際、入院が必要な食中毒の症例のうち６０％もの原因因子が細菌であると推定されている。結果として、衰弱の最大の原因の１つは、食品の微生物汚染に対する効果的でなくもたもたした検査により生じる遅延である。現在の試験方法では、製造会社は微生物培養の結果が出るまで３〜７日間待たなければならない。そのような遅延に起因するコストは甚大である。つまり、供給プロセスの効率を低下させ、在庫を止め、腐敗を増加させる。
【０００４】
不適切または不十分な試験のコストは、少なくとも大きな代償を支払う必要性が生じうる。たとえば、１９９９年にそのような試験によってサラ・リー社は、Ｂｉｌ Ｍａｒ食品課における３５００万ポンドのホットドッグおよびデリ・ミートのリコールに関連して、それらの食品がリステリア菌の発生と関連づけられた後に、推定７６００万ドルの代償を支払った。ザ・スコッツマン新聞社によると、２００６年にサルモネラ菌がチョコレートに雑菌混入したことにより、キャドベリー・シュウェップス社はリコールの代償や広告、収益の喪失、その後の製造作業の改善に対して、推定２０００万ユーロを支払った。つい最近の２００９年には、２００８年に推定２５００万ドルを売り上げた米国のピーナッツ社は、米国でピーナッツにおける主なサルモネラ菌の発生源であると認定された後に、破産申請をした。
【０００５】
したがって、食品、飼料および環境サンプル中で、サルモネラ菌、赤痢菌およびリステリア菌などの病原微生物の存在を検出することは、経済的に非常に重要である。しかし、そのような微生物を検出するための従来の培養方法は、骨が折れるし時間がかかっていた。そのような従来の方法は、５０年以上も使用されてきた標準プロセスに依存することが多かった。
【０００６】
加えて、病原微生物は「生存可能だが培養不可能な状態（ＶＮＣ）」または「すぐに培養することはできない状態（ＮＩＣ）」として知られる非常にストレスのかかった環境下で長期間生存することができる。そのように非常にストレスのかかった微生物は非常に弱い代謝活性しか示さない。代謝活性は検出限界に満たないことが多い。そのような微生物は非選択プレート培地上でコロニーを形成する能力または非選択液体培地中で増殖する能力を失っている（Ｒｅｉｓｓｂｒｏｄｔら、２００２年）。しかし、そのような培養不能なコロニーは、食品や動物の飼料中に存在した場合、体内に取り込まれれば依然として病気を引き起こしうる。これは検出に関して特殊な問題を提起する。それは、そのようなストレスを受けた微生物は検出可能なほど十分には復活しない可能性があるからである。
【０００７】
その結果、さらなる培養、プレートへの塗布（ｐｌａｔｉｎｇ）および検出に先立ち、そのような細胞を復活させる目的で、追加的な細胞培養ステップがあらゆる診断に含められることが多い。したがって非選択培地中であらかじめ濃縮しておくことは従来方法の必須要素である（Ｓｔｅｐｈｅｎｓら、２０００年）。例えば、サルモネラ菌の検出には５日間も塗布しなければならいいくつかの培養段階を要する。つまり、「病気の」細菌を再生させるために濃縮ステップが解析に含められることが多い。また、検出はそのような濃縮培養液および培養物の特性によって制限されることが多い。
【０００８】
したがって、細菌の外来集団に棲み家を提供する可能性のある臨床材料、食品およびその他の製品から微生物を再生させる目的で、３つの一般的なタイプの培地が入手可能である。つまり、（１）初期の単離用の非選択培地、（２）濃縮培養液、および（３）選択用寒天培地および／または識別用寒天培地、である。
【０００９】
そのような培地の配合は通常複雑であり、特定の細菌種の成長を阻害する、つまり選択的な成分を含むと同時に、試料中に存在する微生物の予備的確認を行う、つまり識別する際に重要な生化学的特性を検出する成分も含む。合理的な選択をするためには、微生物学者は各配合の組成物、用途および含有される各化合物の相対濃度を知らなければならない。あいにく入手可能な培地は過度に複雑であることが多く、様々な成分の影響および量は通常ほとんど理解されていない。使用される培地は何１０年も使用されてきた培地と同じものであることが多い。また、培地は本来全く異なる生物用に開発されたものであるかもしれない。たとえば、そのような非効率性ゆえ、サルモネラ菌の現在の検出率は、１５日以内では５０％未満であり、２８日以内では９０％未満である（Ｋｉｎｇ、２００９年）。
【００１０】
したがって、明確で、ほとんどまたは全く効果がないか、悪影響を及ぼしさえする余計な含有物が含まれておらず、かつストレスを受けた微生物でさえ成長および迅速な培養が可能な最適な培地が求められている。そのような培地は、二次的／追加的な培養ステップの必要性を否定する必要がある。また、個体数が非常に少なく不均一な微生物環境に存在する病原微生物の単離および／または同定を可能とする、新たなより良い検出方法も必要とされている。さらに、そのような任意の方法は、化粧品、冷凍食品、凍結乾燥製剤、および液体の製品を含む食品、尿や排泄物などの臨床サンプル、または血液サンプルおよび環境サンプルなどの多様な供給源に由来する微生物の検出に、等しく適用できる必要がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｂｕｚｂｙ，Ｊ．Ｃ．およびＲｏｂｅｒｔｓ，Ｔ．（１９９７年）“Ｅｃｏｎｏｍｉｃ ｃｏｓｔｓ ａｎｄ ｔｒａｄｅ ｉｍｐａｃｔｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｆｏｏｄｂｏｒｎｅ ｉｌｌｎｅｓｓ．”Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｔａｔ．Ｑ．第５０巻（第１〜２号）：第５７〜６６頁
【非特許文献２】Ｄａｖｉｄ Ｂｙｒｎｅ、 Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｆｏｒ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｃｏｎｓｕｍｅｒ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ、２０００年
【非特許文献３】Ｍｅａｄｅ，Ｐ．Ｓ．，Ｓｌｕｔｓｋｅｒ，Ｌ．，Ｄｉｅｔｚ，Ｖ．，ＭｃＣａｉｇ，Ｌ．Ｆ．，Ｂｒｅｓｅｅ，Ｊ．Ｓ．，Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｃ．，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｐ．Ｍ．およびＴａｕｘｅ，Ｒ．Ｖ．（１９９９年）“Ｆｏｏｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｉｌｌｎｅｓｓ ａｎｄ ｄｅａｔｈ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ．”Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．第５巻：第６０７〜６２５頁
【非特許文献４】Ｌｅｅ，Ｗ．Ｃ，Ｌｅｅ，ＭＪ．，Ｋｉｍ，Ｊ．Ｓ．およびＰａｒｋ，Ｓ．Ｙ．（２００１年）“Ｆｏｏｄｂｏｒｎｅ ｉｌｌｎｅｓｓ ｏｕｔｂｒｅａｋｓ ｉｎ Ｋｏｒｅａ ａｎｄ Ｊａｐａｎ ｓｔｕｄｉｅｄ ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．”Ｊ．Ｆｏｏｄ．Ｐｒｏｔ．第６４巻：第８９９〜９０２頁
【非特許文献５】Ｒｅｉｓｓｂｒｏｄｔ，Ｒ．，Ｒｉｅｎａｅｃｋｅｒ，Ｉ．，Ｒｏｍａｎｏｖａ，Ｊ．Ｍ．，Ｆｒｅｅｓｔｏｎｅ，Ｐ．Ｐ．Ｅ．，Ｈａｉｇｈ，Ｒ．Ｄ．，Ｌｙｔｅ，Ｍ．，Ｔｓｃｈａｐｅ，Ｈ．およびＷｉｌｌｉａｍｓ，Ｐ．Ｈ．（２００２年）“Ｒｅｓｕｓｃｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ａｎｄ ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｖｉａｂｌｅ ｂｕｔ ｎｏｎｃｕｌｔｕｒａｂｌｅ ｓｔａｔｅ ｂｙ ｈｅａｔ ｓｔａｂｌｅ ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｕｔｏｉｎｄｕｃｅｒ．”Ａｐｐ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．第６８巻（第１０号）：第４７８８〜４７９４頁
【非特許文献６】Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，Ｐ．Ｊ．，Ｄｒｕｇｇａｎ，Ｐ．およびＮｅｂｅ−ｖｏｎ Ｃａｒｏｎ，Ｇ．（２０００年）“Ｓｔｒｅｓｓｅｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ａｒｅ ｅｘｐｏｓｅｄ ｔｏ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ｆｒｏｍ ｔｗｏ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｏｕｒｃｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｉｎ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ．”Ｉｎｔ．Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．第６０巻：第２６９〜２８５頁
【非特許文献７】Ｋｉｎｇ，Ｌ．（２００９年）“Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎｔｅｒａｇｅｎｃｙ ｇｒｏｕｐ ｍｅｅｔｉｎｇ．”ＦＤＡ ｅｘｅｃｕｔｉｖｅ ｓｕｍｍａｒｙ（２００９年１月３０日）
【発明の概要】
【００１２】
本発明の第１の態様では、実質的に以下の成分から構成される少なくとも１つの微生物を成長させるための培地が提供される。
（ｉ）基礎培養液と、
（ｉｉ）ブリリアントグリーン、ナリジクス酸および塩化リチウムから構成される群から選択される少なくとも１つの増殖抑制剤と、
（ｉｉｉ）任意成分として、テトラチオン酸ナトリウム、テトラチオン酸カリウム塩、クエン酸第二鉄アンモニウムおよびクエン酸ナトリウムから構成される群から選択される少なくとも１つの成長促進物質。
【００１３】
疑義を避けるため、本明細書で使用される「実質的に構成される」という用語には、特定の物質またはステップのみの場合も含まれるが、本発明の基本的な特性および新規な特性に実質的に影響を及ぼさない限り、追加的な成分または分子も含まれる。
【００１４】
培地は単純、複雑、または明確なものに分類することができる。基礎液体培地または基礎培地は基本的に単純な培地であり、最小限の追加成分で細菌を生育させる。通常、そのような基礎培養液は単にエネルギー源を供給し、正確な浸透圧を維持しさえすればよい。ペプトン、トリプトン、栄養液体培地（ペプトン、肉抽出物、任意的に酵母抽出物および塩化ナトリウム）、Ｌ−液体培地（トリプトン、酵母抽出物および塩化ナトリウム）、グラム陰性液体培地、トリプシン大豆培養液、酵母含有トリプシン大豆培養液、ならびに改良トリプシン大豆培養液は、先行技術で知られている好適な基本成分である。ペプトンは、消化中に酸または酵素によるタンパク質の部分加水分解によって得られる様々な水溶性のタンパク質誘導体である。トリプシン大豆培養液は通常、たとえばトリプトン（カゼインの膵液消化）、ソイトン（大豆ミールのパパイン消化）および塩化ナトリウムを含む。改良トリプシン大豆培養液は、さらにＤ形グルコース、胆汁塩およびリン酸二カリウムを含んでもよい。特に、基礎培養液は、トリプトン、栄養液体培地、Ｌ−液体培地、グラム陰性液体培地、ペプトン、トリプシン大豆培養液、酵母含有トリプシン大豆培養液、および改良トリプシン大豆培養液から構成される群から選択される。より具体的には、基礎培養液は、ペプトン、トリプシン大豆培養液、酵母含有トリプシン大豆培養液、および改良トリプシン大豆培養液から構成される群から選択される。
【００１５】
特定の実施の形態では、増殖抑制剤はブリリアントグリーン、トリアリルメタン色素（ＣＡＳ番号６３３−０３−４）である。
【００１６】
ブリリアントグリーンはグラム陽性細菌および大部分のグラム陰性細菌の成長を抑制することが知られている色素である。ブリリアントグリーンは、先行技術では様々な量、たとえばＤｉｆｃｏ（登録商標）ｍブリリアントグリーン液体培地中に２５ｍｇ／Ｌ、ブリリアントグリーンテトラチオン酸塩胆汁液体培地中に７０ｍｇ／Ｌ、ＭＬＣＢ寒天培地中に４．５〜６ｍｇ／Ｌ、およびＭｕｌｌｅｒ Ｋａｕｆｆｍａｎｎテトラチオン酸塩液体培地中に１０ｍｇ／Ｌ使用される。何１０年も使用されてきたが、本発明者らは驚くべきことに、ブリリアントグリーンのそのような濃度は、たとえばサルモネラ菌および赤痢菌を成長させるために最適ではないということを見出した。実際にそのような高濃度は、サルモネラ菌および赤痢菌を効率的かつ素早く成長させるためには有害であると信じられている。また、「病気の」または「ストレスを受けた」細菌を再生する妨げになる可能性もある。サルモネラ菌の特定の株、たとえばサルモネラ菌ｔｙｐｈｉ種またはｐａｒａｔｙｐｈｉ種は特に、ブリリアントグリーン感受性株であることが知られている。また現在、株間で識別（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）阻害作用を示さない適切な培地が存在しない（ＣｈａｕおよびＬｅｕｎｇ、２００８年）。
【００１７】
本発明者らはここで、たとえばグラム陽性細菌に対する阻害作用を有す一方で、サルモネラ菌（ｔｙｐｈｉ種およびｐａｒａｔｙｐｈｉ種を含む）の迅速な再生および成長を可能にするブリリアントグリーンの濃度の範囲を見出した。したがって、特定の実施の形態では、本培地は約０．０５ｍｇ／Ｌ〜約０．２５ｍｇ／Ｌまたは約０．１ｍｇ／Ｌ〜約０．２５ｍｇ／Ｌ、より具体的には０．１５ｍｇ／Ｌのブリリアントグリーンを含む。
【００１８】
これらの「低濃度」は、既に先行技術で知られている培地中の濃度から考えると驚くべき濃度である。先行技術で知られている培養方法は長時間持続的であるため、競合する微生物の成長を阻害するために、４８時間にも及ぶ培養を持続させるために、高濃度のブリリアントグリーンを利用する必要があると以前は信じられてきた。しかし、本発明の培地中では成長効率が良いため、単一の培地中で２０時間以内、具体的には約４〜１５時間以内、より具体的には約４〜８時間以内、さらにより具体的には約４〜６時間以内に、検出に適したレベルまで微生物を培養できる。別の実施の形態では、たとえばスワブ（ｓｗａｂ：表面拭い）試験を使用する場合には、この時間はさらに約３０分間〜約４時間、具体的には約１、１．５、２、２．５または３時間にまでさらに減少させられる可能性がある。結果として、ブリリアントグリーンを極めて低濃度で使用することが可能となる。ブリリアントグリーンはこの低濃度でも依然として、２０時間まで特定の競合微生物の成長を阻害する機能を有する。しかし、ブリリアントグリーンはたとえばサルモネラ菌および／または赤痢菌などの目的とする微生物の成長に全く影響を及ぼさない程度に、十分に低濃度である。
【００１９】
含有量は通常、ｍｇ／Ｌまたはｇ／Ｌで表されるが、水に単独でまたは連続的に添加されるために、たとえばタブレット、粉末、顆粒またはその他任意の所望の乾燥した形態にてあらかじめ混合された状態で、組成物が供給されてもよいことを理解する必要がある。また組成物は、所望の場合には多包装システムの別々の成分として提供されてもよい。この場合、含有量は成分の最終濃度に注意する必要がある。成分の最終濃度は、適量の水で希釈した時点で得られる。たとえば、０．５ｍｇのブリリアントグリーンを含む乾燥粉末の小包が２Ｌの水に希釈されると、得られる濃度は０．２５ｍｇ／Ｌである。
【００２０】
別の実施の形態では、本培地はナリジクス酸および／または塩化リチウムを増殖抑制剤として含む。
【００２１】
ナリジクス酸（ＣＡＳ番号：３８９−０８−２）はグラム陽性細菌とグラム陰性細菌の両方に対して有効である。低濃度では、ナリジクス酸は静菌性を有する。つまり、ナリジクス酸は細菌の成長と繁殖を阻害する。高濃度では、ナリジクス酸は殺菌性を有する。つまり、単に成長を阻害するのではなく、ナリジクス酸は細菌を死滅させる。特定の実施の形態では、本培地はナリジクス酸を約１〜３ｍｇ／Ｌ、より具体的には約２ｍｇ／Ｌ含む。
【００２２】
塩化リチウム（ＣＡＳ番号７４４７−４１−８）は、グラム陽性細菌の成長に影響を与えることなくグラム陰性細菌の成長を阻害する。特定の実施の形態では、本培地は約１〜３ｇ／Ｌ、より具体的には約２ｇ／Ｌの塩化リチウムを含む。
【００２３】
リステリア菌種の成長用の培地中に、ナリジクス酸および／または塩化リチウムを増殖抑制剤として使用することは有益である。
【００２４】
特定の実施の形態では、培地は任意的に成長促進物質を含んでいてもよい。
【００２５】
サルモネラ菌種に対しては、基礎培養液がペプトンを含む場合、テトラチオン酸ナトリウムまたはその塩を含むことが有益であることが見出されている。驚くべきことに本発明者らは、培地中のテトラチオン酸ナトリウムの濃度が約２０ｇ／Ｌよりも高ければサルモネラ菌種の成長を著しく阻害することを見出した。これが驚くべきことであるのは、２０ｇ／Ｌよりも高い濃度は、ポジティブセレクション用やサルモネラ菌種の成長用に、従来技術で日常的に使用されているからである。したがって、テトラチオン酸ナトリウムは約１〜約２０ｇ／Ｌ、より具体的には約４〜約１５ｇ／Ｌ、約６〜約１５ｇ／Ｌ、さらにより具体的には約７〜１５ｇ／Ｌ、約８〜１２ｇ／Ｌまたは約８ｇ／Ｌの濃度で含有されることが好ましい。
【００２６】
代替の実施形態では、本発明の精神から逸脱しない範囲で、テトラチオン酸ナトリウムに代えて適量のチオ硫酸ナトリウムおよびヨウ素が使用されてもよい。これは、ヨウ素が生体内でチオ硫酸ナトリウムと反応することにより、テトラチオン酸ナトリウム（およびヨウ化ナトリウム）が生成される可能性があるからである。別の実施の形態では、テトラチオン酸塩アニオン（Ｓ４Ｏ６２−）を放出するテトラチオン酸カリウム塩、バリウムのジチオン酸塩の無水物、それらの塩または化合物もしくは化合物の混合物が利用されてもよい。
【００２７】
別の実施の形態では、本培地は、成長促進物質を含む。この場合、成長促進物質はクエン酸第二鉄アンモニウムである。
【００２８】
特定の実施の形態では、クエン酸第二鉄アンモニウム（ＣＡＳ番号：１１８５−５７−５）が約２００〜１０００ｍｇ／Ｌ、より具体的には約２００〜約５００ｍｇ／Ｌ、さらにより具体的には２００ｍｇ／Ｌ〜約３００ｍｇ／Ｌ、およびさらにより具体的には約２５０ｍｇ／Ｌの濃度で使用される。
【００２９】
さらに別の実施の形態では、本培地は成長促進物質であるクエン酸ナトリウムをさらに含む。
【００３０】
特定の実施の形態では、トリクエン酸ナトリウム（ＣＡＳ番号：６８−０４−２）が約１０〜約２０ｇ／Ｌ、約１２〜１８ｇ／Ｌ、より具体的には約１５ｇ／Ｌの濃度で使用される。
【００３１】
特定の実施の形態では、本培地はサルモネラ菌種の成長用の培地である。別の実施の形態では、本培地は赤痢菌種の成長用の培地である。さらに別の実施の形態では、本培地はリステリア菌種の成長用の培地である。
【００３２】
本発明の第２の態様により提供されるのは、微生物の細胞からコアオリゴ糖モノマーを放出するための以下のステップを含む方法である。
（ｉ）洗浄剤を前記微生物を含む少なくとも１つの培養サンプルに添加することにより、洗浄剤−培養液を供給するステップと、
（ｉｉ）洗浄剤−培養液をコアオリゴ糖を放出するのに十分な温度にまで加熱するステップ。
【００３３】
細菌のリポ多糖類（ＬＰＳ）は、すべてのグラム陰性細菌およびある種のグラム陽性細菌の外膜の必須成分である。ＬＰＳは、そのような細菌に感染した患者の炎症性反応に関与する主要因子であると信じられている。グラム陰性細菌の例としては、病原性大腸菌、サルモネラ菌、赤痢菌およびカンピロバクター菌が含まれる。リステリア菌はグラム陽性細菌である。
【００３４】
特定されたＬＰＳの大部分は、同じ主要構造を有する。つまり、ＬＰＳの構造は３つの異なる領域である脂質Ａ領域、コアオリゴ糖、およびｏ−多糖鎖から構成されることが解明されている（図１２ａ）。この構造は、特にＬＰＳの脂質Ａ領域および内側のコア部において保存されている。この構造が保存されているため、脂質Ａ領域に結合する抗体のような結合分子は、特定の種に特異的ではない可能性がある。これにより、あらゆる分子検出ステップにおいて偽陽性が生じてしまう。さらに、たとえばコア領域に対して複数の結合分子を使用することは不十分である。それは、そのような結合分子は同じエピトープを求めて競合する可能性があるため、またはエピトープが近接していることによりそれぞれの結合反応が妨げられる可能性があるからである。したがって、先行技術の検出方法は、それらのエピトープが容易に接近できるため、細胞表面またはたとえばサルモネラ菌などの細菌に特異的な結合分子に依存していた。
【００３５】
ＬＰＳは通常、含水フェノール抽出と続く精製によって、細菌から単離される。単離されたＬＰＳは、続いてたとえばＳＤＳ−ＰＡＧＥ、質量分析およびＮＭＲによって特定することができる（Ｒａｅｔｚ、１９９６年）。本発明者らは、洗浄剤と熱の適用を利用する迅速な方法の使用を通じて、コアオリゴ糖領域が開放されるか、接近可能になるか、たとえば抗体結合技術による検出に使用できるようになる可能性があることを見出した。そのような単純な手順を使用することは、たとえば細胞表面の抗原または細菌の検出には適していないであろう。それは、洗浄剤が脂質と相互作用することが知られており、結合分子が相互作用する可能性がある脂質Ａエピトープを破壊または崩壊させるからである。洗浄剤を単独でも使用できるが、熱を使用するとさらに有利である。それは、熱がＬＰＳを検出可能なモノマーに分解するとともに、病原性細菌を死滅させるという追加的な利点も有するからである。
【００３６】
洗浄剤は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）またはＴＷＥＥＮ ２０、４０、６０または８０であることが好ましい。
【００３７】
驚くべきことに、本発明者らはＳＤＳを使用すると抗体などの結合分子とエピトープとの結合を、後述する直接アッセイにおいて１０倍も強くすることができることを見い出した。同様に、他の洗浄剤は直接アッセイ（後述）において抗体結合を干渉したり阻害したりするが、驚くべきことに本発明者らは、ＴＷＥＥＮ ２０、４０、６０または８０は、たとえば競合アッセイにおいて、そのような影響をほとんど及ぼさないか全く及ぼさないことを見い出した。これはたとえばＱｕａｌｔｉｅｒｅら（１９７７年）のような技術による確立された教示とは正反対である。
【００３８】
洗浄剤は、たとえば水などの溶媒に溶かして培養サンプルに液体として加えられてもよいし、ＳＤＳの場合は固体として加えられてもよい。本方法で使用される洗浄剤の具体的な濃度は、約０．１％〜約２％、特に約０．５％〜約１％である（ｗ／ｖまたはｖ／ｖ）。
【００３９】
洗浄剤を水に溶解または希釈させ、上述の濃度になるように液体として添加されることが好ましい。洗浄剤溶液は、バッファなどのさらなる成分を含まないことが好ましい。したがって、好ましい実施の形態では、本洗浄剤溶液は、水に溶解した洗浄剤であるドデシル硫酸ナトリウム、またはＴＷＥＥＮ ２０、４０、６０もしくは８０から実質的に構成される。
【００４０】
本方法の次のステップでは、洗浄剤−培養液はコアオリゴ糖を放出するのに十分な温度にまで加熱される。サンプル中に存在する可能性のある細菌、特にサルモネラ菌、赤痢菌またはリステリア菌を死滅させるのに十分な温度にまで溶液を加熱することが好ましい。具体的な温度には、約６０℃〜約１００℃、特には約６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５〜約１００℃が含まれる。ステップ（ｉ）および（ｉｉ）が連続的または同時に行われれてもよいことは、当業者には明らかであろう。培養サンプルおよび／または洗浄剤が混合前に加熱されてもよいことも当業者には明らかであろう。洗浄剤−培養液は、約３０秒間〜約２０分間、具体的には約２分間〜約１５分間、より具体的には約２、３、４、５、６、７、８、９または約１０分間加熱されてもよい。
【００４１】
本発明の第３の実施の形態では、試験サンプル中で目的とする微生物の存在または不存在を検出するための以下のステップを含むアッセイ方法が提供される。
（ｉ）試験サンプルを培地中で培養することにより、目的とする微生物の増殖を可能とするステップと、
（ｉｉ）試験サンプル中に存在する任意の微生物から１つ以上のコアオリゴ糖を放出するのに十分な程度に、試験サンプルを処理するステップと、
（ｉｉｉ）目的とする微生物のコアオリゴ糖に対する結合特異性を有する少なくとも１つの結合分子に、試験サンプルを接触させるステップと、
（ｉｖ）少なくとも１つの結合分子と目的とする微生物のコアオリゴ糖との任意の結合を検出するステップ。
【００４２】
本アッセイ方法は、直接的であってもよいし、間接的であってもよい。「サンドイッチアッセイ」とも呼ばれる直接結合アッセイ、つまり非競合アッセイ（直接的または間接的）では、抗体が目的とする微生物の任意のコアオリゴ糖と反応するように、コアオリゴ糖は表面および結合分子に結合することが好ましい。結合分子は標識結合分子であることが好ましい。次に、表面の標識結合分子の量が測定される。
【００４３】
直接アッセイ方法の結果は通常、サンプル中のコアオリゴ糖の濃度に正比例する。コアオリゴ糖がサンプル中に存在しない場合、標識結合分子が結合しないのは明らかである。
【００４４】
競合アッセイでは、試験サンプル中のコアオリゴ糖は、結合分子に結合しようとして標識コアオリゴ糖と競合する。次に、コアオリゴ糖に結合した標識結合分子の量が測定される。この方法では、反応はサンプル中のコアオリゴ糖の濃度に反比例する。これは、反応の程度が大きいほど、「未知の」サンプル、つまり試験サンプル中で標識コアオリゴ糖と競合するために使用可能なコアオリゴ糖が少なくなるからである。
【００４５】
アッセイが直接的であるか間接的であるかにかかわらず、検出のためにコアオリゴ糖または標識コアオリゴ糖がそれぞれ表面に結合することが好ましい。
【００４６】
コアオリゴ糖が結合する表面は、先行技術で知られている材料、たとえば樹脂、ガラス、セラミックスなどの有機ポリマーで形成されていてもよい。特定の有機ポリマーには、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、セルロースおよびニトロセルロースが含まれる。好ましいポリマーはポリスチレンであり、より具体的にはガンマ線を照射したポリスチレンである。その表面自体は、シート、マイクロプレートまたはマイクロタイタープレート、トレイ、メンブレン、ウェル、ペレット、竿、棒、チューブ、ビーズなどの形態またはその一部であってもよい。
【００４７】
特定の実施の形態では、ＬＰＳまたはコアオリゴ糖を含むモノマーは、修飾されることなく表面に固定化される。たとえば、分子の疎水性の脂質Ａ部分は、非共有の疎水性相互作用を介して、ガンマ線を照射したポリスチレン表面のような表面に結合してもよい。そのような結合は、コアオリゴ糖領域を抗体などの結合分子と相互作用をするために接近可能なままに留める。
【００４８】
代替の実施形態では、ＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖は、抗体、複合体、または他の結合などの結合仲介分子を用いることによって、表面に固定化される。好適な代替物は、国際特許出願第ＷＯ０３／３６４１９号に開示されている。
【００４９】
本方法の第１のステップは、試験サンプルを培地中で培養することにより、目的とする微生物の増殖を可能とするステップを含む。
【００５０】
ある実施の形態では、本方法は食物または食品中に存在する微生物タンパク質またはフラグメントを検出するために使用される。別の実施の形態では、サンプルは環境サンプル、農産物サンプル、医療品、または製造サンプルである。試験サンプルは、加工食品、乾燥食品、冷凍食品、または冷蔵食品を含む、肉、ミンチを含む肉製品、卵、チーズ、ミルク、野菜、チョコレート、ピーナッツバターなどの食品であってもよい。または、試験サンプルは、生検サンプル、糞便、唾液、水和液、栄養液、血液、血液製剤、組織抽出物、ワクチン、麻酔、薬理活性のある薬剤、造影剤または尿サンプルなどの臨床サンプルであってもよい。試験サンプルはまた、肌のスワブ、盲腸のスワブ、糞便のスワブ、排せつ物のスワブ、もしくは直腸のスワブ、または床、ドアおよび壁などの表面のスワブ、または動物の死体スワブを含む、食品から得られたスワブなどのスワブ（ｓｗａｂｓ：ぬぐい液）を含んでいてもよい。試験サンプルはまた、ファンデーション化粧品、口紅、ローション、クリーム、シャンプーなどの化粧品サンプルを含んでいてもよい。
【００５１】
試験サンプルは、本発明の第１の態様に従った培地中で培養されることが好ましい。
【００５２】
特定の実施の形態では、試験サンプルは培地中で約３０℃〜約４４℃、具体的には約３７℃〜４２℃、より具体的には約３７℃にて培養される。試験サンプルは培地中で、約４〜１５時間、より具体的には約４〜８時間、さらにより具体的には約４〜６時間培養されてもよい。別の実施の形態では、試験サンプルは培地中で、約３０分間〜約４時間、具体的には約１、１．５、２、２．５または３時間培養されてもよい。
【００５３】
本方法の第２のステップには、試験サンプル中に存在する任意の微生物から１つ以上のコアオリゴ糖を放出するのに十分な程度に、試験サンプルを処理するステップを含む。
【００５４】
試験サンプルは、細菌のＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖を微生物の細胞膜から放出させるのに適した任意の方法で処理されてもよい。試験サンプルは、本発明の第２の態様に従って処理されるのが好ましい。
【００５５】
他の好適ではあるがおそらく効率が低い抽出方法が従来技術には存在する。超音波処理、加圧型細胞破壊装置の使用、酵素の使用、「ビーズビート法（ｂｅａｄ ｂｅａｔｉｎｇ）」などを含むそれらの方法もまた使用することができる。しかし、サルモネラ菌などの病原性細菌を扱う場合、高温の洗浄剤（煮沸したものまたは上述のもの）を使用することが特に有用である。なぜなら、高温により確実にすべての細菌が死滅するからである。より具体的には、アッセイが直接結合アッセイの場合、ＳＤＳが好適に利用される。一方、アッセイが競合型の場合、プレートに塗布する抗原を調整するためにＳＤＳが使用される。ただし、残りの手順の間は、ＴＷＥＥＮ ２０、ＴＷＥＥＮ ４０、ＴＷＥＥＮ ６０またはＴＷＥＥＮ ８０のいずれか、特にＴＷＥＥＮ ２０が使用される。上述の第１の態様との関係で、適切な加熱／処理時間の長さが規定される。目的とする微生物が試験サンプル中に存在しなくてもよいことは明らかであろう。その場合、目的とする微生物のＬＰＳおよびコアオリゴ糖も存在しないであろう。
【００５６】
本方法の第３のステップでは、目的とする微生物のコアオリゴ糖に対する結合特異性を有する少なくとも１つの結合分子に、試験サンプルが接触させられる。
【００５７】
特定の実施の形態では、処理した試験サンプル中のコアオリゴ糖、ＬＰＳまたはモノマーは、ステップ（ｉｉｉ）の前に、表面に固定化される。コアオリゴ糖、ＬＰＳまたはモノマーは、目的とする微生物のコアオリゴ糖に結合特異性を有する、少なくとも１つの結合分子に曝されている。そのような実施の形態では、サンプル中のコアオリゴ糖、ＬＰＳまたはモノマーは、処理された試験サンプルを表面に接触させ、接触させた状態で約１０分間、２０分間、３０分間、４０分間、５０分間、もしくは約６０分間インキュベートおよび／または維持することによって、固定化されてもよい。
【００５８】
別の実施の形態、たとえば競合アッセイでは、試験サンプルは表面に塗布されるか接触させられる。表面には、既に固定化された既知量または標準量のコアオリゴ糖、ＬＰＳまたはモノマーが存在する。既知量または標準量両方のコアオリゴ糖、ＬＰＳまたはモノマーが、少なくとも１つの結合分子と結合しようとして、試験サンプルから得られたコアオリゴ糖、ＬＰＳまたはモノマーと競合する。
【００５９】
コアオリゴ糖、ＬＰＳまたはモノマーは、たとえば非共有の疎水性相互作用によって前記表面に直接固定化されてもよいし、上述のように間接的に固定化されてもよい。
【００６０】
試験サンプルを少なくとも１つの結合分子に十分な時間接触させることにより、コアオリゴ糖、ＬＰＳまたはモノマーが少なくとも１つの結合分子に結合できるようにして、たとえばコアオリゴ糖／結合分子複合体のような複合体を形成するべきである。適切な時間には、約１分間〜約４時間、特に約３０分間〜約２時間、特に約４５分間、１時間および１．５時間が含まれる。
【００６１】
ある実施の形態では、本方法の任意のステップにおいて、複合体は、少なくとも１つの結合分子に対し結合特異性を有する第２の結合分子に十分な時間接触させられる。これにより、第２の結合分子は二次的な複合体、たとえばコアオリゴ糖／結合分子／第２の結合分子複合体を形成することができる。
【００６２】
結合分子は、抗体、より具体的には親和性により精製された抗体、さらにより具体的にはモノクローナル抗体であることが好ましい。
【００６３】
本発明のアッセイに使用される抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体であってもよい。そのような抗体は一本鎖で構成されてもよいが、少なくともＬ鎖またはＨ鎖で構成されることが好ましい。しかし、抗体が結合特異性を有するコアオリゴ糖または汚染微生物などの標的に結合するために、少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）が必要であることは理解されるであろう。
【００６４】
抗体を作製する方法は、先行技術で知られている。たとえば、ポリクローナル抗体が望ましい場合、マウス、ウサギ、ヤギまたはウマなどの選択された哺乳類が、細菌のエンドトキシンなどの選択された抗原によって免疫されてもよい。次に、免疫された動物から得られた血清が集められ、たとえば免疫親和性クロマトグラフィーによって、抗体を得るように処理される。
【００６５】
モノクローナル抗体は、先行技術で知られており通常行われている方法によって製造されてもよい。ハイブリドーマ技術を用いてモノクローナル抗体を製造するための通常の方法は、よく知られている（たとえば、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ，Ｎａｔｕｒｅ、第２５６巻：第４９５〜４９７頁（１９７５年）；Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ、第４巻：第７２頁（１９８３年）；Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．第７７〜９６頁（１９８５年）を参照）。
【００６６】
後述のとおり抗体は、ＣＤＲなどのエピトープ−結合領域で構成されている必要がある。抗体は、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよび特にＩｇＧを含む、任意の適切なクラスであればよい。また、それらの抗体の様々なサブクラスも想定される。ここで用いられるように、「抗体結合フラグメント」という用語は、抗体のフラグメント、つまり抗体から得られたポリペプチドをいう。このポリペプチドは、抗体の結合特異性を有する。そのようなフラグメントには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖなどの抗体フラグメントが含まれるが、これらには限られない。これらのフラグメントはすべて、エピトープに結合することができる。
【００６７】
また、「抗体」という用語は、入手可能な様々な任意の自然抗体、人工抗体、および抗体由来のタンパク質、ならびにそれらの派生物に及ぶ。派生物としては、たとえばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体，単一ドメイン抗体、抗体全体、Ｆ（ａｂ’）２およびＦ（ａｂ）フラグメントなどの抗体フラグメント、Ｆｖフラグメント（非共有のヘテロ二量体），一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）などの一本鎖抗体、小体（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）、オリゴ体（ｏｌｉｇｏｂｏｄｉｅｓ）、二量体または三量体の抗体フラグメント、あるいはコンストラクトなどが含まれるが、これらには限られない。「抗体」という用語は、何ら特定の由来を意味するものではなく、ファージ提示法など、従来の方法ではない方法によって得られた抗体も含む。本発明の抗体は、任意のアイソタイプ（たとえばＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、つまりα、γまたはμのＨ鎖）とすることができ、Ｋ（カッパ）またはλ（ラムダ）のＬ鎖を有してもよい。
【００６８】
したがって、本発明は、本発明で使用されるコアオリゴ糖に対する結合特異性を有する抗体および抗体から得られた結合フラグメントの使用にまで及ぶ。
【００６９】
「特異的に結合する」または「結合特異性」という用語は、抗体またはそのフラグメントが、標的ではないエピトープに対するよりも高い親和性で、標的となる微生物病原体に結合する能力をいう。たとえば標的エピトープに対する抗体の結合は、標的ではないエピトープに対する結合親和性よりも、少なくとも１０倍、５０倍、１００倍、２５０倍、５００倍、または１０００倍を超える結合親和性をもたらしてもよい。ある実施の形態では、結合親和性は親和性ＥＬＩＳＡアッセイによって決定される。代替の実施形態では、親和性はＢＩＡｃｏｒｅアッセイによって決定される。代わりに、結合親和性は速度論的方法によって決定されてもよい。
【００７０】
ある実施の形態では、抗体などの結合分子が表面上に固定されてもよい。そして任意的な洗浄ステップの後、目的とするコアオリゴ糖または汚染微生物を含みうる試験サンプルを、表面に結合した抗体に、結合が起きて表面に結合した第１の結合分子ーコア複合体が形成されるように、十分な時間接触させることができる。本アッセイは次に、第１の結合分子ーコア複合体が結合した表面を、抗体などの第２の結合分子に接触させるステップを含んでもよい。第２の結合分子は、たとえばアクリジニウムエステルなどの発光手段と共有結合していてもよい。そのような場合、第２の結合分子は、第１の結合分子、コアオリゴ糖または汚染微生物に存在するエピトープに対する結合特異性を有する。それにより、生成されたシグナルの量は、第１の結合分子または第２の結合分子が結合したコアオリゴ糖または汚染微生物の量に対応する。
【００７１】
典型的には、抗体は精製されることにより凝集が抑制される。
【００７２】
ある実施の形態では、表面は、例えば従来型設計のマイクロタイタープレートである。しかし、たとえば暗い側壁と（底面などに）白色または透明な部分とを有する改良表面を使用すれば、利点を得ることができる。これにより、測定時において、生成された任意のシグナルを増幅し、背景光を低減することができる。白色の部分が光を反射させることにより、生成されたシグナルを増幅することができる。したがって、特定の実施の形態では、表面は複数のウェルを含むマルチウェルプレートである。この場合、各ウェルの底面は透明または実質的に透明である。一方、ウェルの側壁は、光の透過を防止するために不透明もしくは暗くされるか、またはウェルの底面部に対してコントラストを与えることにより光が底面部で通過できるようにするために着色されている。
【００７３】
さらにより具体的には、本抗体は種特異的なモノクローナル抗体である。
【００７４】
「種特異的な」という用語を使うことによって、交差反応がほんんどないか全くない程度に、例えばサルモネラ菌、赤痢菌およびリステリア菌の間でそのような抗体が異なることを意味することを目的としている。
【００７５】
特定の実施の形態では、結合分子は以下のＬＰＳコアオリゴ糖のエピトープと反応して結合する。
【００７６】
【化１】
このエピトープは種特異的であり、サルモネラ菌を他の細菌から識別する。他の細菌としては、赤痢菌、リステリア菌、病原性大腸菌などがあるが、これらには限定されない。特定の実施の形態では、本アッセイ方法は、サルモネラ菌を定量的に検出するための方法である。本アッセイ方法は、サルモネラ菌の存在または不存在を検出するために利用されてもよい。特定の実施の形態では、結合分子は、たとえば化学発光性または蛍光性の化合物に対する結合により標識された標識結合分子である。
【００７７】
しかし、本発明の方法は、様々な標的汚染微生物の同定および定量に使用できることは明らかであろう。本発明のアッセイ方法は、存在性に関するサンプルの分析または汚染微生物量の分析を含む。本発明の方法を用いて試験されるサンプルのすべてが汚染微生物を含むわけではないということは理解されるであろう。ある実施の形態では、汚染微生物は病原性微生物から得られたタンパク質またはそのフラグメントである。あるさらなる実施の形態では、汚染微生物は、細胞壁のフラグメント、ペプチドグリカン、糖タンパク質、リポタンパク質、糖脂質タンパク質、小ペプチド、糖配列および脂質配列から構成される群のうちの少なくとも１つであってもよいが、これらに限られるわけではない。本発明の方法は、細菌、ウイルスおよび菌類から得られた構造タンパク質および／または毒素を含む微生物タンパク質を検出するのに特に適している。
【００７８】
本方法の第４のステップは、目的とする微生物のコアオリゴ糖または汚染微生物に対する、少なくとも１つの結合分子の任意の結合を検出するステップを含む。
【００７９】
本検出方法は、蛍光測定、比色定量、フローサイトメトリー、化学発光などの先行技術で知られている任意の適切な方法によるものであってもよい。好適な実施の形態では、結合の検出は、たとえば化学発光性の化合物が発する化学発光性の光の発光シグナルの測定／検出による。適切な化学発光性の化合物には、アクリジニウムエステル、アクリジニウムスルホンアミド、フェナントリジニウム（ｐｈｅｎａｎｔｈｒｉｄｉｎｉｕｍｓ）、１，２−ジオキシエタン、ルミノール、または化学発光性の基質を触媒する酵素などが含まれる。
【００８０】
ある実施の形態では、結合分子は発光部と直接結合してもよい。ある実施の形態では、結合分子はアクリジニウム化合物またはその派生物と結合する。派生物には、アクリジニウムエステル分子または発光ラベルとして機能するアクリジニウムスルホンアミドがある。抗体または結合フラグメントがアクリジニウムエステルまたはアクリジニウムスルホンアミドと結合する実施の形態では、本アッセイ方法はＡＭＰＰＤを試験サンプルに添加するステップをさらに含んでもよい。
【００８１】
ＡＭＰＰＤは、以下の同義語によって知られているかもしれない：３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３”−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキシエタン；３−（４−メトキシスピロ（１，２−ジオキシエタン−３，２’−トリシクロ（３．３．１．１（３，７））デカン）−４−ｙｌ）フェニルリン酸塩；４−メトキシ−４−（３−リン酸塩フェニル）スピロ（１，２−ジオキシエタン）−３，２’−アダマンタン。
【００８２】
ある別の実施の形態では、抗体は間接的に発光部と関連してもよい。たとえば、アクリジニウムエステル分子は、第１の抗体と結合可能な第２の抗体と結合してもよい。ある実施の形態では、１つ以上の発光性または蛍光性の部分がアビジン／ストレプトアビジンに結合してもよい。同様にアビジン／ストレプトアビジンは、抗体に化学的に結合したビオチンに結合してもよい。ある別の実施の形態では、レクチン（プロテインＡ／Ｇ／Ｌ）は発光性または蛍光性の分子と結合しうる。また、発光性または蛍光性の分子は、抗体または他のタンパク質複合体に取り付けられていてもよい。
【００８３】
検出可能なシグナルを生成する刺激は、光、たとえば紫外線光などの特定の波長の光であってもよいし、電気的刺激または放射性刺激、化学反応または酵素−基質反応など、他の何らかの刺激であってもよい。
【００８４】
本検出方法は、１００００ｃｆｕもの病原性大腸菌など他の微生物の存在下で、またはたとえばスワブもしくは開始サンプルあたり、サルモネラ菌、赤痢菌またはリステリア菌の１コロニー形成単位（ｃｆｕ）を好ましくは検出／識別できるべきである。特定の検出限界は、サンプルサイズ（ｍｇ，ｇなど）または体積（ｍｌ，Ｌなど）の単位あたり約１０００ｃｆｕ、具体的には約５００ｃｆｕ、より具体的には約２５０ｃｆｕ、２００ｃｆｕ、１５０ｃｆｕ、１００ｃｆｕ、５０ｃｆｕ、１０ｃｆｕ、および約１ｃｆｕである。液体培養では、特定の検出限界は約５００ｃｆｕ／ｍｌである。
【００８５】
別の実施の形態では、抗体はそのような発光部と間接的に関係があってもよい。例えば、アクリジニウムエステル分子は、第１の結合分子と結合することができる第２の結合分子と共役してもよい。
【００８６】
本アッセイ方法は、定性的であってもよいし、定量的であってもよい。また、標準コントロールを流すことにより、生成された平均シグナルを既知量の例えばコアオリゴ糖と関連づけてもよい。
【００８７】
ある実施の形態では、本方法は複数のコアオリゴ糖または汚染微生物のサンプルにおける決定用に使用されてもよい。これは、異なるエピトープまたは汚染微生物に対してそれぞれ結合特異性を有する抗体のような、複数の結合分子を提供することにより実現される。ある実施の形態では、二重特異性の抗体が使用されてもよい。
【００８８】
本方法の各段階の間または各段階において、任意の洗浄ステップ、乾燥ステップ、および／または培養ステップが含められてもよいことは明らかであろう。また、本方法は「ブロッキングステップ」を本方法の１つ以上のステップ間に任意的に含んでもよい。この場合、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはカゼインなどの非反応性タンパク質の濃縮液が、たとえばマイクロタイタープレートのすべてのウェルに対して添加される。特定のブロッキング薬剤もまた、ミルク粉末などの溶液を含む。そのようなタンパク質が、他のタンパク質がプレートに非特異的に吸着することを阻止する。また、そのようなタンパク質は、アッセイの感度を妨げうる「バックグラントの」ノイズを低減させるために有益であってもよい。
【００８９】
本発明の第６の実施の形態によると、サルモネラ菌、赤痢菌およびリステリア菌から構成される群から選択される微生物を特異的に検出するための、コアオリゴ糖に対して結合特異性を有する結合分子の使用が提供される。
【００９０】
本発明の第５の実施の形態によると、本発明の第１、２、３、４および／または５の実施に従って本発明を実行するためのキットが提供される。そのようなキットは、（即使用可能なまたは希釈用に濃縮された）液体状態もしくは（たとえば粉末、顆粒、タブレットなどの）乾燥状態の培地、洗浄剤もしくは洗浄剤溶液、洗浄バッファ、希釈剤、調整済プレート、調整済チューブまたはビーズ、１つ以上の（１次、２次）抗体、検出試薬、手袋、ピペット用チップ、取扱説明書などを含んでいてもよい。調整済プレートまたはチューブのウェルは、既知または標準量のコアオリゴ糖、ＬＰＳもしくはモノマー、または抗体などの結合分子によって被覆済であってもよい。そのような調整済の表面は、凍結乾燥されていてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】図１（ａ）および図１（ｂ）は、直接結合アッセイの概略図である。黒塗りの菱形は、サルモネラ菌などの細菌のコアオリゴ糖、ＬＰＳまたはモノマーを表す。図１（ａ）は直接免疫アッセイを示し、図１（ｂ）は間接免疫アッセイを示す。
【図２】図２（ａ）および図２（ｂ）は、結合タンパク競合アッセイの概略図である。黒塗りの菱形は、サルモネラ菌などの細菌のコアオリゴ糖、ＬＰＳまたはモノマーを表す。図２（ａ）は直接競合免疫アッセイを示し、図２（ｂ）は間接競合免疫アッセイを示す。
【図３】図３は、テトラチオン酸塩はサルモネラ菌に対して正の成長効果を及ぼすが、他の細菌の成長は抑制されることを示すグラフである。
【図４】図４は、ブリリアントグリーンがサルモネラ菌、赤痢菌、病原性大腸菌およびブドウ球菌の成長に及ぼす影響を示すグラフである。本グラフは、特に０．１５ｍｇ／Ｌのブリリアントグリーン濃度で競合する細菌を阻害することによりサルモネラ菌を成長させるためのブリリアントグリーンの最適な濃度範囲を実証する。
【図５】図５は、クエン酸第二鉄アンモニウムがサルモネラ菌、赤痢菌、病原性大腸菌およびブドウ球菌の成長に及ぼす影響を示すグラフである。本グラフは、特に０．２５ｇ／Ｌの濃度で赤痢菌を成長させるためのクエン酸第二鉄アンモニウムの最適な濃度範囲を実証する。０．２５ｇ／Ｌを上回る濃度では、サルモネラ菌の成長は影響を受けない。
【図６】図６は、クエン酸ナトリウムがサルモネラ菌、赤痢菌、病原性大腸菌およびブドウ球菌の成長に及ぼす影響を示すグラフである。サルモネラ菌および赤痢菌の成長は助長されるが、競合する細菌の成長は阻害される。
【図７】図７は、グラム陰性液体培地中での細菌の成長を示すグラフである。
【図８】図８は、デオキシコール酸塩ークエン酸塩ーラクトースースクロース液体培地中での細菌の成長を示すグラフである。
【図９】図９は、ペプトン液体培地中での細菌の成長を示すグラフである。
【図１０】図１０は、改良トリプシン大豆培養液中での細菌の成長を示すグラフである。サルモネラ菌および赤痢菌の両方の成長が助長され、約３０分間という倍増時間を示す。
【図１１】図１１は、本発明の液体培地中で競合する細菌を阻害した場合の、リステリア菌種の成長の速さを説明するためのグラフである。
【図１２（ａ）】図１２（ａ）は、目的とするある細菌のＬＰＳの一般的な構造を示す（Ｏ−抗原、コア多糖（オリゴ糖）、脂質Ａ）。
【図１２（ｂ）】図１２（ｂ）は、種特異的な抗体結合エピトープを含むサルモネラ菌のＬＰＳモノマーの詳細な説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００９２】
本発明のアッセイは、あるサンプル中で、細菌のＬＰＳのコアオリゴ糖の存在または不存在を特定するために利用されることが好ましい。本発明のアッセイは、サルモネラ菌、赤痢菌、もしくはリステリア菌などの細菌を含むか、または細菌に汚染されたサンプルを特定することができる。これらの細菌は、種特異的なエピトープをＬＰＳのコアオリゴ糖領域中に有する。本発明の方法を説明することを目的とする以下の説明と例を参照すれば、本発明をより理解できるかもしれない。
【００９３】
図１（ａ）は、標識一次抗体を利用する直接結合アッセイのステップを示す。図１（ｂ）は、標識一次抗体と標識された二次抗体とを利用する直接結合アッセイを示す。動物の死体や食料品中においてサルモネラ菌種を検出するための直接結合（直接的または間接的な抗体結合）による化学発光に基づく免疫吸着アッセイは、後述のように実行されてもよい。
【００９４】
本発明の第１の態様に従い、２５ｇの食品サンプルが２２５ｍｌの培地に添加された。これに代えて、死骸において表面スワブが１０×１０ｃｍの領域から採取され、本発明の第１の態様に従って、２〜５ｍｌの培地中で培養されてもよい。具体的には、本培地は１％のペプトン、８ｇ／Ｌのテトラチオン酸ナトリウム、および０．１５ｍｇ／Ｌのブリリアントグリーンを含有していた。サンプルは３７℃で５時間培養された。
【００９５】
５時間の培養後、サンプルのうち２ｍｌの一定分量が取り出され、最終濃度が０．５％（ｗ／ｖ）となるようにＳＤＳが添加された。そのサンプルは１００℃で５分間加熱された後、冷却された。１００μｌの各試験サンプルが、硬質で白色の９６ウェル高結合性マイクロタイタープレート（グライナーバイオワン社）のウェルに直接添加され、３７℃で３０分間インキュベートされた。インキュベート中、ＬＰＳの脂質Ａ部分が非共有の疎水性相互作用によってプレートの表面に結合する（図１ａ（１）、図１ｂ（１））。インキュベートに続き、プレートの溶液を捨て、０．０１Ｍのリン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ７．４）、０．１４７ＭのＮａＣｌおよび０．０５（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ ２０を含む洗浄バッファを用いてウェルが３回洗浄された。
【００９６】
０．１４７ＭのＮａＣｌを含む０．０１Ｍのリン酸バッファ（ｐＨ７．４）中での濃度が５００ｎｇ／ｍｌの抗サルモネラ菌抗体複合体１００μｌが各ウェルに添加された。ウェルあたりの抗体の最終濃度は５０ｎｇであった。プレートに結合したサンプル（サルモネラ菌ＬＰＳ／コアオリゴ糖）および抗体が被覆されたウェル中で３０分間、３７℃にてインキュベートされた。インキュベートに続き、プレートが洗浄バッファ中で３回洗浄され、検出の前に完全に乾燥させられた（図１ａ（２）、図１ｂ（２））。
【００９７】
抗サルモネラ菌抗体がアクリジニウムエステルで直接標識された場合、プレートが照度計の中に配置される。３０μｌの誘因溶液Ａと６０μｌの誘因溶液Ｂがマイクロタイタープレートの各ウェルに添加されることにより、結合したアクリジニウムエステルから光出力が開始される（図１ａ（３））。照度計の設定は以下のとおりである。
【００９８】
遅延注入Ｐ（溶液Ａ用） − １．６秒
測定時間間隔１ − ０．０秒
遅延注入Ｍ（溶液Ｂ用） − ０．０秒
測定時間間隔２ − １．０秒
【００９９】
誘因溶液Ａは、６３μｌの７０％（ｗ／ｗ）硝酸と１６５μｌの３０％（ｖ／ｖ）Ｈ２Ｏ２とを全容積が１０ｍｌの蒸留水中に含んでいた。誘因溶液Ｂは、０．１ｇのＮａＯＨと７５ｍｇのＣＴＡＣとを１０ｍｌの蒸留水中に含んでいた。
【０１００】
ヤギの抗マウスＩｇＧ２ｂアクリジニウム複合体の添加（抗サルモネラ菌モノクローナル抗体が結合しない場合）
抗サルモネラ菌抗体が標識されていない場合、第２の結合分子であるヤギの抗マウスＩｇＧ２ｂ複合体が使用される。カラム処理後のＩｇＧ２ｂが、３％（ｗ／ｖ）の無脂肪ミルク粉末および０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ ２０を含む希釈剤中で１：１００に希釈された。希釈後の溶液１００μｌがプレートの各ウェルに添加された。（図１ｂ（３））。３７℃における６０分間のインキュベートに続き、プレートが洗浄バッファで４回洗浄され、乾燥され、上述のように測定された（図１ｂ（４））。
【０１０１】
食料品中のサルモネラ菌種を検出するための競合（直接的または間接的）化学発光結合性免疫吸着アッセイを後述のように行ってもよい。サルモネラ菌エンテリティディス種のＬＰＳを被覆したマイクロタイタープレートは、以下のように調整された。サルモネラ菌エンテリティディス種が標準液体培地（２％（ｗ／ｖ）の緩衝化ペプトン水（オキソイド社））中で本発明の第１の態様に従わずに１８時間かけて培養された。コロニー形成単位数が定量され、蓋がされているが密封はされておらず、最終濃度がそれぞれ１０ｍＭおよび０．５％（ｗ／ｖ）となるＮａＥＤＴＡおよびＳＤＳを含むポリプロピレン試験管中に、約１０８ｃｆｕ／ｍｌ分が入れられた。この培養液が１００℃で２分間煮沸されることにより、細菌を死滅させ（そしてあらゆる関連有害物質を中和させ）、さらにまた細菌のＬＰＳコアオリゴ糖つまりモノマーエピトープを露出させた（たとえば図１２ｂを参照）。煮沸されたストックは、２％の緩衝化ペプトン水（ＢＰＷ社）を含む希釈剤を添加することによって、１０６ｃｆｕ／ｍｌの濃度にまでさらに希釈された。
【０１０２】
希釈され煮沸されたストックのうち１００μｌが硬質で白色の９６ウェル高結合性マイクロタイタープレート（グライナーバイオワン社）の各ウェルに添加され、３７℃で６０分間インキュベートされた。インキュベート中、ＬＰＳの脂質Ａ部分は、非共有の疎水性相互作用によりプレートの表面に結合する。インキュベートに続き、プレートの溶液が捨てられ、ウェルが０．０１Ｍのリン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ７．４）、０．１４７ＭのＮａＣｌおよび０．０５（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ ２０を含む洗浄バッファによって３回洗浄された。洗浄された被覆プレートは、すぐに使用されるか保存用に凍結乾燥された（図２ａ（１）、図２ｂ（１））。
【０１０３】
１０ｃｆｕのサルモネラ菌に曝されたひき肉の試験サンプル２５ｇが、本発明の第１の態様に従って２００ｍｌの培地中に添加された。具体的には、本培地は１％のペプトン、８ｇ／Ｌのテトラチオン酸ナトリウムおよび１５ｍｇ／Ｌのブリリアントグリーンを含有していた。本サンプルは３７℃で５時間インキュベートされた。５時間のインキュベート後、本サンプルの一定分量である５ｍｌが取り出され、最終濃度が２％（ｖ／ｖ）となるようにＴＷＥＥＮ ２０が添加された。このサンプルは１００℃で２分間加熱された後、冷却された。煮沸後のサンプルの一定分量である８０μｌが被覆マイクロタイタープレートの各ウェルに添加された。
【０１０４】
０．１４７ＭのＮａＣｌを含む０．０１Ｍのリン酸バッファ（ｐＨ７．４）中での濃度が１２５ｎｇ／ｍｌである２０μｌの抗サルモネラ菌抗体複合体が各ウェルに添加された（図２ａ（２），図２ｂ（２））。ウェルあたりの抗体の最終濃度は２５ｎｇ／ｍｌであった。競合サンプルＬＰＳ／コアオリゴ糖および抗体は、被覆ウェル中で３７℃で６０分間インキュベートされた。インキュベートに続き、プレートが洗浄バッファで３回洗浄され、検出の前に完全に乾燥させられた（図２ａ（３）、図２ｂ（３））。
【０１０５】
抗サルモネラ菌抗体がアクリジニウムエステルを用いて直接標識された場合、プレートは照度計中に配置された．３０μｌの誘因溶液Ａおよび６０μｌの誘因溶液Ｂがマイクロタイタープレートの各ウェルに添加されることにより、結合したアクリジニウムエステルから光出力が開始された（図２ａ（４））。照度計の設定は以下のとおりであった。
【０１０６】
遅延注入Ｐ（溶液Ａ用） − １．６秒
測定時間間隔１ − ０．０秒
遅延注入Ｍ（溶液Ｂ用） − ０．０秒
測定時間間隔２ − １．０秒
【０１０７】
誘因溶液Ａは、６３μｌの７０％（ｗ／ｗ）硝酸（ＨＮＯ３）と１６５μｌの３０％（ｖ／ｖ）Ｈ２Ｏ２とを全容積が１０ｍｌの蒸留水中に含んでいた。誘因溶液Ｂは、０．１ｇのＮａＯＨと７５ｍｇのＣＴＡＣとを全容積が１０ｍｌの蒸留水中に含んでいた。
【０１０８】
ヤギの抗マウスＩｇＧ２ｂアクリジニウム複合体の添加（抗サルモネラ菌モノクローナル抗体が結合しない場合）
抗サルモネラ菌抗体が標識されない場合、第２の結合分子であるヤギの抗マウスＩｇＧ２ｂ複合体が使用される。カラム処理後のＩｇＧ２ｂが３％（ｗ／ｖ）の無脂肪ミルク粉末および０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ ２０を含む希釈剤中に１：１００で希釈され、１００μｌのこの溶液がプレートの各ウェルに添加された（図２ｂ（４））。３７℃で６０分間のインキュベート後、プレートは洗浄バッファ中で４回洗浄され、乾燥され、上述のように読み取られた（図２ｂ（５））。
【実施例】
【０１０９】
（実施例１）サルモネラ菌を成長させるための培地の調製
図３は、０〜１６ｇ／Ｌの濃度のテトラチオン酸ナトリウムがサルモネラ菌アバディーン種、フレキシナ赤痢菌、ブドウ球菌アウレウス種および病原性大腸菌の成長に及ぼす影響を示す。０．１ｍｌの接種材料（１０３細胞／ｍｌ）が、０〜１６ｇ／Ｌのテトラチオン酸ナトリウムを含むトリプシン大豆培養液の入った１００ｍｌ三角フラスコに添加された。フラスコは３７℃で１８時間培養された。この後、Ａ６２０の値が測定された。各値は、３回の独立した実験の平均±標準偏差を表す。＊はｐ＜０．０５を示す。濃度が２〜１６ｇ／Ｌの場合、赤痢菌、ブドウ球菌および病原性大腸菌の成長が抑制された。一方、サルモネラ菌の成長は影響を受けないかまたは促進された。
【０１１０】
【表１】
【０１１１】
テトラチオン酸塩は、４ｇ／Ｌより高い濃度で病原性大腸菌の成長を阻害するだけでなく、８ｇ／Ｌの濃度ではサルモネラ菌の成長を明らかに増長する効果を有する。Ａ６２０は濁りを測定するため、この値が高くなるほど、細菌の成長が速いということに留意する。約１６ｇ／Ｌより高い濃度では、サルモネラ菌の成長は阻害される。
【０１１２】
図４は、ブリリアントグリーンに対する細菌の生育反応を示す。０．１ｍｌの接種材料（１０３細胞／ｍｌ）が、０．０５ｇ〜５ｇ／Ｌのブリリアントグリーンを含むトリプシン大豆培養液の入った１００ｍｌ三角フラスコに添加された。フラスコは３７℃で１８時間培養された。この後、Ａ６２０の値が測定された。各値は、３回の独立した実験の平均±標準偏差を表す。＊はｐ＜０．０５を示す。”はｐ＜０．０１を示す。
【０１１３】
【表２】
【０１１４】
比濁法による細菌数の尺度としてＡ６２０を採用した。＊ブリリアントグリーンの吸光度による高い吸光度値を示す。これらの濃度において、ブリリアントグリーン溶液に対して分光計をブランクにすることはできなかった。ブリリアントグリーンの濃度が０．３ｍｇ／Ｌ以上の場合、サルモネラ菌および病原性大腸菌の両方の成長が抑制された。しかし、０．１５ｍｇ／Ｌの濃度では、ブリリアントグリーンは病原性大腸菌に対しては阻害作用を示したが、サルモネラ菌に対しては示さなかった。
【０１１５】
（実施例２）赤痢菌を成長させるための培地の調製
図５は、クエン酸第二鉄アンモニウムに対する細菌の生育反応を示す。０．１ｍｌの接種材料（１０３細胞／ｍｌ）が、０．２５〜１．５ｇ／Ｌのクエン酸第二鉄アンモニウムを含むトリプシン大豆培養液の入った１００ｍｌ三角フラスコに添加された。フラスコは３７℃で１８時間インキュベートされた。この後、Ａ６２０が測定された。各値は、３回の独立した実験の平均±標準偏差を表す。＊はｐ＜０．０５を示す。クエン酸第二鉄アンモニウムの濃度が０．２５ｇ／Ｌ以上の場合、ブドウ球菌および病原性大腸菌の両方の成長が抑制される。
【０１１６】
図６は、クエン酸ナトリウムに対する細菌の生育反応を示す。０．１ｍｌの接種材料（１０３細胞／ｍｌ）が、５〜２５ｇ／Ｌのクエン酸ナトリウムを含むトリプシン大豆培養液の入った１００ｍｌ三角フラスコに添加された。フラスコは３７℃で１８時間培養された。この後、Ａ６２０が測定された。各値は、３回の独立した実験の平均±標準偏差を表す。＊はｐ＜０．０５を示す。クエン酸ナトリウムの濃度が５ｇ／Ｌ以上の場合、ブドウ球菌および病原性大腸菌の両方の成長が抑制された。クエン酸ナトリウムの濃度が１５ｇ／Ｌの場合、赤痢菌の生育反応はブドウ球菌および病原性大腸菌の生育反応に比べ、著しく増長された。
【０１１７】
（実施例３）ペプトン、トリプシン大豆培養液および改良トリプシン大豆液体培地中における異なる細菌の世代試験
赤痢菌の３つの株とサルモネラ菌アバディーン種、病原性大腸菌およびブドウ球菌アウレウス種を含む他の細菌とを、従来の液体培地培養液中で培養することにより、世代時間が調べられた。ペプトン（図７）、トリプシン大豆液体培地（ＴＳＢ）（図８）、改良トリプシン大豆培養液（ｍＴＳＢ）（図９）またはグラム陰性液体培地（図１０）のいずれかを含む１００ｍｌ三角フラスコに、０．１ｍｌの接種材料（１０３細胞／ｍｌ）が添加された。
【０１１８】
各フラスコは３７０Ｃで１８時間培養された。この後、生存細胞の数が栄養寒天培地上でドロッププレート法により決定された。かっこ内の値は世代時間である。各値は３回の独立した実験の平均±標準偏差を表す。＊はｐ＜０．０５を表す。倍増時間がペプトン、トリプシン大豆および改良トリプシン大豆培養液中で調べられた。グラム陰性液体培地中で培養された場合、フレキシナ赤痢菌、サルモネラ菌アバディーン種、病原性大腸菌およびブドウ球菌アウレウス種の世代時間は、それぞれ３６、５７、４１および４４分であった。
【０１１９】
すべての細菌の増殖速度がＴＳＢ中では増大した。その結果、赤痢菌が選択的に成長できるようにするために、従来の他の選択剤とともに、ＴＳＢが基礎成長培地として単独でまたは組み合わせて使用された。フレキシナ赤痢菌、サルモネラ菌アバディーン種、病原性大腸菌およびブドウ球菌アウレウス種の倍増時間は、ＴＳＢ中では４８、４６、２８および３３分であった。フレキシナ赤痢菌およびサルモネラ菌アバディーン種はｍＴＳＢ中では有意に速く成長した（ｐ＜０．０１）。一方、この基礎培養液中では、病原性大腸菌およびブドウ球菌アウレウス種は増殖するのにより長い時間がかかった。改良ＴＳＢ中で培養した場合、病原性大腸菌の増殖速度は６８分まで遅らせることができた。改良ＴＳＢ中では、フレキシナ赤痢菌の世代時間は４６分間にまで短縮することができた。
【０１２０】
（実施例４）リステリア菌を成長させるための培地の調製
塩化リチウムとナリジクス酸との組み合わせを含むリステリア菌の成長培地が調整された。０．１ｍｌの接種材料（１０３細胞／ｍｌ）が、以下のレシピの培地を含む１００ｍｌ三角フラスコに添加された：３．３％のＴＳＢＹＥ、０．５％酵母抽出物を含むトリプシン大豆培養液、２ｇ／ＬのＬｉＣｌ、２ｍｇ／Ｌのナリジクス酸、および２５０ｍｇ／Ｌのクエン酸第二鉄アンモニウム。フラスコは３７℃で２０時間培養された。この後、Ａ６２０の値が測定された（図１１）。各値は、３回の独立した実験の平均±標準偏差を表す。リステリア菌モノサイトゲネス種およびリステリア菌イノキュア種は、本培地中で効率的に成長できた。病原性大腸菌、アシドフィルス菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）およびブタ丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）の成長はすべて著しく阻害された。
【０１２１】
（実施例５）サルモネラ菌、赤痢菌またはリステリア菌を選択的に成長させるための培地の調製
上述のデータを利用して、以下のレシピに従って選択培地が調整された。
【０１２２】
サルモネラ菌１
・２％のペプトン
・０．１５ｍｇ／Ｌのブリリアントグリーン
・４〜８ｇ／Ｌのテトラチオン酸塩（すべての型）
【０１２３】
サルモネラ菌２
・３．３％（ｗ／ｖ）のｍＴＳＢ
・０．１５ｍｇ／ＬのＢＧ
・１ｇ／Ｌのクエン酸第二鉄アンモニウム
【０１２４】
赤痢菌１３．３％のｍＴＳＢ
・０．１ｍｇ／Ｌのブリリアントグリーン
・２５０ｍｇ／Ｌのクエン酸第二鉄アンモニウム
・１５ｇ／Ｌのトリクエン酸ナトリウム
【０１２５】
リステリア菌１ＴＳＢＹＥ−０．５％酵母抽出物を含有する３．３％トリプシン大豆培養液
・２ｇ／Ｌの塩化リチウム
・２ｍｇ／Ｌのナリジクス酸
・２５０ｍｇ／Ｌのクエン酸第二鉄アンモニウム
【０１２６】
（実施例６）免疫アッセイに使用するためにアクリジニウムエステルと結合させるための抗体および抗体フラグメントの調整
腹水からプロテインＡのクロマトグラフィーを用いて純粋なＩｇＧを調整し、次にＩｇＧを消化することによってＦａｂフラグメントを生じさせ、そのフラグメントまたは抗体全体をエステルに結合させ、続いて精製を行う任意のステップによって、抗体の改善された調製を行うことができる。代わりに、抗体の他のアイソタイプまたはアイソフォームを精製されていない状態で使用することもできる。
【０１２７】
プロテインＡ／Ｇの分離
（ｉ）バッファおよび溶液
・ＰＢＳ：０．１５ＭのＮａＣｌを含む０．１Ｍのリン酸バッファ（ｐＨ８）
・０．１Ｍのクエン酸酸性バッファ（ｐＨ６およびｐＨ４．５）：２９ｇの乾燥したクエン酸ナトリウムを８００ｍｌの蒸留水に溶解させる。それぞれｐＨが６および４．５となるまで１Ｍのクエン酸溶液（２１０ｇ／Ｌ）を添加する。１Ｌにメスアップする。
・０．１５ＭのＮａＣｌを含有する０．１Ｍの酢酸バッファ（ｐＨ３）：８００ｍｌの蒸留水に１Ｍの酢酸１００ｍｌと１．５ＭのＮａＣｌ１００ｍｌとを添加する。
３ＭのＮａＣｌを含有する１．５Ｍのグリシンバッファ（ｐＨ８．９）：１１２ｇのグリシンおよび１７４ｇのＮａＣｌを７００ｍｌの蒸留水に溶解させる。５Ｍの水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨを８．９に調整し、蒸留水を用いて１Ｌにメスアップする。
【０１２８】
（ｉｉ）手順
０．１Ｍのリン酸バッファ（ｐＨ８）中で３０分間、１．５ｇのプロテインＡ−セファロース（ＣＬ−４Ｂ、ファルマシア社）（プロテインＧも使用されてもよい）が膨張できるようにする（１．５ｇのビーズから５ｍｌのゲル得られる）。２０×２ｃｍのカラムをこのゲルで充填し、開始バッファでリンスする。開始バッファに対して透析した後、４０％（ｖ／ｖ）にて飽和状態の硫酸アンモニウムにより前もって脱脂しておいた腹水を１ｍｌ、カラムにアプライする。腹水が使用される場合、腹水の脱脂は１０００００ｇで４５分間遠心分離することにより行われる。形成されたあらゆるペレット、つまり浮かんだ「脂質」が捨てられる。Ａ２８０が０．０５０未満となるまで０．１Ｍのリン酸バッファ（ｐＨ８）を用いてカラムを洗浄する。クエン酸塩バッファ（ｐＨ６）を添加し、Ａ２８０が０．０５０未満となるまで洗浄する。引き続いてｐＨ４．５とｐＨ３のバッファを用いることにより、他の免疫グロブリンを同様にして溶出させる。０．０２％のアジ化ナトリウムを含むリン酸バッファ（ｐＨ８）を用いて中和させ、プロテインＡ−セファロースをこのバッファ中で保存する。溶出後、１Ｍのリン酸バッファ（ｐＨ８）を数滴用いて抗体を中和させ、ＰＢＳに対して透析させる。
【０１２９】
（ｉｉｉ）Ｆａｂフラグメントの調整
酵素消化が完全に進行することはない。そのため、パパインがＩｇＧに作用した場合、ＦａｂフラグメントおよびＦｃフラグメントに加え、１０％の未消化ＩｇＧが生じる。ＦａｂフラグメントとＦｃフラグメントは同一の分子量を有するため、分離するのが困難である。それらの精製を容易にするために、プロテインＡが使用される。最初のステップで抗体がパパインを用いて処理される。次に、その混合物がＩｇＧおよびＦａｂを分離するためにプロテインＡに通される。次に、ＳｅｐｈａｄｅｘまたはプロテインＡ−セファロースを用いたろ過によって、Ｆａｂフラグメントが未消化のＩｇＧから分離される。
【０１３０】
（材料）
・クロマトグラフィーカラム（２．５ｃｍ×８０ｃｍ）
・パパイン：ベーリンガー社製
・Ｌ−塩酸システイン：メルク社製
・ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）：メルク社製
・ヨードアセトアミド：メルク社製
【０１３１】
（バッファおよび溶液）
・リン酸塩−緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）
・０．１Ｍのリン酸バッファ（ｐＨ７．４）
・市販の原液から調整された１ｍｇ／ｍｌのパパイン溶液
・０．２ＭのＬ−システイン：３５ｍｇ／ｍｌの０．１Ｍリン酸バッファ（ｐＨ７．４）
・０．１ＭのＥＤＴＡ：３．６ｇのＥＤＴＡを１００ｍｌの０．２ＭのＮａＯＨ溶液に溶解させる。ＥＤＴＡはｐＨが約８の場合にのみ著しく溶解する。そのため、溶液のｐＨを調整してＥＤＴＡを完全に溶解させるために、１ＭのＮａＯＨを数滴添加する必要があるかもしれない。
・０．４Ｍのヨードアセトアミド：０．１Ｍのリン酸バッファ（ｐＨ７．４）中に７４ｍｇ／ｍｌの濃度
【０１３２】
（手順）
４０％（ｖ／ｖ）の飽和硫酸アンモニウム溶液とともに沈殿させることにより、免疫グロブリン画分が抗血清から調整された。免疫グロブリンはｐＨ７．４の０．１Ｍリン酸バッファに対して透析された。おおよそのタンパク濃度が決定された（ＩｇＧの１ｍｇ／ｍｌ溶液のＡ２８０の値は１．４である）。
【０１３３】
ＩｇＧの濃度を３０ｍｇ／ｍｌに調整し、２０ｍｇ／ｍｌのタンパク濃度を得るために必要な最終的な体積（Ｖ）が計算された。親和性の観点から、最終濃度が２．５ｍｇ／ｍｌの精製された抗体が使用された。最終的な体積（Ｖ）の１／２０量の０．０４ＭのＥＤＴＡが添加された（最終濃度：０．００２Ｍ）。次に、最終的な体積（Ｖ）の１／２０量の０．２ＭのＬ−システイン溶液が添加された（最終濃度：０．０１Ｍ）。１００ｍｇのグロブリンあたり１ｍｇのパパインとなるように、１ｍｇ／ｍｌのパパイン溶液が添加された。０．１Ｍのリン酸バッファ（ｐＨ７．４）を用いて体積がＶｍｌに調整された。反応は３７℃で２時間行われた。最終的な体積（Ｖ）の１／１０量の０．４Ｍのヨードアセトアミド溶液が添加された（最終濃度：０．０４Ｍ）。この状態で３０分間放置された。次に調整液がＰＢＳに対して４℃で一晩透析された。
【０１３４】
プロテインＡクロマトグラフィーにより、ＧｌｃＮＡｃ−Ｇｌｃ−Ｇａｌエピトープ（図１２）に結合するＩｇＧ抗体およびＦａｂフラグメントが単離された。Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００カラム（２．５×８０ｃｍ）上で混合物が分画され、ＰＢＳで平衡化された。第１のピークがＩｇＧに対応し、第２のピークがＦａｂフラグメントに対応した。Ｆａｂピークは５ｍｇ／ｍｌに濃縮された。
【０１３５】
（実施例７）抗体または抗体フラグメントとアクリジニウムエステルとの結合
ａ）調整
ｉ）（４−（２−スクシンイミドイルオキシカルボニルエチル）フェニル−１０−ジメチルアクリジニウム−９−カルボキシレートフルオロ硫酸などのアクリジニウムエステルが、綺麗な乾燥したホウケイ酸の瓶の中で秤量された。乾燥したジメチルホルムアミドが添加された（体積は使用可能なアクリジニウムエステルの量による）。また、その溶液が通常１瓶あたり５ｍｇの量で瓶の中に等分に分注された。
ｉｉ）０．５ｍｇのＩｇＧ／ｍｌの濃度で、抗体が０．２Ｍのリン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ８．０）に溶解される。
ｉｉｉ）５ｍｇのアクリジニウムエステル溶液を２００ｍｌの抗体溶液に加え、十分に攪拌する。
ｉｖ）室温で１５分間インキュベートする。次に、１０％（ｗ／ｖ）のリシン一塩酸塩を１００ｍｌ添加することにより、反応を停止させる。続いて室温にて暗所で５分間さらにインキュベートする。
ｖ）後述の（ｂ）に従って精製する。
【０１３６】
ｂ）複合体の精製
（ｉ）複合体を精製するためにゲルろ過カラムが使用されてもよい。
０．１４７ＭのＮａＣｌおよび０．５％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン（シグマ社）を含む０．１Ｍのリン酸バッファ（ｐＨ７．４）を用いて、１．６×１００ｃｍのＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２００カラム（ファルマシア社）が平衡化される。１．５ｍｌ以下の複合体がカラム上にアプライされ、１８時間かけて流速９ｍｌ／ｈで分離される。流出物がＡ２８０にてモニタされ、４５〜５５キロダルトンに対応するピークがＦａｂフラグメントとして集められ、１４０〜１７０キロダルトンに対応するピークが完全な抗体として集められる。この完全な抗体が複合体であり、複合体は使用前に使用される濃度に希釈される必要がある。
【０１３７】
（ｉｉ）好ましい代替的な手順では、ＦＰＬＣが使用される。複合体はＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ＨＲ １０／３０カラム（ファルマシア社）を用いて精製される。０．００７ｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液５０ｍｌが複合体に添加される（複合体のＢＳＡ濃度が溶出バッファのＢＳＡ濃度にまで高められる）。
【０１３８】
サンプルをアプライする前に、カラムの容積の２倍量（５０ｍｌ）の溶出バッファでカラムが平衡化される。次に、複合体溶液を１００００ｇにて１０分間遠心することにより、あらゆる粒子状物質が除去される。そしてＦＰＬＣカラムにアプライされる。０．５ｍｌ／分の流速で溶出バッファおよび保存バッファ中で、抗体がカラムから溶出される。最初の５ｍｌがカラムを通過した後、０．５ｍｌの画分が収集される。
【０１３９】
紫外線（ＵＶ）モニタを使用することによって、抗体の存在が検出される。抗体ピークをカバーする画分が収集され、発光活性が解析される（通常は画分１６〜２１である）。
【０１４０】
（発光活性のチェック）
抗体画分が生理食塩水と各画分のアッセイ用プレートのウェルにスポットされたサンプル５μｌにより１：５００で希釈される。次にその画分の発光活性が、活性化試薬１および２との反応によってテストされる。最初に１５μｌの活性化試薬１がサンプルウェルに添加され、続いて３０μｌの活性化試薬２が添加される。これは、照度計中における自動注入により通常行われる。次に、問題としているウェルから発せられる光の放出を計測するために、照度計が動かされる。その結果が、各サンプルとも複数回繰り返して記録される。次に、高強度の発光活性を有するサンプルを、微生物アッセイ、この例ではサルモネラ菌アッセイにおいて確認することができる。
【０１４１】
（実施例８）ＡＭＰＰＤとアルカリホスファターゼが結合した抗サルモネラ菌抗体の使用
十分な発光シグナルを生成するために、免疫アッセイで使用される酵素アルカリホスファターゼおよび基質ＡＭＰＰＤに抗体を結合させてもよい。ＡＭＰＰＤは、３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３”−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキシエタン；３−（４−メトキシスピロ（１，２−ジオキシエタン−３，２’−トリシクロ（３．３．１．１（３，７））デカン）−４−ｙｌ）フェニルリン酸塩である。この基質用の希釈剤は、０．９ｇのＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウム臭化物）、１．９ｍｌのＡＭＰ（２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール）、１４．５ｍｇの塩化マグネシウム６水和物を、１ｍＭ、ｐＨ９．６となるように１００ｍｌの蒸留水で調整した水溶液である。
【０１４２】
（試薬）
洗浄バッファ
・０．２ＭのＴｒｉｓ（２４．２２８ｇ／Ｌ）、０．２ＭのＮａＣｌ（１１．６８８ｇ／Ｌ）および０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ（０．５ｍｌ／Ｌ）
・２４．２２８ｇのＴｒｉｓと１１．６８８ｇのＮａＣｌを９００ｍｌの蒸留水に溶解させる。０．５ｍｌのＴｗｅｅｎ ２０を添加する。ＨＣｌを用いてｐＨを７．４に調整し、１Ｌにメスアップし、室温で保存する。
・１０×洗浄バッファ濃縮液（防腐剤アジ化ナトリウムを含む）
・２ＭのＴｒｉｓ（２４．２２８ｇ／１００ｍｌ）、２ＭのＮａＣｌ（１１．６８８ｇ／１００ｍｌ）および０．５％のＴｗｅｅｎ （０．５ｍｌ／１００ｍｌ）：２４．２２８ｇのＴｒｉｓおよび１１．６８８ｇのＮａＣｌを８０ｍｌの蒸留水に溶解させる。０．５ｍｌのＴｗｅｅｎ ２０を添加し、濃縮ＨＣｌを用いてｐＨを７．４に調整する。蒸留水で１００ｍｌにメスアップし、室温で保存する。洗浄バッファに戻すためには、１００ｍｌの濃縮液を９００ｍｌの蒸留水に添加し、室温で保存する。
【０１４３】
溶出用バッファおよび保存用バッファ
・０．１５ＭのＮａＣｌ、０．１％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．０５％のＮａＮ３を含む０．１Ｍのリン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ６．３）
・０．１ＭのＮａＨ２ＰＯ４と０．１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡを含む０．１５ＭのＮａＣｌとの溶液（Ａ）と、０．１ＭのＮａ２ＨＰＯ４と０．１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡを含む０．１５ＭのＮａＣｌとの溶液（Ｂ）を作る。１００ｍｌのＡを５０ｍｌのＢに添加する。０．０５％のＮａＮ３を添加し、０．２２ｍＭのフィルタに通し、４℃で保存する。
【０１４４】
アッセイ用バッファ
・０．１％（ｗ／ｖ）のＮａＮ３と０．２５％（ｗ／ｖ）のＢＳＡとを含む０．０１ＭのＮａＨ２ＰＯ４（１．２ｇ／Ｌ）および０．１５ＭのＮａＣｌ（８．７５ｇ／Ｌ）の溶液
・１．２ｇのＮａＨ２ＰＯ４と８．７５ｇのＮａＣｌとを９００ｍｌの蒸留水に溶解させる。１．０ｇのＮａＮ３と２．５ｇのＢＳＡとを添加する。完全に溶解させ、１．０ＭのＮａＯＨを用いてｐＨを７．４に調整する。蒸留水を用いて１０００ｍｌにメスアップする。０．２２μＭのフィルタに通し、４℃で保存する。
【０１４５】
洗浄剤溶液
２０％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ溶液：５ｇのＳＤＳを２５ｍｌの蒸留水中に溶解させる。室温で保存する。
【０１４６】
成長促進剤
８ｇのテトラチオン酸ナトリウムと０．１５ｍｇのブリリアントグリーンとを１Ｌの滅菌ペプトン液体培地に添加する。均一に混合されるまで穏やかに攪拌する。
【０１４７】
活性化試薬１（１Ｌ）
６．３ｍｌの７０％硝酸、１６．５ｍｌの３０％過酸化水素、および９７７ｍｌの蒸留水。
【０１４８】
活性化試薬２（１Ｌ）
１０．０ｇのＮａＯＨ、７．５ｍｌのセチルトリメチルアンモニウムクロライド、および９８３ｍｌの蒸留水。
【０１４９】
（サルモネラ菌結合用の試験画分）
アッセイ用プレートのウェルは、標準濃度の細菌によって３７℃で１時間被覆される。これらの標準濃度は、１０６、１０５、５×１０４、２．５×１０４、１０４および５×１０３ならびに１０６の病原性大腸菌を含むブランクのウェルである。試験される画分は、アッセイバッファ中で１：１００に希釈され、５０ｍｌが各ウェルに添加され、３７℃で２０分間インキュベートされる。次に各ウェルが照度計上で上述のように計測される。アッセイにおいて高い結合を示した画分がプールされる。プールされた複合体に対する最適な希釈は、通常１：１００〜１：１０００である。
【０１５０】
（直接結合サルモネラ菌アッセイにおける洗浄剤の影響）
洗浄剤であるドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いて、新しい黒白プレート（Ｗａｌｌａｃ社）がチューブ照度計（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ ＬＢ９５０９）によって読み取られる。
【０１５１】
【表３】
【０１５２】
【表４】
【０１５３】
【表５】
【０１５４】
白色プレート（Ｗａｌｌａｃ社）、ルーシー１プレート照度計を用いた読み取り（複合体を１：１００で希釈）
【０１５５】
【表６】
【０１５６】
【表７】
【０１５７】
黒白プレートを用いた直接結合サルモネラ菌アッセイにおける様々な濃度のＳＤＳの影響（複合体を１：１００で希釈）
【０１５８】
【表８】
【０１５９】
【表９】
【０１６０】
黒白プレートを用いた競合結合サルモネラ菌アッセイにおける様々な濃度のＴＷＥＥＮ ２０の影響（複合体を１：１００で希釈）
【０１６１】
【表１０】
【０１６２】
１：１００に希釈した抗２ｂ複合体を用いた抗サルモネラ菌モノクローナル抗体のインキュベート時間の影響
最適なインキュベート時間を決定するために、サルモネラ菌またはリステリア菌のいずれかとともにモノクローナル抗体（１：１００に希釈）がインキュベートされた。
【０１６３】
【表１１】
【０１６４】
１：２００に希釈した抗２ｂ複合体を用いた抗サルモネラ菌モノクローナル抗体のインキュベート時間の影響
最適なインキュベート時間を決定するために、サルモネラ菌またはリステリア菌のいずれかとともにモノクローナル抗体（１：２００に希釈）がインキュベートされた。
【０１６５】
【表１２】
【０１６６】
食品培養物に対するＳＤＳ濃度の影響
【０１６７】
【表１３】
【０１６８】
コアオリゴ糖の放出および検出における異なる洗浄剤の影響
【０１６９】
【表１４】
【０１７０】
ＳＤＳは、食品サンプルを用いたサルモネラ菌ＬＰＳのモノマーへの分解において最も信頼性および再現性のある結果をもたらす。しかし、競合アッセイではこの目的にはＴＷＥＥＮのみが使用可能である。それは、タンパク質−洗浄剤が他の洗浄剤と相互作用するからである。
【０１７１】
競合アッセイのサルモネラ菌の検出における様々な抗サルモネラ菌抗体の濃度の影響
【０１７２】
【表１５】
【０１７３】
（参考文献）
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Ｒｅｉｓｓｂｒｏｄｔ，Ｒ．，Ｒｉｅｎａｅｃｋｅｒ，Ｉ．，Ｒｏｍａｎｏｖａ，Ｊ．Ｍ．，Ｆｒｅｅｓｔｏｎｅ，Ｐ．Ｐ．Ｅ．，Ｈａｉｇｈ，Ｒ．Ｄ．，Ｌｙｔｅ，Ｍ．，Ｔｓｃｈａｐｅ，Ｈ．およびＷｉｌｌｉａｍｓ，Ｐ．Ｈ．（２００２年）“Ｒｅｓｕｓｃｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ａｎｄ ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｖｉａｂｌｅ ｂｕｔ ｎｏｎｃｕｌｔｕｒａｂｌｅ ｓｔａｔｅ ｂｙ ｈｅａｔ ｓｔａｂｌｅ ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｕｔｏｉｎｄｕｃｅｒ．”Ａｐｐ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．第６８巻（第１０号）：第４７８８〜４７９４頁。
Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，Ｐ．Ｊ．，Ｄｒｕｇｇａｎ，Ｐ．およびＮｅｂｅ−ｖｏｎ Ｃａｒｏｎ，Ｇ．（２０００年）“Ｓｔｒｅｓｓｅｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ａｒｅ ｅｘｐｏｓｅｄ ｔｏ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ｆｒｏｍ ｔｗｏ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｏｕｒｃｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｉｎ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ．”Ｉｎｔ．Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．第６０巻：第２６９〜２８５頁。
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ペプトン、トリプシン大豆培養液、酵母を含むトリプシン大豆培養液、および改良トリプシン大豆培養液から構成される群から選択される基礎培養液と、
（ｉｉ）ブリリアントグリーン、ナリジクス酸および塩化リチウムから構成される群から選択される少なくとも１つの増殖抑制剤と、
（ｉｉｉ）任意成分として、テトラチオン酸ナトリウム、クエン酸第二鉄アンモニウムおよびクエン酸ナトリウムから構成される群から選択される少なくとも１つの成長促進物質と、から実質的に構成されることを特徴とする少なくとも１つの微生物を成長させるための培地。
【請求項２】
増殖抑制剤は、約０．０５〜約０．２５ｍｇ／Ｌのブリリアントグリーンであることを特徴とする請求項１に記載の培地。
【請求項３】
増殖抑制剤は、約１〜３ｍｇ／Ｌのナリジクス酸および約１〜約３ｇ／Ｌの塩化リチウムであることを特徴とする請求項１に記載の培地。
【請求項４】
成長促進物質を含む培地であって、
成長促進物質は約４〜約１２ｇ／Ｌのテトラチオン酸ナトリウムであることを特徴とする請求項１または２に記載の培地。
【請求項５】
成長促進物質を含む培地であって、
成長促進物質は約２００〜３００ｍｇ／Ｌのクエン酸第二鉄アンモニウムであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の培地。
【請求項６】
成長促進物質であるクエン酸ナトリウムを、約１０〜２０ｇ／Ｌ、より具体的には約１５ｇ／Ｌの量、さらに含むことを特徴とする請求項７または８に記載の培地。
【請求項７】
少なくとも１つの微生物がサルモネラ菌種であることを特徴とする請求項１、２または４のいずれか１項に記載の培地。
【請求項８】
少なくとも１つの微生物が赤痢菌種であることを特徴とする請求項１、２、５または６のいずれか１項に記載の培地。
【請求項９】
少なくとも１つの微生物がリステリア菌種であることを特徴とする請求項１、３または５のいずれか１項に記載の培地。
【請求項１０】
（ｉ）試験サンプルを培地中で培養することにより、目的とする微生物の増殖を可能とするステップと、
（ｉｉ）試験サンプル中に存在する任意の微生物から１つ以上のコアオリゴ糖を放出するのに十分な程度に、試験サンプルを処理するステップと、
（ｉｉｉ）目的とする微生物のコアオリゴ糖に対する結合特異性を有する少なくとも１つの結合分子に、試験サンプルを接触させるステップと、
（ｉｖ）少なくとも１つの結合分子と目的とする微生物のコアオリゴ糖との任意の結合を検出するステップと、を含むことを特徴とする試験サンプル中における目的とする微生物の存在または不存在を検出するためのアッセイ方法。
【請求項１１】
ステップ（ｉｉ）は、
（ａ）洗浄剤を前記目的とする微生物を含む試験サンプルに添加することにより、洗浄剤−培養液を供給するステップと、
（ｂ）コアオリゴ糖を放出するのに十分な温度にまで洗浄剤−培養液を加熱するステップと、を含むことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
洗浄剤は、ドデシル硫酸ナトリウム、ＴＷＥＥＮ ２０、ＴＷＥＥＮ ４０、ＴＷＥＥＮ ６０またはＴＷＥＥＮ ８０であることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｉ）が請求項１〜９のいずれか１項に記載の培地を用いて実行されることを特徴とする請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ｉｖ）が発光シグナルの検出によることを特徴とする請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
発光シグナルがアクリジニウムエステルによって生成されることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
（ｉ）微生物を含む少なくとも１つの培養サンプルに洗浄剤を添加することにより、洗浄剤−培養液を供給するステップと、
（ｉｉ）コアオリゴ糖を放出するのに十分な温度にまで洗浄剤−培養液を加熱するステップと、を含むことを特徴とする微生物の細胞からコアオリゴ糖を放出する方法。
【請求項１７】
洗浄剤がドデシル硫酸ナトリウム、ＴＷＥＥＮ ２０、ＴＷＥＥＮ ４０、ＴＷＥＥＮ ６０またはＴＷＥＥＮ ８０であることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１６の方法において、実質的にドデシル硫酸ナトリウム、ＴＷＥＥＮ ２０、ＴＷＥＥＮ ４０、ＴＷＥＥＮ ６０またはＴＷＥＥＮ ８０から構成される溶液の使用。
【請求項１９】
サルモネラ菌、赤痢菌およびリステリア菌から構成される群から選択される微生物を特異的に検出するための、コアオリゴ糖に対する結合特異性を有する結合分子の使用。
【請求項２０】
少なくとも１つの細菌、特にサルモネラ菌、赤痢菌またはリステリア菌を成長させるための請求項１〜９のいずれか１項に記載の培地の使用。
【請求項２１】
コアオリゴ糖が以下のエピトープを有することを特徴とする請求項１０〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【化１】
【請求項１】
（ｉ）ペプトン、トリプシン大豆培養液、酵母を含むトリプシン大豆培養液、および改良トリプシン大豆培養液から構成される群から選択される基礎培養液と、
（ｉｉ）ブリリアントグリーン、ナリジクス酸および塩化リチウムから構成される群から選択される少なくとも１つの増殖抑制剤と、
（ｉｉｉ）任意成分として、テトラチオン酸ナトリウム、クエン酸第二鉄アンモニウムおよびクエン酸ナトリウムから構成される群から選択される少なくとも１つの成長促進物質と、から実質的に構成されることを特徴とする少なくとも１つの微生物を成長させるための培地。
【請求項２】
増殖抑制剤は、約０．０５〜約０．２５ｍｇ／Ｌのブリリアントグリーンであることを特徴とする請求項１に記載の培地。
【請求項３】
増殖抑制剤は、約１〜３ｍｇ／Ｌのナリジクス酸および約１〜約３ｇ／Ｌの塩化リチウムであることを特徴とする請求項１に記載の培地。
【請求項４】
成長促進物質を含む培地であって、
成長促進物質は約４〜約１２ｇ／Ｌのテトラチオン酸ナトリウムであることを特徴とする請求項１または２に記載の培地。
【請求項５】
成長促進物質を含む培地であって、
成長促進物質は約２００〜３００ｍｇ／Ｌのクエン酸第二鉄アンモニウムであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の培地。
【請求項６】
成長促進物質であるクエン酸ナトリウムを、約１０〜２０ｇ／Ｌ、より具体的には約１５ｇ／Ｌの量、さらに含むことを特徴とする請求項７または８に記載の培地。
【請求項７】
少なくとも１つの微生物がサルモネラ菌種であることを特徴とする請求項１、２または４のいずれか１項に記載の培地。
【請求項８】
少なくとも１つの微生物が赤痢菌種であることを特徴とする請求項１、２、５または６のいずれか１項に記載の培地。
【請求項９】
少なくとも１つの微生物がリステリア菌種であることを特徴とする請求項１、３または５のいずれか１項に記載の培地。
【請求項１０】
（ｉ）試験サンプルを培地中で培養することにより、目的とする微生物の増殖を可能とするステップと、
（ｉｉ）試験サンプル中に存在する任意の微生物から１つ以上のコアオリゴ糖を放出するのに十分な程度に、試験サンプルを処理するステップと、
（ｉｉｉ）目的とする微生物のコアオリゴ糖に対する結合特異性を有する少なくとも１つの結合分子に、試験サンプルを接触させるステップと、
（ｉｖ）少なくとも１つの結合分子と目的とする微生物のコアオリゴ糖との任意の結合を検出するステップと、を含むことを特徴とする試験サンプル中における目的とする微生物の存在または不存在を検出するためのアッセイ方法。
【請求項１１】
ステップ（ｉｉ）は、
（ａ）洗浄剤を前記目的とする微生物を含む試験サンプルに添加することにより、洗浄剤−培養液を供給するステップと、
（ｂ）コアオリゴ糖を放出するのに十分な温度にまで洗浄剤−培養液を加熱するステップと、を含むことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
洗浄剤は、ドデシル硫酸ナトリウム、ＴＷＥＥＮ ２０、ＴＷＥＥＮ ４０、ＴＷＥＥＮ ６０またはＴＷＥＥＮ ８０であることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｉ）が請求項１〜９のいずれか１項に記載の培地を用いて実行されることを特徴とする請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ｉｖ）が発光シグナルの検出によることを特徴とする請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
発光シグナルがアクリジニウムエステルによって生成されることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
（ｉ）微生物を含む少なくとも１つの培養サンプルに洗浄剤を添加することにより、洗浄剤−培養液を供給するステップと、
（ｉｉ）コアオリゴ糖を放出するのに十分な温度にまで洗浄剤−培養液を加熱するステップと、を含むことを特徴とする微生物の細胞からコアオリゴ糖を放出する方法。
【請求項１７】
洗浄剤がドデシル硫酸ナトリウム、ＴＷＥＥＮ ２０、ＴＷＥＥＮ ４０、ＴＷＥＥＮ ６０またはＴＷＥＥＮ ８０であることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１６の方法において、実質的にドデシル硫酸ナトリウム、ＴＷＥＥＮ ２０、ＴＷＥＥＮ ４０、ＴＷＥＥＮ ６０またはＴＷＥＥＮ ８０から構成される溶液の使用。
【請求項１９】
サルモネラ菌、赤痢菌およびリステリア菌から構成される群から選択される微生物を特異的に検出するための、コアオリゴ糖に対する結合特異性を有する結合分子の使用。
【請求項２０】
少なくとも１つの細菌、特にサルモネラ菌、赤痢菌またはリステリア菌を成長させるための請求項１〜９のいずれか１項に記載の培地の使用。
【請求項２１】
コアオリゴ糖が以下のエピトープを有することを特徴とする請求項１０〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【化１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２（ａ）】
【図１２（ｂ）】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２（ａ）】
【図１２（ｂ）】
【公表番号】特表２０１２−５０１６６８（Ｐ２０１２−５０１６６８Ａ）
【公表日】平成２４年１月２６日（２０１２．１．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５２６５７０（Ｐ２０１１−５２６５７０）
【出願日】平成２１年９月１０日（２００９．９．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００９／０５１１６１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０２９３６０
【国際公開日】平成２２年３月１８日（２０１０．３．１８）
【出願人】（５１１０６３５７２）ソルス サイエンティフィック ソリューションズ リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１月２６日（２０１２．１．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月１０日（２００９．９．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００９／０５１１６１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０２９３６０
【国際公開日】平成２２年３月１８日（２０１０．３．１８）
【出願人】（５１１０６３５７２）ソルス サイエンティフィック ソリューションズ リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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