癌の分類および使用法
本発明は、チロシンキナーゼまたはリン酸化型チロシンキナーゼの有無またはレベルに基づいて癌細胞を分類する方法に関する。また、本発明は、癌の分類を用いて癌を治療する方法にも関する。さらに、本発明は、癌の分類を用いて癌に対する治療の有効性を判定する方法にも関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チロシンキナーゼまたはリン酸化型チロシンキナーゼの有無またはレベルに基づいて癌細胞を分類する方法に関する。また、本発明は、癌の分類を用いて癌を治療する方法にも関する。本発明はさらに、癌の分類を用いて癌の治療の有効性を判定する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
肺癌は、現在世界中で、癌死の主要な原因となっている。何十年もの集中的な解析にもかかわらず、肺癌発症の原因となる役割を果たしている分子的な異常の大多数は未知のままである。肺癌で重要な発癌遺伝子には、Ｋ−ＲＡＳおよびＥＧＦＲの２つがあり、ＮＳＣＬＣ患者の１５％および１０％においてこれらに変異が生じている。大規模なＤＮＡ配列決定の試みにより、ＰＩ３ＫＣＡ、ＥＲＢＢ２、およびＢ−ＲＡＦの変異が確認されており、これは、合わせてさらに５％のＮＳＣＬＣ患者に相当する（Greenman, C.,
Stephens, P., Smith, R., Dalgliesh, G. L., Hunter, C., Bignell, G., Davies, H.,
Teague, J., Butler,
A., Stevens, C.ら（2007）Patterns of
somatic mutation in human cancer genomes. Nature 446, 153-158；Thomas, R.K., Baker, A.C., Debiasi, R.M., Winckler, W., Laframboise,
T., Lin, W.M., Wang, M., Feng, W., Zander, T., Macconnaill, L. E.ら（2007）High-throughput oncogene mutation profiling
in human cancer. Nat. Genet. 39, 347-351）。ＣＧＨアレイおよびＳＮＰアレイを用いた、増幅および欠失を含む再発性の染色体異常の解析により、癌において変化している多数のさらなる遺伝子が特定される見込みが出てきている（Chin, K., DeVries, S., Fridlyand, J., Spellman, P.T., Roydasgupta, R.,
Kuo, W. L., Lapuk, A., Neve, R.M., Qian, Z., Ryder, T.ら（2006）Genomic and transcriptional aberrations linked to breast cancer
pathophysiologies. Cancer Cell 10, 529-541；Neve, R.M.,
Chin, K., Fridlyand, J., Yeh, J., Baehner, F. L., Fevr, T., Clark, L., Bayani, N.,
Coppe, J.P., Tong, F.ら（2006）A
collection of breast cancer cell lines for the study of functionally distinct
cancer subtypes. Cancer Cell 10, 515-527)。しかし、遺伝学的なアプローチでは、ゲノム不安定性に関連した多くの変化の中で、原因となるわずかな変化を特定するのは困難である。したがって、疾患を引き起こしている鍵となる損傷に焦点を当てた方法が必要とされている。
【０００３】
このような一戦略には、癌における間違った細胞のシグナル伝達経路の解析が含まれる（Vogelstein, B.およびKinzler, K. W.（2004）Cancer
genes and the pathways they control. Nat. Med. 10, 789-799)。チロシンキナーゼを介したシグナル伝達は、癌において無秩序であることが多く、これは、多細胞生物においてこれらの酵素が多くの増殖および生存のシグナル伝達を媒介しているためである（Blume-Jensen, P.およびHunter, T.（2001）Oncogenic kinase signalling. Nature 411,
355-365)。近年、癌の治療において、選択的なチロシンキナーゼの阻害剤による成功が示されてきている。しかし、この成功は、活性化したキナーゼによって引き起こされる腫瘍の特定によるものであって、したがって、腫瘍の生存および臨床的な有用性は、標的とするキナーゼによって決まる（Dowell, J. E.およびMinna, J. D.（2005）Chasing
mutations in the epidermal growth factor in lung cancer. N. Engl. J. Med. 352,
830-832; Weinstein, I. B.（2002）Cancer. Addiction to oncogenes-the Achilles
heal of cancer. Science 297, 63-64）。したがって、疾患の惹起および進行における活性化チロシンキナーゼを特定する方法が必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
異常なチロシンキナーゼに基づいて癌細胞を分類できることが見出されている。このような分類は、癌を治療する際および癌の治療の有効性を判定する際に有用である。
【０００５】
したがって、本発明は、少なくとも１つのシグナル伝達経路にある１種または複数種のチロシンキナーゼの有無またはレベルに基づいて、試料中の癌細胞を分類する方法を提供する。また、本発明は、少なくとも１つのシグナル伝達経路にある１種または複数種のリン酸化型チロシンキナーゼの有無またはレベルに基づいて、癌細胞を分類する方法も提供する。
【０００６】
さらに、本発明は、少なくとも１つのシグナル伝達経路にある１種または複数種の異常に発現したチロシンキナーゼのレベルに基づいて癌細胞を分類し、その分類に基づいて有効量の１種または複数種のチロシンキナーゼ阻害剤を投与することによって、対象者の癌を治療する方法を提供する。また、本発明は、少なくとも１つのシグナル伝達経路にある１種または複数種の異常にリン酸化されたチロシンキナーゼのレベルに基づいて癌細胞を分類し、その分類に基づいて有効量の１種または複数種のチロシンキナーゼ阻害剤を投与することによって、癌を治療する方法も提供する。
【０００７】
さらに、本発明は、１種または複数種のチロシンキナーゼの有無またはレベルが治療の有効性と相関している場合に、試料中の少なくとも１つのシグナル伝達経路にある１種または複数種のチロシンキナーゼの有無またはレベルを検出することに基づいて、対象者における癌治療の有効性を判定する方法を提供する。また、本発明は、１種または複数種のチロシンキナーゼの有無またはレベルが治療の有効性と相関している場合に、試料中の少なくとも１つのシグナル伝達経路にある１種または複数種のリン酸化型チロシンキナーゼの有無またはレベルを検出することに基づいて、癌治療の有効性を判定する方法も提供する。
【０００８】
いくつかの実施形態では、１つまたは複数のＦＩＳＨ、ＩＨＣ、ＰＣＲ、ＭＳ、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、またはＥＬＩＳＡを用いて、１種または複数種のチロシンキナーゼの有無またはレベルを測定する。
【０００９】
いくつかの実施形態では、リン酸化ペプチドを免疫沈降して、免疫沈降したリン酸化ペプチドを解析することによって、１種または複数種のリン酸化型チロシンキナーゼの有無またはレベルを測定する。
【００１０】
いくつかの実施形態では、チロシンキナーゼは、ＥＧＦＲ、ＦＡＫ、Ｓｒｃ、ＡＬＫ、ＰＤＧＦＲａ、Ｅｒｂ２、ＲＯＳ、ｃＭｅｔ、Ａｘｌ，ｅｐｈＡ２、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、またはＦＧＦＲから選択される。
【００１１】
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の統計的な方法を用いて、癌細胞を分類する。この実施形態のいくつかの態様では、この統計的な方法は教師なしピアソンクラスタ分析である。
【００１２】
いくつかの実施形態では、癌細胞を、１種または２種のみの高度にリン酸化されたチロシンキナーゼを有するものとして分類する。他の実施形態では、癌細胞を、リン酸化型のＦａｋ、Ｓｒｃ、Ａｂｌ、ならびにＥＧＦＲ、ＡＬＫ、ＰＤＧＦＲａ、Ｅｒｂ２、ＲＯＳ、ｃＭｅｔ、Ａｘｌ、ｅｐｈＡ２、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＦＧＦＲ、ＶＥＧＲ−２、ＩＧＦＲ１、ＬＹＮ、ＨＣＫ、ＨＥＲ２、ＩＲＳ１、ＩＲＳ２、ＢＲＫ、ＥｐｈＢ４、ＦＧＦＲ１、ＥｒｂＢ３、ＶＥＧＦＲ−１、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ５、Ｔｙｒｏ３、ＥｐｈＢ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＢ３、Ｍｅｒ、ＥｐｈＢ４、およびＫｉｔからなる群から選択される少なくとも１つの受容体チロシンキナーゼを発現しているものとして分類する。他の実施形態では、癌細胞を、リン酸化型のＤＤＲ１、Ｓｒｃ、およびＡｂｌを発現しているものとして分類する。他の実施形態では、癌細胞を、リン酸化型のＳｒｃならびにＥＧＦＲ、ＡＬＫ、ＰＤＧＦＲａ、Ｅｒｂ２、ＲＯＳ、ｃＭｅｔ、Ａｘｌ、ｅｐｈＡ２、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＦＧＦＲ、ＶＥＧＲ−２、ＩＧＦＲ１、ＬＹＮ、ＨＣＫ、ＨＥＲ２、ＩＲＳ１、ＩＲＳ２、 ＢＲＫ、ＥｐｈＢ４、ＦＧＦＲ１、ＥｒｂＢ３、ＶＥＧＦＲ−１、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ１、 ＥｐｈＡ５、Ｔｙｒｏ３、ＥｐｈＢ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＢ３、Ｍｅｒ、ＥｐｈＢ４、およびＫｉｔからなる群から選択される少なくとも１つの受容体チロシンキナーゼを発現しているものとして分類する。他の実施形態では、癌細胞を、リン酸化型のＳｒｃおよびＡｂｌを発現しているものとして分類する。
【００１３】
他の実施形態では、癌細胞は肺癌、血液癌、前立腺癌、乳癌、または消化管の腫瘍に由来する癌細胞である。いくつかの実施形態では、これらの方法を、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を分類するために用いる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１Ａは、高度、中程度、および低度のリン酸化チロシンの発現を示した、パラフィン包埋したヒト非小細胞肺癌腫瘍組織のＩＨＣ染色の顕微鏡写真である。図１Ｂは、異なるパターンのリン酸化チロシン反応性を示す２２種の異なる非小細胞肺癌細胞株におけるリン酸化チロシンのシグナル伝達を示したウエスタンブロットである。図１Ｃは、免疫親和性のプロファイリング法の実施形態を示した略図である。細胞または組織を尿素緩衝液に溶解し、タンパク質分解酵素で消化する。結果として生じたペプチドを、固定化リン酸化チロシン特異的抗体（Ｐ−Ｔｙｒ−１００）を用いて免疫親和性精製し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで解析する。より大きな液体クロマトグラフィーのピークは小さなピークよりも多く抽出されるため、特定のタンパク質に割り当てられた観測スペクトル数は、このタンパク質の存在量の半定量的測定である。図１Ｄは、ＮＳＣＬＣ細胞株でＭｅｔおよびリン酸化型Ｍｅｔ（Ｔｙｒ１２３４／５）の発現を示したウエスタンブロットである。免疫ブロットとＭＳ／ＭＳで同定したリン酸化ペプチド数の比較を下に示している。同定した異なる部位数を括弧内に示している。
【図２】図２Ａは、リン酸化タンパク質の種類の分布を示した円グラフである。観測した各リン酸化タンパク質をPhosphoSiteの概念体系からタンパク質の区分に割り当てた。各区分にある固有のタンパク質の数は、全体の一部分として円グラフの楔型で表されている。図２Ｂは、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）間のスペクトル数の分布を示した円グラフである。細胞株（上）または腫瘍（下）のすべてにわたる各ＲＴＫに割り当てた観測スペクトルの総数を、観測された総ＲＴＫスペクトルの割合として表している。図２Ｃは、非受容体チロシンキナーゼのスペクトル数の分布を示した円グラフである。細胞株（上）または腫瘍（下）のすべてにわたる各ＴＫ（非受容体）に割り当てた観測スペクトルの総数を、観測された総ＴＫ（非受容体）スペクトルの割合として表している。図２Ｄおよび図２Ｅは、肺癌細胞株でのチロシンキナーゼのリン酸化を示したグラフである。各細胞株での各ＴＫに割り当てられた観測スペクトルの総数を、ピアソン相関の距離メトリックおよび平均連結法を使用したクラスタ分析の基盤として使用した。図２Ｄでは、標準化を適用していない。図２Ｅにおいて、行列にある各値は行平均を差し引いたものである。
【図３】図３Ａは、チロシンリン酸化による腫瘍のクラスタ分析を示したグラフである。患者の腫瘍にあるチロシンキナーゼのスペクトル数をＧＳＫ３βに対する数値に標準化し、次いで、図２Ｅに記載のようにクラスタ分析を行った。クラスタ分析によって、異なる組の優勢なチロシンキナーゼを含む腫瘍の群が５つ生じた。図３Ｂ〜図３Ｄは、異なる腫瘍群において選択された非キナーゼタンパク質のリン酸化を示したグラフである。腫瘍試料を図３Ａでのクラスタ分析によって定められた群に配分し、スペクトル数をＧＳＫ３βに対する数値に標準化した。タンパク質群からすべてのキナーゼを除去した後に、図２Ｅのようにデータをクラスタ化し、上位３０タンパク質を表示した。図３Ｂで用いた腫瘍は図３Ａの第１群由来であり、図３Ｃのものは第２群由来であり、図３Ｄのものは第４群由来である。図３Ｅ〜図３Ｇは、最も顕著なリン酸化タンパク質を示したグラフである。スペクトル数に基づいてタンパク質をランク付けして、上位２５を示している。腫瘍のタンパク質をランク付けする前に、各タンパク質の数値をＧＳＫ３βに対する数値に標準化して、次いで、全腫瘍のそのタンパク質の平均数値を差し引いた。細胞株のタンパク質では、すべての細胞株の平均数値を差し引いた。矢印は細胞株と腫瘍との間で共通しているタンパク質を指している。
【図４】図４Ａおよび図４Ｂは、Ｈ２２２８細胞株およびＨＣＣ７８細胞株にある受容体チロシンキナーゼ間のスペクトル数の分布を示した円グラフである。各ＲＴＫに割り当てた観測スペクトルの総数を、観測した総ＲＴＫスペクトルの割合として表している。図４Ｃは、ＥＭＬ４、ＡＬＫ、およびＥＭＬ４−ＡＬＫ融合タンパク質の略図である。矢印は染色体切断点を指している。図４Ｄは、ＴＦＧ、ＡＬＫ、およびＴＦＧ−ＡＬＫ融合タンパク質の略図である。矢印は染色体切断点を指している。図４Ｅは、ＳＬＣ３４Ａ２、ＲＯＳ、およびＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ融合タンパク質の略図である。矢印は染色体切断点を指している。図４Ｆは、ＣＤ７４、ＲＯＳ、およびＣＤ７４−ＲＯＳ融合タンパク質の略図である。矢印は染色体切断点を指している。
【図５】図５Ａは、Ｈ１７０３にある受容体チロシンキナーゼ間のスペクトル数の分布を示した円グラフである。図５Ｂは、Ａｋｔのリン酸化に対する、ＥＧＦＲ阻害剤およびＰＤＧＦＲ阻害剤の効果を示したウエスタンブロットである。Ｈ１７０３細胞は、ＥＧＦ、イレッサとＥＧＦ、またはグリベックで１時間の処置をするかしないかのいずれかを行い、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲα、およびＡｋｔのレベルをウエスタンブロットによって測定した。ＥＧＦＲ（Ｔｙｒ１０６８）およびＡｋｔ（Ｓｅｒ４７３）のリン酸化は、リン酸化状態特異的抗体を用いて測定した。図５Ｃは、Ｈ１７０３細胞においてメシル酸イマチニブが細胞増殖を阻害し、アポトーシスを誘発することを示したグラフである。Ｈ１７０３細胞をグリベックで７２時間処置して、ＭＴＳアッセイを行った。３回の実験の平均による結果を示した（エラーバーは標準偏差を示す）。図５Ｄは、Ｈ１７０３マウス異種移植片に対するイマチニブ治療を示したグラフである。同様のサイズの腫瘍を有するマウスを２群に分けて、一方の群（５匹のマウス）をグリベックで治療し、他方の群（５匹のマウス）は治療しなかった。治療の７日後に、各腫瘍のサイズ（ｍｍ長×ｍｍ幅）を測定した。図５Ｅは、Ｈ１７０３細胞におけるイマチニブによるＰＤＧＦＲαのリン酸化の調節を示したイメージ図である。Ｈ１７０３細胞を軽いアミノ酸および重いアミノ酸で標識して、ＳＩＬＡＣについて記載のように、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳタンデム質量分析によって分析した。質量分析によって検出されたＰＤＧＦＲαのリン酸化部位を、イマチニブの処置の３時間後に測定したフォールドの変化と共に示した。図５Ｆは、ＳＩＬＡＣおよびＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって測定されるような、Ｈ１７０３細胞におけるＰＤＧＦＲαの下流のシグナル伝達の調節を示したイメージ図である。赤い円は、イマチニブ処置後にリン酸化が減少したタンパク質を表している。黒および赤の矢印はそれぞれ、既知の基質および予測される基質（scansiteおよびnetphosK）を指している。
【図６】チロシンキナーゼにおけるリン酸化部位のクラスタ分析を示したグラフである。各腫瘍試料について、その部位の全試料の平均数値を差し引いた。次いで、試料を、全試料の最も高い標準偏差、ピアソン相関距離メトリック、および平均連結法を用いて、１２０部位を使用してクラスタ化した。
【図７】腫瘍と隣接組織との間のシグナル伝達の差異を示したｔ検定比較である。腫瘍および隣接組織にある各タンパク質のスペクトル数を、ＧＳＫ３βに対する数値に標準化した。全腫瘍および全隣接組織から隣接組織の平均数値を差し引いた。ピアソン相関距離および平均連結のクラスタ分析と共にTIGRのMeVプログラム（Saeed, A.I., Sharov, V.,White, J., Li, J., Liang, W., Bhagabati, N., Braisted, J., Klapa, M., Currier,T., Thiagarajan, M.ら（2003）TM4: a free, open-source system formicroarray data management and analysis. Biotechniques 34, 374-378）を用いてｔ検定を行って、隣接組織と腫瘍組織との間で著しい相違を示したチロシンリン酸化型タンパク質を特定した。
【図８】図８Ａは、ＮＳＣＬＣ細胞株におけるＡＬＫの発現を示したウエスタンブロットである。ＡＬＫの発現はＨ２２２８細胞にきわめて限定されている。図８Ｂは、ＮＳＣＬＣ細胞株におけるＲＯＳの発現を示したウエスタンブロットである。ＲＯＳの発現はＨＣＣ７８細胞株にきわめて限定されている。図８Ｃおよび図８Ｄはそれぞれ、ＨＣＣ７８細胞においてＲＯＳのノックダウンが細胞増殖を阻害し、細胞死を誘発することを示した棒グラフおよびウエスタンブロットである。ＨＣＣ７８細胞およびＨ２０６６細胞を、ＲＯＳに対するｓｉＲＮＡで４８時間トランスフェクトした。対照細胞およびトランスフェクトした細胞の生存率を、トリパンブルー除去法によって測定した。生存細胞の（４実験の）平均百分率＋／−ＳＤを棒グラフで表している。対照のｓｉＲＮＡおよびＲＯＳのｓｉＲＮＡ（１００ｎＭ）の両方からの細胞溶解液を、ＲＯＳ、切断ＰＡＲＰ、およびβ−アクチンの抗体を用いて免疫ブロットした。図８Ｅは、ｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイを示した棒グラフおよびウエスタンブロットである。ｐＥｘｃｈａｎｇｅ−２ベクターまたはｐＥｘｃｈａｎｇｅ−２／ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ（Ｓ）ベクターを２９３Ｔ細胞に一過的にトランスフェクトし、ＲＯＳ融合タンパク質をＭｙｃタグ抗体で免疫沈降して、キナーゼアッセイを実施した。図８Ｆは、ＲＯＳ融合タンパク質の細胞小器官の局在を示したウエスタンブロットである。ｐＥｘｃｈａｎｇｅ−２ベクターまたはｐＥｘｃｈａｎｇｅ−２／ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ（Ｓ）ベクターを２９３Ｔ細胞に一過的にトランスフェクトした。融合タンパク質の細胞小器官の局在をＭｙｃタグ抗体で検出した。原形質膜（ＰＭ）、サイトゾル、および核の分画のマーカーとして、ＩＧＦ１Ｒ、β−アクチン、およびラミンＡ／Ｃを使用した。図８Ｇは、ＡＬＫの切断分離再編成のプローブがＡＬＫ遺伝子の切断点の両側を別々に標識する２つのプローブを含むことを示した、図および顕微鏡写真である。ハイブッド形成した際に、天然のＡＬＫ領域は橙色／緑色（黄色）の融合シグナルのように見えるが、この遺伝子座における再編成によって橙色と緑色の別々のシグナルが生じることとなる。Ｈ２２２８細胞株および患者の試料には、２コピーの正常なＡＬＫ（黄色）ならびにＡＬＫ遺伝子座の３’部分に由来する１つの近位プローブ（赤色；白色の矢印）が含まれる。この遺伝子座の５’部分は欠失するようである。ＥＭＬ４、ＡＬＫおよびＥＭＬ４−ＡＬＫ融合タンパク質の略図である。矢印は染色体切断点を指している。図８Ｈは、ＲＯＳ遺伝子座内における再編成を示した、図および顕微鏡写真である。分離プローブを用いて、ＲＯＳ遺伝子座内での再編成を解析した。ＲＯＳ遺伝子座内における転座によって、ＨＣＣ７８細胞株（左）およびＮＳＣＬＣ腺癌の試料（右）で見られるように、黄色のシグナルが分離して赤色または緑色のシグナルとなる。
【図９】図９Ａは、ＮＳＣＬＣ細胞株におけるＰＤＧＦＲαを示したウエスタンブロットである。ＰＤＧＦＲαの発現はＨ１７０３細胞株にきわめて限定されている。図９Ｂは、Ｈ１７０３細胞におけるメシル酸イマチニブ（グリベック）によるＰＤＧＦＲαおよびＡｋｔのリン酸化の用量依存的な阻害剤を示したウエスタンブロットである。示した量のメシル酸イマチニブでＨ１７０３細胞を１時間処置して、リン酸化型ＰＤＧＦＲα（Ｔｙｒ７５４）、リン酸化型Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）、およびリン酸化型ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）のレベルをウエスタンブロットによって測定した。ＰＤＧＦＲα、Ａｋｔ、およびＭＡＰＫの総タンパク質レベルも同じ試料で測定した。図９Ｃは、アポトーシスアッセイの結果を示した棒グラフである。メシル酸イマチニブ（１μＭ、１０μＭ）またはＤＭＳＯ（対照）を４０％コンフルエントのＨ１７０３細胞に添加し、２４時間後、接着細胞および浮遊細胞の両方を収集して、フローサイトメトリーによって切断カスパーゼ３を定量化してアポトーシスを測定した。独立した３実験の平均による結果を示している（エラーバーは標準偏差を示す）。図９Ｄは、Ｈ１７０３細胞においてイマチニブが切断ＰＡＲＰの発現を誘発することを示したウエスタンブロットである。Ｈ１７０３細胞を漸増濃度のグリベックで３時間処置して、切断ＰＡＲＰを免疫ブロットによって測定した。ＰＤＧＦＲアルファのレベルを測定して、総タンパク質のローディングを調節した。図９Ｅは、グリベック感受性のリン酸化部位を確認するウエスタンブロットである。部位特異的かつリン酸化特異的な抗体を用いたウエスタン分析によって、同イマチニブ処置条件下（１μＭ、３時間）で質量分析により同定された同部位において、グリベックによってＰＤＧＦＲα、ＰＬＣγ１、およびＳＨＰ２のリン酸化が減少していることが確認される。Ｓｔａｔ３のリン酸化は、質量分析によって予測されたとおり、変化しなかった。図９Ｆは、Ｈ１７０３細胞から調製したマウス異種移植片において、メシル酸イマチニブが腫瘍増殖を阻止することを示した写真である。３匹の未治療マウス（赤色矢印）および５０ｍｇ／ｋｇのイマチニブ治療７日後の３匹のグリベック治療マウス（青色矢印）の典型的な腫瘍サイズである。図９Ｇは、ＰＤＧＦＲａの発現が腺癌および細気管支肺胞癌においてより著しく認められることを示した顕微鏡写真である。図９Ｈは、ＰＤＧＦＲαの増幅を示した図および顕微鏡写真である。正常な対照試料を左側に示す。赤色のシグナルはＰＤＧＦＲαプローブ（白色矢印）を示し、緑色のシグナルは４番染色体に位置しＰＤＧＦＲαの近位にあるセントロメアを示している。扁平上皮癌患者由来の中間期核におけるＰＤＧＦＲαの増幅を右側に示す。大きな増幅を黄色の矢印で印した。この細胞は３コピーの４番染色体を有しており、そのうちの１つによってＰＤＧＦＲα遺伝子座における増幅が示される。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書に記載の本発明が完全に理解され得るように、以下に詳細な説明を記載する。
【００１６】
他に定義しない限り、本明細書中で用いているすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当技術分野の当業者に共通して理解される意味と同じ意味を有する。本明細書での記載と類似または等価の方法および物質を本発明の実施または試験に用いることができるが、好ましい方法および物質を以下に記載する。材料、方法、および実施例は例示的なものにすぎず、限定することを意図しない。本明細書で言及するあらゆる刊行物、特許、およびその他の文書は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００１７】
本明細書を通じて、「含む」という言葉または「含んでいる」などのその変形は、言及した整数または整数群の包含を意味するように理解されることとなるが、他のいずれの整数または整数群の排除を意味するように理解されるものではない。
【００１８】
発明をさらに定義するために、以下の用語および定義をここに記載する。
【００１９】
「試料」という用語は、腫瘍組織、脳組織、脳脊髄液、血液、血漿、血清、リンパ、リンパ節、脾臓、肝臓、骨髄、または他のあらゆる生物学的標本（癌細胞を含む）として得られる標本、あるいはこれらから単離される標本のことをいう。
【００２０】
「治療する」または「治療」という用語は、哺乳類において癌の症状の進行を後退、軽減、抑制すること、あるいはその症状を予防または緩和すること、あるいは癌に関連する確証可能な測定法を改良することを意味することを意図する。
【００２１】
「対象者」という用語は、これらに限定されるものではないがヒト、霊長類、ウマ、トリ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、およびマウスを含む、哺乳類のことをいう。
【００２２】
「有効量」という用語は、チロシンキナーゼを阻害するのに十分な阻害剤の量のことをいう。
【００２３】
「治療の有効性」という用語は、治療によって障害または病態、あるいはその１つまたは複数の症状を、後退、緩和、または予防する程度、あるいは障害または病態の進行を抑制する程度のことをいう。
【００２４】
癌細胞を分類する方法
本発明は、試料中の癌細胞を分類する方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法には、癌細胞の試料を得るステップと、その試料中の少なくとも１つのシグナル伝達経路にある１種または複数種のチロシンキナーゼの有無またはレベルを検出するステップと、その１種または複数種のチロシンキナーゼの有無またはレベルに基づいて癌細胞を分類するステップとが含まれる。他の実施形態では、この方法には、癌細胞の試料を得るステップと、その試料中の少なくとも１つのシグナル伝達経路にある１種または複数種のリン酸化型チロシンキナーゼの有無またはレベルを検出するステップと、その１種または複数種のリン酸化型チロシンキナーゼの有無またはレベルに基づいて癌細胞を分類するステップとが含まれる。
【００２５】
本発明の方法に用い得る癌細胞には、癌細胞株由来または対象者の固形腫瘍由来の細胞が含まれるが、これらに限定されない。癌細胞は、いかなる種類の癌からも得ることができ、これには、肺癌（肺の扁平上皮癌を含む）、血液癌（リンパ腫を含む）、前立腺癌、乳癌、および胃腸管の腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、この癌は肺細胞である。好ましい実施形態では、この癌は非小細胞肺癌である。
【００２６】
本明細書で用いているように、通常、チロシンキナーゼという用語は、非受容体チロシンキナーゼおよび受容体チロシンキナーゼのことをいう。非受容体チロシンキナーゼには、ＡＢＬ、ＡＣＫ、ＣＳＫ、ＦＡＫ、ＦＥＳ、ＦＲＫ、ＪＡＫ、ＳＲＣ、ＴＥＣ、およびＳＹＫが含まれるが、これらに限定されない。受容体チロシンキナーゼには、ＡＬＫ、ＡＸＬ、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＥＧＦＲ、ＥＰＨ、ＥＲＢ２、ＦＧＦＲ、ＩＮＳＲ、ＭＥＴ、ＭＵＳＫ、ＰＤＧＦＲ、ＰＴＫ７、ＰＥＴ、ＲＯＲ、ＲＯＳ、ＴＹＫ、ＴＩＥ、ＴＲＫ、ＶＥＧＦＲ、ＡＡＴＹＫ、ｅｐｈＡ２、ＶＥＧＲ−２、ＩＧＦＲ１、ＬＹＮ、ＨＣＫ、ＨＥＲ２、ＩＲＳ１、ＩＲＳ２、ＢＲＫ、ＥｐｈＢ４、ＦＧＦＲ１、ＥｒｂＢ３、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ５、Ｔｙｒｏ３、ＥｐｈＢ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＢ３、Ｍｅｒ，ＥｐｈＢ４、およびＫｉｔが含まれるが、これらに限定されない。Robinson, WuおよびLin、2000を参照されたく、参照によりその内容全体が本明細書に組み込まれる。
【００２７】
一実施形態によれば、チロシンキナーゼの有無またはレベルを検出することに基づいて試料中の癌細胞を分類する。好適な検出方法は当業者に周知であり、これには、蛍光ｉｎ
ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、質量分析（ＭＳ）、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、および酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００２８】
他の一実施形態によれば、リン酸化型チロシンキナーゼの有無またはレベルを検出することに基づいて試料中の癌細胞を分類する。好適な検出方法は当業者に周知であり、これには、試料からのリン酸化ペプチドの免疫沈降および免疫沈降したリン酸化ペプチドの分析、例えば液体クロマトグラフィー（ＬＣ）ＭＳ／ＭＳを用いた分析が含まれるが、これらに限定されない。
【００２９】
さらに他の一実施形態によれば、試料中の少なくとも１つのシグナル伝達経路にある１種または複数種のチロシンキナーゼの活性の有無またはレベルを検出することに基づいて試料中の癌細胞を分類する。好適な検出方法は当業者に周知であり、これには、これらに限定されるものではないが、米国特許の第６,０６６,４６２号、第６,３４８,３１０号、および第６,７５３,１５７号、ならびに欧州特許第０７６０６７８Ｂ９号に開示される方法が含まれ、参照によりこれらの内容全体が本明細書に組み込まれる。
【００３０】
いくつかの実施形態では、いかなる統計的な方法またはコンピュータの方法の補助も用いることなく、この分類のステップを実施する。この実施形態は、検査する試料の数またはチロシンキナーゼの数が少ない場合に好ましい。
【００３１】
他の実施形態では、統計的な方法またはコンピュータの方法の補助を用いて、この分類のステップを実施する。この実施形態は、検査する試料の数またはチロシンキナーゼの数が多い場合に好ましい。統計的な方法は当業者に知られており、コンピュータプログラムを含むが、これに限定されない。好適なコンピュータプログラムには教師なしピアソンクラスタ分析が含まれるが、これに限定されない。
【００３２】
いくつかの実施形態では、１種または２種のみの高度にリン酸化されたチロシンキナーゼを有するものとして癌細胞を分類する（クラスI）。他の実施形態では、リン酸化型のＦａｋ、Ｓｒｃ、Ａｂｌ、ならびにＥＧＦＲ、ＡＬＫ、ＰＤＧＦＲａ、Ｅｒｂ２、ＲＯＳ、ｃＭｅｔ、Ａｘｌ、ｅｐｈＡ２、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＦＧＦＲ、ＶＥＧＲ−２、ＩＧＦＲ１、ＬＹＮ、ＨＣＫ、ＨＥＲ２、ＩＲＳ１、ＩＲＳ２、およびＢＲＫからなる群から選択される少なくとも１つの受容体チロシンキナーゼを発現しているものとして癌細胞を分類する（クラスII）。他の実施形態では、リン酸化型のＤＤＲ１、Ｓｒｃ、およびＡｂｌを発現しているものとして癌細胞を分類する（クラスIII）。他の実施形態では、リン酸化型のＳｒｃ、ならびにＥＧＦＲ、ＡＬＫ、ＰＤＧＦＲａ、Ｅｒｂ２、ＲＯＳ、ｃＭｅｔ、Ａｘｌ、ｅｐｈＡ２、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＦＧＦＲ、ＶＥＧＲ−２、ＩＧＦＲ１、ＬＹＮ、ＨＣＫ、ＨＥＲ２、ＩＲＳ１、ＩＲＳ２、およびＢＲＫからなる群から選択される少なくとも１つの受容体チロシンキナーゼを発現しているものとして癌細胞を分類する（クラスIV）。他の実施形態では、リン酸化型のＳｒｃおよびＡｂｌを発現しているものとして癌細胞を分類する（クラスV）。
【００３３】
好ましい実施形態では、本発明は、非小細胞肺癌細胞を分類するための方法を提供する。この実施形態の一態様によれば、この方法には、ＮＳＣＬＣ細胞の試料を得るステップと、その試料中の少なくとも１つのシグナル伝達経路にある１種または複数種のチロシンキナーゼの有無またはレベルを検出するステップと、その１種または複数種のチロシンキナーゼの有無またはレベルに基づいてＮＳＣＬＣ細胞を分類するステップとが含まれる。この実施形態の他の一態様によれば、この方法には、ＮＳＣＬＣ細胞の試料を得るステップと、その試料中の少なくとも１つのシグナル伝達経路にある１種または複数種のリン酸化型チロシンキナーゼの有無またはレベルを検出するステップと、その１種または複数種のリン酸化型チロシンキナーゼの有無またはレベルに基づいてＮＳＣＬＣ細胞を分類するステップとが含まれる。
【００３４】
癌を治療する方法
また、本発明は、対象者の癌を治療する方法も提供する。いくつかの実施形態では、この方法には、対象者から癌細胞の試料を採取するステップと、その試料中の少なくとも１つのシグナル伝達経路にある１種または複数種の異常に発現したチロシンキナーゼのレベルに基づいて癌細胞を分類するステップと、その分類に基づいて有効量の１種または複数種のチロシンキナーゼ阻害剤を投与するステップとが含まれる。他の実施形態では、この方法には、対象者から癌細胞の試料を採取するステップと、その試料中の少なくとも１つのシグナル伝達経路にある１種または複数種の異常にリン酸化されたチロシンキナーゼのレベルに基づいて癌細胞を分類するステップと、その分類に基づいて有効量の１種または複数種のチロシンキナーゼ阻害剤を投与するステップとが含まれる。
【００３５】
この方法に用い得る癌細胞には、肺癌（肺の扁平上皮癌を含む）、血液癌（リンパ腫を含む）、前立腺癌、乳癌、および胃腸管の腫瘍に由来する癌細胞が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、この癌は肺細胞である。好ましい実施形態では、この癌は非小細胞肺癌である。
【００３６】
この癌細胞の試料は当技術分野で知られている任意の方法によって得ることができ、これには、対象者から腫瘍の標本を採取することが含まれるが、これに限定されない。
【００３７】
いくつかの実施形態では、異常に発現したチロシンキナーゼに基づいて癌細胞を分類する。他の実施形態では、異常に発現したリン酸化型チロシンキナーゼに基づいて癌細胞を分類する。これらの実施形態によれば、チロシンキナーゼ（またはリン酸化型チロシンキナーゼ）の発現、あるいはそれらのリン酸化レベルまたは活性を検出して、正常な細胞を含有する試料中で検出したものと比較する。
【００３８】
いくつかの実施形態では、１種または２種のみの高度にリン酸化されたチロシンキナーゼを有するものとして癌細胞を分類する（クラスI）。他の実施形態では、リン酸化型のＦａｋ、Ｓｒｃ、Ａｂｌ、ならびにＥＧＦＲ、ＡＬＫ、ＰＤＧＦＲａ、Ｅｒｂ２、ＲＯＳ、ｃＭｅｔ、Ａｘｌ、ｅｐｈＡ２、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＦＧＦＲ、 ＶＥＧＲ−２、ＩＧＦＲ１、ＬＹＮ、ＨＣＫ、ＨＥＲ２、ＩＲＳ１、ＩＲＳ２、およびＢＲＫからなる群から選択される少なくとも１つの受容体チロシンキナーゼを発現しているものとして癌細胞を分類する（クラスII）。他の実施形態では、リン酸化型のＤＤＲ１、Ｓｒｃ、およびＡｂｌを発現しているものとして癌細胞を分類する（クラスIII）。他の実施形態では、リン酸化型のＳｒｃ、ならびにＥＧＦＲ、ＡＬＫ、ＰＤＧＦＲａ、Ｅｒｂ２、ＲＯＳ、ｃＭｅｔ、Ａｘｌ、ｅｐｈＡ２、
ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＦＧＦＲ、ＶＥＧＲ−２、ＩＧＦＲ１、ＬＹＮ、ＨＣＫ、ＨＥＲ２、ＩＲＳ１、ＩＲＳ２、およびＢＲＫからなる群から選択される少なくとも１つの受容体チロシンキナーゼを発現しているものとして癌細胞を分類する（クラスIV）。他の実施形態では、リン酸化型のＳｒｃおよびＡｂｌを発現しているものとして癌細胞を分類する（クラスV）。
【００３９】
癌を治療する方法では、この分類に基づいて、有効量の１種または複数種のチロシンキナーゼ阻害剤を対象者に投与する。本発明の方法において投与することができる好適なチロシンキナーゼ阻害剤は当技術分野で知られており、これには、アキシチニブ（AG013736としても知られる；Rugo, H.S., Herbst, R.S., Liu,
G., Park, J.W., Kies, M.S., Steinfeldt, H.M., Pithavala, Y.K., Reich, S.D.,
Freddo, J.L.およびWilding, G.（2005）Phase I
Trial of the Oral Antiangiogenesis Agent AG-013736 in Patients With Advanced
Solid Tumors：Pharmacokinetic and Clinical Results. Journal
of Clinical Oncology 23, 5474-5483）、ボスチニブ（Gambacorti-Passerini,
C., Kantarjian, H.M., Baccarani, M., Porkka, K., Turkina, A., Zaritskey, A.Y.,
Agarwal, S., Hewes, B.およびKhoury, H.J.（2008）Activity and tolerance of bosutinib in
patients with AP and BP CML and Ph+ ALL. J. Clin. Oncol. 26（May 20 suppl；abstr 7049））、セディラニブ（AZD2171としても知られる；Wedge, S.R., Kendrew, J.,
Hennequin, L.F., Valentine, P.J., Barry, S.T., Brave, S.R., Smith, N.R., James,
N. H., Dukes, M., Curwen, J.O., Chester, R., Jackson, J.A., Boffey, S.J.,
Kilburn, L.L., Barnett, S., Richmond, G.H.P., Wadsworth, P.F., Walker, M.,
Bigley, A.L., Taylor, S.T., Cooper, L., Beck, S., Jurgensmeier, J.M.およびOgilvie, D.J.（2005）AZD2171：A Highly Potent, Orally Bioavailable, Vascular Endothelial Growth
Factor Receptor-2 Tyrosine Kinase Inhibitor for the Treatment of Cancer. Cancer
Res. 65, 4389-4400）、ダサチニブ（Talpaz, M., Shah, N.P.,
Kantarjian, H., Donato, N., Nicoll, J., Paquette, R., Cortes, J., O'Brien, S.,
Nicaise, C., Bleickardt, E., Blackwood-Chirchir, M.A., Iyer, V., Chen, T.-T.,
Phil., Huang, F., Decillis, A.P.およびSawyers, C.L.（2006）Dasatinib in Imatinib-Resistant Philadelphia
Chromosome-Positive Leukemias. N. Eng. J. Med. 354, 2531-2541）、エルロチニブ（Perez-Soler, R., Chachoua, A., Hammond, L.A., Rowinsky, E.K., Huberman,
M. Karp, D., Rigas, J., Clark, G.M., Santabarbara, P.およびBonomi,
P.（2004）Determinants of Tumor
Response and Survival With Erlotinib in Patients With Non-Small-Cell Lung
Cancer. Journal of Clinical Oncology 22, 3238-3247、Rappsilber,
J., Ishihama, Y.およびMann, M.（2003）Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser
desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in
proteomics. Anal Chem.75（3):663-70）、ゲフィチニブ（Pao, W., Miller, V., Zakowski, M., Doherty, J., Politi, K., Sarkaria,
I., Singh, B., Heelan, R., Rusch, V., Fulton, L.ら（2004）EGF receptor gene mutations are common in lung cancers from“never smokers”and are associated with sensitivity
of tumors to gefitinib and erlotinib. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101,
13306-13311、Peduto, L., Reuter, V.E., Shaffer, D.R.,
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B.J.（2003）Specific Targeted Therapy
of Chronic Myelogenous Leukemia with Imatinib. Pharmacological Reviews 55, 401-423）、ラパチニブ（Burris III, H.A.（2004）Dual
kinase inhibition in the treatment of breast cancer:initial experience with the
EGFR/ErbB-2 inhibitor Lapatinib. The Ongologist 9（suppl 3）, 10-15）、レスタウルチニブ（Cephalon, Frazer, PA）、ニロチニブ（Kantarjian, H., Giles, F., Wunderle, L., Bhalla, K., O'Brien, S.,
Wassmann, B., Tanaka, C., Manley, P., Rae, P., Mietlowski, W., Bochinski, K.,
Hochhaus, A., Griffin, J.D., Hoelzer, D., Albitar, M., Dugan, M., Cortes, J.,
Alland, L.およびOttmann, O.G.（2006）Nilotinib in Imatinib-Resistant CML and Philadelphia Chromosome-Positive ALL. N. Eng.
J. Med. 354, 2542-2551）、セマキサニブ（O'Donnell, A., Padhani, A.,
Hayes, C., Kakkar, A.J., Leach, M., Trigo, J.M., Scurr, M., Raynaud, F.およびPhillips, S.（2005）A Phase I
study of the angiogenesis inhibitor SU5416（semaxanib）in solid tumours, incorporating dynamic contrast MR pharmacodynamic end
points. British Journal of Cancer 93, 876-883）、スニチニブ（Motzer,
R.J., Hutson, T.E., Tomczak, P., Michaelson, M.D., Bukowski, R.M., Rixe, O.,
Oudard, S., Negrier, S., Szczylik, C., Kim, S.T., Chen, I., Bycott, P.W., Baum,
C.M.およびFiglin, R.A.（2007）Sunitinib versus Interferon Alfa in Metastatic Renal-Cell Carcinoma. N.
Eng. J. Med. 356, 115-124)、およびバンデタニブ（AstraZeneca, London, England）が含まれるが、これらに限定されない。
【００４０】
当技術分野で知られる多様な方法のうち任意の方法を用いてチロシンキナーゼ阻害剤を投与することができる。いくつかの実施形態では、チロシンキナーゼ阻害剤を静脈内に投与する。いくつかの実施形態では、チロシンキナーゼ阻害剤を筋肉内に投与する。いくつかの実施形態では、チロシンキナーゼ阻害剤を皮下に投与する。
【００４１】
治療の有効性を判定する方法
本発明はさらに、対象者における癌の治療の有効性を判定する方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法には、対象者から癌細胞の試料を採取するステップと、その試料中の少なくとも１つのシグナル伝達経路にある１種または複数種のチロシンキナーゼの有無またはレベルを検出するステップとが含まれ、このとき、１種または複数種のチロシンキナーゼの有無またはレベルが治療の有効性と相関している。他の実施形態では、この方法には、対象者から癌細胞の試料を採取するステップと、その試料中の少なくとも１つのシグナル伝達経路にある１種または複数種のリン酸化型チロシンキナーゼの有無またはレベルを検出するステップとが含まれ、このとき、１種または複数種のチロシンキナーゼの有無またはレベルが治療の有効性と相関している。
【００４２】
この方法に用い得る癌細胞には、肺癌（肺の扁平上皮癌を含む）、血液癌（リンパ腫を含む）、前立腺癌、乳癌、および胃腸管の腫瘍に由来する癌細胞が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、この癌は肺細胞である。好ましい実施形態では、この癌は非小細胞肺癌である。
【００４３】
いくつかの実施形態では、１種または複数種のチロシンキナーゼの有無またはレベルを検出する。他の実施形態では、１種または複数種のリン酸化型チロシンキナーゼの有無またはレベルを検出する。チロシンキナーゼを検出する好適な方法には、ＦＩＳＨ、ＩＨＣ、ＰＣＲ、ＭＳ、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、およびＥＬＩＳＡが含まれるが、これらに限定されない。リン酸化型チロシンキナーゼを検出する好適な方法は、当技術分野で知られている（例えば、米国特許の第７，１９８,８９６号および第７，３００,７５３号、これらは両方とも参照によりその内容全体が本明細書に組み込まれる）。
【００４４】
いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、タンパク質チロシンのリン酸化は、癌細胞と正常細胞との間および種々の癌細胞間で著しい相違を示すため、種々の癌細胞において、シグナル伝達経路にあるチロシンキナーゼまたはリン酸化型チロシンキナーゼの有無またはレベルを、癌の重症度、病期、または種類の指標とすることができ、したがって、癌の治療の有効性と相関しているものと考えられる。
【００４５】
本発明がより完全に理解されるように、以下の実施例を記載する。これらの実施例は例示のみを目的とし、いかなる形であれ本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【００４６】
実施例１
ＮＳＣＬＣの腫瘍および細胞株のリン酸化チロシンプロファイル
パラフィン包埋しホルマリン固定した、ＮＳＣＬＣ患者の９６個の組織試料を、免疫組織化学（ＩＨＣ）およびリン酸化特異的抗体を用いてスクリーニングした（図１Ａ）。約３０％の腫瘍が高レベルのリン酸化チロシンの発現を示した。また、この群の患者の試料は高レベルの受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）発現も示しており、ＲＴＫ活性がこれらの肺腫瘍の発生に関与し得ることが示唆される。リン酸化特異的抗体を用いた、４１種のＮＳＣＬＣ細胞株の免疫ブロットによっても、特に受容体チロシンキナーゼの分子量範囲の特性において不均一な反応性が示された（図１Ｂ）。
【００４７】
ＮＳＣＬＣ細胞株および固形腫瘍におけるチロシンキナーゼの活性をさらに特徴付けるために、免疫親和性のリン酸化プロテオミクスのアプローチを用いた。タンデム質量分析(ＭＳ／ＭＳ）による測定では、リン酸化チロシンは細胞のリン酸化プロテオームの１％未満に相当し（Olsen, J.V.,
Blagoev, B., Gnad, F., Macek, B., Kumar, C., Mortensen, P.およびMann, M.（2006）Global, in
vivo, and site-specific phosphorylation dynamics in signaling networks. Cell
127, 635-648)、従来の方法による分析は困難なため、タンデム質量分析による分析の前に、リン酸化チロシン抗体を用いた免疫親和性の精製を用いてリン酸化チロシン含有ペプチドを濃縮した（Rush, J.,
Moritz, A., Lee, K.A., Guo, A., Goss, V.L., Spek, E.J., Zhang, H., Zha, X.M.,
Polakiewicz, R.D.およびComb, M.J.（2005）Immunoaffinity profiling of tyrosine phosphorylation in cancer cells.
Nat. Biotechnol. 23, 94-101)。標準的な病理に基づき、全腫瘍をＮＳＣＬＣとして同定した。癌細胞を５０％以上含有する腫瘍のみを分析した。培養条件によって生じるバックグラウンドのリン酸化を抑えるため、分析前にＮＳＣＬＣ細胞株を低血清中で一晩増殖させた。
【００４８】
この方法を用いて多数の部位（重複していない１５０〜１２００部位／細胞株または腫瘍に及ぶ）のリン酸化状態を検出し、合計で４１種のＮＳＣＬＣ細胞株および１５０個のＮＳＣＬＣ腫瘍からのリン酸化チロシンのプロファイルを得た。２７００種を超えるさまざまなタンパク質上の４５５１個のチロシンリン酸化部位が特定され、ＮＳＣＬＣにおけるチロシンキナーゼシグナル伝達の知識が劇的に広がった。これらの部位を、既知のリン酸化部位の包括的な供給源であるPhosphoSite（www.phosphosite.org）（Hornbeck, P.V., Chabra, I., Kornhauser,
J.M., Skrzypek, E.およびZhang, B.（2004）PhosphoSite：A bioinformatics resource dedicated to
physiological protein phosphorylation. Proteomics 4, 1551-1561）と照合させ、８５％を超えるものが新規であると考えられることが明らかとなった。これらのデータはPhosphoSiteに寄託されており、このデータセットはhttp://www.phosphosite.org/papers/rikova01.htmlを通して無料公開されている。
【００４９】
実施例２
ＮＳＣＬＣのチロシンリン酸化
リン酸化ペプチドのデータセットに基づいて、リン酸化チロシンシグナル伝達の異常をスクリーニングし、ＮＳＣＬＣのタンパク質を比較するための最初のステップとして、リン酸化ペプチドの帰属の数を使用した半定量的な方法を用いて、試料中に存在するリン酸化ペプチドの量を概算した。簡潔に述べると、ＬＣカラムからの溶出のピークが大きいほど、ＬＣ
ＭＳ／ＭＳによってより多くのリン酸化ペプチドが検出されており、したがって、試料中により多くのリン酸化ペプチドが存在している（図１Ｃを参照されたい）。例えば、ｃ−Ｍｅｔのリン酸化ペプチド数と、ウエスタン分析で認められるリン酸化型ｃ−Ｍｅｔタンパク質のレベルとの比較はよく一致している（Gilchrist, A., Au, C.E.,
Hiding, J., Bell,
A.W., Fernandez-Rodriguez, J., Lesimple, S., Nagaya, H., Roy, L., Gosline,
S.J., Hallett, M.ら（2006）Quantitative proteomics analysis of the
secretory pathway. Cell 127, 1265-1281；Old, W.M.,
Meyer-Arendt, K., Aveline-Wolf, L., Pierce, K.G., Mendoza, A., Sevinsky, J.R.,
Resing, K.A.およびAhn, N.G.（2005）Comparison of label-free methods for quantifying human proteins by
shotgun proteomics. Mol. Cell. Proteomics 4, 1487-1502；Zybailov,
B., Coleman, M.K., Florens, L.およびWashburn, M.P.（2005）Correlation of relative abundance ratios
derived from peptide ion chromatograms and spectrum counting for quantitative
proteomic analysis using stable isotope labeling. Anal. Chem. 77, 6218-6224）（図１Ｄを参照されたい）。所定のタンパク質上のすべての部位を組み合わせることによって分析を簡易化できるため、このアプローチは、親イオンのピークの高さなどの他の方法よりも好ましいことが判明した。
【００５０】
次に、タンパク質の分類に基づいて、ＮＳＣＬＣ細胞株および固形腫瘍におけるタンパク質のチロシンリン酸化の分布を比較した。
【００５１】
図２Ａに示すように、タンパク質キナーゼ、接着性タンパク質、および細胞骨格の構成成分が、最も高度にリン酸化されるタンパク質の種類であった。腫瘍は、癌細胞５０％〜９０％に及ぶ複合組織に相当する。細胞株では、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、およびＥｐｈＡ２のチロシンキナーゼで最も高い受容体チロシンキナーゼのリン酸化のレベルが示された一方、腫瘍では、ＤＤＲ１、ＥＧＦＲ、ＤＤＲ２、およびＥｐｈの受容体チロシンキナーゼのリン酸化で高いレベルが示された（図２Ｂ）。ＦａｋキナーゼおよびＳｒｃファミリーキナーゼはＮＳＣＬＣの非受容体チロシンキナーゼのリン酸化の大多数を構成していた（図２Ｃ）。ほとんどのリン酸化はこれらのキナーゼの活性ループから生じている。５６種にわたるさまざまなチロシンキナーゼ上の２６６個の異なるリン酸化部位を分析し、実質的にすべての部位（ｓｒｃファミリーのＣ末端部位のような少数の例外はある）が明確にキナーゼ活性と関連していることが明らかとなった（Blume-Jensen, P.およびHunter, T.（2001）Oncogenic kinase signalling. Nature 411, 355-365; Ullrich, A.およびSchlessinger, J.（1990）Signal
transduction by receptors with tyrosine kinase activity. Cell 61, 203-212）。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、チロシンキナーゼのリン酸化はキナーゼの活性を表すのに役立つと考えられる。
【００５２】
実施例３
ＮＳＣＬＣにおけるチロシンキナーゼの活性化
ＮＳＣＬＣの腫瘍および細胞株の一部において、活性化／過剰発現したチロシンキナーゼに起因した高いチロシンリン酸化が示された（図１Ａおよび図１Ｂ）。異常に活性化されたチロシンキナーゼを特定するために、４１種のさまざまなＮＳＣＬＣ細胞株または１５０個のＮＳＣＬＣ腫瘍のいずれかから得られたシグナル伝達プロファイルの平均を差し引いて、図２Ｅおよび図３Ａに示す教師なし階層的クラスタ分析の結果を得た。この分析によって細胞株間の差異を強調させて、高度にリン酸化された（活性化された）チロシンキナーゼを特定した（図２Ｄおよび図２Ｆを比較されたい）。結果は、ＮＳＣＬＣ細胞株における活性化ＥＧＦＲ（Amann, J., Kalyankrishna, S.,
Massion, P.P., Ohm, J.E., Girard, L., Shigematsu, H., Peyton, M., Juroske, D.,
Huang, Y., Stuart Salmon, J.ら（2005）Aberrant epidermal growth factor receptor
signaling and enhanced sensitivity to EGFR inhibitors in lung cancer. Cancer
Res. 65, 226-235）、ＥｒｂＢ２（Stephens,
P., Hunter, C., Bignell, G., Edkins, S., Davies, H., Teague, J., Stevens, C.,
O'Meara, S., Smith, R., Parker, A.ら（2004）Lung cancer：intragenic ERBB2 kinase mutations in tumours. Nature 431, 525-526）、ＥｒｂＢ３（Engelman, J.A., Janne, P.A.,
Mermel, C., Pearlberg, J., Mukohara, T., Fleet, C., Cichowski, K., Johnson,
B.E.およびCantley, L.C.（2005）ErbB-3
mediates phosphoinositide 3-kinase activity in gefitinib-sensitive nonsmall
cell lung cancer cell lines. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 3788-3793）、ＥｐｈＡ２（Kinch, M.S., Moore, M.B.およびHarpole, D.H., Jr.（2003）Predictive value of the EphA2 receptor
tyrosine kinase in lung cancer recurrence and survival. Clin. Cancer Res. 9,
613-618）、およびｃ−Ｍｅｔ（Ma, P.C., Jagadeeswaran, R.,
Jagadeesh, S., Tretiakova, M.S., Nallasura, V., Fox, E.A., Hansen, M.,
Schaefer, E., Naoki, K., Lader, A.ら（2005）Functional
expression and mutations of c-Met and its therapeutic inhibition with SU11274
and small interfering RNA in nonsmall cell lung cancer. Cancer Res. 65,
1479-1488）の受容体チロシンキナーゼについての先行文献と一致している。１１種の細胞株においてＥＧＦＲキナーゼ活性が亢進しており（図２Ｅ）、このうち５種の細胞株がＥＧＦＲを活性化させる変異を潜伏させていた。例えば、増幅され変異したＥＧＦＲを発現させることが知られている、ＨＣＣ８２７（Amann, J., Kalyankrishna, S.,
Massion, P.P., Ohm, J.E., Girard, L., Shigematsu, H., Peyton, M., Juroske, D.,
Huang, Y., Stuart Salmon, J.ら（2005）Aberrant epidermal growth factor receptor
signaling and enhanced sensitivity to EGFR inhibitors in lung cancer. Cancer
Res. 65, 226-235）およびＨ３２５５（Paez,
J.G., Janne, P.A., Lee, J.C., Tracy,
S., Greulich, H., Gabriel, S., Herman, P., Kaye, F.J., Lindeman, N., Boggon,
T.J.ら（2004）EGFR mutations in lung cancer：correlation with clinical response to gefitinib therapy. Science 304,
1497-1500；Tracy, S., Mukohara, T., Hansen, M., Meyerson,
M., Johnson, B.E.およびJanne, P.A.（2004）Gefitinib induces apoptosis in the EGFRL858R non-small-cell lung cancer
cell line H3255. Cancer Res. 64, 7241-7244）において、高レベルのＥＧＦＲリン酸化ペプチドが認められた。Ｈ１９９３細胞株およびＣａｌｕ−３細胞株においてそれぞれ、高レベルのｃ−ＭｅｔおよびＥｒｂＢ２が認められ、これは、先行文献（Lutterbach, B., Zeng, Q.,
Davis, L.J., Hatch, H., Hang, G., Kohl, N.E., Gibbs, J.B.およびPan, B.S.（2007）Lung cancer cell lines harboring MET gene
amplification are dependent on Met for growth and survival. Cancer Res. 67,
2081-2088；Ma. P.C., Jagadeeswaran, R., Jagadeesh, S.,
Tretiakova, M.S., Nallasura, V., Fox, E.A., Hansen, M., Schaefer, E., Naoki,
K., Lader, A.ら（2005）Functional
expression and mutations of c-Met and its therapeutic inhibition with SU11274
and small interfering RNA in nonsmall cell lung cancer. Cancer Res. 65,
1479-1488；Minami, Y., Shimamura, T., Shah, K.,
Laframboise, T., Glatt, K.A., Liniker, E., Borgman, C.L., Haringsma, H.J.,
Feng, W., Weir, B.A.ら（2007）The major
lung cancer-derived mutants of ERBB2 are oncogenic and are associated with
sensitivity to the irreversible EGFR/ERBB2 inhibitor HK1-272. Oncogene 26,
5023-5027）と一致し、ＮＳＣＬＣ細胞株において知られている受容体チロシンキナーゼ活性を確証している。
【００５３】
ＮＳＣＬＣ腫瘍の同様の分析を、すべてのチロシンキナーゼついては図３Ａに、すべてのチロシンキナーゼのリン酸化部位については図６に示している。教師なしピアソンクラスタ分析を用いて、５つの主要な腫瘍群を特定した（図３Ａ）。左から右に、以下を異常に発現している腫瘍である：１種または２種のみの高い活性のあるチロシンキナーゼを発現している腫瘍（第１群）、多種多様のＳｒｃチロシンキナーゼ、Ａｂｌチロシンキナーゼ、および受容体チロシンキナーゼと共に活性のあるＦａｋを発現している腫瘍（第２群）、ｓｒｃキナーゼおよびａｂｌキナーゼと共に活性化ＤＤＲ１を発現している腫瘍（第３群）、ＥＧＦＲなどのＲＴＫと共にＳｒｃキナーゼを発現している腫瘍（第４群）、優位にｓｒｃチロシンキナーゼおよびＡｂｌチロシンキナーゼを発現している腫瘍（第５群）。
【００５４】
実施例４
チロシンキナーゼの基質
実施例３に記載の各群から、分析したリン酸化基質（チロシンキナーゼおよびセリン／スレオニンキナーゼを除く）を分離した。第１群、第２群、および第４群について、（２５００を超えるリン酸化タンパク質から）３０種の最も有益な基質を特定した（図３Ｂ〜図３Ｄ）。これらの異なる群は、異なる活性キナーゼおよび異なるリン酸化基質を有している。多くの活性チロシンキナーゼを有する第２群の腫瘍は、第１群の腫瘍よりも高いレベルの下流でのリン酸化を示した。例えば、第２群の腫瘍は、運動性および細胞骨格動態に関与するタンパク質ならびに細胞表面受容体および糖分解酵素のリン酸化を示した。全体的に、第１群の腫瘍は比較的低いレベルの基質リン酸化を示し、高いＳＨＰ−１、ＩＲＳ−１／２、およびＰＩ３ＫＲ１／２を示すいくつかのサブグループに分類される。第４群の腫瘍は、ＰＴＥＮおよびヒストンを含むさまざまな基質のリン酸化を示した。
【００５５】
全体的に、第２群の腫瘍について、ＭＳ／ＭＳの結果と一致して、高いリン酸化チロシンのＩＨＣ染色が観察された。入手可能な患者の臨床データおよび腫瘍病理と、階層的クラスタ分析の群の著しい相関は認められなかった。また、ｔ検定比較を用いて、４８個の隣接肺組織試料に対する腫瘍のタンパク質チロシンリン酸化も比較した（図７）。この分析によって、腫瘍と正常組織との間の有意なシグナル伝達の差異を識別し、これには、多くの細胞骨格およびシグナル伝達のタンパク質が含まれていた。
【００５６】
実施例５
活性化チロシンキナーゼのランク付け
一部の細胞株および腫瘍で複数の活性化チロシンキナーゼが発現していることが明らかとなり（第２群の腫瘍を参照されたい）、「誘起因子」キナーゼ（必然的に病因に関係する）の特定は、下流のネットワークで機能している他の活性化キナーゼによって困難となっている。さらに、階層的クラスタ分析が、高いＥＧＦＲのリン酸化を有する腫瘍をグループ化するのには有益ではないことも明らかとなった（図３Ａを参照されたい）。これにより、患者のサブグループにおいて異常に高いレベルのチロシンキナーゼ活性を識別することに基づいて誘起因子のチロシンキナーゼの候補を特定するアプローチを代わりに開発することとなった。図２Ｅもしくは図３Ａにわたる各キナーゼについて全リン酸化を総計して、平均を超えるリン酸化を示す細胞株または患者の数でこれを割った。表１は、平均リン酸化／患者または細胞株によりランク付けした、きわめて高度にリン酸化された受容体チロシンキナーゼを示している。この分析によって、細胞株または患者のサブセットにおける異常に高いチロシンキナーゼリン酸化を識別した。上位２０種の受容体チロシンキナーゼのうち、１５種が細胞株および腫瘍の両方で特定された。上位１０種のうち、Ｍｅｔ、ＡＬＫ、ＲＯＳ、ＰＤＧＦＲａ、ＤＤＲ１、およびＥＧＦＲは、細胞株および腫瘍の両方で認められた（表１）。
【表１】
略記：ＲＴＫ、受容体チロシンキナーゼ；ＮＳＣＬＣ、非小細胞肺癌。
細胞株および患者のサブセットにおける高いキナーゼ活性（リン酸化）の識別。患者の試料では、リン酸化ペプチドの総計は各タンパク質のスペクトル数を表しており、これは、ＧＳＫ３ベータのスペクトル数に標準化して１５０個の腫瘍すべてにわたり総計したもので、すべての腫瘍にわたるそのタンパク質の平均数を差し引いてある。試料の数は、平均を超えるリン酸化ペプチド数を示す腫瘍の数を表している。細胞株では、リン酸化ペプチドの総数は４１種の細胞株すべてにわたるそのタンパク質の平均数を差し引いた後の各タンパク質のスペクトル数を表しており、各実験において同数の細胞を用いたため、標準化を省略した。試料あたりの数値が大きい順に細胞株および組織をランク付けした。
【００５７】
次に、ランク付けのプロセスを適用して、リン酸化の総数に基づいてキナーゼをランク付けすることによって疾患の誘起因子の候補を特定した。ＥＧＦＲのランクが最上位のすべての細胞株の間では、ＥＧＦＲが最も高度にリン酸化されたチロシンキナーゼであることが多く、他では上位２番目または３番目のキナーゼであることが明らかとなった。ＥＧＦＲのランクが最上位のこれらの細胞株の中には、既知のＥＧＦＲ活性化変異を有する全５種の細胞株および既知のＥＧＦＲゲノム増幅を有する細胞株が認められた。
【００５８】
ＮＳＣＬＣ腫瘍試料についてリン酸化のランクを用いた同様な分析を実施して、活性化ＥＧＦＲを示す腫瘍を特定した（表２）。この試験においてＮＳＣＬＣ腫瘍はすべてステージ１またはステージ２であり、７４％男性、５２％喫煙者、３０％腺癌で構成される。ＥＧＦＲのランクが最上位の１８腫瘍のうち、１６腫瘍から解読可能なＥＧＦＲキナーゼドメインのＤＮＡ配列が得られ（表２）、このうち、９／１６個の腫瘍がキナーゼドメイン活性化変異を示し、８／８個の腺癌および５／５名の女性非喫煙者がＥＧＦＲ活性化変異を示していることが明らかとなり、女性非喫煙者および腺癌に多いことを示す先行文献と一致している（Lynch, T.J., Bell, D.W.,
Sordella, R., Gurubhagavatula, S., Okimoto, R.A., Brannigan, B.W., Harris,
P.L., Haserlat, S.M., Supko, J.G., Haluska, F.G.ら（2004）Activating
mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of
non-small-cell lung cancer to gefitinib. N. Engl. J. Med. 350, 2129-2139；Pao, W., Miller, V., Zakowski, M., Doherty, J., Politi, K., Sarkaria,
I., Singh, B., Heelan, R., Rusch, V., Fulton, L.ら（2004）EGF receptor gene mutations are common in lung cancers from“never smokers”and are associated with sensitivity
of tumors to gefitinib and erlotinib. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101,
13306-13311）（表２）。
【表２】
略記：ＡＤ、腺癌；ＳＣＣ、扁平上皮癌。
ＥＧＦＲ、Ａｌｋ、Ｒｏｓ、Ｍｅｔ、およびＰＤＦＧＲａの高度なリン酸化によって患者を分類した。患者の試料については、各患者のスペクトル数をＧＳＫ３ベータのスペクトル数に標準化して、全腫瘍にわたるそのタンパク質の平均数を差し引いた。受容体チロシンキナーゼのリン酸化の数値が平均を超えたものを示している。ＥＧＦＲ活性化変異、ＡｌｋおよびＲｏｓの転座を示している。
【００５９】
ＥＧＦＲのリン酸化ランクによってＥＧＦＲ活性化変異を有する腫瘍を特定できることが実証されたため、新しい誘起因子の候補のチロシンキナーゼの特定を行うために、同じアプローチを適用した。表１に示したように、Ｍｅｔ、ＡＬＫ、ＲＯＳ、ＰＤＧＦＲａ、ＤＤＲ１、およびＥＧＦＲは細胞株および腫瘍の両方に存在することが明らかとなった。患者の試料の１つにおいてＣ−Ｍｅｔが高度にリン酸化されており（表２）、ｃ−Ｍｅｔが誘起因子であることが知られるＨ１９９３細胞で示されるような増幅を示唆している（Lutterbach, B., Zeng, Q.,
Davis, L.J., Hatch, H., Hang, G., Kohl, N.E., Gibbs, J. B.およびPan, B.S.（2007）Lung cancer cell lines harboring MET gene
amplification are dependent on Met for growth and survival. Cancer Res. 67,
2081-2088）。ＥＧＦＲおよびｃ−Ｍｅｔとは対照的に、ＡＬＫ、ＲＯＳ、ＰＤＧＦＲａ、およびＤＤＲ１のキナーゼが肺癌と関連することを示す文献はきわめて少ない。疾患を引き起こす際の活性化キナーゼの役割をさらに試験するには細胞株モデルが決定的であるため、ＮＳＣＬＣ細胞株にいてこれらの候補の発現を試験した。ＲＯＳ、ＡＬＫ、およびＰＤＧＦＲａのタンパク質発現は、少なくとも１つのＮＳＣＬＣ細胞株において高度に上方制御されているようであった（図８Ａ、図８Ｂ、および図９Ａ）。ＤＤＲ１は多くの腫瘍において活性を有するが（Ford, C.E., Lau, S.K., Zhu,
C.Q., Andersson, T., Tsao, M.S.およびVogel, W.F.（2007）Expression
and mutation analysis of the discoidin domain receptors 1 and 2 in non-small
cell lung carcinoma. Br. J. Cancer 96, 808-814）、Ｈ１９９３細胞だけがリン酸化型ＤＤＲ１を発現しており、この細胞はｃ−Ｍｅｔにより引き起こされることが知られている。優れたＤＤＲ１細胞株モデルが欠けていたため、ＮＳＣＬＣ細胞株モデルに相当するＭＳ／ＭＳデータが確認されたＡＬＫ、ｃ−ＲＯＳ、およびＰＤＧＦＲαに焦点を移した。表２は、きわめて高レベルのＡＬＫ、ｃ−ＲＯＳ、ｃ−ＭｅｔおよびＰＤＧＦＲαのリン酸化を示す細胞株および腫瘍を示している。ＥＧＦＲで認められたように、これらのＲＴＫが、常にではないが、最も高度にリン酸化されたチロシンキナーゼであることが多く（表２）、これらが疾患を引き起こす役割を果たし得ることが示唆される。また、細胞株の全リン酸化タンパク質のランク付けも行い、ＡＬＫ（図３Ｅ）、ｃ−ＲＯＳ（図３Ｆ）、およびＰＤＧＦＲａ（図３Ｇ）を発現している腫瘍を選択した。きわめて高度にリン酸化された基質のうち、多くが細胞株と腫瘍との間で共通しており、下流の腫瘍形成のシグナル伝達に関与している（図３Ｅ〜図３Ｇの矢印を参照されたい）。ＨＣＣ７８、Ｈ２２２８、およびＨ１７０３の細胞株、ならびにＲＯＳ、ＡＬＫ、ＥＧＦＲ、ＰＤＦＧＲアルファ、およびｃ−Ｍｅｔを発現している６つの異なるＮＳＣＬＣ腫瘍においてリン酸化ペプチド（２０００を超える多様なリン酸化チロシン部位）が認められた。
【００６０】
ＥＧＦＲ活性化変異により引き起こされるＮＳＣＬＣ腫瘍を特定した。細胞株および腫瘍の全体のＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性をランク付けすることにより、ＥＧＦＲが上位のランクでは、ＥＧＦＲ活性化変異が劇的に多いことが明らかになった。上位ランクの１１種の細胞株のうち、５種が既知のＥＧＦＲ活性化変異を含有し、配列情報を得た１６個のＥＧＦＲ腫瘍のうち、８／９個が腺癌であり、９個がキナーゼドメイン活性化変異を含有していた。残りの扁平上皮癌（ＳＣＣ）患者は高いＥＧＦＲ活性を示した。
【００６１】
ＥＧＦＲが上位ランクの細胞株および腫瘍のうちおよそ半数がＥＧＦＲ活性化変異を有していた。したがって、チロシンキナーゼのランクに基づいて腫瘍をグループ化して、平均レベルを超えて活性化されたキナーゼを発現している腫瘍の特定を行った。ＮＳＣＬＣにおいて、ＲＴＫ（Ｍｅｔ、ＡＬＫ、ＤＤＲ１、ＲＯＳ、ＶＥＧＥＲ−２、ＩＧＦ１Ｒ、ＰＤＧＦＲａ、ＥＧＦＲ、およびＡｘｌ）ならびに非ＲＴＫ（ＦＡＫ、ＬＹＮ、ＦＹＮ、ＨＣＫ、ＦＲＫ、ＢＲＫ、および図３Ａに示す他のもの）が高度にリン酸化されることが明らかとなった。
【００６２】
実施例６
ＮＳＣＬＣの細胞株および腫瘍におけるＡＬＫおよびＲＯＳの融合タンパク質
図３Ａの上方左端の患者群および細胞株Ｈ２２２８（図２Ｅ、図４Ａ、および表１）においてＡＬＫの高レベルのリン酸化が認められ、１つの腫瘍試料およびＨＣＣ７８細胞株（図４Ｂおよび表１）においてＲＯＳの高レベルのリン酸化が認められた。これらの試料中のリン酸化のランクでは、ＡＬＫおよびＲＯＳが最上位かそれに近いところにある（表１）。ＡＬＫおよびＲＯＳのタンパク質の発現は、ＮＳＣＬＳ細胞株間で制限されかつ予測した分子量よりも小さいことが示された（図８Ａおよび図８Ｂ）。ＲＴ−ＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定を行い、発現したＲＮＡ転写産物を調査した。Ｈ２２２８細胞および３つの異なる腫瘍試料に由来するＲＮＡ転写産物の５０のＲＡＣＥ分析により、ＡＬＫが微小管結合タンパク質であるＥＭＬ４と融合していることが示された（図４Ｃを参照されたい）。ＥＭＬ４の短いＮ末端領域は、ＮＰＭ−ＡＬＫ（Morris, S.W., Kirstein, M.N.,
Valentine, M.B., Dittmer, K.G., Shapiro, D.N., Saltman, D.L.およびLook, A.T.（1994）Fusion of a kinase gene, ALK, to a nucleolar
protein gene, NPM, in non-Hodgkin's lymphoma. Science 263, 1281-1284）のような以前に解析された他のＡＬＫの融合で認められた正確な融合部位でＡＬＫのキナーゼドメインと融合していた（図４Ｃ）。また、１つの腫瘍試料では、ＡＬＫがＴＦＧ（Hernandez, L.,
Pinyol, M., Hernandez, S., Bea, S., Pulford, K., Rosenwald, A., Lamant, L.,
Falini, B., Ott, G., Mason, D.Y.ら（1999）TRK-fused gene（TFG) is a new partner of ALK in
anaplastic large cell lymphoma producing two structurally different TFG-ALK
translocations. Blood 94, 3265-3268）と融合していることも判明した（図４Ｄ）。この融合は、以前に認められている短い形態のＴＦＧ−ＡＬＫ（Hernandez, L.,
Bea, S., Bellosillo, B., Pinyol, M., Falini, B., Carbone, A., Ott, G., Rosenwald,
A., Fernandez, A., Pulford, K.ら（2002）Diversity
of genomic breakpoints in TFG-ALK translocations in anaplastic large cell
lymphomas：identification of a new TFG-ALK(XL）chimeric gene with transforming activity. Am. J. Pathol. 160, 1487-1494）と同じである。ＥＭＬ４およびＴＦＧの両方の融合において、コイルドコイルドメインがＡＬＫキナーゼドメインと融合しており、これによって二量体／オリゴマーが形成され、構成的なキナーゼ活性を与えている可能性が高い。
【００６３】
ＨＣＣ７８細胞について同様な分析を行い、ＲＯＳが膜貫通型溶質輸送体タンパク質ＳＬＣ３４Ａ２と融合していることが判明した。最初の膜貫通ドメインの直後で終結するＳＬＣ３４Ａ２のＮ末端領域のＮ末端がＲＯＳの膜貫通ドメインと融合しており、２つの膜貫通ドメインを有する切断型融合タンパク質を形成していた。ＨＣＣ７８細胞において２つの型のこの融合タンパク質が認められ、これは同じ転座現象から生じた異なるスプライシング産物を示しているようである（図４Ｅを参照されたい）。ｃ−ＲＯＳ陽性のＮＳＣＬＣ腫瘍において別のＲＯＳの融合を確認した。図４Ｆに示したように、ｃ−ＲＯＳは、ＭＩＦ免疫サイトカインに対して高い親和性を有するII型の膜貫通タンパク質であるＣＤ７４（Leng, L., Metz,
C.N., Fang, Y., Xu, J., Donnelly, S., Baugh, J., Delohery, T., Chen, Y.,
Mitchell, R.A.およびBucala, R.（2003）MIF signal
transduction initiated by binding to CD74. J. Exp. Med. 197, 1467-1476）のＮ末端の半分と融合している。ＣＤ７４のＮ末端領域がＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳの融合（図４Ｅを参照されたい）の正確な部位でＲＯＳと融合しており、ＳＬＣ３４Ａ２の融合で認められたような２つの膜貫通ドメインを有する融合タンパク質を生じていた。哺乳類細胞において、タグをつけたＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ融合タンパク質を発現させることによって、膜画分に集中した構成的なキナーゼ活性が示された（図８Ｅおよび図８Ｆ）。ＡＬＫおよびＲＯＳのキナーゼドメインを配列決定して、変異がないことを確認した。
【００６４】
ＡＬＫに対するｓｉＲＮＡを用いた実験では、Ｈ２２２８細胞において細胞死が誘発されないことが明らかとなり、これは、ＰＩ３Ｋの変異の活性化（Samuels, Y., Diaz, L.A., Jr.,
Schmidt-Kittler, O., Cummins, J.M., Delong, L., Cheong, I, Rago, C., Huso,
D.L., Lengauer, C., Kinzler, K.W.ら（2005）Mutant PIK3CA
promotes cell growth and invasion of human cancer cells. Cancer Cell 7, 561-573；Samuels, Y.およびVelculescu, V.E.（2004）Oncogenic mutations of PIK3CA in human
cancers. Cell Cycle 3, 1221-1224）またはＰＴＥＮの不活性化（Mellinghoff, I.K., Wang, M.Y.,
Vivanco, I., Haas-Kogan, D.A., Zhu, S., Dia,
E.Q., Lu, K.V., Yoshimoto, K., Huang, J.H., Chute, D.J.ら（2005）Molecular determinants of the response of glioblastomas to EGFR kinase
inhibitors. N. Engl. J. Med. 353, 2012-2024）のように、ＡＬＫに非依存的な生存シグナル伝達を示唆している。ＲＯＳに対するｓｉＲＮＡを用いた同様の実験を行い、ＲＯＳに対する２つの異なるｓｉＲＮＡは、ＲＯＳタンパク質の発現を低減させ、ＨＣＣ７８細胞において細胞死を誘発させるのに効果的であった（図８Ｃおよび図８Ｄ）。これは、ＨＣＣ７８細胞の生存がＲＯＳのシグナル伝達に強く依存していることを示している。
【００６５】
ＡＬＫを発現している細胞株および腫瘍試料（図３Ｅ）において最も高度にリン酸化されている基質の解析を行い、未分化大細胞リンパ腫においてＡＬＫシグナル伝達の重要な下流のメディエーターであることが以前に示されているＳＨＩＰ２、ＩＲＳ−１、ＩＲＳ−２などの下流のシグナル伝達分子の候補を特定した。さらに、融合相手であるＥＭＬ４のリン酸化が顕著に認められた（図３Ｅ）。ｃ−ＲＯＳを発現している試料（図３Ｆ）において高度にリン酸化されているものとして、神経膠芽腫においてＲＯＳの重要な下流のエフェクターであることが以前に報告されているＰＴＰＮ１１およびＩＲＳ−２を特定した（Charest, A., Wilker, E.W., McLaughlin, M.E.,
Lane, K., Gowda, R., Coven, S., McMahon, K., Kovach, S., Feng, Y., Yaffe, M.B.ら（2006）ROS fusion tyrosine kinase activates a SH2 domain-containing
phosphatase-2/phosphatidylinositol 3-kinase/mammalian target of rapamycin
signaling axis to form glioblastoma in mice. Cancer Res. 66, 7473-7481）。
【００６６】
ＡＬＫまたはＲＯＳの遺伝子座のいずれかの側に対するＦＩＳＨ分離プローブを作製して、ｃ−ＲＯＳを発現している細胞株および腫瘍の両方における転座を特定した（図３Ｈ）。ＡＬＫおよびＥＭＬ４は２番染色体の同じアームに位置するため、その間のＤＮＡの欠失によって予測どおりの分離パターンが確認された（図３Ｇ）。ＭＳ／ＭＳで分析した１０３個のＮＳＣＬＣ腫瘍からＡＬＫおよびＥＭＬ４のプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ分析を行い、陽性な３つの試料（表２）を特定し、ＥＭＬ４−ＡＬＫの頻度は３％であった；さらに、ＴＧＦ−ＡＬＫの試料も加えると、全体のＡＬＫの融合の頻度は中国の人口の４％となる。
【００６７】
実施例７
ＮＳＣＬＣにおけるＰＤＧＦＲαの活性化：イマチニブに対する感受性
１種のＮＳＣＬＣ細胞株Ｈ１７０３および８つの異なる腫瘍試料において異常に活性化されたものとしてＰＤＧＦＲαを確認した（図５Ａおよび表１）。また、Ｈ１７０３細胞もリン酸化型のＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ１、および他のＲＴＫを発現していることが判明した（図５Ａ）。ウエスタンブロットによってＰＤＧＦＲαのタンパク質発現を確認した（図９Ａ）。ＰＤＧＦＲ阻害剤イマチニブ（グリベック）およびＥＧＦＲ阻害剤ゲフィチニブ（イレッサ）に対するＨ１７０３細胞の感受性を調べた。Ｓｅｒ４７３におけるＡｋｔのリン酸化は、イマチニブによって阻止されるが、ゲフィチニブ処置によっては阻止されないことが判明した（図５Ｂ）。また、イマチニブの用量反応実験（図９Ｂ）によって、ｐ４４／４２ＭＡＰＫのリン酸化にはたとえあるにせよわずかな効果しかない１００ｎＭのイマチニブで、ＰＤＧＦＲαおよびＡｋｔのリン酸化のほぼ完全な阻害が示されることが判明した。
【００６８】
２０種のＮＳＣＬＣ細胞株のイマチニブに対する感受性をさらに調査するために、細胞増殖のＭＴＴアッセイを実施した。図５Ｃに示したように、Ｈ１７０３細胞は、Ｂｃｒ−Ａｂｌ融合タンパク質を過剰発現するＫ５６２細胞（Druker, B.J., Sawyers, C.L.,
Kantarjian, H., Resta, D.J., Reese, S.F., Ford, J.M., Capdeville, R.およびTalpaz, M.（2001）Activity of a specific inhibitor of the
BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and
acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia
chromosome. N. Engl. J. Med. 344, 1038-1042；Mahon, F.X.,
Deininger, M.W., Schultheis, B., Chabrol, J., Reiffers, J., Goldman, J.M.およびMelo, J.V.（2000）Selection and
characterization of BCR-ABL positive cell lines with differential sensitivity
to the tyrosine kinase inhibitor STI571：diverse mechanisms
of resistance. Blood 96, 1070-1079）と類似した感受性プロファイルを示した。対照的に、１９種のＮＳＣＬＣ細胞株（Ａ５４９、Ｈ１３７３、Ｈ４４１、およびＰＤＧＦＲａ発現について陰性である他の多くの細胞株）はイマチニブに対し非感受性であり（図５Ｃ）、薬物感受性とキナーゼリン酸化との相関がみられた。得られたイマチニブの感受性プロファイルは、Ａ５４９細胞におけるＰＤＧＦＲαの発現を確認し、イマチニブに対する感受性を示した先行文献（Zhang, P., Gao, W.Y., Turner,
S.およびDucatman, B.S.（2003）Gleevec（STI-571）inhibits lung cancer cell growth（A549）and potentiates the cisplatin effect in
vitro. Mol. Cancer 2, 1）とは異なっていた。アポトーシスにおけるイマチニブの効果を試験するために、Ｈ１７０３細胞をイマチニブで処置して、ＰＡＲＰおよびカスパーゼ３の切断をそれぞれ、ウエスタンブロットおよびフローサイトメトリーによって試験した。イマチニブ（０．１ｍＭ）によって、Ｈ１７０３細胞における切断カスパーゼ３および切断ＰＡＲＰの発現は著しく上昇した（図８Ｃおよび図８Ｄ）。次に、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるイマチニブの効果をマウス異種移植モデルを用いて試験した。ヌードマウスの皮下にＨ１７０３細胞を注入し、数週間にわたり腫瘍の形成を監視した。最初の目視可能な腫瘍の出現に応じて、イマチニブ（５０ｍｇ／ｋｇ）または賦形剤を１日１回で２週間マウスに処置した。イマチニブ処置したマウスは腫瘍の増殖に対して即時かつ顕著な効果を示した一方、対照マウスでは腫瘍の増殖が続いた（図５Ｄおよび図８Ｆ）。対照動物およびイマチニブ処置した動物の腫瘍増殖を定量化し（図５Ｄ）、複雑な腫瘍環境においてもイマチニブに対する強い感受性が示された。
【００６９】
リン酸化チロシンのシグナル伝達におけるイマチニブの効果を解析するため、重いアミノ酸の標識培地中および軽いアミノ酸の標識培地中でＨ１７０３細胞を増殖させ、イマチニブで処置し、あるいはイマチニブで処置せずに、質量分析法／ＳＩＬＡＣによってリン酸化ペプチドを分析した（Everley, P.A., Bakalarski,
C.E., Elias, J.E., Waghorne, C.G., Beausoleil, S.A., Gerber, S.A., Faherty,
B.K., Zetter, B.R.およびGygi, S.P.（2006）Enhanced
analysis of metastatic prostate cancer using stable isotopes and high mass
accuracy instrumentation. J. Proteome Res. 5, 1224-1231；Ong,
S.E., Blagoev, B., Kratchmarova, I., Kristensen, D.B., Steen, H., Pandey, A.およびMann, M.（2002）Stable isotope
labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate
approach to expression proteomics. Mol. Cell. Proteomics 1, 376-386）。いくつかのタンパク質およびリン酸化部位がイマチニブを用いた処置によって変化した。イマチニブを用いたＨ１７０３細胞の処置により、ＰＤＧＦＲα受容体の異なる部位で異なる効果があった（図５Ｅ）。１０部位のチロシンリン酸化が認められ、３つの新規部位を特定した（Ｔｙｒ６１３、９２６、９６２）。また、イマチニブは、ホスホリパーゼＣｇ１、調節サブユニットのＰＩ３Ｋ、Ｓｔａｔ５、およびＳＨＰ−２を含む重要な下流のシグナル伝達タンパク質のいくつかのチロシンリン酸化も抑圧した（図５Ｆを参照されたい）。さらに、イマチニブは、細胞骨格およびアクチンの再編成を制御するタンパク質ならびに膜のリサイクルおよびエンドサイトーシスに関わるシグナル伝達分子のチロシンリン酸化を抑圧した。ＥＧＦＲおよびＦＧＦＲに対するリガンドを遊離させる（Peduto, L., Reuter, V.E.,
Shaffer, D.R., Scher, H.I.およびBlobel, C.P.（2005）Critical
function for ADAM9 in mouse prostate cancer. Cancer Res. 65, 9312-9319）既知の細胞表面メタロプロテアーゼＡｄａｍ９（Mazzocca, A., Coppari, R., De
Franco, R., Cho, J.Y., Libermann, T.A., Pinzani, M.およびToker, A.（2005）A secreted form of ADAM9 promotes carcinoma
invasion through tumor-stromal interactions. Cancer Res. 65, 4728-4738）がＨ１７０３細胞において高度にリン酸化されることが明らかとなった。また、イマチニブは、ｒａｓエフェクターＲｉｎ１（Hu, H., Bliss,
J.M., Wang, Y.およびColicelli, J.（2005）RIN1 is an ABL tyrosine kinase activator and a regulator of
epithelial-cell adhesion and migration. Curr. Biol. 15, 815-823）のリン酸化も阻害し、セラミド合成に関わる酵素であるＳＭＳ２（Taguchi, Y., Kondo, T.,
Watanabe, M., Miyaji, M., Umehara, H., Kozutsumi, Y.およびOkazaki, T.（2004）Interleukin-2-induced survival of natural
killer（NK）cells involving
phosphatidylinositol-3 kinasedependent reduction of ceramide through acid
sphingomyelinase, sphingomyelin synthase, and glucosylceramide synthase. Blood
104, 3285-3293）のリン酸化も阻害した。選択したＳＩＬＡＣの結果をウエスタン分析によって確認した（図９Ｅ）。この実験を別々に３回繰り返し、同様の結果を得た。
【００７０】
実施例８
ＮＳＣＬＣ腫瘍試料中のＰＤＧＦＲａ
表２で最も高いレベルのＰＤＧＦＲリン酸化を有する５個の腫瘍からのペプチドを分析した。これらの腫瘍（第２群、図３Ａ）は、他の多くの活性チロシンキナーゼに加えて、ＦＡＫ、Ａｂｌ、ＤＤＲ１／２およびＶＧＥＦ１／２を発現していることが明らかとなった。Ｈ１７０３細胞と同様に、これらのＮＳＣＬＣ腫瘍も、高度にリン酸化された接着タンパク質および細胞骨格タンパク質を示しており（図３Ｇ）、これは、細胞運動性の経路の関与を示唆している。ＰＤＧＦＲα特異的抗体を用いたＩＨＣによって独自の分析を実施し、ＮＳＣＬＣ腫瘍の試料をスクリーニングして、患者の試料の２％〜３％で強いＰＤＧＦＲα染色を確認した（図９Ｇ）。この結果も、ＮＳＣＬＣの腺癌の１００％がＰＤＧＦＲαを発現するという報告（Zhang, P., Gao, W.Y., Turner,
S.およびDucatman, B.S.（2003）Gleevec（STI-571）inhibits lung cancer cell growth（A549）and potentiates the cisplatin effect in
vitro. Mol. Cancer 2, 1）とは異なっていた。蛍光ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）解析により、このＩＨＣ陽性のＮＳＣＬＣ試料の１つでＰＤＧＦＲα遺伝子座における増幅が認められた（図９Ｈ）。
【００７１】
実施例に記載の実験手順がより完全に理解されるように、実施例で用いたいくつかの材料および方法を以下に記載する。これらの材料および方法は例示のみを目的とし、いかなる形であれ本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００７２】
細胞培養、試薬、ウエスタンブロット分析、および免疫沈降分析
細胞培養試薬をInvitrogenから購入した。アメリカ培養細胞系統保存機関からヒトＮＳＣＬＣ細胞株を入手した。ＲＯＳおよびリン酸化型ＰＤＧＦＲαの抗体をSanta Cruzから、その他すべての抗体をCell Signaling
Technology（CST）から購入した。CSTのプロトコルに従ってウエスタンブロット分析および免疫沈降分析を実施した。
【００７３】
ヒトＮＳＣＬＣ細胞株のＨ５２０、Ｈ８３８、Ｈ１４３７、Ｈ１５６３、Ｈ１５６８、Ｈ１７９２、Ｈ１９４４、Ｈ２１７０、Ｈ２１７２、ＨＣＣ８２７、Ｈ２２２８、Ｈ２３４７、Ａ５４９、Ｈ４４１、Ｈ１７０３、Ｈ１３７３、Ｈ３５８、Ｈ１９９３、Ｃａｌｕ−３、Ｈ１６４８、Ｈ１９７５、Ｈ１６６６、Ｈ１８６９、Ｈ１６５０、Ｈ１７３４、Ｈ１７９３、Ｈ２０２３、Ｈ６６１、Ｈ２４４４、Ｈ１２９９、Ｈ１６９３、Ｈ２２６、Ｈ１６２３、Ｈ１６５１、Ｈ４６０、Ｈ２１２２、およびＳＫＭＥＳ−１をアメリカ培養細胞系統保存機関から入手した。これらの細胞を、１０％ＦＢＳを含有し、かつ２ｍＭ
Ｌ−グルタミン、１．５ｇ／Ｌ 炭酸水素ナトリウム、４．５ｇ／Ｌ グルコース、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１．０ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するように調整したＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。ＮＳＣＬＣ細胞株のＨＣＣ７８、Ｃａｌ−１２Ｔ、ＨＣＣ３６６、ＨＣＣ１５、ＨＣＣ４４、およびＬＯＵ−ＮＨ９１をＤＳＭＺから購入し、これらを１０％ＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０で培養した。細胞を５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で維持した。免疫親和性の沈降および免疫ブロットの実験用には、細胞を８０％コンフルエンスまで増殖させた後に、ＦＢＳなしのＲＰＭＩ培地で回収前に一晩飢餓させた。薬剤（イレッサおよびグリベック）をＤＭＳＯ中に溶解し、１０ｍＭの保存溶液を調製して、−２０℃で保存した。
【００７４】
処置した細胞を冷却したＰＢＳで２回洗浄し、次いで、これらを、Complete, Mini, EDTA-freeプロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche）を添加した１×細胞溶解緩衝液（２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ、２．５ｍＭ ピロリン酸ナトリウム、１ｍＭ β−グリセロリン酸、１ｍＭ
Ｎａ３ＶＯ４、１μｇ／ｍＬ ロイペプチン）に溶解した。溶解液を超音波で破砕して、１４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。Coomassieタンパク質アッセイ試薬（Pierce Chemical社、Rockford, IL）を用いてタンパク質濃度を測定した。等量の総タンパク質を８〜１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって分離し、ニトロセルロース膜に転写した。CSTのプロトコルに従い、ブロットを適切な抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。免疫沈降には５００ｕｇのタンパク質溶解液を使用した。清澄化したタンパク質溶解液を２ｕｇの適切な抗体および１５ｕＬのプロテインＧアガロースビーズ（Pierce）と共に４℃で一晩揺動させた。１×細胞溶解緩衝液を用いてこのビーズを３回洗浄し、３０ｕＬの２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液中で５分間煮沸した。次いで、ウエスタンブロット法によって、結合したタンパク質を分析した。
【００７５】
リン酸化ペプチドの免疫沈降およびＬＣ−ＭＳ／ＭＳ質量分析による分析
種々の細胞株からのリン酸化ペプチドの免疫沈降を、以前に記載されているように（Rush, J., Moritz, A., Lee,
K.A., Guo, A., Goss, V.L., Spek, E.J., Zhang, H., Zha, X.M., Polakiewicz, R.D.およびComb, M.J.（2005）Immunoaffinity profiling of tyrosine
phosphorylation in cancer cells. Nat. Biotechnol. 23, 94-101）、CSTのPhosphoScanキット（P-Tyr-100）を用いて実施した。簡単に説明すると、尿素溶解緩衝液（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ８．０、９Ｍ 尿素、１ｍＭ バナジン酸ナトリウム、２．５ｍＭ ピロリン酸ナトリウム、１ｍＭ β−グリセロリン酸）中に１億個の細胞を溶解した。
【００７６】
腫瘍の試料では、電子ホモジナイザーPolyTronを使用して、２００〜５００ｍｇの組織を尿素溶解緩衝液（１ｍＬ／１００ｍｇの組織）中で各３０秒の２パルスでホモジナイズした。溶解液を超音波で破砕し、遠心分離によって清澄化した。清澄化した溶解液を、ＤＴＴによって還元して、ヨードアセトアミドでアルキル化した。次いで、２０ｍＭのＨｅｐｅｓを用いて試料を４回希釈して尿素濃度を２Ｍに低下させて、穏やかに振盪しながらトリプシンによって室温で一晩消化させた。Sep-Pak C18カートリッジを用いてペプチドを粗製した。溶出液を凍結乾燥し、乾燥させたペプチドを１．４ｍＬのＭＯＰＳ ＩＰ緩衝液（５０ｍＭ ＭＯＰＳ／ＮａＯＨ ｐＨ７．２、１０ｍＭ Ｎａ２ＰＯ４、５０ｍＭ
ＮａＣｌ）中に溶解して、遠心分離によって不溶性物質を除去した。プロテインＧアガロースビーズ（Roche）に結合させた１６０ｕｇのリン酸化チロシン１００抗体（CST）を用いて、４℃で一晩、免疫沈降を行った。次いで、冷却しながら、ビーズを１ｍＬのＭＯＰＳ ＩＰ緩衝液で３回、１ｍＬの冷却したＨＰＬＣグレードのｄＨ２Ｏで２回洗浄した。ペプチドをＩＡＰ溶出液中で濃縮し、０．２μＬの逆相StageTips上でさらに精製した（Rappsilber, J., Ishihama, Y.およびMann, M.（2003）Stop and go extraction tips for
matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample
pretreatment in proteomics. Anal Chem.75（3):663-70）。５μＬの６０％ＭｅＣＮ、０．１％ＴＦＡを用いてStageTipsからＬＣ−ＭＳ試料バイアル中にペプチドを溶出し、真空濃縮装置を用いて乾燥させた。乾燥試料を５μＬの５％ギ酸、５％ＭｅＣＮに溶解した。この試料（４μＬ）を、不活性のサンプルインジェクションバルブを有するFamosオートサンプラー（Dionex）を用いて、Magic C18 AQ逆相樹脂（Michrom Bioresources）を充填した１０ｃｍ×７５μｍのPicoFritキャピラリーカラム（New Objective）上にロードした。次いで、このカラムを、０．４％酢酸、０．００５％ＨＦＢＡ中のアセトニトリルの４５分間の直線濃度勾配によって、流速２８０ｎＬ／分（Ultimate、Dionex）で展開した。タンデムマススペクトルを、LTQイオントラップ質量分析計（ThermoFinnigan）により、トップ１０法を用いて、動的除外反復カウント１、反復期間３０秒間、データ従属方式で収集した。試料を回収して、LTQ-Orbitrapハイブリッド質量分析計により、トップ１０法を用いて、動的除外反復カウント１、反復期間３０秒間で、LTQ-Orbitrapタンデムマススペクトルについて実行した。質量分析計を構成しているOrbitrap内でＭＳスペクトルを収集し、LTQ内でＭＳ／ＭＳスペクトルを収集した。
【００７７】
グリベックで処置したＨ１７０３細胞のＳＩＬＡＣ分析
同数のＨ１７０３細胞を、軽いＳＩＬＡＣ培地または重いＳＩＬＡＣ培地（軽い培地には通常のＬ−リジン：ＨＣｌおよびＬ−アルギニン：ＨＣｌ（Sigma）、あるいは重い培地にはＬ−アルギニン：ＨＣｌ（Ｕ−１３Ｃ６、９８％）およびＬ−リジン：２ＨＣｌ（Ｕ−１３Ｃ６、９８％；Ｕ−１５Ｎ２、９８％）（Cambridge Isotope Laboratories）のいずれかを補充した、アルギニンおよびリジン欠乏ＲＰＭＩ培地）のいずれかに分割して増殖させた。また、この培地には１０％のＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンも入れた。それぞれの種類の培地中で細胞が１億個になるまで細胞を少なくとも５世代増殖させた。次いで、重い培地中で増殖させた細胞を１μＭのグリベックで３時間処置した。処置した細胞および対照細胞の両方を尿素溶解緩衝液中に溶解し、上記のようなリン酸化ペプチドの免疫沈降実験に進めた。
【００７８】
リン酸化部位データセットの分析
ペプチド配列を帰属するために、PhosphoSiteでタンパク質を探索するためにBiofacet（Gene-IT）において実行されるハッシュの文字列照合アルゴリズムを用いた。ペプチド配列が複数のタンパク質と合致した場合には、アルファベット順に最初の登録番号を持つタンパク質が代表として選択される。例えば、ＧＡＳＱＡＧＭ＃ＴＧＹ＊ＧＭＰＲはＳＭ２２−アルファ（Ｐ３７８０２）およびＴＡＧＬＮ３（Ｑ９ＵＩ１５）の両方と合致し、ＳＭ２２−アルファに帰属することとなる。少量のペプチドであれば最もよく調べられているタンパク質のセットを代表として手動で選択する。ＧＳＫ３α（Ｐ４９８４０）およびＧＳＫ３β(Ｐ４９８４１）の両方に照合するペプチドＧＥＰＮＶＳＹ＊ＩＣＳＲの場合は、代表としてＧＳＫ３βに帰属した。
【００７９】
質量分析を行う中で各ペプチド配列について観測されたスペクトルの数を計数した（Liu, H., Sadygov, R.G.およびYates, J.R.,
3rd.（2004）A model for random sampling
and estimation of relative protein abundance in shotgun proteomics. Anal. Chem.
76, 4193-4201）。スペクトルを下記の質の判断基準に当てた（すなわち「ＬＴＱ−ＦＴ ＭＳ、Sequest Search、およびVistaの方法（ｐＴｙｒ ＳＩＬＡＣの試料）」で）。タンパク質のスペクトル数を計算するために、その実行において各タンパク質に帰属したすべてのペプチド数を合計した。ピアソン相関距離および平均連結法のクラスタ分析と共にTIGRのMeVプログラムを用いて階層的クラスタ分析を行った（Saeed, A.I., Sharov, V.,
White, J., Li, J., Liang, W., Bhagabati, N., Braisted, J., Klapa, M., Currier,
T., Thiagarajan, M.ら（2003）TM4：a free, open-source
system for microarray data management and analysis. Biotechniques 34, 374-378）。所定のリン酸化タンパク質が確認された回数（そのタンパク質に帰属した観測された全スペクトルの合計）をMeVに取り込み、それを用いてヒートマップを構築した。
【００８０】
各患者の試料について、各タンパク質のスペクトル数をＧＳＫ３βのスペクトル数に標準化し、全腫瘍にわたるタンパク質の平均数を差し引いた。
【００８１】
ＬＴＱ−ＦＴ ＭＳ、Sequest Search、およびVistaの方法（ｐＴｙｒ ＳＩＬＡＣの試料）
各リン酸化ペプチドの試料を２回ずつＬＣ−ＭＳ分析した。融合シリカミクロキャピラリーカラム（１２５μｍ×１８ｃｍ）をC18逆相樹脂（Magic C18AQ、粒子5μm、ポアサイズ200A、Michrom Bioresources、Auburn、CA）で充填した。オートサンプラー（LC Packings Famos、San Francisco、CA）を用いて、試料（４μＬ）をこのカラム上にロードして、０．１％ギ酸中の７〜３０％アセトニトリルの５５分間の直線濃度勾配によって、質量分析計中に溶出した。インラインフロースプリッタを用いてバイナリＨＰＬＣポンプ（Agilent 1100、Palo Alto、CA）を使用しておよそ６００ｎＬ／分でこの勾配を行った。ハイブリッド直線イオントラップ−７のTeslaイオンサイクロトロン共鳴フーリエ変換装置（LTQ-FT、Thermo Electron、San Jose、CA）を用いて溶出したペプチドイオンを質量分析した。トップ７法を用いて、ＩＣＲ細胞において事前にＭＳ調査走査の間に行われた測定に基づいて、直線的イオントラップおよびフーリエ変換装置の同時走査を用いて、７データに従属したＭＳ／ＭＳ走査を収集した。自動利得制御（ＡＧＣ）標的３×１０６かつ質量解像度１０５を用いて、ＭＳ走査を３７５−１８００ｍ／ｚで実施した。ＭＳ／ＭＳについてＡＧＣは４０００、動的除外時間は２５秒であり、わずかに荷電したイオンは荷電状態スクリーニングにより除去した。
【００８２】
Sequestソフトウェア（v.27, rev.12）および複合前方／逆行ＩＰＩヒトタンパク質データベースを用いて、ペプチド配列をＭＳ／ＭＳスペクトルに帰属した。検索パラメータは以下の通りであった：プロテアーゼとしてトリプシン；１．０８Ｄａ前駆体質量耐性；システイン上の静的修飾（＋５７.０２１４６、カルボキシアミドメチル化）；ならびにセリン、スレオニンおよびチロシン（＋７９.９６６３３Ｄａ、リン酸化）、リジン（＋８.０１４２０、１３Ｃ６、１５Ｎ２）、アルギニン（＋６.０２０１３、１３Ｃ６）、およびメチオニン（＋１５.９９４９１、酸化）上の動的修飾。予測擬陽性帰属率が１％より低くなる適切なスコア選別基準を確立するために、標的／デコイデータベース法を用いた。電荷依存ＸＣｏｒｒ閾値（ｚ＝２ではＸＣｏｒｒ２．２以上、ｚ＝３ではＸＣｏｒｒ３．３以上、ｚ＝４ではＸＣｏｒｒ３．５以上）を上回ることに加え、リン酸化チロシンを含み、−５〜＋２５ｐｐｍの質量精度を有し、かつすべて軽いリジン／アルギニン残基もしくはすべて重いリジン／アルギニン残基を含むように帰属を求めた。さらに、ピーク面積および各ペプチドの重い形態と軽い形態との間の最終的な相対的存在量を計算するために、カスタム定量化プログラムVistaを使用して基準を満たす帰属を評価した（Bakalarski, C. E., Elias, J.
E., Villen, J. Haas, W., Gerber, S.A., Everley, P.A.およびGygi, S.P.（2008）The Impact of Peptide Abundance and Dynamic
Range on Stable-Isotope-Based Quantitative Proteomic Analyses. J. Proteome Res.
10.1021 /pr800333e）。ＭＳ走査で信号対ノイズが１５未満と確認されたペプチドは定量化について考慮しなかった。１つの状態にのみ見出されたペプチドについては、信号対ノイズ比を代わりに使用した。
【００８３】
５'ＲＡＣＥ法およびＲＴ−ＰＣＲ
5'
RACEシステム（Invitrogen）を用いてｃＤＮＡ末端の高速増幅を行った。RNeasy Miniキット（Qiagen）を用いて細胞株および患者から全ＲＮＡを抽出した。５'ＲＡＣＥ反応において細胞株および患者の異常なＡｌｋ転写産物を特定するために、プライマーには、ｃＤＮＡ合成用のＡｌｋ−ＧＳＰ１プライマー（５'−ＧＣＡＧＴＡＧＴＴＧＧＧＧＴＴＧＴＡＧＴＣ）ならびにネストＰＣＲ反応用のＡｌｋ−ＧＳＰ２プライマー（５'−ＧＣＧＧＡＧＣＴＴＧＣＴＣＡＧＣＴＴＧＴ）およびＡｌｋ−ＧＳＰ３プライマー（５'−ＴＧＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＴＧＣＴＴＣＣ）を用いた。５'ＲＡＣＥ反応において細胞株および患者の異常なＲｏｓ転写産物を特定するために、プライマーには、ｃＤＮＡ合成用のＲｏｓ−ＧＳＰ１プライマー（５'−ＴＧＧＡＡＡＣＧＡＡＧＡＡＣＣＧＡＧＡＡＧＧＧＴ）ならびにネストＰＣＲ反応用のＲｏｓ−ＧＳＰ２プライマー（５'−ＡＡＧＡＣＡＡＡＧＡＧＴＴＧＧＣＴＧＡＧＣＴＧＣＧ）およびＲｏｓ−ＧＳＰ３プライマー（５'−ＡＡＴＣＣＣＡＣＴＧＡＣＣＴＴＴＧＴＣＴＧＧＣＡＴ）を用いた。PCR精製キット（Qiagen）を用いてこれらのＰＣＲ産物を精製して、それぞれＡｌｋ−ＧＳＰ３およびＲｏｓ−ＧＳＰ３を用いてABI 3130キャピラリー型自動ＤＮＡシークエンサー（Applied
biosystem）を使用してこれらの配列決定を行った。
【００８４】
ＳｉＲＮＡ
Proligoから以下のＲＯＳのｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを得た：ＲＯＳ１（６３１８−６３４０）５'−ＡＡＧＣＣＣＧＧＡＵＧＧＣＡＡＣＧＵＵＴＴ−３'、ＲＯＳ１（７１８１−７２０３）５'−ＡＡＧＣＣＵＧＡＡＧＧＣＣＵＧＡＡＣＵＴＴ−３'。トランスフェクション前日に１２ウェルプレート中にＮＳＣＬＣ細胞を播種し、Mirus TransIT-TKOトランスフェクション試薬を用いて１００ｎＭのＲＯＳのｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、トランスフェクション４８時間後にさらに２４時間細胞を血清飢餓させた。トリプシン処理によって細胞を回収して計数し、細胞溶解液を調製して、ウエスタンブロットでＲＯＳのタンパク質レベルを調べた。
【００８５】
動物試験
Taconicから４〜６週齢の雌のＮＣＲヌードマウスを購入し、それらを用いてＨ１７０３の異種移植片を作製した。ＩＡＣＵＣが承認したプロトコルのもとで実験を行った。調査における適切かつ人道的な動物の使用のため、機関のガイドラインに従った。５×１０６のＨ１７０３細胞を１０匹のマウスに注入することにより腫瘍を発生させ、基底膜Matrigel（BD Biosciences）をＰＢＳ中に１：１の割合で再構成させた。腫瘍サイズが約１ｍｍ×１ｍｍの時に薬剤治療を開始した。５０ｍｇ／ｋｇ／日でグリベックを用いて、先端丸型の給餌管を使用した経口胃管栄養法によって、５匹のマウスを治療した。５匹のマウスは未治療であった。治療開始７日後に、動物を屠殺し、腫瘍を切除して秤量した。キャリパーを使用してマウスの対照群および治療群の両方にある腫瘍の平均直径を測定した。
【００８６】
増殖阻害アッセイおよびアポトーシスアッセイ
製造業者の指示に従って、CellTiter 96 Aqueous One Solution細胞増殖アッセイ（Promega）を用いて細胞増殖阻害アッセイを実施した。簡単に説明すると、平底９６ウェルプレート上に１０００〜５０００個の細胞を播種して、１０％ＦＢＳ入りの完全培地で増殖させた。２４時間後、細胞の培地を、さまざまな濃度のグリベックを含む１０％ＦＢＳ入りの完全増殖培地１００μＬに変更して、細胞をさらに７２時間インキュベートした。薬剤の各濃度を３通りのウェルの細胞に加えた。インキュベーションの終わりに２０μＬのCellTiter 96 AQUESOUS One溶液を各ウェルに加え、プレートを１〜４時間インキュベートした。Titan Multiskan Ascentマイクロプレートリーダー（Titertek
Instrument）を使用して４９０ｎｍで吸光度を読み取った。未処置細胞に対する処置細胞の吸光度測定値の平均±ＳＤ値の百分率として増殖阻害を表した。このアッセイを少なくとも３回繰り返した。OriginPro 6.1ソフトウェア（OriginLab、Northampton、MA）を用いてＩＣ５０を計算した。
【００８７】
フローサイトメトリーを用いてカスパーゼの活性化を定量化することにより、グリベック誘発アポトーシスを測定した。細胞をグリベック（１μＭ、１０μＭ、またはＤＭＳＯのみ）で２４時間、３通りの１５ｃｍプレート中で処置した。ＰＢＳで短時間細胞をすすぎ、セルスクレイパーを用いてＰＢＳ中で細胞をプレートから静かにかき集め、これをペレット化して、直ちに、ＰＢＳ中の３％ホルムアルデヒドを用いて３７℃で１０分間固定した。次いで、氷冷の９０％メタノールで細胞を透過処理し、さらに分析するため、この溶液中で−２０℃で保存した。固定化し透過処理した細胞(５×１０６）を１２×７５ｍｍのポリプロピレンの培養管に分注し、遠心分離によってＰＢＳ中ですすぎ、次いで、非特異的な結合を防ぐために、０．５％ＢＳＡ（ＰＢＳ／ＢＳＡ）を含むＰＢＳ中、室温で１０分間インキュベートした。次いで、AlexaFluor 488を結合させ（Ａｓｐ１７５）、ＰＢＳ／ＢＳＡ中に１：１０で希釈した切断カスパーゼ３抗体（#9669、Cell Signaling
Technology、Danvers、MA）と共に、細胞を室温で１時間インキュベートした。続いて、遠心分離によってＰＢＳ／ＢＳＡ中で細胞をすすぎ、これを０．５ｍＬのＰＢＳ／ＢＳＡ中に再懸濁して、励起のため４８８ｎｍのアルゴンレーザーを使用するBeckman-Coulter FC500フローサイトメーターで分析した。
【００８８】
Ｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイ
ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ（Ｓ）融合遺伝子の短い型のオープンリーディングフレームをＨＣＣ７８のｃＤＮＡからＰＣＲにより増幅して、Ｃ末端にＭｙｃタグを付けてインフレームでｐＥｘｃｈａｎｇｅ−２ベクター（Strategene、CA）にクローニングした。１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭで増殖させた２９３Ｔ細胞を、ｐＥｘｃｈａｎｇｅ−２およびｐＥｘｃｈａｎｇｅ−２／ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ（Ｓ）のそれぞれでトランスフェクトした。トランスフェクション４８時間後に、細胞溶解液を回収した。Ｍｙｃタグ抗体を用いて免疫沈降した後に、キナーゼ緩衝液（６０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、３μＭ Ｎａ３ＶＯ４、および２．５ｍＭ ＤＴＴ）でＲｏｓ免疫複合体を３回洗浄した。基質として１ｍｇ／ｍＬのＰｏｌｙ（ＥＹ、４：１）またはＡＡＡＥＥＥＹＭＭＭＦＡＫＫＫのいずれかと共に、２５μＭのＡＴＰ、０．２ｕＣｉ／ｕＬの（ガンマ３２ｐ）ＡＴＰを含む５０μＬキナーゼ緩衝液にＲｏｓ免疫複合体を再懸濁することによりキナーゼ反応を開始させた。反応混合液をｐ８１の濾紙にスポットすることにより反応を停止させた。次いで、試料を洗浄して、シンチレーションカウンターを用いた検出によってキナーゼ活性についてアッセイした。
【００８９】
免疫組織化学染色
病理組織診断の確認および組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）の構築に適した試料の選別のために、ＮＳＣＬＣのヘマトキシリンおよびエオシンのスライドを再調査した。Beecher組織パンチャー／アレイシステム（Beecher Instruments）を用いてＴＭＡを構築した。各症例について、提供者の腫瘍塊から腫瘍組織の３つのコア試料を得た。免疫組織化学試験用にＴＭＡから連続的な厚さ４μｍの組織切片を切断した。病理組織を検証するため、ヘマトキシリンおよびエオシンで最初の切片を染色した。このスライドをキシレン中で脱パラフィン化し、段階的な濃度系列のエタノールで再水和した。抗原検索（０．０１Ｍ
ＥＤＴＡ緩衝液中で１８分間のマイクロ波加熱）を行った。３％の過酸化水素によって１０分間、内因性ペルオキシダーゼを阻止した。非特異的抗体の結合を阻止するために１０％のヤギ血清（Sigma）溶液を使用し、かつ製造者の推奨する濃度で一次抗体を使用した。スライドを４℃で一晩放置した。ＴＢＳＴ中で５分間×３回洗浄することによって一次抗体を除去した後に、スライドを二次抗体と共に室温で３０分間インキュベートした。ＴＢＳＴでさらに３回洗浄した後に、ストレプトアビジン−ビオチンペルオキシダーゼを用いてスライドを可視化した。低倍率で断片を走査した。染色した腫瘍細胞の割合および強度に基づいて０〜３の免疫染色スコアを評価した。また、膜または細胞質の染色の分布も記録し、高倍率で評価した。腫瘍細胞の染色の割合および強度を考慮して半定量的に免疫反応性をスコア化した。また高倍率においても膜または細胞質の染色の分布を査定した。免疫組織化学染色を可視的な４列規模（０〜３）でスコア化した。弱く染色した細胞が５％ある試料を陰性（スコア０）とした。弱い染色強度の陽性細胞が５％超〜２０％ある試料を弱陽性（スコア１）とスコア化した。中程度から強い染色の陽性細胞が２０％超〜５０％ある試料を中程度の陽性（スコア２）、強い強度の陽性細胞が５０％を超える試料を強陽性（スコア３）としてスコア化した。ＩＨＣスコア１を有するＮＳＣＬＣ試料を陽性試料とみなした。
【００９０】
蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
ＰＤＧＦＲα遺伝子座にかかる２つのＢＡＣクローン（ＲＰ１１−２３１Ｃ１８、ＲＰ１１−８ＯＬ１１）からなるプローブセット、およびセントロメアプローブ（CEP4、Vysis（Vysis、Dowers Grove、IL、USA））を用いたＦＩＳＨにより、ＰＤＧＦＲα遺伝子座における増幅を確認した。セントロメアプローブの多染色性によって、増幅を、ＰＤＧＦＲα遺伝子座それ自体の増幅と識別することができる。ＰＤＧＦＲαのプローブをSpectrum Orange dUTP（Vysis）で、CEP4をSpectrum Green dUTPで標識した。ＲＯＳに関わる再編成を解析するために、二色分離プローブを設計した。近位プローブ（ＢＡＣクローンＲＰ１−１７９Ｐ９）および２種類の遠位プローブ（ＢＡＣクローンＲＰ１１−３２３Ｏ１７、ＲＰ１−９４Ｇ１６）をそれぞれ、Spectrum Orange dUTPまたはSpectrum Green dUTPで標識した。ＡＬＫについては、二色分離再編成プローブをVysis（Vysis、Dowers Grove、IL、USA）から得た。この二色分離再編成プローブには、ＡＬＫの切断点の両側を別々に標識する２つの異なるプローブが含まれる。ＲＯＳおよびＡＬＫのプローブセットの両方について、ハイブッド形成した際に、陰性領域は橙色／緑色の融合シグナルのように見えるが、これらの遺伝子座における再編成によって橙色と緑色の別々のシグナルが生じることとなる。プローブの標識を行った。ニックトランスレーションによるこれらのプローブの標識およびホルマリン固定しパラフィン包埋した（ＦＦＰＥ）組織切片を用いた間期ＦＩＳＨは、製品使用説明書（Vysis）に従って、以下の点を変更して行った。簡単に説明すると、パラフィン包埋組織切片を再水和して、０．０１Ｍのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で１１分間、マイクロ波抗原賦活化を行った。切片を、プロテアーゼ（４ｍｇ／ｍＬペプシン、２０００〜３０００Ｕ／ｍｇ）で３７℃で２５分間消化し、脱水して、該ＦＩＳＨプローブセットと共に３７℃で１８時間ハイブリッド形成させた。洗浄後、Vectashieldマウンティングメディウム（Vector Laboratories、Burlingame、CA）中の４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ；０．５ｕｇ／ｍＬ）を核対比染色に適用した。スクリーニングには、ＮＳＣＬＣ患者の試料由来の０．１ｍｍの組織コアのアレイを用いた。切片全体を用いて陽性試料をさらに解析して、少なくとも５０細胞を計数して細胞遺伝学的な変化の頻度を解析した。該ＦＩＳＨプローブセットを用いたスクリーニングのためのＰＤＧＦＲαのＩＨＣ陽性試料のセットから１８名の患者の試料が利用可能であった。１４試料のスコア化に成功し、１つは大型の増幅を含んでいることが判明した。癌細胞の大多数が増幅を含んでいた。Ｈ１７０３の異種移植片を解析したが増幅は認められなかった。
【００９１】
受託番号
ヌクレオチド配列ＣＤ７４−ＲＯＳ：ＥＵ２３６９４５、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ（ロング)：ＥＵ２３６９４６、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ（ショート)：ＥＵ２３６９４７、ＥＭＬ４−ＡＬＫ：ＥＵ２３６９４８、およびタンパク質配列ＣＤ７４／ＲＯＳ：ＡＢＸ５９６７１、ＳＬＣ３４Ａ２／ＲＯＳ融合タンパク質ロングアイソフォーム：ＡＢＸ５９６７２、ＳＬＣ３４Ａ２／ＲＯＳ融合タンパク質ショートアイソフォーム：ＡＢＸ５９６７３、ＥＭＬ４／ＡＬＫ：ＡＢＸ５９６７４をGenBankに寄託した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チロシンキナーゼまたはリン酸化型チロシンキナーゼの有無またはレベルに基づいて癌細胞を分類する方法に関する。また、本発明は、癌の分類を用いて癌を治療する方法にも関する。本発明はさらに、癌の分類を用いて癌の治療の有効性を判定する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
肺癌は、現在世界中で、癌死の主要な原因となっている。何十年もの集中的な解析にもかかわらず、肺癌発症の原因となる役割を果たしている分子的な異常の大多数は未知のままである。肺癌で重要な発癌遺伝子には、Ｋ−ＲＡＳおよびＥＧＦＲの２つがあり、ＮＳＣＬＣ患者の１５％および１０％においてこれらに変異が生じている。大規模なＤＮＡ配列決定の試みにより、ＰＩ３ＫＣＡ、ＥＲＢＢ２、およびＢ−ＲＡＦの変異が確認されており、これは、合わせてさらに５％のＮＳＣＬＣ患者に相当する（Greenman, C.,
Stephens, P., Smith, R., Dalgliesh, G. L., Hunter, C., Bignell, G., Davies, H.,
Teague, J., Butler,
A., Stevens, C.ら（2007）Patterns of
somatic mutation in human cancer genomes. Nature 446, 153-158；Thomas, R.K., Baker, A.C., Debiasi, R.M., Winckler, W., Laframboise,
T., Lin, W.M., Wang, M., Feng, W., Zander, T., Macconnaill, L. E.ら（2007）High-throughput oncogene mutation profiling
in human cancer. Nat. Genet. 39, 347-351）。ＣＧＨアレイおよびＳＮＰアレイを用いた、増幅および欠失を含む再発性の染色体異常の解析により、癌において変化している多数のさらなる遺伝子が特定される見込みが出てきている（Chin, K., DeVries, S., Fridlyand, J., Spellman, P.T., Roydasgupta, R.,
Kuo, W. L., Lapuk, A., Neve, R.M., Qian, Z., Ryder, T.ら（2006）Genomic and transcriptional aberrations linked to breast cancer
pathophysiologies. Cancer Cell 10, 529-541；Neve, R.M.,
Chin, K., Fridlyand, J., Yeh, J., Baehner, F. L., Fevr, T., Clark, L., Bayani, N.,
Coppe, J.P., Tong, F.ら（2006）A
collection of breast cancer cell lines for the study of functionally distinct
cancer subtypes. Cancer Cell 10, 515-527)。しかし、遺伝学的なアプローチでは、ゲノム不安定性に関連した多くの変化の中で、原因となるわずかな変化を特定するのは困難である。したがって、疾患を引き起こしている鍵となる損傷に焦点を当てた方法が必要とされている。
【０００３】
このような一戦略には、癌における間違った細胞のシグナル伝達経路の解析が含まれる（Vogelstein, B.およびKinzler, K. W.（2004）Cancer
genes and the pathways they control. Nat. Med. 10, 789-799)。チロシンキナーゼを介したシグナル伝達は、癌において無秩序であることが多く、これは、多細胞生物においてこれらの酵素が多くの増殖および生存のシグナル伝達を媒介しているためである（Blume-Jensen, P.およびHunter, T.（2001）Oncogenic kinase signalling. Nature 411,
355-365)。近年、癌の治療において、選択的なチロシンキナーゼの阻害剤による成功が示されてきている。しかし、この成功は、活性化したキナーゼによって引き起こされる腫瘍の特定によるものであって、したがって、腫瘍の生存および臨床的な有用性は、標的とするキナーゼによって決まる（Dowell, J. E.およびMinna, J. D.（2005）Chasing
mutations in the epidermal growth factor in lung cancer. N. Engl. J. Med. 352,
830-832; Weinstein, I. B.（2002）Cancer. Addiction to oncogenes-the Achilles
heal of cancer. Science 297, 63-64）。したがって、疾患の惹起および進行における活性化チロシンキナーゼを特定する方法が必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
異常なチロシンキナーゼに基づいて癌細胞を分類できることが見出されている。このような分類は、癌を治療する際および癌の治療の有効性を判定する際に有用である。
【０００５】
したがって、本発明は、少なくとも１つのシグナル伝達経路にある１種または複数種のチロシンキナーゼの有無またはレベルに基づいて、試料中の癌細胞を分類する方法を提供する。また、本発明は、少なくとも１つのシグナル伝達経路にある１種または複数種のリン酸化型チロシンキナーゼの有無またはレベルに基づいて、癌細胞を分類する方法も提供する。
【０００６】
さらに、本発明は、少なくとも１つのシグナル伝達経路にある１種または複数種の異常に発現したチロシンキナーゼのレベルに基づいて癌細胞を分類し、その分類に基づいて有効量の１種または複数種のチロシンキナーゼ阻害剤を投与することによって、対象者の癌を治療する方法を提供する。また、本発明は、少なくとも１つのシグナル伝達経路にある１種または複数種の異常にリン酸化されたチロシンキナーゼのレベルに基づいて癌細胞を分類し、その分類に基づいて有効量の１種または複数種のチロシンキナーゼ阻害剤を投与することによって、癌を治療する方法も提供する。
【０００７】
さらに、本発明は、１種または複数種のチロシンキナーゼの有無またはレベルが治療の有効性と相関している場合に、試料中の少なくとも１つのシグナル伝達経路にある１種または複数種のチロシンキナーゼの有無またはレベルを検出することに基づいて、対象者における癌治療の有効性を判定する方法を提供する。また、本発明は、１種または複数種のチロシンキナーゼの有無またはレベルが治療の有効性と相関している場合に、試料中の少なくとも１つのシグナル伝達経路にある１種または複数種のリン酸化型チロシンキナーゼの有無またはレベルを検出することに基づいて、癌治療の有効性を判定する方法も提供する。
【０００８】
いくつかの実施形態では、１つまたは複数のＦＩＳＨ、ＩＨＣ、ＰＣＲ、ＭＳ、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、またはＥＬＩＳＡを用いて、１種または複数種のチロシンキナーゼの有無またはレベルを測定する。
【０００９】
いくつかの実施形態では、リン酸化ペプチドを免疫沈降して、免疫沈降したリン酸化ペプチドを解析することによって、１種または複数種のリン酸化型チロシンキナーゼの有無またはレベルを測定する。
【００１０】
いくつかの実施形態では、チロシンキナーゼは、ＥＧＦＲ、ＦＡＫ、Ｓｒｃ、ＡＬＫ、ＰＤＧＦＲａ、Ｅｒｂ２、ＲＯＳ、ｃＭｅｔ、Ａｘｌ，ｅｐｈＡ２、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、またはＦＧＦＲから選択される。
【００１１】
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の統計的な方法を用いて、癌細胞を分類する。この実施形態のいくつかの態様では、この統計的な方法は教師なしピアソンクラスタ分析である。
【００１２】
いくつかの実施形態では、癌細胞を、１種または２種のみの高度にリン酸化されたチロシンキナーゼを有するものとして分類する。他の実施形態では、癌細胞を、リン酸化型のＦａｋ、Ｓｒｃ、Ａｂｌ、ならびにＥＧＦＲ、ＡＬＫ、ＰＤＧＦＲａ、Ｅｒｂ２、ＲＯＳ、ｃＭｅｔ、Ａｘｌ、ｅｐｈＡ２、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＦＧＦＲ、ＶＥＧＲ−２、ＩＧＦＲ１、ＬＹＮ、ＨＣＫ、ＨＥＲ２、ＩＲＳ１、ＩＲＳ２、ＢＲＫ、ＥｐｈＢ４、ＦＧＦＲ１、ＥｒｂＢ３、ＶＥＧＦＲ−１、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ５、Ｔｙｒｏ３、ＥｐｈＢ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＢ３、Ｍｅｒ、ＥｐｈＢ４、およびＫｉｔからなる群から選択される少なくとも１つの受容体チロシンキナーゼを発現しているものとして分類する。他の実施形態では、癌細胞を、リン酸化型のＤＤＲ１、Ｓｒｃ、およびＡｂｌを発現しているものとして分類する。他の実施形態では、癌細胞を、リン酸化型のＳｒｃならびにＥＧＦＲ、ＡＬＫ、ＰＤＧＦＲａ、Ｅｒｂ２、ＲＯＳ、ｃＭｅｔ、Ａｘｌ、ｅｐｈＡ２、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＦＧＦＲ、ＶＥＧＲ−２、ＩＧＦＲ１、ＬＹＮ、ＨＣＫ、ＨＥＲ２、ＩＲＳ１、ＩＲＳ２、 ＢＲＫ、ＥｐｈＢ４、ＦＧＦＲ１、ＥｒｂＢ３、ＶＥＧＦＲ−１、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ１、 ＥｐｈＡ５、Ｔｙｒｏ３、ＥｐｈＢ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＢ３、Ｍｅｒ、ＥｐｈＢ４、およびＫｉｔからなる群から選択される少なくとも１つの受容体チロシンキナーゼを発現しているものとして分類する。他の実施形態では、癌細胞を、リン酸化型のＳｒｃおよびＡｂｌを発現しているものとして分類する。
【００１３】
他の実施形態では、癌細胞は肺癌、血液癌、前立腺癌、乳癌、または消化管の腫瘍に由来する癌細胞である。いくつかの実施形態では、これらの方法を、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を分類するために用いる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１Ａは、高度、中程度、および低度のリン酸化チロシンの発現を示した、パラフィン包埋したヒト非小細胞肺癌腫瘍組織のＩＨＣ染色の顕微鏡写真である。図１Ｂは、異なるパターンのリン酸化チロシン反応性を示す２２種の異なる非小細胞肺癌細胞株におけるリン酸化チロシンのシグナル伝達を示したウエスタンブロットである。図１Ｃは、免疫親和性のプロファイリング法の実施形態を示した略図である。細胞または組織を尿素緩衝液に溶解し、タンパク質分解酵素で消化する。結果として生じたペプチドを、固定化リン酸化チロシン特異的抗体（Ｐ−Ｔｙｒ−１００）を用いて免疫親和性精製し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで解析する。より大きな液体クロマトグラフィーのピークは小さなピークよりも多く抽出されるため、特定のタンパク質に割り当てられた観測スペクトル数は、このタンパク質の存在量の半定量的測定である。図１Ｄは、ＮＳＣＬＣ細胞株でＭｅｔおよびリン酸化型Ｍｅｔ（Ｔｙｒ１２３４／５）の発現を示したウエスタンブロットである。免疫ブロットとＭＳ／ＭＳで同定したリン酸化ペプチド数の比較を下に示している。同定した異なる部位数を括弧内に示している。
【図２】図２Ａは、リン酸化タンパク質の種類の分布を示した円グラフである。観測した各リン酸化タンパク質をPhosphoSiteの概念体系からタンパク質の区分に割り当てた。各区分にある固有のタンパク質の数は、全体の一部分として円グラフの楔型で表されている。図２Ｂは、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）間のスペクトル数の分布を示した円グラフである。細胞株（上）または腫瘍（下）のすべてにわたる各ＲＴＫに割り当てた観測スペクトルの総数を、観測された総ＲＴＫスペクトルの割合として表している。図２Ｃは、非受容体チロシンキナーゼのスペクトル数の分布を示した円グラフである。細胞株（上）または腫瘍（下）のすべてにわたる各ＴＫ（非受容体）に割り当てた観測スペクトルの総数を、観測された総ＴＫ（非受容体）スペクトルの割合として表している。図２Ｄおよび図２Ｅは、肺癌細胞株でのチロシンキナーゼのリン酸化を示したグラフである。各細胞株での各ＴＫに割り当てられた観測スペクトルの総数を、ピアソン相関の距離メトリックおよび平均連結法を使用したクラスタ分析の基盤として使用した。図２Ｄでは、標準化を適用していない。図２Ｅにおいて、行列にある各値は行平均を差し引いたものである。
【図３】図３Ａは、チロシンリン酸化による腫瘍のクラスタ分析を示したグラフである。患者の腫瘍にあるチロシンキナーゼのスペクトル数をＧＳＫ３βに対する数値に標準化し、次いで、図２Ｅに記載のようにクラスタ分析を行った。クラスタ分析によって、異なる組の優勢なチロシンキナーゼを含む腫瘍の群が５つ生じた。図３Ｂ〜図３Ｄは、異なる腫瘍群において選択された非キナーゼタンパク質のリン酸化を示したグラフである。腫瘍試料を図３Ａでのクラスタ分析によって定められた群に配分し、スペクトル数をＧＳＫ３βに対する数値に標準化した。タンパク質群からすべてのキナーゼを除去した後に、図２Ｅのようにデータをクラスタ化し、上位３０タンパク質を表示した。図３Ｂで用いた腫瘍は図３Ａの第１群由来であり、図３Ｃのものは第２群由来であり、図３Ｄのものは第４群由来である。図３Ｅ〜図３Ｇは、最も顕著なリン酸化タンパク質を示したグラフである。スペクトル数に基づいてタンパク質をランク付けして、上位２５を示している。腫瘍のタンパク質をランク付けする前に、各タンパク質の数値をＧＳＫ３βに対する数値に標準化して、次いで、全腫瘍のそのタンパク質の平均数値を差し引いた。細胞株のタンパク質では、すべての細胞株の平均数値を差し引いた。矢印は細胞株と腫瘍との間で共通しているタンパク質を指している。
【図４】図４Ａおよび図４Ｂは、Ｈ２２２８細胞株およびＨＣＣ７８細胞株にある受容体チロシンキナーゼ間のスペクトル数の分布を示した円グラフである。各ＲＴＫに割り当てた観測スペクトルの総数を、観測した総ＲＴＫスペクトルの割合として表している。図４Ｃは、ＥＭＬ４、ＡＬＫ、およびＥＭＬ４−ＡＬＫ融合タンパク質の略図である。矢印は染色体切断点を指している。図４Ｄは、ＴＦＧ、ＡＬＫ、およびＴＦＧ−ＡＬＫ融合タンパク質の略図である。矢印は染色体切断点を指している。図４Ｅは、ＳＬＣ３４Ａ２、ＲＯＳ、およびＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ融合タンパク質の略図である。矢印は染色体切断点を指している。図４Ｆは、ＣＤ７４、ＲＯＳ、およびＣＤ７４−ＲＯＳ融合タンパク質の略図である。矢印は染色体切断点を指している。
【図５】図５Ａは、Ｈ１７０３にある受容体チロシンキナーゼ間のスペクトル数の分布を示した円グラフである。図５Ｂは、Ａｋｔのリン酸化に対する、ＥＧＦＲ阻害剤およびＰＤＧＦＲ阻害剤の効果を示したウエスタンブロットである。Ｈ１７０３細胞は、ＥＧＦ、イレッサとＥＧＦ、またはグリベックで１時間の処置をするかしないかのいずれかを行い、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲα、およびＡｋｔのレベルをウエスタンブロットによって測定した。ＥＧＦＲ（Ｔｙｒ１０６８）およびＡｋｔ（Ｓｅｒ４７３）のリン酸化は、リン酸化状態特異的抗体を用いて測定した。図５Ｃは、Ｈ１７０３細胞においてメシル酸イマチニブが細胞増殖を阻害し、アポトーシスを誘発することを示したグラフである。Ｈ１７０３細胞をグリベックで７２時間処置して、ＭＴＳアッセイを行った。３回の実験の平均による結果を示した（エラーバーは標準偏差を示す）。図５Ｄは、Ｈ１７０３マウス異種移植片に対するイマチニブ治療を示したグラフである。同様のサイズの腫瘍を有するマウスを２群に分けて、一方の群（５匹のマウス）をグリベックで治療し、他方の群（５匹のマウス）は治療しなかった。治療の７日後に、各腫瘍のサイズ（ｍｍ長×ｍｍ幅）を測定した。図５Ｅは、Ｈ１７０３細胞におけるイマチニブによるＰＤＧＦＲαのリン酸化の調節を示したイメージ図である。Ｈ１７０３細胞を軽いアミノ酸および重いアミノ酸で標識して、ＳＩＬＡＣについて記載のように、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳタンデム質量分析によって分析した。質量分析によって検出されたＰＤＧＦＲαのリン酸化部位を、イマチニブの処置の３時間後に測定したフォールドの変化と共に示した。図５Ｆは、ＳＩＬＡＣおよびＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって測定されるような、Ｈ１７０３細胞におけるＰＤＧＦＲαの下流のシグナル伝達の調節を示したイメージ図である。赤い円は、イマチニブ処置後にリン酸化が減少したタンパク質を表している。黒および赤の矢印はそれぞれ、既知の基質および予測される基質（scansiteおよびnetphosK）を指している。
【図６】チロシンキナーゼにおけるリン酸化部位のクラスタ分析を示したグラフである。各腫瘍試料について、その部位の全試料の平均数値を差し引いた。次いで、試料を、全試料の最も高い標準偏差、ピアソン相関距離メトリック、および平均連結法を用いて、１２０部位を使用してクラスタ化した。
【図７】腫瘍と隣接組織との間のシグナル伝達の差異を示したｔ検定比較である。腫瘍および隣接組織にある各タンパク質のスペクトル数を、ＧＳＫ３βに対する数値に標準化した。全腫瘍および全隣接組織から隣接組織の平均数値を差し引いた。ピアソン相関距離および平均連結のクラスタ分析と共にTIGRのMeVプログラム（Saeed, A.I., Sharov, V.,White, J., Li, J., Liang, W., Bhagabati, N., Braisted, J., Klapa, M., Currier,T., Thiagarajan, M.ら（2003）TM4: a free, open-source system formicroarray data management and analysis. Biotechniques 34, 374-378）を用いてｔ検定を行って、隣接組織と腫瘍組織との間で著しい相違を示したチロシンリン酸化型タンパク質を特定した。
【図８】図８Ａは、ＮＳＣＬＣ細胞株におけるＡＬＫの発現を示したウエスタンブロットである。ＡＬＫの発現はＨ２２２８細胞にきわめて限定されている。図８Ｂは、ＮＳＣＬＣ細胞株におけるＲＯＳの発現を示したウエスタンブロットである。ＲＯＳの発現はＨＣＣ７８細胞株にきわめて限定されている。図８Ｃおよび図８Ｄはそれぞれ、ＨＣＣ７８細胞においてＲＯＳのノックダウンが細胞増殖を阻害し、細胞死を誘発することを示した棒グラフおよびウエスタンブロットである。ＨＣＣ７８細胞およびＨ２０６６細胞を、ＲＯＳに対するｓｉＲＮＡで４８時間トランスフェクトした。対照細胞およびトランスフェクトした細胞の生存率を、トリパンブルー除去法によって測定した。生存細胞の（４実験の）平均百分率＋／−ＳＤを棒グラフで表している。対照のｓｉＲＮＡおよびＲＯＳのｓｉＲＮＡ（１００ｎＭ）の両方からの細胞溶解液を、ＲＯＳ、切断ＰＡＲＰ、およびβ−アクチンの抗体を用いて免疫ブロットした。図８Ｅは、ｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイを示した棒グラフおよびウエスタンブロットである。ｐＥｘｃｈａｎｇｅ−２ベクターまたはｐＥｘｃｈａｎｇｅ−２／ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ（Ｓ）ベクターを２９３Ｔ細胞に一過的にトランスフェクトし、ＲＯＳ融合タンパク質をＭｙｃタグ抗体で免疫沈降して、キナーゼアッセイを実施した。図８Ｆは、ＲＯＳ融合タンパク質の細胞小器官の局在を示したウエスタンブロットである。ｐＥｘｃｈａｎｇｅ−２ベクターまたはｐＥｘｃｈａｎｇｅ−２／ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ（Ｓ）ベクターを２９３Ｔ細胞に一過的にトランスフェクトした。融合タンパク質の細胞小器官の局在をＭｙｃタグ抗体で検出した。原形質膜（ＰＭ）、サイトゾル、および核の分画のマーカーとして、ＩＧＦ１Ｒ、β−アクチン、およびラミンＡ／Ｃを使用した。図８Ｇは、ＡＬＫの切断分離再編成のプローブがＡＬＫ遺伝子の切断点の両側を別々に標識する２つのプローブを含むことを示した、図および顕微鏡写真である。ハイブッド形成した際に、天然のＡＬＫ領域は橙色／緑色（黄色）の融合シグナルのように見えるが、この遺伝子座における再編成によって橙色と緑色の別々のシグナルが生じることとなる。Ｈ２２２８細胞株および患者の試料には、２コピーの正常なＡＬＫ（黄色）ならびにＡＬＫ遺伝子座の３’部分に由来する１つの近位プローブ（赤色；白色の矢印）が含まれる。この遺伝子座の５’部分は欠失するようである。ＥＭＬ４、ＡＬＫおよびＥＭＬ４−ＡＬＫ融合タンパク質の略図である。矢印は染色体切断点を指している。図８Ｈは、ＲＯＳ遺伝子座内における再編成を示した、図および顕微鏡写真である。分離プローブを用いて、ＲＯＳ遺伝子座内での再編成を解析した。ＲＯＳ遺伝子座内における転座によって、ＨＣＣ７８細胞株（左）およびＮＳＣＬＣ腺癌の試料（右）で見られるように、黄色のシグナルが分離して赤色または緑色のシグナルとなる。
【図９】図９Ａは、ＮＳＣＬＣ細胞株におけるＰＤＧＦＲαを示したウエスタンブロットである。ＰＤＧＦＲαの発現はＨ１７０３細胞株にきわめて限定されている。図９Ｂは、Ｈ１７０３細胞におけるメシル酸イマチニブ（グリベック）によるＰＤＧＦＲαおよびＡｋｔのリン酸化の用量依存的な阻害剤を示したウエスタンブロットである。示した量のメシル酸イマチニブでＨ１７０３細胞を１時間処置して、リン酸化型ＰＤＧＦＲα（Ｔｙｒ７５４）、リン酸化型Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）、およびリン酸化型ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）のレベルをウエスタンブロットによって測定した。ＰＤＧＦＲα、Ａｋｔ、およびＭＡＰＫの総タンパク質レベルも同じ試料で測定した。図９Ｃは、アポトーシスアッセイの結果を示した棒グラフである。メシル酸イマチニブ（１μＭ、１０μＭ）またはＤＭＳＯ（対照）を４０％コンフルエントのＨ１７０３細胞に添加し、２４時間後、接着細胞および浮遊細胞の両方を収集して、フローサイトメトリーによって切断カスパーゼ３を定量化してアポトーシスを測定した。独立した３実験の平均による結果を示している（エラーバーは標準偏差を示す）。図９Ｄは、Ｈ１７０３細胞においてイマチニブが切断ＰＡＲＰの発現を誘発することを示したウエスタンブロットである。Ｈ１７０３細胞を漸増濃度のグリベックで３時間処置して、切断ＰＡＲＰを免疫ブロットによって測定した。ＰＤＧＦＲアルファのレベルを測定して、総タンパク質のローディングを調節した。図９Ｅは、グリベック感受性のリン酸化部位を確認するウエスタンブロットである。部位特異的かつリン酸化特異的な抗体を用いたウエスタン分析によって、同イマチニブ処置条件下（１μＭ、３時間）で質量分析により同定された同部位において、グリベックによってＰＤＧＦＲα、ＰＬＣγ１、およびＳＨＰ２のリン酸化が減少していることが確認される。Ｓｔａｔ３のリン酸化は、質量分析によって予測されたとおり、変化しなかった。図９Ｆは、Ｈ１７０３細胞から調製したマウス異種移植片において、メシル酸イマチニブが腫瘍増殖を阻止することを示した写真である。３匹の未治療マウス（赤色矢印）および５０ｍｇ／ｋｇのイマチニブ治療７日後の３匹のグリベック治療マウス（青色矢印）の典型的な腫瘍サイズである。図９Ｇは、ＰＤＧＦＲａの発現が腺癌および細気管支肺胞癌においてより著しく認められることを示した顕微鏡写真である。図９Ｈは、ＰＤＧＦＲαの増幅を示した図および顕微鏡写真である。正常な対照試料を左側に示す。赤色のシグナルはＰＤＧＦＲαプローブ（白色矢印）を示し、緑色のシグナルは４番染色体に位置しＰＤＧＦＲαの近位にあるセントロメアを示している。扁平上皮癌患者由来の中間期核におけるＰＤＧＦＲαの増幅を右側に示す。大きな増幅を黄色の矢印で印した。この細胞は３コピーの４番染色体を有しており、そのうちの１つによってＰＤＧＦＲα遺伝子座における増幅が示される。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書に記載の本発明が完全に理解され得るように、以下に詳細な説明を記載する。
【００１６】
他に定義しない限り、本明細書中で用いているすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当技術分野の当業者に共通して理解される意味と同じ意味を有する。本明細書での記載と類似または等価の方法および物質を本発明の実施または試験に用いることができるが、好ましい方法および物質を以下に記載する。材料、方法、および実施例は例示的なものにすぎず、限定することを意図しない。本明細書で言及するあらゆる刊行物、特許、およびその他の文書は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００１７】
本明細書を通じて、「含む」という言葉または「含んでいる」などのその変形は、言及した整数または整数群の包含を意味するように理解されることとなるが、他のいずれの整数または整数群の排除を意味するように理解されるものではない。
【００１８】
発明をさらに定義するために、以下の用語および定義をここに記載する。
【００１９】
「試料」という用語は、腫瘍組織、脳組織、脳脊髄液、血液、血漿、血清、リンパ、リンパ節、脾臓、肝臓、骨髄、または他のあらゆる生物学的標本（癌細胞を含む）として得られる標本、あるいはこれらから単離される標本のことをいう。
【００２０】
「治療する」または「治療」という用語は、哺乳類において癌の症状の進行を後退、軽減、抑制すること、あるいはその症状を予防または緩和すること、あるいは癌に関連する確証可能な測定法を改良することを意味することを意図する。
【００２１】
「対象者」という用語は、これらに限定されるものではないがヒト、霊長類、ウマ、トリ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、およびマウスを含む、哺乳類のことをいう。
【００２２】
「有効量」という用語は、チロシンキナーゼを阻害するのに十分な阻害剤の量のことをいう。
【００２３】
「治療の有効性」という用語は、治療によって障害または病態、あるいはその１つまたは複数の症状を、後退、緩和、または予防する程度、あるいは障害または病態の進行を抑制する程度のことをいう。
【００２４】
癌細胞を分類する方法
本発明は、試料中の癌細胞を分類する方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法には、癌細胞の試料を得るステップと、その試料中の少なくとも１つのシグナル伝達経路にある１種または複数種のチロシンキナーゼの有無またはレベルを検出するステップと、その１種または複数種のチロシンキナーゼの有無またはレベルに基づいて癌細胞を分類するステップとが含まれる。他の実施形態では、この方法には、癌細胞の試料を得るステップと、その試料中の少なくとも１つのシグナル伝達経路にある１種または複数種のリン酸化型チロシンキナーゼの有無またはレベルを検出するステップと、その１種または複数種のリン酸化型チロシンキナーゼの有無またはレベルに基づいて癌細胞を分類するステップとが含まれる。
【００２５】
本発明の方法に用い得る癌細胞には、癌細胞株由来または対象者の固形腫瘍由来の細胞が含まれるが、これらに限定されない。癌細胞は、いかなる種類の癌からも得ることができ、これには、肺癌（肺の扁平上皮癌を含む）、血液癌（リンパ腫を含む）、前立腺癌、乳癌、および胃腸管の腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、この癌は肺細胞である。好ましい実施形態では、この癌は非小細胞肺癌である。
【００２６】
本明細書で用いているように、通常、チロシンキナーゼという用語は、非受容体チロシンキナーゼおよび受容体チロシンキナーゼのことをいう。非受容体チロシンキナーゼには、ＡＢＬ、ＡＣＫ、ＣＳＫ、ＦＡＫ、ＦＥＳ、ＦＲＫ、ＪＡＫ、ＳＲＣ、ＴＥＣ、およびＳＹＫが含まれるが、これらに限定されない。受容体チロシンキナーゼには、ＡＬＫ、ＡＸＬ、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＥＧＦＲ、ＥＰＨ、ＥＲＢ２、ＦＧＦＲ、ＩＮＳＲ、ＭＥＴ、ＭＵＳＫ、ＰＤＧＦＲ、ＰＴＫ７、ＰＥＴ、ＲＯＲ、ＲＯＳ、ＴＹＫ、ＴＩＥ、ＴＲＫ、ＶＥＧＦＲ、ＡＡＴＹＫ、ｅｐｈＡ２、ＶＥＧＲ−２、ＩＧＦＲ１、ＬＹＮ、ＨＣＫ、ＨＥＲ２、ＩＲＳ１、ＩＲＳ２、ＢＲＫ、ＥｐｈＢ４、ＦＧＦＲ１、ＥｒｂＢ３、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ５、Ｔｙｒｏ３、ＥｐｈＢ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＢ３、Ｍｅｒ，ＥｐｈＢ４、およびＫｉｔが含まれるが、これらに限定されない。Robinson, WuおよびLin、2000を参照されたく、参照によりその内容全体が本明細書に組み込まれる。
【００２７】
一実施形態によれば、チロシンキナーゼの有無またはレベルを検出することに基づいて試料中の癌細胞を分類する。好適な検出方法は当業者に周知であり、これには、蛍光ｉｎ
ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、質量分析（ＭＳ）、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、および酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００２８】
他の一実施形態によれば、リン酸化型チロシンキナーゼの有無またはレベルを検出することに基づいて試料中の癌細胞を分類する。好適な検出方法は当業者に周知であり、これには、試料からのリン酸化ペプチドの免疫沈降および免疫沈降したリン酸化ペプチドの分析、例えば液体クロマトグラフィー（ＬＣ）ＭＳ／ＭＳを用いた分析が含まれるが、これらに限定されない。
【００２９】
さらに他の一実施形態によれば、試料中の少なくとも１つのシグナル伝達経路にある１種または複数種のチロシンキナーゼの活性の有無またはレベルを検出することに基づいて試料中の癌細胞を分類する。好適な検出方法は当業者に周知であり、これには、これらに限定されるものではないが、米国特許の第６,０６６,４６２号、第６,３４８,３１０号、および第６,７５３,１５７号、ならびに欧州特許第０７６０６７８Ｂ９号に開示される方法が含まれ、参照によりこれらの内容全体が本明細書に組み込まれる。
【００３０】
いくつかの実施形態では、いかなる統計的な方法またはコンピュータの方法の補助も用いることなく、この分類のステップを実施する。この実施形態は、検査する試料の数またはチロシンキナーゼの数が少ない場合に好ましい。
【００３１】
他の実施形態では、統計的な方法またはコンピュータの方法の補助を用いて、この分類のステップを実施する。この実施形態は、検査する試料の数またはチロシンキナーゼの数が多い場合に好ましい。統計的な方法は当業者に知られており、コンピュータプログラムを含むが、これに限定されない。好適なコンピュータプログラムには教師なしピアソンクラスタ分析が含まれるが、これに限定されない。
【００３２】
いくつかの実施形態では、１種または２種のみの高度にリン酸化されたチロシンキナーゼを有するものとして癌細胞を分類する（クラスI）。他の実施形態では、リン酸化型のＦａｋ、Ｓｒｃ、Ａｂｌ、ならびにＥＧＦＲ、ＡＬＫ、ＰＤＧＦＲａ、Ｅｒｂ２、ＲＯＳ、ｃＭｅｔ、Ａｘｌ、ｅｐｈＡ２、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＦＧＦＲ、ＶＥＧＲ−２、ＩＧＦＲ１、ＬＹＮ、ＨＣＫ、ＨＥＲ２、ＩＲＳ１、ＩＲＳ２、およびＢＲＫからなる群から選択される少なくとも１つの受容体チロシンキナーゼを発現しているものとして癌細胞を分類する（クラスII）。他の実施形態では、リン酸化型のＤＤＲ１、Ｓｒｃ、およびＡｂｌを発現しているものとして癌細胞を分類する（クラスIII）。他の実施形態では、リン酸化型のＳｒｃ、ならびにＥＧＦＲ、ＡＬＫ、ＰＤＧＦＲａ、Ｅｒｂ２、ＲＯＳ、ｃＭｅｔ、Ａｘｌ、ｅｐｈＡ２、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＦＧＦＲ、ＶＥＧＲ−２、ＩＧＦＲ１、ＬＹＮ、ＨＣＫ、ＨＥＲ２、ＩＲＳ１、ＩＲＳ２、およびＢＲＫからなる群から選択される少なくとも１つの受容体チロシンキナーゼを発現しているものとして癌細胞を分類する（クラスIV）。他の実施形態では、リン酸化型のＳｒｃおよびＡｂｌを発現しているものとして癌細胞を分類する（クラスV）。
【００３３】
好ましい実施形態では、本発明は、非小細胞肺癌細胞を分類するための方法を提供する。この実施形態の一態様によれば、この方法には、ＮＳＣＬＣ細胞の試料を得るステップと、その試料中の少なくとも１つのシグナル伝達経路にある１種または複数種のチロシンキナーゼの有無またはレベルを検出するステップと、その１種または複数種のチロシンキナーゼの有無またはレベルに基づいてＮＳＣＬＣ細胞を分類するステップとが含まれる。この実施形態の他の一態様によれば、この方法には、ＮＳＣＬＣ細胞の試料を得るステップと、その試料中の少なくとも１つのシグナル伝達経路にある１種または複数種のリン酸化型チロシンキナーゼの有無またはレベルを検出するステップと、その１種または複数種のリン酸化型チロシンキナーゼの有無またはレベルに基づいてＮＳＣＬＣ細胞を分類するステップとが含まれる。
【００３４】
癌を治療する方法
また、本発明は、対象者の癌を治療する方法も提供する。いくつかの実施形態では、この方法には、対象者から癌細胞の試料を採取するステップと、その試料中の少なくとも１つのシグナル伝達経路にある１種または複数種の異常に発現したチロシンキナーゼのレベルに基づいて癌細胞を分類するステップと、その分類に基づいて有効量の１種または複数種のチロシンキナーゼ阻害剤を投与するステップとが含まれる。他の実施形態では、この方法には、対象者から癌細胞の試料を採取するステップと、その試料中の少なくとも１つのシグナル伝達経路にある１種または複数種の異常にリン酸化されたチロシンキナーゼのレベルに基づいて癌細胞を分類するステップと、その分類に基づいて有効量の１種または複数種のチロシンキナーゼ阻害剤を投与するステップとが含まれる。
【００３５】
この方法に用い得る癌細胞には、肺癌（肺の扁平上皮癌を含む）、血液癌（リンパ腫を含む）、前立腺癌、乳癌、および胃腸管の腫瘍に由来する癌細胞が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、この癌は肺細胞である。好ましい実施形態では、この癌は非小細胞肺癌である。
【００３６】
この癌細胞の試料は当技術分野で知られている任意の方法によって得ることができ、これには、対象者から腫瘍の標本を採取することが含まれるが、これに限定されない。
【００３７】
いくつかの実施形態では、異常に発現したチロシンキナーゼに基づいて癌細胞を分類する。他の実施形態では、異常に発現したリン酸化型チロシンキナーゼに基づいて癌細胞を分類する。これらの実施形態によれば、チロシンキナーゼ（またはリン酸化型チロシンキナーゼ）の発現、あるいはそれらのリン酸化レベルまたは活性を検出して、正常な細胞を含有する試料中で検出したものと比較する。
【００３８】
いくつかの実施形態では、１種または２種のみの高度にリン酸化されたチロシンキナーゼを有するものとして癌細胞を分類する（クラスI）。他の実施形態では、リン酸化型のＦａｋ、Ｓｒｃ、Ａｂｌ、ならびにＥＧＦＲ、ＡＬＫ、ＰＤＧＦＲａ、Ｅｒｂ２、ＲＯＳ、ｃＭｅｔ、Ａｘｌ、ｅｐｈＡ２、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＦＧＦＲ、 ＶＥＧＲ−２、ＩＧＦＲ１、ＬＹＮ、ＨＣＫ、ＨＥＲ２、ＩＲＳ１、ＩＲＳ２、およびＢＲＫからなる群から選択される少なくとも１つの受容体チロシンキナーゼを発現しているものとして癌細胞を分類する（クラスII）。他の実施形態では、リン酸化型のＤＤＲ１、Ｓｒｃ、およびＡｂｌを発現しているものとして癌細胞を分類する（クラスIII）。他の実施形態では、リン酸化型のＳｒｃ、ならびにＥＧＦＲ、ＡＬＫ、ＰＤＧＦＲａ、Ｅｒｂ２、ＲＯＳ、ｃＭｅｔ、Ａｘｌ、ｅｐｈＡ２、
ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＦＧＦＲ、ＶＥＧＲ−２、ＩＧＦＲ１、ＬＹＮ、ＨＣＫ、ＨＥＲ２、ＩＲＳ１、ＩＲＳ２、およびＢＲＫからなる群から選択される少なくとも１つの受容体チロシンキナーゼを発現しているものとして癌細胞を分類する（クラスIV）。他の実施形態では、リン酸化型のＳｒｃおよびＡｂｌを発現しているものとして癌細胞を分類する（クラスV）。
【００３９】
癌を治療する方法では、この分類に基づいて、有効量の１種または複数種のチロシンキナーゼ阻害剤を対象者に投与する。本発明の方法において投与することができる好適なチロシンキナーゼ阻害剤は当技術分野で知られており、これには、アキシチニブ（AG013736としても知られる；Rugo, H.S., Herbst, R.S., Liu,
G., Park, J.W., Kies, M.S., Steinfeldt, H.M., Pithavala, Y.K., Reich, S.D.,
Freddo, J.L.およびWilding, G.（2005）Phase I
Trial of the Oral Antiangiogenesis Agent AG-013736 in Patients With Advanced
Solid Tumors：Pharmacokinetic and Clinical Results. Journal
of Clinical Oncology 23, 5474-5483）、ボスチニブ（Gambacorti-Passerini,
C., Kantarjian, H.M., Baccarani, M., Porkka, K., Turkina, A., Zaritskey, A.Y.,
Agarwal, S., Hewes, B.およびKhoury, H.J.（2008）Activity and tolerance of bosutinib in
patients with AP and BP CML and Ph+ ALL. J. Clin. Oncol. 26（May 20 suppl；abstr 7049））、セディラニブ（AZD2171としても知られる；Wedge, S.R., Kendrew, J.,
Hennequin, L.F., Valentine, P.J., Barry, S.T., Brave, S.R., Smith, N.R., James,
N. H., Dukes, M., Curwen, J.O., Chester, R., Jackson, J.A., Boffey, S.J.,
Kilburn, L.L., Barnett, S., Richmond, G.H.P., Wadsworth, P.F., Walker, M.,
Bigley, A.L., Taylor, S.T., Cooper, L., Beck, S., Jurgensmeier, J.M.およびOgilvie, D.J.（2005）AZD2171：A Highly Potent, Orally Bioavailable, Vascular Endothelial Growth
Factor Receptor-2 Tyrosine Kinase Inhibitor for the Treatment of Cancer. Cancer
Res. 65, 4389-4400）、ダサチニブ（Talpaz, M., Shah, N.P.,
Kantarjian, H., Donato, N., Nicoll, J., Paquette, R., Cortes, J., O'Brien, S.,
Nicaise, C., Bleickardt, E., Blackwood-Chirchir, M.A., Iyer, V., Chen, T.-T.,
Phil., Huang, F., Decillis, A.P.およびSawyers, C.L.（2006）Dasatinib in Imatinib-Resistant Philadelphia
Chromosome-Positive Leukemias. N. Eng. J. Med. 354, 2531-2541）、エルロチニブ（Perez-Soler, R., Chachoua, A., Hammond, L.A., Rowinsky, E.K., Huberman,
M. Karp, D., Rigas, J., Clark, G.M., Santabarbara, P.およびBonomi,
P.（2004）Determinants of Tumor
Response and Survival With Erlotinib in Patients With Non-Small-Cell Lung
Cancer. Journal of Clinical Oncology 22, 3238-3247、Rappsilber,
J., Ishihama, Y.およびMann, M.（2003）Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser
desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in
proteomics. Anal Chem.75（3):663-70）、ゲフィチニブ（Pao, W., Miller, V., Zakowski, M., Doherty, J., Politi, K., Sarkaria,
I., Singh, B., Heelan, R., Rusch, V., Fulton, L.ら（2004）EGF receptor gene mutations are common in lung cancers from“never smokers”and are associated with sensitivity
of tumors to gefitinib and erlotinib. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101,
13306-13311、Peduto, L., Reuter, V.E., Shaffer, D.R.,
Scher, H.I.およびBlobel, C.P.（2005）Critical function for ADAM9 in mouse prostate cancer. Cancer Res. 65,
9312-9319）、イマチニブ（Deininger, M.W.N.およびDruker
B.J.（2003）Specific Targeted Therapy
of Chronic Myelogenous Leukemia with Imatinib. Pharmacological Reviews 55, 401-423）、ラパチニブ（Burris III, H.A.（2004）Dual
kinase inhibition in the treatment of breast cancer:initial experience with the
EGFR/ErbB-2 inhibitor Lapatinib. The Ongologist 9（suppl 3）, 10-15）、レスタウルチニブ（Cephalon, Frazer, PA）、ニロチニブ（Kantarjian, H., Giles, F., Wunderle, L., Bhalla, K., O'Brien, S.,
Wassmann, B., Tanaka, C., Manley, P., Rae, P., Mietlowski, W., Bochinski, K.,
Hochhaus, A., Griffin, J.D., Hoelzer, D., Albitar, M., Dugan, M., Cortes, J.,
Alland, L.およびOttmann, O.G.（2006）Nilotinib in Imatinib-Resistant CML and Philadelphia Chromosome-Positive ALL. N. Eng.
J. Med. 354, 2542-2551）、セマキサニブ（O'Donnell, A., Padhani, A.,
Hayes, C., Kakkar, A.J., Leach, M., Trigo, J.M., Scurr, M., Raynaud, F.およびPhillips, S.（2005）A Phase I
study of the angiogenesis inhibitor SU5416（semaxanib）in solid tumours, incorporating dynamic contrast MR pharmacodynamic end
points. British Journal of Cancer 93, 876-883）、スニチニブ（Motzer,
R.J., Hutson, T.E., Tomczak, P., Michaelson, M.D., Bukowski, R.M., Rixe, O.,
Oudard, S., Negrier, S., Szczylik, C., Kim, S.T., Chen, I., Bycott, P.W., Baum,
C.M.およびFiglin, R.A.（2007）Sunitinib versus Interferon Alfa in Metastatic Renal-Cell Carcinoma. N.
Eng. J. Med. 356, 115-124)、およびバンデタニブ（AstraZeneca, London, England）が含まれるが、これらに限定されない。
【００４０】
当技術分野で知られる多様な方法のうち任意の方法を用いてチロシンキナーゼ阻害剤を投与することができる。いくつかの実施形態では、チロシンキナーゼ阻害剤を静脈内に投与する。いくつかの実施形態では、チロシンキナーゼ阻害剤を筋肉内に投与する。いくつかの実施形態では、チロシンキナーゼ阻害剤を皮下に投与する。
【００４１】
治療の有効性を判定する方法
本発明はさらに、対象者における癌の治療の有効性を判定する方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法には、対象者から癌細胞の試料を採取するステップと、その試料中の少なくとも１つのシグナル伝達経路にある１種または複数種のチロシンキナーゼの有無またはレベルを検出するステップとが含まれ、このとき、１種または複数種のチロシンキナーゼの有無またはレベルが治療の有効性と相関している。他の実施形態では、この方法には、対象者から癌細胞の試料を採取するステップと、その試料中の少なくとも１つのシグナル伝達経路にある１種または複数種のリン酸化型チロシンキナーゼの有無またはレベルを検出するステップとが含まれ、このとき、１種または複数種のチロシンキナーゼの有無またはレベルが治療の有効性と相関している。
【００４２】
この方法に用い得る癌細胞には、肺癌（肺の扁平上皮癌を含む）、血液癌（リンパ腫を含む）、前立腺癌、乳癌、および胃腸管の腫瘍に由来する癌細胞が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、この癌は肺細胞である。好ましい実施形態では、この癌は非小細胞肺癌である。
【００４３】
いくつかの実施形態では、１種または複数種のチロシンキナーゼの有無またはレベルを検出する。他の実施形態では、１種または複数種のリン酸化型チロシンキナーゼの有無またはレベルを検出する。チロシンキナーゼを検出する好適な方法には、ＦＩＳＨ、ＩＨＣ、ＰＣＲ、ＭＳ、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、およびＥＬＩＳＡが含まれるが、これらに限定されない。リン酸化型チロシンキナーゼを検出する好適な方法は、当技術分野で知られている（例えば、米国特許の第７，１９８,８９６号および第７，３００,７５３号、これらは両方とも参照によりその内容全体が本明細書に組み込まれる）。
【００４４】
いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、タンパク質チロシンのリン酸化は、癌細胞と正常細胞との間および種々の癌細胞間で著しい相違を示すため、種々の癌細胞において、シグナル伝達経路にあるチロシンキナーゼまたはリン酸化型チロシンキナーゼの有無またはレベルを、癌の重症度、病期、または種類の指標とすることができ、したがって、癌の治療の有効性と相関しているものと考えられる。
【００４５】
本発明がより完全に理解されるように、以下の実施例を記載する。これらの実施例は例示のみを目的とし、いかなる形であれ本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【００４６】
実施例１
ＮＳＣＬＣの腫瘍および細胞株のリン酸化チロシンプロファイル
パラフィン包埋しホルマリン固定した、ＮＳＣＬＣ患者の９６個の組織試料を、免疫組織化学（ＩＨＣ）およびリン酸化特異的抗体を用いてスクリーニングした（図１Ａ）。約３０％の腫瘍が高レベルのリン酸化チロシンの発現を示した。また、この群の患者の試料は高レベルの受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）発現も示しており、ＲＴＫ活性がこれらの肺腫瘍の発生に関与し得ることが示唆される。リン酸化特異的抗体を用いた、４１種のＮＳＣＬＣ細胞株の免疫ブロットによっても、特に受容体チロシンキナーゼの分子量範囲の特性において不均一な反応性が示された（図１Ｂ）。
【００４７】
ＮＳＣＬＣ細胞株および固形腫瘍におけるチロシンキナーゼの活性をさらに特徴付けるために、免疫親和性のリン酸化プロテオミクスのアプローチを用いた。タンデム質量分析(ＭＳ／ＭＳ）による測定では、リン酸化チロシンは細胞のリン酸化プロテオームの１％未満に相当し（Olsen, J.V.,
Blagoev, B., Gnad, F., Macek, B., Kumar, C., Mortensen, P.およびMann, M.（2006）Global, in
vivo, and site-specific phosphorylation dynamics in signaling networks. Cell
127, 635-648)、従来の方法による分析は困難なため、タンデム質量分析による分析の前に、リン酸化チロシン抗体を用いた免疫親和性の精製を用いてリン酸化チロシン含有ペプチドを濃縮した（Rush, J.,
Moritz, A., Lee, K.A., Guo, A., Goss, V.L., Spek, E.J., Zhang, H., Zha, X.M.,
Polakiewicz, R.D.およびComb, M.J.（2005）Immunoaffinity profiling of tyrosine phosphorylation in cancer cells.
Nat. Biotechnol. 23, 94-101)。標準的な病理に基づき、全腫瘍をＮＳＣＬＣとして同定した。癌細胞を５０％以上含有する腫瘍のみを分析した。培養条件によって生じるバックグラウンドのリン酸化を抑えるため、分析前にＮＳＣＬＣ細胞株を低血清中で一晩増殖させた。
【００４８】
この方法を用いて多数の部位（重複していない１５０〜１２００部位／細胞株または腫瘍に及ぶ）のリン酸化状態を検出し、合計で４１種のＮＳＣＬＣ細胞株および１５０個のＮＳＣＬＣ腫瘍からのリン酸化チロシンのプロファイルを得た。２７００種を超えるさまざまなタンパク質上の４５５１個のチロシンリン酸化部位が特定され、ＮＳＣＬＣにおけるチロシンキナーゼシグナル伝達の知識が劇的に広がった。これらの部位を、既知のリン酸化部位の包括的な供給源であるPhosphoSite（www.phosphosite.org）（Hornbeck, P.V., Chabra, I., Kornhauser,
J.M., Skrzypek, E.およびZhang, B.（2004）PhosphoSite：A bioinformatics resource dedicated to
physiological protein phosphorylation. Proteomics 4, 1551-1561）と照合させ、８５％を超えるものが新規であると考えられることが明らかとなった。これらのデータはPhosphoSiteに寄託されており、このデータセットはhttp://www.phosphosite.org/papers/rikova01.htmlを通して無料公開されている。
【００４９】
実施例２
ＮＳＣＬＣのチロシンリン酸化
リン酸化ペプチドのデータセットに基づいて、リン酸化チロシンシグナル伝達の異常をスクリーニングし、ＮＳＣＬＣのタンパク質を比較するための最初のステップとして、リン酸化ペプチドの帰属の数を使用した半定量的な方法を用いて、試料中に存在するリン酸化ペプチドの量を概算した。簡潔に述べると、ＬＣカラムからの溶出のピークが大きいほど、ＬＣ
ＭＳ／ＭＳによってより多くのリン酸化ペプチドが検出されており、したがって、試料中により多くのリン酸化ペプチドが存在している（図１Ｃを参照されたい）。例えば、ｃ−Ｍｅｔのリン酸化ペプチド数と、ウエスタン分析で認められるリン酸化型ｃ−Ｍｅｔタンパク質のレベルとの比較はよく一致している（Gilchrist, A., Au, C.E.,
Hiding, J., Bell,
A.W., Fernandez-Rodriguez, J., Lesimple, S., Nagaya, H., Roy, L., Gosline,
S.J., Hallett, M.ら（2006）Quantitative proteomics analysis of the
secretory pathway. Cell 127, 1265-1281；Old, W.M.,
Meyer-Arendt, K., Aveline-Wolf, L., Pierce, K.G., Mendoza, A., Sevinsky, J.R.,
Resing, K.A.およびAhn, N.G.（2005）Comparison of label-free methods for quantifying human proteins by
shotgun proteomics. Mol. Cell. Proteomics 4, 1487-1502；Zybailov,
B., Coleman, M.K., Florens, L.およびWashburn, M.P.（2005）Correlation of relative abundance ratios
derived from peptide ion chromatograms and spectrum counting for quantitative
proteomic analysis using stable isotope labeling. Anal. Chem. 77, 6218-6224）（図１Ｄを参照されたい）。所定のタンパク質上のすべての部位を組み合わせることによって分析を簡易化できるため、このアプローチは、親イオンのピークの高さなどの他の方法よりも好ましいことが判明した。
【００５０】
次に、タンパク質の分類に基づいて、ＮＳＣＬＣ細胞株および固形腫瘍におけるタンパク質のチロシンリン酸化の分布を比較した。
【００５１】
図２Ａに示すように、タンパク質キナーゼ、接着性タンパク質、および細胞骨格の構成成分が、最も高度にリン酸化されるタンパク質の種類であった。腫瘍は、癌細胞５０％〜９０％に及ぶ複合組織に相当する。細胞株では、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、およびＥｐｈＡ２のチロシンキナーゼで最も高い受容体チロシンキナーゼのリン酸化のレベルが示された一方、腫瘍では、ＤＤＲ１、ＥＧＦＲ、ＤＤＲ２、およびＥｐｈの受容体チロシンキナーゼのリン酸化で高いレベルが示された（図２Ｂ）。ＦａｋキナーゼおよびＳｒｃファミリーキナーゼはＮＳＣＬＣの非受容体チロシンキナーゼのリン酸化の大多数を構成していた（図２Ｃ）。ほとんどのリン酸化はこれらのキナーゼの活性ループから生じている。５６種にわたるさまざまなチロシンキナーゼ上の２６６個の異なるリン酸化部位を分析し、実質的にすべての部位（ｓｒｃファミリーのＣ末端部位のような少数の例外はある）が明確にキナーゼ活性と関連していることが明らかとなった（Blume-Jensen, P.およびHunter, T.（2001）Oncogenic kinase signalling. Nature 411, 355-365; Ullrich, A.およびSchlessinger, J.（1990）Signal
transduction by receptors with tyrosine kinase activity. Cell 61, 203-212）。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、チロシンキナーゼのリン酸化はキナーゼの活性を表すのに役立つと考えられる。
【００５２】
実施例３
ＮＳＣＬＣにおけるチロシンキナーゼの活性化
ＮＳＣＬＣの腫瘍および細胞株の一部において、活性化／過剰発現したチロシンキナーゼに起因した高いチロシンリン酸化が示された（図１Ａおよび図１Ｂ）。異常に活性化されたチロシンキナーゼを特定するために、４１種のさまざまなＮＳＣＬＣ細胞株または１５０個のＮＳＣＬＣ腫瘍のいずれかから得られたシグナル伝達プロファイルの平均を差し引いて、図２Ｅおよび図３Ａに示す教師なし階層的クラスタ分析の結果を得た。この分析によって細胞株間の差異を強調させて、高度にリン酸化された（活性化された）チロシンキナーゼを特定した（図２Ｄおよび図２Ｆを比較されたい）。結果は、ＮＳＣＬＣ細胞株における活性化ＥＧＦＲ（Amann, J., Kalyankrishna, S.,
Massion, P.P., Ohm, J.E., Girard, L., Shigematsu, H., Peyton, M., Juroske, D.,
Huang, Y., Stuart Salmon, J.ら（2005）Aberrant epidermal growth factor receptor
signaling and enhanced sensitivity to EGFR inhibitors in lung cancer. Cancer
Res. 65, 226-235）、ＥｒｂＢ２（Stephens,
P., Hunter, C., Bignell, G., Edkins, S., Davies, H., Teague, J., Stevens, C.,
O'Meara, S., Smith, R., Parker, A.ら（2004）Lung cancer：intragenic ERBB2 kinase mutations in tumours. Nature 431, 525-526）、ＥｒｂＢ３（Engelman, J.A., Janne, P.A.,
Mermel, C., Pearlberg, J., Mukohara, T., Fleet, C., Cichowski, K., Johnson,
B.E.およびCantley, L.C.（2005）ErbB-3
mediates phosphoinositide 3-kinase activity in gefitinib-sensitive nonsmall
cell lung cancer cell lines. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 3788-3793）、ＥｐｈＡ２（Kinch, M.S., Moore, M.B.およびHarpole, D.H., Jr.（2003）Predictive value of the EphA2 receptor
tyrosine kinase in lung cancer recurrence and survival. Clin. Cancer Res. 9,
613-618）、およびｃ−Ｍｅｔ（Ma, P.C., Jagadeeswaran, R.,
Jagadeesh, S., Tretiakova, M.S., Nallasura, V., Fox, E.A., Hansen, M.,
Schaefer, E., Naoki, K., Lader, A.ら（2005）Functional
expression and mutations of c-Met and its therapeutic inhibition with SU11274
and small interfering RNA in nonsmall cell lung cancer. Cancer Res. 65,
1479-1488）の受容体チロシンキナーゼについての先行文献と一致している。１１種の細胞株においてＥＧＦＲキナーゼ活性が亢進しており（図２Ｅ）、このうち５種の細胞株がＥＧＦＲを活性化させる変異を潜伏させていた。例えば、増幅され変異したＥＧＦＲを発現させることが知られている、ＨＣＣ８２７（Amann, J., Kalyankrishna, S.,
Massion, P.P., Ohm, J.E., Girard, L., Shigematsu, H., Peyton, M., Juroske, D.,
Huang, Y., Stuart Salmon, J.ら（2005）Aberrant epidermal growth factor receptor
signaling and enhanced sensitivity to EGFR inhibitors in lung cancer. Cancer
Res. 65, 226-235）およびＨ３２５５（Paez,
J.G., Janne, P.A., Lee, J.C., Tracy,
S., Greulich, H., Gabriel, S., Herman, P., Kaye, F.J., Lindeman, N., Boggon,
T.J.ら（2004）EGFR mutations in lung cancer：correlation with clinical response to gefitinib therapy. Science 304,
1497-1500；Tracy, S., Mukohara, T., Hansen, M., Meyerson,
M., Johnson, B.E.およびJanne, P.A.（2004）Gefitinib induces apoptosis in the EGFRL858R non-small-cell lung cancer
cell line H3255. Cancer Res. 64, 7241-7244）において、高レベルのＥＧＦＲリン酸化ペプチドが認められた。Ｈ１９９３細胞株およびＣａｌｕ−３細胞株においてそれぞれ、高レベルのｃ−ＭｅｔおよびＥｒｂＢ２が認められ、これは、先行文献（Lutterbach, B., Zeng, Q.,
Davis, L.J., Hatch, H., Hang, G., Kohl, N.E., Gibbs, J.B.およびPan, B.S.（2007）Lung cancer cell lines harboring MET gene
amplification are dependent on Met for growth and survival. Cancer Res. 67,
2081-2088；Ma. P.C., Jagadeeswaran, R., Jagadeesh, S.,
Tretiakova, M.S., Nallasura, V., Fox, E.A., Hansen, M., Schaefer, E., Naoki,
K., Lader, A.ら（2005）Functional
expression and mutations of c-Met and its therapeutic inhibition with SU11274
and small interfering RNA in nonsmall cell lung cancer. Cancer Res. 65,
1479-1488；Minami, Y., Shimamura, T., Shah, K.,
Laframboise, T., Glatt, K.A., Liniker, E., Borgman, C.L., Haringsma, H.J.,
Feng, W., Weir, B.A.ら（2007）The major
lung cancer-derived mutants of ERBB2 are oncogenic and are associated with
sensitivity to the irreversible EGFR/ERBB2 inhibitor HK1-272. Oncogene 26,
5023-5027）と一致し、ＮＳＣＬＣ細胞株において知られている受容体チロシンキナーゼ活性を確証している。
【００５３】
ＮＳＣＬＣ腫瘍の同様の分析を、すべてのチロシンキナーゼついては図３Ａに、すべてのチロシンキナーゼのリン酸化部位については図６に示している。教師なしピアソンクラスタ分析を用いて、５つの主要な腫瘍群を特定した（図３Ａ）。左から右に、以下を異常に発現している腫瘍である：１種または２種のみの高い活性のあるチロシンキナーゼを発現している腫瘍（第１群）、多種多様のＳｒｃチロシンキナーゼ、Ａｂｌチロシンキナーゼ、および受容体チロシンキナーゼと共に活性のあるＦａｋを発現している腫瘍（第２群）、ｓｒｃキナーゼおよびａｂｌキナーゼと共に活性化ＤＤＲ１を発現している腫瘍（第３群）、ＥＧＦＲなどのＲＴＫと共にＳｒｃキナーゼを発現している腫瘍（第４群）、優位にｓｒｃチロシンキナーゼおよびＡｂｌチロシンキナーゼを発現している腫瘍（第５群）。
【００５４】
実施例４
チロシンキナーゼの基質
実施例３に記載の各群から、分析したリン酸化基質（チロシンキナーゼおよびセリン／スレオニンキナーゼを除く）を分離した。第１群、第２群、および第４群について、（２５００を超えるリン酸化タンパク質から）３０種の最も有益な基質を特定した（図３Ｂ〜図３Ｄ）。これらの異なる群は、異なる活性キナーゼおよび異なるリン酸化基質を有している。多くの活性チロシンキナーゼを有する第２群の腫瘍は、第１群の腫瘍よりも高いレベルの下流でのリン酸化を示した。例えば、第２群の腫瘍は、運動性および細胞骨格動態に関与するタンパク質ならびに細胞表面受容体および糖分解酵素のリン酸化を示した。全体的に、第１群の腫瘍は比較的低いレベルの基質リン酸化を示し、高いＳＨＰ−１、ＩＲＳ−１／２、およびＰＩ３ＫＲ１／２を示すいくつかのサブグループに分類される。第４群の腫瘍は、ＰＴＥＮおよびヒストンを含むさまざまな基質のリン酸化を示した。
【００５５】
全体的に、第２群の腫瘍について、ＭＳ／ＭＳの結果と一致して、高いリン酸化チロシンのＩＨＣ染色が観察された。入手可能な患者の臨床データおよび腫瘍病理と、階層的クラスタ分析の群の著しい相関は認められなかった。また、ｔ検定比較を用いて、４８個の隣接肺組織試料に対する腫瘍のタンパク質チロシンリン酸化も比較した（図７）。この分析によって、腫瘍と正常組織との間の有意なシグナル伝達の差異を識別し、これには、多くの細胞骨格およびシグナル伝達のタンパク質が含まれていた。
【００５６】
実施例５
活性化チロシンキナーゼのランク付け
一部の細胞株および腫瘍で複数の活性化チロシンキナーゼが発現していることが明らかとなり（第２群の腫瘍を参照されたい）、「誘起因子」キナーゼ（必然的に病因に関係する）の特定は、下流のネットワークで機能している他の活性化キナーゼによって困難となっている。さらに、階層的クラスタ分析が、高いＥＧＦＲのリン酸化を有する腫瘍をグループ化するのには有益ではないことも明らかとなった（図３Ａを参照されたい）。これにより、患者のサブグループにおいて異常に高いレベルのチロシンキナーゼ活性を識別することに基づいて誘起因子のチロシンキナーゼの候補を特定するアプローチを代わりに開発することとなった。図２Ｅもしくは図３Ａにわたる各キナーゼについて全リン酸化を総計して、平均を超えるリン酸化を示す細胞株または患者の数でこれを割った。表１は、平均リン酸化／患者または細胞株によりランク付けした、きわめて高度にリン酸化された受容体チロシンキナーゼを示している。この分析によって、細胞株または患者のサブセットにおける異常に高いチロシンキナーゼリン酸化を識別した。上位２０種の受容体チロシンキナーゼのうち、１５種が細胞株および腫瘍の両方で特定された。上位１０種のうち、Ｍｅｔ、ＡＬＫ、ＲＯＳ、ＰＤＧＦＲａ、ＤＤＲ１、およびＥＧＦＲは、細胞株および腫瘍の両方で認められた（表１）。
【表１】
略記：ＲＴＫ、受容体チロシンキナーゼ；ＮＳＣＬＣ、非小細胞肺癌。
細胞株および患者のサブセットにおける高いキナーゼ活性（リン酸化）の識別。患者の試料では、リン酸化ペプチドの総計は各タンパク質のスペクトル数を表しており、これは、ＧＳＫ３ベータのスペクトル数に標準化して１５０個の腫瘍すべてにわたり総計したもので、すべての腫瘍にわたるそのタンパク質の平均数を差し引いてある。試料の数は、平均を超えるリン酸化ペプチド数を示す腫瘍の数を表している。細胞株では、リン酸化ペプチドの総数は４１種の細胞株すべてにわたるそのタンパク質の平均数を差し引いた後の各タンパク質のスペクトル数を表しており、各実験において同数の細胞を用いたため、標準化を省略した。試料あたりの数値が大きい順に細胞株および組織をランク付けした。
【００５７】
次に、ランク付けのプロセスを適用して、リン酸化の総数に基づいてキナーゼをランク付けすることによって疾患の誘起因子の候補を特定した。ＥＧＦＲのランクが最上位のすべての細胞株の間では、ＥＧＦＲが最も高度にリン酸化されたチロシンキナーゼであることが多く、他では上位２番目または３番目のキナーゼであることが明らかとなった。ＥＧＦＲのランクが最上位のこれらの細胞株の中には、既知のＥＧＦＲ活性化変異を有する全５種の細胞株および既知のＥＧＦＲゲノム増幅を有する細胞株が認められた。
【００５８】
ＮＳＣＬＣ腫瘍試料についてリン酸化のランクを用いた同様な分析を実施して、活性化ＥＧＦＲを示す腫瘍を特定した（表２）。この試験においてＮＳＣＬＣ腫瘍はすべてステージ１またはステージ２であり、７４％男性、５２％喫煙者、３０％腺癌で構成される。ＥＧＦＲのランクが最上位の１８腫瘍のうち、１６腫瘍から解読可能なＥＧＦＲキナーゼドメインのＤＮＡ配列が得られ（表２）、このうち、９／１６個の腫瘍がキナーゼドメイン活性化変異を示し、８／８個の腺癌および５／５名の女性非喫煙者がＥＧＦＲ活性化変異を示していることが明らかとなり、女性非喫煙者および腺癌に多いことを示す先行文献と一致している（Lynch, T.J., Bell, D.W.,
Sordella, R., Gurubhagavatula, S., Okimoto, R.A., Brannigan, B.W., Harris,
P.L., Haserlat, S.M., Supko, J.G., Haluska, F.G.ら（2004）Activating
mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of
non-small-cell lung cancer to gefitinib. N. Engl. J. Med. 350, 2129-2139；Pao, W., Miller, V., Zakowski, M., Doherty, J., Politi, K., Sarkaria,
I., Singh, B., Heelan, R., Rusch, V., Fulton, L.ら（2004）EGF receptor gene mutations are common in lung cancers from“never smokers”and are associated with sensitivity
of tumors to gefitinib and erlotinib. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101,
13306-13311）（表２）。
【表２】
略記：ＡＤ、腺癌；ＳＣＣ、扁平上皮癌。
ＥＧＦＲ、Ａｌｋ、Ｒｏｓ、Ｍｅｔ、およびＰＤＦＧＲａの高度なリン酸化によって患者を分類した。患者の試料については、各患者のスペクトル数をＧＳＫ３ベータのスペクトル数に標準化して、全腫瘍にわたるそのタンパク質の平均数を差し引いた。受容体チロシンキナーゼのリン酸化の数値が平均を超えたものを示している。ＥＧＦＲ活性化変異、ＡｌｋおよびＲｏｓの転座を示している。
【００５９】
ＥＧＦＲのリン酸化ランクによってＥＧＦＲ活性化変異を有する腫瘍を特定できることが実証されたため、新しい誘起因子の候補のチロシンキナーゼの特定を行うために、同じアプローチを適用した。表１に示したように、Ｍｅｔ、ＡＬＫ、ＲＯＳ、ＰＤＧＦＲａ、ＤＤＲ１、およびＥＧＦＲは細胞株および腫瘍の両方に存在することが明らかとなった。患者の試料の１つにおいてＣ−Ｍｅｔが高度にリン酸化されており（表２）、ｃ−Ｍｅｔが誘起因子であることが知られるＨ１９９３細胞で示されるような増幅を示唆している（Lutterbach, B., Zeng, Q.,
Davis, L.J., Hatch, H., Hang, G., Kohl, N.E., Gibbs, J. B.およびPan, B.S.（2007）Lung cancer cell lines harboring MET gene
amplification are dependent on Met for growth and survival. Cancer Res. 67,
2081-2088）。ＥＧＦＲおよびｃ−Ｍｅｔとは対照的に、ＡＬＫ、ＲＯＳ、ＰＤＧＦＲａ、およびＤＤＲ１のキナーゼが肺癌と関連することを示す文献はきわめて少ない。疾患を引き起こす際の活性化キナーゼの役割をさらに試験するには細胞株モデルが決定的であるため、ＮＳＣＬＣ細胞株にいてこれらの候補の発現を試験した。ＲＯＳ、ＡＬＫ、およびＰＤＧＦＲａのタンパク質発現は、少なくとも１つのＮＳＣＬＣ細胞株において高度に上方制御されているようであった（図８Ａ、図８Ｂ、および図９Ａ）。ＤＤＲ１は多くの腫瘍において活性を有するが（Ford, C.E., Lau, S.K., Zhu,
C.Q., Andersson, T., Tsao, M.S.およびVogel, W.F.（2007）Expression
and mutation analysis of the discoidin domain receptors 1 and 2 in non-small
cell lung carcinoma. Br. J. Cancer 96, 808-814）、Ｈ１９９３細胞だけがリン酸化型ＤＤＲ１を発現しており、この細胞はｃ−Ｍｅｔにより引き起こされることが知られている。優れたＤＤＲ１細胞株モデルが欠けていたため、ＮＳＣＬＣ細胞株モデルに相当するＭＳ／ＭＳデータが確認されたＡＬＫ、ｃ−ＲＯＳ、およびＰＤＧＦＲαに焦点を移した。表２は、きわめて高レベルのＡＬＫ、ｃ−ＲＯＳ、ｃ−ＭｅｔおよびＰＤＧＦＲαのリン酸化を示す細胞株および腫瘍を示している。ＥＧＦＲで認められたように、これらのＲＴＫが、常にではないが、最も高度にリン酸化されたチロシンキナーゼであることが多く（表２）、これらが疾患を引き起こす役割を果たし得ることが示唆される。また、細胞株の全リン酸化タンパク質のランク付けも行い、ＡＬＫ（図３Ｅ）、ｃ−ＲＯＳ（図３Ｆ）、およびＰＤＧＦＲａ（図３Ｇ）を発現している腫瘍を選択した。きわめて高度にリン酸化された基質のうち、多くが細胞株と腫瘍との間で共通しており、下流の腫瘍形成のシグナル伝達に関与している（図３Ｅ〜図３Ｇの矢印を参照されたい）。ＨＣＣ７８、Ｈ２２２８、およびＨ１７０３の細胞株、ならびにＲＯＳ、ＡＬＫ、ＥＧＦＲ、ＰＤＦＧＲアルファ、およびｃ−Ｍｅｔを発現している６つの異なるＮＳＣＬＣ腫瘍においてリン酸化ペプチド（２０００を超える多様なリン酸化チロシン部位）が認められた。
【００６０】
ＥＧＦＲ活性化変異により引き起こされるＮＳＣＬＣ腫瘍を特定した。細胞株および腫瘍の全体のＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性をランク付けすることにより、ＥＧＦＲが上位のランクでは、ＥＧＦＲ活性化変異が劇的に多いことが明らかになった。上位ランクの１１種の細胞株のうち、５種が既知のＥＧＦＲ活性化変異を含有し、配列情報を得た１６個のＥＧＦＲ腫瘍のうち、８／９個が腺癌であり、９個がキナーゼドメイン活性化変異を含有していた。残りの扁平上皮癌（ＳＣＣ）患者は高いＥＧＦＲ活性を示した。
【００６１】
ＥＧＦＲが上位ランクの細胞株および腫瘍のうちおよそ半数がＥＧＦＲ活性化変異を有していた。したがって、チロシンキナーゼのランクに基づいて腫瘍をグループ化して、平均レベルを超えて活性化されたキナーゼを発現している腫瘍の特定を行った。ＮＳＣＬＣにおいて、ＲＴＫ（Ｍｅｔ、ＡＬＫ、ＤＤＲ１、ＲＯＳ、ＶＥＧＥＲ−２、ＩＧＦ１Ｒ、ＰＤＧＦＲａ、ＥＧＦＲ、およびＡｘｌ）ならびに非ＲＴＫ（ＦＡＫ、ＬＹＮ、ＦＹＮ、ＨＣＫ、ＦＲＫ、ＢＲＫ、および図３Ａに示す他のもの）が高度にリン酸化されることが明らかとなった。
【００６２】
実施例６
ＮＳＣＬＣの細胞株および腫瘍におけるＡＬＫおよびＲＯＳの融合タンパク質
図３Ａの上方左端の患者群および細胞株Ｈ２２２８（図２Ｅ、図４Ａ、および表１）においてＡＬＫの高レベルのリン酸化が認められ、１つの腫瘍試料およびＨＣＣ７８細胞株（図４Ｂおよび表１）においてＲＯＳの高レベルのリン酸化が認められた。これらの試料中のリン酸化のランクでは、ＡＬＫおよびＲＯＳが最上位かそれに近いところにある（表１）。ＡＬＫおよびＲＯＳのタンパク質の発現は、ＮＳＣＬＳ細胞株間で制限されかつ予測した分子量よりも小さいことが示された（図８Ａおよび図８Ｂ）。ＲＴ−ＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定を行い、発現したＲＮＡ転写産物を調査した。Ｈ２２２８細胞および３つの異なる腫瘍試料に由来するＲＮＡ転写産物の５０のＲＡＣＥ分析により、ＡＬＫが微小管結合タンパク質であるＥＭＬ４と融合していることが示された（図４Ｃを参照されたい）。ＥＭＬ４の短いＮ末端領域は、ＮＰＭ−ＡＬＫ（Morris, S.W., Kirstein, M.N.,
Valentine, M.B., Dittmer, K.G., Shapiro, D.N., Saltman, D.L.およびLook, A.T.（1994）Fusion of a kinase gene, ALK, to a nucleolar
protein gene, NPM, in non-Hodgkin's lymphoma. Science 263, 1281-1284）のような以前に解析された他のＡＬＫの融合で認められた正確な融合部位でＡＬＫのキナーゼドメインと融合していた（図４Ｃ）。また、１つの腫瘍試料では、ＡＬＫがＴＦＧ（Hernandez, L.,
Pinyol, M., Hernandez, S., Bea, S., Pulford, K., Rosenwald, A., Lamant, L.,
Falini, B., Ott, G., Mason, D.Y.ら（1999）TRK-fused gene（TFG) is a new partner of ALK in
anaplastic large cell lymphoma producing two structurally different TFG-ALK
translocations. Blood 94, 3265-3268）と融合していることも判明した（図４Ｄ）。この融合は、以前に認められている短い形態のＴＦＧ−ＡＬＫ（Hernandez, L.,
Bea, S., Bellosillo, B., Pinyol, M., Falini, B., Carbone, A., Ott, G., Rosenwald,
A., Fernandez, A., Pulford, K.ら（2002）Diversity
of genomic breakpoints in TFG-ALK translocations in anaplastic large cell
lymphomas：identification of a new TFG-ALK(XL）chimeric gene with transforming activity. Am. J. Pathol. 160, 1487-1494）と同じである。ＥＭＬ４およびＴＦＧの両方の融合において、コイルドコイルドメインがＡＬＫキナーゼドメインと融合しており、これによって二量体／オリゴマーが形成され、構成的なキナーゼ活性を与えている可能性が高い。
【００６３】
ＨＣＣ７８細胞について同様な分析を行い、ＲＯＳが膜貫通型溶質輸送体タンパク質ＳＬＣ３４Ａ２と融合していることが判明した。最初の膜貫通ドメインの直後で終結するＳＬＣ３４Ａ２のＮ末端領域のＮ末端がＲＯＳの膜貫通ドメインと融合しており、２つの膜貫通ドメインを有する切断型融合タンパク質を形成していた。ＨＣＣ７８細胞において２つの型のこの融合タンパク質が認められ、これは同じ転座現象から生じた異なるスプライシング産物を示しているようである（図４Ｅを参照されたい）。ｃ−ＲＯＳ陽性のＮＳＣＬＣ腫瘍において別のＲＯＳの融合を確認した。図４Ｆに示したように、ｃ−ＲＯＳは、ＭＩＦ免疫サイトカインに対して高い親和性を有するII型の膜貫通タンパク質であるＣＤ７４（Leng, L., Metz,
C.N., Fang, Y., Xu, J., Donnelly, S., Baugh, J., Delohery, T., Chen, Y.,
Mitchell, R.A.およびBucala, R.（2003）MIF signal
transduction initiated by binding to CD74. J. Exp. Med. 197, 1467-1476）のＮ末端の半分と融合している。ＣＤ７４のＮ末端領域がＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳの融合（図４Ｅを参照されたい）の正確な部位でＲＯＳと融合しており、ＳＬＣ３４Ａ２の融合で認められたような２つの膜貫通ドメインを有する融合タンパク質を生じていた。哺乳類細胞において、タグをつけたＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ融合タンパク質を発現させることによって、膜画分に集中した構成的なキナーゼ活性が示された（図８Ｅおよび図８Ｆ）。ＡＬＫおよびＲＯＳのキナーゼドメインを配列決定して、変異がないことを確認した。
【００６４】
ＡＬＫに対するｓｉＲＮＡを用いた実験では、Ｈ２２２８細胞において細胞死が誘発されないことが明らかとなり、これは、ＰＩ３Ｋの変異の活性化（Samuels, Y., Diaz, L.A., Jr.,
Schmidt-Kittler, O., Cummins, J.M., Delong, L., Cheong, I, Rago, C., Huso,
D.L., Lengauer, C., Kinzler, K.W.ら（2005）Mutant PIK3CA
promotes cell growth and invasion of human cancer cells. Cancer Cell 7, 561-573；Samuels, Y.およびVelculescu, V.E.（2004）Oncogenic mutations of PIK3CA in human
cancers. Cell Cycle 3, 1221-1224）またはＰＴＥＮの不活性化（Mellinghoff, I.K., Wang, M.Y.,
Vivanco, I., Haas-Kogan, D.A., Zhu, S., Dia,
E.Q., Lu, K.V., Yoshimoto, K., Huang, J.H., Chute, D.J.ら（2005）Molecular determinants of the response of glioblastomas to EGFR kinase
inhibitors. N. Engl. J. Med. 353, 2012-2024）のように、ＡＬＫに非依存的な生存シグナル伝達を示唆している。ＲＯＳに対するｓｉＲＮＡを用いた同様の実験を行い、ＲＯＳに対する２つの異なるｓｉＲＮＡは、ＲＯＳタンパク質の発現を低減させ、ＨＣＣ７８細胞において細胞死を誘発させるのに効果的であった（図８Ｃおよび図８Ｄ）。これは、ＨＣＣ７８細胞の生存がＲＯＳのシグナル伝達に強く依存していることを示している。
【００６５】
ＡＬＫを発現している細胞株および腫瘍試料（図３Ｅ）において最も高度にリン酸化されている基質の解析を行い、未分化大細胞リンパ腫においてＡＬＫシグナル伝達の重要な下流のメディエーターであることが以前に示されているＳＨＩＰ２、ＩＲＳ−１、ＩＲＳ−２などの下流のシグナル伝達分子の候補を特定した。さらに、融合相手であるＥＭＬ４のリン酸化が顕著に認められた（図３Ｅ）。ｃ−ＲＯＳを発現している試料（図３Ｆ）において高度にリン酸化されているものとして、神経膠芽腫においてＲＯＳの重要な下流のエフェクターであることが以前に報告されているＰＴＰＮ１１およびＩＲＳ−２を特定した（Charest, A., Wilker, E.W., McLaughlin, M.E.,
Lane, K., Gowda, R., Coven, S., McMahon, K., Kovach, S., Feng, Y., Yaffe, M.B.ら（2006）ROS fusion tyrosine kinase activates a SH2 domain-containing
phosphatase-2/phosphatidylinositol 3-kinase/mammalian target of rapamycin
signaling axis to form glioblastoma in mice. Cancer Res. 66, 7473-7481）。
【００６６】
ＡＬＫまたはＲＯＳの遺伝子座のいずれかの側に対するＦＩＳＨ分離プローブを作製して、ｃ−ＲＯＳを発現している細胞株および腫瘍の両方における転座を特定した（図３Ｈ）。ＡＬＫおよびＥＭＬ４は２番染色体の同じアームに位置するため、その間のＤＮＡの欠失によって予測どおりの分離パターンが確認された（図３Ｇ）。ＭＳ／ＭＳで分析した１０３個のＮＳＣＬＣ腫瘍からＡＬＫおよびＥＭＬ４のプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ分析を行い、陽性な３つの試料（表２）を特定し、ＥＭＬ４−ＡＬＫの頻度は３％であった；さらに、ＴＧＦ−ＡＬＫの試料も加えると、全体のＡＬＫの融合の頻度は中国の人口の４％となる。
【００６７】
実施例７
ＮＳＣＬＣにおけるＰＤＧＦＲαの活性化：イマチニブに対する感受性
１種のＮＳＣＬＣ細胞株Ｈ１７０３および８つの異なる腫瘍試料において異常に活性化されたものとしてＰＤＧＦＲαを確認した（図５Ａおよび表１）。また、Ｈ１７０３細胞もリン酸化型のＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ１、および他のＲＴＫを発現していることが判明した（図５Ａ）。ウエスタンブロットによってＰＤＧＦＲαのタンパク質発現を確認した（図９Ａ）。ＰＤＧＦＲ阻害剤イマチニブ（グリベック）およびＥＧＦＲ阻害剤ゲフィチニブ（イレッサ）に対するＨ１７０３細胞の感受性を調べた。Ｓｅｒ４７３におけるＡｋｔのリン酸化は、イマチニブによって阻止されるが、ゲフィチニブ処置によっては阻止されないことが判明した（図５Ｂ）。また、イマチニブの用量反応実験（図９Ｂ）によって、ｐ４４／４２ＭＡＰＫのリン酸化にはたとえあるにせよわずかな効果しかない１００ｎＭのイマチニブで、ＰＤＧＦＲαおよびＡｋｔのリン酸化のほぼ完全な阻害が示されることが判明した。
【００６８】
２０種のＮＳＣＬＣ細胞株のイマチニブに対する感受性をさらに調査するために、細胞増殖のＭＴＴアッセイを実施した。図５Ｃに示したように、Ｈ１７０３細胞は、Ｂｃｒ−Ａｂｌ融合タンパク質を過剰発現するＫ５６２細胞（Druker, B.J., Sawyers, C.L.,
Kantarjian, H., Resta, D.J., Reese, S.F., Ford, J.M., Capdeville, R.およびTalpaz, M.（2001）Activity of a specific inhibitor of the
BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and
acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia
chromosome. N. Engl. J. Med. 344, 1038-1042；Mahon, F.X.,
Deininger, M.W., Schultheis, B., Chabrol, J., Reiffers, J., Goldman, J.M.およびMelo, J.V.（2000）Selection and
characterization of BCR-ABL positive cell lines with differential sensitivity
to the tyrosine kinase inhibitor STI571：diverse mechanisms
of resistance. Blood 96, 1070-1079）と類似した感受性プロファイルを示した。対照的に、１９種のＮＳＣＬＣ細胞株（Ａ５４９、Ｈ１３７３、Ｈ４４１、およびＰＤＧＦＲａ発現について陰性である他の多くの細胞株）はイマチニブに対し非感受性であり（図５Ｃ）、薬物感受性とキナーゼリン酸化との相関がみられた。得られたイマチニブの感受性プロファイルは、Ａ５４９細胞におけるＰＤＧＦＲαの発現を確認し、イマチニブに対する感受性を示した先行文献（Zhang, P., Gao, W.Y., Turner,
S.およびDucatman, B.S.（2003）Gleevec（STI-571）inhibits lung cancer cell growth（A549）and potentiates the cisplatin effect in
vitro. Mol. Cancer 2, 1）とは異なっていた。アポトーシスにおけるイマチニブの効果を試験するために、Ｈ１７０３細胞をイマチニブで処置して、ＰＡＲＰおよびカスパーゼ３の切断をそれぞれ、ウエスタンブロットおよびフローサイトメトリーによって試験した。イマチニブ（０．１ｍＭ）によって、Ｈ１７０３細胞における切断カスパーゼ３および切断ＰＡＲＰの発現は著しく上昇した（図８Ｃおよび図８Ｄ）。次に、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるイマチニブの効果をマウス異種移植モデルを用いて試験した。ヌードマウスの皮下にＨ１７０３細胞を注入し、数週間にわたり腫瘍の形成を監視した。最初の目視可能な腫瘍の出現に応じて、イマチニブ（５０ｍｇ／ｋｇ）または賦形剤を１日１回で２週間マウスに処置した。イマチニブ処置したマウスは腫瘍の増殖に対して即時かつ顕著な効果を示した一方、対照マウスでは腫瘍の増殖が続いた（図５Ｄおよび図８Ｆ）。対照動物およびイマチニブ処置した動物の腫瘍増殖を定量化し（図５Ｄ）、複雑な腫瘍環境においてもイマチニブに対する強い感受性が示された。
【００６９】
リン酸化チロシンのシグナル伝達におけるイマチニブの効果を解析するため、重いアミノ酸の標識培地中および軽いアミノ酸の標識培地中でＨ１７０３細胞を増殖させ、イマチニブで処置し、あるいはイマチニブで処置せずに、質量分析法／ＳＩＬＡＣによってリン酸化ペプチドを分析した（Everley, P.A., Bakalarski,
C.E., Elias, J.E., Waghorne, C.G., Beausoleil, S.A., Gerber, S.A., Faherty,
B.K., Zetter, B.R.およびGygi, S.P.（2006）Enhanced
analysis of metastatic prostate cancer using stable isotopes and high mass
accuracy instrumentation. J. Proteome Res. 5, 1224-1231；Ong,
S.E., Blagoev, B., Kratchmarova, I., Kristensen, D.B., Steen, H., Pandey, A.およびMann, M.（2002）Stable isotope
labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate
approach to expression proteomics. Mol. Cell. Proteomics 1, 376-386）。いくつかのタンパク質およびリン酸化部位がイマチニブを用いた処置によって変化した。イマチニブを用いたＨ１７０３細胞の処置により、ＰＤＧＦＲα受容体の異なる部位で異なる効果があった（図５Ｅ）。１０部位のチロシンリン酸化が認められ、３つの新規部位を特定した（Ｔｙｒ６１３、９２６、９６２）。また、イマチニブは、ホスホリパーゼＣｇ１、調節サブユニットのＰＩ３Ｋ、Ｓｔａｔ５、およびＳＨＰ−２を含む重要な下流のシグナル伝達タンパク質のいくつかのチロシンリン酸化も抑圧した（図５Ｆを参照されたい）。さらに、イマチニブは、細胞骨格およびアクチンの再編成を制御するタンパク質ならびに膜のリサイクルおよびエンドサイトーシスに関わるシグナル伝達分子のチロシンリン酸化を抑圧した。ＥＧＦＲおよびＦＧＦＲに対するリガンドを遊離させる（Peduto, L., Reuter, V.E.,
Shaffer, D.R., Scher, H.I.およびBlobel, C.P.（2005）Critical
function for ADAM9 in mouse prostate cancer. Cancer Res. 65, 9312-9319）既知の細胞表面メタロプロテアーゼＡｄａｍ９（Mazzocca, A., Coppari, R., De
Franco, R., Cho, J.Y., Libermann, T.A., Pinzani, M.およびToker, A.（2005）A secreted form of ADAM9 promotes carcinoma
invasion through tumor-stromal interactions. Cancer Res. 65, 4728-4738）がＨ１７０３細胞において高度にリン酸化されることが明らかとなった。また、イマチニブは、ｒａｓエフェクターＲｉｎ１（Hu, H., Bliss,
J.M., Wang, Y.およびColicelli, J.（2005）RIN1 is an ABL tyrosine kinase activator and a regulator of
epithelial-cell adhesion and migration. Curr. Biol. 15, 815-823）のリン酸化も阻害し、セラミド合成に関わる酵素であるＳＭＳ２（Taguchi, Y., Kondo, T.,
Watanabe, M., Miyaji, M., Umehara, H., Kozutsumi, Y.およびOkazaki, T.（2004）Interleukin-2-induced survival of natural
killer（NK）cells involving
phosphatidylinositol-3 kinasedependent reduction of ceramide through acid
sphingomyelinase, sphingomyelin synthase, and glucosylceramide synthase. Blood
104, 3285-3293）のリン酸化も阻害した。選択したＳＩＬＡＣの結果をウエスタン分析によって確認した（図９Ｅ）。この実験を別々に３回繰り返し、同様の結果を得た。
【００７０】
実施例８
ＮＳＣＬＣ腫瘍試料中のＰＤＧＦＲａ
表２で最も高いレベルのＰＤＧＦＲリン酸化を有する５個の腫瘍からのペプチドを分析した。これらの腫瘍（第２群、図３Ａ）は、他の多くの活性チロシンキナーゼに加えて、ＦＡＫ、Ａｂｌ、ＤＤＲ１／２およびＶＧＥＦ１／２を発現していることが明らかとなった。Ｈ１７０３細胞と同様に、これらのＮＳＣＬＣ腫瘍も、高度にリン酸化された接着タンパク質および細胞骨格タンパク質を示しており（図３Ｇ）、これは、細胞運動性の経路の関与を示唆している。ＰＤＧＦＲα特異的抗体を用いたＩＨＣによって独自の分析を実施し、ＮＳＣＬＣ腫瘍の試料をスクリーニングして、患者の試料の２％〜３％で強いＰＤＧＦＲα染色を確認した（図９Ｇ）。この結果も、ＮＳＣＬＣの腺癌の１００％がＰＤＧＦＲαを発現するという報告（Zhang, P., Gao, W.Y., Turner,
S.およびDucatman, B.S.（2003）Gleevec（STI-571）inhibits lung cancer cell growth（A549）and potentiates the cisplatin effect in
vitro. Mol. Cancer 2, 1）とは異なっていた。蛍光ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）解析により、このＩＨＣ陽性のＮＳＣＬＣ試料の１つでＰＤＧＦＲα遺伝子座における増幅が認められた（図９Ｈ）。
【００７１】
実施例に記載の実験手順がより完全に理解されるように、実施例で用いたいくつかの材料および方法を以下に記載する。これらの材料および方法は例示のみを目的とし、いかなる形であれ本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００７２】
細胞培養、試薬、ウエスタンブロット分析、および免疫沈降分析
細胞培養試薬をInvitrogenから購入した。アメリカ培養細胞系統保存機関からヒトＮＳＣＬＣ細胞株を入手した。ＲＯＳおよびリン酸化型ＰＤＧＦＲαの抗体をSanta Cruzから、その他すべての抗体をCell Signaling
Technology（CST）から購入した。CSTのプロトコルに従ってウエスタンブロット分析および免疫沈降分析を実施した。
【００７３】
ヒトＮＳＣＬＣ細胞株のＨ５２０、Ｈ８３８、Ｈ１４３７、Ｈ１５６３、Ｈ１５６８、Ｈ１７９２、Ｈ１９４４、Ｈ２１７０、Ｈ２１７２、ＨＣＣ８２７、Ｈ２２２８、Ｈ２３４７、Ａ５４９、Ｈ４４１、Ｈ１７０３、Ｈ１３７３、Ｈ３５８、Ｈ１９９３、Ｃａｌｕ−３、Ｈ１６４８、Ｈ１９７５、Ｈ１６６６、Ｈ１８６９、Ｈ１６５０、Ｈ１７３４、Ｈ１７９３、Ｈ２０２３、Ｈ６６１、Ｈ２４４４、Ｈ１２９９、Ｈ１６９３、Ｈ２２６、Ｈ１６２３、Ｈ１６５１、Ｈ４６０、Ｈ２１２２、およびＳＫＭＥＳ−１をアメリカ培養細胞系統保存機関から入手した。これらの細胞を、１０％ＦＢＳを含有し、かつ２ｍＭ
Ｌ−グルタミン、１．５ｇ／Ｌ 炭酸水素ナトリウム、４．５ｇ／Ｌ グルコース、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１．０ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するように調整したＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。ＮＳＣＬＣ細胞株のＨＣＣ７８、Ｃａｌ−１２Ｔ、ＨＣＣ３６６、ＨＣＣ１５、ＨＣＣ４４、およびＬＯＵ−ＮＨ９１をＤＳＭＺから購入し、これらを１０％ＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０で培養した。細胞を５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で維持した。免疫親和性の沈降および免疫ブロットの実験用には、細胞を８０％コンフルエンスまで増殖させた後に、ＦＢＳなしのＲＰＭＩ培地で回収前に一晩飢餓させた。薬剤（イレッサおよびグリベック）をＤＭＳＯ中に溶解し、１０ｍＭの保存溶液を調製して、−２０℃で保存した。
【００７４】
処置した細胞を冷却したＰＢＳで２回洗浄し、次いで、これらを、Complete, Mini, EDTA-freeプロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche）を添加した１×細胞溶解緩衝液（２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ、２．５ｍＭ ピロリン酸ナトリウム、１ｍＭ β−グリセロリン酸、１ｍＭ
Ｎａ３ＶＯ４、１μｇ／ｍＬ ロイペプチン）に溶解した。溶解液を超音波で破砕して、１４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。Coomassieタンパク質アッセイ試薬（Pierce Chemical社、Rockford, IL）を用いてタンパク質濃度を測定した。等量の総タンパク質を８〜１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって分離し、ニトロセルロース膜に転写した。CSTのプロトコルに従い、ブロットを適切な抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。免疫沈降には５００ｕｇのタンパク質溶解液を使用した。清澄化したタンパク質溶解液を２ｕｇの適切な抗体および１５ｕＬのプロテインＧアガロースビーズ（Pierce）と共に４℃で一晩揺動させた。１×細胞溶解緩衝液を用いてこのビーズを３回洗浄し、３０ｕＬの２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液中で５分間煮沸した。次いで、ウエスタンブロット法によって、結合したタンパク質を分析した。
【００７５】
リン酸化ペプチドの免疫沈降およびＬＣ−ＭＳ／ＭＳ質量分析による分析
種々の細胞株からのリン酸化ペプチドの免疫沈降を、以前に記載されているように（Rush, J., Moritz, A., Lee,
K.A., Guo, A., Goss, V.L., Spek, E.J., Zhang, H., Zha, X.M., Polakiewicz, R.D.およびComb, M.J.（2005）Immunoaffinity profiling of tyrosine
phosphorylation in cancer cells. Nat. Biotechnol. 23, 94-101）、CSTのPhosphoScanキット（P-Tyr-100）を用いて実施した。簡単に説明すると、尿素溶解緩衝液（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ８．０、９Ｍ 尿素、１ｍＭ バナジン酸ナトリウム、２．５ｍＭ ピロリン酸ナトリウム、１ｍＭ β−グリセロリン酸）中に１億個の細胞を溶解した。
【００７６】
腫瘍の試料では、電子ホモジナイザーPolyTronを使用して、２００〜５００ｍｇの組織を尿素溶解緩衝液（１ｍＬ／１００ｍｇの組織）中で各３０秒の２パルスでホモジナイズした。溶解液を超音波で破砕し、遠心分離によって清澄化した。清澄化した溶解液を、ＤＴＴによって還元して、ヨードアセトアミドでアルキル化した。次いで、２０ｍＭのＨｅｐｅｓを用いて試料を４回希釈して尿素濃度を２Ｍに低下させて、穏やかに振盪しながらトリプシンによって室温で一晩消化させた。Sep-Pak C18カートリッジを用いてペプチドを粗製した。溶出液を凍結乾燥し、乾燥させたペプチドを１．４ｍＬのＭＯＰＳ ＩＰ緩衝液（５０ｍＭ ＭＯＰＳ／ＮａＯＨ ｐＨ７．２、１０ｍＭ Ｎａ２ＰＯ４、５０ｍＭ
ＮａＣｌ）中に溶解して、遠心分離によって不溶性物質を除去した。プロテインＧアガロースビーズ（Roche）に結合させた１６０ｕｇのリン酸化チロシン１００抗体（CST）を用いて、４℃で一晩、免疫沈降を行った。次いで、冷却しながら、ビーズを１ｍＬのＭＯＰＳ ＩＰ緩衝液で３回、１ｍＬの冷却したＨＰＬＣグレードのｄＨ２Ｏで２回洗浄した。ペプチドをＩＡＰ溶出液中で濃縮し、０．２μＬの逆相StageTips上でさらに精製した（Rappsilber, J., Ishihama, Y.およびMann, M.（2003）Stop and go extraction tips for
matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample
pretreatment in proteomics. Anal Chem.75（3):663-70）。５μＬの６０％ＭｅＣＮ、０．１％ＴＦＡを用いてStageTipsからＬＣ−ＭＳ試料バイアル中にペプチドを溶出し、真空濃縮装置を用いて乾燥させた。乾燥試料を５μＬの５％ギ酸、５％ＭｅＣＮに溶解した。この試料（４μＬ）を、不活性のサンプルインジェクションバルブを有するFamosオートサンプラー（Dionex）を用いて、Magic C18 AQ逆相樹脂（Michrom Bioresources）を充填した１０ｃｍ×７５μｍのPicoFritキャピラリーカラム（New Objective）上にロードした。次いで、このカラムを、０．４％酢酸、０．００５％ＨＦＢＡ中のアセトニトリルの４５分間の直線濃度勾配によって、流速２８０ｎＬ／分（Ultimate、Dionex）で展開した。タンデムマススペクトルを、LTQイオントラップ質量分析計（ThermoFinnigan）により、トップ１０法を用いて、動的除外反復カウント１、反復期間３０秒間、データ従属方式で収集した。試料を回収して、LTQ-Orbitrapハイブリッド質量分析計により、トップ１０法を用いて、動的除外反復カウント１、反復期間３０秒間で、LTQ-Orbitrapタンデムマススペクトルについて実行した。質量分析計を構成しているOrbitrap内でＭＳスペクトルを収集し、LTQ内でＭＳ／ＭＳスペクトルを収集した。
【００７７】
グリベックで処置したＨ１７０３細胞のＳＩＬＡＣ分析
同数のＨ１７０３細胞を、軽いＳＩＬＡＣ培地または重いＳＩＬＡＣ培地（軽い培地には通常のＬ−リジン：ＨＣｌおよびＬ−アルギニン：ＨＣｌ（Sigma）、あるいは重い培地にはＬ−アルギニン：ＨＣｌ（Ｕ−１３Ｃ６、９８％）およびＬ−リジン：２ＨＣｌ（Ｕ−１３Ｃ６、９８％；Ｕ−１５Ｎ２、９８％）（Cambridge Isotope Laboratories）のいずれかを補充した、アルギニンおよびリジン欠乏ＲＰＭＩ培地）のいずれかに分割して増殖させた。また、この培地には１０％のＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンも入れた。それぞれの種類の培地中で細胞が１億個になるまで細胞を少なくとも５世代増殖させた。次いで、重い培地中で増殖させた細胞を１μＭのグリベックで３時間処置した。処置した細胞および対照細胞の両方を尿素溶解緩衝液中に溶解し、上記のようなリン酸化ペプチドの免疫沈降実験に進めた。
【００７８】
リン酸化部位データセットの分析
ペプチド配列を帰属するために、PhosphoSiteでタンパク質を探索するためにBiofacet（Gene-IT）において実行されるハッシュの文字列照合アルゴリズムを用いた。ペプチド配列が複数のタンパク質と合致した場合には、アルファベット順に最初の登録番号を持つタンパク質が代表として選択される。例えば、ＧＡＳＱＡＧＭ＃ＴＧＹ＊ＧＭＰＲはＳＭ２２−アルファ（Ｐ３７８０２）およびＴＡＧＬＮ３（Ｑ９ＵＩ１５）の両方と合致し、ＳＭ２２−アルファに帰属することとなる。少量のペプチドであれば最もよく調べられているタンパク質のセットを代表として手動で選択する。ＧＳＫ３α（Ｐ４９８４０）およびＧＳＫ３β(Ｐ４９８４１）の両方に照合するペプチドＧＥＰＮＶＳＹ＊ＩＣＳＲの場合は、代表としてＧＳＫ３βに帰属した。
【００７９】
質量分析を行う中で各ペプチド配列について観測されたスペクトルの数を計数した（Liu, H., Sadygov, R.G.およびYates, J.R.,
3rd.（2004）A model for random sampling
and estimation of relative protein abundance in shotgun proteomics. Anal. Chem.
76, 4193-4201）。スペクトルを下記の質の判断基準に当てた（すなわち「ＬＴＱ−ＦＴ ＭＳ、Sequest Search、およびVistaの方法（ｐＴｙｒ ＳＩＬＡＣの試料）」で）。タンパク質のスペクトル数を計算するために、その実行において各タンパク質に帰属したすべてのペプチド数を合計した。ピアソン相関距離および平均連結法のクラスタ分析と共にTIGRのMeVプログラムを用いて階層的クラスタ分析を行った（Saeed, A.I., Sharov, V.,
White, J., Li, J., Liang, W., Bhagabati, N., Braisted, J., Klapa, M., Currier,
T., Thiagarajan, M.ら（2003）TM4：a free, open-source
system for microarray data management and analysis. Biotechniques 34, 374-378）。所定のリン酸化タンパク質が確認された回数（そのタンパク質に帰属した観測された全スペクトルの合計）をMeVに取り込み、それを用いてヒートマップを構築した。
【００８０】
各患者の試料について、各タンパク質のスペクトル数をＧＳＫ３βのスペクトル数に標準化し、全腫瘍にわたるタンパク質の平均数を差し引いた。
【００８１】
ＬＴＱ−ＦＴ ＭＳ、Sequest Search、およびVistaの方法（ｐＴｙｒ ＳＩＬＡＣの試料）
各リン酸化ペプチドの試料を２回ずつＬＣ−ＭＳ分析した。融合シリカミクロキャピラリーカラム（１２５μｍ×１８ｃｍ）をC18逆相樹脂（Magic C18AQ、粒子5μm、ポアサイズ200A、Michrom Bioresources、Auburn、CA）で充填した。オートサンプラー（LC Packings Famos、San Francisco、CA）を用いて、試料（４μＬ）をこのカラム上にロードして、０．１％ギ酸中の７〜３０％アセトニトリルの５５分間の直線濃度勾配によって、質量分析計中に溶出した。インラインフロースプリッタを用いてバイナリＨＰＬＣポンプ（Agilent 1100、Palo Alto、CA）を使用しておよそ６００ｎＬ／分でこの勾配を行った。ハイブリッド直線イオントラップ−７のTeslaイオンサイクロトロン共鳴フーリエ変換装置（LTQ-FT、Thermo Electron、San Jose、CA）を用いて溶出したペプチドイオンを質量分析した。トップ７法を用いて、ＩＣＲ細胞において事前にＭＳ調査走査の間に行われた測定に基づいて、直線的イオントラップおよびフーリエ変換装置の同時走査を用いて、７データに従属したＭＳ／ＭＳ走査を収集した。自動利得制御（ＡＧＣ）標的３×１０６かつ質量解像度１０５を用いて、ＭＳ走査を３７５−１８００ｍ／ｚで実施した。ＭＳ／ＭＳについてＡＧＣは４０００、動的除外時間は２５秒であり、わずかに荷電したイオンは荷電状態スクリーニングにより除去した。
【００８２】
Sequestソフトウェア（v.27, rev.12）および複合前方／逆行ＩＰＩヒトタンパク質データベースを用いて、ペプチド配列をＭＳ／ＭＳスペクトルに帰属した。検索パラメータは以下の通りであった：プロテアーゼとしてトリプシン；１．０８Ｄａ前駆体質量耐性；システイン上の静的修飾（＋５７.０２１４６、カルボキシアミドメチル化）；ならびにセリン、スレオニンおよびチロシン（＋７９.９６６３３Ｄａ、リン酸化）、リジン（＋８.０１４２０、１３Ｃ６、１５Ｎ２）、アルギニン（＋６.０２０１３、１３Ｃ６）、およびメチオニン（＋１５.９９４９１、酸化）上の動的修飾。予測擬陽性帰属率が１％より低くなる適切なスコア選別基準を確立するために、標的／デコイデータベース法を用いた。電荷依存ＸＣｏｒｒ閾値（ｚ＝２ではＸＣｏｒｒ２．２以上、ｚ＝３ではＸＣｏｒｒ３．３以上、ｚ＝４ではＸＣｏｒｒ３．５以上）を上回ることに加え、リン酸化チロシンを含み、−５〜＋２５ｐｐｍの質量精度を有し、かつすべて軽いリジン／アルギニン残基もしくはすべて重いリジン／アルギニン残基を含むように帰属を求めた。さらに、ピーク面積および各ペプチドの重い形態と軽い形態との間の最終的な相対的存在量を計算するために、カスタム定量化プログラムVistaを使用して基準を満たす帰属を評価した（Bakalarski, C. E., Elias, J.
E., Villen, J. Haas, W., Gerber, S.A., Everley, P.A.およびGygi, S.P.（2008）The Impact of Peptide Abundance and Dynamic
Range on Stable-Isotope-Based Quantitative Proteomic Analyses. J. Proteome Res.
10.1021 /pr800333e）。ＭＳ走査で信号対ノイズが１５未満と確認されたペプチドは定量化について考慮しなかった。１つの状態にのみ見出されたペプチドについては、信号対ノイズ比を代わりに使用した。
【００８３】
５'ＲＡＣＥ法およびＲＴ−ＰＣＲ
5'
RACEシステム（Invitrogen）を用いてｃＤＮＡ末端の高速増幅を行った。RNeasy Miniキット（Qiagen）を用いて細胞株および患者から全ＲＮＡを抽出した。５'ＲＡＣＥ反応において細胞株および患者の異常なＡｌｋ転写産物を特定するために、プライマーには、ｃＤＮＡ合成用のＡｌｋ−ＧＳＰ１プライマー（５'−ＧＣＡＧＴＡＧＴＴＧＧＧＧＴＴＧＴＡＧＴＣ）ならびにネストＰＣＲ反応用のＡｌｋ−ＧＳＰ２プライマー（５'−ＧＣＧＧＡＧＣＴＴＧＣＴＣＡＧＣＴＴＧＴ）およびＡｌｋ−ＧＳＰ３プライマー（５'−ＴＧＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＴＧＣＴＴＣＣ）を用いた。５'ＲＡＣＥ反応において細胞株および患者の異常なＲｏｓ転写産物を特定するために、プライマーには、ｃＤＮＡ合成用のＲｏｓ−ＧＳＰ１プライマー（５'−ＴＧＧＡＡＡＣＧＡＡＧＡＡＣＣＧＡＧＡＡＧＧＧＴ）ならびにネストＰＣＲ反応用のＲｏｓ−ＧＳＰ２プライマー（５'−ＡＡＧＡＣＡＡＡＧＡＧＴＴＧＧＣＴＧＡＧＣＴＧＣＧ）およびＲｏｓ−ＧＳＰ３プライマー（５'−ＡＡＴＣＣＣＡＣＴＧＡＣＣＴＴＴＧＴＣＴＧＧＣＡＴ）を用いた。PCR精製キット（Qiagen）を用いてこれらのＰＣＲ産物を精製して、それぞれＡｌｋ−ＧＳＰ３およびＲｏｓ−ＧＳＰ３を用いてABI 3130キャピラリー型自動ＤＮＡシークエンサー（Applied
biosystem）を使用してこれらの配列決定を行った。
【００８４】
ＳｉＲＮＡ
Proligoから以下のＲＯＳのｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを得た：ＲＯＳ１（６３１８−６３４０）５'−ＡＡＧＣＣＣＧＧＡＵＧＧＣＡＡＣＧＵＵＴＴ−３'、ＲＯＳ１（７１８１−７２０３）５'−ＡＡＧＣＣＵＧＡＡＧＧＣＣＵＧＡＡＣＵＴＴ−３'。トランスフェクション前日に１２ウェルプレート中にＮＳＣＬＣ細胞を播種し、Mirus TransIT-TKOトランスフェクション試薬を用いて１００ｎＭのＲＯＳのｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、トランスフェクション４８時間後にさらに２４時間細胞を血清飢餓させた。トリプシン処理によって細胞を回収して計数し、細胞溶解液を調製して、ウエスタンブロットでＲＯＳのタンパク質レベルを調べた。
【００８５】
動物試験
Taconicから４〜６週齢の雌のＮＣＲヌードマウスを購入し、それらを用いてＨ１７０３の異種移植片を作製した。ＩＡＣＵＣが承認したプロトコルのもとで実験を行った。調査における適切かつ人道的な動物の使用のため、機関のガイドラインに従った。５×１０６のＨ１７０３細胞を１０匹のマウスに注入することにより腫瘍を発生させ、基底膜Matrigel（BD Biosciences）をＰＢＳ中に１：１の割合で再構成させた。腫瘍サイズが約１ｍｍ×１ｍｍの時に薬剤治療を開始した。５０ｍｇ／ｋｇ／日でグリベックを用いて、先端丸型の給餌管を使用した経口胃管栄養法によって、５匹のマウスを治療した。５匹のマウスは未治療であった。治療開始７日後に、動物を屠殺し、腫瘍を切除して秤量した。キャリパーを使用してマウスの対照群および治療群の両方にある腫瘍の平均直径を測定した。
【００８６】
増殖阻害アッセイおよびアポトーシスアッセイ
製造業者の指示に従って、CellTiter 96 Aqueous One Solution細胞増殖アッセイ（Promega）を用いて細胞増殖阻害アッセイを実施した。簡単に説明すると、平底９６ウェルプレート上に１０００〜５０００個の細胞を播種して、１０％ＦＢＳ入りの完全培地で増殖させた。２４時間後、細胞の培地を、さまざまな濃度のグリベックを含む１０％ＦＢＳ入りの完全増殖培地１００μＬに変更して、細胞をさらに７２時間インキュベートした。薬剤の各濃度を３通りのウェルの細胞に加えた。インキュベーションの終わりに２０μＬのCellTiter 96 AQUESOUS One溶液を各ウェルに加え、プレートを１〜４時間インキュベートした。Titan Multiskan Ascentマイクロプレートリーダー（Titertek
Instrument）を使用して４９０ｎｍで吸光度を読み取った。未処置細胞に対する処置細胞の吸光度測定値の平均±ＳＤ値の百分率として増殖阻害を表した。このアッセイを少なくとも３回繰り返した。OriginPro 6.1ソフトウェア（OriginLab、Northampton、MA）を用いてＩＣ５０を計算した。
【００８７】
フローサイトメトリーを用いてカスパーゼの活性化を定量化することにより、グリベック誘発アポトーシスを測定した。細胞をグリベック（１μＭ、１０μＭ、またはＤＭＳＯのみ）で２４時間、３通りの１５ｃｍプレート中で処置した。ＰＢＳで短時間細胞をすすぎ、セルスクレイパーを用いてＰＢＳ中で細胞をプレートから静かにかき集め、これをペレット化して、直ちに、ＰＢＳ中の３％ホルムアルデヒドを用いて３７℃で１０分間固定した。次いで、氷冷の９０％メタノールで細胞を透過処理し、さらに分析するため、この溶液中で−２０℃で保存した。固定化し透過処理した細胞(５×１０６）を１２×７５ｍｍのポリプロピレンの培養管に分注し、遠心分離によってＰＢＳ中ですすぎ、次いで、非特異的な結合を防ぐために、０．５％ＢＳＡ（ＰＢＳ／ＢＳＡ）を含むＰＢＳ中、室温で１０分間インキュベートした。次いで、AlexaFluor 488を結合させ（Ａｓｐ１７５）、ＰＢＳ／ＢＳＡ中に１：１０で希釈した切断カスパーゼ３抗体（#9669、Cell Signaling
Technology、Danvers、MA）と共に、細胞を室温で１時間インキュベートした。続いて、遠心分離によってＰＢＳ／ＢＳＡ中で細胞をすすぎ、これを０．５ｍＬのＰＢＳ／ＢＳＡ中に再懸濁して、励起のため４８８ｎｍのアルゴンレーザーを使用するBeckman-Coulter FC500フローサイトメーターで分析した。
【００８８】
Ｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイ
ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ（Ｓ）融合遺伝子の短い型のオープンリーディングフレームをＨＣＣ７８のｃＤＮＡからＰＣＲにより増幅して、Ｃ末端にＭｙｃタグを付けてインフレームでｐＥｘｃｈａｎｇｅ−２ベクター（Strategene、CA）にクローニングした。１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭで増殖させた２９３Ｔ細胞を、ｐＥｘｃｈａｎｇｅ−２およびｐＥｘｃｈａｎｇｅ−２／ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ（Ｓ）のそれぞれでトランスフェクトした。トランスフェクション４８時間後に、細胞溶解液を回収した。Ｍｙｃタグ抗体を用いて免疫沈降した後に、キナーゼ緩衝液（６０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、３μＭ Ｎａ３ＶＯ４、および２．５ｍＭ ＤＴＴ）でＲｏｓ免疫複合体を３回洗浄した。基質として１ｍｇ／ｍＬのＰｏｌｙ（ＥＹ、４：１）またはＡＡＡＥＥＥＹＭＭＭＦＡＫＫＫのいずれかと共に、２５μＭのＡＴＰ、０．２ｕＣｉ／ｕＬの（ガンマ３２ｐ）ＡＴＰを含む５０μＬキナーゼ緩衝液にＲｏｓ免疫複合体を再懸濁することによりキナーゼ反応を開始させた。反応混合液をｐ８１の濾紙にスポットすることにより反応を停止させた。次いで、試料を洗浄して、シンチレーションカウンターを用いた検出によってキナーゼ活性についてアッセイした。
【００８９】
免疫組織化学染色
病理組織診断の確認および組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）の構築に適した試料の選別のために、ＮＳＣＬＣのヘマトキシリンおよびエオシンのスライドを再調査した。Beecher組織パンチャー／アレイシステム（Beecher Instruments）を用いてＴＭＡを構築した。各症例について、提供者の腫瘍塊から腫瘍組織の３つのコア試料を得た。免疫組織化学試験用にＴＭＡから連続的な厚さ４μｍの組織切片を切断した。病理組織を検証するため、ヘマトキシリンおよびエオシンで最初の切片を染色した。このスライドをキシレン中で脱パラフィン化し、段階的な濃度系列のエタノールで再水和した。抗原検索（０．０１Ｍ
ＥＤＴＡ緩衝液中で１８分間のマイクロ波加熱）を行った。３％の過酸化水素によって１０分間、内因性ペルオキシダーゼを阻止した。非特異的抗体の結合を阻止するために１０％のヤギ血清（Sigma）溶液を使用し、かつ製造者の推奨する濃度で一次抗体を使用した。スライドを４℃で一晩放置した。ＴＢＳＴ中で５分間×３回洗浄することによって一次抗体を除去した後に、スライドを二次抗体と共に室温で３０分間インキュベートした。ＴＢＳＴでさらに３回洗浄した後に、ストレプトアビジン−ビオチンペルオキシダーゼを用いてスライドを可視化した。低倍率で断片を走査した。染色した腫瘍細胞の割合および強度に基づいて０〜３の免疫染色スコアを評価した。また、膜または細胞質の染色の分布も記録し、高倍率で評価した。腫瘍細胞の染色の割合および強度を考慮して半定量的に免疫反応性をスコア化した。また高倍率においても膜または細胞質の染色の分布を査定した。免疫組織化学染色を可視的な４列規模（０〜３）でスコア化した。弱く染色した細胞が５％ある試料を陰性（スコア０）とした。弱い染色強度の陽性細胞が５％超〜２０％ある試料を弱陽性（スコア１）とスコア化した。中程度から強い染色の陽性細胞が２０％超〜５０％ある試料を中程度の陽性（スコア２）、強い強度の陽性細胞が５０％を超える試料を強陽性（スコア３）としてスコア化した。ＩＨＣスコア１を有するＮＳＣＬＣ試料を陽性試料とみなした。
【００９０】
蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
ＰＤＧＦＲα遺伝子座にかかる２つのＢＡＣクローン（ＲＰ１１−２３１Ｃ１８、ＲＰ１１−８ＯＬ１１）からなるプローブセット、およびセントロメアプローブ（CEP4、Vysis（Vysis、Dowers Grove、IL、USA））を用いたＦＩＳＨにより、ＰＤＧＦＲα遺伝子座における増幅を確認した。セントロメアプローブの多染色性によって、増幅を、ＰＤＧＦＲα遺伝子座それ自体の増幅と識別することができる。ＰＤＧＦＲαのプローブをSpectrum Orange dUTP（Vysis）で、CEP4をSpectrum Green dUTPで標識した。ＲＯＳに関わる再編成を解析するために、二色分離プローブを設計した。近位プローブ（ＢＡＣクローンＲＰ１−１７９Ｐ９）および２種類の遠位プローブ（ＢＡＣクローンＲＰ１１−３２３Ｏ１７、ＲＰ１−９４Ｇ１６）をそれぞれ、Spectrum Orange dUTPまたはSpectrum Green dUTPで標識した。ＡＬＫについては、二色分離再編成プローブをVysis（Vysis、Dowers Grove、IL、USA）から得た。この二色分離再編成プローブには、ＡＬＫの切断点の両側を別々に標識する２つの異なるプローブが含まれる。ＲＯＳおよびＡＬＫのプローブセットの両方について、ハイブッド形成した際に、陰性領域は橙色／緑色の融合シグナルのように見えるが、これらの遺伝子座における再編成によって橙色と緑色の別々のシグナルが生じることとなる。プローブの標識を行った。ニックトランスレーションによるこれらのプローブの標識およびホルマリン固定しパラフィン包埋した（ＦＦＰＥ）組織切片を用いた間期ＦＩＳＨは、製品使用説明書（Vysis）に従って、以下の点を変更して行った。簡単に説明すると、パラフィン包埋組織切片を再水和して、０．０１Ｍのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で１１分間、マイクロ波抗原賦活化を行った。切片を、プロテアーゼ（４ｍｇ／ｍＬペプシン、２０００〜３０００Ｕ／ｍｇ）で３７℃で２５分間消化し、脱水して、該ＦＩＳＨプローブセットと共に３７℃で１８時間ハイブリッド形成させた。洗浄後、Vectashieldマウンティングメディウム（Vector Laboratories、Burlingame、CA）中の４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ；０．５ｕｇ／ｍＬ）を核対比染色に適用した。スクリーニングには、ＮＳＣＬＣ患者の試料由来の０．１ｍｍの組織コアのアレイを用いた。切片全体を用いて陽性試料をさらに解析して、少なくとも５０細胞を計数して細胞遺伝学的な変化の頻度を解析した。該ＦＩＳＨプローブセットを用いたスクリーニングのためのＰＤＧＦＲαのＩＨＣ陽性試料のセットから１８名の患者の試料が利用可能であった。１４試料のスコア化に成功し、１つは大型の増幅を含んでいることが判明した。癌細胞の大多数が増幅を含んでいた。Ｈ１７０３の異種移植片を解析したが増幅は認められなかった。
【００９１】
受託番号
ヌクレオチド配列ＣＤ７４−ＲＯＳ：ＥＵ２３６９４５、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ（ロング)：ＥＵ２３６９４６、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ（ショート)：ＥＵ２３６９４７、ＥＭＬ４−ＡＬＫ：ＥＵ２３６９４８、およびタンパク質配列ＣＤ７４／ＲＯＳ：ＡＢＸ５９６７１、ＳＬＣ３４Ａ２／ＲＯＳ融合タンパク質ロングアイソフォーム：ＡＢＸ５９６７２、ＳＬＣ３４Ａ２／ＲＯＳ融合タンパク質ショートアイソフォーム：ＡＢＸ５９６７３、ＥＭＬ４／ＡＬＫ：ＡＢＸ５９６７４をGenBankに寄託した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の癌細胞を分類する方法であって、
（ａ）癌細胞の試料を得るステップと、
（ｂ）前記試料中の少なくとも１つのシグナル伝達経路にある１種または複数種のチロシンキナーゼの有無またはレベルを検出するステップと、
（ｃ）１種または複数種の前記チロシンキナーゼの有無またはレベルに基づいて前記癌細胞を分類するステップと
を含む方法。
【請求項２】
ステップ（ｂ）が、ＦＩＳＨ、ＩＨＣ、ＰＣＲ、ＭＳ、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、およびＥＬＩＳＡからなる群から選択される１つまたは複数の方法を用いることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
試料中の癌細胞を分類する方法であって、
（ａ）癌細胞の試料を得るステップと、
（ｂ）前記試料中の少なくとも１つのシグナル伝達経路にある１種または複数種のリン酸化型チロシンキナーゼの有無またはレベルを検出するステップと、
（ｃ）１種または複数種のリン酸化型チロシンキナーゼの有無またはレベルに基づいて前記癌細胞を分類するステップと
を含む方法。
【請求項４】
ステップ（ｂ）が、リン酸化ペプチドを免疫沈降することと、免疫沈降した前記リン酸化ペプチドを分析することとを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
１種または複数種の前記チロシンキナーゼが、ＥＧＦＲ、ＦＡＫ、Ｓｒｃ、ＡＬＫ、ＰＤＧＦＲａ、Ｅｒｂ２、ＲＯＳ、ｃＭｅｔ、Ａｘｌ、ｅｐｈＡ２、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、およびＦＧＦＲからなる群から選択される、請求項１または３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｃ）が、１つまたは複数の統計的な方法を含む、請求項１または３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｃ）が、教師なしピアソンクラスタ分析を用いることを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｃ）が、１種または２種のみの高度にリン酸化されたチロシンキナーゼを有するものとして前記癌細胞を分類することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｃ）が、リン酸化型のＦａｋ、Ｓｒｃ、Ａｂｌ、ならびにＥＧＦＲ、ＡＬＫ、ＰＤＧＦＲａ、Ｅｒｂ２、ＲＯＳ、ｃＭｅｔ、Ａｘｌ、ｅｐｈＡ２、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＦＧＦＲ、ＶＥＧＲ−２、ＩＧＦＲ１、ＬＹＮ、ＨＣＫ、ＨＥＲ２、ＩＲＳ１、ＩＲＳ２、およびＢＲＫからなる群から選択される少なくとも１つの受容体チロシンキナーゼを発現しているものとして前記癌細胞を分類することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｃ）が、リン酸化型のＤＤＲ１、Ｓｒｃ、およびＡｂｌを発現しているものとして前記癌細胞を分類することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｃ）が、リン酸化型のＳｒｃ、ならびにＥＧＦＲ、ＡＬＫ、ＰＤＧＦＲａ、Ｅｒｂ２、ＲＯＳ、ｃＭｅｔ、Ａｘｌ、ｅｐｈＡ２、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＦＧＦＲ、ＶＥＧＲ−２、ＩＧＦＲ１、ＬＹＮ、ＨＣＫ、ＨＥＲ２、ＩＲＳ１、ＩＲＳ２、およびＢＲＫからなる群から選択される少なくとも１つの受容体チロシンキナーゼを発現しているものとして前記癌細胞を分類することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｃ）が、リン酸化型のＳｒｃおよびＡｂｌを発現しているものとして前記癌細胞を分類することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１３】
前記癌細胞が、肺癌、血液癌、前立腺癌、乳癌、および胃腸管の腫瘍からなる群から選択される癌に由来する、請求項１または３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を分類する方法であって、
（ａ）ＮＳＣＬＣ細胞の試料を得るステップと、
（ｂ）前記試料中の少なくとも１つのシグナル伝達経路にある１種または複数種のチロシンキナーゼの有無またはレベルを測定するステップと、
（ｃ）１種または複数種の前記チロシンキナーゼの有無またはレベルに基づいて前記ＮＳＣＬＣ細胞を分類するステップと
を含む方法。
【請求項１５】
ステップ（ｂ）が、ＦＩＳＨ、ＩＨＣ、ＰＣＲ、ＭＳ、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、およびＥＬＩＳＡからなる群から選択される１つまたは複数の方法を用いることを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を分類する方法であって、
（ａ）ＮＳＣＬＣ細胞の試料を得るステップと、
（ｂ）前記試料中の少なくとも１つのシグナル伝達経路にある１種または複数種のリン酸化型チロシンキナーゼの有無またはレベルを測定するステップと、
（ｃ）１種または複数種のリン酸化型チロシンキナーゼの有無またはレベルに基づいて前記ＮＳＣＬＣ細胞を分類するステップと
を含む方法。
【請求項１７】
ステップ（ｂ）が、リン酸化ペプチドを免疫沈降することと、免疫沈降した前記リン酸化ペプチドを分析することとを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
１種または複数種の前記チロシンキナーゼのうちの少なくとも１つが、ＥＧＦＲ、ＦＡＫ、Ｓｒｃ、ＡＬＫ、ＰＤＧＦＲａ、Ｅｒｂ２、ＲＯＳ、ｃＭｅｔ、Ａｘｌ、ｅｐｈＡ２、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、およびＦＧＦＲからなる群から選択される、請求項１４または１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ｃ）が、１つまたは複数の統計的な方法を含む、請求項１４または１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
ステップ（ｃ）が、教師なしピアソンクラスタ分析を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ステップ（ｃ）が、１種または２種のみの高度にリン酸化されたチロシンキナーゼを有するものとして前記ＮＳＣＬＣ細胞を分類することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
ステップ（ｃ）が、リン酸化型のＦａｋ、Ｓｒｃ、Ａｂｌ、ならびにＥＧＦＲ、ＡＬＫ、ＰＤＧＦＲａ、Ｅｒｂ２、ＲＯＳ、ｃＭｅｔ、Ａｘｌ、ｅｐｈＡ２、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＦＧＦＲ、ＶＥＧＲ−２、ＩＧＦＲ１、ＬＹＮ、ＨＣＫ、ＨＥＲ２、ＩＲＳ１、ＩＲＳ２、およびＢＲＫからなる群から選択される少なくとも１つの受容体チロシンキナーゼを発現しているものとして前記ＮＳＣＬＣ細胞を分類することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
ステップ（ｃ）が、リン酸化型のＤＤＲ１、Ｓｒｃ、およびＡｂｌを発現しているものとして前記ＮＳＣＬＣ細胞を分類することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
ステップ（ｃ）が、リン酸化型のＳｒｃ、ならびにＥＧＦＲ、ＡＬＫ、ＰＤＧＦＲａ、Ｅｒｂ２、ＲＯＳ、ｃＭｅｔ、Ａｘｌ、ｅｐｈＡ２、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＦＧＦＲ、ＶＥＧＲ−２、ＩＧＦＲ１、ＬＹＮ、ＨＣＫ、ＨＥＲ２、ＩＲＳ１、ＩＲＳ２、およびＢＲＫからなる群から選択される少なくとも１つの受容体チロシンキナーゼを発現しているものとして前記ＮＳＣＬＣ細胞を分類することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
ステップ（ｃ）が、リン酸化型のＳｒｃおよびＡｂｌを発現しているものとして前記ＮＳＣＬＣ細胞を分類することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２６】
対象者において癌を治療する方法であって、
（ａ）前記対象者から癌細胞の試料を採取するステップと、
（ｂ）前記試料中の少なくとも１つのシグナル伝達経路にある１種または複数種の異常に発現したチロシンキナーゼのレベルに基づいて前記癌細胞を分類するステップと、
（ｃ）前記分類に基づいて有効量の１種または複数種のチロシンキナーゼ阻害剤を投与するステップと
を含む方法。
【請求項２７】
ステップ（ｂ）が、ＦＩＳＨ、ＩＨＣ、ＰＣＲ、ＭＳ、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、およびＥＬＩＳＡからなる群から選択される１つまたは複数の方法を用いることを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
対象者において癌を治療する方法であって、
（ａ）前記対象者から癌細胞の試料を採取するステップと、
（ｂ）前記試料中の少なくとも１つのシグナル伝達経路にある１種または複数種の異常にリン酸化されたチロシンキナーゼのレベルに基づいて前記癌細胞を分類するステップと、
（ｃ）前記分類に基づいて有効量の１種または複数種のチロシンキナーゼ阻害剤を投与するステップと
を含む方法。
【請求項２９】
ステップ（ｂ）が、リン酸化ペプチドを免疫沈降することと、免疫沈降した前記リン酸化ペプチドを分析することとを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
１種または複数種の前記チロシンキナーゼ阻害剤が、ＥＧＦＲ、Ｆａｋ、Ｓｒｃ、Ａｌｋ、ＰＤＧＦＲａ、Ｅｒｂ２、ＲＯＳ、ｃＭｅｔ、Ａｘｌ、ｅｐｈＡ２、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、およびＦＧＦＲからなる群から選択される１種または複数種のチロシンキナーゼを阻害する、請求項２６または２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記癌細胞が、１種または２種のみの高度にリン酸化されたチロシンキナーゼを有するものとして分類される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記癌細胞が、リン酸化型のＦａｋ、Ｓｒｃ、Ａｂｌ、ならびにＥＧＦＲ、ＡＬＫ、ＰＤＧＦＲａ、Ｅｒｂ２、ＲＯＳ、ｃＭｅｔ、Ａｘｌ、ｅｐｈＡ２、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＦＧＦＲ、ＶＥＧＲ−２、ＩＧＦＲ１、ＬＹＮ、ＨＣＫ、ＨＥＲ２、ＩＲＳ１、ＩＲＳ２、およびＢＲＫからなる群から選択される少なくとも１つの受容体チロシンキナーゼを発現しているものとして分類される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記癌細胞が、リン酸化型のＤＤＲ１、Ｓｒｃ、およびＡｂｌを発現しているものとして分類される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記癌細胞が、リン酸化型のＳｒｃ、ならびにＥＧＦＲ、ＡＬＫ、ＰＤＧＦＲａ、Ｅｒｂ２、ＲＯＳ、ｃＭｅｔ、Ａｘｌ、ｅｐｈＡ２、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＦＧＦＲ、ＶＥＧＲ−２、ＩＧＦＲ１、ＬＹＮ、ＨＣＫ、ＨＥＲ２、ＩＲＳ１、ＩＲＳ２、およびＢＲＫからなる群から選択される少なくとも１つの受容体チロシンキナーゼを発現しているものとして分類される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
前記癌細胞が、リン酸化型のＳｒｃおよびＡｂｌを発現しているものとして分類される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
前記癌細胞が、肺癌、血液癌、前立腺癌、乳癌、および胃腸管の腫瘍からなる群から選択される癌に由来する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
対象者において非小細胞肺癌（ＮＳＣＬ（Ｃ）を治療する方法であって、
（ａ）前記対象者からＮＳＣＬＣ細胞の試料を採取するステップと、
（ｂ）前記試料中の少なくとも１つのシグナル伝達経路にある１種または複数種の異常に発現したチロシンキナーゼのレベルに基づいて前記ＮＳＣＬＣ細胞を分類するステップと、
（ｃ）前記分類に基づいて有効量の１種または複数種のチロシンキナーゼ阻害剤を投与するステップと
を含む方法。
【請求項３８】
ステップ（ｂ）が、ＦＩＳＨ、ＩＨＣ、ＰＣＲ、ＭＳ、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、およびＥＬＩＳＡからなる群から選択される１つまたは複数の方法を用いることを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
対象者において非小細胞肺癌（ＮＳＣＬ（Ｃ）を治療する方法であって、
（ａ）前記対象者からＮＳＣＬＣ細胞の試料を採取するステップと、
（ｂ）前記試料中の少なくとも１つのシグナル伝達経路にある１種または複数種の異常にリン酸化されたチロシンキナーゼのレベルに基づいて前記ＮＳＣＬＣ細胞を分類するステップと、
（ｃ）前記分類に基づいて有効量の１種または複数種のチロシンキナーゼ阻害剤を投与するステップと
を含む方法。
【請求項４０】
ステップ（ｂ）が、リン酸化ペプチドを免疫沈降することと、免疫沈降した前記リン酸化ペプチドを分析することとを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
１種または複数種の前記チロシンキナーゼ阻害剤が、ＥＧＦＲ、Ｆａｋ、Ｓｒｃ、Ａｌｋ、ＰＤＧＦＲａ、Ｅｒｂ２、ＲＯＳ、ｃＭｅｔ、Ａｘｌ、ｅｐｈＡ２、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、およびＦＧＦＲからなる群から選択される１種または複数種のチロシンキナーゼを阻害する、請求項３７または３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＮＳＣＬＣ細胞が１種または２種のみの高度にリン酸化されたチロシンキナーゼを有するものとして分類される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＮＳＣＬＣ細胞がリン酸化型のＦａｋ、Ｓｒｃ、Ａｂｌ、ならびにＥＧＦＲ、ＡＬＫ、ＰＤＧＦＲａ、Ｅｒｂ２、ＲＯＳ、ｃＭｅｔ、Ａｘｌ、ｅｐｈＡ２、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＦＧＦＲ、ＶＥＧＲ−２、ＩＧＦＲ１、ＬＹＮ、ＨＣＫ、ＨＥＲ２、ＩＲＳ１、ＩＲＳ２、およびＢＲＫからなる群から選択される少なくとも１つの受容体チロシンキナーゼを発現しているものとして分類される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＮＳＣＬＣ細胞がリン酸化型のＤＤＲ１、Ｓｒｃ、およびＡｂｌを発現しているものとして分類される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
前記ＮＳＣＬＣ細胞がリン酸化型のＳｒｃ、ならびにＥＧＦＲ、ＡＬＫ、ＰＤＧＦＲａ、Ｅｒｂ２、ＲＯＳ、ｃＭｅｔ、Ａｘｌ、ｅｐｈＡ２、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＦＧＦＲ、ＶＥＧＲ−２、ＩＧＦＲ１、ＬＹＮ、ＨＣＫ、ＨＥＲ２、ＩＲＳ１、ＩＲＳ２、およびＢＲＫからなる群から選択される少なくとも１つの受容体チロシンキナーゼを発現しているものとして分類される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４６】
前記ＮＳＣＬＣ細胞がリン酸化型のＳｒｃおよびＡｂｌを発現しているものとして分類される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４７】
対象者における癌に対する治療の有効性を判定する方法であって、
（ａ）前記対象者から癌細胞の試料を採取するステップと、
（ｂ）前記試料中の少なくとも１つのシグナル伝達経路にある１種または複数種のチロシンキナーゼの有無またはレベルを検出するステップと
を含み、１種または複数種の前記チロシンキナーゼの有無またはレベルが前記治療の有効性と相関している方法。
【請求項４８】
ステップ（ｂ）が、ＦＩＳＨ、ＩＨＣ、ＰＣＲ、ＭＳ、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、およびＥＬＩＳＡからなる群から選択される１つまたは複数の方法を用いることを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
対象者における癌に対する治療の有効性を判定する方法であって、
（ａ）前記対象者から癌細胞の試料を採取するステップと、
（ｂ）前記試料中の少なくとも１つのシグナル伝達経路にある１種または複数種のリン酸化型チロシンキナーゼの有無またはレベルを検出するステップと
を含み、１種または複数種の前記チロシンキナーゼの有無またはレベルが前記治療の有効性と相関している方法。
【請求項５０】
ステップ（ｂ）が、リン酸化ペプチドを免疫沈降することと、免疫沈降した前記リン酸化ペプチドを分析することとを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
１種または複数種の前記チロシンキナーゼが、ＥＧＦＲ、ＦＡＫ、Ｓｒｃ、ＡＬＫ、ＰＤＧＦＲａ、Ｅｒｂ２、ＲＯＳ、ｃＭｅｔ、Ａｘｌ、ｅｐｈＡ２、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、およびＦＧＦＲからなる群から選択される、請求項４７または４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１】
試料中の癌細胞を分類する方法であって、
（ａ）癌細胞の試料を得るステップと、
（ｂ）前記試料中の少なくとも１つのシグナル伝達経路にある１種または複数種のチロシンキナーゼの有無またはレベルを検出するステップと、
（ｃ）１種または複数種の前記チロシンキナーゼの有無またはレベルに基づいて前記癌細胞を分類するステップと
を含む方法。
【請求項２】
ステップ（ｂ）が、ＦＩＳＨ、ＩＨＣ、ＰＣＲ、ＭＳ、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、およびＥＬＩＳＡからなる群から選択される１つまたは複数の方法を用いることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
試料中の癌細胞を分類する方法であって、
（ａ）癌細胞の試料を得るステップと、
（ｂ）前記試料中の少なくとも１つのシグナル伝達経路にある１種または複数種のリン酸化型チロシンキナーゼの有無またはレベルを検出するステップと、
（ｃ）１種または複数種のリン酸化型チロシンキナーゼの有無またはレベルに基づいて前記癌細胞を分類するステップと
を含む方法。
【請求項４】
ステップ（ｂ）が、リン酸化ペプチドを免疫沈降することと、免疫沈降した前記リン酸化ペプチドを分析することとを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
１種または複数種の前記チロシンキナーゼが、ＥＧＦＲ、ＦＡＫ、Ｓｒｃ、ＡＬＫ、ＰＤＧＦＲａ、Ｅｒｂ２、ＲＯＳ、ｃＭｅｔ、Ａｘｌ、ｅｐｈＡ２、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、およびＦＧＦＲからなる群から選択される、請求項１または３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｃ）が、１つまたは複数の統計的な方法を含む、請求項１または３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｃ）が、教師なしピアソンクラスタ分析を用いることを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｃ）が、１種または２種のみの高度にリン酸化されたチロシンキナーゼを有するものとして前記癌細胞を分類することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｃ）が、リン酸化型のＦａｋ、Ｓｒｃ、Ａｂｌ、ならびにＥＧＦＲ、ＡＬＫ、ＰＤＧＦＲａ、Ｅｒｂ２、ＲＯＳ、ｃＭｅｔ、Ａｘｌ、ｅｐｈＡ２、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＦＧＦＲ、ＶＥＧＲ−２、ＩＧＦＲ１、ＬＹＮ、ＨＣＫ、ＨＥＲ２、ＩＲＳ１、ＩＲＳ２、およびＢＲＫからなる群から選択される少なくとも１つの受容体チロシンキナーゼを発現しているものとして前記癌細胞を分類することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｃ）が、リン酸化型のＤＤＲ１、Ｓｒｃ、およびＡｂｌを発現しているものとして前記癌細胞を分類することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｃ）が、リン酸化型のＳｒｃ、ならびにＥＧＦＲ、ＡＬＫ、ＰＤＧＦＲａ、Ｅｒｂ２、ＲＯＳ、ｃＭｅｔ、Ａｘｌ、ｅｐｈＡ２、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＦＧＦＲ、ＶＥＧＲ−２、ＩＧＦＲ１、ＬＹＮ、ＨＣＫ、ＨＥＲ２、ＩＲＳ１、ＩＲＳ２、およびＢＲＫからなる群から選択される少なくとも１つの受容体チロシンキナーゼを発現しているものとして前記癌細胞を分類することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｃ）が、リン酸化型のＳｒｃおよびＡｂｌを発現しているものとして前記癌細胞を分類することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１３】
前記癌細胞が、肺癌、血液癌、前立腺癌、乳癌、および胃腸管の腫瘍からなる群から選択される癌に由来する、請求項１または３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を分類する方法であって、
（ａ）ＮＳＣＬＣ細胞の試料を得るステップと、
（ｂ）前記試料中の少なくとも１つのシグナル伝達経路にある１種または複数種のチロシンキナーゼの有無またはレベルを測定するステップと、
（ｃ）１種または複数種の前記チロシンキナーゼの有無またはレベルに基づいて前記ＮＳＣＬＣ細胞を分類するステップと
を含む方法。
【請求項１５】
ステップ（ｂ）が、ＦＩＳＨ、ＩＨＣ、ＰＣＲ、ＭＳ、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、およびＥＬＩＳＡからなる群から選択される１つまたは複数の方法を用いることを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を分類する方法であって、
（ａ）ＮＳＣＬＣ細胞の試料を得るステップと、
（ｂ）前記試料中の少なくとも１つのシグナル伝達経路にある１種または複数種のリン酸化型チロシンキナーゼの有無またはレベルを測定するステップと、
（ｃ）１種または複数種のリン酸化型チロシンキナーゼの有無またはレベルに基づいて前記ＮＳＣＬＣ細胞を分類するステップと
を含む方法。
【請求項１７】
ステップ（ｂ）が、リン酸化ペプチドを免疫沈降することと、免疫沈降した前記リン酸化ペプチドを分析することとを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
１種または複数種の前記チロシンキナーゼのうちの少なくとも１つが、ＥＧＦＲ、ＦＡＫ、Ｓｒｃ、ＡＬＫ、ＰＤＧＦＲａ、Ｅｒｂ２、ＲＯＳ、ｃＭｅｔ、Ａｘｌ、ｅｐｈＡ２、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、およびＦＧＦＲからなる群から選択される、請求項１４または１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ｃ）が、１つまたは複数の統計的な方法を含む、請求項１４または１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
ステップ（ｃ）が、教師なしピアソンクラスタ分析を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ステップ（ｃ）が、１種または２種のみの高度にリン酸化されたチロシンキナーゼを有するものとして前記ＮＳＣＬＣ細胞を分類することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
ステップ（ｃ）が、リン酸化型のＦａｋ、Ｓｒｃ、Ａｂｌ、ならびにＥＧＦＲ、ＡＬＫ、ＰＤＧＦＲａ、Ｅｒｂ２、ＲＯＳ、ｃＭｅｔ、Ａｘｌ、ｅｐｈＡ２、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＦＧＦＲ、ＶＥＧＲ−２、ＩＧＦＲ１、ＬＹＮ、ＨＣＫ、ＨＥＲ２、ＩＲＳ１、ＩＲＳ２、およびＢＲＫからなる群から選択される少なくとも１つの受容体チロシンキナーゼを発現しているものとして前記ＮＳＣＬＣ細胞を分類することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
ステップ（ｃ）が、リン酸化型のＤＤＲ１、Ｓｒｃ、およびＡｂｌを発現しているものとして前記ＮＳＣＬＣ細胞を分類することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
ステップ（ｃ）が、リン酸化型のＳｒｃ、ならびにＥＧＦＲ、ＡＬＫ、ＰＤＧＦＲａ、Ｅｒｂ２、ＲＯＳ、ｃＭｅｔ、Ａｘｌ、ｅｐｈＡ２、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＦＧＦＲ、ＶＥＧＲ−２、ＩＧＦＲ１、ＬＹＮ、ＨＣＫ、ＨＥＲ２、ＩＲＳ１、ＩＲＳ２、およびＢＲＫからなる群から選択される少なくとも１つの受容体チロシンキナーゼを発現しているものとして前記ＮＳＣＬＣ細胞を分類することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
ステップ（ｃ）が、リン酸化型のＳｒｃおよびＡｂｌを発現しているものとして前記ＮＳＣＬＣ細胞を分類することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２６】
対象者において癌を治療する方法であって、
（ａ）前記対象者から癌細胞の試料を採取するステップと、
（ｂ）前記試料中の少なくとも１つのシグナル伝達経路にある１種または複数種の異常に発現したチロシンキナーゼのレベルに基づいて前記癌細胞を分類するステップと、
（ｃ）前記分類に基づいて有効量の１種または複数種のチロシンキナーゼ阻害剤を投与するステップと
を含む方法。
【請求項２７】
ステップ（ｂ）が、ＦＩＳＨ、ＩＨＣ、ＰＣＲ、ＭＳ、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、およびＥＬＩＳＡからなる群から選択される１つまたは複数の方法を用いることを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
対象者において癌を治療する方法であって、
（ａ）前記対象者から癌細胞の試料を採取するステップと、
（ｂ）前記試料中の少なくとも１つのシグナル伝達経路にある１種または複数種の異常にリン酸化されたチロシンキナーゼのレベルに基づいて前記癌細胞を分類するステップと、
（ｃ）前記分類に基づいて有効量の１種または複数種のチロシンキナーゼ阻害剤を投与するステップと
を含む方法。
【請求項２９】
ステップ（ｂ）が、リン酸化ペプチドを免疫沈降することと、免疫沈降した前記リン酸化ペプチドを分析することとを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
１種または複数種の前記チロシンキナーゼ阻害剤が、ＥＧＦＲ、Ｆａｋ、Ｓｒｃ、Ａｌｋ、ＰＤＧＦＲａ、Ｅｒｂ２、ＲＯＳ、ｃＭｅｔ、Ａｘｌ、ｅｐｈＡ２、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、およびＦＧＦＲからなる群から選択される１種または複数種のチロシンキナーゼを阻害する、請求項２６または２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記癌細胞が、１種または２種のみの高度にリン酸化されたチロシンキナーゼを有するものとして分類される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記癌細胞が、リン酸化型のＦａｋ、Ｓｒｃ、Ａｂｌ、ならびにＥＧＦＲ、ＡＬＫ、ＰＤＧＦＲａ、Ｅｒｂ２、ＲＯＳ、ｃＭｅｔ、Ａｘｌ、ｅｐｈＡ２、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＦＧＦＲ、ＶＥＧＲ−２、ＩＧＦＲ１、ＬＹＮ、ＨＣＫ、ＨＥＲ２、ＩＲＳ１、ＩＲＳ２、およびＢＲＫからなる群から選択される少なくとも１つの受容体チロシンキナーゼを発現しているものとして分類される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記癌細胞が、リン酸化型のＤＤＲ１、Ｓｒｃ、およびＡｂｌを発現しているものとして分類される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記癌細胞が、リン酸化型のＳｒｃ、ならびにＥＧＦＲ、ＡＬＫ、ＰＤＧＦＲａ、Ｅｒｂ２、ＲＯＳ、ｃＭｅｔ、Ａｘｌ、ｅｐｈＡ２、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＦＧＦＲ、ＶＥＧＲ−２、ＩＧＦＲ１、ＬＹＮ、ＨＣＫ、ＨＥＲ２、ＩＲＳ１、ＩＲＳ２、およびＢＲＫからなる群から選択される少なくとも１つの受容体チロシンキナーゼを発現しているものとして分類される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
前記癌細胞が、リン酸化型のＳｒｃおよびＡｂｌを発現しているものとして分類される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
前記癌細胞が、肺癌、血液癌、前立腺癌、乳癌、および胃腸管の腫瘍からなる群から選択される癌に由来する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
対象者において非小細胞肺癌（ＮＳＣＬ（Ｃ）を治療する方法であって、
（ａ）前記対象者からＮＳＣＬＣ細胞の試料を採取するステップと、
（ｂ）前記試料中の少なくとも１つのシグナル伝達経路にある１種または複数種の異常に発現したチロシンキナーゼのレベルに基づいて前記ＮＳＣＬＣ細胞を分類するステップと、
（ｃ）前記分類に基づいて有効量の１種または複数種のチロシンキナーゼ阻害剤を投与するステップと
を含む方法。
【請求項３８】
ステップ（ｂ）が、ＦＩＳＨ、ＩＨＣ、ＰＣＲ、ＭＳ、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、およびＥＬＩＳＡからなる群から選択される１つまたは複数の方法を用いることを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
対象者において非小細胞肺癌（ＮＳＣＬ（Ｃ）を治療する方法であって、
（ａ）前記対象者からＮＳＣＬＣ細胞の試料を採取するステップと、
（ｂ）前記試料中の少なくとも１つのシグナル伝達経路にある１種または複数種の異常にリン酸化されたチロシンキナーゼのレベルに基づいて前記ＮＳＣＬＣ細胞を分類するステップと、
（ｃ）前記分類に基づいて有効量の１種または複数種のチロシンキナーゼ阻害剤を投与するステップと
を含む方法。
【請求項４０】
ステップ（ｂ）が、リン酸化ペプチドを免疫沈降することと、免疫沈降した前記リン酸化ペプチドを分析することとを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
１種または複数種の前記チロシンキナーゼ阻害剤が、ＥＧＦＲ、Ｆａｋ、Ｓｒｃ、Ａｌｋ、ＰＤＧＦＲａ、Ｅｒｂ２、ＲＯＳ、ｃＭｅｔ、Ａｘｌ、ｅｐｈＡ２、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、およびＦＧＦＲからなる群から選択される１種または複数種のチロシンキナーゼを阻害する、請求項３７または３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＮＳＣＬＣ細胞が１種または２種のみの高度にリン酸化されたチロシンキナーゼを有するものとして分類される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＮＳＣＬＣ細胞がリン酸化型のＦａｋ、Ｓｒｃ、Ａｂｌ、ならびにＥＧＦＲ、ＡＬＫ、ＰＤＧＦＲａ、Ｅｒｂ２、ＲＯＳ、ｃＭｅｔ、Ａｘｌ、ｅｐｈＡ２、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＦＧＦＲ、ＶＥＧＲ−２、ＩＧＦＲ１、ＬＹＮ、ＨＣＫ、ＨＥＲ２、ＩＲＳ１、ＩＲＳ２、およびＢＲＫからなる群から選択される少なくとも１つの受容体チロシンキナーゼを発現しているものとして分類される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＮＳＣＬＣ細胞がリン酸化型のＤＤＲ１、Ｓｒｃ、およびＡｂｌを発現しているものとして分類される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
前記ＮＳＣＬＣ細胞がリン酸化型のＳｒｃ、ならびにＥＧＦＲ、ＡＬＫ、ＰＤＧＦＲａ、Ｅｒｂ２、ＲＯＳ、ｃＭｅｔ、Ａｘｌ、ｅｐｈＡ２、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＦＧＦＲ、ＶＥＧＲ−２、ＩＧＦＲ１、ＬＹＮ、ＨＣＫ、ＨＥＲ２、ＩＲＳ１、ＩＲＳ２、およびＢＲＫからなる群から選択される少なくとも１つの受容体チロシンキナーゼを発現しているものとして分類される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４６】
前記ＮＳＣＬＣ細胞がリン酸化型のＳｒｃおよびＡｂｌを発現しているものとして分類される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４７】
対象者における癌に対する治療の有効性を判定する方法であって、
（ａ）前記対象者から癌細胞の試料を採取するステップと、
（ｂ）前記試料中の少なくとも１つのシグナル伝達経路にある１種または複数種のチロシンキナーゼの有無またはレベルを検出するステップと
を含み、１種または複数種の前記チロシンキナーゼの有無またはレベルが前記治療の有効性と相関している方法。
【請求項４８】
ステップ（ｂ）が、ＦＩＳＨ、ＩＨＣ、ＰＣＲ、ＭＳ、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、およびＥＬＩＳＡからなる群から選択される１つまたは複数の方法を用いることを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
対象者における癌に対する治療の有効性を判定する方法であって、
（ａ）前記対象者から癌細胞の試料を採取するステップと、
（ｂ）前記試料中の少なくとも１つのシグナル伝達経路にある１種または複数種のリン酸化型チロシンキナーゼの有無またはレベルを検出するステップと
を含み、１種または複数種の前記チロシンキナーゼの有無またはレベルが前記治療の有効性と相関している方法。
【請求項５０】
ステップ（ｂ）が、リン酸化ペプチドを免疫沈降することと、免疫沈降した前記リン酸化ペプチドを分析することとを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
１種または複数種の前記チロシンキナーゼが、ＥＧＦＲ、ＦＡＫ、Ｓｒｃ、ＡＬＫ、ＰＤＧＦＲａ、Ｅｒｂ２、ＲＯＳ、ｃＭｅｔ、Ａｘｌ、ｅｐｈＡ２、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、およびＦＧＦＲからなる群から選択される、請求項４７または４９のいずれか１項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２０１１−５２２２１２（Ｐ２０１１−５２２２１２Ａ）
【公表日】平成２３年７月２８日（２０１１．７．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２９９８４（Ｐ２０１０−５２９９８４）
【出願日】平成２０年１０月２０日（２００８．１０．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１１９６９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０５４９３９
【国際公開日】平成２１年４月３０日（２００９．４．３０）
【出願人】（５０１０８７４９０）セル・シグナリング・テクノロジー・インコーポレイテツド (11)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年７月２８日（２０１１．７．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月２０日（２００８．１０．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１１９６９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０５４９３９
【国際公開日】平成２１年４月３０日（２００９．４．３０）
【出願人】（５０１０８７４９０）セル・シグナリング・テクノロジー・インコーポレイテツド (11)
【Ｆターム（参考）】
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