癌診断方法
癌の初期において癌細胞の存在証拠を血液中から検出できる、癌診断方法を提供する。体液中から体細胞・癌細胞成分として、ＲＮＡのみを含む試料を得る工程と、ＲＮＡを含む試料から逆転写酵素でｃＤＮＡを生成する逆転写酵素反応と蛍光色素を用いたＰＣＲを、プライマーとして、ｈＴＥＲＴでは、ＣＧＧＡＡＧＡＧＴＧＴＣＴＧＧＡＧＣＡＡとＧＧＡＴＧＡＡＧＣＧＧＡＧＴＣＴＧＧＡを用いて行い、ＰＣＲにより増幅されたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物と結合した蛍光色素を用い、定量的に計測する工程とを備える。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、癌診断方法に関し、特に、早期に癌細胞の存在の有無を診断できる、癌診断方法に関する。
【背景技術】
日本において、毎年、新たに、３００，０００件の癌の症例が診断されている。
また、日本において、４人から５人に１人が、癌又は癌治療に関連した合併症で死亡している。このため、癌治療又は癌治療に関連した合併症の治療の改善に相当な努力が継続して行われている。
また、癌は早期に発見されると治癒率が高いことから、癌を早期に発見でき、精度の高い癌の診断方法の開発や改良が行われている。
即ち、大部分の癌患者は、その癌又は癌治療に関連した合併症腫瘍によっては死亡しない。癌患者の多くは、転移した癌、即ち、元の腫瘍細胞から分かれて、元の腫瘍細胞が存在している部位とは別の部位に移動する悪性細胞から形成される複数の腫瘍コロニーに負けるのである。
従って、患者の初期の腫瘍が発見・検出でき、そのような初期の腫瘍を、内科的切除術や、内科的抗がん治療、手術、放射線治療、抗がん剤による化学療法、及び、これらの組み合わせにより、縮小したり、除去できれば、患者は、癌を克服したり、延命することができる確立が非常に高くなる。
しかしながら、患者の腫瘍の早期発見・検出が困難であり、また、悪性腫瘍を特徴づける、転移性コロニーは、その検出が困難であり、除去も困難である、という現状があり、臨床的観点から言えば、癌治療は困難なものとなっている、という現状がある。
ところで、癌の転移は、以下に示すような複雑な出来事を含む。
１） 最初の癌の発生位置から周囲組織への癌の拡張。
２） 体腔及び血管中への腫瘍細胞の浸透。
３） 循環系により腫瘍細胞が離れた部位への輸送・放出。
４） 滞留部位における腫瘍細胞の組織への再侵入。
５） 新たな部位における腫瘍細胞の生存と、腫瘍増殖をするための血管形成等の新たな環境への適応。
即ち、腫瘍細胞は、初期の段階で、周囲組織に侵入し、組織バリアを破壊するので、腫瘍細胞は、固形腫瘍の発達の非常に初期段階（即ち、腫瘍が、１０４個以上１０６個以下の腫瘍細胞を含む時点）において、組織空間及び毛細血管中に侵入し、結局は、血液中に至るものと仮定される。この時点においては、腫瘍細胞の大部分は、アポトーシスや、免疫担当細胞により排除されたり、免疫担当細胞の殺傷機能により細胞死するか休眠状態となる。
これは、このような段階では、腫瘍細胞は、異所性環境において未だ生き残ることができず、また、成長することができないからである。
ところで、本発明者等の知る限り、このような初期段階の小さな腫瘍を検出する検出方法は未だ開発されていない。
現時点では、腫瘍がある程度大きくなった場合に、特定タイプの癌の診断に使用可能な高感度方法が開発されているに過ぎない。
そのような診断方法としては、例えば、乳房中の２×１０８個の乳腫瘍細胞を検出できる、乳房撮影が開発されている。
乳癌の場合、その初期段階においては、腫瘍細胞の大部分の流出細胞が死ぬとされている。しかしながら、腫瘍細胞が、１０６個以上１０９個まで増殖すると、何世代かにわたり、遺伝子的に不安定な腫瘍細胞のクローンは、更に、遺伝子レベルの変化を遂げ、より迅速に増殖する攻撃的な変異細胞を生じうる。そして、このような変異細胞は、二次腫瘍として生着する可能性が非常に高い。
しかしながら、上述したように、現状では、癌の診断は、初期段階では行えないため、例えば、膵臓、胃、卵巣、腎臓、肺、肝臓などの大部分の癌は、通常、１０１０個〜１０１２個の腫瘍細胞が存在するような、癌の非常に後期の段階において行われており、この時点においては、腫瘍が既に周囲組織に侵入し、転移している可能性がある。
従来は、癌の初期段階における癌診断ができないこと、癌の根治治療が困難なこと、癌転移の複雑さ、化学療法に用いる薬剤の副作用の問題や、癌患者の治療に対する欲求不満を考慮して、治療方針を立て、癌の転移又は再発に対する治療効果をモニターするための診断試験の開発が行われてきた。
そして、最近２０数年に亘る研究成果として、種々の診断試験方法が開発され、その有用性が評価されてきている。
より詳しく述べると、最初の試みとして、胎児の消化器で生産される胎児性のガン抗原と考えられていたが、結腸・直腸ガン、膵ガン、胆道系ガンなどの消化器ガンや、肺ガンなどの特定の腫瘍細胞上に出現する、癌胎児性抗原（ｃａｒｃｉｎｏ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ；ＣＥＡ）に関するイムノアッセイの定式化がある。
その後、免疫化学的手法であるラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ）や、エンザイム・イムノアッセイ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ−Ｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（酵素免疫測定法（ＥＩＡ（又はＥＬＩＳＡとも称される。）））の出現により、ＣＥＡを腫瘍マーカーとして用いたＲＩＡ（ビーズ固相法）や、αフェトプロテイン（α−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＡＦＰ）を腫瘍マーカーとして用いた逆受身赤血球凝集反応（Ｒ−ＰＨＡ）やＲＩＡ（ビーズ固相法）や、前立腺特異性抗原をマーカーとして用いたエンザイ厶・イムノアッセイ（ＥＩＡ）やＲＩＡ（ビーズ固相法）や、ＣＡ１５−３を腫瘍マーカーとして用いたＲＩＡ（ビーズ固相法）や、ＣＡ５０をマーカーとして用いたエンザイム・イムノアッセイ（ＥＩＡ）や、ＣＡ１２５をマーカーとして用いたＲＩＡ（ビーズ固相法）や、ＰＩＶＫＡ ＩＩ（［ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｖｉｔａｍｉｎｅ Ｋ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ］ＩＩ）を用いたエンザイム・イムノアッセイ（ＥＩＡ）などが多数開発されてきた。
しかしながら、これらの診断方法では、ＣＥＡ、ＡＦＰ、ＣＡ１５−３、ＣＡ５０、ＣＡ１２５、ＰＩＶＫＡ ＩＩといった抗原は、通常、血中への出現が予想されず、検出された時には、既に、患者の癌が既に相当進行しており、既に、患者の生存の望みが殆どないので、これらの診断方法は、幾分、実りの無いものである、という評価を受けている。
しかしながら、最近１０年間において、ある一つの腫瘍マーカーが、癌の早期検出に有用であると期待され、その臨床応用に向けた研究開発が継続されてきた。
即ち、このある一つの腫瘍マーカーとは、「テロメレース（ｈＴＥＲＴ）」である。
このテロメレース（ｈＴＥＲＴ）は、９０％の癌腫で産生し且つ発現する悪性腫瘍特異的抗原（酵素）であり、その活性が１９９４年に発見されて以来（Ｋｉｍ ＮＷ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２３；２６６：２０１１−２０１５（１９９４）を参照）、その後、遺伝子の発見及び機能解析が行われてきたが、その特異性にも関わらず、臨床応用に関しては、腫瘍形成、転移後の切除組織中からの検出に留まり、現行の臨床検査のように血液中から簡易に検出することができなかった。また、このテロメレース（ｈＴＥＲＴ）は、たとえ、検出できても、混入しわずかに産生し発現している他の細胞（リンパ球など）の影響が無視できず、定性的に検出することが正確にはできなかった。
２０００年には、乳癌患者の血液からｈＴＥＲＴの定性的検出に関する報告がなされたが（Ｃｈｅｎ ＸＱ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６：３８２３−３８２６（２０００））、感度が６０％以下であり臨床応用にはほど遠かった（Ｋｉｍ ＮＷ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２３；２６６：第２０１１頁〜第２０１５頁（１９９４）、Ｃｈｅｎ ＸＱ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６：第３８２３頁〜第３８２６頁（２０００）を参照。）。
ところで、有用な診断試験をするためには、非常に高感度且つ信頼できる定量性が必要とされる。
また、血液１ｍｌ中における１個の腫瘍細胞の存在が検出できる血液試験が開発できれば、それは、平均して循環している全部で３０００個〜４０００個の細胞に匹敵する。動物において、腫瘍を生着させるための接種実験において、実際にそのような数の細胞が腫瘍の生着を可能にする。さらに、３０００個〜４０００個の循環細胞が腫瘍中の全細胞の０．０１％である場合、全部で、約４×１０７個の細胞が含まれることになり、そのような数の細胞を含む腫瘍は、現在のいずれの方法によっても見ることができない。
それゆえ、腫瘍細胞が癌の初期の段階において流出する場合、上記の感度を有する試験が開発できれば、その試験により、癌を検出することができる。
また、腫瘍細胞が腫瘍サイズといくらかの関連性を持って血液中に流出する場合、腫瘍負荷を評価するための定量的試験は、有益である。
また、流出した腫瘍細胞と生体内の免疫細胞との闘いの末、腫瘍細胞や免疫担当細胞内の多種多様なＤＮＡや蛋白質やＲＮＡなどが血液中に流れ出る結果、ＲＮＡが検出されるとも考えられる。もしそうであれば、腫瘍特異的ＲＮＡの検出は、転移の最も早期での出来事を物語っているのかも知れない。しかしながら、従来は、非常に初期段階の循環腫瘍細胞の存在に関する情報がなかった。
上記のことより、二次腫瘍の確立の前に転移能を有する循環中の細胞を固定するための方法、特に癌の初期において同定する方法が渇望される。癌細胞の存在証拠を血液中から検出でき、正常細胞での発現レベルを認識でき、癌細胞由来のＲＮＡを１〜１０コピーレベルの高感度で検出できることは、臨床上、極めて有用な情報を提供することになる。
機器開発の向上に伴い、癌組織の定量化が可能になったことを受けて、そのような高感度な定量法が可能となる時代に入ってきたことで、各種癌細胞由来ＲＮＡの定量化の実現の準備は技術的にも整っていると考えられる。
本発明は、上記した問題を解決するためになされたものであって、特に、癌の初期において癌細胞の存在証拠を血液中から検出できる、癌診断方法を提供することを目的としている。
【発明の開示】
請求の範囲第１項に記載の癌診断方法は、体液中から体細胞・癌細胞成分として、ＲＮＡのみを含む試料を得る工程と、ＲＮＡを含む試料から逆転写酵素でｃＤＮＡを生成する逆転写酵素反応と蛍光色素を用いたＰＣＲを、プライマーとして、ｈＴＥＲＴでは、ＣＧＧＡＡＧＡＧＴＧＴＣＴＧＧＡＧＣＡＡとＧＧＡＴＧＡＡＧＣＧＧＡＧＴＣＴＧＧＡを用いて行い、ＰＣＲにより増幅されたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物と結合した蛍光色素を用い、定量的に計測する工程とを備える。
尚、本明細書で用いる用語、「体液」は、血液、リンパ液その他の体液を意味する。
請求の範囲第２項に記載の癌診断方法は、体液中から体細胞・癌細胞成分として、ＲＮＡのみを含む試料を得る工程と、ＲＮＡを含む試料から逆転写酵素でｃＤＮＡを生成する逆転写酵素反応と蛍光色素を用いたＰＣＲを、プライマーとして、ＡＦＰでは、ＣＣＡＧＡＡＡＣＴＡＧＴＣＣＴＧＧＡＴＧＴとＣＧＴＧＧＴＣＡＧＴＴＴＧＣＡＧＣＡＴＴを用いて行い、ＰＣＲにより増幅されたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物と結合した蛍光色素を用い、定量的に計測する工程とを備える。
本発明に係る癌診断方法は、癌の初期において癌細胞の存在証拠を血液中から検出できるので、早期に医療行為によって癌細胞を根絶することが可能になる。
また、本発明に係る癌診断方法では、血液中からｍＲＮＡを含む試料を得るようにしたので、癌組織腫瘍形成、転移後の切除組織中からテロメレース（ｈＴＥＲＴ）やＡＦＰを検出するような場合に比べ、癌細胞の有無を正確に検出することができる。
また、ＰＣＲを行う際に使用するプライマーを工夫することで、癌の初期において癌細胞の存在証拠を血液中から検出できる。
【図面の簡単な説明】
第１図は、ＰＣＲ法により、本手法で抽出されたＲＮＡ中にはＴリンパ球分画（ＣＤ３、ＣＤ８、ＰＣＲにより増幅されたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物と結合する蛍光色素を用い、定量的に計測する）しか検出できず、血球成分の除去を確認したことを示す図である。
第２図は、慢性肝疾患（肝炎および肝硬変）から肝ガン発ガンへ増悪するにつれて、多段階的にテロメレース遺伝子およびＡＦＰの発現が検出されていることをコピー数で示しており、各病変間での統計学的有意差が数字で表の上部に示されている。散布図の左傍には９５％信頼区間をエラーバーで示し、エラーバーに囲まれた四角は平均値を示している。
第３図は、本発明に係る遺伝子発現（ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡ）による癌診断方法が、従来の腫瘍マーカーより優れた方法であることを、健常者に対する肝ガン患者の統計学的有意差を用いて示している箱ヒゲ図である。
第４図は、臨床上の各検査項目や検査所見と、定量化した２つの遺伝子発現（ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡ及びＡＦＰ ｍＲＮＡ）を多変量解析した結果を示している図である。
第５図は、２つの遺伝子発現（ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡ及びＡＦＰ ｍＲＮＡ）の癌診断方法による定量化の感度と特異度を示しているＲＯＣ曲線である。（ＲＯＣ曲線は、Ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｏｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｃｕｒｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓを示す。）
第６図は、慢性肝疾患から肝ガンへの過程と、従来の腫瘍マーカー（ＡＦＰ、ＡＦＰ−Ｌ３、ＤＣＰ）による癌診断方法と、２つの遺伝子発現（ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡ及びＡＦＰ ｍＲＮＡ）による癌診断方法の定量値を含めた各臨床検査結果や検査所見との相関を多変量解析した結果を示す図である。
第７図は、肝ガンにおける従来の腫瘍マーカー（ＡＦＰ、ＡＦＰ−Ｌ３、ＤＣＰ）と該方法で用いた２つの遺伝子発現（ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡ及びＡＦＰ ｍＲＮＡ）の結果を、慢性肝疾患から肝ガンへの過程で、感度および特異度について比較した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明に係る癌診断方法の一例を更に詳しく説明する。
本発明に係る癌診断方法では、まず、被験者（患者）の血液を採取する。
次に、血液中からＲＮＡを含む試料を得る。
この工程においては、血液中を循環しているＲＮＡを、他の血液細胞の影響を極力受ける事のないように、選択的に抽出する必要がある。
この目的を達成するために、被験者（患者）から体液を採液してから、迅速に以下のように処理をする。
１） 採血管にＥＤＴＡが混入していない場合
患者の同意の下に、採液により得られた体液（約１〜２ｍｌ）を７００〜８００ｘｇで１０分間、４℃で遠心分離し、上清を他のＲＮａｓｅ ｆｒｅｅのチューブに移し、それを１５００ｘｇで１０分間、４℃で遠心分離し、上清を別のＲＮａｓｅ ｆｒｅｅのチューブに移し、最後に、１６００〜３０００ｘｇで１０分間、４℃で遠心分離し、ＲＮＡを含む原試料として、直ぐに用いるか、使用まで−８０℃に貯蔵する。
２） 採血管にＥＤＴＡが混入している場合
上記１）と同様にして得られた体液を１５００〜１６００ｘｇで１０分間、４℃で遠心分離し、上清を他のＲＮａｓｅ ｆｒｅｅのチューブに移し、１５，０００ｘｇ以上で１０分間、４℃で遠心分離し、その上清を０．２２ｍｉｃｒｏ ｍｅｔｅｒのフィルターで濾過して、ＲＮＡを含む原試料として、直ぐに用いるか、使用まで−８０℃に貯蔵する。
次に、ＲＮＡを含む試料を、プライマーとして、ｈＴＥＲＴのときは、ＣＧＧＡＡＧＡＧＴＧＴＣＴＧＧＡＧＣＡＡとＧＧＡＴＧＡＡＧＣＧＧＡＧＴＣＴＧＧＡを用い、ＰＣＲを行い、ＰＣＲにより増幅されたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物と結合する蛍光色素を用い、定量的に計測する。尚、ＡＦＰでは、プライマーとして、ＣＣＡＧＡＡＡＣＴＡＧＴＣＣＴＧＧＡＴＧＴとＣＧＴＧＧＴＣＡＧＴＴＴＧＣＡＧＣＡＴＴを用い、ＰＣＲを行い、ＰＣＲにより増幅されたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物と結合する蛍光色素を用い、定量的に計測する。
より詳しく説明すると、上記１）又は２）により調製した、ＲＮＡを含む試料液１００マイクロリットル（μｌ）に対し１７５マイクロリットル（μｌ）の希釈緩衝液（ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）、ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（ＳＶ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）、または、ＴＲＩｚｏｌ試薬を用いて、その後、ＤＮａｓｅ処理を含んだＲＮＡ抽出をマニュアル（この例では、ＳＶ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍのマニュアル）に従って執り行う。
２回の溶出により得られたＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ ２００ｍｉｃｒｏ ｌｉｔｅｒ中のＲＮＡを、２０ｍｉｃｒｏ ｌｉｔｅｒをＲＴ−ＰＣＲ反応に用いるか、１０ｍｉｃｒｏ ｌｉｔｅｒ相当の溶媒になるように調製し、その１マイクロリットル（μｌ）をＲＴ−ＰＣＲ反応に用いる。
次いで、ワンステップで定量化するために、ＲＮＡから逆転写酵素でｃＤＮＡを生成する逆転写酵素反応と蛍光色素（この例では、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ １、ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）社製を用いている。）を用いた定量的ＰＣＲ法をシングルチューブで行う。
より詳細に説明すると、総反応液量２５マイクロリットル（μｌ）に対し、１マイクロリットル（μｌ）以上２マイクロリットル（μｌ）の蛍光色素（この例では、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ １、ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）社製を用いている。）を用い、マニュアル（この例では、Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）のマニュアル）に従って反応液を調製し、定量計測器（例えば、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）社製）にセットして、マニュアル（この例では、Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）のマニュアル）の指示通りに作動させ、原試料中のＲＮＡの発現量を定量化する。
その際、反応条件として、１）逆転写反応を５０℃で３０分、２）反応活性化段階として、９５℃で１５分、その後、３）３ステップのＰＣＲ反応を５５サイクル程度行う。アニーリング温度はプライマーに依存する。例えば、プライマーとして、ｈＴＥＲＴでは、ＣＧＧＡＡＧＡＧＴＧＴＣＴＧＧＡＧＣＡＡとＧＧＡＴＧＡＡＧＣＧＧＡＧＴＣＴＧＧＡを用いＡＦＰでは、ＣＣＡＧＡＡＡＣＴＡＧＴＣＣＴＧＧＡＴＧＴとＣＧＴＧＧＴＣＡＧＴＴＴＧＣＡＧＣＡＴＴを用いる。得られた計測数は、各腫瘍に応じて統計処理された最適カットオフ価（ガンの種類によっては特異性を高めるために複数のマーカーのカットオフ値を用いる。）と比較分析され、採血された患者における、目的とする癌細胞の有無を判定する。
次に、試験結果を説明する。
第１図は、ＰＣＲ法により、本発明に係る癌診断方法で抽出されたＲＮＡ中には、Ｔリンパ球分画（ＣＤ３、ＣＤ８、ＰＣＲにより増幅されたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物と結合する蛍光色素を用い、定量的に計測する。）しか検出できず、血球成分の除去を確認したことを示す図である。
第１図より明らかなように、本発明者は、本発明に係る癌診断方法にとって重要な肯定である、血球細胞除去は、血球細胞マーカーであるＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ４５、ＣＤ６８のｍＲＮＡなどで確認した。
第２図は、肝疾患（肝炎および肝硬変）から肝ガン発ガンへ増悪するにつれて、多段階的にテロメレース遺伝子およびＡＦＰの発現が検出されていることをコピー数で示しており、各病変間での統計学的有意差が数字で表の上部に示されている。散布図の左傍には９５％信頼区間をエラーバーで示し、エラーバーに囲まれた四角は平均値を示している。
また、第３図は、本発明に係る癌診断方法が、従来の腫瘍マーカーによる癌診断方法よりも優れた方法であることを、健常者に対する肝ガン患者の統計学的有意差を用いて示している箱ヒゲ図である。
第２図及び第３図の結果から、本発明に係る癌診断方法では、肝病変の進行および増悪につれて、ｈＴＥＲＴｍＲＮＡの発現は多段階的に高まっていることが、明らかになった。
第４図は、臨床上の各検査項目や検査所見と、定量化した２つの遺伝子発現（ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡ及びＡＦＰ ｍＲＮＡ）を多変量解析した結果を示している図である。
第４図から、臨床上の検査項目（肝機能についての生化学的検査やウイルス量などの血清学的検査）、検査所見（腫瘍径、腫瘍数、腫瘍の分化度）との多変量解析による比較により、特に、ｈＴＥＲＴｍＲＮＡの発現は、発ガンということに関しては腫瘍径、腫瘍数、腫瘍の分化度との強い相関があることが、明らかになった。
第５図は、２つの遺伝子発現（ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡ及びＡＦＰ ｍＲＮＡ）による癌診断方法による定量化の感度と特異度を示しているＲＯＣ曲線である。尚、ＲＯＣ曲線は、Ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｏｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｃｕｒｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓを示す。
第５図から明らかなように、ガン死亡率第４位である肝ガンにおいて、本発明に係る遺伝子発現（ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡ）による癌診断方法は、感度が８８．２％であり、特異度が６８．７％であった。
一方、遺伝子発現（ＡＦＰ ｍＲＮＡ）による癌診断方法は、感度が７０．１％であり、特異度が６５．８％であった。
また、肝ガンの発ガン過程（ほとんどの肝発ガンはウイルス性慢性肝疾患から発ガンであり、健常者を除いて統計処理する場合）で、本発明に係る遺伝子発現（ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡ）による癌診断方法の感度は、８５．９％であり、また、特異度は、７０．０％であり、他の腫瘍マーカーに劣るものではなかった。
第６図は、慢性肝疾患から肝ガンへの過程と、従来の腫瘍マーカー（ＡＦＰ、ＡＦＰ−Ｌ３、ＤＣＰ）と、２つの遺伝子発現（ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡ及びＡＦＰ ｍＲＮＡ）による癌診断方法の定量値を含めた各臨床検査結果や検査所見との相関を多変量解析した結果を示す図である。
また、第７図は、肝ガンにおける従来の腫瘍マーカー（ＡＦＰ、ＡＦＰ−Ｌ３、ＤＣＰ）による癌診断方法と、２つの遺伝子発現（ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡ及びＡＦＰ ｍＲＮＡ）による癌診断方法の結果を、慢性肝疾患から肝ガンへの過程で、感度および特異度について比較した図である。
第６図及び第７図から、肝ガンの腫瘍マーカーの一つであり、最も実績が高かったアルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）を２つの遺伝子発現（ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡ及びＡＦＰ ｍＲＮＡ）による癌診断方法で検出したところ、本発明に係る遺伝子発現（ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡ）による癌診断方法の方が、従来の遺伝子発現（ＡＦＰ）による癌診断方法（感度６９．３％、特異度６０．０％）よりも高い感度（感度８５．９％、特異度７０．０％）を示すことが、明らかになった。
また、本発明に係る遺伝子発現（ＡＦＰ ｍＲＮＡ）による癌診断方法の方が、従来の遺伝子発現（ＡＦＰ）による癌診断方法（感度６９．３％、特異度６０．０％）よりも高い感度（感度７１．６％、特異度６７．５％）を示すことが、明らかになった。
このことから、本発明に係る遺伝子発現（ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡ）による癌診断方法が、転移性の悪性腫瘍全般にわたり、有効であると考えられた。更に、本発明に係る遺伝子発現（ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡ）による癌診断方法を基礎として、体液中ＲＮＡによるガン細胞存在診断が、健診レベルでもスクリーニングが可能になり、一人でも多くの患者が早期発見及び再発発見により、その生命予後が著しく改善されうると考える。
また、本発明に係る遺伝子発現（ＡＦＰ ｍＲＮＡ）による癌診断方法を基礎として、体液中ＲＮＡによるガン細胞存在診断が、健診レベルでもスクリーニングが可能になり、一人でも多くの患者が早期発見及び再発発見により、その生命予後が著しく改善されうると考える。
尚、本明細書の、発明を実施するための最良の形態では、本発明に係る癌診断方法として、血液中からＲＮＡを抽出した例を示したが、本発明に係る癌診断方法では、血液からＲＮＡを抽出する場合に限られず、血液以外の体液からＲＮＡを抽出するようにしてもよい。
【産業上の利用可能性】
以上のように、本発明に係る癌診断方法は、癌の初期において癌細胞の存在証拠を血液中から検出できるので、早期に医療行為によって癌細胞を根絶することが可能になる。
また、血液中からｍＲＮＡを含む試料を得るようにしたので、癌組織腫瘍形成、転移後の切除組織中からテロメレース（ｈＴＥＲＴ）やＡＦＰを検出するような場合に比べ、癌細胞の有無を正確に検出することができる。
また、ＰＣＲを行う際に使用するプライマーを工夫することにより、癌の初期において癌細胞の存在証拠を血液中から検出できる。
本発明に係る癌診断方法は、医療分野において利用する価値が高い。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【技術分野】
本発明は、癌診断方法に関し、特に、早期に癌細胞の存在の有無を診断できる、癌診断方法に関する。
【背景技術】
日本において、毎年、新たに、３００，０００件の癌の症例が診断されている。
また、日本において、４人から５人に１人が、癌又は癌治療に関連した合併症で死亡している。このため、癌治療又は癌治療に関連した合併症の治療の改善に相当な努力が継続して行われている。
また、癌は早期に発見されると治癒率が高いことから、癌を早期に発見でき、精度の高い癌の診断方法の開発や改良が行われている。
即ち、大部分の癌患者は、その癌又は癌治療に関連した合併症腫瘍によっては死亡しない。癌患者の多くは、転移した癌、即ち、元の腫瘍細胞から分かれて、元の腫瘍細胞が存在している部位とは別の部位に移動する悪性細胞から形成される複数の腫瘍コロニーに負けるのである。
従って、患者の初期の腫瘍が発見・検出でき、そのような初期の腫瘍を、内科的切除術や、内科的抗がん治療、手術、放射線治療、抗がん剤による化学療法、及び、これらの組み合わせにより、縮小したり、除去できれば、患者は、癌を克服したり、延命することができる確立が非常に高くなる。
しかしながら、患者の腫瘍の早期発見・検出が困難であり、また、悪性腫瘍を特徴づける、転移性コロニーは、その検出が困難であり、除去も困難である、という現状があり、臨床的観点から言えば、癌治療は困難なものとなっている、という現状がある。
ところで、癌の転移は、以下に示すような複雑な出来事を含む。
１） 最初の癌の発生位置から周囲組織への癌の拡張。
２） 体腔及び血管中への腫瘍細胞の浸透。
３） 循環系により腫瘍細胞が離れた部位への輸送・放出。
４） 滞留部位における腫瘍細胞の組織への再侵入。
５） 新たな部位における腫瘍細胞の生存と、腫瘍増殖をするための血管形成等の新たな環境への適応。
即ち、腫瘍細胞は、初期の段階で、周囲組織に侵入し、組織バリアを破壊するので、腫瘍細胞は、固形腫瘍の発達の非常に初期段階（即ち、腫瘍が、１０４個以上１０６個以下の腫瘍細胞を含む時点）において、組織空間及び毛細血管中に侵入し、結局は、血液中に至るものと仮定される。この時点においては、腫瘍細胞の大部分は、アポトーシスや、免疫担当細胞により排除されたり、免疫担当細胞の殺傷機能により細胞死するか休眠状態となる。
これは、このような段階では、腫瘍細胞は、異所性環境において未だ生き残ることができず、また、成長することができないからである。
ところで、本発明者等の知る限り、このような初期段階の小さな腫瘍を検出する検出方法は未だ開発されていない。
現時点では、腫瘍がある程度大きくなった場合に、特定タイプの癌の診断に使用可能な高感度方法が開発されているに過ぎない。
そのような診断方法としては、例えば、乳房中の２×１０８個の乳腫瘍細胞を検出できる、乳房撮影が開発されている。
乳癌の場合、その初期段階においては、腫瘍細胞の大部分の流出細胞が死ぬとされている。しかしながら、腫瘍細胞が、１０６個以上１０９個まで増殖すると、何世代かにわたり、遺伝子的に不安定な腫瘍細胞のクローンは、更に、遺伝子レベルの変化を遂げ、より迅速に増殖する攻撃的な変異細胞を生じうる。そして、このような変異細胞は、二次腫瘍として生着する可能性が非常に高い。
しかしながら、上述したように、現状では、癌の診断は、初期段階では行えないため、例えば、膵臓、胃、卵巣、腎臓、肺、肝臓などの大部分の癌は、通常、１０１０個〜１０１２個の腫瘍細胞が存在するような、癌の非常に後期の段階において行われており、この時点においては、腫瘍が既に周囲組織に侵入し、転移している可能性がある。
従来は、癌の初期段階における癌診断ができないこと、癌の根治治療が困難なこと、癌転移の複雑さ、化学療法に用いる薬剤の副作用の問題や、癌患者の治療に対する欲求不満を考慮して、治療方針を立て、癌の転移又は再発に対する治療効果をモニターするための診断試験の開発が行われてきた。
そして、最近２０数年に亘る研究成果として、種々の診断試験方法が開発され、その有用性が評価されてきている。
より詳しく述べると、最初の試みとして、胎児の消化器で生産される胎児性のガン抗原と考えられていたが、結腸・直腸ガン、膵ガン、胆道系ガンなどの消化器ガンや、肺ガンなどの特定の腫瘍細胞上に出現する、癌胎児性抗原（ｃａｒｃｉｎｏ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ；ＣＥＡ）に関するイムノアッセイの定式化がある。
その後、免疫化学的手法であるラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ）や、エンザイム・イムノアッセイ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ−Ｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（酵素免疫測定法（ＥＩＡ（又はＥＬＩＳＡとも称される。）））の出現により、ＣＥＡを腫瘍マーカーとして用いたＲＩＡ（ビーズ固相法）や、αフェトプロテイン（α−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＡＦＰ）を腫瘍マーカーとして用いた逆受身赤血球凝集反応（Ｒ−ＰＨＡ）やＲＩＡ（ビーズ固相法）や、前立腺特異性抗原をマーカーとして用いたエンザイ厶・イムノアッセイ（ＥＩＡ）やＲＩＡ（ビーズ固相法）や、ＣＡ１５−３を腫瘍マーカーとして用いたＲＩＡ（ビーズ固相法）や、ＣＡ５０をマーカーとして用いたエンザイム・イムノアッセイ（ＥＩＡ）や、ＣＡ１２５をマーカーとして用いたＲＩＡ（ビーズ固相法）や、ＰＩＶＫＡ ＩＩ（［ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｖｉｔａｍｉｎｅ Ｋ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ］ＩＩ）を用いたエンザイム・イムノアッセイ（ＥＩＡ）などが多数開発されてきた。
しかしながら、これらの診断方法では、ＣＥＡ、ＡＦＰ、ＣＡ１５−３、ＣＡ５０、ＣＡ１２５、ＰＩＶＫＡ ＩＩといった抗原は、通常、血中への出現が予想されず、検出された時には、既に、患者の癌が既に相当進行しており、既に、患者の生存の望みが殆どないので、これらの診断方法は、幾分、実りの無いものである、という評価を受けている。
しかしながら、最近１０年間において、ある一つの腫瘍マーカーが、癌の早期検出に有用であると期待され、その臨床応用に向けた研究開発が継続されてきた。
即ち、このある一つの腫瘍マーカーとは、「テロメレース（ｈＴＥＲＴ）」である。
このテロメレース（ｈＴＥＲＴ）は、９０％の癌腫で産生し且つ発現する悪性腫瘍特異的抗原（酵素）であり、その活性が１９９４年に発見されて以来（Ｋｉｍ ＮＷ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２３；２６６：２０１１−２０１５（１９９４）を参照）、その後、遺伝子の発見及び機能解析が行われてきたが、その特異性にも関わらず、臨床応用に関しては、腫瘍形成、転移後の切除組織中からの検出に留まり、現行の臨床検査のように血液中から簡易に検出することができなかった。また、このテロメレース（ｈＴＥＲＴ）は、たとえ、検出できても、混入しわずかに産生し発現している他の細胞（リンパ球など）の影響が無視できず、定性的に検出することが正確にはできなかった。
２０００年には、乳癌患者の血液からｈＴＥＲＴの定性的検出に関する報告がなされたが（Ｃｈｅｎ ＸＱ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６：３８２３−３８２６（２０００））、感度が６０％以下であり臨床応用にはほど遠かった（Ｋｉｍ ＮＷ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２３；２６６：第２０１１頁〜第２０１５頁（１９９４）、Ｃｈｅｎ ＸＱ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６：第３８２３頁〜第３８２６頁（２０００）を参照。）。
ところで、有用な診断試験をするためには、非常に高感度且つ信頼できる定量性が必要とされる。
また、血液１ｍｌ中における１個の腫瘍細胞の存在が検出できる血液試験が開発できれば、それは、平均して循環している全部で３０００個〜４０００個の細胞に匹敵する。動物において、腫瘍を生着させるための接種実験において、実際にそのような数の細胞が腫瘍の生着を可能にする。さらに、３０００個〜４０００個の循環細胞が腫瘍中の全細胞の０．０１％である場合、全部で、約４×１０７個の細胞が含まれることになり、そのような数の細胞を含む腫瘍は、現在のいずれの方法によっても見ることができない。
それゆえ、腫瘍細胞が癌の初期の段階において流出する場合、上記の感度を有する試験が開発できれば、その試験により、癌を検出することができる。
また、腫瘍細胞が腫瘍サイズといくらかの関連性を持って血液中に流出する場合、腫瘍負荷を評価するための定量的試験は、有益である。
また、流出した腫瘍細胞と生体内の免疫細胞との闘いの末、腫瘍細胞や免疫担当細胞内の多種多様なＤＮＡや蛋白質やＲＮＡなどが血液中に流れ出る結果、ＲＮＡが検出されるとも考えられる。もしそうであれば、腫瘍特異的ＲＮＡの検出は、転移の最も早期での出来事を物語っているのかも知れない。しかしながら、従来は、非常に初期段階の循環腫瘍細胞の存在に関する情報がなかった。
上記のことより、二次腫瘍の確立の前に転移能を有する循環中の細胞を固定するための方法、特に癌の初期において同定する方法が渇望される。癌細胞の存在証拠を血液中から検出でき、正常細胞での発現レベルを認識でき、癌細胞由来のＲＮＡを１〜１０コピーレベルの高感度で検出できることは、臨床上、極めて有用な情報を提供することになる。
機器開発の向上に伴い、癌組織の定量化が可能になったことを受けて、そのような高感度な定量法が可能となる時代に入ってきたことで、各種癌細胞由来ＲＮＡの定量化の実現の準備は技術的にも整っていると考えられる。
本発明は、上記した問題を解決するためになされたものであって、特に、癌の初期において癌細胞の存在証拠を血液中から検出できる、癌診断方法を提供することを目的としている。
【発明の開示】
請求の範囲第１項に記載の癌診断方法は、体液中から体細胞・癌細胞成分として、ＲＮＡのみを含む試料を得る工程と、ＲＮＡを含む試料から逆転写酵素でｃＤＮＡを生成する逆転写酵素反応と蛍光色素を用いたＰＣＲを、プライマーとして、ｈＴＥＲＴでは、ＣＧＧＡＡＧＡＧＴＧＴＣＴＧＧＡＧＣＡＡとＧＧＡＴＧＡＡＧＣＧＧＡＧＴＣＴＧＧＡを用いて行い、ＰＣＲにより増幅されたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物と結合した蛍光色素を用い、定量的に計測する工程とを備える。
尚、本明細書で用いる用語、「体液」は、血液、リンパ液その他の体液を意味する。
請求の範囲第２項に記載の癌診断方法は、体液中から体細胞・癌細胞成分として、ＲＮＡのみを含む試料を得る工程と、ＲＮＡを含む試料から逆転写酵素でｃＤＮＡを生成する逆転写酵素反応と蛍光色素を用いたＰＣＲを、プライマーとして、ＡＦＰでは、ＣＣＡＧＡＡＡＣＴＡＧＴＣＣＴＧＧＡＴＧＴとＣＧＴＧＧＴＣＡＧＴＴＴＧＣＡＧＣＡＴＴを用いて行い、ＰＣＲにより増幅されたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物と結合した蛍光色素を用い、定量的に計測する工程とを備える。
本発明に係る癌診断方法は、癌の初期において癌細胞の存在証拠を血液中から検出できるので、早期に医療行為によって癌細胞を根絶することが可能になる。
また、本発明に係る癌診断方法では、血液中からｍＲＮＡを含む試料を得るようにしたので、癌組織腫瘍形成、転移後の切除組織中からテロメレース（ｈＴＥＲＴ）やＡＦＰを検出するような場合に比べ、癌細胞の有無を正確に検出することができる。
また、ＰＣＲを行う際に使用するプライマーを工夫することで、癌の初期において癌細胞の存在証拠を血液中から検出できる。
【図面の簡単な説明】
第１図は、ＰＣＲ法により、本手法で抽出されたＲＮＡ中にはＴリンパ球分画（ＣＤ３、ＣＤ８、ＰＣＲにより増幅されたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物と結合する蛍光色素を用い、定量的に計測する）しか検出できず、血球成分の除去を確認したことを示す図である。
第２図は、慢性肝疾患（肝炎および肝硬変）から肝ガン発ガンへ増悪するにつれて、多段階的にテロメレース遺伝子およびＡＦＰの発現が検出されていることをコピー数で示しており、各病変間での統計学的有意差が数字で表の上部に示されている。散布図の左傍には９５％信頼区間をエラーバーで示し、エラーバーに囲まれた四角は平均値を示している。
第３図は、本発明に係る遺伝子発現（ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡ）による癌診断方法が、従来の腫瘍マーカーより優れた方法であることを、健常者に対する肝ガン患者の統計学的有意差を用いて示している箱ヒゲ図である。
第４図は、臨床上の各検査項目や検査所見と、定量化した２つの遺伝子発現（ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡ及びＡＦＰ ｍＲＮＡ）を多変量解析した結果を示している図である。
第５図は、２つの遺伝子発現（ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡ及びＡＦＰ ｍＲＮＡ）の癌診断方法による定量化の感度と特異度を示しているＲＯＣ曲線である。（ＲＯＣ曲線は、Ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｏｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｃｕｒｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓを示す。）
第６図は、慢性肝疾患から肝ガンへの過程と、従来の腫瘍マーカー（ＡＦＰ、ＡＦＰ−Ｌ３、ＤＣＰ）による癌診断方法と、２つの遺伝子発現（ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡ及びＡＦＰ ｍＲＮＡ）による癌診断方法の定量値を含めた各臨床検査結果や検査所見との相関を多変量解析した結果を示す図である。
第７図は、肝ガンにおける従来の腫瘍マーカー（ＡＦＰ、ＡＦＰ−Ｌ３、ＤＣＰ）と該方法で用いた２つの遺伝子発現（ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡ及びＡＦＰ ｍＲＮＡ）の結果を、慢性肝疾患から肝ガンへの過程で、感度および特異度について比較した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明に係る癌診断方法の一例を更に詳しく説明する。
本発明に係る癌診断方法では、まず、被験者（患者）の血液を採取する。
次に、血液中からＲＮＡを含む試料を得る。
この工程においては、血液中を循環しているＲＮＡを、他の血液細胞の影響を極力受ける事のないように、選択的に抽出する必要がある。
この目的を達成するために、被験者（患者）から体液を採液してから、迅速に以下のように処理をする。
１） 採血管にＥＤＴＡが混入していない場合
患者の同意の下に、採液により得られた体液（約１〜２ｍｌ）を７００〜８００ｘｇで１０分間、４℃で遠心分離し、上清を他のＲＮａｓｅ ｆｒｅｅのチューブに移し、それを１５００ｘｇで１０分間、４℃で遠心分離し、上清を別のＲＮａｓｅ ｆｒｅｅのチューブに移し、最後に、１６００〜３０００ｘｇで１０分間、４℃で遠心分離し、ＲＮＡを含む原試料として、直ぐに用いるか、使用まで−８０℃に貯蔵する。
２） 採血管にＥＤＴＡが混入している場合
上記１）と同様にして得られた体液を１５００〜１６００ｘｇで１０分間、４℃で遠心分離し、上清を他のＲＮａｓｅ ｆｒｅｅのチューブに移し、１５，０００ｘｇ以上で１０分間、４℃で遠心分離し、その上清を０．２２ｍｉｃｒｏ ｍｅｔｅｒのフィルターで濾過して、ＲＮＡを含む原試料として、直ぐに用いるか、使用まで−８０℃に貯蔵する。
次に、ＲＮＡを含む試料を、プライマーとして、ｈＴＥＲＴのときは、ＣＧＧＡＡＧＡＧＴＧＴＣＴＧＧＡＧＣＡＡとＧＧＡＴＧＡＡＧＣＧＧＡＧＴＣＴＧＧＡを用い、ＰＣＲを行い、ＰＣＲにより増幅されたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物と結合する蛍光色素を用い、定量的に計測する。尚、ＡＦＰでは、プライマーとして、ＣＣＡＧＡＡＡＣＴＡＧＴＣＣＴＧＧＡＴＧＴとＣＧＴＧＧＴＣＡＧＴＴＴＧＣＡＧＣＡＴＴを用い、ＰＣＲを行い、ＰＣＲにより増幅されたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物と結合する蛍光色素を用い、定量的に計測する。
より詳しく説明すると、上記１）又は２）により調製した、ＲＮＡを含む試料液１００マイクロリットル（μｌ）に対し１７５マイクロリットル（μｌ）の希釈緩衝液（ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）、ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（ＳＶ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）、または、ＴＲＩｚｏｌ試薬を用いて、その後、ＤＮａｓｅ処理を含んだＲＮＡ抽出をマニュアル（この例では、ＳＶ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍのマニュアル）に従って執り行う。
２回の溶出により得られたＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ ２００ｍｉｃｒｏ ｌｉｔｅｒ中のＲＮＡを、２０ｍｉｃｒｏ ｌｉｔｅｒをＲＴ−ＰＣＲ反応に用いるか、１０ｍｉｃｒｏ ｌｉｔｅｒ相当の溶媒になるように調製し、その１マイクロリットル（μｌ）をＲＴ−ＰＣＲ反応に用いる。
次いで、ワンステップで定量化するために、ＲＮＡから逆転写酵素でｃＤＮＡを生成する逆転写酵素反応と蛍光色素（この例では、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ １、ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）社製を用いている。）を用いた定量的ＰＣＲ法をシングルチューブで行う。
より詳細に説明すると、総反応液量２５マイクロリットル（μｌ）に対し、１マイクロリットル（μｌ）以上２マイクロリットル（μｌ）の蛍光色素（この例では、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ １、ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）社製を用いている。）を用い、マニュアル（この例では、Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）のマニュアル）に従って反応液を調製し、定量計測器（例えば、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）社製）にセットして、マニュアル（この例では、Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）のマニュアル）の指示通りに作動させ、原試料中のＲＮＡの発現量を定量化する。
その際、反応条件として、１）逆転写反応を５０℃で３０分、２）反応活性化段階として、９５℃で１５分、その後、３）３ステップのＰＣＲ反応を５５サイクル程度行う。アニーリング温度はプライマーに依存する。例えば、プライマーとして、ｈＴＥＲＴでは、ＣＧＧＡＡＧＡＧＴＧＴＣＴＧＧＡＧＣＡＡとＧＧＡＴＧＡＡＧＣＧＧＡＧＴＣＴＧＧＡを用いＡＦＰでは、ＣＣＡＧＡＡＡＣＴＡＧＴＣＣＴＧＧＡＴＧＴとＣＧＴＧＧＴＣＡＧＴＴＴＧＣＡＧＣＡＴＴを用いる。得られた計測数は、各腫瘍に応じて統計処理された最適カットオフ価（ガンの種類によっては特異性を高めるために複数のマーカーのカットオフ値を用いる。）と比較分析され、採血された患者における、目的とする癌細胞の有無を判定する。
次に、試験結果を説明する。
第１図は、ＰＣＲ法により、本発明に係る癌診断方法で抽出されたＲＮＡ中には、Ｔリンパ球分画（ＣＤ３、ＣＤ８、ＰＣＲにより増幅されたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物と結合する蛍光色素を用い、定量的に計測する。）しか検出できず、血球成分の除去を確認したことを示す図である。
第１図より明らかなように、本発明者は、本発明に係る癌診断方法にとって重要な肯定である、血球細胞除去は、血球細胞マーカーであるＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ４５、ＣＤ６８のｍＲＮＡなどで確認した。
第２図は、肝疾患（肝炎および肝硬変）から肝ガン発ガンへ増悪するにつれて、多段階的にテロメレース遺伝子およびＡＦＰの発現が検出されていることをコピー数で示しており、各病変間での統計学的有意差が数字で表の上部に示されている。散布図の左傍には９５％信頼区間をエラーバーで示し、エラーバーに囲まれた四角は平均値を示している。
また、第３図は、本発明に係る癌診断方法が、従来の腫瘍マーカーによる癌診断方法よりも優れた方法であることを、健常者に対する肝ガン患者の統計学的有意差を用いて示している箱ヒゲ図である。
第２図及び第３図の結果から、本発明に係る癌診断方法では、肝病変の進行および増悪につれて、ｈＴＥＲＴｍＲＮＡの発現は多段階的に高まっていることが、明らかになった。
第４図は、臨床上の各検査項目や検査所見と、定量化した２つの遺伝子発現（ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡ及びＡＦＰ ｍＲＮＡ）を多変量解析した結果を示している図である。
第４図から、臨床上の検査項目（肝機能についての生化学的検査やウイルス量などの血清学的検査）、検査所見（腫瘍径、腫瘍数、腫瘍の分化度）との多変量解析による比較により、特に、ｈＴＥＲＴｍＲＮＡの発現は、発ガンということに関しては腫瘍径、腫瘍数、腫瘍の分化度との強い相関があることが、明らかになった。
第５図は、２つの遺伝子発現（ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡ及びＡＦＰ ｍＲＮＡ）による癌診断方法による定量化の感度と特異度を示しているＲＯＣ曲線である。尚、ＲＯＣ曲線は、Ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｏｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｃｕｒｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓを示す。
第５図から明らかなように、ガン死亡率第４位である肝ガンにおいて、本発明に係る遺伝子発現（ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡ）による癌診断方法は、感度が８８．２％であり、特異度が６８．７％であった。
一方、遺伝子発現（ＡＦＰ ｍＲＮＡ）による癌診断方法は、感度が７０．１％であり、特異度が６５．８％であった。
また、肝ガンの発ガン過程（ほとんどの肝発ガンはウイルス性慢性肝疾患から発ガンであり、健常者を除いて統計処理する場合）で、本発明に係る遺伝子発現（ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡ）による癌診断方法の感度は、８５．９％であり、また、特異度は、７０．０％であり、他の腫瘍マーカーに劣るものではなかった。
第６図は、慢性肝疾患から肝ガンへの過程と、従来の腫瘍マーカー（ＡＦＰ、ＡＦＰ−Ｌ３、ＤＣＰ）と、２つの遺伝子発現（ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡ及びＡＦＰ ｍＲＮＡ）による癌診断方法の定量値を含めた各臨床検査結果や検査所見との相関を多変量解析した結果を示す図である。
また、第７図は、肝ガンにおける従来の腫瘍マーカー（ＡＦＰ、ＡＦＰ−Ｌ３、ＤＣＰ）による癌診断方法と、２つの遺伝子発現（ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡ及びＡＦＰ ｍＲＮＡ）による癌診断方法の結果を、慢性肝疾患から肝ガンへの過程で、感度および特異度について比較した図である。
第６図及び第７図から、肝ガンの腫瘍マーカーの一つであり、最も実績が高かったアルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）を２つの遺伝子発現（ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡ及びＡＦＰ ｍＲＮＡ）による癌診断方法で検出したところ、本発明に係る遺伝子発現（ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡ）による癌診断方法の方が、従来の遺伝子発現（ＡＦＰ）による癌診断方法（感度６９．３％、特異度６０．０％）よりも高い感度（感度８５．９％、特異度７０．０％）を示すことが、明らかになった。
また、本発明に係る遺伝子発現（ＡＦＰ ｍＲＮＡ）による癌診断方法の方が、従来の遺伝子発現（ＡＦＰ）による癌診断方法（感度６９．３％、特異度６０．０％）よりも高い感度（感度７１．６％、特異度６７．５％）を示すことが、明らかになった。
このことから、本発明に係る遺伝子発現（ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡ）による癌診断方法が、転移性の悪性腫瘍全般にわたり、有効であると考えられた。更に、本発明に係る遺伝子発現（ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡ）による癌診断方法を基礎として、体液中ＲＮＡによるガン細胞存在診断が、健診レベルでもスクリーニングが可能になり、一人でも多くの患者が早期発見及び再発発見により、その生命予後が著しく改善されうると考える。
また、本発明に係る遺伝子発現（ＡＦＰ ｍＲＮＡ）による癌診断方法を基礎として、体液中ＲＮＡによるガン細胞存在診断が、健診レベルでもスクリーニングが可能になり、一人でも多くの患者が早期発見及び再発発見により、その生命予後が著しく改善されうると考える。
尚、本明細書の、発明を実施するための最良の形態では、本発明に係る癌診断方法として、血液中からＲＮＡを抽出した例を示したが、本発明に係る癌診断方法では、血液からＲＮＡを抽出する場合に限られず、血液以外の体液からＲＮＡを抽出するようにしてもよい。
【産業上の利用可能性】
以上のように、本発明に係る癌診断方法は、癌の初期において癌細胞の存在証拠を血液中から検出できるので、早期に医療行為によって癌細胞を根絶することが可能になる。
また、血液中からｍＲＮＡを含む試料を得るようにしたので、癌組織腫瘍形成、転移後の切除組織中からテロメレース（ｈＴＥＲＴ）やＡＦＰを検出するような場合に比べ、癌細胞の有無を正確に検出することができる。
また、ＰＣＲを行う際に使用するプライマーを工夫することにより、癌の初期において癌細胞の存在証拠を血液中から検出できる。
本発明に係る癌診断方法は、医療分野において利用する価値が高い。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
体液中から、体細胞・癌細胞成分として、ＲＮＡのみを含む試料を得る工程と、
前記ＲＮＡのみを含む試料から逆転写酵素でｃＤＮＡを生成する逆転写酵素反応と蛍光色素を用いたＰＣＲを、プライマーとして、ｈＴＥＲＴでは、ＣＧＧＡＡＧＡＧＴＧＴＣＴＧＧＡＧＣＡＡとＧＧＡＴＧＡＡＧＣＧＧＡＧＴＣＴＧＧＡを用いて行い、前記ＰＣＲにより増幅されたＰＣＲ産物を前記ＰＣＲ産物と結合した蛍光色素を用い、定量的に計測する工程とを備える、癌診断方法。
【請求項２】
体液中から、体細胞・癌細胞成分として、ＲＮＡのみを含む試料を得る工程と、
前記ＲＮＡのみを含む試料から逆転写酵素でｃＤＮＡを生成する逆転写酵素反応と蛍光色素を用いたＰＣＲを、プライマーとして、ＡＦＰでは、ＣＣＡＧＡＡＡＣＴＡＧＴＣＣＴＧＧＡＴＧＴとＣＧＴＧＧＴＣＡＧＴＴＴＧＣＡＧＣＡＴＴを用いて行い、前記ＰＣＲにより増幅されたＰＣＲ産物を前記ＰＣＲ産物と結合した蛍光色素を用い、定量的に計測する工程とを備える、癌診断方法。
【請求項１】
体液中から、体細胞・癌細胞成分として、ＲＮＡのみを含む試料を得る工程と、
前記ＲＮＡのみを含む試料から逆転写酵素でｃＤＮＡを生成する逆転写酵素反応と蛍光色素を用いたＰＣＲを、プライマーとして、ｈＴＥＲＴでは、ＣＧＧＡＡＧＡＧＴＧＴＣＴＧＧＡＧＣＡＡとＧＧＡＴＧＡＡＧＣＧＧＡＧＴＣＴＧＧＡを用いて行い、前記ＰＣＲにより増幅されたＰＣＲ産物を前記ＰＣＲ産物と結合した蛍光色素を用い、定量的に計測する工程とを備える、癌診断方法。
【請求項２】
体液中から、体細胞・癌細胞成分として、ＲＮＡのみを含む試料を得る工程と、
前記ＲＮＡのみを含む試料から逆転写酵素でｃＤＮＡを生成する逆転写酵素反応と蛍光色素を用いたＰＣＲを、プライマーとして、ＡＦＰでは、ＣＣＡＧＡＡＡＣＴＡＧＴＣＣＴＧＧＡＴＧＴとＣＧＴＧＧＴＣＡＧＴＴＴＧＣＡＧＣＡＴＴを用いて行い、前記ＰＣＲにより増幅されたＰＣＲ産物を前記ＰＣＲ産物と結合した蛍光色素を用い、定量的に計測する工程とを備える、癌診断方法。
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０４９８６４
【国際公開日】平成１７年６月２日（２００５．６．２）
【発行日】平成１９年１１月２９日（２００７．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１５６９８（Ｐ２００５−５１５６９８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１７５４２
【国際出願日】平成１６年１１月１８日（２００４．１１．１８）
【出願人】（５０３４２９９５１）
【出願人】（５０２３７７７７４）
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年６月２日（２００５．６．２）
【発行日】平成１９年１１月２９日（２００７．１１．２９）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１７５４２
【国際出願日】平成１６年１１月１８日（２００４．１１．１８）
【出願人】（５０３４２９９５１）
【出願人】（５０２３７７７７４）
【Ｆターム（参考）】
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