癌評価の遺伝子関連ＣｐＧアイランドのメチル化アッセイのための材料と方法
被験者における前立腺癌などの癌の評価のための方法、試薬、及びキットが提供される。開示された癌評価の方法としては、癌の診断方法、癌の予知方法及び癌治療の効果の評価方法が挙げられる。当該方法は、特定の遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について生物学的試料をアッセイする工程を含む。提供された試薬及びキットは、特定の遺伝子に関連する標的ＣｐＧアイランドの少なくとも一部を増幅するのに適しているプライマーを含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本特許出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、２００５年１１月８日に出願された米国仮特許出願第６０／７３４５７７号の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
リン酸エステル結合シトシン−グアニン（ＣｐＧ）ジヌクレオチドは、哺乳類を含む高等真核生物のゲノムの中でも統計的に過小評価されている。このジヌクレオチドの予測頻度はわずか５〜１０％であることが分かったと報告されている。ヒトゲノム内に残っているＣｐＧジヌクレオチドの大部分は通常、低レベルの遺伝子発現を特徴とし、シトシン残基でメチル化を示す繰り返し配列内に位置している。
【０００３】
一方、ＣｐＧアイランドは、ＣｐＧジヌクレオチドのクラスターを含むゲノム配列を代表している。ＣｐＧアイランドはプロモーター領域もしくはコーディング配列の５’端と関連している可能性があり、又はイントロン内もしくはコーディング配列と関連していることが知られていないゲノム領域に存在する可能性がある。ＣｐＧアイランドは、正常な組織において非メチル化もしくはメチル化され、メチル化のパターンは組織特異的発現及びインプリンティング遺伝子の発現を調節するために用いられる可能性がある。プロモーター領域内のＣｐＧアイランドのメチル化は、結果として関連遺伝子の下方制御又はサイレンシングにつながり得る。正常には非メチル化されているアイランドのメチル化の増加は、ＤＮＡの全メチルシトシン含有量が低下するにも関わらず、老化組織で観察される。異常メチル化パターンは、様々な癌組織で検出される増加したメチル化もしくは過剰メチル化を有する癌細胞でより明白であった。ＣｐＧアイランドは、同じ組織内で異なる密度でメチル化される可能性がある。このように、ＣｐＧアイランド内のシトシンの異常なメチル化は、ＤＮＡ損傷修復、ホルモン応答、細胞周期調節及び腫瘍細胞粘着性／転移、腫瘍発生、進行及び転移の誘導といった重篤な細胞過程に含まれる遺伝子発現を抑制するために働く主要なエピジェネティックな事象となり得る(Li et al., Biochim. Biophys. Acta, 1704: 87−102 (2004))。プロモーターの過剰メチル化のユニークプロファイルは、それぞれのヒト癌（当該癌では、癌が共有する遺伝子変化もあれば、癌の型特異的な遺伝子変化もある）に存在すると提唱されてきた (Esteller et al., Cancer Res., 61: 3225−3229 (2001))。もし異常メチル化が、ゲノムＤＮＡにおいて正常に存在しない新しい情報を表し、異常メチル化が共通ＤＮＡ修飾であり、多くのゲノム標的に影響するのであれば、複数の標的ＣｐＧから得た情報に基づいた診断及び予後検査を開発することが実現可能である。このような検査は、病変組織において異常に過剰メチル化もしくは低メチル化されたＣｐＧに基づくことができる。これらは、その変化が癌の存在と相関する限り、ＣｐＧアイランドにおけるメチル化密度の変化にも基づくことができる。
【０００４】
例えば、最も一般的な悪性腫瘍であり、アメリカの男性の中で第２の主要な死亡原因である前立腺癌(Li et al. (2004), 上述)は、３０を超える遺伝子のプロモーター内ＣｐＧアイランド、特にグルタチオンＳ−トランスフェラーゼＰ１（ＧＳＴＰ１）遺伝子のＣｐＧアイランドのメチル化と関連していることが明らかになった。ＧＳＴＰ１のメチル化は、前立腺癌の患者の尿及び血漿から回収したＤＮＡの５０％を超えて検出された(Goessl et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 945: 51−58 (2001); Cairns et al., Clin. Cancer Res., 7: 2727−2730 (2001); Jeronimo et al., Urology, 60: 1131-1135 (2002); 及び Gonzalgo et al., Clin. Cancer Res., 9: 2673−2677 (2003))。しかし、もし前立腺癌の診断がＧＳＴＰ１遺伝子におけるＣｐＧアイランドのメチル化の検出にのみ頼っているのであれば、このような試験の感度の理論的限界は、約９０％の感度でしかないであろう。ＧＳＴＰ１は、前立腺上皮内病変（ＰＩＮ）においてもメチル化されるが、これは偽陽性の診断を導くかもおそれがある。いくつかのＣｐＧアイランドは、前立腺癌及び良性前立腺過形成（ＢＰＨ）といった他の前立腺疾患においてメチル化される。これらは、正常な老化前立腺でも、ある程度メチル化を示している。このような指標は個々の前立腺癌診断には適さない。したがって、指標のパネルは、臨床試験に必要な感度及び特異性を達成することが求められる。
【０００５】
前立腺特異的抗原すなわちＰＳＡ試験は、前立腺癌の早期発見に広く使用され続けている。ＰＳＡ試験は、無症状の男性で診断された前立腺癌症例の大多数となったが(Mettlin et al., Cancer, 83(8): 1679-1684 (1998a); Mettlin et al., Cancer, 82(2): 249-251 (1998b); Humphrey et al., J. Urol., 155: 816-820 (1996);及びGrossfeld et al., Epidemiol. Rev., 23(1): 173-180 (2001))、ＰＳＡ試験は、その感度は８３％と高かったにも関わらず、２．６ｎｇ／ｍｌのＰＳＡカットオフ値を用いた場合（Thompson et al.,N.Engl.J.Med.,350:2239-2246(2004)）、３３％という低い特異性に苦しんでいた。ＰＳＡ試験の低特異性は、ＢＰＨ及び前立腺炎といった他の前立腺疾患における上昇したＰＳＡ分泌の直接の結果である。このように、高いＰＳＡレベルは、針生検の形式で追加的スクリーニングの必要性を示唆している。最終的に、針生検の結果は、前立腺癌の診断をもたらす。
【０００６】
毎年１００万を越す前立腺の針生検がそれぞれ約１５００ドルの費用で行われており、患者にとってはとても不快なものである。しかし、これらのうち２０万未満が前立腺癌の診断結果である。したがって、針生検の大部分は必要以上に実施されている。
【０００７】
以上を考慮すると、現在利用可能な癌のスクリーニング方法に付随する費用と苦痛を軽減する、前立腺癌等の癌の非侵襲的診断及び予知方法が必要とされている。本発明の目的は、前立腺癌等の癌の非侵襲的診断及び予知のための材料及び方法を提供することにある。この目的及び他の目的及び効果、並びに追加の発明の特徴は、下記の発明の詳細な説明で明らかになるであろう。
【０００８】
発明の要約
本発明は癌の評価のための材料及び方法を提供する。評価方法としては、癌の診断及び予知方法並びに癌治療の効果の評価方法が挙げられ得る。提供される方法は、一般的に、特異的遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化についてアッセイする工程を含む。本発明はまた例えば、特異的遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化状態を増幅及び／又は検出するため、本発明の方法で用いられ得る単離又は精製されたプライマー対を提供する。本発明はまた、開示された方法において有用である１以上のプライマー対を含むキットを提供する。
【０００９】
本発明は、癌の指標となる１以上のメチル化されたＣｐＧアイランドについてアッセイすることによる癌の診断方法を提供する。一般的に、当該方法は、癌診断を必要とする被験者由来の生物学的試料を準備する工程、並びに：
ニューレグリン細胞表面リガンド（ＮＲＧ１）、アドレナリン作動Ｂ３レセプター（ＡＤＲＢ３）、グリコシルホスファチジルイノシトール細胞表面レセプター（ＧＦＲＡ２）、キネシンファミリーメンバー１３Ｂ（ＫＩＦ１３Ｂ）、ＲＥＴ原癌遺伝子（ＲＥＴ）、Ｇ−タンパク質共役タンパク質レセプター１４７（ＧＰＲ１４７）、ニューロゲニン３転写因子（ＮＥＵＲＯＧ３）、パラジン（予想タンパク質チロシンホスファターゼ）（ＰＡＬＤ）、メチルトランスフェラーゼファミリーメンバー１（ＨＥＭＫ１）、線維芽細胞成長因子４癌遺伝子（ＦＧＦ４）、５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）レセプター１Ａ（ＨＴＲ１Ａ）、リングフィンガータンパク質１８０（ＬＯＧ２８５６７１もしくはＲＮＦ１８０）、ＥＧＦＲ共増幅及び過剰発現（ＤＫＦＺＰ５６４Ｋ０８２２もしくはＥＣＯＰ）、亜鉛フィンガータンパク質５９６（ＺＮＦ５９６）、７回膜貫通型ヘリックスレセプター類似（ＬＯＣ４４１３２０）、Ｌ−トレオニンデヒドロゲナーゼ（ＴＤＨ）、仮想タンパク質ＦＬＪ３６９８０（ＦＬＪ３６９８０）、線維芽細胞成長因子レセプター２０（ＦＧＦ２０）、ＥＦ−ハンドドメインファミリーメンバー２Ａ（ＬＯＣ２８６０９７もしくはＥＦＨＡ２）、Ｎ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ（酸性セラミナーゼ）１（ＡＳＡＨ１）、ｎｏｄａｌホモログ（ＴＧＦ−βシグナル伝達経路）（ＮＯＤＡＬ）、亜鉛フィンガータンパク質５３２に類似の仮想タンパク質（ＬＯＣ３９９７８３）、転写因子ＬＩＭホメオドメイン（ＩＳＬ２）、キネシンファミリーメンバーＣ２（ＫＩＦＣ２）、クロモソーム２０オープンリーディングフレーム２３（キネシン様モータータンパク質）（Ｃ２０ｏｒｆ２３）、ＧＤＮＦファミリーレセプターアルファ１（ＧＦＲＡ１）、グルタチオンペルオキシダーゼ７（ＧＰＸ７）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆホモログ２（ＤＫＫ２）、ネトリン１（ＮＴＮ１）、マトリックスメタロペプチダーゼ９（ＭＭＰ９）、腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー１１（ＴＮＦＳＦ１１）、ｒａｓホモログ遺伝子ファミリーメンバーＤ（ＲＨＯＤ）、及び高ロイシン反復含有４９（ＬＲＲＣ４９）からなる群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子に関連する１以上のＣｐＧアイランドのメチル化について前記試料をアッセイする工程を含む。
【００１０】
本発明はまた、前立腺癌の指標となる１以上のメチル化されたＣｐＧアイランドについてアッセイすることによる、哺乳類のオスにおける前立腺癌の診断方法を提供する。当該方法としては、癌診断を必要とする被験者由来の生物学的試料を準備する工程、並びに：
ＮＲＧ１、ＡＤＲＢ３、ＧＦＲＡ２、ＫＩＦ１３Ｂ、ＲＥＴ、ＧＰＲ１４７、ＮＥＵＲＯＧ３、ＰＡＬＤ、ＨＥＭＫ１、ＦＧＦ４、ＨＴＲ１Ａ、ＲＮＦ１８０、ＥＣＯＰ、ＺＮＦ５９６、ＬＯＣ４４１３２０、ＴＤＨ、ＦＬＪ３６９８０、ＥＦＨＡ２、ＡＳＨＡ１、ＮＯＤＡＬ、ＬＯＣ３９９７８３、ＩＳＬ２、ＭＭＰ９、ＴＮＦＳＦ１１、ＲＨＯＤもしくはＬＲＲＣ４９からなる群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について前記試料をアッセイする工程が挙げられ得る。キネシンファミリーメンバーＣ２（ＫＩＦＣ２）、クロモソーム２０オープンリーディングフレーム２３（キネシン様モータータンパク質）（Ｃ２０ｏｒｆ２３）、ＧＤＮＦファミリーレセプターアルファ１（ＧＦＲＡ１）、グルタチオンペルオキシダーゼ７（ＧＰＸ７）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆホモログ２（ＤＫＫ２）、ネトリン１（ＮＴＮ１）、Ｒａｓ関連（ＲａｌＧＤＳ／ＡＦ−６）ドメインファミリー５（ＲＡＳＳＦ５）、及びＨｔｒＡセリンペプチダーゼ４（ＨＴＲＡ４）。任意に、前立腺癌の診断方法は、前立腺癌においてメチル化されることが知られているが、ＢＰＨにおいては検出可能にメチル化されないか、もしくは低レベル（例、約５０％以下、約４０％以下、約３０％以下、約２０％以下、もしくは約１０％以下）でメチル化されることが知られている少なくとも1つの遺伝子に関連する1以上のＣｐＧアイランドのメチル化についてアッセイする工程も含み得る。
【００１１】
本発明はまた、癌のグレードもしくはステージ、及び／又は、癌治療後の無病生存期間の長さの指標となる１以上の遺伝子のメチル化についてアッセイすることによる、癌の予知方法を提供する。一般的に、当該方法は、癌予後診断を必要とする被験者由来の生物学的試料を準備する工程、並びに：
ＮＲＧ１、ＡＤＲＢ３、ＧＦＲＡ２、ＫＩＦ１３Ｂ、ＲＥＴ、ＧＰＲ１４７、ＮＥＵＲＯＧ３、ＰＡＬＤ、ＨＥＭＫ１、ＦＧＦ４、ＨＴＲ１Ａ、ＲＮＦ１８０、ＤＫＦＺＰ５６４０８２２、ＺＮＦ５９６、ＬＯＣ４４１３２０、ＴＤＨ、ＦＬＪ３６９８０、ＦＧＦ２０、ＥＦＨＡ２、ＡＳＨＡ１、ＮＯＤＡＬ、ＬＯＣ３９９７８３、ＩＳＬ２、ＫＩＦＣ２、Ｃ２０ｏｒｆ２３、ＧＦＲＡ１、ＧＰＸ７、ＤＫＫ２、ＮＴＮ１、ＭＭＰ９、ＴＮＦＳＦ１１、ＲＨＯＤ及びＬＲＲＣ４９からなる群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について前記試料をアッセイする工程を含む。
【００１２】
さらに、本発明は、前立腺癌のグレードもしくはステージ、及び／又は前立腺癌治療後の無病生存期間の長さの指標となる1以上のメチル化されたＣｐＧアイランドについてアッセイすることによる、哺乳類のオスにおける前立腺癌の予知方法を提供する。当該方法は、哺乳類のオス由来の生物学的試料を準備する工程、並びに以下の遺伝子：
ＮＲＧ１、ＡＤＲＢ３、ＧＦＲＡ２、ＫＩＦ１３Ｂ、ＲＥＴ、ＧＰＲ１４７、ＮＥＵＲＯＧ３、ＰＡＬＤ、ＨＥＭＫ１、ＦＧＦ４、ＧＰＲ６２、ＨＴＲ１Ａ、ＲＮＦ１８０、ＤＫＦＺＰ５６４０８２２、ＺＮＦ５９６、ＬＯＣ４４１３２０、ＴＤＨ、ＦＬＪ３６９８０、ＦＧＦ２０、ＥＦＨＡ２、ＡＳＨＡ１、ＮＯＤＡＬ、ＬＯＣ３９９７８３、ＩＳＬ２、ＫＩＦＣ２、Ｃ２０ｏｒｆ２３、ＧＦＲＡ１、ＧＰＸ７、ＤＫＫ２、ＮＴＮ１、ＲＡＳＳＦ５、ＨＴＲＡ４、ＭＭＰ９、ＴＮＦＳＦ１１、ＲＨＯＤもしくはＬＲＲＣ４９の少なくとも1つに関連するＣｐＧアイランドのメチル化について前記試料をアッセイする工程を含む。任意に、前立腺癌の予知方法は、前立腺癌においてメチル化されることが知られているがＢＰＨにおいては検出可能にメチル化されないか、もしくは低レベル（例、約５０％以下、約４０％以下、約３０％以下、約２０％以下、もしくは約１０％以下）でメチル化されることが知られている少なくとも1つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について前記生物学的試料をアッセイする工程も含み得る。前記遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化は、癌のグレードもしくはステージ、及び／又は治療後の無病生存期間の長さの指標となる。
【００１３】
さらに、本発明は治療の効果の指標となるＣｐＧアイランドのメチル化の減少についてアッセイすることによる癌治療の効果の評価方法を提供する。一般的に、当該方法は、癌治療の効果の評価を必要とする被験者由来の第一及び第二生物学的試料を準備する工程、並びに：
ＮＲＧ１、ＡＤＲＢ３、ＧＦＲＡ２、ＫＩＦ１３Ｂ、ＲＥＴ、ＧＰＲ１４７、ＮＥＵＲＯＧ３、ＰＡＬＤ、ＨＥＭＫ１、ＦＧＦ４、ＨＴＲ１Ａ、ＲＮＦ１８０、ＤＫＦＺＰ５６４０８２２、ＺＮＦ５９６、ＬＯＣ４４１３２０、ＴＤＨ、ＦＬＪ３６９８０、ＦＧＦ２０、ＥＦＨＡ２、ＡＳＨＡ１、ＮＯＤＡＬ、ＬＯＣ３９９７８３、ＩＳＬ２、ＫＩＦＣ２、Ｃ２０ｏｒｆ２３、ＧＦＲＡ１、ＧＰＸ７、ＤＫＫ２、ＮＴＮ１、ＭＭＰ９、ＴＮＦＳＦ１１、ＲＨＯＤ及びＬＲＲＣ４９からなる群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化レベルにおける変化について前記試料をアッセイする工程を含む。第一生物学的試料を、第二生物学的試料の前に採取し、かつ第二生物学的試料を治療コース中又は治療コース後に採取する。第二試料（即ち、治療コース後）におけるアッセイされた１以上のＣｐＧアイランドのメチル化の減少もしくは欠如は、治療が有効であることを示す。あるいは、第二試料におけるアッセイされたＣｐＧアイランド中のメチル化の維持もしくは増加は、治療効果の減少もしくは欠如を示し得る。
【００１４】
また、本発明は、治療コース中に哺乳類のオスから定期的に採取した生物学的試料をＣｐＧアイランドのメチル化についてアッセイすることによる、哺乳類のオスにおける前立腺癌治療の効果の評価方法を提供し、ここで、治療コース後のＣｐＧアイランドのメチル化の減少もしくは欠如は、治療が有効であることを示す。当該方法は、
（ａ）癌の治療コースを受けている被験者由来の第一及び第二生物学的試料を準備する工程、ここで、第一生物学的試料を第二生物学的試料よりも早い時期に採取し、第二生物学的試料を治療コース中又は治療コース後に採取する、並びに
（ｂ）：ＮＲＧ１、ＡＤＲＢ３、ＧＦＲＡ２、ＫＩＦ１３Ｂ、ＲＥＴ、ＧＰＲ１４７、ＮＥＵＲＯＧ３、ＰＡＬＤ、ＨＥＭＫ１、ＦＧＦ４、ＨＴＲ１Ａ、ＲＮＦ１８０、ＤＫＦＺＰ５６４０８２２、ＺＮＦ５９６、ＬＯＣ４４１３２０、ＴＤＨ、ＦＬＪ３６９８０、ＦＧＦ２０、ＥＦＨＡ２、ＡＳＨＡ１、ＮＯＤＡＬ、ＬＯＣ３９９７８３、ＩＳＬ２、ＫＩＦＣ２、Ｃ２０ｏｒｆ２３、ＧＦＲＡ１、ＧＰＸ７、ＤＫＫ２、ＮＴＮ１、ＲＡＳＳＦ５、ＨＴＲＡ４、ＭＭＰ９、ＴＮＦＳＦ１１、ＲＨＯＤ及びＬＲＲＣ４９からなる群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について前記試料をアッセイする工程を含む。任意に、本方法は、前立腺癌においてメチル化されることが知られているがＢＰＨにおいては検出可能にメチル化されないか、もしくは低レベル（例、約５０％以下、約４０％以下、約３０％以下、約２０％以下、もしくは約１０％以下）でメチル化される少なくとも1つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について前記生物学的試料をアッセイする工程も含み得る。
【００１５】
好ましい実施形態において、前述の診断方法、予知方法及び癌治療の効果の評価方法は、複数のＣｐＧアイランドのメチル化について前記生物学的試料をアッセイする工程をさらに含み得、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１以上の遺伝子に関連するＣｐＧアイランドである。
【００１６】
さらに、本発明は、ＣｐＧアイランドのメチル化状態を決定するターミネーター結合リニア増幅法を提供する。一般的に、当該方法は、ターミネーター結合リニア増幅のためのＤＮＡ試料を準備する工程及び、続いて脱アミノ化条件下でＤＮＡ試料をインキュベートする工程を含み、それにより脱アミノ化ＤＮＡ試料が生成される。任意に、脱アミノ化ＤＮＡ試料が精製され得る。脱アミノ化試料は、１以上のＣｐＧアイランドもしくは前記１以上のＣｐＧの一部を含む標的配列（単数もしくは複数）を増幅するためにテンプレートとして用いられ、それにより１以上の増幅標的配列が生成される。任意に、１以上の増幅標的配列が精製される。増幅標的配列中の１以上の配列は、プライマー及びジデオキシヌクレオチド存在下で、異なる長さの１以上の断片を複数生成するためにリニア増幅され、ここで、それぞれの長さはプライマーの５’末端からジデオキシヌクレオチドが取り込まれた位置までの塩基の距離と一致する。任意に、前記１以上の断片が精製される。１以上の断片はそれらの長さを決定するため単離され解析される。かつ、断片長は、１以上の増幅標的配列内のメチル化シトシンのメチル化状態を決定するために用いられる。
【００１７】
本発明はまた、本明細書に記載された遺伝子に関連するＣｐＧアイランドの増幅に適するプライマー対を提供する。プライマーとしては、標的配列を包含するＣｐＧアイランドの増幅に適している単離もしくは精製された核酸分子が挙げられ得る。標的配列としては、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４３、配列番号：４４、配列番号：４９、配列番号：５０、配列番号：５１、配列番号：５２、配列番号：５３、及び配列番号：５４における配列などの完全にメチル化されている及び完全に脱アミノ化されているゲノム配列が挙げられ得る。
【００１８】
プライマー対の例としては、配列番号：５５及び５６、配列番号：５７及び５８、配列番号：５９及び６０、配列番号：６１及び６２、配列番号：６３及び６４、配列番号：６５及び６６、配列番号：６７及び６８、配列番号：６９及び７０、配列番号：７１及び７２、配列番号：７３及び７４、配列番号：７７及び７８、配列番号：７９及び８０、配列番号：８１及び８２、配列番号：８３及び８４、配列番号：８７及び８８、配列番号：８９及び９０、配列番号：９１及び９２、配列番号：９３及び９４、配列番号：９５及び９６、配列番号：９７及び９８、配列番号：１０３及び１０４、配列番号：１０５及び１０６、配列番号：１０７及び１０８、配列番号：１０９及び１１０、配列番号：１１１及び１１２、配列番号：１１３及び１１４、配列番号：１１５及び１１６、配列番号：１１７及び１１８、配列番号：１９９及び２００、配列番号：２０１及び２０２、配列番号：２０３及び２０４、配列番号：２０５及び２０６、配列番号：２０７及び２０８、配列番号：２０９及び２１０、配列番号：２１１及び２１２、配列番号：２１３及び２１４、配列番号：２１５及び２１６、配列番号：２１７及び２１８、配列番号：２１９及び２２０、配列番号：２２１及び２２２、配列番号：２２４及び２２５、配列番号：２２７及び２２８、配列番号：２３０及び２３１が挙げられる。
【００１９】
また、本発明は１以上の前述のプライマー対を含むキットを提供する。
【発明の詳細な説明】
【００２０】
本発明は、癌の指標となる１以上のＣｐＧアイランドのメチル化についてアッセイすることによる、癌の診断方法を提供する。癌としては、例えば、肺、肝臓、膵臓、頭頸部、咽喉、甲状腺、食道、脳、卵巣、腎臓、皮膚、結腸直腸、及び造血関連（例、リンパ腫及び白血病）癌が挙げられ得る。一般的に、当該方法は、癌診断を必要とする被験者由来の生物学的試料を準備する工程、並びに：
ＮＲＧ１、ＡＤＲＢ３、ＧＦＲＡ２、ＫＩＦ１３Ｂ、ＲＥＴ、ＧＰＲ１４７、ＮＥＵＲＯＧ３、ＰＡＬＤ、ＨＥＭＫ１、ＦＧＦ４、ＨＴＲ１Ａ、ＲＮＦ１８０、ＤＫＦＺＰ５６４０８２２、ＺＮＦ５９６、ＬＯＣ４４１３２０、ＴＤＨ、ＦＬＪ３６９８０、ＦＧＦ２０、ＥＦＨＡ２、ＡＳＨＡ１、ＮＯＤＡＬ、ＬＯＣ３９９７８３、ＩＳＬ２、ＫＩＦＣ２、Ｃ２０ｏｒｆ２３、ＧＦＲＡ１、ＧＰＸ７、ＤＫＫ２、ＮＴＮ１、ＭＭＰ９、ＴＮＦＳＦ１１、ＲＨＯＤもしくはＬＲＲＣ４９からなる群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について前記試料をアッセイする工程を含む。好ましい実施形態において、当該方法は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１以上の前述の遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化についてアッセイする工程を含み得る。これらの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化は癌の指標となる。
【００２１】
本発明はさらに、哺乳類のオスにおける前立腺癌の指標となる１以上のＣｐＧアイランドのメチル化についてアッセイすることによる、前立腺癌の診断方法を提供する。１つの実施形態において、当該方法は、癌診断を必要とする哺乳類のオス由来の生物学的試料を準備する工程、並びに：
ＮＲＧ１、ＡＤＲＢ３、ＧＦＲＡ２、ＫＩＦ１３Ｂ、ＲＥＴ、ＧＰＲ１４７、ＮＥＵＲＯＧ３、ＰＡＬＤ、ＨＥＭＫ１、ＦＧＦ４、ＨＴＲ１Ａ、ＲＮＦ１８０、ＤＫＦＺＰ５６４０８２２、ＺＮＦ５９６、ＬＯＣ４４１３２０、ＴＤＨ、ＦＬＪ３６９８０、ＦＧＦ２０、ＥＦＨＡ２、ＡＳＨＡ１、ＮＯＤＡＬ、ＬＯＣ３９９７８３、ＫＩＦＣ２、Ｃ２０ｏｒｆ２３、ＧＦＲＡ１、ＧＰＸ７、ＤＫＫ２、ＮＴＮ１、ＲＡＳＳＦ５、ＨＴＲＡ４、ＭＭＰ９、ＴＮＦＳＦ１１、ＲＨＯＤ及びＬＲＲＣ４９からなる群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について前記試料をアッセイする工程を含む。例えば、前立腺癌の診断方法は、ＮＲＧ１、ＫＩＦ１３Ｂもしくは両方に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について前記生物学的試料をアッセイする工程を含む。別の例において、当該方法は：
ＴＧＤＨ、ＡＳＡＨ１、ＦＧＦ２０、ＨＥＭＫ１、ＰＡＬＤ、ＮＥＵＲＯＧ、ＥＦＨＡ２、ＫＩＦＣ２、ＧＦＲＡ１、ＤＫＫ２、ＴＮＦＳＦ１１、ＮＴＮ１、及びＲＨＯＤからなる群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化についてアッセイする工程を含む。好ましい実施形態において、前立腺癌の診断方法は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１以上の前述の遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化についてアッセイする工程を含み得る。これらの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化は癌の指標となる。
【００２２】
前述の前立腺癌の診断方法は、前述の遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化についてアッセイする工程と組み合わせて、さらに
（ｉ）前立腺癌においてメチル化されること、及び
（ｉｉ）ＢＰＨにおいては検出可能にメチル化されないか、もしくは低レベル（例、約５０％以下、約４０％以下、約３０％以下、約２０％以下、もしくは約１０％以下）でメチル化されること
が知られている少なくとも1つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について前記生物学的試料をアッセイする工程を任意に含み得る。この点において、前立腺癌においてメチル化されることが知られているが、ＢＰＨにおいては検出可能にメチル化されないか、もしくは低レベルでメチル化されることが知られている少なくとも１つのＣｐＧアイランドについてアッセイする工程を含む場合、当該方法は、好ましくは、少なくとも３つの異なる遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について前記生物学的試料をアッセイする工程を含む。前立腺癌においてメチル化されるが、ＢＰＨにおいては検出可能にメチル化されないか、もしくは低レベルでメチル化されることが知られているＣｐＧアイランドの例としては、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼＰ１（ＧＳＴＰ１）、グルタチオンペルオキシダーゼ３（ＧＰＸ３）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼＭ１（ＧＳＴＭ１）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼＭ４（ＧＳＴＭ４）、Ｃｕｂ及びＳｕｓｈｉ複数ドメイン１（ＣＳＭＤ１）、腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリーメンバー１０Ａ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ）、腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリーメンバー１０Ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ）、腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリーメンバー１０Ｃ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ）、腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリー１０Ｄ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ）、分泌ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質１（ＳＦＲＰ１）、分泌ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質２（ＳＦＲＰ２）、ｄｉｃｋｋｏｐｆホモログ３（ＤＫＫ３）、プロスタグランジン−エンドペルオキシドシンターゼ２（ＰＴＧＳ２）、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子１Ｃ（ＣＤＫＮ１Ｃ／ｐ５７）、Ｒａｓ関連（ＲａｌＧＤＳ／ＡＦ−６）ドメインファミリー１（ＲＡＳＳＦ１）、及びＧタンパク質共役レセプター６２（ＧＰＲ６２）に関連するＣｐＧアイランドが挙げられる。
【００２３】
本発明はまた、癌のグレードもしくはステージ、及び／又は癌治療後の無病生存期間の長さの指標となる１以上の遺伝子のメチル化についてアッセイすることによる、癌の予知方法を提供する。一般的に、当該方法は、癌の予知を必要とする被験者由来の生物学的試料を準備する工程、並びに：
ＮＲＧ１、ＡＤＲＢ３、ＧＦＲＡ２、ＫＩＦ１３Ｂ、ＲＥＴ、ＧＰＲ１４７、ＮＥＵＲＯＧ３、ＰＡＬＤ、ＨＥＭＫ１、ＦＧＦ４、ＨＴＲ１Ａ、ＲＮＦ１８０、ＤＫＦＺＰ５６４０８２２、ＺＮＦ５９６、ＬＯＣ４４１３２０、ＴＤＨ、ＦＬＪ３６９８０、ＦＧＦ２０、ＥＦＨＡ２、ＡＳＡＨ１、ＮＯＤＡＬ、ＬＯＣ３９９７８３、ＩＳＬ２、ＫＩＦＣ２、Ｃ２０ｏｒｆ２３、ＧＦＲＡ１、ＧＰＸ７、ＤＫＫ２、ＮＴＮ１、ＭＭＰ９、ＴＮＦＳＦ１１、ＲＨＯＤ、及びＬＲＲＣ４９からなる群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について前記試料をアッセイする工程を含む。好ましい実施形態において、当該方法は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１以上の前述の遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化についてアッセイする工程を含み得る。これらの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化は、癌のグレードもしくはステージ、及び／又は癌治療後の無病生存期間の長さの指標となる。
【００２４】
本発明はまた、前立腺癌のグレードもしくはステージ、及び／又は前立腺癌の治療後の無病生存期間の長さの指標となる１以上のＣｐＧアイランドのメチル化についてアッセイすることによる、哺乳類のオスにおける前立腺癌の予知方法を提供する。１つの実施形態において、当該方法は、以下の遺伝子：
ＮＲＧ１、ＡＤＲＢ３、ＧＦＲＡ２、ＫＩＦ１３Ｂ、ＲＥＴ、ＧＰＲ１４７、ＮＥＵＲＯＧ３、ＰＡＬＤ、ＨＥＭＫ１、ＦＧＦ４、ＨＴＲ１Ａ、ＲＮＦ１８０、ＤＫＦＺＰ５６４０８２２、ＺＮＦ５９６、ＬＯＣ４４１３２０、ＴＤＨ、ＦＬＪ３６９８０、ＦＧＦ２０、ＥＦＨＡ２、ＡＳＡＨ１、ＮＯＤＡＬ、ＬＯＣ３９９７８３、もしくはＩＳＬ２の少なくとも１つに関連するＣｐＧアイランドのメチル化について哺乳類のオス由来の前記生物学的試料をアッセイする工程を含む。加えて、もしくは前述に代えて、当該方法は、以下の遺伝子：
ＫＩＦＣ２、Ｃ２０ｏｒｆ２３、ＧＦＲＡ１、ＧＰＸ７、ＤＫＫ２、ＮＴＮ１、ＲＡＳＳＦ５、ＨＴＲＡ４、ＭＭＰ９、ＴＮＦＳＦ１１、ＲＨＯＤもしくはＬＲＲＣ４９の少なくとも１つに関連するＣｐＧアイランドのメチル化について前記生物学的試料をアッセイする工程を含み得る。例えば、前立腺癌の診断方法は、ＮＲＧ１、ＫＩＦ１３Ｂ、もしくは両方に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について前記生物学的試料をアッセイする工程を含む。別の例において、当該方法は、以下の遺伝子：
ＴＧＤＨ、ＡＳＡＨ１、ＦＧＦ２０、ＨＥＭＫ１、ＰＡＬＤ、ＮＥＵＲＯＧ、ＥＦＨＡ２、ＫＩＦＣ２、ＧＦＲＡ１、ＤＫＫ２、ＴＮＦＳＦ１１、ＮＴＮ１、もしくはＲＨＯＤの少なくとも１つについてアッセイする工程を含む。好ましい実施形態において、前立腺の診断方法は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１以上の前述の遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化についてアッセイする工程を含み得る。これらの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化は、前立腺癌のグレードもしくはステージ、及び／又は前立腺癌の治療後の無病生存期間の長さの指標となる。
【００２５】
前述の前立腺癌の予知方法は、前述の遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化についてアッセイする工程と組み合わせ、さらに
（ｉ）前立腺癌においてメチル化されること、及び
（ｉｉ）ＢＰＨにおいては検出可能にメチル化されないか、もしくは低レベル（例、約５０％以下、約４０％以下、約３０％以下、約２０％以下、もしくは約１０％以下）でメチル化されること
が知られている少なくとも1つの遺伝子に関連する1以上のＣｐＧアイランドのメチル化について前記生物学的試料をアッセイする工程、任意に含み得る。ＢＰＨにおけるメチル化レベルの割合とは、その遺伝子座でいくらかの検出可能なメチル化レベルを示す患者の割合をいう。この点において、当該方法は、前立腺癌においてメチル化されることが知られているが、ＢＰＨにおいては検出可能にメチル化されないか、もしくは低レベルでメチル化されることが知られている少なくとも１つのＣｐＧアイランドのメチル化についてアッセイする工程を含む場合、当該方法は、好ましくは、少なくとも３つの異なる遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について前記生物学的試料をアッセイする工程を含む。前立腺癌においてメチル化されるが、ＢＰＨにおいては検出可能にメチル化されないか、もしくは低レベルでメチル化されることが知られているＣｐＧアイランドの例としては、ＧＳＴＰ１、ＧＰＸ３、ＧＳＴＭ１、ＧＳＴＭ４、ＣＳＭＤ１、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ、ＳＦＲＰ１、ＳＦＲＰ２、ＤＫＫ３、ＰＴＧＳ２、ＣＤＫＮ１Ｃ／ｐ５７、ＲＡＳＳＦ１及びＧＰＲ６２に関連するＣｐＧアイランドが挙げられる。この遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化は、前立腺癌のグレードもしくはステージ、及び／又は前立腺癌の治療後の無病生存期間の長さの指標となる。
【００２６】
癌の治療コースを選択している場合は、癌の悪性度、そのグレード、及びそのステージについて情報を得ることが役に立つ。ＣｐＧメチル化のパターンは腫瘍の病理学的ステージ及びグレードと相関関係を示し得る。例えば、前立腺癌において、ＣｐＧメチル化のパターンは、原発腫瘍のグリソンスコア、及び癌のステージと相関関係を示し得る。ＣｐＧのメチル化から得られた分子情報は、生存の見込み及び治療後の無病生存期間の長さとも相関関係を示し得る。上記の診断方法は、癌のコースの予測並びに治療への最良のアプローチを可能にし得る。
【００２７】
また、本発明は治療の効果の指標となるＣｐＧアイランドのメチル化の減少についてアッセイすることによる、癌治療の効果の評価方法を提供する。一般的に、当該方法は、癌治療の効果の評価を必要とする被験者由来の第一及び第二生物学的試料を準備する工程、並びに：
ＮＲＧ１、ＡＤＲＢ３、ＧＦＲＡ２、ＫＩＦ１３Ｂ、ＲＥＴ、ＧＰＲ１４７、ＮＥＵＲＯＧ３、ＰＡＬＤ、ＨＥＭＫ１、ＦＧＦ４、ＨＴＲ１Ａ、ＲＮＦ１８０、ＤＫＦＺＰ５６４０８２２、ＺＮＦ５９６、ＬＯＣ４４１３２０、ＴＤＨ、ＦＬＪ３６９８０、ＦＧＦ２０、ＥＦＨＡ２、ＡＳＨＡ１、ＮＯＤＡＬ、ＬＯＣ３９９７８３、ＩＳＬ２、ＫＩＦＣ２、Ｃ２０ｏｒｆ２３、ＧＦＲＡ１、ＧＰＸ７、ＤＫＫ２、ＮＴＮ１、ＭＭＰ９、ＴＮＦＳＦ１１、ＲＨＯＤ及びＬＲＲＣ４９からなる群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化レベルにおける変化について前記試料をアッセイする工程を含む。一般的に、第一生物学的試料を第二生物学的試料の前に採取し（例、治療開始前もしくは治療中）、かつ第二生物学的試料を治療コース後に採取する。好ましい実施形態において、当該方法は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１以上の前述の遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化における変化についてアッセイする工程を含む。第二試料（即ち、治療コース後）におけるアッセイされた１以上のＣｐＧアイランドのメチル化の減少もしくは欠如は、治療が有効であることを示す。あるいは、第二試料でのアッセイされたＣｐＧアイランドにおけるメチル化の維持もしくは増加は、治療効果の減少もしくは欠如を示し得る。
【００２８】
本発明は、前立腺癌治療の効果を示すＣｐＧアイランドのメチル化の減少についてアッセイすることによる、哺乳類のオスにおける前立腺癌治療の効果の評価方法を提供する。１つの実施形態において、当該方法は：
ＮＲＧ１、ＡＤＲＢ３、ＧＦＲＡ２、ＫＩＦ１３Ｂ、ＲＥＴ、ＧＰＲ１４７、ＮＥＵＲＯＧ３、ＰＡＬＤ、ＨＥＭＫ１、ＦＧＦ４、ＨＴＲ１Ａ、ＲＮＦ１８０、ＤＫＦＺＰ５６４０８２２、ＺＮＦ５９６、ＬＯＣ４４１３２０、ＴＤＨ、ＦＬＪ３６９８０、ＦＧＦ２０、ＥＦＨＡ２、ＡＳＨＡ１、ＮＯＤＡＬ、ＬＯＣ３９９７８３、及びＩＳＬ２からなる群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について、治療コース中に哺乳類のオスから定期的に採取する生物学的試料をアッセイする工程を含む。加えて、もしくは前述に代えて、当該方法は：
ＫＩＦＣ２、Ｃ２０ｏｒｆ２３、ＧＦＲＡ１、ＧＰＸ７、ＤＫＫ２、ＮＴＮ１、ＲＡＳＳＦ５、ＨＴＲＡ４、ＭＭＰ９、ＴＮＦＳＦ１１、ＲＨＯＤ及びＬＲＲＣ４９からなる群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子に関するＣｐＧアイランドのメチル化について前記生物学的試料をアッセイする工程を含み得る。例えば、前立腺癌治療の効果の評価方法は、ＮＲＧ１、ＫＩＦ１３Ｂ、もしくは両方に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について前記生物学的試料をアッセイする工程を含む。別の例においては、当該方法は：
ＴＧＤＨ、ＡＳＡＨ１、ＦＧＦ２０、ＨＥＭＫ１、ＰＡＬＤ、ＮＥＵＲＯＧ、ＥＦＨＡ２、ＫＩＦＣ２、ＧＦＲＡ１、ＤＫＫ２、ＴＮＦＳＦ１１、ＮＴＮ１、及びＲＨＯＤからなる群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドについてアッセイする工程を含む。好ましい実施形態において、当該方法は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１以上の前述の遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化についてアッセイする工程を含み得る。一般的に、当該方法においてアッセイされる生物学的試料としては、第一及び第二生物学的試料が挙げられる。第一生物学的試料は、例えば、治療開示前もしくは治療中、しかしいずれにしても第二生物学的試料の採取より前に採取し得る。第二生物学的試料は、治療コース中もしくは治療コース後に採取する。第一試料と比較して、第二試料（即ち、治療コース後）におけるアッセイされた１以上のＣｐＧアイランドのメチル化の減少もしくは欠如は、治療が有効であることを示す。あるいは、第一試料と比較して、第二試料でのアッセイされたＣｐＧアイランドにおけるメチル化の維持もしくは増加は、治療効果の減少もしくは欠如を示し得る。
【００２９】
前述の前立腺癌治療の効果の評価方法は、前述の遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化についてアッセイする工程と組み合わせて、さらに
（ｉ）前立腺癌においてメチル化されること、及び
（ｉｉ）ＢＰＨにおいては検出可能にメチル化されないか、もしくは低レベル（例、約５０％以下、約４０％以下、約３０％以下、約２０％以下、もしくは約１０％以下）でメチル化されること
が知られている少なくとも1つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化の減少について前記生物学的試料をアッセイする工程を、任意に含み得る。この点において、当該方法は、前立腺癌においてメチル化されることが知られているが、ＢＰＨにおいては検出可能にメチル化されないか、もしくは低レベルでメチル化されることが知られている少なくとも１つのＣｐＧアイランドのメチル化について前記生物学的試料をアッセイする工程を含む場合、当該方法は、好ましくは、少なくとも３つの異なる遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化についてアッセイする工程を含む。前立腺癌においてメチル化されるが、ＢＰＨにおいては検出可能にメチル化されないか、もしくは低レベルでメチル化されることが知られているＣｐＧアイランドの例としては、ＧＳＴＰ１、ＧＰＸ３、ＧＳＴＭ１、ＧＳＴＭ４、ＣＳＭＤ１、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ、ＳＦＲＰ１、ＳＦＲＰ２、ＤＫＫ３、ＰＴＧＳ２、ＣＤＫＮ１Ｃ／ｐ５７、ＲＡＳＳＦ１、及びＧＰＲ６２が挙げられる。第一試料と比較して、いくつかの、もしくは全ての治療コースの後の第二試料におけるアッセイされた遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化の減少もしくは欠如は、治療が有効であることを示す。あるいは、第一試料と比較して、第二試料でのアッセイされたＣｐＧアイランドにおけるメチル化の維持もしくは増加は、治療効果の減少もしくは欠如を示し得る。
【００３０】
ＣｐＧアイランド(Bird, Nature 321: 209-213 (1986)；及びGardiner-Garden et al., J. Molec. Biol. 196: 261-282 (1987))は、脊椎動物ゲノムの約１％を構成し、全ＣｐＧヌクレオチド数の約１５％を占める。ＣｐＧアイランドは典型的に約０．２〜約２．０ｋｂの間の長さである。これらは関連遺伝子のコーディング配列の上流に（例、プロモーターもしくはエンハンサー領域中に）位置し得、又は、これらはその関連遺伝子の遺伝子コーディング領域にも広がり、もしくは遺伝子コーディング領域内で見られ得る。遺伝子コーディング領域としては、エキソン及びイントロンが挙げられ得る。遺伝子に対するＣｐＧアイランドの関係を説明するための「関連する」という語句の使用は、遺伝子コーディング配列の上流であるＣｐＧアイランド並びに内部ＣｐＧアイランドを包含することを意図する。例えば、ＲＥＴ遺伝子に関連するＣｐＧアイランドは内部にあり、メチル化されたときＲＥＴ遺伝子の発現に影響を及ぼすことを期待されない。いくつかのＣｐＧアイランドは２つの遺伝子のプロモーターに関連し、それは両方の遺伝子の発現に作用し得る。ＣｐＧは、最も近傍にある遺伝子に対するそれらの位置に基づき標識された。ある場合には、ＣｐＧアイランドは２つの異なる遺伝子のプロモーター付近に位置し得、この場合、両方の遺伝子の発現に影響を与え得る。このような場合、ＣｐＧアイランドは両遺伝子のうち１つに由来して命名した。例えば、ＬＲＲＣ４９ＣｐＧアイランドはＴＨＡＰドメイン含有１０（ＴＨＡＰ１０）遺伝子にも関連する。ＣｐＧアイランドは偽遺伝子にも関連し得、又は、既知の遺伝子もしくは偽遺伝子を含まない遺伝子領域に位置し得る。ＣｐＧアイランドは、そのメチル化状態が疾病状態と相関関係がある限り、まだ関心が持たれ得る。
【００３１】
ＣｐＧアイランドは、最も近傍にある遺伝子の転写開始部位から最大で２５キロベース（ｋｂ）まで（例、２０ｋｂまで、１９ｋｂまで、１８ｋｂまで、１７ｋｂまで、１６ｋｂまで、１５ｋｂまで、１０ｋｂまで、９ｋｂまで、８ｋｂまで、７ｋｂまで、６ｋｂまで、５ｋｂまで、４ｋｂまで、３ｋｂまで、２ｋｂまで、１ｋｂまで）分離され得、いまだ当該遺伝子に「関連する」と見なされ得る。好ましくは、少なくとも３つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドがアッセイされる。しかし、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７もしくはそれ以上の遺伝子に関連するＣｐＧアイランドはアッセイされ得る。
【００３２】
ＣｐＧアイランドの同定方法が記載されてきた。（例、Takai et al., Proc. Nat’l. Assoc. Sci. USA, 99:3740-3745 (2002)）。例えば、ゲノム配列は、少なくとも２００ｂｐの長さで、少なくとも６０％のＧＣ含有量を有し、かつ少なくとも７％のＣｐＧジヌクレオチドを含むＣｐＧアイランドを包含する配列を同定するために解析され得る。好ましい配列は、少なくとも２５０ｂｐの長さであり、少なくとも６０％の高ＧＣであり、かつ少なくとも７％のＣｐＧヌクレオチドを包含する。さらに、望ましくない高頻度繰り返し配列は、配列を除去するリピートマスカー（repeat masker）を用いて排除され得る。望ましい配列は、同定されたＣｐＧアイランドの長さ内に５０％未満の繰り返し（即ち、複雑性を低減した配列もしくは多数の遺伝子座において存在する配列）を包含する。好ましくは、ＣｐＧアイランドは４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、もしくは１１％未満の繰り返しである。もっとも望ましい配列は１０％未満の繰り返しである。繰り返し配列の例は、例えば、国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)のウェブサイトにおいて入手可能である。
【００３３】
「生物学的試料」は、ＣｐＧアイランドメチル化の正確なアッセイを可能にする任意の適する試料を包含することを意図する。適する生物学的試料の例としては、全血、血漿、血清、尿、唾液、細胞（例、上皮細胞のような血液から採取した細胞）、及び組織が挙げられるが、これに限定されない。このような試料は当技術分野で周知の方法に従って得られる。生物学的試料が全血、血漿もしくは尿の場合、好ましくは、３つより多い遺伝子に関連するＣｐＧアイランドをアッセイする。
【００３４】
ＣｐＧアイランドがメチル化されないか、もしくは用いたアッセイ法の検出感度水準に満たないレベルでメチル化された場合、ＣｐＧアイランドは「検出可能にメチル化されない」。
【００３５】
「非癌性の」組織は良性もしくは正常であり得る。あるいは、しかし好ましくないことに、癌性でない限り、組織は罹患し得る。
【００３６】
ＣｐＧアイランドのメチル化アッセイの方法は当技術分野で公知であり、例えば、サザンブロット解析と併用されるメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによる消化を用いるような制限酵素に基づく技術、メチル化感受性の任意にプライムしたＰＣＲ（ＡＰ−ＰＣＲ；例、Gonzalgo et al., Cancer Res., 57: 594-599 (1997)を参照）といったメチル化感受性酵素とポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、制限ランドマークゲノムスキャニング法（ＲＬＧＳ；例、Plass et al., Genomic 58: 254-262 (1999)を参照）、メチル化ＣｐＧアイランド増幅（ＭＣＡ；例、Toyota et al., Cancer Res., 59: 2307-2312 (1999)を参照）、示差メチル化ハイブリダイゼーション（ＤＭＨ；例、Huang et al., Human Mol. Genet., 8: 459-470 (1999)を参照）、及び、ＮｏｔＩに基づく示差メチル化ハイブリダイゼーション（例、特許協力条約出願公開第ＷＯ ０２／０８６１６３号）が挙げられる。他の方法は米国特許出願公開第２００３／０１７０６８４号及び特許協力条約出願公開第ＷＯ ０４／０５１２２号に記載される。
【００３７】
あるいは、シトシン変換に基づいた技術が用いられ得る。このような技術は、ＤＮＡ配列解析後の単離ゲノムＤＮＡもしくはその断片内でのＣｐＧアイランドの化学的修飾依存性メチル化状態（即ち、ＣｐＧアイランドにおける非メチル化シトシンの脱アミノ化）に依存する。このような方法はヒドラジン及び亜硫酸水素塩のような試薬を用いる。アルカリ加水分解後の亜硫酸水素塩処理は、Olek et al., Nucl. Acids Res., 24: 5064-5066 (1996)；及びFrommer et al., PNAS USA, 89: 1827-1831 (1992)に記載される。単離ゲノムＤＮＡにおけるＣｐＧアイランドのメチル化アッセイのためのメチル化感受性プライマーの使用は、Herman et al., PNAS USA, 93: 9821-9826 (1996)、並びに米国特許第５７８６１４６号及び第６２６５１７１号に記載される。亜硫酸水素塩処理ＤＮＡは、次いで、ＰＣＲ増幅、蛍光ベースのリアルタイムＰＣＲ（例、Eads et al., Cancer Res., 59: 2302-2306 (1999); Heid et al., Genome Res., 6: 986-994 (1996)；及び米国特許第６３３１３９３号を参照）、シーケンシング、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション検出、並びにメチル化感受性シングルヌクレオチドプライマー伸長（Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ；例、 Gonzalgo et al., Nucl. Acids Res., 25: 2529-2531 (1997)； 及び 米国特許第６２５１５９４号を参照）といった従来の分子技術により解析され得る。
【００３８】
ＣｐＧアイランドのメチル化についてアッセイする好ましい方法としては、生物学的試料からゲノムＤＮＡ（及び／もしくはその断片）を単離する工程、非メチル化シトシンをウラシルに変換する脱アミノ化状態下でＤＮＡを処理する工程、目的のＣｐＧアイランドを含む標的配列を増幅するためのＰＣＲ反応におけるテンプレートとして処理ＤＮＡを用いる工程を含み、それにより増幅配列が生成される。脱アミノ化処理によりウラシルに変換される標的配列中の非メチル化シトシンは、増幅配列の相当する位置でチミンとして増幅される。ＣｐＧアイランドのフォワード及びリバース鎖の配列は、脱アミノ化反応後その相補性を失うので、ＣｐＧアイランドのメチル化状態は目的の鎖をアニールできるプライマーを用いて、オリジナル鎖の片側もしくは両側をアッセイすることにより決定され得る。
【００３９】
脱アミノ化反応は完了まで進まないかも知れず、これは結果として擬陽性となる。例えば、亜硫酸水素塩を用いたＤＮＡ配列の脱アミノ化は、ＤＮＡの精度、インキュベーションの長さ、及び変性したテンプレートの二次構造に感受性である。定量的ＰＣＲ法は脱アミノ化の効果についてアッセイするために用いられ得る。しかし定量的ＰＣＲ法はプライマー及びプローブがテンプレートに対してアニールする部位内の変換状態のアッセイに限定される。
【００４０】
定量的ＰＣＲ法はまた、プライマー及びプローブがテンプレートに対してアニールする部位内のシトシンのメチル化についてのアッセイに限定される。プライマー及びプローブは、適切なシトシンヌクレオチドにおいて完全に変換されメチル化を包含するテンプレートに対して効果的にアニールするのみである。このように、これらはアッセイされていないＣｐＧジヌクレオチドに関するメチル化情報を提供できない。ＣｐＧアイランドはまた、脱アミノ化処理後に直接配列決定を用いて解析され得る。しかし、ＣｐＧアイランド内のメチル化パターンの不均一性及び配列内のホモポリマー状伸長の存在に依存して、ＣｐＧアイランドの直接配列決定は、利用可能なシークエンシングソフトウェアに対して非常にノイズが多く複雑であるシークエンシングパターンをもたらし得る。
【００４１】
臨床検査のためにこれらの不都合を克服し、解析の全コストを最小限に抑えるために、我々は、ターミネーション結合リニア増幅による増幅配列を解析するための方法を開発した。ｄＮＴＰ及びジデオキシシチジンもしくはジデオキシグアニンのような１つもしくは２つのジデオキシヌクレオチド存在下で、フォワードもしくはリバースプライマーを用いてＤＮＡをリニア増幅する。増幅配列は、チミン及び／もしくはシトシンヌクレオチドにおいて（逆鎖をアッセイする場合、又は、グアニン及び／もしくはアデニンにおいて）終了する伸長反応産物を作るため、メチル化されたＣｐＧジヌクレオチドについてアッセイするとき、チミン及び／もしくはシトシンターミネーター（又は、目的のＣｐＧジヌクレオチドと反対の増幅鎖を解析する場合のアデニン及び／もしくはグアニンターミネーター）のみを用いて、任意に、解析され得る。増幅反応は、多数の長さを有する、断片の生成をもたらし、それぞれの長さは、増幅に用いられたプライマーと、増幅反応に添加したジデオキシヌクレオチドに相補的であるヌクレオチドの標的配列内の位置との間の塩基の距離に一致する。このような増幅は、１００〜１５０ｂｐのＣｐＧアイランド含有アンプリコンの平均から、１０〜２０の断片の生成をもたらし得る。伸長産物をアクリルアミドゲル上でサイズごとに分離して、
（ａ）サイズ標準と比較し、及び／又は、
（ｂ）当該断片と完全に非メチル化された（ＰＣＲがテンプレートもしくは大腸菌におけるクローン）もしくは完全にメチル化された（ｉｎ ｖｉｔｒｏで酵素的にメチル化された）テンプレートが生成したものとを比較することにより、それにより、増幅ＣｐＧアイランド包含配列において、シトシン（もしくは逆鎖におけるグアニン）の存在又は、チミン（もしくは逆鎖におけるアデニン）の存在が決定され得る。亜硫酸水素塩を脱アミノ化剤として用いるとき、増幅配列は、増幅の間、ＤＮＡポリメラーゼスリップに依存する添加断片をもたらし得る、チミンもしくはアデニンの大きな伸長を包含し得る。このような「スタッター（ｓｔｕｔｔｅｒ）」パターンは、より短いホモポリマー配列を有するＣｐＧアイランドのセグメントを選択的に解析することにより最小限に抑えられ得る。スタッター断片はまた、コントロールテンプレート解析により同定され得る。
【００４２】
蛍光ラベルを用いてターミネーター結合リニア増幅で使用するタグプライマーもしくはジデオキシヌクレオチドに標識するとき、得られる断片は自動化されたシークエンシングマシン及びＤＮＡ断片のサイズを決定するために設計されたソフトウェアを用いて解析され得る。この点において、GENESCAN （Applied Biosystems, Foster City, CA）及びGENEMAPPER （Applied Biosystems）といった市販の利用可能なソフトウェアを、マイクロサテライト反復の増幅の間、ＤＮＡポリメラーゼスリップに依存するスタッターパターンを認識し、明らかにするためにトレーニングする。このようなソフトウェアは、ＣｐＧアイランドの亜硫酸水素塩変換後に見られ得るように、ＤＮＡのホモポリマー伸長を増幅するとき観察されるスタッターパターンを明らかにするためにも用いられ得る。ＤＮＡの自動化解析に利用可能な多くの蛍光染色があり、例えば、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、ＶＩＣ染料、５−カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、スクシンイミジルエステル（５−ＲＯＸ）、６−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）などが挙げられるが、これに限定されない。アンプリコンサイズを決定する方法及び装置は１０年以上もの間利用されており、遺伝子リンケージマッピング、ＤＮＡ同定、及び法医学において用いられてきた。例えば、アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）は、ＡＢＩシークエンサーで４つの別々の増幅反応由来の多重断片に用いられ得る５つの染料及びリンケージマッピングにおいて用いる１つのスタンダードのセットを有する。単一個体由来の４つの異なるＣｐＧアイランドは蛍光タグプライマーを用いてリニア増幅され、反応物は解析前に保存され得る。あるいは、異なる個体由来の異なるＣｐＧアイランドは蛍光タグプライマーを用いてリニア増幅され、反応物は解析前に保存され得る。
【００４３】
試料（即ち、ＣｐＧ配列が不均一である）における特定のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化が常に完全ではないことから、本明細書に記述された方法は、試料内の特定のＣｐＧジヌクレオチド部位のメチル化の割合の程度を解析するために有利に用いられ得る。好ましい方法において、蛍光ジデオキシシークエンシング反応において２つの異なる蛍光染色ターミネーターは、それぞれチミン及びシトシン（もしくは、逆鎖を解析するとき、それぞれアデニン及びグアニン）に用いられる。同サイズ伸長産物における２つの染色の相対存在量は、特定の配列位置における２つのヌクレオチドの相対存在量の指標であり、それによりＣｐＧアイランド内の特定のＣｐＧジヌクレオチド部位のメチル化の割合を示唆し得る。予想される２つの染色の相対存在量を決定するために、完全に非メチル化されたテンプレートに対する完全にメチル化されたテンプレートの公知の比率の範囲でコントロール反応を使用することができる。コントロール反応から得たデータは、試料中のメチル化及び非メチル化シトシンの相対存在量を見積もるための基準として用いられ得る。
【００４４】
所定のＣｐＧアイランドにおけるメチル化のレベルもしくはメチル化のパターンは、必要に応じてアッセイされ得る。このアッセイは、必要に応じて、異常メチル化の決定を可能にするために、参照基準を用い得る。参照基準は隣接組織の年齢を適合させた非癌性のクラスから得た基準試料に基づき、正常末梢血リンパ球を用いて決定され得る。例えば、治療の効果が評価されているとき、治療コースを引き継いだ生物学的試料の結果についてのアッセイは、参照基準の使用無しに比較され得る。
【００４５】
生物学的試料から得たＤＮＡが限られた量であり、複数マーカーの解析に十分でないとき、本明細書に記述された方法は、試料由来のＤＮＡを増幅する工程を含み得る。増幅は、ＰＣＲ増幅もしくは等温増幅法を用いて行われ得、例えばこれらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている米国特許第５８５４０３３号、 第６１２４１２０号、第６１４３４９５号、第６２１０８８４号、第６６４２０３４号、第６２８０９４９号、第６６３２６０９号及び第６６４２０３４号、並びに 米国特許出願公開第２００３／００３２０２４号、第２００３／０１４３５３６号、第２００３／０２３５８４９号、第２００４／００６３１４４号及び第２００４／０２６５８９７号に記載されている。等温増幅としては、ローリングサークルもしくは鎖置換増幅が挙げられ得る。ＰＣＲ及び等温増幅を組み合わせる方法もまた記載されている（それぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれている米国特許第６７７７１８７号、及び第６８２８０９８号又は、米国特許出願第２００４／０２０９２９８号、第２００５／００３２１０４号及び第２００６／００６８３９４号）。参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、米国特許出願第２００５／０２０２４９０号は、ＤＮＡのメチル化パターンを研究するためにメチル化感受性制限酵素と併用したこのような方法の使用を記載する。参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、米国特許出願１１／４０２６８１号（２００６年４月１１日出願）に記載されたように、ＤＮＡ増幅としてはまた、必要なＤＮＡを生成するためにメチル化結合全ゲノム増幅が挙げられ得る。メチル化結合全ゲノム増幅は、ＤＮＡが微小な生物学的試料又は尿もしくは血漿といった体液から回収されるとき、特に有利であり得る。
【００４６】
当業者は、本明細書に記載された様々な増幅方法、例、ＰＣＲ増幅、等温増幅、及びターミネーション結合リニア増幅法が、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログ誘導体、及び／又はこれらの組み合わせを用い得ることを、正しく理解するだろう。
【００４７】
必要に応じて、ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルをアッセイし得、これらの発現レベルにおける変化は、所定のＣｐＧアイランドにおけるメチル化レベルもしくはメチル化パターンにおける変化の指標となり得る。このようなｍＲＮＡ及びタンパク質レベルのアッセイの方法も当技術分野の技術の範囲内である。例えば、参照により本明細書に組み込まれている、２００５年５月８日に出願された米国仮特許出願第６０／７０５９６４号及び２００６年４月８日に出願された特許協力条約出願第ＰＣＴ／ＵＳ／３０７２１号に記載された、ｍＲＮＡアッセイ方法が用いられ得る。分解した組織試料を生物学的試料として用いるとき、このような方法は特に有用である。あるいは、遺伝子特異的プライマーを用いた逆転写は、ｍＲＮＡレベルをアッセイするために用いられ得る。タンパク質レベルは、例えば、抗体及び染色技術を用いてアッセイされ得る。
【００４８】
ＣｐＧアイランドの異常メチル化が、関連遺伝子の発現に影響し得るとしても、本明細書に記載されている方法が過剰メチル化の生物学的役割に依存していないことに言及することは重要である。それは、遺伝子発現に影響があるにも関わらず、過剰メチル化されたＣｐＧアイランドは本発明の方法において有用であり得るということである。したがって、唯一の条件は、ＣｐＧアイランドのメチル化状態と癌の存在との間に相関関係があることである。
【００４９】
本発明はさらに、上記の方法において有用である標的配列及び相当するプライマーもしくはプローブを提供する。標的配列は、メチル化についてアッセイするためのＣｐＧアイランドの選抜に対する背景を提供する。所定の標的配列が１より多くのＣｐＧアイランドを包含するとき、全てもしくはそれより少ないＣｐＧアイランド、1つのＣｐＧヌクレオチドですら、その特定の標的配列に関するメチル化についてアッセイされ得る。この点において、標的配列としては、完全にメチル化された、及び完全に脱アミノ化された配列番号：１もしくは２［ＮＲＧ１］、配列番号：３もしくは４［ＡＤＲＢ３］、配列番号：５もしくは６［ＧＦＲＡ２］、配列番号：７もしくは８［ＫＩＦ１３Ｂ］、配列番号：９もしくは１０［ＲＥＴ］、配列番号：１１もしくは１２［ＧＰＲ１４７］、配列番号：１３もしくは１４［ＮＥＵＲＯＧ３］、配列番号：１５もしくは１６［ＰＡＬＤ］、配列番号：１７もしくは１８［ＨＥＭＫ１］、配列番号：１９もしくは２０［ＦＧＦ４］、配列番号：２３もしくは２４［ＨＴＲ１Ａ］、配列番号：２５もしくは２６［ＲＮＦ１８０］、配列番号：２７もしくは２８［ＥＣＯＰ］、配列番号：２９もしくは３０［ＺＮＦ５９６］、配列番号：３３もしくは３４［ＬＯＣ４４１３２０］、配列番号：３５もしくは３６［ＴＤＨ］、配列番号：３７もしくは３８［ＦＬＪ３６９８０］、配列番号：３９もしくは４０［ＦＧＦ２０］、配列番号：４１もしくは４２［ＥＦＨＡ２］、配列番号：４３もしくは４４［ＡＳＡＨ１］、配列番号：４５もしくは４６又は配列番号：４９もしくは５０［ＮＯＤＡＬ］、配列番号：５１もしくは５２［ＬＯＣ３９９７８３］、配列番号：５３もしくは５４［ＩＳＬ２］といったゲノム配列が挙げられ得る。これらの完全にメチル化された及び脱アミノ化された配列は、例証目的のために用いられ、本発明の方法における部分的メチル化及び脱アミノ化配列の使用を除外しない。標的配列としては、腫瘍から得たＤＮＡにおけるような部分的にメチル化され、その結果、標的が上記に挙げた配列と異なるように脱アミノ化されるゲノム配列が挙げられ得る。当業者は、部分的にメチル化された及び脱アミノ化されたＣｐＧアイランドを含む標的配列は、１以上のＣｐＧジヌクレオチドにおけるシトシン残基と一致する１以上の位置において異なるＤＮＡ分子集団をもたらすであろうことを、正しく理解するだろう。このように、標的配列としては、以下のゲノム配列
配列番号：１１９もしくは２２０［ＫＩＦＣ２］、配列番号：１２１もしくは１２２［Ｃ２０ＰＲＦ２３］、配列番号：１２３もしくは１２４［ＧＦＲＡ１］、配列番号：１２９もしくは１３０［ＤＫＫ２］、配列番号：１３３もしくは１３４［ＲＡＳＳＦ５］、配列番号：１３５もしくは１３６［ＮＴＮ１］、配列番号：１３９もしくは１４０［ＧＰＲ１４７］、配列番号：１４１もしくは１４２［ＮＥＵＲＯＧ３］、配列番号：１４３もしくは１４４［ＮＯＤＡＬ］、配列番号：１４５もしくは１４６［ＰＡＬＤ］、配列番号：１４７もしくは１４８［ＬＯＣ３９９７８３］、配列番号：１５１もしくは１５２［ＬＯＣ４４１３２０］、配列番号：１５３もしくは１５４［ＺＮＦ５９６］、配列番号：１５５もしくは１５６［ＴＤＨ］、配列番号：１５７もしくは１５８［ＡＳＡＨ１］、配列番号：１５９もしくは１６０［ＦＧＦ２０］、配列番号：１６１もしくは１６２［ＦＬＪ３６９８０］、配列番号：１６３もしくは１６４［ＧＦＲＡ２］、配列番号：１６５もしくは１６６［ＥＦＨＡ２］、配列番号：１７１もしくは１７２［ＫＩＦ１３Ｂ］、配列番号：１７３もしくは１７４［ＡＤＲＢ３］、配列番号：１７５もしくは１７６［ＮＲＧ１］、配列番号：１７７もしくは１７８［ＥＣＯＰ］、配列番号：１７９もしくは１８０［ＨＴＲ１Ａ］、配列番号：１８１もしくは１８２［ＩＳＬ２］、配列番号：１８３もしくは１８４［ＬＯＣ２８５６７１］、配列番号：１８５もしくは１８６［ＦＧＦ４］、配列番号：１８９もしくは１９０［ＨＥＭＫ１］、配列番号：１９１もしくは１９２［ＲＥＴ］、配列番号：１９３もしくは１９４［ＨＴＲＡ４］、配列番号：１９５［ＲＨＯＤ］、配列番号：１９６［ＴＮＦＳＦ１１］、配列番号：１９７［ＭＭＰ９］、及び配列番号：１９８［ＬＲＲＣ４９］
に基づく様々な部分的にメチル化された及び脱アミノ化された配列が挙げられ得る。
【００５０】
これらの標的は公知の配列（例えば、ＧＳＴＰ１、ＧＰＸ３、ＧＳＴＭ１、ＧＳＴＭ４、ＣＳＭＤ１、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ、ＳＦＲＰ１、ＳＦＲＰ２、ＤＫＫ３、ＰＴＧＳ２、ＣＤＫＮ１Ｃ／ｐ５７、ＲＡＳＳＦ１、及びＧＰＲ６２に関連する公知のＣｐＧアイランド）との併用で用いられ得る。例えば、配列番号：３１もしくは３２［ＣＳＭＤ１］、配列番号：４５もしくは４６［ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ］、配列番号：４７もしくは４８［ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ］、配列番号：２１もしくは２２［ＧＰＲ６２］中のこれらの遺伝子の一部に対して完全にメチル化された及び脱アミノ化された配列が提供される。また、例えば、標的配列としては、以下のゲノム配列
配列番号：１３１もしくは１３２［ＧＰＸ３］、配列番号：１２５もしくは１２６［ＧＰＸ７］、配列番号：１２７もしくは１２８［ＧＳＴＭ４］、配列番号：１３７もしくは１３８［ＳＦＲＰ２］、配列番号：１４９もしくは１５０［ＣＳＭＤ１］、配列番号：１６７もしくは１６８［ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ］、配列番号：１６９もしくは１７０［ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ］、及び配列番号：１８７もしくは１８８［ＧＰＲ６２］に基づく完全にもしくは部分的にメチル化され、（次に）脱アミノ化された配列が挙げられ得る。このような標的配列は当技術分野に公知の方法に従って単離もしくは精製され得る。
【００５１】
本発明はまた、上記の単離もしくは精製された核酸分子の内部の増幅配列に由来し、かつその増幅に適する、単離もしくは精製されたプライマーを提供する。単離もしくは精製されたプライマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡなどであり得る。しかし、１つの型の核酸は、特定の生物学的試料、ＣｐＧアイランドのメチル化アッセイに用いる方法論及びメチル化を検出するための特定の型の核酸の能力に依存して、別のものよりも好ましいものであり得ることは当業者に理解されるであろう。１以上（例、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０以上）の単離されたプライマー対が提供され得る。任意に、プライマーは本明細書に開示された方法に有用なキットの一部として提供される。プライマー対は、配列番号：５５及び５６、配列番号：５７及び５８、配列番号：５９及び６０、配列番号：６１及び６２、配列番号：６３及び６４、配列番号：６５及び６６、配列番号：６７及び６８、配列番号：６９及び７０、配列番号：７１及び７２、配列番号：７３及び７４、配列番号：７５及び７６、配列番号：７７及び７８、配列番号：７９及び８０、配列番号：８１及び８２、配列番号：８３及び８４、配列番号：８５及び８６、配列番号：８７及び８８、配列番号：８９及び９０、配列番号：９１及び９２、配列番号：９３及び９４、配列番号：９５及び９６、配列番号：９７及び９８、配列番号：９９及び１００、配列番号：１０１及び１０２、配列番号：１０３及び１０４、配列番号：１０５及び１０６、又は配列番号：１０７及び１０８から本質的になり得る。これらのプライマー対は、本発明に照らして使用するのに適するプライマーの例であることが理解される。例えば、それぞれのプライマーは１０〜４０ヌクレオチドの間であり得、同時にプライマー対は目的のＣｐＧアイランドにおいて１以上のＣｐＧヌクレオチドを含む少なくとも１０、２０、３０，４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１３０、１４０、１５０、２００、２５０、３００ｂｐの長さの領域に隣接し得る。これらのプライマー対は塩基の化学的修飾のような様々な方法で修飾され得、及び本発明に照らして今もなお有用であり得る。標的配列由来の他のプライマー、即ち配列番号：１〜５４及び１１９〜１９８、及びこれらの変異体もまた本発明に照らして用いられ得る。唯一の条件は、このようなプライマーが所定のＣｐＧアイランドのメチル化アッセイに機能することである。このように、例えば、プライマーがまだ本明細書に開示された遺伝子に関連するＣｐＧアイランドの修飾アッセイに適する限り、代わりのプライマーが選択可能であり、又は、与えられたプライマーを修飾し、一定の集団内の標的配列多型を説明するために縮重型で提供され得る。
【００５２】
標的配列のように、プライマー対は当技術分野に公知の方法に従って単離もしくは精製され得る。あるいは、これらは慣用の方法を用いて合成され得る。
【００５３】
プライマーはキットの一部であり得る。好ましくは、キットは少なくとも３つのプライマー対を含み、ここでそれぞれのプライマー対は異なる遺伝子に関連するＣｐＧアイランドに特異的である。しかし、キットは同じ遺伝子に関連する他のＣｐＧアイランドに対するプライマー対、又は４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７もしくはそれ以上の遺伝子に関連するＣｐＧアイランド増幅のためのプライマー対といった追加プライマー対を含み得る。キットはＣｐＧアイランドのメチル化についてアッセイするための１以上の試薬、使用に関する指示書、及び／又は典型的にキット中に見られる他の成分をさらに含み得る。例えば、キットは
（ａ）生物学的試料由来の標的配列を含むゲノムＤＮＡを単離する工程、
（ｂ）標的配列の一部を増幅する工程、及び／又は
（ｃ）標的配列を脱アミノ化する工程
に適するバッファを含み得る。前立腺癌の評価を対象とする実施形態において、キットは血清及び／もしくは尿試料由来のゲノムＤＮＡを準備するのに適する１以上のバッファを含み得る。
【実施例】
【００５４】
以下に実施例を用いて本発明を説明する。実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【００５５】
［実施例１］
本実施例は、メチル化特異的ＰＣＲ増幅に基づいたマーカーのメチル化状態の決定を行った。パラフィン包埋された前立腺組織を、前立腺全摘出術後に採取した。組織試料を２３の１０ミクロン切片に切断し、スライド１、１２及び２３はヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）を用いて染色した。Ｈ＆Ｅスライドを指針として用い、癌組織に相当する範囲を非染色スライドから顕微解剖した。残った組織は正常ペア試料として使用するために回収した。２回のキシレン抽出及び２回のエタノール洗浄を用いた脱パラフィンの後、５０℃で５日間の標準プロテイナーゼＫ消化、フェノール／クロロホルム抽出、及びエタノール沈殿によって、癌組織及び周囲の正常組織からＤＮＡを単離した(Current Protocols in Molecular Biology, edited by Ausubel, et al., Wiley-Interscience (New York 1988, revised 1988-2006))。ＤＮＡをＴＥ８で再懸濁し、ＤＮＡの質と量は、濃度及びサイズの標準を基準として用いたアガロースゲル電気泳動により評価した。０．３MのＮａＯＨ存在下で変性後、ＤＮＡを、５００μｌ当たり１μｇのＤＮＡ濃度で１ｍＭハイドロキノン存在下で、ｐＨ５．５の２．５Ｍメタ亜硫酸水素ナトリウムで処理した。反応物を、サーモサイクラー内で合計８サイクル（９５℃５分、５５℃１１５分）インキュベートした。
【００５６】
亜硫酸水素塩処理後、ＤＮＡはＱＩＡＥＸＩＩ精製キット(Qiagen, Valencia, CA)を用いて製造者の推奨に従って精製し、５０μｌのＴＥ８で溶出した。水酸化ナトリウム（２Ｎ ５．５μｌ）を添加し、ＤＮＡを室温で１５分インキュベートした。次に、ＤＮＡを３倍量のエタノール及び０．３倍量の５M ＮＨ４ＯＡＣで沈殿させた。ＤＮＡを５０μｌのＴＥ８に再懸濁し、−２０℃で保存した。
【００５７】
癌組織から単離したゲノムＤＮＡにおいて特定のＣｐＧ位置がメチル化されているかどうか決定するために、目的のＣｐＧアイランドの位置と重複するように設計したプライマーを用いてメチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。全てのＰＣＲ反応はマスターサイクラーサーモサイクラー(Eppendorf, Westbury, NY)で９５℃１５秒、６３℃３０秒、及び７２℃１０秒を４２サイクル行った。それぞれの反応は、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．２５ｍＭのｄＮＴＰＳ、各プライマー１２．５ｐｍｏｌずつ、及び０．５ユニットのPLATINUM Taq酵素(Invitrogen, Carlsbad CA)を含む１×PLATINUM Taq ＰＣＲバッファ３０μｌ中で行った。各ＣｐＧアイランドに用いたプライマー、産物のサイズを表１に示す（表中、「Ｆ」はフォワードプライマーを表し、「Ｒ」はリバースプライマーを表し、「ｍ」はメチル化を表し、「ｕ」は非メチル化を表す）。
【００５８】
【表１−１】
【００５９】
【表１−２】
【００６０】
ＰＣＲ反応産物を、８％アクリルアミドゲル上で分離した。プライマー内に存在する全てのＣｐＧアイランドでメチル化を示すテンプレートだけが、増幅反応に有効なテンプレートとなり得た。インビトロでＳＳ１（ＣｐＧ）メチラーゼ(NEB, Beverly, MA)を用いて製造者プロトコルに従ってメチル化された、完全にメチル化されたテンプレートを用いて、コントロール反応を行った。表１に記載した全プライマー対は、完全にメチル化されたコントロールテンプレートから正しいサイズの産物を生じた。２つのネガティブコントロール（水、及び白血球から単離したＤＮＡ）は、ＰＣＲ産物を生じない各ターゲットＰＣＲ増幅に含まれていた。ＤＮＡ試料中のＣｐＧアイランドがメチル化される場合、予想されたサイズの増幅産物を得た。本実施例は、上記プライマーを用いて前立腺癌のＣｐＧアイランドのメチル化のアッセイが可能であり、かつＣｐＧアイランドは前立腺癌でメチル化を示すことを明らかにした。
【００６１】
［実施例２］
本実施例は、ＤＮＡ塩基配列決定法によるＡＤＲＢ３遺伝子座におけるＣｐＧアイランドのメチル化状態の決定を示す。ＤＮＡは癌試料から得て、実施例１に記載した通り亜硫酸水素ナトリウムで処理する。亜硫酸水素塩処理したＤＮＡ２μｌは、以下のプライマー：
ADRB3-F1: GAGAAGAGGAAGGTAGAAGGAG［配列番号：２２１］ 及びADRB3-R1: CTACCTAACTATAACCAACCC ［配列番号：２２２］で、実施例１に記載した通り（但し、５５℃まで低くしたアニーリング温度は除く）４０サイクルで増幅する。増幅した２５０ｂｐの産物をQIA quick PCR精製キット(Qiagen, Valencia CA)を用いて精製し、ＴＥ８で回収する。BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kitを用いて、ADRB3-F2:ACGGAGGAGGATAGTAGTACG ［配列番号：２２３］を１．２５ｐｍｏｌ使用して、５０ｎｇＡＤＲＢ３増幅産物の配列を決定し、シークエンス反応物はCentri-Sep columns (Applied Biosystems) を用いて製造者のプロトコルに従って精製した。シークエンス反応産物は、ＡＢＩ３７００シークエンサーを用いて製造者の仕様書に従って解析した。得られたＤＮＡ配列は、元の癌ＤＮＡの中の完全にもしくは部分的にメチル化されたＣｐＧジヌクレオチドのシトシン残基部位におけるシトシン塩基もしくはシトシン／チミジン混合塩基と一致する１以上の配列ピークを示す。
【００６２】
あるいは、より詳細な配列解析は、ＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット (Invitrogen, Carlsbad CA)を用いて供給者のプロトコルに従って増幅反応産物をクローニングすることにより得られる。さらなる解析のため約２０コロニーを選抜する。各コロニーを３ｍｌのＬＢ培地で１６時間生育させる。１．５ｍｌアリコートからキアゲン製のplasmid preparation kitを用いてＤＮＡを単離する。プラスミドＤＮＡを分光光度計を用いて定量し、１μｇのアリコートを上述の通り配列解析する。２０の個々のクローンの配列は、どのシトシンがメチル化されるのかを決定するために及び癌試料においてメチル化の速度の評価を提供するために比較する。本実施例は、ＣｐＧアイランド内のシトシンのメチル化状態は、シークエンシングアプローチを用いて決定できることを示す。
【００６３】
［実施例３］
本実施例は、ターミネーター結合リニア増幅法によりＫＩＦＣ２、ＧＦＲＡ１及びＧＰＸ７に関連する複数のＣｐＧアイランドのメチル化パターンの決定を行う。実施例１で記載した通り準備した癌試料由来のＤＮＡから、ＫＩＦＣ２、ＧＦＲＡ１、ＧＰＸ７に関連するＣｐＧアイランドの断片を、それぞれのＣｐＧアイランドに対して以下に示したｍＦ１及びｍＲ１プライマーを用いて個々に増幅する。増幅反応は実施例１に記載した通り（但し、５８℃に下げたアニーリング温度は除く）４２サイクル行う。増幅反応物のアリコートは、適切な長さの断片が得られたことを確認するために８％アクリルアミドゲル上で分離する(ＫＩＦＣ２：２６４ｂｐ、ＧＦＲＡ１：３２６ｂｐ、ＧＰＸ７：３６７ｂｐ)。ＰＣＲ反応産物は、QIAQUICK PCR精製キット(Qiagen)を用いて精製した。
【００６４】
それぞれの増幅産物（２５ｎｇ）を、対応するアンプリコンに対して以下に示した蛍光標識されたＦ２プライマー１．５ｐｍｏｌを用いてリニアターミネーター結合増幅に供した。増幅反応液は、1× ＶｅｎｔＲ (exo-)ＤＮＡポリメラーゼ (New England Biolabs, Beverly MA)、 ３０μＭのｄＡＴＰ、３７μＭのｄＣＴＰ、１００μＭのｄＧＴＰ、１００μＭのｄＴＴＰ、４８０μＭのｄｄＣＴＰ及び2 ユニットのＶｅｎｔＲ (exo-)ＤＮＡポリメラーゼを含んでいる。反応は、マスターサイクラーサーモサイクラー(Eppendorf)で９５℃１５秒、５８℃３０秒、及び７２℃３０秒を３０サイクル行う。増幅後、反応産物をシングルチューブに回収し、Centri-Sep columns (Applied Biosystems)を用いて製造者のプロトコルに従って精製する。Genescan 500 LIZ スタンダード (Applied Biosystems)１μｌを１０分の１量の精製断片及び、the ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems)を用いて製造者の指示に従って単離したＤＮＡに加える。このデータはGENESCAN 及びGENEMAPPER ソフトウェア(Applied Biosystems)を用いて解析する。
【００６５】
増幅のために以下のプライマーを使用する。
【００６６】
KIFC2-F1: AGGTA(C/T)GTTGTATTTGGTGGATTTGG ［配列番号：２２４］
【００６７】
KIFC2-R1: CCCACCTACAACAACAACACC ［配列番号：２２５］
【００６８】
KIFC2-F2: 6FAM-GAACGCGTACGGAAGGTAGG ［配列番号：２２６］
【００６９】
GFRA1-F1: GTGATAGGTTTGTAGATTTGATAGTTG［配列番号：２２７］
【００７０】
GFRA1-R1: AACTAACCTCCATTTTAACTATTTC ［配列番号：２２８］
【００７１】
GFRA1-F2: NED-GAGAGATGAATTTGGATATTAGT ［配列番号：２２９］
【００７２】
GPX7-F1: GGTAAATTGGTGT(C/T)GTTGGAGAAG ［配列番号：２３０］
【００７３】
GPX7-R1: ACTAAACAATAATACCC(A/G)ACCTC ［配列番号：２３１］
【００７４】
GPX7-F2: VIC-GTCGTTGGGTTCGGTTTCGTTTTG ［配列番号：２３２］
【００７５】
Ｆ１及びＲ１プライマーは癌ＤＮＡ由来のＣｐＧアイランド断片の増幅のために使用する。Ｆ２プライマーはターミネーション結合リニア増幅のために使用する。
【００７６】
本実施例は、不完全な脱アミノ化は配列内のＣｐＧジヌクレオチドの位置から予測される長さとは異なる長さを有する断片をもたらすので、
（ｉ）目的の配列中のＣｐＧアイランドのメチル化シトシンの存在及び／又は位置の決定；並びに
（ｉｉ）脱アミノ化反応の効率に関する情報の提供
のために、ターミネーション結合リニア増幅断片長が解析され得ることを示す。
【００７７】
［実施例４］
本実施例は、ＣｐＧアイランドマーカーアッセイに利用可能なＤＮＡ量を増やすため、尿試料から回収したＤＮＡにメチル化結合全ゲノム増幅の使用を行う。尿試料は前立腺癌と最近診断された４人の患者から採取した。５０ｍｌの試料を４０００ｒｐｍで１５分スピンダウンし、１．５ｍｌチューブに移し、ＰＢＳで2回洗浄した。ＤＮＡをプロテイナーゼＫ消化(１００μｌの２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１００ ｍＭ ＮａＣＬ、1％ ＳＤＳ、5 ｍＭ ＥＤＴＡ及び１０μｇ プロテイナーゼＫ)を用いて抽出した後に、フェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿を行った。ＤＮＡをＴＥ８バッファ(１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１ ｍＭ ＥＤＴＡ)１０μｌで再懸濁した。
【００７８】
ＧＧＧＮ６配列を持つ部分的ランダムプライマー（５０ｎｇ）をＤＮＡ５μｌに添加した。変性溶液(５０ ｍＭ ＫＯＨ、０．１ ｍＭ ＥＤＴＡ)１２μｌをＤＮＡ／ランダムプライマー混合物に添加した。室温で５分間インキュベート後、反応液を中和させるために中和溶液(６０ｍＭ Ｔｒｉｓ (ｐＨ ７．５)、５０ ｍＭ ＨＣｌ)１２μｌを加えた。ＤＮＡ／プライマー混合物を９４℃で５分変性させ、室温で１０分インキュベートし、そして氷上に置いた。
【００７９】
示された最終濃度となるように以下の試薬を以下の方法に従って添加することで、増幅反応液を３０μｌの最終容量に合わせた。
【００８０】
（ａ）１Ｘ ＮＥＢ バッファ２ (１Ｘ ＮＥＢ ｂｕｆｆｅｒ ２: ５０ ｍＭ ＮａＣｌ、 １０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、 ｐＨ ７．９， １０ ｍＭ ＭｇＣｌ２、 １ ｍＭ ジチオスレイトール)、 ３３３μＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、１６０μＭ Ｓ−アデノシルメチオニン及び１０ ｎｇ／μｌ のウシ血清アルブミン(ＢＳＡ) を混合し、
【００８１】
（ｂ）ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ酵素１（０．１５ ｕｎｉｔｓ／μｌ） (New England Biolabs)を（ａ）に加え３７℃で１０分インキュベートし、かつ続いて
【００８２】
（ｃ）クレノウポリメラーゼを最終濃度が０．１６７ユニット／μｌになるように加え、かつクレノウエキソを最終濃度が０．１６７ユニット／μｌ（New England biolabs）になるように加えた。
【００８３】
反応液を３７℃で１６時間インキュベートし、最終濃度が５ｍＭになるようにＥＤＴＡを添加して反応を停止し、フェノール／クロロホルム抽出、及びエタノール沈殿を行った。ＤＮＡを４０μｌのＴＥ８で再懸濁し、２μｌはＤＮＡの存在を確認するためにアガロースゲル上で分離した。
【００８４】
ＤＮＡを亜硫酸水素ナトリウムで処理し、ＧＰＲ１４７及びＲＥＴアッセイを用いて実施例１に記載した通りにメチル化特異的ＰＣＲにより解析した。いずれかのマーカーに対する予想されたサイズのバンドの存在は、入力ＤＮＡにおいて関連マーカーのメチル化を示唆した。
【００８５】
本明細書で引用された文献、特許出願及び特許を含むすべての参考文献は、各文献が個々にかつ具体的に参照により組み込まれ、本明細書にその全体が説明されたのと同じ範囲まで参照により本明細書に組み込まれる。
【００８６】
「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」といった用語の使用及び発明の説明の文脈における類似指示（特に以下の請求項の文脈において）は、本明細書に示されたり、もしくは文脈から明確に矛盾している場合でない限り、単数形のみならず複数形にも及ぶと解釈される。本明細書の値の範囲の列挙は本明細書に示されない限り、単に、範囲内におさまる分けられた各々の値に対して個別に参照する簡略な方法として供することを意図し、分けられた各々の値は、本明細書に別々に列挙されたものとして明細書に組み込まれる。本明細書に説明された全ての方法は、本明細書で示されないもしくは文脈から明らかに矛盾していない限り、いかなる適する順序でも実行され得る。本明細書で提供されるいずれか及び全ての実施例、並びに模範的用語（例、such as）の使用は、単に発明をより明らかにするものであって、クレームされない限り発明の範囲の減縮をもたらさない。明細書内にない用語は、発明の実施に不可欠であるいかなるクレームされていない要素も示していると解釈すべきである。
【００８７】
本発明を実施するために本発明者らが知っているベストモードを含む本発明の好ましい態様は、本明細書に記載されている。説明された態様は単なる例示であって本発明の範囲を限定するものとして取り扱われるべきではないことを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１Ａ】配列番号：１のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図１Ｂ】配列番号：２のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図１Ｃ】配列番号：３のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図１Ｄ】配列番号：４のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図１Ｅ】配列番号：５のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図１Ｆ】配列番号：６のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図１Ｇ】配列番号：７及び８のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図１Ｈ】配列番号：９及び１０のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図１Ｉ】配列番号：１１及び１２のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図１Ｊ】配列番号：１３、１４及び１５のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図１Ｋ】配列番号：１６、１７及び１８のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図１Ｌ】配列番号：１９のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図１Ｍ】配列番号：２０のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図１Ｎ】配列番号：２１及び２２のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図１Ｏ】配列番号：２３、２４及び２５のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図１Ｐ】配列番号：２６及び２７のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図１Ｑ】配列番号：２８のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図１Ｒ】配列番号：２９及び３０のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図１Ｓ】配列番号：３１のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図１Ｔ】配列番号：３２及び３３のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図１Ｕ】配列番号：３４及び３５のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図１Ｖ】配列番号：３６及び３７のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図１Ｗ】配列番号：３８及び３９のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図１Ｘ】配列番号：４０及び４１のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図１Ｙ】配列番号：４２及び４３のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図１Ｚ】配列番号：４４、４５及び４６のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図１ＡＡ】配列番号：４７及び４８のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図１ＢＢ】配列番号：４９のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図１ＣＣ】配列番号：５０、５１及び５２のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図１ＤＤ】配列番号：５３及び５４のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２Ａ】配列番号：１１９及び１２０のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２Ｂ】配列番号：１２１、１２２、１２３及び１２４のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２Ｃ】配列番号：１２５、１２６及び１２７のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２Ｄ】配列番号：１２８、１２９、１３０及び１３１のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２Ｅ】配列番号：１３２、１３３及び１３４のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２Ｆ】配列番号：１３５のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２Ｇ】配列番号：１３６のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２Ｈ】配列番号：１３７及び１３８のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２Ｉ】配列番号：１３９及び１４０のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２Ｊ】配列番号：１４１及び１４２のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２Ｋ】配列番号：１４３のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２Ｌ】配列番号：１４４及び１４５のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２Ｍ】配列番号：１４６、１４７及び１４８のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２Ｎ】配列番号：１４９及び１５０のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２Ｏ】配列番号：１５１及び１５２のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２Ｐ】配列番号：１５３及び１５４のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２Ｑ】配列番号：１５５及び１５６のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２Ｒ】配列番号：１５７、１５８及び１５９のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２Ｓ】配列番号：１６０及び１６１のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２Ｔ】配列番号：１６２及び１６３のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２Ｕ】配列番号：１６４及び１６５のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２Ｖ】配列番号：１６６及び１６７のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２Ｗ】配列番号：１６８、１６９及び１７０のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２Ｘ】配列番号：１７１及び１７２のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２Ｙ】配列番号：１７３及び１７４のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２Ｚ】配列番号：１７５のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２ＡＡ】配列番号：１７６のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２ＢＢ】配列番号：１７７及び１７８のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２ＣＣ】配列番号：１７９、１８０及び１８１のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２ＤＤ】配列番号：１８２、１８３及び１８４のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２ＥＥ】配列番号：１８５のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２ＦＦ】配列番号：１８６及び１８７のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２ＧＧ】配列番号：１８８、１８９及び１９０のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２ＨＨ】配列番号：１９１，１９２及び１９３のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２ＩＩ】配列番号：１９４、１９５及び１９６のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２ＪＪ】配列番号：１９７のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２ＫＫ】配列番号：１９８のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本特許出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、２００５年１１月８日に出願された米国仮特許出願第６０／７３４５７７号の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
リン酸エステル結合シトシン−グアニン（ＣｐＧ）ジヌクレオチドは、哺乳類を含む高等真核生物のゲノムの中でも統計的に過小評価されている。このジヌクレオチドの予測頻度はわずか５〜１０％であることが分かったと報告されている。ヒトゲノム内に残っているＣｐＧジヌクレオチドの大部分は通常、低レベルの遺伝子発現を特徴とし、シトシン残基でメチル化を示す繰り返し配列内に位置している。
【０００３】
一方、ＣｐＧアイランドは、ＣｐＧジヌクレオチドのクラスターを含むゲノム配列を代表している。ＣｐＧアイランドはプロモーター領域もしくはコーディング配列の５’端と関連している可能性があり、又はイントロン内もしくはコーディング配列と関連していることが知られていないゲノム領域に存在する可能性がある。ＣｐＧアイランドは、正常な組織において非メチル化もしくはメチル化され、メチル化のパターンは組織特異的発現及びインプリンティング遺伝子の発現を調節するために用いられる可能性がある。プロモーター領域内のＣｐＧアイランドのメチル化は、結果として関連遺伝子の下方制御又はサイレンシングにつながり得る。正常には非メチル化されているアイランドのメチル化の増加は、ＤＮＡの全メチルシトシン含有量が低下するにも関わらず、老化組織で観察される。異常メチル化パターンは、様々な癌組織で検出される増加したメチル化もしくは過剰メチル化を有する癌細胞でより明白であった。ＣｐＧアイランドは、同じ組織内で異なる密度でメチル化される可能性がある。このように、ＣｐＧアイランド内のシトシンの異常なメチル化は、ＤＮＡ損傷修復、ホルモン応答、細胞周期調節及び腫瘍細胞粘着性／転移、腫瘍発生、進行及び転移の誘導といった重篤な細胞過程に含まれる遺伝子発現を抑制するために働く主要なエピジェネティックな事象となり得る(Li et al., Biochim. Biophys. Acta, 1704: 87−102 (2004))。プロモーターの過剰メチル化のユニークプロファイルは、それぞれのヒト癌（当該癌では、癌が共有する遺伝子変化もあれば、癌の型特異的な遺伝子変化もある）に存在すると提唱されてきた (Esteller et al., Cancer Res., 61: 3225−3229 (2001))。もし異常メチル化が、ゲノムＤＮＡにおいて正常に存在しない新しい情報を表し、異常メチル化が共通ＤＮＡ修飾であり、多くのゲノム標的に影響するのであれば、複数の標的ＣｐＧから得た情報に基づいた診断及び予後検査を開発することが実現可能である。このような検査は、病変組織において異常に過剰メチル化もしくは低メチル化されたＣｐＧに基づくことができる。これらは、その変化が癌の存在と相関する限り、ＣｐＧアイランドにおけるメチル化密度の変化にも基づくことができる。
【０００４】
例えば、最も一般的な悪性腫瘍であり、アメリカの男性の中で第２の主要な死亡原因である前立腺癌(Li et al. (2004), 上述)は、３０を超える遺伝子のプロモーター内ＣｐＧアイランド、特にグルタチオンＳ−トランスフェラーゼＰ１（ＧＳＴＰ１）遺伝子のＣｐＧアイランドのメチル化と関連していることが明らかになった。ＧＳＴＰ１のメチル化は、前立腺癌の患者の尿及び血漿から回収したＤＮＡの５０％を超えて検出された(Goessl et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 945: 51−58 (2001); Cairns et al., Clin. Cancer Res., 7: 2727−2730 (2001); Jeronimo et al., Urology, 60: 1131-1135 (2002); 及び Gonzalgo et al., Clin. Cancer Res., 9: 2673−2677 (2003))。しかし、もし前立腺癌の診断がＧＳＴＰ１遺伝子におけるＣｐＧアイランドのメチル化の検出にのみ頼っているのであれば、このような試験の感度の理論的限界は、約９０％の感度でしかないであろう。ＧＳＴＰ１は、前立腺上皮内病変（ＰＩＮ）においてもメチル化されるが、これは偽陽性の診断を導くかもおそれがある。いくつかのＣｐＧアイランドは、前立腺癌及び良性前立腺過形成（ＢＰＨ）といった他の前立腺疾患においてメチル化される。これらは、正常な老化前立腺でも、ある程度メチル化を示している。このような指標は個々の前立腺癌診断には適さない。したがって、指標のパネルは、臨床試験に必要な感度及び特異性を達成することが求められる。
【０００５】
前立腺特異的抗原すなわちＰＳＡ試験は、前立腺癌の早期発見に広く使用され続けている。ＰＳＡ試験は、無症状の男性で診断された前立腺癌症例の大多数となったが(Mettlin et al., Cancer, 83(8): 1679-1684 (1998a); Mettlin et al., Cancer, 82(2): 249-251 (1998b); Humphrey et al., J. Urol., 155: 816-820 (1996);及びGrossfeld et al., Epidemiol. Rev., 23(1): 173-180 (2001))、ＰＳＡ試験は、その感度は８３％と高かったにも関わらず、２．６ｎｇ／ｍｌのＰＳＡカットオフ値を用いた場合（Thompson et al.,N.Engl.J.Med.,350:2239-2246(2004)）、３３％という低い特異性に苦しんでいた。ＰＳＡ試験の低特異性は、ＢＰＨ及び前立腺炎といった他の前立腺疾患における上昇したＰＳＡ分泌の直接の結果である。このように、高いＰＳＡレベルは、針生検の形式で追加的スクリーニングの必要性を示唆している。最終的に、針生検の結果は、前立腺癌の診断をもたらす。
【０００６】
毎年１００万を越す前立腺の針生検がそれぞれ約１５００ドルの費用で行われており、患者にとってはとても不快なものである。しかし、これらのうち２０万未満が前立腺癌の診断結果である。したがって、針生検の大部分は必要以上に実施されている。
【０００７】
以上を考慮すると、現在利用可能な癌のスクリーニング方法に付随する費用と苦痛を軽減する、前立腺癌等の癌の非侵襲的診断及び予知方法が必要とされている。本発明の目的は、前立腺癌等の癌の非侵襲的診断及び予知のための材料及び方法を提供することにある。この目的及び他の目的及び効果、並びに追加の発明の特徴は、下記の発明の詳細な説明で明らかになるであろう。
【０００８】
発明の要約
本発明は癌の評価のための材料及び方法を提供する。評価方法としては、癌の診断及び予知方法並びに癌治療の効果の評価方法が挙げられ得る。提供される方法は、一般的に、特異的遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化についてアッセイする工程を含む。本発明はまた例えば、特異的遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化状態を増幅及び／又は検出するため、本発明の方法で用いられ得る単離又は精製されたプライマー対を提供する。本発明はまた、開示された方法において有用である１以上のプライマー対を含むキットを提供する。
【０００９】
本発明は、癌の指標となる１以上のメチル化されたＣｐＧアイランドについてアッセイすることによる癌の診断方法を提供する。一般的に、当該方法は、癌診断を必要とする被験者由来の生物学的試料を準備する工程、並びに：
ニューレグリン細胞表面リガンド（ＮＲＧ１）、アドレナリン作動Ｂ３レセプター（ＡＤＲＢ３）、グリコシルホスファチジルイノシトール細胞表面レセプター（ＧＦＲＡ２）、キネシンファミリーメンバー１３Ｂ（ＫＩＦ１３Ｂ）、ＲＥＴ原癌遺伝子（ＲＥＴ）、Ｇ−タンパク質共役タンパク質レセプター１４７（ＧＰＲ１４７）、ニューロゲニン３転写因子（ＮＥＵＲＯＧ３）、パラジン（予想タンパク質チロシンホスファターゼ）（ＰＡＬＤ）、メチルトランスフェラーゼファミリーメンバー１（ＨＥＭＫ１）、線維芽細胞成長因子４癌遺伝子（ＦＧＦ４）、５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）レセプター１Ａ（ＨＴＲ１Ａ）、リングフィンガータンパク質１８０（ＬＯＧ２８５６７１もしくはＲＮＦ１８０）、ＥＧＦＲ共増幅及び過剰発現（ＤＫＦＺＰ５６４Ｋ０８２２もしくはＥＣＯＰ）、亜鉛フィンガータンパク質５９６（ＺＮＦ５９６）、７回膜貫通型ヘリックスレセプター類似（ＬＯＣ４４１３２０）、Ｌ−トレオニンデヒドロゲナーゼ（ＴＤＨ）、仮想タンパク質ＦＬＪ３６９８０（ＦＬＪ３６９８０）、線維芽細胞成長因子レセプター２０（ＦＧＦ２０）、ＥＦ−ハンドドメインファミリーメンバー２Ａ（ＬＯＣ２８６０９７もしくはＥＦＨＡ２）、Ｎ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ（酸性セラミナーゼ）１（ＡＳＡＨ１）、ｎｏｄａｌホモログ（ＴＧＦ−βシグナル伝達経路）（ＮＯＤＡＬ）、亜鉛フィンガータンパク質５３２に類似の仮想タンパク質（ＬＯＣ３９９７８３）、転写因子ＬＩＭホメオドメイン（ＩＳＬ２）、キネシンファミリーメンバーＣ２（ＫＩＦＣ２）、クロモソーム２０オープンリーディングフレーム２３（キネシン様モータータンパク質）（Ｃ２０ｏｒｆ２３）、ＧＤＮＦファミリーレセプターアルファ１（ＧＦＲＡ１）、グルタチオンペルオキシダーゼ７（ＧＰＸ７）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆホモログ２（ＤＫＫ２）、ネトリン１（ＮＴＮ１）、マトリックスメタロペプチダーゼ９（ＭＭＰ９）、腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー１１（ＴＮＦＳＦ１１）、ｒａｓホモログ遺伝子ファミリーメンバーＤ（ＲＨＯＤ）、及び高ロイシン反復含有４９（ＬＲＲＣ４９）からなる群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子に関連する１以上のＣｐＧアイランドのメチル化について前記試料をアッセイする工程を含む。
【００１０】
本発明はまた、前立腺癌の指標となる１以上のメチル化されたＣｐＧアイランドについてアッセイすることによる、哺乳類のオスにおける前立腺癌の診断方法を提供する。当該方法としては、癌診断を必要とする被験者由来の生物学的試料を準備する工程、並びに：
ＮＲＧ１、ＡＤＲＢ３、ＧＦＲＡ２、ＫＩＦ１３Ｂ、ＲＥＴ、ＧＰＲ１４７、ＮＥＵＲＯＧ３、ＰＡＬＤ、ＨＥＭＫ１、ＦＧＦ４、ＨＴＲ１Ａ、ＲＮＦ１８０、ＥＣＯＰ、ＺＮＦ５９６、ＬＯＣ４４１３２０、ＴＤＨ、ＦＬＪ３６９８０、ＥＦＨＡ２、ＡＳＨＡ１、ＮＯＤＡＬ、ＬＯＣ３９９７８３、ＩＳＬ２、ＭＭＰ９、ＴＮＦＳＦ１１、ＲＨＯＤもしくはＬＲＲＣ４９からなる群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について前記試料をアッセイする工程が挙げられ得る。キネシンファミリーメンバーＣ２（ＫＩＦＣ２）、クロモソーム２０オープンリーディングフレーム２３（キネシン様モータータンパク質）（Ｃ２０ｏｒｆ２３）、ＧＤＮＦファミリーレセプターアルファ１（ＧＦＲＡ１）、グルタチオンペルオキシダーゼ７（ＧＰＸ７）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆホモログ２（ＤＫＫ２）、ネトリン１（ＮＴＮ１）、Ｒａｓ関連（ＲａｌＧＤＳ／ＡＦ−６）ドメインファミリー５（ＲＡＳＳＦ５）、及びＨｔｒＡセリンペプチダーゼ４（ＨＴＲＡ４）。任意に、前立腺癌の診断方法は、前立腺癌においてメチル化されることが知られているが、ＢＰＨにおいては検出可能にメチル化されないか、もしくは低レベル（例、約５０％以下、約４０％以下、約３０％以下、約２０％以下、もしくは約１０％以下）でメチル化されることが知られている少なくとも1つの遺伝子に関連する1以上のＣｐＧアイランドのメチル化についてアッセイする工程も含み得る。
【００１１】
本発明はまた、癌のグレードもしくはステージ、及び／又は、癌治療後の無病生存期間の長さの指標となる１以上の遺伝子のメチル化についてアッセイすることによる、癌の予知方法を提供する。一般的に、当該方法は、癌予後診断を必要とする被験者由来の生物学的試料を準備する工程、並びに：
ＮＲＧ１、ＡＤＲＢ３、ＧＦＲＡ２、ＫＩＦ１３Ｂ、ＲＥＴ、ＧＰＲ１４７、ＮＥＵＲＯＧ３、ＰＡＬＤ、ＨＥＭＫ１、ＦＧＦ４、ＨＴＲ１Ａ、ＲＮＦ１８０、ＤＫＦＺＰ５６４０８２２、ＺＮＦ５９６、ＬＯＣ４４１３２０、ＴＤＨ、ＦＬＪ３６９８０、ＦＧＦ２０、ＥＦＨＡ２、ＡＳＨＡ１、ＮＯＤＡＬ、ＬＯＣ３９９７８３、ＩＳＬ２、ＫＩＦＣ２、Ｃ２０ｏｒｆ２３、ＧＦＲＡ１、ＧＰＸ７、ＤＫＫ２、ＮＴＮ１、ＭＭＰ９、ＴＮＦＳＦ１１、ＲＨＯＤ及びＬＲＲＣ４９からなる群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について前記試料をアッセイする工程を含む。
【００１２】
さらに、本発明は、前立腺癌のグレードもしくはステージ、及び／又は前立腺癌治療後の無病生存期間の長さの指標となる1以上のメチル化されたＣｐＧアイランドについてアッセイすることによる、哺乳類のオスにおける前立腺癌の予知方法を提供する。当該方法は、哺乳類のオス由来の生物学的試料を準備する工程、並びに以下の遺伝子：
ＮＲＧ１、ＡＤＲＢ３、ＧＦＲＡ２、ＫＩＦ１３Ｂ、ＲＥＴ、ＧＰＲ１４７、ＮＥＵＲＯＧ３、ＰＡＬＤ、ＨＥＭＫ１、ＦＧＦ４、ＧＰＲ６２、ＨＴＲ１Ａ、ＲＮＦ１８０、ＤＫＦＺＰ５６４０８２２、ＺＮＦ５９６、ＬＯＣ４４１３２０、ＴＤＨ、ＦＬＪ３６９８０、ＦＧＦ２０、ＥＦＨＡ２、ＡＳＨＡ１、ＮＯＤＡＬ、ＬＯＣ３９９７８３、ＩＳＬ２、ＫＩＦＣ２、Ｃ２０ｏｒｆ２３、ＧＦＲＡ１、ＧＰＸ７、ＤＫＫ２、ＮＴＮ１、ＲＡＳＳＦ５、ＨＴＲＡ４、ＭＭＰ９、ＴＮＦＳＦ１１、ＲＨＯＤもしくはＬＲＲＣ４９の少なくとも1つに関連するＣｐＧアイランドのメチル化について前記試料をアッセイする工程を含む。任意に、前立腺癌の予知方法は、前立腺癌においてメチル化されることが知られているがＢＰＨにおいては検出可能にメチル化されないか、もしくは低レベル（例、約５０％以下、約４０％以下、約３０％以下、約２０％以下、もしくは約１０％以下）でメチル化されることが知られている少なくとも1つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について前記生物学的試料をアッセイする工程も含み得る。前記遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化は、癌のグレードもしくはステージ、及び／又は治療後の無病生存期間の長さの指標となる。
【００１３】
さらに、本発明は治療の効果の指標となるＣｐＧアイランドのメチル化の減少についてアッセイすることによる癌治療の効果の評価方法を提供する。一般的に、当該方法は、癌治療の効果の評価を必要とする被験者由来の第一及び第二生物学的試料を準備する工程、並びに：
ＮＲＧ１、ＡＤＲＢ３、ＧＦＲＡ２、ＫＩＦ１３Ｂ、ＲＥＴ、ＧＰＲ１４７、ＮＥＵＲＯＧ３、ＰＡＬＤ、ＨＥＭＫ１、ＦＧＦ４、ＨＴＲ１Ａ、ＲＮＦ１８０、ＤＫＦＺＰ５６４０８２２、ＺＮＦ５９６、ＬＯＣ４４１３２０、ＴＤＨ、ＦＬＪ３６９８０、ＦＧＦ２０、ＥＦＨＡ２、ＡＳＨＡ１、ＮＯＤＡＬ、ＬＯＣ３９９７８３、ＩＳＬ２、ＫＩＦＣ２、Ｃ２０ｏｒｆ２３、ＧＦＲＡ１、ＧＰＸ７、ＤＫＫ２、ＮＴＮ１、ＭＭＰ９、ＴＮＦＳＦ１１、ＲＨＯＤ及びＬＲＲＣ４９からなる群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化レベルにおける変化について前記試料をアッセイする工程を含む。第一生物学的試料を、第二生物学的試料の前に採取し、かつ第二生物学的試料を治療コース中又は治療コース後に採取する。第二試料（即ち、治療コース後）におけるアッセイされた１以上のＣｐＧアイランドのメチル化の減少もしくは欠如は、治療が有効であることを示す。あるいは、第二試料におけるアッセイされたＣｐＧアイランド中のメチル化の維持もしくは増加は、治療効果の減少もしくは欠如を示し得る。
【００１４】
また、本発明は、治療コース中に哺乳類のオスから定期的に採取した生物学的試料をＣｐＧアイランドのメチル化についてアッセイすることによる、哺乳類のオスにおける前立腺癌治療の効果の評価方法を提供し、ここで、治療コース後のＣｐＧアイランドのメチル化の減少もしくは欠如は、治療が有効であることを示す。当該方法は、
（ａ）癌の治療コースを受けている被験者由来の第一及び第二生物学的試料を準備する工程、ここで、第一生物学的試料を第二生物学的試料よりも早い時期に採取し、第二生物学的試料を治療コース中又は治療コース後に採取する、並びに
（ｂ）：ＮＲＧ１、ＡＤＲＢ３、ＧＦＲＡ２、ＫＩＦ１３Ｂ、ＲＥＴ、ＧＰＲ１４７、ＮＥＵＲＯＧ３、ＰＡＬＤ、ＨＥＭＫ１、ＦＧＦ４、ＨＴＲ１Ａ、ＲＮＦ１８０、ＤＫＦＺＰ５６４０８２２、ＺＮＦ５９６、ＬＯＣ４４１３２０、ＴＤＨ、ＦＬＪ３６９８０、ＦＧＦ２０、ＥＦＨＡ２、ＡＳＨＡ１、ＮＯＤＡＬ、ＬＯＣ３９９７８３、ＩＳＬ２、ＫＩＦＣ２、Ｃ２０ｏｒｆ２３、ＧＦＲＡ１、ＧＰＸ７、ＤＫＫ２、ＮＴＮ１、ＲＡＳＳＦ５、ＨＴＲＡ４、ＭＭＰ９、ＴＮＦＳＦ１１、ＲＨＯＤ及びＬＲＲＣ４９からなる群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について前記試料をアッセイする工程を含む。任意に、本方法は、前立腺癌においてメチル化されることが知られているがＢＰＨにおいては検出可能にメチル化されないか、もしくは低レベル（例、約５０％以下、約４０％以下、約３０％以下、約２０％以下、もしくは約１０％以下）でメチル化される少なくとも1つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について前記生物学的試料をアッセイする工程も含み得る。
【００１５】
好ましい実施形態において、前述の診断方法、予知方法及び癌治療の効果の評価方法は、複数のＣｐＧアイランドのメチル化について前記生物学的試料をアッセイする工程をさらに含み得、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１以上の遺伝子に関連するＣｐＧアイランドである。
【００１６】
さらに、本発明は、ＣｐＧアイランドのメチル化状態を決定するターミネーター結合リニア増幅法を提供する。一般的に、当該方法は、ターミネーター結合リニア増幅のためのＤＮＡ試料を準備する工程及び、続いて脱アミノ化条件下でＤＮＡ試料をインキュベートする工程を含み、それにより脱アミノ化ＤＮＡ試料が生成される。任意に、脱アミノ化ＤＮＡ試料が精製され得る。脱アミノ化試料は、１以上のＣｐＧアイランドもしくは前記１以上のＣｐＧの一部を含む標的配列（単数もしくは複数）を増幅するためにテンプレートとして用いられ、それにより１以上の増幅標的配列が生成される。任意に、１以上の増幅標的配列が精製される。増幅標的配列中の１以上の配列は、プライマー及びジデオキシヌクレオチド存在下で、異なる長さの１以上の断片を複数生成するためにリニア増幅され、ここで、それぞれの長さはプライマーの５’末端からジデオキシヌクレオチドが取り込まれた位置までの塩基の距離と一致する。任意に、前記１以上の断片が精製される。１以上の断片はそれらの長さを決定するため単離され解析される。かつ、断片長は、１以上の増幅標的配列内のメチル化シトシンのメチル化状態を決定するために用いられる。
【００１７】
本発明はまた、本明細書に記載された遺伝子に関連するＣｐＧアイランドの増幅に適するプライマー対を提供する。プライマーとしては、標的配列を包含するＣｐＧアイランドの増幅に適している単離もしくは精製された核酸分子が挙げられ得る。標的配列としては、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４３、配列番号：４４、配列番号：４９、配列番号：５０、配列番号：５１、配列番号：５２、配列番号：５３、及び配列番号：５４における配列などの完全にメチル化されている及び完全に脱アミノ化されているゲノム配列が挙げられ得る。
【００１８】
プライマー対の例としては、配列番号：５５及び５６、配列番号：５７及び５８、配列番号：５９及び６０、配列番号：６１及び６２、配列番号：６３及び６４、配列番号：６５及び６６、配列番号：６７及び６８、配列番号：６９及び７０、配列番号：７１及び７２、配列番号：７３及び７４、配列番号：７７及び７８、配列番号：７９及び８０、配列番号：８１及び８２、配列番号：８３及び８４、配列番号：８７及び８８、配列番号：８９及び９０、配列番号：９１及び９２、配列番号：９３及び９４、配列番号：９５及び９６、配列番号：９７及び９８、配列番号：１０３及び１０４、配列番号：１０５及び１０６、配列番号：１０７及び１０８、配列番号：１０９及び１１０、配列番号：１１１及び１１２、配列番号：１１３及び１１４、配列番号：１１５及び１１６、配列番号：１１７及び１１８、配列番号：１９９及び２００、配列番号：２０１及び２０２、配列番号：２０３及び２０４、配列番号：２０５及び２０６、配列番号：２０７及び２０８、配列番号：２０９及び２１０、配列番号：２１１及び２１２、配列番号：２１３及び２１４、配列番号：２１５及び２１６、配列番号：２１７及び２１８、配列番号：２１９及び２２０、配列番号：２２１及び２２２、配列番号：２２４及び２２５、配列番号：２２７及び２２８、配列番号：２３０及び２３１が挙げられる。
【００１９】
また、本発明は１以上の前述のプライマー対を含むキットを提供する。
【発明の詳細な説明】
【００２０】
本発明は、癌の指標となる１以上のＣｐＧアイランドのメチル化についてアッセイすることによる、癌の診断方法を提供する。癌としては、例えば、肺、肝臓、膵臓、頭頸部、咽喉、甲状腺、食道、脳、卵巣、腎臓、皮膚、結腸直腸、及び造血関連（例、リンパ腫及び白血病）癌が挙げられ得る。一般的に、当該方法は、癌診断を必要とする被験者由来の生物学的試料を準備する工程、並びに：
ＮＲＧ１、ＡＤＲＢ３、ＧＦＲＡ２、ＫＩＦ１３Ｂ、ＲＥＴ、ＧＰＲ１４７、ＮＥＵＲＯＧ３、ＰＡＬＤ、ＨＥＭＫ１、ＦＧＦ４、ＨＴＲ１Ａ、ＲＮＦ１８０、ＤＫＦＺＰ５６４０８２２、ＺＮＦ５９６、ＬＯＣ４４１３２０、ＴＤＨ、ＦＬＪ３６９８０、ＦＧＦ２０、ＥＦＨＡ２、ＡＳＨＡ１、ＮＯＤＡＬ、ＬＯＣ３９９７８３、ＩＳＬ２、ＫＩＦＣ２、Ｃ２０ｏｒｆ２３、ＧＦＲＡ１、ＧＰＸ７、ＤＫＫ２、ＮＴＮ１、ＭＭＰ９、ＴＮＦＳＦ１１、ＲＨＯＤもしくはＬＲＲＣ４９からなる群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について前記試料をアッセイする工程を含む。好ましい実施形態において、当該方法は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１以上の前述の遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化についてアッセイする工程を含み得る。これらの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化は癌の指標となる。
【００２１】
本発明はさらに、哺乳類のオスにおける前立腺癌の指標となる１以上のＣｐＧアイランドのメチル化についてアッセイすることによる、前立腺癌の診断方法を提供する。１つの実施形態において、当該方法は、癌診断を必要とする哺乳類のオス由来の生物学的試料を準備する工程、並びに：
ＮＲＧ１、ＡＤＲＢ３、ＧＦＲＡ２、ＫＩＦ１３Ｂ、ＲＥＴ、ＧＰＲ１４７、ＮＥＵＲＯＧ３、ＰＡＬＤ、ＨＥＭＫ１、ＦＧＦ４、ＨＴＲ１Ａ、ＲＮＦ１８０、ＤＫＦＺＰ５６４０８２２、ＺＮＦ５９６、ＬＯＣ４４１３２０、ＴＤＨ、ＦＬＪ３６９８０、ＦＧＦ２０、ＥＦＨＡ２、ＡＳＨＡ１、ＮＯＤＡＬ、ＬＯＣ３９９７８３、ＫＩＦＣ２、Ｃ２０ｏｒｆ２３、ＧＦＲＡ１、ＧＰＸ７、ＤＫＫ２、ＮＴＮ１、ＲＡＳＳＦ５、ＨＴＲＡ４、ＭＭＰ９、ＴＮＦＳＦ１１、ＲＨＯＤ及びＬＲＲＣ４９からなる群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について前記試料をアッセイする工程を含む。例えば、前立腺癌の診断方法は、ＮＲＧ１、ＫＩＦ１３Ｂもしくは両方に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について前記生物学的試料をアッセイする工程を含む。別の例において、当該方法は：
ＴＧＤＨ、ＡＳＡＨ１、ＦＧＦ２０、ＨＥＭＫ１、ＰＡＬＤ、ＮＥＵＲＯＧ、ＥＦＨＡ２、ＫＩＦＣ２、ＧＦＲＡ１、ＤＫＫ２、ＴＮＦＳＦ１１、ＮＴＮ１、及びＲＨＯＤからなる群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化についてアッセイする工程を含む。好ましい実施形態において、前立腺癌の診断方法は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１以上の前述の遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化についてアッセイする工程を含み得る。これらの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化は癌の指標となる。
【００２２】
前述の前立腺癌の診断方法は、前述の遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化についてアッセイする工程と組み合わせて、さらに
（ｉ）前立腺癌においてメチル化されること、及び
（ｉｉ）ＢＰＨにおいては検出可能にメチル化されないか、もしくは低レベル（例、約５０％以下、約４０％以下、約３０％以下、約２０％以下、もしくは約１０％以下）でメチル化されること
が知られている少なくとも1つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について前記生物学的試料をアッセイする工程を任意に含み得る。この点において、前立腺癌においてメチル化されることが知られているが、ＢＰＨにおいては検出可能にメチル化されないか、もしくは低レベルでメチル化されることが知られている少なくとも１つのＣｐＧアイランドについてアッセイする工程を含む場合、当該方法は、好ましくは、少なくとも３つの異なる遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について前記生物学的試料をアッセイする工程を含む。前立腺癌においてメチル化されるが、ＢＰＨにおいては検出可能にメチル化されないか、もしくは低レベルでメチル化されることが知られているＣｐＧアイランドの例としては、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼＰ１（ＧＳＴＰ１）、グルタチオンペルオキシダーゼ３（ＧＰＸ３）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼＭ１（ＧＳＴＭ１）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼＭ４（ＧＳＴＭ４）、Ｃｕｂ及びＳｕｓｈｉ複数ドメイン１（ＣＳＭＤ１）、腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリーメンバー１０Ａ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ）、腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリーメンバー１０Ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ）、腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリーメンバー１０Ｃ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ）、腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリー１０Ｄ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ）、分泌ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質１（ＳＦＲＰ１）、分泌ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質２（ＳＦＲＰ２）、ｄｉｃｋｋｏｐｆホモログ３（ＤＫＫ３）、プロスタグランジン−エンドペルオキシドシンターゼ２（ＰＴＧＳ２）、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子１Ｃ（ＣＤＫＮ１Ｃ／ｐ５７）、Ｒａｓ関連（ＲａｌＧＤＳ／ＡＦ−６）ドメインファミリー１（ＲＡＳＳＦ１）、及びＧタンパク質共役レセプター６２（ＧＰＲ６２）に関連するＣｐＧアイランドが挙げられる。
【００２３】
本発明はまた、癌のグレードもしくはステージ、及び／又は癌治療後の無病生存期間の長さの指標となる１以上の遺伝子のメチル化についてアッセイすることによる、癌の予知方法を提供する。一般的に、当該方法は、癌の予知を必要とする被験者由来の生物学的試料を準備する工程、並びに：
ＮＲＧ１、ＡＤＲＢ３、ＧＦＲＡ２、ＫＩＦ１３Ｂ、ＲＥＴ、ＧＰＲ１４７、ＮＥＵＲＯＧ３、ＰＡＬＤ、ＨＥＭＫ１、ＦＧＦ４、ＨＴＲ１Ａ、ＲＮＦ１８０、ＤＫＦＺＰ５６４０８２２、ＺＮＦ５９６、ＬＯＣ４４１３２０、ＴＤＨ、ＦＬＪ３６９８０、ＦＧＦ２０、ＥＦＨＡ２、ＡＳＡＨ１、ＮＯＤＡＬ、ＬＯＣ３９９７８３、ＩＳＬ２、ＫＩＦＣ２、Ｃ２０ｏｒｆ２３、ＧＦＲＡ１、ＧＰＸ７、ＤＫＫ２、ＮＴＮ１、ＭＭＰ９、ＴＮＦＳＦ１１、ＲＨＯＤ、及びＬＲＲＣ４９からなる群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について前記試料をアッセイする工程を含む。好ましい実施形態において、当該方法は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１以上の前述の遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化についてアッセイする工程を含み得る。これらの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化は、癌のグレードもしくはステージ、及び／又は癌治療後の無病生存期間の長さの指標となる。
【００２４】
本発明はまた、前立腺癌のグレードもしくはステージ、及び／又は前立腺癌の治療後の無病生存期間の長さの指標となる１以上のＣｐＧアイランドのメチル化についてアッセイすることによる、哺乳類のオスにおける前立腺癌の予知方法を提供する。１つの実施形態において、当該方法は、以下の遺伝子：
ＮＲＧ１、ＡＤＲＢ３、ＧＦＲＡ２、ＫＩＦ１３Ｂ、ＲＥＴ、ＧＰＲ１４７、ＮＥＵＲＯＧ３、ＰＡＬＤ、ＨＥＭＫ１、ＦＧＦ４、ＨＴＲ１Ａ、ＲＮＦ１８０、ＤＫＦＺＰ５６４０８２２、ＺＮＦ５９６、ＬＯＣ４４１３２０、ＴＤＨ、ＦＬＪ３６９８０、ＦＧＦ２０、ＥＦＨＡ２、ＡＳＡＨ１、ＮＯＤＡＬ、ＬＯＣ３９９７８３、もしくはＩＳＬ２の少なくとも１つに関連するＣｐＧアイランドのメチル化について哺乳類のオス由来の前記生物学的試料をアッセイする工程を含む。加えて、もしくは前述に代えて、当該方法は、以下の遺伝子：
ＫＩＦＣ２、Ｃ２０ｏｒｆ２３、ＧＦＲＡ１、ＧＰＸ７、ＤＫＫ２、ＮＴＮ１、ＲＡＳＳＦ５、ＨＴＲＡ４、ＭＭＰ９、ＴＮＦＳＦ１１、ＲＨＯＤもしくはＬＲＲＣ４９の少なくとも１つに関連するＣｐＧアイランドのメチル化について前記生物学的試料をアッセイする工程を含み得る。例えば、前立腺癌の診断方法は、ＮＲＧ１、ＫＩＦ１３Ｂ、もしくは両方に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について前記生物学的試料をアッセイする工程を含む。別の例において、当該方法は、以下の遺伝子：
ＴＧＤＨ、ＡＳＡＨ１、ＦＧＦ２０、ＨＥＭＫ１、ＰＡＬＤ、ＮＥＵＲＯＧ、ＥＦＨＡ２、ＫＩＦＣ２、ＧＦＲＡ１、ＤＫＫ２、ＴＮＦＳＦ１１、ＮＴＮ１、もしくはＲＨＯＤの少なくとも１つについてアッセイする工程を含む。好ましい実施形態において、前立腺の診断方法は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１以上の前述の遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化についてアッセイする工程を含み得る。これらの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化は、前立腺癌のグレードもしくはステージ、及び／又は前立腺癌の治療後の無病生存期間の長さの指標となる。
【００２５】
前述の前立腺癌の予知方法は、前述の遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化についてアッセイする工程と組み合わせ、さらに
（ｉ）前立腺癌においてメチル化されること、及び
（ｉｉ）ＢＰＨにおいては検出可能にメチル化されないか、もしくは低レベル（例、約５０％以下、約４０％以下、約３０％以下、約２０％以下、もしくは約１０％以下）でメチル化されること
が知られている少なくとも1つの遺伝子に関連する1以上のＣｐＧアイランドのメチル化について前記生物学的試料をアッセイする工程、任意に含み得る。ＢＰＨにおけるメチル化レベルの割合とは、その遺伝子座でいくらかの検出可能なメチル化レベルを示す患者の割合をいう。この点において、当該方法は、前立腺癌においてメチル化されることが知られているが、ＢＰＨにおいては検出可能にメチル化されないか、もしくは低レベルでメチル化されることが知られている少なくとも１つのＣｐＧアイランドのメチル化についてアッセイする工程を含む場合、当該方法は、好ましくは、少なくとも３つの異なる遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について前記生物学的試料をアッセイする工程を含む。前立腺癌においてメチル化されるが、ＢＰＨにおいては検出可能にメチル化されないか、もしくは低レベルでメチル化されることが知られているＣｐＧアイランドの例としては、ＧＳＴＰ１、ＧＰＸ３、ＧＳＴＭ１、ＧＳＴＭ４、ＣＳＭＤ１、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ、ＳＦＲＰ１、ＳＦＲＰ２、ＤＫＫ３、ＰＴＧＳ２、ＣＤＫＮ１Ｃ／ｐ５７、ＲＡＳＳＦ１及びＧＰＲ６２に関連するＣｐＧアイランドが挙げられる。この遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化は、前立腺癌のグレードもしくはステージ、及び／又は前立腺癌の治療後の無病生存期間の長さの指標となる。
【００２６】
癌の治療コースを選択している場合は、癌の悪性度、そのグレード、及びそのステージについて情報を得ることが役に立つ。ＣｐＧメチル化のパターンは腫瘍の病理学的ステージ及びグレードと相関関係を示し得る。例えば、前立腺癌において、ＣｐＧメチル化のパターンは、原発腫瘍のグリソンスコア、及び癌のステージと相関関係を示し得る。ＣｐＧのメチル化から得られた分子情報は、生存の見込み及び治療後の無病生存期間の長さとも相関関係を示し得る。上記の診断方法は、癌のコースの予測並びに治療への最良のアプローチを可能にし得る。
【００２７】
また、本発明は治療の効果の指標となるＣｐＧアイランドのメチル化の減少についてアッセイすることによる、癌治療の効果の評価方法を提供する。一般的に、当該方法は、癌治療の効果の評価を必要とする被験者由来の第一及び第二生物学的試料を準備する工程、並びに：
ＮＲＧ１、ＡＤＲＢ３、ＧＦＲＡ２、ＫＩＦ１３Ｂ、ＲＥＴ、ＧＰＲ１４７、ＮＥＵＲＯＧ３、ＰＡＬＤ、ＨＥＭＫ１、ＦＧＦ４、ＨＴＲ１Ａ、ＲＮＦ１８０、ＤＫＦＺＰ５６４０８２２、ＺＮＦ５９６、ＬＯＣ４４１３２０、ＴＤＨ、ＦＬＪ３６９８０、ＦＧＦ２０、ＥＦＨＡ２、ＡＳＨＡ１、ＮＯＤＡＬ、ＬＯＣ３９９７８３、ＩＳＬ２、ＫＩＦＣ２、Ｃ２０ｏｒｆ２３、ＧＦＲＡ１、ＧＰＸ７、ＤＫＫ２、ＮＴＮ１、ＭＭＰ９、ＴＮＦＳＦ１１、ＲＨＯＤ及びＬＲＲＣ４９からなる群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化レベルにおける変化について前記試料をアッセイする工程を含む。一般的に、第一生物学的試料を第二生物学的試料の前に採取し（例、治療開始前もしくは治療中）、かつ第二生物学的試料を治療コース後に採取する。好ましい実施形態において、当該方法は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１以上の前述の遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化における変化についてアッセイする工程を含む。第二試料（即ち、治療コース後）におけるアッセイされた１以上のＣｐＧアイランドのメチル化の減少もしくは欠如は、治療が有効であることを示す。あるいは、第二試料でのアッセイされたＣｐＧアイランドにおけるメチル化の維持もしくは増加は、治療効果の減少もしくは欠如を示し得る。
【００２８】
本発明は、前立腺癌治療の効果を示すＣｐＧアイランドのメチル化の減少についてアッセイすることによる、哺乳類のオスにおける前立腺癌治療の効果の評価方法を提供する。１つの実施形態において、当該方法は：
ＮＲＧ１、ＡＤＲＢ３、ＧＦＲＡ２、ＫＩＦ１３Ｂ、ＲＥＴ、ＧＰＲ１４７、ＮＥＵＲＯＧ３、ＰＡＬＤ、ＨＥＭＫ１、ＦＧＦ４、ＨＴＲ１Ａ、ＲＮＦ１８０、ＤＫＦＺＰ５６４０８２２、ＺＮＦ５９６、ＬＯＣ４４１３２０、ＴＤＨ、ＦＬＪ３６９８０、ＦＧＦ２０、ＥＦＨＡ２、ＡＳＨＡ１、ＮＯＤＡＬ、ＬＯＣ３９９７８３、及びＩＳＬ２からなる群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について、治療コース中に哺乳類のオスから定期的に採取する生物学的試料をアッセイする工程を含む。加えて、もしくは前述に代えて、当該方法は：
ＫＩＦＣ２、Ｃ２０ｏｒｆ２３、ＧＦＲＡ１、ＧＰＸ７、ＤＫＫ２、ＮＴＮ１、ＲＡＳＳＦ５、ＨＴＲＡ４、ＭＭＰ９、ＴＮＦＳＦ１１、ＲＨＯＤ及びＬＲＲＣ４９からなる群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子に関するＣｐＧアイランドのメチル化について前記生物学的試料をアッセイする工程を含み得る。例えば、前立腺癌治療の効果の評価方法は、ＮＲＧ１、ＫＩＦ１３Ｂ、もしくは両方に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について前記生物学的試料をアッセイする工程を含む。別の例においては、当該方法は：
ＴＧＤＨ、ＡＳＡＨ１、ＦＧＦ２０、ＨＥＭＫ１、ＰＡＬＤ、ＮＥＵＲＯＧ、ＥＦＨＡ２、ＫＩＦＣ２、ＧＦＲＡ１、ＤＫＫ２、ＴＮＦＳＦ１１、ＮＴＮ１、及びＲＨＯＤからなる群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドについてアッセイする工程を含む。好ましい実施形態において、当該方法は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１以上の前述の遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化についてアッセイする工程を含み得る。一般的に、当該方法においてアッセイされる生物学的試料としては、第一及び第二生物学的試料が挙げられる。第一生物学的試料は、例えば、治療開示前もしくは治療中、しかしいずれにしても第二生物学的試料の採取より前に採取し得る。第二生物学的試料は、治療コース中もしくは治療コース後に採取する。第一試料と比較して、第二試料（即ち、治療コース後）におけるアッセイされた１以上のＣｐＧアイランドのメチル化の減少もしくは欠如は、治療が有効であることを示す。あるいは、第一試料と比較して、第二試料でのアッセイされたＣｐＧアイランドにおけるメチル化の維持もしくは増加は、治療効果の減少もしくは欠如を示し得る。
【００２９】
前述の前立腺癌治療の効果の評価方法は、前述の遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化についてアッセイする工程と組み合わせて、さらに
（ｉ）前立腺癌においてメチル化されること、及び
（ｉｉ）ＢＰＨにおいては検出可能にメチル化されないか、もしくは低レベル（例、約５０％以下、約４０％以下、約３０％以下、約２０％以下、もしくは約１０％以下）でメチル化されること
が知られている少なくとも1つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化の減少について前記生物学的試料をアッセイする工程を、任意に含み得る。この点において、当該方法は、前立腺癌においてメチル化されることが知られているが、ＢＰＨにおいては検出可能にメチル化されないか、もしくは低レベルでメチル化されることが知られている少なくとも１つのＣｐＧアイランドのメチル化について前記生物学的試料をアッセイする工程を含む場合、当該方法は、好ましくは、少なくとも３つの異なる遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化についてアッセイする工程を含む。前立腺癌においてメチル化されるが、ＢＰＨにおいては検出可能にメチル化されないか、もしくは低レベルでメチル化されることが知られているＣｐＧアイランドの例としては、ＧＳＴＰ１、ＧＰＸ３、ＧＳＴＭ１、ＧＳＴＭ４、ＣＳＭＤ１、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ、ＳＦＲＰ１、ＳＦＲＰ２、ＤＫＫ３、ＰＴＧＳ２、ＣＤＫＮ１Ｃ／ｐ５７、ＲＡＳＳＦ１、及びＧＰＲ６２が挙げられる。第一試料と比較して、いくつかの、もしくは全ての治療コースの後の第二試料におけるアッセイされた遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化の減少もしくは欠如は、治療が有効であることを示す。あるいは、第一試料と比較して、第二試料でのアッセイされたＣｐＧアイランドにおけるメチル化の維持もしくは増加は、治療効果の減少もしくは欠如を示し得る。
【００３０】
ＣｐＧアイランド(Bird, Nature 321: 209-213 (1986)；及びGardiner-Garden et al., J. Molec. Biol. 196: 261-282 (1987))は、脊椎動物ゲノムの約１％を構成し、全ＣｐＧヌクレオチド数の約１５％を占める。ＣｐＧアイランドは典型的に約０．２〜約２．０ｋｂの間の長さである。これらは関連遺伝子のコーディング配列の上流に（例、プロモーターもしくはエンハンサー領域中に）位置し得、又は、これらはその関連遺伝子の遺伝子コーディング領域にも広がり、もしくは遺伝子コーディング領域内で見られ得る。遺伝子コーディング領域としては、エキソン及びイントロンが挙げられ得る。遺伝子に対するＣｐＧアイランドの関係を説明するための「関連する」という語句の使用は、遺伝子コーディング配列の上流であるＣｐＧアイランド並びに内部ＣｐＧアイランドを包含することを意図する。例えば、ＲＥＴ遺伝子に関連するＣｐＧアイランドは内部にあり、メチル化されたときＲＥＴ遺伝子の発現に影響を及ぼすことを期待されない。いくつかのＣｐＧアイランドは２つの遺伝子のプロモーターに関連し、それは両方の遺伝子の発現に作用し得る。ＣｐＧは、最も近傍にある遺伝子に対するそれらの位置に基づき標識された。ある場合には、ＣｐＧアイランドは２つの異なる遺伝子のプロモーター付近に位置し得、この場合、両方の遺伝子の発現に影響を与え得る。このような場合、ＣｐＧアイランドは両遺伝子のうち１つに由来して命名した。例えば、ＬＲＲＣ４９ＣｐＧアイランドはＴＨＡＰドメイン含有１０（ＴＨＡＰ１０）遺伝子にも関連する。ＣｐＧアイランドは偽遺伝子にも関連し得、又は、既知の遺伝子もしくは偽遺伝子を含まない遺伝子領域に位置し得る。ＣｐＧアイランドは、そのメチル化状態が疾病状態と相関関係がある限り、まだ関心が持たれ得る。
【００３１】
ＣｐＧアイランドは、最も近傍にある遺伝子の転写開始部位から最大で２５キロベース（ｋｂ）まで（例、２０ｋｂまで、１９ｋｂまで、１８ｋｂまで、１７ｋｂまで、１６ｋｂまで、１５ｋｂまで、１０ｋｂまで、９ｋｂまで、８ｋｂまで、７ｋｂまで、６ｋｂまで、５ｋｂまで、４ｋｂまで、３ｋｂまで、２ｋｂまで、１ｋｂまで）分離され得、いまだ当該遺伝子に「関連する」と見なされ得る。好ましくは、少なくとも３つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドがアッセイされる。しかし、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７もしくはそれ以上の遺伝子に関連するＣｐＧアイランドはアッセイされ得る。
【００３２】
ＣｐＧアイランドの同定方法が記載されてきた。（例、Takai et al., Proc. Nat’l. Assoc. Sci. USA, 99:3740-3745 (2002)）。例えば、ゲノム配列は、少なくとも２００ｂｐの長さで、少なくとも６０％のＧＣ含有量を有し、かつ少なくとも７％のＣｐＧジヌクレオチドを含むＣｐＧアイランドを包含する配列を同定するために解析され得る。好ましい配列は、少なくとも２５０ｂｐの長さであり、少なくとも６０％の高ＧＣであり、かつ少なくとも７％のＣｐＧヌクレオチドを包含する。さらに、望ましくない高頻度繰り返し配列は、配列を除去するリピートマスカー（repeat masker）を用いて排除され得る。望ましい配列は、同定されたＣｐＧアイランドの長さ内に５０％未満の繰り返し（即ち、複雑性を低減した配列もしくは多数の遺伝子座において存在する配列）を包含する。好ましくは、ＣｐＧアイランドは４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、もしくは１１％未満の繰り返しである。もっとも望ましい配列は１０％未満の繰り返しである。繰り返し配列の例は、例えば、国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)のウェブサイトにおいて入手可能である。
【００３３】
「生物学的試料」は、ＣｐＧアイランドメチル化の正確なアッセイを可能にする任意の適する試料を包含することを意図する。適する生物学的試料の例としては、全血、血漿、血清、尿、唾液、細胞（例、上皮細胞のような血液から採取した細胞）、及び組織が挙げられるが、これに限定されない。このような試料は当技術分野で周知の方法に従って得られる。生物学的試料が全血、血漿もしくは尿の場合、好ましくは、３つより多い遺伝子に関連するＣｐＧアイランドをアッセイする。
【００３４】
ＣｐＧアイランドがメチル化されないか、もしくは用いたアッセイ法の検出感度水準に満たないレベルでメチル化された場合、ＣｐＧアイランドは「検出可能にメチル化されない」。
【００３５】
「非癌性の」組織は良性もしくは正常であり得る。あるいは、しかし好ましくないことに、癌性でない限り、組織は罹患し得る。
【００３６】
ＣｐＧアイランドのメチル化アッセイの方法は当技術分野で公知であり、例えば、サザンブロット解析と併用されるメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによる消化を用いるような制限酵素に基づく技術、メチル化感受性の任意にプライムしたＰＣＲ（ＡＰ−ＰＣＲ；例、Gonzalgo et al., Cancer Res., 57: 594-599 (1997)を参照）といったメチル化感受性酵素とポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、制限ランドマークゲノムスキャニング法（ＲＬＧＳ；例、Plass et al., Genomic 58: 254-262 (1999)を参照）、メチル化ＣｐＧアイランド増幅（ＭＣＡ；例、Toyota et al., Cancer Res., 59: 2307-2312 (1999)を参照）、示差メチル化ハイブリダイゼーション（ＤＭＨ；例、Huang et al., Human Mol. Genet., 8: 459-470 (1999)を参照）、及び、ＮｏｔＩに基づく示差メチル化ハイブリダイゼーション（例、特許協力条約出願公開第ＷＯ ０２／０８６１６３号）が挙げられる。他の方法は米国特許出願公開第２００３／０１７０６８４号及び特許協力条約出願公開第ＷＯ ０４／０５１２２号に記載される。
【００３７】
あるいは、シトシン変換に基づいた技術が用いられ得る。このような技術は、ＤＮＡ配列解析後の単離ゲノムＤＮＡもしくはその断片内でのＣｐＧアイランドの化学的修飾依存性メチル化状態（即ち、ＣｐＧアイランドにおける非メチル化シトシンの脱アミノ化）に依存する。このような方法はヒドラジン及び亜硫酸水素塩のような試薬を用いる。アルカリ加水分解後の亜硫酸水素塩処理は、Olek et al., Nucl. Acids Res., 24: 5064-5066 (1996)；及びFrommer et al., PNAS USA, 89: 1827-1831 (1992)に記載される。単離ゲノムＤＮＡにおけるＣｐＧアイランドのメチル化アッセイのためのメチル化感受性プライマーの使用は、Herman et al., PNAS USA, 93: 9821-9826 (1996)、並びに米国特許第５７８６１４６号及び第６２６５１７１号に記載される。亜硫酸水素塩処理ＤＮＡは、次いで、ＰＣＲ増幅、蛍光ベースのリアルタイムＰＣＲ（例、Eads et al., Cancer Res., 59: 2302-2306 (1999); Heid et al., Genome Res., 6: 986-994 (1996)；及び米国特許第６３３１３９３号を参照）、シーケンシング、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション検出、並びにメチル化感受性シングルヌクレオチドプライマー伸長（Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ；例、 Gonzalgo et al., Nucl. Acids Res., 25: 2529-2531 (1997)； 及び 米国特許第６２５１５９４号を参照）といった従来の分子技術により解析され得る。
【００３８】
ＣｐＧアイランドのメチル化についてアッセイする好ましい方法としては、生物学的試料からゲノムＤＮＡ（及び／もしくはその断片）を単離する工程、非メチル化シトシンをウラシルに変換する脱アミノ化状態下でＤＮＡを処理する工程、目的のＣｐＧアイランドを含む標的配列を増幅するためのＰＣＲ反応におけるテンプレートとして処理ＤＮＡを用いる工程を含み、それにより増幅配列が生成される。脱アミノ化処理によりウラシルに変換される標的配列中の非メチル化シトシンは、増幅配列の相当する位置でチミンとして増幅される。ＣｐＧアイランドのフォワード及びリバース鎖の配列は、脱アミノ化反応後その相補性を失うので、ＣｐＧアイランドのメチル化状態は目的の鎖をアニールできるプライマーを用いて、オリジナル鎖の片側もしくは両側をアッセイすることにより決定され得る。
【００３９】
脱アミノ化反応は完了まで進まないかも知れず、これは結果として擬陽性となる。例えば、亜硫酸水素塩を用いたＤＮＡ配列の脱アミノ化は、ＤＮＡの精度、インキュベーションの長さ、及び変性したテンプレートの二次構造に感受性である。定量的ＰＣＲ法は脱アミノ化の効果についてアッセイするために用いられ得る。しかし定量的ＰＣＲ法はプライマー及びプローブがテンプレートに対してアニールする部位内の変換状態のアッセイに限定される。
【００４０】
定量的ＰＣＲ法はまた、プライマー及びプローブがテンプレートに対してアニールする部位内のシトシンのメチル化についてのアッセイに限定される。プライマー及びプローブは、適切なシトシンヌクレオチドにおいて完全に変換されメチル化を包含するテンプレートに対して効果的にアニールするのみである。このように、これらはアッセイされていないＣｐＧジヌクレオチドに関するメチル化情報を提供できない。ＣｐＧアイランドはまた、脱アミノ化処理後に直接配列決定を用いて解析され得る。しかし、ＣｐＧアイランド内のメチル化パターンの不均一性及び配列内のホモポリマー状伸長の存在に依存して、ＣｐＧアイランドの直接配列決定は、利用可能なシークエンシングソフトウェアに対して非常にノイズが多く複雑であるシークエンシングパターンをもたらし得る。
【００４１】
臨床検査のためにこれらの不都合を克服し、解析の全コストを最小限に抑えるために、我々は、ターミネーション結合リニア増幅による増幅配列を解析するための方法を開発した。ｄＮＴＰ及びジデオキシシチジンもしくはジデオキシグアニンのような１つもしくは２つのジデオキシヌクレオチド存在下で、フォワードもしくはリバースプライマーを用いてＤＮＡをリニア増幅する。増幅配列は、チミン及び／もしくはシトシンヌクレオチドにおいて（逆鎖をアッセイする場合、又は、グアニン及び／もしくはアデニンにおいて）終了する伸長反応産物を作るため、メチル化されたＣｐＧジヌクレオチドについてアッセイするとき、チミン及び／もしくはシトシンターミネーター（又は、目的のＣｐＧジヌクレオチドと反対の増幅鎖を解析する場合のアデニン及び／もしくはグアニンターミネーター）のみを用いて、任意に、解析され得る。増幅反応は、多数の長さを有する、断片の生成をもたらし、それぞれの長さは、増幅に用いられたプライマーと、増幅反応に添加したジデオキシヌクレオチドに相補的であるヌクレオチドの標的配列内の位置との間の塩基の距離に一致する。このような増幅は、１００〜１５０ｂｐのＣｐＧアイランド含有アンプリコンの平均から、１０〜２０の断片の生成をもたらし得る。伸長産物をアクリルアミドゲル上でサイズごとに分離して、
（ａ）サイズ標準と比較し、及び／又は、
（ｂ）当該断片と完全に非メチル化された（ＰＣＲがテンプレートもしくは大腸菌におけるクローン）もしくは完全にメチル化された（ｉｎ ｖｉｔｒｏで酵素的にメチル化された）テンプレートが生成したものとを比較することにより、それにより、増幅ＣｐＧアイランド包含配列において、シトシン（もしくは逆鎖におけるグアニン）の存在又は、チミン（もしくは逆鎖におけるアデニン）の存在が決定され得る。亜硫酸水素塩を脱アミノ化剤として用いるとき、増幅配列は、増幅の間、ＤＮＡポリメラーゼスリップに依存する添加断片をもたらし得る、チミンもしくはアデニンの大きな伸長を包含し得る。このような「スタッター（ｓｔｕｔｔｅｒ）」パターンは、より短いホモポリマー配列を有するＣｐＧアイランドのセグメントを選択的に解析することにより最小限に抑えられ得る。スタッター断片はまた、コントロールテンプレート解析により同定され得る。
【００４２】
蛍光ラベルを用いてターミネーター結合リニア増幅で使用するタグプライマーもしくはジデオキシヌクレオチドに標識するとき、得られる断片は自動化されたシークエンシングマシン及びＤＮＡ断片のサイズを決定するために設計されたソフトウェアを用いて解析され得る。この点において、GENESCAN （Applied Biosystems, Foster City, CA）及びGENEMAPPER （Applied Biosystems）といった市販の利用可能なソフトウェアを、マイクロサテライト反復の増幅の間、ＤＮＡポリメラーゼスリップに依存するスタッターパターンを認識し、明らかにするためにトレーニングする。このようなソフトウェアは、ＣｐＧアイランドの亜硫酸水素塩変換後に見られ得るように、ＤＮＡのホモポリマー伸長を増幅するとき観察されるスタッターパターンを明らかにするためにも用いられ得る。ＤＮＡの自動化解析に利用可能な多くの蛍光染色があり、例えば、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、ＶＩＣ染料、５−カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、スクシンイミジルエステル（５−ＲＯＸ）、６−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）などが挙げられるが、これに限定されない。アンプリコンサイズを決定する方法及び装置は１０年以上もの間利用されており、遺伝子リンケージマッピング、ＤＮＡ同定、及び法医学において用いられてきた。例えば、アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）は、ＡＢＩシークエンサーで４つの別々の増幅反応由来の多重断片に用いられ得る５つの染料及びリンケージマッピングにおいて用いる１つのスタンダードのセットを有する。単一個体由来の４つの異なるＣｐＧアイランドは蛍光タグプライマーを用いてリニア増幅され、反応物は解析前に保存され得る。あるいは、異なる個体由来の異なるＣｐＧアイランドは蛍光タグプライマーを用いてリニア増幅され、反応物は解析前に保存され得る。
【００４３】
試料（即ち、ＣｐＧ配列が不均一である）における特定のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化が常に完全ではないことから、本明細書に記述された方法は、試料内の特定のＣｐＧジヌクレオチド部位のメチル化の割合の程度を解析するために有利に用いられ得る。好ましい方法において、蛍光ジデオキシシークエンシング反応において２つの異なる蛍光染色ターミネーターは、それぞれチミン及びシトシン（もしくは、逆鎖を解析するとき、それぞれアデニン及びグアニン）に用いられる。同サイズ伸長産物における２つの染色の相対存在量は、特定の配列位置における２つのヌクレオチドの相対存在量の指標であり、それによりＣｐＧアイランド内の特定のＣｐＧジヌクレオチド部位のメチル化の割合を示唆し得る。予想される２つの染色の相対存在量を決定するために、完全に非メチル化されたテンプレートに対する完全にメチル化されたテンプレートの公知の比率の範囲でコントロール反応を使用することができる。コントロール反応から得たデータは、試料中のメチル化及び非メチル化シトシンの相対存在量を見積もるための基準として用いられ得る。
【００４４】
所定のＣｐＧアイランドにおけるメチル化のレベルもしくはメチル化のパターンは、必要に応じてアッセイされ得る。このアッセイは、必要に応じて、異常メチル化の決定を可能にするために、参照基準を用い得る。参照基準は隣接組織の年齢を適合させた非癌性のクラスから得た基準試料に基づき、正常末梢血リンパ球を用いて決定され得る。例えば、治療の効果が評価されているとき、治療コースを引き継いだ生物学的試料の結果についてのアッセイは、参照基準の使用無しに比較され得る。
【００４５】
生物学的試料から得たＤＮＡが限られた量であり、複数マーカーの解析に十分でないとき、本明細書に記述された方法は、試料由来のＤＮＡを増幅する工程を含み得る。増幅は、ＰＣＲ増幅もしくは等温増幅法を用いて行われ得、例えばこれらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている米国特許第５８５４０３３号、 第６１２４１２０号、第６１４３４９５号、第６２１０８８４号、第６６４２０３４号、第６２８０９４９号、第６６３２６０９号及び第６６４２０３４号、並びに 米国特許出願公開第２００３／００３２０２４号、第２００３／０１４３５３６号、第２００３／０２３５８４９号、第２００４／００６３１４４号及び第２００４／０２６５８９７号に記載されている。等温増幅としては、ローリングサークルもしくは鎖置換増幅が挙げられ得る。ＰＣＲ及び等温増幅を組み合わせる方法もまた記載されている（それぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれている米国特許第６７７７１８７号、及び第６８２８０９８号又は、米国特許出願第２００４／０２０９２９８号、第２００５／００３２１０４号及び第２００６／００６８３９４号）。参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、米国特許出願第２００５／０２０２４９０号は、ＤＮＡのメチル化パターンを研究するためにメチル化感受性制限酵素と併用したこのような方法の使用を記載する。参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、米国特許出願１１／４０２６８１号（２００６年４月１１日出願）に記載されたように、ＤＮＡ増幅としてはまた、必要なＤＮＡを生成するためにメチル化結合全ゲノム増幅が挙げられ得る。メチル化結合全ゲノム増幅は、ＤＮＡが微小な生物学的試料又は尿もしくは血漿といった体液から回収されるとき、特に有利であり得る。
【００４６】
当業者は、本明細書に記載された様々な増幅方法、例、ＰＣＲ増幅、等温増幅、及びターミネーション結合リニア増幅法が、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログ誘導体、及び／又はこれらの組み合わせを用い得ることを、正しく理解するだろう。
【００４７】
必要に応じて、ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルをアッセイし得、これらの発現レベルにおける変化は、所定のＣｐＧアイランドにおけるメチル化レベルもしくはメチル化パターンにおける変化の指標となり得る。このようなｍＲＮＡ及びタンパク質レベルのアッセイの方法も当技術分野の技術の範囲内である。例えば、参照により本明細書に組み込まれている、２００５年５月８日に出願された米国仮特許出願第６０／７０５９６４号及び２００６年４月８日に出願された特許協力条約出願第ＰＣＴ／ＵＳ／３０７２１号に記載された、ｍＲＮＡアッセイ方法が用いられ得る。分解した組織試料を生物学的試料として用いるとき、このような方法は特に有用である。あるいは、遺伝子特異的プライマーを用いた逆転写は、ｍＲＮＡレベルをアッセイするために用いられ得る。タンパク質レベルは、例えば、抗体及び染色技術を用いてアッセイされ得る。
【００４８】
ＣｐＧアイランドの異常メチル化が、関連遺伝子の発現に影響し得るとしても、本明細書に記載されている方法が過剰メチル化の生物学的役割に依存していないことに言及することは重要である。それは、遺伝子発現に影響があるにも関わらず、過剰メチル化されたＣｐＧアイランドは本発明の方法において有用であり得るということである。したがって、唯一の条件は、ＣｐＧアイランドのメチル化状態と癌の存在との間に相関関係があることである。
【００４９】
本発明はさらに、上記の方法において有用である標的配列及び相当するプライマーもしくはプローブを提供する。標的配列は、メチル化についてアッセイするためのＣｐＧアイランドの選抜に対する背景を提供する。所定の標的配列が１より多くのＣｐＧアイランドを包含するとき、全てもしくはそれより少ないＣｐＧアイランド、1つのＣｐＧヌクレオチドですら、その特定の標的配列に関するメチル化についてアッセイされ得る。この点において、標的配列としては、完全にメチル化された、及び完全に脱アミノ化された配列番号：１もしくは２［ＮＲＧ１］、配列番号：３もしくは４［ＡＤＲＢ３］、配列番号：５もしくは６［ＧＦＲＡ２］、配列番号：７もしくは８［ＫＩＦ１３Ｂ］、配列番号：９もしくは１０［ＲＥＴ］、配列番号：１１もしくは１２［ＧＰＲ１４７］、配列番号：１３もしくは１４［ＮＥＵＲＯＧ３］、配列番号：１５もしくは１６［ＰＡＬＤ］、配列番号：１７もしくは１８［ＨＥＭＫ１］、配列番号：１９もしくは２０［ＦＧＦ４］、配列番号：２３もしくは２４［ＨＴＲ１Ａ］、配列番号：２５もしくは２６［ＲＮＦ１８０］、配列番号：２７もしくは２８［ＥＣＯＰ］、配列番号：２９もしくは３０［ＺＮＦ５９６］、配列番号：３３もしくは３４［ＬＯＣ４４１３２０］、配列番号：３５もしくは３６［ＴＤＨ］、配列番号：３７もしくは３８［ＦＬＪ３６９８０］、配列番号：３９もしくは４０［ＦＧＦ２０］、配列番号：４１もしくは４２［ＥＦＨＡ２］、配列番号：４３もしくは４４［ＡＳＡＨ１］、配列番号：４５もしくは４６又は配列番号：４９もしくは５０［ＮＯＤＡＬ］、配列番号：５１もしくは５２［ＬＯＣ３９９７８３］、配列番号：５３もしくは５４［ＩＳＬ２］といったゲノム配列が挙げられ得る。これらの完全にメチル化された及び脱アミノ化された配列は、例証目的のために用いられ、本発明の方法における部分的メチル化及び脱アミノ化配列の使用を除外しない。標的配列としては、腫瘍から得たＤＮＡにおけるような部分的にメチル化され、その結果、標的が上記に挙げた配列と異なるように脱アミノ化されるゲノム配列が挙げられ得る。当業者は、部分的にメチル化された及び脱アミノ化されたＣｐＧアイランドを含む標的配列は、１以上のＣｐＧジヌクレオチドにおけるシトシン残基と一致する１以上の位置において異なるＤＮＡ分子集団をもたらすであろうことを、正しく理解するだろう。このように、標的配列としては、以下のゲノム配列
配列番号：１１９もしくは２２０［ＫＩＦＣ２］、配列番号：１２１もしくは１２２［Ｃ２０ＰＲＦ２３］、配列番号：１２３もしくは１２４［ＧＦＲＡ１］、配列番号：１２９もしくは１３０［ＤＫＫ２］、配列番号：１３３もしくは１３４［ＲＡＳＳＦ５］、配列番号：１３５もしくは１３６［ＮＴＮ１］、配列番号：１３９もしくは１４０［ＧＰＲ１４７］、配列番号：１４１もしくは１４２［ＮＥＵＲＯＧ３］、配列番号：１４３もしくは１４４［ＮＯＤＡＬ］、配列番号：１４５もしくは１４６［ＰＡＬＤ］、配列番号：１４７もしくは１４８［ＬＯＣ３９９７８３］、配列番号：１５１もしくは１５２［ＬＯＣ４４１３２０］、配列番号：１５３もしくは１５４［ＺＮＦ５９６］、配列番号：１５５もしくは１５６［ＴＤＨ］、配列番号：１５７もしくは１５８［ＡＳＡＨ１］、配列番号：１５９もしくは１６０［ＦＧＦ２０］、配列番号：１６１もしくは１６２［ＦＬＪ３６９８０］、配列番号：１６３もしくは１６４［ＧＦＲＡ２］、配列番号：１６５もしくは１６６［ＥＦＨＡ２］、配列番号：１７１もしくは１７２［ＫＩＦ１３Ｂ］、配列番号：１７３もしくは１７４［ＡＤＲＢ３］、配列番号：１７５もしくは１７６［ＮＲＧ１］、配列番号：１７７もしくは１７８［ＥＣＯＰ］、配列番号：１７９もしくは１８０［ＨＴＲ１Ａ］、配列番号：１８１もしくは１８２［ＩＳＬ２］、配列番号：１８３もしくは１８４［ＬＯＣ２８５６７１］、配列番号：１８５もしくは１８６［ＦＧＦ４］、配列番号：１８９もしくは１９０［ＨＥＭＫ１］、配列番号：１９１もしくは１９２［ＲＥＴ］、配列番号：１９３もしくは１９４［ＨＴＲＡ４］、配列番号：１９５［ＲＨＯＤ］、配列番号：１９６［ＴＮＦＳＦ１１］、配列番号：１９７［ＭＭＰ９］、及び配列番号：１９８［ＬＲＲＣ４９］
に基づく様々な部分的にメチル化された及び脱アミノ化された配列が挙げられ得る。
【００５０】
これらの標的は公知の配列（例えば、ＧＳＴＰ１、ＧＰＸ３、ＧＳＴＭ１、ＧＳＴＭ４、ＣＳＭＤ１、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ、ＳＦＲＰ１、ＳＦＲＰ２、ＤＫＫ３、ＰＴＧＳ２、ＣＤＫＮ１Ｃ／ｐ５７、ＲＡＳＳＦ１、及びＧＰＲ６２に関連する公知のＣｐＧアイランド）との併用で用いられ得る。例えば、配列番号：３１もしくは３２［ＣＳＭＤ１］、配列番号：４５もしくは４６［ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ］、配列番号：４７もしくは４８［ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ］、配列番号：２１もしくは２２［ＧＰＲ６２］中のこれらの遺伝子の一部に対して完全にメチル化された及び脱アミノ化された配列が提供される。また、例えば、標的配列としては、以下のゲノム配列
配列番号：１３１もしくは１３２［ＧＰＸ３］、配列番号：１２５もしくは１２６［ＧＰＸ７］、配列番号：１２７もしくは１２８［ＧＳＴＭ４］、配列番号：１３７もしくは１３８［ＳＦＲＰ２］、配列番号：１４９もしくは１５０［ＣＳＭＤ１］、配列番号：１６７もしくは１６８［ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ］、配列番号：１６９もしくは１７０［ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ］、及び配列番号：１８７もしくは１８８［ＧＰＲ６２］に基づく完全にもしくは部分的にメチル化され、（次に）脱アミノ化された配列が挙げられ得る。このような標的配列は当技術分野に公知の方法に従って単離もしくは精製され得る。
【００５１】
本発明はまた、上記の単離もしくは精製された核酸分子の内部の増幅配列に由来し、かつその増幅に適する、単離もしくは精製されたプライマーを提供する。単離もしくは精製されたプライマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡなどであり得る。しかし、１つの型の核酸は、特定の生物学的試料、ＣｐＧアイランドのメチル化アッセイに用いる方法論及びメチル化を検出するための特定の型の核酸の能力に依存して、別のものよりも好ましいものであり得ることは当業者に理解されるであろう。１以上（例、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０以上）の単離されたプライマー対が提供され得る。任意に、プライマーは本明細書に開示された方法に有用なキットの一部として提供される。プライマー対は、配列番号：５５及び５６、配列番号：５７及び５８、配列番号：５９及び６０、配列番号：６１及び６２、配列番号：６３及び６４、配列番号：６５及び６６、配列番号：６７及び６８、配列番号：６９及び７０、配列番号：７１及び７２、配列番号：７３及び７４、配列番号：７５及び７６、配列番号：７７及び７８、配列番号：７９及び８０、配列番号：８１及び８２、配列番号：８３及び８４、配列番号：８５及び８６、配列番号：８７及び８８、配列番号：８９及び９０、配列番号：９１及び９２、配列番号：９３及び９４、配列番号：９５及び９６、配列番号：９７及び９８、配列番号：９９及び１００、配列番号：１０１及び１０２、配列番号：１０３及び１０４、配列番号：１０５及び１０６、又は配列番号：１０７及び１０８から本質的になり得る。これらのプライマー対は、本発明に照らして使用するのに適するプライマーの例であることが理解される。例えば、それぞれのプライマーは１０〜４０ヌクレオチドの間であり得、同時にプライマー対は目的のＣｐＧアイランドにおいて１以上のＣｐＧヌクレオチドを含む少なくとも１０、２０、３０，４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１３０、１４０、１５０、２００、２５０、３００ｂｐの長さの領域に隣接し得る。これらのプライマー対は塩基の化学的修飾のような様々な方法で修飾され得、及び本発明に照らして今もなお有用であり得る。標的配列由来の他のプライマー、即ち配列番号：１〜５４及び１１９〜１９８、及びこれらの変異体もまた本発明に照らして用いられ得る。唯一の条件は、このようなプライマーが所定のＣｐＧアイランドのメチル化アッセイに機能することである。このように、例えば、プライマーがまだ本明細書に開示された遺伝子に関連するＣｐＧアイランドの修飾アッセイに適する限り、代わりのプライマーが選択可能であり、又は、与えられたプライマーを修飾し、一定の集団内の標的配列多型を説明するために縮重型で提供され得る。
【００５２】
標的配列のように、プライマー対は当技術分野に公知の方法に従って単離もしくは精製され得る。あるいは、これらは慣用の方法を用いて合成され得る。
【００５３】
プライマーはキットの一部であり得る。好ましくは、キットは少なくとも３つのプライマー対を含み、ここでそれぞれのプライマー対は異なる遺伝子に関連するＣｐＧアイランドに特異的である。しかし、キットは同じ遺伝子に関連する他のＣｐＧアイランドに対するプライマー対、又は４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７もしくはそれ以上の遺伝子に関連するＣｐＧアイランド増幅のためのプライマー対といった追加プライマー対を含み得る。キットはＣｐＧアイランドのメチル化についてアッセイするための１以上の試薬、使用に関する指示書、及び／又は典型的にキット中に見られる他の成分をさらに含み得る。例えば、キットは
（ａ）生物学的試料由来の標的配列を含むゲノムＤＮＡを単離する工程、
（ｂ）標的配列の一部を増幅する工程、及び／又は
（ｃ）標的配列を脱アミノ化する工程
に適するバッファを含み得る。前立腺癌の評価を対象とする実施形態において、キットは血清及び／もしくは尿試料由来のゲノムＤＮＡを準備するのに適する１以上のバッファを含み得る。
【実施例】
【００５４】
以下に実施例を用いて本発明を説明する。実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【００５５】
［実施例１］
本実施例は、メチル化特異的ＰＣＲ増幅に基づいたマーカーのメチル化状態の決定を行った。パラフィン包埋された前立腺組織を、前立腺全摘出術後に採取した。組織試料を２３の１０ミクロン切片に切断し、スライド１、１２及び２３はヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）を用いて染色した。Ｈ＆Ｅスライドを指針として用い、癌組織に相当する範囲を非染色スライドから顕微解剖した。残った組織は正常ペア試料として使用するために回収した。２回のキシレン抽出及び２回のエタノール洗浄を用いた脱パラフィンの後、５０℃で５日間の標準プロテイナーゼＫ消化、フェノール／クロロホルム抽出、及びエタノール沈殿によって、癌組織及び周囲の正常組織からＤＮＡを単離した(Current Protocols in Molecular Biology, edited by Ausubel, et al., Wiley-Interscience (New York 1988, revised 1988-2006))。ＤＮＡをＴＥ８で再懸濁し、ＤＮＡの質と量は、濃度及びサイズの標準を基準として用いたアガロースゲル電気泳動により評価した。０．３MのＮａＯＨ存在下で変性後、ＤＮＡを、５００μｌ当たり１μｇのＤＮＡ濃度で１ｍＭハイドロキノン存在下で、ｐＨ５．５の２．５Ｍメタ亜硫酸水素ナトリウムで処理した。反応物を、サーモサイクラー内で合計８サイクル（９５℃５分、５５℃１１５分）インキュベートした。
【００５６】
亜硫酸水素塩処理後、ＤＮＡはＱＩＡＥＸＩＩ精製キット(Qiagen, Valencia, CA)を用いて製造者の推奨に従って精製し、５０μｌのＴＥ８で溶出した。水酸化ナトリウム（２Ｎ ５．５μｌ）を添加し、ＤＮＡを室温で１５分インキュベートした。次に、ＤＮＡを３倍量のエタノール及び０．３倍量の５M ＮＨ４ＯＡＣで沈殿させた。ＤＮＡを５０μｌのＴＥ８に再懸濁し、−２０℃で保存した。
【００５７】
癌組織から単離したゲノムＤＮＡにおいて特定のＣｐＧ位置がメチル化されているかどうか決定するために、目的のＣｐＧアイランドの位置と重複するように設計したプライマーを用いてメチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。全てのＰＣＲ反応はマスターサイクラーサーモサイクラー(Eppendorf, Westbury, NY)で９５℃１５秒、６３℃３０秒、及び７２℃１０秒を４２サイクル行った。それぞれの反応は、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．２５ｍＭのｄＮＴＰＳ、各プライマー１２．５ｐｍｏｌずつ、及び０．５ユニットのPLATINUM Taq酵素(Invitrogen, Carlsbad CA)を含む１×PLATINUM Taq ＰＣＲバッファ３０μｌ中で行った。各ＣｐＧアイランドに用いたプライマー、産物のサイズを表１に示す（表中、「Ｆ」はフォワードプライマーを表し、「Ｒ」はリバースプライマーを表し、「ｍ」はメチル化を表し、「ｕ」は非メチル化を表す）。
【００５８】
【表１−１】
【００５９】
【表１−２】
【００６０】
ＰＣＲ反応産物を、８％アクリルアミドゲル上で分離した。プライマー内に存在する全てのＣｐＧアイランドでメチル化を示すテンプレートだけが、増幅反応に有効なテンプレートとなり得た。インビトロでＳＳ１（ＣｐＧ）メチラーゼ(NEB, Beverly, MA)を用いて製造者プロトコルに従ってメチル化された、完全にメチル化されたテンプレートを用いて、コントロール反応を行った。表１に記載した全プライマー対は、完全にメチル化されたコントロールテンプレートから正しいサイズの産物を生じた。２つのネガティブコントロール（水、及び白血球から単離したＤＮＡ）は、ＰＣＲ産物を生じない各ターゲットＰＣＲ増幅に含まれていた。ＤＮＡ試料中のＣｐＧアイランドがメチル化される場合、予想されたサイズの増幅産物を得た。本実施例は、上記プライマーを用いて前立腺癌のＣｐＧアイランドのメチル化のアッセイが可能であり、かつＣｐＧアイランドは前立腺癌でメチル化を示すことを明らかにした。
【００６１】
［実施例２］
本実施例は、ＤＮＡ塩基配列決定法によるＡＤＲＢ３遺伝子座におけるＣｐＧアイランドのメチル化状態の決定を示す。ＤＮＡは癌試料から得て、実施例１に記載した通り亜硫酸水素ナトリウムで処理する。亜硫酸水素塩処理したＤＮＡ２μｌは、以下のプライマー：
ADRB3-F1: GAGAAGAGGAAGGTAGAAGGAG［配列番号：２２１］ 及びADRB3-R1: CTACCTAACTATAACCAACCC ［配列番号：２２２］で、実施例１に記載した通り（但し、５５℃まで低くしたアニーリング温度は除く）４０サイクルで増幅する。増幅した２５０ｂｐの産物をQIA quick PCR精製キット(Qiagen, Valencia CA)を用いて精製し、ＴＥ８で回収する。BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kitを用いて、ADRB3-F2:ACGGAGGAGGATAGTAGTACG ［配列番号：２２３］を１．２５ｐｍｏｌ使用して、５０ｎｇＡＤＲＢ３増幅産物の配列を決定し、シークエンス反応物はCentri-Sep columns (Applied Biosystems) を用いて製造者のプロトコルに従って精製した。シークエンス反応産物は、ＡＢＩ３７００シークエンサーを用いて製造者の仕様書に従って解析した。得られたＤＮＡ配列は、元の癌ＤＮＡの中の完全にもしくは部分的にメチル化されたＣｐＧジヌクレオチドのシトシン残基部位におけるシトシン塩基もしくはシトシン／チミジン混合塩基と一致する１以上の配列ピークを示す。
【００６２】
あるいは、より詳細な配列解析は、ＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット (Invitrogen, Carlsbad CA)を用いて供給者のプロトコルに従って増幅反応産物をクローニングすることにより得られる。さらなる解析のため約２０コロニーを選抜する。各コロニーを３ｍｌのＬＢ培地で１６時間生育させる。１．５ｍｌアリコートからキアゲン製のplasmid preparation kitを用いてＤＮＡを単離する。プラスミドＤＮＡを分光光度計を用いて定量し、１μｇのアリコートを上述の通り配列解析する。２０の個々のクローンの配列は、どのシトシンがメチル化されるのかを決定するために及び癌試料においてメチル化の速度の評価を提供するために比較する。本実施例は、ＣｐＧアイランド内のシトシンのメチル化状態は、シークエンシングアプローチを用いて決定できることを示す。
【００６３】
［実施例３］
本実施例は、ターミネーター結合リニア増幅法によりＫＩＦＣ２、ＧＦＲＡ１及びＧＰＸ７に関連する複数のＣｐＧアイランドのメチル化パターンの決定を行う。実施例１で記載した通り準備した癌試料由来のＤＮＡから、ＫＩＦＣ２、ＧＦＲＡ１、ＧＰＸ７に関連するＣｐＧアイランドの断片を、それぞれのＣｐＧアイランドに対して以下に示したｍＦ１及びｍＲ１プライマーを用いて個々に増幅する。増幅反応は実施例１に記載した通り（但し、５８℃に下げたアニーリング温度は除く）４２サイクル行う。増幅反応物のアリコートは、適切な長さの断片が得られたことを確認するために８％アクリルアミドゲル上で分離する(ＫＩＦＣ２：２６４ｂｐ、ＧＦＲＡ１：３２６ｂｐ、ＧＰＸ７：３６７ｂｐ)。ＰＣＲ反応産物は、QIAQUICK PCR精製キット(Qiagen)を用いて精製した。
【００６４】
それぞれの増幅産物（２５ｎｇ）を、対応するアンプリコンに対して以下に示した蛍光標識されたＦ２プライマー１．５ｐｍｏｌを用いてリニアターミネーター結合増幅に供した。増幅反応液は、1× ＶｅｎｔＲ (exo-)ＤＮＡポリメラーゼ (New England Biolabs, Beverly MA)、 ３０μＭのｄＡＴＰ、３７μＭのｄＣＴＰ、１００μＭのｄＧＴＰ、１００μＭのｄＴＴＰ、４８０μＭのｄｄＣＴＰ及び2 ユニットのＶｅｎｔＲ (exo-)ＤＮＡポリメラーゼを含んでいる。反応は、マスターサイクラーサーモサイクラー(Eppendorf)で９５℃１５秒、５８℃３０秒、及び７２℃３０秒を３０サイクル行う。増幅後、反応産物をシングルチューブに回収し、Centri-Sep columns (Applied Biosystems)を用いて製造者のプロトコルに従って精製する。Genescan 500 LIZ スタンダード (Applied Biosystems)１μｌを１０分の１量の精製断片及び、the ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems)を用いて製造者の指示に従って単離したＤＮＡに加える。このデータはGENESCAN 及びGENEMAPPER ソフトウェア(Applied Biosystems)を用いて解析する。
【００６５】
増幅のために以下のプライマーを使用する。
【００６６】
KIFC2-F1: AGGTA(C/T)GTTGTATTTGGTGGATTTGG ［配列番号：２２４］
【００６７】
KIFC2-R1: CCCACCTACAACAACAACACC ［配列番号：２２５］
【００６８】
KIFC2-F2: 6FAM-GAACGCGTACGGAAGGTAGG ［配列番号：２２６］
【００６９】
GFRA1-F1: GTGATAGGTTTGTAGATTTGATAGTTG［配列番号：２２７］
【００７０】
GFRA1-R1: AACTAACCTCCATTTTAACTATTTC ［配列番号：２２８］
【００７１】
GFRA1-F2: NED-GAGAGATGAATTTGGATATTAGT ［配列番号：２２９］
【００７２】
GPX7-F1: GGTAAATTGGTGT(C/T)GTTGGAGAAG ［配列番号：２３０］
【００７３】
GPX7-R1: ACTAAACAATAATACCC(A/G)ACCTC ［配列番号：２３１］
【００７４】
GPX7-F2: VIC-GTCGTTGGGTTCGGTTTCGTTTTG ［配列番号：２３２］
【００７５】
Ｆ１及びＲ１プライマーは癌ＤＮＡ由来のＣｐＧアイランド断片の増幅のために使用する。Ｆ２プライマーはターミネーション結合リニア増幅のために使用する。
【００７６】
本実施例は、不完全な脱アミノ化は配列内のＣｐＧジヌクレオチドの位置から予測される長さとは異なる長さを有する断片をもたらすので、
（ｉ）目的の配列中のＣｐＧアイランドのメチル化シトシンの存在及び／又は位置の決定；並びに
（ｉｉ）脱アミノ化反応の効率に関する情報の提供
のために、ターミネーション結合リニア増幅断片長が解析され得ることを示す。
【００７７】
［実施例４］
本実施例は、ＣｐＧアイランドマーカーアッセイに利用可能なＤＮＡ量を増やすため、尿試料から回収したＤＮＡにメチル化結合全ゲノム増幅の使用を行う。尿試料は前立腺癌と最近診断された４人の患者から採取した。５０ｍｌの試料を４０００ｒｐｍで１５分スピンダウンし、１．５ｍｌチューブに移し、ＰＢＳで2回洗浄した。ＤＮＡをプロテイナーゼＫ消化(１００μｌの２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１００ ｍＭ ＮａＣＬ、1％ ＳＤＳ、5 ｍＭ ＥＤＴＡ及び１０μｇ プロテイナーゼＫ)を用いて抽出した後に、フェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿を行った。ＤＮＡをＴＥ８バッファ(１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１ ｍＭ ＥＤＴＡ)１０μｌで再懸濁した。
【００７８】
ＧＧＧＮ６配列を持つ部分的ランダムプライマー（５０ｎｇ）をＤＮＡ５μｌに添加した。変性溶液(５０ ｍＭ ＫＯＨ、０．１ ｍＭ ＥＤＴＡ)１２μｌをＤＮＡ／ランダムプライマー混合物に添加した。室温で５分間インキュベート後、反応液を中和させるために中和溶液(６０ｍＭ Ｔｒｉｓ (ｐＨ ７．５)、５０ ｍＭ ＨＣｌ)１２μｌを加えた。ＤＮＡ／プライマー混合物を９４℃で５分変性させ、室温で１０分インキュベートし、そして氷上に置いた。
【００７９】
示された最終濃度となるように以下の試薬を以下の方法に従って添加することで、増幅反応液を３０μｌの最終容量に合わせた。
【００８０】
（ａ）１Ｘ ＮＥＢ バッファ２ (１Ｘ ＮＥＢ ｂｕｆｆｅｒ ２: ５０ ｍＭ ＮａＣｌ、 １０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、 ｐＨ ７．９， １０ ｍＭ ＭｇＣｌ２、 １ ｍＭ ジチオスレイトール)、 ３３３μＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、１６０μＭ Ｓ−アデノシルメチオニン及び１０ ｎｇ／μｌ のウシ血清アルブミン(ＢＳＡ) を混合し、
【００８１】
（ｂ）ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ酵素１（０．１５ ｕｎｉｔｓ／μｌ） (New England Biolabs)を（ａ）に加え３７℃で１０分インキュベートし、かつ続いて
【００８２】
（ｃ）クレノウポリメラーゼを最終濃度が０．１６７ユニット／μｌになるように加え、かつクレノウエキソを最終濃度が０．１６７ユニット／μｌ（New England biolabs）になるように加えた。
【００８３】
反応液を３７℃で１６時間インキュベートし、最終濃度が５ｍＭになるようにＥＤＴＡを添加して反応を停止し、フェノール／クロロホルム抽出、及びエタノール沈殿を行った。ＤＮＡを４０μｌのＴＥ８で再懸濁し、２μｌはＤＮＡの存在を確認するためにアガロースゲル上で分離した。
【００８４】
ＤＮＡを亜硫酸水素ナトリウムで処理し、ＧＰＲ１４７及びＲＥＴアッセイを用いて実施例１に記載した通りにメチル化特異的ＰＣＲにより解析した。いずれかのマーカーに対する予想されたサイズのバンドの存在は、入力ＤＮＡにおいて関連マーカーのメチル化を示唆した。
【００８５】
本明細書で引用された文献、特許出願及び特許を含むすべての参考文献は、各文献が個々にかつ具体的に参照により組み込まれ、本明細書にその全体が説明されたのと同じ範囲まで参照により本明細書に組み込まれる。
【００８６】
「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」といった用語の使用及び発明の説明の文脈における類似指示（特に以下の請求項の文脈において）は、本明細書に示されたり、もしくは文脈から明確に矛盾している場合でない限り、単数形のみならず複数形にも及ぶと解釈される。本明細書の値の範囲の列挙は本明細書に示されない限り、単に、範囲内におさまる分けられた各々の値に対して個別に参照する簡略な方法として供することを意図し、分けられた各々の値は、本明細書に別々に列挙されたものとして明細書に組み込まれる。本明細書に説明された全ての方法は、本明細書で示されないもしくは文脈から明らかに矛盾していない限り、いかなる適する順序でも実行され得る。本明細書で提供されるいずれか及び全ての実施例、並びに模範的用語（例、such as）の使用は、単に発明をより明らかにするものであって、クレームされない限り発明の範囲の減縮をもたらさない。明細書内にない用語は、発明の実施に不可欠であるいかなるクレームされていない要素も示していると解釈すべきである。
【００８７】
本発明を実施するために本発明者らが知っているベストモードを含む本発明の好ましい態様は、本明細書に記載されている。説明された態様は単なる例示であって本発明の範囲を限定するものとして取り扱われるべきではないことを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１Ａ】配列番号：１のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図１Ｂ】配列番号：２のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図１Ｃ】配列番号：３のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図１Ｄ】配列番号：４のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図１Ｅ】配列番号：５のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図１Ｆ】配列番号：６のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図１Ｇ】配列番号：７及び８のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図１Ｈ】配列番号：９及び１０のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図１Ｉ】配列番号：１１及び１２のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図１Ｊ】配列番号：１３、１４及び１５のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図１Ｋ】配列番号：１６、１７及び１８のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図１Ｌ】配列番号：１９のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図１Ｍ】配列番号：２０のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図１Ｎ】配列番号：２１及び２２のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図１Ｏ】配列番号：２３、２４及び２５のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図１Ｐ】配列番号：２６及び２７のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図１Ｑ】配列番号：２８のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図１Ｒ】配列番号：２９及び３０のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図１Ｓ】配列番号：３１のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図１Ｔ】配列番号：３２及び３３のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図１Ｕ】配列番号：３４及び３５のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図１Ｖ】配列番号：３６及び３７のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図１Ｗ】配列番号：３８及び３９のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図１Ｘ】配列番号：４０及び４１のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図１Ｙ】配列番号：４２及び４３のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図１Ｚ】配列番号：４４、４５及び４６のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図１ＡＡ】配列番号：４７及び４８のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図１ＢＢ】配列番号：４９のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図１ＣＣ】配列番号：５０、５１及び５２のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図１ＤＤ】配列番号：５３及び５４のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２Ａ】配列番号：１１９及び１２０のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２Ｂ】配列番号：１２１、１２２、１２３及び１２４のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２Ｃ】配列番号：１２５、１２６及び１２７のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２Ｄ】配列番号：１２８、１２９、１３０及び１３１のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２Ｅ】配列番号：１３２、１３３及び１３４のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２Ｆ】配列番号：１３５のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２Ｇ】配列番号：１３６のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２Ｈ】配列番号：１３７及び１３８のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２Ｉ】配列番号：１３９及び１４０のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２Ｊ】配列番号：１４１及び１４２のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２Ｋ】配列番号：１４３のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２Ｌ】配列番号：１４４及び１４５のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２Ｍ】配列番号：１４６、１４７及び１４８のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２Ｎ】配列番号：１４９及び１５０のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２Ｏ】配列番号：１５１及び１５２のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２Ｐ】配列番号：１５３及び１５４のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２Ｑ】配列番号：１５５及び１５６のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２Ｒ】配列番号：１５７、１５８及び１５９のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２Ｓ】配列番号：１６０及び１６１のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２Ｔ】配列番号：１６２及び１６３のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２Ｕ】配列番号：１６４及び１６５のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２Ｖ】配列番号：１６６及び１６７のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２Ｗ】配列番号：１６８、１６９及び１７０のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２Ｘ】配列番号：１７１及び１７２のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２Ｙ】配列番号：１７３及び１７４のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２Ｚ】配列番号：１７５のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２ＡＡ】配列番号：１７６のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２ＢＢ】配列番号：１７７及び１７８のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２ＣＣ】配列番号：１７９、１８０及び１８１のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２ＤＤ】配列番号：１８２、１８３及び１８４のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２ＥＥ】配列番号：１８５のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２ＦＦ】配列番号：１８６及び１８７のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２ＧＧ】配列番号：１８８、１８９及び１９０のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２ＨＨ】配列番号：１９１，１９２及び１９３のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２ＩＩ】配列番号：１９４、１９５及び１９６のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２ＪＪ】配列番号：１９７のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【図２ＫＫ】配列番号：１９８のヌクレオチド配列を表す。配列は慣例に従って左から右及び上から下に掲示する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の診断方法であって、下記工程：
癌の診断を必要とする被験者由来の生物学的試料を準備する工程；並びに
ニューレグリン細胞表面リガンド（ＮＲＧ１）、キネシンファミリーメンバー１３Ｂ（ＫＩＦ１３Ｂ）、アドレナリン作動Ｂ３レセプター（ＡＤＲＢ３）、グリコシルホスファチジルイノシトール細胞表面レセプター（ＧＦＲＡ２）、ＲＥＴ原癌遺伝子（ＲＥＴ）、Ｇ−タンパク質共役タンパク質レセプター１４７（ＧＰＲ１４７）、ニューロゲニン３転写因子（ＮＥＵＲＯＧ３）、パラジン（予想タンパク質チロシンホスファターゼ）（ＰＡＬＤ）、メチルトランスフェラーゼファミリーメンバー１（ＨＥＭＫ１）、線維芽細胞成長因子４癌遺伝子（ＦＧＦ４）、５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）レセプター１Ａ（ＨＴＲ１Ａ）、リングフィンガータンパク質１８０（ＲＮＦ１８０）、ＥＧＦＲ共増幅及び過剰発現（ＤＫＦＺＰ５６４Ｋ０８２２もしくはＥＣＯＰ）、亜鉛フィンガータンパク質５９６（ＺＮＦ５９６）、７回膜貫通型ヘリックスレセプター類似（ＬＯＣ４４１３２０）、Ｌ−トレオニンデヒドロゲナーゼ（ＴＤＨ）、仮想タンパク質Ｃ８ｏｒｆ７９（Ｃ８ｏｒｆ７９／ＦＬＪ３６９８０）、線維芽細胞成長因子レセプター２０（ＦＧＦ２０）、ＥＦ−ハンドドメインファミリーメンバー２Ａ（ＬＯＣ２８６０９７／ＥＦＨＡ２）、Ｎ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ（酸性セラミナーゼ）１（ＡＳＡＨ１）、ｎｏｄａｌホモログ（ＮＯＤＡＬ）、亜鉛フィンガータンパク質５３２に類似の仮想タンパク質（ＬＯＣ３９９７８３）、転写因子ＬＩＭホメオドメイン（ＩＳＬ２）、マトリックスメタロペプチダーゼ９（ＭＭＰ９）、高ロイシン反復含有４９（ＬＲＲＣ４９）、腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリーメンバー１１（ＴＮＦＳＦ１１）、ｒａｓホモログ遺伝子ファミリーメンバーＤ（ＲＨＯＤ）、キネシンファミリーメンバーＣ２（ＫＩＦＣ２）、クロモソーム２０オープンリーディングフレーム２３（キネシン様モータータンパク質）（Ｃ２０ｏｒｆ２３）、ＧＤＮＦファミリーレセプターアルファ１（ＧＦＲＡ１）、グルタチオンペルオキシダーゼ７（ＧＰＸ７）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆホモログ２（ＤＫＫ２）、ネトリン１（ＮＴＮ１）、マトリックスメタロペプチダーゼ９（ＭＭＰ９）、腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー１１（ＴＮＦＳＦ１１）、ｒａｓホモログ遺伝子ファミリーメンバーＤ（ＲＨＯＤ）、及び高ロイシン反復含有４９（ＬＲＲＣ４９）からなる群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について前記試料をアッセイする工程を含み、ここで、アッセイされたＣｐＧアイランドのメチル化は、被験者における癌の指標となる、方法。
【請求項２】
哺乳類のオスにおける癌の予知方法であって、下記工程：
癌の予知を必要とする被験者由来の生物学的試料を準備する工程；並びに
ニューレグリン細胞表面リガンド（ＮＲＧ１）、キネシンファミリーメンバー１３Ｂ（ＫＩＦ１３Ｂ）、アドレナリン作動Ｂ３レセプター（ＡＤＲＢ３）、グリコシルホスファチジルイノシトール細胞表面レセプター（ＧＦＲＡ２）、ＲＥＴ原癌遺伝子（ＲＥＴ）、Ｇ−タンパク質共役タンパク質レセプター１４７（ＧＰＲ１４７）、ニューロゲニン３転写因子（ＮＥＵＲＯＧ３）、パラジン（予想タンパク質チロシンホスファターゼ）（ＰＡＬＤ）、メチルトランスフェラーゼファミリーメンバー１（ＨＥＭＫ１）、線維芽細胞成長因子４癌遺伝子（ＦＧＦ４）、５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）レセプター１Ａ（ＨＴＲ１Ａ）、リングフィンガータンパク質１８０（ＲＮＦ１８０）、ＥＧＦＲ共増幅及び過剰発現（ＤＫＦＺＰ５６４Ｋ０８２２もしくはＥＣＯＰ）、亜鉛フィンガータンパク質５９６（ＺＮＦ５９６）、７回膜貫通型ヘリックスレセプター類似（ＬＯＣ４４１３２０）、Ｌ−トレオニンデヒドロゲナーゼ（ＴＤＨ）、仮想タンパク質Ｃ８ｏｒｆ７９（Ｃ８ｏｒｆ７９／ＦＬＪ３６９８０）、線維芽細胞成長因子レセプター２０（ＦＧＦ２０）、ＥＦ−ハンドドメインファミリーメンバー２Ａ（ＬＯＣ２８６０９７／ＥＦＨＡ２）、Ｎ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ（酸性セラミナーゼ）１（ＡＳＡＨ１）、ｎｏｄａｌホモログ（ＮＯＤＡＬ）、亜鉛フィンガータンパク質５３２に類似の仮想タンパク質（ＬＯＣ３９９７８３）、転写因子ＬＩＭホメオドメイン（ＩＳＬ２）、マトリックスメタロペプチダーゼ９（ＭＭＰ９）、高ロイシン反復含有４９（ＬＲＲＣ４９）、腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリーメンバー１１（ＴＮＦＳＦ１１）、ｒａｓホモログ遺伝子ファミリーメンバーＤ（ＲＨＯＤ）、キネシンファミリーメンバーＣ２（ＫＩＦＣ２）、クロモソーム２０オープンリーディングフレーム２３（キネシン様モータータンパク質）（Ｃ２０ｏｒｆ２３）、ＧＤＮＦファミリーレセプターアルファ１（ＧＦＲＡ１）、グルタチオンペルオキシダーゼ７（ＧＰＸ７）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆホモログ２（ＤＫＫ２）、ネトリン１（ＮＴＮ１）、マトリックスメタロペプチダーゼ９（ＭＭＰ９）、腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー１１（ＴＮＦＳＦ１１）、ｒａｓホモログ遺伝子ファミリーメンバーＤ（ＲＨＯＤ）、及び高ロイシン反復含有４９（ＬＲＲＣ４９）からなる群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について前記試料をアッセイする工程を含み、ここで、アッセイされたＣｐＧアイランドのメチル化は、癌のグレードもしくはステージ、及び／又は治療後の被験者の無病生存期間の長さの指標となる、方法。
【請求項３】
被験者における癌治療の効果の評価方法であって、下記工程：
癌の治療コースを受けている被験者由来の第一生物学的試料及び第二生物学的試料を準備する工程、ここで、第一生物学的試料を第二生物学的試料よりも早い時期に採取し、第二生物学的試料を治療コース中または治療コース後に採取する；並びに
ニューレグリン細胞表面リガンド（ＮＲＧ１）、キネシンファミリーメンバー１３Ｂ（ＫＩＦ１３Ｂ）、アドレナリン作動Ｂ３レセプター（ＡＤＲＢ３）、グリコシルホスファチジルイノシトール細胞表面レセプター（ＧＦＲＡ２）、ＲＥＴ原癌遺伝子（ＲＥＴ）、Ｇ−タンパク質共役タンパク質レセプター１４７（ＧＰＲ１４７）、ニューロゲニン３転写因子（ＮＥＵＲＯＧ３）、パラジン（予想タンパク質チロシンホスファターゼ）（ＰＡＬＤ）、メチルトランスフェラーゼファミリーメンバー１（ＨＥＭＫ１）、線維芽細胞成長因子４癌遺伝子（ＦＧＦ４）、５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）レセプター１Ａ（ＨＴＲ１Ａ）、リングフィンガータンパク質１８０（ＲＮＦ１８０）、ＥＧＦＲ共増幅及び過剰発現（ＤＫＦＺＰ５６４Ｋ０８２２もしくはＥＣＯＰ）、亜鉛フィンガータンパク質５９６（ＺＮＦ５９６）、７回膜貫通型ヘリックスレセプター類似（ＬＯＣ４４１３２０）、Ｌ−トレオニンデヒドロゲナーゼ（ＴＤＨ）、仮想タンパク質Ｃ８ｏｒｆ７９（Ｃ８ｏｒｆ７９／ＦＬＪ３６９８０）、線維芽細胞成長因子レセプター２０（ＦＧＦ２０）、ＥＦ−ハンドドメインファミリーメンバー２Ａ（ＬＯＣ２８６０９７／ＥＦＨＡ２）、Ｎ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ（酸性セラミナーゼ）１（ＡＳＡＨ１）、ｎｏｄａｌホモログ（ＮＯＤＡＬ）、亜鉛フィンガータンパク質５３２に類似の仮想タンパク質（ＬＯＣ３９９７８３）、転写因子ＬＩＭホメオドメイン（ＩＳＬ２）、マトリックスメタロペプチダーゼ９（ＭＭＰ９）、高ロイシン反復含有４９（ＬＲＲＣ４９）、腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリーメンバー１１（ＴＮＦＳＦ１１）、ｒａｓホモログ遺伝子ファミリーメンバーＤ（ＲＨＯＤ）、キネシンファミリーメンバーＣ２（ＫＩＦＣ２）、クロモソーム２０オープンリーディングフレーム２３（キネシン様モータータンパク質）（Ｃ２０ｏｒｆ２３）、ＧＤＮＦファミリーレセプターアルファ１（ＧＦＲＡ１）、グルタチオンペルオキシダーゼ７（ＧＰＸ７）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆホモログ２（ＤＫＫ２）、ネトリン１（ＮＴＮ１）、マトリックスメタロペプチダーゼ９（ＭＭＰ９）、腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー１１（ＴＮＦＳＦ１１）、ｒａｓホモログ遺伝子ファミリーメンバーＤ（ＲＨＯＤ）、及び高ロイシン反復含有４９（ＬＲＲＣ４９）群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について第一及び第二生物学的試料をアッセイする工程を含み、ここで、治療コースの後アッセイされたＣｐＧアイランドのメチル化の減少もしくは欠如は、治療が有効であることを示す、方法。
【請求項４】
哺乳類のオスにおける前立腺癌の診断方法であって、下記工程：
ニューレグリン細胞表面リガンド（ＮＲＧ１）、キネシンファミリーメンバー１３Ｂ（ＫＩＦ１３Ｂ）、アドレナリン作動Ｂ３レセプター（ＡＤＲＢ３）、グリコシルホスファチジルイノシトール細胞表面レセプター（ＧＦＲＡ２）、ＲＥＴ原癌遺伝子（ＲＥＴ）、Ｇ−タンパク質共役タンパク質レセプター１４７（ＧＰＲ１４７）、ニューロゲニン３転写因子（ＮＥＵＲＯＧ３）、パラジン（タンパク質チロシンホスファターゼ）（ＰＡＬＤ）、メチルトランスフェラーゼファミリーメンバー１（ＨＥＭＫ１）、線維芽細胞成長因子４癌遺伝子（ＦＧＦ４）、５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）レセプター１Ａ（ＨＴＲ１Ａ）、リングフィンガータンパク質１８０（ＬＯＣ２８５６７１もしくはＲＮＦ１８０）、ＥＧＦＲ共増幅及び過剰発現（ＤＫＦＺＰ５６４０８２２もしくはＥＣＯＰ）、亜鉛フィンガータンパク質５９６（ＺＮＦ５９６）、７回膜貫通型ヘリックスレセプター類似（ＬＯＣ４４１３２０）、Ｌ−トレオニンデヒドロゲナーゼ（ＴＤＨ）、仮想タンパク質ＦＬＪ３６９８０（ＦＬＪ３６９８０）、線維芽細胞成長因子レセプター２０（ＦＧＦ２０）、ＥＦ−ハンドドメインファミリーメンバー２Ａ（ＬＯＣ２８６０９７）（ＥＦＨＡ２）、Ｎ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ（酸性セラミナーゼ）１（ＡＳＡＨ１）、ｎｏｄａｌホモログ（ＴＧＦ−βシグナル伝達経路）（ＮＯＤＡＬ）、亜鉛フィンガータンパク質５３２に類似の仮想タンパク質（ＬＯＣ３９９７８３）、及び転写因子ＬＩＭホメオドメイン（ＩＳＬ２）、マトリックスメタロペプチダーゼ９（ＭＭＰ９）、高ロイシン反復含有４９（ＬＲＲＣ４９）、腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリーメンバー１１（ＴＮＦＳＦ１１）、ｒａｓホモログ遺伝子ファミリーメンバーＤ（ＲＨＯＤ）、キネシンファミリーメンバーＣ２（ＫＩＦＣ２）、クロモソーム２０オープンリーディングフレーム２３（キネシン様モータータンパク質）（Ｃ２０ｏｒｆ２３）、ＧＤＮＦファミリーレセプターアルファ１（ＧＦＲＡ１）、グルタチオンペルオキシダーゼ７（ＧＰＸ７）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆホモログ２（ＤＫＫ２）、ネトリン１（ＮＴＮ１）、Ｒａｓ関連（ＲａｌＧＤＳ／ＡＦ−６）ドメインファミリー５（ＲＡＳＳＦ５）、及びＨｔｒＡセリンペプチダーゼ４（ＨＴＲＡ４）からなる群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について哺乳類のオス由来の前記生物学的試料をアッセイする工程；並びに
任意に、前立腺癌においてメチル化されることが知られ、良性前立腺過形成（ＢＰＨ）においては検出可能にメチル化されないか、もしくは低レベルでメチル化されることが知られている少なくとも１つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について前記生物学的試料をアッセイする工程をさらに含み；ここで、アッセイされたＣｐＧアイランド（単数もしくは複数）のメチル化は、被験者における前立腺癌の指標となる、方法。
【請求項５】
前記診断方法が下記工程：
ニューレグリン細胞表面リガンド（ＮＲＧ１）、キネシンファミリーメンバー１３Ｂ（ＫＩＦ１３Ｂ）、アドレナリン作動Ｂ３レセプター（ＡＤＲＢ３）、グリコシルホスファチジルイノシトール細胞表面レセプター（ＧＦＲＡ２）、ＲＥＴ原癌遺伝子（ＲＥＴ）、Ｇ−タンパク質共役タンパク質レセプター１４７（ＧＰＲ１４７）、ニューロゲニン３転写因子（ＮＥＵＲＯＧ３）、パラジン（タンパク質チロシンホスファターゼ）（ＰＡＬＤ）、メチルトランスフェラーゼファミリーメンバー１（ＨＥＭＫ１）、線維芽細胞成長因子４癌遺伝子（ＦＧＦ４）、５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）レセプター１Ａ（ＨＴＲ１Ａ）、リングフィンガータンパク質１８０（ＬＯＣ２８５６７１もしくはＲＮＦ１８０）、ＥＧＦＲ共増幅及び過剰発現（ＤＫＦＺＰ５６４０８２２もしくはＥＣＯＰ）、亜鉛フィンガータンパク質５９６（ＺＮＦ５９６）、７回膜貫通型ヘリックスレセプター類似（ＬＯＣ４４１３２０）、Ｌ−トレオニンデヒドロゲナーゼ（ＴＤＨ）、仮想タンパク質ＦＬＪ３６９８０（ＦＬＪ３６９８０）、線維芽細胞成長因子レセプター２０（ＦＧＦ２０）、ＥＦ−ハンドドメインファミリーメンバー２Ａ（ＬＯＣ２８６０９７もしくはＥＦＨＡ２）、Ｎ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ（酸性セラミナーゼ）１（ＡＳＡＨ１）、ｎｏｄａｌホモログ（ＴＧＦ−βシグナル伝達経路）（ＮＯＤＡＬ）、亜鉛フィンガータンパク質５３２に類似の仮想タンパク質（ＬＯＣ３９９７８３）、及び転写因子ＬＩＭホメオドメイン（ＩＳＬ２）からなる群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について前記試料をアッセイする工程；並びに
少なくとも３つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について前記試料をアッセイする工程を含み、ここで、前立腺癌においてメチル化されることが知られている少なくとも１つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドがＢＰＨにおいてはメチル化されないか、又は約１０％以下のレベルでメチル化されることも知られており少なくとも３つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化は、被験者における前立腺癌の指標となるものである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前立腺癌の診断を必要とする哺乳類のオス由来の生物学的試料を準備する工程を含む、請求項４又は５記載の方法。
【請求項７】
哺乳類のオスにおける前立腺癌の予知方法であって、下記工程：
ニューレグリン細胞表面リガンド（ＮＲＧ１）、キネシンファミリーメンバー１３Ｂ（ＫＩＦ１３Ｂ）、アドレナリン作動Ｂ３レセプター（ＡＤＲＢ３）、グリコシルホスファチジルイノシトール細胞表面レセプター（ＧＦＲＡ２）、ＲＥＴ原癌遺伝子（ＲＥＴ）、Ｇ−タンパク質共役タンパク質レセプター１４７（ＧＰＲ１４７）、ニューロゲニン３転写因子（ＮＥＵＲＯＧ３）、パラジン（タンパク質チロシンホスファターゼ）（ＰＡＬＤ）、メチルトランスフェラーゼファミリーメンバー１（ＨＥＭＫ１）、線維芽細胞成長因子４癌遺伝子（ＦＧＦ４）、５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）レセプター１Ａ（ＨＴＲ１Ａ）、リングフィンガータンパク質１８０（ＬＯＣ２８５６７１）（ＲＮＦ１８０）、ＥＧＦＲ共増幅及び過剰発現（ＥＣＯＰ）（ＤＫＦＺＰ５６４０８２２）、亜鉛フィンガータンパク質５９６（ＺＮＦ５９６）、７回膜貫通型ヘリックスレセプター類似（ＬＯＣ４４１３２０）、Ｌ−トレオニンデヒドロゲナーゼ（ＴＤＨ）、仮想タンパク質ＦＬＪ３６９８０（ＦＬＪ３６９８０）、線維芽細胞成長因子レセプター２０（ＦＧＦ２０）、ＥＦ−ハンドドメインファミリーメンバー２Ａ（ＬＯＣ２８６０９７）（ＥＦＨＡ２）、Ｎ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ（酸性セラミナーゼ）１（ＡＳＡＨ１）、ｎｏｄａｌホモログ（ＴＧＦ−Ｂシグナル伝達経路）（ＮＯＤＡＬ）、亜鉛フィンガータンパク質５３２に類似の仮想タンパク質（ＬＯＣ３９９７８３）、及び転写因子ＬＩＭホメオドメイン（ＩＳＬ２）、マトリックスメタロペプチダーゼ９（ＭＭＰ９）、高ロイシン反復含有４９（ＬＲＲＣ４９）、腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリーメンバー１１（ＴＮＦＳＦ１１）、ｒａｓホモログ遺伝子ファミリーメンバーＤ（ＲＨＯＤ）、キネシンファミリーメンバーＣ２（ＫＩＦＣ２）、クロモソーム２０オープンリーディングフレーム２３（キネシン様モータータンパク質）（Ｃ２０ｏｒｆ２３）、ＧＤＮＦファミリーレセプターアルファ１（ＧＦＲＡ１）、グルタチオンペルオキシダーゼ７（ＧＰＸ７）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆホモログ２（ＤＫＫ２）、ネトリン１（ＮＴＮ１）、Ｒａｓ関連（ＲａｌＧＤＳ／ＡＦ−６）ドメインファミリー５（ＲＡＳＳＦ５）、及びＨｔｒＡセリンペプチダーゼ４（ＨＴＲＡ４）からなる群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について前記試料をアッセイする工程；並びに
任意に、前立腺癌においてメチル化されることが知られ、良性前立腺過形成（ＢＰＨ）においては検出可能にメチル化されないか、もしくは低レベルでメチル化されることが知られている少なくとも１つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について前記生物学的試料をアッセイする工程を含み、ここで、アッセイされたＣｐＧアイランド（単数もしくは複数）のメチル化の減少又は欠如は、癌のグレードもしくはステージ、及び／又は治療後の被験者の無病生存期間の長さの指標となる、方法。
【請求項８】
前記予知方法が下記工程：
ニューレグリン細胞表面リガンド（ＮＲＧ１）、キネシンファミリーメンバー１３Ｂ（ＫＩＦ１３Ｂ）、アドレナリン作動Ｂ３レセプター（ＡＤＲＢ３）、グリコシルホスファチジルイノシトール細胞表面レセプター（ＧＦＲＡ２）、ＲＥＴ原癌遺伝子（ＲＥＴ）、Ｇ−タンパク質共役タンパク質レセプター１４７（ＧＰＲ１４７）、ニューロゲニン３転写因子（ＮＥＵＲＯＧ３）、パラジン（タンパク質チロシンホスファターゼ）（ＰＡＬＤ）、メチルトランスフェラーゼファミリーメンバー１（ＨＥＭＫ１）、線維芽細胞成長因子４癌遺伝子（ＦＧＦ４）、５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）レセプター１Ａ（ＨＴＲ１Ａ）、リングフィンガータンパク質１８０（ＬＯＣ２８５６７１もしくはＲＮＦ１８０）、ＥＧＦＲ共増幅及び過剰発現（ＤＫＦＺＰ５６４０８２２もしくはＥＣＯＰ）、亜鉛フィンガータンパク質５９６（ＺＮＦ５９６）、７回膜貫通型ヘリックスレセプター類似（ＬＯＣ４４１３２０）、Ｌ−トレオニンデヒドロゲナーゼ（ＴＤＨ）、仮想タンパク質ＦＬＪ３６９８０（ＦＬＪ３６９８０）、線維芽細胞成長因子レセプター２０（ＦＧＦ２０）、ＥＦ−ハンドドメインファミリーメンバー２Ａ（ＬＯＣ２８６０９７もしくはＥＦＨＡ２）、Ｎ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ（酸性セラミナーゼ）１（ＡＳＡＨ１）、ｎｏｄａｌホモログ（ＴＧＦ−Ｂシグナル伝達経路）（ＮＯＤＡＬ）、亜鉛フィンガータンパク質５３２に類似の仮想タンパク質（ＬＯＣ３９９７８３）、及び転写因子ＬＩＭホメオドメイン（ＩＳＬ２）からなる群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について前記試料をアッセイする工程；並びに
少なくとも３つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について前記試料をアッセイする工程を含み、ここで、前立腺癌においてメチル化されることが知られている少なくとも１つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドがＢＰＨにおいてはメチル化されないか、又は約１０％以下のレベルでメチル化されることも知られており、少なくとも３つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化は、癌のグレードもしくはステージ、及び／又は治療の後の無病生存期間の長さの指標となる、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前立腺癌の予後診断を必要とする哺乳類のオス由来の生物学的試料を準備する工程を含む、請求項７又は８記載の方法。
【請求項１０】
被験者における前立腺癌治療の効果の評価方法であって、下記工程：
癌の治療コースを受けている被験者由来の第一生物学的試料及び第二生物学的試料を準備する工程、ここで、第一生物学的試料を第二生物学的試料よりも早い時期に採取し、第二生物学的試料を治療コース中又は治療コース後に採取する；ニューレグリン細胞表面リガンド（ＮＲＧ１）、キネシンファミリーメンバー１３Ｂ（ＫＩＦ１３Ｂ）、アドレナリン作動Ｂ３レセプター（ＡＤＲＢ３）、グリコシルホスファチジルイノシトール細胞表面レセプター（ＧＦＲＡ２）、ＲＥＴ原癌遺伝子（ＲＥＴ）、Ｇ−タンパク質共役タンパク質レセプター１４７（ＧＰＲ１４７）、ニューロゲニン３転写因子（ＮＥＵＲＯＧ３）、パラジン（タンパク質チロシンホスファターゼ）（ＰＡＬＤ）、メチルトランスフェラーゼファミリーメンバー１（ＨＥＭＫ１）、線維芽細胞成長因子４癌遺伝子（ＦＧＦ４）、５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）レセプター１Ａ（ＨＴＲ１Ａ）、リングフィンガータンパク質１８０（ＬＯＣ２８５６７１）（ＲＮＦ１８０）、ＥＧＦＲ共増幅及び過剰発現（ＥＣＯＰ）（ＤＫＦＺＰ５６４０８２２）、亜鉛フィンガータンパク質５９６（ＺＮＦ５９６）、７回膜貫通型ヘリックスレセプター類似（ＬＯＣ４４１３２０）、Ｌ−トレオニンデヒドロゲナーゼ（ＴＤＨ）、仮想タンパク質ＦＬＪ３６９８０（ＦＬＪ３６９８０）、線維芽細胞成長因子レセプター２０（ＦＧＦ２０）、ＥＦ−ハンドドメインファミリーメンバー２Ａ（ＬＯＣ２８６０９７）（ＥＦＨＡ２）、Ｎ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ（酸性セラミナーゼ）１（ＡＳＡＨ１）、ｎｏｄａｌホモログ（ＴＧＦ−Ｂシグナル伝達経路）（ＮＯＤＡＬ）、亜鉛フィンガータンパク質５３２に類似の仮想タンパク質（ＬＯＣ３９９７８３）、及び転写因子ＬＩＭホメオドメイン（ＩＳＬ２）、マトリックスメタロペプチダーゼ９（ＭＭＰ９）、高ロイシン反復含有４９（ＬＲＲＣ４９）、腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリーメンバー１１（ＴＮＦＳＦ１１）、ｒａｓホモログ遺伝子ファミリーメンバーＤ（ＲＨＯＤ）、キネシンファミリーメンバーＣ２（ＫＩＦＣ２）、クロモソーム２０オープンリーディングフレーム２３（キネシン様モータータンパク質）（Ｃ２０ｏｒｆ２３）、ＧＤＮＦファミリーレセプターアルファ１（ＧＦＲＡ１）、グルタチオンペルオキシダーゼ７（ＧＰＸ７）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆホモログ２（ＤＫＫ２）、ネトリン１（ＮＴＮ１）、Ｒａｓ関連（ＲａｌＧＤＳ／ＡＦ−６）ドメインファミリー５（ＲＡＳＳＦ５）、及びＨｔｒＡセリンペプチダーゼ４（ＨＴＲＡ４）からなる群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について前記第一及び第二試料をアッセイする工程；並びに
任意に、前立腺癌においてメチル化されることが知られ、良性前立腺過形成（ＢＰＨ）においては検出可能にメチル化されないか、もしくは低レベルでメチル化されることが知られている少なくとも１つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について前記生物学的試料をアッセイする工程を含み、ここで、治療コース後にアッセイされた少なくとも３つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化の減少もしくは欠如は、治療が有効であることを示す、方法。
【請求項１１】
前記第一及び第二試料が治療コースの間、定期的に哺乳類のオスから採取され、及び前記評価方法が下記工程：
ニューレグリン細胞表面リガンド（ＮＲＧ１）、キネシンファミリーメンバー１３Ｂ（ＫＩＦ１３Ｂ）、アドレナリン作動Ｂ３レセプター（ＡＤＲＢ３）、グリコシルホスファチジルイノシトール細胞表面レセプター（ＧＦＲＡ２）、ＲＥＴ原癌遺伝子（ＲＥＴ）、Ｇ−タンパク質共役タンパク質レセプター１４７（ＧＰＲ１４７）、ニューロゲニン３転写因子（ＮＥＵＲＯＧ３）、パラジン（タンパク質チロシンホスファターゼ）（ＰＡＬＤ）、メチルトランスフェラーゼファミリーメンバー１（ＨＥＭＫ１）、線維芽細胞成長因子４癌遺伝子（ＦＧＦ４）、５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）レセプター１Ａ（ＨＴＲ１Ａ）、リングフィンガータンパク質１８０（ＬＯＣ２８５６７１もしくはＲＮＦ１８０）、ＥＧＦＲ共増幅及び過剰発現（ＤＫＦＺＰ５６４０８２２もしくはＥＣＯＰ）、亜鉛フィンガータンパク質５９６（ＺＮＦ５９６）、７回膜貫通型ヘリックスレセプター類似（ＬＯＣ４４１３２０）、Ｌ−トレオニンデヒドロゲナーゼ（ＴＤＨ）、仮想タンパク質ＦＬＪ３６９８０（ＦＬＪ３６９８０）、線維芽細胞成長因子レセプター２０（ＦＧＦ２０）、ＥＦ−ハンドドメインファミリーメンバー２Ａ（ＬＯＣ２８６０９７もしくはＥＦＨＡ２）、Ｎ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ（酸性セラミナーゼ）１（ＡＳＡＨ１）、ｎｏｄａｌホモログ（ＴＧＦ−Ｂシグナル伝達経路）（ＮＯＤＡＬ）、亜鉛フィンガータンパク質５３２に類似の仮想タンパク質（ＬＯＣ３９９７８３）、及び転写因子ＬＩＭホメオドメイン（ＩＳＬ２）からなる群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について前記試料をアッセイする工程；並びに
少なくとも３つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について前記試料をアッセイする工程を含み、ここで、前立腺癌においてメチル化されることが知られている少なくとも１つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドがＢＰＨにおいてはメチル化されないか、又は約１０％以下のレベルでメチル化されることも知られており、治療コース後に少なくとも３つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化は、治療が有効であることを示す、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前立腺癌においてメチル化されることが知られ、ＢＰＨにおいては非メチル化もしくは低レベルでメチル化されることが知られている少なくとも１つのＣｐＧアイランドがグルタチオンＳ−トランスフェラーゼＰ１（ＧＳＴＰ１）、グルタチオンペルオキシダーゼ３（ＧＰＸ３）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼＭ１（ＧＳＴＭ１）、Ｃｕｂ及びＳｕｓｈｉ多機能ドメイン１（ＣＳＭＤ１）、腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリーメンバー１０Ｃ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ）、腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリー１０Ｄ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ）、分泌ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質１（ＳＦＲＰ１）、分泌ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質２（ＳＦＲＰ２）、ｄｉｃｋｋｏｐｆホモログ３（ＤＫＫ３）、プロスタグランジン−エンドペルオキシドシンターゼ２（ＰＴＧＳ２）、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子１Ｃ（ＣＤＫＮ１Ｃ／ｐ５７）、Ｒａｓ関連（ＲａｌＧＤＳ／ＡＦ−６）ドメインファミリー１（ＲＡＳＳＦ１）、Ｇタンパク質共役レセプター６２（ＧＰＲ６２）に関連する１以上のＣｐＧアイランドであるか当該ＣｐＧアイランドを含む、請求項４〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前立腺癌においてメチル化されることが知られ、ＢＰＨにおいては非メチル化もしくは低レベルでメチル化されることが知られている少なくとも１つのＣｐＧアイランドがグルタチオンＳ−トランスフェラーゼＰ１（ＧＳＴＰ１）に関連する１以上のＣｐＧアイランドであるか当該ＣｐＧアイランドを含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも４つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化についてアッセイする工程を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも５つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化についてアッセイする工程を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも６つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化についてアッセイする工程を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも７つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化についてアッセイする工程を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも８つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化についてアッセイする工程を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも９つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化についてアッセイする工程を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
ＣｐＧアイランドのメチル化についてのアッセイが、
（ａ）配列番号：１もしくは２［ＮＲＧ１］、配列番号：３もしくは４［ＡＤＲＢ３］、配列番号：５もしくは６［ＧＦＲＡ２］、配列番号：７もしくは８［ＫＩＦ１３Ｂ］、配列番号：９もしくは１０［ＲＥＴ］、配列番号：１１もしくは１２［ＧＰＲ１４７］、配列番号：１３もしくは１４［ＮＥＵＲＯＧ３］、配列番号：１５もしくは１６［ＰＡＬＤ］、配列番号：１７もしくは１８［ＨＥＭＫ１］、配列番号：１９もしくは２０［ＦＧＦ４］、配列番号：２１もしくは２２［ＧＰＲ６２］、配列番号：２３もしくは２４［ＨＴＲ１Ａ］、配列番号：２５もしくは２６［ＲＮＦ１８０］、配列番号：２７もしくは２８［ＤＫＦＺＰ５６４０８２２］、配列番号：２９もしくは３０［ＺＮＦ５９６］、配列番号：３３もしくは３４［ＬＯＣ４４１３２０］、配列番号：３５もしくは３６［ＴＤＫ］、配列番号：３７もしくは３８［ＦＬＪ３６９８０］、配列番号：３９もしくは４０［ＦＧＦ２０］、配列番号：４１もしくは４２［ＥＦＨＡ２］、配列番号：４３もしくは４４［ＡＳＡＨ１］、配列番号：４９もしくは５０［ＮＯＤＡＬ］、配列番号：５１もしくは５２［ＬＯＣ３９９７８３］、配列番号：５３もしくは５４［ＩＳＬ２］及び
（ｂ）（ａ）の完全にもしくは部分的にメチル化された誘導体
からなる群より選ばれる標的配列における少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含む標的配列を増幅する工程を含み、それにより増幅配列が生成される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
ＣｐＧアイランドのメチル化についてのアッセイが、
（ａ）配列番号：１１９もしくは２２０［ＫＩＦＣ２］、配列番号：１２１もしくは１２２［Ｃ２０ＯＲＦ２３］、配列番号：１２３もしくは１２４［ＧＦＲＡ１］、配列番号：１２９もしくは１３０［ＤＫＫ２］、配列番号：１３５もしくは１３６［ＮＴＮ１］、配列番号：１９５［ＲＨＯＤ］、配列番号：１９６［ＴＮＦＳＦ１１］、配列番号：１９７［ＭＭＰ９］、及び配列番号：１９８［ＬＲＲＣ４９］、
（ｂ）（ａ）の完全にもしくは部分的にメチル化されたシトシン誘導体、並びに
（ｃ）（ｂ）の脱アミノ化誘導体
からなる群より選ばれる標的配列における少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド、又はメチル化シトシンＣｐＧジヌクレオチドの脱アミノ化誘導体を含む標的配列を増幅する工程を含み、それにより増幅配列が生成される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
ＣｐＧアイランドのメチル化についてのアッセイが、
（ａ）配列番号：１１９もしくは２２０［ＫＩＦＣ２］、配列番号：１２１もしくは１２２［Ｃ２０ＯＲＦ２３］、配列番号：１２３もしくは１２４［ＧＦＲＡ１］、配列番号：１２９もしくは１３０［ＤＫＫ２］、配列番号：１３５もしくは１３６［ＮＴＮ１］、配列番号：１３３もしくは１３４［ＲＡＳＳＦ５］及び配列番号：１９３もしくは１９４［ＨＴＲＡ４］、
（ｂ）（ａ）の完全にもしくは部分的にメチル化されたシトシン誘導体、並びに
（ｃ）（ｂ）の脱アミノ化誘導体
からなる群より選ばれる標的配列における少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド、又はメチル化シトシンＣｐＧジヌクレオチドの脱アミノ化誘導体を含む標的配列を増幅する工程を含み、それにより増幅配列が生成される、請求項４、７、１０、又は請求項１２〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
メチル化についてのアッセイが、少なくとも１つのジデオキシヌクレオチドの存在下でターミネーター結合リニア増幅を行う工程及び増幅断片のサイズを決定する工程を含み、それによりシチジン残基のメチル化状態が決定される、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
アッセイが１つのジデオキシヌクレオチドのみの存在下でリニア増幅を行う工程を含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
アッセイが２つのジデオキシヌクレオチドのみの存在下でリニア増幅を行う工程を含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
少なくとも１つのジデオキシヌクレオチドが、ジデオキシアデニン、ジデオキシチジン（ｄｉｄｅｏｘｃｙｔｉｄｉｎｅ）、ジデオキシグアニン（ｄｉｄｅｏｘｇｕａｎｉｎｅ）及びジデオキシチミジン（ｄｉｄｅｏｘｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）からなる群より選ばれる、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
ＣｐＧアイランドのメチル化状態を決定するターミネーター結合リニア増幅法であって、下記工程：
（ａ）ターミネーター結合リニア増幅のためのＤＮＡ試料を準備する工程
（ｂ）脱アミノ化条件下でＤＮＡ試料をインキュベートする工程、それにより脱アミノ化ＤＮＡ試料が生成される
（ｃ）任意に、脱アミノ化ＤＮＡ試料を精製する工程
（ｄ）１以上のＣｐＧアイランド又は１以上のＣｐＧアイランドの部分を含む標的配列（単数もしくは複数）を増幅する工程、それにより１以上の増幅標的配列が生成される
（ｅ）任意に、１以上の増幅標的配列を精製する工程
（ｆ）１以上の異なる長さの断片を生成するためにプライマー及びジデオキシヌクレオチドの存在下で１以上の増幅標的配列をリニア増幅する工程、ここで、それぞれの長さはプライマーの５´末端からジデオキシヌクレオチドが組み込まれた位置までの塩基の距離と一致する；
（ｇ）任意に、１以上の断片を精製する工程、並びに
（ｈ）前記長さを決定するために１以上の断片を分析する工程及びそれにより１以上の増幅標的配列内のメチル化シトシンのメチル化状態を決定する工程
を含む、方法。
【請求項２８】
（ｄ）の標的配列（単数もしくは複数）を増幅する工程がＰＣＲ増幅、等温増幅、又はＰＣＲと等温増幅の組み合わせを含む、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
脱アミノ化条件が化学的脱アミノ化剤を含む、請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
脱アミノ化剤が亜硫酸水素塩である、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
脱アミノ化条件が酵素的脱アミノ化剤を含む、請求項２７記載の方法。
【請求項３２】
脱アミノ化剤がＤＮＡシチジンデアミナーゼ活性を有する酵素である、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
１以上の増幅標的配列が、１つのジデオキシヌクレオチドのみの存在下でリニア増幅される、請求項２７〜３２のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３４】
１以上の増幅標的配列が、２つのジデオキシヌクレオチドのみの存在下でリニア増幅される、請求項２７〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
少なくとも1つのジデオキシヌクレオチドが、ジデオキシアデニン、ジデオキシシチジン、ジデオキシグアニン及びジデオキシチミジンからなる群より選ばれる、請求項２７〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
下記工程：
（ｉ）非メチル化シトシンの脱アミノ化に適した条件下で標的配列を含むＣｐＧアイランドを処理する工程；及び
（ｉｉ）処理した標的配列を増幅する工程、それによりリニア増幅のための増幅配列が生成される
をさらに含む方法である、請求項２７〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
下記工程：
（ｉ）ＤＮＡ試料を準備する工程
（ｉｉ）メチル化結合等温増幅を用いてＤＮＡ試料を増幅する工程、それによりターミネーター結合リニア増幅のためのＤＮＡ試料である増幅ＤＮＡ試料が生成される
をさらに含む方法である、請求項２７〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
リニア増幅により生成された複数の断片が検出可能なタグを含む、請求項２７〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
それぞれの標的配列から生成されたそれぞれの複数の断片が同じ検出可能なタグを含むように、リニア増幅がそれぞれの増幅標的配列のための検出可能なタグを含む異なるプライマーを添加する工程を含む、請求項２７〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
ニューレグリン細胞表面リガンド（ＮＲＧ１）、アドレナリン作動Ｂ３レセプター（ＡＤＲＢ３）、グリコシルホスファチジルイノシトール細胞表面レセプター（ＧＦＲＡ２）、キネシンファミリーメンバー１３Ｂ（ＫＩＦ１３Ｂ）、ＲＥＴ原癌遺伝子（ＲＥＴ）、Ｇ−タンパク質共役タンパク質レセプター１４７（ＧＰＲ１４７）、ニューロゲニン３転写因子（ＮＥＵＲＯＧ３）、パラジン（タンパク質チロシンホスファターゼ）（ＰＡＬＤ）、メチルトランスフェラーゼファミリーメンバー１（ＨＥＭＫ１）、線維芽細胞成長因子４癌遺伝子（ＦＧＦ４）、５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）レセプター１Ａ（ＨＴＲ１Ａ）、リングフィンガータンパク質１８０（ＬＯＣ２８５６７１）（ＲＮＦ１８０）、ＥＧＦＲ共増幅及び過剰発現（ＥＣＯＰ）（ＤＫＦＺＰ５６４０８２２）、亜鉛フィンガータンパク質５９６（ＺＮＦ５９６）、７回膜貫通型ヘリックスレセプター類似（ＬＯＣ４４１３２０）、Ｌ−トレオニンデヒドロゲナーゼ（ＴＤＨ）、仮想タンパク質ＦＬＪ３６９８０（ＦＬＪ３６９８０）、線維芽細胞成長因子レセプター２０（ＦＧＦ２０）、ＥＦ−ハンドドメインファミリーメンバー２Ａ（ＬＯＣ２８６０９７）（ＥＦＨＡ２）、Ｎ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ（酸性セラミナーゼ）１（ＡＳＡＨ１）、ｎｏｄａｌホモログ（ＴＧＦ−Ｂシグナル伝達経路）（ＮＯＤＡＬ）、亜鉛フィンガータンパク質５３２に類似の仮想タンパク質（ＬＯＣ３９９７８３）、転写因子ＬＩＭホメオドメイン（ＩＳＬ２）、キネシンファミリーメンバーＣ２（ＫＩＦＣ２）、クロモソーム２０オープンリーディングフレーム２３（キネシン様モータータンパク質）（Ｃ２０ｏｒｆ２３）、ＧＤＮＦファミリーレセプターアルファ１（ＧＦＲＡ１）、グルタチオンペルオキシダーゼ７（ＧＰＸ７）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆホモログ２（ＤＫＫ２）、ネトリン１（ＮＴＮ１）、マトリックスメタロペプチダーゼ９（ＭＭＰ９）、腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー１１（ＴＮＦＳＦ１１）、ｒａｓホモログ遺伝子ファミリーメンバーＤ（ＲＨＯＤ）、及び高ロイシン反復含有４９（ＬＲＲＣ４９）からなる群より選ばれる１つの遺伝子に関連する１以上のＣｐＧアイランドの少なくとも一部を増幅するのに適している、１以上のプライマー対。
【請求項４１】
請求項４０記載の少なくとも１つのプライマー対；及び
前立腺癌においてメチル化されるが、ＢＰＨにおいてはメチル化されないか、もしくは低レベルでメチル化されることが知られている少なくとも1つの他の遺伝子に関連するＣｐＧアイランドの少なくとも一部の増幅に適している少なくとも１つのプライマー対を含む、セットプライマー。
【請求項４２】
請求項４０記載の第一プライマー対；及び
請求項４０記載の第二プライマー対、該第二プライマー対は該第一プライマー対よりも、異なるＣｐＧアイランドの少なくとも一部を増幅するのに適している、
を含む、プライマーセット。
【請求項４３】
第一プライマー対で増幅したＣｐＧアイランドが第一遺伝子に関連し、第二プライマー対で増幅したＣｐＧアイランドが第二遺伝子に関連し；並びに第一及び第二遺伝子は異なる遺伝子である、請求項４２記載のプライマーセット。
【請求項４４】
（ｉ）請求項４０記載のプライマー対及び
（ｉｉ）前立腺癌においてメチル化されるがＢＰＨにおいてはメチル化されないか、もしくは低レベルでメチル化されることが知られているＣｐＧアイランドの増幅に適しているプライマー対
からなる群より選ばれる第三プライマー対をさらに含み、ここで、第三プライマー対は第一もしくは第二プライマー対による増幅に適したものとは異なるＣｐＧアイランドの増幅に適している、請求項４１、４２又は４３のいずれか１項に記載のプライマーセット。
【請求項４５】
（ｉ）請求項４０記載のプライマー対及び
（ｉｉ）前立腺癌においてメチル化されることが知られているＣｐＧアイランドの増幅に適しているプライマー対
からなる群より選ばれる第四プライマー対をさらに含み、ここで、第四プライマー対は第一、第二もしくは第三プライマー対による増幅に適したものとは異なるＣｐＧアイランドの増幅に適している、請求項４４記載のプライマーセット。
【請求項４６】
（ｉ）請求項４０記載のプライマー対及び
（ｉｉ）前立腺癌においてメチル化されることが知られているＣｐＧアイランドの増幅に適しているプライマー対
からなる群より選ばれる第五プライマー対をさらに含み、ここで、第五プライマー対は第一、第二、第三もしくは第四プライマー対による増幅に適したものとは異なるＣｐＧアイランドの増幅に適している、請求項４５記載のプライマーセット。
【請求項４７】
（ｉ）請求項４０記載のプライマー対及び
（ｉｉ）前立腺癌においてメチル化されていることが知られているＣｐＧアイランドの増幅に適しているプライマー対
からなる群より選ばれる第六プライマー対をさらに含み、ここで、第六プライマー対は第一、第二、第三、第四もしくは第五プライマー対による増幅に適したものとは異なるＣｐＧアイランドの増幅に適している、請求項４６記載のプライマーセット。
【請求項４８】
請求項４０記載のプライマー対をさらに１〜４つ追加して含み、セット中の各プライマー対は異なるＣｐＧアイランドを増幅する、請求項４７記載のプライマーセット。
【請求項４９】
請求項４０記載のプライマー対をさらに１以上含み、セット中の各プライマー対は異なるＣｐＧアイランドを増幅する、請求項４８記載のプライマーセット。
【請求項５０】
プライマー対又はプライマーセットが、配列番号：５５〜１１８からなる群より選ばれる２つの配列から本質的になる配列を持つ２つのプライマーを含む、請求項４０〜４９のいずれか１項に記載のプライマー対又はプライマーセット。
【請求項５１】
プライマー対又はプライマーセットが、ＮＲＧ１もしくはＫＩＦ１３ｂに関連するＣｐＧアイランドの増幅に適している２つのプライマーを含む、請求項４０〜４９のいずれか１項に記載のプライマー又はプライマーセット。
【請求項５２】
プライマー対又はプライマーセットが、ＴＤＨ、ＡＳＡＨ１、ＦＧＦ２０、ＨＥＭＫ１、ＰＡＬＤ、ＮＥＵＲＯＧ、ＥＦＨＡ２、ＫＩＦＣ２、ＧＦＲＡ１、ＤＫＫ２、ＴＮＦＳＦ１１、ＮＴＮ１もしくはＲＨＯＤに関連するＣｐＧアイランドの増幅に適している２つのプライマーを含む、請求項４０〜４９のいずれか１項に記載のプライマーもしくはプライマーセット。
【請求項５３】
癌の診断又は予知のためのキットであって、請求項４０〜５１のいずれか１項に記載のプライマー対もしくはプライマーセット；及び
生物学的試料から少なくとも１つのＣｐＧアイランドを増幅するためのプライマーの使用に関する指示書を含むキット。
【請求項５４】
少なくとも１つの増幅ＣｐＧアイランドのメチル化の評価及び当該メチル化と癌の診断又は予知との相関に関する説明書をさらに含む、請求項５３記載のキット。
【請求項５５】
ゲノムＤＮＡを増幅するためのバッファをさらに含む、請求項５３又は５４記載のキット。
【請求項５６】
生物学的試料からゲノムＤＮＡを調製するためのバッファをさらに含む、請求項５３〜５５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項５７】
生物学的試料からゲノムＤＮＡを調製するためのバッファが、血漿もしくは尿からゲノムＤＮＡを調製するためのバッファである、請求項５６記載のキット。
【請求項１】
癌の診断方法であって、下記工程：
癌の診断を必要とする被験者由来の生物学的試料を準備する工程；並びに
ニューレグリン細胞表面リガンド（ＮＲＧ１）、キネシンファミリーメンバー１３Ｂ（ＫＩＦ１３Ｂ）、アドレナリン作動Ｂ３レセプター（ＡＤＲＢ３）、グリコシルホスファチジルイノシトール細胞表面レセプター（ＧＦＲＡ２）、ＲＥＴ原癌遺伝子（ＲＥＴ）、Ｇ−タンパク質共役タンパク質レセプター１４７（ＧＰＲ１４７）、ニューロゲニン３転写因子（ＮＥＵＲＯＧ３）、パラジン（予想タンパク質チロシンホスファターゼ）（ＰＡＬＤ）、メチルトランスフェラーゼファミリーメンバー１（ＨＥＭＫ１）、線維芽細胞成長因子４癌遺伝子（ＦＧＦ４）、５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）レセプター１Ａ（ＨＴＲ１Ａ）、リングフィンガータンパク質１８０（ＲＮＦ１８０）、ＥＧＦＲ共増幅及び過剰発現（ＤＫＦＺＰ５６４Ｋ０８２２もしくはＥＣＯＰ）、亜鉛フィンガータンパク質５９６（ＺＮＦ５９６）、７回膜貫通型ヘリックスレセプター類似（ＬＯＣ４４１３２０）、Ｌ−トレオニンデヒドロゲナーゼ（ＴＤＨ）、仮想タンパク質Ｃ８ｏｒｆ７９（Ｃ８ｏｒｆ７９／ＦＬＪ３６９８０）、線維芽細胞成長因子レセプター２０（ＦＧＦ２０）、ＥＦ−ハンドドメインファミリーメンバー２Ａ（ＬＯＣ２８６０９７／ＥＦＨＡ２）、Ｎ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ（酸性セラミナーゼ）１（ＡＳＡＨ１）、ｎｏｄａｌホモログ（ＮＯＤＡＬ）、亜鉛フィンガータンパク質５３２に類似の仮想タンパク質（ＬＯＣ３９９７８３）、転写因子ＬＩＭホメオドメイン（ＩＳＬ２）、マトリックスメタロペプチダーゼ９（ＭＭＰ９）、高ロイシン反復含有４９（ＬＲＲＣ４９）、腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリーメンバー１１（ＴＮＦＳＦ１１）、ｒａｓホモログ遺伝子ファミリーメンバーＤ（ＲＨＯＤ）、キネシンファミリーメンバーＣ２（ＫＩＦＣ２）、クロモソーム２０オープンリーディングフレーム２３（キネシン様モータータンパク質）（Ｃ２０ｏｒｆ２３）、ＧＤＮＦファミリーレセプターアルファ１（ＧＦＲＡ１）、グルタチオンペルオキシダーゼ７（ＧＰＸ７）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆホモログ２（ＤＫＫ２）、ネトリン１（ＮＴＮ１）、マトリックスメタロペプチダーゼ９（ＭＭＰ９）、腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー１１（ＴＮＦＳＦ１１）、ｒａｓホモログ遺伝子ファミリーメンバーＤ（ＲＨＯＤ）、及び高ロイシン反復含有４９（ＬＲＲＣ４９）からなる群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について前記試料をアッセイする工程を含み、ここで、アッセイされたＣｐＧアイランドのメチル化は、被験者における癌の指標となる、方法。
【請求項２】
哺乳類のオスにおける癌の予知方法であって、下記工程：
癌の予知を必要とする被験者由来の生物学的試料を準備する工程；並びに
ニューレグリン細胞表面リガンド（ＮＲＧ１）、キネシンファミリーメンバー１３Ｂ（ＫＩＦ１３Ｂ）、アドレナリン作動Ｂ３レセプター（ＡＤＲＢ３）、グリコシルホスファチジルイノシトール細胞表面レセプター（ＧＦＲＡ２）、ＲＥＴ原癌遺伝子（ＲＥＴ）、Ｇ−タンパク質共役タンパク質レセプター１４７（ＧＰＲ１４７）、ニューロゲニン３転写因子（ＮＥＵＲＯＧ３）、パラジン（予想タンパク質チロシンホスファターゼ）（ＰＡＬＤ）、メチルトランスフェラーゼファミリーメンバー１（ＨＥＭＫ１）、線維芽細胞成長因子４癌遺伝子（ＦＧＦ４）、５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）レセプター１Ａ（ＨＴＲ１Ａ）、リングフィンガータンパク質１８０（ＲＮＦ１８０）、ＥＧＦＲ共増幅及び過剰発現（ＤＫＦＺＰ５６４Ｋ０８２２もしくはＥＣＯＰ）、亜鉛フィンガータンパク質５９６（ＺＮＦ５９６）、７回膜貫通型ヘリックスレセプター類似（ＬＯＣ４４１３２０）、Ｌ−トレオニンデヒドロゲナーゼ（ＴＤＨ）、仮想タンパク質Ｃ８ｏｒｆ７９（Ｃ８ｏｒｆ７９／ＦＬＪ３６９８０）、線維芽細胞成長因子レセプター２０（ＦＧＦ２０）、ＥＦ−ハンドドメインファミリーメンバー２Ａ（ＬＯＣ２８６０９７／ＥＦＨＡ２）、Ｎ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ（酸性セラミナーゼ）１（ＡＳＡＨ１）、ｎｏｄａｌホモログ（ＮＯＤＡＬ）、亜鉛フィンガータンパク質５３２に類似の仮想タンパク質（ＬＯＣ３９９７８３）、転写因子ＬＩＭホメオドメイン（ＩＳＬ２）、マトリックスメタロペプチダーゼ９（ＭＭＰ９）、高ロイシン反復含有４９（ＬＲＲＣ４９）、腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリーメンバー１１（ＴＮＦＳＦ１１）、ｒａｓホモログ遺伝子ファミリーメンバーＤ（ＲＨＯＤ）、キネシンファミリーメンバーＣ２（ＫＩＦＣ２）、クロモソーム２０オープンリーディングフレーム２３（キネシン様モータータンパク質）（Ｃ２０ｏｒｆ２３）、ＧＤＮＦファミリーレセプターアルファ１（ＧＦＲＡ１）、グルタチオンペルオキシダーゼ７（ＧＰＸ７）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆホモログ２（ＤＫＫ２）、ネトリン１（ＮＴＮ１）、マトリックスメタロペプチダーゼ９（ＭＭＰ９）、腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー１１（ＴＮＦＳＦ１１）、ｒａｓホモログ遺伝子ファミリーメンバーＤ（ＲＨＯＤ）、及び高ロイシン反復含有４９（ＬＲＲＣ４９）からなる群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について前記試料をアッセイする工程を含み、ここで、アッセイされたＣｐＧアイランドのメチル化は、癌のグレードもしくはステージ、及び／又は治療後の被験者の無病生存期間の長さの指標となる、方法。
【請求項３】
被験者における癌治療の効果の評価方法であって、下記工程：
癌の治療コースを受けている被験者由来の第一生物学的試料及び第二生物学的試料を準備する工程、ここで、第一生物学的試料を第二生物学的試料よりも早い時期に採取し、第二生物学的試料を治療コース中または治療コース後に採取する；並びに
ニューレグリン細胞表面リガンド（ＮＲＧ１）、キネシンファミリーメンバー１３Ｂ（ＫＩＦ１３Ｂ）、アドレナリン作動Ｂ３レセプター（ＡＤＲＢ３）、グリコシルホスファチジルイノシトール細胞表面レセプター（ＧＦＲＡ２）、ＲＥＴ原癌遺伝子（ＲＥＴ）、Ｇ−タンパク質共役タンパク質レセプター１４７（ＧＰＲ１４７）、ニューロゲニン３転写因子（ＮＥＵＲＯＧ３）、パラジン（予想タンパク質チロシンホスファターゼ）（ＰＡＬＤ）、メチルトランスフェラーゼファミリーメンバー１（ＨＥＭＫ１）、線維芽細胞成長因子４癌遺伝子（ＦＧＦ４）、５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）レセプター１Ａ（ＨＴＲ１Ａ）、リングフィンガータンパク質１８０（ＲＮＦ１８０）、ＥＧＦＲ共増幅及び過剰発現（ＤＫＦＺＰ５６４Ｋ０８２２もしくはＥＣＯＰ）、亜鉛フィンガータンパク質５９６（ＺＮＦ５９６）、７回膜貫通型ヘリックスレセプター類似（ＬＯＣ４４１３２０）、Ｌ−トレオニンデヒドロゲナーゼ（ＴＤＨ）、仮想タンパク質Ｃ８ｏｒｆ７９（Ｃ８ｏｒｆ７９／ＦＬＪ３６９８０）、線維芽細胞成長因子レセプター２０（ＦＧＦ２０）、ＥＦ−ハンドドメインファミリーメンバー２Ａ（ＬＯＣ２８６０９７／ＥＦＨＡ２）、Ｎ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ（酸性セラミナーゼ）１（ＡＳＡＨ１）、ｎｏｄａｌホモログ（ＮＯＤＡＬ）、亜鉛フィンガータンパク質５３２に類似の仮想タンパク質（ＬＯＣ３９９７８３）、転写因子ＬＩＭホメオドメイン（ＩＳＬ２）、マトリックスメタロペプチダーゼ９（ＭＭＰ９）、高ロイシン反復含有４９（ＬＲＲＣ４９）、腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリーメンバー１１（ＴＮＦＳＦ１１）、ｒａｓホモログ遺伝子ファミリーメンバーＤ（ＲＨＯＤ）、キネシンファミリーメンバーＣ２（ＫＩＦＣ２）、クロモソーム２０オープンリーディングフレーム２３（キネシン様モータータンパク質）（Ｃ２０ｏｒｆ２３）、ＧＤＮＦファミリーレセプターアルファ１（ＧＦＲＡ１）、グルタチオンペルオキシダーゼ７（ＧＰＸ７）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆホモログ２（ＤＫＫ２）、ネトリン１（ＮＴＮ１）、マトリックスメタロペプチダーゼ９（ＭＭＰ９）、腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー１１（ＴＮＦＳＦ１１）、ｒａｓホモログ遺伝子ファミリーメンバーＤ（ＲＨＯＤ）、及び高ロイシン反復含有４９（ＬＲＲＣ４９）群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について第一及び第二生物学的試料をアッセイする工程を含み、ここで、治療コースの後アッセイされたＣｐＧアイランドのメチル化の減少もしくは欠如は、治療が有効であることを示す、方法。
【請求項４】
哺乳類のオスにおける前立腺癌の診断方法であって、下記工程：
ニューレグリン細胞表面リガンド（ＮＲＧ１）、キネシンファミリーメンバー１３Ｂ（ＫＩＦ１３Ｂ）、アドレナリン作動Ｂ３レセプター（ＡＤＲＢ３）、グリコシルホスファチジルイノシトール細胞表面レセプター（ＧＦＲＡ２）、ＲＥＴ原癌遺伝子（ＲＥＴ）、Ｇ−タンパク質共役タンパク質レセプター１４７（ＧＰＲ１４７）、ニューロゲニン３転写因子（ＮＥＵＲＯＧ３）、パラジン（タンパク質チロシンホスファターゼ）（ＰＡＬＤ）、メチルトランスフェラーゼファミリーメンバー１（ＨＥＭＫ１）、線維芽細胞成長因子４癌遺伝子（ＦＧＦ４）、５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）レセプター１Ａ（ＨＴＲ１Ａ）、リングフィンガータンパク質１８０（ＬＯＣ２８５６７１もしくはＲＮＦ１８０）、ＥＧＦＲ共増幅及び過剰発現（ＤＫＦＺＰ５６４０８２２もしくはＥＣＯＰ）、亜鉛フィンガータンパク質５９６（ＺＮＦ５９６）、７回膜貫通型ヘリックスレセプター類似（ＬＯＣ４４１３２０）、Ｌ−トレオニンデヒドロゲナーゼ（ＴＤＨ）、仮想タンパク質ＦＬＪ３６９８０（ＦＬＪ３６９８０）、線維芽細胞成長因子レセプター２０（ＦＧＦ２０）、ＥＦ−ハンドドメインファミリーメンバー２Ａ（ＬＯＣ２８６０９７）（ＥＦＨＡ２）、Ｎ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ（酸性セラミナーゼ）１（ＡＳＡＨ１）、ｎｏｄａｌホモログ（ＴＧＦ−βシグナル伝達経路）（ＮＯＤＡＬ）、亜鉛フィンガータンパク質５３２に類似の仮想タンパク質（ＬＯＣ３９９７８３）、及び転写因子ＬＩＭホメオドメイン（ＩＳＬ２）、マトリックスメタロペプチダーゼ９（ＭＭＰ９）、高ロイシン反復含有４９（ＬＲＲＣ４９）、腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリーメンバー１１（ＴＮＦＳＦ１１）、ｒａｓホモログ遺伝子ファミリーメンバーＤ（ＲＨＯＤ）、キネシンファミリーメンバーＣ２（ＫＩＦＣ２）、クロモソーム２０オープンリーディングフレーム２３（キネシン様モータータンパク質）（Ｃ２０ｏｒｆ２３）、ＧＤＮＦファミリーレセプターアルファ１（ＧＦＲＡ１）、グルタチオンペルオキシダーゼ７（ＧＰＸ７）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆホモログ２（ＤＫＫ２）、ネトリン１（ＮＴＮ１）、Ｒａｓ関連（ＲａｌＧＤＳ／ＡＦ−６）ドメインファミリー５（ＲＡＳＳＦ５）、及びＨｔｒＡセリンペプチダーゼ４（ＨＴＲＡ４）からなる群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について哺乳類のオス由来の前記生物学的試料をアッセイする工程；並びに
任意に、前立腺癌においてメチル化されることが知られ、良性前立腺過形成（ＢＰＨ）においては検出可能にメチル化されないか、もしくは低レベルでメチル化されることが知られている少なくとも１つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について前記生物学的試料をアッセイする工程をさらに含み；ここで、アッセイされたＣｐＧアイランド（単数もしくは複数）のメチル化は、被験者における前立腺癌の指標となる、方法。
【請求項５】
前記診断方法が下記工程：
ニューレグリン細胞表面リガンド（ＮＲＧ１）、キネシンファミリーメンバー１３Ｂ（ＫＩＦ１３Ｂ）、アドレナリン作動Ｂ３レセプター（ＡＤＲＢ３）、グリコシルホスファチジルイノシトール細胞表面レセプター（ＧＦＲＡ２）、ＲＥＴ原癌遺伝子（ＲＥＴ）、Ｇ−タンパク質共役タンパク質レセプター１４７（ＧＰＲ１４７）、ニューロゲニン３転写因子（ＮＥＵＲＯＧ３）、パラジン（タンパク質チロシンホスファターゼ）（ＰＡＬＤ）、メチルトランスフェラーゼファミリーメンバー１（ＨＥＭＫ１）、線維芽細胞成長因子４癌遺伝子（ＦＧＦ４）、５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）レセプター１Ａ（ＨＴＲ１Ａ）、リングフィンガータンパク質１８０（ＬＯＣ２８５６７１もしくはＲＮＦ１８０）、ＥＧＦＲ共増幅及び過剰発現（ＤＫＦＺＰ５６４０８２２もしくはＥＣＯＰ）、亜鉛フィンガータンパク質５９６（ＺＮＦ５９６）、７回膜貫通型ヘリックスレセプター類似（ＬＯＣ４４１３２０）、Ｌ−トレオニンデヒドロゲナーゼ（ＴＤＨ）、仮想タンパク質ＦＬＪ３６９８０（ＦＬＪ３６９８０）、線維芽細胞成長因子レセプター２０（ＦＧＦ２０）、ＥＦ−ハンドドメインファミリーメンバー２Ａ（ＬＯＣ２８６０９７もしくはＥＦＨＡ２）、Ｎ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ（酸性セラミナーゼ）１（ＡＳＡＨ１）、ｎｏｄａｌホモログ（ＴＧＦ−βシグナル伝達経路）（ＮＯＤＡＬ）、亜鉛フィンガータンパク質５３２に類似の仮想タンパク質（ＬＯＣ３９９７８３）、及び転写因子ＬＩＭホメオドメイン（ＩＳＬ２）からなる群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について前記試料をアッセイする工程；並びに
少なくとも３つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について前記試料をアッセイする工程を含み、ここで、前立腺癌においてメチル化されることが知られている少なくとも１つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドがＢＰＨにおいてはメチル化されないか、又は約１０％以下のレベルでメチル化されることも知られており少なくとも３つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化は、被験者における前立腺癌の指標となるものである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前立腺癌の診断を必要とする哺乳類のオス由来の生物学的試料を準備する工程を含む、請求項４又は５記載の方法。
【請求項７】
哺乳類のオスにおける前立腺癌の予知方法であって、下記工程：
ニューレグリン細胞表面リガンド（ＮＲＧ１）、キネシンファミリーメンバー１３Ｂ（ＫＩＦ１３Ｂ）、アドレナリン作動Ｂ３レセプター（ＡＤＲＢ３）、グリコシルホスファチジルイノシトール細胞表面レセプター（ＧＦＲＡ２）、ＲＥＴ原癌遺伝子（ＲＥＴ）、Ｇ−タンパク質共役タンパク質レセプター１４７（ＧＰＲ１４７）、ニューロゲニン３転写因子（ＮＥＵＲＯＧ３）、パラジン（タンパク質チロシンホスファターゼ）（ＰＡＬＤ）、メチルトランスフェラーゼファミリーメンバー１（ＨＥＭＫ１）、線維芽細胞成長因子４癌遺伝子（ＦＧＦ４）、５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）レセプター１Ａ（ＨＴＲ１Ａ）、リングフィンガータンパク質１８０（ＬＯＣ２８５６７１）（ＲＮＦ１８０）、ＥＧＦＲ共増幅及び過剰発現（ＥＣＯＰ）（ＤＫＦＺＰ５６４０８２２）、亜鉛フィンガータンパク質５９６（ＺＮＦ５９６）、７回膜貫通型ヘリックスレセプター類似（ＬＯＣ４４１３２０）、Ｌ−トレオニンデヒドロゲナーゼ（ＴＤＨ）、仮想タンパク質ＦＬＪ３６９８０（ＦＬＪ３６９８０）、線維芽細胞成長因子レセプター２０（ＦＧＦ２０）、ＥＦ−ハンドドメインファミリーメンバー２Ａ（ＬＯＣ２８６０９７）（ＥＦＨＡ２）、Ｎ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ（酸性セラミナーゼ）１（ＡＳＡＨ１）、ｎｏｄａｌホモログ（ＴＧＦ−Ｂシグナル伝達経路）（ＮＯＤＡＬ）、亜鉛フィンガータンパク質５３２に類似の仮想タンパク質（ＬＯＣ３９９７８３）、及び転写因子ＬＩＭホメオドメイン（ＩＳＬ２）、マトリックスメタロペプチダーゼ９（ＭＭＰ９）、高ロイシン反復含有４９（ＬＲＲＣ４９）、腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリーメンバー１１（ＴＮＦＳＦ１１）、ｒａｓホモログ遺伝子ファミリーメンバーＤ（ＲＨＯＤ）、キネシンファミリーメンバーＣ２（ＫＩＦＣ２）、クロモソーム２０オープンリーディングフレーム２３（キネシン様モータータンパク質）（Ｃ２０ｏｒｆ２３）、ＧＤＮＦファミリーレセプターアルファ１（ＧＦＲＡ１）、グルタチオンペルオキシダーゼ７（ＧＰＸ７）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆホモログ２（ＤＫＫ２）、ネトリン１（ＮＴＮ１）、Ｒａｓ関連（ＲａｌＧＤＳ／ＡＦ−６）ドメインファミリー５（ＲＡＳＳＦ５）、及びＨｔｒＡセリンペプチダーゼ４（ＨＴＲＡ４）からなる群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について前記試料をアッセイする工程；並びに
任意に、前立腺癌においてメチル化されることが知られ、良性前立腺過形成（ＢＰＨ）においては検出可能にメチル化されないか、もしくは低レベルでメチル化されることが知られている少なくとも１つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について前記生物学的試料をアッセイする工程を含み、ここで、アッセイされたＣｐＧアイランド（単数もしくは複数）のメチル化の減少又は欠如は、癌のグレードもしくはステージ、及び／又は治療後の被験者の無病生存期間の長さの指標となる、方法。
【請求項８】
前記予知方法が下記工程：
ニューレグリン細胞表面リガンド（ＮＲＧ１）、キネシンファミリーメンバー１３Ｂ（ＫＩＦ１３Ｂ）、アドレナリン作動Ｂ３レセプター（ＡＤＲＢ３）、グリコシルホスファチジルイノシトール細胞表面レセプター（ＧＦＲＡ２）、ＲＥＴ原癌遺伝子（ＲＥＴ）、Ｇ−タンパク質共役タンパク質レセプター１４７（ＧＰＲ１４７）、ニューロゲニン３転写因子（ＮＥＵＲＯＧ３）、パラジン（タンパク質チロシンホスファターゼ）（ＰＡＬＤ）、メチルトランスフェラーゼファミリーメンバー１（ＨＥＭＫ１）、線維芽細胞成長因子４癌遺伝子（ＦＧＦ４）、５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）レセプター１Ａ（ＨＴＲ１Ａ）、リングフィンガータンパク質１８０（ＬＯＣ２８５６７１もしくはＲＮＦ１８０）、ＥＧＦＲ共増幅及び過剰発現（ＤＫＦＺＰ５６４０８２２もしくはＥＣＯＰ）、亜鉛フィンガータンパク質５９６（ＺＮＦ５９６）、７回膜貫通型ヘリックスレセプター類似（ＬＯＣ４４１３２０）、Ｌ−トレオニンデヒドロゲナーゼ（ＴＤＨ）、仮想タンパク質ＦＬＪ３６９８０（ＦＬＪ３６９８０）、線維芽細胞成長因子レセプター２０（ＦＧＦ２０）、ＥＦ−ハンドドメインファミリーメンバー２Ａ（ＬＯＣ２８６０９７もしくはＥＦＨＡ２）、Ｎ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ（酸性セラミナーゼ）１（ＡＳＡＨ１）、ｎｏｄａｌホモログ（ＴＧＦ−Ｂシグナル伝達経路）（ＮＯＤＡＬ）、亜鉛フィンガータンパク質５３２に類似の仮想タンパク質（ＬＯＣ３９９７８３）、及び転写因子ＬＩＭホメオドメイン（ＩＳＬ２）からなる群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について前記試料をアッセイする工程；並びに
少なくとも３つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について前記試料をアッセイする工程を含み、ここで、前立腺癌においてメチル化されることが知られている少なくとも１つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドがＢＰＨにおいてはメチル化されないか、又は約１０％以下のレベルでメチル化されることも知られており、少なくとも３つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化は、癌のグレードもしくはステージ、及び／又は治療の後の無病生存期間の長さの指標となる、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前立腺癌の予後診断を必要とする哺乳類のオス由来の生物学的試料を準備する工程を含む、請求項７又は８記載の方法。
【請求項１０】
被験者における前立腺癌治療の効果の評価方法であって、下記工程：
癌の治療コースを受けている被験者由来の第一生物学的試料及び第二生物学的試料を準備する工程、ここで、第一生物学的試料を第二生物学的試料よりも早い時期に採取し、第二生物学的試料を治療コース中又は治療コース後に採取する；ニューレグリン細胞表面リガンド（ＮＲＧ１）、キネシンファミリーメンバー１３Ｂ（ＫＩＦ１３Ｂ）、アドレナリン作動Ｂ３レセプター（ＡＤＲＢ３）、グリコシルホスファチジルイノシトール細胞表面レセプター（ＧＦＲＡ２）、ＲＥＴ原癌遺伝子（ＲＥＴ）、Ｇ−タンパク質共役タンパク質レセプター１４７（ＧＰＲ１４７）、ニューロゲニン３転写因子（ＮＥＵＲＯＧ３）、パラジン（タンパク質チロシンホスファターゼ）（ＰＡＬＤ）、メチルトランスフェラーゼファミリーメンバー１（ＨＥＭＫ１）、線維芽細胞成長因子４癌遺伝子（ＦＧＦ４）、５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）レセプター１Ａ（ＨＴＲ１Ａ）、リングフィンガータンパク質１８０（ＬＯＣ２８５６７１）（ＲＮＦ１８０）、ＥＧＦＲ共増幅及び過剰発現（ＥＣＯＰ）（ＤＫＦＺＰ５６４０８２２）、亜鉛フィンガータンパク質５９６（ＺＮＦ５９６）、７回膜貫通型ヘリックスレセプター類似（ＬＯＣ４４１３２０）、Ｌ−トレオニンデヒドロゲナーゼ（ＴＤＨ）、仮想タンパク質ＦＬＪ３６９８０（ＦＬＪ３６９８０）、線維芽細胞成長因子レセプター２０（ＦＧＦ２０）、ＥＦ−ハンドドメインファミリーメンバー２Ａ（ＬＯＣ２８６０９７）（ＥＦＨＡ２）、Ｎ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ（酸性セラミナーゼ）１（ＡＳＡＨ１）、ｎｏｄａｌホモログ（ＴＧＦ−Ｂシグナル伝達経路）（ＮＯＤＡＬ）、亜鉛フィンガータンパク質５３２に類似の仮想タンパク質（ＬＯＣ３９９７８３）、及び転写因子ＬＩＭホメオドメイン（ＩＳＬ２）、マトリックスメタロペプチダーゼ９（ＭＭＰ９）、高ロイシン反復含有４９（ＬＲＲＣ４９）、腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリーメンバー１１（ＴＮＦＳＦ１１）、ｒａｓホモログ遺伝子ファミリーメンバーＤ（ＲＨＯＤ）、キネシンファミリーメンバーＣ２（ＫＩＦＣ２）、クロモソーム２０オープンリーディングフレーム２３（キネシン様モータータンパク質）（Ｃ２０ｏｒｆ２３）、ＧＤＮＦファミリーレセプターアルファ１（ＧＦＲＡ１）、グルタチオンペルオキシダーゼ７（ＧＰＸ７）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆホモログ２（ＤＫＫ２）、ネトリン１（ＮＴＮ１）、Ｒａｓ関連（ＲａｌＧＤＳ／ＡＦ−６）ドメインファミリー５（ＲＡＳＳＦ５）、及びＨｔｒＡセリンペプチダーゼ４（ＨＴＲＡ４）からなる群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について前記第一及び第二試料をアッセイする工程；並びに
任意に、前立腺癌においてメチル化されることが知られ、良性前立腺過形成（ＢＰＨ）においては検出可能にメチル化されないか、もしくは低レベルでメチル化されることが知られている少なくとも１つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について前記生物学的試料をアッセイする工程を含み、ここで、治療コース後にアッセイされた少なくとも３つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化の減少もしくは欠如は、治療が有効であることを示す、方法。
【請求項１１】
前記第一及び第二試料が治療コースの間、定期的に哺乳類のオスから採取され、及び前記評価方法が下記工程：
ニューレグリン細胞表面リガンド（ＮＲＧ１）、キネシンファミリーメンバー１３Ｂ（ＫＩＦ１３Ｂ）、アドレナリン作動Ｂ３レセプター（ＡＤＲＢ３）、グリコシルホスファチジルイノシトール細胞表面レセプター（ＧＦＲＡ２）、ＲＥＴ原癌遺伝子（ＲＥＴ）、Ｇ−タンパク質共役タンパク質レセプター１４７（ＧＰＲ１４７）、ニューロゲニン３転写因子（ＮＥＵＲＯＧ３）、パラジン（タンパク質チロシンホスファターゼ）（ＰＡＬＤ）、メチルトランスフェラーゼファミリーメンバー１（ＨＥＭＫ１）、線維芽細胞成長因子４癌遺伝子（ＦＧＦ４）、５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）レセプター１Ａ（ＨＴＲ１Ａ）、リングフィンガータンパク質１８０（ＬＯＣ２８５６７１もしくはＲＮＦ１８０）、ＥＧＦＲ共増幅及び過剰発現（ＤＫＦＺＰ５６４０８２２もしくはＥＣＯＰ）、亜鉛フィンガータンパク質５９６（ＺＮＦ５９６）、７回膜貫通型ヘリックスレセプター類似（ＬＯＣ４４１３２０）、Ｌ−トレオニンデヒドロゲナーゼ（ＴＤＨ）、仮想タンパク質ＦＬＪ３６９８０（ＦＬＪ３６９８０）、線維芽細胞成長因子レセプター２０（ＦＧＦ２０）、ＥＦ−ハンドドメインファミリーメンバー２Ａ（ＬＯＣ２８６０９７もしくはＥＦＨＡ２）、Ｎ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ（酸性セラミナーゼ）１（ＡＳＡＨ１）、ｎｏｄａｌホモログ（ＴＧＦ−Ｂシグナル伝達経路）（ＮＯＤＡＬ）、亜鉛フィンガータンパク質５３２に類似の仮想タンパク質（ＬＯＣ３９９７８３）、及び転写因子ＬＩＭホメオドメイン（ＩＳＬ２）からなる群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について前記試料をアッセイする工程；並びに
少なくとも３つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化について前記試料をアッセイする工程を含み、ここで、前立腺癌においてメチル化されることが知られている少なくとも１つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドがＢＰＨにおいてはメチル化されないか、又は約１０％以下のレベルでメチル化されることも知られており、治療コース後に少なくとも３つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化は、治療が有効であることを示す、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前立腺癌においてメチル化されることが知られ、ＢＰＨにおいては非メチル化もしくは低レベルでメチル化されることが知られている少なくとも１つのＣｐＧアイランドがグルタチオンＳ−トランスフェラーゼＰ１（ＧＳＴＰ１）、グルタチオンペルオキシダーゼ３（ＧＰＸ３）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼＭ１（ＧＳＴＭ１）、Ｃｕｂ及びＳｕｓｈｉ多機能ドメイン１（ＣＳＭＤ１）、腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリーメンバー１０Ｃ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ）、腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリー１０Ｄ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ）、分泌ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質１（ＳＦＲＰ１）、分泌ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質２（ＳＦＲＰ２）、ｄｉｃｋｋｏｐｆホモログ３（ＤＫＫ３）、プロスタグランジン−エンドペルオキシドシンターゼ２（ＰＴＧＳ２）、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子１Ｃ（ＣＤＫＮ１Ｃ／ｐ５７）、Ｒａｓ関連（ＲａｌＧＤＳ／ＡＦ−６）ドメインファミリー１（ＲＡＳＳＦ１）、Ｇタンパク質共役レセプター６２（ＧＰＲ６２）に関連する１以上のＣｐＧアイランドであるか当該ＣｐＧアイランドを含む、請求項４〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前立腺癌においてメチル化されることが知られ、ＢＰＨにおいては非メチル化もしくは低レベルでメチル化されることが知られている少なくとも１つのＣｐＧアイランドがグルタチオンＳ−トランスフェラーゼＰ１（ＧＳＴＰ１）に関連する１以上のＣｐＧアイランドであるか当該ＣｐＧアイランドを含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも４つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化についてアッセイする工程を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも５つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化についてアッセイする工程を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも６つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化についてアッセイする工程を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも７つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化についてアッセイする工程を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも８つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化についてアッセイする工程を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも９つの遺伝子に関連するＣｐＧアイランドのメチル化についてアッセイする工程を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
ＣｐＧアイランドのメチル化についてのアッセイが、
（ａ）配列番号：１もしくは２［ＮＲＧ１］、配列番号：３もしくは４［ＡＤＲＢ３］、配列番号：５もしくは６［ＧＦＲＡ２］、配列番号：７もしくは８［ＫＩＦ１３Ｂ］、配列番号：９もしくは１０［ＲＥＴ］、配列番号：１１もしくは１２［ＧＰＲ１４７］、配列番号：１３もしくは１４［ＮＥＵＲＯＧ３］、配列番号：１５もしくは１６［ＰＡＬＤ］、配列番号：１７もしくは１８［ＨＥＭＫ１］、配列番号：１９もしくは２０［ＦＧＦ４］、配列番号：２１もしくは２２［ＧＰＲ６２］、配列番号：２３もしくは２４［ＨＴＲ１Ａ］、配列番号：２５もしくは２６［ＲＮＦ１８０］、配列番号：２７もしくは２８［ＤＫＦＺＰ５６４０８２２］、配列番号：２９もしくは３０［ＺＮＦ５９６］、配列番号：３３もしくは３４［ＬＯＣ４４１３２０］、配列番号：３５もしくは３６［ＴＤＫ］、配列番号：３７もしくは３８［ＦＬＪ３６９８０］、配列番号：３９もしくは４０［ＦＧＦ２０］、配列番号：４１もしくは４２［ＥＦＨＡ２］、配列番号：４３もしくは４４［ＡＳＡＨ１］、配列番号：４９もしくは５０［ＮＯＤＡＬ］、配列番号：５１もしくは５２［ＬＯＣ３９９７８３］、配列番号：５３もしくは５４［ＩＳＬ２］及び
（ｂ）（ａ）の完全にもしくは部分的にメチル化された誘導体
からなる群より選ばれる標的配列における少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含む標的配列を増幅する工程を含み、それにより増幅配列が生成される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
ＣｐＧアイランドのメチル化についてのアッセイが、
（ａ）配列番号：１１９もしくは２２０［ＫＩＦＣ２］、配列番号：１２１もしくは１２２［Ｃ２０ＯＲＦ２３］、配列番号：１２３もしくは１２４［ＧＦＲＡ１］、配列番号：１２９もしくは１３０［ＤＫＫ２］、配列番号：１３５もしくは１３６［ＮＴＮ１］、配列番号：１９５［ＲＨＯＤ］、配列番号：１９６［ＴＮＦＳＦ１１］、配列番号：１９７［ＭＭＰ９］、及び配列番号：１９８［ＬＲＲＣ４９］、
（ｂ）（ａ）の完全にもしくは部分的にメチル化されたシトシン誘導体、並びに
（ｃ）（ｂ）の脱アミノ化誘導体
からなる群より選ばれる標的配列における少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド、又はメチル化シトシンＣｐＧジヌクレオチドの脱アミノ化誘導体を含む標的配列を増幅する工程を含み、それにより増幅配列が生成される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
ＣｐＧアイランドのメチル化についてのアッセイが、
（ａ）配列番号：１１９もしくは２２０［ＫＩＦＣ２］、配列番号：１２１もしくは１２２［Ｃ２０ＯＲＦ２３］、配列番号：１２３もしくは１２４［ＧＦＲＡ１］、配列番号：１２９もしくは１３０［ＤＫＫ２］、配列番号：１３５もしくは１３６［ＮＴＮ１］、配列番号：１３３もしくは１３４［ＲＡＳＳＦ５］及び配列番号：１９３もしくは１９４［ＨＴＲＡ４］、
（ｂ）（ａ）の完全にもしくは部分的にメチル化されたシトシン誘導体、並びに
（ｃ）（ｂ）の脱アミノ化誘導体
からなる群より選ばれる標的配列における少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド、又はメチル化シトシンＣｐＧジヌクレオチドの脱アミノ化誘導体を含む標的配列を増幅する工程を含み、それにより増幅配列が生成される、請求項４、７、１０、又は請求項１２〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
メチル化についてのアッセイが、少なくとも１つのジデオキシヌクレオチドの存在下でターミネーター結合リニア増幅を行う工程及び増幅断片のサイズを決定する工程を含み、それによりシチジン残基のメチル化状態が決定される、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
アッセイが１つのジデオキシヌクレオチドのみの存在下でリニア増幅を行う工程を含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
アッセイが２つのジデオキシヌクレオチドのみの存在下でリニア増幅を行う工程を含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
少なくとも１つのジデオキシヌクレオチドが、ジデオキシアデニン、ジデオキシチジン（ｄｉｄｅｏｘｃｙｔｉｄｉｎｅ）、ジデオキシグアニン（ｄｉｄｅｏｘｇｕａｎｉｎｅ）及びジデオキシチミジン（ｄｉｄｅｏｘｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）からなる群より選ばれる、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
ＣｐＧアイランドのメチル化状態を決定するターミネーター結合リニア増幅法であって、下記工程：
（ａ）ターミネーター結合リニア増幅のためのＤＮＡ試料を準備する工程
（ｂ）脱アミノ化条件下でＤＮＡ試料をインキュベートする工程、それにより脱アミノ化ＤＮＡ試料が生成される
（ｃ）任意に、脱アミノ化ＤＮＡ試料を精製する工程
（ｄ）１以上のＣｐＧアイランド又は１以上のＣｐＧアイランドの部分を含む標的配列（単数もしくは複数）を増幅する工程、それにより１以上の増幅標的配列が生成される
（ｅ）任意に、１以上の増幅標的配列を精製する工程
（ｆ）１以上の異なる長さの断片を生成するためにプライマー及びジデオキシヌクレオチドの存在下で１以上の増幅標的配列をリニア増幅する工程、ここで、それぞれの長さはプライマーの５´末端からジデオキシヌクレオチドが組み込まれた位置までの塩基の距離と一致する；
（ｇ）任意に、１以上の断片を精製する工程、並びに
（ｈ）前記長さを決定するために１以上の断片を分析する工程及びそれにより１以上の増幅標的配列内のメチル化シトシンのメチル化状態を決定する工程
を含む、方法。
【請求項２８】
（ｄ）の標的配列（単数もしくは複数）を増幅する工程がＰＣＲ増幅、等温増幅、又はＰＣＲと等温増幅の組み合わせを含む、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
脱アミノ化条件が化学的脱アミノ化剤を含む、請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
脱アミノ化剤が亜硫酸水素塩である、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
脱アミノ化条件が酵素的脱アミノ化剤を含む、請求項２７記載の方法。
【請求項３２】
脱アミノ化剤がＤＮＡシチジンデアミナーゼ活性を有する酵素である、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
１以上の増幅標的配列が、１つのジデオキシヌクレオチドのみの存在下でリニア増幅される、請求項２７〜３２のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３４】
１以上の増幅標的配列が、２つのジデオキシヌクレオチドのみの存在下でリニア増幅される、請求項２７〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
少なくとも1つのジデオキシヌクレオチドが、ジデオキシアデニン、ジデオキシシチジン、ジデオキシグアニン及びジデオキシチミジンからなる群より選ばれる、請求項２７〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
下記工程：
（ｉ）非メチル化シトシンの脱アミノ化に適した条件下で標的配列を含むＣｐＧアイランドを処理する工程；及び
（ｉｉ）処理した標的配列を増幅する工程、それによりリニア増幅のための増幅配列が生成される
をさらに含む方法である、請求項２７〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
下記工程：
（ｉ）ＤＮＡ試料を準備する工程
（ｉｉ）メチル化結合等温増幅を用いてＤＮＡ試料を増幅する工程、それによりターミネーター結合リニア増幅のためのＤＮＡ試料である増幅ＤＮＡ試料が生成される
をさらに含む方法である、請求項２７〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
リニア増幅により生成された複数の断片が検出可能なタグを含む、請求項２７〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
それぞれの標的配列から生成されたそれぞれの複数の断片が同じ検出可能なタグを含むように、リニア増幅がそれぞれの増幅標的配列のための検出可能なタグを含む異なるプライマーを添加する工程を含む、請求項２７〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
ニューレグリン細胞表面リガンド（ＮＲＧ１）、アドレナリン作動Ｂ３レセプター（ＡＤＲＢ３）、グリコシルホスファチジルイノシトール細胞表面レセプター（ＧＦＲＡ２）、キネシンファミリーメンバー１３Ｂ（ＫＩＦ１３Ｂ）、ＲＥＴ原癌遺伝子（ＲＥＴ）、Ｇ−タンパク質共役タンパク質レセプター１４７（ＧＰＲ１４７）、ニューロゲニン３転写因子（ＮＥＵＲＯＧ３）、パラジン（タンパク質チロシンホスファターゼ）（ＰＡＬＤ）、メチルトランスフェラーゼファミリーメンバー１（ＨＥＭＫ１）、線維芽細胞成長因子４癌遺伝子（ＦＧＦ４）、５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）レセプター１Ａ（ＨＴＲ１Ａ）、リングフィンガータンパク質１８０（ＬＯＣ２８５６７１）（ＲＮＦ１８０）、ＥＧＦＲ共増幅及び過剰発現（ＥＣＯＰ）（ＤＫＦＺＰ５６４０８２２）、亜鉛フィンガータンパク質５９６（ＺＮＦ５９６）、７回膜貫通型ヘリックスレセプター類似（ＬＯＣ４４１３２０）、Ｌ−トレオニンデヒドロゲナーゼ（ＴＤＨ）、仮想タンパク質ＦＬＪ３６９８０（ＦＬＪ３６９８０）、線維芽細胞成長因子レセプター２０（ＦＧＦ２０）、ＥＦ−ハンドドメインファミリーメンバー２Ａ（ＬＯＣ２８６０９７）（ＥＦＨＡ２）、Ｎ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ（酸性セラミナーゼ）１（ＡＳＡＨ１）、ｎｏｄａｌホモログ（ＴＧＦ−Ｂシグナル伝達経路）（ＮＯＤＡＬ）、亜鉛フィンガータンパク質５３２に類似の仮想タンパク質（ＬＯＣ３９９７８３）、転写因子ＬＩＭホメオドメイン（ＩＳＬ２）、キネシンファミリーメンバーＣ２（ＫＩＦＣ２）、クロモソーム２０オープンリーディングフレーム２３（キネシン様モータータンパク質）（Ｃ２０ｏｒｆ２３）、ＧＤＮＦファミリーレセプターアルファ１（ＧＦＲＡ１）、グルタチオンペルオキシダーゼ７（ＧＰＸ７）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆホモログ２（ＤＫＫ２）、ネトリン１（ＮＴＮ１）、マトリックスメタロペプチダーゼ９（ＭＭＰ９）、腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー１１（ＴＮＦＳＦ１１）、ｒａｓホモログ遺伝子ファミリーメンバーＤ（ＲＨＯＤ）、及び高ロイシン反復含有４９（ＬＲＲＣ４９）からなる群より選ばれる１つの遺伝子に関連する１以上のＣｐＧアイランドの少なくとも一部を増幅するのに適している、１以上のプライマー対。
【請求項４１】
請求項４０記載の少なくとも１つのプライマー対；及び
前立腺癌においてメチル化されるが、ＢＰＨにおいてはメチル化されないか、もしくは低レベルでメチル化されることが知られている少なくとも1つの他の遺伝子に関連するＣｐＧアイランドの少なくとも一部の増幅に適している少なくとも１つのプライマー対を含む、セットプライマー。
【請求項４２】
請求項４０記載の第一プライマー対；及び
請求項４０記載の第二プライマー対、該第二プライマー対は該第一プライマー対よりも、異なるＣｐＧアイランドの少なくとも一部を増幅するのに適している、
を含む、プライマーセット。
【請求項４３】
第一プライマー対で増幅したＣｐＧアイランドが第一遺伝子に関連し、第二プライマー対で増幅したＣｐＧアイランドが第二遺伝子に関連し；並びに第一及び第二遺伝子は異なる遺伝子である、請求項４２記載のプライマーセット。
【請求項４４】
（ｉ）請求項４０記載のプライマー対及び
（ｉｉ）前立腺癌においてメチル化されるがＢＰＨにおいてはメチル化されないか、もしくは低レベルでメチル化されることが知られているＣｐＧアイランドの増幅に適しているプライマー対
からなる群より選ばれる第三プライマー対をさらに含み、ここで、第三プライマー対は第一もしくは第二プライマー対による増幅に適したものとは異なるＣｐＧアイランドの増幅に適している、請求項４１、４２又は４３のいずれか１項に記載のプライマーセット。
【請求項４５】
（ｉ）請求項４０記載のプライマー対及び
（ｉｉ）前立腺癌においてメチル化されることが知られているＣｐＧアイランドの増幅に適しているプライマー対
からなる群より選ばれる第四プライマー対をさらに含み、ここで、第四プライマー対は第一、第二もしくは第三プライマー対による増幅に適したものとは異なるＣｐＧアイランドの増幅に適している、請求項４４記載のプライマーセット。
【請求項４６】
（ｉ）請求項４０記載のプライマー対及び
（ｉｉ）前立腺癌においてメチル化されることが知られているＣｐＧアイランドの増幅に適しているプライマー対
からなる群より選ばれる第五プライマー対をさらに含み、ここで、第五プライマー対は第一、第二、第三もしくは第四プライマー対による増幅に適したものとは異なるＣｐＧアイランドの増幅に適している、請求項４５記載のプライマーセット。
【請求項４７】
（ｉ）請求項４０記載のプライマー対及び
（ｉｉ）前立腺癌においてメチル化されていることが知られているＣｐＧアイランドの増幅に適しているプライマー対
からなる群より選ばれる第六プライマー対をさらに含み、ここで、第六プライマー対は第一、第二、第三、第四もしくは第五プライマー対による増幅に適したものとは異なるＣｐＧアイランドの増幅に適している、請求項４６記載のプライマーセット。
【請求項４８】
請求項４０記載のプライマー対をさらに１〜４つ追加して含み、セット中の各プライマー対は異なるＣｐＧアイランドを増幅する、請求項４７記載のプライマーセット。
【請求項４９】
請求項４０記載のプライマー対をさらに１以上含み、セット中の各プライマー対は異なるＣｐＧアイランドを増幅する、請求項４８記載のプライマーセット。
【請求項５０】
プライマー対又はプライマーセットが、配列番号：５５〜１１８からなる群より選ばれる２つの配列から本質的になる配列を持つ２つのプライマーを含む、請求項４０〜４９のいずれか１項に記載のプライマー対又はプライマーセット。
【請求項５１】
プライマー対又はプライマーセットが、ＮＲＧ１もしくはＫＩＦ１３ｂに関連するＣｐＧアイランドの増幅に適している２つのプライマーを含む、請求項４０〜４９のいずれか１項に記載のプライマー又はプライマーセット。
【請求項５２】
プライマー対又はプライマーセットが、ＴＤＨ、ＡＳＡＨ１、ＦＧＦ２０、ＨＥＭＫ１、ＰＡＬＤ、ＮＥＵＲＯＧ、ＥＦＨＡ２、ＫＩＦＣ２、ＧＦＲＡ１、ＤＫＫ２、ＴＮＦＳＦ１１、ＮＴＮ１もしくはＲＨＯＤに関連するＣｐＧアイランドの増幅に適している２つのプライマーを含む、請求項４０〜４９のいずれか１項に記載のプライマーもしくはプライマーセット。
【請求項５３】
癌の診断又は予知のためのキットであって、請求項４０〜５１のいずれか１項に記載のプライマー対もしくはプライマーセット；及び
生物学的試料から少なくとも１つのＣｐＧアイランドを増幅するためのプライマーの使用に関する指示書を含むキット。
【請求項５４】
少なくとも１つの増幅ＣｐＧアイランドのメチル化の評価及び当該メチル化と癌の診断又は予知との相関に関する説明書をさらに含む、請求項５３記載のキット。
【請求項５５】
ゲノムＤＮＡを増幅するためのバッファをさらに含む、請求項５３又は５４記載のキット。
【請求項５６】
生物学的試料からゲノムＤＮＡを調製するためのバッファをさらに含む、請求項５３〜５５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項５７】
生物学的試料からゲノムＤＮＡを調製するためのバッファが、血漿もしくは尿からゲノムＤＮＡを調製するためのバッファである、請求項５６記載のキット。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図１Ｆ】
【図１Ｇ】
【図１Ｈ】
【図１Ｉ】
【図１Ｊ】
【図１Ｋ】
【図１Ｌ】
【図１Ｍ】
【図１Ｎ】
【図１Ｏ】
【図１Ｐ】
【図１Ｑ】
【図１Ｒ】
【図１Ｓ】
【図１Ｔ】
【図１Ｕ】
【図１Ｖ】
【図１Ｗ】
【図１Ｘ】
【図１Ｙ】
【図１Ｚ】
【図１ＡＡ】
【図１ＢＢ】
【図１ＣＣ】
【図１ＤＤ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図２Ｆ】
【図２Ｇ】
【図２Ｈ】
【図２Ｉ】
【図２Ｊ】
【図２Ｋ】
【図２Ｌ】
【図２Ｍ】
【図２Ｎ】
【図２Ｏ】
【図２Ｐ】
【図２Ｑ】
【図２Ｒ】
【図２Ｓ】
【図２Ｔ】
【図２Ｕ】
【図２Ｖ】
【図２Ｗ】
【図２Ｘ】
【図２Ｙ】
【図２Ｚ】
【図２ＡＡ】
【図２ＢＢ】
【図２ＣＣ】
【図２ＤＤ】
【図２ＥＥ】
【図２ＦＦ】
【図２ＧＧ】
【図２ＨＨ】
【図２ＩＩ】
【図２ＪＪ】
【図２ＫＫ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図１Ｆ】
【図１Ｇ】
【図１Ｈ】
【図１Ｉ】
【図１Ｊ】
【図１Ｋ】
【図１Ｌ】
【図１Ｍ】
【図１Ｎ】
【図１Ｏ】
【図１Ｐ】
【図１Ｑ】
【図１Ｒ】
【図１Ｓ】
【図１Ｔ】
【図１Ｕ】
【図１Ｖ】
【図１Ｗ】
【図１Ｘ】
【図１Ｙ】
【図１Ｚ】
【図１ＡＡ】
【図１ＢＢ】
【図１ＣＣ】
【図１ＤＤ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図２Ｆ】
【図２Ｇ】
【図２Ｈ】
【図２Ｉ】
【図２Ｊ】
【図２Ｋ】
【図２Ｌ】
【図２Ｍ】
【図２Ｎ】
【図２Ｏ】
【図２Ｐ】
【図２Ｑ】
【図２Ｒ】
【図２Ｓ】
【図２Ｔ】
【図２Ｕ】
【図２Ｖ】
【図２Ｗ】
【図２Ｘ】
【図２Ｙ】
【図２Ｚ】
【図２ＡＡ】
【図２ＢＢ】
【図２ＣＣ】
【図２ＤＤ】
【図２ＥＥ】
【図２ＦＦ】
【図２ＧＧ】
【図２ＨＨ】
【図２ＩＩ】
【図２ＪＪ】
【図２ＫＫ】
【公表番号】特表２００９−５１４５５５（Ｐ２００９−５１４５５５Ａ）
【公表日】平成２１年４月９日（２００９．４．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４０３３０（Ｐ２００８−５４０３３０）
【出願日】平成１８年１１月８日（２００６．１１．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０６０６８５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１０２８９１
【国際公開日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【出願人】（５０８１３８８７４）ユークリッド ダイアグノスティックス リミテッド ライアビリティー カンパニー (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年４月９日（２００９．４．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１１月８日（２００６．１１．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０６０６８５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１０２８９１
【国際公開日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【出願人】（５０８１３８８７４）ユークリッド ダイアグノスティックス リミテッド ライアビリティー カンパニー (1)
【Ｆターム（参考）】
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