発作に関連する突然変異
本発明は虚血性発作の素因を有する被験者を特定する方法に関する。本方法は、組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を低下させる突然変異を前記被験者において特定する段階を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は虚血性発作の素因を有する被験者を特定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
虚血は、酸素の供給と需要の間のアンバランスによって組織や器官への酸素供給が不十分になる場合に起こる。虚血は、血管内に血塊（血栓）が形成されることによって血管における血流が滞ることにより起こることが多い。
【０００３】
虚血性発作においては、脳血管の一部に閉塞性血栓が形成される。虚血性発作は血栓又は塞栓に起因する発作である。血栓性の発作においては、アテローム性動脈硬化症により既に狭窄した血管内に血塊が発達する。塞栓性の発作においては、血塊が身体の至るところに形成され、更に循環系を介して脳に運ばれる。
【０００４】
ラクナー発作は、脳内の小動脈の閉塞に起因する発作であり、元来は血栓性又は塞栓性の発作である。ラクナー発作は場合によってはアテローム性動脈硬化症以外の原因、例えばリポヒアリン症によっても起こり得る。
【０００５】
血管における血塊形成の可能性は、血塊を形成する方向に向かう凝固カスケードと血塊を溶解させる方向に向かうフィブリン溶解系とのバランスによって決定される。凝固カスケードもフィブリン溶解系も共にタンパク質分解の複合カスケードを伴う。凝固カスケードの最終エフェクター分子はセリンプロテアーゼトロンビンであり、これはフィブリノーゲンを開裂してフィブリン血塊を生じさせる。フィブリン溶解系の最終エフェクター分子はセリンプロテイナーゼプラスミンであり、これはフィブリンを可溶性分解物に開裂する。
【０００６】
組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）はフィブリン溶解系において非常に重要な役割を果たす。ｔＰＡは、不活性な前駆体であるプラスミノーゲンを活性なプロテイナーゼプラスミンへ転化する際の触媒となる。然るに、ｔＰＡは血栓症を予防する血管内のフィブリン溶解の主たるメディエーターである。内皮細胞によるｔＰＡの分泌は二種の機構によって制御される。即ち（ａ）血管損傷により数秒から数分の間に沈澱する局所ｔＰＡの急激な放出及び（ｂ）フィブリン溶解系の慢性的活性化によって決定され且つｔＰＡ血漿循環レベルの変化に関与する長期間基礎分泌速度である。循環ｔＰＡ活性は、プラスミノーゲン活性化因子インヒビター１との不可逆複合体の形成によっても低下する。静脈閉塞、運動、血管活性物質の注射等の種々の刺激は、ｔＰＡの放出を刺激することにより血漿ｔＰＡレベルを急激に上昇させることが知られている。
【０００７】
フィブリン溶解系の活性化は、必ずしも虚血性発作罹患の可能性を低減することと相関するわけではない。実際、発作イベントから数年先行して、フィブリン溶解防御系の長期に亘る活性化がみられる場合もある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
現在、閉塞性血栓症に伴う疾病や状態の発現において遺伝因子が果たす重要性に関する情報、特に虚血性発作に役割を果たす遺伝因子に関する情報は非常に少ない。よって、閉塞性血栓症に罹患しやすい可能性のある被験者を特定する方法（虚血性発作に罹患しやすい被験者を特定する方法を含む）が必要である。
【０００９】
本発明は、虚血性発作の素因を有する被験者を特定する方法に関し、組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を低下させる突然変異を前記被験者において特定することによる方法に関する。特に本発明は、ｔＰＡ遺伝子の上流領域における特定の多型の存在が虚血性発作に関連することを特定することに関する。この多型は、ｔＰＡ放出速度の低下に関連する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本明細書全体を通し、本発明の様々なアスペクトを記述する目的で種々の文献を引用する。しかしながら、該文献の如何なるものについても、本発明に対する先行技術であることを本発明者らは自認するものではない。特に、本明細書に掲載されている如何なる文献への言及も、オーストラリア及び他のいずれかの国で、その内容が本技術分野における共通一般知識を構成するものであると自認することを意味するものではない。各文献についての記載は、該当文献の著者が述べていることであり、本出願人は、ここに引用する如何なる文献についても、その正確性や本発明との関連性について糾す権利を留保するものである。
【００１１】
本発明は、虚血性発作の素因を有する被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を低下させる突然変異を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【００１２】
本発明は、小血管閉塞の素因を有する被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を低下させる突然変異を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【００１３】
本発明はまた、小血管閉塞に関連する疾病又は状態の素因を有する被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を低下させる突然変異を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【００１４】
本発明はまた、虚血性発作の予防及び／又は治療を行うために好適な被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を低下させる突然変異を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【００１５】
本発明はまた、小血管閉塞又は小血管閉塞に関連する疾病又は状態の予防及び／又は治療を行うために好適な被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を低下させる突然変異を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【００１６】
本発明はまた、被験者の小血管閉塞に関連する疾病又は状態の治療方法であって、前記被験者における組織プラスミノーゲン活性化因子放出速度向上剤を前記被験者の治療に有効な量投与する段階を含む方法を提供する。
【００１７】
本発明はまた、細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を増大可能な剤を特定する方法であって、前記方法は（ａ）細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を低下させる突然変異を含む細胞に剤を作用させる段階と、（ｂ）前記剤を作用させた細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を測定する段階と（ｃ）前記剤を、細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を増大可能な剤と特定する段階とを含む方法を提供する。
【００１８】
本発明は、虚血性発作の素因を有する被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の両対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在を前記被験者において特定する段階を含む方法を更に提供する。
【００１９】
本発明はまた、小血管閉塞又は小血管閉塞に関連する疾病又は状態の素因を有する被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の両対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在を前記被験者において特定する段階を含む方法を更に提供する。
【００２０】
本発明はまた、虚血性発作の予防及び／又は治療を行うために好適な被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の両対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【００２１】
本発明はまた、小血管閉塞又は小血管閉塞に関連する疾病又は状態の予防及び／又は治療を行うために好適な被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の両対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【００２２】
本発明はまた、組織プラスミノーゲン活性化因子放出速度向上剤により治療するために好適な被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の両対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【００２３】
本発明はまた、被験者における虚血性発作のリスクを決定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の一方若しくは両方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在を前記被験者において決定する段階を含む方法を提供する。
【００２４】
本発明はまた、被験者における小血管閉塞のリスク又被験者における小血管閉塞に関連する疾病又は状態の進行のリスクを決定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の一方若しくは両方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在を前記被験者において決定する段階を含む方法を提供する。
【００２５】
本発明はまた、細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を変化可能な剤を特定する方法であって、前記方法は、（ａ）組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の一方若しくは両方の対立遺伝子における−７３５１位にシトシンチミン多型を含む細胞に剤を作用させる段階と、（ｂ）前記剤を作用させた細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を測定する段階と（ｃ）前記剤を、細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を変化可能な剤と特定する段階とを含む方法を更に提供する。
【００２６】
本発明は、細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を増大可能な剤を特定する方法であって、前記方法は、（ａ）組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の全部又は一部を形質転換した細胞であって、前記形質転換した遺伝子座は−７３５１位にシトシンからチミンへの突然変異を含み且つ前記形質転換した遺伝子座はレポーター遺伝子の発現を制御する細胞に剤を作用させる段階と、（ｂ）前記剤を作用させた細胞におけるレポーター遺伝子の発現レベルを決定する段階と、（ｃ）前記レポーター遺伝子の発現を増大可能な剤を特定する段階と、（ｄ）前記レポーター遺伝子の発現を増大可能な剤を、細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を増大可能な剤と特定する段階とを含む方法を更に提供する。
【００２７】
本発明はまた、配列番号３に記載の配列からなる単離された核酸又はそのＲＮＡ等価物を提供する。
【００２８】
本発明はまた、配列番号３に記載の配列中に一以上の塩基置換を有する単離された核酸であって、前記核酸はストリンジェントなハイブリッド形成条件下で配列番号３の相補配列とハイブリッド化する核酸を提供する。前記ストリンジェントなハイブリッド形成条件は４２℃における６ｘＳＳＣのハイブリッド形成及び２０℃における２ｘＳＳＣの洗浄を含む。
【００２９】
本発明はまた、配列番号４に記載の配列からなる単離された核酸又はそのＲＮＡ等価物を提供する。
【００３０】
本発明はまた、配列番号４に記載の配列中に一以上の塩基置換を有する単離された核酸であって、前記核酸はストリンジェントなハイブリッド形成条件下で配列番号４の相補配列とハイブリッド化する核酸を提供する。前記ストリンジェントなハイブリッド形成条件は４２℃における６ｘＳＳＣのハイブリッド形成及び２０℃における２ｘＳＳＣの洗浄を含む。
【００３１】
本発明はまた、配列番号３に記載の配列中に一以上の塩基置換を有する単離された核酸であって、前記核酸は配列番号３と８０％以上の相同性を有する核酸又はそのＲＮＡ等価物を提供する。
【００３２】
本発明はまた、配列番号４に記載の配列中に一以上の塩基置換を有する単離された核酸であって、前記核酸は配列番号４と８０％以上の相同性を有する核酸又はそのＲＮＡ等価物を提供する。
【００３３】
本発明はまた、配列番号１のヌクレオチド１８４０〜２２４５の配列を含む、単離された核酸を提供する。
【００３４】
本発明はまた、虚血性発作の素因を有する被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子の低減された放出速度を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【００３５】
本発明はまた、小血管閉塞の素因を有する被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子の低減された放出速度を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【００３６】
本発明はまた、小血管閉塞に関連する疾病又は状態の素因を有する被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子の低減された放出速度を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【００３７】
本発明はまた、虚血性発作の予防及び／又は治療を行うために好適な被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子の低減された放出速度を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【００３８】
本発明はまた、小血管閉塞又は小血管閉塞に関連する疾病又は状態の予防及び／又は治療を行うために好適な被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子の低減された放出速度を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【００３９】
本発明はヒト虚血性発作の素因の研究に基づく。特に、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子のエンハンサーにおける突然変異が虚血性発作の非依存的予知インディケーターであることを見出した。この知見から、個々の被験者におけるプラスミノーゲン活性化因子の低減された放出速度が虚血性発作の非依存的予知インディケーターであることがわかる。
【００４０】
本明細書全体に用いられる各用語の意味は、当業者には容易に理解されよう。しかしながら、参照を容易とする観点からこれらの用語の内の一部について次のように定義する。
【００４１】
本明細書において用いられる「ｔＰＡ遺伝子座」とは、ｔＰＡ遺伝子をコードする領域に関連するＤＮＡのいずれか、ｔＰＡのｍＲＮＡの未翻訳領域をコードするＤＮＡのいずれか、ｔＰＡのプレ−ｍＲＮＡ（例えばイントロン配列）コードするＤＮＡのいずれか、ｔＰＡ発現の制御に関連するＤＮＡのいずれか（例えばプロモーターエレメント、エンハンサーエレメント（近接又は遠隔）、レギュレーター因子の結合サイト（例えばＳＰ１結合サイト）、ｔＰＡ遺伝子座の発現に役割を果たす他のＤＮＡのいずれか（例えば異質染色性ＤＮＡ）等を意味すると理解されたい。
【００４２】
本明細書において虚血性発作又は小血管閉塞に関連して用いられる「素因」とは、虚血性発作又は小血管閉塞を伴うための他のリスク因子（例えば心房細動、喫煙歴等）が被験者間で同程度という条件下で、突然変異を有する被験者が虚血性発作又は小血管閉塞に罹患する可能性が、突然変異を有さない他の被験者が虚血性発作又は小血管閉塞に罹患する可能性に比べて増大することを意味すると理解されたい。
【００４３】
本明細書において用いられる「突然変異」は、正常なＤＮＡ配列のいかなる変化をも意味すると理解されたい。突然変異はまた、多型的であることも理解されよう。突然変異のタイプの例としては、挿入、欠失、フレームシフト、塩基置換等が挙げられる。
【００４４】
本明細書において用いられる「小血管閉塞」とは、直径８００μｍ未満のいずれの血管の血栓による閉塞をも意味すると理解されたい。前毛細血管小動脈、毛細血管及び後毛細血管静脈はこの定義に含まれる。脳内において小血管閉塞は臨床的には、ラクナー発作や、視床部梗塞、白質髄管梗塞、汎発性皮質下ロイコアリオーシス（leukoariosis）を呈する。この内、後者の病理学的現象は、血管性痴呆の潜在的要因となる。
【００４５】
本明細書において用いられる「多型」とは、個体間におけるＤＮＡ配列の差異を意味すると理解されたい。
【００４６】
本明細書において用いられる「増幅又は増幅する（又はそれらの変形表現）」とは、核酸配列の付加的コピーの製造を意味すると理解されたい。例えば、増幅はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法により行うことができる（Dieffenbach, C. W. and G. S. Dveksler （１９９５） PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N. Y.に記載 ）。或いは環状テンプレート上におけるローリングサークル増幅（例えばFire, A. and Xu, S-Q.（１９９５） Proc. Natl. Acad. Sci ９２:４６４１〜４６４５に記載）等の他の増幅方法により行うことができる。
【００４７】
本明細書において用いられる「核酸」とは、一本鎖又は二本鎖のデオキシリボヌクレオチド類又はリボヌクレオチド類からなるポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドのいずれかを意味すると理解されたい。
【００４８】
この点に関し、核酸は塩基部、糖部、リン酸骨格において修飾されていてもよく、核酸の機能発現を促進するための他の基が添加されていてもよい。
【００４９】
例えば、核酸は次の群から選択される少なくとも一種の修飾塩基部分を含むことができる：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンチルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン，２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルケオシン、５′−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ウイブトキシン、プソイドウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ及び２，６−ジアミノプリン。
【００５０】
核酸は、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシロース及びヘキソースからなる群から選択される少なくとも一種の糖部分を有していてもよいが、これらに限定されない。更に核酸は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミドチオエート、ホスホロアミデート、ホスホロジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル及びホルムアセタール又はその類似体等の少なくとも一種のホスフェート骨格を含んでいてもよい。
【００５１】
本明細書において用いられる「単離された核酸」とは、元来核酸を伴う他の細胞成分から実質的に単離された核酸を意味すると理解されたい。本用語は、自然環境から取り出した核酸配列を含み、天然、クローン化又は組み替えＤＮＡ類、化学合成による核酸類（例えば化学合成オリゴヌクレオチド、ヘテロロガス系により生物学的に合成されたＤＮＡ又はＲＮＡ及び他の形態のポリヌクレオチド類似体のいずれか）を含む。
【００５２】
本明細書において用いられる「ハイブリッド化又はハイブリッド形成（又はそれらの変形表現）」は、それによって核酸の鎖が塩基ペアリングによって相補鎖に結合する過程のいずれかを意味すると理解されたい。ハイブリッド形成は溶液中で行われてもよく、或いは溶液中に存在する一核酸配列と固体支持体（例えば膜、フィルター、チップ等）に固定された他の核酸配列との間で行われてもよい。
【００５３】
本明細書において用いられる「ストリンジェントな条件」とは、Ｔｍ（Ｔｍ：融点）付近からＴｍより約２０℃低い範囲において相補的な核酸がお互いに結合しあうことを許容する条件を意味すると理解されたい。相補領域の長さ、核酸類（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成物）の種類及び組成、塩類及び他の成分の濃度（例えばホルムアミド、デキストラン、デキストラン硫酸、及び／又ポリエチレングリコールの有無）等の諸因子は全て考慮する必要がある。これらは基本的には、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. （１９８９）に記載されている。
【００５４】
本明細書においてｔＰＡ遺伝子座に関連して用いられる「上流領域」とは、通常ｔＰＡ遺伝子座の転写領域の開始から１０ｋｂ以内（しかしコード領域からより離れていてもよい）配列で、遺伝子の発現に影響する（遺伝子の転写及びメッセンジャーＲＮＡの翻訳、スプライシング、安定性等）配列を意味すると理解されたい。
【００５５】
この点に関し、ｔＰＡ遺伝子座の上流領域に関して本明細書において用いられる配列座標は、ＧｅｎＢａｎｋ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｚ４８４８４）に対応する配列座標である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５６】
本発明は一形態において、虚血性発作の素因を有する被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を低下させる突然変異を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【００５７】
本被験者は、男性か女性のヒト被験者のいずれかであり、虚血性発作の素因を決定すべき被験者である。好ましい被験者はコーカソイド起源のヒトである。
【００５８】
虚血性発作は、被験者に起こりうる血栓性又は塞栓性発作であり、心塞栓性又はアテローム血栓性の虚血性発作を含む。好ましくは、虚血性発作はアテローム血栓性の虚血性発作である。
【００５９】
虚血性発作は好ましくは小血管発作（即ちラクナー発作）である。従って、本発明は好ましい形態において、ラクナー発作の素因を有する被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を低下させる突然変異を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【００６０】
被験者における突然変異は、内皮細胞からのｔＰＡの放出速度を低減するいずれかの遺伝子又は遺伝子外領域における突然変異のいずれかである。例えば、突然変異は、ｔＰＡ遺伝子座と関連しない遺伝子若しくは領域における突然変異でも、ｔＰＡ遺伝子座における突然変異でもよく、後者の例としては、ｔＰＡ遺伝子の転写に影響を及ぼすｔＰＡコード領域上流における突然変異や、エンハンサーにおける突然変異、ｔＰＡ遺伝子のエクソンにおける突然変異、スプライシングに影響を及ぼすイントロンにおける突然変異、翻訳又はｍＲＮＡの安定性に影響を及ぼすｔＰＡの３′領域における突然変異が挙げられる。
【００６１】
突然変異は、特定遺伝子の一方又は両方の対立遺伝子に存在してもよい。突然変異が特定遺伝子の両方の対立遺伝子に存在することが最も好ましい。
【００６２】
突然変異はｔＰＡ遺伝子座に存在することが好ましい。特に好ましい形態においては、突然変異はｔＰＡ遺伝子座の両対立遺伝子に存在する。
【００６３】
この点に関し、ヒトｔＰＡ遺伝子座の構造は、Degenら、（１９８６）J. Biol. Chem. ２６１（１５）:６９７２〜６９８５に記載されている。ｔＰＡ遺伝子は１４のエクソンと１３のイントロンからなる。
【００６４】
上流領域は遺伝子の転写を制御する作用を有する多数の領域を含む。例えば、ヒトｔＰＡ遺伝子の転写は−７ｋｂにおいて多重ホルモン受容性エンハンサーによって制御される。トランジエントトランスフェクションの研究から、近接プロモーター領域に−７ｋｂエンハンサー要求ＳＰ１結合を有するｔＰＡレポーター構築物が、前記エンハンサーを媒介としてレチノレイン酸によりプロモーターを誘導可能とすることがわかっている。
【００６５】
ｔＰＡの上流領域の−７３５１位におけるＣ〜Ｔ多型はこれまでに特定され、この突然変異が多型のホモ接合及びヘテロ接合個体におけるインビボでのｔＰＡ放出速度を低減させる（Ladenvallら、（２０００）Thromb. Haemost. ８４:１５０〜１５５）。この突然変異はＳＰ１結合サイトに存在する。
【００６６】
突然変異の組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を低減させる能力は、当業界で知られた好ましい方法によって決定することができる。例えば、特定の突然変異が内皮細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を低減させる能力は、突然変異を有する内皮細胞をインビトロで培養し、内皮細胞からのｔＰＡ放出速度を決定し、更に前記細胞を新鮮な媒体で洗浄し、その媒体へのｔＰＡの放出速度の時間変化の程度を野生型内皮細胞と比較して決定することにより、決定することができる。酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）（例えばＴｉｎｔＥｌｉｚｅ(R)ｔ−ＰＡ、ＢｉｏｐｏｏｌＡＢ）によって全ｔＰＡ抗原を定量することができる。この種のアッセイは二重抗体原理を基礎とする。遊離ｔＰＡとｔＰＡ−インヒビター複合体とは同程度の効率で検出される。
【００６７】
内皮細胞からのｔＰＡの放出を誘起するためには、当業界において内皮細胞からのｔＰＡの放出を誘起することが知られているトロンビンやカルシウムイオノホア等の剤を用いることができる。インビトロにおいて内皮細胞からのｔＰＡの放出を誘起する好ましい方法はRosnobletら、（１９９９）Arterioscler Thromb Vasc Biol. １９（７）:１７９６〜８０３に記載されている。
【００６８】
また、被験者におけるｔＰＡ放出速度は、例えば前腕部における放出速度を突然変異を有さない被験者と比較して決定することにより直接決定することができる。インビボにおけるｔＰＡの放出速度を決定する好ましい方法は、Jernら、（１９９９）Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. １９（２）:４５４〜４５９に記載されている。
【００６９】
突然変異はｔＰＡ遺伝子座に位置することが好ましい。更に好ましくは、被験者の突然変異はｔＰＡ遺伝子座の上流領域に存在する突然変異である。更に好ましくは、突然変異はｔＰＡ遺伝子座のエンハンサーエレメントにおける突然変異である。最も好ましくは、突然変異はｔＰＡ遺伝子座の上流領域の−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異である。
【００７０】
−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異はｔＰＡ遺伝子座の一方又は両方の対立遺伝子に存在していてもよい。突然変異はｔＰＡ遺伝子座の両方の対立遺伝子に存在していることが最も好ましい。
【００７１】
従って、好ましい形態において本発明は、虚血性発作の素因を有する被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の両対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【００７２】
既に述べたように、虚血性発作はラクナー発作であることが好ましい。従って、他の好ましい形態において本発明は、ラクナー発作の素因を有する被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の両対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【００７３】
ｔＰＡの放出速度を低下させる突然変異を被験者において特定することは、当業界で知られている好ましい方法によって決定することができる。
【００７４】
ＤＮＡは被験者から当業界で知られている好ましい方法によって単離することができる。被験者の静脈全血からゲノムＤＮＡを単離する好ましい方法は、Millerら、（１９８８） Nucleic Acids Research １６（３）:１２１５に記載されている。
【００７５】
突然変異の特定には種々の方法を用いることができる。ＤＮＡ塩基配列決定法（マニュアル或いは自動蛍光塩基配列決定）を用いて突然変異を検出することができる。この場合、特定の被験者から誘導される領域のクローンの塩基配列を決定して、増幅してもしなくても突然変異を特定することができるが、突然変異の特定は通常、被験者（全ゲノムＤＮＡ）から単離した核酸から突然変異を含む領域を増幅することを伴う。
【００７６】
突然変異特定の他の方法としては、一本鎖コンホーメーション多型アッセイ（ＳＳＣＡ）（Oritaら、（１９８９） Genomics ５（４）:８７４〜８７９）がある。この方法は全ての配列の変化を検出するのではないが、特にＤＮＡフラグメントサイズが２００ｂｐより大きいければ、大部分のＤＮＡ配列変化を検出して最適化できる。ＳＳＣＡゲル上で移動度が変化したフラグメントは後に塩基配列を決定し、ＤＮＡ配列変化の正確な性質を決定する。
【００７７】
他の方法としては、二本のＤＮＡ相補鎖間のミスマッチを検出することの基づく方法であって、固定変性ゲル電気泳動を含む方法（Sheffieldら、（１９９１）Am. J. Hum. Genet.４９:６９９〜７０６に記載）、ヘテロデュプレックス分析（Whiteら、（１９９２）Genomics １２:３０１〜３０３）、化学的ミスマッチ開裂（Grompeら、（１９８９） Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８６:５８５５〜５８９２）である。突然変異が具体的に特定されたならば、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション等の対立遺伝子特異的検出方法を用いることができる。
【００７８】
ＤＮＡ配列分析を用いて突然変異を特定する場合には、一対立遺伝子に突然変異の存在が見出されるということは（即ち被験者が突然変異についてヘテロ接合性）、ＤＮＡ配列中の関連する位置に二個のヌクレオチドが存在することとなる。正常な対立遺伝子に対してホモ接合性或いは突然変異に対してホモ接合性である、被験者から取り出したＤＮＡ配列であれば、ＤＮＡ配列中の関連する位置において相当する一ヌクレオチドの存在のみを得ることとなる。
【００７９】
塩基配列決定のための好ましいテンプレートを提供するには、被験者から単離されたゲノムＤＮＡの領域を適切に設計したプライマーを用いて増幅することができる。適切なプライマーとの配列決定反応及びＤＮＡ配列の分析は当業界で知られた好ましい方法によって行うことができる。突然変異がｔＰＡ遺伝子座の上流領域の−７３５１位におけるＣ〜Ｔ突然変異であるならば、増幅の好ましい領域は、配列番号１のヌクレオチド１８４０〜２２４５の領域である。
【００８０】
あるいは、突然変異の存在は、被験者から単離されたＤＮＡから野生型対立遺伝子又は突然変異を有する対立遺伝子のいずれかのみを増幅する配列特異的プライマーを用いて決定することができる。配列特異的プライマーを用いてＤＮＡを増幅する場合、コンセンサスプライマーと二種の代替プライマーのうち一種とが用いられる。代替プライマーのそれぞれは、野生型配列（ＷＴプライマー）に対応するか多型配列（ＳＰＮプライマー）に対応する３′ 末端ヌクレオチドを有する。この場合、増幅は正確な相補ヌクレオチドを有するテンプレートからのみ生じるであろう。
【００８１】
他の突然変異特定の方法は、核酸配列における差異の差別化を可能ならしめる、突然変異を有する核酸と他の核酸（即ちレポーター核酸）とのハイブリッド化を伴う。例えば、オリゴヌクレオチドを用いるサザン分析を用いて突然変異を検出することができる。また、オリゴヌクレオチドをチップ等の固体支持体に付加し、突然変異を有する核酸の結合をオリゴヌクレオチドへの結合（結合なし）によって検出する方法も当業界で知られている。これらの場合、突然変異を被験者において特定することは、被験者から単離・誘導した核酸をレポーター核酸とハイブリッド形成することによって突然変異を検出することも含む。
【００８２】
突然変異が−７３５１位におけるＣ〜Ｔ突然変異の場合、ＷＴ及びＳＮＰプライマーでの増幅に好ましいｔＰＡ遺伝子座の領域は、配列番号１のヌクレオチド１８４０〜２２４５の領域である。
【００８３】
従って、他の形態において本発明は、単離された核酸において、ポリヌクレオチドが配列番号１のヌクレオチド１８４０〜２２４５の配列からなる核酸を提供する。
【００８４】
配列番号１のヌクレオチド１８４０〜２２４５の領域の配列を次に示す：
５′-ATTGGCGCAA ACTCCTCACA GAGGAAAAAA TGTACAGTTA GAGTGAAGTG AAAGAACATC TCTATAAAAT ATGCATCACT TCCTGGCGGG GAGGAGAGAG GAGCTATGGA AAGCTACACC AAAGCTGTAT TCACTGGACA AAAATGCTTG ACTCAGGAAG GAGGCCGGAG CGGCGAGTCC TGTGATGCCA TGGCGGGAGG TGGGTCCCAT GTAAACAGTG GTGTTCCTGT CACCCTGAGC ACATGCAGTC TCCCGTGGGT AACCAGAACT GATGCAAGAG CCCCTGCTGT GGAAGTCACC ACGCTCTCCC AGAACGCGCC TCCCCCCAGG TCTGAGTGAT CTCATTGCCG AGGTGAATAG GGCTTTGGCC GCTCTCCCAA AGGAGCCCGC CCCAGACACA GCCAT-３′
【００８５】
好ましくは、正常−７３５１配列を有するｔＰＡ遺伝子座の領域を増幅するために用いるプライマーは配列番号２（５′−ＡＴＴＧＧＣＧＣＡＡＡＣＴＣＣＴＣＡＣＡ−３′）及び配列番号３（５′−ＡＴＧＧＣＴＧＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＧ−３′）であり、−７３５１Ｃ〜Ｔ多型配列を有するｔＰＡ遺伝子座の領域を増幅するために用いるプライマーは配列番号２（５′−ＡＴＴＧＧＣＧＣＡＡＡＣＴＣＣＴＣＡＣＡ−３′）及び配列番号４（５′−ＡＴＧＧＣＴＧＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＡ−３′）である。これらプライマーでｔＰＡ遺伝子座を増幅するための好ましい反応条件は、ＰＴＣ-２００ペルチエサーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を次のＰＣＲサイクルパラメータで使用することを含む：９６℃で２５秒、７０℃で４５秒及び７２℃で４５秒（５サイクル）；９６℃で２５秒、６５℃で５０秒及び７２℃で４５秒（２１サイクル）；９６℃で２５秒、５５℃で６０秒及び７２℃で１２５秒（４サイクル）。
【００８６】
増幅生成物は当業界で知られている好ましい方法により検出することができる。例えば、増幅生成物をアガロースゲル上に展開し、エチジウムブロミドで染色し視覚化することができる。
【００８７】
突然変異の特定は、被験者から単離・誘導した核酸から突然変異を含む領域を増幅することを含むことが好ましい。
【００８８】
本発明の本形態は、虚血性発作の予防及び／又は治療が必要な被験者を特定することにも有用である。
【００８９】
従って、他の形態において本発明はまた、虚血性発作の予防及び／又は治療を行うために好適な被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を低下させる突然変異を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【００９０】
更に本発明はまた、好ましい形態において、虚血性発作の予防及び／又は治療を行うために好適な被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の両対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【００９１】
本発明はまた、虚血性発作の素因を有する被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子の低減された放出速度を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【００９２】
虚血性発作は、被験者に起こりうる血栓性又は塞栓性発作であり、心塞栓性又はアテローム血栓性の虚血性発作を含む。好ましくは、虚血性発作はアテローム血栓性の虚血性発作である。
【００９３】
虚血性発作は好ましくは小血管発作（即ちラクナー発作）である。従って、本発明は好ましい形態において、ラクナー発作の素因を有する被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子の低減された放出速度を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【００９４】
本被験者は、男性か女性のヒト被験者のいずれかであり、虚血性発作の素因を決定すべき被験者である。好ましい被験者はコーカソイド起源のヒトである。
【００９５】
被験者は、被験者においてｔＰＡ放出速度を低下させる突然変異をｔＰＡ遺伝子座に有することが好ましい。より好ましくは、被験者は、被験者においてｔＰＡ放出速度を低下させる突然変異をｔＰＡ遺伝子座の上流領域に有する。より好ましくは、被験者は、被験者においてｔＰＡ放出速度を低下させる突然変異をｔＰＡ遺伝子座のエンハンサーエレメントに有する。最も好ましくは、被験者は、被験者においてｔＰＡ放出速度を低下させる突然変異をｔＰＡ遺伝子座の上流領域のシトシンからチミンへの−７３５１位に有する。
【００９６】
−７３５１位シトシンからチミンへの突然変異は、ｔＰＡ遺伝子座の一方又は両方の対立遺伝子の存在してもよい。この突然変異がｔＰＡ遺伝子座の両方の対立遺伝子の存在することが最も好ましい。
【００９７】
また、被験者における低減されたｔＰＡ放出速度は、当業界で知られている好ましい方法によって特定することができる。例えば被験者の前腕部におけるｔＰＡ放出速度を決定することにより直接決定することができる。インビボにおけるｔＰＡの放出速度を決定する好ましい方法は、Jernら、（１９９９）Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. １９（２）:４５４〜４５９に記載されている。
【００９８】
本発明の本形態は、虚血性発作の予防及び／又は治療が必要な被験者を特定することにも有用である。
【００９９】
従って本発明は他の形態においては、虚血性発作の予防及び／又は治療を行うために好適な被験者を特定する方法にも係るものであって、組織プラスミノーゲン活性化因子の低減された放出速度を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【０１００】
本発明はまた、小血管閉塞の素因を有する被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を低下させる突然変異を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【０１０１】
本被験者は、男性か女性のヒト被験者のいずれかであり、小血管閉塞の素因を決定すべき被験者である。好ましい被験者はコーカソイド起源のヒトである。
【０１０２】
本発明において小血管閉塞は種々の形態を呈し、被験者の小血管に起こり得る血栓性又は塞栓性の閉塞のいずれかであり、ラクナー発作、痴呆、虚血性心疾患（虚血性心筋症含む）、末梢血管疾患、血管内凝固症候群、小血管炎、虚血性神経障害、虚血性網膜症、虚血性胃疾患（小腸大腸虚血含む）、広汎性肺塞栓症及び血管性インポテンス等を臨床的に呈する小血管閉塞である。
【０１０３】
好ましくは、小血管閉塞は脳内に発生し、臨床的にはラクナー発作を呈する小血管閉塞を含む。
【０１０４】
被験者における突然変異は、内皮細胞からのｔＰＡの放出速度を低減するいずれの遺伝子又は遺伝子外領域における突然変異のいずれかである。例えば、突然変異はｔＰＡ遺伝子座における突然変異でもよく、その例としては、ｔＰＡコード領域上流における突然変異や、エンハンサーエレメントにおける突然変異、ｔＰＡ遺伝子のエクソンにおける突然変異、スプライシングに影響を及ぼすイントロンにおける突然変異、翻訳又はｍＲＮＡの安定性に影響を及ぼすｔＰＡの３′領域における突然変異が挙げられる。
【０１０５】
突然変異は、特定遺伝子の一方又は両方の対立遺伝子の存在してもよい。突然変異が特定遺伝子の両方の対立遺伝子の存在することが最も好ましい。
【０１０６】
既に述べたように、ｔＰＡの放出速度を低下させる突然変異を被験者において特定することは、当業界で知られている好ましい方法によって決定することができる。
【０１０７】
ＤＮＡは被験者から当業界で知られている好ましい方法によって単離することができる。被験者の静脈全血からゲノムＤＮＡを単離する好ましい方法は、Millerら、（１９８８） Nucleic Acids Research １６（３）:１２１５に記載されている。
【０１０８】
突然変異の組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を低減させる能力は、当業界で知られた好ましい方法によって決定することができる。例えば、特定の突然変異が内皮細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を低減させる能力は、突然変異を有する内皮細胞をインビトロで培養し、内皮細胞からのｔＰＡ放出速度を決定し、更に前記細胞を新鮮な媒体で洗浄し、その媒体へのｔＰＡの放出速度の時間変化の程度を野生型内皮細胞と比較して決定することにより、決定することができる。酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）（例えばＴｉｎｔＥｌｉｚｅ(R)ｔ−ＰＡ、ＢｉｏｐｏｏｌＡＢ）によって全ｔＰＡ抗原を定量することができる。この種のアッセイは二重抗体原理を基礎とする。遊離ｔＰＡとｔＰＡ−インヒビター複合体とは同程度の効率で検出される。
【０１０９】
内皮細胞からのｔＰＡの放出を誘起するためには、当業界において内皮細胞からのｔＰＡの放出を誘起することが知られているトロンビンやカルシウムイオノホア等の剤を用いることができる。インビトロにおいて内皮細胞からのｔＰＡの放出を誘起する好ましい方法はRosnobletら、（１９９９）Arterioscler Thromb Vasc Biol. １９（７）:１７９６〜８０３に記載されている。
【０１１０】
被験者における突然変異はｔＰＡ遺伝子座に存在する突然変異であることが好ましい。より好ましくは、被験者における突然変異はｔＰＡ遺伝子座の上流領域に存在する突然変異である。より好ましくは、被験者における突然変異はｔＰＡ遺伝子座のエンハンサーエレメントに存在する突然変異である。最も好ましくは、被験者における突然変異はｔＰＡ遺伝子座の上流領域のシトシンからチミンへの−７３５１位における突然変異である。
【０１１１】
−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異はｔＰＡ遺伝子座の一方又は両方の対立遺伝子に存在していてもよい。突然変異はｔＰＡ遺伝子座の両方の対立遺伝子に存在していることが最も好ましい。
【０１１２】
従って本発明はその好ましい形態において、小血管閉塞の素因を有する被験者を特定する方法に係るものでもあって、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の両対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在を前記被験者において特定する段階を含む方法を更に提供する。
【０１１３】
既に述べたように、ｔＰＡの放出速度を低下させる突然変異を被験者において特定することは、当業界で知られている好ましい方法によって決定することができる。
【０１１４】
ＤＮＡは被験者から当業界で知られている好ましい方法によって単離することができる。被験者の静脈全血からゲノムＤＮＡを単離する好ましい方法は、Millerら、（１９８８） Nucleic Acids Research １６（３）:１２１５に記載されている。
【０１１５】
既に述べたように、突然変異の特定には種々の方法を用いることができる。
【０１１６】
ＤＮＡ塩基配列決定法（マニュアル或いは自動蛍光塩基配列決定）を用いて突然変異を検出することができる。突然変異特定の他の方法としては、一本鎖コンホーメーション多型アッセイ（ＳＳＣＡ） （Oritaら、（１９８９） Genomics ５ （４）:８７４〜８７９）がある。この方法は全ての配列の変化を検出するのではないが、特に仮にＤＮＡフラグメントサイズが２００ｂｐより大きい場合であれば、大部分のＤＮＡ配列変化を検出して最適化することができる。ＳＳＣＡゲル上で移動度が変化したフラグメントは後に塩基配列を決定し、そしてＤＮＡ配列変化の正確な性質を決定する。
【０１１７】
他の方法としては、二本のＤＮＡ相補鎖間のミスマッチを検出することの基づく方法であって、固定変性ゲル電気泳動を含む方法（Sheffieldら、（１９９１）Am. J. Hum. Genet.４９:６９９〜７０６に記載）、ヘテロデュプレックス分析（Whiteら、（１９９２）Genomics １２:３０１〜３０３）、化学的ミスマッチ開裂（Grompeら、（１９８９） Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８６:５８５５〜５８９２）がある。特定の突然変異が特定されたならば、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション等の対立遺伝子特異的検出方法を用いることができる。
【０１１８】
ＤＮＡ配列分析を用いて突然変異を特定する場合には、一対立遺伝子に突然変異の存在が見出されるということは（即ち被験者が突然変異についてヘテロ接合性）、ＤＮＡ配列中の関連する位置に二個のヌクレオチドが存在することとなる。正常な対立遺伝子に対してホモ接合性或いは突然変異に対してホモ接合性である、被験者から取り出したＤＮＡ配列であれば、ＤＮＡ配列中の関連する位置において相当する一ヌクレオチドの存在のみを得ることとなる。
【０１１９】
塩基配列決定のための好ましいテンプレートを提供するには、被験者から単離されたゲノムＤＮＡの領域を適切に設計したプライマーを用いて増幅することができる。適切なプライマーとの配列決定反応及びＤＮＡ配列の分析は当業界で知られた好ましい方法によって行うことができる。突然変異がｔＰＡ遺伝子座の上流領域の−７３５１位におけるＣ〜Ｔ突然変異であるならば、増幅の好ましい領域は、配列番号１のヌクレオチド１８４０〜２２４５の領域である。
【０１２０】
あるいは、突然変異の存在は、被験者から単離されたＤＮＡから野生型対立遺伝子又は突然変異を有する対立遺伝子のいずれかのみを増幅する配列特異的プライマーを用いて決定することができる。配列特異的プライマーを用いてＤＮＡを増幅する場合、コンセンサスプライマーと二種の代替プライマーのうち一種とが用いられる。代替プライマーのそれぞれは、野生型配列（ＷＴプライマー）に対応するか多型配列（ＳＰＮプライマー）に対応する３′ 末端ヌクレオチドを有する。この場合、増幅は正確な相補ヌクレオチドを有するテンプレートからのみ生じるであろう。
【０１２１】
突然変異が−７３５１位におけるＣ〜Ｔ突然変異の場合、ＷＴ及びＳＮＰプライマーでの増幅に好ましいｔＰＡ遺伝子座の領域は、配列番号１のヌクレオチド１８４０〜２２４５の領域である。
【０１２２】
好ましくは、正常−７３５１配列を有するｔＰＡ遺伝子座の領域を増幅するために用いるプライマーは配列番号２（５′−ＡＴＴＧＧＣＧＣＡＡＡＣＴＣＣＴＣＡＣＡ−３′）及び配列番号３（５′−ＡＴＧＧＣＴＧＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＧ−３′）であり、−７３５１Ｃ〜Ｔ多型配列を有するｔＰＡ遺伝子座の領域を増幅するために用いるプライマーは配列番号２（５′−ＡＴＴＧＧＣＧＣＡＡＡＣＴＣＣＴＣＡＣＡ−３′）及び配列番号４（５′−ＡＴＧＧＣＴＧＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＡ−３′）である。これらプライマーでｔＰＡ遺伝子座を増幅するための好ましい反応条件は、ＰＴＣ-２００ペルチエサーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を次のＰＣＲサイクルパラメータで使用することを含む：９６℃で２５秒、７０℃で４５秒及び７２℃で４５秒（５サイクル）；９６℃で２５秒、６５℃で５０秒及び７２℃で４５秒（２１サイクル）；９６℃で２５秒、５５℃で６０秒及び７２℃で１２５秒（４サイクル）。
【０１２３】
増幅生成物は当業界で知られている好ましい方法により検出することができる。例えば、増幅生成物をアガロースゲル上に展開し、エチジウムブロミドで染色し視覚化することができる。
【０１２４】
突然変異の特定は、被験者から単離・誘導した核酸から突然変異を含む領域を増幅することを含むことが好ましい。
【０１２５】
突然変異の特定は、被験者から単離・誘導した核酸をレポーター核酸とハイブリッド形成することにより突然変異を検出することも含むことが好ましい。
【０１２６】
本発明の本形態は、小血管閉塞に関連する疾病又は状態の予防及び／又は治療が必要な被験者を特定することにも有用である。
【０１２７】
従って本発明はまた、他の形態において、小血管閉塞に関連する疾病又は状態の予防及び／又は治療を行うために好適な被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を低下させる突然変異を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【０１２８】
更に本発明はまた、好ましい形態において、小血管閉塞に関連する疾病又は状態の予防及び／又は治療を行うために好適な被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の両対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【０１２９】
本発明はまた、小血管閉塞の素因を有する被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子の低減された放出速度を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【０１３０】
本被験者は、男性か女性のヒト被験者のいずれかであり、小血管閉塞の素因を決定すべき被験者である。好ましい被験者はコーカソイド起源のヒトである。
【０１３１】
小血管閉塞は被験者の小血管に起こり得る血栓性又は塞栓性の閉塞のいずれかであり、ラクナー発作、痴呆、虚血性心疾患（虚血性心筋症含む）、末梢血管疾患、血管内凝固症候群、小血管炎、虚血性神経障害、虚血性網膜症、虚血性胃疾患（小腸大腸虚血含む）、広汎性肺塞栓症及び血管性インポテンス等を含む。
【０１３２】
好ましくは、小血管閉塞は脳内に発生し、臨床的にはラクナー発作を呈する小血管閉塞を含む。
【０１３３】
被験者は、被験者においてｔＰＡ放出速度を低下させる突然変異をｔＰＡ遺伝子座に有することが好ましい。より好ましくは、被験者は、被験者においてｔＰＡ放出速度を低下させる突然変異をｔＰＡ遺伝子座の上流領域に有する。より好ましくは、被験者は、被験者においてｔＰＡ放出速度を低下させる突然変異をｔＰＡ遺伝子座のエンハンサーエレメントに有する。最も好ましくは、被験者は、被験者においてｔＰＡ放出速度を低下させる突然変異をｔＰＡ遺伝子座の上流領域のシトシンからチミンへの−７３５１位に有する。
【０１３４】
−７３５１位シトシンからチミンへの突然変異は、ｔＰＡ遺伝子座の一方又は両方の対立遺伝子の存在してもよい。この突然変異がｔＰＡ遺伝子座の両方の対立遺伝子の存在することが最も好ましい。
【０１３５】
また、被験者における低減されたｔＰＡ放出速度は、当業界で知られている好ましい方法によって特定することができる。例えば被験者の前腕部におけるｔＰＡ放出速度を決定することにより直接決定することができる。
【０１３６】
インビボにおけるｔＰＡの放出速度を決定する好ましい方法は、Jernら、（１９９９）Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. １９（２）:４５４〜４５９に記載されている。
【０１３７】
本発明の本形態は、小血管閉塞に関連する疾病又は状態の予防及び／又は治療が必要な被験者を特定することにも有用である。
【０１３８】
従って本発明はまた他の形態において、小血管閉塞に関連する疾病又は状態の予防及び／又は治療を行うために好適な被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子の低減された放出速度を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【０１３９】
本発明はまた、小血管閉塞に関連する疾病又は状態の素因を有する被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の両対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【０１４０】
本被験者は、男性か女性のヒト被験者のいずれかであり、小血管閉塞に関連する疾病又は状態の進行の素因を決定すべき被験者である。好ましい被験者はコーカソイド起源のヒトである。
【０１４１】
小血管閉塞に関連する疾病又は状態の例としては、ラクナー発作、痴呆、虚血性心疾患（虚血性心筋症含む）、末梢血管疾患、血管内凝固症候群、小血管炎、虚血性神経障害、虚血性網膜症、虚血性胃疾患（小腸大腸虚血含む）、広汎性肺塞栓症及び血管性インポテンスが挙げられる。
【０１４２】
好ましくは、小血管閉塞に関連する疾病又は状態は脳内に発生し、ラクナー発作を含む。
【０１４３】
組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の両対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在を被験者において特定することは、当業界において知られている好ましい方法によって行うことができる。
【０１４４】
ＤＮＡは被験者から当業界で知られている好ましい方法によって単離することができる。被験者の静脈全血からゲノムＤＮＡを単離する好ましい方法は、Millerら、（１９８８） Nucleic Acids Research １６（３）:１２１５に記載されている。
【０１４５】
組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の両対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異を特定するには、ＤＮＡ塩基配列決定法（マニュアル或いは自動蛍光塩基配列決定）を用いて突然変異を検出することができる。
【０１４６】
既に述べたように、突然変異の特定には種々の方法を用いることができる。ＤＮＡ配列分析を用いて突然変異を特定する場合には、一対立遺伝子に突然変異の存在が見出されるということは（即ち被験者が突然変異についてヘテロ接合性）、ＤＮＡ配列中の関連する位置に二個のヌクレオチド（Ｃ及びＴ）が存在することとなる。正常な対立遺伝子に対してホモ接合性或いは突然変異に対してホモ接合性である、被験者から取り出したＤＮＡ配列であれば、ＤＮＡ配列中の関連する位置において相当する一ヌクレオチドの存在のみを得ることとなる。
【０１４７】
塩基配列決定のための好ましいテンプレートを提供するには、被験者から単離されたゲノムＤＮＡの領域を適切に設計したプライマーを用いて増幅することができる。適切なプライマーとの配列決定反応及びＤＮＡ配列の分析は当業界で知られた好ましい方法によって行うことができる。増幅の好ましい領域は、配列番号１のヌクレオチド１８４０〜２２４５の領域である。
【０１４８】
両対立遺伝子における突然変異の存在は、被験者から単離されたＤＮＡから野生型対立遺伝子又は突然変異を有する対立遺伝子のいずれかのみを増幅する配列特異的プライマーを用いて決定することができる。繰り返すが、ＷＴ及びＳＮＰプライマーでの増幅に好ましいｔＰＡ遺伝子座の領域は、配列番号１のヌクレオチド１８４０〜２２４５の領域である。
【０１４９】
あるいは、好ましくは、正常−７３５１配列を有するｔＰＡ遺伝子座の領域を増幅するために用いるプライマーは配列番号２（５′−ＡＴＴＧＧＣＧＣＡＡＡＣＴＣＣＴＣＡＣＡ−３′）及び配列番号３（５′−ＡＴＧＧＣＴＧＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＧ−３′）であり、−７３５１Ｃ〜Ｔ多型配列を有するｔＰＡ遺伝子座の領域を増幅するために用いるプライマーは配列番号２（５′−ＡＴＴＧＧＣＧＣＡＡＡＣＴＣＣＴＣＡＣＡ−３′）及び配列番号４（５′−ＡＴＧＧＣＴＧＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＡ−３′）である。これらプライマーでｔＰＡ遺伝子座を増幅するための好ましい反応条件は、ＰＴＣ-２００ペルチエサーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を次のＰＣＲサイクルパラメータで使用することを含む：９６℃で２５秒、７０℃で４５秒及び７２℃で４５秒（５サイクル）；９６℃で２５秒、６５℃で５０秒及び７２℃で４５秒（２１サイクル）；９６℃で２５秒、５５℃で６０秒及び７２℃で１２５秒（４サイクル）。
【０１５０】
増幅生成物は当業界で知られている好ましい方法により検出することができる。例えば、増幅生成物をアガロースゲル上に展開し、エチジウムブロミドで染色し視覚化することができる。
【０１５１】
突然変異の特定は、被験者から単離・誘導した核酸から突然変異を含む領域を増幅することを含むことが好ましい。
【０１５２】
突然変異の特定は、被験者から単離・誘導した核酸をレポーター核酸とハイブリッド形成することにより突然変異を検出することも含むことが好ましい。
【０１５３】
本発明の本形態は、小血管閉塞に関連する疾病又は状態の予防及び／又は治療が必要な被験者を特定することにも有用である。
【０１５４】
従って本発明はまた他の形態において、小血管閉塞に関連する疾病又は状態の予防及び／又は治療を行うために好適な被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の両対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【０１５５】
本発明はまた、被験者における虚血性発作のリスクを決定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の一方若しくは両方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在を前記被験者において決定する段階を含む方法を提供する。
【０１５６】
被験者における虚血性発作のリスクとは、虚血性発作を伴うための他のリスク因子（例えば心房細動、喫煙歴等）が被験者間で同程度という条件下で、被験者集団全体が虚血性発作に罹患する可能性と比較したｔＰＡ遺伝子座に突然変異を有する被験者が虚血性発作に罹患する可能性である。
【０１５７】
この点に関し、ｔＰＡ遺伝子座の一方若しくは両方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在（即ち多型についてヘテロ接合性の個体）は、虚血性発作又は小血管閉塞を伴うための他のリスク因子（例えば心房細動、喫煙歴等）が被験者間で同程度という条件下で、被験者が虚血性発作に罹患するリスクが被験者集団全体と比較してより高いことを示す。
【０１５８】
例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の一方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の被験者における存在は、組織プラスミノーゲン遺伝子座のいずれの対立遺伝子にも突然変異を有さない被験者の虚血性発作のリスクと比較した場合の被験者の虚血性発作のリスクの増大を示す。
【０１５９】
また、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の一方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の被験者における存在は、被験者集団全体の虚血性発作に対するリスクと比較した場合の被験者の高い虚血性発作に対するリスク、又は虚血性発作を伴うための他の同様のリスク因子を有する他の被験者の虚血性発作に対するリスクと比較した場合の被験者の高い虚血性発作に対するリスクを示す。
【０１６０】
更に、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の両方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の被験者における存在は、組織プラスミノーゲン遺伝子座の一方若しくは両方の対立遺伝子における突然変異を有さない被験者の虚血性発作に対するリスクと比較した場合の被験者の高い虚血性発作に対するリスクを示す。
【０１６１】
また、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の両方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の被験者における存在は、被験者集団全体の虚血性発作に対するリスクと比較した場合の被験者の高い虚血性発作に対するリスク、又は虚血性発作を伴うための他の同様のリスク因子を有する被験者の虚血性発作に対するリスクと比較した場合の被験者の高い虚血性発作に対するリスクを示す。
【０１６２】
本被験者は、男性か女性のヒト被験者のいずれかであり、虚血性発作罹患のリスクを決定すべき被験者である。好ましい被験者はコーカソイド起源のヒトである。
【０１６３】
虚血性発作は、被験者に起こりうる血栓性又は塞栓性発作のいずれかであり、心塞栓性又はアテローム血栓性の虚血性発作を含む。好ましくは、虚血性発作はアテローム血栓性の虚血性発作である。
【０１６４】
好ましくは、虚血性発作は小血管発作（即ちラクナー発作）である。従って、本発明はまた、好ましい形態において、被験者におけるラクナー発作のリスクを決定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の一方若しくは両方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在を前記被験者において決定する段階を含む方法を提供する。
【０１６５】
既に述べたように、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の一方若しくは両方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在を前記被験者において決定することは、当業界で知られている好ましい方法によって決定することができる。
【０１６６】
ＤＮＡは被験者から当業界で知られている好ましい方法によって単離することができる。被験者の静脈全血からゲノムＤＮＡを単離する好ましい方法は、Millerら、（１９８８） Nucleic Acids Research １６（３）:１２１５に記載されている。
【０１６７】
既に述べたように、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の一方若しくは両方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在を前記被験者において決定するためには、ＤＮＡ塩基配列決定法（マニュアル或いは自動蛍光塩基配列決定）等の種々の方法を用いることができる。
【０１６８】
ＤＮＡ配列分析を用いて突然変異を特定する場合には、一対立遺伝子に突然変異の存在が見出されるということは（即ち被験者が突然変異についてヘテロ接合性）、ＤＮＡ配列中の関連する位置に二個のヌクレオチド（Ｃ及びＴ）が存在することとなる。正常な対立遺伝子に対してホモ接合性或いは突然変異に対してホモ接合性である、被験者から取り出したＤＮＡ配列であれば、ＤＮＡ配列中の関連する位置において相当する一ヌクレオチドの存在のみを得ることとなる。
【０１６９】
突然変異の塩基配列決定のための好ましいテンプレートを提供するには、被験者から単離されたゲノムＤＮＡの領域を適切に設計したプライマーを用いて増幅することができる。適切なプライマーとの配列決定反応及びＤＮＡ配列の分析は当業界で知られた好ましい方法によって行うことができる。増幅の好ましい領域は、配列番号１のヌクレオチド１８４０〜２２４５の領域である。
【０１７０】
また、突然変異の存在は、被験者から単離されたＤＮＡから野生型対立遺伝子又は突然変異を有する対立遺伝子のいずれかのみを増幅する配列特異的プライマーを用いて決定することができる。繰り返すが、ＷＴ及びＳＮＰプライマーでの増幅に好ましいｔＰＡ遺伝子座の領域は、配列番号１のヌクレオチド１８４０〜２２４５の領域である。
【０１７１】
好ましくは、正常−７３５１配列を有するｔＰＡ遺伝子座の領域を増幅するために用いるプライマーは配列番号２（５′−ＡＴＴＧＧＣＧＣＡＡＡＣＴＣＣＴＣＡＣＡ−３′）及び配列番号３（５′−ＡＴＧＧＣＴＧＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＧ−３′）であり、−７３５１Ｃ〜Ｔ多型配列を有するｔＰＡ遺伝子座の領域を増幅するために用いるプライマーは配列番号２（５′−ＡＴＴＧＧＣＧＣＡＡＡＣＴＣＣＴＣＡＣＡ−３′）及び配列番号４（５′−ＡＴＧＧＣＴＧＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＡ−３′）である。これらプライマーでｔＰＡ遺伝子座を増幅するための好ましい反応条件は、ＰＴＣ-２００ペルチエサーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を次のＰＣＲサイクルパラメータで使用することを含む：９６℃で２５秒、７０℃で４５秒及び７２℃で４５秒（５サイクル）；９６℃で２５秒、６５℃で５０秒及び７２℃で４５秒（２１サイクル）；９６℃で２５秒、５５℃で０秒及び７２℃で１２５秒（４サイクル）。
【０１７２】
増幅生成物は当業界で知られている好ましい方法により検出することができる。例えば、増幅生成物をアガロースゲル上に展開し、エチジウムブロミドで染色し視覚化することができる。
【０１７３】
突然変異の特定は、被験者から単離・誘導した核酸から突然変異を含む領域を増幅することを含むことが好ましい。
【０１７４】
突然変異の特定は、被験者から単離・誘導した核酸をレポーター核酸とハイブリッド形成することにより突然変異を検出することも含むことが好ましい。
【０１７５】
本発明はまた、被験者における小血管閉塞のリスク又は前記被験者のおける小血管閉塞に関連する疾病又は状態の進行のリスクを決定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の一方若しくは両方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在を前記被験者において決定する段階を含む方法を提供する。
【０１７６】
被験者における小血管閉塞のリスクとは、小血管閉塞を伴うための他のリスク因子が被験者間で同程度という条件下で、被験者集団全体が小血管閉塞に罹患する可能性と比較したｔＰＡ遺伝子座に突然変異を有する被験者が小血管閉塞に罹患する可能性である。
【０１７７】
この点に関し、ｔＰＡ遺伝子座の一方若しくは両方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在（即ち多型についてヘテロ接合性の個体）は、小血管閉塞を伴うための他のリスク因子が被験者間で同程度という条件下で、被験者が小血管閉塞に罹患するリスクが被験者集団全体と比較してより高いことを示す。両方の対立遺伝子における突然変異の存在は、一方の対立遺伝子における突然変異の存在より更に高リスクを示す。
【０１７８】
例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の一方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の被験者における存在は、組織プラスミノーゲン遺伝子座のいずれの対立遺伝子にも突然変異を有さない被験者のリスクと比較した場合の被験者の小血管閉塞のリスク又は前記被験者の小血管閉塞に関連する疾患の進行のリスクの増大を示す。
【０１７９】
また、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の一方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の被験者における存在は、被験者集団全体のリスクと比較した場合の被験者の小血管閉塞のリスク又は前記被験者の小血管閉塞に関連する疾患の進行のリスクの増大を、又は小血管閉塞を伴うための他の同様のリスク因子を有する他の被験者のリスクと比較した場合の被験者の小血管閉塞のリスク又は前記被験者の小血管閉塞前記被験者の虚血性発作に関連する疾患の進行虚血性発作のリスクの増大を示す。
【０１８０】
組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の両方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の被験者における存在は、組織プラスミノーゲン遺伝子座の一方若しくは両方の対立遺伝子における突然変異を有さない被験者のリスクと比較した場合の被験者の小血管閉塞のリスク又は前記被験者の小血管閉塞に関連する疾患の進行のリスクの増大を示す。
【０１８１】
また、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の両方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の被験者における存在は、被験者集団全体のリスクと比較した場合の小血管閉塞のリスク又は前記被験者の小血管閉塞に関連する疾患の進行のリスクの増大を、又は小血管閉塞を伴うための他の同様のリスク因子を有する他の被験者のリスクと比較した場合の被験者の小血管閉塞のリスク又は前記被験者の小血管閉塞に関連する疾患の進行のリスクの増大を示す。
【０１８２】
本被験者は、男性か女性のヒト被験者のいずれかであり、小血管閉塞罹患のリスクを決定すべき被験者である。好ましい被験者はコーカソイド起源のヒトである。
【０１８３】
小血管閉塞は被験者の小血管に起こり得る血栓性又は塞栓性の閉塞のいずれかであり、ラクナー発作、痴呆、虚血性心疾患（虚血性心筋症含む）、末梢血管疾患、血管内凝固症候群、小血管炎、虚血性神経障害、虚血性網膜症、虚血性胃疾患（小腸大腸虚血含む）、広汎性肺塞栓症及び血管性インポテンス等を臨床的に呈する小血管閉塞を含む。
【０１８４】
好ましくは、小血管閉塞は脳内に発生し、臨床的にはラクナー発作を呈する小血管閉塞を含む。
【０１８５】
既に述べたように、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の一方若しくは両方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在を前記被験者において決定するためには、当業界で知られている好ましい方法を用いることができる。
【０１８６】
ＤＮＡは被験者から当業界で知られている好ましい方法によって単離することができる。被験者の静脈全血からゲノムＤＮＡを単離する好ましい方法は、Millerら、（１９８８） Nucleic Acids Research １６（３）:１２１５に記載されている。
【０１８７】
組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の一方若しくは両方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異を決定するには、ＤＮＡ塩基配列決定法（マニュアル或いは自動蛍光塩基配列決定）を用いて突然変異を検出することができる。
【０１８８】
ＤＮＡ配列分析を用いて突然変異を特定する場合には、一対立遺伝子に突然変異の存在が見出されるということは（即ち被験者が突然変異についてヘテロ接合性）、ＤＮＡ配列中の関連する位置に二個のヌクレオチド（Ｃ及びＴ）が存在することとなる。正常な対立遺伝子に対してホモ接合性或いは突然変異に対してホモ接合性である、被験者から取り出したＤＮＡ配列であれば、ＤＮＡ配列中の関連する位置において相当する一ヌクレオチドの存在のみを得ることとなる。
【０１８９】
突然変異の塩基配列決定のための好ましいテンプレートを提供するには、被験者から単離されたゲノムＤＮＡの領域を適切に設計したプライマーを用いて増幅することができる。適切なプライマーとの配列決定反応及びＤＮＡ配列の分析は当業界で知られた好ましい方法によって行うことができる。増幅の好ましい領域は、配列番号１のヌクレオチド１８４０〜２２４５の領域である。
【０１９０】
また、突然変異の存在は、被験者から単離されたＤＮＡから野生型対立遺伝子又は突然変異を有する対立遺伝子のいずれかのみを増幅する配列特異的プライマーを用いて決定することができる。繰り返すが、ＷＴ及びＳＮＰプライマーでの増幅に好ましいｔＰＡ遺伝子座の領域は、配列番号１のヌクレオチド１８４０〜２２４５の領域である。
【０１９１】
好ましくは、正常−７３５１配列を有するｔＰＡ遺伝子座の領域を増幅するために用いるプライマーは配列番号２（５′−ＡＴＴＧＧＣＧＣＡＡＡＣＴＣＣＴＣＡＣＡ−３′）及び配列番号３（５′−ＡＴＧＧＣＴＧＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＧ−３′）であり、−７３５１Ｃ〜Ｔ多型配列を有するｔＰＡ遺伝子座の領域を増幅するために用いるプライマーは配列番号２（５′−ＡＴＴＧＧＣＧＣＡＡＡＣＴＣＣＴＣＡＣＡ−３′）及び配列番号４（５′−ＡＴＧＧＣＴＧＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＡ−３′）である。これらプライマーでｔＰＡ遺伝子座を増幅するための好ましい反応条件は、ＰＴＣ-２００ペルチエサーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を次のＰＣＲサイクルパラメータで使用することを含む：９６℃で２５秒、７０℃で４５秒及び７２℃で４５秒（５サイクル）；９６℃で２５秒、６５℃で５０秒及び７２℃で４５秒（２１サイクル）；９６℃で２５秒、５５℃で６０秒及び７２℃で１２５秒（４サイクル）。
【０１９２】
増幅生成物は当業界で知られている好ましい方法により検出することができる。例えば、増幅生成物をアガロースゲル上に展開し、エチジウムブロミドで染色し視覚化することができる。
【０１９３】
突然変異の特定は、被験者から単離・誘導した核酸から突然変異を含む領域を増幅することを含むことが好ましい。
【０１９４】
突然変異の特定は、被験者から単離・誘導した核酸をレポーター核酸とハイブリッド形成することにより突然変異を検出することも含むことが好ましい。
【０１９５】
本発明はまた、配列番号３に記載の配列からなる単離された核酸又はそのＲＮＡ等価物、或いは配列番号３に記載の配列中に一以上の塩基置換を有する単離された核酸であって、前記核酸はストリンジェントなハイブリッド形成条件下で配列番号３の相補配列とハイブリッド化する核酸を提供する。前記ストリンジェントなハイブリッド形成条件は４２℃における６ｘＳＳＣのハイブリッド形成及び２０℃における２ｘＳＳＣの洗浄を含む。
【０１９６】
本発明の本形態は、配列番号３（５′−ＡＴＧＧＣＴＧＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＧ−３′）に記載の配列からなる単離された核酸又はそのＲＮＡ等価物、或いはこの配列中に一以上の塩基置換を有する単離された核酸であって、前記核酸はストリンジェントなハイブリッド形成条件下で配列番号３の相補配列とハイブリッド化する核酸に関する。前記ストリンジェントなハイブリッド形成条件は４２℃における６ｘＳＳＣのハイブリッド形成及び２０℃における２ｘＳＳＣの洗浄を含む。
【０１９７】
核酸は当業界において知られている標準的な方法により合成することができる。例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Steinらの方法（Steinら、（１９８８） Nucl. Acids Res. １６: ３２０９に記載）により合成することができる。
【０１９８】
ストリンジェントなハイブリッド形成条件とは、Ｔｍ（Ｔｍ：融点）付近からＴｍより約２０℃低い範囲において相補的な核酸がお互いに結合しあうことを許容する条件である。
【０１９９】
相補領域の長さ、核酸類（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成物）の種類及び組成、塩類及び他の成分の濃度（例えばホルムアミド、デキストラン、デキストラン硫酸、及び／又ポリエチレングリコールの有無）等の諸因子は全て考慮する必要がある。これらは基本的には、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. （１９８９）に記載されている。
【０２００】
例えば、核酸をストリンジェントなハイブリッド形成条件下で配列番号３の相補配列とハイブリッド化せしめる条件は次のようになる。プレハイブリッド化をプレハイブリッド化溶液（例えば６ＸＳＳＣ（１ｘ＝１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、５Ｘデンハール試薬（各１ｇ／Ｌのフィコール、ポリビニルピロリドン及びウシ血清アルブミン）、１.０％ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍＬ変性フラグメント化サケ精子ＤＮＡ）中で２〜１２時間行うことができる。続いてターゲット（即ちフィルター）とプローブとのハイブリッド化を、条件（６ＸＳＳＣ、１.０％ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍＬ変性フラグメント化サケ精子ＤＮＡ、４２℃）下で一夜行うことができる。このフィルターを２ＸＳＳＣ及び０.５％ＳＤＳを用い室温で１５分（２０℃）で洗浄することができる。
【０２０１】
本発明はまた、配列番号４に記載の配列からなる単離された核酸又はそのＲＮＡ等価物、或いは配列番号４に記載の配列中に一以上の塩基置換を有する単離された核酸であって、前記核酸はストリンジェントなハイブリッド形成条件下で配列番号４の相補配列とハイブリッド化する核酸を提供する。前記ストリンジェントなハイブリッド形成条件は４２℃における６ｘＳＳＣのハイブリッド形成及び２０℃における２ｘＳＳＣの洗浄を含む。
【０２０２】
本発明の本形態は、配列番号４（５′−ＡＴＧＧＣＴＧＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＡ−３′）に記載の配列からなる単離された核酸又はそのＲＮＡ等価物、或いはこの配列中に一以上の塩基置換を有する単離された核酸であって、前記核酸はストリンジェントなハイブリッド形成条件下で配列番号４の相補配列とハイブリッド化する核酸に関する。前記ストリンジェントなハイブリッド形成条件は４２℃における６ｘＳＳＣのハイブリッド形成及び２０℃における２ｘＳＳＣの洗浄を含む。
【０２０３】
核酸は当業界において知られている標準的な方法により合成することができる。例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Steinらの方法（Steinら、（１９８８） Nucl. Acids Res. １６: ３２０９に記載）により合成することができる。
【０２０４】
ストリンジェントなハイブリッド形成条件とは、Ｔｍ（Ｔｍ：融点）付近からＴｍより約２０℃低い範囲において相補的な核酸がお互いに結合しあうことを許容する条件である。
【０２０５】
相補領域の長さ、核酸類（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成物）の種類及び組成、塩類及び他の成分の濃度（例えばホルムアミド、デキストラン、デキストラン硫酸、及び／又ポリエチレングリコールの有無）等の諸因子は全て考慮する必要がある。これらは基本的には、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. （１９８９）に記載されている。
【０２０６】
例えば、核酸をストリンジェントなハイブリッド形成条件下で配列番号４の相補配列とハイブリッド化せしめる条件は次のようになる。プレハイブリッド化をプレハイブリッド化溶液（例えば６ＸＳＳＣ（１ｘ＝１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、５Ｘデンハール試薬（各１ｇ／Ｌのフィコール、ポリビニルピロリドン及びウシ血清アルブミン）、１.０％ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍＬ変性フラグメント化サケ精子ＤＮＡ）中で２〜１２時間行うことができる。続いてターゲット（即ちフィルター）とプローブとのハイブリッド化を、条件（６ＸＳＳＣ、１.０％ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍＬ変性フラグメント化サケ精子ＤＮＡ、４２℃）下で一夜行うことができる。その後、このフィルターを２ＸＳＳＣ及び０.５％ＳＤＳを用い室温で１５分（２０℃）で洗浄することができる。
【０２０７】
本発明はまた、配列番号３に記載の配列中に一以上の塩基置換を有する単離された核酸であって、前記核酸は配列番号３と８０％以上の相同性を有する核酸又はそのＲＮＡ等価物を提供する。
【０２０８】
本発明の本形態は、配列番号３に記載の配列中に一以上の塩基置換を有する単離された核酸であって、前記核酸は配列番号３と８０％以上の相同性を有する核酸又はそのＲＮＡ等価物に関する。
【０２０９】
二種の核酸配列の相同性の程度を決定するための種々のアルゴリズムが存在する。例えばＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて二種の配列間の配列相同性の程度を決定することができる。ＢＬＡＳＴは二種の配列間ローカルアラインメントを特定し、偶然発生したローカルアラインメントの可能性を予知する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、Altschulら、１９９０, J. Mol. Biol. ２１５:４０３〜４１０に記載されている。
【０２１０】
好ましくは、前記核酸又はそのＲＮＡ等価物は配列番号３と９０％以上の相同性を有する。更に好ましくは、前記核酸又はそのＲＮＡ等価物は配列番号３と９５％以上の相同性を有する。
【０２１１】
核酸は当業界において知られている標準的な方法により合成することができる。例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Steinらの方法（Steinら、（１９８８） Nucl. Acids Res. １６: ３２０９に記載）により合成することができる。
【０２１２】
本発明はまた、配列番号４に記載の配列中に一以上の塩基置換を有する単離された核酸であって、前記核酸又はそのＲＮＡ等価物は配列番号４と８０％以上の相同性を有する核酸を提供する。
【０２１３】
本発明の本形態は、配列番号４に記載の配列中に一以上の塩基置換を有する単離された核酸であって、前記核酸又はそのＲＮＡ等価物は配列番号４と８０％以上の相同性を有する核酸に関する。
【０２１４】
繰り返すが、二種の核酸配列の相同性の程度を決定するための種々のアルゴリズムが存在する。例えばＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて二種の配列間の配列相同性の程度を決定することができる。ＢＬＡＳＴは二種の配列間ローカルアラインメントを特定し、偶然発生したローカルアラインメントの可能性を予知する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、Altschulら、１９９０, J. Mol. Biol. ２１５:４０３〜４１０に記載されている。
【０２１５】
好ましくは、前記核酸又はそのＲＮＡ等価物は配列番号４と９０％以上の相同性を有する。更に好ましくは、前記核酸又はそのＲＮＡ等価物は配列番号４と９５％以上の相同性を有する。
【０２１６】
核酸は当業界において知られている標準的な方法により合成することができる。例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Steinらの方法（Steinら、（１９８８） Nucl. Acids Res. １６: ３２０９に記載）により合成することができる。
【０２１７】
本発明はまた、細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を増大可能な剤を特定する方法であって、前記方法は（ａ）細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を低下させる突然変異を含む細胞に剤を作用させる段階と、（ｂ）前記剤を作用させた細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を測定する段階と（ｃ）前記剤を、細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を増大可能な剤と特定する段階とを含む方法を提供する。
【０２１８】
本発明の本形態は、細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を増大可能な剤を特定する方法に関する。このようにして特定された剤は、被験者が虚血性発作又は小血管閉塞、特にラクナー発作に罹る可能性を低減するために被験者に投与するための化合物候補である。
【０２１９】
この剤は、組織プラスミノーゲン活性化因子の細胞からの放出速度を増大させる能力を決定すべき剤のいずれかである。
【０２２０】
「作用させる」とは、剤を細胞外部から投与することと、細胞内で剤を発現させることとをその範囲に含むと理解されたい。従って、剤を細胞に作用させるとは、細胞に剤を接触させること、即ち例えば、細胞内で剤の発現を指向し得る組み換え核酸を用いて細胞を形質転換することであってもよい。
【０２２１】
細胞は、突然変異を有さない同様の細胞と比較した場合に、細胞組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を低減させる突然変異を有する細胞のいずれかである。
【０２２２】
この細胞は好ましくは内皮細胞である。ヒト内皮細胞が最も好ましい。好ましい内皮細胞は、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）である。
【０２２３】
細胞内の突然変異は、細胞からのｔＰＡの放出速度を低下させる突然変異のいずれかである。例えば、ｔＰＡ遺伝子座に関連しない遺伝子又は領域の突然変異でもよい。或いは、ｔＰＡ遺伝子座における突然変異でもよく、その例としては、ｔＰＡ遺伝子の転写に影響を及ぼすｔＰＡコード領域上流における突然変異や、ｔＰＡ遺伝子のエクソンにおける突然変異、エンハンサーエレメントにおける突然変異、スプライシングに影響を及ぼすイントロンにおける突然変異、翻訳又はｍＲＮＡの安定性に影響を及ぼすｔＰＡの３′領域における突然変異が挙げられる。
【０２２４】
突然変異は特定遺伝子の対立遺伝子の一方にあっても両方にあってもよい。
【０２２５】
好ましくは、内皮細胞からのｔＰＡの放出速度を低減させる、ｔＰＡ遺伝子座における突然変異である。
【０２２６】
突然変異の組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を低減させる能力は、当業界で知られた好ましい方法によって確認することができる。例えば、ｔＰＡ遺伝子座の特定の突然変異が内皮細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を低減させる能力は、突然変異を有する内皮細胞をインビトロで培養し、内皮細胞からのｔＰＡ放出速度を決定し、更に前記細胞を新鮮な媒体で洗浄し、その媒体へのｔＰＡの放出速度の時間変化の程度を野生型内皮細胞と比較して決定することにより、決定することができる。内皮細胞からのｔＰＡの放出を誘起するためには、当業界において内皮細胞からのｔＰＡの分泌を誘起することが知られているトロンビンやカルシウムイオノホア等の剤を用いることができる。インビトロにおいて内皮細胞からのｔＰＡの放出を誘起する好ましい方法はRosnobletら、（１９９９）Arterioscler Thromb Vasc Biol. １９（７）:１７９６〜８０３に記載されている。
【０２２７】
酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）（例えばＴｉｎｔＥｌｉｚｅ(R)ｔ−ＰＡ、ＢｉｏｐｏｏｌＡＢ）によって全ｔＰＡ抗原を定量することができる。この種のアッセイは二重抗体原理を基礎とする。遊離ｔＰＡとｔＰＡ−インヒビター複合体とは同程度の効率で検出される。
【０２２８】
細胞中の突然変異はｔＰＡ遺伝子座の上流領域に存在する突然変異であることが好ましい。更に好ましくは、突然変異はｔＰＡ遺伝子座のエンハンサーエレメントにおける突然変異である。最も好ましくは、突然変異はｔＰＡ遺伝子座の上流領域の−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異である。
【０２２９】
−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異は、ｔＰＡ遺伝子座の対立遺伝子に一方にあっても両方にあってもよい。
【０２３０】
従って、本発明はまた、好ましい形態において、細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を増大可能な剤を特定する方法であって、前記方法は（ａ）組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の一方若しくは両方の対立遺伝子の−７３５１位にシトシンからチミンへの多型を含む細胞に剤を作用させる段階と、（ｂ）前記剤を作用させた細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を測定する段階と（ｃ）前記剤を、細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を増大可能な剤と特定する段階とを含む方法を提供する。
【０２３１】
最も好ましくは、−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異は、ｔＰＡ遺伝子座の対立遺伝子に両方に存在する。
【０２３２】
細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子放出速度向上剤の能力は、細胞に作用させる剤の濃度に依存することは理解されよう。従って、剤を好ましい濃度で細胞に作用させて、その濃度における細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を増大させる能力を調べる。
【０２３３】
内皮細胞からのｔＰＡの放出速度向上剤としては、モノナトリウム［２-（６-ヒドロキシナフタレン−２−イル）−６−メチル−ピリジン−４−イルオキシ］アセテートジハイドレート（ＪＴＶ−９２６）（Ueshimaら、（２００２） "Function of tissue-type plasminogen activator releaser on vascular endotherial cells in thrombolysis in vivo" Thrombosis Haemostasis ８７:１０６９〜７４）が知られている。
【０２３４】
細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度は、当業界で知られた好ましい方法によって決定することができる。例えば、ある剤が内皮細胞からのｔＰＡの放出速度を変化させる能力は、内皮細胞をインビトロで培養し、内皮細胞からのｔＰＡ放出速度をその剤の存在又は非存在下において決定する。放出速度を決定するには、前記細胞を新鮮な媒体で洗浄し、その媒体へのｔＰＡの放出速度の時間変化の程度を決定する。内皮細胞からのｔＰＡの放出を誘起するためには、当業界において内皮細胞からのｔＰＡの放出を誘起することが知られているトロンビンやカルシウムイオノホア等の剤を用いることができる。インビトロにおいて内皮細胞からのｔＰＡの放出を誘起する好ましい方法はRosnobletら、（１９９９）Arterioscler Thromb Vasc Biol. １９（７）:１７９６〜８０３に記載されている。
【０２３５】
酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）（例えばＴｉｎｔＥｌｉｚｅ(R)ｔ−ＰＡ、ＢｉｏｐｏｏｌＡＢ）によって全ｔＰＡ抗原を定量することができる。この種のアッセイは二重抗体原理を基礎とする。遊離ｔＰＡとｔＰＡ−インヒビター複合体とは同程度の効率で検出される。
【０２３６】
ｔＰＡ放出速度向上剤は、その効果をｔＰＡ放出速度に関して比較して特定することができる。比較対象は、剤が存在しない場合の放出速度及び従来のｔＰＡ放出速度向上剤（例えばＪＴＶ−９２６）である。このようにして特定された、組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を増大する剤は、被験者が虚血性発作（特にラクナー発作）又は小血管閉塞に罹る可能性を低減するために被験者に投与するための化合物候補である。
【０２３７】
本発明はまた、細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を増大可能な剤を特定する方法であって、前記方法は、（ａ）組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の全部又は一部を形質転換した細胞であって、前記形質転換した遺伝子座は−７３５１位にシトシンからチミンへの突然変異を含み且つ前記形質転換した遺伝子座はレポーター遺伝子の発現を制御する細胞に剤を作用させる段階と、（ｂ）前記剤を作用させた細胞におけるレポーター遺伝子の発現レベルを決定する段階と、（ｃ）前記レポーター遺伝子の発現を増大可能な剤を特定する段階と、（ｄ）前記レポーター遺伝子の発現を増大可能な剤を、細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を増大可能な剤と特定する段階とを含む方法を提供する。
【０２３８】
本発明の本形態は、細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を増大可能な剤を特定する方法に関する。このようにして特定された剤は、被験者が虚血性発作（特にラクナー発作）又は小血管閉塞に罹る可能性を低減するために被験者に投与するための化合物候補である。
【０２３９】
本細胞は、−７３５１位にシトシンからチミンへの突然変異を有し且つ好ましいレポーター遺伝子の発現を制御する組織プラスミノーゲン遺伝子座の全部又は一部を形質転換した細胞のいずれかである。
【０２４０】
形質転換できる好ましい細胞の例としては、内皮細胞（例えばＨＵＶＥＣ、ウシ大動脈内皮細胞等）やＨｅＬａ細胞が挙げられる。
【０２４１】
好ましくは、形質転換細胞は内皮細胞である。更に好ましくは、形質転換細胞はヒト内皮細胞である。最も好ましくは、内皮細胞はＨＵＶＥＣである。
【０２４２】
レポーター遺伝子の発現を駆動するｔＰＡ遺伝子座の全部又は一部をコードするＤＮＡは適切なヒトゲノムクローンから誘導することができ、そのクローンは当業界で知られた好ましい方法で製造される。
【０２４３】
例えば、−７３５１位にＣ〜Ｔ突然変異を有するｔＰＡ遺伝子座は、当該ゲノムＤＮＡを制限酵素（例えばＳａｕ ３Ａ１）でＤＮＡを部分消化し、ラムダ若しくはコスミッドベクター（Sambrook J, Fritsch, E. F. and Maniatis, T. Molecular Cloning : A Laboratory Manual ２nd. ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. （１９８９）に記載）へショットガンクローニングすることによりクローニングすることができる。このライブラリーは適切なプローブ（例えばラベルされたオリゴヌクレオチド又はｔＰＡ遺伝子座の上流領域から得たニック翻訳断片）を用いてスクリーンされることにより適切なクローンと単離することができる（Sambrookら、（１９９８）に記載）。
【０２４４】
また、ｔＰＡ遺伝子座の全部又は一部は、ゲノムＤＮＡから適切なプライマーを用いてＰＣＲ増幅により発生させることができる（Dieffenbach, C. W. and G. S. Dveksler （１９９５） PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N. Y.に記載）。
【０２４５】
組織プラスミノーゲン遺伝子座の一部をレポーター遺伝子発現の制御に用いる場合には、ｔＰＡ遺伝子座の一部における内皮細胞において適切な発現を制御する能力が決定される。例えば、組織プラスミノーゲン遺伝子座の一部がトロンビン又はカルシウムイオノホアの処理に応答してレポーター遺伝子の発現を誘起する能力が決定される。
【０２４６】
続いてクローニング領域を含むＤＮＡを標準的なクローニングプロトコールにより適切なレポーター遺伝子に融合させることができる（Sambrook, J, Fritsch, E. F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual ２nd. ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.（１９８９）に記載）。
【０２４７】
好ましいレポーター遺伝子に例としては、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、緑蛍光タンパク質（及びその変異種）及びルシフェラーゼが挙げられる。
【０２４８】
レポーター遺伝子構築物の内皮細胞へのトランスフェクションは、グリセロールショックを含めたリン酸カルシウム沈澱法を含む当業界で知られた好ましい方法により行うことができる（Sambrook, J, Fritsch, E. F. and Maniatis, T. Molecular Cloning : A Laboratory Manual ２nd. ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.（１９８９）に記載）。曝露後の細胞を収穫することができ、レポーター遺伝子活性の相対的変化を定量することができる。
【０２４９】
ｔＰＡ遺伝子座から駆動される発現を誘起するためには、トロンビン又はカルシウムイオノホア等のｔＰＡの放出を誘起することが当業界で知れれた剤を使用することができる。好ましい方法は、Rosnobletら、（１９９９） Arterioscler Thromb Vasc Biol. １９ （７）:１７９６〜８０３に記載されている。
【０２５０】
トランスフェクションの効率は、サイトメガロウイルスプロモーターやｌａｃＺ遺伝子構築物等の適切な制御構築物を細胞にコトランスフェクトさせることにより評価することもできる。続いてβ−ガラクトシダーゼアッセイを、Sambrook, J, Fritsch, E. F. and Maniatis, T. Molecular Cloning : A Laboratory Manual ２nd. ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.（１９８９）に記載されているとおりに行うことができ、トランスフェクション効率の直接的指標を得ることができ、種々の実験においてレポーター遺伝子活性をノーマライズするために用いる。
【０２５１】
続いて、レポーター遺伝子の発現を増大可能な剤の細胞からのｔＰＡ放出速度を増大させる能力を調べる。レポーター遺伝子の発現を増大させる剤の能力は、細胞に作用させる剤の濃度に依存することは理解されよう。従って、剤を好ましい濃度で細胞に作用させて、その濃度におけるレポーター遺伝子の発現を増大させる剤の能力を調べる。
【０２５２】
剤が有する細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を増大させる能力は、当業界で知られた好ましい方法によって確認することができる。例えば、内皮細胞（ｔＰＡ遺伝子座の−７３５１位にＣ〜Ｔ突然変異があっても無くても）からのｔＰＡの放出速度向上剤の能力は、内皮細胞をインビトロで培養し、剤の存在下及び非存在下における内皮細胞からのｔＰＡ放出速度を決定することにより決定することができる。放出速度を決定するには、前記細胞を新鮮な媒体で洗浄し、その媒体へのｔＰＡの放出速度の時間変化の程度を決定する。内皮細胞からのｔＰＡの放出を誘起するためには、当業界において内皮細胞からのｔＰＡの分泌を誘起することが知られているトロンビンやカルシウムイオノホア等の剤を用いることができる。インビトロにおいて内皮細胞からのｔＰＡの放出を誘起する好ましい方法はRosnobletら、（１９９９）Arterioscler Thromb Vasc Biol. １９（７）:１７９６〜８０３に記載されている。
【０２５３】
酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）（例えばＴｉｎｔＥｌｉｚｅ(R)ｔ−ＰＡ、ＢｉｏｐｏｏｌＡＢ）によって全ｔＰＡ抗原を定量することができる。この種のアッセイは二重抗体原理を基礎とする。遊離ｔＰＡとｔＰＡ−インヒビター複合体とは同程度の効率で検出される。
【０２５４】
内皮細胞からのｔＰＡの放出速度向上剤としては、モノナトリウム［２-（６-ヒドロキシナフタレン−２−イル）−６−メチル−ピリジン−４−イルオキシ］アセテートジハイドレート（ＪＴＶ−９２６）（Ueshimaら、（２００２） "Function of tissue-type plasminogen activator releaser on vascular endotherial cells in thrombolysis in vivo" Thrombosis Haemostasis ８７:１０６９〜７４）が知られている。
【０２５５】
本発明はまた、組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を増大させる剤を用いて治療するために好適な被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン遺伝子座の両対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの多型の存在を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【０２５６】
被験者は、男性か女性のヒト被験者のいずれかであり、組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を増大させる剤を用いて治療することが有益であろう被験者である。好ましい被験者はコーカソイド起源のヒトである。
【０２５７】
この点に関し、組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を増大させる剤を用いる治療が役に立つであろう被験者は、虚血性発作又は小血管閉塞にリスクが高い、特にラクナー発作にリスクが高い被験者である。
【０２５８】
好ましくは、治療に好適な被験者は、組織プラスミノーゲン遺伝子座の両対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの多型を有する。
【０２５９】
従って、本発明はまた、好ましい形態において、組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を増大させる剤を用いて治療するために好適な被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン遺伝子座の両対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの多型の存在を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【０２６０】
内皮細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度向上剤の一例は、モノナトリウム［２-（６-ヒドロキシナフタレン−２−イル）−６−メチル−ピリジン−４−イルオキシ］アセテートジハイドレート（ＪＴＶ−９２６）（Ueshimaら、（２００２） "Function of tissue-type plasminogen activator releaser on vascular endotherial cells in thrombolysis in vivo" Thrombosis Haemostasis ８７:１０６９〜７４）である。
【０２６１】
組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の一方若しくは両方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在を前記被験者における特定は、当業界で知られた好ましい方法により行うことができる。
【０２６２】
ＤＮＡは被験者から当業界で知られている好ましい方法によって単離することができる。被験者の静脈全血からゲノムＤＮＡを単離する好ましい方法は、Millerら、（１９８８） Nucleic Acids Research １６（３）:１２１５に記載されている。
【０２６３】
組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の一方若しくは両方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在の特定は、ＤＮＡ塩基配列決定法（マニュアル或いは自動蛍光塩基配列決定）を用いて突然変異を検出することができる。
【０２６４】
ＤＮＡ配列分析を用いて突然変異を特定する場合には、一対立遺伝子に突然変異の存在が見出されるということは（即ち被験者が突然変異についてヘテロ接合性）、ＤＮＡ配列中の関連する位置に二個のヌクレオチド（Ｃ及びＴ）が存在することとなる。正常な対立遺伝子に対してホモ接合性、或いは突然変異に対してホモ接合性である、被験者から取り出したＤＮＡ配列であれば、ＤＮＡ配列中の関連する位置において相当する一ヌクレオチドのみを得ることとなる。
【０２６５】
突然変異の塩基配列決定のための好ましいテンプレートを提供するには、被験者から単離されたゲノムＤＮＡの領域を適切に設計したプライマーを用いて増幅することができる。適切なプライマーとの配列決定反応及びＤＮＡ配列の分析は当業界で知られた好ましい方法によって行うことができる。増幅の好ましい領域は、配列番号１のヌクレオチド１８４０〜２２４５の領域である。
【０２６６】
突然変異の存在は、被験者から単離されたＤＮＡから野生型対立遺伝子又は突然変異を有する対立遺伝子のいずれかのみを増幅する配列特異的プライマーを用いて決定することができる。繰り返すが、ＷＴ及びＳＮＰプライマーでの増幅に好ましいｔＰＡ遺伝子座の領域は、配列番号１のヌクレオチド１８４０〜２２４５の領域である。
【０２６７】
好ましくは、正常−７３５１配列を有するｔＰＡ遺伝子座の領域を増幅するために用いるプライマーは配列番号２（５′−ＡＴＴＧＧＣＧＣＡＡＡＣＴＣＣＴＣＡＣＡ−３′）及び配列番号３（５′−ＡＴＧＧＣＴＧＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＧ−３′）であり、−７３５１Ｃ〜Ｔ多型配列を有するｔＰＡ遺伝子座の領域を増幅するために用いるプライマーは配列番号２（５′−ＡＴＴＧＧＣＧＣＡＡＡＣＴＣＣＴＣＡＣＡ−３′）及び配列番号４（５′−ＡＴＧＧＣＴＧＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＡ−３′）である。これらプライマーでｔＰＡ遺伝子座を増幅するための好ましい反応条件は、ＰＴＣ-２００ペルチエサーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を次のＰＣＲサイクルパラメータで使用することを含む：９６℃で２５秒、７０℃で４５秒及び７２℃で４５秒（５サイクル）；９６℃で２５秒、６５℃で５０秒及び７２℃で４５秒（２１サイクル）；９６℃で２５秒、５５℃で６０秒及び７２℃で１２５秒（４サイクル）。
【０２６８】
増幅生成物は当業界で知られている好ましい方法により検出することができる。例えば、増幅生成物をアガロースゲル上に展開し、エチジウムブロミドで染色し視覚化することができる。
【０２６９】
突然変異の特定は、被験者から単離・誘導した核酸から突然変異を含む領域を増幅することを含むことが好ましい。
【０２７０】
突然変異の特定は、被験者から単離・誘導した核酸をレポーター核酸とハイブリッド形成することにより突然変異を検出することも含むことが好ましい。
【０２７１】
本発明はまた、被験者の小血管閉塞に関連する疾病又は状態の治療方法であって、前記被験者における組織プラスミノーゲン活性化因子放出速度向上剤を前記被験者の治療に有効な量投与する段階を含む方法を提供する。
【０２７２】
被験者は、小血管閉塞に関連する疾病又は状態に罹りやすい若しくは罹患している被験者のいずれかである。
【０２７３】
従って、本発明は他の形態において、小血管閉塞に関連する疾病又は状態に罹りやすい被験者の治療方法であって、前記被験者における組織プラスミノーゲン活性化因子放出速度向上剤を前記被験者の治療に有効な量投与する段階を含む方法を提供する。
【０２７４】
小血管閉塞に関連する疾病又は状態の例としては、ラクナー発作、痴呆、虚血性心疾患（虚血性心筋症含む）、末梢血管疾患、血管内凝固症候群、小血管炎、虚血性神経障害、虚血性網膜症、虚血性胃疾患（小腸大腸虚血含む）、広汎性肺塞栓症及び血管性インポテンスが挙げられる。
【０２７５】
好ましくは、小血管閉塞に関連する疾病又は状態は脳内に発生し、ラクナー発作を含む
【０２７６】
従って、本発明はまた、好ましい形態において、被験者のラクナー発作の治療方法であって、前記被験者における組織プラスミノーゲン活性化因子放出速度向上剤を前記被験者の治療に有効な量投与する段階を含む方法を提供する。
【０２７７】
本発明は他の形態において、ラクナー発作に罹りやすい被験者の治療方法であって、前記被験者における組織プラスミノーゲン活性化因子放出速度向上剤を前記被験者の治療に有効な量投与する段階を含む方法を提供する。
【０２７８】
この剤は、被験者に投与した際にｔＰＡの放出速度を増大可能な剤である。ｔＰＡの放出速度を増大可能な剤の一例は、モノナトリウム［２-（６-ヒドロキシナフタレン−２−イル）−６−メチル−ピリジン−４−イルオキシ］アセテートジハイドレート（ＪＴＶ−９２６）（Ueshimaら、（２００２） "Function of tissue-type plasminogen activator releaser on vascular endotherial cells in thrombolysis in vivo" Thrombosis Haemostasis ８７:１０６９〜７４）である。
【０２７９】
被験者に投与されるべきｔＰＡ放出速度向上剤の有効量は、その剤が一般に薬理的有用性又は治療効果を示す量や形態の範囲内にある限り、特に限定されない。
【０２８０】
これに関し、ｔＰＡ放出速度向上剤の有効量は、被験者内で達成されるべきｔＰＡ放出速度の増加程度、治療されるべき小血管閉塞関連疾病や小血管閉塞関連状態の種類、被験者の年齢及び体重、投与頻度、及びその他活性剤の存在を考慮して、適切に選択されうる。
【０２８１】
ｔＰＡ放出速度向上剤の投与は、被験者のｔＰＡ放出速度向上という点で所望の効果を生じさせるのに適切であれば如何なる時に行っても良く(within any time)、剤は、経口、非経口或いはその他適切な手段により投与される。その際、薬物の移行時間(transit time)を考慮すべきである。
【０２８２】
ｔＰＡ放出速度を向上させる剤の投与においては、投与されるｔＰＡ放出速度向上剤の実際の物理的、化学的特性を考慮し、医薬的に許容される塩、アミノ酸、ポリペプチド、ポリマー類、溶剤、緩衝剤、賦形剤、増量剤等、医薬的に許容される添加剤の一種以上を使用することができる。
【０２８３】
例えば、ｔＰＡ放出速度向上剤は、水性液、油性調製物、脂肪エマルジョン、エマルジョン、ゲル等の各種製薬形態に製剤することができる。これらの製剤は、筋注剤や皮下注射剤、臓器への注射剤、或いは包埋剤の他、鼻腔、直腸、子宮、膣、肺等の経粘膜剤として投与することができる。このような組成物は、経口薬（例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤等の固形製剤、シロップ、乳剤、懸濁剤等の液状製剤）として投与しても良い。ｔＰＡ放出速度向上剤を含有する組成物は、保存剤、或いは安定剤、分散剤、ｐＨ調整剤、等張剤を含有することができる。保存剤としては、グリセリン、プロピレングリコール、フェノール、ベンジルアルコール等が好ましい。安定剤としては、デキストラン、ゼラチン、α−トコフェロール酢酸、或いはα−チオグリセリン等が好ましい。好適な分散剤としては、ポリオキシエチレン（２０）やソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０）、ソルビタンセスキオレエート（Ｓｐａｎ３０）、ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８）、ポリオキシエチレン水添ひまし油６０等が挙げられる。好適なｐＨ調整剤としては、塩酸や水酸化ナトリウム等が挙げられる。好適な等張剤としては、グルコースやＤ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール等が挙げられる。
【０２８４】
ｔＰＡ放出速度向上剤の投与は、ｔＰＡ放出速度向上剤の物理的性質及び化学的性質を考慮し、薬学的に許容される担体や希釈剤、賦形剤、懸濁剤、滑沢剤、補助剤、ビヒクル、送達系、乳化剤、崩壊剤、吸収剤、保存剤、界面活性剤、着色剤、矯臭剤、矯味剤を含有する組成物の形態で行うこともできる。
【０２８５】
上述の目的のため、組成物は経口的或いは非経口的に、非毒性の薬学的に許容される従来の担体を含有する剤形で埋込み型容器（implanted reservoir）を介して吸入スプレー、吸着、吸収、局所的、経直腸的、経鼻的、口腔的、経膣的、経心室的（intraventricularly）に投与することができ、或いは他の都合のよい剤形によって投与することができる。本明細書において非経口的という用語は、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、髄腔内、心室内、胸骨内、頭蓋内での注射或いは注入技法を含む。
【０２８６】
非経口投与の場合、組成物は通常、薬学的に許容される担体と組み合わせ、単位投与量の滅菌注射剤形態（溶液、懸濁液或いはエマルジョン）とされるが、これはレシピエントの血液と等張であることが好ましい。このような滅菌注射剤形態としては、滅菌した注射用水性懸濁液或いは油性懸濁液を挙げることができる。このような懸濁液は、当業界で公知の技法に従い、好適な分散剤或いは湿潤剤、及び懸濁液を用いて調製できる。滅菌注射剤形態はまた、非毒性で非経口的に許容される希釈剤或いは溶媒の滅菌した注射用溶液或いは懸濁液（例えば、１，３−ブタンジオール溶液）であってもよい。使用可能な許容されるビヒクル及び溶媒としては、水や生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、等張塩化ナトリウム溶液、ハンクス溶液を挙げることができる。なお、溶媒や懸濁化媒体としては従来、滅菌した固定油が用いられている。この目的のため、無刺激性の固定油であれば如何なるものでも用いることができ、合成モノグリセリド類や合成ジグリセリド類、コーン油、綿実油、ピーナッツ油、ごま油等を挙げることができる。エチルオレエートやイソプロピルミリステート、オレイン酸とそのグリセリド誘導体（例えば、オリーブオイルやひまし油、特にこれらがポリオキシエチレン化されたもの）等の脂肪酸が注射剤の調製に有用である。これらの油性溶液或いは油性懸濁液はまた、長鎖アルコール希釈剤或いは分散剤を含有していてもよい。
【０２８７】
担体は微量の添加剤を含有していてもよく、このような添加剤としては溶解性や等張性、化学的安定性を向上させる物質（例えば抗酸化剤や緩衝剤、保存剤）等が挙げられる。
【０２８８】
経口投与の場合、従来の装置及び当技術分野において公知の技法を用いて、組成物は通常、錠剤やカシェ剤（cachets）、粉末、顆粒、ビーズ、チュアブルロゼンジ（chewable lozenges）、カプセル、液状、水性懸濁液、水性溶液等の単位投与量の剤形、その他の剤形に調製される。このような形状は通常、固形担体や半固形担体、液状担体を含む。担体の例としては、ラクトースやデキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アラビアゴム、リン酸カルシウム、ミネラルオイル、ココアバター、テオブロマ油（oil of theobroma）、アルギン酸、トラガカント、ゼラチン、シロップ、メチルセルロース、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム等を挙げることができる。
【０２８９】
錠剤は、活性成分を、必要に応じ一以上の補助成分と共に圧縮や成型に付すことにより製造される。圧縮錠剤は、適切な機械を利用して、粉末や顆粒等の自由流動形態にある活性成分を必要に応じ結合剤や潤滑剤、不活性希釈剤、界面活性剤、分散剤等と混合した上で、圧縮することによって調製される。成型錠剤は、適切な機械を利用して、粉状の活性成分と不活性希釈剤液で湿らせた適切な担体との混合物を成型することによって製造される。
【０２９０】
ｔＰＡ放出速度向上剤の投与にあたっては、放出速度制御技術も利用することができる。ｔＰＡ放出速度向上剤は、徐放性医薬として投与することもできる。徐放効果を更に高めるため、本組成物は、植物油（例えば大豆油、ごま油、ツバキ油、ひまし油、ピーナツ油、菜種油）や中鎖脂肪酸トリグリセリド、脂肪酸エステル（エチルオレエートなど）；ポリシロキサン誘導体等の付加的成分と共に、或いはヒアルロン酸やその塩（重量平均分子量：約８０，０００〜２，０００，０００）、カルボキシメチルセルロース−Ｎａ（重量平均分子量：約２０，０００〜４００，０００）、ヒドロキシプロピルセルロース（２％水溶液の粘度：３〜４，０００ｃｐｓ）、アテロコラーゲン（重量平均分子量：約３００，０００）、ポリエチレングリコール（重量平均分子量：約４００〜２０，０００）、ポリエチレンオキサイド（重量平均分子量：約１００，０００〜９，０００，０００）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（１％水溶液の粘度：４〜１００，０００ｃＳｔ）、メチルセルロース（２％水溶液の粘度：１５〜８，０００ｃＳｔ）、ポリビニルアルコール（粘度：２〜１００ｃＳｔ）、ポリビニルピロリドン（重量平均分子量：２５，０００〜１，２００，０００）等の水溶性高分子化合物と共に製剤化することができる。
【０２９１】
あるいは、本ｔＰＡ放出速度向上剤は、幾日かの期間に亘り制御された放出を持続させるため、疎水性のポリマーマトリックスに担持させることもできる。本発明組成物は次いで固形インプラントや外用の貼付剤等、該ｔＰＡ放出速度向上剤の効果発現濃度を、再投与を頻繁に行う必要なしに、長期間に亘って達成するのに適切な形態に成型される。このような制御放出フィルムについては当技術分野で周知である。この目的のために用いることができる広く利用されているポリマーの他の例としては、非分解性エチレン−酢酸ビニル共重合体や分解性乳酸−グリコール酸共重合体が挙げられ、これらは外用や内用に用いることができる。ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）やポリ（ビニルアルコール）等、或る種のヒドロゲルも有用であるが、これらは上に述べたポリマーなど他のポリマー放出系より短い放出サイクルに用いられる。
【０２９２】
担体もまた、適切な時間放出特性と放出動力学を有する、固形の生分解性ポリマーや複数の生分解性ポリマーの混合物とすることができる。組成物は次いで、該ｔＰＡ放出速度向上剤の効果発現濃度を、再投与を頻繁に行う必要なく、長期間に亘って達成するのに適切な固形インプラント形態に成型される。ｔＰＡ放出速度向上剤は、当業者に知られた何らかの適切な方法によって生分解性ポリマーや複数の生分解性ポリマーの混合物に添加することができ、生分解性ポリマーと共に均一なマトリックスを形成させたり、或いは該ポリマー内に何らかの方法で包埋させることができる。また、成型によって固形インプラントとすることもできる。
【０２９３】
以下、上述の本発明の一般原則を具現化する実験について例示する。しかしながら、次の記載は上の記載の一般性を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０２９４】
実施例１
ゲノムＤＮＡの単離
ゲノムＤＮＡは、Miller,S.A.、D.D.Dykes、H.F.Polesky（１９８８）による「ヒト有核細胞からの抽出のための簡単な塩析技法 (A simple salting out procedure for extracting from human nucleated cells)」、Nucleic Acids Research １６（３）：１２１５に記載の手順に従い、静脈全血６ｍＬから単離した。
【０２９５】
実施例２
オリゴヌクレオチドプライマー
２種の対立遺伝子特異的リバースプライマーの配列は次の通りである：
ＳＮＰプライマー：５′−ＡＴＧＧＣＴＧＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＧ−３′（配列番号３）
ＷＴプライマー：５′−ＡＴＧＧＣＴＧＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＡ−３′（配列番号４）
フォワードコンセンサスプライマー：５′−ＡＴＴＧＧＣＧＣＡＡＡＣＴＣＣＴＣＡＣＡ−３′（配列番号２）
【０２９６】
ＤＮＡ配列中の各プライマーの相対位置を図１に示す。これらのプライマーにより、ｔＰＡ遺伝子の４０５塩基対のＤＮＡ増幅フラグメント（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ４８４８４の１８４０〜２２４５のヌクレオチド；配列番号１）が得られる。
【０２９７】
ＨＬＡ−ＤＲＢ３遺伝子の６００ｂｐフラグメントをコードする２種のポジティブ対照プライマーの配列は次の通りである。
フォワード（センス）プライマー：５′−ＴＧＣＣＡＡＧＴＧＧＡＧＣＡＣＣＣＡＡ−３′
リバース（アンチセンス）プライマー：５′−ＧＣＡＴＣＴＴＧＣＴＣＴＧＴＧＣＡＧＡＴ−３′
【０２９８】
オリゴヌクレオチドプライマーはいずれもＧｅｎｅｗｏｒｋｓ Ｐｔｙ Ｌｔｄ．製のものを用いた。各プライマーは、オートクレーブで滅菌した脱イオン水で使用形態に戻し、最終濃度を２０００μｇ／ｍＬとした。
【０２９９】
実施例３
遺伝子型の決定
ｔＰＡ遺伝子の４０５塩基対ＤＮＡフラグメント（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ４８４８４；配列番号１の１８４０〜２２４５のヌクレオチド）は、Bunce,M.、C.M.O′Neill、M.C.Barnardoら（１９９５）による、「フォトタイピング：PCR-SSPを利用して１４４種のプライマーミックス (primer mixes) でPCRを行う、HLA-A,B,C,DRB1,DRB3,DRB4,DRB5とDQB1のための明解DNAタイピング (Phototyping:comprehensive DNA typing for HLA-A,B,C,DRB1,DRB3,DRB4,DRB5&DQB1 by PCR with 144 primer mixes utilizing sequence-specific primers (PCR-SSP))」、Tissue Antigens ４６（５）：ｐ．３５５〜３６７に記載の方法に従って、配列特異的プライマーポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ−ＳＳＰ）を用いて増幅した。
【０３００】
ＰＣＲ−ＳＳＰの特異性は、標的ＤＮＡ配列とプライマーの３′末端ヌクレオチドとのマッチングによる。従ってＰＣＲサイクルにおいては、プライマーとＤＮＡテンプレート（多型ヌクレオチドを含む）とがマッチングした場合のみ、Ｔａｑポリメラーゼによる増幅反応が正常に行われる。この原理を利用して、マッチングする３′末端ヌクレオチドを多型部位に有するようなオリゴヌクレオチドプライマーを特異的に作製できる。安定な非多型領域（ＤＮＡ配列上流或いは下流の約３００〜４００塩基対）と相補的なコンセンサスプライマーによって、一塩基多型（ＳＮＰ）を含むセグメントを増幅できる。所定のＰＣＲ条件下では、標的ＤＮＡセグメントは、対立遺伝子特異的なプライマーとコンセンサスプライマーのいずれもがＤＮＡテンプレートと相補的である場合にのみ増幅される。従って、ｓｎｐの有無については、ゲル電気泳動を行いエチジウムブロマイド添加により発色させてＰＣＲ産物を検出し判定できる。Ｔａｑポリメラーゼがエキソヌクレアーゼ活性を欠き、そのためプライマーの３′末端ヌクレオチドのミスマッチを修正できないことから、ＰＣＲ−ＳＳＰを効果的に利用することができる。
【０３０１】
この方法により、多重ＰＣＲ (PCR multiplexing) を容易に行うことができる。多重ＰＣＲでは、更なる他の２種のプライマー（これらは或る別のＤＮＡ部位に相補的である）を同一反応ミックスに含有させて添加する。この研究においては、ＨＬＡ−ＤＲＢ３遺伝子から６００ｂｐＤＮＡフラグメントを生じさせる２個のオリゴヌクレオチドプライマーを各ＰＣＲ−ＳＳＰ反応で増幅させポジティブ対照として用いて、失敗したＰＣＲ反応をネガティブＰＣＲ反応と弁別できるようにした。このような対照がなければ、ホモ接合性を示す結果（即ち、野生型対立遺伝子におけるネガティブ反応）はいずれも信頼性を欠くものとなろう。本法の別の重要な特徴は、プライマーの設計によって、多数の小ボリュームＰＣＲ反応（各反応は或る対立遺伝子に特異的である）が同一のＰＣＲサイクル条件下で起こるということである。本研究における遺伝子タイピングは、９６ウェルＰＣＲプレートを用いて行った。
【０３０２】
（ｉ）ＳＳＰ−ＰＣＲの試薬
試薬 サプライヤー
硫酸アンモニウム ＢＤＨラボラトリーサプライズ
(BDH Laboratory Supplies）
ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ アプライドバイオシステムズ
（５Ｕ／μＬ） （Applied Biosystems）
クレゾールレッド溶液（１０ｍｇ／ｍＬ） フルカ （Fluka）
ｄｎＴＰ′ｓ（ヌクレオチド） アプライドバイオシステムズ
（Applied Biosystems）
塩化マグネシウム（２５ｍＭ） アプライドバイオシステムズ
（Applied Biosystem）
Ｔｒｉｚｍａ Ｂａｓｅ シグマケミカルズ（Sigma Chemicals）
Ｔｗｅｅｎ２０ ＢＤＨラボラトリーサプライズ
（BDH Laboratory Supplies）
【０３０３】
（ｉｉ）オリゴヌクレオチドプライマーの調製
ＨＬＡ−ＤＲＢ３ポジティブ対照プライマー含有プライマーストック液は次のプロトコルを用いて作製した。
オートクレーブ滅菌した脱イオン水８ｍＬ
クレゾールレッド５０μＬ
ＨＬＡ−ＤＲＢ３フォワードプライマー２０μＬ
ＨＬＡ−ＤＲＢ３リバースプライマー２０μＬ
【０３０４】
クレゾールレッドは、酸性のＤＮＡに接すると色が変わる酸塩基指示薬（ピンク色に変わる）であり、これを用いてＤＮＡのコンタミネーションを視覚的に確認できる。この対照用プライマーストック液を１.５ｍＬエッペンドルフチューブに分注し、対立遺伝子特異的プライマー及びコンセンサスプライマーと合わせ最終体積を１ｍＬとする。
【０３０５】
次に、９６ウェルＰＣＲプレートの各ウェルに各プライマーミックス（５μＬ）を入れた。パラフィン油（１０μＬ）を各ウェルに添加し、ＰＣＲのサーマルサイクルにおけるプライマーと試薬の蒸発が最小限となるようにした。
【０３０６】
ｔＰＡ−７３５１Ｃ／Ｔｓｎｐ用のプライマーミックスは、対立遺伝子特異的プライマー（１０μＬ）、コンセンサスプライマー（１０μＬ）、対照プライマーストック液（９８０ｕｏ）を混合し次のように調製した。
【０３０７】
（ｉｉｉ）試薬ミックス
１０×ＰＣＲバッファー
Ｔｒｉｓ Ｂａｓｅ（４０.５６８ｇ）をオートクレーブした水（４００ｍＬ）に溶解させる。
濃塩酸でｐＨを８.９に調整する。
得られた溶液に硫酸アンモニウム（１０.９６ｇ）を溶解させる。
オートクレーブする。
Ｔｗｅｅｎ２０（５ｍＬ）とオートクレーブした水を添加し５００ｍＬとする。
１０×ｄｎＴＰ
１００ｍＭ ｄＡＴＰ６０μＬ
１００ｍＭ ｄＣＴＰ６０μＬ
１００ｍＭ ｄＴＴＰ６０μＬ
１００ｍＭ ｄＧＴＰ６０μＬ
オートクレーブ処理済み脱イオン水５７６０μＬ
ＴＭＤＨ混合物
１０×ＰＣＲバッファー６ｍＬ
１０×ｄＮＴＰ６ｍＬ
２５ｍＭ 塩化マグネシウム５．１ｍＬ
オートクレーブ処理済み脱イオン水６ｍＬ
【０３０８】
ＰＣＲ溶液は次のプロトコルに従って調製した。
ＴＭＤＨ１００μＬ
オートクレーブ処理済み脱イオン水５７μＬ
ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μＬ）０.８５μＬ
ＤＮＡ（１μｇ／μＬ）３μＬ
【０３０９】
次に、対立遺伝子特異的プライマーを含有する各ウェルにＤＮＡ溶液（８μＬ）を添加した。色の変化（クレゾールレッドによってピンク色に変化）から、ＰＣＲ反応ミックスｓ中のＤＮＡの存在が確認された。
【０３１０】
（ｉｖ）ＰＣＲサーマルサイクル
ＰＣＲは、ＰＴＣ−２００ Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて行った。ＰＣＲサイクルのパラメータは次のようにした。
９６℃で２５秒、７０℃で４５秒、７２℃で４５秒のサイクルを５回；
９６℃で２５秒、６５℃で５０秒、７２℃で４５秒のサイクルを２１回；
９６℃で２５秒、５５℃で６０秒、７２℃で１２５秒のサイクルを４回
【０３１１】
ＳＳＰ−ＰＣＲ産物は、２％アガロースゲル上エチジウムブロマイドを添加し発色させて解析した。高解像度デジタル写真を撮り、遺伝子カウンティングによって遺伝子型を判定した。被験者を代表する３名の増幅産物の例を図２に示す。上方の増幅バンドはＨＬＡ−ＤＢＲ３が増幅されたバンドである。下方の増幅バンドはｔＰＡ対立遺伝子特異的な増幅産物である。図２において、被験者７６はＣＣホモ接合性、被験者７７はＴＴのホモ接合性、被験者７８はＣＴのヘテロ接合性である。
【０３１２】
テストの信頼性を保証するため、遺伝子タイピングはＤＮＡの出所を知らされていない技術者２名によって独立して行った。結果は１００パーセント一致した。
【０３１３】
実施例４
統計学的解析
本研究で得られたデータの統計学的解析はＳｔａｔａの統計ソフトウェアを用いて行った（バージョン７.０、米国、テキサス州、カレッジステーション）。各症例と各対照間のベースライン特性は、カテゴリ変数についてはカイ二乗検定を用い、連続型変数については両側ｔ−検定を用いて解析を行った。ｔＰＡ−７３５１Ｃ／Ｔ遺伝子型と虚血性発作との間の関連の強さについては、オッズ比（ＯＲ）と９５％信頼区間（ＣＩ）を算出し評価した。公知危険因子の相対的な関連の強さについても同様の方法で求めた。二変量カイ二乗解析を用いて、ｔＰＡ−７３５１Ｃ／Ｔ遺伝子型と従来知られている各危険因子との関係について調べた。これにより、無条件のロジスティック回帰モデルに組込まれた重要な交絡変数が同定され、ｔＰＡ−７３５１Ｃ／Ｔ多型に関連する虚血性発作の危険率を決定できた。最後に、虚血性発作サブタイプについて層状とした多変量解析を行った。両側のｐ値については＜０.０５を有意とした。
【０３１４】
実施例５
被験者の選択
南オーストラリア州の州都アデレードにある主要５病院のうちの１施設に急性虚血性発作で入院していた２０１名の患者について、本研究への参加を打診したところ１８２名（９０.５％）の患者が承諾した。このうち１３７名（７５％）は、初めての虚血性発作で受診した患者であった。
【０３１５】
虚血性発作の診断は、世界保健機構（ＷＨＯ）による定義（Ｈａｔｏｎｏ，Ｓ．（１９７６）「多施設発作記録からの経験：予備的報告書 ("Experience from a multicentre stroke register:a preliminary report" Bull WHO 54:541-553)に記載」に準拠し、神経科医が脳コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）或いは磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）を行うことで下された。虚血性発作は、Oxfordshire Community Stroke Project （ＯＣＳＰ）による分類システム（Bamford,J.，P. Sandercock,M.Dennisら、（１９９１）「臨床的に特定可能な脳梗塞のサブタイプの分類と自然史 "Classification and natural history of clinically identifiable subtypes of cerebral infarction"」Ｌａｎｃｅｔ ３３７（８７５６）：１５２１〜１５２６）を用いて次の４カテゴリーにサブタイピングした。即ち、（ａ）全身性前方循環症候群（Total anterior circulation syndrome）；（ｂ）部分前方循環症候群（Partial anterior circulation syndrome）；（ｃ）後方循環症候群（Posterior circulation syndrome）；（ｄ）ラクナー症候群である。発作のサブタイプは、脳ＣＴ或いはＭＲＩの結果を用いて確認した。
【０３１６】
対照グループは、大都市アデレード在住の入院中でない３０１名からなり、脳血管疾患の個人歴のないグループとした。対照は、南オーストラリア州の電子電話帳から無作為抽出により選択し、年齢と性別を患者と合わせた（年齢については５年の年齢差内に収まるように）。
【０３１７】
インフォームドコンセントの後、被験者と面接し人口統計学的(demographic)情報を記録した。高血圧や高コレステロール血症、糖尿病等の脳血管疾患の経歴が報告されている場合や、検査の時点でこれらの各症状についての治療を個々の被験者が受けている場合には、これら疾患の危険因子が存在すると考えた。心電図をとり心房細動の有無を判定した。最近５年以内にシガレット或いはタバコを常用していた被験者を喫煙者とみなした。一親等血縁者の発作歴も記録した。本研究は、North West Adelaide Health Service Ethics Committeeにより承認された。
【０３１８】
実施例６
虚血性発作患者と健常対照の人口統計学的特性及び各危険因子保持率
１８２名の虚血性発作症例と３０１名の対照について、人口統計学的特性及び脳血管疾患危険因子保持率を表１に示した。本研究では症例と対照の年齢及び性別を合わせたため、これら変数（即ち年齢と性別）について２グループ間に差は見られなかった。本研究の母集団の大部分はコーカソイド起源であったため、症例と対照との間の差は統計的有意差に関与しない。調査を行った公知の危険因子のうち、心房細動は、虚血性発作の最高危険率と関連付けられ、虚血性発作症例での２３％に対し、対照で有した者は３％であった（ＯＲ８.５、９５％ＣＩ ４.１〜１７.４）。最近５年間の喫煙歴（ＯＲ３.１、９５％ＣＩ １.９〜５.２）と糖尿病（ＯＲ２.７、１.６〜４.４）についても、虚血性発作と有意な関連性が見られた。高血圧保持率は対照よりも症例において高かったが、統計的に有意な差ではなかった。一親等血縁者の発作歴或いは高コレステロール血症と虚血性発作との関連性は見られなかった（表１）。
【０３１９】
【表１】
【０３２０】
実施例７
虚血性発作患者と健常対照におけるｔＰＡ−７３５１多型の保持率
静脈血サンプリング前に２名の患者が死去したため、これらの症例については遺伝的解析（実施例３に記載）を実施できなかった。
【０３２１】
表２は、残りの１８０名の虚血性発作の症例と３０１名の対照におけるｔＰＡ−７３５１Ｃ／Ｔ多型（図１に示す）の保持率を示す。対照グループのうち４６％がＣ対立遺伝子（ＣＣ）のホモ接合性であり、４５％がヘテロ接合性（ＣＴ）、９％がＴ対立遺伝子のホモ接合性（ＴＴ）であった。虚血性発作の集団において各遺伝子型の分布は、４１％（ＣＣ）、４６％（ＣＴ）、１３％（ＴＴ）であった。ＣＴとＴＴ遺伝子型の保持率は、発作症例で対照より高い値を示したが、単変量解析において統計的に有意ではなかった。公知危険因子について調整を行い、ＴＴ遺伝子型が虚血性発作の有意且つ独立した予測因子であることが判明した（ＯＲ１.９、９５％ＣＩ １.０１〜３.６、ｐ＜０.０５）。
【０３２２】
【表２】
【０３２３】
実施例８
発作のサブタイプについて層別化した患者と対照におけるｔＰＡ−７３５１Ｃ／Ｔ遺伝子型の分布
発作のサブタイプについて層別化した患者と対照におけるｔＰＡ−７３５１Ｃ／Ｔ遺伝子型の分布を表３に示す。虚血性発作の患者のうち４４名（２４.５％）がラクナー発作に分類された。このサブグループにおいては、ＴＴホモ接合性状態が単変量解析でラクナー発作と有意に関連していた（ＯＲ２.６、９５％ＣＩ １.１〜６.４、ｐ＜０.０５）。無条件のロジスティック回帰モデルを用いて公知の危険因子の調整を行った後も得られた結果の有意性は変わらなかった（表３）。ＣＴ遺伝子型はラクナー発作との統計的に有意な関連性を示さなかったが、Ｔ対立遺伝子と発作リスクとの保持に関し用量依存的効果が見られた（ＣＣ ＯＲ１.０、ＣＴ ＯＲ１.１、ＴＴ ＯＲ２.７）。これに対して、ｔＰＡ−７３５１Ｃ／Ｔ遺伝子型と非ラクナー発作の危険率との間に関連性は見られなかった。
【０３２４】
【表３】
【０３２５】
実施例９
細胞培養
（ｉ）ウシ大動脈内皮細胞
ウシ大動脈内皮細胞は、ウシ胸部大動脈の内膜表面をそっと掻き取って採取し、これを培養フラスコ中、１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ユタ州ローガン）、５μｇ／ｍＬデオキシシチジン、５μｇ／ｍＬチミジン、１％ペニシリン−ストレプトマイシン及びファンギゾンを含有するダルベッコ変法イーグル培地Ｆ１２を用いて維持できる。内皮細胞は、加湿された５％ＣＯ2インキュベーター中３７℃で増殖させ２〜１０代継代したものを使用できる。内皮細胞は、特徴的な形態をとることから確認可能であり、また１，１−ジオクタデシル−１−３，３，３′，３′−テトラメチルインドカルボシアニン（ジ−Ｉ）−アセチル化低密度リポプロテイン（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、マサチューセッツ州ストートン）でポジティブ染色しても確認できる。内皮細胞は、Ｉ型コラーゲンをコートした培養プレートでコンフルエントになるまで増殖させることができる。
【０３２６】
（ｉｉ）ＨＵＶＥＣ
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、Jaffeら、（１９７３） J. Clin. Invest.５２：２７４５〜２７５６に記載の方法により単離し、Van Hinsberghら、（１９８７）Arteriosclerosis ７；３８９〜４００の記載に従って培養できる。
【０３２７】
ＨＵＶＥＣは、フィブロネクチンをコートしたディッシュを用いて、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）（２０ｍＭ）、新生仔ウシ血清（非働化処理済み；１０％（ｖ／ｖ））、ヒト血清（１０％（ｖ／ｖ））、ヘパリン（５ＩＵ／ｍＬ）、内皮細胞増殖添加物（１５０μｇ／ｍＬ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させることができる。
【０３２８】
（ｉｉｉ）ＨｅＬａ細胞
ＨｅＬａ細胞は、ＨＥＰＥＳ（２０ｍＭ）、ウシ胎児血清（非働化処理済み；８％（ｖ／ｖ））、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を添加したＤＭＥＭ中で増殖させることができる。
【０３２９】
各種細胞はいずれも、５％ＣＯ2／９５％空気雰囲気下３７℃で増殖させ、培地は２〜３日毎に交換する。トリプシン／エチレンジニトリロ四酢酸二ナトリウム塩二水和物（ＥＤＴＡ）で処理し、ＨＵＶＥＣとウシ大動脈内皮細胞ではスプリット比１：３で、ＨｅＬａ細胞ではスプリット比１：１０で継代培養する。内皮細胞は最大でも３継代とする。
【０３３０】
実験を行うにあたっては、実験日の前日に、コンフルエントな培養物からインキュベーション用培地（即ち、ＨＵＶＥＣでは、ヒト血清（１０％）、Ｌ−グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ；ＨｅＬａ細胞では：Ｌ−グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ）に再度細胞をまき直して行う。
【０３３１】
実施例１０
内皮細胞からのｔＰＡ放出の誘導
クレブスリンガー重炭酸塩バッファー（ＫＲＢＨ、１２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣＩ、４.７５ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ、１.２ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＨ2ＰＯ4、０.６ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＳ０4、１.２ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ2、２５ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＨＣＯ3、２５ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７.４）／ＢＳＡ０.１％、ｐＨ７.４を用いて、２４ウェルプレート中に増殖させたＨＵＶＥＣを３回洗浄し、ＫＲＢＨ／ＢＳＡ（１ｍＬ）に３０分間プレインキュベートさせ、次いで各０.５ｍＬの新鮮なＫＲＢＨ/ＢＳＡのみ、ヒトトロンビン（シグマ社）１ＮＩＨ Ｕ／ｍＬ含有ＫＲＢＨ/ＢＳＡ、カルシウムイオノホアＡ２３１８７（シグマ社）２μｍｏｌ／Ｌ含有ＫＲＢＨ/ＢＳＡを用いて再度３０分間インキュベートを行う。細胞上清を遠心し、ｔ−ＰＡ濃度測定まで−２０℃で保存する。
【０３３２】
実施例１１
内皮細胞に対するｔＰＡ上流領域のトランスフェクション
野生型配列（−７３５１Ｃ）或いは多型性配列（−７３５１Ｔ）のいずれかを有するｔＰＡ遺伝子座の全上流領域（＋３０８まで）は、好適なヒトゲノムクローンから得るか、或いはゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅により得ることができる。
【０３３３】
得られたＤＮＡは次いで、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）レポーター遺伝子とつなぎ合わせることができる。ｔＰＡプロモーター−ＣＡＴ遺伝子構築物の内皮細胞へのトランスフェクションは、Sambrook,J、Fritsch,E.F.、Maniatis,T.によるMolecular Cloning：A′Laboratory Manual 2nd.ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York.（１９８９）の記載に従い、リン酸カルシウム沈澱法（グリセロールショックを含む）を用いて行うことができる。２４時間後、プレートのコラーゲンコーティングを施したウェルにトランスフェクトされた細胞をまき、一晩インキュベートする。ｔＰＡ放出誘導剤（トロンビン、カルシウムイオノホア等）に接触させた後、細胞を回収し、Sambrook,J、Fritsch,E.F.、Maniatis,T.によるMolecular Cloning：A Laboratory Manual 2nd.ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York．（１９８９）の記載に従い、薄層クロマトグラフィーと液体シンチレーションカウンティングによって［14Ｃ］クロラムフェニコールのアセチル化産物への転換率を測定して、ＣＡＴ活性の相対変化を定量する。
【０３３４】
トランスフェクション効率は、サイトメガロウィルスプロモーターとｌａｃＺ遺伝子構築物を内皮細胞にコトランスフェクトさせることにより評価できる。β−ガラクトシダーゼアッセイは、Sambrook,Ｊ、Fritsch,E.F.、Maniatis,T.によるMolecular Cloning：A Laboratory Manual 2nd.ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York.（１９８９）の記載に従って行い、トランスフェクション効率の直接的指標を得ることができ、これを各種実験におけるＣＡＴ活性の標準化に用いる。
【０３３５】
実施例１２
インビトロにおけるｔＰＡ放出速度の測定
ヒト臍帯静脈内皮細胞或いはウシ大動脈内皮細胞の培養物を、上述のようにコンフルエントに達するまで増殖させた。
【０３３６】
内皮細胞からのｔＰＡ放出速度の測定にあたり、培地を交換しｔＰＡ放出を誘導（トロンビンやカルシウムイオノホアを添加する等）して、培地中のｔＰＡ濃度を経時的にモニターするため全ｔＰＡ量の定量を酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）（ＴｉｎｔＥｌｉｚｅ(R)ｔ−ＰＡ、Ｂｉｏｐｏｏｌ ＡＢ等）を用いて行った。このアッセイは、二重抗体の原理に基づく。
【０３３７】
ｔＰＡ放出速度を求めるため、培地中のｔＰＡの経時的な相対的増加量を算出した。
【０３３８】
実施例１３
ｔＰＡ放出速度を増大させる候補剤の試験
実施例９で述べたヒト臍帯静脈内皮細胞から、（ｉ）ｔＰＡ遺伝子座における正常な配列、（ｉｉ）−７３５１がＣからＴへ突然変異した１本の対立遺伝子、或いは（ｉｉｉ）−７３５１がＣからＴへ突然変異した２本の対立遺伝子を有するヒト内皮細胞を得ることができる。遺伝子型解析によりＨＵＶＥＣをスクリーニングし、正常ｔＰＡ配列のホモ接合性細胞、−７３５１がＣからＴへ突然変異したヘテロ接合性細胞、或いはＣからＴへ突然変異したホモ接合性細胞の同定を行う。
【０３３９】
次いで、内皮細胞は候補化合物存在下、ｔＰＡ放出を誘起するまで１、２、４、８、１２、１８、２４時間の各時間培養する。試験のため、候補化合物の好適濃度を選択する。対照としてこれら化合物の非存在下における内皮細胞からのｔＰＡ放出の程度、そしてモノナトリウム［２−（６−ヒドロキシナフタレン−２−イル）−６−メチル−ピリミジン−４−イルオキシ］アセテートジハイドレート（ＪＴＶ−９２６）存在下における内皮細胞からのｔＰＡ放出の程度について試験を行う。ＪＴＶ−９２６は、内皮細胞からのｔＰＡ放出速度向上剤として知られている（Ueshimaら、（２００２）「生体内血栓溶解における組織型プラスミノーゲンアクチベータ放出剤の血管内皮細胞に対する機能 "Function of tissue-type plasminogen activator releaser on vascular endothelial cells in thrombolysis in vivo"」Thrombosis Haemostasis ８７：１０６９〜７４に記載）。
【０３４０】
実施例１４
インビボにおけるｔＰＡ放出速度の測定
ｔ−ＰＡ放出についての前腕部におけるインビボ実験は、健常者において、Jernら、（１９９９）Afferioscler.Jhromb Vasc.Biol.１９（２）：４５４〜４５９の記載に従って行うことができる。実験は一晩絶食後に行う。
【０３４１】
動脈用ポリエチレン製カテーテル（Ｖｉｇｇｏ製、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｖｉｇｇｏ）は、Ｓｅｌｄｉｎｇｅｒの技法を用い、経皮的に利き腕でない方の上腕動脈から近位方向に１０ｃｍ挿入する。留置カニューラ（Ｖｅｎｆｌｏｎ等、Ｖｉｇｇｏ）は、同じ腕の肘前静脈深くに逆向きに導入することにより、筋肉の血管床から静脈血をサンプリングできる。
【０３４２】
動脈内血圧は、電気式トランスデューサ（ＥＭＴ ３５等、Ｓｉｅｍｅｎｓ−Ｅｌｅｍａ）やミンゴグラフ（Mingograph）８２（例えば、Ｓｉｅｍｅｎｓ−Ｅｌｅｍａ）により連続的に記録できる。平均動脈圧は、圧力信号の電気的減衰によって得ることができる。また、心電図（ＥＣＧ）をミンゴグラフ上に連続的にモニターできる。水銀入りゴム袋型の歪ゲージを備えた静脈閉塞プレチスモグラフィーによってＦＢＦを評価できる。ＦＢＦ（ｍＬ×ｍｉｎ-1×Ｌ-1組織）は、各血液サンプリングの後、それらについての記録データから算出することができる。
【０３４３】
カテーテルを導入し各記録装置適用後、血液サンプルは１０分間隔をおいて２回採取する。血液サンプリングは、厳密に制御され標準化された手順で行い、交感神経副腎の活性化を避ける必要がある。
【０３４４】
動脈血及び静脈血の各サンプルは、カテーテルから二人で同時採取することができる。血液の最初の３〜４ｍＬは廃棄する。各血液サンプルは、１：１０で０.４５ｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ４.３（Ｓｔａｂｉｌｙｔｅ等、Ｂｉｏｐｏｏｌ ＡＢ）を含有するチューブに回収される。各血液サンプリングの後、ヘパリン（５ＩＵ／ｍＬ）添加生理食塩水でカテーテルをフラッシュ洗浄する。チューブは氷冷下に維持し、６０分以内に遠心分離（４℃、２０００ｇ、２０分間）を行って血漿を単離する。血漿は分割量に分け−７０℃で直ちに凍結保存する。
【０３４５】
全ｔ−ＰＡ抗原の定量的測定には、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用することができる（例えば、ＴｉｎｔＥｌｉｚｅ(R)ｔ−ＰＡ、Ｂｉｏｐｏｏｌ ＡＢ）。このアッセイは二重抗体の原理に基づく。遊離ｔ−ＰＡとｔ−ＰＡ−インヒビター複合体は同程度の効率で検出される。活性遊離ｔ−ＰＡ画分（ｔ−ＰＡ活性）は、バイオイムノアッセイにより測定できる（例えば、Ｃｈｒｏｍｏｌｉｚｅ（ＴＭ）ｔ−ＰＡ、Ｂｉｏｐｏｏｌ ＡＢ）。活性ｔ−ＰＡは、６００ＩＵ／μｇの特異的活性を用いてμｇ／Ｌ単位で表される。１個人から採取した全サンプルは、同一のマイクロテストプレートに２連にしてアッセイを行う。
【０３４６】
ヘマトクリットは、マイクロヘマトクリット遠心機（例えば、Ｈｅｔｔｉｃｈ Ｈｅｍａｔｏｋｒｉｔ、Ｈｅｔｔｉｃｈ Ｚｅｎｔｒｉｆｕｇｅｎ）を用いて、動脈血から２連で測定する。
【０３４７】
全ｔ−ＰＡの正味の放出速度は、次のようにして測定する：各個人の静動脈濃度勾配（ＡＶ勾配）は、同時採取した静脈血と動脈血における血漿中全ｔ−ＰＡ値を減算することにより算出できる。差が正の場合は正味の放出を、負の場合は正味の取込みを示す。個々の前腕部の血漿フローはＦＢＦから計算され、動脈血ヘマトクリットはトラップ血漿を１％として補正する。個々の正味放出速度或いは取込み速度は、ＡＶ勾配×血漿フロー／単位時間・Ｌ（前腕組織）で算出される。次の式を使用する。
ＦＰＦ＝ＦＢＦ×（［１０１−ヘマトクリット］／１００）
正味の放出＝（ＣV−ＣA）×ＦＰＦ
（式中、ＣVは静脈血中の血漿濃度を示し、ＣAは動脈血中の濃度を示す）
【０３４８】
前腕部における活性型ｔ−ＰＡの正味の増加は、全ｔ−ＰＡの正味の放出について用いた式で計算できる。しかしながら活性型ｔ−ＰＡについては、局所における正味フラックスは、組織における放出／取込みを反映するだけでなく、前腕部血管床を通過する際に起こり得る、複合体結合ｔ−ＰＡ画分と遊離ｔ−ＰＡ画分との間のシフトを反映するということも考えられる。この点を考慮して、活性型ｔ−ＰＡについて「正味の増加」という用語を「正味の放出」の代わりに使用する。
【０３４９】
最後に、当業者であれば、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、上述した本発明方法及び本発明組成物に対する種々の変更や変形を容易に想到できることが理解されるであろう。好ましい特定の実施形態と関連させて本発明を説明してきたが、特許請求に係る本発明は、それら特定の実施形態に不当に限定されるべきではないと理解されたい。実際、本発明を実施するための上掲の各種態様に対してなされ得る、血管生物学、分子生物学或いはその他関連分野における当業者にとって明白な種々の変更は、本発明の範囲内にあるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０３５０】
【図１】−７３５１Ｃ／Ｔ多型近傍の組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の上流領域のヌクレオチド配列を示す。ヌクレオチド配列の各座標はＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ４８４８４に基づいている。ヌクレオチド２２２８にあるＣ／Ｔ多型に位置を太字で示す。コンセンサスプライマー（配列番号２；ヌクレオチド１８４０〜１８６０）、ＷＴプライマー（配列番号３；ヌクレオチド２２４５〜２２２８）及びＳＮＰプライマー（配列番号４；ヌクレオチド２２４５〜２２２８）の各位置も示す。
【図２】異なるｔＰＡ遺伝子型を有する３被験者の増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行った結果を示す。（被験者７６，７７，７８のＴＰＡ−７３５１遺伝子型−ＡＧＳＳである。遺伝子型は左からＣＣ，ＴＴ，ＴＣである。上方のバンドは対照バンドを示し、下方のバンドは対立遺伝子特異的バンドを示す。）
【技術分野】
【０００１】
本発明は虚血性発作の素因を有する被験者を特定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
虚血は、酸素の供給と需要の間のアンバランスによって組織や器官への酸素供給が不十分になる場合に起こる。虚血は、血管内に血塊（血栓）が形成されることによって血管における血流が滞ることにより起こることが多い。
【０００３】
虚血性発作においては、脳血管の一部に閉塞性血栓が形成される。虚血性発作は血栓又は塞栓に起因する発作である。血栓性の発作においては、アテローム性動脈硬化症により既に狭窄した血管内に血塊が発達する。塞栓性の発作においては、血塊が身体の至るところに形成され、更に循環系を介して脳に運ばれる。
【０００４】
ラクナー発作は、脳内の小動脈の閉塞に起因する発作であり、元来は血栓性又は塞栓性の発作である。ラクナー発作は場合によってはアテローム性動脈硬化症以外の原因、例えばリポヒアリン症によっても起こり得る。
【０００５】
血管における血塊形成の可能性は、血塊を形成する方向に向かう凝固カスケードと血塊を溶解させる方向に向かうフィブリン溶解系とのバランスによって決定される。凝固カスケードもフィブリン溶解系も共にタンパク質分解の複合カスケードを伴う。凝固カスケードの最終エフェクター分子はセリンプロテアーゼトロンビンであり、これはフィブリノーゲンを開裂してフィブリン血塊を生じさせる。フィブリン溶解系の最終エフェクター分子はセリンプロテイナーゼプラスミンであり、これはフィブリンを可溶性分解物に開裂する。
【０００６】
組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）はフィブリン溶解系において非常に重要な役割を果たす。ｔＰＡは、不活性な前駆体であるプラスミノーゲンを活性なプロテイナーゼプラスミンへ転化する際の触媒となる。然るに、ｔＰＡは血栓症を予防する血管内のフィブリン溶解の主たるメディエーターである。内皮細胞によるｔＰＡの分泌は二種の機構によって制御される。即ち（ａ）血管損傷により数秒から数分の間に沈澱する局所ｔＰＡの急激な放出及び（ｂ）フィブリン溶解系の慢性的活性化によって決定され且つｔＰＡ血漿循環レベルの変化に関与する長期間基礎分泌速度である。循環ｔＰＡ活性は、プラスミノーゲン活性化因子インヒビター１との不可逆複合体の形成によっても低下する。静脈閉塞、運動、血管活性物質の注射等の種々の刺激は、ｔＰＡの放出を刺激することにより血漿ｔＰＡレベルを急激に上昇させることが知られている。
【０００７】
フィブリン溶解系の活性化は、必ずしも虚血性発作罹患の可能性を低減することと相関するわけではない。実際、発作イベントから数年先行して、フィブリン溶解防御系の長期に亘る活性化がみられる場合もある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
現在、閉塞性血栓症に伴う疾病や状態の発現において遺伝因子が果たす重要性に関する情報、特に虚血性発作に役割を果たす遺伝因子に関する情報は非常に少ない。よって、閉塞性血栓症に罹患しやすい可能性のある被験者を特定する方法（虚血性発作に罹患しやすい被験者を特定する方法を含む）が必要である。
【０００９】
本発明は、虚血性発作の素因を有する被験者を特定する方法に関し、組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を低下させる突然変異を前記被験者において特定することによる方法に関する。特に本発明は、ｔＰＡ遺伝子の上流領域における特定の多型の存在が虚血性発作に関連することを特定することに関する。この多型は、ｔＰＡ放出速度の低下に関連する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本明細書全体を通し、本発明の様々なアスペクトを記述する目的で種々の文献を引用する。しかしながら、該文献の如何なるものについても、本発明に対する先行技術であることを本発明者らは自認するものではない。特に、本明細書に掲載されている如何なる文献への言及も、オーストラリア及び他のいずれかの国で、その内容が本技術分野における共通一般知識を構成するものであると自認することを意味するものではない。各文献についての記載は、該当文献の著者が述べていることであり、本出願人は、ここに引用する如何なる文献についても、その正確性や本発明との関連性について糾す権利を留保するものである。
【００１１】
本発明は、虚血性発作の素因を有する被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を低下させる突然変異を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【００１２】
本発明は、小血管閉塞の素因を有する被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を低下させる突然変異を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【００１３】
本発明はまた、小血管閉塞に関連する疾病又は状態の素因を有する被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を低下させる突然変異を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【００１４】
本発明はまた、虚血性発作の予防及び／又は治療を行うために好適な被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を低下させる突然変異を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【００１５】
本発明はまた、小血管閉塞又は小血管閉塞に関連する疾病又は状態の予防及び／又は治療を行うために好適な被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を低下させる突然変異を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【００１６】
本発明はまた、被験者の小血管閉塞に関連する疾病又は状態の治療方法であって、前記被験者における組織プラスミノーゲン活性化因子放出速度向上剤を前記被験者の治療に有効な量投与する段階を含む方法を提供する。
【００１７】
本発明はまた、細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を増大可能な剤を特定する方法であって、前記方法は（ａ）細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を低下させる突然変異を含む細胞に剤を作用させる段階と、（ｂ）前記剤を作用させた細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を測定する段階と（ｃ）前記剤を、細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を増大可能な剤と特定する段階とを含む方法を提供する。
【００１８】
本発明は、虚血性発作の素因を有する被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の両対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在を前記被験者において特定する段階を含む方法を更に提供する。
【００１９】
本発明はまた、小血管閉塞又は小血管閉塞に関連する疾病又は状態の素因を有する被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の両対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在を前記被験者において特定する段階を含む方法を更に提供する。
【００２０】
本発明はまた、虚血性発作の予防及び／又は治療を行うために好適な被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の両対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【００２１】
本発明はまた、小血管閉塞又は小血管閉塞に関連する疾病又は状態の予防及び／又は治療を行うために好適な被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の両対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【００２２】
本発明はまた、組織プラスミノーゲン活性化因子放出速度向上剤により治療するために好適な被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の両対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【００２３】
本発明はまた、被験者における虚血性発作のリスクを決定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の一方若しくは両方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在を前記被験者において決定する段階を含む方法を提供する。
【００２４】
本発明はまた、被験者における小血管閉塞のリスク又被験者における小血管閉塞に関連する疾病又は状態の進行のリスクを決定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の一方若しくは両方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在を前記被験者において決定する段階を含む方法を提供する。
【００２５】
本発明はまた、細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を変化可能な剤を特定する方法であって、前記方法は、（ａ）組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の一方若しくは両方の対立遺伝子における−７３５１位にシトシンチミン多型を含む細胞に剤を作用させる段階と、（ｂ）前記剤を作用させた細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を測定する段階と（ｃ）前記剤を、細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を変化可能な剤と特定する段階とを含む方法を更に提供する。
【００２６】
本発明は、細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を増大可能な剤を特定する方法であって、前記方法は、（ａ）組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の全部又は一部を形質転換した細胞であって、前記形質転換した遺伝子座は−７３５１位にシトシンからチミンへの突然変異を含み且つ前記形質転換した遺伝子座はレポーター遺伝子の発現を制御する細胞に剤を作用させる段階と、（ｂ）前記剤を作用させた細胞におけるレポーター遺伝子の発現レベルを決定する段階と、（ｃ）前記レポーター遺伝子の発現を増大可能な剤を特定する段階と、（ｄ）前記レポーター遺伝子の発現を増大可能な剤を、細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を増大可能な剤と特定する段階とを含む方法を更に提供する。
【００２７】
本発明はまた、配列番号３に記載の配列からなる単離された核酸又はそのＲＮＡ等価物を提供する。
【００２８】
本発明はまた、配列番号３に記載の配列中に一以上の塩基置換を有する単離された核酸であって、前記核酸はストリンジェントなハイブリッド形成条件下で配列番号３の相補配列とハイブリッド化する核酸を提供する。前記ストリンジェントなハイブリッド形成条件は４２℃における６ｘＳＳＣのハイブリッド形成及び２０℃における２ｘＳＳＣの洗浄を含む。
【００２９】
本発明はまた、配列番号４に記載の配列からなる単離された核酸又はそのＲＮＡ等価物を提供する。
【００３０】
本発明はまた、配列番号４に記載の配列中に一以上の塩基置換を有する単離された核酸であって、前記核酸はストリンジェントなハイブリッド形成条件下で配列番号４の相補配列とハイブリッド化する核酸を提供する。前記ストリンジェントなハイブリッド形成条件は４２℃における６ｘＳＳＣのハイブリッド形成及び２０℃における２ｘＳＳＣの洗浄を含む。
【００３１】
本発明はまた、配列番号３に記載の配列中に一以上の塩基置換を有する単離された核酸であって、前記核酸は配列番号３と８０％以上の相同性を有する核酸又はそのＲＮＡ等価物を提供する。
【００３２】
本発明はまた、配列番号４に記載の配列中に一以上の塩基置換を有する単離された核酸であって、前記核酸は配列番号４と８０％以上の相同性を有する核酸又はそのＲＮＡ等価物を提供する。
【００３３】
本発明はまた、配列番号１のヌクレオチド１８４０〜２２４５の配列を含む、単離された核酸を提供する。
【００３４】
本発明はまた、虚血性発作の素因を有する被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子の低減された放出速度を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【００３５】
本発明はまた、小血管閉塞の素因を有する被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子の低減された放出速度を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【００３６】
本発明はまた、小血管閉塞に関連する疾病又は状態の素因を有する被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子の低減された放出速度を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【００３７】
本発明はまた、虚血性発作の予防及び／又は治療を行うために好適な被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子の低減された放出速度を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【００３８】
本発明はまた、小血管閉塞又は小血管閉塞に関連する疾病又は状態の予防及び／又は治療を行うために好適な被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子の低減された放出速度を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【００３９】
本発明はヒト虚血性発作の素因の研究に基づく。特に、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子のエンハンサーにおける突然変異が虚血性発作の非依存的予知インディケーターであることを見出した。この知見から、個々の被験者におけるプラスミノーゲン活性化因子の低減された放出速度が虚血性発作の非依存的予知インディケーターであることがわかる。
【００４０】
本明細書全体に用いられる各用語の意味は、当業者には容易に理解されよう。しかしながら、参照を容易とする観点からこれらの用語の内の一部について次のように定義する。
【００４１】
本明細書において用いられる「ｔＰＡ遺伝子座」とは、ｔＰＡ遺伝子をコードする領域に関連するＤＮＡのいずれか、ｔＰＡのｍＲＮＡの未翻訳領域をコードするＤＮＡのいずれか、ｔＰＡのプレ−ｍＲＮＡ（例えばイントロン配列）コードするＤＮＡのいずれか、ｔＰＡ発現の制御に関連するＤＮＡのいずれか（例えばプロモーターエレメント、エンハンサーエレメント（近接又は遠隔）、レギュレーター因子の結合サイト（例えばＳＰ１結合サイト）、ｔＰＡ遺伝子座の発現に役割を果たす他のＤＮＡのいずれか（例えば異質染色性ＤＮＡ）等を意味すると理解されたい。
【００４２】
本明細書において虚血性発作又は小血管閉塞に関連して用いられる「素因」とは、虚血性発作又は小血管閉塞を伴うための他のリスク因子（例えば心房細動、喫煙歴等）が被験者間で同程度という条件下で、突然変異を有する被験者が虚血性発作又は小血管閉塞に罹患する可能性が、突然変異を有さない他の被験者が虚血性発作又は小血管閉塞に罹患する可能性に比べて増大することを意味すると理解されたい。
【００４３】
本明細書において用いられる「突然変異」は、正常なＤＮＡ配列のいかなる変化をも意味すると理解されたい。突然変異はまた、多型的であることも理解されよう。突然変異のタイプの例としては、挿入、欠失、フレームシフト、塩基置換等が挙げられる。
【００４４】
本明細書において用いられる「小血管閉塞」とは、直径８００μｍ未満のいずれの血管の血栓による閉塞をも意味すると理解されたい。前毛細血管小動脈、毛細血管及び後毛細血管静脈はこの定義に含まれる。脳内において小血管閉塞は臨床的には、ラクナー発作や、視床部梗塞、白質髄管梗塞、汎発性皮質下ロイコアリオーシス（leukoariosis）を呈する。この内、後者の病理学的現象は、血管性痴呆の潜在的要因となる。
【００４５】
本明細書において用いられる「多型」とは、個体間におけるＤＮＡ配列の差異を意味すると理解されたい。
【００４６】
本明細書において用いられる「増幅又は増幅する（又はそれらの変形表現）」とは、核酸配列の付加的コピーの製造を意味すると理解されたい。例えば、増幅はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法により行うことができる（Dieffenbach, C. W. and G. S. Dveksler （１９９５） PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N. Y.に記載 ）。或いは環状テンプレート上におけるローリングサークル増幅（例えばFire, A. and Xu, S-Q.（１９９５） Proc. Natl. Acad. Sci ９２:４６４１〜４６４５に記載）等の他の増幅方法により行うことができる。
【００４７】
本明細書において用いられる「核酸」とは、一本鎖又は二本鎖のデオキシリボヌクレオチド類又はリボヌクレオチド類からなるポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドのいずれかを意味すると理解されたい。
【００４８】
この点に関し、核酸は塩基部、糖部、リン酸骨格において修飾されていてもよく、核酸の機能発現を促進するための他の基が添加されていてもよい。
【００４９】
例えば、核酸は次の群から選択される少なくとも一種の修飾塩基部分を含むことができる：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンチルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン，２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルケオシン、５′−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ウイブトキシン、プソイドウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ及び２，６−ジアミノプリン。
【００５０】
核酸は、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシロース及びヘキソースからなる群から選択される少なくとも一種の糖部分を有していてもよいが、これらに限定されない。更に核酸は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミドチオエート、ホスホロアミデート、ホスホロジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル及びホルムアセタール又はその類似体等の少なくとも一種のホスフェート骨格を含んでいてもよい。
【００５１】
本明細書において用いられる「単離された核酸」とは、元来核酸を伴う他の細胞成分から実質的に単離された核酸を意味すると理解されたい。本用語は、自然環境から取り出した核酸配列を含み、天然、クローン化又は組み替えＤＮＡ類、化学合成による核酸類（例えば化学合成オリゴヌクレオチド、ヘテロロガス系により生物学的に合成されたＤＮＡ又はＲＮＡ及び他の形態のポリヌクレオチド類似体のいずれか）を含む。
【００５２】
本明細書において用いられる「ハイブリッド化又はハイブリッド形成（又はそれらの変形表現）」は、それによって核酸の鎖が塩基ペアリングによって相補鎖に結合する過程のいずれかを意味すると理解されたい。ハイブリッド形成は溶液中で行われてもよく、或いは溶液中に存在する一核酸配列と固体支持体（例えば膜、フィルター、チップ等）に固定された他の核酸配列との間で行われてもよい。
【００５３】
本明細書において用いられる「ストリンジェントな条件」とは、Ｔｍ（Ｔｍ：融点）付近からＴｍより約２０℃低い範囲において相補的な核酸がお互いに結合しあうことを許容する条件を意味すると理解されたい。相補領域の長さ、核酸類（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成物）の種類及び組成、塩類及び他の成分の濃度（例えばホルムアミド、デキストラン、デキストラン硫酸、及び／又ポリエチレングリコールの有無）等の諸因子は全て考慮する必要がある。これらは基本的には、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. （１９８９）に記載されている。
【００５４】
本明細書においてｔＰＡ遺伝子座に関連して用いられる「上流領域」とは、通常ｔＰＡ遺伝子座の転写領域の開始から１０ｋｂ以内（しかしコード領域からより離れていてもよい）配列で、遺伝子の発現に影響する（遺伝子の転写及びメッセンジャーＲＮＡの翻訳、スプライシング、安定性等）配列を意味すると理解されたい。
【００５５】
この点に関し、ｔＰＡ遺伝子座の上流領域に関して本明細書において用いられる配列座標は、ＧｅｎＢａｎｋ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｚ４８４８４）に対応する配列座標である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５６】
本発明は一形態において、虚血性発作の素因を有する被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を低下させる突然変異を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【００５７】
本被験者は、男性か女性のヒト被験者のいずれかであり、虚血性発作の素因を決定すべき被験者である。好ましい被験者はコーカソイド起源のヒトである。
【００５８】
虚血性発作は、被験者に起こりうる血栓性又は塞栓性発作であり、心塞栓性又はアテローム血栓性の虚血性発作を含む。好ましくは、虚血性発作はアテローム血栓性の虚血性発作である。
【００５９】
虚血性発作は好ましくは小血管発作（即ちラクナー発作）である。従って、本発明は好ましい形態において、ラクナー発作の素因を有する被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を低下させる突然変異を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【００６０】
被験者における突然変異は、内皮細胞からのｔＰＡの放出速度を低減するいずれかの遺伝子又は遺伝子外領域における突然変異のいずれかである。例えば、突然変異は、ｔＰＡ遺伝子座と関連しない遺伝子若しくは領域における突然変異でも、ｔＰＡ遺伝子座における突然変異でもよく、後者の例としては、ｔＰＡ遺伝子の転写に影響を及ぼすｔＰＡコード領域上流における突然変異や、エンハンサーにおける突然変異、ｔＰＡ遺伝子のエクソンにおける突然変異、スプライシングに影響を及ぼすイントロンにおける突然変異、翻訳又はｍＲＮＡの安定性に影響を及ぼすｔＰＡの３′領域における突然変異が挙げられる。
【００６１】
突然変異は、特定遺伝子の一方又は両方の対立遺伝子に存在してもよい。突然変異が特定遺伝子の両方の対立遺伝子に存在することが最も好ましい。
【００６２】
突然変異はｔＰＡ遺伝子座に存在することが好ましい。特に好ましい形態においては、突然変異はｔＰＡ遺伝子座の両対立遺伝子に存在する。
【００６３】
この点に関し、ヒトｔＰＡ遺伝子座の構造は、Degenら、（１９８６）J. Biol. Chem. ２６１（１５）:６９７２〜６９８５に記載されている。ｔＰＡ遺伝子は１４のエクソンと１３のイントロンからなる。
【００６４】
上流領域は遺伝子の転写を制御する作用を有する多数の領域を含む。例えば、ヒトｔＰＡ遺伝子の転写は−７ｋｂにおいて多重ホルモン受容性エンハンサーによって制御される。トランジエントトランスフェクションの研究から、近接プロモーター領域に−７ｋｂエンハンサー要求ＳＰ１結合を有するｔＰＡレポーター構築物が、前記エンハンサーを媒介としてレチノレイン酸によりプロモーターを誘導可能とすることがわかっている。
【００６５】
ｔＰＡの上流領域の−７３５１位におけるＣ〜Ｔ多型はこれまでに特定され、この突然変異が多型のホモ接合及びヘテロ接合個体におけるインビボでのｔＰＡ放出速度を低減させる（Ladenvallら、（２０００）Thromb. Haemost. ８４:１５０〜１５５）。この突然変異はＳＰ１結合サイトに存在する。
【００６６】
突然変異の組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を低減させる能力は、当業界で知られた好ましい方法によって決定することができる。例えば、特定の突然変異が内皮細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を低減させる能力は、突然変異を有する内皮細胞をインビトロで培養し、内皮細胞からのｔＰＡ放出速度を決定し、更に前記細胞を新鮮な媒体で洗浄し、その媒体へのｔＰＡの放出速度の時間変化の程度を野生型内皮細胞と比較して決定することにより、決定することができる。酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）（例えばＴｉｎｔＥｌｉｚｅ(R)ｔ−ＰＡ、ＢｉｏｐｏｏｌＡＢ）によって全ｔＰＡ抗原を定量することができる。この種のアッセイは二重抗体原理を基礎とする。遊離ｔＰＡとｔＰＡ−インヒビター複合体とは同程度の効率で検出される。
【００６７】
内皮細胞からのｔＰＡの放出を誘起するためには、当業界において内皮細胞からのｔＰＡの放出を誘起することが知られているトロンビンやカルシウムイオノホア等の剤を用いることができる。インビトロにおいて内皮細胞からのｔＰＡの放出を誘起する好ましい方法はRosnobletら、（１９９９）Arterioscler Thromb Vasc Biol. １９（７）:１７９６〜８０３に記載されている。
【００６８】
また、被験者におけるｔＰＡ放出速度は、例えば前腕部における放出速度を突然変異を有さない被験者と比較して決定することにより直接決定することができる。インビボにおけるｔＰＡの放出速度を決定する好ましい方法は、Jernら、（１９９９）Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. １９（２）:４５４〜４５９に記載されている。
【００６９】
突然変異はｔＰＡ遺伝子座に位置することが好ましい。更に好ましくは、被験者の突然変異はｔＰＡ遺伝子座の上流領域に存在する突然変異である。更に好ましくは、突然変異はｔＰＡ遺伝子座のエンハンサーエレメントにおける突然変異である。最も好ましくは、突然変異はｔＰＡ遺伝子座の上流領域の−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異である。
【００７０】
−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異はｔＰＡ遺伝子座の一方又は両方の対立遺伝子に存在していてもよい。突然変異はｔＰＡ遺伝子座の両方の対立遺伝子に存在していることが最も好ましい。
【００７１】
従って、好ましい形態において本発明は、虚血性発作の素因を有する被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の両対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【００７２】
既に述べたように、虚血性発作はラクナー発作であることが好ましい。従って、他の好ましい形態において本発明は、ラクナー発作の素因を有する被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の両対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【００７３】
ｔＰＡの放出速度を低下させる突然変異を被験者において特定することは、当業界で知られている好ましい方法によって決定することができる。
【００７４】
ＤＮＡは被験者から当業界で知られている好ましい方法によって単離することができる。被験者の静脈全血からゲノムＤＮＡを単離する好ましい方法は、Millerら、（１９８８） Nucleic Acids Research １６（３）:１２１５に記載されている。
【００７５】
突然変異の特定には種々の方法を用いることができる。ＤＮＡ塩基配列決定法（マニュアル或いは自動蛍光塩基配列決定）を用いて突然変異を検出することができる。この場合、特定の被験者から誘導される領域のクローンの塩基配列を決定して、増幅してもしなくても突然変異を特定することができるが、突然変異の特定は通常、被験者（全ゲノムＤＮＡ）から単離した核酸から突然変異を含む領域を増幅することを伴う。
【００７６】
突然変異特定の他の方法としては、一本鎖コンホーメーション多型アッセイ（ＳＳＣＡ）（Oritaら、（１９８９） Genomics ５（４）:８７４〜８７９）がある。この方法は全ての配列の変化を検出するのではないが、特にＤＮＡフラグメントサイズが２００ｂｐより大きいければ、大部分のＤＮＡ配列変化を検出して最適化できる。ＳＳＣＡゲル上で移動度が変化したフラグメントは後に塩基配列を決定し、ＤＮＡ配列変化の正確な性質を決定する。
【００７７】
他の方法としては、二本のＤＮＡ相補鎖間のミスマッチを検出することの基づく方法であって、固定変性ゲル電気泳動を含む方法（Sheffieldら、（１９９１）Am. J. Hum. Genet.４９:６９９〜７０６に記載）、ヘテロデュプレックス分析（Whiteら、（１９９２）Genomics １２:３０１〜３０３）、化学的ミスマッチ開裂（Grompeら、（１９８９） Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８６:５８５５〜５８９２）である。突然変異が具体的に特定されたならば、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション等の対立遺伝子特異的検出方法を用いることができる。
【００７８】
ＤＮＡ配列分析を用いて突然変異を特定する場合には、一対立遺伝子に突然変異の存在が見出されるということは（即ち被験者が突然変異についてヘテロ接合性）、ＤＮＡ配列中の関連する位置に二個のヌクレオチドが存在することとなる。正常な対立遺伝子に対してホモ接合性或いは突然変異に対してホモ接合性である、被験者から取り出したＤＮＡ配列であれば、ＤＮＡ配列中の関連する位置において相当する一ヌクレオチドの存在のみを得ることとなる。
【００７９】
塩基配列決定のための好ましいテンプレートを提供するには、被験者から単離されたゲノムＤＮＡの領域を適切に設計したプライマーを用いて増幅することができる。適切なプライマーとの配列決定反応及びＤＮＡ配列の分析は当業界で知られた好ましい方法によって行うことができる。突然変異がｔＰＡ遺伝子座の上流領域の−７３５１位におけるＣ〜Ｔ突然変異であるならば、増幅の好ましい領域は、配列番号１のヌクレオチド１８４０〜２２４５の領域である。
【００８０】
あるいは、突然変異の存在は、被験者から単離されたＤＮＡから野生型対立遺伝子又は突然変異を有する対立遺伝子のいずれかのみを増幅する配列特異的プライマーを用いて決定することができる。配列特異的プライマーを用いてＤＮＡを増幅する場合、コンセンサスプライマーと二種の代替プライマーのうち一種とが用いられる。代替プライマーのそれぞれは、野生型配列（ＷＴプライマー）に対応するか多型配列（ＳＰＮプライマー）に対応する３′ 末端ヌクレオチドを有する。この場合、増幅は正確な相補ヌクレオチドを有するテンプレートからのみ生じるであろう。
【００８１】
他の突然変異特定の方法は、核酸配列における差異の差別化を可能ならしめる、突然変異を有する核酸と他の核酸（即ちレポーター核酸）とのハイブリッド化を伴う。例えば、オリゴヌクレオチドを用いるサザン分析を用いて突然変異を検出することができる。また、オリゴヌクレオチドをチップ等の固体支持体に付加し、突然変異を有する核酸の結合をオリゴヌクレオチドへの結合（結合なし）によって検出する方法も当業界で知られている。これらの場合、突然変異を被験者において特定することは、被験者から単離・誘導した核酸をレポーター核酸とハイブリッド形成することによって突然変異を検出することも含む。
【００８２】
突然変異が−７３５１位におけるＣ〜Ｔ突然変異の場合、ＷＴ及びＳＮＰプライマーでの増幅に好ましいｔＰＡ遺伝子座の領域は、配列番号１のヌクレオチド１８４０〜２２４５の領域である。
【００８３】
従って、他の形態において本発明は、単離された核酸において、ポリヌクレオチドが配列番号１のヌクレオチド１８４０〜２２４５の配列からなる核酸を提供する。
【００８４】
配列番号１のヌクレオチド１８４０〜２２４５の領域の配列を次に示す：
５′-ATTGGCGCAA ACTCCTCACA GAGGAAAAAA TGTACAGTTA GAGTGAAGTG AAAGAACATC TCTATAAAAT ATGCATCACT TCCTGGCGGG GAGGAGAGAG GAGCTATGGA AAGCTACACC AAAGCTGTAT TCACTGGACA AAAATGCTTG ACTCAGGAAG GAGGCCGGAG CGGCGAGTCC TGTGATGCCA TGGCGGGAGG TGGGTCCCAT GTAAACAGTG GTGTTCCTGT CACCCTGAGC ACATGCAGTC TCCCGTGGGT AACCAGAACT GATGCAAGAG CCCCTGCTGT GGAAGTCACC ACGCTCTCCC AGAACGCGCC TCCCCCCAGG TCTGAGTGAT CTCATTGCCG AGGTGAATAG GGCTTTGGCC GCTCTCCCAA AGGAGCCCGC CCCAGACACA GCCAT-３′
【００８５】
好ましくは、正常−７３５１配列を有するｔＰＡ遺伝子座の領域を増幅するために用いるプライマーは配列番号２（５′−ＡＴＴＧＧＣＧＣＡＡＡＣＴＣＣＴＣＡＣＡ−３′）及び配列番号３（５′−ＡＴＧＧＣＴＧＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＧ−３′）であり、−７３５１Ｃ〜Ｔ多型配列を有するｔＰＡ遺伝子座の領域を増幅するために用いるプライマーは配列番号２（５′−ＡＴＴＧＧＣＧＣＡＡＡＣＴＣＣＴＣＡＣＡ−３′）及び配列番号４（５′−ＡＴＧＧＣＴＧＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＡ−３′）である。これらプライマーでｔＰＡ遺伝子座を増幅するための好ましい反応条件は、ＰＴＣ-２００ペルチエサーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を次のＰＣＲサイクルパラメータで使用することを含む：９６℃で２５秒、７０℃で４５秒及び７２℃で４５秒（５サイクル）；９６℃で２５秒、６５℃で５０秒及び７２℃で４５秒（２１サイクル）；９６℃で２５秒、５５℃で６０秒及び７２℃で１２５秒（４サイクル）。
【００８６】
増幅生成物は当業界で知られている好ましい方法により検出することができる。例えば、増幅生成物をアガロースゲル上に展開し、エチジウムブロミドで染色し視覚化することができる。
【００８７】
突然変異の特定は、被験者から単離・誘導した核酸から突然変異を含む領域を増幅することを含むことが好ましい。
【００８８】
本発明の本形態は、虚血性発作の予防及び／又は治療が必要な被験者を特定することにも有用である。
【００８９】
従って、他の形態において本発明はまた、虚血性発作の予防及び／又は治療を行うために好適な被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を低下させる突然変異を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【００９０】
更に本発明はまた、好ましい形態において、虚血性発作の予防及び／又は治療を行うために好適な被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の両対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【００９１】
本発明はまた、虚血性発作の素因を有する被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子の低減された放出速度を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【００９２】
虚血性発作は、被験者に起こりうる血栓性又は塞栓性発作であり、心塞栓性又はアテローム血栓性の虚血性発作を含む。好ましくは、虚血性発作はアテローム血栓性の虚血性発作である。
【００９３】
虚血性発作は好ましくは小血管発作（即ちラクナー発作）である。従って、本発明は好ましい形態において、ラクナー発作の素因を有する被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子の低減された放出速度を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【００９４】
本被験者は、男性か女性のヒト被験者のいずれかであり、虚血性発作の素因を決定すべき被験者である。好ましい被験者はコーカソイド起源のヒトである。
【００９５】
被験者は、被験者においてｔＰＡ放出速度を低下させる突然変異をｔＰＡ遺伝子座に有することが好ましい。より好ましくは、被験者は、被験者においてｔＰＡ放出速度を低下させる突然変異をｔＰＡ遺伝子座の上流領域に有する。より好ましくは、被験者は、被験者においてｔＰＡ放出速度を低下させる突然変異をｔＰＡ遺伝子座のエンハンサーエレメントに有する。最も好ましくは、被験者は、被験者においてｔＰＡ放出速度を低下させる突然変異をｔＰＡ遺伝子座の上流領域のシトシンからチミンへの−７３５１位に有する。
【００９６】
−７３５１位シトシンからチミンへの突然変異は、ｔＰＡ遺伝子座の一方又は両方の対立遺伝子の存在してもよい。この突然変異がｔＰＡ遺伝子座の両方の対立遺伝子の存在することが最も好ましい。
【００９７】
また、被験者における低減されたｔＰＡ放出速度は、当業界で知られている好ましい方法によって特定することができる。例えば被験者の前腕部におけるｔＰＡ放出速度を決定することにより直接決定することができる。インビボにおけるｔＰＡの放出速度を決定する好ましい方法は、Jernら、（１９９９）Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. １９（２）:４５４〜４５９に記載されている。
【００９８】
本発明の本形態は、虚血性発作の予防及び／又は治療が必要な被験者を特定することにも有用である。
【００９９】
従って本発明は他の形態においては、虚血性発作の予防及び／又は治療を行うために好適な被験者を特定する方法にも係るものであって、組織プラスミノーゲン活性化因子の低減された放出速度を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【０１００】
本発明はまた、小血管閉塞の素因を有する被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を低下させる突然変異を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【０１０１】
本被験者は、男性か女性のヒト被験者のいずれかであり、小血管閉塞の素因を決定すべき被験者である。好ましい被験者はコーカソイド起源のヒトである。
【０１０２】
本発明において小血管閉塞は種々の形態を呈し、被験者の小血管に起こり得る血栓性又は塞栓性の閉塞のいずれかであり、ラクナー発作、痴呆、虚血性心疾患（虚血性心筋症含む）、末梢血管疾患、血管内凝固症候群、小血管炎、虚血性神経障害、虚血性網膜症、虚血性胃疾患（小腸大腸虚血含む）、広汎性肺塞栓症及び血管性インポテンス等を臨床的に呈する小血管閉塞である。
【０１０３】
好ましくは、小血管閉塞は脳内に発生し、臨床的にはラクナー発作を呈する小血管閉塞を含む。
【０１０４】
被験者における突然変異は、内皮細胞からのｔＰＡの放出速度を低減するいずれの遺伝子又は遺伝子外領域における突然変異のいずれかである。例えば、突然変異はｔＰＡ遺伝子座における突然変異でもよく、その例としては、ｔＰＡコード領域上流における突然変異や、エンハンサーエレメントにおける突然変異、ｔＰＡ遺伝子のエクソンにおける突然変異、スプライシングに影響を及ぼすイントロンにおける突然変異、翻訳又はｍＲＮＡの安定性に影響を及ぼすｔＰＡの３′領域における突然変異が挙げられる。
【０１０５】
突然変異は、特定遺伝子の一方又は両方の対立遺伝子の存在してもよい。突然変異が特定遺伝子の両方の対立遺伝子の存在することが最も好ましい。
【０１０６】
既に述べたように、ｔＰＡの放出速度を低下させる突然変異を被験者において特定することは、当業界で知られている好ましい方法によって決定することができる。
【０１０７】
ＤＮＡは被験者から当業界で知られている好ましい方法によって単離することができる。被験者の静脈全血からゲノムＤＮＡを単離する好ましい方法は、Millerら、（１９８８） Nucleic Acids Research １６（３）:１２１５に記載されている。
【０１０８】
突然変異の組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を低減させる能力は、当業界で知られた好ましい方法によって決定することができる。例えば、特定の突然変異が内皮細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を低減させる能力は、突然変異を有する内皮細胞をインビトロで培養し、内皮細胞からのｔＰＡ放出速度を決定し、更に前記細胞を新鮮な媒体で洗浄し、その媒体へのｔＰＡの放出速度の時間変化の程度を野生型内皮細胞と比較して決定することにより、決定することができる。酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）（例えばＴｉｎｔＥｌｉｚｅ(R)ｔ−ＰＡ、ＢｉｏｐｏｏｌＡＢ）によって全ｔＰＡ抗原を定量することができる。この種のアッセイは二重抗体原理を基礎とする。遊離ｔＰＡとｔＰＡ−インヒビター複合体とは同程度の効率で検出される。
【０１０９】
内皮細胞からのｔＰＡの放出を誘起するためには、当業界において内皮細胞からのｔＰＡの放出を誘起することが知られているトロンビンやカルシウムイオノホア等の剤を用いることができる。インビトロにおいて内皮細胞からのｔＰＡの放出を誘起する好ましい方法はRosnobletら、（１９９９）Arterioscler Thromb Vasc Biol. １９（７）:１７９６〜８０３に記載されている。
【０１１０】
被験者における突然変異はｔＰＡ遺伝子座に存在する突然変異であることが好ましい。より好ましくは、被験者における突然変異はｔＰＡ遺伝子座の上流領域に存在する突然変異である。より好ましくは、被験者における突然変異はｔＰＡ遺伝子座のエンハンサーエレメントに存在する突然変異である。最も好ましくは、被験者における突然変異はｔＰＡ遺伝子座の上流領域のシトシンからチミンへの−７３５１位における突然変異である。
【０１１１】
−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異はｔＰＡ遺伝子座の一方又は両方の対立遺伝子に存在していてもよい。突然変異はｔＰＡ遺伝子座の両方の対立遺伝子に存在していることが最も好ましい。
【０１１２】
従って本発明はその好ましい形態において、小血管閉塞の素因を有する被験者を特定する方法に係るものでもあって、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の両対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在を前記被験者において特定する段階を含む方法を更に提供する。
【０１１３】
既に述べたように、ｔＰＡの放出速度を低下させる突然変異を被験者において特定することは、当業界で知られている好ましい方法によって決定することができる。
【０１１４】
ＤＮＡは被験者から当業界で知られている好ましい方法によって単離することができる。被験者の静脈全血からゲノムＤＮＡを単離する好ましい方法は、Millerら、（１９８８） Nucleic Acids Research １６（３）:１２１５に記載されている。
【０１１５】
既に述べたように、突然変異の特定には種々の方法を用いることができる。
【０１１６】
ＤＮＡ塩基配列決定法（マニュアル或いは自動蛍光塩基配列決定）を用いて突然変異を検出することができる。突然変異特定の他の方法としては、一本鎖コンホーメーション多型アッセイ（ＳＳＣＡ） （Oritaら、（１９８９） Genomics ５ （４）:８７４〜８７９）がある。この方法は全ての配列の変化を検出するのではないが、特に仮にＤＮＡフラグメントサイズが２００ｂｐより大きい場合であれば、大部分のＤＮＡ配列変化を検出して最適化することができる。ＳＳＣＡゲル上で移動度が変化したフラグメントは後に塩基配列を決定し、そしてＤＮＡ配列変化の正確な性質を決定する。
【０１１７】
他の方法としては、二本のＤＮＡ相補鎖間のミスマッチを検出することの基づく方法であって、固定変性ゲル電気泳動を含む方法（Sheffieldら、（１９９１）Am. J. Hum. Genet.４９:６９９〜７０６に記載）、ヘテロデュプレックス分析（Whiteら、（１９９２）Genomics １２:３０１〜３０３）、化学的ミスマッチ開裂（Grompeら、（１９８９） Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８６:５８５５〜５８９２）がある。特定の突然変異が特定されたならば、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション等の対立遺伝子特異的検出方法を用いることができる。
【０１１８】
ＤＮＡ配列分析を用いて突然変異を特定する場合には、一対立遺伝子に突然変異の存在が見出されるということは（即ち被験者が突然変異についてヘテロ接合性）、ＤＮＡ配列中の関連する位置に二個のヌクレオチドが存在することとなる。正常な対立遺伝子に対してホモ接合性或いは突然変異に対してホモ接合性である、被験者から取り出したＤＮＡ配列であれば、ＤＮＡ配列中の関連する位置において相当する一ヌクレオチドの存在のみを得ることとなる。
【０１１９】
塩基配列決定のための好ましいテンプレートを提供するには、被験者から単離されたゲノムＤＮＡの領域を適切に設計したプライマーを用いて増幅することができる。適切なプライマーとの配列決定反応及びＤＮＡ配列の分析は当業界で知られた好ましい方法によって行うことができる。突然変異がｔＰＡ遺伝子座の上流領域の−７３５１位におけるＣ〜Ｔ突然変異であるならば、増幅の好ましい領域は、配列番号１のヌクレオチド１８４０〜２２４５の領域である。
【０１２０】
あるいは、突然変異の存在は、被験者から単離されたＤＮＡから野生型対立遺伝子又は突然変異を有する対立遺伝子のいずれかのみを増幅する配列特異的プライマーを用いて決定することができる。配列特異的プライマーを用いてＤＮＡを増幅する場合、コンセンサスプライマーと二種の代替プライマーのうち一種とが用いられる。代替プライマーのそれぞれは、野生型配列（ＷＴプライマー）に対応するか多型配列（ＳＰＮプライマー）に対応する３′ 末端ヌクレオチドを有する。この場合、増幅は正確な相補ヌクレオチドを有するテンプレートからのみ生じるであろう。
【０１２１】
突然変異が−７３５１位におけるＣ〜Ｔ突然変異の場合、ＷＴ及びＳＮＰプライマーでの増幅に好ましいｔＰＡ遺伝子座の領域は、配列番号１のヌクレオチド１８４０〜２２４５の領域である。
【０１２２】
好ましくは、正常−７３５１配列を有するｔＰＡ遺伝子座の領域を増幅するために用いるプライマーは配列番号２（５′−ＡＴＴＧＧＣＧＣＡＡＡＣＴＣＣＴＣＡＣＡ−３′）及び配列番号３（５′−ＡＴＧＧＣＴＧＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＧ−３′）であり、−７３５１Ｃ〜Ｔ多型配列を有するｔＰＡ遺伝子座の領域を増幅するために用いるプライマーは配列番号２（５′−ＡＴＴＧＧＣＧＣＡＡＡＣＴＣＣＴＣＡＣＡ−３′）及び配列番号４（５′−ＡＴＧＧＣＴＧＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＡ−３′）である。これらプライマーでｔＰＡ遺伝子座を増幅するための好ましい反応条件は、ＰＴＣ-２００ペルチエサーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を次のＰＣＲサイクルパラメータで使用することを含む：９６℃で２５秒、７０℃で４５秒及び７２℃で４５秒（５サイクル）；９６℃で２５秒、６５℃で５０秒及び７２℃で４５秒（２１サイクル）；９６℃で２５秒、５５℃で６０秒及び７２℃で１２５秒（４サイクル）。
【０１２３】
増幅生成物は当業界で知られている好ましい方法により検出することができる。例えば、増幅生成物をアガロースゲル上に展開し、エチジウムブロミドで染色し視覚化することができる。
【０１２４】
突然変異の特定は、被験者から単離・誘導した核酸から突然変異を含む領域を増幅することを含むことが好ましい。
【０１２５】
突然変異の特定は、被験者から単離・誘導した核酸をレポーター核酸とハイブリッド形成することにより突然変異を検出することも含むことが好ましい。
【０１２６】
本発明の本形態は、小血管閉塞に関連する疾病又は状態の予防及び／又は治療が必要な被験者を特定することにも有用である。
【０１２７】
従って本発明はまた、他の形態において、小血管閉塞に関連する疾病又は状態の予防及び／又は治療を行うために好適な被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を低下させる突然変異を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【０１２８】
更に本発明はまた、好ましい形態において、小血管閉塞に関連する疾病又は状態の予防及び／又は治療を行うために好適な被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の両対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【０１２９】
本発明はまた、小血管閉塞の素因を有する被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子の低減された放出速度を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【０１３０】
本被験者は、男性か女性のヒト被験者のいずれかであり、小血管閉塞の素因を決定すべき被験者である。好ましい被験者はコーカソイド起源のヒトである。
【０１３１】
小血管閉塞は被験者の小血管に起こり得る血栓性又は塞栓性の閉塞のいずれかであり、ラクナー発作、痴呆、虚血性心疾患（虚血性心筋症含む）、末梢血管疾患、血管内凝固症候群、小血管炎、虚血性神経障害、虚血性網膜症、虚血性胃疾患（小腸大腸虚血含む）、広汎性肺塞栓症及び血管性インポテンス等を含む。
【０１３２】
好ましくは、小血管閉塞は脳内に発生し、臨床的にはラクナー発作を呈する小血管閉塞を含む。
【０１３３】
被験者は、被験者においてｔＰＡ放出速度を低下させる突然変異をｔＰＡ遺伝子座に有することが好ましい。より好ましくは、被験者は、被験者においてｔＰＡ放出速度を低下させる突然変異をｔＰＡ遺伝子座の上流領域に有する。より好ましくは、被験者は、被験者においてｔＰＡ放出速度を低下させる突然変異をｔＰＡ遺伝子座のエンハンサーエレメントに有する。最も好ましくは、被験者は、被験者においてｔＰＡ放出速度を低下させる突然変異をｔＰＡ遺伝子座の上流領域のシトシンからチミンへの−７３５１位に有する。
【０１３４】
−７３５１位シトシンからチミンへの突然変異は、ｔＰＡ遺伝子座の一方又は両方の対立遺伝子の存在してもよい。この突然変異がｔＰＡ遺伝子座の両方の対立遺伝子の存在することが最も好ましい。
【０１３５】
また、被験者における低減されたｔＰＡ放出速度は、当業界で知られている好ましい方法によって特定することができる。例えば被験者の前腕部におけるｔＰＡ放出速度を決定することにより直接決定することができる。
【０１３６】
インビボにおけるｔＰＡの放出速度を決定する好ましい方法は、Jernら、（１９９９）Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. １９（２）:４５４〜４５９に記載されている。
【０１３７】
本発明の本形態は、小血管閉塞に関連する疾病又は状態の予防及び／又は治療が必要な被験者を特定することにも有用である。
【０１３８】
従って本発明はまた他の形態において、小血管閉塞に関連する疾病又は状態の予防及び／又は治療を行うために好適な被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子の低減された放出速度を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【０１３９】
本発明はまた、小血管閉塞に関連する疾病又は状態の素因を有する被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の両対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【０１４０】
本被験者は、男性か女性のヒト被験者のいずれかであり、小血管閉塞に関連する疾病又は状態の進行の素因を決定すべき被験者である。好ましい被験者はコーカソイド起源のヒトである。
【０１４１】
小血管閉塞に関連する疾病又は状態の例としては、ラクナー発作、痴呆、虚血性心疾患（虚血性心筋症含む）、末梢血管疾患、血管内凝固症候群、小血管炎、虚血性神経障害、虚血性網膜症、虚血性胃疾患（小腸大腸虚血含む）、広汎性肺塞栓症及び血管性インポテンスが挙げられる。
【０１４２】
好ましくは、小血管閉塞に関連する疾病又は状態は脳内に発生し、ラクナー発作を含む。
【０１４３】
組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の両対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在を被験者において特定することは、当業界において知られている好ましい方法によって行うことができる。
【０１４４】
ＤＮＡは被験者から当業界で知られている好ましい方法によって単離することができる。被験者の静脈全血からゲノムＤＮＡを単離する好ましい方法は、Millerら、（１９８８） Nucleic Acids Research １６（３）:１２１５に記載されている。
【０１４５】
組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の両対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異を特定するには、ＤＮＡ塩基配列決定法（マニュアル或いは自動蛍光塩基配列決定）を用いて突然変異を検出することができる。
【０１４６】
既に述べたように、突然変異の特定には種々の方法を用いることができる。ＤＮＡ配列分析を用いて突然変異を特定する場合には、一対立遺伝子に突然変異の存在が見出されるということは（即ち被験者が突然変異についてヘテロ接合性）、ＤＮＡ配列中の関連する位置に二個のヌクレオチド（Ｃ及びＴ）が存在することとなる。正常な対立遺伝子に対してホモ接合性或いは突然変異に対してホモ接合性である、被験者から取り出したＤＮＡ配列であれば、ＤＮＡ配列中の関連する位置において相当する一ヌクレオチドの存在のみを得ることとなる。
【０１４７】
塩基配列決定のための好ましいテンプレートを提供するには、被験者から単離されたゲノムＤＮＡの領域を適切に設計したプライマーを用いて増幅することができる。適切なプライマーとの配列決定反応及びＤＮＡ配列の分析は当業界で知られた好ましい方法によって行うことができる。増幅の好ましい領域は、配列番号１のヌクレオチド１８４０〜２２４５の領域である。
【０１４８】
両対立遺伝子における突然変異の存在は、被験者から単離されたＤＮＡから野生型対立遺伝子又は突然変異を有する対立遺伝子のいずれかのみを増幅する配列特異的プライマーを用いて決定することができる。繰り返すが、ＷＴ及びＳＮＰプライマーでの増幅に好ましいｔＰＡ遺伝子座の領域は、配列番号１のヌクレオチド１８４０〜２２４５の領域である。
【０１４９】
あるいは、好ましくは、正常−７３５１配列を有するｔＰＡ遺伝子座の領域を増幅するために用いるプライマーは配列番号２（５′−ＡＴＴＧＧＣＧＣＡＡＡＣＴＣＣＴＣＡＣＡ−３′）及び配列番号３（５′−ＡＴＧＧＣＴＧＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＧ−３′）であり、−７３５１Ｃ〜Ｔ多型配列を有するｔＰＡ遺伝子座の領域を増幅するために用いるプライマーは配列番号２（５′−ＡＴＴＧＧＣＧＣＡＡＡＣＴＣＣＴＣＡＣＡ−３′）及び配列番号４（５′−ＡＴＧＧＣＴＧＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＡ−３′）である。これらプライマーでｔＰＡ遺伝子座を増幅するための好ましい反応条件は、ＰＴＣ-２００ペルチエサーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を次のＰＣＲサイクルパラメータで使用することを含む：９６℃で２５秒、７０℃で４５秒及び７２℃で４５秒（５サイクル）；９６℃で２５秒、６５℃で５０秒及び７２℃で４５秒（２１サイクル）；９６℃で２５秒、５５℃で６０秒及び７２℃で１２５秒（４サイクル）。
【０１５０】
増幅生成物は当業界で知られている好ましい方法により検出することができる。例えば、増幅生成物をアガロースゲル上に展開し、エチジウムブロミドで染色し視覚化することができる。
【０１５１】
突然変異の特定は、被験者から単離・誘導した核酸から突然変異を含む領域を増幅することを含むことが好ましい。
【０１５２】
突然変異の特定は、被験者から単離・誘導した核酸をレポーター核酸とハイブリッド形成することにより突然変異を検出することも含むことが好ましい。
【０１５３】
本発明の本形態は、小血管閉塞に関連する疾病又は状態の予防及び／又は治療が必要な被験者を特定することにも有用である。
【０１５４】
従って本発明はまた他の形態において、小血管閉塞に関連する疾病又は状態の予防及び／又は治療を行うために好適な被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の両対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【０１５５】
本発明はまた、被験者における虚血性発作のリスクを決定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の一方若しくは両方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在を前記被験者において決定する段階を含む方法を提供する。
【０１５６】
被験者における虚血性発作のリスクとは、虚血性発作を伴うための他のリスク因子（例えば心房細動、喫煙歴等）が被験者間で同程度という条件下で、被験者集団全体が虚血性発作に罹患する可能性と比較したｔＰＡ遺伝子座に突然変異を有する被験者が虚血性発作に罹患する可能性である。
【０１５７】
この点に関し、ｔＰＡ遺伝子座の一方若しくは両方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在（即ち多型についてヘテロ接合性の個体）は、虚血性発作又は小血管閉塞を伴うための他のリスク因子（例えば心房細動、喫煙歴等）が被験者間で同程度という条件下で、被験者が虚血性発作に罹患するリスクが被験者集団全体と比較してより高いことを示す。
【０１５８】
例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の一方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の被験者における存在は、組織プラスミノーゲン遺伝子座のいずれの対立遺伝子にも突然変異を有さない被験者の虚血性発作のリスクと比較した場合の被験者の虚血性発作のリスクの増大を示す。
【０１５９】
また、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の一方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の被験者における存在は、被験者集団全体の虚血性発作に対するリスクと比較した場合の被験者の高い虚血性発作に対するリスク、又は虚血性発作を伴うための他の同様のリスク因子を有する他の被験者の虚血性発作に対するリスクと比較した場合の被験者の高い虚血性発作に対するリスクを示す。
【０１６０】
更に、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の両方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の被験者における存在は、組織プラスミノーゲン遺伝子座の一方若しくは両方の対立遺伝子における突然変異を有さない被験者の虚血性発作に対するリスクと比較した場合の被験者の高い虚血性発作に対するリスクを示す。
【０１６１】
また、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の両方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の被験者における存在は、被験者集団全体の虚血性発作に対するリスクと比較した場合の被験者の高い虚血性発作に対するリスク、又は虚血性発作を伴うための他の同様のリスク因子を有する被験者の虚血性発作に対するリスクと比較した場合の被験者の高い虚血性発作に対するリスクを示す。
【０１６２】
本被験者は、男性か女性のヒト被験者のいずれかであり、虚血性発作罹患のリスクを決定すべき被験者である。好ましい被験者はコーカソイド起源のヒトである。
【０１６３】
虚血性発作は、被験者に起こりうる血栓性又は塞栓性発作のいずれかであり、心塞栓性又はアテローム血栓性の虚血性発作を含む。好ましくは、虚血性発作はアテローム血栓性の虚血性発作である。
【０１６４】
好ましくは、虚血性発作は小血管発作（即ちラクナー発作）である。従って、本発明はまた、好ましい形態において、被験者におけるラクナー発作のリスクを決定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の一方若しくは両方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在を前記被験者において決定する段階を含む方法を提供する。
【０１６５】
既に述べたように、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の一方若しくは両方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在を前記被験者において決定することは、当業界で知られている好ましい方法によって決定することができる。
【０１６６】
ＤＮＡは被験者から当業界で知られている好ましい方法によって単離することができる。被験者の静脈全血からゲノムＤＮＡを単離する好ましい方法は、Millerら、（１９８８） Nucleic Acids Research １６（３）:１２１５に記載されている。
【０１６７】
既に述べたように、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の一方若しくは両方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在を前記被験者において決定するためには、ＤＮＡ塩基配列決定法（マニュアル或いは自動蛍光塩基配列決定）等の種々の方法を用いることができる。
【０１６８】
ＤＮＡ配列分析を用いて突然変異を特定する場合には、一対立遺伝子に突然変異の存在が見出されるということは（即ち被験者が突然変異についてヘテロ接合性）、ＤＮＡ配列中の関連する位置に二個のヌクレオチド（Ｃ及びＴ）が存在することとなる。正常な対立遺伝子に対してホモ接合性或いは突然変異に対してホモ接合性である、被験者から取り出したＤＮＡ配列であれば、ＤＮＡ配列中の関連する位置において相当する一ヌクレオチドの存在のみを得ることとなる。
【０１６９】
突然変異の塩基配列決定のための好ましいテンプレートを提供するには、被験者から単離されたゲノムＤＮＡの領域を適切に設計したプライマーを用いて増幅することができる。適切なプライマーとの配列決定反応及びＤＮＡ配列の分析は当業界で知られた好ましい方法によって行うことができる。増幅の好ましい領域は、配列番号１のヌクレオチド１８４０〜２２４５の領域である。
【０１７０】
また、突然変異の存在は、被験者から単離されたＤＮＡから野生型対立遺伝子又は突然変異を有する対立遺伝子のいずれかのみを増幅する配列特異的プライマーを用いて決定することができる。繰り返すが、ＷＴ及びＳＮＰプライマーでの増幅に好ましいｔＰＡ遺伝子座の領域は、配列番号１のヌクレオチド１８４０〜２２４５の領域である。
【０１７１】
好ましくは、正常−７３５１配列を有するｔＰＡ遺伝子座の領域を増幅するために用いるプライマーは配列番号２（５′−ＡＴＴＧＧＣＧＣＡＡＡＣＴＣＣＴＣＡＣＡ−３′）及び配列番号３（５′−ＡＴＧＧＣＴＧＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＧ−３′）であり、−７３５１Ｃ〜Ｔ多型配列を有するｔＰＡ遺伝子座の領域を増幅するために用いるプライマーは配列番号２（５′−ＡＴＴＧＧＣＧＣＡＡＡＣＴＣＣＴＣＡＣＡ−３′）及び配列番号４（５′−ＡＴＧＧＣＴＧＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＡ−３′）である。これらプライマーでｔＰＡ遺伝子座を増幅するための好ましい反応条件は、ＰＴＣ-２００ペルチエサーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を次のＰＣＲサイクルパラメータで使用することを含む：９６℃で２５秒、７０℃で４５秒及び７２℃で４５秒（５サイクル）；９６℃で２５秒、６５℃で５０秒及び７２℃で４５秒（２１サイクル）；９６℃で２５秒、５５℃で０秒及び７２℃で１２５秒（４サイクル）。
【０１７２】
増幅生成物は当業界で知られている好ましい方法により検出することができる。例えば、増幅生成物をアガロースゲル上に展開し、エチジウムブロミドで染色し視覚化することができる。
【０１７３】
突然変異の特定は、被験者から単離・誘導した核酸から突然変異を含む領域を増幅することを含むことが好ましい。
【０１７４】
突然変異の特定は、被験者から単離・誘導した核酸をレポーター核酸とハイブリッド形成することにより突然変異を検出することも含むことが好ましい。
【０１７５】
本発明はまた、被験者における小血管閉塞のリスク又は前記被験者のおける小血管閉塞に関連する疾病又は状態の進行のリスクを決定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の一方若しくは両方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在を前記被験者において決定する段階を含む方法を提供する。
【０１７６】
被験者における小血管閉塞のリスクとは、小血管閉塞を伴うための他のリスク因子が被験者間で同程度という条件下で、被験者集団全体が小血管閉塞に罹患する可能性と比較したｔＰＡ遺伝子座に突然変異を有する被験者が小血管閉塞に罹患する可能性である。
【０１７７】
この点に関し、ｔＰＡ遺伝子座の一方若しくは両方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在（即ち多型についてヘテロ接合性の個体）は、小血管閉塞を伴うための他のリスク因子が被験者間で同程度という条件下で、被験者が小血管閉塞に罹患するリスクが被験者集団全体と比較してより高いことを示す。両方の対立遺伝子における突然変異の存在は、一方の対立遺伝子における突然変異の存在より更に高リスクを示す。
【０１７８】
例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の一方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の被験者における存在は、組織プラスミノーゲン遺伝子座のいずれの対立遺伝子にも突然変異を有さない被験者のリスクと比較した場合の被験者の小血管閉塞のリスク又は前記被験者の小血管閉塞に関連する疾患の進行のリスクの増大を示す。
【０１７９】
また、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の一方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の被験者における存在は、被験者集団全体のリスクと比較した場合の被験者の小血管閉塞のリスク又は前記被験者の小血管閉塞に関連する疾患の進行のリスクの増大を、又は小血管閉塞を伴うための他の同様のリスク因子を有する他の被験者のリスクと比較した場合の被験者の小血管閉塞のリスク又は前記被験者の小血管閉塞前記被験者の虚血性発作に関連する疾患の進行虚血性発作のリスクの増大を示す。
【０１８０】
組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の両方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の被験者における存在は、組織プラスミノーゲン遺伝子座の一方若しくは両方の対立遺伝子における突然変異を有さない被験者のリスクと比較した場合の被験者の小血管閉塞のリスク又は前記被験者の小血管閉塞に関連する疾患の進行のリスクの増大を示す。
【０１８１】
また、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の両方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の被験者における存在は、被験者集団全体のリスクと比較した場合の小血管閉塞のリスク又は前記被験者の小血管閉塞に関連する疾患の進行のリスクの増大を、又は小血管閉塞を伴うための他の同様のリスク因子を有する他の被験者のリスクと比較した場合の被験者の小血管閉塞のリスク又は前記被験者の小血管閉塞に関連する疾患の進行のリスクの増大を示す。
【０１８２】
本被験者は、男性か女性のヒト被験者のいずれかであり、小血管閉塞罹患のリスクを決定すべき被験者である。好ましい被験者はコーカソイド起源のヒトである。
【０１８３】
小血管閉塞は被験者の小血管に起こり得る血栓性又は塞栓性の閉塞のいずれかであり、ラクナー発作、痴呆、虚血性心疾患（虚血性心筋症含む）、末梢血管疾患、血管内凝固症候群、小血管炎、虚血性神経障害、虚血性網膜症、虚血性胃疾患（小腸大腸虚血含む）、広汎性肺塞栓症及び血管性インポテンス等を臨床的に呈する小血管閉塞を含む。
【０１８４】
好ましくは、小血管閉塞は脳内に発生し、臨床的にはラクナー発作を呈する小血管閉塞を含む。
【０１８５】
既に述べたように、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の一方若しくは両方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在を前記被験者において決定するためには、当業界で知られている好ましい方法を用いることができる。
【０１８６】
ＤＮＡは被験者から当業界で知られている好ましい方法によって単離することができる。被験者の静脈全血からゲノムＤＮＡを単離する好ましい方法は、Millerら、（１９８８） Nucleic Acids Research １６（３）:１２１５に記載されている。
【０１８７】
組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の一方若しくは両方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異を決定するには、ＤＮＡ塩基配列決定法（マニュアル或いは自動蛍光塩基配列決定）を用いて突然変異を検出することができる。
【０１８８】
ＤＮＡ配列分析を用いて突然変異を特定する場合には、一対立遺伝子に突然変異の存在が見出されるということは（即ち被験者が突然変異についてヘテロ接合性）、ＤＮＡ配列中の関連する位置に二個のヌクレオチド（Ｃ及びＴ）が存在することとなる。正常な対立遺伝子に対してホモ接合性或いは突然変異に対してホモ接合性である、被験者から取り出したＤＮＡ配列であれば、ＤＮＡ配列中の関連する位置において相当する一ヌクレオチドの存在のみを得ることとなる。
【０１８９】
突然変異の塩基配列決定のための好ましいテンプレートを提供するには、被験者から単離されたゲノムＤＮＡの領域を適切に設計したプライマーを用いて増幅することができる。適切なプライマーとの配列決定反応及びＤＮＡ配列の分析は当業界で知られた好ましい方法によって行うことができる。増幅の好ましい領域は、配列番号１のヌクレオチド１８４０〜２２４５の領域である。
【０１９０】
また、突然変異の存在は、被験者から単離されたＤＮＡから野生型対立遺伝子又は突然変異を有する対立遺伝子のいずれかのみを増幅する配列特異的プライマーを用いて決定することができる。繰り返すが、ＷＴ及びＳＮＰプライマーでの増幅に好ましいｔＰＡ遺伝子座の領域は、配列番号１のヌクレオチド１８４０〜２２４５の領域である。
【０１９１】
好ましくは、正常−７３５１配列を有するｔＰＡ遺伝子座の領域を増幅するために用いるプライマーは配列番号２（５′−ＡＴＴＧＧＣＧＣＡＡＡＣＴＣＣＴＣＡＣＡ−３′）及び配列番号３（５′−ＡＴＧＧＣＴＧＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＧ−３′）であり、−７３５１Ｃ〜Ｔ多型配列を有するｔＰＡ遺伝子座の領域を増幅するために用いるプライマーは配列番号２（５′−ＡＴＴＧＧＣＧＣＡＡＡＣＴＣＣＴＣＡＣＡ−３′）及び配列番号４（５′−ＡＴＧＧＣＴＧＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＡ−３′）である。これらプライマーでｔＰＡ遺伝子座を増幅するための好ましい反応条件は、ＰＴＣ-２００ペルチエサーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を次のＰＣＲサイクルパラメータで使用することを含む：９６℃で２５秒、７０℃で４５秒及び７２℃で４５秒（５サイクル）；９６℃で２５秒、６５℃で５０秒及び７２℃で４５秒（２１サイクル）；９６℃で２５秒、５５℃で６０秒及び７２℃で１２５秒（４サイクル）。
【０１９２】
増幅生成物は当業界で知られている好ましい方法により検出することができる。例えば、増幅生成物をアガロースゲル上に展開し、エチジウムブロミドで染色し視覚化することができる。
【０１９３】
突然変異の特定は、被験者から単離・誘導した核酸から突然変異を含む領域を増幅することを含むことが好ましい。
【０１９４】
突然変異の特定は、被験者から単離・誘導した核酸をレポーター核酸とハイブリッド形成することにより突然変異を検出することも含むことが好ましい。
【０１９５】
本発明はまた、配列番号３に記載の配列からなる単離された核酸又はそのＲＮＡ等価物、或いは配列番号３に記載の配列中に一以上の塩基置換を有する単離された核酸であって、前記核酸はストリンジェントなハイブリッド形成条件下で配列番号３の相補配列とハイブリッド化する核酸を提供する。前記ストリンジェントなハイブリッド形成条件は４２℃における６ｘＳＳＣのハイブリッド形成及び２０℃における２ｘＳＳＣの洗浄を含む。
【０１９６】
本発明の本形態は、配列番号３（５′−ＡＴＧＧＣＴＧＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＧ−３′）に記載の配列からなる単離された核酸又はそのＲＮＡ等価物、或いはこの配列中に一以上の塩基置換を有する単離された核酸であって、前記核酸はストリンジェントなハイブリッド形成条件下で配列番号３の相補配列とハイブリッド化する核酸に関する。前記ストリンジェントなハイブリッド形成条件は４２℃における６ｘＳＳＣのハイブリッド形成及び２０℃における２ｘＳＳＣの洗浄を含む。
【０１９７】
核酸は当業界において知られている標準的な方法により合成することができる。例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Steinらの方法（Steinら、（１９８８） Nucl. Acids Res. １６: ３２０９に記載）により合成することができる。
【０１９８】
ストリンジェントなハイブリッド形成条件とは、Ｔｍ（Ｔｍ：融点）付近からＴｍより約２０℃低い範囲において相補的な核酸がお互いに結合しあうことを許容する条件である。
【０１９９】
相補領域の長さ、核酸類（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成物）の種類及び組成、塩類及び他の成分の濃度（例えばホルムアミド、デキストラン、デキストラン硫酸、及び／又ポリエチレングリコールの有無）等の諸因子は全て考慮する必要がある。これらは基本的には、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. （１９８９）に記載されている。
【０２００】
例えば、核酸をストリンジェントなハイブリッド形成条件下で配列番号３の相補配列とハイブリッド化せしめる条件は次のようになる。プレハイブリッド化をプレハイブリッド化溶液（例えば６ＸＳＳＣ（１ｘ＝１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、５Ｘデンハール試薬（各１ｇ／Ｌのフィコール、ポリビニルピロリドン及びウシ血清アルブミン）、１.０％ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍＬ変性フラグメント化サケ精子ＤＮＡ）中で２〜１２時間行うことができる。続いてターゲット（即ちフィルター）とプローブとのハイブリッド化を、条件（６ＸＳＳＣ、１.０％ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍＬ変性フラグメント化サケ精子ＤＮＡ、４２℃）下で一夜行うことができる。このフィルターを２ＸＳＳＣ及び０.５％ＳＤＳを用い室温で１５分（２０℃）で洗浄することができる。
【０２０１】
本発明はまた、配列番号４に記載の配列からなる単離された核酸又はそのＲＮＡ等価物、或いは配列番号４に記載の配列中に一以上の塩基置換を有する単離された核酸であって、前記核酸はストリンジェントなハイブリッド形成条件下で配列番号４の相補配列とハイブリッド化する核酸を提供する。前記ストリンジェントなハイブリッド形成条件は４２℃における６ｘＳＳＣのハイブリッド形成及び２０℃における２ｘＳＳＣの洗浄を含む。
【０２０２】
本発明の本形態は、配列番号４（５′−ＡＴＧＧＣＴＧＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＡ−３′）に記載の配列からなる単離された核酸又はそのＲＮＡ等価物、或いはこの配列中に一以上の塩基置換を有する単離された核酸であって、前記核酸はストリンジェントなハイブリッド形成条件下で配列番号４の相補配列とハイブリッド化する核酸に関する。前記ストリンジェントなハイブリッド形成条件は４２℃における６ｘＳＳＣのハイブリッド形成及び２０℃における２ｘＳＳＣの洗浄を含む。
【０２０３】
核酸は当業界において知られている標準的な方法により合成することができる。例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Steinらの方法（Steinら、（１９８８） Nucl. Acids Res. １６: ３２０９に記載）により合成することができる。
【０２０４】
ストリンジェントなハイブリッド形成条件とは、Ｔｍ（Ｔｍ：融点）付近からＴｍより約２０℃低い範囲において相補的な核酸がお互いに結合しあうことを許容する条件である。
【０２０５】
相補領域の長さ、核酸類（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成物）の種類及び組成、塩類及び他の成分の濃度（例えばホルムアミド、デキストラン、デキストラン硫酸、及び／又ポリエチレングリコールの有無）等の諸因子は全て考慮する必要がある。これらは基本的には、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. （１９８９）に記載されている。
【０２０６】
例えば、核酸をストリンジェントなハイブリッド形成条件下で配列番号４の相補配列とハイブリッド化せしめる条件は次のようになる。プレハイブリッド化をプレハイブリッド化溶液（例えば６ＸＳＳＣ（１ｘ＝１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、５Ｘデンハール試薬（各１ｇ／Ｌのフィコール、ポリビニルピロリドン及びウシ血清アルブミン）、１.０％ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍＬ変性フラグメント化サケ精子ＤＮＡ）中で２〜１２時間行うことができる。続いてターゲット（即ちフィルター）とプローブとのハイブリッド化を、条件（６ＸＳＳＣ、１.０％ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍＬ変性フラグメント化サケ精子ＤＮＡ、４２℃）下で一夜行うことができる。その後、このフィルターを２ＸＳＳＣ及び０.５％ＳＤＳを用い室温で１５分（２０℃）で洗浄することができる。
【０２０７】
本発明はまた、配列番号３に記載の配列中に一以上の塩基置換を有する単離された核酸であって、前記核酸は配列番号３と８０％以上の相同性を有する核酸又はそのＲＮＡ等価物を提供する。
【０２０８】
本発明の本形態は、配列番号３に記載の配列中に一以上の塩基置換を有する単離された核酸であって、前記核酸は配列番号３と８０％以上の相同性を有する核酸又はそのＲＮＡ等価物に関する。
【０２０９】
二種の核酸配列の相同性の程度を決定するための種々のアルゴリズムが存在する。例えばＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて二種の配列間の配列相同性の程度を決定することができる。ＢＬＡＳＴは二種の配列間ローカルアラインメントを特定し、偶然発生したローカルアラインメントの可能性を予知する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、Altschulら、１９９０, J. Mol. Biol. ２１５:４０３〜４１０に記載されている。
【０２１０】
好ましくは、前記核酸又はそのＲＮＡ等価物は配列番号３と９０％以上の相同性を有する。更に好ましくは、前記核酸又はそのＲＮＡ等価物は配列番号３と９５％以上の相同性を有する。
【０２１１】
核酸は当業界において知られている標準的な方法により合成することができる。例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Steinらの方法（Steinら、（１９８８） Nucl. Acids Res. １６: ３２０９に記載）により合成することができる。
【０２１２】
本発明はまた、配列番号４に記載の配列中に一以上の塩基置換を有する単離された核酸であって、前記核酸又はそのＲＮＡ等価物は配列番号４と８０％以上の相同性を有する核酸を提供する。
【０２１３】
本発明の本形態は、配列番号４に記載の配列中に一以上の塩基置換を有する単離された核酸であって、前記核酸又はそのＲＮＡ等価物は配列番号４と８０％以上の相同性を有する核酸に関する。
【０２１４】
繰り返すが、二種の核酸配列の相同性の程度を決定するための種々のアルゴリズムが存在する。例えばＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて二種の配列間の配列相同性の程度を決定することができる。ＢＬＡＳＴは二種の配列間ローカルアラインメントを特定し、偶然発生したローカルアラインメントの可能性を予知する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、Altschulら、１９９０, J. Mol. Biol. ２１５:４０３〜４１０に記載されている。
【０２１５】
好ましくは、前記核酸又はそのＲＮＡ等価物は配列番号４と９０％以上の相同性を有する。更に好ましくは、前記核酸又はそのＲＮＡ等価物は配列番号４と９５％以上の相同性を有する。
【０２１６】
核酸は当業界において知られている標準的な方法により合成することができる。例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Steinらの方法（Steinら、（１９８８） Nucl. Acids Res. １６: ３２０９に記載）により合成することができる。
【０２１７】
本発明はまた、細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を増大可能な剤を特定する方法であって、前記方法は（ａ）細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を低下させる突然変異を含む細胞に剤を作用させる段階と、（ｂ）前記剤を作用させた細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を測定する段階と（ｃ）前記剤を、細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を増大可能な剤と特定する段階とを含む方法を提供する。
【０２１８】
本発明の本形態は、細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を増大可能な剤を特定する方法に関する。このようにして特定された剤は、被験者が虚血性発作又は小血管閉塞、特にラクナー発作に罹る可能性を低減するために被験者に投与するための化合物候補である。
【０２１９】
この剤は、組織プラスミノーゲン活性化因子の細胞からの放出速度を増大させる能力を決定すべき剤のいずれかである。
【０２２０】
「作用させる」とは、剤を細胞外部から投与することと、細胞内で剤を発現させることとをその範囲に含むと理解されたい。従って、剤を細胞に作用させるとは、細胞に剤を接触させること、即ち例えば、細胞内で剤の発現を指向し得る組み換え核酸を用いて細胞を形質転換することであってもよい。
【０２２１】
細胞は、突然変異を有さない同様の細胞と比較した場合に、細胞組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を低減させる突然変異を有する細胞のいずれかである。
【０２２２】
この細胞は好ましくは内皮細胞である。ヒト内皮細胞が最も好ましい。好ましい内皮細胞は、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）である。
【０２２３】
細胞内の突然変異は、細胞からのｔＰＡの放出速度を低下させる突然変異のいずれかである。例えば、ｔＰＡ遺伝子座に関連しない遺伝子又は領域の突然変異でもよい。或いは、ｔＰＡ遺伝子座における突然変異でもよく、その例としては、ｔＰＡ遺伝子の転写に影響を及ぼすｔＰＡコード領域上流における突然変異や、ｔＰＡ遺伝子のエクソンにおける突然変異、エンハンサーエレメントにおける突然変異、スプライシングに影響を及ぼすイントロンにおける突然変異、翻訳又はｍＲＮＡの安定性に影響を及ぼすｔＰＡの３′領域における突然変異が挙げられる。
【０２２４】
突然変異は特定遺伝子の対立遺伝子の一方にあっても両方にあってもよい。
【０２２５】
好ましくは、内皮細胞からのｔＰＡの放出速度を低減させる、ｔＰＡ遺伝子座における突然変異である。
【０２２６】
突然変異の組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を低減させる能力は、当業界で知られた好ましい方法によって確認することができる。例えば、ｔＰＡ遺伝子座の特定の突然変異が内皮細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を低減させる能力は、突然変異を有する内皮細胞をインビトロで培養し、内皮細胞からのｔＰＡ放出速度を決定し、更に前記細胞を新鮮な媒体で洗浄し、その媒体へのｔＰＡの放出速度の時間変化の程度を野生型内皮細胞と比較して決定することにより、決定することができる。内皮細胞からのｔＰＡの放出を誘起するためには、当業界において内皮細胞からのｔＰＡの分泌を誘起することが知られているトロンビンやカルシウムイオノホア等の剤を用いることができる。インビトロにおいて内皮細胞からのｔＰＡの放出を誘起する好ましい方法はRosnobletら、（１９９９）Arterioscler Thromb Vasc Biol. １９（７）:１７９６〜８０３に記載されている。
【０２２７】
酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）（例えばＴｉｎｔＥｌｉｚｅ(R)ｔ−ＰＡ、ＢｉｏｐｏｏｌＡＢ）によって全ｔＰＡ抗原を定量することができる。この種のアッセイは二重抗体原理を基礎とする。遊離ｔＰＡとｔＰＡ−インヒビター複合体とは同程度の効率で検出される。
【０２２８】
細胞中の突然変異はｔＰＡ遺伝子座の上流領域に存在する突然変異であることが好ましい。更に好ましくは、突然変異はｔＰＡ遺伝子座のエンハンサーエレメントにおける突然変異である。最も好ましくは、突然変異はｔＰＡ遺伝子座の上流領域の−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異である。
【０２２９】
−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異は、ｔＰＡ遺伝子座の対立遺伝子に一方にあっても両方にあってもよい。
【０２３０】
従って、本発明はまた、好ましい形態において、細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を増大可能な剤を特定する方法であって、前記方法は（ａ）組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の一方若しくは両方の対立遺伝子の−７３５１位にシトシンからチミンへの多型を含む細胞に剤を作用させる段階と、（ｂ）前記剤を作用させた細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を測定する段階と（ｃ）前記剤を、細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を増大可能な剤と特定する段階とを含む方法を提供する。
【０２３１】
最も好ましくは、−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異は、ｔＰＡ遺伝子座の対立遺伝子に両方に存在する。
【０２３２】
細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子放出速度向上剤の能力は、細胞に作用させる剤の濃度に依存することは理解されよう。従って、剤を好ましい濃度で細胞に作用させて、その濃度における細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を増大させる能力を調べる。
【０２３３】
内皮細胞からのｔＰＡの放出速度向上剤としては、モノナトリウム［２-（６-ヒドロキシナフタレン−２−イル）−６−メチル−ピリジン−４−イルオキシ］アセテートジハイドレート（ＪＴＶ−９２６）（Ueshimaら、（２００２） "Function of tissue-type plasminogen activator releaser on vascular endotherial cells in thrombolysis in vivo" Thrombosis Haemostasis ８７:１０６９〜７４）が知られている。
【０２３４】
細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度は、当業界で知られた好ましい方法によって決定することができる。例えば、ある剤が内皮細胞からのｔＰＡの放出速度を変化させる能力は、内皮細胞をインビトロで培養し、内皮細胞からのｔＰＡ放出速度をその剤の存在又は非存在下において決定する。放出速度を決定するには、前記細胞を新鮮な媒体で洗浄し、その媒体へのｔＰＡの放出速度の時間変化の程度を決定する。内皮細胞からのｔＰＡの放出を誘起するためには、当業界において内皮細胞からのｔＰＡの放出を誘起することが知られているトロンビンやカルシウムイオノホア等の剤を用いることができる。インビトロにおいて内皮細胞からのｔＰＡの放出を誘起する好ましい方法はRosnobletら、（１９９９）Arterioscler Thromb Vasc Biol. １９（７）:１７９６〜８０３に記載されている。
【０２３５】
酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）（例えばＴｉｎｔＥｌｉｚｅ(R)ｔ−ＰＡ、ＢｉｏｐｏｏｌＡＢ）によって全ｔＰＡ抗原を定量することができる。この種のアッセイは二重抗体原理を基礎とする。遊離ｔＰＡとｔＰＡ−インヒビター複合体とは同程度の効率で検出される。
【０２３６】
ｔＰＡ放出速度向上剤は、その効果をｔＰＡ放出速度に関して比較して特定することができる。比較対象は、剤が存在しない場合の放出速度及び従来のｔＰＡ放出速度向上剤（例えばＪＴＶ−９２６）である。このようにして特定された、組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を増大する剤は、被験者が虚血性発作（特にラクナー発作）又は小血管閉塞に罹る可能性を低減するために被験者に投与するための化合物候補である。
【０２３７】
本発明はまた、細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を増大可能な剤を特定する方法であって、前記方法は、（ａ）組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の全部又は一部を形質転換した細胞であって、前記形質転換した遺伝子座は−７３５１位にシトシンからチミンへの突然変異を含み且つ前記形質転換した遺伝子座はレポーター遺伝子の発現を制御する細胞に剤を作用させる段階と、（ｂ）前記剤を作用させた細胞におけるレポーター遺伝子の発現レベルを決定する段階と、（ｃ）前記レポーター遺伝子の発現を増大可能な剤を特定する段階と、（ｄ）前記レポーター遺伝子の発現を増大可能な剤を、細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を増大可能な剤と特定する段階とを含む方法を提供する。
【０２３８】
本発明の本形態は、細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を増大可能な剤を特定する方法に関する。このようにして特定された剤は、被験者が虚血性発作（特にラクナー発作）又は小血管閉塞に罹る可能性を低減するために被験者に投与するための化合物候補である。
【０２３９】
本細胞は、−７３５１位にシトシンからチミンへの突然変異を有し且つ好ましいレポーター遺伝子の発現を制御する組織プラスミノーゲン遺伝子座の全部又は一部を形質転換した細胞のいずれかである。
【０２４０】
形質転換できる好ましい細胞の例としては、内皮細胞（例えばＨＵＶＥＣ、ウシ大動脈内皮細胞等）やＨｅＬａ細胞が挙げられる。
【０２４１】
好ましくは、形質転換細胞は内皮細胞である。更に好ましくは、形質転換細胞はヒト内皮細胞である。最も好ましくは、内皮細胞はＨＵＶＥＣである。
【０２４２】
レポーター遺伝子の発現を駆動するｔＰＡ遺伝子座の全部又は一部をコードするＤＮＡは適切なヒトゲノムクローンから誘導することができ、そのクローンは当業界で知られた好ましい方法で製造される。
【０２４３】
例えば、−７３５１位にＣ〜Ｔ突然変異を有するｔＰＡ遺伝子座は、当該ゲノムＤＮＡを制限酵素（例えばＳａｕ ３Ａ１）でＤＮＡを部分消化し、ラムダ若しくはコスミッドベクター（Sambrook J, Fritsch, E. F. and Maniatis, T. Molecular Cloning : A Laboratory Manual ２nd. ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. （１９８９）に記載）へショットガンクローニングすることによりクローニングすることができる。このライブラリーは適切なプローブ（例えばラベルされたオリゴヌクレオチド又はｔＰＡ遺伝子座の上流領域から得たニック翻訳断片）を用いてスクリーンされることにより適切なクローンと単離することができる（Sambrookら、（１９９８）に記載）。
【０２４４】
また、ｔＰＡ遺伝子座の全部又は一部は、ゲノムＤＮＡから適切なプライマーを用いてＰＣＲ増幅により発生させることができる（Dieffenbach, C. W. and G. S. Dveksler （１９９５） PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N. Y.に記載）。
【０２４５】
組織プラスミノーゲン遺伝子座の一部をレポーター遺伝子発現の制御に用いる場合には、ｔＰＡ遺伝子座の一部における内皮細胞において適切な発現を制御する能力が決定される。例えば、組織プラスミノーゲン遺伝子座の一部がトロンビン又はカルシウムイオノホアの処理に応答してレポーター遺伝子の発現を誘起する能力が決定される。
【０２４６】
続いてクローニング領域を含むＤＮＡを標準的なクローニングプロトコールにより適切なレポーター遺伝子に融合させることができる（Sambrook, J, Fritsch, E. F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual ２nd. ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.（１９８９）に記載）。
【０２４７】
好ましいレポーター遺伝子に例としては、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、緑蛍光タンパク質（及びその変異種）及びルシフェラーゼが挙げられる。
【０２４８】
レポーター遺伝子構築物の内皮細胞へのトランスフェクションは、グリセロールショックを含めたリン酸カルシウム沈澱法を含む当業界で知られた好ましい方法により行うことができる（Sambrook, J, Fritsch, E. F. and Maniatis, T. Molecular Cloning : A Laboratory Manual ２nd. ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.（１９８９）に記載）。曝露後の細胞を収穫することができ、レポーター遺伝子活性の相対的変化を定量することができる。
【０２４９】
ｔＰＡ遺伝子座から駆動される発現を誘起するためには、トロンビン又はカルシウムイオノホア等のｔＰＡの放出を誘起することが当業界で知れれた剤を使用することができる。好ましい方法は、Rosnobletら、（１９９９） Arterioscler Thromb Vasc Biol. １９ （７）:１７９６〜８０３に記載されている。
【０２５０】
トランスフェクションの効率は、サイトメガロウイルスプロモーターやｌａｃＺ遺伝子構築物等の適切な制御構築物を細胞にコトランスフェクトさせることにより評価することもできる。続いてβ−ガラクトシダーゼアッセイを、Sambrook, J, Fritsch, E. F. and Maniatis, T. Molecular Cloning : A Laboratory Manual ２nd. ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.（１９８９）に記載されているとおりに行うことができ、トランスフェクション効率の直接的指標を得ることができ、種々の実験においてレポーター遺伝子活性をノーマライズするために用いる。
【０２５１】
続いて、レポーター遺伝子の発現を増大可能な剤の細胞からのｔＰＡ放出速度を増大させる能力を調べる。レポーター遺伝子の発現を増大させる剤の能力は、細胞に作用させる剤の濃度に依存することは理解されよう。従って、剤を好ましい濃度で細胞に作用させて、その濃度におけるレポーター遺伝子の発現を増大させる剤の能力を調べる。
【０２５２】
剤が有する細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を増大させる能力は、当業界で知られた好ましい方法によって確認することができる。例えば、内皮細胞（ｔＰＡ遺伝子座の−７３５１位にＣ〜Ｔ突然変異があっても無くても）からのｔＰＡの放出速度向上剤の能力は、内皮細胞をインビトロで培養し、剤の存在下及び非存在下における内皮細胞からのｔＰＡ放出速度を決定することにより決定することができる。放出速度を決定するには、前記細胞を新鮮な媒体で洗浄し、その媒体へのｔＰＡの放出速度の時間変化の程度を決定する。内皮細胞からのｔＰＡの放出を誘起するためには、当業界において内皮細胞からのｔＰＡの分泌を誘起することが知られているトロンビンやカルシウムイオノホア等の剤を用いることができる。インビトロにおいて内皮細胞からのｔＰＡの放出を誘起する好ましい方法はRosnobletら、（１９９９）Arterioscler Thromb Vasc Biol. １９（７）:１７９６〜８０３に記載されている。
【０２５３】
酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）（例えばＴｉｎｔＥｌｉｚｅ(R)ｔ−ＰＡ、ＢｉｏｐｏｏｌＡＢ）によって全ｔＰＡ抗原を定量することができる。この種のアッセイは二重抗体原理を基礎とする。遊離ｔＰＡとｔＰＡ−インヒビター複合体とは同程度の効率で検出される。
【０２５４】
内皮細胞からのｔＰＡの放出速度向上剤としては、モノナトリウム［２-（６-ヒドロキシナフタレン−２−イル）−６−メチル−ピリジン−４−イルオキシ］アセテートジハイドレート（ＪＴＶ−９２６）（Ueshimaら、（２００２） "Function of tissue-type plasminogen activator releaser on vascular endotherial cells in thrombolysis in vivo" Thrombosis Haemostasis ８７:１０６９〜７４）が知られている。
【０２５５】
本発明はまた、組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を増大させる剤を用いて治療するために好適な被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン遺伝子座の両対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの多型の存在を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【０２５６】
被験者は、男性か女性のヒト被験者のいずれかであり、組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を増大させる剤を用いて治療することが有益であろう被験者である。好ましい被験者はコーカソイド起源のヒトである。
【０２５７】
この点に関し、組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を増大させる剤を用いる治療が役に立つであろう被験者は、虚血性発作又は小血管閉塞にリスクが高い、特にラクナー発作にリスクが高い被験者である。
【０２５８】
好ましくは、治療に好適な被験者は、組織プラスミノーゲン遺伝子座の両対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの多型を有する。
【０２５９】
従って、本発明はまた、好ましい形態において、組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を増大させる剤を用いて治療するために好適な被験者を特定する方法であって、組織プラスミノーゲン遺伝子座の両対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの多型の存在を前記被験者において特定する段階を含む方法を提供する。
【０２６０】
内皮細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度向上剤の一例は、モノナトリウム［２-（６-ヒドロキシナフタレン−２−イル）−６−メチル−ピリジン−４−イルオキシ］アセテートジハイドレート（ＪＴＶ−９２６）（Ueshimaら、（２００２） "Function of tissue-type plasminogen activator releaser on vascular endotherial cells in thrombolysis in vivo" Thrombosis Haemostasis ８７:１０６９〜７４）である。
【０２６１】
組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の一方若しくは両方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在を前記被験者における特定は、当業界で知られた好ましい方法により行うことができる。
【０２６２】
ＤＮＡは被験者から当業界で知られている好ましい方法によって単離することができる。被験者の静脈全血からゲノムＤＮＡを単離する好ましい方法は、Millerら、（１９８８） Nucleic Acids Research １６（３）:１２１５に記載されている。
【０２６３】
組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の一方若しくは両方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在の特定は、ＤＮＡ塩基配列決定法（マニュアル或いは自動蛍光塩基配列決定）を用いて突然変異を検出することができる。
【０２６４】
ＤＮＡ配列分析を用いて突然変異を特定する場合には、一対立遺伝子に突然変異の存在が見出されるということは（即ち被験者が突然変異についてヘテロ接合性）、ＤＮＡ配列中の関連する位置に二個のヌクレオチド（Ｃ及びＴ）が存在することとなる。正常な対立遺伝子に対してホモ接合性、或いは突然変異に対してホモ接合性である、被験者から取り出したＤＮＡ配列であれば、ＤＮＡ配列中の関連する位置において相当する一ヌクレオチドのみを得ることとなる。
【０２６５】
突然変異の塩基配列決定のための好ましいテンプレートを提供するには、被験者から単離されたゲノムＤＮＡの領域を適切に設計したプライマーを用いて増幅することができる。適切なプライマーとの配列決定反応及びＤＮＡ配列の分析は当業界で知られた好ましい方法によって行うことができる。増幅の好ましい領域は、配列番号１のヌクレオチド１８４０〜２２４５の領域である。
【０２６６】
突然変異の存在は、被験者から単離されたＤＮＡから野生型対立遺伝子又は突然変異を有する対立遺伝子のいずれかのみを増幅する配列特異的プライマーを用いて決定することができる。繰り返すが、ＷＴ及びＳＮＰプライマーでの増幅に好ましいｔＰＡ遺伝子座の領域は、配列番号１のヌクレオチド１８４０〜２２４５の領域である。
【０２６７】
好ましくは、正常−７３５１配列を有するｔＰＡ遺伝子座の領域を増幅するために用いるプライマーは配列番号２（５′−ＡＴＴＧＧＣＧＣＡＡＡＣＴＣＣＴＣＡＣＡ−３′）及び配列番号３（５′−ＡＴＧＧＣＴＧＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＧ−３′）であり、−７３５１Ｃ〜Ｔ多型配列を有するｔＰＡ遺伝子座の領域を増幅するために用いるプライマーは配列番号２（５′−ＡＴＴＧＧＣＧＣＡＡＡＣＴＣＣＴＣＡＣＡ−３′）及び配列番号４（５′−ＡＴＧＧＣＴＧＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＡ−３′）である。これらプライマーでｔＰＡ遺伝子座を増幅するための好ましい反応条件は、ＰＴＣ-２００ペルチエサーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を次のＰＣＲサイクルパラメータで使用することを含む：９６℃で２５秒、７０℃で４５秒及び７２℃で４５秒（５サイクル）；９６℃で２５秒、６５℃で５０秒及び７２℃で４５秒（２１サイクル）；９６℃で２５秒、５５℃で６０秒及び７２℃で１２５秒（４サイクル）。
【０２６８】
増幅生成物は当業界で知られている好ましい方法により検出することができる。例えば、増幅生成物をアガロースゲル上に展開し、エチジウムブロミドで染色し視覚化することができる。
【０２６９】
突然変異の特定は、被験者から単離・誘導した核酸から突然変異を含む領域を増幅することを含むことが好ましい。
【０２７０】
突然変異の特定は、被験者から単離・誘導した核酸をレポーター核酸とハイブリッド形成することにより突然変異を検出することも含むことが好ましい。
【０２７１】
本発明はまた、被験者の小血管閉塞に関連する疾病又は状態の治療方法であって、前記被験者における組織プラスミノーゲン活性化因子放出速度向上剤を前記被験者の治療に有効な量投与する段階を含む方法を提供する。
【０２７２】
被験者は、小血管閉塞に関連する疾病又は状態に罹りやすい若しくは罹患している被験者のいずれかである。
【０２７３】
従って、本発明は他の形態において、小血管閉塞に関連する疾病又は状態に罹りやすい被験者の治療方法であって、前記被験者における組織プラスミノーゲン活性化因子放出速度向上剤を前記被験者の治療に有効な量投与する段階を含む方法を提供する。
【０２７４】
小血管閉塞に関連する疾病又は状態の例としては、ラクナー発作、痴呆、虚血性心疾患（虚血性心筋症含む）、末梢血管疾患、血管内凝固症候群、小血管炎、虚血性神経障害、虚血性網膜症、虚血性胃疾患（小腸大腸虚血含む）、広汎性肺塞栓症及び血管性インポテンスが挙げられる。
【０２７５】
好ましくは、小血管閉塞に関連する疾病又は状態は脳内に発生し、ラクナー発作を含む
【０２７６】
従って、本発明はまた、好ましい形態において、被験者のラクナー発作の治療方法であって、前記被験者における組織プラスミノーゲン活性化因子放出速度向上剤を前記被験者の治療に有効な量投与する段階を含む方法を提供する。
【０２７７】
本発明は他の形態において、ラクナー発作に罹りやすい被験者の治療方法であって、前記被験者における組織プラスミノーゲン活性化因子放出速度向上剤を前記被験者の治療に有効な量投与する段階を含む方法を提供する。
【０２７８】
この剤は、被験者に投与した際にｔＰＡの放出速度を増大可能な剤である。ｔＰＡの放出速度を増大可能な剤の一例は、モノナトリウム［２-（６-ヒドロキシナフタレン−２−イル）−６−メチル−ピリジン−４−イルオキシ］アセテートジハイドレート（ＪＴＶ−９２６）（Ueshimaら、（２００２） "Function of tissue-type plasminogen activator releaser on vascular endotherial cells in thrombolysis in vivo" Thrombosis Haemostasis ８７:１０６９〜７４）である。
【０２７９】
被験者に投与されるべきｔＰＡ放出速度向上剤の有効量は、その剤が一般に薬理的有用性又は治療効果を示す量や形態の範囲内にある限り、特に限定されない。
【０２８０】
これに関し、ｔＰＡ放出速度向上剤の有効量は、被験者内で達成されるべきｔＰＡ放出速度の増加程度、治療されるべき小血管閉塞関連疾病や小血管閉塞関連状態の種類、被験者の年齢及び体重、投与頻度、及びその他活性剤の存在を考慮して、適切に選択されうる。
【０２８１】
ｔＰＡ放出速度向上剤の投与は、被験者のｔＰＡ放出速度向上という点で所望の効果を生じさせるのに適切であれば如何なる時に行っても良く(within any time)、剤は、経口、非経口或いはその他適切な手段により投与される。その際、薬物の移行時間(transit time)を考慮すべきである。
【０２８２】
ｔＰＡ放出速度を向上させる剤の投与においては、投与されるｔＰＡ放出速度向上剤の実際の物理的、化学的特性を考慮し、医薬的に許容される塩、アミノ酸、ポリペプチド、ポリマー類、溶剤、緩衝剤、賦形剤、増量剤等、医薬的に許容される添加剤の一種以上を使用することができる。
【０２８３】
例えば、ｔＰＡ放出速度向上剤は、水性液、油性調製物、脂肪エマルジョン、エマルジョン、ゲル等の各種製薬形態に製剤することができる。これらの製剤は、筋注剤や皮下注射剤、臓器への注射剤、或いは包埋剤の他、鼻腔、直腸、子宮、膣、肺等の経粘膜剤として投与することができる。このような組成物は、経口薬（例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤等の固形製剤、シロップ、乳剤、懸濁剤等の液状製剤）として投与しても良い。ｔＰＡ放出速度向上剤を含有する組成物は、保存剤、或いは安定剤、分散剤、ｐＨ調整剤、等張剤を含有することができる。保存剤としては、グリセリン、プロピレングリコール、フェノール、ベンジルアルコール等が好ましい。安定剤としては、デキストラン、ゼラチン、α−トコフェロール酢酸、或いはα−チオグリセリン等が好ましい。好適な分散剤としては、ポリオキシエチレン（２０）やソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０）、ソルビタンセスキオレエート（Ｓｐａｎ３０）、ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８）、ポリオキシエチレン水添ひまし油６０等が挙げられる。好適なｐＨ調整剤としては、塩酸や水酸化ナトリウム等が挙げられる。好適な等張剤としては、グルコースやＤ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール等が挙げられる。
【０２８４】
ｔＰＡ放出速度向上剤の投与は、ｔＰＡ放出速度向上剤の物理的性質及び化学的性質を考慮し、薬学的に許容される担体や希釈剤、賦形剤、懸濁剤、滑沢剤、補助剤、ビヒクル、送達系、乳化剤、崩壊剤、吸収剤、保存剤、界面活性剤、着色剤、矯臭剤、矯味剤を含有する組成物の形態で行うこともできる。
【０２８５】
上述の目的のため、組成物は経口的或いは非経口的に、非毒性の薬学的に許容される従来の担体を含有する剤形で埋込み型容器（implanted reservoir）を介して吸入スプレー、吸着、吸収、局所的、経直腸的、経鼻的、口腔的、経膣的、経心室的（intraventricularly）に投与することができ、或いは他の都合のよい剤形によって投与することができる。本明細書において非経口的という用語は、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、髄腔内、心室内、胸骨内、頭蓋内での注射或いは注入技法を含む。
【０２８６】
非経口投与の場合、組成物は通常、薬学的に許容される担体と組み合わせ、単位投与量の滅菌注射剤形態（溶液、懸濁液或いはエマルジョン）とされるが、これはレシピエントの血液と等張であることが好ましい。このような滅菌注射剤形態としては、滅菌した注射用水性懸濁液或いは油性懸濁液を挙げることができる。このような懸濁液は、当業界で公知の技法に従い、好適な分散剤或いは湿潤剤、及び懸濁液を用いて調製できる。滅菌注射剤形態はまた、非毒性で非経口的に許容される希釈剤或いは溶媒の滅菌した注射用溶液或いは懸濁液（例えば、１，３−ブタンジオール溶液）であってもよい。使用可能な許容されるビヒクル及び溶媒としては、水や生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、等張塩化ナトリウム溶液、ハンクス溶液を挙げることができる。なお、溶媒や懸濁化媒体としては従来、滅菌した固定油が用いられている。この目的のため、無刺激性の固定油であれば如何なるものでも用いることができ、合成モノグリセリド類や合成ジグリセリド類、コーン油、綿実油、ピーナッツ油、ごま油等を挙げることができる。エチルオレエートやイソプロピルミリステート、オレイン酸とそのグリセリド誘導体（例えば、オリーブオイルやひまし油、特にこれらがポリオキシエチレン化されたもの）等の脂肪酸が注射剤の調製に有用である。これらの油性溶液或いは油性懸濁液はまた、長鎖アルコール希釈剤或いは分散剤を含有していてもよい。
【０２８７】
担体は微量の添加剤を含有していてもよく、このような添加剤としては溶解性や等張性、化学的安定性を向上させる物質（例えば抗酸化剤や緩衝剤、保存剤）等が挙げられる。
【０２８８】
経口投与の場合、従来の装置及び当技術分野において公知の技法を用いて、組成物は通常、錠剤やカシェ剤（cachets）、粉末、顆粒、ビーズ、チュアブルロゼンジ（chewable lozenges）、カプセル、液状、水性懸濁液、水性溶液等の単位投与量の剤形、その他の剤形に調製される。このような形状は通常、固形担体や半固形担体、液状担体を含む。担体の例としては、ラクトースやデキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アラビアゴム、リン酸カルシウム、ミネラルオイル、ココアバター、テオブロマ油（oil of theobroma）、アルギン酸、トラガカント、ゼラチン、シロップ、メチルセルロース、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム等を挙げることができる。
【０２８９】
錠剤は、活性成分を、必要に応じ一以上の補助成分と共に圧縮や成型に付すことにより製造される。圧縮錠剤は、適切な機械を利用して、粉末や顆粒等の自由流動形態にある活性成分を必要に応じ結合剤や潤滑剤、不活性希釈剤、界面活性剤、分散剤等と混合した上で、圧縮することによって調製される。成型錠剤は、適切な機械を利用して、粉状の活性成分と不活性希釈剤液で湿らせた適切な担体との混合物を成型することによって製造される。
【０２９０】
ｔＰＡ放出速度向上剤の投与にあたっては、放出速度制御技術も利用することができる。ｔＰＡ放出速度向上剤は、徐放性医薬として投与することもできる。徐放効果を更に高めるため、本組成物は、植物油（例えば大豆油、ごま油、ツバキ油、ひまし油、ピーナツ油、菜種油）や中鎖脂肪酸トリグリセリド、脂肪酸エステル（エチルオレエートなど）；ポリシロキサン誘導体等の付加的成分と共に、或いはヒアルロン酸やその塩（重量平均分子量：約８０，０００〜２，０００，０００）、カルボキシメチルセルロース−Ｎａ（重量平均分子量：約２０，０００〜４００，０００）、ヒドロキシプロピルセルロース（２％水溶液の粘度：３〜４，０００ｃｐｓ）、アテロコラーゲン（重量平均分子量：約３００，０００）、ポリエチレングリコール（重量平均分子量：約４００〜２０，０００）、ポリエチレンオキサイド（重量平均分子量：約１００，０００〜９，０００，０００）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（１％水溶液の粘度：４〜１００，０００ｃＳｔ）、メチルセルロース（２％水溶液の粘度：１５〜８，０００ｃＳｔ）、ポリビニルアルコール（粘度：２〜１００ｃＳｔ）、ポリビニルピロリドン（重量平均分子量：２５，０００〜１，２００，０００）等の水溶性高分子化合物と共に製剤化することができる。
【０２９１】
あるいは、本ｔＰＡ放出速度向上剤は、幾日かの期間に亘り制御された放出を持続させるため、疎水性のポリマーマトリックスに担持させることもできる。本発明組成物は次いで固形インプラントや外用の貼付剤等、該ｔＰＡ放出速度向上剤の効果発現濃度を、再投与を頻繁に行う必要なしに、長期間に亘って達成するのに適切な形態に成型される。このような制御放出フィルムについては当技術分野で周知である。この目的のために用いることができる広く利用されているポリマーの他の例としては、非分解性エチレン−酢酸ビニル共重合体や分解性乳酸−グリコール酸共重合体が挙げられ、これらは外用や内用に用いることができる。ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）やポリ（ビニルアルコール）等、或る種のヒドロゲルも有用であるが、これらは上に述べたポリマーなど他のポリマー放出系より短い放出サイクルに用いられる。
【０２９２】
担体もまた、適切な時間放出特性と放出動力学を有する、固形の生分解性ポリマーや複数の生分解性ポリマーの混合物とすることができる。組成物は次いで、該ｔＰＡ放出速度向上剤の効果発現濃度を、再投与を頻繁に行う必要なく、長期間に亘って達成するのに適切な固形インプラント形態に成型される。ｔＰＡ放出速度向上剤は、当業者に知られた何らかの適切な方法によって生分解性ポリマーや複数の生分解性ポリマーの混合物に添加することができ、生分解性ポリマーと共に均一なマトリックスを形成させたり、或いは該ポリマー内に何らかの方法で包埋させることができる。また、成型によって固形インプラントとすることもできる。
【０２９３】
以下、上述の本発明の一般原則を具現化する実験について例示する。しかしながら、次の記載は上の記載の一般性を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０２９４】
実施例１
ゲノムＤＮＡの単離
ゲノムＤＮＡは、Miller,S.A.、D.D.Dykes、H.F.Polesky（１９８８）による「ヒト有核細胞からの抽出のための簡単な塩析技法 (A simple salting out procedure for extracting from human nucleated cells)」、Nucleic Acids Research １６（３）：１２１５に記載の手順に従い、静脈全血６ｍＬから単離した。
【０２９５】
実施例２
オリゴヌクレオチドプライマー
２種の対立遺伝子特異的リバースプライマーの配列は次の通りである：
ＳＮＰプライマー：５′−ＡＴＧＧＣＴＧＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＧ−３′（配列番号３）
ＷＴプライマー：５′−ＡＴＧＧＣＴＧＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＡ−３′（配列番号４）
フォワードコンセンサスプライマー：５′−ＡＴＴＧＧＣＧＣＡＡＡＣＴＣＣＴＣＡＣＡ−３′（配列番号２）
【０２９６】
ＤＮＡ配列中の各プライマーの相対位置を図１に示す。これらのプライマーにより、ｔＰＡ遺伝子の４０５塩基対のＤＮＡ増幅フラグメント（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ４８４８４の１８４０〜２２４５のヌクレオチド；配列番号１）が得られる。
【０２９７】
ＨＬＡ−ＤＲＢ３遺伝子の６００ｂｐフラグメントをコードする２種のポジティブ対照プライマーの配列は次の通りである。
フォワード（センス）プライマー：５′−ＴＧＣＣＡＡＧＴＧＧＡＧＣＡＣＣＣＡＡ−３′
リバース（アンチセンス）プライマー：５′−ＧＣＡＴＣＴＴＧＣＴＣＴＧＴＧＣＡＧＡＴ−３′
【０２９８】
オリゴヌクレオチドプライマーはいずれもＧｅｎｅｗｏｒｋｓ Ｐｔｙ Ｌｔｄ．製のものを用いた。各プライマーは、オートクレーブで滅菌した脱イオン水で使用形態に戻し、最終濃度を２０００μｇ／ｍＬとした。
【０２９９】
実施例３
遺伝子型の決定
ｔＰＡ遺伝子の４０５塩基対ＤＮＡフラグメント（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ４８４８４；配列番号１の１８４０〜２２４５のヌクレオチド）は、Bunce,M.、C.M.O′Neill、M.C.Barnardoら（１９９５）による、「フォトタイピング：PCR-SSPを利用して１４４種のプライマーミックス (primer mixes) でPCRを行う、HLA-A,B,C,DRB1,DRB3,DRB4,DRB5とDQB1のための明解DNAタイピング (Phototyping:comprehensive DNA typing for HLA-A,B,C,DRB1,DRB3,DRB4,DRB5&DQB1 by PCR with 144 primer mixes utilizing sequence-specific primers (PCR-SSP))」、Tissue Antigens ４６（５）：ｐ．３５５〜３６７に記載の方法に従って、配列特異的プライマーポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ−ＳＳＰ）を用いて増幅した。
【０３００】
ＰＣＲ−ＳＳＰの特異性は、標的ＤＮＡ配列とプライマーの３′末端ヌクレオチドとのマッチングによる。従ってＰＣＲサイクルにおいては、プライマーとＤＮＡテンプレート（多型ヌクレオチドを含む）とがマッチングした場合のみ、Ｔａｑポリメラーゼによる増幅反応が正常に行われる。この原理を利用して、マッチングする３′末端ヌクレオチドを多型部位に有するようなオリゴヌクレオチドプライマーを特異的に作製できる。安定な非多型領域（ＤＮＡ配列上流或いは下流の約３００〜４００塩基対）と相補的なコンセンサスプライマーによって、一塩基多型（ＳＮＰ）を含むセグメントを増幅できる。所定のＰＣＲ条件下では、標的ＤＮＡセグメントは、対立遺伝子特異的なプライマーとコンセンサスプライマーのいずれもがＤＮＡテンプレートと相補的である場合にのみ増幅される。従って、ｓｎｐの有無については、ゲル電気泳動を行いエチジウムブロマイド添加により発色させてＰＣＲ産物を検出し判定できる。Ｔａｑポリメラーゼがエキソヌクレアーゼ活性を欠き、そのためプライマーの３′末端ヌクレオチドのミスマッチを修正できないことから、ＰＣＲ−ＳＳＰを効果的に利用することができる。
【０３０１】
この方法により、多重ＰＣＲ (PCR multiplexing) を容易に行うことができる。多重ＰＣＲでは、更なる他の２種のプライマー（これらは或る別のＤＮＡ部位に相補的である）を同一反応ミックスに含有させて添加する。この研究においては、ＨＬＡ−ＤＲＢ３遺伝子から６００ｂｐＤＮＡフラグメントを生じさせる２個のオリゴヌクレオチドプライマーを各ＰＣＲ−ＳＳＰ反応で増幅させポジティブ対照として用いて、失敗したＰＣＲ反応をネガティブＰＣＲ反応と弁別できるようにした。このような対照がなければ、ホモ接合性を示す結果（即ち、野生型対立遺伝子におけるネガティブ反応）はいずれも信頼性を欠くものとなろう。本法の別の重要な特徴は、プライマーの設計によって、多数の小ボリュームＰＣＲ反応（各反応は或る対立遺伝子に特異的である）が同一のＰＣＲサイクル条件下で起こるということである。本研究における遺伝子タイピングは、９６ウェルＰＣＲプレートを用いて行った。
【０３０２】
（ｉ）ＳＳＰ−ＰＣＲの試薬
試薬 サプライヤー
硫酸アンモニウム ＢＤＨラボラトリーサプライズ
(BDH Laboratory Supplies）
ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ アプライドバイオシステムズ
（５Ｕ／μＬ） （Applied Biosystems）
クレゾールレッド溶液（１０ｍｇ／ｍＬ） フルカ （Fluka）
ｄｎＴＰ′ｓ（ヌクレオチド） アプライドバイオシステムズ
（Applied Biosystems）
塩化マグネシウム（２５ｍＭ） アプライドバイオシステムズ
（Applied Biosystem）
Ｔｒｉｚｍａ Ｂａｓｅ シグマケミカルズ（Sigma Chemicals）
Ｔｗｅｅｎ２０ ＢＤＨラボラトリーサプライズ
（BDH Laboratory Supplies）
【０３０３】
（ｉｉ）オリゴヌクレオチドプライマーの調製
ＨＬＡ−ＤＲＢ３ポジティブ対照プライマー含有プライマーストック液は次のプロトコルを用いて作製した。
オートクレーブ滅菌した脱イオン水８ｍＬ
クレゾールレッド５０μＬ
ＨＬＡ−ＤＲＢ３フォワードプライマー２０μＬ
ＨＬＡ−ＤＲＢ３リバースプライマー２０μＬ
【０３０４】
クレゾールレッドは、酸性のＤＮＡに接すると色が変わる酸塩基指示薬（ピンク色に変わる）であり、これを用いてＤＮＡのコンタミネーションを視覚的に確認できる。この対照用プライマーストック液を１.５ｍＬエッペンドルフチューブに分注し、対立遺伝子特異的プライマー及びコンセンサスプライマーと合わせ最終体積を１ｍＬとする。
【０３０５】
次に、９６ウェルＰＣＲプレートの各ウェルに各プライマーミックス（５μＬ）を入れた。パラフィン油（１０μＬ）を各ウェルに添加し、ＰＣＲのサーマルサイクルにおけるプライマーと試薬の蒸発が最小限となるようにした。
【０３０６】
ｔＰＡ−７３５１Ｃ／Ｔｓｎｐ用のプライマーミックスは、対立遺伝子特異的プライマー（１０μＬ）、コンセンサスプライマー（１０μＬ）、対照プライマーストック液（９８０ｕｏ）を混合し次のように調製した。
【０３０７】
（ｉｉｉ）試薬ミックス
１０×ＰＣＲバッファー
Ｔｒｉｓ Ｂａｓｅ（４０.５６８ｇ）をオートクレーブした水（４００ｍＬ）に溶解させる。
濃塩酸でｐＨを８.９に調整する。
得られた溶液に硫酸アンモニウム（１０.９６ｇ）を溶解させる。
オートクレーブする。
Ｔｗｅｅｎ２０（５ｍＬ）とオートクレーブした水を添加し５００ｍＬとする。
１０×ｄｎＴＰ
１００ｍＭ ｄＡＴＰ６０μＬ
１００ｍＭ ｄＣＴＰ６０μＬ
１００ｍＭ ｄＴＴＰ６０μＬ
１００ｍＭ ｄＧＴＰ６０μＬ
オートクレーブ処理済み脱イオン水５７６０μＬ
ＴＭＤＨ混合物
１０×ＰＣＲバッファー６ｍＬ
１０×ｄＮＴＰ６ｍＬ
２５ｍＭ 塩化マグネシウム５．１ｍＬ
オートクレーブ処理済み脱イオン水６ｍＬ
【０３０８】
ＰＣＲ溶液は次のプロトコルに従って調製した。
ＴＭＤＨ１００μＬ
オートクレーブ処理済み脱イオン水５７μＬ
ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μＬ）０.８５μＬ
ＤＮＡ（１μｇ／μＬ）３μＬ
【０３０９】
次に、対立遺伝子特異的プライマーを含有する各ウェルにＤＮＡ溶液（８μＬ）を添加した。色の変化（クレゾールレッドによってピンク色に変化）から、ＰＣＲ反応ミックスｓ中のＤＮＡの存在が確認された。
【０３１０】
（ｉｖ）ＰＣＲサーマルサイクル
ＰＣＲは、ＰＴＣ−２００ Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて行った。ＰＣＲサイクルのパラメータは次のようにした。
９６℃で２５秒、７０℃で４５秒、７２℃で４５秒のサイクルを５回；
９６℃で２５秒、６５℃で５０秒、７２℃で４５秒のサイクルを２１回；
９６℃で２５秒、５５℃で６０秒、７２℃で１２５秒のサイクルを４回
【０３１１】
ＳＳＰ−ＰＣＲ産物は、２％アガロースゲル上エチジウムブロマイドを添加し発色させて解析した。高解像度デジタル写真を撮り、遺伝子カウンティングによって遺伝子型を判定した。被験者を代表する３名の増幅産物の例を図２に示す。上方の増幅バンドはＨＬＡ−ＤＢＲ３が増幅されたバンドである。下方の増幅バンドはｔＰＡ対立遺伝子特異的な増幅産物である。図２において、被験者７６はＣＣホモ接合性、被験者７７はＴＴのホモ接合性、被験者７８はＣＴのヘテロ接合性である。
【０３１２】
テストの信頼性を保証するため、遺伝子タイピングはＤＮＡの出所を知らされていない技術者２名によって独立して行った。結果は１００パーセント一致した。
【０３１３】
実施例４
統計学的解析
本研究で得られたデータの統計学的解析はＳｔａｔａの統計ソフトウェアを用いて行った（バージョン７.０、米国、テキサス州、カレッジステーション）。各症例と各対照間のベースライン特性は、カテゴリ変数についてはカイ二乗検定を用い、連続型変数については両側ｔ−検定を用いて解析を行った。ｔＰＡ−７３５１Ｃ／Ｔ遺伝子型と虚血性発作との間の関連の強さについては、オッズ比（ＯＲ）と９５％信頼区間（ＣＩ）を算出し評価した。公知危険因子の相対的な関連の強さについても同様の方法で求めた。二変量カイ二乗解析を用いて、ｔＰＡ−７３５１Ｃ／Ｔ遺伝子型と従来知られている各危険因子との関係について調べた。これにより、無条件のロジスティック回帰モデルに組込まれた重要な交絡変数が同定され、ｔＰＡ−７３５１Ｃ／Ｔ多型に関連する虚血性発作の危険率を決定できた。最後に、虚血性発作サブタイプについて層状とした多変量解析を行った。両側のｐ値については＜０.０５を有意とした。
【０３１４】
実施例５
被験者の選択
南オーストラリア州の州都アデレードにある主要５病院のうちの１施設に急性虚血性発作で入院していた２０１名の患者について、本研究への参加を打診したところ１８２名（９０.５％）の患者が承諾した。このうち１３７名（７５％）は、初めての虚血性発作で受診した患者であった。
【０３１５】
虚血性発作の診断は、世界保健機構（ＷＨＯ）による定義（Ｈａｔｏｎｏ，Ｓ．（１９７６）「多施設発作記録からの経験：予備的報告書 ("Experience from a multicentre stroke register:a preliminary report" Bull WHO 54:541-553)に記載」に準拠し、神経科医が脳コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）或いは磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）を行うことで下された。虚血性発作は、Oxfordshire Community Stroke Project （ＯＣＳＰ）による分類システム（Bamford,J.，P. Sandercock,M.Dennisら、（１９９１）「臨床的に特定可能な脳梗塞のサブタイプの分類と自然史 "Classification and natural history of clinically identifiable subtypes of cerebral infarction"」Ｌａｎｃｅｔ ３３７（８７５６）：１５２１〜１５２６）を用いて次の４カテゴリーにサブタイピングした。即ち、（ａ）全身性前方循環症候群（Total anterior circulation syndrome）；（ｂ）部分前方循環症候群（Partial anterior circulation syndrome）；（ｃ）後方循環症候群（Posterior circulation syndrome）；（ｄ）ラクナー症候群である。発作のサブタイプは、脳ＣＴ或いはＭＲＩの結果を用いて確認した。
【０３１６】
対照グループは、大都市アデレード在住の入院中でない３０１名からなり、脳血管疾患の個人歴のないグループとした。対照は、南オーストラリア州の電子電話帳から無作為抽出により選択し、年齢と性別を患者と合わせた（年齢については５年の年齢差内に収まるように）。
【０３１７】
インフォームドコンセントの後、被験者と面接し人口統計学的(demographic)情報を記録した。高血圧や高コレステロール血症、糖尿病等の脳血管疾患の経歴が報告されている場合や、検査の時点でこれらの各症状についての治療を個々の被験者が受けている場合には、これら疾患の危険因子が存在すると考えた。心電図をとり心房細動の有無を判定した。最近５年以内にシガレット或いはタバコを常用していた被験者を喫煙者とみなした。一親等血縁者の発作歴も記録した。本研究は、North West Adelaide Health Service Ethics Committeeにより承認された。
【０３１８】
実施例６
虚血性発作患者と健常対照の人口統計学的特性及び各危険因子保持率
１８２名の虚血性発作症例と３０１名の対照について、人口統計学的特性及び脳血管疾患危険因子保持率を表１に示した。本研究では症例と対照の年齢及び性別を合わせたため、これら変数（即ち年齢と性別）について２グループ間に差は見られなかった。本研究の母集団の大部分はコーカソイド起源であったため、症例と対照との間の差は統計的有意差に関与しない。調査を行った公知の危険因子のうち、心房細動は、虚血性発作の最高危険率と関連付けられ、虚血性発作症例での２３％に対し、対照で有した者は３％であった（ＯＲ８.５、９５％ＣＩ ４.１〜１７.４）。最近５年間の喫煙歴（ＯＲ３.１、９５％ＣＩ １.９〜５.２）と糖尿病（ＯＲ２.７、１.６〜４.４）についても、虚血性発作と有意な関連性が見られた。高血圧保持率は対照よりも症例において高かったが、統計的に有意な差ではなかった。一親等血縁者の発作歴或いは高コレステロール血症と虚血性発作との関連性は見られなかった（表１）。
【０３１９】
【表１】
【０３２０】
実施例７
虚血性発作患者と健常対照におけるｔＰＡ−７３５１多型の保持率
静脈血サンプリング前に２名の患者が死去したため、これらの症例については遺伝的解析（実施例３に記載）を実施できなかった。
【０３２１】
表２は、残りの１８０名の虚血性発作の症例と３０１名の対照におけるｔＰＡ−７３５１Ｃ／Ｔ多型（図１に示す）の保持率を示す。対照グループのうち４６％がＣ対立遺伝子（ＣＣ）のホモ接合性であり、４５％がヘテロ接合性（ＣＴ）、９％がＴ対立遺伝子のホモ接合性（ＴＴ）であった。虚血性発作の集団において各遺伝子型の分布は、４１％（ＣＣ）、４６％（ＣＴ）、１３％（ＴＴ）であった。ＣＴとＴＴ遺伝子型の保持率は、発作症例で対照より高い値を示したが、単変量解析において統計的に有意ではなかった。公知危険因子について調整を行い、ＴＴ遺伝子型が虚血性発作の有意且つ独立した予測因子であることが判明した（ＯＲ１.９、９５％ＣＩ １.０１〜３.６、ｐ＜０.０５）。
【０３２２】
【表２】
【０３２３】
実施例８
発作のサブタイプについて層別化した患者と対照におけるｔＰＡ−７３５１Ｃ／Ｔ遺伝子型の分布
発作のサブタイプについて層別化した患者と対照におけるｔＰＡ−７３５１Ｃ／Ｔ遺伝子型の分布を表３に示す。虚血性発作の患者のうち４４名（２４.５％）がラクナー発作に分類された。このサブグループにおいては、ＴＴホモ接合性状態が単変量解析でラクナー発作と有意に関連していた（ＯＲ２.６、９５％ＣＩ １.１〜６.４、ｐ＜０.０５）。無条件のロジスティック回帰モデルを用いて公知の危険因子の調整を行った後も得られた結果の有意性は変わらなかった（表３）。ＣＴ遺伝子型はラクナー発作との統計的に有意な関連性を示さなかったが、Ｔ対立遺伝子と発作リスクとの保持に関し用量依存的効果が見られた（ＣＣ ＯＲ１.０、ＣＴ ＯＲ１.１、ＴＴ ＯＲ２.７）。これに対して、ｔＰＡ−７３５１Ｃ／Ｔ遺伝子型と非ラクナー発作の危険率との間に関連性は見られなかった。
【０３２４】
【表３】
【０３２５】
実施例９
細胞培養
（ｉ）ウシ大動脈内皮細胞
ウシ大動脈内皮細胞は、ウシ胸部大動脈の内膜表面をそっと掻き取って採取し、これを培養フラスコ中、１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ユタ州ローガン）、５μｇ／ｍＬデオキシシチジン、５μｇ／ｍＬチミジン、１％ペニシリン−ストレプトマイシン及びファンギゾンを含有するダルベッコ変法イーグル培地Ｆ１２を用いて維持できる。内皮細胞は、加湿された５％ＣＯ2インキュベーター中３７℃で増殖させ２〜１０代継代したものを使用できる。内皮細胞は、特徴的な形態をとることから確認可能であり、また１，１−ジオクタデシル−１−３，３，３′，３′−テトラメチルインドカルボシアニン（ジ−Ｉ）−アセチル化低密度リポプロテイン（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、マサチューセッツ州ストートン）でポジティブ染色しても確認できる。内皮細胞は、Ｉ型コラーゲンをコートした培養プレートでコンフルエントになるまで増殖させることができる。
【０３２６】
（ｉｉ）ＨＵＶＥＣ
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、Jaffeら、（１９７３） J. Clin. Invest.５２：２７４５〜２７５６に記載の方法により単離し、Van Hinsberghら、（１９８７）Arteriosclerosis ７；３８９〜４００の記載に従って培養できる。
【０３２７】
ＨＵＶＥＣは、フィブロネクチンをコートしたディッシュを用いて、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）（２０ｍＭ）、新生仔ウシ血清（非働化処理済み；１０％（ｖ／ｖ））、ヒト血清（１０％（ｖ／ｖ））、ヘパリン（５ＩＵ／ｍＬ）、内皮細胞増殖添加物（１５０μｇ／ｍＬ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させることができる。
【０３２８】
（ｉｉｉ）ＨｅＬａ細胞
ＨｅＬａ細胞は、ＨＥＰＥＳ（２０ｍＭ）、ウシ胎児血清（非働化処理済み；８％（ｖ／ｖ））、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を添加したＤＭＥＭ中で増殖させることができる。
【０３２９】
各種細胞はいずれも、５％ＣＯ2／９５％空気雰囲気下３７℃で増殖させ、培地は２〜３日毎に交換する。トリプシン／エチレンジニトリロ四酢酸二ナトリウム塩二水和物（ＥＤＴＡ）で処理し、ＨＵＶＥＣとウシ大動脈内皮細胞ではスプリット比１：３で、ＨｅＬａ細胞ではスプリット比１：１０で継代培養する。内皮細胞は最大でも３継代とする。
【０３３０】
実験を行うにあたっては、実験日の前日に、コンフルエントな培養物からインキュベーション用培地（即ち、ＨＵＶＥＣでは、ヒト血清（１０％）、Ｌ−グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ；ＨｅＬａ細胞では：Ｌ−グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ）に再度細胞をまき直して行う。
【０３３１】
実施例１０
内皮細胞からのｔＰＡ放出の誘導
クレブスリンガー重炭酸塩バッファー（ＫＲＢＨ、１２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣＩ、４.７５ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ、１.２ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＨ2ＰＯ4、０.６ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＳ０4、１.２ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ2、２５ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＨＣＯ3、２５ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７.４）／ＢＳＡ０.１％、ｐＨ７.４を用いて、２４ウェルプレート中に増殖させたＨＵＶＥＣを３回洗浄し、ＫＲＢＨ／ＢＳＡ（１ｍＬ）に３０分間プレインキュベートさせ、次いで各０.５ｍＬの新鮮なＫＲＢＨ/ＢＳＡのみ、ヒトトロンビン（シグマ社）１ＮＩＨ Ｕ／ｍＬ含有ＫＲＢＨ/ＢＳＡ、カルシウムイオノホアＡ２３１８７（シグマ社）２μｍｏｌ／Ｌ含有ＫＲＢＨ/ＢＳＡを用いて再度３０分間インキュベートを行う。細胞上清を遠心し、ｔ−ＰＡ濃度測定まで−２０℃で保存する。
【０３３２】
実施例１１
内皮細胞に対するｔＰＡ上流領域のトランスフェクション
野生型配列（−７３５１Ｃ）或いは多型性配列（−７３５１Ｔ）のいずれかを有するｔＰＡ遺伝子座の全上流領域（＋３０８まで）は、好適なヒトゲノムクローンから得るか、或いはゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅により得ることができる。
【０３３３】
得られたＤＮＡは次いで、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）レポーター遺伝子とつなぎ合わせることができる。ｔＰＡプロモーター−ＣＡＴ遺伝子構築物の内皮細胞へのトランスフェクションは、Sambrook,J、Fritsch,E.F.、Maniatis,T.によるMolecular Cloning：A′Laboratory Manual 2nd.ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York.（１９８９）の記載に従い、リン酸カルシウム沈澱法（グリセロールショックを含む）を用いて行うことができる。２４時間後、プレートのコラーゲンコーティングを施したウェルにトランスフェクトされた細胞をまき、一晩インキュベートする。ｔＰＡ放出誘導剤（トロンビン、カルシウムイオノホア等）に接触させた後、細胞を回収し、Sambrook,J、Fritsch,E.F.、Maniatis,T.によるMolecular Cloning：A Laboratory Manual 2nd.ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York．（１９８９）の記載に従い、薄層クロマトグラフィーと液体シンチレーションカウンティングによって［14Ｃ］クロラムフェニコールのアセチル化産物への転換率を測定して、ＣＡＴ活性の相対変化を定量する。
【０３３４】
トランスフェクション効率は、サイトメガロウィルスプロモーターとｌａｃＺ遺伝子構築物を内皮細胞にコトランスフェクトさせることにより評価できる。β−ガラクトシダーゼアッセイは、Sambrook,Ｊ、Fritsch,E.F.、Maniatis,T.によるMolecular Cloning：A Laboratory Manual 2nd.ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York.（１９８９）の記載に従って行い、トランスフェクション効率の直接的指標を得ることができ、これを各種実験におけるＣＡＴ活性の標準化に用いる。
【０３３５】
実施例１２
インビトロにおけるｔＰＡ放出速度の測定
ヒト臍帯静脈内皮細胞或いはウシ大動脈内皮細胞の培養物を、上述のようにコンフルエントに達するまで増殖させた。
【０３３６】
内皮細胞からのｔＰＡ放出速度の測定にあたり、培地を交換しｔＰＡ放出を誘導（トロンビンやカルシウムイオノホアを添加する等）して、培地中のｔＰＡ濃度を経時的にモニターするため全ｔＰＡ量の定量を酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）（ＴｉｎｔＥｌｉｚｅ(R)ｔ−ＰＡ、Ｂｉｏｐｏｏｌ ＡＢ等）を用いて行った。このアッセイは、二重抗体の原理に基づく。
【０３３７】
ｔＰＡ放出速度を求めるため、培地中のｔＰＡの経時的な相対的増加量を算出した。
【０３３８】
実施例１３
ｔＰＡ放出速度を増大させる候補剤の試験
実施例９で述べたヒト臍帯静脈内皮細胞から、（ｉ）ｔＰＡ遺伝子座における正常な配列、（ｉｉ）−７３５１がＣからＴへ突然変異した１本の対立遺伝子、或いは（ｉｉｉ）−７３５１がＣからＴへ突然変異した２本の対立遺伝子を有するヒト内皮細胞を得ることができる。遺伝子型解析によりＨＵＶＥＣをスクリーニングし、正常ｔＰＡ配列のホモ接合性細胞、−７３５１がＣからＴへ突然変異したヘテロ接合性細胞、或いはＣからＴへ突然変異したホモ接合性細胞の同定を行う。
【０３３９】
次いで、内皮細胞は候補化合物存在下、ｔＰＡ放出を誘起するまで１、２、４、８、１２、１８、２４時間の各時間培養する。試験のため、候補化合物の好適濃度を選択する。対照としてこれら化合物の非存在下における内皮細胞からのｔＰＡ放出の程度、そしてモノナトリウム［２−（６−ヒドロキシナフタレン−２−イル）−６−メチル−ピリミジン−４−イルオキシ］アセテートジハイドレート（ＪＴＶ−９２６）存在下における内皮細胞からのｔＰＡ放出の程度について試験を行う。ＪＴＶ−９２６は、内皮細胞からのｔＰＡ放出速度向上剤として知られている（Ueshimaら、（２００２）「生体内血栓溶解における組織型プラスミノーゲンアクチベータ放出剤の血管内皮細胞に対する機能 "Function of tissue-type plasminogen activator releaser on vascular endothelial cells in thrombolysis in vivo"」Thrombosis Haemostasis ８７：１０６９〜７４に記載）。
【０３４０】
実施例１４
インビボにおけるｔＰＡ放出速度の測定
ｔ−ＰＡ放出についての前腕部におけるインビボ実験は、健常者において、Jernら、（１９９９）Afferioscler.Jhromb Vasc.Biol.１９（２）：４５４〜４５９の記載に従って行うことができる。実験は一晩絶食後に行う。
【０３４１】
動脈用ポリエチレン製カテーテル（Ｖｉｇｇｏ製、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｖｉｇｇｏ）は、Ｓｅｌｄｉｎｇｅｒの技法を用い、経皮的に利き腕でない方の上腕動脈から近位方向に１０ｃｍ挿入する。留置カニューラ（Ｖｅｎｆｌｏｎ等、Ｖｉｇｇｏ）は、同じ腕の肘前静脈深くに逆向きに導入することにより、筋肉の血管床から静脈血をサンプリングできる。
【０３４２】
動脈内血圧は、電気式トランスデューサ（ＥＭＴ ３５等、Ｓｉｅｍｅｎｓ−Ｅｌｅｍａ）やミンゴグラフ（Mingograph）８２（例えば、Ｓｉｅｍｅｎｓ−Ｅｌｅｍａ）により連続的に記録できる。平均動脈圧は、圧力信号の電気的減衰によって得ることができる。また、心電図（ＥＣＧ）をミンゴグラフ上に連続的にモニターできる。水銀入りゴム袋型の歪ゲージを備えた静脈閉塞プレチスモグラフィーによってＦＢＦを評価できる。ＦＢＦ（ｍＬ×ｍｉｎ-1×Ｌ-1組織）は、各血液サンプリングの後、それらについての記録データから算出することができる。
【０３４３】
カテーテルを導入し各記録装置適用後、血液サンプルは１０分間隔をおいて２回採取する。血液サンプリングは、厳密に制御され標準化された手順で行い、交感神経副腎の活性化を避ける必要がある。
【０３４４】
動脈血及び静脈血の各サンプルは、カテーテルから二人で同時採取することができる。血液の最初の３〜４ｍＬは廃棄する。各血液サンプルは、１：１０で０.４５ｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ４.３（Ｓｔａｂｉｌｙｔｅ等、Ｂｉｏｐｏｏｌ ＡＢ）を含有するチューブに回収される。各血液サンプリングの後、ヘパリン（５ＩＵ／ｍＬ）添加生理食塩水でカテーテルをフラッシュ洗浄する。チューブは氷冷下に維持し、６０分以内に遠心分離（４℃、２０００ｇ、２０分間）を行って血漿を単離する。血漿は分割量に分け−７０℃で直ちに凍結保存する。
【０３４５】
全ｔ−ＰＡ抗原の定量的測定には、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用することができる（例えば、ＴｉｎｔＥｌｉｚｅ(R)ｔ−ＰＡ、Ｂｉｏｐｏｏｌ ＡＢ）。このアッセイは二重抗体の原理に基づく。遊離ｔ−ＰＡとｔ−ＰＡ−インヒビター複合体は同程度の効率で検出される。活性遊離ｔ−ＰＡ画分（ｔ−ＰＡ活性）は、バイオイムノアッセイにより測定できる（例えば、Ｃｈｒｏｍｏｌｉｚｅ（ＴＭ）ｔ−ＰＡ、Ｂｉｏｐｏｏｌ ＡＢ）。活性ｔ−ＰＡは、６００ＩＵ／μｇの特異的活性を用いてμｇ／Ｌ単位で表される。１個人から採取した全サンプルは、同一のマイクロテストプレートに２連にしてアッセイを行う。
【０３４６】
ヘマトクリットは、マイクロヘマトクリット遠心機（例えば、Ｈｅｔｔｉｃｈ Ｈｅｍａｔｏｋｒｉｔ、Ｈｅｔｔｉｃｈ Ｚｅｎｔｒｉｆｕｇｅｎ）を用いて、動脈血から２連で測定する。
【０３４７】
全ｔ−ＰＡの正味の放出速度は、次のようにして測定する：各個人の静動脈濃度勾配（ＡＶ勾配）は、同時採取した静脈血と動脈血における血漿中全ｔ−ＰＡ値を減算することにより算出できる。差が正の場合は正味の放出を、負の場合は正味の取込みを示す。個々の前腕部の血漿フローはＦＢＦから計算され、動脈血ヘマトクリットはトラップ血漿を１％として補正する。個々の正味放出速度或いは取込み速度は、ＡＶ勾配×血漿フロー／単位時間・Ｌ（前腕組織）で算出される。次の式を使用する。
ＦＰＦ＝ＦＢＦ×（［１０１−ヘマトクリット］／１００）
正味の放出＝（ＣV−ＣA）×ＦＰＦ
（式中、ＣVは静脈血中の血漿濃度を示し、ＣAは動脈血中の濃度を示す）
【０３４８】
前腕部における活性型ｔ−ＰＡの正味の増加は、全ｔ−ＰＡの正味の放出について用いた式で計算できる。しかしながら活性型ｔ−ＰＡについては、局所における正味フラックスは、組織における放出／取込みを反映するだけでなく、前腕部血管床を通過する際に起こり得る、複合体結合ｔ−ＰＡ画分と遊離ｔ−ＰＡ画分との間のシフトを反映するということも考えられる。この点を考慮して、活性型ｔ−ＰＡについて「正味の増加」という用語を「正味の放出」の代わりに使用する。
【０３４９】
最後に、当業者であれば、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、上述した本発明方法及び本発明組成物に対する種々の変更や変形を容易に想到できることが理解されるであろう。好ましい特定の実施形態と関連させて本発明を説明してきたが、特許請求に係る本発明は、それら特定の実施形態に不当に限定されるべきではないと理解されたい。実際、本発明を実施するための上掲の各種態様に対してなされ得る、血管生物学、分子生物学或いはその他関連分野における当業者にとって明白な種々の変更は、本発明の範囲内にあるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０３５０】
【図１】−７３５１Ｃ／Ｔ多型近傍の組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の上流領域のヌクレオチド配列を示す。ヌクレオチド配列の各座標はＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ４８４８４に基づいている。ヌクレオチド２２２８にあるＣ／Ｔ多型に位置を太字で示す。コンセンサスプライマー（配列番号２；ヌクレオチド１８４０〜１８６０）、ＷＴプライマー（配列番号３；ヌクレオチド２２４５〜２２２８）及びＳＮＰプライマー（配列番号４；ヌクレオチド２２４５〜２２２８）の各位置も示す。
【図２】異なるｔＰＡ遺伝子型を有する３被験者の増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行った結果を示す。（被験者７６，７７，７８のＴＰＡ−７３５１遺伝子型−ＡＧＳＳである。遺伝子型は左からＣＣ，ＴＴ，ＴＣである。上方のバンドは対照バンドを示し、下方のバンドは対立遺伝子特異的バンドを示す。）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
虚血性発作の素因を有する被験者を特定する方法であって、前記方法は組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を低下させる突然変異を前記被験者において特定する段階を含む方法。
【請求項２】
前記虚血性発作はラクナー発作である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記突然変異は前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座に位置する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記突然変異は前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の上流領域に位置する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記突然変異は前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座のエンハンサーエレメントに位置する、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
前記突然変異は組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の両対立遺伝子に存在する、請求項３乃至５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記突然変異は、組織プラスミノーゲン遺伝子座の上流領域の−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記突然変異の特定は、被験者から単離又は誘導された核酸から突然変異を含む領域を増幅することを含む、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記突然変異の特定は、被験者から単離又は誘導された核酸をレポーター核酸とハイブリッド形成することにより突然変異を検出することを含む、請求項１乃至８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
小血管閉塞の素因を有する被験者を特定する方法であって、前記方法は組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を低下させる突然変異を前記被験者において特定する段階を含む方法。
【請求項１１】
前記小血管閉塞は、ラクナー発作、痴呆、虚血性心疾患（虚血性心筋症含む）、末梢血管疾患、血管内凝固症候群、小血管炎、虚血性神経障害、虚血性網膜症、虚血性胃疾患（小腸大腸虚血含む）、広汎性肺塞栓症及び血管性インポテンスを臨床的に呈する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記小血管閉塞はラクナー発作を臨床的に呈する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記突然変異は前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座に位置する、請求項１０乃至１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記突然変異は前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の上流領域に位置する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記突然変異は前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座のエンハンサーエレメントに位置する、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記突然変異は組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の両対立遺伝子に存在する、請求項１３乃至１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記突然変異は、組織プラスミノーゲン遺伝子座の上流領域の−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記突然変異の特定は、被験者から単離又は誘導された核酸から突然変異を含む領域を増幅することを含む、請求項１０乃至１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記突然変異の特定は、被験者から単離又は誘導された核酸をレポーター核酸とハイブリッド形成することにより突然変異を検出することを含む、請求項１０乃至１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
小血管閉塞に関連する疾病又は状態の素因を有する被験者を特定する方法であって、前記方法は組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を低下させる突然変異を前記被験者において特定する段階を含む方法。
【請求項２１】
前記疾病又は状態は、ラクナー発作、痴呆、虚血性心疾患（虚血性心筋症含む）、末梢血管疾患、血管内凝固症候群、小血管炎、虚血性神経障害、虚血性網膜症、虚血性胃疾患（小腸大腸虚血含む）、広汎性肺塞栓症又は血管性インポテンスである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記状態はラクナー発作である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記突然変異は前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座に位置する、請求項２０乃至２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記突然変異は前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の上流領域に位置する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記突然変異は前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座のエンハンサーエレメントに位置する、請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記突然変異は組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の両対立遺伝子に存在する、請求項２３乃至２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記突然変異は、組織プラスミノーゲン遺伝子座の上流領域の−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記突然変異の特定は、被験者から単離又は誘導された核酸から突然変異を含む領域を増幅することを含む、請求項２０乃至２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記突然変異の特定は、被験者から単離又は誘導された核酸をレポーター核酸とハイブリッド形成することにより突然変異を検出することを含む、請求項２０乃至２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
虚血性発作の予防及び／又は治療を行うために好適な被験者を特定する方法であって、前記方法は組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を低下させる突然変異を前記被験者において特定する段階を含む方法。
【請求項３１】
前記虚血性発作はラクナー発作である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記突然変異は前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座に位置する、請求項３０又は３２に記載の方法。
【請求項３３】
前記突然変異は前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の上流領域に位置する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記突然変異は前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座のエンハンサーエレメントに位置する、請求項３２又は３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記突然変異は組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の両対立遺伝子に存在する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３６】
前記突然変異は、組織プラスミノーゲン遺伝子座の上流領域の−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記突然変異の特定は、被験者から単離又は誘導された核酸から突然変異を含む領域を増幅することを含む、請求項３０乃至３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記突然変異の特定は、被験者から単離又は誘導された核酸をレポーター核酸とハイブリッド形成することにより突然変異を検出することを含む、請求項３０乃至３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
小血管閉塞又は小血管閉塞に関連する疾病又は状態の予防及び／又は治療を行うために好適な被験者を特定する方法であって、前記方法は組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を低下させる突然変異を前記被験者において特定する段階を含む方法。
【請求項４０】
前記疾病又は状態は、ラクナー発作、痴呆、虚血性心疾患（虚血性心筋症含む）、末梢血管疾患、血管内凝固症候群、小血管炎、虚血性神経障害、虚血性網膜症、虚血性胃疾患（小腸大腸虚血含む）、広汎性肺塞栓症又は血管性インポテンスである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記状態はラクナー発作である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記突然変異は前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座に位置する、請求項３９乃至４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記突然変異は前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の上流領域に位置する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記突然変異は前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座のエンハンサーエレメントに位置する、請求項４２又は４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記突然変異は組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の両対立遺伝子に存在する、請求項４２乃至４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記突然変異は、組織プラスミノーゲン遺伝子座の上流領域の−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記突然変異の特定は、被験者から単離又は誘導された核酸から突然変異を含む領域を増幅することを含む、請求項３９乃至４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記突然変異の特定は、被験者から単離又は誘導された核酸をレポーター核酸とハイブリッド形成することにより突然変異を検出することを含む、請求項３９乃至４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
被験者の小血管閉塞に関連する疾病又は状態の治療方法であって、前記方法は前記被験者における組織プラスミノーゲン活性化因子放出速度向上剤を前記被験者の治療に有効な量投与する段階を含む方法。
【請求項５０】
前記疾病又は状態は、ラクナー発作、痴呆、虚血性心疾患（虚血性心筋症含む）、末梢血管疾患、血管内凝固症候群、小血管炎、虚血性神経障害、虚血性網膜症、虚血性胃疾患（小腸大腸虚血含む）、広汎性肺塞栓症又は血管性インポテンスである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記状態はラクナー発作である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
小血管閉塞に関連する疾病又は状態に罹りやすい被験者の治療方法であって、前記方法は、前記被験者における組織プラスミノーゲン活性化因子放出速度向上剤を前記被験者の治療に有効な量投与する段階を含む方法。
【請求項５３】
前記疾病又は状態は、ラクナー発作、痴呆、虚血性心疾患（虚血性心筋症含む）、末梢血管疾患、血管内凝固症候群、小血管炎、虚血性神経障害、虚血性網膜症、虚血性胃疾患（小腸大腸虚血含む）、広汎性肺塞栓症又は血管性インポテンスである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記状態はラクナー発作である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を増大可能な剤を特定する方法であって、前記方法は（ａ）細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を低下させる突然変異を含む細胞に剤を作用させる段階と、（ｂ）前記剤を作用させた細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を測定する段階と（ｃ）前記剤を、細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を増大可能な剤と特定する段階とを含む方法。
【請求項５６】
前記細胞は内皮細胞である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記突然変異は前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座に位置する、請求項５５又は５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記突然変異は前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の上流領域に位置する、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記突然変異は前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座のエンハンサーエレメントに位置する、請求項５７又は５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記突然変異は組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の両対立遺伝子に存在する、請求項５７乃至５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記突然変異は、組織プラスミノーゲン遺伝子座の上流領域の−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記組織プラスミノーゲン活性化因子放出速度に決定は、組織プラスミノーゲン活性化因子の免疫学的検出を含む、請求項５５乃至６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
虚血性発作の素因を有する被験者を特定する方法であって、前記方法は、組織プラスミノーゲン遺伝子座の両対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在を前記被験者において特定する段階を含む方法。
【請求項６４】
前記虚血性発作はラクナー発作である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記突然変異の特定は、被験者から単離又は誘導された核酸から突然変異を含む領域を増幅することを含む、請求項６３又は６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記突然変異の特定は、被験者から単離又は誘導された核酸をレポーター核酸とハイブリッド形成することにより突然変異を検出することを含む、請求項６３乃至６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
小血管閉塞の素因を有する被験者を特定する方法であって、前記方法は、組織プラスミノーゲン遺伝子座の両対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在を前記被験者において特定する段階を含む方法。
【請求項６８】
前記小血管閉塞は、ラクナー発作、痴呆、虚血性心疾患（虚血性心筋症含む）、末梢血管疾患、血管内凝固症候群、小血管炎、虚血性神経障害、虚血性網膜症、虚血性胃疾患（小腸大腸虚血含む）、広汎性肺塞栓症及び血管性インポテンスを臨床的に呈する、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記小血管閉塞はラクナー発作を臨床的に呈する、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
前記突然変異の特定は、被験者から単離又は誘導された核酸から突然変異を含む領域を増幅することを含む、請求項６７乃至６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記突然変異の特定は、被験者から単離又は誘導された核酸をレポーター核酸とハイブリッド形成することにより突然変異を検出することを含む、請求項６７乃至７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
小血管閉塞に関連する疾病又は状態の素因を有する被験者を特定する方法であって、前記方法は、組織プラスミノーゲン遺伝子座の両対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在を前記被験者において特定する段階を含む方法。
【請求項７３】
前記疾病又は状態は、ラクナー発作、痴呆、虚血性心疾患（虚血性心筋症含む）、末梢血管疾患、血管内凝固症候群、小血管炎、虚血性神経障害、虚血性網膜症、虚血性胃疾患（小腸大腸虚血含む）、広汎性肺塞栓症又は血管性インポテンスである、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記状態はラクナー発作である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
前記突然変異の特定は、被験者から単離又は誘導された核酸から突然変異を含む領域を増幅することを含む、請求項７２乃至７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記突然変異の特定は、被験者から単離又は誘導された核酸をレポーター核酸とハイブリッド形成することにより突然変異を検出することを含む、請求項７２乃至７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
虚血性発作の予防及び／又は治療を行うために好適な被験者を特定する方法であって、前記方法は、組織プラスミノーゲン遺伝子座の両対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在を前記被験者において特定する段階を含む方法。
【請求項７８】
前記虚血性発作はラクナー発作である、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記突然変異の特定は、被験者から単離又は誘導された核酸から突然変異を含む領域を増幅することを含む、請求項７７又は７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記突然変異の特定は、被験者から単離又は誘導された核酸をレポーター核酸とハイブリッド形成することにより突然変異を検出することを含む、請求項７７乃至７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
小血管閉塞又は小血管閉塞に関連する疾病又は状態の予防及び／又は治療を行うために好適な被験者を特定する方法であって、前記方法は、組織プラスミノーゲン遺伝子座の両対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在を前記被験者において特定する段階を含む方法。
【請求項８２】
前記疾病又は状態は、ラクナー発作、痴呆、虚血性心疾患（虚血性心筋症含む）、末梢血管疾患、血管内凝固症候群、小血管炎、虚血性神経障害、虚血性網膜症、虚血性胃疾患（小腸大腸虚血含む）、広汎性肺塞栓症又は血管性インポテンスである、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記状態はラクナー発作である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８４】
前記突然変異の特定は、被験者から単離又は誘導された核酸から突然変異を含む領域を増幅することを含む、請求項８１乃至８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
前記突然変異の特定は、被験者から単離又は誘導された核酸をレポーター核酸とハイブリッド形成することにより突然変異を検出することを含む、請求項８１乃至８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
組織プラスミノーゲン活性化因子放出速度向上剤により治療するために好適な被験者を特定する方法であって、前記方法は、組織プラスミノーゲン遺伝子座の両対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在を前記被験者において特定する段階を含む方法。
【請求項８７】
前記被験者は虚血性発作の素因を有するか、或いはそれに罹患している、請求項８５に記載の方法。
【請求項８８】
前記虚血性発作はラクナー発作である、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記被験者は、小血管閉塞に関連する疾病又は状態の素因を有するか、或いはそれに罹患している、請求項８６に記載の方法。
【請求項９０】
前記疾病又は状態は、痴呆、虚血性心疾患（虚血性心筋症含む）、末梢血管疾患、血管内凝固症候群、小血管炎、虚血性神経障害、虚血性網膜症、虚血性胃疾患（小腸大腸虚血含む）、広汎性肺塞栓症又は血管性インポテンスである、請求項８４に記載の方法。
【請求項９１】
被験者における虚血性発作のリスクを決定する方法であって、前記方法は、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の一方若しくは両方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在を前記被験者において決定する段階を含む方法。
【請求項９２】
前記虚血性発作はラクナー発作である、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の一方若しくは両方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の被験者における存在の決定は、被験者から単離又は誘導された核酸から突然変異を含む領域を増幅することを含む、請求項９１又は９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の一方若しくは両方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の被験者における存在の決定は、被験者から単離又は誘導された核酸をレポーター核酸とハイブリッド形成することにより突然変異を検出することを含む、請求項９１乃至９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の一方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の被験者における存在は、組織プラスミノーゲン遺伝子座のいずれの対立遺伝子にも突然変異を有さない被験者の虚血性発作のリスクと比較した場合の被験者の虚血性発作のリスクの増大を示す、請求項９１乃至９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の一方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の被験者における存在は、被験者集団全体の虚血性発作に対するリスクと比較した場合の被験者の虚血性発作のリスクの増大を示す、請求項９１乃至９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の一方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の被験者における存在は、虚血性発作を伴うための他の同様のリスク因子を有する他の被験者の虚血性発作に対するリスクと比較した場合の被験者の虚血性発作のリスクの増大を示す、請求項９１乃至９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の両方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の被験者における存在は、組織プラスミノーゲン遺伝子座の一方若しくは両方の対立遺伝子に突然変異を有さない被験者の虚血性発作のリスクと比較した場合の被験者の虚血性発作のリスクの増大を示す、請求項９１乃至９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の両方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の被験者における存在は、被験者集団全体の虚血性発作に対するリスクと比較した場合の被験者の虚血性発作のリスクの増大を示す、請求項９１乃至９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の両方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の被験者における存在は、虚血性発作を伴うための他の同様のリスク因子を有する被験者の虚血性発作に対するリスクと比較した場合の被験者の虚血性発作のリスクの増大を示す、請求項９１乃至９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
被験者における小血管閉塞のリスクを決定する方法又は被験者における小血管閉塞に関連する疾病又は状態の進行のリスクを決定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の一方若しくは両方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在を前記被験者において決定する段階を含む方法。
【請求項１０２】
前記疾病又は状態或いは小血管閉塞に関連する状態は、ラクナー発作、痴呆、虚血性心疾患（虚血性心筋症含む）、末梢血管疾患、血管内凝固症候群、小血管炎、虚血性神経障害、虚血性網膜症、虚血性胃疾患（小腸大腸虚血含む）、広汎性肺塞栓症又は血管性インポテンスである、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の一方若しくは両方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の被験者における存在の決定は、被験者から単離又は誘導された核酸から突然変異を含む領域を増幅することを含む、請求項１０１又は１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の一方若しくは両方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の被験者における存在の決定は、被験者から単離又は誘導された核酸をレポーター核酸とハイブリッド形成することにより突然変異を検出することを含む、請求項１０１乃至１０３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０５】
前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の一方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の被験者における存在は、組織プラスミノーゲン遺伝子座のいずれの対立遺伝子にも突然変異を有さない被験者のリスクと比較した場合の被験者の小血管閉塞又は小血管閉塞に関連する疾病の進行のリスクの増大を示す、請求項１０１乃至１０４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０６】
前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の一方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の被験者における存在は、被験者集団全体のリスクと比較した場合の被験者の小血管閉塞又は小血管閉塞に関連する疾病の進行のリスクの増大を示す、請求項１０１乃至１０４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０７】
前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の一方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の被験者における存在は、小血管閉塞を伴うための他の同様のリスク因子を有する他の被験者のリスクと比較した場合の被験者の小血管閉塞又は小血管閉塞に関連する被験者の虚血性発作に関連する疾病の進行のリスクの増大を示す、請求項１０１乃至１０４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の両方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の被験者における存在は、組織プラスミノーゲン遺伝子座の一方若しくは両方の対立遺伝子に突然変異を有さない被験者のリスクと比較した場合の被験者の小血管閉塞又は小血管閉塞に関連する疾病の進行のリスクの増大を示す、請求項１０１乃至１０４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０９】
前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の両方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の被験者における存在は、被験者集団全体のリスクと比較した場合の被験者の小血管閉塞又は小血管閉塞に関連する疾病の進行のリスクの増大を示す、請求項１０１乃至１０４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１０】
前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の両方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の被験者における存在は、小血管閉塞を伴うための他の同様のリスク因子を有する他の被験者のリスクと比較した場合の被験者の小血管閉塞又は小血管閉塞に関連する疾病の進行のリスクの増大を示す、請求項１０１乃至１０４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１１】
細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を変化可能な剤を特定する方法であって、前記方法は、（ａ）組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の一方若しくは両方の対立遺伝子における−７３５１位にシトシンチミン多型を含む細胞に剤を作用させる段階と、（ｂ）前記剤を作用させた細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を測定する段階と（ｃ）前記剤を、細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を変化可能な剤と特定する段階とを含む方法。
【請求項１１２】
細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を増大可能な剤を特定する方法であって、前記方法は、（ａ）組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の全部又は一部を形質転換した細胞であって、前記形質転換した遺伝子座は−７３５１位にシトシンからチミンへの突然変異を含み且つ前記形質転換した遺伝子座はレポーター遺伝子の発現を制御する細胞に剤を作用させる段階と、（ｂ）前記剤を作用させた細胞におけるレポーター遺伝子の発現レベルを決定する段階と、（ｃ）前記レポーター遺伝子の発現を増大可能な剤を特定する段階と、（ｄ）前記レポーター遺伝子の発現を増大可能な剤を、細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を増大可能な剤と特定する段階とを含む方法。
【請求項１１３】
配列番号３に記載の配列からなる単離された核酸又はそのＲＮＡ等価物。
【請求項１１４】
配列番号３に記載の配列中に一以上の塩基置換を有する単離された核酸であって、前記核酸はストリンジェントなハイブリッド形成条件下で配列番号３の相補配列とハイブリッド化し、前記ストリンジェントなハイブリッド形成条件は４２℃における６ｘＳＳＣのハイブリッド形成及び２０℃における２ｘＳＳＣの洗浄を含む核酸。
【請求項１１５】
配列番号４に記載の配列からなる単離された核酸又はそのＲＮＡ等価物。
【請求項１１６】
配列番号４に記載の配列中に一以上の塩基置換を有する単離された核酸であって、前記核酸はストリンジェントなハイブリッド形成条件下で配列番号４の相補配列とハイブリッド化し、前記ストリンジェントなハイブリッド形成条件は４２℃における６ｘＳＳＣのハイブリッド形成及び２０℃における２ｘＳＳＣの洗浄を含む核酸。
【請求項１１７】
配列番号３に記載の配列中に一以上の塩基置換を有する単離された核酸であって、前記核酸は配列番号３と８０％以上の相同性を有する核酸或いはそのＲＮＡ等価物。
【請求項１１８】
配列番号４に記載の配列中に一以上の塩基置換を有する単離された核酸であって、前記核酸は配列番号４と８０％以上の相同性を有する核酸或いはそのＲＮＡ等価物。
【請求項１１９】
配列番号１のヌクレオチド１８４０〜２２４５の配列からなる、単離された核酸。
【請求項１２０】
虚血性発作の素因を有する被験者を特定する方法であって、前記方法は組織プラスミノーゲン活性化因子の低減された放出速度を前記被験者において特定する段階を含む方法。
【請求項１２１】
前記虚血性発作はラクナー発作である請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
小血管閉塞の素因を有する被験者を特定する方法であって、前記方法は組織プラスミノーゲン活性化因子の低減された放出速度を前記被験者において特定する段階を含む方法。
【請求項１２３】
前記小血管閉塞は、ラクナー発作、痴呆、虚血性心疾患（虚血性心筋症含む）、末梢血管疾患、血管内凝固症候群、小血管炎、虚血性神経障害、虚血性網膜症、虚血性胃疾患（小腸大腸虚血含む）、広汎性肺塞栓症及び血管性インポテンスを臨床的に呈する、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
小血管閉塞に関連する疾病又は状態の素因を有する被験者を特定する方法であって、前記方法は組織プラスミノーゲン活性化因子の低減された放出速度を前記被験者において特定する段階を含む方法。
【請求項１２５】
前記疾病又は状態は、ラクナー発作、痴呆、虚血性心疾患（虚血性心筋症含む）、末梢血管疾患、血管内凝固症候群、小血管炎、虚血性神経障害、虚血性網膜症、虚血性胃疾患（小腸大腸虚血含む）、広汎性肺塞栓症又は血管性インポテンスである、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
虚血性発作の予防及び／又は治療を行うために好適な被験者を特定する方法であって、前記方法は組織プラスミノーゲン活性化因子の低減された放出速度を前記被験者において特定する段階を含む方法。
【請求項１２７】
前記虚血性発作はラクナー発作である請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
小血管閉塞又は小血管閉塞に関連する疾病又は状態を予防及び／又は治療を行うために好適な被験者を特定する方法であって、前記方法は組織プラスミノーゲン活性化因子の低減された放出速度を前記被験者において特定する段階を含む方法。
【請求項１２９】
前記小血管閉塞に関連する疾病又は状態は、ラクナー発作、痴呆、虚血性心疾患（虚血性心筋症含む）、末梢血管疾患、血管内凝固症候群、小血管炎、虚血性神経障害、虚血性網膜症、虚血性胃疾患（小腸大腸虚血含む）、広汎性肺塞栓症又は血管性インポテンスである、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１】
虚血性発作の素因を有する被験者を特定する方法であって、前記方法は組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を低下させる突然変異を前記被験者において特定する段階を含む方法。
【請求項２】
前記虚血性発作はラクナー発作である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記突然変異は前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座に位置する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記突然変異は前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の上流領域に位置する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記突然変異は前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座のエンハンサーエレメントに位置する、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
前記突然変異は組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の両対立遺伝子に存在する、請求項３乃至５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記突然変異は、組織プラスミノーゲン遺伝子座の上流領域の−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記突然変異の特定は、被験者から単離又は誘導された核酸から突然変異を含む領域を増幅することを含む、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記突然変異の特定は、被験者から単離又は誘導された核酸をレポーター核酸とハイブリッド形成することにより突然変異を検出することを含む、請求項１乃至８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
小血管閉塞の素因を有する被験者を特定する方法であって、前記方法は組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を低下させる突然変異を前記被験者において特定する段階を含む方法。
【請求項１１】
前記小血管閉塞は、ラクナー発作、痴呆、虚血性心疾患（虚血性心筋症含む）、末梢血管疾患、血管内凝固症候群、小血管炎、虚血性神経障害、虚血性網膜症、虚血性胃疾患（小腸大腸虚血含む）、広汎性肺塞栓症及び血管性インポテンスを臨床的に呈する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記小血管閉塞はラクナー発作を臨床的に呈する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記突然変異は前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座に位置する、請求項１０乃至１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記突然変異は前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の上流領域に位置する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記突然変異は前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座のエンハンサーエレメントに位置する、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記突然変異は組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の両対立遺伝子に存在する、請求項１３乃至１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記突然変異は、組織プラスミノーゲン遺伝子座の上流領域の−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記突然変異の特定は、被験者から単離又は誘導された核酸から突然変異を含む領域を増幅することを含む、請求項１０乃至１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記突然変異の特定は、被験者から単離又は誘導された核酸をレポーター核酸とハイブリッド形成することにより突然変異を検出することを含む、請求項１０乃至１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
小血管閉塞に関連する疾病又は状態の素因を有する被験者を特定する方法であって、前記方法は組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を低下させる突然変異を前記被験者において特定する段階を含む方法。
【請求項２１】
前記疾病又は状態は、ラクナー発作、痴呆、虚血性心疾患（虚血性心筋症含む）、末梢血管疾患、血管内凝固症候群、小血管炎、虚血性神経障害、虚血性網膜症、虚血性胃疾患（小腸大腸虚血含む）、広汎性肺塞栓症又は血管性インポテンスである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記状態はラクナー発作である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記突然変異は前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座に位置する、請求項２０乃至２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記突然変異は前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の上流領域に位置する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記突然変異は前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座のエンハンサーエレメントに位置する、請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記突然変異は組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の両対立遺伝子に存在する、請求項２３乃至２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記突然変異は、組織プラスミノーゲン遺伝子座の上流領域の−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記突然変異の特定は、被験者から単離又は誘導された核酸から突然変異を含む領域を増幅することを含む、請求項２０乃至２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記突然変異の特定は、被験者から単離又は誘導された核酸をレポーター核酸とハイブリッド形成することにより突然変異を検出することを含む、請求項２０乃至２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
虚血性発作の予防及び／又は治療を行うために好適な被験者を特定する方法であって、前記方法は組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を低下させる突然変異を前記被験者において特定する段階を含む方法。
【請求項３１】
前記虚血性発作はラクナー発作である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記突然変異は前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座に位置する、請求項３０又は３２に記載の方法。
【請求項３３】
前記突然変異は前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の上流領域に位置する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記突然変異は前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座のエンハンサーエレメントに位置する、請求項３２又は３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記突然変異は組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の両対立遺伝子に存在する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３６】
前記突然変異は、組織プラスミノーゲン遺伝子座の上流領域の−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記突然変異の特定は、被験者から単離又は誘導された核酸から突然変異を含む領域を増幅することを含む、請求項３０乃至３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記突然変異の特定は、被験者から単離又は誘導された核酸をレポーター核酸とハイブリッド形成することにより突然変異を検出することを含む、請求項３０乃至３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
小血管閉塞又は小血管閉塞に関連する疾病又は状態の予防及び／又は治療を行うために好適な被験者を特定する方法であって、前記方法は組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を低下させる突然変異を前記被験者において特定する段階を含む方法。
【請求項４０】
前記疾病又は状態は、ラクナー発作、痴呆、虚血性心疾患（虚血性心筋症含む）、末梢血管疾患、血管内凝固症候群、小血管炎、虚血性神経障害、虚血性網膜症、虚血性胃疾患（小腸大腸虚血含む）、広汎性肺塞栓症又は血管性インポテンスである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記状態はラクナー発作である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記突然変異は前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座に位置する、請求項３９乃至４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記突然変異は前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の上流領域に位置する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記突然変異は前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座のエンハンサーエレメントに位置する、請求項４２又は４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記突然変異は組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の両対立遺伝子に存在する、請求項４２乃至４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記突然変異は、組織プラスミノーゲン遺伝子座の上流領域の−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記突然変異の特定は、被験者から単離又は誘導された核酸から突然変異を含む領域を増幅することを含む、請求項３９乃至４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記突然変異の特定は、被験者から単離又は誘導された核酸をレポーター核酸とハイブリッド形成することにより突然変異を検出することを含む、請求項３９乃至４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
被験者の小血管閉塞に関連する疾病又は状態の治療方法であって、前記方法は前記被験者における組織プラスミノーゲン活性化因子放出速度向上剤を前記被験者の治療に有効な量投与する段階を含む方法。
【請求項５０】
前記疾病又は状態は、ラクナー発作、痴呆、虚血性心疾患（虚血性心筋症含む）、末梢血管疾患、血管内凝固症候群、小血管炎、虚血性神経障害、虚血性網膜症、虚血性胃疾患（小腸大腸虚血含む）、広汎性肺塞栓症又は血管性インポテンスである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記状態はラクナー発作である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
小血管閉塞に関連する疾病又は状態に罹りやすい被験者の治療方法であって、前記方法は、前記被験者における組織プラスミノーゲン活性化因子放出速度向上剤を前記被験者の治療に有効な量投与する段階を含む方法。
【請求項５３】
前記疾病又は状態は、ラクナー発作、痴呆、虚血性心疾患（虚血性心筋症含む）、末梢血管疾患、血管内凝固症候群、小血管炎、虚血性神経障害、虚血性網膜症、虚血性胃疾患（小腸大腸虚血含む）、広汎性肺塞栓症又は血管性インポテンスである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記状態はラクナー発作である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を増大可能な剤を特定する方法であって、前記方法は（ａ）細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を低下させる突然変異を含む細胞に剤を作用させる段階と、（ｂ）前記剤を作用させた細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を測定する段階と（ｃ）前記剤を、細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を増大可能な剤と特定する段階とを含む方法。
【請求項５６】
前記細胞は内皮細胞である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記突然変異は前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座に位置する、請求項５５又は５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記突然変異は前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の上流領域に位置する、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記突然変異は前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座のエンハンサーエレメントに位置する、請求項５７又は５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記突然変異は組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の両対立遺伝子に存在する、請求項５７乃至５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記突然変異は、組織プラスミノーゲン遺伝子座の上流領域の−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記組織プラスミノーゲン活性化因子放出速度に決定は、組織プラスミノーゲン活性化因子の免疫学的検出を含む、請求項５５乃至６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
虚血性発作の素因を有する被験者を特定する方法であって、前記方法は、組織プラスミノーゲン遺伝子座の両対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在を前記被験者において特定する段階を含む方法。
【請求項６４】
前記虚血性発作はラクナー発作である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記突然変異の特定は、被験者から単離又は誘導された核酸から突然変異を含む領域を増幅することを含む、請求項６３又は６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記突然変異の特定は、被験者から単離又は誘導された核酸をレポーター核酸とハイブリッド形成することにより突然変異を検出することを含む、請求項６３乃至６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
小血管閉塞の素因を有する被験者を特定する方法であって、前記方法は、組織プラスミノーゲン遺伝子座の両対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在を前記被験者において特定する段階を含む方法。
【請求項６８】
前記小血管閉塞は、ラクナー発作、痴呆、虚血性心疾患（虚血性心筋症含む）、末梢血管疾患、血管内凝固症候群、小血管炎、虚血性神経障害、虚血性網膜症、虚血性胃疾患（小腸大腸虚血含む）、広汎性肺塞栓症及び血管性インポテンスを臨床的に呈する、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記小血管閉塞はラクナー発作を臨床的に呈する、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
前記突然変異の特定は、被験者から単離又は誘導された核酸から突然変異を含む領域を増幅することを含む、請求項６７乃至６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記突然変異の特定は、被験者から単離又は誘導された核酸をレポーター核酸とハイブリッド形成することにより突然変異を検出することを含む、請求項６７乃至７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
小血管閉塞に関連する疾病又は状態の素因を有する被験者を特定する方法であって、前記方法は、組織プラスミノーゲン遺伝子座の両対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在を前記被験者において特定する段階を含む方法。
【請求項７３】
前記疾病又は状態は、ラクナー発作、痴呆、虚血性心疾患（虚血性心筋症含む）、末梢血管疾患、血管内凝固症候群、小血管炎、虚血性神経障害、虚血性網膜症、虚血性胃疾患（小腸大腸虚血含む）、広汎性肺塞栓症又は血管性インポテンスである、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記状態はラクナー発作である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
前記突然変異の特定は、被験者から単離又は誘導された核酸から突然変異を含む領域を増幅することを含む、請求項７２乃至７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記突然変異の特定は、被験者から単離又は誘導された核酸をレポーター核酸とハイブリッド形成することにより突然変異を検出することを含む、請求項７２乃至７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
虚血性発作の予防及び／又は治療を行うために好適な被験者を特定する方法であって、前記方法は、組織プラスミノーゲン遺伝子座の両対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在を前記被験者において特定する段階を含む方法。
【請求項７８】
前記虚血性発作はラクナー発作である、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記突然変異の特定は、被験者から単離又は誘導された核酸から突然変異を含む領域を増幅することを含む、請求項７７又は７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記突然変異の特定は、被験者から単離又は誘導された核酸をレポーター核酸とハイブリッド形成することにより突然変異を検出することを含む、請求項７７乃至７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
小血管閉塞又は小血管閉塞に関連する疾病又は状態の予防及び／又は治療を行うために好適な被験者を特定する方法であって、前記方法は、組織プラスミノーゲン遺伝子座の両対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在を前記被験者において特定する段階を含む方法。
【請求項８２】
前記疾病又は状態は、ラクナー発作、痴呆、虚血性心疾患（虚血性心筋症含む）、末梢血管疾患、血管内凝固症候群、小血管炎、虚血性神経障害、虚血性網膜症、虚血性胃疾患（小腸大腸虚血含む）、広汎性肺塞栓症又は血管性インポテンスである、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記状態はラクナー発作である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８４】
前記突然変異の特定は、被験者から単離又は誘導された核酸から突然変異を含む領域を増幅することを含む、請求項８１乃至８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
前記突然変異の特定は、被験者から単離又は誘導された核酸をレポーター核酸とハイブリッド形成することにより突然変異を検出することを含む、請求項８１乃至８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
組織プラスミノーゲン活性化因子放出速度向上剤により治療するために好適な被験者を特定する方法であって、前記方法は、組織プラスミノーゲン遺伝子座の両対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在を前記被験者において特定する段階を含む方法。
【請求項８７】
前記被験者は虚血性発作の素因を有するか、或いはそれに罹患している、請求項８５に記載の方法。
【請求項８８】
前記虚血性発作はラクナー発作である、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記被験者は、小血管閉塞に関連する疾病又は状態の素因を有するか、或いはそれに罹患している、請求項８６に記載の方法。
【請求項９０】
前記疾病又は状態は、痴呆、虚血性心疾患（虚血性心筋症含む）、末梢血管疾患、血管内凝固症候群、小血管炎、虚血性神経障害、虚血性網膜症、虚血性胃疾患（小腸大腸虚血含む）、広汎性肺塞栓症又は血管性インポテンスである、請求項８４に記載の方法。
【請求項９１】
被験者における虚血性発作のリスクを決定する方法であって、前記方法は、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の一方若しくは両方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在を前記被験者において決定する段階を含む方法。
【請求項９２】
前記虚血性発作はラクナー発作である、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の一方若しくは両方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の被験者における存在の決定は、被験者から単離又は誘導された核酸から突然変異を含む領域を増幅することを含む、請求項９１又は９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の一方若しくは両方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の被験者における存在の決定は、被験者から単離又は誘導された核酸をレポーター核酸とハイブリッド形成することにより突然変異を検出することを含む、請求項９１乃至９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の一方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の被験者における存在は、組織プラスミノーゲン遺伝子座のいずれの対立遺伝子にも突然変異を有さない被験者の虚血性発作のリスクと比較した場合の被験者の虚血性発作のリスクの増大を示す、請求項９１乃至９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の一方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の被験者における存在は、被験者集団全体の虚血性発作に対するリスクと比較した場合の被験者の虚血性発作のリスクの増大を示す、請求項９１乃至９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の一方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の被験者における存在は、虚血性発作を伴うための他の同様のリスク因子を有する他の被験者の虚血性発作に対するリスクと比較した場合の被験者の虚血性発作のリスクの増大を示す、請求項９１乃至９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の両方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の被験者における存在は、組織プラスミノーゲン遺伝子座の一方若しくは両方の対立遺伝子に突然変異を有さない被験者の虚血性発作のリスクと比較した場合の被験者の虚血性発作のリスクの増大を示す、請求項９１乃至９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の両方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の被験者における存在は、被験者集団全体の虚血性発作に対するリスクと比較した場合の被験者の虚血性発作のリスクの増大を示す、請求項９１乃至９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の両方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の被験者における存在は、虚血性発作を伴うための他の同様のリスク因子を有する被験者の虚血性発作に対するリスクと比較した場合の被験者の虚血性発作のリスクの増大を示す、請求項９１乃至９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
被験者における小血管閉塞のリスクを決定する方法又は被験者における小血管閉塞に関連する疾病又は状態の進行のリスクを決定する方法であって、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の一方若しくは両方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の存在を前記被験者において決定する段階を含む方法。
【請求項１０２】
前記疾病又は状態或いは小血管閉塞に関連する状態は、ラクナー発作、痴呆、虚血性心疾患（虚血性心筋症含む）、末梢血管疾患、血管内凝固症候群、小血管炎、虚血性神経障害、虚血性網膜症、虚血性胃疾患（小腸大腸虚血含む）、広汎性肺塞栓症又は血管性インポテンスである、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の一方若しくは両方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の被験者における存在の決定は、被験者から単離又は誘導された核酸から突然変異を含む領域を増幅することを含む、請求項１０１又は１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の一方若しくは両方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の被験者における存在の決定は、被験者から単離又は誘導された核酸をレポーター核酸とハイブリッド形成することにより突然変異を検出することを含む、請求項１０１乃至１０３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０５】
前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の一方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の被験者における存在は、組織プラスミノーゲン遺伝子座のいずれの対立遺伝子にも突然変異を有さない被験者のリスクと比較した場合の被験者の小血管閉塞又は小血管閉塞に関連する疾病の進行のリスクの増大を示す、請求項１０１乃至１０４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０６】
前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の一方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の被験者における存在は、被験者集団全体のリスクと比較した場合の被験者の小血管閉塞又は小血管閉塞に関連する疾病の進行のリスクの増大を示す、請求項１０１乃至１０４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０７】
前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の一方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の被験者における存在は、小血管閉塞を伴うための他の同様のリスク因子を有する他の被験者のリスクと比較した場合の被験者の小血管閉塞又は小血管閉塞に関連する被験者の虚血性発作に関連する疾病の進行のリスクの増大を示す、請求項１０１乃至１０４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の両方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の被験者における存在は、組織プラスミノーゲン遺伝子座の一方若しくは両方の対立遺伝子に突然変異を有さない被験者のリスクと比較した場合の被験者の小血管閉塞又は小血管閉塞に関連する疾病の進行のリスクの増大を示す、請求項１０１乃至１０４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０９】
前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の両方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の被験者における存在は、被験者集団全体のリスクと比較した場合の被験者の小血管閉塞又は小血管閉塞に関連する疾病の進行のリスクの増大を示す、請求項１０１乃至１０４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１０】
前記組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の両方の対立遺伝子における−７３５１位のシトシンからチミンへの突然変異の被験者における存在は、小血管閉塞を伴うための他の同様のリスク因子を有する他の被験者のリスクと比較した場合の被験者の小血管閉塞又は小血管閉塞に関連する疾病の進行のリスクの増大を示す、請求項１０１乃至１０４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１１】
細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を変化可能な剤を特定する方法であって、前記方法は、（ａ）組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の一方若しくは両方の対立遺伝子における−７３５１位にシトシンチミン多型を含む細胞に剤を作用させる段階と、（ｂ）前記剤を作用させた細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を測定する段階と（ｃ）前記剤を、細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を変化可能な剤と特定する段階とを含む方法。
【請求項１１２】
細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を増大可能な剤を特定する方法であって、前記方法は、（ａ）組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子座の全部又は一部を形質転換した細胞であって、前記形質転換した遺伝子座は−７３５１位にシトシンからチミンへの突然変異を含み且つ前記形質転換した遺伝子座はレポーター遺伝子の発現を制御する細胞に剤を作用させる段階と、（ｂ）前記剤を作用させた細胞におけるレポーター遺伝子の発現レベルを決定する段階と、（ｃ）前記レポーター遺伝子の発現を増大可能な剤を特定する段階と、（ｄ）前記レポーター遺伝子の発現を増大可能な剤を、細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の放出速度を増大可能な剤と特定する段階とを含む方法。
【請求項１１３】
配列番号３に記載の配列からなる単離された核酸又はそのＲＮＡ等価物。
【請求項１１４】
配列番号３に記載の配列中に一以上の塩基置換を有する単離された核酸であって、前記核酸はストリンジェントなハイブリッド形成条件下で配列番号３の相補配列とハイブリッド化し、前記ストリンジェントなハイブリッド形成条件は４２℃における６ｘＳＳＣのハイブリッド形成及び２０℃における２ｘＳＳＣの洗浄を含む核酸。
【請求項１１５】
配列番号４に記載の配列からなる単離された核酸又はそのＲＮＡ等価物。
【請求項１１６】
配列番号４に記載の配列中に一以上の塩基置換を有する単離された核酸であって、前記核酸はストリンジェントなハイブリッド形成条件下で配列番号４の相補配列とハイブリッド化し、前記ストリンジェントなハイブリッド形成条件は４２℃における６ｘＳＳＣのハイブリッド形成及び２０℃における２ｘＳＳＣの洗浄を含む核酸。
【請求項１１７】
配列番号３に記載の配列中に一以上の塩基置換を有する単離された核酸であって、前記核酸は配列番号３と８０％以上の相同性を有する核酸或いはそのＲＮＡ等価物。
【請求項１１８】
配列番号４に記載の配列中に一以上の塩基置換を有する単離された核酸であって、前記核酸は配列番号４と８０％以上の相同性を有する核酸或いはそのＲＮＡ等価物。
【請求項１１９】
配列番号１のヌクレオチド１８４０〜２２４５の配列からなる、単離された核酸。
【請求項１２０】
虚血性発作の素因を有する被験者を特定する方法であって、前記方法は組織プラスミノーゲン活性化因子の低減された放出速度を前記被験者において特定する段階を含む方法。
【請求項１２１】
前記虚血性発作はラクナー発作である請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
小血管閉塞の素因を有する被験者を特定する方法であって、前記方法は組織プラスミノーゲン活性化因子の低減された放出速度を前記被験者において特定する段階を含む方法。
【請求項１２３】
前記小血管閉塞は、ラクナー発作、痴呆、虚血性心疾患（虚血性心筋症含む）、末梢血管疾患、血管内凝固症候群、小血管炎、虚血性神経障害、虚血性網膜症、虚血性胃疾患（小腸大腸虚血含む）、広汎性肺塞栓症及び血管性インポテンスを臨床的に呈する、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
小血管閉塞に関連する疾病又は状態の素因を有する被験者を特定する方法であって、前記方法は組織プラスミノーゲン活性化因子の低減された放出速度を前記被験者において特定する段階を含む方法。
【請求項１２５】
前記疾病又は状態は、ラクナー発作、痴呆、虚血性心疾患（虚血性心筋症含む）、末梢血管疾患、血管内凝固症候群、小血管炎、虚血性神経障害、虚血性網膜症、虚血性胃疾患（小腸大腸虚血含む）、広汎性肺塞栓症又は血管性インポテンスである、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
虚血性発作の予防及び／又は治療を行うために好適な被験者を特定する方法であって、前記方法は組織プラスミノーゲン活性化因子の低減された放出速度を前記被験者において特定する段階を含む方法。
【請求項１２７】
前記虚血性発作はラクナー発作である請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
小血管閉塞又は小血管閉塞に関連する疾病又は状態を予防及び／又は治療を行うために好適な被験者を特定する方法であって、前記方法は組織プラスミノーゲン活性化因子の低減された放出速度を前記被験者において特定する段階を含む方法。
【請求項１２９】
前記小血管閉塞に関連する疾病又は状態は、ラクナー発作、痴呆、虚血性心疾患（虚血性心筋症含む）、末梢血管疾患、血管内凝固症候群、小血管炎、虚血性神経障害、虚血性網膜症、虚血性胃疾患（小腸大腸虚血含む）、広汎性肺塞栓症又は血管性インポテンスである、請求項１２８に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２００７−５２５１９８（Ｐ２００７−５２５１９８Ａ）
【公表日】平成１９年９月６日（２００７．９．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１７９００（Ｐ２００６−５１７９００）
【出願日】平成１６年７月２日（２００４．７．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＵ２００４／０００９０５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００３３８２
【国際公開日】平成１７年１月１３日（２００５．１．１３）
【出願人】（５０６００３３２５）ザ クイーン エリザベス ホスピタル リサーチ ファンデーション インク． (1)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＱＵＥＥＮ ＥＬＩＺＡＢＥＴＨ ＨＯＳＰＩＴＡＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ ＩＮＣ．
【出願人】（５０６００３３３６）アデレード リサーチ アンド イノベイション ピーティーワイ エルティーディー (3)
【氏名又は名称原語表記】ＡＤＥＬＡＩＤＥ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＆ ＩＮＮＯＶＡＴＩＯＮ ＰＴＹ ＬＴＤ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年９月６日（２００７．９．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年７月２日（２００４．７．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＵ２００４／０００９０５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００３３８２
【国際公開日】平成１７年１月１３日（２００５．１．１３）
【出願人】（５０６００３３２５）ザ クイーン エリザベス ホスピタル リサーチ ファンデーション インク． (1)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＱＵＥＥＮ ＥＬＩＺＡＢＥＴＨ ＨＯＳＰＩＴＡＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ ＩＮＣ．
【出願人】（５０６００３３３６）アデレード リサーチ アンド イノベイション ピーティーワイ エルティーディー (3)
【氏名又は名称原語表記】ＡＤＥＬＡＩＤＥ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＆ ＩＮＮＯＶＡＴＩＯＮ ＰＴＹ ＬＴＤ
【Ｆターム（参考）】
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