発光持続性の高いルシフェラーゼを用いた破壊系細胞アッセイ法
【課題】 本発明は、ヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼを用いた細胞アッセイ方法をに関する。さらに詳しくは、発光安定性が高いルシフェラーゼを用いた細胞アッセイ方法に関する。
【解決手段】ホタルルシフェラーゼに比べ発光の減衰が少ないヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼをレポーターとして発現する細胞において、前記細胞中に存在するルシフェラーゼを細胞溶解・発光反応によって測定することによって、転写制御解析・細胞内タンパク質の存在量の変動解析などの細胞アッセイを高感度、高精度に行う方法。
【解決手段】ホタルルシフェラーゼに比べ発光の減衰が少ないヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼをレポーターとして発現する細胞において、前記細胞中に存在するルシフェラーゼを細胞溶解・発光反応によって測定することによって、転写制御解析・細胞内タンパク質の存在量の変動解析などの細胞アッセイを高感度、高精度に行う方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発光安定性の高いルシフェラーゼを用いた破壊系細胞アッセイ方法に関する。さらに詳しくは、転写活性の変動解析、細胞内タンパク質の存在量の変動解析に関する。
【背景技術】
【０００２】
レポーター遺伝子、タンパク質を用いた細胞アッセイは、基礎研究ツールとして細胞内分子メカニズムの解析から、化合物の細胞への作用の調査や所望の細胞作用を有する化合物のスクリーニングなど、化学物質の毒性評価やドラッグディスカバリーなど、産業支援ツールとして種々の研究段階で使用される技術である。
【０００３】
細胞アッセイのマーカーとして、標識色素、標識抗体、レポータータンパク質などが用いられている。レポータータンパク質として、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)やβ−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの多くの酵素が用いられてきた。その中で、ホタルルシフェラーゼの発光を利用したシステムは定量性が高く、他のレポーター酵素アッセイに比べ簡便なことから、現在広く用いられている。GFPも基質を必要とせず、励起光を照射することによって容易に検出することが可能であるが、定量化には適していない。
【０００４】
ホタルルシフェラーゼは発光性甲虫由来の発光酵素であり、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ、Ｐｈｏｔｕｒｉｓ及びＬｕｃｉｏｌａ属のホタルからｃＤＮＡが単離されている。特にＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｌａｌｉｓ由来のものは、長年に渡って仔細な研究がなされている。ホタルを含む甲虫由来のルシフェラーゼは、多複素環式有機酸Ｄ―（−）−２−（６‘−ヒドロキシ―２’―ベンゾチアゾリル)-Δ２―チアゾリン―４―カルボン酸（以後、ルシフェリンと表記する）を基質とし、Ｍｇイオン存在下でＡＴＰとルシフェリンが反応してルシフェニルアデニレートを形成し、酸素と結合し、励起状態のオキシルシフェリンが生じる。このオキシルシフェリンが基底状態に戻るときに光を発する。
【０００５】
この反応を用いたホタルルシフェラーゼの検出においては、発光の短時間性が問題となっていた。すなわち、ホタルルシフェラーゼの発光反応では、発光が急速にピーク強度に達し、閃光が放たれ、続いて、よりゆっくりではあるが依然急速に減衰する。そこで、正確な測定を実施するには発光基質を迅速に注入する機構を有するような検出器が必要であった。
【０００６】
これを解決するため、Ｋｅｅｔｈ Ｖ．Ｗ．らは補酵素Ａ（ＣｏＡ）と５ｍＭ以上のジチオトレイトール（ＤＴＴ）などのチオール試薬を発光反応に共存させることによって、発光量を増大させ、かつ発光半減期を５分以上に延長する方法を見出した（特許文献１）。さらに、ピロリン酸を添加する方法（特許文献２、３）、ルシフェラーゼ阻害剤を添加する方法（特許文献1）、ＡＭＰを添加する方法（特許文献4）などが開発された。しかしながら、これらの方法では発光強度の積分値は大きくなるものの、発光強度そのものが小さくなってしまう。そのため、発光強度が高く、持続性もあるアッセイ方法が望まれていた。
【特許文献１】特許3171595号
【特許文献２】US4,246,340
【特許文献３】特開平8-47399
【特許文献４】US5,618,682
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼを用いた細胞アッセイ方法を提供することを目的とする。さらに詳しくは、発光安定性が高いルシフェラーゼを用いた細胞アッセイ方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、特願２００５―３３２００７において、発光による細胞内イメージングツールとして、哺乳類細胞などの生細胞において高い活性を示すヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼを開示している。本発明者は、上記課題を解決するため、さらに鋭意研究を重ねた結果、本ルシフェラーゼはホタルルシフェラーゼに比べ発光の減衰が少ないこと、特に細胞溶解・発光を同時に行う検出においてホタルルシフェラーゼよりも発光強度の高い検出が可能であることを見出し、本発明を完成するに到った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
項１．下記の工程からなる、細胞アッセイ方法：
（１）ヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼを発現する試験細胞を所望の条件下で培養する工程、
（２）前記細胞を溶解する工程、
（３）前記細胞溶解液の一部またはすべてをルシフェリンを含む発光反応試薬と反応させる工程、
（４）前記反応による発光を測定し、サンプル中のルシフェラーゼの存在量を決定する工程。
項２．工程（２）、工程（３）を同時に行う、項１に記載の方法。
項３．ヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼがＰｙｒｏｐｈｏｒｕｓ属、Ｐｙｒｅａｒｉｎｕｓ属由来またはその変異体の群より選択される、項1、２のいずれかに記載の方法。
項４．ヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼが配列番号：2に示される配列を有する、項３に記載の方法。
項５．ヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼが不安定化されたルシフェラーゼである、項４に記載の方法。
項６．ヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼ遺伝子が試験対象となる転写制御配列下にある、請求項１に記載の方法。
項７．ヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼが試験対象となる第２のタンパク質との融合タンパク質である、請求項1に記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の方法により、発光安定性の高いルシフェラーゼを用いることによって、従来のホタルルシフェラーゼに比べ、安定した計測を簡便に行うことが可能になった。特に、細胞溶解、発光反応を同時に行う方法では、ホタルルシフェラーゼに比べ高感度な検出が可能である。さらに、本発明の方法により、高濃度のジチオトレイトール、AMP、阻害剤を添加することなく、安定した発光反応が行える。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明の破壊系細胞アッセイ法とは、ルシフェラーゼを発現する試験細胞を界面活性剤で破壊し、細胞内で発現するルシフェラーゼの活性を測定することを意味する。前記ルシフェラーゼは細胞内イベントをモニターするためのプローブとして利用されるもので、前記ルシフェラーゼ量を調べることによって、細胞内で起こる事象を解析することが可能である。
【００１２】
本発明の実施態様の１つは、下記の工程からなる、細胞アッセイ方法である。
（１）ヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼを発現する試験細胞を所望の条件下で培養する工程、
（２）前記細胞を溶解する工程、
（３）前記細胞溶解液の一部またはすべてをルシフェリンを含む発光反応試薬と反応させる工程、
（４）前記反応による発光を測定し、サンプル中のルシフェラーゼの存在量を決定する工程。
【００１３】
本発明で使用されるルシフェラーゼ遺伝子としては、ブラジル産ヒカリコメツキＰｙｒｅａｒｉｎｕｓ ｔｅｒｍｉｔｉｌｌｕｍｉｎａｎｓ由来のルシフェラーゼ及びその変異体が好ましい。しかしながら、類縁生物由来のルシフェラーゼであれば同様の性質を有することが考えられ、類縁生物としてはヒカリコメツキが挙げられ、Ｐｙｒｏｐｈｏｒｕｓ属あるいはＰｙｒｅａｒｉｎｕｓ属由来のルシフェラーゼが用いられる。Ｐｙｒｅａｒｉｎｕｓ属としては前記Ｐｙｒｅａｒｉｎｕｓ ｔｅｒｍｉｔｉｌｌｕｍｉｎａｎｓが、Ｐｙｒｅａｒｉｎｕｓ属としてはＰｙｒｅａｒｉｎｕｓ ｐｕｎｃｔａｔｉｓｉｍｕｓルシフェラーゼが例示される。
【００１４】
ヒカリコメツキ由来のルシフェラーゼはｐＨによる発光スペクトルの変動がなく、特にＰｙｒｅａｒｉｎｕｓ ｔｅｒｍｉｔｉｌｌｕｍｉｎａｎｓ由来のルシフェラーゼは最大発光波長５３８ ｎｍを有し（非特許文献１）、ルシフェラーゼによる発光検出の際に一般に用いられる光電子増倍管 （ＰＭＴ） やｃｈａｒｇｅｄ―ｃｏｕｐｌｅｄ device （ＣＣＤ）カメラの量子効率の最大域と一致するため、より高感度な検出が可能である。
【非特許文献１】Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ，７０，２５４−２６０（１９９０）
【００１５】
前記ルシフェラーゼ遺伝子は天然の遺伝子を使用してもよいが、試験に使用される細胞種において翻訳効率が向上するように遺伝子工学的に改変された遺伝子を用いることがより好ましい。
【００１６】
例えば、天然のヒカリコメツキルシフェラーゼ遺伝子としては配列番号１のものが挙げられ、それを改変したものとして配列番号2のヒカリコメツキ発光酵素遺伝子改変体を挙げることができる。
【００１７】
遺伝子の改変は、具体的には、a) 余分な転写因子が結合しないように、ｃDNAの配列を変えること、b）ｃDNAの配列を、昆虫のコドンユーセージ（コドンの使用頻度の偏り）を哺乳類用に変え、さらにc)使用上、制限酵素部位が多いことで応用が限定されることからそのｃDNAを変えることなどが挙げられ、これらを適宜組み合わせて翻訳効率を向上させることで、発光酵素の発現量を増大し、発光イメージングが容易に行える程度にまで発光量を高めることができ、例えば、配列番号２の遺伝子改変体は改変前の配列番号1の遺伝子と比較して150倍程度の発光量を有する。
【００１８】
例えば、哺乳類細胞における転写制御解析を行うのであれば、配列番号２のヒカリコメツキルシフェラーゼ改変体を用いることが好ましい。
あるいは、配列番号２のＤＮＡとストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、かつＰｈｏｔｉｎｕｓ Ｐｙｒａｌｉｓ由来ルシフェラーゼ遺伝子よりも哺乳類細胞内の発現活性が高い変異型遺伝子を用いることもできる。
【００１９】
「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリダイゼーションのみがおき、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいう。このような条件は、通常、「１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、３７℃」程度であり、好ましくは「０．５×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、４２℃」程度であり、さらに好ましくは「０．２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、６５℃」程度である。ハイブリダイゼーションによって得られるＤＮＡは配列番号２記載の塩基配列によって表されるＤＮＡと通常高い相同性を有する。高い相同性とは、８０%以上の相同性、好ましくは８５%以上の相同性、更に好ましくは９０%以上、特に９５%以上の相同性を示す。
【００２０】
さらに、天然の発光酵素と同一のアミノ酸配列を有しても、また１又は２以上のアミノ酸の置換、付加、欠失または挿入が含まれるものであってもよいし、Ｎ末端またはＣ末端に第２のタンパク質が結合した融合タンパク質であってもよい。
【００２１】
本発明で使用される、ヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼを発現する試験細胞は、特に限定されるものではないが、例えば、哺乳類細胞、植物細胞、昆虫細胞、酵母、細菌などが挙げられる。
哺乳類細胞を試験細胞として用いる場合には、配列番号２のヒカリコメツキルシフェラーゼ改変体のように、哺乳類細胞における翻訳効率が向上するように遺伝子工学的に改変されたルシフェラーぜ遺伝子を用いることが好ましい。試験細胞として他の細胞種を用いる場合には、配列番号１または２のヒカリコメツキルシフェラーゼ遺伝子及びその改変体遺伝子を用いることもできるが、より好ましくは試験細胞種のコドンユーセージの頻度を鑑み、改変された遺伝子であることがさらに好ましい。
【００２２】
上記の試験細胞は任意の所望の条件で培養することができる。例えば、ある生物学的過程に作用する薬剤をスクリーニングする場合、前記生物学的過程の促進または抑制の指標となるように作成されたルシフェラーゼ遺伝子構築体を試験細胞にあらかじめ導入しておき、前記細胞を種々の種類及び濃度の化合物の存在下で培養し、前記ルシフェラーゼの存在量の増減を評価する。あるいはある受容体タンパク質などの機能を解析する際には、前記タンパク質の活性化または不活性化の指標となるように作成されたルシフェラーゼ遺伝子構築体の他に、さらに前記タンパク質を発現する遺伝子構築体を試験細胞に導入し、培養することによって、前記ルシフェラーゼの存在量の増減をもとに前記タンパク質の機能を評価することもできる。
【００２３】
前記ルシフェラーゼ量の測定は、ルシフェラーゼを発現する細胞を化学的に溶解し、その処理液の全部または一部と発光反応に十分な濃度のＭｇイオン、ＡＴＰ、ルシフェリンなどを含む発光反応液を調製し、発光量をもとに各サンプル中のルシフェラーゼの相対的な存在量を決定する。
【００２４】
細胞を化学的に溶解する方法としては、界面活性剤で細胞膜を破壊する方法があり、界面活性剤としてはｄｉｇｉｔｏｎｉｎ，ｓａｐｏｎｉｎ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ８０、Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（３−Ｄ−ｇｌｕｃｏｎａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｃｈｏｌａｍｉｄｅ［ＢＩＧＣＨＡＰ］、Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（３−Ｄ−ｇｌｕｃｏｎａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｍｉｄｅ［Ｄｅｏｘｙ−ＢＩＧＣＨＡＰ］、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−９ＥＸ［Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（９） Ｌａｕｒｙｌ Ｅｔｈｅｒ］、Ｏｃｔａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｃａｍｉｄｅ［ＭＥＧＡ−８］、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０等が挙げられるが、これに限らない。また、細胞膜を破壊する物質としては、細菌毒素の用いることができる。
【００２５】
ルシフェラーゼを発現する細胞を化学的に溶解する代わりに、物理的に破砕することも可能である。物理的に破砕する方法としては、超音波破砕などが挙げられる。しかしながら、ソニケーターなどの特別な装置を必要とすることや、特にサンプル数が多くなると煩雑さが増すため、より好ましくは化学的に溶解することが好ましい。
【００２６】
このようにして溶解した細胞溶解液の一部またはすべてをルシフェリンを含む発光反応試薬と反応させる工程は特に限定されないが、例えば細胞溶解液の一部を別の容器に移し、ルシフェリンを含む発光反応試薬と反応させてルシフェラーゼを活性を測定し、残った溶解液で他の細胞内成分量の測定を行うこともできる。しかしながら、細胞溶解液のすべてを用いる場合にはさらに発光試薬を添加するだけで、別の容器への移し変えなどの操作を省略できるため、煩雑さを低減できる。さらに、細胞溶解を行う試薬に発光反応成分を加えておくことによって、操作性は向上する。
【００２７】
前記反応による発光を測定し、サンプル中のルシフェラーゼの存在量を決定する方法は特に限定されないが、例えば光電子増倍管（ＰＭＴ）や冷却ＣＣＤカメラを備えた発光測定装置などを用いて発光強度を測定し、サンプル中のルシフェラーゼの相対的な存在量を決定する。ホタルルシフェラーゼのような発光の持続性が特に低い場合には発光基質を迅速に注入するインジェクターを装着することが好ましいが、ヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼは発光安定性が比較的高いことから、インジェクターのない発光測定装置でも十分に精度の高い測定が可能である。さらに、多数のサンプルを測定する際には、96ウェル、３８４ウェル、１５３６ウェルなどのプレート対応型の発光測定装置を用いることによってハイスループットな測定を実施できる。
【００２８】
界面活性剤や細菌毒素を、発光反応に十分な濃度のＭｇイオン、ＡＴＰ、ルシフェリンを含む溶液と、細胞に同時に添加することによって、細胞溶解と発光反応を同時に進めることも可能である。この場合は細胞溶解が十分に行われ、発光反応が安定した後に発光を測定することが望ましい。
特に多くの化合物ライブラリーの中から所望の作用のある化合物をスクリーニングする場合など、多条件の細胞で同時にアッセイを行う必要がある際には操作性を向上させるため、96ウェル、３８４ウェル、１５３６ウェルなどのプレートに細胞を培養し、その後細胞溶解と発光反応を同時に進め、そのまま発光測定装置にセットして測定できることが好ましい。
【００２９】
本発明は、前記ルシフェラーゼ遺伝子上流に転写活性（プロモーター活性）を有するか、有する可能性のある被験配列を連結して、前記配列の転写制御に応じて発現されるルシフェラーゼの活性を指標に、前記配列の転写制御を解析する。哺乳類細胞において転写活性を測定するには、ルシフェラーゼ遺伝子が効率的に発現可能なように、開始コドンの上流に翻訳を効率化するためのＫｏｚａｋ配列を、ルシフェラーゼ遺伝子下流にはポリアデニル化シグナルを配置する。さらに好ましくは、ルシフェラーゼ遺伝子の上流に配置される被験配列上流に転写終結シグナルを配置することによって、被験配列以外の配列による発現への影響をできるだけ排除することが好ましい。
【００３０】
さらに、例えば該日時計遺伝子の転写制御解析のように、ダイナミックな転写活性の増減変動をする解析するためには、ルシフェラーゼの細胞内寿命があまりに長いと、いったん合成されたルシフェラーゼが細胞内に長く留まり基底状態のシグナルが高くなるため、転写の活性化がモニターしづらい。このような場合、ルシフェラーゼの細胞内寿命を短縮化することによって、より明瞭な転写活性の変動解析を行うことが可能である。ルシフェラーゼを短寿命化するには、タンパク質分解促進シグナル、例えばユビキチン化シグナルやPEST配列、をルシフェラーゼに融合することで成し遂げられる。
【００３１】
さらに、本発明は、ヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼを試験対象となる第２のタンパク質との融合タンパク質の形で発現させ、その存在量を発光を測定することによって、試験対象となったタンパク質量の調節をモニターする方法である。例えば、ＩκＢとの融合タンパク質として細胞内で発現させることによって、ＴＮＦα、IL-1など刺激によってＩκＢが分解され、転写因子NFκBが活性化されるが、一定発現プロモーターに連結されたルシフェラーゼとＩκＢとの融合タンパク質を発現することが可能な細胞において、該融合タンパク質による発光シグナルを測定することによってＩκＢの分解の程度、ＮＦκＢの活性化の程度を測定することができる。
【実施例】
【００３２】
以下、本発明の実施例を例示することによって、本発明の効果をより一層明確なものとする。
【００３３】
実施例１ ヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼの発光安定性の評価(1)
ＣＨＯ―Ｋ１細胞を、１２ウェルプレートに1ウェル当たり２×１０５ ｃｅｌｌｓ （２ ｍｌ）ずつ播種し、１０％ＦＣＳを含むＨａｍ‘ｓ Ｆ１２培地（日水製薬）中で培養した。翌日、ヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼＰｔＧＲ（配列番号２）またはホタルルシフェラーゼＦＬｕｃをＳＶ４０プロモーターに連結したプラスミドを1ウェル当たり1μｇを３μl ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地１００μｌで希釈）と混合し、１０％ＦＣＳを含むＨａｍ‘ｓ Ｆ１２培地１ ｍｌで置換した培地に添加して２４時間インキュベートした。その後、培地を除去後、Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ (Ｐｒｏｍｅｇａ社)のＰａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（５倍希釈済み）２５０μｌを加え、５分間放置して細胞を溶解した。この細胞ライセート２０μｌを１００μｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ ＩＩを加え、混合直後、３分、６分、１５分、４０分経過後の発光を測定した。この結果を図1に示す。ホタルルシフェラーゼの発光は１５分後には反応開始直後に対し２６％まで減衰が認められたが、ＰｔＧＲにおいてはほとんど減衰が認められなかった。さらに４０分後には、ホタルルシフェラーゼの発光は３％に減衰したのに対し、ＰｔＧＲでは７３％の発光を維持していた。
【００３４】
実施例２ ヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼの発光安定性の評価(2)
ＣＨＯ―Ｋ１細胞を、２４ウェルプレートに1ウェル当たり１×１０５ ｃｅｌｌｓ （２ ｍｌ）ずつ播種し、１０％ＦＣＳを含むＨａｍ‘ｓ Ｆ１２培地（日水製薬）中で培養した。翌日、ヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼＰｔＧＲ（配列番号２）またはホタルルシフェラーゼをＳＶ４０プロモーターに連結したプラスミドを１ウェル当たり０．５μｇを１．５μｌ Ｇｅｎｅ Ｊｕｉｃｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地５０μｌで希釈）と混合し、１０％FCSを含むHam’s F12培地0.5 mlで置換した培地に添加して２４時間インキュベートした。その後、培地を200μl残して除去し、200μlのＢｒｉｇｈｔ―Ｇｌｏ Ｒｅａｇｅｎｔ（プロメガ社）または２００μｌ発光試薬（４０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ―ＮａＯＨ ｐＨ ７．４、２．１４ｍＭ 塩基性炭酸マグネシウム、５．３４ｍＭ 硫酸マグネシウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．８１ｍＭ 補酵素Ａ、０．９４ｍＭ Ｄ―ルシフェリン、１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ―４０、５％ グリセロール）を加え、５分軽く振とうした。その直後、１０分、２０分、３０分後の発光を測定した。この結果を図２に示す。ホタルルシフェラーゼの発光はいずれの試薬においても３０分後には２０〜３０％に減衰したが、ヒカリコメツキ由来のルシフェラーゼの発光は７０〜９０％維持されていた。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明は、ヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼを発現する試験細胞を用いた細胞アッセイ方法を提供する。ヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼを発現する細胞を溶解し、前記ルシフェラーゼの存在量を測定する手法は、従来のホタルルシフェラーゼのアッセイに比べ発光が安定で、特に細胞溶解・発光反応を同時に行う検出方法ではシグナル強度が高いことから、プレートフォーマットで多検体を同時に処理するようなアッセイ系の感度・精度をあげることが可能である。化合物の評価・スクリーニングの系として利用することができ、化学物質の毒性評価、創薬・医療などの産業界に寄与することが大である。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】細胞溶解、発光反応を別々に行う検出試薬で、ホタルルシフェラーゼに比べ、ヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼの発光持続性が高いことを示す図である。
【図２】細胞溶解、発光反応を同時に行う検出試薬で、ホタルルシフェラーゼに比べ、ヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼの発光持続性が高いことを示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発光安定性の高いルシフェラーゼを用いた破壊系細胞アッセイ方法に関する。さらに詳しくは、転写活性の変動解析、細胞内タンパク質の存在量の変動解析に関する。
【背景技術】
【０００２】
レポーター遺伝子、タンパク質を用いた細胞アッセイは、基礎研究ツールとして細胞内分子メカニズムの解析から、化合物の細胞への作用の調査や所望の細胞作用を有する化合物のスクリーニングなど、化学物質の毒性評価やドラッグディスカバリーなど、産業支援ツールとして種々の研究段階で使用される技術である。
【０００３】
細胞アッセイのマーカーとして、標識色素、標識抗体、レポータータンパク質などが用いられている。レポータータンパク質として、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)やβ−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの多くの酵素が用いられてきた。その中で、ホタルルシフェラーゼの発光を利用したシステムは定量性が高く、他のレポーター酵素アッセイに比べ簡便なことから、現在広く用いられている。GFPも基質を必要とせず、励起光を照射することによって容易に検出することが可能であるが、定量化には適していない。
【０００４】
ホタルルシフェラーゼは発光性甲虫由来の発光酵素であり、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ、Ｐｈｏｔｕｒｉｓ及びＬｕｃｉｏｌａ属のホタルからｃＤＮＡが単離されている。特にＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｌａｌｉｓ由来のものは、長年に渡って仔細な研究がなされている。ホタルを含む甲虫由来のルシフェラーゼは、多複素環式有機酸Ｄ―（−）−２−（６‘−ヒドロキシ―２’―ベンゾチアゾリル)-Δ２―チアゾリン―４―カルボン酸（以後、ルシフェリンと表記する）を基質とし、Ｍｇイオン存在下でＡＴＰとルシフェリンが反応してルシフェニルアデニレートを形成し、酸素と結合し、励起状態のオキシルシフェリンが生じる。このオキシルシフェリンが基底状態に戻るときに光を発する。
【０００５】
この反応を用いたホタルルシフェラーゼの検出においては、発光の短時間性が問題となっていた。すなわち、ホタルルシフェラーゼの発光反応では、発光が急速にピーク強度に達し、閃光が放たれ、続いて、よりゆっくりではあるが依然急速に減衰する。そこで、正確な測定を実施するには発光基質を迅速に注入する機構を有するような検出器が必要であった。
【０００６】
これを解決するため、Ｋｅｅｔｈ Ｖ．Ｗ．らは補酵素Ａ（ＣｏＡ）と５ｍＭ以上のジチオトレイトール（ＤＴＴ）などのチオール試薬を発光反応に共存させることによって、発光量を増大させ、かつ発光半減期を５分以上に延長する方法を見出した（特許文献１）。さらに、ピロリン酸を添加する方法（特許文献２、３）、ルシフェラーゼ阻害剤を添加する方法（特許文献1）、ＡＭＰを添加する方法（特許文献4）などが開発された。しかしながら、これらの方法では発光強度の積分値は大きくなるものの、発光強度そのものが小さくなってしまう。そのため、発光強度が高く、持続性もあるアッセイ方法が望まれていた。
【特許文献１】特許3171595号
【特許文献２】US4,246,340
【特許文献３】特開平8-47399
【特許文献４】US5,618,682
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼを用いた細胞アッセイ方法を提供することを目的とする。さらに詳しくは、発光安定性が高いルシフェラーゼを用いた細胞アッセイ方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、特願２００５―３３２００７において、発光による細胞内イメージングツールとして、哺乳類細胞などの生細胞において高い活性を示すヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼを開示している。本発明者は、上記課題を解決するため、さらに鋭意研究を重ねた結果、本ルシフェラーゼはホタルルシフェラーゼに比べ発光の減衰が少ないこと、特に細胞溶解・発光を同時に行う検出においてホタルルシフェラーゼよりも発光強度の高い検出が可能であることを見出し、本発明を完成するに到った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
項１．下記の工程からなる、細胞アッセイ方法：
（１）ヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼを発現する試験細胞を所望の条件下で培養する工程、
（２）前記細胞を溶解する工程、
（３）前記細胞溶解液の一部またはすべてをルシフェリンを含む発光反応試薬と反応させる工程、
（４）前記反応による発光を測定し、サンプル中のルシフェラーゼの存在量を決定する工程。
項２．工程（２）、工程（３）を同時に行う、項１に記載の方法。
項３．ヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼがＰｙｒｏｐｈｏｒｕｓ属、Ｐｙｒｅａｒｉｎｕｓ属由来またはその変異体の群より選択される、項1、２のいずれかに記載の方法。
項４．ヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼが配列番号：2に示される配列を有する、項３に記載の方法。
項５．ヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼが不安定化されたルシフェラーゼである、項４に記載の方法。
項６．ヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼ遺伝子が試験対象となる転写制御配列下にある、請求項１に記載の方法。
項７．ヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼが試験対象となる第２のタンパク質との融合タンパク質である、請求項1に記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の方法により、発光安定性の高いルシフェラーゼを用いることによって、従来のホタルルシフェラーゼに比べ、安定した計測を簡便に行うことが可能になった。特に、細胞溶解、発光反応を同時に行う方法では、ホタルルシフェラーゼに比べ高感度な検出が可能である。さらに、本発明の方法により、高濃度のジチオトレイトール、AMP、阻害剤を添加することなく、安定した発光反応が行える。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明の破壊系細胞アッセイ法とは、ルシフェラーゼを発現する試験細胞を界面活性剤で破壊し、細胞内で発現するルシフェラーゼの活性を測定することを意味する。前記ルシフェラーゼは細胞内イベントをモニターするためのプローブとして利用されるもので、前記ルシフェラーゼ量を調べることによって、細胞内で起こる事象を解析することが可能である。
【００１２】
本発明の実施態様の１つは、下記の工程からなる、細胞アッセイ方法である。
（１）ヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼを発現する試験細胞を所望の条件下で培養する工程、
（２）前記細胞を溶解する工程、
（３）前記細胞溶解液の一部またはすべてをルシフェリンを含む発光反応試薬と反応させる工程、
（４）前記反応による発光を測定し、サンプル中のルシフェラーゼの存在量を決定する工程。
【００１３】
本発明で使用されるルシフェラーゼ遺伝子としては、ブラジル産ヒカリコメツキＰｙｒｅａｒｉｎｕｓ ｔｅｒｍｉｔｉｌｌｕｍｉｎａｎｓ由来のルシフェラーゼ及びその変異体が好ましい。しかしながら、類縁生物由来のルシフェラーゼであれば同様の性質を有することが考えられ、類縁生物としてはヒカリコメツキが挙げられ、Ｐｙｒｏｐｈｏｒｕｓ属あるいはＰｙｒｅａｒｉｎｕｓ属由来のルシフェラーゼが用いられる。Ｐｙｒｅａｒｉｎｕｓ属としては前記Ｐｙｒｅａｒｉｎｕｓ ｔｅｒｍｉｔｉｌｌｕｍｉｎａｎｓが、Ｐｙｒｅａｒｉｎｕｓ属としてはＰｙｒｅａｒｉｎｕｓ ｐｕｎｃｔａｔｉｓｉｍｕｓルシフェラーゼが例示される。
【００１４】
ヒカリコメツキ由来のルシフェラーゼはｐＨによる発光スペクトルの変動がなく、特にＰｙｒｅａｒｉｎｕｓ ｔｅｒｍｉｔｉｌｌｕｍｉｎａｎｓ由来のルシフェラーゼは最大発光波長５３８ ｎｍを有し（非特許文献１）、ルシフェラーゼによる発光検出の際に一般に用いられる光電子増倍管 （ＰＭＴ） やｃｈａｒｇｅｄ―ｃｏｕｐｌｅｄ device （ＣＣＤ）カメラの量子効率の最大域と一致するため、より高感度な検出が可能である。
【非特許文献１】Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ，７０，２５４−２６０（１９９０）
【００１５】
前記ルシフェラーゼ遺伝子は天然の遺伝子を使用してもよいが、試験に使用される細胞種において翻訳効率が向上するように遺伝子工学的に改変された遺伝子を用いることがより好ましい。
【００１６】
例えば、天然のヒカリコメツキルシフェラーゼ遺伝子としては配列番号１のものが挙げられ、それを改変したものとして配列番号2のヒカリコメツキ発光酵素遺伝子改変体を挙げることができる。
【００１７】
遺伝子の改変は、具体的には、a) 余分な転写因子が結合しないように、ｃDNAの配列を変えること、b）ｃDNAの配列を、昆虫のコドンユーセージ（コドンの使用頻度の偏り）を哺乳類用に変え、さらにc)使用上、制限酵素部位が多いことで応用が限定されることからそのｃDNAを変えることなどが挙げられ、これらを適宜組み合わせて翻訳効率を向上させることで、発光酵素の発現量を増大し、発光イメージングが容易に行える程度にまで発光量を高めることができ、例えば、配列番号２の遺伝子改変体は改変前の配列番号1の遺伝子と比較して150倍程度の発光量を有する。
【００１８】
例えば、哺乳類細胞における転写制御解析を行うのであれば、配列番号２のヒカリコメツキルシフェラーゼ改変体を用いることが好ましい。
あるいは、配列番号２のＤＮＡとストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、かつＰｈｏｔｉｎｕｓ Ｐｙｒａｌｉｓ由来ルシフェラーゼ遺伝子よりも哺乳類細胞内の発現活性が高い変異型遺伝子を用いることもできる。
【００１９】
「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリダイゼーションのみがおき、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいう。このような条件は、通常、「１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、３７℃」程度であり、好ましくは「０．５×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、４２℃」程度であり、さらに好ましくは「０．２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、６５℃」程度である。ハイブリダイゼーションによって得られるＤＮＡは配列番号２記載の塩基配列によって表されるＤＮＡと通常高い相同性を有する。高い相同性とは、８０%以上の相同性、好ましくは８５%以上の相同性、更に好ましくは９０%以上、特に９５%以上の相同性を示す。
【００２０】
さらに、天然の発光酵素と同一のアミノ酸配列を有しても、また１又は２以上のアミノ酸の置換、付加、欠失または挿入が含まれるものであってもよいし、Ｎ末端またはＣ末端に第２のタンパク質が結合した融合タンパク質であってもよい。
【００２１】
本発明で使用される、ヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼを発現する試験細胞は、特に限定されるものではないが、例えば、哺乳類細胞、植物細胞、昆虫細胞、酵母、細菌などが挙げられる。
哺乳類細胞を試験細胞として用いる場合には、配列番号２のヒカリコメツキルシフェラーゼ改変体のように、哺乳類細胞における翻訳効率が向上するように遺伝子工学的に改変されたルシフェラーぜ遺伝子を用いることが好ましい。試験細胞として他の細胞種を用いる場合には、配列番号１または２のヒカリコメツキルシフェラーゼ遺伝子及びその改変体遺伝子を用いることもできるが、より好ましくは試験細胞種のコドンユーセージの頻度を鑑み、改変された遺伝子であることがさらに好ましい。
【００２２】
上記の試験細胞は任意の所望の条件で培養することができる。例えば、ある生物学的過程に作用する薬剤をスクリーニングする場合、前記生物学的過程の促進または抑制の指標となるように作成されたルシフェラーゼ遺伝子構築体を試験細胞にあらかじめ導入しておき、前記細胞を種々の種類及び濃度の化合物の存在下で培養し、前記ルシフェラーゼの存在量の増減を評価する。あるいはある受容体タンパク質などの機能を解析する際には、前記タンパク質の活性化または不活性化の指標となるように作成されたルシフェラーゼ遺伝子構築体の他に、さらに前記タンパク質を発現する遺伝子構築体を試験細胞に導入し、培養することによって、前記ルシフェラーゼの存在量の増減をもとに前記タンパク質の機能を評価することもできる。
【００２３】
前記ルシフェラーゼ量の測定は、ルシフェラーゼを発現する細胞を化学的に溶解し、その処理液の全部または一部と発光反応に十分な濃度のＭｇイオン、ＡＴＰ、ルシフェリンなどを含む発光反応液を調製し、発光量をもとに各サンプル中のルシフェラーゼの相対的な存在量を決定する。
【００２４】
細胞を化学的に溶解する方法としては、界面活性剤で細胞膜を破壊する方法があり、界面活性剤としてはｄｉｇｉｔｏｎｉｎ，ｓａｐｏｎｉｎ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ８０、Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（３−Ｄ−ｇｌｕｃｏｎａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｃｈｏｌａｍｉｄｅ［ＢＩＧＣＨＡＰ］、Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（３−Ｄ−ｇｌｕｃｏｎａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｍｉｄｅ［Ｄｅｏｘｙ−ＢＩＧＣＨＡＰ］、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−９ＥＸ［Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（９） Ｌａｕｒｙｌ Ｅｔｈｅｒ］、Ｏｃｔａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｃａｍｉｄｅ［ＭＥＧＡ−８］、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０等が挙げられるが、これに限らない。また、細胞膜を破壊する物質としては、細菌毒素の用いることができる。
【００２５】
ルシフェラーゼを発現する細胞を化学的に溶解する代わりに、物理的に破砕することも可能である。物理的に破砕する方法としては、超音波破砕などが挙げられる。しかしながら、ソニケーターなどの特別な装置を必要とすることや、特にサンプル数が多くなると煩雑さが増すため、より好ましくは化学的に溶解することが好ましい。
【００２６】
このようにして溶解した細胞溶解液の一部またはすべてをルシフェリンを含む発光反応試薬と反応させる工程は特に限定されないが、例えば細胞溶解液の一部を別の容器に移し、ルシフェリンを含む発光反応試薬と反応させてルシフェラーゼを活性を測定し、残った溶解液で他の細胞内成分量の測定を行うこともできる。しかしながら、細胞溶解液のすべてを用いる場合にはさらに発光試薬を添加するだけで、別の容器への移し変えなどの操作を省略できるため、煩雑さを低減できる。さらに、細胞溶解を行う試薬に発光反応成分を加えておくことによって、操作性は向上する。
【００２７】
前記反応による発光を測定し、サンプル中のルシフェラーゼの存在量を決定する方法は特に限定されないが、例えば光電子増倍管（ＰＭＴ）や冷却ＣＣＤカメラを備えた発光測定装置などを用いて発光強度を測定し、サンプル中のルシフェラーゼの相対的な存在量を決定する。ホタルルシフェラーゼのような発光の持続性が特に低い場合には発光基質を迅速に注入するインジェクターを装着することが好ましいが、ヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼは発光安定性が比較的高いことから、インジェクターのない発光測定装置でも十分に精度の高い測定が可能である。さらに、多数のサンプルを測定する際には、96ウェル、３８４ウェル、１５３６ウェルなどのプレート対応型の発光測定装置を用いることによってハイスループットな測定を実施できる。
【００２８】
界面活性剤や細菌毒素を、発光反応に十分な濃度のＭｇイオン、ＡＴＰ、ルシフェリンを含む溶液と、細胞に同時に添加することによって、細胞溶解と発光反応を同時に進めることも可能である。この場合は細胞溶解が十分に行われ、発光反応が安定した後に発光を測定することが望ましい。
特に多くの化合物ライブラリーの中から所望の作用のある化合物をスクリーニングする場合など、多条件の細胞で同時にアッセイを行う必要がある際には操作性を向上させるため、96ウェル、３８４ウェル、１５３６ウェルなどのプレートに細胞を培養し、その後細胞溶解と発光反応を同時に進め、そのまま発光測定装置にセットして測定できることが好ましい。
【００２９】
本発明は、前記ルシフェラーゼ遺伝子上流に転写活性（プロモーター活性）を有するか、有する可能性のある被験配列を連結して、前記配列の転写制御に応じて発現されるルシフェラーゼの活性を指標に、前記配列の転写制御を解析する。哺乳類細胞において転写活性を測定するには、ルシフェラーゼ遺伝子が効率的に発現可能なように、開始コドンの上流に翻訳を効率化するためのＫｏｚａｋ配列を、ルシフェラーゼ遺伝子下流にはポリアデニル化シグナルを配置する。さらに好ましくは、ルシフェラーゼ遺伝子の上流に配置される被験配列上流に転写終結シグナルを配置することによって、被験配列以外の配列による発現への影響をできるだけ排除することが好ましい。
【００３０】
さらに、例えば該日時計遺伝子の転写制御解析のように、ダイナミックな転写活性の増減変動をする解析するためには、ルシフェラーゼの細胞内寿命があまりに長いと、いったん合成されたルシフェラーゼが細胞内に長く留まり基底状態のシグナルが高くなるため、転写の活性化がモニターしづらい。このような場合、ルシフェラーゼの細胞内寿命を短縮化することによって、より明瞭な転写活性の変動解析を行うことが可能である。ルシフェラーゼを短寿命化するには、タンパク質分解促進シグナル、例えばユビキチン化シグナルやPEST配列、をルシフェラーゼに融合することで成し遂げられる。
【００３１】
さらに、本発明は、ヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼを試験対象となる第２のタンパク質との融合タンパク質の形で発現させ、その存在量を発光を測定することによって、試験対象となったタンパク質量の調節をモニターする方法である。例えば、ＩκＢとの融合タンパク質として細胞内で発現させることによって、ＴＮＦα、IL-1など刺激によってＩκＢが分解され、転写因子NFκBが活性化されるが、一定発現プロモーターに連結されたルシフェラーゼとＩκＢとの融合タンパク質を発現することが可能な細胞において、該融合タンパク質による発光シグナルを測定することによってＩκＢの分解の程度、ＮＦκＢの活性化の程度を測定することができる。
【実施例】
【００３２】
以下、本発明の実施例を例示することによって、本発明の効果をより一層明確なものとする。
【００３３】
実施例１ ヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼの発光安定性の評価(1)
ＣＨＯ―Ｋ１細胞を、１２ウェルプレートに1ウェル当たり２×１０５ ｃｅｌｌｓ （２ ｍｌ）ずつ播種し、１０％ＦＣＳを含むＨａｍ‘ｓ Ｆ１２培地（日水製薬）中で培養した。翌日、ヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼＰｔＧＲ（配列番号２）またはホタルルシフェラーゼＦＬｕｃをＳＶ４０プロモーターに連結したプラスミドを1ウェル当たり1μｇを３μl ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地１００μｌで希釈）と混合し、１０％ＦＣＳを含むＨａｍ‘ｓ Ｆ１２培地１ ｍｌで置換した培地に添加して２４時間インキュベートした。その後、培地を除去後、Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ (Ｐｒｏｍｅｇａ社)のＰａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（５倍希釈済み）２５０μｌを加え、５分間放置して細胞を溶解した。この細胞ライセート２０μｌを１００μｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ ＩＩを加え、混合直後、３分、６分、１５分、４０分経過後の発光を測定した。この結果を図1に示す。ホタルルシフェラーゼの発光は１５分後には反応開始直後に対し２６％まで減衰が認められたが、ＰｔＧＲにおいてはほとんど減衰が認められなかった。さらに４０分後には、ホタルルシフェラーゼの発光は３％に減衰したのに対し、ＰｔＧＲでは７３％の発光を維持していた。
【００３４】
実施例２ ヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼの発光安定性の評価(2)
ＣＨＯ―Ｋ１細胞を、２４ウェルプレートに1ウェル当たり１×１０５ ｃｅｌｌｓ （２ ｍｌ）ずつ播種し、１０％ＦＣＳを含むＨａｍ‘ｓ Ｆ１２培地（日水製薬）中で培養した。翌日、ヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼＰｔＧＲ（配列番号２）またはホタルルシフェラーゼをＳＶ４０プロモーターに連結したプラスミドを１ウェル当たり０．５μｇを１．５μｌ Ｇｅｎｅ Ｊｕｉｃｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地５０μｌで希釈）と混合し、１０％FCSを含むHam’s F12培地0.5 mlで置換した培地に添加して２４時間インキュベートした。その後、培地を200μl残して除去し、200μlのＢｒｉｇｈｔ―Ｇｌｏ Ｒｅａｇｅｎｔ（プロメガ社）または２００μｌ発光試薬（４０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ―ＮａＯＨ ｐＨ ７．４、２．１４ｍＭ 塩基性炭酸マグネシウム、５．３４ｍＭ 硫酸マグネシウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．８１ｍＭ 補酵素Ａ、０．９４ｍＭ Ｄ―ルシフェリン、１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ―４０、５％ グリセロール）を加え、５分軽く振とうした。その直後、１０分、２０分、３０分後の発光を測定した。この結果を図２に示す。ホタルルシフェラーゼの発光はいずれの試薬においても３０分後には２０〜３０％に減衰したが、ヒカリコメツキ由来のルシフェラーゼの発光は７０〜９０％維持されていた。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明は、ヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼを発現する試験細胞を用いた細胞アッセイ方法を提供する。ヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼを発現する細胞を溶解し、前記ルシフェラーゼの存在量を測定する手法は、従来のホタルルシフェラーゼのアッセイに比べ発光が安定で、特に細胞溶解・発光反応を同時に行う検出方法ではシグナル強度が高いことから、プレートフォーマットで多検体を同時に処理するようなアッセイ系の感度・精度をあげることが可能である。化合物の評価・スクリーニングの系として利用することができ、化学物質の毒性評価、創薬・医療などの産業界に寄与することが大である。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】細胞溶解、発光反応を別々に行う検出試薬で、ホタルルシフェラーゼに比べ、ヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼの発光持続性が高いことを示す図である。
【図２】細胞溶解、発光反応を同時に行う検出試薬で、ホタルルシフェラーゼに比べ、ヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼの発光持続性が高いことを示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程からなる、細胞アッセイ方法：
（１）ヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼを発現する試験細胞を所望の条件下で培養する工程、
（２）前記細胞を溶解する工程、
（３）前記細胞溶解液の一部またはすべてをルシフェリンを含む発光反応試薬と反応させる工程、
（４）前記反応による発光を測定し、サンプル中のルシフェラーゼの存在量を決定する工程。
【請求項２】
工程（２）、工程（３）を同時に行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼがＰｙｒｏｐｈｏｒｕｓ属、Ｐｙｒｅａｒｉｎｕｓ属由来またはその変異体の群より選択される、請求項1、２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
ヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼが配列番号：2に示される配列を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼ遺伝子が試験対象となる転写制御配列下にある、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼが不安定化されたルシフェラーゼである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
ヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼが試験対象となる第２のタンパク質との融合タンパク質である、請求項1に記載の方法。
【請求項１】
下記の工程からなる、細胞アッセイ方法：
（１）ヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼを発現する試験細胞を所望の条件下で培養する工程、
（２）前記細胞を溶解する工程、
（３）前記細胞溶解液の一部またはすべてをルシフェリンを含む発光反応試薬と反応させる工程、
（４）前記反応による発光を測定し、サンプル中のルシフェラーゼの存在量を決定する工程。
【請求項２】
工程（２）、工程（３）を同時に行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼがＰｙｒｏｐｈｏｒｕｓ属、Ｐｙｒｅａｒｉｎｕｓ属由来またはその変異体の群より選択される、請求項1、２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
ヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼが配列番号：2に示される配列を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼ遺伝子が試験対象となる転写制御配列下にある、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼが不安定化されたルシフェラーゼである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
ヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼが試験対象となる第２のタンパク質との融合タンパク質である、請求項1に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００８−１１３６１９（Ｐ２００８−１１３６１９Ａ）
【公開日】平成２０年５月２２日（２００８．５．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−３０１０９４（Ｐ２００６−３０１０９４）
【出願日】平成１８年１１月７日（２００６．１１．７）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年５月２２日（２００８．５．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１１月７日（２００６．１１．７）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
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