発芽発酵ソバからＡＣＥ阻害活性画分を分画する方法
【課題】発芽発酵ソバの上清液からＡＣＥ阻害活性成分を特定するべく、発芽発酵ソバの上清液からＡＣＥ阻害活性成分を含有する画分の分取する方法を提供すること。
【解決手段】そば芽の搾汁を醗酵させて得た発芽発酵ソバの上清液よりアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性成分を含有する画分を分取する方法であって、
（ａ）発芽発酵ソバを遠心分離し、その上清液を凍結乾燥し、
（ｂ）得られた凍結乾燥物を含水アルコール溶液に溶解し、溶解液を遠心分離して得た上清液を凍結乾燥し、
（ｃ）凍結乾燥物を水に溶解させ、不溶物を濾別し、
（ｄ）得られた濾液を逆相高速液体クロマトグラフィー（逆相ＨＰＬＣ）に付し、ＡＣＥ阻害活性含有画分を分取する、
ことを特徴とするＡＣＥ阻害活性画分の分離方法。
【解決手段】そば芽の搾汁を醗酵させて得た発芽発酵ソバの上清液よりアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性成分を含有する画分を分取する方法であって、
（ａ）発芽発酵ソバを遠心分離し、その上清液を凍結乾燥し、
（ｂ）得られた凍結乾燥物を含水アルコール溶液に溶解し、溶解液を遠心分離して得た上清液を凍結乾燥し、
（ｃ）凍結乾燥物を水に溶解させ、不溶物を濾別し、
（ｄ）得られた濾液を逆相高速液体クロマトグラフィー（逆相ＨＰＬＣ）に付し、ＡＣＥ阻害活性含有画分を分取する、
ことを特徴とするＡＣＥ阻害活性画分の分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、そば芽の搾汁を乳酸菌および／または酵母菌醗酵させて得た発芽発酵ソバ（そば芽抽出液）からＡＣＥ阻害活性画分を分画する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
そば（蕎麦）は、ルチンなどのポリフェノール等の薬効成分を豊富に含む食品として知られており、古くからそば粉を利用して麺類などの各種食品に加工され、食されてきている。また最近、そばの種子を発芽させ、茎を１０〜１５ｃｍ程度に生育させたそばの若芽（そば芽：スプラウト）が緑色植物を基本とする健康食品として提案され、市場に登場してきている。
【０００３】
上記により提案されたそばの若芽（そば芽）は、そのまま食された場合には、シャキッとした歯ごたえがあり、独特の風味を有することから、簡便な生食用の生野菜として広く利用されるようになってきた。このそばの若芽も、ルチン等の薬効成分を多く含む食品として広く食されてきているが、所望の薬効を得るためには、そばの若芽をかなり大量に食さなければならない。そこで最近になって、かかるそばの若芽の有効成分を効率的に摂取し得る手段として、そばの若芽を原料としたジュースの製造方法が提案されている（特許文献１）。
【０００４】
このそばの若芽を原料とするジュースは、そば芽を破砕して搾汁（青汁）を得、かかる搾汁を乳酸菌醗酵および／または酵母菌醗酵させた上澄み液からなるものである。得られたそば芽を原料としたジュースは、特許文献１の記載によれば、そばの薬効成分を豊富に含み、飲用し易い飲み物であるとされており、そばに含まれるルチンやカリウム等を含有するジュースであるとされている。
【０００５】
かかるジュースは、乳酸菌醗酵および／または酵母菌醗酵されていることにより、搾汁液（青汁）の青臭さが減じられており、飲用時における苦痛さはないが、その効果を発揮する量を飲用するには多量のジュースを飲用しなければならない不都合がある。
したがって、大量飲料に代わる、発芽発酵ソバを効果的に含有する製品の開発が望まれていた。
【０００６】
本発明者らは、その点を改良するべく、そば芽を原料としたジュースを製造する段階で得られるそば芽の搾汁を乳酸菌醗酵および／または酵母菌醗酵させた上清液（発芽発酵ソバの上清液）を凍結乾燥させ、粉末状にしたものが、そばの有効成分をそのまま含有する、極めて有効な、発芽発酵ソバ含有粉末状組成物になることを確認し、かつ、その発芽発酵ソバ含有粉末状組成物が、アトピー性皮膚炎用、喘息予防用、花粉症予防用、アレルギー性鼻炎予防用、糖尿病予防用、動脈硬化予防用、血流改善用、適正血圧調整用、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害用、静脈瘤の予防用のための機能性食品として極めて効果的なものであること、あるいは、高血圧・脳卒中など生活習慣病の危険要因の低減・除去効果、すなわち、心拍数低下作用、血中中性脂肪低下作用を有することを確認し、特許出願を完了している（特許文献２）。
【０００７】
ところで、上記で提案した発芽発酵ソバ含有粉末状組成物は、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性はかなり強いものであり、in vitroにおける試験では、例えば市販の特定保健用食品のＩＣ５０値（４８％）と比較して、ＩＣ５０値（３．５％あるいは２．５％）と極めて低い値を示していた（非特許文献１、２）。
【０００８】
【特許文献１】特開２００２−２０９５６２号公報
【特許文献２】特開２００５−３０４３５５号公報
【非特許文献１】新村恵美、信州大学学位論文（２００６）
【非特許文献２】前島靖勲、信州大学学位論文（２００７）
【０００９】
そこで今回本発明者等は、上記した発芽発酵ソバの上清液からアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性成分を特定するべく検討を行い、ＡＣＥ阻害活性成分を含有する画分の分取を検討した。
その結果、一般的なカラムクロマトグラフィー等の分離手段ではかかるＡＣＥ阻害活性成分を含有する画分の分取を行うことは困難であり、特異的な条件に基づく逆相高速液体クロマトグラフィー（逆相ＨＰＬＣ）を用い、移動相として直線濃度勾配（グラジエント）による手法により、発芽発酵ソバの上清液からＡＣＥ阻害活性成分を含有する分画の分取に成功した。
更に、当該画分からＡＣＥ阻害活性成分を単離するべくより詳細な分画を行い、ＡＣＥ阻害活性成分を高濃度で含有する分画の取得に成功し、本発明を完成させるに至った。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって本発明は、発芽発酵ソバの上清液からＡＣＥ阻害活性成分を特定するために、発芽発酵ソバの上清液からＡＣＥ阻害活性成分を含有する画分の分取する方法を提供することを課題とする。
更に本発明は、上記で得られたＡＣＥ阻害活性成分を含有する画分を更に詳細に分画し、ＡＣＥ阻害活性成分を高濃度で含有する分画を分取する方法を提供することを課題とする。
また、本発明は、上記で分画された、ＡＣＥ阻害活性成分を含有する画分を提供すことを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
かかる課題を解決するための基本的態様として請求項１に記載の本発明は、
（１）そば芽の搾汁を醗酵させて得た発芽発酵ソバの上清液よりアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性成分を含有する画分を分取する方法であって、
（ａ）発芽発酵ソバを遠心分離し、その上清液を凍結乾燥し、
（ｂ）得られた凍結乾燥物を含水アルコール溶液に溶解し、溶解液を遠心分離して得た上清液を凍結乾燥し、
（ｃ）水に溶解させた凍結乾燥物を、所望により不溶物を濾別後、逆相高速液体クロマトグラフィー（逆相ＨＰＬＣ）に付し、ＡＣＥ阻害活性含有画分を分取する、
ことを特徴とするＡＣＥ阻害活性画分の分離方法；
である。
【００１２】
より具体的な請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の発明において、逆相ＨＰＬＣが、ＯＤＳカラムを用いた逆相ＨＰＬＣであり、移動相として、水−アセトニトリルの直線濃度勾配（０％〜７０％）で溶出することを特徴とするＡＣＥ阻害活性画分の分離方法である。
【００１３】
さらに具体的な請求項３に記載の発明は、上記請求項２に記載の発明において、ＯＤＳカラムが、ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＡＲ−３００であるＡＣＥ阻害活性画分の分離方法である。
【００１４】
また、別の態様としての請求項４に記載の本発明は、上記で得られたＡＣＥ阻害活性画分を、更にＯＤＳカラムを用いたＨＰＬＣに付し、移動相としてトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）含有水（ｐＨ１．０〜２．０）により溶出させることを特徴とするＡＣＥ阻害活性画分の分離方法である。
【００１５】
より具体的な請求項５に記載の本発明は、請求項４に記載の発明において、ＯＤＳカラムが、ＣＨＥＭＣＯＢＯＮＤ ５−ＯＤＳ−ＷであるＡＣＥ阻害活性画分の分離方法である。
【００１６】
更に別な態様における本発明は、上記で分離されたＡＣＥ阻害活性画分であり、詳細には、請求項１〜３に記載の分離方法により分離されたことを特徴とするＡＣＥ阻害活性成分を含有する画分であり、また、記請求項４又は５に記載の方法により分離されたことを特徴とするＡＣＥ阻害活性成分を含有する画分である。
【００１７】
また本発明は、ＡＣＥ阻害活性の測定方法にも関し、具体的には、前記請求項４に記載の方法により分離されたＡＣＥ阻害活性画分について、各画分のＨＰＬＣにおけるピーク面積値を基準にして、そのＡＣＥ阻害活性を測定する方法である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、発芽発酵ソバの上清液が所有するＡＣＥ阻害作用を発揮する活性成分を高濃度で含有する画分を効率良く分画することが可能となった。
したがって、この画分をそのままヒトに適用することにより効果的な高血圧治療剤、更には高血圧・脳卒中など生活習慣病の危険要因の低減・除去効果、すなわち、心拍数低下作用、血中中性脂肪低下作用を有する機能性食品、機能性飲料を提供できる利点を有している。
【００１９】
また、ＡＣＥ阻害作用を発揮する活性成分を高濃度で含有する画分を効率良く分画することが可能となったことから、ＡＣＥ阻害作用活性成分を単離・特定することができ、かかる成分の構造決定並びにその化学的合成が可能となり、より効果的な医薬品を提供できる利点を有する。
【００２０】
さらにまた、本発明が提供する分離取得方法を適宜応用することにより、発芽発酵ソバの上清液が所有する他の作用物質、例えば抗アレルギー作用物質、糖尿病予防作用物質、動脈硬化予防作用物質を単離・特定することが可能となる利点を有している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明は上記したように、そば芽の搾汁を乳酸菌醗酵および／または酵母菌醗酵させた上清液（発芽発酵ソバの上清液）から、ＡＣＥ阻害作用を発揮する活性成分を高濃度で含有する画分を効率良く分画する方法である。
かかる分画方法に使用する発芽発酵ソバの上清液は、具体的には以下のようにして得ることができる。すなわち、そばの種子を発芽させて発育させた３〜２０ｃｍ程度の茎を有するそばの若芽を洗浄し、ミキサー等により粉砕し、搾汁することによって搾汁液（青汁）を得る。次いで、得られた搾汁液を一旦冷凍して凍結させた後、凍結した搾汁液を常温により解凍すると共に、そばの若芽に付着しているおよび／または空気中に存在する自然の乳酸菌および／または酵母菌により醗酵させる。その醗酵した搾汁液の上清液として、本発明で使用する発酵発芽そばエキスの上清液を得ることができる。
【００２２】
かくして得られた発芽発酵ソバの上清液を用いた、ＡＣＥ阻害作用を発揮する活性成分を高濃度で含有する画分を分画する方法の実際を、実施例に代えて、以下に詳細に説明する。
なお、以下に説明する具体的分画方法は、その好ましい一例として記載するものであって、その目的を達成するために種々の変形が可能であり、かかる変形も本発明の技術的範囲内に包含されるものである。
また、かかる種々の変形に基づく分画方法により得られたＡＣＥ阻害活性画分も、本発明の技術的範囲内に包含されるものである。
【００２３】
１．ＡＣＥ阻害活性画分の分取用画分の調製
上記で得られた発芽発酵ソバの上清液を遠心分離（４℃／３２２０ｇ／２０分間）し、上清液を得、凍結乾燥し、凍結乾燥粉末を得る。
次いで、この凍結乾燥粉末を含水アルコール、例えば、７０％メタノール水溶液に溶解させ、溶解液を遠心分離（４℃／３２２０ｇ／２０分間）し、上清液を得、凍結乾燥し、凍結乾燥粉末を得た。
なお、ここで使用するアルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール等が挙げられ、その含水率は適宜変更することができる。
この凍結乾燥粉末を水に溶解し、０．４５μｍのフィルター Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標：ミリポア社製）による濾過を行い、得られた濾液を用いてＡＣＥ阻害活性画分の検索を行った。
【００２４】
ＡＣＥ阻害活性画分の分取としては、具体的には、逆相高速液体クロマトグラフィー（逆相ＨＰＬＣ）による分取を行った。
逆相ＨＰＬＣ分取条件は、装置：ＳＣＬ−１０Ａｖｐ、ＬＣ−６ＡＤ、ＣＴＯ−１０Ａｖｐ、ＳＰＤ−Ｍ１０Ａｖｐ、Ｍｕｌｔｉ−ＰＤＡ、Ｃｌａｓｓ−ＶＰ ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ；カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＡＲ−３００（ナカライテスク社製）；移動相Ａ：水；移動相Ｂ：アセトニトリルで、直線勾配（グラジエント）による０→１５％（０→１０分）、１５→７０％（１０→２５分）、流速：１０ｍＬ／分；カラムオーブン温度：４０℃；検出波長２５１ｎｍである。
【００２５】
その結果、８．９分付近に観察されたピークとして、ＡＣＥ阻害活性成分が含まれている画分を分取できた。
このときのＨＰＬＣクロマトグラムを図１に示した。
かくして得られたＡＣＥ阻害活性成分が含まれている画分を、遠心エバポレーターで溶媒を留去して、−４０℃にて保存した。
【００２６】
２．ＡＣＥ阻害活性物質分離条件の検討
以上のようにして得られたＡＣＥ阻害活性成分が含まれている画分（第一次画分）を更に分画し、ＡＣＥ阻害活性物質の分離を検討した。
凍結乾燥しておいた上記で得られたＡＣＥ阻害活性成分が含まれている第一次画分を、適当な濃度で水に溶解させ、０．４５μｍのフィルター Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標：ミリポア社製）で濾過し、濾液（以下、ＡＣＥ阻害活性画分サンプル）を用いてＡＣＥ阻害活性物質の分離検討を行った。
【００２７】
２−１：シリカゲルカラムを用いた検討
最初にシリカゲルカラムを用いた逆相ＨＰＬＣによる分離検討を行った。ＨＰＬＣ装置は上記１で用いた装置と同様であり、カラムとしてＴＳＫ−ｇｅｌ（登録商標）Ｓｉｌｉｃａ−１５０（４．６×２５０ｍｍ）（東ソー社製）を使用し、移動相Ａにメタノール、移動相Ｂをイソプロパノール、酢酸エチル、ジクロロメタンとした３種類の溶媒系を用い、移動相Ｂの混合比率を０、２５、５０、７５、１００％に変化させた合計１３通りの条件で分析を行った。
その結果、ＡＣＥ阻害活性ピークに含まれる物質のカラム充填剤への吸着は認められず、ピークの分離には至らなかった。
なお、混合比率５０、７５及び１００％では僅かにピークの分離がみられ、混合比率１００％のとき、すなわち、イソプロパノールのみを移動相とした場合には、さらに３つのピークに分離できたが、その分離は不十分であった。
【００２８】
２−２：アミドカラムを用いた検討
次に、ＡＣＥ阻害活性画分サンプルを９５％アセトニトリルに溶解し、０．２５ｍｇ／ｍＬに調整した。これを装置：ＬＣ−２０１０Ｃ、Ｃｌａｓｓ−ＶＰ ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ；カラム：ＴＳＫ−ｇｅｌ（登録商標）Ａｍｉｄｅ−８０（４．６×２５０ｍｍ）（東ソー社製）を使用し、流速：１．０ｍＬ／分；カラム温度：４０℃；検出波長：２１５ｎｍの条件で移動相Ａに水、移動相Ｂにアセトニトリルを用いた条件、及び、移動相Ａに０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）含有水、移動相Ｂに０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリルを用いた２種類の溶媒系を用い、移動相Ｂの混合比率を８５、９０、９５％に変化させ、合計６通りの条件で分析を行った。
その結果、アセトニトリル濃度が高いものほど保持が強くなり、ＡＣＥ阻害活性を含有する第一次画分を２本のピークに分離することができたが、水−アセトニトリル系でのアミドカラムでは十分な分離は出来なかった。
【００２９】
２−３：イオン交換カラムを用いた検討
更に、陰イオン交換カラム、陽イオン交換カラムの２種類のカラムを用いて分析を行った。
すなわち、陰イオン交換カラムでの分析は装置：ＳＩＬ−１０Ａ、ＬＣ−１０ＡＤ、ＣＴＯ−１０ＡＳ、ＣＢＭ−１０Ａ、ＳＰＤ−Ｍ１０Ａ、ＬＣ１０；カラム：Ｓｈｏｄｅｘ（登録商標）ＤＥＡＥ−８２５（８．０×７５ｍｍ）（昭和電工社製）、流速：０．８ｍＬ／分；カラム温度：４０℃；検出波長：２１５ｎｍの条件で移動相を５ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．４）、１０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．４）の２通りの条件で分析を行った。
【００３０】
一方、陽イオン交換カラムでの分析は装置：ＬＣ−２０１０Ｃ、Ｃｌａｓｓ−ＶＰ ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ；カラム：ＴＳＫ−ｇｅｌ（登録商標）ＳＰ−５ＰＷ（７．５×７５ｍｍ）（東ソー社製）、流速：０．８ｍＬ／分；カラム温度：４０℃；検出波長２１５ｎｍの条件で移動層に１ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．４）、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．６）、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．７）を用い、計３条件での分析を行った。
【００３１】
その結果、カラムが陰イオン交換カラムであり、移動相に５ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液を用いた場合には、強く吸着される物質が存在し、３５分付近のピークとなって現われたが、分離は十分でなかった。
【００３２】
２−４：イオン排除カラムを用いた検討
ＡＣＥ阻害活性画分サンプルを水に溶解し、２．５ｍｇ／ｍＬに調整した。これを装置：ＳＩＬ−２０Ａ，ＬＣ−２０ＡＤ，ＣＴＯ２０Ａ、ＳＰＤ−Ｍ２０Ａ、ＣＢＭ−２０Ａ、ＬＣｓｏｌｕｔｉｏｎ；カラム：ＴＳＫ−ｇｅｌ（登録商標）ＯＡｐａｋ−Ｐ＋ＴＳＫ−ｇｅｌ（登録商標）ＯＡｐａｋ−Ａ（６．０×４０ｍｍ＋７．８×３００ｍｍ）（東ソー社製）、流速：０．８ｍＬ／分；検出波長：２１５ｎｍの条件で、移動相として，０．１％燐酸及び１％燐酸を用いた２条件で分析を行った。
その結果、どちらの移動相条件においても物質の保持がみられいくつかのピークに分離することができたが、発芽発酵ソバのＡＣＥ阻害物質分離方法としては不十分であった。
【００３３】
２−５：ＯＤＳカラムを用いた検討
ＡＣＥ阻害活性画分サンプルを水に溶解して調製した２．５ｍｇ／ｍＬ溶液を用い、２種類のＯＤＳカラムで分離条件の検討を行った。すなわち、ＯＤＳカラムとして、ＣＯＳＭＯＳＩＬ（登録商標）５Ｃ１８−ＰＡＱを用いた分離検討では装置：ＳＩＬ−２０Ａ、ＬＣ−２０ＡＤ、ＣＴＯ２０Ａ、ＳＰＤ−Ｍ２０Ａ、ＣＢＭ−２０Ａ、ＬＣｓｏｌｕｔｉｏｎ；カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ（登録商標）５Ｃ１８−ＰＡＱ（４．６×１５０ｍｍ）（ナカライテスク社製）、流速：０．８ｍＬ／分；検出波長：２１５ｎｍの条件で、移動相として、水及びＴＦＡでｐＨ２．６に調整した水を用いた２条件で分析を行った。また、ＣＨＥＭＣＯＢＯＮＤ（登録商標）５−ＯＤＳ−Ｗを用いた分離検討ではカラム：ＣＨＥＭＣＯＢＯＮＤ（登録商標）５−ＯＤＳ−W（４．６×１５０ｍｍ；ケムコ社製）；流速：０．８ｍＬ／分；検出波長：２１５ｎｍの条件で、移動相として水、ＴＦＡでｐＨ２．６に調整した水、ＴＦＡでｐＨ２．０に調整した水を用いた３条件で分析を行った。
【００３４】
カラムにＣＯＳＭＯＳＩＬ（登録商標）５Ｃ１８−ＰＡＱ（４．６×１５０ｍｍ）を用い、移動相として水及びＴＦＡ含有水（ｐＨ２．６）を用いて得られたＨＰＬＣクロマトグラムを図２に示した。
どちらの移動相条件においても分析物質の保持がみられ、移動相にＴＦＡ含有水（ｐＨ２．６）を用いた場合に、さらに分離が向上し７本のピークに分離された。
【００３５】
また、カラムにＣＨＥＭＣＯＢＯＮＤ（登録商標）５−ＯＤＳ−Ｗ（４．６×１５０ｍｍ）を用い、移動相に水、ＴＦＡ含有水（ｐＨ２．６）、ＴＦＡ含有水（ｐＨ２．０）を用いて得られたＨＰＬＣクロマトグラムを図３に示した。
移動相のｐＨを低下させることで分離が向上しており、移動相にＴＦＡ含有水（ｐＨ２．０）を用いたもので最も良好な分離が認められた。
以上の結果から、移動相ｐＨ２．０での分離により、上記の「１：ＡＣＥ阻害活性画分サンプルの調整」で述べたＣＯＳＭＯＳＩＬ（登録商標）５Ｃ１８−ＡＲ−３００による分離で１ピークとして検出されたＡＣＥ阻害画分（第一次画分）を、１０本のピークに分離することができた。
【００３６】
以上の点から、発芽発酵ソバの上清液が所有するＡＣＥ阻害作用を発揮する活性成分を高濃度で含有する画分を、ＯＤＳカラムを使用し、ＨＰＬＣとして移動相（分離溶媒）に酸性溶媒を使用することで、効率良く分画することが可能となった。
【００３７】
使用しうるＯＤＳカラムとしては、全多孔性球状シリカゲルの表面を一反応性基型オクタデシル（モノクロロオクタデシルシリル基）、又は三反応性基型オクタデシル基で修（トリクロロ飾したものであり、充填剤の直径が約５μｍ、細孔径１３０Å、炭素率１５％、表面積３００ｍ２／ｇであり、残存するシラノール基をＴＭＳ（トリメチルシリル基）によるエンドキャップ処理（不完全エンドキャップ／完全エンドキャップ処理）をしたことを特徴とする樹脂を充填したものである。
かかるＯＤＳカラムとしては、ＣＨＥＭＣＯＢＯＮＤ（登録商標）５−ＯＤＳ−Ｗ、或いは、ＣＯＳＭＯＳＩＬ（登録商標）５Ｃ１８−ＰＡＱに限らず，これと類似した性質の充填剤で構成されるカラムであれば本発明での分離方法に使用することができる。
【００３８】
かかる検討を踏まえ、分離溶媒のｐＨの検討を行った。
３．分離溶媒のｐＨの検討
上記の検討結果から、ＡＣＥ阻害活性画分の分離のためには、水溶媒用のＯＤＳカラムが適していることが判明した。この条件検討の過程で、移動相のｐＨを小さくすることで分離能に大きな変化が認められた。
カラム条件検討の結果で得られた最適条件では、より低いｐＨに調整したＴＦＡ水（ｐＨ２．０）を移動相とした分析で、さらに良好な分離結果が得られている。
そこで移動相のｐＨを２．０から１．１まで０．１ずつ変化させて、各ピークの保持時間を求めた。
その結果、ｐＨの低下とともに１０本に分かれていたピークのなかでも、保持時間の短い順序でのピーク３、４、６、７、９の保持が高まった。ピーク１と２は、検討したｐＨ領域でほとんどリテンションタイムに変化がなかった。
【００３９】
ピーク３、４、６、７、９、１０は、移動相のｐＨが小さくなるにつれて保持時間が長くなり、逆に、ピーク５、８はｐＨが小さくなるにつれて保持時間が短くなる傾向があった。
これらの結果から、ＡＣＥ阻害活性物質を検索するために必要な各ピークの取得のためには、下記表１に示した移動相のｐＨで行うのがよいことが判明した。
【００４０】
【表１】
【００４１】
以上の結果から、全てのピークを同時に分離するには、移動相としてｐＨ１．０〜２．０、好ましくはｐＨが約１．５の移動相を使用するのがよいことが判明した。
【００４２】
上記した検討の結果、ＡＣＥ阻害活性物質を検索するために必要な各ピークに分画する最適な条件としては、例えば、以下の条件が好ましいものであった。
カラム：ＣＨＥＭＣＯＢＯＮＤ（登録商標）５−ＯＤＳ−Ｗ（４．６×１５０ｍｍ）
移動相：ＴＦＡ含有水（ｐＨ１．７）
流速：０．８ｍＬ／分
カラム温度：１９℃
検出波長：２１５ｎｍ
試料注入量：１０μＬ
【００４３】
その最適条件下で分離したＨＰＬＣクロマトグラフを図４として示す。
図中に示した結果からも判明するように、活性画分をそれぞれ独立した１０本のピークとして分離されていることが判明する。
【００４４】
以上に記載した検討の結果、発芽発酵ソバの上清液が所有するＡＣＥ阻害作用を発揮する活性成分を高濃度で含有する画分を効率良く分画するには、本発明の［課題を解決するための手段］に記載する、基本的構成による第一次分画によるＡＣＥ阻害活性画分（再一次画分）の分離、さらにＯＤＳカラムを用いた酸性移動相による分画方法が好ましいものであることが判明した。
【００４５】
本発明は、基本的には、例えば上記した方法による、発芽発酵ソバの上清液が所有するＡＣＥ阻害作用を発揮する活性成分を高濃度で含有する画分を効率良く分画する方法、及びそれにより得られたＡＣＥ阻害作用を発揮する画分であるが、本発明における発芽発酵ソバ試料のＡＣＥ阻害活性測定は、具体的には以下のようにして行われる。
【００４６】
すなわち、ＡＣＥ阻害活性測定は、Ｃｕｓｈｍａｎらが開発した方法をもとに考案された川岸らの方法にしたがって行った。
実験系ではアンジオテンシンＩの類似化合物として、基質となるHippuryl-His-Leuを用い、ＡＣＥの作用により遊離する遊離の馬尿酸の生成量を算出した。
２ｍＬ容チューブに、基質（Hippuryl-His-Leu）溶液（２５０ｍＬ）と試料溶液（３０μＬ）を入れ、３７℃で約５分間保温した。ここに酵素溶液（１００μＬ）を添加し撹拌した後、３７℃で３０分間反応させた。１Ｎ塩酸（２５０μＬ）を添加して反応を停止させた後、酢酸エチル（１０００μＬ）を添加し、十分に撹拌して遊離した馬尿酸を酢酸エチル中に抽出した。これをeppendorf centrifuge 5415Rにより遠心分離（４℃／８００ｇ／１０分）した後、酢酸エチル層８００μＬを回収し、別のチューブに入れ、遠心エバポレーター（IWAKI VEC-310）で酢酸エチルを留去した。ここに水５００μＬを添加し十分に撹拌した後ＨＰＬＣに供し、遊離馬尿酸の量を測定した。
【００４７】
試料溶液の代わりに水を用いたものをブランク、試料溶液を添加する前に１Ｎ塩酸を添加したものをサンプルコントロール、試料溶液の代わりに水を用い、酵素溶液を添加する前に１Ｎ塩酸を添加したものをブランクコントロールとして同様に測定を行った。
馬尿酸の量の測定におけるＨＰＬＣの条件は、装置：ＬＣ２０１０−ＣＴＨ、Ｃｌａｓｓ−ＶＰ ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（島津製作所社製）、カラム：ＴＳＫ−ｇｅｌ（４．６×１５０ミリメートル）ＯＤＳ １２０Ａ（東ソー社製）、移動相Ａ：水（ＴＦＡによりｐＨ３．２に調整）、移動相Ｂ：アセトニトリル：０．１％ＴＦＡ＝１０００：１、グラジエント：１０→２５％（０→１５分）（Ｂ）、カラム温度４０℃、流速：１ｍＬ／分、サンプル注入量：１０μＬ、検出波長：２２８ｎｍであった。
ＡＣＥ阻害活性は、サンプル（Ｓ）、サンプルコントロール（Ｓｃ）、ブランク（Ｂ）、ブランクコントロール（Ｂｃ）での遊離馬尿酸量を次の式に代入して求めた。
阻害率（％）＝［｛（Ｂ−Ｂｃ）−（Ｓ−Ｓｃ）｝／（Ｂ−Ｂｃ）］×１００
【００４８】
これにより得られたＡＣＥ阻害活性の値（阻害活性率）と、分画されたＨＰＬＣクロマトグラフ上の分画部のピーク面積を比較し、その相関性を求めた。
例えば、図４の番号８のピーク面積値とＡＣＥ阻害活性との相関性を図５に示した。
図中に示した結果からも判明するように、番号８のピーク面積値とＡＣＥ阻害活性とは非常に高い相関性（Ｒ２＝０．９７２９）を持つことから、番号８のピーク面積値からＡＣＥ阻害活性を類推することが可能である。
すなわち、ＨＰＬＣクロマトグラフ上においてピーク面積が大きい分画部は、ＡＣＥ阻害活性が高いという相関関係にある。
【００４９】
例えば図４に示した分画ピークを有する場合にあっては、ｙ＝１０．０９４Ｌｎ（ｘ）−５１．９２（ｘ：番号８のピーク面積値、ｙ：ＡＣＥ阻害活性）の換算式で、番号８のピーク面積値からＡＣＥ阻害活性を求めることができた。
なお、ピーク８だけでなく、ＡＣＥ阻害活性に関係する、その他の１つまたはそれ以上のピークも、同様の相関関係を示しているものであり、それらを総合的に評価し、より高い精度で発酵発芽ソバのＡＣＥ阻害活性を求めることが可能となる。
【００５０】
従来のＡＣＥ阻害活性の測定は、試料サンプルの調製と、基質との酵素反応、その結果遊離された遊離馬尿酸の有機溶媒抽出、有機溶媒留去、ＨＰＬＣによる遊離馬尿酸量の測定の４行程で行われている。そのため，操作が煩雑であり、長時間を要する点が問題であった。
これに対して本発明のＡＣＥ阻害活性の測定方法は、本発明が提供するＡＣＥ阻害活性を有する画分を分離する段階で得られた、ＨＰＬＣ各画分のピーク面積値をＨＰＬＣクロマトグラフトして測定するだけで、ＡＣＥ阻害活性を求めることができる。
したがって、発芽発酵ソバのＡＣＥ阻害活性測定が大幅に簡略化され、測定時間を短縮化することが可能となり、また、必要経費が大幅に削減できるものである。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
以上説明したように、本発明により、発芽発酵ソバの上清液が所有するＡＣＥ阻害作用を発揮する活性成分を高濃度で含有する画分を効率良く分画することが可能となった。
本発明で分画される画分をそのままヒトに適用することにより効果的な高血圧治療剤、更には高血圧・脳卒中など生活習慣病の危険要因の低減・除去効果、すなわち、心拍数低下作用、血中中性脂肪低下作用を有する機能性食品、機能性飲料を提供できる利点を有している。
【００５２】
また、ＡＣＥ阻害作用を発揮する活性成分を高濃度で含有する画分を効率良く分画することが可能となったことから、ＡＣＥ阻害作用活性成分を単離・特定することができ、かかる成分の構造決定並びにその化学的合成が可能となり、より効果的な医薬品を提供できる点でその産業上の利用可能性は多大なものである。
【００５３】
さらに、本発明が提供するＡＣＥ阻害活性の測定方法は、分離されたＡＣＥ阻害活性画分について、各画分のＨＰＬＣにおけるピーク面積値を基準にして、そのＡＣＥ阻害活性を測定する方法であり、ＡＣＥ阻害活性測定を大幅に簡略化することができ、必要経費が大幅に削減できる。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】１．ＡＣＥ阻害活性画分の分取用画分の調製における、ＨＰＬＣクロマトグラムを示した図である。
【図２】２−４：ＯＤＳカラムを用いた検討における、移動相に水及びＴＦＡ含有水（ｐＨ２．６）を用いて得られたＨＰＬＣクロマトグラムを示した図である。
【図３】２−４：ＯＤＳカラムを用いた検討における、移動相に水、ＴＦＡ含有水（ｐＨ２．６）、ＴＦＡ含有水（ｐＨ２．０）を用いて得られたＨＰＬＣクロマトグラムを示した図である。
【図４】本発明の好ましい分画条件により、第一次画分を分画してＨＰＬＣクロマトグラムを示した図である。
【図５】図４に示したピーク８の面積値とＡＣＥ阻害活性の相関を示したグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、そば芽の搾汁を乳酸菌および／または酵母菌醗酵させて得た発芽発酵ソバ（そば芽抽出液）からＡＣＥ阻害活性画分を分画する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
そば（蕎麦）は、ルチンなどのポリフェノール等の薬効成分を豊富に含む食品として知られており、古くからそば粉を利用して麺類などの各種食品に加工され、食されてきている。また最近、そばの種子を発芽させ、茎を１０〜１５ｃｍ程度に生育させたそばの若芽（そば芽：スプラウト）が緑色植物を基本とする健康食品として提案され、市場に登場してきている。
【０００３】
上記により提案されたそばの若芽（そば芽）は、そのまま食された場合には、シャキッとした歯ごたえがあり、独特の風味を有することから、簡便な生食用の生野菜として広く利用されるようになってきた。このそばの若芽も、ルチン等の薬効成分を多く含む食品として広く食されてきているが、所望の薬効を得るためには、そばの若芽をかなり大量に食さなければならない。そこで最近になって、かかるそばの若芽の有効成分を効率的に摂取し得る手段として、そばの若芽を原料としたジュースの製造方法が提案されている（特許文献１）。
【０００４】
このそばの若芽を原料とするジュースは、そば芽を破砕して搾汁（青汁）を得、かかる搾汁を乳酸菌醗酵および／または酵母菌醗酵させた上澄み液からなるものである。得られたそば芽を原料としたジュースは、特許文献１の記載によれば、そばの薬効成分を豊富に含み、飲用し易い飲み物であるとされており、そばに含まれるルチンやカリウム等を含有するジュースであるとされている。
【０００５】
かかるジュースは、乳酸菌醗酵および／または酵母菌醗酵されていることにより、搾汁液（青汁）の青臭さが減じられており、飲用時における苦痛さはないが、その効果を発揮する量を飲用するには多量のジュースを飲用しなければならない不都合がある。
したがって、大量飲料に代わる、発芽発酵ソバを効果的に含有する製品の開発が望まれていた。
【０００６】
本発明者らは、その点を改良するべく、そば芽を原料としたジュースを製造する段階で得られるそば芽の搾汁を乳酸菌醗酵および／または酵母菌醗酵させた上清液（発芽発酵ソバの上清液）を凍結乾燥させ、粉末状にしたものが、そばの有効成分をそのまま含有する、極めて有効な、発芽発酵ソバ含有粉末状組成物になることを確認し、かつ、その発芽発酵ソバ含有粉末状組成物が、アトピー性皮膚炎用、喘息予防用、花粉症予防用、アレルギー性鼻炎予防用、糖尿病予防用、動脈硬化予防用、血流改善用、適正血圧調整用、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害用、静脈瘤の予防用のための機能性食品として極めて効果的なものであること、あるいは、高血圧・脳卒中など生活習慣病の危険要因の低減・除去効果、すなわち、心拍数低下作用、血中中性脂肪低下作用を有することを確認し、特許出願を完了している（特許文献２）。
【０００７】
ところで、上記で提案した発芽発酵ソバ含有粉末状組成物は、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性はかなり強いものであり、in vitroにおける試験では、例えば市販の特定保健用食品のＩＣ５０値（４８％）と比較して、ＩＣ５０値（３．５％あるいは２．５％）と極めて低い値を示していた（非特許文献１、２）。
【０００８】
【特許文献１】特開２００２−２０９５６２号公報
【特許文献２】特開２００５−３０４３５５号公報
【非特許文献１】新村恵美、信州大学学位論文（２００６）
【非特許文献２】前島靖勲、信州大学学位論文（２００７）
【０００９】
そこで今回本発明者等は、上記した発芽発酵ソバの上清液からアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性成分を特定するべく検討を行い、ＡＣＥ阻害活性成分を含有する画分の分取を検討した。
その結果、一般的なカラムクロマトグラフィー等の分離手段ではかかるＡＣＥ阻害活性成分を含有する画分の分取を行うことは困難であり、特異的な条件に基づく逆相高速液体クロマトグラフィー（逆相ＨＰＬＣ）を用い、移動相として直線濃度勾配（グラジエント）による手法により、発芽発酵ソバの上清液からＡＣＥ阻害活性成分を含有する分画の分取に成功した。
更に、当該画分からＡＣＥ阻害活性成分を単離するべくより詳細な分画を行い、ＡＣＥ阻害活性成分を高濃度で含有する分画の取得に成功し、本発明を完成させるに至った。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって本発明は、発芽発酵ソバの上清液からＡＣＥ阻害活性成分を特定するために、発芽発酵ソバの上清液からＡＣＥ阻害活性成分を含有する画分の分取する方法を提供することを課題とする。
更に本発明は、上記で得られたＡＣＥ阻害活性成分を含有する画分を更に詳細に分画し、ＡＣＥ阻害活性成分を高濃度で含有する分画を分取する方法を提供することを課題とする。
また、本発明は、上記で分画された、ＡＣＥ阻害活性成分を含有する画分を提供すことを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
かかる課題を解決するための基本的態様として請求項１に記載の本発明は、
（１）そば芽の搾汁を醗酵させて得た発芽発酵ソバの上清液よりアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性成分を含有する画分を分取する方法であって、
（ａ）発芽発酵ソバを遠心分離し、その上清液を凍結乾燥し、
（ｂ）得られた凍結乾燥物を含水アルコール溶液に溶解し、溶解液を遠心分離して得た上清液を凍結乾燥し、
（ｃ）水に溶解させた凍結乾燥物を、所望により不溶物を濾別後、逆相高速液体クロマトグラフィー（逆相ＨＰＬＣ）に付し、ＡＣＥ阻害活性含有画分を分取する、
ことを特徴とするＡＣＥ阻害活性画分の分離方法；
である。
【００１２】
より具体的な請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の発明において、逆相ＨＰＬＣが、ＯＤＳカラムを用いた逆相ＨＰＬＣであり、移動相として、水−アセトニトリルの直線濃度勾配（０％〜７０％）で溶出することを特徴とするＡＣＥ阻害活性画分の分離方法である。
【００１３】
さらに具体的な請求項３に記載の発明は、上記請求項２に記載の発明において、ＯＤＳカラムが、ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＡＲ−３００であるＡＣＥ阻害活性画分の分離方法である。
【００１４】
また、別の態様としての請求項４に記載の本発明は、上記で得られたＡＣＥ阻害活性画分を、更にＯＤＳカラムを用いたＨＰＬＣに付し、移動相としてトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）含有水（ｐＨ１．０〜２．０）により溶出させることを特徴とするＡＣＥ阻害活性画分の分離方法である。
【００１５】
より具体的な請求項５に記載の本発明は、請求項４に記載の発明において、ＯＤＳカラムが、ＣＨＥＭＣＯＢＯＮＤ ５−ＯＤＳ−ＷであるＡＣＥ阻害活性画分の分離方法である。
【００１６】
更に別な態様における本発明は、上記で分離されたＡＣＥ阻害活性画分であり、詳細には、請求項１〜３に記載の分離方法により分離されたことを特徴とするＡＣＥ阻害活性成分を含有する画分であり、また、記請求項４又は５に記載の方法により分離されたことを特徴とするＡＣＥ阻害活性成分を含有する画分である。
【００１７】
また本発明は、ＡＣＥ阻害活性の測定方法にも関し、具体的には、前記請求項４に記載の方法により分離されたＡＣＥ阻害活性画分について、各画分のＨＰＬＣにおけるピーク面積値を基準にして、そのＡＣＥ阻害活性を測定する方法である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、発芽発酵ソバの上清液が所有するＡＣＥ阻害作用を発揮する活性成分を高濃度で含有する画分を効率良く分画することが可能となった。
したがって、この画分をそのままヒトに適用することにより効果的な高血圧治療剤、更には高血圧・脳卒中など生活習慣病の危険要因の低減・除去効果、すなわち、心拍数低下作用、血中中性脂肪低下作用を有する機能性食品、機能性飲料を提供できる利点を有している。
【００１９】
また、ＡＣＥ阻害作用を発揮する活性成分を高濃度で含有する画分を効率良く分画することが可能となったことから、ＡＣＥ阻害作用活性成分を単離・特定することができ、かかる成分の構造決定並びにその化学的合成が可能となり、より効果的な医薬品を提供できる利点を有する。
【００２０】
さらにまた、本発明が提供する分離取得方法を適宜応用することにより、発芽発酵ソバの上清液が所有する他の作用物質、例えば抗アレルギー作用物質、糖尿病予防作用物質、動脈硬化予防作用物質を単離・特定することが可能となる利点を有している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明は上記したように、そば芽の搾汁を乳酸菌醗酵および／または酵母菌醗酵させた上清液（発芽発酵ソバの上清液）から、ＡＣＥ阻害作用を発揮する活性成分を高濃度で含有する画分を効率良く分画する方法である。
かかる分画方法に使用する発芽発酵ソバの上清液は、具体的には以下のようにして得ることができる。すなわち、そばの種子を発芽させて発育させた３〜２０ｃｍ程度の茎を有するそばの若芽を洗浄し、ミキサー等により粉砕し、搾汁することによって搾汁液（青汁）を得る。次いで、得られた搾汁液を一旦冷凍して凍結させた後、凍結した搾汁液を常温により解凍すると共に、そばの若芽に付着しているおよび／または空気中に存在する自然の乳酸菌および／または酵母菌により醗酵させる。その醗酵した搾汁液の上清液として、本発明で使用する発酵発芽そばエキスの上清液を得ることができる。
【００２２】
かくして得られた発芽発酵ソバの上清液を用いた、ＡＣＥ阻害作用を発揮する活性成分を高濃度で含有する画分を分画する方法の実際を、実施例に代えて、以下に詳細に説明する。
なお、以下に説明する具体的分画方法は、その好ましい一例として記載するものであって、その目的を達成するために種々の変形が可能であり、かかる変形も本発明の技術的範囲内に包含されるものである。
また、かかる種々の変形に基づく分画方法により得られたＡＣＥ阻害活性画分も、本発明の技術的範囲内に包含されるものである。
【００２３】
１．ＡＣＥ阻害活性画分の分取用画分の調製
上記で得られた発芽発酵ソバの上清液を遠心分離（４℃／３２２０ｇ／２０分間）し、上清液を得、凍結乾燥し、凍結乾燥粉末を得る。
次いで、この凍結乾燥粉末を含水アルコール、例えば、７０％メタノール水溶液に溶解させ、溶解液を遠心分離（４℃／３２２０ｇ／２０分間）し、上清液を得、凍結乾燥し、凍結乾燥粉末を得た。
なお、ここで使用するアルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール等が挙げられ、その含水率は適宜変更することができる。
この凍結乾燥粉末を水に溶解し、０．４５μｍのフィルター Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標：ミリポア社製）による濾過を行い、得られた濾液を用いてＡＣＥ阻害活性画分の検索を行った。
【００２４】
ＡＣＥ阻害活性画分の分取としては、具体的には、逆相高速液体クロマトグラフィー（逆相ＨＰＬＣ）による分取を行った。
逆相ＨＰＬＣ分取条件は、装置：ＳＣＬ−１０Ａｖｐ、ＬＣ−６ＡＤ、ＣＴＯ−１０Ａｖｐ、ＳＰＤ−Ｍ１０Ａｖｐ、Ｍｕｌｔｉ−ＰＤＡ、Ｃｌａｓｓ−ＶＰ ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ；カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＡＲ−３００（ナカライテスク社製）；移動相Ａ：水；移動相Ｂ：アセトニトリルで、直線勾配（グラジエント）による０→１５％（０→１０分）、１５→７０％（１０→２５分）、流速：１０ｍＬ／分；カラムオーブン温度：４０℃；検出波長２５１ｎｍである。
【００２５】
その結果、８．９分付近に観察されたピークとして、ＡＣＥ阻害活性成分が含まれている画分を分取できた。
このときのＨＰＬＣクロマトグラムを図１に示した。
かくして得られたＡＣＥ阻害活性成分が含まれている画分を、遠心エバポレーターで溶媒を留去して、−４０℃にて保存した。
【００２６】
２．ＡＣＥ阻害活性物質分離条件の検討
以上のようにして得られたＡＣＥ阻害活性成分が含まれている画分（第一次画分）を更に分画し、ＡＣＥ阻害活性物質の分離を検討した。
凍結乾燥しておいた上記で得られたＡＣＥ阻害活性成分が含まれている第一次画分を、適当な濃度で水に溶解させ、０．４５μｍのフィルター Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標：ミリポア社製）で濾過し、濾液（以下、ＡＣＥ阻害活性画分サンプル）を用いてＡＣＥ阻害活性物質の分離検討を行った。
【００２７】
２−１：シリカゲルカラムを用いた検討
最初にシリカゲルカラムを用いた逆相ＨＰＬＣによる分離検討を行った。ＨＰＬＣ装置は上記１で用いた装置と同様であり、カラムとしてＴＳＫ−ｇｅｌ（登録商標）Ｓｉｌｉｃａ−１５０（４．６×２５０ｍｍ）（東ソー社製）を使用し、移動相Ａにメタノール、移動相Ｂをイソプロパノール、酢酸エチル、ジクロロメタンとした３種類の溶媒系を用い、移動相Ｂの混合比率を０、２５、５０、７５、１００％に変化させた合計１３通りの条件で分析を行った。
その結果、ＡＣＥ阻害活性ピークに含まれる物質のカラム充填剤への吸着は認められず、ピークの分離には至らなかった。
なお、混合比率５０、７５及び１００％では僅かにピークの分離がみられ、混合比率１００％のとき、すなわち、イソプロパノールのみを移動相とした場合には、さらに３つのピークに分離できたが、その分離は不十分であった。
【００２８】
２−２：アミドカラムを用いた検討
次に、ＡＣＥ阻害活性画分サンプルを９５％アセトニトリルに溶解し、０．２５ｍｇ／ｍＬに調整した。これを装置：ＬＣ−２０１０Ｃ、Ｃｌａｓｓ−ＶＰ ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ；カラム：ＴＳＫ−ｇｅｌ（登録商標）Ａｍｉｄｅ−８０（４．６×２５０ｍｍ）（東ソー社製）を使用し、流速：１．０ｍＬ／分；カラム温度：４０℃；検出波長：２１５ｎｍの条件で移動相Ａに水、移動相Ｂにアセトニトリルを用いた条件、及び、移動相Ａに０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）含有水、移動相Ｂに０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリルを用いた２種類の溶媒系を用い、移動相Ｂの混合比率を８５、９０、９５％に変化させ、合計６通りの条件で分析を行った。
その結果、アセトニトリル濃度が高いものほど保持が強くなり、ＡＣＥ阻害活性を含有する第一次画分を２本のピークに分離することができたが、水−アセトニトリル系でのアミドカラムでは十分な分離は出来なかった。
【００２９】
２−３：イオン交換カラムを用いた検討
更に、陰イオン交換カラム、陽イオン交換カラムの２種類のカラムを用いて分析を行った。
すなわち、陰イオン交換カラムでの分析は装置：ＳＩＬ−１０Ａ、ＬＣ−１０ＡＤ、ＣＴＯ−１０ＡＳ、ＣＢＭ−１０Ａ、ＳＰＤ−Ｍ１０Ａ、ＬＣ１０；カラム：Ｓｈｏｄｅｘ（登録商標）ＤＥＡＥ−８２５（８．０×７５ｍｍ）（昭和電工社製）、流速：０．８ｍＬ／分；カラム温度：４０℃；検出波長：２１５ｎｍの条件で移動相を５ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．４）、１０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．４）の２通りの条件で分析を行った。
【００３０】
一方、陽イオン交換カラムでの分析は装置：ＬＣ−２０１０Ｃ、Ｃｌａｓｓ−ＶＰ ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ；カラム：ＴＳＫ−ｇｅｌ（登録商標）ＳＰ−５ＰＷ（７．５×７５ｍｍ）（東ソー社製）、流速：０．８ｍＬ／分；カラム温度：４０℃；検出波長２１５ｎｍの条件で移動層に１ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．４）、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．６）、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．７）を用い、計３条件での分析を行った。
【００３１】
その結果、カラムが陰イオン交換カラムであり、移動相に５ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液を用いた場合には、強く吸着される物質が存在し、３５分付近のピークとなって現われたが、分離は十分でなかった。
【００３２】
２−４：イオン排除カラムを用いた検討
ＡＣＥ阻害活性画分サンプルを水に溶解し、２．５ｍｇ／ｍＬに調整した。これを装置：ＳＩＬ−２０Ａ，ＬＣ−２０ＡＤ，ＣＴＯ２０Ａ、ＳＰＤ−Ｍ２０Ａ、ＣＢＭ−２０Ａ、ＬＣｓｏｌｕｔｉｏｎ；カラム：ＴＳＫ−ｇｅｌ（登録商標）ＯＡｐａｋ−Ｐ＋ＴＳＫ−ｇｅｌ（登録商標）ＯＡｐａｋ−Ａ（６．０×４０ｍｍ＋７．８×３００ｍｍ）（東ソー社製）、流速：０．８ｍＬ／分；検出波長：２１５ｎｍの条件で、移動相として，０．１％燐酸及び１％燐酸を用いた２条件で分析を行った。
その結果、どちらの移動相条件においても物質の保持がみられいくつかのピークに分離することができたが、発芽発酵ソバのＡＣＥ阻害物質分離方法としては不十分であった。
【００３３】
２−５：ＯＤＳカラムを用いた検討
ＡＣＥ阻害活性画分サンプルを水に溶解して調製した２．５ｍｇ／ｍＬ溶液を用い、２種類のＯＤＳカラムで分離条件の検討を行った。すなわち、ＯＤＳカラムとして、ＣＯＳＭＯＳＩＬ（登録商標）５Ｃ１８−ＰＡＱを用いた分離検討では装置：ＳＩＬ−２０Ａ、ＬＣ−２０ＡＤ、ＣＴＯ２０Ａ、ＳＰＤ−Ｍ２０Ａ、ＣＢＭ−２０Ａ、ＬＣｓｏｌｕｔｉｏｎ；カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ（登録商標）５Ｃ１８−ＰＡＱ（４．６×１５０ｍｍ）（ナカライテスク社製）、流速：０．８ｍＬ／分；検出波長：２１５ｎｍの条件で、移動相として、水及びＴＦＡでｐＨ２．６に調整した水を用いた２条件で分析を行った。また、ＣＨＥＭＣＯＢＯＮＤ（登録商標）５−ＯＤＳ−Ｗを用いた分離検討ではカラム：ＣＨＥＭＣＯＢＯＮＤ（登録商標）５−ＯＤＳ−W（４．６×１５０ｍｍ；ケムコ社製）；流速：０．８ｍＬ／分；検出波長：２１５ｎｍの条件で、移動相として水、ＴＦＡでｐＨ２．６に調整した水、ＴＦＡでｐＨ２．０に調整した水を用いた３条件で分析を行った。
【００３４】
カラムにＣＯＳＭＯＳＩＬ（登録商標）５Ｃ１８−ＰＡＱ（４．６×１５０ｍｍ）を用い、移動相として水及びＴＦＡ含有水（ｐＨ２．６）を用いて得られたＨＰＬＣクロマトグラムを図２に示した。
どちらの移動相条件においても分析物質の保持がみられ、移動相にＴＦＡ含有水（ｐＨ２．６）を用いた場合に、さらに分離が向上し７本のピークに分離された。
【００３５】
また、カラムにＣＨＥＭＣＯＢＯＮＤ（登録商標）５−ＯＤＳ−Ｗ（４．６×１５０ｍｍ）を用い、移動相に水、ＴＦＡ含有水（ｐＨ２．６）、ＴＦＡ含有水（ｐＨ２．０）を用いて得られたＨＰＬＣクロマトグラムを図３に示した。
移動相のｐＨを低下させることで分離が向上しており、移動相にＴＦＡ含有水（ｐＨ２．０）を用いたもので最も良好な分離が認められた。
以上の結果から、移動相ｐＨ２．０での分離により、上記の「１：ＡＣＥ阻害活性画分サンプルの調整」で述べたＣＯＳＭＯＳＩＬ（登録商標）５Ｃ１８−ＡＲ−３００による分離で１ピークとして検出されたＡＣＥ阻害画分（第一次画分）を、１０本のピークに分離することができた。
【００３６】
以上の点から、発芽発酵ソバの上清液が所有するＡＣＥ阻害作用を発揮する活性成分を高濃度で含有する画分を、ＯＤＳカラムを使用し、ＨＰＬＣとして移動相（分離溶媒）に酸性溶媒を使用することで、効率良く分画することが可能となった。
【００３７】
使用しうるＯＤＳカラムとしては、全多孔性球状シリカゲルの表面を一反応性基型オクタデシル（モノクロロオクタデシルシリル基）、又は三反応性基型オクタデシル基で修（トリクロロ飾したものであり、充填剤の直径が約５μｍ、細孔径１３０Å、炭素率１５％、表面積３００ｍ２／ｇであり、残存するシラノール基をＴＭＳ（トリメチルシリル基）によるエンドキャップ処理（不完全エンドキャップ／完全エンドキャップ処理）をしたことを特徴とする樹脂を充填したものである。
かかるＯＤＳカラムとしては、ＣＨＥＭＣＯＢＯＮＤ（登録商標）５−ＯＤＳ−Ｗ、或いは、ＣＯＳＭＯＳＩＬ（登録商標）５Ｃ１８−ＰＡＱに限らず，これと類似した性質の充填剤で構成されるカラムであれば本発明での分離方法に使用することができる。
【００３８】
かかる検討を踏まえ、分離溶媒のｐＨの検討を行った。
３．分離溶媒のｐＨの検討
上記の検討結果から、ＡＣＥ阻害活性画分の分離のためには、水溶媒用のＯＤＳカラムが適していることが判明した。この条件検討の過程で、移動相のｐＨを小さくすることで分離能に大きな変化が認められた。
カラム条件検討の結果で得られた最適条件では、より低いｐＨに調整したＴＦＡ水（ｐＨ２．０）を移動相とした分析で、さらに良好な分離結果が得られている。
そこで移動相のｐＨを２．０から１．１まで０．１ずつ変化させて、各ピークの保持時間を求めた。
その結果、ｐＨの低下とともに１０本に分かれていたピークのなかでも、保持時間の短い順序でのピーク３、４、６、７、９の保持が高まった。ピーク１と２は、検討したｐＨ領域でほとんどリテンションタイムに変化がなかった。
【００３９】
ピーク３、４、６、７、９、１０は、移動相のｐＨが小さくなるにつれて保持時間が長くなり、逆に、ピーク５、８はｐＨが小さくなるにつれて保持時間が短くなる傾向があった。
これらの結果から、ＡＣＥ阻害活性物質を検索するために必要な各ピークの取得のためには、下記表１に示した移動相のｐＨで行うのがよいことが判明した。
【００４０】
【表１】
【００４１】
以上の結果から、全てのピークを同時に分離するには、移動相としてｐＨ１．０〜２．０、好ましくはｐＨが約１．５の移動相を使用するのがよいことが判明した。
【００４２】
上記した検討の結果、ＡＣＥ阻害活性物質を検索するために必要な各ピークに分画する最適な条件としては、例えば、以下の条件が好ましいものであった。
カラム：ＣＨＥＭＣＯＢＯＮＤ（登録商標）５−ＯＤＳ−Ｗ（４．６×１５０ｍｍ）
移動相：ＴＦＡ含有水（ｐＨ１．７）
流速：０．８ｍＬ／分
カラム温度：１９℃
検出波長：２１５ｎｍ
試料注入量：１０μＬ
【００４３】
その最適条件下で分離したＨＰＬＣクロマトグラフを図４として示す。
図中に示した結果からも判明するように、活性画分をそれぞれ独立した１０本のピークとして分離されていることが判明する。
【００４４】
以上に記載した検討の結果、発芽発酵ソバの上清液が所有するＡＣＥ阻害作用を発揮する活性成分を高濃度で含有する画分を効率良く分画するには、本発明の［課題を解決するための手段］に記載する、基本的構成による第一次分画によるＡＣＥ阻害活性画分（再一次画分）の分離、さらにＯＤＳカラムを用いた酸性移動相による分画方法が好ましいものであることが判明した。
【００４５】
本発明は、基本的には、例えば上記した方法による、発芽発酵ソバの上清液が所有するＡＣＥ阻害作用を発揮する活性成分を高濃度で含有する画分を効率良く分画する方法、及びそれにより得られたＡＣＥ阻害作用を発揮する画分であるが、本発明における発芽発酵ソバ試料のＡＣＥ阻害活性測定は、具体的には以下のようにして行われる。
【００４６】
すなわち、ＡＣＥ阻害活性測定は、Ｃｕｓｈｍａｎらが開発した方法をもとに考案された川岸らの方法にしたがって行った。
実験系ではアンジオテンシンＩの類似化合物として、基質となるHippuryl-His-Leuを用い、ＡＣＥの作用により遊離する遊離の馬尿酸の生成量を算出した。
２ｍＬ容チューブに、基質（Hippuryl-His-Leu）溶液（２５０ｍＬ）と試料溶液（３０μＬ）を入れ、３７℃で約５分間保温した。ここに酵素溶液（１００μＬ）を添加し撹拌した後、３７℃で３０分間反応させた。１Ｎ塩酸（２５０μＬ）を添加して反応を停止させた後、酢酸エチル（１０００μＬ）を添加し、十分に撹拌して遊離した馬尿酸を酢酸エチル中に抽出した。これをeppendorf centrifuge 5415Rにより遠心分離（４℃／８００ｇ／１０分）した後、酢酸エチル層８００μＬを回収し、別のチューブに入れ、遠心エバポレーター（IWAKI VEC-310）で酢酸エチルを留去した。ここに水５００μＬを添加し十分に撹拌した後ＨＰＬＣに供し、遊離馬尿酸の量を測定した。
【００４７】
試料溶液の代わりに水を用いたものをブランク、試料溶液を添加する前に１Ｎ塩酸を添加したものをサンプルコントロール、試料溶液の代わりに水を用い、酵素溶液を添加する前に１Ｎ塩酸を添加したものをブランクコントロールとして同様に測定を行った。
馬尿酸の量の測定におけるＨＰＬＣの条件は、装置：ＬＣ２０１０−ＣＴＨ、Ｃｌａｓｓ−ＶＰ ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（島津製作所社製）、カラム：ＴＳＫ−ｇｅｌ（４．６×１５０ミリメートル）ＯＤＳ １２０Ａ（東ソー社製）、移動相Ａ：水（ＴＦＡによりｐＨ３．２に調整）、移動相Ｂ：アセトニトリル：０．１％ＴＦＡ＝１０００：１、グラジエント：１０→２５％（０→１５分）（Ｂ）、カラム温度４０℃、流速：１ｍＬ／分、サンプル注入量：１０μＬ、検出波長：２２８ｎｍであった。
ＡＣＥ阻害活性は、サンプル（Ｓ）、サンプルコントロール（Ｓｃ）、ブランク（Ｂ）、ブランクコントロール（Ｂｃ）での遊離馬尿酸量を次の式に代入して求めた。
阻害率（％）＝［｛（Ｂ−Ｂｃ）−（Ｓ−Ｓｃ）｝／（Ｂ−Ｂｃ）］×１００
【００４８】
これにより得られたＡＣＥ阻害活性の値（阻害活性率）と、分画されたＨＰＬＣクロマトグラフ上の分画部のピーク面積を比較し、その相関性を求めた。
例えば、図４の番号８のピーク面積値とＡＣＥ阻害活性との相関性を図５に示した。
図中に示した結果からも判明するように、番号８のピーク面積値とＡＣＥ阻害活性とは非常に高い相関性（Ｒ２＝０．９７２９）を持つことから、番号８のピーク面積値からＡＣＥ阻害活性を類推することが可能である。
すなわち、ＨＰＬＣクロマトグラフ上においてピーク面積が大きい分画部は、ＡＣＥ阻害活性が高いという相関関係にある。
【００４９】
例えば図４に示した分画ピークを有する場合にあっては、ｙ＝１０．０９４Ｌｎ（ｘ）−５１．９２（ｘ：番号８のピーク面積値、ｙ：ＡＣＥ阻害活性）の換算式で、番号８のピーク面積値からＡＣＥ阻害活性を求めることができた。
なお、ピーク８だけでなく、ＡＣＥ阻害活性に関係する、その他の１つまたはそれ以上のピークも、同様の相関関係を示しているものであり、それらを総合的に評価し、より高い精度で発酵発芽ソバのＡＣＥ阻害活性を求めることが可能となる。
【００５０】
従来のＡＣＥ阻害活性の測定は、試料サンプルの調製と、基質との酵素反応、その結果遊離された遊離馬尿酸の有機溶媒抽出、有機溶媒留去、ＨＰＬＣによる遊離馬尿酸量の測定の４行程で行われている。そのため，操作が煩雑であり、長時間を要する点が問題であった。
これに対して本発明のＡＣＥ阻害活性の測定方法は、本発明が提供するＡＣＥ阻害活性を有する画分を分離する段階で得られた、ＨＰＬＣ各画分のピーク面積値をＨＰＬＣクロマトグラフトして測定するだけで、ＡＣＥ阻害活性を求めることができる。
したがって、発芽発酵ソバのＡＣＥ阻害活性測定が大幅に簡略化され、測定時間を短縮化することが可能となり、また、必要経費が大幅に削減できるものである。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
以上説明したように、本発明により、発芽発酵ソバの上清液が所有するＡＣＥ阻害作用を発揮する活性成分を高濃度で含有する画分を効率良く分画することが可能となった。
本発明で分画される画分をそのままヒトに適用することにより効果的な高血圧治療剤、更には高血圧・脳卒中など生活習慣病の危険要因の低減・除去効果、すなわち、心拍数低下作用、血中中性脂肪低下作用を有する機能性食品、機能性飲料を提供できる利点を有している。
【００５２】
また、ＡＣＥ阻害作用を発揮する活性成分を高濃度で含有する画分を効率良く分画することが可能となったことから、ＡＣＥ阻害作用活性成分を単離・特定することができ、かかる成分の構造決定並びにその化学的合成が可能となり、より効果的な医薬品を提供できる点でその産業上の利用可能性は多大なものである。
【００５３】
さらに、本発明が提供するＡＣＥ阻害活性の測定方法は、分離されたＡＣＥ阻害活性画分について、各画分のＨＰＬＣにおけるピーク面積値を基準にして、そのＡＣＥ阻害活性を測定する方法であり、ＡＣＥ阻害活性測定を大幅に簡略化することができ、必要経費が大幅に削減できる。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】１．ＡＣＥ阻害活性画分の分取用画分の調製における、ＨＰＬＣクロマトグラムを示した図である。
【図２】２−４：ＯＤＳカラムを用いた検討における、移動相に水及びＴＦＡ含有水（ｐＨ２．６）を用いて得られたＨＰＬＣクロマトグラムを示した図である。
【図３】２−４：ＯＤＳカラムを用いた検討における、移動相に水、ＴＦＡ含有水（ｐＨ２．６）、ＴＦＡ含有水（ｐＨ２．０）を用いて得られたＨＰＬＣクロマトグラムを示した図である。
【図４】本発明の好ましい分画条件により、第一次画分を分画してＨＰＬＣクロマトグラムを示した図である。
【図５】図４に示したピーク８の面積値とＡＣＥ阻害活性の相関を示したグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
そば芽の搾汁を醗酵させて得た発酵発芽ソバの上清液よりアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性成分を含有する画分を分取する方法であって、
（ａ）発芽発酵ソバを遠心分離し、その上清液を凍結乾燥し、
（ｂ）得られた凍結乾燥物を含水アルコール溶液に溶解し、溶解液を遠心分離して得た上清液を凍結乾燥し、
（ｃ）水に溶解した凍結乾燥物を逆相高速液体クロマトグラフィー（逆相ＨＰＬＣ）に付し、ＡＣＥ阻害活性含有画分を分取する、
ことを特徴とするＡＣＥ阻害活性画分の分離方法。
【請求項２】
逆相ＨＰＬＣが、ＯＤＳカラムを用いた逆相ＨＰＬＣであり、移動相として、水−アセトニトリルの直線濃度勾配（０％〜７０％）で溶出することを特徴とする請求項１に記載のＡＣＥ阻害活性画分の分離方法。
【請求項３】
ＯＤＳカラムが、ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＡＲ−３００である請求項２に記載のＡＣＥ阻害活性画分の分離方法。
【請求項４】
上記請求項１〜３で得られたＡＣＥ阻害活性画分を、更にＯＤＳカラムを用いたＨＰＬＣに付し、移動相としてトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）含有水（ｐＨ１．０〜２．０）により溶出させることを特徴とするＡＣＥ阻害活性画分の分離方法。
【請求項５】
ＯＤＳカラムが、ＣＨＥＭＣＯＢＯＮＤ ５−ＯＤＳ−Ｗである請求項４に記載のＡＣＥ阻害活性画分の分離方法。
【請求項６】
上記請求項１〜３に記載のいずれかの分離方法により分離されたことを特徴とするＡＣＥ阻害活性成分を含有する画分。
【請求項７】
上記請求項４又は５に記載の方法により分離されたことを特徴とするＡＣＥ阻害活性成分を含有する画分。
【請求項８】
前記請求項４に記載の方法により分離されたＡＣＥ阻害活性画分について、各画分のＨＰＬＣにおけるピーク面積値を基準にして、そのＡＣＥ阻害活性を測定する方法。
【請求項１】
そば芽の搾汁を醗酵させて得た発酵発芽ソバの上清液よりアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性成分を含有する画分を分取する方法であって、
（ａ）発芽発酵ソバを遠心分離し、その上清液を凍結乾燥し、
（ｂ）得られた凍結乾燥物を含水アルコール溶液に溶解し、溶解液を遠心分離して得た上清液を凍結乾燥し、
（ｃ）水に溶解した凍結乾燥物を逆相高速液体クロマトグラフィー（逆相ＨＰＬＣ）に付し、ＡＣＥ阻害活性含有画分を分取する、
ことを特徴とするＡＣＥ阻害活性画分の分離方法。
【請求項２】
逆相ＨＰＬＣが、ＯＤＳカラムを用いた逆相ＨＰＬＣであり、移動相として、水−アセトニトリルの直線濃度勾配（０％〜７０％）で溶出することを特徴とする請求項１に記載のＡＣＥ阻害活性画分の分離方法。
【請求項３】
ＯＤＳカラムが、ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＡＲ−３００である請求項２に記載のＡＣＥ阻害活性画分の分離方法。
【請求項４】
上記請求項１〜３で得られたＡＣＥ阻害活性画分を、更にＯＤＳカラムを用いたＨＰＬＣに付し、移動相としてトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）含有水（ｐＨ１．０〜２．０）により溶出させることを特徴とするＡＣＥ阻害活性画分の分離方法。
【請求項５】
ＯＤＳカラムが、ＣＨＥＭＣＯＢＯＮＤ ５−ＯＤＳ−Ｗである請求項４に記載のＡＣＥ阻害活性画分の分離方法。
【請求項６】
上記請求項１〜３に記載のいずれかの分離方法により分離されたことを特徴とするＡＣＥ阻害活性成分を含有する画分。
【請求項７】
上記請求項４又は５に記載の方法により分離されたことを特徴とするＡＣＥ阻害活性成分を含有する画分。
【請求項８】
前記請求項４に記載の方法により分離されたＡＣＥ阻害活性画分について、各画分のＨＰＬＣにおけるピーク面積値を基準にして、そのＡＣＥ阻害活性を測定する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００８−２３９４９８（Ｐ２００８−２３９４９８Ａ）
【公開日】平成２０年１０月９日（２００８．１０．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−７７９９０（Ｐ２００７−７７９９０）
【出願日】平成１９年３月２４日（２００７．３．２４）
【出願人】（５０４１８０２３９）国立大学法人信州大学 (759)
【出願人】（５０３１１２５５８）株式会社海洋牧場 (5)
【出願人】（５０２２６９８８２）株式会社不二工芸製作所 (5)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１０月９日（２００８．１０．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月２４日（２００７．３．２４）
【出願人】（５０４１８０２３９）国立大学法人信州大学 (759)
【出願人】（５０３１１２５５８）株式会社海洋牧場 (5)
【出願人】（５０２２６９８８２）株式会社不二工芸製作所 (5)
【Ｆターム（参考）】
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