発酵用酵素ブレンド
本発明はグルコアミラーゼ、酸安定性アルファアミラーゼ、及び酸性菌類プロテアーゼを含む酵素ブレンド組成物に関する。さらに、本発明は発酵性糖類からのアルコール類のような最終産物を生産する方法であって、（ａ）デンプン含有粉砕穀物を含むスラリーをアルファアミラーゼと接触させ液状化物を生産する段階、（ｂ）前記液状化物をグルコアミラーゼ、酸安定性アルファアミラーゼ、及び酸性菌類プロテアーゼと接触させ発酵性糖類を生産する段階、及び（ｃ）発酵生物の存在下発酵性糖類を発酵させ最終産物を生産する段階を含む方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はグルコアミラーゼ、酸安定性アルファアミラーゼ、及び酸性菌類プロテアーゼを含む酵素ブレンドに関する。また、本発明は例えばエタノールのような最終産物を生産するようなデンプン転換プロセスにおける酵素ブレンドを利用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
産業用発酵は、酵素類、タンパク質類、アミノ酸類、有機酸類、糖アルコール類、医薬品類、及び他の生物化学薬品類のような、多くの最終産物の生産のための原料として、グルコースを主に用いる。多くの利用においてグルコースはデンプン及びセルロース（例、全体を粉砕される穀物）含有基質の酵素的転換から生産される。デンプンは、アミロース及びアミロペクチンという二つのポリサッカライド分画を有し、顆粒状粒子として、植物細胞中に存在する。これらの顆粒の部分的結晶構造は冷水中不溶性であり、その結果、水に対するデンプン顆粒の可溶化は一般的に顆粒の結晶構造を崩壊するための熱エネルギーが必要となる。多大なプロセスをデンプン可溶化に使用し、これらは粒状デンプン含有基質の直接的及び間接的加熱を含む（例えば、ＳＴＡＲＣＨ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＡＮＤ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ, Ｅｄｓ Ｒ.Ｌ. Ｗｈｉｓｔｌｅｒ他、２ｎｄ Ｅｄ., １９８４ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ., Ｏｒｌａｎｄｏ ＦＬ及びＳＴＡＲＣＨ ＣＯＮＶＥＲＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ, Ｅｄｓ Ｇ.Ｍ.Ａ. Ｖａｎ Ｂｅｙｎｕｍ他、Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｅｒｉｅｓ １９８５ Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ. ＮＹを参照）。
【０００３】
一般的に、デンプンからグルコースへの処理は、二段階からなり、これらの段階はデンプンの液状化及び液化デンプンの糖化を含む。さらに、段階は、（ａ）所望の最終産物が精製デキストロース又はフルクトースの場合に、精製及び異性化又は（ｂ）所望の最終産物が例えば、アルコール（例、エタノール）の場合に、発酵及び蒸留を含んでよい。
【０００４】
デンプン液状化プロセスの目的はデンプンポリマー顆粒のスラリーを低粘度のさらに短い鎖の長さであるデキストリンの液体へ転換することである。これは、デンプン転換プロセスにて用いる産業用装置の便利な操作のための重要な段階である。通常、デンプンは高温及び酵素的生物的変換の使用により液化される。例えば、通常の酵素的液状化プロセスは熱安定性微生物のアルファアミラーゼ（例、スペザイム（商標）プライム（ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＰＲＩＭＥ）及びスペザイム（商標）フレッド （ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＦＲＥＤ）、スペザイム（商標）エチル（ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＸＴＨＹＬ） (ダニスコユー．エス．インク、ジェネンコ ディビジョン（Ｄａｎｉｓｃｏ Ｕ．Ｓ．， Ｉｎｃ， Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）)、又はターマミルＳＣ（ＴＥＲＭＡＭＹＬ ＳＣ）、ターマミル スープラ （ＴＥＲＭＡＭＹＬ ＳＵＰＲＡ）又はターマミル １２０Ｌ（ＴＥＲＭＡＮＹＬ １２０Ｌ） (ノボザイムズ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）)）を粒状デンプン含有基質を含むスラリーに添加し、ｐＨを５．５から６．５の間及び９０℃以上の温度に調整することを伴う。デンプンは液化し、そして、糖化酵素に接触される。典型的に、糖化は、アスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）（例、オプチデックスＬ−４００（ＯＰＴＩＤＥＸ Ｌ−４００）(ジェネンコ インターナショナル社（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ）)）由来のグルコアミラーゼのようなグルコアミラーゼの存在下液状化段階のｐＨより酸性のｐＨで起こる。
【０００５】
数多くのバリエーションがデンプン基質の液状化及び糖化には存在する、しかし、デンプンの液状化、糖化、及び発酵のための効率のよい手段の必要性がなお存在する。
【発明の概要】
【０００６】
本発明はグルコアミラーゼ（ＧＡ）、酸性菌類プロテアーゼ（ＡＦＰ）、及び酸安定性アルファアミラーゼ（ＡＡ）を含む酵素ブレンド組成物に関する。好ましくは、グルコアミラーゼ、酸安定性アルファアミラーゼ、及び酸性菌類プロテアーゼの比がＧＡＵ：ＳＳＵ：ＳＡＰＵで測定した場合、約１：１．５：０．１から約１：８：１又は約１：２：０．２から約１：５：０．６である。
【０００７】
酵素ブレンド組成物は発酵性糖からの最終産物を生産するために有用であり、特に、液状化物からのエタノールの生産に有用である。酵素ブレンド組成物の有利な効果は実質的に同様な条件下グルコアミラーゼを単独に用いて生産されるエタノール量に比較して多くの量のエタノールをもたらすことである。ある態様においては、ＧＡ単独と比較して０．５％より大きい増加であり、１．０％、１．５％、２％、及び２．５％より大きい増加を含む。
【０００８】
ある態様においては、ＧＡがトリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．）、タラロミセス種（Ｔａｌｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）、ペニシリウム種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐｐ．）、アスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）及びフミコーラ種（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｓｐｐ．）から成る群から選択される糸状菌から得られる。さらなる態様においては、グルコアミラーゼは配列番号１の配列を有するグルコアミラーゼと少なくとも９０％の相同性を有し、及び／又はＡＦＰは配列番号１４の配列を有するＡＦＰと少なくとも９０％の相同性を有し、及び／又はアルファアミラーゼは配列番号５の配列を有するＡＡと少なくとも９０％の相同性を有し、及び／又はアルファアミラーゼは配列番号５の配列を有するＡＡと少なくとも９５％の相同性を有する。
【０００９】
酵素ブレンド組成物は任意に一以上の他の酵素を含み、例えば、第二のグルコアミラーゼ、第二のアルファアミラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、第二のプロテアーゼ類、フィターゼ、プルラナーゼ、ベータ‐アミラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ベータ‐グルカナーゼ、ガラクトシダーゼ、エステラーゼ、シクロデキストリントランスグルコシルトランスフェラーゼ、及びそれらの組み合わせを含む。
【００１０】
さらに、本発明は発酵性糖類からアルコールのようなの最終産物を生産するための方法に関する。方法は、
（ａ）デンプン含有粉砕穀物を含むスラリーをアルファアミラーゼと接触させ液状化物を生産する段階、
（ｂ）前記液状化物をグルコアミラーゼ、酸安定性アルファアミラーゼ、及び酸性菌類プロテアーゼと接触させ発酵性糖類を生産する段階、及び
（ｃ）発酵生物の存在下発酵性糖類を発酵させ最終産物を生産する段階
を含む。
この方法において、段階（ｂ）である糖化及び段階（ｃ）である発酵を連続して行って又は同時に行ってよい。グルコアミラーゼ、酸安定性アルファアミラーゼ、及び酸性菌類プロテアーゼを液状化物に別々に添加してよい。あるいは、グルコアミラーゼ、酸安定性アルファアミラーゼ、及び酸性菌類プロテアーゼを含む酵素ブレンド組成物を液状化物へ添加してよい。処理の間に任意に、アルファアミラーゼ、グルコアミラーゼ、フィターゼ、セルラーゼ、プルラナーゼ、プロテアーゼ、又はラッカーゼのような少なくとも一つの他の酵素を用いてよい。また、方法は最終産物を回収する段階を含んでよい。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
図１は実施例２にさらに記載のように液状化した全粉砕トウモロコシを用いた同時糖化／発酵の間、異なる酵素ブレンドを用いて得られる最終アルコール濃度を示す。Ｙ軸は％エタノールを示し（Ｖ／Ｖ）、Ｘ軸は次の通りである。
１．ＴｒＧＡ、０．２５ＧＡＵ／ｇｄｓ トウモロコシ、
２．番号１ ＋ ０．０５ＳＡＰＵ ＡＦＰ／ｇｄｓ トウモロコシ
３．番号１ ＋ ２．０ＳＳＵアルファアミラーゼ／ｇｄｓ トウモロコシ、
４．番号１ ＋ ０．０５ＳＡＰＵ、ＡＦＰ ＋ ２．０ＳＳＵアルファアミラーゼ／ｇｄｓ トウモロコシ
【発明を実施するための形態】
【００１２】
定義
本明細書にて他に定義されていない限り、本明細書で用いるすべての技術的及び特別な用語はこの発明に属する当業者によって普通に理解されるものと同様の意味を持つ。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ、他、 ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， ２Ｄ ＥＤ．、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ (１９９４)及びＨａｌｅ ＆ Ｍａｒｈａｍ， ＴＨＥ ＨＡＲＰＥＲ ＣＯＬＬＩＮＳ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ， ＮＹ (１９９１)が、当業者には本発明で用いられる用語の多くの一般的辞書となる。さらに、特定の用語は明瞭性のため及び参照の場合のために下記に定義する。
【００１３】
「アルファアミラーゼ（Ａｌｐｈａ ａｍｙｌａｓｅｓ）」はアルファ‐１、４、‐４‐グルカン‐グルカノヒドロラーゼ（Ｅ. Ｃ. ３．２.１．１）であり、デンプン（例、アミロペクチン又はアミロースポリマー）中アルファ‐１、４‐グルコシド内部結合を切断又は加水分解する酵素である。
【００１４】
用語「ゼラチン化温度より低い（ｂｅｌｏｗ ｔｈｅ ｇｅｌａｔｉｎｉｚａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）」は、ゼラチン化温度より低い温度をいう。
【００１５】
用語「ＤＥ」又は「デキストロース当量（ｄｅｘｔｒｏｓｅ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）」は、乾燥重量を基本にＤ‐グルコースとして計算される、還元糖全体の濃度を測定するための業界基準である。非加水分解粒状デンプンはＤＥが実質的に０であり、Ｄ‐グルコースはＤＥが１００となる。
【００１６】
「デキストリン（Ｄｅｘｔｒｉｎｓ）」はグルコースの短鎖ポリマー（例、２から１０単位）である。
【００１７】
用語「乾燥固体（ｄｒｙ ｓｏｌｉｄｓ）（ｄｓ）」は、乾燥重量を基本として％表示のスラリーの固体の総数をいう。
【００１８】
用語「最終産物（ｅｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔ）」は、発酵基質から酵素的に転換される任意の炭素源由来産物をいう。幾つかの好ましい実施態様においては、最終産物はアルコール（例えば、エタノール）である。
【００１９】
本明細書にて用いる用語「エタノール生産体（ｅｔｈａｎｏｌ ｐｒｏｄｕｃｅｒ）」又は「エタノール生産微生物（ｅｔｈａｎｏｌ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）」はモノサッカライド又はオリゴサッカロイドからエタノールを生産することのできる発酵微生物をいう。
【００２０】
用語「発酵性糖類（ｆｅｒｍｅｎｔａｂｌｅ ｓｕｇａｒｓ）」は発酵生物により発酵される任意の糖類をいう。発酵性糖類はオリゴサッカロイド類及びデキストリン類を含む。
【００２１】
「発酵性糖（ｆｅｒｍｅｎｔａｂｌｅ ｓｕｇａｒ）」はモノサッカライド又はジサッカロイドをいい、最終産物を生産するためにその発酵性糖に接触して微生物より発酵工程にて転換してよい。幾つかの実施態様においては、発酵性糖は微生物により代謝され、他の実施態様においては、微生物による酵素の発現及び／又は分泌によって発酵性糖の所望の転換を達成する。
【００２２】
用語「発酵（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）」は、より簡単な有機化合物を生産するために微生物によって有機基質の酵素的及び嫌気的分解をすることをいう。発酵は嫌気的条件下で行われる一方、この用語は単に嫌気条件下で行われるものに限定されず、酸素存在下での発酵も意図する。
【００２３】
本明細書にて用いる用語「発酵生物（ｆｅｒｍｅｎｔｉｎｇ ｏｒｇａｎｉｓｍ）」は、発酵における使用に適し、直接又は間接的に最終産物を生産するのに適する任意の微生物又は細胞をいう。
【００２４】
用語「機能的に同等（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）」は、野生型酵素と同様の酵素の機能的特徴を有する酵素及び野生型由来の酵素を意味する。
【００２５】
用語「ゼラチン化（ｇｅｌａｔｉｎｉｚａｔｉｏｎ）」は一般的に、粘性のある懸濁液を形成するために加熱によるデンプン分子の可溶化をいう。
【００２６】
用語「ゼラチン化温度（ｇｅｌａｔｉｎｉｚａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）」は基質を含むデンプンのゼラチン化が始まる最も低い温度をいう。ゼラチン化の適切な温度は特定のデンプンで決定され、植物の種、及び環境と増殖条件のような因子次第で変化してよい。
【００２７】
用語「粒状デンプン（ｇｒａｎｕｌａｒ ｓｔａｒｃｈ）」は、生デンプン、つまり、ゼラチン化温度にさらされていないデンプンを意味する。
【００２８】
用語「粒状デンプン加水分解（ＧＳＨ）酵素（ｇｒａｎｕｌａｒ ｓｔａｒｃｈ ｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇ (ＧＳＨ) ｅｎｚｙｍｅ）」及び「粒状デンプン加水分解（ＧＳＨ）活性（ｇｒａｎｕｌａｒ ｓｔａｒｃｈ ｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇ (ＧＳＨ) ａｘｔｉｖｉｔｙ）を有する酵素」は粒状形態でデンプンを加水分解する能力を有する酵素をいう。
【００２９】
用語「％ホモロジー（％ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」は用語「％相同性（％ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」と本明細書にて互換可能に用いる。二つの配列間の相同性を決定するために用いることのできる典型的なコンピュータープログラムは、一連のＢＬＡＳＴプログラム、例えば、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ、及びＴＢＬＡＳＴＸ、ＢＬＡＳＴＰとＴＢＬＡＳＴＮ、及びインターネットで公的に入手可能なもの(例えばＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎウェブサイト上ＢＬＡＳＴページを参照)を含むが、これらに限定されない。また、Ａｌｔｓｃｈｕｌ, 他、１９９０及びＡｌｔｓｃｈｕｌ、他、１９９７を参照願いたい。
【００３０】
得られる核酸配列をＧｅｎＢａｎｋＤＮＡ配列における核酸配列及び他の公的データベースと比較して評価する場合、配列検索は一般的にＢＬＡＳＴＮプログラムを用いて行う。ＢＬＡＳＴＸプログラムはＧｅｎＢａｎｋタンパク質配列における核酸配列及び他の公的データベースにおけるアミノ酸配列に対してすべてのリーディングフレーム中に翻訳される核酸配列を検索するために有用である。ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＸ両者はオープンギャップペナルティ１１．０、及び拡張ギャップペナルティ１．０のデフォルトパラメータを用いて計算され、ＢＬＯＳＵＭ‐６２マトリックスを利用する。（例、Ａｌｔｓｃｈｕｌ、他、１９９７参照。）
【００３１】
可溶化デンプン基質又は液状化基質とも呼ばれる「液状化物（Ｌｉｑｕｅｆａｃｔ）」は高温液状化にさらされる熱安定性アルファアミラーゼを含む全粒粉砕穀物スラリーであり、その結果、糖化及び発酵又はＳＳＦのための可溶性基質となる。高温とは穀物のゼラチン化温度より高い温度である。
【００３２】
「液状化（Ｌｉｑｕｅｆａｃｔｉｏｎ）」又は「液化する（ｌｉｑｕｅｆｙ）」は、デンプンがより短い鎖及びより低い粘性のデキストリンに転換するプロセスを意味する。
【００３３】
用語「製粉する（ｍｉｌｌｅｄ）」は、すりつぶす、押しつぶす、断片化する、又は粒子サイズを小さくする他の任意の手段によって、サイズを小さくする植物原料をいうために本明細書にて用いる。製粉には乾式又は湿式製粉を含む。「乾式製粉（Ｄｒｙ ｍｉｌｌｉｎｇ）」は乾燥穀物全体の製粉をいう。「湿式製粉（Ｗｅｔ ｍｉｌｌｉｎｇ）」は穀物を柔らかくするために穀物を最初に水に浸す（染み込む）プロセスをいう。
【００３４】
用語「オリゴサッカライド（ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）」は、グリコシド結合で結合する２から１０のモノサッカライド単位を有する任意の化合物をいう。単糖類のこれらの短鎖ポリマーはデキストリンを含む。
【００３５】
本明細書にて同定されたアミノ酸配列又は核酸配列に関して本明細書で用いる「配列相同性割合（％）（ｐｅｒｃｅｎｔ(％)ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、必要であれば、最大の割合の配列相同性を達成するように、いずれの同類置換をも配列相同性の一部として考慮することなく、配列を整列し及びギャップを挿入した後、配列中のアミノ酸残基又はヌクレオチドと同定された候補配列におけるアミノ酸残基又はヌクレオチドとの割合で定義される。周知である配列整列をする方法と配列相同性の決定は過度の実験をせずに行うことができ、相同性値の計算は確実に得られる。例えばＡｕｓｕｂｅｌ他編、(１９９５)Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ, １９章(Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｅｌｙ‐Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ, ＮｅｗＹｏｒｋ)及びＡＬＩＧＮ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｄａｙｈｏｆｆ （１９７８）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５:Ｓｕｐｐｌｅ ３（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ, Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ, Ｄ.Ｃ.）を参照願いたい。多くのアルゴリズムは配列を整列させ、配列相同性を決定するのに利用可能である。例えばＮｅｅｄｌｅｍａｎ他のｔｈｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（１９７０）Ｊ.Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ.４８:４４３、スミス他のｔｈｅ ｌｏｃａｌ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（１９８１）Ａｄｖ.Ａｐｐｌ.Ｍａｔｈ.２:４８２, Ｐｅａｒｓｏｎ他のｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｍｅｔｈｏｄ (１９８８) Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ８５:２４４４, ｔｈｅ Ｓｍｉｔｈ‐Ｗｓｔｅｒｍａｎ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ (Ｍｅｔｈ.Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ.７０:１７３‐１８７(１９９７)及びＢＬＡＳＴＰ, ＢＬＡＳＴＩＮ, ａｎｄ ＢＬＡＳＴＸ ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ(参照Ａｌｔｓｃｈｕｌ他（１９９０）J.Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ.２１５:４０３−４１０)を参照されたい。これらのアルゴニズムに使用するコンピュータープログラムは入手可能であり、以下のものを含むがこれらに限定はされない。即ち、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｎ
ｇ(ＤＡＮＳＴＡＲ)ソフトウエア又はＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２(Ａｌｔｓｃｈｕｌ他、Ｍｅｔｈ. Ｅｎｚｙｍ., ２６６:４６０-４８０(１９９６))、又はＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ(Ａｌｔｓｃｈｕｌ他)上記、ＦＡＳＴＡ及びＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ (ＧＣＧ)パッケージ、バージョン８、マジソン、ウィスコン州米国にて入手可能なＴＦＡＳＴＡ及びＩｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅｓ, Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、カリフォルニア州による ＣＬＵＳＴＡＬ ｉｎ ｔｈｅ ＰＣ/Ｇｅｎｅ ｐｒｏｇｒａｍである。当業者であれば比較される配列の長さに渡って最大の配列比較を達成するために必要であるアルゴリズムを含め、整列を測定する適切なパラメーターを決定できる。好ましくは、配列相同性はプログラムによって決定されたデフォルトパラメーターを使用することにより決定される。特に、配列相同性はＳｍｉｔｈ-Ｗａｔｅｒｍａｎ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｓｅａｒｃｈ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ (Ｍｅｔｈ. Ｍｏｌ. Ｂｉｏｌ. ７０: １７３-１ ８７ (１９９７)) によって決定される。このアルゴリズムは次のサーチパラメーターで、すなわち１２のギャップ開始ペナルティ及び１のギャップ伸長ペナルティで、アファインギャップサーチを使用しているＭＳＰＲＣＨ ｐｒｏｇｒａｍ (Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ) で実行される。好ましくは対のアミノ酸の比較はＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ, Ｉｎｃ., Ｍａｄｉｓｏｎ, Ｗｉｓ.の１２のギャップウエイトと２のレングスウエイトをもつＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸置換行列を使用しているＧＣＧ配列分析ソフトウエアパッケージの使用により実行される。二つのアミノ酸配列の最適整列に関して、種々のアミノ酸配列の連続セグメントは参照アミノ酸配列に対して追加アミノ酸残基又は欠損アミノ酸残基をもってもよい。参照アミノ酸配列と比較するために使用した連続セグメントは少なくとも２０アミノ酸残基を含んでもよく、３０、４０、５０又はそれ以上のアミノ酸残基を含んでもよい。誘導体のアミノ酸配列中ギャップを含む関係で増加した配列相同性の補正はギャップペナルティを割り当てることにより実行できる。
【００３６】
用語「タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ）」及び「ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」は、本明細書にて互換可能に用いる。本明細書及び特許請求の範囲において、従来の１文字及び３文字のアミノ酸残基コードを使用する。アミノ酸の３文字コードは、生化学命名に関するＩＵＰＡＣ‐ＩＵＢ委員会（ＩＵＰＡＣ‐ＩＵＢ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ （ＪＣＢＮ））に基づいて定められる。また、ポリペプチドが、遺伝子コードの縮重により二以上のヌクレオチド配列によりコードされてよいことは理解される。
【００３７】
本発明の変異体は「原型のアミノ酸／位置／置換されるアミノ酸残基」の順の命名法を用いて記載する。例えば８９位のアラニン（Ａ）にかかるトレオニン（Ｔ）の置換をＡ８９Ｔとして表す。二つ以上のアミノ酸が所定の位置にて置換される場合、例えば、置換を１）Ａ８９Ｃ、Ａ８９Ｄ又はＡ８９Ｔ、２）Ａ８９Ｃ、Ｄ又はＴ、又は３）Ａ８９Ｃ／Ｄ／Ｔとして表す。置換に有用な位置が具体的アミノ酸が示唆されずに本明細書にて同定される場合、任意のアミノ酸残基がその位置でそのアミノ酸残基に関して置換されてよいことが理解される。
【００３８】
用語「糖化酵素（ｓａｃｃｈａｒｉｆｙｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）」及び「グルコアミラーゼ（ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ）（Ｅ. Ｃ. ３．２.１．３）」は本明細書にて互換可能に用い、デンプン及び関連オリゴサッカライドとポリサッカライドの非還元末端からＤ‐グルコースの放出を触媒することができる任意の酵素をいう。
【００３９】
語句「同時糖化発酵（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｓａｃｃｈａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）（ＳＳＦ）」は、エタノール生産微生物のような発酵生物と糖化酵素のような少なくとも一つの酵素が同じ反応器中同じ工程で併用する最終産物の生産工程をいう。
【００４０】
用語「スラリー（ｓｌｕｒｒｙ）」は不溶性固体（例えば、粒状デンプン）を含む水溶性混合液をいう。
【００４１】
本明細書にて用いる用語「デンプン（ｓｔａｒｃｈ）」は、植物性ポリサッカライドの炭水化物の複合体を含み、化学式（Ｃ６Ｈ１０Ｏ５）ｘで表すアミロース及びアミロペクチンを含む任意の原料をいい、ここでｘは任意の数字である。
【００４２】
用語「蒸留残液（ｔｈｉｎ ｓｔｉｌｌａｇｅ）」は、懸濁微粒子及び溶解原料を含む固体（例えば、スクリーニング又は遠心分離によって生じる）から分離される蒸留物（ｓｔｉｌｌａｇｅ）の液体部分を意味する。用語「バックセット（ｂａｃｋｓｅｔ）」は一般的に再循環される蒸留残液（ｔｈｉｎ ｓｔｉｌｌａｇｅ）を意味するために用いる。
【００４３】
用語「全体の糖度（ｔｏｔａｌ ｓｕｇａｒ ｃｏｎｔｅｎｔ）」は、デンプン組成物中に存在する全体の糖の含有量をいう。
【００４４】
酵素（例、アルファアミラーゼ、グルコアミラーゼ、酸性菌プロテアーゼ、フィターゼ、又はその同類）に関して用いる場合、用語「変異体（ｖａｒｉａｎｔ）」は、自然的に生じる酵素（野生型）由来の酵素であるが、自然発生的酵素に比較して一以上のアミノ酸の置換、付加、欠失を有する酵素を意味する。その用語は、酵素のハイブリッドの形態を含み、例えば、酵素がバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）（例、バシルス リチェニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ））由来のＣ末端と異なるバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）（例、バシルス ステアロテルモフィルス（Ｂ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））由来のＮ末端を有してもよい。変異体は、野生型と比較して、熱安定性の増加、タンパク質分解安定性の増加、特異的活性の増加、基質特異性の拡張、ｐＨ範囲に対する活性の拡張、又はそれらの組み合わせのような、しかしこれらに限定されないが、一以上の改変される特徴を有してよい。
【００４５】
本明細書にて用いる用語「野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）」は、宿主細胞中に自然発生的（自然）に生じる酵素をいう。
【００４６】
典型的な実施態様
発明者はアルファアミラーゼ、グルコアミラーゼ、及び酸性菌プロテアーゼを含む酵素ブレンドを発見した。そのような組成物は糖化及び／又は糖化／発酵の間デンプン転換プロセスにおいて有用である。そのような組成物を使用することはデンプン転換プロセスにおいてグルコアミラーゼを単独にて用いるより有用な効果を提供する。
【００４７】
本発明はグルコアミラーゼ、酸性菌プロテアーゼ、及び酸安定性アルファアミラーゼを含む組成物に関する。また、本発明は発酵性糖から所望の最終産物を生産するための組成物の使用に関し、例えば、液状化物からのエタノールを生産することである。組成物の有利な効果は実質的に同様の条件下グルコアミラーゼを単独にて生産するエタノール量に比較して多量のエタノールをもたらすことである。ある態様においては、増加はグルコアミラーゼ単独に比較して０．５％より多く、好ましくは、１．０％、１．５％、２％、及び２．５％より多い。
【００４８】
グルコアミラーゼ
グルコアミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．３．）はデンプン類及びデキストリン類をグルコースへ分解する酵素である。グルコアミラーゼはエキソ作用酵素である。それはデンプンにおけるアルファ１−４及びアルファ１−６グルコシド結合を加水分解し、グルコースを放出する。
【００４９】
本発明による有用なグルコアミラーゼは野生型グルコアミラーゼ、その変異体又はフラグメント又は例えば、ある微生物源からの触媒部位及び別の微生物源からのデンプン結合部位由来のハイブリッドグルコアミラーゼでよい。次のグルコアミラーゼ類は本発明により含まれるプロセスに使用されるグルコアミラーゼの例であるが、これらに限定されない。
【００５０】
グルコアミラーゼをアスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）Ｇ１及びＧ２グルコアミラーゼ（例えば、Ｂｏｅｌ他、（１９８４） ＥＭＢＯ Ｊ. ３： １０９７ − １ １０２： ＷＯ ９２／００３８１、ＷＯ ００／０４１３６及びＵＳＰ ６，３５２，８５１を参照）、アスペルギルス アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）グルコアミラーゼ（例えば、ＷＯ ８４／０２９２１参照）、アスペルギルス オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）グルコアミラーゼ（例えば、Ｈａｔａ他、（１９９１） Ａｇｒｉｃ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ. ５５：９４１−９４９参照）及びアスペルギルス シロウサミ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ Ｓｈｉｒｏｕｓａｍｉ）(例えば、Ｃｈｅｎ他、（１９９６） Ｐｒｏｔ. Ｅｎｇ. ９：４９９ − ５０５： Ｃｈｅｎ他、(１９９５) Ｐｒｏｔ. Ｅｎｇ. ８：５７５−５８２；及びＣｈｅｎ他、（１９９４） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ. ３０２：２７５−２８１を参照)の菌から得てよい。タラロミセス エマーソニー（Ｔ. ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）、タラロミセス レイセタヌス（Ｔ. ｌｅｙｃｅｔｔａｎｕｓ）、タラロミセス デュポンティ（Ｔ. ｄｕｐｏｎｔｉ）、及びタラロミセス テルモフィラス（Ｔ. ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ） (例えば、ＷＯ ９９／２８４８８； ＵＳＰ Ｎｏ. ＲＥ： ３２，１５３； ＵＳＰ Ｎｏ. ４，５８７，２１５を参照)のようなタラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、トリコデルマ レーシ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ）及び特に、ＵＳ Ｐａｔ. Ｐｕｂ. Ｎｏ. ２００６‐００９４０８０に記載の配列番号４と少なくとも約８０％、８５％、９０％及び９５％の配列相同性を有するグルコアミラーゼのようなトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の菌株、リゾプス ニベウス（Ｒ. ｎｉｖｅｕｓ）及びリゾプス オリザエ（Ｒ. ｏｒｙｚａｅ）のようなリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）の菌株、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）の菌株、フミコーラ グリセア（Ｈ． ｇｒｉｓｅａ）（例えば、Ｂｏｅｌ他、（１９８４） ＥＭＢＯ Ｊ. ３：１０９７−１１０２； ＷＯ ９２／００３８１ ； ＷＯ ００／０４１３６； Ｃｈｅｎ他、（１９９６） Ｐｒｏｔ. Ｅｎｇ. ９：４９９−５０５； Ｔａｙｌｏｒ他、（１９７８） Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓ. ６１ ：３０１−３０８； ＵＳＰ. ４，５１４，４９６； ＵＳＰ ４，０９２，４３４； ＵＳＰ ４，６１８，５７９； Ｊｅｎｓｅｎ他、（１９８８） Ｃａｎ. Ｊ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. ３４：２１８−２２３及びＷＯ ２００５／０５２１４８の配列番号３を参照）のようなフミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）の菌株から得られる。幾つかの実施態様においては、グルコアミラーゼは、ＷＯ ０５／０５２１４８記載の配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも約８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％及び９９％の配列相同性を有する。本発明に有用な他のグルコアミラーゼは、アセリア ロルフシイ（Ａｔｈｅｌｉａ ｒｏｌｆｓｉｉ）及びそれらの変異体(例えば、ＷＯ ０４／１１１２１８を参照)から得られるものを含む。
【００５１】
商業的に用いるグルコアミラーゼ活性を有する酵素は、例えば、アスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）（ジェネンコ インターナショナル社（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ.））製の商品名ＤＩＳＴＩＬＬＡＳＥ、ＯＰＴＩＤＥＸ Ｌ−４００及びＧ ＺＹＭＥ Ｇ９９０ ４Ｘ）又はリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）種（日本の新日本化学（Ｓｈｉｎ Ｎｉｈｏｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）製の商品名ＣＵ．ＣＯＮＣを参照）から生産される。また、商業的な消化酵素は、日本の天野製薬（Ａｍａｎｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）製の商品名グルクザイム（ＧＬＵＣＺＹＭＥ）（例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉ他、（１９８５） Ｊ. Ｂｉｏｃｈｅｍ. ９８：６６３−６７１を参照）である。さらなる酵素はリゾプス種（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐ．）のグルコアミラーゼ（Ｅ． Ｃ．３．２．１．３）の３つの形態を含む、すなわち、「Ｇｌｕｃ１」（ＭＷ ７４，０００）、「Ｇｌｕｃ２」（ＭＷ ５８，６００）及び「Ｇｌｕｃ３」（ＭＷ ６１，４００）である。また、酵素調製ＧＣ４８０（ジェネンコ インターナショナル社（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ.））を本発明に用いる。上記のグルコアミラーゼ及び商業的酵素の例は本発明をこれらに限定することを意図せず、単に実施例として提供される。
【００５２】
グルコアミラーゼは細菌、植物及び菌を供給源とする異種又は内因性タンパク質発現由来でよい。本発明に有用な好ましいグルコアミラーゼは糸状菌及び酵母の数種の菌株により生産され、特に、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の菌株から分泌されるグルコアミラーゼ類である。
【００５３】
表１は５９９アミノ酸を有するトリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼの推定アミノ酸配列（配列番号１）を示し、触媒部位（配列番号２）は下線をひいてなく１‐４５３残基の位置により示される。リンカー領域（配列番号３）は下線をひいて４５４‐４９１残基の位置により示される。デンプン結合部位である配列番号４は太字にて４９２‐５９９残基の位置により示される。
【表１】
【００５４】
発明者はグルコアミラーゼ活性に関与する二つの部位を同定した。即ち、結合部位及び触媒部位である。これらの部位における保存的変異はグルコアミラーゼ活性を有するタンパク質となりうる。これらの部位においてすべての保存的アミノ酸置換が必ずしもグルコアミラーゼ活性を有するタンパク質とならないが、当業者はこれらの保存的置換の多くがグルコアミラーゼ活性を有するタンパク質となるであろうと予測する。さらに、二つの同定された機能部位の外側でのアミノ酸置換はグルコアミラーゼ活性に顕著な影響はないと考えられる。
【００５５】
幾つかの実施態様においては、本発明に有用なグルコアミラーゼは配列番号１又は２のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有する。
【００５６】
アルファアミラーゼ
本発明による有用なアルファアミラーゼは野生型アルファアミラーゼ、その変異体又はフラグメント又は例えば、ある微生物源からの触媒部位及び別の微生物源からのデンプン結合部位由来のハイブリッドアルファアミラーゼでよい。あるいは、アルファアミラーゼは酸安定性であるように組み換えらた変異体でよい。また、アルファアミラーゼは粒状デンプン加水分解活性（ＧＳＨＥ）を有するアルファアミラーゼでよい。なぜならその酵素は液状化物における多くのデンプンを分解するように働くからである。
【００５７】
菌類アルファアミラーゼの例は、糸状菌の菌株から得られるものを含み、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（例、アスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス カワチ（Ａ. ｋａｗａｃｈｉ）、及びアスペルギルス オリザエ（Ａ． ｏｒｙｚａｅ））、トリコデルマ 種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ．）、リゾプス種（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐ．）、ムコール種（Ｍｕｃｏｒ ｓｐ．）、及びペニシリウム種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．）を含むがこれらに限定されない。幾つかの実施態様においては、アルファアミラーゼはアスペルギルス カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ. ｋａｗａｃｈｉ）菌株又はトリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）の菌株から得られる。
【００５８】
本発明により取り込まれる方法及び組成物に用いると考えられる商業的に入手可能なアルファアミラーゼは、ＧＺＹＭＥ ９９７及びＣＬＡＲＡＳＥ Ｌ(ジェネンコ インターナショナル社)、ターマミル（ＴＥＲＭＡＭＹＬ）１２０−Ｌ、ＬＣ及びＳＣ及びスープラ（ＳＵＰＲＡ） (ノボザイムズ バイオテック（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ）)、及びサン スーパー（ＳＡＮ ＳＵＰＥＲ ）(ノボザイムズ エイエス（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ/Ｓ）)、及びＦＵＥＬＺＹＭＥ ＦＬ（Ｄｉｖｅｒｓａ/Ｖａｌｌｅｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を含む。
【００５９】
幾つかの実施態様においては、本発明に有用なアルファアミラーゼは、酸安定性アルファアミラーゼであり、有効な量が添加される時、ｐＨ３．０から７．０の範囲及び好ましくはｐＨ３．５から６．５の範囲であってｐＨ約４．０、４．５、５．０、５．５及び６．０を含む範囲で活性を有する。本発明による有用な酸安定性アルファアミラーゼは菌類のアルファアミラーゼ又は細菌類のアルファアミラーゼでよい。好ましい酸安定性アルファアミラーゼはアスペルギルス カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉ）（例えば、ＡｋＡＡ）、アスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）（例えば、ＡｎＡＡ）、及びトリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）（例えば、ＴｒＡＡ）から得られるものを含む。
【００６０】
表２はアスペルギルス カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉ）アルファアミラーゼ（ＡｋＡＡ）（配列番号５）に関する成熟タンパク質配列を示す。推定リンカーはTTTTTTAATSTSKATTSSSSSSAAATTSSSCTATSTT(配列番号６)であって、下線にて表示する。リンカーのアミノ酸上流は触媒部位（配列番号７）を含み、下線をひいていない。リンカーのアミノ酸下流はデンプン結合部位（ＳＢＤ）を含み、（配列番号８）、太字で表示する。ＳＢＤはポリペプチドの最後１０２個のアミノ酸を含む。
【表２】
【００６１】
発明者はアルファアミラーゼ活性に関与する二つの部位を同定した。即ち、結合部位及び触媒部位である。これらの部位における保存的変異はアルファアミラーゼ活性を有するタンパク質となりうる。これらの部位においてすべての保存的アミノ酸置換が必ずしもアルファアミラーゼ活性を有するタンパク質とならないが、当業者はこれらの保存的置換の多くがアルファアミラーゼ活性を有するタンパク質となるであろうと予測する。さらに、二つの同定された機能部位の外側でのアミノ酸置換はアルファアミラーゼ活性に顕著な影響はないと考えられる。
【００６２】
幾つかの実施態様においては、アルファアミラーゼは配列番号５又は７のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有する。
【００６３】
表３はアスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）アルファアミラーゼ（ＡｎＡＡ）（配列番号９）に関する成熟タンパク質配列を示す。表中、触媒部位を１−４７８のアミノ酸（配列番号１０）で表し、下線を引いていない。リンカー領域を下線部（配列番号１１）で示す。デンプン‐結合部位は太字（配列番号１２）で示す。
【表３】
【００６４】
幾つかの実施態様においては、アルファアミラーゼは配列番号９又は１０のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有する。
【００６５】
表４は４４３個のアミノ酸を有するトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）アルファアミラーゼ（ＴｒＡＡ）に関する成熟タンパク質配列（配列番号１３）を示す。このアルファアミラーゼはＳＢＤ又はリンカーを含まない。
【表４】
【００６６】
幾つかの実施態様においては、アルファアミラーゼは配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有する。
【００６７】
本発明に従って有用な酸性菌類プロテアーゼ（Ａｃｉｄ ｆｕｎｇａｌ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ）（ＡＦＰ）は野生型酸性菌類プロテアーゼ、その変異体又はフラグメント、又は遺伝的に組み換えられた変異ＡＦＰでよい。
【００６８】
例えば、酸性菌類プロテアーゼは、アスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス アワモリ（Ａ． ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、及びムコール ミエヘイ（Ｍ．ｍｉｅｈｅｉ）のような、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）及びリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）から得られるものを含む。ＡＦＰは細菌類、植物及び菌類を供給源とする異種又は内因性タンパク質発現由来でよい。本発明に有用な好ましいグルコアミラーゼは糸状菌及び酵母の数種の菌株により生産され、特に、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の菌株から分泌されるＡＦＰが好ましい。
【００６９】
表５はトリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）由来の好ましいＡＦＰに関する成熟タンパク質配列（３５５アミノ酸）（配列番号１４）を示す。
【表５】
【００７０】
幾つかの実施態様においては、酸性菌類プロテアーゼは配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有する。
【００７１】
第二酵素
本発明の幾つかの実施態様は、少なくとも一つの酸安定性アルファアミラーゼ、少なくとも一つのグルコアミラーゼ、及び少なくとも一つの菌類プロテアーゼを含む組成物を含むけれども、任意的に、組成物は他の酵素を含んでもよい。例えば、組成物を多様な適用（例えば、デンプン処理適用）に用いる場合、さらに、第二酵素を含んでよい。本発明によるブレンド組成物は発酵微生物及び他の成分及び他の第二酵素を伴って糖化段階及び／又は発酵段階において用いてよい。追加される酵素は、追加グルコアミラーゼ、追加アルファアミラーゼ、追加プロテアーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、フィターゼ、プルラナーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ベータ‐グルカナーゼ、ガラクトシダーゼ、エステラーゼ、シクロデキストリントランスグルコシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅｓ），ベータ‐アミラーゼ、及びそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない。
【００７２】
幾つかの実施態様においては、追加酵素は菌類アルファアミラーゼのような、第二酸安定性アルファアミラーゼである。幾つかの実施態様においては、第二アルファアミラーゼはＡｋＡＡ、ＴｒＡＡ又はＡｓＡＡのようなＧＳＨＥである。ブレンドと組み合わせて用いることのできる他のアルファアミラーゼの例は、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、及びフミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）由来のものであるが、これらに限定されない。
【００７３】
これらのアミラーゼの幾つかは商業的に入手可能である。例えば、ノボ ノルディスク エーエス（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ）から入手可能なターマミル（ＴＥＲＭＡＭＹＬ）及びＳＵＰＲＡ、Ｄｉｖｅｒｓａから入手可能なＦＵＥＬＺＹＭＥ、ノボ ノルディスク エーエス（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ/Ｓ）から入手可能なリコザイム（ＬＩＱＵＥＺＹＭＥ）ＳＣ、及びジェネンコ インターナショナル社（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ）から入手可能なスペザイム フレッド（ＳＰＥＺＹＭＥ ＦＲＥＤ）、スペザイム エチル（ＳＰＥＺＹＭＥ ＥＴＨＹＬ）及びＧＺＹＭＥ Ｇ９９７である。
【００７４】
別の実施態様においては、本発明はフィターゼの添加を含んでよい。フィターゼはイノシトール６リン酸から少なくとも一つの無機リン酸塩を遊離することができる酵素である。フィターゼはフィチン酸分子が加水分解を開始するリン酸エステル基の特定の位置への優先性に従って分けられる（例えば、３‐フィターゼ（ＥＣ３．１．３．８）として又は６−フィターゼ（ＥＣ３．１．３．２６）として）。フィターゼの典型的な例はミオ‐イノシトール‐ヘキサキスフォスフェート‐３‐フォスフォヒドロラーゼ（ｍｙｏ‐ｉｎｏｓｉｔｏｌ‐ｈｅｘａｋｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ‐３‐ｐｈｏｓｐｈｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）である。フィターゼを菌類及び細菌類のような微生物から得て良い。これらの微生物のいくつかは例えばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（例、アスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス テレウス（Ａ. ｔｅｒｒｅｕｓ）、及びアスペルギルス フミガタス（Ａ． ｆｕｍｉｇａｔｕｓ））、ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）（ミセリオフトラ サーモフィラ（Ｍ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ））、タラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）（タラロミセス テルモフィルス（Ｔ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、トリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ）（トリコデルマ レーシ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ））及びテルモミセス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）（ＷＯ ９９／４９７４０）を含む。また、フィターゼはペニシリウム種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）から得られ、例えば、ペニシリウム ホルデイ（Ｐ． ｈｏｒｄｅｉ）(ＡＴＣＣ Ｎｏ．２２０５３)、ペニシリウム ピセウム（Ｐ． ｐｉｃｅｕｍ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ． １０５１９）、又はペニシリウム ブレビ‐コンパクタム（Ｐ． ｂｒｅｖｉ−ｃｏｍｐａｃｔｕｍ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．４８９４４）である。例えば、ＵＳＰ ６，４７５，７６２を参照願いたい。さらに、フィターゼはペニオフォラ（Ｐｅｎｉｏｐｈｏｒａ）、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｂａｃｔｅｒ）及びブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）（２００５年１０月１７日出願のＷＯ２００６／０４３１７８を参照願いたい）から得られる。市販のフィターゼはＮＡＴＵＰＨＯＳ （ＢＡＳＦ）、ＲＯＮＯＺＹＭＥ Ｐ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）、ＰＨＺＹＭＥ （Ｄａｎｉｓｃｏ Ａ／Ｓ， Ｄｉｖｅｒｓａ）及びＦＩＮＡＳＥ （ＡＢ Ｅｎｚｙｍｅｓ）のように入手可能である。幾つかの実施態様においては、本発明に有用な少なくとも一つフィターゼはブティアウクセラ種（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ ｓｐｐ．）である微生物由来のものである。ブティアウクセラ種（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ ｓｐｐ．）は、ブティアウクセラ アグレスティス（Ｂ． ａｇｒｅｓｔｉｓ）、 ブティアウクセラ ブレネラエ（Ｂ． ｂｒｅｎｎｅｒａｅ）、ブティアウクセラ フェラギターゼ（Ｂ． ｆｅｒｒａｇｕｔｉａｓｅ）、ブティアウクセラ ガビニアエ（Ｂ. ｇａｖｉｎｉａｅ）、ブティアウクセラ イザルディイ（Ｂ. ｉｚａｒｄｉｉ）、ブティアウクセラ ノアキアエ（Ｂ. ｎｏａｃｋｉａｅ）、及びブティアウクセラ ワ−ムボールディアエ（Ｂ. ｗａｒｍｂｏｌｄｉａｅ）を含む。ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）種の菌株はＤＳＭＺ、ｔｈｅ Ｇｅｒｍａｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌ (Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｂｅ ７Ｂ, ３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ, Ｇｅｒｍａｎｙ) から入手できる。登録番号ＮＣＩＭＢ ４１２４８にて寄託されるブティアウクセラ種（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ ｓｐ．）の菌株であるＰ１−２９は、フィターゼが本発明によって得られ及び使用されてよい特に有用な菌株の例である。
【００７５】
また、セルラーゼを本発明によるブレンド及び／又は組成物に用いてよい。セルラーゼはセルロース（β‐１，４‐Ｄ‐グルカン結合）及び／又はリン酸膨張セルロースのようなそれらの誘導体を加水分解する酵素組成物である。セルラーゼはエキソ‐セロビオヒドロラーゼ（ｅｘｏｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ）（ＣＢＨ）エンドグルカナーゼ（ＥＧ）及びベータ‐グルコシダーゼ（ＢＧ）（ＥＣ３．２．１９１、ＥＣ３．２．１．４及びＥＣ３．２.１．２１）に分類できる。セルラーゼの例はペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、テルモモノスポラ（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）及びアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）からのセルラーゼを含む。食品業界で販売される商業的に入手可能なセルラーゼは、ＲＯＶＡＢＩＯ（Ａｄｉｓｓｅｏ）、ＮＡＴＵＧＲＡＩＮ（ＢＡＳＦ）、ＭＵＬＴＩＦＥＣＴ ＢＧＬ(ダニスコ ジェネンコ（Ｄａｎｉｓｃｏ Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）)及びＥＣＯＮＡＳＥ（ＡＢ Ｅｎｚｙｍｅｓ）のようなベータ‐グルカナーゼである。
【００７６】
また、キシラナーゼを本発明によるブレンド及び／又は組成物に用いてよい。キシラナーゼ（例えば、エンド‐β‐キシラナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．８）は、キシラン骨格鎖を加水分解するが、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、アシドサーマス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ）、ミクロテトラスポラ（Ｍｉｃｒｏｔｅｔｒａｐｓｏｒａ）又はテルモモノスポラ（Ｔｈｅｒｍｏｎｏｓｐｏｒａ）のような細菌由来でよい。さらに、キシラナーゼは、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、及びフミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、又はフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）のような菌類由来でもよい。（例えば、ＥＰ４７３ ５４５、ＵＳＰ ５，６１２，０５５、ＷＯ ９２／０６２０９およびＷＯ ９７／２０９２０を参照願いたい。）商業的調製品は、ＭＵＬＴＩＦＥＣＴ及びＦＥＥＤＴＲＥＡＴ Ｙ５（ダニスコ ジェネンコ（Ｄａｎｉｓｃｏ Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）、ＲＯＮＯＺＹＭＥ ＷＸ(ノボザイムズ エイエス（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ)）、及びＮＡＴＵＧＲＡＩＮ ＷＨＥＡＴ（ＢＡＳＦ）を含む。
【００７７】
また、追加的プロテアーゼを本発明によるブレンド及び／又は組成物に用いてよい。プロテアーゼは細菌又は菌類由来でよい。細菌のプロテアーゼの供給源は、バシルス アミロリケファシエンス（Ｂ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バシルス レンツス（Ｂ． ｌｅｎｔｕｓ）、バシルス リチェニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、及びバシルス ズブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のようなバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来のプロテアーゼを含む。これらの供給源は、バシルス アミロリケファシエンス（Ｂ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）及びそれらの変異体（ＵＳＰ ４，７６０，０２５）から得られるスブチリシンのようなスブチリシンを含む。適切な業務用プロテアーゼは、ＭＵＬＴＩＦＥＣＴ Ｐ ３０００（ダニスコ ジェネンコ （Ｄａｎｉｓｃｏ Ｇｅｎｅｎｃｏｒ））及びスミザイム ＦＰ（ＳＵＭＩＺＹＭＥ ＦＰ）（新日本(Ｓｈｉｎ Ｎｉｈｏｎ)）を含む。また、菌類プロテアーゼの供給源は、例えば、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）（例えば、ＮＳＰ‐２４）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、及び、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）を含む。
【００７８】
酵素ブレンド組成物
本発明の酵素ブレンド組成物はグルコアミラーゼ、アルファアミラーゼ、及び酸性菌類プロテアーゼを含む。三つの酵素成分は一緒に混合される三つの酵素を含むブレンドされた製剤、又は本発明により含まれる組成物を得るためにプロセス段階の間に別個に添加される酵素成分を含むブレンドされた製剤として用いてよい。好ましくは、本発明の組成物をデンプン転換における段階の間に用い、その結果、下記に規定する活性比率が維持される。これは経時的（ｔｉｍｅ‐ｗｉｓｅ ｍａｎｎｅｒ）に組成物の別々の成分を加えることに関係し、その結果、酵素比は維持され、例えば、その成分を同時に添加してもよい。
【００７９】
幾つかの実施態様においては、酵素ブレンド組成物は、
ａ）配列番号１に対して少なくとも９５％又は少なくとも９７％の配列相同性を有するＧＡ、配列番号５に対して少なくとも９７％配列相同性を有するＡｋＡＡ及びＡＦＰ、
ｂ）配列番号１に対して少なくとも９５％又は少なくとも９７％配列相同性を有するＧＡ、酸安定性ＡＡ、及びＡＦＰ、
ｃ）配列番号１に対して少なくとも９５％又は少なくとも９７％配列相同性を有するＧＡ、ＧＳＨＥ ＡＡ、及び配列番号１４に対して少なくとも９０％、９５％又は９９％の配列相同性を有するＡＦＰ、
ｄ）ＧＡ、ＡｋＡＡ又はＴｒＡＡ、及び配列番号１４に対して少なくとも９５％又は少なくとも９７％の配列相同性を有する酸性菌類プロテアーゼ、
ｅ）ＧＡ、ＡｋＡＡ、及び配列番号１４に対して少なくとも９５％又は少なくとも９７％の配列相同性を有する酸性菌類プロテアーゼ、
ｆ）配列番号１に対して少なくとも９５％又は少なくとも９７％の配列相同性を有するＧＡ、ＡｋＡＡ、及び配列番号１４に対して少なくとも９５％又は少なくとも９７％の配列相同性を有するＡＦＰ、
ｇ）配列番号１に対して少なくとも９５％又は少なくとも９７％の配列相同性を有するＧＡ、ＴｒＡＡ、及び配列番号１４に対して少なくとも９５％又は少なくとも９７％の配列相同性を有する酸性菌類プロテアーゼ、
ｈ）配列番号１に対して少なくとも９５％の配列相同性を有するＧＡ、配列番号１４に対して少なくとも９５％の配列相同性を有するＡＦＰ、及び配列番号５に対して少なくとも９５％の配列相同性を有するＡＡ、
ｉ）配列番号１に対して少なくとも９８％の配列相同性を有するＧＡ、配列番号１４に対して少なくとも９８％の配列相同性を有するＡＦＰ、及び配列番号５に対して少なくとも９８％の配列相同性を有するＡＡ、及び
ｊ）ＳＴＡＲＧＥＮ（商標）００１であって、酸安定性アスペルギルス カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉ）アルファアミラーゼ、アスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼのブレンド（ジェネンコ インターナショナル社から商業的に入手可能）、及び酸性菌類プロテアーゼ、
を含む。
【００８０】
しばしば、酵素活性をグルコアミラーゼに関してＧＡＵ、アルファアミラーゼに関してＳＳＵ、及び酸性菌類プロテアーゼに関してＳＡＰＵにて測定する。
【００８１】
幾つかの実施態様においては、酵素活性の比を下記に規定し、各酵素の比をグルコアミラーゼ（ＧＡ）に関して示す。例えば、ＧＡ（ＧＡＵ）：ＡＡ（ＳＳＵ）の比は約１：１から１：１５であり、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、及び１：１０を含むがこれらに限定されない。比は最低で１：１と最高で１：１５である。好ましい実施態様においては、ＧＡ（ＧＡＵ）：ＡＡ（ＳＳＵ）の比は約１：１．５から約１：８又は約１：２から約１：５である。ある好ましい実施態様においては、ＧＡ（ＧＡＵ）：ＡＡ（ＳＳＵ）の比は約１：４である。
【００８２】
幾つかの実施態様においては、ＧＡ（ＧＡＵ）対ＡＦＰ（ＳＡＰＵ）の比は約１：０．１から約１：５であり、１：０．２、１：０．３、１：０．４、１：０．５、１：０．６、１：０．７、１：０．８、１：０．９、１：１を含むがこれらに限定されない。又は最高で１：５であり、１：２、１：３、及び１．４含むがこれらに限定されない。好ましくは、ＧＡ（ＧＡＵ）対ＡＦＰ（ＳＡＰＵ）の比は約１：０．１から１：１又は約１：０．２から約１：０．８又は１：０．２から１：０．６の間である。ある好ましい実施態様においては、ＧＡ（ＧＡＵ）対ＡＦＰ（ＳＡＰＵ）の比は約１：０．４である。
【００８３】
ある好ましい組成物において、グルコアミラーゼ、酸安定性アルファアミラーゼ、及び酸性菌類
プロテアーゼは、ＧＡＵ：ＳＳＵ：ＳＡＰＵによる測定として約１：１．５：０．１から約１：８：１である。
【００８４】
ある好ましい組成物において、グルコアミラーゼ、酸安定性アルファアミラーゼ、及び酸性菌類
プロテアーゼは、ＧＡＵ：ＳＳＵ：ＳＡＰＵにて測定して約１：２：０．２から約１：５：０．６である。
【００８５】
ある好ましい組成物において、ＧＡ：ＡＡ：ＡＦＰの比は約１：４：０．４である。活性比に関して本明細書にて用いる時、「約（ａｂｏｕｔ）」は記載する数字の±１５％を含むことを意味する。
【００８６】
使用方法
本発明はさらに発酵性糖類から最終産物を生産するための方法に関する。方法は
（ａ）デンプン含有粉砕穀物を含むスラリーをアルファアミラーゼと接触させ、液状化物を生産する段階、
（ｂ）その液状化物をグルコアミラーゼ、酸安定性アルファアミラーゼ、及び酸性菌類プロテアーゼに接触させ、発酵性糖類を生産する段階、及び
（ｃ）発酵生物の存在下発酵性糖類を発酵させて最終産物を生産する段階
を含む。前記方法において、工程（ｂ）糖化及び（ｃ）発酵は連続して行って又は同時に行ってもよい。グルコアミラーゼ、酸安定性アルファアミラーゼ、及び酸性菌類プロテアーゼを液状化物に別個に添加してよい。あるいは、グルコアミラーゼ、酸安定性アルファアミラーゼ、及び酸性菌類プロテアーゼを含む酵素ブレンド組成物を液状化物へ添加してよい。各段階を以下に詳しく記載する。
【００８７】
デンプン転換
植物原料を含む基質を周知の方法により粉末にして又は粉砕してよい。植物原料は小麦、トウモロコシ、ライ、ソルガム（ミロ）、米、キビ、オオムギ、ライ小麦、キャッサバ（タピオカ）、ジャガイモ、サツマイモ、サトウダイコン、サトウキビ、及び大豆及びエンドウ豆のような豆類を含む植物から得られる。好ましい植物の原料は、トウモロコシ、オオムギ、小麦、米、ミロ、及びそれらの組み合わせを含む。植物原料はハイブリッド変異体及び遺伝的に修飾される変異体（例えば、異種性遺伝子を含むトランスジェニックトウモロコシ、オオムギ、又は大豆）を含んでよい。
【００８８】
デンプンを含む植物のいずれの部位を液状化物を生産するために使用してよく、葉、茎、さや、殻、塊茎、トウモロコシの穂軸、穀物の粒、及び同様物のような植物の部位を含むが、これらに限定されない。好ましい未精白の穀物は、トウモロコシ、小麦、ライ、オオムギ、ソルガム、及びそれらの組み合わせを含む。他の実施態様においては、デンプンは、繊維、内胚乳、及び／又は胚成分を含む分割された穀物から得てよい。トウモロコシ及び小麦のような植物原料を分割する方法は周知である。幾つかの実施態様においては、異なる供給源から得られる植物原料を一緒に（例えば、トウモロコシとミロ又はトウモロコシとオオムギ）混合してよい。製粉の方法は周知技術であり、ＴＨＥ ＡＬＣＯＨＯＬ ＴＥＸＴＢＯＯＫ： Ａ ＲＥＦＥＲＥＮＣＥ ＦＯＲ ＴＨＥ ＢＥＶＥＲＡＧＥ, ＦＵＥＬ ＡＮＤ ＩＮＤＵＳＴＲＩＡＬ ＡＬＣＯＨＯＬ ＩＮＤＵＳＴＲＩＥＳ ３ｒｄ ＥＤ. Ｋ. Ａ. Ｊａｃｑｕｅｓ他、Ｅｄｓ,（１９９９） Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ.に引用されている。２章及び４章を参照願いたい。
【００８９】
幾つかの実施態様においては、製粉であれ、他の方法であれ粉末にされる植物原料は液体と混合することによりデンプン基質を含むスラリーが得られる。幾つかの実施態様においては、スラリーは、バックセットのようなデンプンプロセスの副流を含んでよい。幾つかの実施態様においては、スラリーは、１５−５５％ｄｓ（例えば、２０−５０％、２５−４５％、２５−４０％、及び２０−３５％ｄｓ）を含む。粉末植物原料を含むスラリーを液状化処理してよく、アルファアミラーゼを液状化段階の間に添加してよい。これにより液状化物を得る。液状化物を生産するために、一回投与量又は分割投与量のアルファアミラーゼをスラリーに添加してよい。当業者は容易に液状化処理中に用いるべきアルファアミラーゼの有効な量を決定する。
【００９０】
幾つかの実施態様においては、液状化に用いるアルファアミラーゼの量は大部分のデンプンの液状化を引き起こすのに効果的な量である。他の実施態様においては、その量は４０％より多いデンプンの液状化を可能とするのに効果的であり、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、及び１００％を含む。幾つかの実施態様においては、その範囲は０．０５から５０ＡＵＵ／ｇｄｓ、また０．１から２０ＡＵＵ／ｇｄｓ、及び１．０から１０．０ＡＵＵ／ｇｄｓである。さらなる実施態様においては、アルファアミラーゼ量は０．０１から１０．０ｋｇ／メトリックトン（ＭＴ）ｄｓ、また０．０５から５．０ｋｇ／ＭＴ ｄｓ及び０．１から４．０ｋｇ／ＭＴ ｄｓである。
【００９１】
幾つかの実施態様においては、アルファアミラーゼを粉末植物原料の粒状デンプンのデンプンゼラチン化温度未満の０から３０℃の温度で加えてよい。この温度はデンプンゼラチン化温度未満の０から２５℃、０から２０℃、０から１５℃及び０から１０℃でよい。この具体的な値はスラリーを含む穀物のタイプにより変化し及び依存してよい。例えば、トウモロコシのデンプンゼラチン化温度は一般的にライ又は小麦のデンプンゼラチン化温度より高い。幾つかの実施態様においては、温度は４５から８０℃の間、また５０から７５℃の間、また５０から７２℃の間でよく、幾つかの実施態様においては、温度は６８℃未満、６５℃未満、６２℃未満、６０℃未満、及びまた５５℃未満でよい。他の実施態様においては、温度は４０℃、４５℃、５０℃、５５℃より高い温度でよい。幾つかの好ましい実施態様においては、インキュベーションの温度は５８℃と７２℃の間及び６０℃から６８℃の間でよい。
【００９２】
幾つかの実施態様においては、スラリーは約３．０から約６．５未満の範囲のｐＨで、また、約４．０から約６．２未満の範囲のｐＨで、また、約４．５から約６．０未満のｐＨで及び好ましくは約５．０から約６．０（例えば、約５．４から約５．８まで）に維持され、スラリー中の製粉穀物は２分から８時間（例えば、５分から３時間、１５分から２．５時間及び３０分から２時間）の間酵素組成物と接触できる。さらなる段階において、インキュベーションされる基質は、約４．０から約６．５のｐＨで２分から８時間（例えば、２分から６時間、５分から４時間及び好ましくは１時間から２時間）の間、インキュベーションされる基質をデンプンゼラチン化温度（例えば、６５℃から１２０℃まで、７０℃から１１０℃まで、７０℃から９０℃まで）以上の０から５５℃のような温度上昇に処されることにより液化する。幾つかの実施態様においては、温度を約８５‐９０℃の間まで温度上昇させ、単独投与量のアルファアミラーゼを用いてよい。もし温度が９０‐１０５℃より高い温度に上昇するならば、温度が通常に戻った後、第二回目の投与のアルファアミラーゼを加えてよい。さらなる実施態様においては、温度を約１０５℃と１４０℃の間まで温度上昇させ、分割投与のアルファアミラーゼを用いてよく、これは、温度上昇前に添加される一部分と温度が少なくとも１０５℃より低く下がった後であって、１０４、１０３、１０２、１０１、１００、９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、及び９１℃を含み、好ましくは９０℃より低く下がった後添加される他の部分を用いてよい。幾つかの実施態様においては、得られる液状化物を糖化前に冷却する。
【００９３】
糖化及び発酵
上述のように得られた液状化物を所望の酵素比を出来る限り長く維持する単独投与又は分割投与にてグルコアミラーゼ、酸安定性アルファアミラーゼ及び酸性菌類プロテアーゼと接触してよい。
つまり、分割投与量とは、所望の比における全体投与量を一以上に分割して添加し、二分割又は三分割を含むことを意味する。ある実施態様においては、全体投与量の一部分を初期に添加し、第二部分をプロセスにおける特定の時間に添加する。ある実施態様においては、、少なくとも一部分の投与量を糖化（又はＳＳＦ）の初期に添加し、糖化処理を始める。ある実施態様においては、酵素組成物中各酵素を液状化物に別々に、けれども、連続してまたは活性比が維持されるように十分短い時間にて添加してよい。あるいは、グルコアミラーゼ、酸安定性アルファアミラーゼ及び酸性菌類プロテアーゼを含む酵素ブレンド組成物を糖化及び発酵の一つの間又は両方の間に添加してよい。グルコアミラーゼ、酸安定性アルファアミラーゼ及び酸性菌類プロテアーゼの比はＧＡＵ：ＳＳＵ：ＳＡＰＵによる測定として好ましくは約１：１．５：０．１から約１：８：１、及びより好ましくは、約１：２：０．２から約１：５：０．６である。
【００９４】
糖化プロセスは１２から１２０時間続けてよい。しかしながら、３０分から２時間の間、糖化を行い、それから発酵の間に糖化を完了することが通常である。時々、これを同時糖化発酵（ＳＳＦ）という。通常、糖化を３０から６５℃の温度で一般的に４．０から５．０を含むｐＨ３．０から５．０で行う。糖化によって発酵性糖類の生産物として得てよい。
【００９５】
幾つかの実施態様においては、発酵性糖類を発酵微生物用いる発酵に用いてよい。接触段階及び発酵段階を同じ反応容器で同時又は分離して行ってよい。一般的に、発酵プロセスはＴｈｅ Ａｌｃｏｈｏｌ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ３ｒｄ ＥＤ， Ａ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｅｖｅｒａｇｅ， Ｆｕｅｌ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ａｌｃｏｈｏｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ, Ｅｄｓ Ｊａｃｑｕｅｓ他、（１９９９） Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， ＵＫに記載されている。
【００９６】
幾つかの実施態様においては、方法はさらに、アルコール（例えば、エタノール）、有機酸類（例えば、コハク酸、乳酸）、糖アルコール類（例えば、グリセロール）、アスコルビン酸中間体（例えば、グルコネート、ＤＫＧ，ＫＬＧ）、アミノ酸（例えば、リジン）、及びタンパク質類の（例えば、抗体及びそれらのフラグメント）ような最終産物を得るために、適切な発酵条件下、微生物の発酵における発酵用原料として発酵性糖類（デキストリン、例えば、グルコース）の使用を含む。
【００９７】
幾つかの好ましい実施態様においては、アルコール産物、好ましくはエタノールを生産するために、発酵性糖類を１５から４０℃、２０から３８℃及びまた２５から３５℃の範囲の温度にて、ｐＨ３．０から６．５、またｐＨ３．０から６．０、ｐＨ３．０からｐＨ５．５、ｐＨ３．５から５．０及びまたｐＨ３．５から４．５の範囲のｐＨにて、５時間から１２０時間、好ましくは１２から１２０時間より好ましくは２４時間から９０時間の間、酵母を用いて発酵する。
【００９８】
酵母細胞を一般的に１０４から１０１２の量で供給し、好ましくは、発酵培地の１ｍｌあたり１０７から１０１０生存酵母数で供給する。発酵は、さらに発酵微生物（例えば、酵母）、栄養素、任意の酸及び／又は追加的酵素を含むことができる。幾つかの実施態様においては、上述の生原料に加えて、発酵培地はサプリメント類を含んでよく、それはビタミン類（例えば、ビオチン、葉酸、ニコチン酸、リボフラビン）、コファクター、及びマクロとミクロ栄養素及び塩類（例えば、（ＮＨ４）２ＳＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、ＮａＣｌ、ＭｇＳＯ４、Ｈ３ＢＯ３、ＺｎＣｌ２、及びＣａＣｌ２）を含むが、これらに限定されない。
【００９９】
幾つかの好ましい実施態様においては、粉砕植物原料は大麦、ミロ、トウモロコシ及びそれらの組み合わせを含み、接触及び発酵段階は３．５から５．５の範囲のｐＨ、３０−４５℃の温度にて及び４８から９０時間にて同時に導入され、少なくとも５０％のデンプンが可溶化することを特徴とする。
【０１００】
最終産物
即時発酵プロセスのある好ましい最終産物は例えばエタノールのようなアルコール産物である。さらなる実施態様においては、最終産物は、乾燥した蒸留穀物残渣（Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ Ｄｒｉｅｄ Ｇｒａｉｎｓ）（ＤＤＧ）、可溶性物質添加乾燥蒸留穀物残渣（Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ Ｄｒｉｅｄ Ｇｒａｉｎ ｐｌｕｓ Ｓｏｌｕｂｌｅｓ）(ＤＤＧＳ)、のような発酵副産物であって、動物の飼料として用いられるものである。
【０１０１】
さらなる実施態様においては、周知であって適切な発酵微生物の使用により、発酵最終産物はグルセロール、１，３‐プロパンジオール、グルコネート、２‐ケト‐Ｄ‐グルコネート、２，５‐ジケト‐Ｄ‐グルコネート、２‐ケト‐Ｌ‐グロン酸、コハク酸、乳酸、アミノ酸類、及びそれらの誘導体を含むが、これらに限定されない。
【０１０２】
発酵生物
発酵生物の例はエタノール生産微生物（ｅｔｈａｎｏｌｏｇｅｎｉｃ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）又はアルコールデヒドロゲナーゼ及びピルビン酸デヒドロゲナーゼを発現し、ザイモモナス モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｌｉｓ）(例えば、ＵＳＰ ５，０００，０００、ＵＳＰ ５，０２８，５３９、ＵＳＰ ５，４２４，２０２、ＵＳＰ ５，５１４，５８３及びＵＳＰ ５，５５４，５２０を参照願いたい)から得られるエタノール生産細菌類のようなエタノール生産微生物（ｅｔｈａｎｏｌ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）である。さらなる実施態様においては、エタノール生産微生物はキシロースリダクターゼ及びキシリトールデヒドロゲナーゼであって、キシロースをキシルロースに変える酵素を発現する。さらなる実施態様においては、キシロース イソメラーゼはキシロースをキシルロースに変える。ある好ましい実施態様においては、ペントース類及びヘキソース類両方をエタノールへ発酵できる微生物を利用してよい。例えば、幾つかの実施態様においては、微生物は天然の微生物又は遺伝子組み換えをしていない微生物であり、他の実施態様においては、微生物は組み換え微生物でよい。
【０１０３】
発酵微生物はバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、大腸菌(Ｅ．ｃｏｌｉ)、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）(例えばパントエア シトレア（Ｐ． ｃｉｔｒｅａ）)、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、及びクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）（例えば、クレブシエラ オキシトカ（Ｋ. ｏｘｙｔｏｃａ）(例えば、ＵＳＰ ５，０２８，５３９、ＵＳＰ ５，４２４，２０２、及びＷＯ ９５/１３３６２を参照願いたい)由来の細菌菌株を含むがこれらに限定されない。バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）は好ましい発酵微生物である。発酵段階で用いる発酵微生物は生産されるべき最終産物で決定してよい。
【０１０４】
別の好ましい実施態様においては、エタノール生産微生物はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）のような菌類微生物、酵母、及び特に、サッカロミセス セレビジアエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＵＳＰ ４，３１６，９５６）の菌株のようなサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）である。多くのサッカロミセス セレビジアエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は商業的に入手可能であり、これらはＦＡＬＩ（Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ‘ｓ Ｙｅａｓｔ）、ＳＵＰＥＲＳＴＡＲＴ（Ａｌｌｔｅｃｈ）、ＦＥＲＭＩＯＬ（ＤＳＭ Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ）、ＲＥＤ ＳＴＡＲ（Ｌｅｓａｆｆｒｅ）及びＡｎｇｅｌ ａｌｃｏｈｏｌ ｙｅａｓｔ（Ａｎｇｅｌ Ｙｅａｓｔ Ｃｏｍｐａｎｙ, Ｃｈｉｎａ）を含むが、これらに限定されない。
【０１０５】
例えば、乳酸が所望な最終産物の場合、ラクトバシルス種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）（ラクトバシルス カセイ（Ｌ． ｃａｓｅｉ））を用いてよい。グルセロール又は１，３‐プロパンジオールが所望の最終産物の場合は大腸菌(Ｅ．ｃｏｌｉ)を用いてよい。そして２‐ケト‐Ｄ‐グルコネート、２，５‐ジケト‐Ｄ‐グルコネート、及び２‐ケト‐Ｌ‐グロン酸が所望の最終産物である場合、パントエア シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａ）を発酵微生物として用いてよい。上記列挙するリストは単なる例であり、当業者は所望の最終産物を得るために適切に用いることのできる多くの発酵微生物を知っている。
【０１０６】
最終産物の回収
本発明の方法に従って生産される最終産物は発酵培地から分離及び／又は精製されてよい。分離及び精製の方法は周知であり、例えば培地を抽出、蒸留及びカラムクロマトグラフィー処理による方法である。幾つかの実施態様においては、最終産物は培地を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析にて処理することにより直接同定される。
【０１０７】
さらなる実施態様においては、例えばマッシュ（ｍａｓｈ）を遠心分離により液相と固相及びアルコールや回収される固体のような最終産物へ分離してよい。アルコールを蒸留及びモレキュラーシーブ脱水又は限外ろ過のような手段にて回収してよい。
【０１０８】
幾つかの実施態様においては、エタノール生産の方法にかかる本発明による酵素ブレンド又は組成物の使用は８％、１０％、１２％、１４％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、及び２２％（ｖ／ｖ）より多いエタノールの収量を得る。
【０１０９】
任意的に、発酵に続いて、例えば、アルコール（例えば、エタノール）を蒸留により抽出できる。エタノールは燃料、携帯用又は産業用エタノールとして使用できる。
【実施例】
【０１１０】
本発明を次の実施例にてさらに詳しく述べるが、これは特許請求の範囲を限定することを全く意図していない。添付図面は本発明の明細書及び本発明の記載の不可分な一部として考えられる。すべての引用文献は、記載されるすべてのものを本明細書に引用することにより具体的に本明細書に取り込まれる。次の実施例は本発明を説明するために提供されるが、特許請求の範囲を限定するものではない。
【０１１１】
開示及び次の実施例のセクションにおいて、つぎの略語が適用される。ｗｔ％（質量パーセント（ｗｅｉｇｈｔ ｐｅｒｃｅｎｔ）、℃（摂氏(ｄｅｇｒｅｅｓ Ｃｅｎｔｉｇｒａｄｅ)、Ｈ２Ｏ（水（ｗａｔｅｒ））、ｄＨ２Ｏ（脱イオン水（ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ ｗａｔｅｒ））、ｄＩＨ２Ｏ（脱イオン水、ミリＱろ過（ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ ｗａｔｅｒ,Ｍｉｌｌｉ−Ｑ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ)、ｇまたはｇｍ（グラム（ｇｒａｍｓ））、μg（マイクログラム(ｍｉｃｒｏｇｒａｍｓ)）、ｍｇ（ミリグラム（ｍｉｌｌｉｇｒａｍｓ））、ｋｇ（キログラム（ｋｉｌｏｇｒａｍｓ））、μL（マイクロリットル（ｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒｓ））、ｍｌ及びｍＬ（ミリリットル(ｍｉｌｌｉｌｉｔｅｒｓ)、ｍｍ（ミリメートル（ｍｉｌｌｉｍｅｔｅｒｓ））、μｍ（マイクロメートル(ｍｉｃｒｏｍｅｔｅｒ)）、Ｍ（モル（ｍｏｌａｒ））、ｍＭ（ミリモル（ｍｉｌｌｉｍｏｌａｒ））、μＭ（マイクロモル(ｍｉｃｒｏｍｏｌａｒ)）、Ｕ（単位(ｕｎｉｔｓ)）、ＭＷ（分子量(ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ)）、ｓｅｃ（秒(ｓｅｃｏｎｄｓ)）、ｍｉｎ（ｓ）（分(ｍｉｎｕｔｅ／ｍｉｎｕｔｅｓ)）、ｈｒ（ｓ）（時間(ｈｏｕｒ／ｈｏｕｒｓ)）、ＤＯ（溶解酸素(ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ ｏｘｙｇｅｎ)）、Ｗ／Ｖ（重量／体積(ｗｅｉｇｈｔ ｔｏ ｖｏｌｕｍｅ)）、Ｗ／Ｗ（重量／重量(ｗｅｉｇｈｔ ｔｏ ｗｅｉｇｈｔ)）、Ｖ／Ｖ（体積／体積(ｖｏｌｕｍｅ ｔｏ ｖｏｌｕｍｅ)）、ＩＫＡ (アイケーエー（ＩＫＡ Ｗｏｒｋｓ Ｉｎｃ． ２６３５ Ｎｏｒｔｈ Ｃｈａｓｅ Ｐａｒｋｗａｙ ＳＥ， Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， ＮＣ)）、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ（ジェネンコー インターナショナル社(Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｉｎｃ．， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ)）、Ｎｃｍ（ニュートン センチメートル(Ｎｅｗｔｏｎ ｃｅｎｔｉｍｅｔｅｒ)）、ＥＴＯＨ（エタノール(ｅｔｈａｎｏｌ)）、ｅｑ（当量(ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ)、Ｎ（規定(Ｎｏｒｍａｌ)）ｄｓ又はＤＳ（乾燥固体含有量(ｄｒｙ ｓｏｌｉｄｓ ｃｏｎｔｅｎｔ)）、ＳＡＰＵ（分光光度の酸性プロテアーゼ単位(ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｕｎｉｔ)であって、１ＳＡＰＵはアッセイ条件下カゼイン基質
から１マイクロモルのチロシンを遊離するプロテアーゼ酵素活性の量である）、及びＧＡＵ（グルコアミラーゼ ユニット（ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ ｕｎｉｔ）であって、ｐＨ４．２及び６０℃にて可溶性デンプン基質から時間当たりグルコースに換算して１ｇの還元糖を生産することのできる酵素量として規定される）。
【０１１２】
材料及び方法
粘度測定
グラスクッカー‐粘度計（ｇｌａｓｓ ｃｏｏｋｅｒ ‐ｖｉｓｃｏｍｅｔｅｒ）、ＬＲ‐２．ＳＴシステムＩＫＡを粘度測定するために用いる。手短に説明すると、粘度計は、ユーロスター ラボテクニック パワー コントロール‐粘度計（Ｅｕｒｏｓｔａｒ Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ ｐｏｗｅｒ ｃｏｎｔｒｏｌ−ｖｉｓｃｏｍｅｔｅｒ）(ビスコクリック（Ｖｉｓｃｏｋｌｉｃｋ）粘度計の粘度範囲は０から６００Ｎｃｍ)によって攪拌されるアンカーミキサーを有する２０００ｍｌの二重壁のガラス容器からなる。一般的に、本明細書に記載する実施例のために、デンプン基質及び適切な酵素量を含有するスラリーを粘度計容器に注いだ。温度及び粘度を８５℃まで加熱する間記録し、インキュベーションをさらに６０分から１２０分間続けた。Ｎｃｍとして測定される粘度は間隔を置いて記録した。
【０１１３】
酵素
用いたグルコアミラーゼは表１に配列番号１として示すトリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ＧＡ（ＴｒＧＡ）であった（また、ＵＳ ２００６／０００３４０８、１／５／２００６発行、及びＵＳ ２００６／００９４０８０、５／４／２００６発行を参照願いたい、両者は参照によりここに取り込まれる）。実施例にて用いる酸性菌類プロテアーゼは、配列番号１４の配列を有するトリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）であった（また、ＵＳ ２００６／０１５３４２、７／１３／２００６発行、配列番号１０を参照願いたい、参照により取り込まれる）。アルファアミラーゼは、本明細書にて配列番号５（米国特許第７，２０５，１３８）として示すアスペルギルス カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ. ｋａｗａｃｈｉ）アルファアミラーゼ（ＡｋＡＡ）であった。すべての特許出願はそれら全体を参照により本明細書に取り込まれる。
【０１１４】
高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による炭水化物分析：
オリゴサッカライド反応産物の組成物を屈折率（ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ ｉｎｄｅｘ）（ＲＩ）検出器(ＥＲＣ−７５１５Ａ ＲＩ検出器, Ａｎｓｐｅｃ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｉｎｃ．)に接続し５０℃に維持したＨＰＬＣカラム(レゼックス（Ｒｅｚｅｘ） ８ｕ ８％ Ｈ， モノサッカライド)が備わったＨＰＬＣ（ベックマンシステム（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｓｙｓｔｅｍ） Ｇｏｌｄ ３２ Ｋａｒａｔ Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ， ＣＡ）により測定した。サッカライド類は分子量に基づいて分離された。ＤＰ１の記号は、グルコースのようなモノサッカライド、ＤＰ２の記号は、マルトースのようなジサッカライド、ＤＰ３の記号は、マルトトリオースのようなトリサッカライド及び「ＤＰ４＋」の記号は、４以上の重合（ＤＰ）度を有するオリゴサッカライドである。
【０１１５】
アルファアミラーゼ活性（ＡＡＵ）は分光学的に測定されるヨード染色能の減少割合を反映するようにデンプン加水分解の割合によって決定した。アルファアミラーゼ活性の１ＡＡＵは標準条件下、１分当たり１０ｍｇのデンプンを加水分解することのできる酵素量である。
【０１１６】
アルファアミラーゼ活性は、可溶性デンプン単位（ＳＳＵ）として算定した。ｐＨ４．５、５０℃にて酵素サンプルの一部によって可溶性ジャガイモデンプン基質（４％ＤＳ）の加水分解の程度に基づく。還元糖含有量はＭｉｌｌｅｒ， Ｇ． Ｌ． （１９５９） Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ. ３１ ：４２６−４２８に記載のＤＮＳ方法を用いて測定される。スペザイム フレッド（ＳＰＥＺＹＭＥ ＦＲＥＤ）でのＬＩＱＵＩＦＯＮ Ｕｎｉｔｓ (ＬＵ)におけるアルファアミラーゼ活性はＵＳＰ ５，９５８，７３９記載の方法に従って測定された。手短に説明すると、試験方法は、化学的にブロックされる非還元末端糖を有する基質としてｐ−ニトロフェニルマルトヘプトシド（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ｍａｌｔｏｈｅｐｔｏｓｉｄｅ）を用いる。ｐ−ニトロフェニルの放出の割合はアルファアミラーゼ活性と比例し、放出は４１０ｎｍで測定される。活性は標準コントロールに対して計算される。
【０１１７】
グルコアミラーゼ活性単位（ＧＡＵ）は＝ＰＮＰＧ試験をグルコアミラーゼの活性を測定するために用いる。
【０１１８】
酸性菌類プロテアーゼ活性（ＳＡＰＵ）＝酸性菌類プロテアーゼ活性はｐＨ３．０及び３７℃にて精製高窒素カゼイン基質（Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｈｉｇｈ ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｓｅｉｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）の３０分間タンパク質加水分解から可溶性カゼインペプチドの遊離に基づく。非加水分解基質をトリクロロ酢酸を用いて沈殿させろ過にて除去する。可溶化カゼインをそれから分光学的に測定される。１の分光光度の酸性プロテアーゼ単位（ＳＡＰＵ）はその方法の条件下酵素産物の１グラム当たり１分間での１マイクロモルのチロシン相当量を遊離する活性である。
【０１１９】
実施例１
エタノール発酵でのＴｒＧＡ、ＡｋＡＡ及びＡＦＰブレンド又は組成物の効果
この実施例は、エタノール発酵でのグルコアミラーゼ、アルファアミラーゼ及び酸性菌類プロテアーゼのブレンドの驚くべき有用性を示す。
【０１２０】
グルコアミラーゼ（トリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）又はアスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ））を用いた酸性菌類プロテアーゼ（ジェネンコ−ダニスコ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ‐Ｄａｎｉｓｃｏ）製ファームゲン（商標）（ＦＥＲＭＧＥＮ（商標））及び酸安定性アルファアミラーゼ（配列番号５を有するＡｋＡＡ）の効果を酵母発酵の間、炭素転換効率（アルコール収量）にて分析した。液状化全粒粉砕トウモロコシを含む培地を試験した。この試験用のマッシュを蒸留残液（ｔｈｉｎ ｓｔｉｌｌａｇｅ）（ニュー エネルギー（Ｎｅｗ Ｅｎｅｒｇｙ， Ｓｏｕｔｈ Ｂｅｎｄ ＩＮ）から得られる９．８％ ＤＳ）を用いて３２％ＤＳまでニュー エネルギー（Ｎｅｗ Ｅｎｅｒｇｙ， Ｓｏｕｔｈ Ｂｅｎｄ ＩＮ）液状化物（３９．８％ ＤＳ Ｗ／Ｗ）を希釈することにより作成した。マッシュ（ｍａｓｈ）は２９．３％トウモロコシＤＳを含んだ。そのマッシュ（ｍａｓｈ）のｐＨを６Ｎ硫酸にて４．２に調整した。６００ｐｐｍ尿素をレッドスターエタノール（Ｒｅｄ Ｓｔａｒ Ｅｔｈａｎｏｌ）の酵母播種材料と共に添加した。発酵を３００ｇｍのマッシュ（ｍａｓｈ）を含む５００ｍｌフラスコにて行った。酵素を希釈してそのフラスコへ０．２ｍｌ添加した。すべての酵素用量を１ｇｍトウモロコシＤＳ当たりの酵素用量であった。フラスコを３２℃の水浴に置き、場合によって混合した。表６に示す酵素濃度を用いた。
【０１２１】
発酵の間、ＨＰＬＣ分析のために約２ｍｌの発酵培地（ブロス）をサンプルとして採取した。スクリューキャップ試験管中０．５ｍｌのサンプル上澄みを４．４５ｍｌの水と０．０５ｍｌの１Ｎ硫酸に加えた。試験管に蓋をして１５分間７５℃の水浴に置いて、酵素活性を失活させた。加熱後、ＨＰＬＣ分析のために希釈されたサンプルを０．２ミクロンフィルターを通してろ過した。ＨＰＬＣ分離を６０℃にて０．０１Ｎ硫酸の移動相を用いて０．６ｍｌ／分にてフェノミネックス酸性カラム（Ｐｈｅｎｏｍｉｎｅｘ ａｃｉｄ ｃｏｌｕｍｎ）で行った。２０μｌのサンプルを注入した。７１時間後発酵を停止し、発酵培地を廃棄した。
【０１２２】
表６に示すＨＰＬＣの結果は酵母発酵（０．２５ＧＡＵのＴｒ‐ＧＡ／ｇｄｓ ｃｏｒｎ、３２％ｄｓ、ｐＨ４．３、３２℃）の間酸安定性アルファアミラーゼ（ＡｋＡＡ）及び酸性菌類プロテアーゼ（ファームゲン（ＦＥＲＭＧＥＮ）／ＡＦＰ）の効果を示す。重合の程度、又はＤＰは重合反応中時間ｔにて平均ポリマー鎖における繰り返し単位の数である。長さはモノマー単位である。重合の程度は分子量の測定である。ＤＰ‐１の例はグルコース及びフルクトースのようなモノサッカライド類である。ＤＰ‐２の例はマルトース及びスクロースのようなジサッカライド類である。ＤＰ‐３はマルトトリオースをいう。ＤＰ＞３は３より大きい重合度を有するポリマーを示す。表６に示すＤＰ‐１、ＤＰ‐２、及びＤＰ‐３はデンプンの加水分解から得られる糖類である。
【０１２３】
乳酸はラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）菌により炭水化物の発酵中に生産される有機酸である。乳酸の生産は感染されたエタノール発酵中の収量の低下の主な原因となる。そのことから、乳酸は定期的にモニターされる。グリセロールはエタノール発酵の副産物である。それは酵母発酵の調子の指標として定期的にモニターされる。
【０１２４】
表６の結果は酵素ブレンド中ＡｋＡＡのレベルが増加する場合、高い糖のの割合の減少（＞ＤＰ３）と結果としてエタノール生産の割合が増加し、最終的にエタノールの収量が増加することを示す。
【表６】
【０１２５】
実施例２
マスバランス試験
酵母発酵の間、炭素転換効率（アルコール収率）に対するグルコアミラーゼ（トリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ））を用いた酸性菌類プロテアーゼ（Ｄａｎｉｓｃｏ ＵＳ， Ｉｎｃ， Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ製のファームゲン（ＦＥＲＭＧＥＮ））及び酸安定性アルファアミラーゼ（配列番号５）の効果を分析した。液状化全粒粉砕トウモロコシを含む培地をさらにマスバランス試験に用いた。
【０１２６】
液状化物（液状化全粒粉砕トウモロコシ基質）を最終ＤＳが３２％になるように蒸留残液（ｔｈｉｎ ｓｔｉｌｌａｇｅ）を全粒粉砕トウモロコシ液状化物へ加えることによって調製した。ｐＨを６Ｎ硫酸を用いて４．３に調整した。マッシュに４００ｐｐｍの尿素を０．０５重量％のレッドスターエタノール（Ｒｅｄ Ｓｔａｒ Ｅｔｈａｎｏｌ）酵母播種材料と共に添加した。マッシュを１２００グラムの量に分割し、表８に記載する０．３２５ＧＡＵ／ｇＤＳレベルにて酵素を投与した。約８００グラムのマッシュを４つの１リットルの容量フラスコにそれぞれ定量的に加えた。さらにそれぞれ約１５０グラムを２５０ｍｌ三角フラスコに添加した。１リットル容量フラスコはＣＯ２を逃がすための針を備えたゴム製コルク栓で蓋をし、３２℃のインキュベーターに置き、定期的に重量を測定した。２５０ｍｌの三角フラスコは１５０ｒｐｍにて３２℃の強制空気シェーカー中に置き、ＨＰＬＣ分析用に定期的にサンプリングした。１Ｌ容器の発酵の最後にＨＰＬＣ分析用に一部の溶液を採取した。フラスコの内容物を約５００ｍｌの脱イオン水（ＤＩ ｗａｔｅｒ）を用いながら定量的に２Ｌの三角フラスコに移したフラスコを蒸留装置に装着し、蒸留させた。約８００ｍｌの蒸留物を１Ｌの容量フラスコに集め、１Ｌに希釈した。サンプルをそれからＨＰＬＣ分析用に採取した。蒸留後残留物を天秤皿に移し１０４℃にて乾燥した。乾燥残留物（ＤＤＧＳ）を集め、残留デンプンを試験した。
【０１２７】
発酵中のアルコール収率及び糖の組成物プロファイルに対する０．３２５ＧＡＵのＴｒＧＡ／ｇｄｓ トウモロコシでのＡｋＡＡ及びＡＦＰの効果に関するＨＰＬＣデータを表７に示す。
【表７】
【０１２８】
表８のデータは酸性菌類プロテアーゼ（ＡＦＰ）の添加がアルコール産物の割合の増加をもたらすが、アルファアミラーゼ（ＡｋＡＡ）の添加はコントロールと比較してさらに高いアルコール産物を生産した。マスバランスデータを表８にまとめた。表８はＴｒＧＡ、ＡＦＰ、及びＡｋＡＡを含む三種の酵素ブレンドがＴｒＧＡとＡＦＰ又はＡｋＡＡ単独との組み合わせと比較して高い炭素転換効率（２,６７％）をもたらすことを示した。
【表８】
【０１２９】
蒸留からのアルコール収率はＣＯ２の値と同様の傾向を示し、７３００及び５０００ＳＳＵ／ｇアルファアミラーゼを含むブレンドは１ブッシェルのトウモロコシ当たり１ガロンのエタノールに関する最終の値において互いに同じくらいであり、コントロールよりよかった（表８を参照願いたい）。表８のデータはＡｋＡＡの容量増加につれて最終発酵でのエタノールレベルが増加することを示す。最終培地のＨＰＬＣ分析は同じ傾向を十分示すが、ＣＯ２値及び蒸留物の値ほどまで示さなかった。
【０１３０】
液状化全粒粉砕トウモロコシを用いる酵母発酵条件下異なる酵素組成を用いて得られる最終アルコール濃度をＴｒＧＡに対して比較して図１に示した。図１は液状化全粒粉砕トウモロコシの酵母発酵の間最終アルコール収率に対するＴｒＧＡ添加酸性菌類プロテアーゼ（ＳＡＰＵ）及び酸安定性アルファアミラーゼ（ＳＳＵ）の効果を示した。図１中番号が付けられた異なる酵素混合物は
１：ＴｒＧＡ、０．２５ＧＡＵ／ｇｄｓ トウモロコシ、
２：番号１＋０．０５ＳＡＰＵ ＡＦＰ／ｇｄｓ トウモロコシ、
３：番号１＋２．０ＳＳＵ アルファアミラーゼ／ｇｄｓ．トウモロコシ、
４：番号１＋０．０５ＳＡＰＵ、ＡＦＰ＋２．０ＳＳＵ アルファアミラーゼ／ｇｄｓ トウモロコシ
である。
【０１３１】
予想外に結果は炭素転換効率（トウモロコシｄｓのグラム当たりアルコール収量）は酵素ブレンド組成に依存することを示した。ＡＦＰ又はＡｋＡＡを含むＴｒＧＡを用いるアルコール収率における増加は付加的ではなく、予想外に相乗的効果を示した。
【０１３２】
上記明細書に言及するすべての文献及び特許は引用により本明細書に組み入れられる。本発明の記載された方法及びシステムの種々の修飾及び変化は本発明の範囲及び精神に沿って当業者にて明らかである。本発明は特定の所望の実施態様との関係で記載されているが、特許請求の範囲にかかる発明が、そのような特定の実施態様に不当に限定すべきでないことは理解されるところである。実際に、本発明を行うために当業者とってあきらかな態様の種々の修飾は以下の特許請求の範囲内であることを意図する。
【図１】
【技術分野】
【０００１】
本発明はグルコアミラーゼ、酸安定性アルファアミラーゼ、及び酸性菌類プロテアーゼを含む酵素ブレンドに関する。また、本発明は例えばエタノールのような最終産物を生産するようなデンプン転換プロセスにおける酵素ブレンドを利用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
産業用発酵は、酵素類、タンパク質類、アミノ酸類、有機酸類、糖アルコール類、医薬品類、及び他の生物化学薬品類のような、多くの最終産物の生産のための原料として、グルコースを主に用いる。多くの利用においてグルコースはデンプン及びセルロース（例、全体を粉砕される穀物）含有基質の酵素的転換から生産される。デンプンは、アミロース及びアミロペクチンという二つのポリサッカライド分画を有し、顆粒状粒子として、植物細胞中に存在する。これらの顆粒の部分的結晶構造は冷水中不溶性であり、その結果、水に対するデンプン顆粒の可溶化は一般的に顆粒の結晶構造を崩壊するための熱エネルギーが必要となる。多大なプロセスをデンプン可溶化に使用し、これらは粒状デンプン含有基質の直接的及び間接的加熱を含む（例えば、ＳＴＡＲＣＨ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＡＮＤ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ, Ｅｄｓ Ｒ.Ｌ. Ｗｈｉｓｔｌｅｒ他、２ｎｄ Ｅｄ., １９８４ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ., Ｏｒｌａｎｄｏ ＦＬ及びＳＴＡＲＣＨ ＣＯＮＶＥＲＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ, Ｅｄｓ Ｇ.Ｍ.Ａ. Ｖａｎ Ｂｅｙｎｕｍ他、Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｅｒｉｅｓ １９８５ Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ. ＮＹを参照）。
【０００３】
一般的に、デンプンからグルコースへの処理は、二段階からなり、これらの段階はデンプンの液状化及び液化デンプンの糖化を含む。さらに、段階は、（ａ）所望の最終産物が精製デキストロース又はフルクトースの場合に、精製及び異性化又は（ｂ）所望の最終産物が例えば、アルコール（例、エタノール）の場合に、発酵及び蒸留を含んでよい。
【０００４】
デンプン液状化プロセスの目的はデンプンポリマー顆粒のスラリーを低粘度のさらに短い鎖の長さであるデキストリンの液体へ転換することである。これは、デンプン転換プロセスにて用いる産業用装置の便利な操作のための重要な段階である。通常、デンプンは高温及び酵素的生物的変換の使用により液化される。例えば、通常の酵素的液状化プロセスは熱安定性微生物のアルファアミラーゼ（例、スペザイム（商標）プライム（ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＰＲＩＭＥ）及びスペザイム（商標）フレッド （ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＦＲＥＤ）、スペザイム（商標）エチル（ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＸＴＨＹＬ） (ダニスコユー．エス．インク、ジェネンコ ディビジョン（Ｄａｎｉｓｃｏ Ｕ．Ｓ．， Ｉｎｃ， Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）)、又はターマミルＳＣ（ＴＥＲＭＡＭＹＬ ＳＣ）、ターマミル スープラ （ＴＥＲＭＡＭＹＬ ＳＵＰＲＡ）又はターマミル １２０Ｌ（ＴＥＲＭＡＮＹＬ １２０Ｌ） (ノボザイムズ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）)）を粒状デンプン含有基質を含むスラリーに添加し、ｐＨを５．５から６．５の間及び９０℃以上の温度に調整することを伴う。デンプンは液化し、そして、糖化酵素に接触される。典型的に、糖化は、アスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）（例、オプチデックスＬ−４００（ＯＰＴＩＤＥＸ Ｌ−４００）(ジェネンコ インターナショナル社（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ）)）由来のグルコアミラーゼのようなグルコアミラーゼの存在下液状化段階のｐＨより酸性のｐＨで起こる。
【０００５】
数多くのバリエーションがデンプン基質の液状化及び糖化には存在する、しかし、デンプンの液状化、糖化、及び発酵のための効率のよい手段の必要性がなお存在する。
【発明の概要】
【０００６】
本発明はグルコアミラーゼ（ＧＡ）、酸性菌類プロテアーゼ（ＡＦＰ）、及び酸安定性アルファアミラーゼ（ＡＡ）を含む酵素ブレンド組成物に関する。好ましくは、グルコアミラーゼ、酸安定性アルファアミラーゼ、及び酸性菌類プロテアーゼの比がＧＡＵ：ＳＳＵ：ＳＡＰＵで測定した場合、約１：１．５：０．１から約１：８：１又は約１：２：０．２から約１：５：０．６である。
【０００７】
酵素ブレンド組成物は発酵性糖からの最終産物を生産するために有用であり、特に、液状化物からのエタノールの生産に有用である。酵素ブレンド組成物の有利な効果は実質的に同様な条件下グルコアミラーゼを単独に用いて生産されるエタノール量に比較して多くの量のエタノールをもたらすことである。ある態様においては、ＧＡ単独と比較して０．５％より大きい増加であり、１．０％、１．５％、２％、及び２．５％より大きい増加を含む。
【０００８】
ある態様においては、ＧＡがトリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．）、タラロミセス種（Ｔａｌｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）、ペニシリウム種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐｐ．）、アスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）及びフミコーラ種（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｓｐｐ．）から成る群から選択される糸状菌から得られる。さらなる態様においては、グルコアミラーゼは配列番号１の配列を有するグルコアミラーゼと少なくとも９０％の相同性を有し、及び／又はＡＦＰは配列番号１４の配列を有するＡＦＰと少なくとも９０％の相同性を有し、及び／又はアルファアミラーゼは配列番号５の配列を有するＡＡと少なくとも９０％の相同性を有し、及び／又はアルファアミラーゼは配列番号５の配列を有するＡＡと少なくとも９５％の相同性を有する。
【０００９】
酵素ブレンド組成物は任意に一以上の他の酵素を含み、例えば、第二のグルコアミラーゼ、第二のアルファアミラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、第二のプロテアーゼ類、フィターゼ、プルラナーゼ、ベータ‐アミラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ベータ‐グルカナーゼ、ガラクトシダーゼ、エステラーゼ、シクロデキストリントランスグルコシルトランスフェラーゼ、及びそれらの組み合わせを含む。
【００１０】
さらに、本発明は発酵性糖類からアルコールのようなの最終産物を生産するための方法に関する。方法は、
（ａ）デンプン含有粉砕穀物を含むスラリーをアルファアミラーゼと接触させ液状化物を生産する段階、
（ｂ）前記液状化物をグルコアミラーゼ、酸安定性アルファアミラーゼ、及び酸性菌類プロテアーゼと接触させ発酵性糖類を生産する段階、及び
（ｃ）発酵生物の存在下発酵性糖類を発酵させ最終産物を生産する段階
を含む。
この方法において、段階（ｂ）である糖化及び段階（ｃ）である発酵を連続して行って又は同時に行ってよい。グルコアミラーゼ、酸安定性アルファアミラーゼ、及び酸性菌類プロテアーゼを液状化物に別々に添加してよい。あるいは、グルコアミラーゼ、酸安定性アルファアミラーゼ、及び酸性菌類プロテアーゼを含む酵素ブレンド組成物を液状化物へ添加してよい。処理の間に任意に、アルファアミラーゼ、グルコアミラーゼ、フィターゼ、セルラーゼ、プルラナーゼ、プロテアーゼ、又はラッカーゼのような少なくとも一つの他の酵素を用いてよい。また、方法は最終産物を回収する段階を含んでよい。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
図１は実施例２にさらに記載のように液状化した全粉砕トウモロコシを用いた同時糖化／発酵の間、異なる酵素ブレンドを用いて得られる最終アルコール濃度を示す。Ｙ軸は％エタノールを示し（Ｖ／Ｖ）、Ｘ軸は次の通りである。
１．ＴｒＧＡ、０．２５ＧＡＵ／ｇｄｓ トウモロコシ、
２．番号１ ＋ ０．０５ＳＡＰＵ ＡＦＰ／ｇｄｓ トウモロコシ
３．番号１ ＋ ２．０ＳＳＵアルファアミラーゼ／ｇｄｓ トウモロコシ、
４．番号１ ＋ ０．０５ＳＡＰＵ、ＡＦＰ ＋ ２．０ＳＳＵアルファアミラーゼ／ｇｄｓ トウモロコシ
【発明を実施するための形態】
【００１２】
定義
本明細書にて他に定義されていない限り、本明細書で用いるすべての技術的及び特別な用語はこの発明に属する当業者によって普通に理解されるものと同様の意味を持つ。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ、他、 ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， ２Ｄ ＥＤ．、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ (１９９４)及びＨａｌｅ ＆ Ｍａｒｈａｍ， ＴＨＥ ＨＡＲＰＥＲ ＣＯＬＬＩＮＳ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ， ＮＹ (１９９１)が、当業者には本発明で用いられる用語の多くの一般的辞書となる。さらに、特定の用語は明瞭性のため及び参照の場合のために下記に定義する。
【００１３】
「アルファアミラーゼ（Ａｌｐｈａ ａｍｙｌａｓｅｓ）」はアルファ‐１、４、‐４‐グルカン‐グルカノヒドロラーゼ（Ｅ. Ｃ. ３．２.１．１）であり、デンプン（例、アミロペクチン又はアミロースポリマー）中アルファ‐１、４‐グルコシド内部結合を切断又は加水分解する酵素である。
【００１４】
用語「ゼラチン化温度より低い（ｂｅｌｏｗ ｔｈｅ ｇｅｌａｔｉｎｉｚａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）」は、ゼラチン化温度より低い温度をいう。
【００１５】
用語「ＤＥ」又は「デキストロース当量（ｄｅｘｔｒｏｓｅ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）」は、乾燥重量を基本にＤ‐グルコースとして計算される、還元糖全体の濃度を測定するための業界基準である。非加水分解粒状デンプンはＤＥが実質的に０であり、Ｄ‐グルコースはＤＥが１００となる。
【００１６】
「デキストリン（Ｄｅｘｔｒｉｎｓ）」はグルコースの短鎖ポリマー（例、２から１０単位）である。
【００１７】
用語「乾燥固体（ｄｒｙ ｓｏｌｉｄｓ）（ｄｓ）」は、乾燥重量を基本として％表示のスラリーの固体の総数をいう。
【００１８】
用語「最終産物（ｅｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔ）」は、発酵基質から酵素的に転換される任意の炭素源由来産物をいう。幾つかの好ましい実施態様においては、最終産物はアルコール（例えば、エタノール）である。
【００１９】
本明細書にて用いる用語「エタノール生産体（ｅｔｈａｎｏｌ ｐｒｏｄｕｃｅｒ）」又は「エタノール生産微生物（ｅｔｈａｎｏｌ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）」はモノサッカライド又はオリゴサッカロイドからエタノールを生産することのできる発酵微生物をいう。
【００２０】
用語「発酵性糖類（ｆｅｒｍｅｎｔａｂｌｅ ｓｕｇａｒｓ）」は発酵生物により発酵される任意の糖類をいう。発酵性糖類はオリゴサッカロイド類及びデキストリン類を含む。
【００２１】
「発酵性糖（ｆｅｒｍｅｎｔａｂｌｅ ｓｕｇａｒ）」はモノサッカライド又はジサッカロイドをいい、最終産物を生産するためにその発酵性糖に接触して微生物より発酵工程にて転換してよい。幾つかの実施態様においては、発酵性糖は微生物により代謝され、他の実施態様においては、微生物による酵素の発現及び／又は分泌によって発酵性糖の所望の転換を達成する。
【００２２】
用語「発酵（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）」は、より簡単な有機化合物を生産するために微生物によって有機基質の酵素的及び嫌気的分解をすることをいう。発酵は嫌気的条件下で行われる一方、この用語は単に嫌気条件下で行われるものに限定されず、酸素存在下での発酵も意図する。
【００２３】
本明細書にて用いる用語「発酵生物（ｆｅｒｍｅｎｔｉｎｇ ｏｒｇａｎｉｓｍ）」は、発酵における使用に適し、直接又は間接的に最終産物を生産するのに適する任意の微生物又は細胞をいう。
【００２４】
用語「機能的に同等（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）」は、野生型酵素と同様の酵素の機能的特徴を有する酵素及び野生型由来の酵素を意味する。
【００２５】
用語「ゼラチン化（ｇｅｌａｔｉｎｉｚａｔｉｏｎ）」は一般的に、粘性のある懸濁液を形成するために加熱によるデンプン分子の可溶化をいう。
【００２６】
用語「ゼラチン化温度（ｇｅｌａｔｉｎｉｚａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）」は基質を含むデンプンのゼラチン化が始まる最も低い温度をいう。ゼラチン化の適切な温度は特定のデンプンで決定され、植物の種、及び環境と増殖条件のような因子次第で変化してよい。
【００２７】
用語「粒状デンプン（ｇｒａｎｕｌａｒ ｓｔａｒｃｈ）」は、生デンプン、つまり、ゼラチン化温度にさらされていないデンプンを意味する。
【００２８】
用語「粒状デンプン加水分解（ＧＳＨ）酵素（ｇｒａｎｕｌａｒ ｓｔａｒｃｈ ｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇ (ＧＳＨ) ｅｎｚｙｍｅ）」及び「粒状デンプン加水分解（ＧＳＨ）活性（ｇｒａｎｕｌａｒ ｓｔａｒｃｈ ｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇ (ＧＳＨ) ａｘｔｉｖｉｔｙ）を有する酵素」は粒状形態でデンプンを加水分解する能力を有する酵素をいう。
【００２９】
用語「％ホモロジー（％ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」は用語「％相同性（％ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」と本明細書にて互換可能に用いる。二つの配列間の相同性を決定するために用いることのできる典型的なコンピュータープログラムは、一連のＢＬＡＳＴプログラム、例えば、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ、及びＴＢＬＡＳＴＸ、ＢＬＡＳＴＰとＴＢＬＡＳＴＮ、及びインターネットで公的に入手可能なもの(例えばＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎウェブサイト上ＢＬＡＳＴページを参照)を含むが、これらに限定されない。また、Ａｌｔｓｃｈｕｌ, 他、１９９０及びＡｌｔｓｃｈｕｌ、他、１９９７を参照願いたい。
【００３０】
得られる核酸配列をＧｅｎＢａｎｋＤＮＡ配列における核酸配列及び他の公的データベースと比較して評価する場合、配列検索は一般的にＢＬＡＳＴＮプログラムを用いて行う。ＢＬＡＳＴＸプログラムはＧｅｎＢａｎｋタンパク質配列における核酸配列及び他の公的データベースにおけるアミノ酸配列に対してすべてのリーディングフレーム中に翻訳される核酸配列を検索するために有用である。ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＸ両者はオープンギャップペナルティ１１．０、及び拡張ギャップペナルティ１．０のデフォルトパラメータを用いて計算され、ＢＬＯＳＵＭ‐６２マトリックスを利用する。（例、Ａｌｔｓｃｈｕｌ、他、１９９７参照。）
【００３１】
可溶化デンプン基質又は液状化基質とも呼ばれる「液状化物（Ｌｉｑｕｅｆａｃｔ）」は高温液状化にさらされる熱安定性アルファアミラーゼを含む全粒粉砕穀物スラリーであり、その結果、糖化及び発酵又はＳＳＦのための可溶性基質となる。高温とは穀物のゼラチン化温度より高い温度である。
【００３２】
「液状化（Ｌｉｑｕｅｆａｃｔｉｏｎ）」又は「液化する（ｌｉｑｕｅｆｙ）」は、デンプンがより短い鎖及びより低い粘性のデキストリンに転換するプロセスを意味する。
【００３３】
用語「製粉する（ｍｉｌｌｅｄ）」は、すりつぶす、押しつぶす、断片化する、又は粒子サイズを小さくする他の任意の手段によって、サイズを小さくする植物原料をいうために本明細書にて用いる。製粉には乾式又は湿式製粉を含む。「乾式製粉（Ｄｒｙ ｍｉｌｌｉｎｇ）」は乾燥穀物全体の製粉をいう。「湿式製粉（Ｗｅｔ ｍｉｌｌｉｎｇ）」は穀物を柔らかくするために穀物を最初に水に浸す（染み込む）プロセスをいう。
【００３４】
用語「オリゴサッカライド（ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）」は、グリコシド結合で結合する２から１０のモノサッカライド単位を有する任意の化合物をいう。単糖類のこれらの短鎖ポリマーはデキストリンを含む。
【００３５】
本明細書にて同定されたアミノ酸配列又は核酸配列に関して本明細書で用いる「配列相同性割合（％）（ｐｅｒｃｅｎｔ(％)ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、必要であれば、最大の割合の配列相同性を達成するように、いずれの同類置換をも配列相同性の一部として考慮することなく、配列を整列し及びギャップを挿入した後、配列中のアミノ酸残基又はヌクレオチドと同定された候補配列におけるアミノ酸残基又はヌクレオチドとの割合で定義される。周知である配列整列をする方法と配列相同性の決定は過度の実験をせずに行うことができ、相同性値の計算は確実に得られる。例えばＡｕｓｕｂｅｌ他編、(１９９５)Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ, １９章(Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｅｌｙ‐Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ, ＮｅｗＹｏｒｋ)及びＡＬＩＧＮ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｄａｙｈｏｆｆ （１９７８）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５:Ｓｕｐｐｌｅ ３（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ, Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ, Ｄ.Ｃ.）を参照願いたい。多くのアルゴリズムは配列を整列させ、配列相同性を決定するのに利用可能である。例えばＮｅｅｄｌｅｍａｎ他のｔｈｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（１９７０）Ｊ.Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ.４８:４４３、スミス他のｔｈｅ ｌｏｃａｌ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（１９８１）Ａｄｖ.Ａｐｐｌ.Ｍａｔｈ.２:４８２, Ｐｅａｒｓｏｎ他のｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｍｅｔｈｏｄ (１９８８) Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ８５:２４４４, ｔｈｅ Ｓｍｉｔｈ‐Ｗｓｔｅｒｍａｎ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ (Ｍｅｔｈ.Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ.７０:１７３‐１８７(１９９７)及びＢＬＡＳＴＰ, ＢＬＡＳＴＩＮ, ａｎｄ ＢＬＡＳＴＸ ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ(参照Ａｌｔｓｃｈｕｌ他（１９９０）J.Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ.２１５:４０３−４１０)を参照されたい。これらのアルゴニズムに使用するコンピュータープログラムは入手可能であり、以下のものを含むがこれらに限定はされない。即ち、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｎ
ｇ(ＤＡＮＳＴＡＲ)ソフトウエア又はＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２(Ａｌｔｓｃｈｕｌ他、Ｍｅｔｈ. Ｅｎｚｙｍ., ２６６:４６０-４８０(１９９６))、又はＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ(Ａｌｔｓｃｈｕｌ他)上記、ＦＡＳＴＡ及びＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ (ＧＣＧ)パッケージ、バージョン８、マジソン、ウィスコン州米国にて入手可能なＴＦＡＳＴＡ及びＩｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅｓ, Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、カリフォルニア州による ＣＬＵＳＴＡＬ ｉｎ ｔｈｅ ＰＣ/Ｇｅｎｅ ｐｒｏｇｒａｍである。当業者であれば比較される配列の長さに渡って最大の配列比較を達成するために必要であるアルゴリズムを含め、整列を測定する適切なパラメーターを決定できる。好ましくは、配列相同性はプログラムによって決定されたデフォルトパラメーターを使用することにより決定される。特に、配列相同性はＳｍｉｔｈ-Ｗａｔｅｒｍａｎ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｓｅａｒｃｈ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ (Ｍｅｔｈ. Ｍｏｌ. Ｂｉｏｌ. ７０: １７３-１ ８７ (１９９７)) によって決定される。このアルゴリズムは次のサーチパラメーターで、すなわち１２のギャップ開始ペナルティ及び１のギャップ伸長ペナルティで、アファインギャップサーチを使用しているＭＳＰＲＣＨ ｐｒｏｇｒａｍ (Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ) で実行される。好ましくは対のアミノ酸の比較はＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ, Ｉｎｃ., Ｍａｄｉｓｏｎ, Ｗｉｓ.の１２のギャップウエイトと２のレングスウエイトをもつＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸置換行列を使用しているＧＣＧ配列分析ソフトウエアパッケージの使用により実行される。二つのアミノ酸配列の最適整列に関して、種々のアミノ酸配列の連続セグメントは参照アミノ酸配列に対して追加アミノ酸残基又は欠損アミノ酸残基をもってもよい。参照アミノ酸配列と比較するために使用した連続セグメントは少なくとも２０アミノ酸残基を含んでもよく、３０、４０、５０又はそれ以上のアミノ酸残基を含んでもよい。誘導体のアミノ酸配列中ギャップを含む関係で増加した配列相同性の補正はギャップペナルティを割り当てることにより実行できる。
【００３６】
用語「タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ）」及び「ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」は、本明細書にて互換可能に用いる。本明細書及び特許請求の範囲において、従来の１文字及び３文字のアミノ酸残基コードを使用する。アミノ酸の３文字コードは、生化学命名に関するＩＵＰＡＣ‐ＩＵＢ委員会（ＩＵＰＡＣ‐ＩＵＢ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ （ＪＣＢＮ））に基づいて定められる。また、ポリペプチドが、遺伝子コードの縮重により二以上のヌクレオチド配列によりコードされてよいことは理解される。
【００３７】
本発明の変異体は「原型のアミノ酸／位置／置換されるアミノ酸残基」の順の命名法を用いて記載する。例えば８９位のアラニン（Ａ）にかかるトレオニン（Ｔ）の置換をＡ８９Ｔとして表す。二つ以上のアミノ酸が所定の位置にて置換される場合、例えば、置換を１）Ａ８９Ｃ、Ａ８９Ｄ又はＡ８９Ｔ、２）Ａ８９Ｃ、Ｄ又はＴ、又は３）Ａ８９Ｃ／Ｄ／Ｔとして表す。置換に有用な位置が具体的アミノ酸が示唆されずに本明細書にて同定される場合、任意のアミノ酸残基がその位置でそのアミノ酸残基に関して置換されてよいことが理解される。
【００３８】
用語「糖化酵素（ｓａｃｃｈａｒｉｆｙｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）」及び「グルコアミラーゼ（ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ）（Ｅ. Ｃ. ３．２.１．３）」は本明細書にて互換可能に用い、デンプン及び関連オリゴサッカライドとポリサッカライドの非還元末端からＤ‐グルコースの放出を触媒することができる任意の酵素をいう。
【００３９】
語句「同時糖化発酵（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｓａｃｃｈａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）（ＳＳＦ）」は、エタノール生産微生物のような発酵生物と糖化酵素のような少なくとも一つの酵素が同じ反応器中同じ工程で併用する最終産物の生産工程をいう。
【００４０】
用語「スラリー（ｓｌｕｒｒｙ）」は不溶性固体（例えば、粒状デンプン）を含む水溶性混合液をいう。
【００４１】
本明細書にて用いる用語「デンプン（ｓｔａｒｃｈ）」は、植物性ポリサッカライドの炭水化物の複合体を含み、化学式（Ｃ６Ｈ１０Ｏ５）ｘで表すアミロース及びアミロペクチンを含む任意の原料をいい、ここでｘは任意の数字である。
【００４２】
用語「蒸留残液（ｔｈｉｎ ｓｔｉｌｌａｇｅ）」は、懸濁微粒子及び溶解原料を含む固体（例えば、スクリーニング又は遠心分離によって生じる）から分離される蒸留物（ｓｔｉｌｌａｇｅ）の液体部分を意味する。用語「バックセット（ｂａｃｋｓｅｔ）」は一般的に再循環される蒸留残液（ｔｈｉｎ ｓｔｉｌｌａｇｅ）を意味するために用いる。
【００４３】
用語「全体の糖度（ｔｏｔａｌ ｓｕｇａｒ ｃｏｎｔｅｎｔ）」は、デンプン組成物中に存在する全体の糖の含有量をいう。
【００４４】
酵素（例、アルファアミラーゼ、グルコアミラーゼ、酸性菌プロテアーゼ、フィターゼ、又はその同類）に関して用いる場合、用語「変異体（ｖａｒｉａｎｔ）」は、自然的に生じる酵素（野生型）由来の酵素であるが、自然発生的酵素に比較して一以上のアミノ酸の置換、付加、欠失を有する酵素を意味する。その用語は、酵素のハイブリッドの形態を含み、例えば、酵素がバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）（例、バシルス リチェニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ））由来のＣ末端と異なるバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）（例、バシルス ステアロテルモフィルス（Ｂ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））由来のＮ末端を有してもよい。変異体は、野生型と比較して、熱安定性の増加、タンパク質分解安定性の増加、特異的活性の増加、基質特異性の拡張、ｐＨ範囲に対する活性の拡張、又はそれらの組み合わせのような、しかしこれらに限定されないが、一以上の改変される特徴を有してよい。
【００４５】
本明細書にて用いる用語「野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）」は、宿主細胞中に自然発生的（自然）に生じる酵素をいう。
【００４６】
典型的な実施態様
発明者はアルファアミラーゼ、グルコアミラーゼ、及び酸性菌プロテアーゼを含む酵素ブレンドを発見した。そのような組成物は糖化及び／又は糖化／発酵の間デンプン転換プロセスにおいて有用である。そのような組成物を使用することはデンプン転換プロセスにおいてグルコアミラーゼを単独にて用いるより有用な効果を提供する。
【００４７】
本発明はグルコアミラーゼ、酸性菌プロテアーゼ、及び酸安定性アルファアミラーゼを含む組成物に関する。また、本発明は発酵性糖から所望の最終産物を生産するための組成物の使用に関し、例えば、液状化物からのエタノールを生産することである。組成物の有利な効果は実質的に同様の条件下グルコアミラーゼを単独にて生産するエタノール量に比較して多量のエタノールをもたらすことである。ある態様においては、増加はグルコアミラーゼ単独に比較して０．５％より多く、好ましくは、１．０％、１．５％、２％、及び２．５％より多い。
【００４８】
グルコアミラーゼ
グルコアミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．３．）はデンプン類及びデキストリン類をグルコースへ分解する酵素である。グルコアミラーゼはエキソ作用酵素である。それはデンプンにおけるアルファ１−４及びアルファ１−６グルコシド結合を加水分解し、グルコースを放出する。
【００４９】
本発明による有用なグルコアミラーゼは野生型グルコアミラーゼ、その変異体又はフラグメント又は例えば、ある微生物源からの触媒部位及び別の微生物源からのデンプン結合部位由来のハイブリッドグルコアミラーゼでよい。次のグルコアミラーゼ類は本発明により含まれるプロセスに使用されるグルコアミラーゼの例であるが、これらに限定されない。
【００５０】
グルコアミラーゼをアスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）Ｇ１及びＧ２グルコアミラーゼ（例えば、Ｂｏｅｌ他、（１９８４） ＥＭＢＯ Ｊ. ３： １０９７ − １ １０２： ＷＯ ９２／００３８１、ＷＯ ００／０４１３６及びＵＳＰ ６，３５２，８５１を参照）、アスペルギルス アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）グルコアミラーゼ（例えば、ＷＯ ８４／０２９２１参照）、アスペルギルス オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）グルコアミラーゼ（例えば、Ｈａｔａ他、（１９９１） Ａｇｒｉｃ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ. ５５：９４１−９４９参照）及びアスペルギルス シロウサミ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ Ｓｈｉｒｏｕｓａｍｉ）(例えば、Ｃｈｅｎ他、（１９９６） Ｐｒｏｔ. Ｅｎｇ. ９：４９９ − ５０５： Ｃｈｅｎ他、(１９９５) Ｐｒｏｔ. Ｅｎｇ. ８：５７５−５８２；及びＣｈｅｎ他、（１９９４） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ. ３０２：２７５−２８１を参照)の菌から得てよい。タラロミセス エマーソニー（Ｔ. ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）、タラロミセス レイセタヌス（Ｔ. ｌｅｙｃｅｔｔａｎｕｓ）、タラロミセス デュポンティ（Ｔ. ｄｕｐｏｎｔｉ）、及びタラロミセス テルモフィラス（Ｔ. ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ） (例えば、ＷＯ ９９／２８４８８； ＵＳＰ Ｎｏ. ＲＥ： ３２，１５３； ＵＳＰ Ｎｏ. ４，５８７，２１５を参照)のようなタラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、トリコデルマ レーシ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ）及び特に、ＵＳ Ｐａｔ. Ｐｕｂ. Ｎｏ. ２００６‐００９４０８０に記載の配列番号４と少なくとも約８０％、８５％、９０％及び９５％の配列相同性を有するグルコアミラーゼのようなトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の菌株、リゾプス ニベウス（Ｒ. ｎｉｖｅｕｓ）及びリゾプス オリザエ（Ｒ. ｏｒｙｚａｅ）のようなリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）の菌株、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）の菌株、フミコーラ グリセア（Ｈ． ｇｒｉｓｅａ）（例えば、Ｂｏｅｌ他、（１９８４） ＥＭＢＯ Ｊ. ３：１０９７−１１０２； ＷＯ ９２／００３８１ ； ＷＯ ００／０４１３６； Ｃｈｅｎ他、（１９９６） Ｐｒｏｔ. Ｅｎｇ. ９：４９９−５０５； Ｔａｙｌｏｒ他、（１９７８） Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓ. ６１ ：３０１−３０８； ＵＳＰ. ４，５１４，４９６； ＵＳＰ ４，０９２，４３４； ＵＳＰ ４，６１８，５７９； Ｊｅｎｓｅｎ他、（１９８８） Ｃａｎ. Ｊ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. ３４：２１８−２２３及びＷＯ ２００５／０５２１４８の配列番号３を参照）のようなフミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）の菌株から得られる。幾つかの実施態様においては、グルコアミラーゼは、ＷＯ ０５／０５２１４８記載の配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも約８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％及び９９％の配列相同性を有する。本発明に有用な他のグルコアミラーゼは、アセリア ロルフシイ（Ａｔｈｅｌｉａ ｒｏｌｆｓｉｉ）及びそれらの変異体(例えば、ＷＯ ０４／１１１２１８を参照)から得られるものを含む。
【００５１】
商業的に用いるグルコアミラーゼ活性を有する酵素は、例えば、アスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）（ジェネンコ インターナショナル社（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ.））製の商品名ＤＩＳＴＩＬＬＡＳＥ、ＯＰＴＩＤＥＸ Ｌ−４００及びＧ ＺＹＭＥ Ｇ９９０ ４Ｘ）又はリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）種（日本の新日本化学（Ｓｈｉｎ Ｎｉｈｏｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）製の商品名ＣＵ．ＣＯＮＣを参照）から生産される。また、商業的な消化酵素は、日本の天野製薬（Ａｍａｎｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）製の商品名グルクザイム（ＧＬＵＣＺＹＭＥ）（例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉ他、（１９８５） Ｊ. Ｂｉｏｃｈｅｍ. ９８：６６３−６７１を参照）である。さらなる酵素はリゾプス種（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐ．）のグルコアミラーゼ（Ｅ． Ｃ．３．２．１．３）の３つの形態を含む、すなわち、「Ｇｌｕｃ１」（ＭＷ ７４，０００）、「Ｇｌｕｃ２」（ＭＷ ５８，６００）及び「Ｇｌｕｃ３」（ＭＷ ６１，４００）である。また、酵素調製ＧＣ４８０（ジェネンコ インターナショナル社（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ.））を本発明に用いる。上記のグルコアミラーゼ及び商業的酵素の例は本発明をこれらに限定することを意図せず、単に実施例として提供される。
【００５２】
グルコアミラーゼは細菌、植物及び菌を供給源とする異種又は内因性タンパク質発現由来でよい。本発明に有用な好ましいグルコアミラーゼは糸状菌及び酵母の数種の菌株により生産され、特に、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の菌株から分泌されるグルコアミラーゼ類である。
【００５３】
表１は５９９アミノ酸を有するトリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼの推定アミノ酸配列（配列番号１）を示し、触媒部位（配列番号２）は下線をひいてなく１‐４５３残基の位置により示される。リンカー領域（配列番号３）は下線をひいて４５４‐４９１残基の位置により示される。デンプン結合部位である配列番号４は太字にて４９２‐５９９残基の位置により示される。
【表１】
【００５４】
発明者はグルコアミラーゼ活性に関与する二つの部位を同定した。即ち、結合部位及び触媒部位である。これらの部位における保存的変異はグルコアミラーゼ活性を有するタンパク質となりうる。これらの部位においてすべての保存的アミノ酸置換が必ずしもグルコアミラーゼ活性を有するタンパク質とならないが、当業者はこれらの保存的置換の多くがグルコアミラーゼ活性を有するタンパク質となるであろうと予測する。さらに、二つの同定された機能部位の外側でのアミノ酸置換はグルコアミラーゼ活性に顕著な影響はないと考えられる。
【００５５】
幾つかの実施態様においては、本発明に有用なグルコアミラーゼは配列番号１又は２のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有する。
【００５６】
アルファアミラーゼ
本発明による有用なアルファアミラーゼは野生型アルファアミラーゼ、その変異体又はフラグメント又は例えば、ある微生物源からの触媒部位及び別の微生物源からのデンプン結合部位由来のハイブリッドアルファアミラーゼでよい。あるいは、アルファアミラーゼは酸安定性であるように組み換えらた変異体でよい。また、アルファアミラーゼは粒状デンプン加水分解活性（ＧＳＨＥ）を有するアルファアミラーゼでよい。なぜならその酵素は液状化物における多くのデンプンを分解するように働くからである。
【００５７】
菌類アルファアミラーゼの例は、糸状菌の菌株から得られるものを含み、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（例、アスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス カワチ（Ａ. ｋａｗａｃｈｉ）、及びアスペルギルス オリザエ（Ａ． ｏｒｙｚａｅ））、トリコデルマ 種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ．）、リゾプス種（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐ．）、ムコール種（Ｍｕｃｏｒ ｓｐ．）、及びペニシリウム種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．）を含むがこれらに限定されない。幾つかの実施態様においては、アルファアミラーゼはアスペルギルス カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ. ｋａｗａｃｈｉ）菌株又はトリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）の菌株から得られる。
【００５８】
本発明により取り込まれる方法及び組成物に用いると考えられる商業的に入手可能なアルファアミラーゼは、ＧＺＹＭＥ ９９７及びＣＬＡＲＡＳＥ Ｌ(ジェネンコ インターナショナル社)、ターマミル（ＴＥＲＭＡＭＹＬ）１２０−Ｌ、ＬＣ及びＳＣ及びスープラ（ＳＵＰＲＡ） (ノボザイムズ バイオテック（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ）)、及びサン スーパー（ＳＡＮ ＳＵＰＥＲ ）(ノボザイムズ エイエス（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ/Ｓ）)、及びＦＵＥＬＺＹＭＥ ＦＬ（Ｄｉｖｅｒｓａ/Ｖａｌｌｅｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を含む。
【００５９】
幾つかの実施態様においては、本発明に有用なアルファアミラーゼは、酸安定性アルファアミラーゼであり、有効な量が添加される時、ｐＨ３．０から７．０の範囲及び好ましくはｐＨ３．５から６．５の範囲であってｐＨ約４．０、４．５、５．０、５．５及び６．０を含む範囲で活性を有する。本発明による有用な酸安定性アルファアミラーゼは菌類のアルファアミラーゼ又は細菌類のアルファアミラーゼでよい。好ましい酸安定性アルファアミラーゼはアスペルギルス カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉ）（例えば、ＡｋＡＡ）、アスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）（例えば、ＡｎＡＡ）、及びトリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）（例えば、ＴｒＡＡ）から得られるものを含む。
【００６０】
表２はアスペルギルス カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉ）アルファアミラーゼ（ＡｋＡＡ）（配列番号５）に関する成熟タンパク質配列を示す。推定リンカーはTTTTTTAATSTSKATTSSSSSSAAATTSSSCTATSTT(配列番号６)であって、下線にて表示する。リンカーのアミノ酸上流は触媒部位（配列番号７）を含み、下線をひいていない。リンカーのアミノ酸下流はデンプン結合部位（ＳＢＤ）を含み、（配列番号８）、太字で表示する。ＳＢＤはポリペプチドの最後１０２個のアミノ酸を含む。
【表２】
【００６１】
発明者はアルファアミラーゼ活性に関与する二つの部位を同定した。即ち、結合部位及び触媒部位である。これらの部位における保存的変異はアルファアミラーゼ活性を有するタンパク質となりうる。これらの部位においてすべての保存的アミノ酸置換が必ずしもアルファアミラーゼ活性を有するタンパク質とならないが、当業者はこれらの保存的置換の多くがアルファアミラーゼ活性を有するタンパク質となるであろうと予測する。さらに、二つの同定された機能部位の外側でのアミノ酸置換はアルファアミラーゼ活性に顕著な影響はないと考えられる。
【００６２】
幾つかの実施態様においては、アルファアミラーゼは配列番号５又は７のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有する。
【００６３】
表３はアスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）アルファアミラーゼ（ＡｎＡＡ）（配列番号９）に関する成熟タンパク質配列を示す。表中、触媒部位を１−４７８のアミノ酸（配列番号１０）で表し、下線を引いていない。リンカー領域を下線部（配列番号１１）で示す。デンプン‐結合部位は太字（配列番号１２）で示す。
【表３】
【００６４】
幾つかの実施態様においては、アルファアミラーゼは配列番号９又は１０のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有する。
【００６５】
表４は４４３個のアミノ酸を有するトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）アルファアミラーゼ（ＴｒＡＡ）に関する成熟タンパク質配列（配列番号１３）を示す。このアルファアミラーゼはＳＢＤ又はリンカーを含まない。
【表４】
【００６６】
幾つかの実施態様においては、アルファアミラーゼは配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有する。
【００６７】
本発明に従って有用な酸性菌類プロテアーゼ（Ａｃｉｄ ｆｕｎｇａｌ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ）（ＡＦＰ）は野生型酸性菌類プロテアーゼ、その変異体又はフラグメント、又は遺伝的に組み換えられた変異ＡＦＰでよい。
【００６８】
例えば、酸性菌類プロテアーゼは、アスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス アワモリ（Ａ． ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、及びムコール ミエヘイ（Ｍ．ｍｉｅｈｅｉ）のような、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）及びリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）から得られるものを含む。ＡＦＰは細菌類、植物及び菌類を供給源とする異種又は内因性タンパク質発現由来でよい。本発明に有用な好ましいグルコアミラーゼは糸状菌及び酵母の数種の菌株により生産され、特に、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の菌株から分泌されるＡＦＰが好ましい。
【００６９】
表５はトリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）由来の好ましいＡＦＰに関する成熟タンパク質配列（３５５アミノ酸）（配列番号１４）を示す。
【表５】
【００７０】
幾つかの実施態様においては、酸性菌類プロテアーゼは配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有する。
【００７１】
第二酵素
本発明の幾つかの実施態様は、少なくとも一つの酸安定性アルファアミラーゼ、少なくとも一つのグルコアミラーゼ、及び少なくとも一つの菌類プロテアーゼを含む組成物を含むけれども、任意的に、組成物は他の酵素を含んでもよい。例えば、組成物を多様な適用（例えば、デンプン処理適用）に用いる場合、さらに、第二酵素を含んでよい。本発明によるブレンド組成物は発酵微生物及び他の成分及び他の第二酵素を伴って糖化段階及び／又は発酵段階において用いてよい。追加される酵素は、追加グルコアミラーゼ、追加アルファアミラーゼ、追加プロテアーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、フィターゼ、プルラナーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ベータ‐グルカナーゼ、ガラクトシダーゼ、エステラーゼ、シクロデキストリントランスグルコシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅｓ），ベータ‐アミラーゼ、及びそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない。
【００７２】
幾つかの実施態様においては、追加酵素は菌類アルファアミラーゼのような、第二酸安定性アルファアミラーゼである。幾つかの実施態様においては、第二アルファアミラーゼはＡｋＡＡ、ＴｒＡＡ又はＡｓＡＡのようなＧＳＨＥである。ブレンドと組み合わせて用いることのできる他のアルファアミラーゼの例は、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、及びフミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）由来のものであるが、これらに限定されない。
【００７３】
これらのアミラーゼの幾つかは商業的に入手可能である。例えば、ノボ ノルディスク エーエス（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ）から入手可能なターマミル（ＴＥＲＭＡＭＹＬ）及びＳＵＰＲＡ、Ｄｉｖｅｒｓａから入手可能なＦＵＥＬＺＹＭＥ、ノボ ノルディスク エーエス（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ/Ｓ）から入手可能なリコザイム（ＬＩＱＵＥＺＹＭＥ）ＳＣ、及びジェネンコ インターナショナル社（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ）から入手可能なスペザイム フレッド（ＳＰＥＺＹＭＥ ＦＲＥＤ）、スペザイム エチル（ＳＰＥＺＹＭＥ ＥＴＨＹＬ）及びＧＺＹＭＥ Ｇ９９７である。
【００７４】
別の実施態様においては、本発明はフィターゼの添加を含んでよい。フィターゼはイノシトール６リン酸から少なくとも一つの無機リン酸塩を遊離することができる酵素である。フィターゼはフィチン酸分子が加水分解を開始するリン酸エステル基の特定の位置への優先性に従って分けられる（例えば、３‐フィターゼ（ＥＣ３．１．３．８）として又は６−フィターゼ（ＥＣ３．１．３．２６）として）。フィターゼの典型的な例はミオ‐イノシトール‐ヘキサキスフォスフェート‐３‐フォスフォヒドロラーゼ（ｍｙｏ‐ｉｎｏｓｉｔｏｌ‐ｈｅｘａｋｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ‐３‐ｐｈｏｓｐｈｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）である。フィターゼを菌類及び細菌類のような微生物から得て良い。これらの微生物のいくつかは例えばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（例、アスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス テレウス（Ａ. ｔｅｒｒｅｕｓ）、及びアスペルギルス フミガタス（Ａ． ｆｕｍｉｇａｔｕｓ））、ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）（ミセリオフトラ サーモフィラ（Ｍ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ））、タラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）（タラロミセス テルモフィルス（Ｔ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、トリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ）（トリコデルマ レーシ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ））及びテルモミセス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）（ＷＯ ９９／４９７４０）を含む。また、フィターゼはペニシリウム種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）から得られ、例えば、ペニシリウム ホルデイ（Ｐ． ｈｏｒｄｅｉ）(ＡＴＣＣ Ｎｏ．２２０５３)、ペニシリウム ピセウム（Ｐ． ｐｉｃｅｕｍ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ． １０５１９）、又はペニシリウム ブレビ‐コンパクタム（Ｐ． ｂｒｅｖｉ−ｃｏｍｐａｃｔｕｍ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．４８９４４）である。例えば、ＵＳＰ ６，４７５，７６２を参照願いたい。さらに、フィターゼはペニオフォラ（Ｐｅｎｉｏｐｈｏｒａ）、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｂａｃｔｅｒ）及びブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）（２００５年１０月１７日出願のＷＯ２００６／０４３１７８を参照願いたい）から得られる。市販のフィターゼはＮＡＴＵＰＨＯＳ （ＢＡＳＦ）、ＲＯＮＯＺＹＭＥ Ｐ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）、ＰＨＺＹＭＥ （Ｄａｎｉｓｃｏ Ａ／Ｓ， Ｄｉｖｅｒｓａ）及びＦＩＮＡＳＥ （ＡＢ Ｅｎｚｙｍｅｓ）のように入手可能である。幾つかの実施態様においては、本発明に有用な少なくとも一つフィターゼはブティアウクセラ種（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ ｓｐｐ．）である微生物由来のものである。ブティアウクセラ種（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ ｓｐｐ．）は、ブティアウクセラ アグレスティス（Ｂ． ａｇｒｅｓｔｉｓ）、 ブティアウクセラ ブレネラエ（Ｂ． ｂｒｅｎｎｅｒａｅ）、ブティアウクセラ フェラギターゼ（Ｂ． ｆｅｒｒａｇｕｔｉａｓｅ）、ブティアウクセラ ガビニアエ（Ｂ. ｇａｖｉｎｉａｅ）、ブティアウクセラ イザルディイ（Ｂ. ｉｚａｒｄｉｉ）、ブティアウクセラ ノアキアエ（Ｂ. ｎｏａｃｋｉａｅ）、及びブティアウクセラ ワ−ムボールディアエ（Ｂ. ｗａｒｍｂｏｌｄｉａｅ）を含む。ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）種の菌株はＤＳＭＺ、ｔｈｅ Ｇｅｒｍａｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌ (Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｂｅ ７Ｂ, ３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ, Ｇｅｒｍａｎｙ) から入手できる。登録番号ＮＣＩＭＢ ４１２４８にて寄託されるブティアウクセラ種（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ ｓｐ．）の菌株であるＰ１−２９は、フィターゼが本発明によって得られ及び使用されてよい特に有用な菌株の例である。
【００７５】
また、セルラーゼを本発明によるブレンド及び／又は組成物に用いてよい。セルラーゼはセルロース（β‐１，４‐Ｄ‐グルカン結合）及び／又はリン酸膨張セルロースのようなそれらの誘導体を加水分解する酵素組成物である。セルラーゼはエキソ‐セロビオヒドロラーゼ（ｅｘｏｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ）（ＣＢＨ）エンドグルカナーゼ（ＥＧ）及びベータ‐グルコシダーゼ（ＢＧ）（ＥＣ３．２．１９１、ＥＣ３．２．１．４及びＥＣ３．２.１．２１）に分類できる。セルラーゼの例はペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、テルモモノスポラ（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）及びアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）からのセルラーゼを含む。食品業界で販売される商業的に入手可能なセルラーゼは、ＲＯＶＡＢＩＯ（Ａｄｉｓｓｅｏ）、ＮＡＴＵＧＲＡＩＮ（ＢＡＳＦ）、ＭＵＬＴＩＦＥＣＴ ＢＧＬ(ダニスコ ジェネンコ（Ｄａｎｉｓｃｏ Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）)及びＥＣＯＮＡＳＥ（ＡＢ Ｅｎｚｙｍｅｓ）のようなベータ‐グルカナーゼである。
【００７６】
また、キシラナーゼを本発明によるブレンド及び／又は組成物に用いてよい。キシラナーゼ（例えば、エンド‐β‐キシラナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．８）は、キシラン骨格鎖を加水分解するが、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、アシドサーマス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ）、ミクロテトラスポラ（Ｍｉｃｒｏｔｅｔｒａｐｓｏｒａ）又はテルモモノスポラ（Ｔｈｅｒｍｏｎｏｓｐｏｒａ）のような細菌由来でよい。さらに、キシラナーゼは、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、及びフミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、又はフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）のような菌類由来でもよい。（例えば、ＥＰ４７３ ５４５、ＵＳＰ ５，６１２，０５５、ＷＯ ９２／０６２０９およびＷＯ ９７／２０９２０を参照願いたい。）商業的調製品は、ＭＵＬＴＩＦＥＣＴ及びＦＥＥＤＴＲＥＡＴ Ｙ５（ダニスコ ジェネンコ（Ｄａｎｉｓｃｏ Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）、ＲＯＮＯＺＹＭＥ ＷＸ(ノボザイムズ エイエス（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ)）、及びＮＡＴＵＧＲＡＩＮ ＷＨＥＡＴ（ＢＡＳＦ）を含む。
【００７７】
また、追加的プロテアーゼを本発明によるブレンド及び／又は組成物に用いてよい。プロテアーゼは細菌又は菌類由来でよい。細菌のプロテアーゼの供給源は、バシルス アミロリケファシエンス（Ｂ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バシルス レンツス（Ｂ． ｌｅｎｔｕｓ）、バシルス リチェニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、及びバシルス ズブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のようなバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来のプロテアーゼを含む。これらの供給源は、バシルス アミロリケファシエンス（Ｂ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）及びそれらの変異体（ＵＳＰ ４，７６０，０２５）から得られるスブチリシンのようなスブチリシンを含む。適切な業務用プロテアーゼは、ＭＵＬＴＩＦＥＣＴ Ｐ ３０００（ダニスコ ジェネンコ （Ｄａｎｉｓｃｏ Ｇｅｎｅｎｃｏｒ））及びスミザイム ＦＰ（ＳＵＭＩＺＹＭＥ ＦＰ）（新日本(Ｓｈｉｎ Ｎｉｈｏｎ)）を含む。また、菌類プロテアーゼの供給源は、例えば、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）（例えば、ＮＳＰ‐２４）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、及び、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）を含む。
【００７８】
酵素ブレンド組成物
本発明の酵素ブレンド組成物はグルコアミラーゼ、アルファアミラーゼ、及び酸性菌類プロテアーゼを含む。三つの酵素成分は一緒に混合される三つの酵素を含むブレンドされた製剤、又は本発明により含まれる組成物を得るためにプロセス段階の間に別個に添加される酵素成分を含むブレンドされた製剤として用いてよい。好ましくは、本発明の組成物をデンプン転換における段階の間に用い、その結果、下記に規定する活性比率が維持される。これは経時的（ｔｉｍｅ‐ｗｉｓｅ ｍａｎｎｅｒ）に組成物の別々の成分を加えることに関係し、その結果、酵素比は維持され、例えば、その成分を同時に添加してもよい。
【００７９】
幾つかの実施態様においては、酵素ブレンド組成物は、
ａ）配列番号１に対して少なくとも９５％又は少なくとも９７％の配列相同性を有するＧＡ、配列番号５に対して少なくとも９７％配列相同性を有するＡｋＡＡ及びＡＦＰ、
ｂ）配列番号１に対して少なくとも９５％又は少なくとも９７％配列相同性を有するＧＡ、酸安定性ＡＡ、及びＡＦＰ、
ｃ）配列番号１に対して少なくとも９５％又は少なくとも９７％配列相同性を有するＧＡ、ＧＳＨＥ ＡＡ、及び配列番号１４に対して少なくとも９０％、９５％又は９９％の配列相同性を有するＡＦＰ、
ｄ）ＧＡ、ＡｋＡＡ又はＴｒＡＡ、及び配列番号１４に対して少なくとも９５％又は少なくとも９７％の配列相同性を有する酸性菌類プロテアーゼ、
ｅ）ＧＡ、ＡｋＡＡ、及び配列番号１４に対して少なくとも９５％又は少なくとも９７％の配列相同性を有する酸性菌類プロテアーゼ、
ｆ）配列番号１に対して少なくとも９５％又は少なくとも９７％の配列相同性を有するＧＡ、ＡｋＡＡ、及び配列番号１４に対して少なくとも９５％又は少なくとも９７％の配列相同性を有するＡＦＰ、
ｇ）配列番号１に対して少なくとも９５％又は少なくとも９７％の配列相同性を有するＧＡ、ＴｒＡＡ、及び配列番号１４に対して少なくとも９５％又は少なくとも９７％の配列相同性を有する酸性菌類プロテアーゼ、
ｈ）配列番号１に対して少なくとも９５％の配列相同性を有するＧＡ、配列番号１４に対して少なくとも９５％の配列相同性を有するＡＦＰ、及び配列番号５に対して少なくとも９５％の配列相同性を有するＡＡ、
ｉ）配列番号１に対して少なくとも９８％の配列相同性を有するＧＡ、配列番号１４に対して少なくとも９８％の配列相同性を有するＡＦＰ、及び配列番号５に対して少なくとも９８％の配列相同性を有するＡＡ、及び
ｊ）ＳＴＡＲＧＥＮ（商標）００１であって、酸安定性アスペルギルス カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉ）アルファアミラーゼ、アスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼのブレンド（ジェネンコ インターナショナル社から商業的に入手可能）、及び酸性菌類プロテアーゼ、
を含む。
【００８０】
しばしば、酵素活性をグルコアミラーゼに関してＧＡＵ、アルファアミラーゼに関してＳＳＵ、及び酸性菌類プロテアーゼに関してＳＡＰＵにて測定する。
【００８１】
幾つかの実施態様においては、酵素活性の比を下記に規定し、各酵素の比をグルコアミラーゼ（ＧＡ）に関して示す。例えば、ＧＡ（ＧＡＵ）：ＡＡ（ＳＳＵ）の比は約１：１から１：１５であり、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、及び１：１０を含むがこれらに限定されない。比は最低で１：１と最高で１：１５である。好ましい実施態様においては、ＧＡ（ＧＡＵ）：ＡＡ（ＳＳＵ）の比は約１：１．５から約１：８又は約１：２から約１：５である。ある好ましい実施態様においては、ＧＡ（ＧＡＵ）：ＡＡ（ＳＳＵ）の比は約１：４である。
【００８２】
幾つかの実施態様においては、ＧＡ（ＧＡＵ）対ＡＦＰ（ＳＡＰＵ）の比は約１：０．１から約１：５であり、１：０．２、１：０．３、１：０．４、１：０．５、１：０．６、１：０．７、１：０．８、１：０．９、１：１を含むがこれらに限定されない。又は最高で１：５であり、１：２、１：３、及び１．４含むがこれらに限定されない。好ましくは、ＧＡ（ＧＡＵ）対ＡＦＰ（ＳＡＰＵ）の比は約１：０．１から１：１又は約１：０．２から約１：０．８又は１：０．２から１：０．６の間である。ある好ましい実施態様においては、ＧＡ（ＧＡＵ）対ＡＦＰ（ＳＡＰＵ）の比は約１：０．４である。
【００８３】
ある好ましい組成物において、グルコアミラーゼ、酸安定性アルファアミラーゼ、及び酸性菌類
プロテアーゼは、ＧＡＵ：ＳＳＵ：ＳＡＰＵによる測定として約１：１．５：０．１から約１：８：１である。
【００８４】
ある好ましい組成物において、グルコアミラーゼ、酸安定性アルファアミラーゼ、及び酸性菌類
プロテアーゼは、ＧＡＵ：ＳＳＵ：ＳＡＰＵにて測定して約１：２：０．２から約１：５：０．６である。
【００８５】
ある好ましい組成物において、ＧＡ：ＡＡ：ＡＦＰの比は約１：４：０．４である。活性比に関して本明細書にて用いる時、「約（ａｂｏｕｔ）」は記載する数字の±１５％を含むことを意味する。
【００８６】
使用方法
本発明はさらに発酵性糖類から最終産物を生産するための方法に関する。方法は
（ａ）デンプン含有粉砕穀物を含むスラリーをアルファアミラーゼと接触させ、液状化物を生産する段階、
（ｂ）その液状化物をグルコアミラーゼ、酸安定性アルファアミラーゼ、及び酸性菌類プロテアーゼに接触させ、発酵性糖類を生産する段階、及び
（ｃ）発酵生物の存在下発酵性糖類を発酵させて最終産物を生産する段階
を含む。前記方法において、工程（ｂ）糖化及び（ｃ）発酵は連続して行って又は同時に行ってもよい。グルコアミラーゼ、酸安定性アルファアミラーゼ、及び酸性菌類プロテアーゼを液状化物に別個に添加してよい。あるいは、グルコアミラーゼ、酸安定性アルファアミラーゼ、及び酸性菌類プロテアーゼを含む酵素ブレンド組成物を液状化物へ添加してよい。各段階を以下に詳しく記載する。
【００８７】
デンプン転換
植物原料を含む基質を周知の方法により粉末にして又は粉砕してよい。植物原料は小麦、トウモロコシ、ライ、ソルガム（ミロ）、米、キビ、オオムギ、ライ小麦、キャッサバ（タピオカ）、ジャガイモ、サツマイモ、サトウダイコン、サトウキビ、及び大豆及びエンドウ豆のような豆類を含む植物から得られる。好ましい植物の原料は、トウモロコシ、オオムギ、小麦、米、ミロ、及びそれらの組み合わせを含む。植物原料はハイブリッド変異体及び遺伝的に修飾される変異体（例えば、異種性遺伝子を含むトランスジェニックトウモロコシ、オオムギ、又は大豆）を含んでよい。
【００８８】
デンプンを含む植物のいずれの部位を液状化物を生産するために使用してよく、葉、茎、さや、殻、塊茎、トウモロコシの穂軸、穀物の粒、及び同様物のような植物の部位を含むが、これらに限定されない。好ましい未精白の穀物は、トウモロコシ、小麦、ライ、オオムギ、ソルガム、及びそれらの組み合わせを含む。他の実施態様においては、デンプンは、繊維、内胚乳、及び／又は胚成分を含む分割された穀物から得てよい。トウモロコシ及び小麦のような植物原料を分割する方法は周知である。幾つかの実施態様においては、異なる供給源から得られる植物原料を一緒に（例えば、トウモロコシとミロ又はトウモロコシとオオムギ）混合してよい。製粉の方法は周知技術であり、ＴＨＥ ＡＬＣＯＨＯＬ ＴＥＸＴＢＯＯＫ： Ａ ＲＥＦＥＲＥＮＣＥ ＦＯＲ ＴＨＥ ＢＥＶＥＲＡＧＥ, ＦＵＥＬ ＡＮＤ ＩＮＤＵＳＴＲＩＡＬ ＡＬＣＯＨＯＬ ＩＮＤＵＳＴＲＩＥＳ ３ｒｄ ＥＤ. Ｋ. Ａ. Ｊａｃｑｕｅｓ他、Ｅｄｓ,（１９９９） Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ.に引用されている。２章及び４章を参照願いたい。
【００８９】
幾つかの実施態様においては、製粉であれ、他の方法であれ粉末にされる植物原料は液体と混合することによりデンプン基質を含むスラリーが得られる。幾つかの実施態様においては、スラリーは、バックセットのようなデンプンプロセスの副流を含んでよい。幾つかの実施態様においては、スラリーは、１５−５５％ｄｓ（例えば、２０−５０％、２５−４５％、２５−４０％、及び２０−３５％ｄｓ）を含む。粉末植物原料を含むスラリーを液状化処理してよく、アルファアミラーゼを液状化段階の間に添加してよい。これにより液状化物を得る。液状化物を生産するために、一回投与量又は分割投与量のアルファアミラーゼをスラリーに添加してよい。当業者は容易に液状化処理中に用いるべきアルファアミラーゼの有効な量を決定する。
【００９０】
幾つかの実施態様においては、液状化に用いるアルファアミラーゼの量は大部分のデンプンの液状化を引き起こすのに効果的な量である。他の実施態様においては、その量は４０％より多いデンプンの液状化を可能とするのに効果的であり、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、及び１００％を含む。幾つかの実施態様においては、その範囲は０．０５から５０ＡＵＵ／ｇｄｓ、また０．１から２０ＡＵＵ／ｇｄｓ、及び１．０から１０．０ＡＵＵ／ｇｄｓである。さらなる実施態様においては、アルファアミラーゼ量は０．０１から１０．０ｋｇ／メトリックトン（ＭＴ）ｄｓ、また０．０５から５．０ｋｇ／ＭＴ ｄｓ及び０．１から４．０ｋｇ／ＭＴ ｄｓである。
【００９１】
幾つかの実施態様においては、アルファアミラーゼを粉末植物原料の粒状デンプンのデンプンゼラチン化温度未満の０から３０℃の温度で加えてよい。この温度はデンプンゼラチン化温度未満の０から２５℃、０から２０℃、０から１５℃及び０から１０℃でよい。この具体的な値はスラリーを含む穀物のタイプにより変化し及び依存してよい。例えば、トウモロコシのデンプンゼラチン化温度は一般的にライ又は小麦のデンプンゼラチン化温度より高い。幾つかの実施態様においては、温度は４５から８０℃の間、また５０から７５℃の間、また５０から７２℃の間でよく、幾つかの実施態様においては、温度は６８℃未満、６５℃未満、６２℃未満、６０℃未満、及びまた５５℃未満でよい。他の実施態様においては、温度は４０℃、４５℃、５０℃、５５℃より高い温度でよい。幾つかの好ましい実施態様においては、インキュベーションの温度は５８℃と７２℃の間及び６０℃から６８℃の間でよい。
【００９２】
幾つかの実施態様においては、スラリーは約３．０から約６．５未満の範囲のｐＨで、また、約４．０から約６．２未満の範囲のｐＨで、また、約４．５から約６．０未満のｐＨで及び好ましくは約５．０から約６．０（例えば、約５．４から約５．８まで）に維持され、スラリー中の製粉穀物は２分から８時間（例えば、５分から３時間、１５分から２．５時間及び３０分から２時間）の間酵素組成物と接触できる。さらなる段階において、インキュベーションされる基質は、約４．０から約６．５のｐＨで２分から８時間（例えば、２分から６時間、５分から４時間及び好ましくは１時間から２時間）の間、インキュベーションされる基質をデンプンゼラチン化温度（例えば、６５℃から１２０℃まで、７０℃から１１０℃まで、７０℃から９０℃まで）以上の０から５５℃のような温度上昇に処されることにより液化する。幾つかの実施態様においては、温度を約８５‐９０℃の間まで温度上昇させ、単独投与量のアルファアミラーゼを用いてよい。もし温度が９０‐１０５℃より高い温度に上昇するならば、温度が通常に戻った後、第二回目の投与のアルファアミラーゼを加えてよい。さらなる実施態様においては、温度を約１０５℃と１４０℃の間まで温度上昇させ、分割投与のアルファアミラーゼを用いてよく、これは、温度上昇前に添加される一部分と温度が少なくとも１０５℃より低く下がった後であって、１０４、１０３、１０２、１０１、１００、９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、及び９１℃を含み、好ましくは９０℃より低く下がった後添加される他の部分を用いてよい。幾つかの実施態様においては、得られる液状化物を糖化前に冷却する。
【００９３】
糖化及び発酵
上述のように得られた液状化物を所望の酵素比を出来る限り長く維持する単独投与又は分割投与にてグルコアミラーゼ、酸安定性アルファアミラーゼ及び酸性菌類プロテアーゼと接触してよい。
つまり、分割投与量とは、所望の比における全体投与量を一以上に分割して添加し、二分割又は三分割を含むことを意味する。ある実施態様においては、全体投与量の一部分を初期に添加し、第二部分をプロセスにおける特定の時間に添加する。ある実施態様においては、、少なくとも一部分の投与量を糖化（又はＳＳＦ）の初期に添加し、糖化処理を始める。ある実施態様においては、酵素組成物中各酵素を液状化物に別々に、けれども、連続してまたは活性比が維持されるように十分短い時間にて添加してよい。あるいは、グルコアミラーゼ、酸安定性アルファアミラーゼ及び酸性菌類プロテアーゼを含む酵素ブレンド組成物を糖化及び発酵の一つの間又は両方の間に添加してよい。グルコアミラーゼ、酸安定性アルファアミラーゼ及び酸性菌類プロテアーゼの比はＧＡＵ：ＳＳＵ：ＳＡＰＵによる測定として好ましくは約１：１．５：０．１から約１：８：１、及びより好ましくは、約１：２：０．２から約１：５：０．６である。
【００９４】
糖化プロセスは１２から１２０時間続けてよい。しかしながら、３０分から２時間の間、糖化を行い、それから発酵の間に糖化を完了することが通常である。時々、これを同時糖化発酵（ＳＳＦ）という。通常、糖化を３０から６５℃の温度で一般的に４．０から５．０を含むｐＨ３．０から５．０で行う。糖化によって発酵性糖類の生産物として得てよい。
【００９５】
幾つかの実施態様においては、発酵性糖類を発酵微生物用いる発酵に用いてよい。接触段階及び発酵段階を同じ反応容器で同時又は分離して行ってよい。一般的に、発酵プロセスはＴｈｅ Ａｌｃｏｈｏｌ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ３ｒｄ ＥＤ， Ａ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｅｖｅｒａｇｅ， Ｆｕｅｌ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ａｌｃｏｈｏｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ, Ｅｄｓ Ｊａｃｑｕｅｓ他、（１９９９） Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， ＵＫに記載されている。
【００９６】
幾つかの実施態様においては、方法はさらに、アルコール（例えば、エタノール）、有機酸類（例えば、コハク酸、乳酸）、糖アルコール類（例えば、グリセロール）、アスコルビン酸中間体（例えば、グルコネート、ＤＫＧ，ＫＬＧ）、アミノ酸（例えば、リジン）、及びタンパク質類の（例えば、抗体及びそれらのフラグメント）ような最終産物を得るために、適切な発酵条件下、微生物の発酵における発酵用原料として発酵性糖類（デキストリン、例えば、グルコース）の使用を含む。
【００９７】
幾つかの好ましい実施態様においては、アルコール産物、好ましくはエタノールを生産するために、発酵性糖類を１５から４０℃、２０から３８℃及びまた２５から３５℃の範囲の温度にて、ｐＨ３．０から６．５、またｐＨ３．０から６．０、ｐＨ３．０からｐＨ５．５、ｐＨ３．５から５．０及びまたｐＨ３．５から４．５の範囲のｐＨにて、５時間から１２０時間、好ましくは１２から１２０時間より好ましくは２４時間から９０時間の間、酵母を用いて発酵する。
【００９８】
酵母細胞を一般的に１０４から１０１２の量で供給し、好ましくは、発酵培地の１ｍｌあたり１０７から１０１０生存酵母数で供給する。発酵は、さらに発酵微生物（例えば、酵母）、栄養素、任意の酸及び／又は追加的酵素を含むことができる。幾つかの実施態様においては、上述の生原料に加えて、発酵培地はサプリメント類を含んでよく、それはビタミン類（例えば、ビオチン、葉酸、ニコチン酸、リボフラビン）、コファクター、及びマクロとミクロ栄養素及び塩類（例えば、（ＮＨ４）２ＳＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、ＮａＣｌ、ＭｇＳＯ４、Ｈ３ＢＯ３、ＺｎＣｌ２、及びＣａＣｌ２）を含むが、これらに限定されない。
【００９９】
幾つかの好ましい実施態様においては、粉砕植物原料は大麦、ミロ、トウモロコシ及びそれらの組み合わせを含み、接触及び発酵段階は３．５から５．５の範囲のｐＨ、３０−４５℃の温度にて及び４８から９０時間にて同時に導入され、少なくとも５０％のデンプンが可溶化することを特徴とする。
【０１００】
最終産物
即時発酵プロセスのある好ましい最終産物は例えばエタノールのようなアルコール産物である。さらなる実施態様においては、最終産物は、乾燥した蒸留穀物残渣（Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ Ｄｒｉｅｄ Ｇｒａｉｎｓ）（ＤＤＧ）、可溶性物質添加乾燥蒸留穀物残渣（Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ Ｄｒｉｅｄ Ｇｒａｉｎ ｐｌｕｓ Ｓｏｌｕｂｌｅｓ）(ＤＤＧＳ)、のような発酵副産物であって、動物の飼料として用いられるものである。
【０１０１】
さらなる実施態様においては、周知であって適切な発酵微生物の使用により、発酵最終産物はグルセロール、１，３‐プロパンジオール、グルコネート、２‐ケト‐Ｄ‐グルコネート、２，５‐ジケト‐Ｄ‐グルコネート、２‐ケト‐Ｌ‐グロン酸、コハク酸、乳酸、アミノ酸類、及びそれらの誘導体を含むが、これらに限定されない。
【０１０２】
発酵生物
発酵生物の例はエタノール生産微生物（ｅｔｈａｎｏｌｏｇｅｎｉｃ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）又はアルコールデヒドロゲナーゼ及びピルビン酸デヒドロゲナーゼを発現し、ザイモモナス モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｌｉｓ）(例えば、ＵＳＰ ５，０００，０００、ＵＳＰ ５，０２８，５３９、ＵＳＰ ５，４２４，２０２、ＵＳＰ ５，５１４，５８３及びＵＳＰ ５，５５４，５２０を参照願いたい)から得られるエタノール生産細菌類のようなエタノール生産微生物（ｅｔｈａｎｏｌ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）である。さらなる実施態様においては、エタノール生産微生物はキシロースリダクターゼ及びキシリトールデヒドロゲナーゼであって、キシロースをキシルロースに変える酵素を発現する。さらなる実施態様においては、キシロース イソメラーゼはキシロースをキシルロースに変える。ある好ましい実施態様においては、ペントース類及びヘキソース類両方をエタノールへ発酵できる微生物を利用してよい。例えば、幾つかの実施態様においては、微生物は天然の微生物又は遺伝子組み換えをしていない微生物であり、他の実施態様においては、微生物は組み換え微生物でよい。
【０１０３】
発酵微生物はバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、大腸菌(Ｅ．ｃｏｌｉ)、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）(例えばパントエア シトレア（Ｐ． ｃｉｔｒｅａ）)、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、及びクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）（例えば、クレブシエラ オキシトカ（Ｋ. ｏｘｙｔｏｃａ）(例えば、ＵＳＰ ５，０２８，５３９、ＵＳＰ ５，４２４，２０２、及びＷＯ ９５/１３３６２を参照願いたい)由来の細菌菌株を含むがこれらに限定されない。バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）は好ましい発酵微生物である。発酵段階で用いる発酵微生物は生産されるべき最終産物で決定してよい。
【０１０４】
別の好ましい実施態様においては、エタノール生産微生物はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）のような菌類微生物、酵母、及び特に、サッカロミセス セレビジアエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＵＳＰ ４，３１６，９５６）の菌株のようなサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）である。多くのサッカロミセス セレビジアエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は商業的に入手可能であり、これらはＦＡＬＩ（Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ‘ｓ Ｙｅａｓｔ）、ＳＵＰＥＲＳＴＡＲＴ（Ａｌｌｔｅｃｈ）、ＦＥＲＭＩＯＬ（ＤＳＭ Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ）、ＲＥＤ ＳＴＡＲ（Ｌｅｓａｆｆｒｅ）及びＡｎｇｅｌ ａｌｃｏｈｏｌ ｙｅａｓｔ（Ａｎｇｅｌ Ｙｅａｓｔ Ｃｏｍｐａｎｙ, Ｃｈｉｎａ）を含むが、これらに限定されない。
【０１０５】
例えば、乳酸が所望な最終産物の場合、ラクトバシルス種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）（ラクトバシルス カセイ（Ｌ． ｃａｓｅｉ））を用いてよい。グルセロール又は１，３‐プロパンジオールが所望の最終産物の場合は大腸菌(Ｅ．ｃｏｌｉ)を用いてよい。そして２‐ケト‐Ｄ‐グルコネート、２，５‐ジケト‐Ｄ‐グルコネート、及び２‐ケト‐Ｌ‐グロン酸が所望の最終産物である場合、パントエア シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａ）を発酵微生物として用いてよい。上記列挙するリストは単なる例であり、当業者は所望の最終産物を得るために適切に用いることのできる多くの発酵微生物を知っている。
【０１０６】
最終産物の回収
本発明の方法に従って生産される最終産物は発酵培地から分離及び／又は精製されてよい。分離及び精製の方法は周知であり、例えば培地を抽出、蒸留及びカラムクロマトグラフィー処理による方法である。幾つかの実施態様においては、最終産物は培地を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析にて処理することにより直接同定される。
【０１０７】
さらなる実施態様においては、例えばマッシュ（ｍａｓｈ）を遠心分離により液相と固相及びアルコールや回収される固体のような最終産物へ分離してよい。アルコールを蒸留及びモレキュラーシーブ脱水又は限外ろ過のような手段にて回収してよい。
【０１０８】
幾つかの実施態様においては、エタノール生産の方法にかかる本発明による酵素ブレンド又は組成物の使用は８％、１０％、１２％、１４％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、及び２２％（ｖ／ｖ）より多いエタノールの収量を得る。
【０１０９】
任意的に、発酵に続いて、例えば、アルコール（例えば、エタノール）を蒸留により抽出できる。エタノールは燃料、携帯用又は産業用エタノールとして使用できる。
【実施例】
【０１１０】
本発明を次の実施例にてさらに詳しく述べるが、これは特許請求の範囲を限定することを全く意図していない。添付図面は本発明の明細書及び本発明の記載の不可分な一部として考えられる。すべての引用文献は、記載されるすべてのものを本明細書に引用することにより具体的に本明細書に取り込まれる。次の実施例は本発明を説明するために提供されるが、特許請求の範囲を限定するものではない。
【０１１１】
開示及び次の実施例のセクションにおいて、つぎの略語が適用される。ｗｔ％（質量パーセント（ｗｅｉｇｈｔ ｐｅｒｃｅｎｔ）、℃（摂氏(ｄｅｇｒｅｅｓ Ｃｅｎｔｉｇｒａｄｅ)、Ｈ２Ｏ（水（ｗａｔｅｒ））、ｄＨ２Ｏ（脱イオン水（ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ ｗａｔｅｒ））、ｄＩＨ２Ｏ（脱イオン水、ミリＱろ過（ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ ｗａｔｅｒ,Ｍｉｌｌｉ−Ｑ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ)、ｇまたはｇｍ（グラム（ｇｒａｍｓ））、μg（マイクログラム(ｍｉｃｒｏｇｒａｍｓ)）、ｍｇ（ミリグラム（ｍｉｌｌｉｇｒａｍｓ））、ｋｇ（キログラム（ｋｉｌｏｇｒａｍｓ））、μL（マイクロリットル（ｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒｓ））、ｍｌ及びｍＬ（ミリリットル(ｍｉｌｌｉｌｉｔｅｒｓ)、ｍｍ（ミリメートル（ｍｉｌｌｉｍｅｔｅｒｓ））、μｍ（マイクロメートル(ｍｉｃｒｏｍｅｔｅｒ)）、Ｍ（モル（ｍｏｌａｒ））、ｍＭ（ミリモル（ｍｉｌｌｉｍｏｌａｒ））、μＭ（マイクロモル(ｍｉｃｒｏｍｏｌａｒ)）、Ｕ（単位(ｕｎｉｔｓ)）、ＭＷ（分子量(ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ)）、ｓｅｃ（秒(ｓｅｃｏｎｄｓ)）、ｍｉｎ（ｓ）（分(ｍｉｎｕｔｅ／ｍｉｎｕｔｅｓ)）、ｈｒ（ｓ）（時間(ｈｏｕｒ／ｈｏｕｒｓ)）、ＤＯ（溶解酸素(ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ ｏｘｙｇｅｎ)）、Ｗ／Ｖ（重量／体積(ｗｅｉｇｈｔ ｔｏ ｖｏｌｕｍｅ)）、Ｗ／Ｗ（重量／重量(ｗｅｉｇｈｔ ｔｏ ｗｅｉｇｈｔ)）、Ｖ／Ｖ（体積／体積(ｖｏｌｕｍｅ ｔｏ ｖｏｌｕｍｅ)）、ＩＫＡ (アイケーエー（ＩＫＡ Ｗｏｒｋｓ Ｉｎｃ． ２６３５ Ｎｏｒｔｈ Ｃｈａｓｅ Ｐａｒｋｗａｙ ＳＥ， Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， ＮＣ)）、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ（ジェネンコー インターナショナル社(Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｉｎｃ．， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ)）、Ｎｃｍ（ニュートン センチメートル(Ｎｅｗｔｏｎ ｃｅｎｔｉｍｅｔｅｒ)）、ＥＴＯＨ（エタノール(ｅｔｈａｎｏｌ)）、ｅｑ（当量(ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ)、Ｎ（規定(Ｎｏｒｍａｌ)）ｄｓ又はＤＳ（乾燥固体含有量(ｄｒｙ ｓｏｌｉｄｓ ｃｏｎｔｅｎｔ)）、ＳＡＰＵ（分光光度の酸性プロテアーゼ単位(ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｕｎｉｔ)であって、１ＳＡＰＵはアッセイ条件下カゼイン基質
から１マイクロモルのチロシンを遊離するプロテアーゼ酵素活性の量である）、及びＧＡＵ（グルコアミラーゼ ユニット（ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ ｕｎｉｔ）であって、ｐＨ４．２及び６０℃にて可溶性デンプン基質から時間当たりグルコースに換算して１ｇの還元糖を生産することのできる酵素量として規定される）。
【０１１２】
材料及び方法
粘度測定
グラスクッカー‐粘度計（ｇｌａｓｓ ｃｏｏｋｅｒ ‐ｖｉｓｃｏｍｅｔｅｒ）、ＬＲ‐２．ＳＴシステムＩＫＡを粘度測定するために用いる。手短に説明すると、粘度計は、ユーロスター ラボテクニック パワー コントロール‐粘度計（Ｅｕｒｏｓｔａｒ Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ ｐｏｗｅｒ ｃｏｎｔｒｏｌ−ｖｉｓｃｏｍｅｔｅｒ）(ビスコクリック（Ｖｉｓｃｏｋｌｉｃｋ）粘度計の粘度範囲は０から６００Ｎｃｍ)によって攪拌されるアンカーミキサーを有する２０００ｍｌの二重壁のガラス容器からなる。一般的に、本明細書に記載する実施例のために、デンプン基質及び適切な酵素量を含有するスラリーを粘度計容器に注いだ。温度及び粘度を８５℃まで加熱する間記録し、インキュベーションをさらに６０分から１２０分間続けた。Ｎｃｍとして測定される粘度は間隔を置いて記録した。
【０１１３】
酵素
用いたグルコアミラーゼは表１に配列番号１として示すトリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ＧＡ（ＴｒＧＡ）であった（また、ＵＳ ２００６／０００３４０８、１／５／２００６発行、及びＵＳ ２００６／００９４０８０、５／４／２００６発行を参照願いたい、両者は参照によりここに取り込まれる）。実施例にて用いる酸性菌類プロテアーゼは、配列番号１４の配列を有するトリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）であった（また、ＵＳ ２００６／０１５３４２、７／１３／２００６発行、配列番号１０を参照願いたい、参照により取り込まれる）。アルファアミラーゼは、本明細書にて配列番号５（米国特許第７，２０５，１３８）として示すアスペルギルス カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ. ｋａｗａｃｈｉ）アルファアミラーゼ（ＡｋＡＡ）であった。すべての特許出願はそれら全体を参照により本明細書に取り込まれる。
【０１１４】
高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による炭水化物分析：
オリゴサッカライド反応産物の組成物を屈折率（ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ ｉｎｄｅｘ）（ＲＩ）検出器(ＥＲＣ−７５１５Ａ ＲＩ検出器, Ａｎｓｐｅｃ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｉｎｃ．)に接続し５０℃に維持したＨＰＬＣカラム(レゼックス（Ｒｅｚｅｘ） ８ｕ ８％ Ｈ， モノサッカライド)が備わったＨＰＬＣ（ベックマンシステム（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｓｙｓｔｅｍ） Ｇｏｌｄ ３２ Ｋａｒａｔ Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ， ＣＡ）により測定した。サッカライド類は分子量に基づいて分離された。ＤＰ１の記号は、グルコースのようなモノサッカライド、ＤＰ２の記号は、マルトースのようなジサッカライド、ＤＰ３の記号は、マルトトリオースのようなトリサッカライド及び「ＤＰ４＋」の記号は、４以上の重合（ＤＰ）度を有するオリゴサッカライドである。
【０１１５】
アルファアミラーゼ活性（ＡＡＵ）は分光学的に測定されるヨード染色能の減少割合を反映するようにデンプン加水分解の割合によって決定した。アルファアミラーゼ活性の１ＡＡＵは標準条件下、１分当たり１０ｍｇのデンプンを加水分解することのできる酵素量である。
【０１１６】
アルファアミラーゼ活性は、可溶性デンプン単位（ＳＳＵ）として算定した。ｐＨ４．５、５０℃にて酵素サンプルの一部によって可溶性ジャガイモデンプン基質（４％ＤＳ）の加水分解の程度に基づく。還元糖含有量はＭｉｌｌｅｒ， Ｇ． Ｌ． （１９５９） Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ. ３１ ：４２６−４２８に記載のＤＮＳ方法を用いて測定される。スペザイム フレッド（ＳＰＥＺＹＭＥ ＦＲＥＤ）でのＬＩＱＵＩＦＯＮ Ｕｎｉｔｓ (ＬＵ)におけるアルファアミラーゼ活性はＵＳＰ ５，９５８，７３９記載の方法に従って測定された。手短に説明すると、試験方法は、化学的にブロックされる非還元末端糖を有する基質としてｐ−ニトロフェニルマルトヘプトシド（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ｍａｌｔｏｈｅｐｔｏｓｉｄｅ）を用いる。ｐ−ニトロフェニルの放出の割合はアルファアミラーゼ活性と比例し、放出は４１０ｎｍで測定される。活性は標準コントロールに対して計算される。
【０１１７】
グルコアミラーゼ活性単位（ＧＡＵ）は＝ＰＮＰＧ試験をグルコアミラーゼの活性を測定するために用いる。
【０１１８】
酸性菌類プロテアーゼ活性（ＳＡＰＵ）＝酸性菌類プロテアーゼ活性はｐＨ３．０及び３７℃にて精製高窒素カゼイン基質（Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｈｉｇｈ ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｓｅｉｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）の３０分間タンパク質加水分解から可溶性カゼインペプチドの遊離に基づく。非加水分解基質をトリクロロ酢酸を用いて沈殿させろ過にて除去する。可溶化カゼインをそれから分光学的に測定される。１の分光光度の酸性プロテアーゼ単位（ＳＡＰＵ）はその方法の条件下酵素産物の１グラム当たり１分間での１マイクロモルのチロシン相当量を遊離する活性である。
【０１１９】
実施例１
エタノール発酵でのＴｒＧＡ、ＡｋＡＡ及びＡＦＰブレンド又は組成物の効果
この実施例は、エタノール発酵でのグルコアミラーゼ、アルファアミラーゼ及び酸性菌類プロテアーゼのブレンドの驚くべき有用性を示す。
【０１２０】
グルコアミラーゼ（トリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）又はアスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ））を用いた酸性菌類プロテアーゼ（ジェネンコ−ダニスコ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ‐Ｄａｎｉｓｃｏ）製ファームゲン（商標）（ＦＥＲＭＧＥＮ（商標））及び酸安定性アルファアミラーゼ（配列番号５を有するＡｋＡＡ）の効果を酵母発酵の間、炭素転換効率（アルコール収量）にて分析した。液状化全粒粉砕トウモロコシを含む培地を試験した。この試験用のマッシュを蒸留残液（ｔｈｉｎ ｓｔｉｌｌａｇｅ）（ニュー エネルギー（Ｎｅｗ Ｅｎｅｒｇｙ， Ｓｏｕｔｈ Ｂｅｎｄ ＩＮ）から得られる９．８％ ＤＳ）を用いて３２％ＤＳまでニュー エネルギー（Ｎｅｗ Ｅｎｅｒｇｙ， Ｓｏｕｔｈ Ｂｅｎｄ ＩＮ）液状化物（３９．８％ ＤＳ Ｗ／Ｗ）を希釈することにより作成した。マッシュ（ｍａｓｈ）は２９．３％トウモロコシＤＳを含んだ。そのマッシュ（ｍａｓｈ）のｐＨを６Ｎ硫酸にて４．２に調整した。６００ｐｐｍ尿素をレッドスターエタノール（Ｒｅｄ Ｓｔａｒ Ｅｔｈａｎｏｌ）の酵母播種材料と共に添加した。発酵を３００ｇｍのマッシュ（ｍａｓｈ）を含む５００ｍｌフラスコにて行った。酵素を希釈してそのフラスコへ０．２ｍｌ添加した。すべての酵素用量を１ｇｍトウモロコシＤＳ当たりの酵素用量であった。フラスコを３２℃の水浴に置き、場合によって混合した。表６に示す酵素濃度を用いた。
【０１２１】
発酵の間、ＨＰＬＣ分析のために約２ｍｌの発酵培地（ブロス）をサンプルとして採取した。スクリューキャップ試験管中０．５ｍｌのサンプル上澄みを４．４５ｍｌの水と０．０５ｍｌの１Ｎ硫酸に加えた。試験管に蓋をして１５分間７５℃の水浴に置いて、酵素活性を失活させた。加熱後、ＨＰＬＣ分析のために希釈されたサンプルを０．２ミクロンフィルターを通してろ過した。ＨＰＬＣ分離を６０℃にて０．０１Ｎ硫酸の移動相を用いて０．６ｍｌ／分にてフェノミネックス酸性カラム（Ｐｈｅｎｏｍｉｎｅｘ ａｃｉｄ ｃｏｌｕｍｎ）で行った。２０μｌのサンプルを注入した。７１時間後発酵を停止し、発酵培地を廃棄した。
【０１２２】
表６に示すＨＰＬＣの結果は酵母発酵（０．２５ＧＡＵのＴｒ‐ＧＡ／ｇｄｓ ｃｏｒｎ、３２％ｄｓ、ｐＨ４．３、３２℃）の間酸安定性アルファアミラーゼ（ＡｋＡＡ）及び酸性菌類プロテアーゼ（ファームゲン（ＦＥＲＭＧＥＮ）／ＡＦＰ）の効果を示す。重合の程度、又はＤＰは重合反応中時間ｔにて平均ポリマー鎖における繰り返し単位の数である。長さはモノマー単位である。重合の程度は分子量の測定である。ＤＰ‐１の例はグルコース及びフルクトースのようなモノサッカライド類である。ＤＰ‐２の例はマルトース及びスクロースのようなジサッカライド類である。ＤＰ‐３はマルトトリオースをいう。ＤＰ＞３は３より大きい重合度を有するポリマーを示す。表６に示すＤＰ‐１、ＤＰ‐２、及びＤＰ‐３はデンプンの加水分解から得られる糖類である。
【０１２３】
乳酸はラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）菌により炭水化物の発酵中に生産される有機酸である。乳酸の生産は感染されたエタノール発酵中の収量の低下の主な原因となる。そのことから、乳酸は定期的にモニターされる。グリセロールはエタノール発酵の副産物である。それは酵母発酵の調子の指標として定期的にモニターされる。
【０１２４】
表６の結果は酵素ブレンド中ＡｋＡＡのレベルが増加する場合、高い糖のの割合の減少（＞ＤＰ３）と結果としてエタノール生産の割合が増加し、最終的にエタノールの収量が増加することを示す。
【表６】
【０１２５】
実施例２
マスバランス試験
酵母発酵の間、炭素転換効率（アルコール収率）に対するグルコアミラーゼ（トリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ））を用いた酸性菌類プロテアーゼ（Ｄａｎｉｓｃｏ ＵＳ， Ｉｎｃ， Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ製のファームゲン（ＦＥＲＭＧＥＮ））及び酸安定性アルファアミラーゼ（配列番号５）の効果を分析した。液状化全粒粉砕トウモロコシを含む培地をさらにマスバランス試験に用いた。
【０１２６】
液状化物（液状化全粒粉砕トウモロコシ基質）を最終ＤＳが３２％になるように蒸留残液（ｔｈｉｎ ｓｔｉｌｌａｇｅ）を全粒粉砕トウモロコシ液状化物へ加えることによって調製した。ｐＨを６Ｎ硫酸を用いて４．３に調整した。マッシュに４００ｐｐｍの尿素を０．０５重量％のレッドスターエタノール（Ｒｅｄ Ｓｔａｒ Ｅｔｈａｎｏｌ）酵母播種材料と共に添加した。マッシュを１２００グラムの量に分割し、表８に記載する０．３２５ＧＡＵ／ｇＤＳレベルにて酵素を投与した。約８００グラムのマッシュを４つの１リットルの容量フラスコにそれぞれ定量的に加えた。さらにそれぞれ約１５０グラムを２５０ｍｌ三角フラスコに添加した。１リットル容量フラスコはＣＯ２を逃がすための針を備えたゴム製コルク栓で蓋をし、３２℃のインキュベーターに置き、定期的に重量を測定した。２５０ｍｌの三角フラスコは１５０ｒｐｍにて３２℃の強制空気シェーカー中に置き、ＨＰＬＣ分析用に定期的にサンプリングした。１Ｌ容器の発酵の最後にＨＰＬＣ分析用に一部の溶液を採取した。フラスコの内容物を約５００ｍｌの脱イオン水（ＤＩ ｗａｔｅｒ）を用いながら定量的に２Ｌの三角フラスコに移したフラスコを蒸留装置に装着し、蒸留させた。約８００ｍｌの蒸留物を１Ｌの容量フラスコに集め、１Ｌに希釈した。サンプルをそれからＨＰＬＣ分析用に採取した。蒸留後残留物を天秤皿に移し１０４℃にて乾燥した。乾燥残留物（ＤＤＧＳ）を集め、残留デンプンを試験した。
【０１２７】
発酵中のアルコール収率及び糖の組成物プロファイルに対する０．３２５ＧＡＵのＴｒＧＡ／ｇｄｓ トウモロコシでのＡｋＡＡ及びＡＦＰの効果に関するＨＰＬＣデータを表７に示す。
【表７】
【０１２８】
表８のデータは酸性菌類プロテアーゼ（ＡＦＰ）の添加がアルコール産物の割合の増加をもたらすが、アルファアミラーゼ（ＡｋＡＡ）の添加はコントロールと比較してさらに高いアルコール産物を生産した。マスバランスデータを表８にまとめた。表８はＴｒＧＡ、ＡＦＰ、及びＡｋＡＡを含む三種の酵素ブレンドがＴｒＧＡとＡＦＰ又はＡｋＡＡ単独との組み合わせと比較して高い炭素転換効率（２,６７％）をもたらすことを示した。
【表８】
【０１２９】
蒸留からのアルコール収率はＣＯ２の値と同様の傾向を示し、７３００及び５０００ＳＳＵ／ｇアルファアミラーゼを含むブレンドは１ブッシェルのトウモロコシ当たり１ガロンのエタノールに関する最終の値において互いに同じくらいであり、コントロールよりよかった（表８を参照願いたい）。表８のデータはＡｋＡＡの容量増加につれて最終発酵でのエタノールレベルが増加することを示す。最終培地のＨＰＬＣ分析は同じ傾向を十分示すが、ＣＯ２値及び蒸留物の値ほどまで示さなかった。
【０１３０】
液状化全粒粉砕トウモロコシを用いる酵母発酵条件下異なる酵素組成を用いて得られる最終アルコール濃度をＴｒＧＡに対して比較して図１に示した。図１は液状化全粒粉砕トウモロコシの酵母発酵の間最終アルコール収率に対するＴｒＧＡ添加酸性菌類プロテアーゼ（ＳＡＰＵ）及び酸安定性アルファアミラーゼ（ＳＳＵ）の効果を示した。図１中番号が付けられた異なる酵素混合物は
１：ＴｒＧＡ、０．２５ＧＡＵ／ｇｄｓ トウモロコシ、
２：番号１＋０．０５ＳＡＰＵ ＡＦＰ／ｇｄｓ トウモロコシ、
３：番号１＋２．０ＳＳＵ アルファアミラーゼ／ｇｄｓ．トウモロコシ、
４：番号１＋０．０５ＳＡＰＵ、ＡＦＰ＋２．０ＳＳＵ アルファアミラーゼ／ｇｄｓ トウモロコシ
である。
【０１３１】
予想外に結果は炭素転換効率（トウモロコシｄｓのグラム当たりアルコール収量）は酵素ブレンド組成に依存することを示した。ＡＦＰ又はＡｋＡＡを含むＴｒＧＡを用いるアルコール収率における増加は付加的ではなく、予想外に相乗的効果を示した。
【０１３２】
上記明細書に言及するすべての文献及び特許は引用により本明細書に組み入れられる。本発明の記載された方法及びシステムの種々の修飾及び変化は本発明の範囲及び精神に沿って当業者にて明らかである。本発明は特定の所望の実施態様との関係で記載されているが、特許請求の範囲にかかる発明が、そのような特定の実施態様に不当に限定すべきでないことは理解されるところである。実際に、本発明を行うために当業者とってあきらかな態様の種々の修飾は以下の特許請求の範囲内であることを意図する。
【図１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコアミラーゼ、酸安定性アルファアミラーゼ、及び酸性菌類プロテアーゼを含む組成物。
【請求項２】
グルコアミラーゼ、酸安定性アルファアミラーゼ、及び酸性菌類プロテアーゼの比がＧＡＵ：ＳＳＵ：ＳＡＰＵで測定した場合、約１：１．５：０．１から約１：８：１であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
グルコアミラーゼ、酸安定性アルファアミラーゼ、及び酸性菌類プロテアーゼの比がＧＡＵ：ＳＳＵ：ＳＡＰＵで測定した場合、約１：２：０．２から１：５：０．６であることを特徴とする、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記グルコアミラーゼがトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、タラロミセス（Ｔａｌeｒｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）及びフミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）から成る群から選択される菌類から得られることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記グルコアミラーゼが配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記グルコアミラーゼ配列番号１のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記酸安定性アルファアミラーゼがトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）又はアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）から得られることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記酸安定性アルファアミラーゼが配列番号５、７、９、１０、又は１３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記グルコアミラーゼが配列番号５のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記酸性菌類プロテアーゼがトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）から得られることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記酸性菌類プロテアーゼが配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記酸性菌類プロテアーゼが配列番号１４のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
さらに、第二のグルコアミラーゼ、第二のアルファアミラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、第二のプロテアーゼ類、フィターゼ、プルラナーゼ、ベータアミラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ベータ‐グルカナーゼ、ガラクトシダーゼ、エステラーゼ、シクロデキストリントランスグルコシルトランスフェラーゼ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される追加酵素を含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
発酵性糖類から最終産物を生産するための方法であって、
ａ．デンプン含有粉砕穀物を含むスラリーをアルファアミラーゼと接触させ液状化物を生産する段階、
ｂ．前記液状化物をグルコアミラーゼ、酸安定性アルファアミラーゼ、及び酸性菌類プロテアーゼと接触させ発酵性糖類を生産する段階、及び
ｃ．発酵生物の存在下発酵性糖類を発酵させ最終産物を生産する段階、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
前記最終産物がアルコールであることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
グルコアミラーゼ、酸安定性アルファアミラーゼ、及び酸性菌類プロテアーゼの比がＧＡＵ：ＳＳＵ：ＳＡＰＵで測定した場合、約１：１．５：０．１から約１：８：１であることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
段階（ｂ）と段階（ｃ）を連続して行うことを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
段階（ｂ）と段階（ｃ）を同時に行うことを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
段階（ｂ）が３０から６５℃及びｐＨ３．０からｐＨ５．０にて行うことを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
段階（ｃ）が１５−４０℃及びｐＨ３．０からｐＨ６．５にて行うことを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１】
グルコアミラーゼ、酸安定性アルファアミラーゼ、及び酸性菌類プロテアーゼを含む組成物。
【請求項２】
グルコアミラーゼ、酸安定性アルファアミラーゼ、及び酸性菌類プロテアーゼの比がＧＡＵ：ＳＳＵ：ＳＡＰＵで測定した場合、約１：１．５：０．１から約１：８：１であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
グルコアミラーゼ、酸安定性アルファアミラーゼ、及び酸性菌類プロテアーゼの比がＧＡＵ：ＳＳＵ：ＳＡＰＵで測定した場合、約１：２：０．２から１：５：０．６であることを特徴とする、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記グルコアミラーゼがトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、タラロミセス（Ｔａｌeｒｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）及びフミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）から成る群から選択される菌類から得られることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記グルコアミラーゼが配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記グルコアミラーゼ配列番号１のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記酸安定性アルファアミラーゼがトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）又はアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）から得られることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記酸安定性アルファアミラーゼが配列番号５、７、９、１０、又は１３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記グルコアミラーゼが配列番号５のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記酸性菌類プロテアーゼがトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）から得られることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記酸性菌類プロテアーゼが配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記酸性菌類プロテアーゼが配列番号１４のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
さらに、第二のグルコアミラーゼ、第二のアルファアミラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、第二のプロテアーゼ類、フィターゼ、プルラナーゼ、ベータアミラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ベータ‐グルカナーゼ、ガラクトシダーゼ、エステラーゼ、シクロデキストリントランスグルコシルトランスフェラーゼ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される追加酵素を含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
発酵性糖類から最終産物を生産するための方法であって、
ａ．デンプン含有粉砕穀物を含むスラリーをアルファアミラーゼと接触させ液状化物を生産する段階、
ｂ．前記液状化物をグルコアミラーゼ、酸安定性アルファアミラーゼ、及び酸性菌類プロテアーゼと接触させ発酵性糖類を生産する段階、及び
ｃ．発酵生物の存在下発酵性糖類を発酵させ最終産物を生産する段階、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
前記最終産物がアルコールであることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
グルコアミラーゼ、酸安定性アルファアミラーゼ、及び酸性菌類プロテアーゼの比がＧＡＵ：ＳＳＵ：ＳＡＰＵで測定した場合、約１：１．５：０．１から約１：８：１であることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
段階（ｂ）と段階（ｃ）を連続して行うことを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
段階（ｂ）と段階（ｃ）を同時に行うことを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
段階（ｂ）が３０から６５℃及びｐＨ３．０からｐＨ５．０にて行うことを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
段階（ｃ）が１５−４０℃及びｐＨ３．０からｐＨ６．５にて行うことを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【公表番号】特表２０１１−５０００５８（Ｐ２０１１−５０００５８Ａ）
【公表日】平成２３年１月６日（２０１１．１．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３００６５（Ｐ２０１０−５３００６５）
【出願日】平成２０年１０月１４日（２００８．１０．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７９８２７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０５２１０１
【国際公開日】平成２１年４月２３日（２００９．４．２３）
【出願人】（５０９２４０４７９）ダニスコ・ユーエス・インク (81)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１月６日（２０１１．１．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月１４日（２００８．１０．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７９８２７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０５２１０１
【国際公開日】平成２１年４月２３日（２００９．４．２３）
【出願人】（５０９２４０４７９）ダニスコ・ユーエス・インク (81)
【Ｆターム（参考）】
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