直交リシルｔＲＮＡとアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの対の組成物及びその使用
４塩基コドンに応答してホモグルタミンを蛋白質に組込む蛋白質生合成機構の成分として、直交リシルｔＲＮＡ、直交リシル−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ、及びリシルｔＲＮＡ／シンテターゼ直交対の組成物とその作製方法を提供する。これらの直交対の同定方法と、これらの直交対を使用してホモグルタミンを組込んだ蛋白質を生産する方法も提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
直交リシルｔＲＮＡ（リシルＯ−ｔＲＮＡ）もしくはその修飾変異体；
直交リシルｔＲＮＡもしくはその修飾変異体に１種以上のアミノ酸を優先的に負荷する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）；又は
直交リシルｔＲＮＡ（リシルＯ−ｔＲＮＡ）もしくはその修飾変異体とリシルＯ−ｔＲＮＡもしくはその修飾変異体に１種以上のアミノ酸を優先的に負荷する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含む翻訳系。
【請求項２】
翻訳系が細胞を含む請求項１に記載の翻訳系。
【請求項３】
細胞が大腸菌細胞である請求項２に記載の翻訳系。
【請求項４】
アミノ酸が非天然アミノ酸である請求項１に記載の翻訳系。
【請求項５】
非天然アミノ酸がホモグルタミンである請求項４に記載の翻訳系。
【請求項６】
リシルＯ−ｔＲＮＡもしくはその修飾変異体、Ｏ−ＲＳ又はその両者がＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ（ＰｈＫＲＳ）に由来する請求項１に記載の翻訳系。
【請求項７】
Ｏ−ＲＳがＰｈＫＲＳ、Ｅ４４４Ｇ、ＰｈΔＡＤ、又はＰｈΔＡＤのＩ４１及び／又はＳ２６８突然変異体である請求項６に記載の翻訳系。
【請求項８】
Ｏ−ＲＳが大腸菌細胞で発現されると、ＰｈΔＡＤのＩ４１及び／又はＳ２６８突然変異体の毒性以下の毒性を示す請求項６に記載の翻訳系。
【請求項９】
リシルＯ−ｔＲＮＡ又はその修飾変異体が４塩基コドン又はアンバーコドンの認識配列を含む請求項１に記載の翻訳系。
【請求項１０】
リシルＯ−ｔＲＮＡ又はその修飾変異体がＡＧＧＡの認識配列を含む請求項１に記載の翻訳系。
【請求項１１】
リシルＯ−ｔＲＮＡ又はその修飾変異体がＣＵ（Ｘ）ｎＸＸＸＡＡ配列を含むアンチコドンループを含む請求項１に記載の翻訳系。
【請求項１２】
ＣＵ（Ｘ）ｎＸＸＸＡＡ配列がＣＵＣＵＡＡＡ又はＣＵＵＣＣＵＡＡを含む請求項１１に記載の翻訳系。
【請求項１３】
リシルＯ−ｔＲＮＡ又はその修飾変異体が配列番号２４又は配列番号２６を含む請求項１に記載の翻訳系。
【請求項１４】
Ｏ−ＲＳとリシルＯ−ｔＲＮＡ又はその修飾変異体がＥ４４４Ｇ、ＰｈΔＡＤ、又はＰｈΔＡＤのＩ４１及び／又はＳ２６８突然変異体を配列番号２４又は配列番号２６のＯ−ｔＲＮＡと併用する場合の少なくとも５０％の効率で終止又はフレームシフトセレクターコドンを抑圧する請求項１に記載の翻訳系。
【請求項１５】
付加Ｏ−ＲＳと付加Ｏ−ｔＲＮＡを含み、付加Ｏ−ＲＳと付加Ｏ−ｔＲＮＡがリシルＯ−ｔＲＮＡ又はその変異体とリシルＯ−ｔＲＮＡ又はその修飾変異体に優先的に負荷するＯ−ＲＳにより抑圧されるフレームシフトセレクターコドンとは異なるフレームシフトセレクターコドンを抑圧する請求項１に記載の翻訳系。
【請求項１６】
翻訳系がターゲットポリペプチドをコードするターゲット核酸において４塩基セレクターコドンと終止セレクターコドンの両者を抑圧する請求項１に記載の翻訳系。
【請求項１７】
４塩基セレクターコドンがＡＧＧＡ配列を含み、終止セレクターコドンがＴＡＧ又はＵＡＧ配列を含む請求項１６に記載の翻訳系。
【請求項１８】
４塩基セレクターコドンを含むターゲット核酸を含む請求項１に記載の翻訳系。
【請求項１９】
ターゲット核酸によりコードされる蛋白質を含む請求項１８に記載の翻訳系。
【請求項２０】
蛋白質がホモグルタミンを含む請求項１９に記載の翻訳系。
【請求項２１】
４塩基セレクターコドンと終止セレクターコドンを含むターゲット核酸を含む請求項１に記載の翻訳系。
【請求項２２】
ターゲット核酸によりコードされる蛋白質を含み、前記蛋白質が少なくとも２種の異なる非天然アミノ酸を含む請求項２１に記載の翻訳系。
【請求項２３】
４塩基セレクターコドンを認識する第１の直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；
前記Ｏ−ｔＲＮＡに第１の非天然アミノ酸を優先的に負荷する第１の直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と；
終止セレクターコドンを認識する第２のＯ−ｔＲＮＡと；
第２のＯ−ｔＲＮＡに第２の非天然アミノ酸を優先的に負荷する第２のＯ−ＲＳを含む翻訳系。
【請求項２４】
４塩基セレクターコドンがＡＧＧＡである請求項２３に記載の翻訳系。
【請求項２５】
終止コドンがＵＡＧである請求項２３に記載の翻訳系。
【請求項２６】
翻訳系が細胞を含む請求項２３に記載の翻訳系。
【請求項２７】
第１又は第２のＯ−ｔＲＮＡが直交リシルｔＲＮＡ（リシルＯ−ｔＲＮＡ）又はその修飾変異体である請求項２３に記載の翻訳系。
【請求項２８】
第１のＯ−ｔＲＮＡが直交リシルｔＲＮＡ（リシルＯ−ｔＲＮＡ）又はその修飾変異体であり、第２のＯ−ｔＲＮＡが直交チロシルｔＲＮＡ（チロシルＯ−ｔＲＮＡ）又はその修飾変異体である請求項２３に記載の翻訳系。
【請求項２９】
少なくとも４塩基セレクターコドンと終止セレクターコドンを含む核酸を更に含む請求項２３に記載の翻訳系。
【請求項３０】
４塩基セレクターコドンがＡＧＧＡであり、終止セレクターコドンがＴＡＧ又はＵＡＧである請求項２９に記載の翻訳系。
【請求項３１】
核酸が発現されたＲＮＡである請求項２９に記載の翻訳系。
【請求項３２】
翻訳系が核酸によりコードされる蛋白質を含み、前記蛋白質が少なくとも２種の異なる非天然アミノ酸を含む請求項２９に記載の翻訳系。
【請求項３３】
蛋白質がホモグルタミンを含む請求項３２に記載の翻訳系。
【請求項３４】
蛋白質がミオグロビンに相同である請求項３２に記載の翻訳系。
【請求項３５】
ホモグルタミンを含む請求項２３に記載の翻訳系。
【請求項３６】
ＰｈＫＲＳ、Ｅ４４４Ｇ、ＰｈΔＡＤ、ＰｈΔＡＤのＩ４１及び／又はＳ２６８突然変異体、又はその保存変異体を含む組成物。
【請求項３７】
ＰｈＫＲＳ、Ｅ４４４Ｇ、ＰｈΔＡＤ、ＰｈΔＡＤのＩ４１及び／又はＳ２６８突然変異体、又はその保存変異体をコードする核酸。
【請求項３８】
配列番号２４もしくは配列番号２６又はその保存変異体に対応するｔＲＮＡを含むか又はコードする核酸。
【請求項３９】
直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含み、前記Ｏ−ＲＳがＯ−ｔＲＮＡをホモグルタミンで優先的にアミノアシル化する組成物。
【請求項４０】
Ｏ−ＲＳがＰｈΔＡＤのＩ４１及び／又はＳ２６８突然変異体、又はその保存変異体を含む請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
Ｏ−ＲＳがＰｈΔＡＤのＩ４１及び／又はＳ２６８突然変異体の効率の少なくとも５０％の効率でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する請求項３９に記載の組成物。
【請求項４２】
Ｏ−ＲＳがＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉに由来する請求項３９に記載の組成物。
【請求項４３】
Ｏ−ｔＲＮＡを含み、前記Ｏ−ｔＲＮＡが４塩基セレクターコドンを認識する請求項３９に記載の組成物。
【請求項４４】
４塩基セレクターコドンがＡＧＧＡ配列を含む請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
細胞を含み、Ｏ−ＲＳが前記細胞において１種以上の核酸によりコードされる請求項３９に記載の組成物。
【請求項４６】
細胞が大腸菌細胞である請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
翻訳系を含む請求項３９に記載の組成物。
【請求項４８】
細胞を含み、Ｏ−ＲＳが前記細胞において１種以上の核酸によりコードされ、前記細胞が更に、
直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；
ホモグルタミンを含み；
Ｏ−ｔＲＮＡが第１のセレクターコドンを認識し、Ｏ−ＲＳがＯ−ｔＲＮＡを第１のホモグルタミンで優先的にアミノアシル化する請求項３９に記載の組成物。
【請求項４９】
細胞が該当ポリペプチドをコードするターゲット核酸を含み、ターゲット核酸がＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含む請求項４８に記載の組成物。
【請求項５０】
Ｏ−ｔＲＮＡが配列番号２４もしくは配列番号２６に記載のポリヌクレオチド配列又はその相補的ポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされ、Ｏ−ＲＳがＥ４４４Ｇ、ＰｈΔＡＤ、ＰｈΔＡＤのＩ４１及び／又はＳ２６８突然変異体、又はその保存変異体に対応するアミノ酸配列を含む請求項４８に記載の組成物。
【請求項５１】
Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡがＥ４４４Ｇ、ＰｈΔＡＤ、又はＰｈΔＡＤのＩ４１及び／又はＳ２６８突然変異体を配列番号２４又は配列番号２６のＯ−ｔＲＮＡと併用する場合の少なくとも５０％の効率で終止又はフレームシフトセレクターコドンを抑圧する請求項４８に記載の組成物。
【請求項５２】
細胞が大腸菌細胞である請求項４８に記載の組成物。
【請求項５３】
細胞が異なる付加Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対と異なる付加非天然アミノ酸を更に含み、Ｏ−ｔＲＮＡが第２のセレクターコドンを認識し、Ｏ−ＲＳがＯ−ｔＲＮＡを第２の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する請求項４８に記載の組成物。
【請求項５４】
細胞が第１及び第２のセレクターコドンを含むターゲット核酸を含む請求項５３に記載の組成物。
【請求項５５】
細胞がターゲット核酸によりコードされる蛋白質を含み、前記蛋白質が少なくとも２種の異なる非天然アミノ酸を含む請求項５４に記載の組成物。
【請求項５６】
蛋白質を含有する組成物であって、前記蛋白質がホモグルタミンを含む前記組成物。
【請求項５７】
蛋白質が野生型治療用蛋白質、診断用蛋白質、産業用酵素、又はその部分のアミノ酸配列に少なくとも７５％一致するアミノ酸配列を含む請求項５６に記載の組成物。
【請求項５８】
組成物が医薬的に許容可能なキャリヤーを含有する請求項５６に記載の組成物。
【請求項５９】
ホモグルタミンを直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）に負荷する活性直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）の選択方法であって、
１）Ｏ−ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡはＯ−ｔＲＮＡを含む細胞集団のメンバーに直交性である）と；
２）集団の１個以上の細胞においてＯ−ｔＲＮＡにホモグルタミンを負荷する１個以上の活性Ｏ−ＲＳメンバーを含む複数のＯ−ＲＳと；
３）選択マーカーをコードし、Ｏ−ｔＲＮＡにより認識される少なくとも１個のセレクターコドンを含むポリヌクレオチドと；
４）ホモグルタミン
を併有する細胞集団に選択を実施し、複数のＲＳを含まず且つＯ−ｔＲＮＡを含む対照細胞の抑圧効率に比較して選択マーカーの抑圧効率の増加により活性Ｏ−ＲＳを含むターゲット細胞を集団から同定する段階と；
ターゲット細胞を選択することにより、活性Ｏ−ＲＳを選択する段階を含む前記方法。
【請求項６０】
Ｏ−ｔＲＮＡにホモグルタミン以外のアミノ酸を負荷する非ターゲットＯ−ＲＳを含む細胞を排除するように細胞を更に選択する請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
選択がポジティブ選択を含み、選択マーカーがポジティブ選択マーカーを含む請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
複数のＲＳが突然変異体ＲＳ、第１の種以外の１種以上の種に由来するＲＳ、又は突然変異体ＲＳと第１の種以外の種に由来するＲＳの両者を含む請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
請求項５９に記載の方法により同定された直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ。
【請求項６４】
特定位置にホモグルタミンを組込んだ蛋白質を細胞で生産する方法であって、
少なくとも１個のセレクターコドンを含み、蛋白質をコードする核酸を含む細胞を適当な培地で増殖させる段階と；
ホモグルタミンを提供する段階を含み；
前記細胞が更に、
セレクターコドンを認識する直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；
Ｏ−ｔＲＮＡをホモグルタミンで優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含み；
更に、セレクターコドンに応答してホモグルタミンを特定位置に組込むことにより、蛋白質を生産する段階を含む前記方法。
【請求項６５】
Ｏ−ＲＳがＥ４４４Ｇ、ＰｈΔＡＤ、ＰｈΔＡＤのＩ４１及び／又はＳ２６８突然変異体、又はその保存変異体に対応するアミノ酸配列を含む請求項６４に記載の方法。
【請求項１】
直交リシルｔＲＮＡ（リシルＯ−ｔＲＮＡ）もしくはその修飾変異体；
直交リシルｔＲＮＡもしくはその修飾変異体に１種以上のアミノ酸を優先的に負荷する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）；又は
直交リシルｔＲＮＡ（リシルＯ−ｔＲＮＡ）もしくはその修飾変異体とリシルＯ−ｔＲＮＡもしくはその修飾変異体に１種以上のアミノ酸を優先的に負荷する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含む翻訳系。
【請求項２】
翻訳系が細胞を含む請求項１に記載の翻訳系。
【請求項３】
細胞が大腸菌細胞である請求項２に記載の翻訳系。
【請求項４】
アミノ酸が非天然アミノ酸である請求項１に記載の翻訳系。
【請求項５】
非天然アミノ酸がホモグルタミンである請求項４に記載の翻訳系。
【請求項６】
リシルＯ−ｔＲＮＡもしくはその修飾変異体、Ｏ−ＲＳ又はその両者がＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ（ＰｈＫＲＳ）に由来する請求項１に記載の翻訳系。
【請求項７】
Ｏ−ＲＳがＰｈＫＲＳ、Ｅ４４４Ｇ、ＰｈΔＡＤ、又はＰｈΔＡＤのＩ４１及び／又はＳ２６８突然変異体である請求項６に記載の翻訳系。
【請求項８】
Ｏ−ＲＳが大腸菌細胞で発現されると、ＰｈΔＡＤのＩ４１及び／又はＳ２６８突然変異体の毒性以下の毒性を示す請求項６に記載の翻訳系。
【請求項９】
リシルＯ−ｔＲＮＡ又はその修飾変異体が４塩基コドン又はアンバーコドンの認識配列を含む請求項１に記載の翻訳系。
【請求項１０】
リシルＯ−ｔＲＮＡ又はその修飾変異体がＡＧＧＡの認識配列を含む請求項１に記載の翻訳系。
【請求項１１】
リシルＯ−ｔＲＮＡ又はその修飾変異体がＣＵ（Ｘ）ｎＸＸＸＡＡ配列を含むアンチコドンループを含む請求項１に記載の翻訳系。
【請求項１２】
ＣＵ（Ｘ）ｎＸＸＸＡＡ配列がＣＵＣＵＡＡＡ又はＣＵＵＣＣＵＡＡを含む請求項１１に記載の翻訳系。
【請求項１３】
リシルＯ−ｔＲＮＡ又はその修飾変異体が配列番号２４又は配列番号２６を含む請求項１に記載の翻訳系。
【請求項１４】
Ｏ−ＲＳとリシルＯ−ｔＲＮＡ又はその修飾変異体がＥ４４４Ｇ、ＰｈΔＡＤ、又はＰｈΔＡＤのＩ４１及び／又はＳ２６８突然変異体を配列番号２４又は配列番号２６のＯ−ｔＲＮＡと併用する場合の少なくとも５０％の効率で終止又はフレームシフトセレクターコドンを抑圧する請求項１に記載の翻訳系。
【請求項１５】
付加Ｏ−ＲＳと付加Ｏ−ｔＲＮＡを含み、付加Ｏ−ＲＳと付加Ｏ−ｔＲＮＡがリシルＯ−ｔＲＮＡ又はその変異体とリシルＯ−ｔＲＮＡ又はその修飾変異体に優先的に負荷するＯ−ＲＳにより抑圧されるフレームシフトセレクターコドンとは異なるフレームシフトセレクターコドンを抑圧する請求項１に記載の翻訳系。
【請求項１６】
翻訳系がターゲットポリペプチドをコードするターゲット核酸において４塩基セレクターコドンと終止セレクターコドンの両者を抑圧する請求項１に記載の翻訳系。
【請求項１７】
４塩基セレクターコドンがＡＧＧＡ配列を含み、終止セレクターコドンがＴＡＧ又はＵＡＧ配列を含む請求項１６に記載の翻訳系。
【請求項１８】
４塩基セレクターコドンを含むターゲット核酸を含む請求項１に記載の翻訳系。
【請求項１９】
ターゲット核酸によりコードされる蛋白質を含む請求項１８に記載の翻訳系。
【請求項２０】
蛋白質がホモグルタミンを含む請求項１９に記載の翻訳系。
【請求項２１】
４塩基セレクターコドンと終止セレクターコドンを含むターゲット核酸を含む請求項１に記載の翻訳系。
【請求項２２】
ターゲット核酸によりコードされる蛋白質を含み、前記蛋白質が少なくとも２種の異なる非天然アミノ酸を含む請求項２１に記載の翻訳系。
【請求項２３】
４塩基セレクターコドンを認識する第１の直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；
前記Ｏ−ｔＲＮＡに第１の非天然アミノ酸を優先的に負荷する第１の直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と；
終止セレクターコドンを認識する第２のＯ−ｔＲＮＡと；
第２のＯ−ｔＲＮＡに第２の非天然アミノ酸を優先的に負荷する第２のＯ−ＲＳを含む翻訳系。
【請求項２４】
４塩基セレクターコドンがＡＧＧＡである請求項２３に記載の翻訳系。
【請求項２５】
終止コドンがＵＡＧである請求項２３に記載の翻訳系。
【請求項２６】
翻訳系が細胞を含む請求項２３に記載の翻訳系。
【請求項２７】
第１又は第２のＯ−ｔＲＮＡが直交リシルｔＲＮＡ（リシルＯ−ｔＲＮＡ）又はその修飾変異体である請求項２３に記載の翻訳系。
【請求項２８】
第１のＯ−ｔＲＮＡが直交リシルｔＲＮＡ（リシルＯ−ｔＲＮＡ）又はその修飾変異体であり、第２のＯ−ｔＲＮＡが直交チロシルｔＲＮＡ（チロシルＯ−ｔＲＮＡ）又はその修飾変異体である請求項２３に記載の翻訳系。
【請求項２９】
少なくとも４塩基セレクターコドンと終止セレクターコドンを含む核酸を更に含む請求項２３に記載の翻訳系。
【請求項３０】
４塩基セレクターコドンがＡＧＧＡであり、終止セレクターコドンがＴＡＧ又はＵＡＧである請求項２９に記載の翻訳系。
【請求項３１】
核酸が発現されたＲＮＡである請求項２９に記載の翻訳系。
【請求項３２】
翻訳系が核酸によりコードされる蛋白質を含み、前記蛋白質が少なくとも２種の異なる非天然アミノ酸を含む請求項２９に記載の翻訳系。
【請求項３３】
蛋白質がホモグルタミンを含む請求項３２に記載の翻訳系。
【請求項３４】
蛋白質がミオグロビンに相同である請求項３２に記載の翻訳系。
【請求項３５】
ホモグルタミンを含む請求項２３に記載の翻訳系。
【請求項３６】
ＰｈＫＲＳ、Ｅ４４４Ｇ、ＰｈΔＡＤ、ＰｈΔＡＤのＩ４１及び／又はＳ２６８突然変異体、又はその保存変異体を含む組成物。
【請求項３７】
ＰｈＫＲＳ、Ｅ４４４Ｇ、ＰｈΔＡＤ、ＰｈΔＡＤのＩ４１及び／又はＳ２６８突然変異体、又はその保存変異体をコードする核酸。
【請求項３８】
配列番号２４もしくは配列番号２６又はその保存変異体に対応するｔＲＮＡを含むか又はコードする核酸。
【請求項３９】
直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含み、前記Ｏ−ＲＳがＯ−ｔＲＮＡをホモグルタミンで優先的にアミノアシル化する組成物。
【請求項４０】
Ｏ−ＲＳがＰｈΔＡＤのＩ４１及び／又はＳ２６８突然変異体、又はその保存変異体を含む請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
Ｏ−ＲＳがＰｈΔＡＤのＩ４１及び／又はＳ２６８突然変異体の効率の少なくとも５０％の効率でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する請求項３９に記載の組成物。
【請求項４２】
Ｏ−ＲＳがＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉに由来する請求項３９に記載の組成物。
【請求項４３】
Ｏ−ｔＲＮＡを含み、前記Ｏ−ｔＲＮＡが４塩基セレクターコドンを認識する請求項３９に記載の組成物。
【請求項４４】
４塩基セレクターコドンがＡＧＧＡ配列を含む請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
細胞を含み、Ｏ−ＲＳが前記細胞において１種以上の核酸によりコードされる請求項３９に記載の組成物。
【請求項４６】
細胞が大腸菌細胞である請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
翻訳系を含む請求項３９に記載の組成物。
【請求項４８】
細胞を含み、Ｏ−ＲＳが前記細胞において１種以上の核酸によりコードされ、前記細胞が更に、
直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；
ホモグルタミンを含み；
Ｏ−ｔＲＮＡが第１のセレクターコドンを認識し、Ｏ−ＲＳがＯ−ｔＲＮＡを第１のホモグルタミンで優先的にアミノアシル化する請求項３９に記載の組成物。
【請求項４９】
細胞が該当ポリペプチドをコードするターゲット核酸を含み、ターゲット核酸がＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含む請求項４８に記載の組成物。
【請求項５０】
Ｏ−ｔＲＮＡが配列番号２４もしくは配列番号２６に記載のポリヌクレオチド配列又はその相補的ポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされ、Ｏ−ＲＳがＥ４４４Ｇ、ＰｈΔＡＤ、ＰｈΔＡＤのＩ４１及び／又はＳ２６８突然変異体、又はその保存変異体に対応するアミノ酸配列を含む請求項４８に記載の組成物。
【請求項５１】
Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡがＥ４４４Ｇ、ＰｈΔＡＤ、又はＰｈΔＡＤのＩ４１及び／又はＳ２６８突然変異体を配列番号２４又は配列番号２６のＯ−ｔＲＮＡと併用する場合の少なくとも５０％の効率で終止又はフレームシフトセレクターコドンを抑圧する請求項４８に記載の組成物。
【請求項５２】
細胞が大腸菌細胞である請求項４８に記載の組成物。
【請求項５３】
細胞が異なる付加Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対と異なる付加非天然アミノ酸を更に含み、Ｏ−ｔＲＮＡが第２のセレクターコドンを認識し、Ｏ−ＲＳがＯ−ｔＲＮＡを第２の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する請求項４８に記載の組成物。
【請求項５４】
細胞が第１及び第２のセレクターコドンを含むターゲット核酸を含む請求項５３に記載の組成物。
【請求項５５】
細胞がターゲット核酸によりコードされる蛋白質を含み、前記蛋白質が少なくとも２種の異なる非天然アミノ酸を含む請求項５４に記載の組成物。
【請求項５６】
蛋白質を含有する組成物であって、前記蛋白質がホモグルタミンを含む前記組成物。
【請求項５７】
蛋白質が野生型治療用蛋白質、診断用蛋白質、産業用酵素、又はその部分のアミノ酸配列に少なくとも７５％一致するアミノ酸配列を含む請求項５６に記載の組成物。
【請求項５８】
組成物が医薬的に許容可能なキャリヤーを含有する請求項５６に記載の組成物。
【請求項５９】
ホモグルタミンを直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）に負荷する活性直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）の選択方法であって、
１）Ｏ−ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡはＯ−ｔＲＮＡを含む細胞集団のメンバーに直交性である）と；
２）集団の１個以上の細胞においてＯ−ｔＲＮＡにホモグルタミンを負荷する１個以上の活性Ｏ−ＲＳメンバーを含む複数のＯ−ＲＳと；
３）選択マーカーをコードし、Ｏ−ｔＲＮＡにより認識される少なくとも１個のセレクターコドンを含むポリヌクレオチドと；
４）ホモグルタミン
を併有する細胞集団に選択を実施し、複数のＲＳを含まず且つＯ−ｔＲＮＡを含む対照細胞の抑圧効率に比較して選択マーカーの抑圧効率の増加により活性Ｏ−ＲＳを含むターゲット細胞を集団から同定する段階と；
ターゲット細胞を選択することにより、活性Ｏ−ＲＳを選択する段階を含む前記方法。
【請求項６０】
Ｏ−ｔＲＮＡにホモグルタミン以外のアミノ酸を負荷する非ターゲットＯ−ＲＳを含む細胞を排除するように細胞を更に選択する請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
選択がポジティブ選択を含み、選択マーカーがポジティブ選択マーカーを含む請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
複数のＲＳが突然変異体ＲＳ、第１の種以外の１種以上の種に由来するＲＳ、又は突然変異体ＲＳと第１の種以外の種に由来するＲＳの両者を含む請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
請求項５９に記載の方法により同定された直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ。
【請求項６４】
特定位置にホモグルタミンを組込んだ蛋白質を細胞で生産する方法であって、
少なくとも１個のセレクターコドンを含み、蛋白質をコードする核酸を含む細胞を適当な培地で増殖させる段階と；
ホモグルタミンを提供する段階を含み；
前記細胞が更に、
セレクターコドンを認識する直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；
Ｏ−ｔＲＮＡをホモグルタミンで優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含み；
更に、セレクターコドンに応答してホモグルタミンを特定位置に組込むことにより、蛋白質を生産する段階を含む前記方法。
【請求項６５】
Ｏ−ＲＳがＥ４４４Ｇ、ＰｈΔＡＤ、ＰｈΔＡＤのＩ４１及び／又はＳ２６８突然変異体、又はその保存変異体に対応するアミノ酸配列を含む請求項６４に記載の方法。
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図８】
【図９】
【図３】
【図４】
【図５】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２００７−５２９９９８（Ｐ２００７−５２９９９８Ａ）
【公表日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１８９５２（Ｐ２００６−５１８９５２）
【出願日】平成１６年７月７日（２００４．７．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２２１８７
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１９４１５
【国際公開日】平成１７年３月３日（２００５．３．３）
【出願人】（５９３０５２７８５）ザ スクリップス リサーチ インスティテュート (91)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年７月７日（２００４．７．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２２１８７
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１９４１５
【国際公開日】平成１７年３月３日（２００５．３．３）
【出願人】（５９３０５２７８５）ザ スクリップス リサーチ インスティテュート (91)
【Ｆターム（参考）】
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