神経幹細胞の分化およびその治療用途
【課題】本発明は、インビトロまたはインビボにて、神経系細胞（ニューロンまたはグリア細胞を含む）を選択的に産生する方法を提供する。また、神経系細胞を産生することによって神経変性疾患または病状を処置または緩和させる方法を提供する。
【解決手段】神経前駆細胞またはグリア前駆細胞を産生するために、種々の因子の組み合わせを、２つの工程：神経幹細胞の数を増加させる工程、およびニューロンまたはグリア細胞に選択的になるように神経幹細胞を指示する工程を達成するために用いる。また、神経変性疾患または病状を処置または緩和するために、（ａ）神経幹細胞の数を増加させ得る該因子を哺乳動物に投与し；および（ｂ）限定された系統の細胞の産生を促進する条件下に、この哺乳動物を供し；これによって限定された系統の細胞の産生を促進させる。
【解決手段】神経前駆細胞またはグリア前駆細胞を産生するために、種々の因子の組み合わせを、２つの工程：神経幹細胞の数を増加させる工程、およびニューロンまたはグリア細胞に選択的になるように神経幹細胞を指示する工程を達成するために用いる。また、神経変性疾患または病状を処置または緩和するために、（ａ）神経幹細胞の数を増加させ得る該因子を哺乳動物に投与し；および（ｂ）限定された系統の細胞の産生を促進する条件下に、この哺乳動物を供し；これによって限定された系統の細胞の産生を促進させる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、インビトロまたはインビボにて、神経系細胞（ｎｅｕｒａｌ ｃｅｌｌ）（例えば、ニューロンまたはグリア細胞）を選択的に産生する方法に関する。また、神経系細胞を産生することによって神経変性疾患または病状を処置または緩和させる方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
近年、神経変性疾患は、これらの障害に関する多大な危険のある高齢者の増加に起因して、重大な懸念となっている。神経変性疾患としては、中枢神経系（ＣＮＳ）の特定部位における神経系細胞の変性に関連している疾患が挙げられ、意図された機能を実行するこれらの細胞の能力を不能にする。これらの疾患としては、アルツハイマー病、多発性硬化症（ＭＳ）、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、およびパーキンソン病が挙げられる。さらに、おそらく（罹患した人の数に対する）ＣＮＳ機能不全の最大領域は、神経系細胞の欠損によってではなく、存在する神経系細胞の異常な機能によって特徴付けられている。これは、ニューロンの不適切な興奮、または神経伝達物質の異常な合成、放出、およびプロセシングに起因し得る。これらの機能不全は、うつ病および癲癇のような十分に研究され特徴付けられた障害、または壊死および精神病のようなあまり理解されていない障害の結果であり得る。さらに、脳損傷は、しばしば、神経系細胞の欠損、罹患した脳の部位の不適切な機能、およびその結果の行動異常を生じる。
【０００３】
従って、神経変性疾患または神経変性状態を処置するために、変性したニューロン／グリア細胞または欠損したニューロン／グリア細胞を補償するように脳に神経系細胞を供給することが望ましい。この目標のための１つのアプローチは、患者の脳に神経系細胞を移植することである。このアプローチは、好ましくは、対移植片性宿主拒絶（ｈｏｓｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｇｒａｆｔ−ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）もしくは対宿主性移植片拒絶が最小になり得るように、同じ個体または非常に関連する個体に由来する神経系細胞の多量の供給源を必要とする。１人の人物から多量のニューロンまたはグリア細胞を取り出し、別の人物に移植することは現実的ではないので、多量の神経系細胞を培養する方法が、このアプローチの成功には必須である。
【０００４】
別のアプローチは、欠損または変性した細胞を補償するために、インサイチュで神経系細胞の産生を誘導することである。このアプローチは、脳（特に生体の脳）において神経系細胞を産生することが可能であるか否か、およびその方法についての広い知識を必要とする。
【０００５】
多能性神経幹細胞の単離およびインビトロ培養についての技術（例えば、米国特許第５，７５０，３７６号；同第５，９８０，８８５号；同第５，８５１，８３２号を参照のこと）の開発は、両方のアプローチの見込みを非常に増大させた。胎児の脳は、インビトロにて多能性神経幹細胞を単離し、そして培養するために用いられ得ることが発見された。さらに、対照的に、生体の脳細胞は、脳細胞を複製または再生できないと長い間考えられてきたが、神経幹細胞は、生体の哺乳動物の脳からも単離され得ることが発見された。胎児または生体の脳のいずれかに由来するこれらの幹細胞は、自己複製し得る。子孫細胞は、再び増殖し得るか、または神経系の細胞系統（ニューロン、アストロサイトおよびオリゴデンドロサイトを含む）の任意の細胞に分化し得る。それゆえ、これらの知見は、移植に用いられ得る神経系細胞の供給源を提供するだけでなく、成体脳における多能性神経幹細胞の存在およびインサイチュにおいてこれらの幹細胞からニューロンまたはグリア細胞を産生する能力もまた、実証する。
【０００６】
（参考文献）
【数１】
【数２】
【０００７】
【数３】
【０００８】
本明細書において上または他の部分に引用される刊行物、特許および特許出願の全ては、各個々の刊行物、特許または特許出願の開示がその全体において参考として援用されることが具体的にかつ別個に示されるのと同じ程度まで、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、以下の２つの目的のために、神経幹細胞を効果的に増殖させるための方法を開発することが望ましい：移植治療に用いられ得る、より多くの幹細胞および神経系細胞を得ること、ならびにインサイチュでより多くの幹細胞を産生するために用いられ得る方法を同定すること。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は、インビトロまたはインビボで神経系細胞を産生する２工程の方法に関する。本発明者らは、多能性神経幹細胞（ＮＳＣ）による神経新生およびグリア新生が、増殖および方向付けられた分化に関わることを発見した。図１に示されるように、ＥＧＦ（すなわち、ＥＧＦの成体ホモログのＴＧＦα）は、ＮＳＣ集団の自己複製／増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）を誘導する。ＮＳＣは、グリア前駆細胞（ＧＰＣ）になる規定の経路において自然発生的な分化を起こす。この自然発生的な分化は、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）によって減弱され得る。ＧＰＣは、グリア細胞に分化する（この分化は、ＥＧＦによって促進される）。あるいは、ＮＳＣは、ニューロンだけを産生する神経前駆細胞（ＮＰＣ）に分化するように、ＥＰＯおよび／またはＰＡＣＡＰ／ｃＡＭＰによって指示を受け得る。
【００１１】
従って、以下の２工程プロセスは、ニューロンまたはグリア細胞を産生するために使用され得る：（１）ＮＳＣの数を増加させる工程；および（２）ニューロンまたはグリア細胞の産生を選択的に促進する適切な条件にＮＳＣを供することによって、ニューロンまたはグリア細胞のいずれかにＮＳＣの分化を促進させる工程。
【００１２】
従って、本発明の１つの局面は、神経前駆細胞またはグリア前駆細胞を産生する方法を提供し、この方法は、以下：
（ａ）少なくとも１つの神経幹細胞を提供する工程；
（ｂ）該神経幹細胞を、プロラクチン、成長ホルモン、エストロゲン、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、形質転換成長因子α（ＴＧＦα）および上皮成長因子（ＥＧＦ）からなる群より選択される因子の、該神経幹細胞の数を増加させるのに十分な量
と接触させる工程；および
（ｃ）工程（ｂ）からの該神経幹細胞を、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＰＡＣＡＰ、プロラクチン、セロトニン、骨形成因子（ＢＭＰ）およびｃＡＭＰからなる群より選択される因子の、該神経幹細胞から神経前駆細胞またはグリア前駆細胞の産生を促進させるのに十分な量と接触させる工程；
を包含する方法であって、
但し、工程（ｂ）の因子がＥＧＦまたはＦＧＦである場合、工程（ｃ）の因子はＰＡＣＡＰまたはプロラクチンである。
【００１３】
従って、工程（ｂ）は、神経幹細胞の数を増加させるために実施され、この工程は、以下の少なくとも１つによって達成され得る：
（ｉ）例えば、ＥＧＦを提供することによって、神経幹細胞の増殖を増大させる工程；
（ｉｉ）例えば、ＣＮＴＦを提供することによって、神経幹細胞の自然発生的な分化を阻害する工程；または
（ｉｉｉ）例えば、エストロゲンを提供することによって、神経幹細胞の生存を促進する工程。
【００１４】
これらの２工程（ＮＳＣ数を増加させる工程およびニューロンまたはグリアの産生を促進する工程）は、連続してか、または同時に実施され得る。工程（ｂ）は工程（ｃ）の前に実施されることが好ましい。
【００１５】
これらの因子は、当該分野において確立された任意の方法によって提供され得る。例えば、血管内投与、髄腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与、局所的投与、経口的投与、直腸内投与、膣内投与、鼻腔内投与、吸入投与され得るか、または脳内に投与され得る。この投与は、好ましくは、全身的に、特に皮下投与によって実施される。これらの因子はまた、哺乳動物において内因性因子の量を増大させ得るのに有効な量を、哺乳動物に投与することによって提供され得る。例えば、哺乳動物におけるプロラクチンのレベルは、プロラクチン放出ペプチドを使用することによって増加され得る。
【００１６】
これらの因子が脳内に直接的に送達されない場合、血液脳関門透過剤は、必要に応じて、脳への侵入を促進するために含まれ得る。血液脳関門透過剤は、当該分野で公知であり、そしてこれらとしては、例えば、ブラジキニンおよびブラジキニンアゴニスト（米国特許第５，６８６，４１６号；同第５，５０６，２０６号および同第５，２６８，１６４号（例えば、ＮＨ２−アルギニン−プロリン−ヒドロキシプロキシプロリン−グリシン−チエニルアラニン−セリン−プロリン−４−Ｍｅ−チロシンΨ（ＣＨ２ＮＨ）−アルギニン−ＣＯＯＨ）に記載される）が挙げられる。あるいは、これらの因子は、トランスフェリンレセプター抗体（例えば、米国特許第６，３２９，５０８号；同第６，０１５，５５５号；同第５，８３３，９８８号または同第５，５２７，５２７号に記載される）に結合され得る。これらの因子はまた、トランスフェリンレセプターのような脳毛細管内皮細胞レセプター（例えば、米国特許第５，９７７，３０７号を参照のこと）と反応性である、因子およびリガンドを含む融合タンパク質として送達され得る。
【００１７】
全年齢の哺乳動物は、この方法に供され得るが、哺乳動物は胚でないことが、好ましい。より好ましくは、哺乳動物は成体である。
【００１８】
哺乳動物は、神経変性疾患または神経変性状態に罹患しているか、あるいはこれらを有すると疑われ得る。この疾患または状態は、脳の外科手術によって引き起こされる発作または損傷のような脳損傷であり得る。神経幹細胞の数が非常に減少することに関連する疾患または状態は、加齢であり得る。この疾患または状態はまた、神経変性疾患、特にアルツハイマー病、多発性硬化症、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、およびパーキンソン病であり得る。
【００１９】
あるいは、神経幹細胞は、インビトロでの培養物として存在し得る。この細胞は、任意の年齢の哺乳動物由来であり得る。好ましくは、この動物は、胚ではなく、そして最も好ましくは、この動物は成体である。
【００２０】
本発明の別の局面は、神経変性疾患または病状を処置または緩和するための方法を提供し、この方法は、（ａ）神経幹細胞の数を増加させ得る因子を哺乳動物に投与する工程；および（ｂ）限定された系統の細胞の産生を促進する条件下に、この哺乳動物を供し；これによって限定された系統の細胞の産生を促進させる、工程を包含する。例えば、ニューロンは、ＥＧＦおよびＥＰＯを投与することによって、欠損したニューロンまたは機能不全のニューロンを補償するように産生され得る。ＮＳＣの数を増加させ得る他の因子（例えば、ＣＮＴＦ、ＦＧＦ、プロラクチン、成長ホルモン、ＩＧＦ−１、ＰＡＣＡＰまたはエストロゲン）もまた、ＥＧＦの代わりに使用されるか、またはＥＧＦに加えて使用され得る。同様に、ニューロン産生を促進し得る他の因子（例えば、ＰＡＣＡＰまたはｃＡＭＰレベルを高める因子）が、ＥＰＯの代わりに使用され得るか、またはＥＰＯに加えて用いられ得る。
【００２１】
欠損したグリア細胞または機能不全のグリア細胞を補償するようにグリア細胞を産生するためにＥＧＦが投与され得、このＥＧＦはＮＳＣ増殖を刺激し、その結果、ＮＳＣは規定によってグリア細胞に分化する。必要に応じて、神経経路のインヒビター（例えば、ＥＰＯの抗体およびｃＡＭＰシグナル伝達インヒビター）は、グリア産生を促進するために使用され得る。好ましくは、グリア形成を促進する因子（例えば、ＢＭＰ）はまた、グリア細胞をさらに産生するために使用される。
【００２２】
（発明の詳細な説明）
本発明は、インビトロまたはインビボで神経系細胞（ニューロンまたはグリア細胞を含む）を選択的に産生する方法に関する。また、神経系細胞を産生することによって神経変性疾患または病状を処置または緩和させる方法を提供する。従って、因子の組み合わせが、以下の２つの工程を達成するための使用される：神経幹細胞の数を増加させる工程およびニューロンまたはグリア細胞に選択的になるように、神経幹細胞に指示する工程。
【００２３】
本発明をさらに詳細に記載する前に、本明細書中において使用される用語は、別の指示がない限り、以下のように定義される。
【００２４】
（定義）
「神経幹細胞」は、神経系の細胞系統における幹細胞である。幹細胞は、自己再生し得る細胞である。言い換えると、幹細胞の分割から生じた娘細胞は幹細胞を含む。神経幹細胞は、神経系の細胞系統（ニューロン、アストロサイトおよびオリゴデンドロサイト（アストロサイロトおよびオリゴデンドロサイトは、グリアまたはグリア細胞の総称である）を含む）にける全ての細胞型に最終的に分化し得る。従って、本明細書中で言及される神経幹細胞は、多能性の神経幹細胞である。
【００２５】
「ニューロスフェア（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ）」は、クローンに増殖した結果として単一の神経幹細胞から誘導された細胞の群である。「初代ニューロスフェア」は、神経幹細胞を含む初代培養脳組織のプレーティングによって生成されるニューロスフェアをいう。ニューロスフェアを形成する神経幹細胞の培養方法は、例えば、米国特許第５，７５０，３７６号に記載されている。「二代目のニューロスフェア」は、初代ニューロスフェアをバラバラにすることによって生じ、そして個々のバラバラにした細胞がニューロスフェアを再び形成することを可能にするニューロスフェアをいう。
【００２６】
「神経系細胞（ｎｅｕｒａｌ ｃｅｌｌ）」は、神経系の系統の任意の細胞である。好ましくは、神経系細胞は、ニューロンまたはグリア細胞である。
【００２７】
ネイティブな因子と「実質的な配列の類似性」を共有するポリペプチドは、ネイティブ因子とアミノ酸レベルで、少なくとも約３０％同一である。このポリペプチドは、ネイティブ因子とアミノ酸レベルで、好ましくは少なくとも約４０％、より好ましくは少なくとも約６０％、さらにより好ましくは少なくとも約７０％、そして最も好ましくは少なくとも約８０％同一である。
【００２８】
句、ネイティブ因子とアナログまたは改変体の「パーセント同一性」または「％同一性」は、２つの配列が整列した場合に、アナログまたは改変体にもまた見出される、ネイティブ因子のアミノ酸配列の割合をいう。パーセント同一性は、当該分野において確立された任意の方法またはアルゴリズム（例えば、ＬＡＬＩＧＮまたはＢＬＡＳＴ）によって決定され得る。
【００２９】
ポリペプチドは、ネイティブ因子に対するレセプターに結合され得るか、またはネイティブ因子に対して惹起されたポリクローナル抗体によって認識され得る場合に、ネイティブ因子の「生物学的活性」を有する。好ましくは、このポリペプチドは、レセプター結合アッセイにおいて、ネイティブ因子に対するレセプターに特異的に結合し得る。
【００３０】
ネイティブ因子の「機能的アゴニスト」は、ネイティブ因子のレセプターに結合し、活性化する化合物であるが、ネイティブ因子と実質的な配列類似性を共有することは必須ではない。
【００３１】
「プロラクチン」は、（１）ネイティブな哺乳動物プロラクチン、好ましくはネイティブなヒトプロラクチン（下垂体で主に合成される１９９アミノ酸のポリペプチド）と実質的な配列類似性を共有し；（２）ネイティブな哺乳動物のプロラクチンの生物学的活性を有する、ポリペプチドである。従って、用語「プロラクチン」は、ネイティブプロラクチンの欠失改変体、挿入改変体または置換改変体であるプロラクチンアナログを含む。さらに、用語「プロラクチン」は、他の種に由来するプロラクチンおよびその天然に存在する改変体を含む。さらに、用語「プロラクチン」は、他の種および天然に存在するそれらの改変体由来のプロラクチンを含む。
【００３２】
さらに、「プロラクチン」はまた、ネイティブな哺乳動物プロラクチンレセプターの機能的アゴニストであり得る。例えば、機能的アゴニストは、以下であり得る：プロラクチンレセプターについての米国特許第６，３３３，０３１号に開示された活性化アミノ酸配列；プロラクチンレセプターに対するアゴニスト活性を有する金属錯体レセプターリガンド（米国特許第６，４１３，９５２号）；Ｇ１２０ＲｈＧＨ（これは、ヒト成長ホルモンのアナログであるが、プロラクチンアゴニストとして作用する）（Ｍｏｄｅら、１９９６）；または米国特許第５，５０６，１０７号および同第５，８３７，４６０号に記載されるようなプロラクチンレセプターに対するリガンド。
【００３３】
「ＥＧＦ」は、ネイティブなＥＧＦまたは任意のＥＧＦのアナログもしくは改変体を意味し、このアナログまたは改変体は、ネイティブなＥＧＦと実質的なアミノ酸類配列似性を共有し、そして少なくとも１つ、ネイティブＥＧＦの有する生物学的活性（例えば、ＥＧＦレセプターへの結合）を共有する。特に、ＥＧＦとしては、任意の種のネイティブＥＧＦ、ＴＧＦα、または組換え改変ＥＧＦが挙げられる。特定の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：２つのＣ末端アミノ酸の欠失および５１位での１つの中性アミノ酸置換を有する組換え改変ＥＧＦ（特に、ＥＧＦ５１ｇｌｎ５１；米国特許出願公開番号２００２００９８１７８Ａ１）、１６位のＨｉｓ残基が中性アミノ酸または酸性アミノ酸で置換されている、ＥＧＦムテイン（ＥＧＦ−Ｘ１６）（米国特許第６，１９１，１０６号）、ネイティブＥＧＦのアミノ末端残基を欠く、ＥＧＦの５２アミノ酸欠失改変体（ＥＧＦ−Ｄ）、Ｎ末端残基ならびに２つのＣ末端残基（Ａｒｇ−Ｌｅｕ）が欠失された、ＥＧＦ欠失改変体（ＥＧＦ−Ｂ）、２１位のＭｅｔ残基が酸化されているＥＧＦ−Ｄ（ＥＧＦ−Ｃ）、２１位のＭｅｔ残基が酸化されているＥＧＦ−Ｂ（ＥＧＦ−Ａ）、ヘパリン−結合ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、βセルリン、アンフィレグリン（ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）、ニューレグリン（ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ）、または上記のいずれかを含む融合タンパク質。他の有用なＥＧＦのアナログまたは改変体は、米国特許出願番号２００２００９８１７８Ａ１、ならびに米国特許第６，１９１，１０６号および同第５，５４７，９３５号に記載されている。
【００３４】
さらに、「ＥＧＦ」はまた、ネイティブの哺乳動物ＥＧＦレセプターの機能性アゴニストであり得る。例えば、機能性アゴニストは、ＥＧＦレセプターの活性化アミノ酸配列（米国特許第６，３３３，０３１号に開示される）、またはＥＧＦレセプターに対してアゴニスト活性を有する抗体（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｐｏｌ、１９８５および米国特許第５，７２３，１１５号）であり得る。
【００３５】
「ＰＡＣＡＰ」は、ネイティブＰＡＣＡＰ、あるいはネイティブＰＡＣＡＰと実質的なアミノ酸配列類似性を共有する任意のＰＡＣＡＰアナログまたは改変体、ならびにネイティブＰＡＣＡＰへの少なくとも１つの生物学的活性（例えば、ＰＡＣＡＰレセプターへの結合）を共有する任意のＰＡＣＡＰアナログまたは改変体を意味する。有用なＰＡＣＡＰアナログおよび改変体としては、以下に限定されないが、ＰＡＣＡＰの３８アミノ酸改変体および２７アミノ酸改変体（それぞれ、ＰＡＣＡＰ３８およびＰＡＣＡＰ２７）、そして例えば、米国特許第５，１２８，２４２号；同第５，１９８，５４２号；同第５，２０８，３２０号；同第５，３２６，８６０号；同第５，６２３，０５０号；同第５，８０１，１４７号；ならびに同第６，２４２，５６３号に開示されるアナログおよび改変体が挙げられる。
【００３６】
さらに、「ＰＡＣＡＰ」はまた、ネイティブの哺乳動物ＰＡＣＡＰレセプターの機能性アゴニストであり得る。例えば、機能性アゴニストは、マキサディラン（ｍａｘａｄｉｌａｎ）（ＰＡＣＡＰ１型レセプターの特異的アゴニストとして作用するポリペプチド）（Ｍｏｒｏら、１９９７）であり得る。
【００３７】
「エリスロポエチン（ＥＰＯ）」とは、ネイティブＥＰＯ、あるいはネイティブＥＰＯと実質的なアミノ酸配列類似性を共有する任意のＥＰＯアナログまたは改変体、ならびにネイティブＥＰＯへの少なくとも１つの生物学的活性（例えば、ＥＰＯレセプターへの結合）を共有する任意のＥＰＯアナログまたは改変体を意味する。エリスロポエチンアナログおよび改変体は、例えば、米国特許第６，０４８，９７１号および同第５，６１４，１８４号に開示される。
【００３８】
さらに、「ＥＰＯ」はまた、ネイティブの哺乳動物ＥＰＯレセプターの機能性アゴニストであり得る。例えば、機能性アゴニストは以下のものであり得る：ＥＭＰ１（ＥＰＯ擬態ペプチド１、Ｊｏｈｎｓｏｎら、２０００）；ＥＰＯの短いペプチド擬態の１つ（Ｗｒｉｇｈｔｏｎら、１９９６および米国特許第５，７７３，５６９号に記載される）；任意の低分子ＥＰＯ擬態（Ｋａｕｓｈａｎｓｋｙ、２００１に開示される）；ＥＰＯレセプターを活性化する抗体（米国特許第５，８８５，５７４号、ＷＯ９６／４０２３１、ＷＯ９７／４８７２９、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｐｏｌ、１９８５または米国特許第５，７２３，１１５号に記載される）；活性化アミノ酸配列（米国特許第６，３３３，０３１号にＥＰＯレセプターについて開示される）；ＥＰＯレセプターに対してアゴニスト活性を有する金属錯体化レセプターリガンド（米国特許第６，４１３，９５２号）；またはＥＰＯレセプターに対するリガンド（米国特許第５，５０６，１０７号および同第５，８３７，４６０号に記載される）。
【００３９】
細胞型の形成の「増強」または「促進」は、その細胞型の数が増加することを意味する。従って、ある因子の存在下におけるニューロン数が、その因子の不存下におけるニューロン数より大きい場合に、その因子は、ニューロン形成を増強するために使用され得る。その因子の不存下におけるニューロン数は、０以上であり得る。
【００４０】
「神経変性疾患または神経変性状態」としては、ニューロン欠損またはニューロン機能不全に関連する疾患または医学的状態である。神経変性疾患または神経変性状態の例としては、神経変性疾患、脳損傷またはＣＮＳ機能不全が挙げられる。神経変性疾患としては、例えば、以下のものが挙げられる：アルツハイマー病、多発性硬化症（ＭＳ）、黄斑変性、緑内障、糖尿病性網膜症、末梢神経障害、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、およびパーキンソン病。脳損傷としては、例えば、以下が挙げられる；発作（例えば、出血性発作、局所性の虚血性発作または全体的な虚血性発作）；および外傷性脳損傷（例えば、脳外科手術または物理的な事故により引き起こされる損傷）。ＣＮＳ機能不全としては、例えば、うつ病、てんかん、神経症および精神病が挙げられる。
【００４１】
「治療または改善」とは、疾患または医学的状態の症状の軽減あるいは完全な除去を意味する。
【００４２】
「神経変性疾患または神経変性状態を有すること疑われる」哺乳動物とは、神経変性疾患または神経変性状態と正式には診断されないが、神経変性疾患または神経変性状態の症状を示す哺乳動物であり、家族歴または遺伝素因に起因して神経変性疾患または神経変性状態と疑われるか、または、以前に神経変性疾患または神経変性状態を有しており、そして再発の危険にさらされている哺乳動物である。
【００４３】
哺乳動物への組成物の「移植」は、当該分野において確立された任意の方法によって、哺乳動物の身体内へ組成物を導入することをいう。導入される組成物は「移植片」であり、哺乳動物は「レシピエント」である。移植片およびレシピエントは、同系、同種異系、または異種であり得る。好ましくは、移植は、自己移植である。
【００４４】
「有効な量」は、意図する目的を達成するために十分な治療剤の量である。例えば、神経幹細胞の数を増加させるための因子の有効な量は、インビボまたはインビトロのいずれの場合もあり得るが、神経幹細胞数の増加という結果を生じさせるために十分な量である。神経変性疾患または神経変性状態を処置または改善するための組成物の有効な量は、神経変性疾患または神経変性状態の症状を軽減または取り除くのに十分な組成物の量である。所定の治療剤の有効な量は、因子（例えば、薬剤の性質、投与経路、治療剤を受ける動物のサイズおよび種、ならびに投与の目的）によって変化する。各個々の症例における有効な量は、当該分野において確立された方法に従って、当業者によって経験的に決定され得る。
【００４５】
（方法）
神経幹細胞（ＮＳＣ）（例えば、成体前脳において見出される神経幹細胞）は、限定された神経系前駆体およびグリア前駆体の供給源である可能性が高く、これらは、それぞれ例えば、嗅球および脳梁といった構造中に存在する。ＮＳＣが限定された前駆体を生じる機構は、本発明以前には不明である。
【００４６】
本発明者らは、ＥＧＦ応答性ＮＳＣが、グリア系列に徐々に限定されるようになることを見出した。このプロセスは、多分化能段階においてＮＳＣを維持するために、ｎｏｔｃｈ１を通じて作用するＣＮＴＦによって遮断される。本発明者らは、エリスロポエチン（ＥＰＯ）が、Ｍａｓｈ１を利用する機構を通じて、制限された神経前駆体の産生を指示することを見出した。
【００４７】
従って、本発明者らは、成体マウスの側脳室へ、ＣＮＴＦまたはＥＰＯのいずれかを６日間注入し、その後、本発明者らは、ＥＧＦ−応答性ＮＳＣの総数を調べるために、成体の上衣／上衣下を全て取り出したか、または、神経前駆体のインビボでの産生を試験した。ＣＮＴＦ注入により、ＮＳＣの数が２０〜２５％増加しており、このことは、グリア前駆体へのＮＳＣ分化を妨げることによるという可能性が最も高い。ＥＰＯ注入により、ＮＳＣの数が５０％減少し、そして、同時に神経前駆体倍加が生じた。抗ＥＰＯ抗体の注入により、ＮＳＣが２０％増加した。それゆえに、ＥＧＦ応答性ＮＳＣは、インビボで持続的にターンオーバーされ、その部分集団が、自発的に限定されたグリア前駆体へ分化し、一方、別の部分集団は、ＥＰＯによって限定された神経系列へと向う。
【００４８】
図１に、この機構が示される。従って、ＥＧＦ（またはその成体ホモログＴＧＦα）は、ＮＳＣ集団の自己再生／自己拡張を引き起こす。グリア細胞へと分化するグリア前駆細胞（ＧＰＣ）となる初期経路として、ＮＳＣは自発的な分化を受ける。この自発的な分化は、ＣＮＴＦによって減衰され得る。あるいは、ニューロンのみを産生する神経前駆細胞（ＮＰＣ）へと分化するように、ＮＳＣは、ＥＰＯおよび／またはＰＡＣＡＰ／ｃＡＭＰによって指示され得る。
【００４９】
この機構に基づいて、本発明者らは、神経系細胞を産生するための２段階の方法を開発した。第１の工程は、神経幹細胞の数を増加させることであり、それは、例えば、神経幹細胞を（例えば、ＥＧＦ、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＴＧＦα、エストロゲン、プロラクチン、ＰＡＣＡＰ、成長ホルモン、および／またはＩＧＦ−１によって）増殖させること、神経幹細胞の自発的な分化を（例えば、ＣＮＴＦによって）阻害すること、および／または神経幹細胞の生存を（例えば、エストロゲンによって）促進させることによって達成され得る。第２の工程は、神経幹細胞からの神経形成またはグリア形成を増強することである。例えば、エリスロポエチン、プロラクチン、セロトニン、ＰＡＣＡＰおよび／サイクリックＡＭＰが、ニューロン形成を増強させるために使用され得、一方、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）が、グリア形成の増強のために使用され得る。
【００５０】
本発明の方法は、インビボまたはインビトロで使用され得る。インビトロでは、本発明は、多数の神経系細胞を生じ、これは、研究または治療目的において使用され得る。特に、神経系細胞は、神経変性疾患または神経変性状態の移植処置において使用され得る。インビボでは、本発明の方法は、インサイチュで神経幹細胞の数を増加し得、そして神経幹細胞の拡大したプールからの神経形成またはグリア形成を増強し得る。生じた神経系細胞は、神経学的機能を増強するために、神経系において適切な位置へ移動し得るか、または、欠損もしくは機能不全の神経系細胞を補強し得る。さらに、インビボ適用およびインビトロ適用は、組み合わせ得る。従って、神経系細胞、特にインビトロで本発明の方法によって産生される神経幹細胞は、動物へ移植され得、そして、第２の工程の因子が、インビボで神経系細胞の分化を増強するために、動物へと提供され得る。必要に応じて、第１の工程の因子はまた、引き続いてニューロン細胞またはグリア細胞へと変換され得る神経幹細胞の数をさらに増加させるために、動物へと提供され得る。
【００５１】
１つの特に興味深い神経変性状態は、老化である。本発明者らは、脳室下帯における神経幹細胞の数が、老化したマウスにおいてはかなり減少していることを見出した。従って、本発明によって老化に関連する問題を改善することは、特に興味深いことである。
【００５２】
さらに、脳室下帯における神経幹細胞は、嗅覚ニューロンの供給源であり、そして、嗅覚機能不全は、前脳神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病およびハンチントン病）の特徴である。嗅球への神経系細胞移動の中断は、嗅覚識別の欠損へとつながり、新しい嗅覚の介在ニューロン（ｉｎｔｅｒｎｅｕｏｎ）の倍加は、新しい匂いの記憶を増強させる（Ｒｏｃｈｅｆｏｒｔら、２００２）。それゆえに、嗅覚識別または嗅覚記憶、ならびに嗅覚および嗅覚識別に関連する生理学的機能（例えば、交配、子孫認識および成育）を増強させるために、本発明は使用され得る。
【００５３】
本発明の別の特に重要な適用は、脳損傷（例えば、発作）の処置および／または改善である（実施例２）。発作を模倣する脳損傷を、ラットの運動野に導入し、そしてこの損傷されたラットは、その損傷の位置と相関する異常な行動を示した。次いで、これらのラットに７日間プロラクチンまたは成長ホルモン（これらは両方とも神経幹細胞増殖を増大し得る）を与えた。続いて、これらのラットにビヒクルコントロールまたはニューロン形成を増強するためのエリスロポエチンを７日間与えた。次いで、これらのラットを行動試験について一定期間観察し、そして解剖分析のために屠殺した。
【００５４】
この結果は、プロラクチン処置および成長ホルモン処置の両方が、損傷したラットにおける運動機能の改善をもたらしたことを示す。エリスロポエチンの追加は、特にプロラクチンと組合せた場合に、さらにこの効果を増強した。解剖分析はまた、移動するニューロンおよび／または神経幹細胞の数が、プロラクチンまたは成長ホルモンを含む処置毎に増加したことを示す。実際、プロラクチンおよびエリスロポエチンの組合せは、大部分のラットにおける脳損傷により生成された空隙の完全または部分的な充てんさえ生じた。従って、これらの因子（特に、これらの組合せ）を使用して、神経系細胞を産生し得、そして脳損傷を有する動物における神経学的機能を修復し得る。
【００５５】
興味深い知見は、プロラクチンおよび成長ホルモンが、異なる行動機能の修復をもたらしたことである。従って、これらのラットは、成長ホルモンを与えられた後のバランシングにおいて非対称的な前肢使用から回復し、一方、プロラクチンは、水泳の間の前肢の異常な位置付けを修正した。従って、異なる因子は、異なる神経機構に関与する、異なる細胞遊走パターンまたは異なる細胞の産生をもたらし得る。従って、複数の因子が、複雑な症状を有する疾患または状態の処置において組み合わされることが好ましい。好ましい組合せとしては、以下が挙げられる：
（ａ）プロラクチン、および神経分化またはグリア分化を増強する少なくとも１つの因子（例えば、ＥＰＯ、ＰＡＣＡＰ、サイクリックＡＭＰおよび／またはＢＭＰ）；
（ｂ）ＥＧＦ、および神経分化またはグリア分化を増強する少なくとも１つの因子（例えば、プロラクチン、ＥＰＯ、ＰＡＣＡＰ、サイクリックＡＭＰおよび／またはＢＭＰ、特に、プロラクチンおよび／またはＰＡＣＡＰ）；
（ｃ）プロラクチンと共に、神経幹細胞数を増加させる少なくとも１つの因子；
（ｄ）ＰＡＣＡＰと共に、神経幹細胞数を増加させる少なくとも１つの因子；
（ｅ）ＥＰＯと共に、神経幹細胞数を増加させる少なくとも１つの因子；ならびに
（ｆ）上記のものの組合せ。
【００５６】
特に好ましい組合せとしては、以下が挙げられる：ＥＧＦおよびＥＰＯ、ＥＧＦおよびプロラクチン、ＥＧＦおよびＰＡＣＡＰ、ＥＧＦおよび成長ホルモン（および／またはＩＧＦ−１）、ＥＧＦおよびプロラクチンおよび成長ホルモン（および／またはＩＧＦ−１）、ＥＧＦおよびプロラクチンおよびＰＡＣＡＰ、プロラクチンおよび成長ホルモン（および／またはＩＧＦ−１）、プロラクチンおよび成長ホルモン（および／またはＩＧＦ−１）およびＥＰＯ、プロラクチンおよびＰＡＣＡＰおよび成長ホルモン（および／またはＩＧＦ−１）。最も好ましい組合せとしては、ＥＧＦおよびＰＡＣＡＰ、ＥＧＦおよびプロラクチン、ならびにプロラクチンおよびＰＡＣＡＰが挙げられる。好ましくは、ＥＧＦは、使用されない。
【００５７】
（組成物）
本発明は、神経幹細胞数を増加し得る少なくとも１つの因子、および神経幹細胞の分化を増強し得る少なくとも１つの因子を含む組成物を提供する。いくつかの因子（例えば、プロラクチン）は、両方の機能が可能であることに留意すべきである。ＰＡＣＡＰはまた、神経分化を増強することに加えて、別のマイトジェンの存在下で神経幹細胞の増殖を増強する。
【００５８】
本発明において有用な因子には、ネイティブの因子と実質的な類似性および少なくとも１つの生物学的活性を共有するそれらのアナログおよび改変体が含まれる。例えば、下垂体において見出されるプロラクチンの主要な形態は、２３ｋＤａの分子量を有するが、プロラクチンの改変体は、多くの哺乳動物（ヒトを含む）において特徴付けられている。プロラクチン改変体は、一次転写物の選択的スプライシング、タンパク質分解切断、および他の翻訳後修飾から生じ得る。１３７アミノ酸のプロラクチン改変体は、下垂体前葉にあると記載されており、これは、選択的スプライシングの産物であるようである。プロラクチンの種々のタンパク質分解産物が特徴付けられており（特に、１４ｋＤａ、１６ｋＤａ、および２２ｋＤａのプロラクチン改変体）、これらの全ては、Ｃ末端で短縮されたプロラクチンフラグメントであるようである。プロラクチンについて報告された他の翻訳後修飾としては、二量体化、重合、リン酸化、グリコシル化、硫酸化、および脱アミド化が挙げられる。
【００５９】
本発明において有用なプロラクチンは、任意のプロラクチンアナログ、改変体または神経幹細胞数を増加し得るプロラクチン関連タンパク質を含む。プロラクチンアナログまたは改変体は、ネイティブヒトプロラクチンのアミノ酸配列の少なくとも約３０％を含むポリペプチドであり、これは、プロラクチンの生物学的活性を有する。好ましくは、プロラクチンの生物学的活性は、プロラクチンレセプターに結合する能力である。プロラクチンレセプターのいくつかのアイソフォームは、単離されているが（例えば、ラットにおける長い形態、中間の形態、および短い形態）、これらのアイソフォームは、プロラクチンに結合する同じ細胞外ドメインを共有する。従って、任意のレセプターアイソフォームを使用して、プロラクチン結合活性についてアッセイし得る。プロラクチンとしては、具体的に、以下が挙げられる：天然に存在するプロラクチン改変体、プロラクチン関連タンパク質、胎盤ラクトゲン、Ｓ１７９Ｄヒトプロラクチン（Ｂｅｒｎｉｃｈｔｅｉｎら、２００１）、種々の哺乳動物種（ヒト、他の霊長類、ラット、マウス、ヒツジ、ブタ、およびウシが揚げられるがこれらに限定されない）由来のプロラクチン、および米国特許第６，４２９，２８６号および同第５，９５５，３４６号に記載されるプロラクチン変異体。
【００６０】
同様に、ネイティブのＥＧＦに加えて、ＥＧＦアナログまたはＥＧＦ改変体もまた使用され得、これらは、ネイティブのＥＧＦと実質的なアミノ酸配列類似性を共有するべきであり、かつネイティブのＥＧＦと少なくとも１つの生物学的活性（例えば、ＥＧＦレセプターへの結合）を共有するべきである。ＥＧＦとして特に挙げられるものは、任意の主のネイティブＥＧＦ、ＴＧＦα、または組換え改変されたＥＧＦである。具体例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：２つのＣ末端アミノ酸の欠失および５１位において中性アミノ酸置換を有する組換え改変されたＥＧＦ（特にＥＧＦ５１ｇｌｎ５１；米国特許出願公開第２００２００９８１７８号Ａ１）、１６位のＨｉｓ残基が中性または酸性のアミノ酸で置き換えられているＥＧＦムテイン（ＥＧＦ−Ｘ１６）（米国特許第６，１９１，１０６号）、ネイティブＥＧＦのアミノ末端残基を欠く、ＥＧＦの５２−アミノ酸欠失変異体（ＥＧＦ−Ｄ）、Ｎ末端残基および２つのＣ末端残基（Ａｒｇ−Ｌｅｕ）が欠失されているＥＧＦ欠失変異体（ＥＧＦ−Ｂ）、２１位のＭｅｔ残基が酸化されているＥＧＦ−Ｄ（ＥＧＦ−Ｃ）、２１位のＭｅｔ残基が酸化されているＥＧＦ−Ｂ（ＥＧＦ−Ａ）、ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、βセルリン、アンフィレグリン（ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）、ニューレグリン（ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ）、または上記のうちのいずれかを含む融合タンパク質。他の有用なＥＧＦアナログまたは改変体は、米国特許出願公開第２００２００９８１７８号Ａ１、および米国特許第６，１９１，１０６号および同第５，５４７，９３５号に記載される。
【００６１】
別の例として、有用なＰＡＣＡＰアナログおよび改変体としては、限定することなく、ＰＡＣＡＰの３８アミノ酸改変体および２７アミノ酸改変体（それぞれ、ＰＡＣＡＰ３８およびＰＡＣＡＰ２７）、ならびに例えば、米国特許第５，１２８，２４２号；同第５，１９８，５４２号；同第５，２０８，３２０号；同第５，３２６，８６０号；同第５，６２３，０５０号；同第５，８０１，１４７号および同第６，２４２，５６３号に開示されるアナログおよび改変体が挙げられる。
【００６２】
エリスロポエチンアナログおよび改変体は、例えば、米国特許第６，０４８，９７１号および同第５，６１４，１８４号に開示される。
【００６３】
さらに、本発明において有用なプロラクチンの機能的アナログまたはさらなる因子が本発明において企図される。これらの機能的アゴニストは、ネイティブの因子のレセプターに結合しそして活性化するが、これらは、必ずしもネイティブの因子と実質的な配列類似性を共有する必要はない。例えば、ｍａｘａｄｉｌａｎは、ＰＡＣＡＰ１型レセプターの特異的アゴニストとして作用するポリペプチドである（Ｍｏｒｏら、１９９７）。
【００６４】
ＥＰＯの機能的アゴニストは、広く研究されている。ＥＭＰ１（ＥＰＯミメティックペプチド１）は、Ｊｏｈｎｓｏｎら、２０００に記載されるＥＰＯミメティックのうちの１つである。ＥＰＯの短いペプチドミメティックは、例えば、Ｗｒｉｇｈｔｏｎら、１９９６および米国特許第５，７７３，５６９号に記載される。低分子ＥＰＯミメティックは、例えば、Ｋａｕｓｈａｎｓｋｙ、２００１に開示される。ＥＰＯレセプターを活性化する抗体は、例えば、米国特許第５，８８５，５７４号；ＷＯ９６／４０２３１およびＷＯ９７／４８７２９に記載される。
【００６５】
ＥＧＦレセプターに対してアゴニスト活性を有する抗体は、例えば、Ｆｅｎａｎｄｅｚ−Ｐｏｌ，１９８５および米国特許第５，７２３，１１５号に記載される。さらに、ＥＰＯレセプター、ＥＧＦレセプター、プロラクチンレセプターおよび多くの他の細胞表面レセプターを活性化するアミノ酸配列もまた、米国特許第６，３３３，０３１号に開示される；プロラクチンレセプターおよびＥＰＯレセプターに対してアゴニスト活性を有する金属錯化レセプターリガンドは、米国特許第６，４１３，９５２号に見出され得る。レセプター（例えば、ＥＰＯレセプターおよびプロラクチンレセプター）に対するリガンドを同定および調製する他の方法は、例えば、米国特許第５，５０６，１０７号および同第５，８３７，４６０号に記載される。
【００６６】
各アナログ、改変体または機能的アゴニストの有効量が、ネイティブの因子または化合物についての有効量と異なり得ることに留意すべきであり、そして各々の場合における有効量は、本明細書中の開示に従って当業者により決定され得る。好ましくは、ネイティブの因子、またはそのネイティブの因子と実質的な配列類似性を共有するアナログおよび改変体は、本発明において使用される。
【００６７】
薬学的組成物もまた提供され、これは、上記の因子、および薬学的に受容可能な賦形剤および／またはキャリアを含む。
【００６８】
薬学的組成物は、以下のような当該分野で公知の任意の経路を介して送達され得る：非経口、髄腔内、脈管内、静脈内、筋内、経皮的、皮内、皮下、鼻腔内、局所的、経口、直腸、膣、肺または腹腔内。好ましくは、この組成物は、注射または灌流により中枢神経系に送達される。より好ましくは、これは、脳室、特に側脳室に送達される。あるいは、この組成物は、好ましくは全身経路（例えば、皮下投与）により送達される。例えば、本発明者らは、プロラクチン、成長ホルモン、ＩＧＦ−１、ＰＡＣＡＰおよびＥＰＯが、皮下投与により有効に送達されて、脳室下帯（ｓｕｂｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｚｏｎｅ）における神経幹細胞の数を調節し得ることを発見した。
【００６９】
組成物が、脳に直接送達されない場合、およびその組成物中の因子が、血液脳関門を容易に横切らない場合、血液脳関門浸透剤が、脳への進入を容易にするために必要に応じて含まれ得る。血液脳関門浸透剤は、当該分野で公知であり、これらとしては、例として、米国特許第５，６８６，４１６号；同第５，５０６，２０６号および同第５，２６８，１６４号に記載されるブラジキニンおよびブラジキニンアゴニスト（例えば、ＮＨ２−アルギニン−プロリン−ヒドロキシプロキシプロリン−グリシン−チエニルアラニン−セリン−プロリン−４−Ｍｅ−チロシンΨ（ＣＨ２ＮＨ）−アルギニン−ＣＯＯＨ）が挙げられる。あるいは、これらの因子は、米国特許第６，３２９，５０８号；同第６，０１５，５５５号；同第５，８３３，９８８号または同第５，５２７，５２７号に記載されるようなトランスフェリンレセプター抗体に結合体化され得る。これらの因子はまた、その因子と、脳毛細管内皮細胞レセプター（例えば、トランスフェリンレセプター）と反応性のリガンド（例えば、米国特許第５，９７７，３０７号を参照のこと）とを含む融合タンパク質として送達され得る。
【００７０】
薬学的組成物は、所望の治療剤と、意図された投与経路に適した適切なビヒクルと混合することにより調製され得る。本発明の薬学的組成物を作製する際に、治療剤は、通常、賦形剤と混合されるか、賦形剤により希釈されるか、またはカプセル、サシェ、紙または他の容器の形態であり得るようなキャリア内に包含される。薬学的に授与可能な賦形剤は、希釈剤として作用する場合、これは、固体、半固体、または液体の材料であり得、これらは、治療剤のためのビヒクル、キャリアまたは媒体として作用する。従って、組成物は、錠剤、丸剤、粉末、ロゼンジ、サシェ、カシェ剤、エリキシル、懸濁液、乳剤、液剤、シロップ、エーロゾル（固体または液体媒体中として）、例えば、１０重量％までの治療剤を含有する軟膏、軟質および硬質のゼラチンカプセル、坐剤、滅菌注射用液、ならびに滅菌パッケージングされた粉末の形態であり得る。
【００７１】
適切な賦形剤のいくつかの例としては、人工脳髄液、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギナート、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、滅菌水、シロップ、およびメチルセルロースが挙げられる。処方物は、さらに以下を含み得る：タルク、ステアリン酸マグネシウム、および鉱油のような滑沢剤；湿潤剤；乳化剤および懸濁剤；ヒドロキシ安息香酸メチルおよびヒドロキシ安息香酸プロピルのような保存剤；甘味料；ならびに香味料。本発明の組成物は、当該分野で公知の手順を使用することにより、患者への投与後に、治療剤の急速な放出、持続された放出、または遅延した放出を提供するように処方され得る。
【００７２】
錠剤のような固体組成物を調製するために、治療剤は、薬学的賦形剤と混合されて、本発明の化合物の均一な混合物を含む固体の予め配合された組成物を形成する。これらの予め配合された組成物を均一として言及する場合、これは、組成物が、等しく有効な単位投薬形態（例えば、錠剤、丸剤およびカプセル）に容易に小分けされ得るように、その組成物全体にわたって一様に治療剤が分散されることを意味する。
【００７３】
本発明の錠剤または丸剤は、被覆されるか、またはそうでなければ長期の作用という利点を提供する投薬形態を提供するように混合され得る。例えば、錠剤または丸剤は、内部投薬成分および外部投薬成分を含み得、後者は、前者を包み込む形態である。この２つの成分は、腸溶性層により隔てられ得、この腸溶層は、胃における崩壊に抵抗するように作用し、そして内部成分がインタクトなままで十二指腸に通過するかまたは放出を遅らせることを可能にする。種々の材料は、このような腸溶性層または被覆のために使用され得、このような材料としては、多数のポリマー酸、およびポリマー酸とこのような材料（シェラック、セチルアルコール、および酢酸セルロースとして）との混合物が挙げられる。
【００７４】
本発明の新規な組成物が経口投与または注射による投与のために組み込まれ得る液体形態としては、水溶液、適切に香味付けされたシロップ、水性懸濁液または油懸濁液、および食用油（例えば、トウモロコシ油、綿実油、ゴマ油、ココナッツ油、またはピーナッツ油）を用いて香味付けした乳剤、ならびにエリキシルおよび同様の薬学的ビヒクルが挙げられる。
【００７５】
吸入または吹き入れ（insufflation）のための組成物としては、薬学的に受容可能な、水性溶媒もしくは有機溶媒、またはそれらの混合物中の溶液および懸濁液、ならびに粉末が挙げられる。液体または固体の組成物は、本明細書中に記載されるような適切な薬学的に受容可能な賦形剤を含み得る。これらの組成物は、局所効果または全身効果のための経口または経鼻呼吸経路により投与される。好ましくは薬学的に受容可能な溶媒中の組成物は、不活性ガスの使用により噴霧され得る。噴霧される溶液は、噴霧デバイスから直接吸入されても、噴霧デバイスが、フェースマスクテントもしくは間欠正圧換気機に取り付けられてもよい。溶液、懸濁液または粉末の組成物は、適切な様式で処方物を送達するデバイスから好ましくは経口または経鼻で投与され得る。
【００７６】
本発明の方法において使用される別の処方物は、経皮送達デバイス（「パッチ」）を使用する。このような経皮パッチを使用して、制御された量で本発明の治療剤の連続的または不連続な注入を提供し得る。薬剤の送達のための経皮パッチの構築および使用は、当該分野で周知である。例えば、米国特許第５，０２３，２５２号（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。このようなパッチは、薬剤の連続的、拍動性、または要求に応じた送達用に構築され得る。
【００７７】
本発明に用いるための、他の適切な処方物が、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに見出され得る。
【００７８】
以下の略語は、以下の意味を有する。略語は、一般に受け入れられている意味を有するとは規定されない。
ＥＧＦ ＝表皮増殖因子
ＰＤＧＦ ＝血小板由来増殖因子
ＤＭＳＯ ＝ジメチルスルホキシド
ＣＮＴＦ ＝毛様体神経栄養性因子
ＥＰＯ ＝エリスロポエチン
ＮＳＣ ＝神経幹細胞
ＧＰＣ ＝グリア前駆細胞
ＮＰＣ ＝神経前駆細胞
ＰＡＣＡＰ＝下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド
ｃＡＭＰ ＝サイクリックＡＭＰ
【実施例】
【００７９】
（材料および方法）
（神経幹細胞培養）
神経幹細胞培養のためのプロトコルは、米国特許第５，７５０，３７６号またはＳｈｉｎｇｏら，２００１に詳細に示される。簡単にいうと、Ｅ１４内側および側方の神経節隆起から胚性神経幹細胞を調製した。成熟した神経幹細胞を、成体マウスの脳室下帯から調製した。組織を、２０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ、または各々のケースに示されるような他の成長因子を含む標準培地内で培養し、ニューロスフェア（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ）を形成した。標準培地の組成物は、以下のようである：ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）；グルコース（０．６％）；グルタミン（２ｍＭ）；重炭酸ナトリウム（３ｍＭ）；ＨＥＰＥＳ（５ｍＭ）；インスリン（２５μｇ／ｍｌ）；トランスフェリン（１００μｇ／ｍｌ）；プロゲステロン（２０ｎＭ）；プトレシン（６０μＭ）；および塩化セレン（３０ｎＭ）。
【００８０】
７日後、機械的分離によってニューロスフェア（初代のニューロスフェア）を経て、単一の細胞（初代）として再度播種した。２代目のニューロスフェアのために、次いで、この単一の細胞を７日間培養し、２代目のニューロスフェアを得た。
【００８１】
（増殖因子の注入）
２月齢のＣＤ−１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ−Ｒｉｖｅｒ，Ｌａｖａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）を、ペントバルビタールナトリウム（１２０ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｐ．）で麻酔し、浸透圧ポンプ（Ａｌｚｅｔ １００７Ｄ；Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）で移植した。カニューラを右側脳室（ブレグマに対して、前後に＋０．２ｍｍ、側方に＋０．８ｍｍ、および背腹方向に硬膜下−２．５ｍｍ、ラムダとブレグマとの間の頭蓋レベルで）に配置した。ヒト組換えＥＰＯ（１０００ＩＵ／ｍｌ）、ウサギ抗ＥＰＯ中和抗体（１００μｇ／ｍｌ）、ウサギＩｇＧ（１００μｇ／ｍｌ）、ラット組換えＣＮＴＦ（３３μｇ／ｍｌ）、またはヒト組換えＥＧＦ（３３μｇ／ｍｌ）を、０．９％生理食塩水（１ｍｇ／ｍｌ マウス血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）を含む）中に溶解した。各動物に、０．５μｌ／時間の流速で、６日間継続的に注入し、１日あたり約２５ＩＵのＥＰＯ、３μｇの抗体、あるいは４００ｎｇのＣＮＴＦまたはＥＧＦを送達した。
【００８２】
（発作の研究のための試験動物）
雄成体ロングエバンスラット（２５０〜３５０ｇ）を、Ｃｈａｒｌｓ Ｒｉｖｅｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｆａｒｍｓから入手し、任意の処理前の２週間、コロニーに適応させた。手術の１週間前に、このラットで、行動試験におけるベースライン試験を行った。
【００８３】
（局所虚血性の損傷および注入）
発作研究のための動物に、感覚運動皮質の片側の脈管遮断を施した。イソフルラン麻酔を用いて、皮膚を切開し、収縮させ、そして表面の筋膜を頭蓋から除去した。頭蓋の開口部を、硬膜を傷つけないように注意して、以下の座標に形成した：ＡＰ ＋４．０〜−２．０；Ｌ １．５〜４（傍矢状の隆線；Ｋｏｌｂら，１９９７）。この硬膜を切り、頭蓋の開口部から収縮させた。生理食塩水中に浸漬した綿棒で、露出した軟膜越しに穏やかに擦り、血管を除いた。次いで、反対側の半球に穴を開け、浸透圧ミニポンプ（ＡＰ −０．５；Ｌ １．５）を備えたカニューラのための穴を提供した。浸透圧ミニポンプを、肩甲骨の間の皮膚の下に配置し、チューブを、速乾性セメントで頭蓋に取り付けたカニューラに皮膚の下で接続した。一旦止血がなされると、頭皮を５−Ｏ 滅菌縫合糸を用いて縫合し、閉じた。この動物に、Ｂａｎａｍｉｎｅ（鎮痛薬（ａｎａｌｇｅｓｉｃ））の注射を１回与え、ホームケージに戻した。骨に穴を開けた偽手術動物には麻酔のみを与え、皮膚を切開し、そして縫合した。
【００８４】
６日後、この動物を、行動試験を用いて評価した。次の日、この動物を再度麻酔し、ミニポンプを適切な溶液を備えた第２のミニポンプと置換した。偽手術動物は、麻酔のみを行った。これらの動物を、７日後、１４日後、および２８日後に再試験し、１週間目、２週間目、３週間目、４週間目および６週間目での行動測定結果を得た。
【００８５】
（前肢抑止試験）
この試験は、新皮質前方領域の機能的な保全性の、感度の高い測定を構成することが示されている。通常のラットにおいて、泳ぎは、後肢からの推進力によってなされる。前肢は、通常、任意の動作が抑止され、動かないままであり、動物の頚部の下部と一緒にされる。前肢の抑止は、泳いでいる間、動物を撮影することによって評価した。動物を、室温の水（約２５℃）で深さ２５ｃｍまで満たした水槽（３０ｗ×９０ｌ×４３ｈ ｃｍ）の一方の端に導入し、これらの動物が泳ぐのを、９．５ｃｍ四方の可視的プラットフォームに撮影した。このプラットフォームを、水面の２ｃｍ上に投影し、そして水槽の反対側の端に配置する。水槽の長さに沿った３回の泳ぎにおいて、各前肢によってなされる場合、動作回数の計数によって抑止をスコアリングした。泳ぎは、動物が、泳ぎを試行している間に水槽の側面に接触しなかった場合にのみ、スコアリング可能であると考えられる。
【００８６】
（前肢非対称性試験）
動物の前足の非対称性を、それらの動物（直径２５ｃｍのアクリルシリンダー中、アクリルプラットフォーム上）を下から撮影することによって決定した。動物が、５分間に左前足または右前足を上げ下げした回数をそれぞれ計数することによって、姿勢の安定性の挙動における優先度を決定した。この試験は、前肢の使用における非対称性の測定を可能にし、測定結果は、外傷に対する同側の肢の使用に対する信頼できるバイアスを示す。
【００８７】
（脳の解剖学的分析）
６週の終りに、動物に過剰量のエタノール（Ｅｕｔｈａｎｏｌ）を与え、ピクリン酸中の０．９％生理食塩水および４％パラホルムアルデヒドで心臓内を灌流した。この脳を細胞保護し、そしてビブラトームで、４０ミクロンに切った。５セットの切片を、４００ミクロンごとに保持した。２セットを染色した（一方をクレシルバイオレットで、そしてもう一方をダブルコルチンで）。残りのセットは、保存した。クレシルバイオレット染色を、スライド上で実施し、一方ダブルコルチン染色は、自由なフロートの切片における免疫組織化学手順で実施した。クレシルバイオレット染色は、損傷領域の評価を可能にし、一方、ダブルコルチン染色は、移動性の神経前駆細胞（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）に存在するタンパク質と会合した。
【００８８】
（実施例１）
（インビボでのＣＮＴＦおよびＥＰＯの効果）
インビボでのＣＮＴＦおよびＥＰＯの有効性を決定するために、ＣＮＴＦまたはＥＰＯを、材料および方法に記載されるように、６日間にわたり成体マウスに注入した。次いで、その脳組織を収集し、注入後の脳における神経幹細胞の数の指標として神経幹細胞の増殖に用いた。あるいは、チロシンヒドロキシラーゼまたはＭａｓｈ１について脳組織を染色し、神経発生領域を決定した。
【００８９】
Ｓｈｉｍａｚａｋｉら，２００１に詳細に記載されるように、ＣＮＴＦ注入は、脳から得られ得る初期ニューロスフェアの有意な増加（約２５％）をもたらした。さらに、ＥＧＦおよびＣＮＴＦの同時注入は、神経幹細胞の数を４０％増加させた。従って、ＣＮＴＦは、特にＥＧＦとの組合せにおいて、神経幹細胞数を増加させ得る。ＢｒｄＵがまた動物に与えられる場合、ＣＮＴＦは、ＢｒｄＵ陽性細胞の数を増加させなかったように、ＣＮＴＦは、神経幹細胞の増殖を刺激しない。
【００９０】
ＣＮＴＦは、神経幹細胞の増殖または生存を促進しないので、本発明者らは、ＣＮＴＦが、神経幹細胞の自発的な分化を阻害するとの仮説を立てた。系統的に制限された細胞への自発的な分化により、神経幹細胞は、自己再生する能力がなく、神経幹細胞の数は、分化細胞の数が増えるにつれて減少する。従って、ＣＮＴＦが、この自発的な分化を阻害する場合、ＣＮＴＦ存在下で生成されるニューロスフェアは、ＣＮＴＦ非存在下で生成したニューロスフェアより展開可能であり、そして多能である。
【００９１】
従って、本発明者らは、ＥＧＦ単独中またはＥＧＦ＋ＣＮＴＦ中で生成したニューロスフェアの展開可能性および多能性を比較した。展開可能性について、初代ニューロスフェアを分離し、そしてクローン密度で再プレートして２代目ニューロスフェアを産生し、そして単一の初代のスフェア由来の２代目ニューロスフェアの数を計数した。この結果は、ＥＧＦ＋ＣＮＴＦ中で産生した初代ニューロスフェアが、有意なさらなる２代目スフェアをもたらしたことを表し、これらの初代スフェアが、ＥＧＦ単独中で産生したスフェアより展開可能性のある細胞を含むことを示す。多能性について、各ニューロスフェア由来のニューロン、乏突起膠細胞およびの星状膠細胞のパーセントを決定した。その結果は、ＥＧＦ単独中で生成したニューロスフェアがまた、ＥＧＦ＋ＣＮＴＦ中で生成したニューロスフェアより、４倍の数のグリア細胞が産生したことを表す。従って、神経幹細胞は、デフォルトで、グリア細胞に分化し、これはＣＮＴＦによって阻害され得る。
【００９２】
一方、ＥＰＯは、神経幹細胞の数を、約５０％減少させ、神経発生を増加させた。従って、たとえ神経幹細胞が自発的にグリア系に分化するとしても、神経幹細胞の一部は、ＥＰＯによって神経前駆細胞の形成が誘導され得る。なおさらに、抗ＥＰＯ抗体の注入は、神経幹細胞の増加をもたらすが、非特異的ＩｇＧは、神経幹細胞の増加をもたらさなかった。このことは、ＥＰＯを含む進行中のインビボでの神経発生プロセスが存在することを示す。
【００９３】
（実施例２）
（動作モデルにおける因子組合せの効果）
脳に損傷を受けた動物における因子の種々の組合せの効果を決定するために、動作のモデルとして、ラットの脳に局所的な虚血性損傷を誘導した。脳損傷の結果、この動物は、運動皮質に損傷を有し、２つの行動試験において異常な行動をした。１つは前肢抑止試験（新皮質前部の領域の機能保全性の感覚測定）である。通常のラットは、泳ぐとき、前肢の使用を抑止するが、本実験において、運動皮質の一方を損傷させた場合、運動皮質は、体の反対側を制御するので、そのラットは、反対側の前肢の使用を抑止しなかった。他の試験（前肢非対称性試験）において、正常なラットは、それらのラットが自身のバランスをとることを試行する場合と同様に、両前肢を使用する。しかし、損傷したマウスは、同側の前肢を使用することを好む。何故ならば、おそらくそれらのマウスは、自身の反対側の前肢をコントロールし得ないからである。
【００９４】
次いで、この動物に、種々の試験因子を与え、前肢の抑止試験および脳解剖学におけるこれらの因子の効果を評価した。コントロールとして、偽手術コントロール動物群に、偽脳損傷および試験に使わない因子を与え、そしてビヒクルコントロール群に脳損傷ならびに人工的な大脳脊髄液（ＣＳＦ）の注入を行った。各試験群で行った処置を、以下にまとめた：
【００９５】
【表１】
【００９６】
脳損傷、注入、行動試験および解剖学的分析のスケジュールおよび手順は、材料および方法に記載される。
【００９７】
（Ａ．プロラクチンおよびプロラクチン＋ＥＰＯの効果）
脳損傷前、全てのラットは、前肢抑止試験において両前足を抑止した。損傷後、全ての虚血性群（群２〜群６）は、反対側の前足を抑止しなかったが、同側の前足は抑止し続けた。試験因子の注入により、２つのプロラクチン群（群３および４群）は、より高い前足の抑止を示した。実際、最終週（注入完了の４週間後）の終りまでには、プロラクチン＋ＥＰＯ群（群４）は、コントロールと区別不可能であった。従って、プロラクチン、および特に、プロラクチンとＥＰＯとの組み合せは、行動の代表的な症状からの回復をもたらした。
【００９８】
解剖学的には、プロラクチン群は、脳において高度のダブルコルチン染色を示し、このことは、プロラクチンが、広範囲の神経発生を誘導したことを示す。プロラクチン＋ＥＰＯ群のラットは、拡張された脳室下帯を有し、このことは、この領域における有意な細胞増殖を示す。さらに、多くのダブルコルチン陽性細胞が、外傷領域、白質および側脳室において見られた。ダブルコルチン陽性細胞は、脳室下帯と外傷領域との間に観察される。ダブルコルチンは、移動性神経前駆細胞のマーカーであるので、これらの結果は、処理の際に神経幹細胞が神経前駆細胞を生じ、これらの前駆細胞が、外傷領域に移動したことを示す。外傷領域における新たな増殖は、非常に広範囲であり、その結果、この群の大部分のラットにおいて、虚血性外傷によって生じた空洞が、完全にまたは部分的に満たされた。従って、これらの解剖学的結果は、プロラクチン、またはプロラクチンとＥＰＯとの組合せが、脳損傷（例えば、発作）処置に用いられ得る行動学的研究を、強く支持する。
【００９９】
（Ｂ．成長ホルモンおよび成長ホルモン＋ＥＰＯの効果）
前肢非対称性試験の結果は、全ての試験群において、６週目の終りには非対称の程度は下がったが、成長ホルモンを与えた群（群３および群４）は、初めの４週間で、より速いかつ広範囲の回復が見られたことを示す。これらの結果は、解剖学的分析からの結果と一致し、成長ホルモン単独（群３）は、ダブルコルチン陽性細胞の増加をもたらし、そして成長ホルモンとＥＰＯとの組合せ（群４）は、側脳室の周囲でのダブルコルチン陽性細胞の移動をもたらした。
【０１００】
従って、成長ホルモン単独、または成長ホルモンとＥＰＯとの組合せのいずれかは、脳における発作モデルの運動神経関連機能ならびに神経の形成／移動を改善し、このことは、成長ホルモンを用いて、脳損傷を処置または改善し得ることを示す。
【０１０１】
従って、プロラクチンおよびプロラクチンとＥＰＯとの組み合せは、前肢抑止試験における損傷したラットの運動機能を改善し、前肢非対称性試験は改善しなかったが、一方、成長ホルモンおよび成長ホルモンとＥＰＯとの組合せは回復効果を有した。これらの結果は、様々な因子が、異なる神経経路を刺激し得、そして異なる神経細胞の回路の回復を促進することを立証し、より完全かつ効果的な処置結果のためには、種々の因子を組み合わせることが重要であることを示す。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】図１は、神経幹細胞（ＮＳＣ）による神経新生およびグリア新生についての模式図である。ＥＧＦ（すなわち、ＥＧＦの成体ホモログのＴＧＦα）は、ＮＳＣ集団の自己複製／増殖を誘導する。ＮＳＣは、グリア前駆細胞（ＧＰＣ）になる規定の経路において自然発生的な分化を起こす。この自然発生的な分化は、ＣＮＴＦによって減弱され得る。ＧＰＣは、アストロサイトおよび／またはオリゴデンドロサイトに分化する（この分化は、ＥＧＦによって促進される）。あるいは、ＮＳＣは、ニューロンだけを産生する神経前駆細胞（ＮＰＣ）に分化するように、ＥＰＯおよび／またはＰＡＣＡＰ／ｃＡＭＰによって指示を受け得る。
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、インビトロまたはインビボにて、神経系細胞（ｎｅｕｒａｌ ｃｅｌｌ）（例えば、ニューロンまたはグリア細胞）を選択的に産生する方法に関する。また、神経系細胞を産生することによって神経変性疾患または病状を処置または緩和させる方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
近年、神経変性疾患は、これらの障害に関する多大な危険のある高齢者の増加に起因して、重大な懸念となっている。神経変性疾患としては、中枢神経系（ＣＮＳ）の特定部位における神経系細胞の変性に関連している疾患が挙げられ、意図された機能を実行するこれらの細胞の能力を不能にする。これらの疾患としては、アルツハイマー病、多発性硬化症（ＭＳ）、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、およびパーキンソン病が挙げられる。さらに、おそらく（罹患した人の数に対する）ＣＮＳ機能不全の最大領域は、神経系細胞の欠損によってではなく、存在する神経系細胞の異常な機能によって特徴付けられている。これは、ニューロンの不適切な興奮、または神経伝達物質の異常な合成、放出、およびプロセシングに起因し得る。これらの機能不全は、うつ病および癲癇のような十分に研究され特徴付けられた障害、または壊死および精神病のようなあまり理解されていない障害の結果であり得る。さらに、脳損傷は、しばしば、神経系細胞の欠損、罹患した脳の部位の不適切な機能、およびその結果の行動異常を生じる。
【０００３】
従って、神経変性疾患または神経変性状態を処置するために、変性したニューロン／グリア細胞または欠損したニューロン／グリア細胞を補償するように脳に神経系細胞を供給することが望ましい。この目標のための１つのアプローチは、患者の脳に神経系細胞を移植することである。このアプローチは、好ましくは、対移植片性宿主拒絶（ｈｏｓｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｇｒａｆｔ−ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）もしくは対宿主性移植片拒絶が最小になり得るように、同じ個体または非常に関連する個体に由来する神経系細胞の多量の供給源を必要とする。１人の人物から多量のニューロンまたはグリア細胞を取り出し、別の人物に移植することは現実的ではないので、多量の神経系細胞を培養する方法が、このアプローチの成功には必須である。
【０００４】
別のアプローチは、欠損または変性した細胞を補償するために、インサイチュで神経系細胞の産生を誘導することである。このアプローチは、脳（特に生体の脳）において神経系細胞を産生することが可能であるか否か、およびその方法についての広い知識を必要とする。
【０００５】
多能性神経幹細胞の単離およびインビトロ培養についての技術（例えば、米国特許第５，７５０，３７６号；同第５，９８０，８８５号；同第５，８５１，８３２号を参照のこと）の開発は、両方のアプローチの見込みを非常に増大させた。胎児の脳は、インビトロにて多能性神経幹細胞を単離し、そして培養するために用いられ得ることが発見された。さらに、対照的に、生体の脳細胞は、脳細胞を複製または再生できないと長い間考えられてきたが、神経幹細胞は、生体の哺乳動物の脳からも単離され得ることが発見された。胎児または生体の脳のいずれかに由来するこれらの幹細胞は、自己複製し得る。子孫細胞は、再び増殖し得るか、または神経系の細胞系統（ニューロン、アストロサイトおよびオリゴデンドロサイトを含む）の任意の細胞に分化し得る。それゆえ、これらの知見は、移植に用いられ得る神経系細胞の供給源を提供するだけでなく、成体脳における多能性神経幹細胞の存在およびインサイチュにおいてこれらの幹細胞からニューロンまたはグリア細胞を産生する能力もまた、実証する。
【０００６】
（参考文献）
【数１】
【数２】
【０００７】
【数３】
【０００８】
本明細書において上または他の部分に引用される刊行物、特許および特許出願の全ては、各個々の刊行物、特許または特許出願の開示がその全体において参考として援用されることが具体的にかつ別個に示されるのと同じ程度まで、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、以下の２つの目的のために、神経幹細胞を効果的に増殖させるための方法を開発することが望ましい：移植治療に用いられ得る、より多くの幹細胞および神経系細胞を得ること、ならびにインサイチュでより多くの幹細胞を産生するために用いられ得る方法を同定すること。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は、インビトロまたはインビボで神経系細胞を産生する２工程の方法に関する。本発明者らは、多能性神経幹細胞（ＮＳＣ）による神経新生およびグリア新生が、増殖および方向付けられた分化に関わることを発見した。図１に示されるように、ＥＧＦ（すなわち、ＥＧＦの成体ホモログのＴＧＦα）は、ＮＳＣ集団の自己複製／増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）を誘導する。ＮＳＣは、グリア前駆細胞（ＧＰＣ）になる規定の経路において自然発生的な分化を起こす。この自然発生的な分化は、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）によって減弱され得る。ＧＰＣは、グリア細胞に分化する（この分化は、ＥＧＦによって促進される）。あるいは、ＮＳＣは、ニューロンだけを産生する神経前駆細胞（ＮＰＣ）に分化するように、ＥＰＯおよび／またはＰＡＣＡＰ／ｃＡＭＰによって指示を受け得る。
【００１１】
従って、以下の２工程プロセスは、ニューロンまたはグリア細胞を産生するために使用され得る：（１）ＮＳＣの数を増加させる工程；および（２）ニューロンまたはグリア細胞の産生を選択的に促進する適切な条件にＮＳＣを供することによって、ニューロンまたはグリア細胞のいずれかにＮＳＣの分化を促進させる工程。
【００１２】
従って、本発明の１つの局面は、神経前駆細胞またはグリア前駆細胞を産生する方法を提供し、この方法は、以下：
（ａ）少なくとも１つの神経幹細胞を提供する工程；
（ｂ）該神経幹細胞を、プロラクチン、成長ホルモン、エストロゲン、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、形質転換成長因子α（ＴＧＦα）および上皮成長因子（ＥＧＦ）からなる群より選択される因子の、該神経幹細胞の数を増加させるのに十分な量
と接触させる工程；および
（ｃ）工程（ｂ）からの該神経幹細胞を、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＰＡＣＡＰ、プロラクチン、セロトニン、骨形成因子（ＢＭＰ）およびｃＡＭＰからなる群より選択される因子の、該神経幹細胞から神経前駆細胞またはグリア前駆細胞の産生を促進させるのに十分な量と接触させる工程；
を包含する方法であって、
但し、工程（ｂ）の因子がＥＧＦまたはＦＧＦである場合、工程（ｃ）の因子はＰＡＣＡＰまたはプロラクチンである。
【００１３】
従って、工程（ｂ）は、神経幹細胞の数を増加させるために実施され、この工程は、以下の少なくとも１つによって達成され得る：
（ｉ）例えば、ＥＧＦを提供することによって、神経幹細胞の増殖を増大させる工程；
（ｉｉ）例えば、ＣＮＴＦを提供することによって、神経幹細胞の自然発生的な分化を阻害する工程；または
（ｉｉｉ）例えば、エストロゲンを提供することによって、神経幹細胞の生存を促進する工程。
【００１４】
これらの２工程（ＮＳＣ数を増加させる工程およびニューロンまたはグリアの産生を促進する工程）は、連続してか、または同時に実施され得る。工程（ｂ）は工程（ｃ）の前に実施されることが好ましい。
【００１５】
これらの因子は、当該分野において確立された任意の方法によって提供され得る。例えば、血管内投与、髄腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与、局所的投与、経口的投与、直腸内投与、膣内投与、鼻腔内投与、吸入投与され得るか、または脳内に投与され得る。この投与は、好ましくは、全身的に、特に皮下投与によって実施される。これらの因子はまた、哺乳動物において内因性因子の量を増大させ得るのに有効な量を、哺乳動物に投与することによって提供され得る。例えば、哺乳動物におけるプロラクチンのレベルは、プロラクチン放出ペプチドを使用することによって増加され得る。
【００１６】
これらの因子が脳内に直接的に送達されない場合、血液脳関門透過剤は、必要に応じて、脳への侵入を促進するために含まれ得る。血液脳関門透過剤は、当該分野で公知であり、そしてこれらとしては、例えば、ブラジキニンおよびブラジキニンアゴニスト（米国特許第５，６８６，４１６号；同第５，５０６，２０６号および同第５，２６８，１６４号（例えば、ＮＨ２−アルギニン−プロリン−ヒドロキシプロキシプロリン−グリシン−チエニルアラニン−セリン−プロリン−４−Ｍｅ−チロシンΨ（ＣＨ２ＮＨ）−アルギニン−ＣＯＯＨ）に記載される）が挙げられる。あるいは、これらの因子は、トランスフェリンレセプター抗体（例えば、米国特許第６，３２９，５０８号；同第６，０１５，５５５号；同第５，８３３，９８８号または同第５，５２７，５２７号に記載される）に結合され得る。これらの因子はまた、トランスフェリンレセプターのような脳毛細管内皮細胞レセプター（例えば、米国特許第５，９７７，３０７号を参照のこと）と反応性である、因子およびリガンドを含む融合タンパク質として送達され得る。
【００１７】
全年齢の哺乳動物は、この方法に供され得るが、哺乳動物は胚でないことが、好ましい。より好ましくは、哺乳動物は成体である。
【００１８】
哺乳動物は、神経変性疾患または神経変性状態に罹患しているか、あるいはこれらを有すると疑われ得る。この疾患または状態は、脳の外科手術によって引き起こされる発作または損傷のような脳損傷であり得る。神経幹細胞の数が非常に減少することに関連する疾患または状態は、加齢であり得る。この疾患または状態はまた、神経変性疾患、特にアルツハイマー病、多発性硬化症、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、およびパーキンソン病であり得る。
【００１９】
あるいは、神経幹細胞は、インビトロでの培養物として存在し得る。この細胞は、任意の年齢の哺乳動物由来であり得る。好ましくは、この動物は、胚ではなく、そして最も好ましくは、この動物は成体である。
【００２０】
本発明の別の局面は、神経変性疾患または病状を処置または緩和するための方法を提供し、この方法は、（ａ）神経幹細胞の数を増加させ得る因子を哺乳動物に投与する工程；および（ｂ）限定された系統の細胞の産生を促進する条件下に、この哺乳動物を供し；これによって限定された系統の細胞の産生を促進させる、工程を包含する。例えば、ニューロンは、ＥＧＦおよびＥＰＯを投与することによって、欠損したニューロンまたは機能不全のニューロンを補償するように産生され得る。ＮＳＣの数を増加させ得る他の因子（例えば、ＣＮＴＦ、ＦＧＦ、プロラクチン、成長ホルモン、ＩＧＦ−１、ＰＡＣＡＰまたはエストロゲン）もまた、ＥＧＦの代わりに使用されるか、またはＥＧＦに加えて使用され得る。同様に、ニューロン産生を促進し得る他の因子（例えば、ＰＡＣＡＰまたはｃＡＭＰレベルを高める因子）が、ＥＰＯの代わりに使用され得るか、またはＥＰＯに加えて用いられ得る。
【００２１】
欠損したグリア細胞または機能不全のグリア細胞を補償するようにグリア細胞を産生するためにＥＧＦが投与され得、このＥＧＦはＮＳＣ増殖を刺激し、その結果、ＮＳＣは規定によってグリア細胞に分化する。必要に応じて、神経経路のインヒビター（例えば、ＥＰＯの抗体およびｃＡＭＰシグナル伝達インヒビター）は、グリア産生を促進するために使用され得る。好ましくは、グリア形成を促進する因子（例えば、ＢＭＰ）はまた、グリア細胞をさらに産生するために使用される。
【００２２】
（発明の詳細な説明）
本発明は、インビトロまたはインビボで神経系細胞（ニューロンまたはグリア細胞を含む）を選択的に産生する方法に関する。また、神経系細胞を産生することによって神経変性疾患または病状を処置または緩和させる方法を提供する。従って、因子の組み合わせが、以下の２つの工程を達成するための使用される：神経幹細胞の数を増加させる工程およびニューロンまたはグリア細胞に選択的になるように、神経幹細胞に指示する工程。
【００２３】
本発明をさらに詳細に記載する前に、本明細書中において使用される用語は、別の指示がない限り、以下のように定義される。
【００２４】
（定義）
「神経幹細胞」は、神経系の細胞系統における幹細胞である。幹細胞は、自己再生し得る細胞である。言い換えると、幹細胞の分割から生じた娘細胞は幹細胞を含む。神経幹細胞は、神経系の細胞系統（ニューロン、アストロサイトおよびオリゴデンドロサイト（アストロサイロトおよびオリゴデンドロサイトは、グリアまたはグリア細胞の総称である）を含む）にける全ての細胞型に最終的に分化し得る。従って、本明細書中で言及される神経幹細胞は、多能性の神経幹細胞である。
【００２５】
「ニューロスフェア（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ）」は、クローンに増殖した結果として単一の神経幹細胞から誘導された細胞の群である。「初代ニューロスフェア」は、神経幹細胞を含む初代培養脳組織のプレーティングによって生成されるニューロスフェアをいう。ニューロスフェアを形成する神経幹細胞の培養方法は、例えば、米国特許第５，７５０，３７６号に記載されている。「二代目のニューロスフェア」は、初代ニューロスフェアをバラバラにすることによって生じ、そして個々のバラバラにした細胞がニューロスフェアを再び形成することを可能にするニューロスフェアをいう。
【００２６】
「神経系細胞（ｎｅｕｒａｌ ｃｅｌｌ）」は、神経系の系統の任意の細胞である。好ましくは、神経系細胞は、ニューロンまたはグリア細胞である。
【００２７】
ネイティブな因子と「実質的な配列の類似性」を共有するポリペプチドは、ネイティブ因子とアミノ酸レベルで、少なくとも約３０％同一である。このポリペプチドは、ネイティブ因子とアミノ酸レベルで、好ましくは少なくとも約４０％、より好ましくは少なくとも約６０％、さらにより好ましくは少なくとも約７０％、そして最も好ましくは少なくとも約８０％同一である。
【００２８】
句、ネイティブ因子とアナログまたは改変体の「パーセント同一性」または「％同一性」は、２つの配列が整列した場合に、アナログまたは改変体にもまた見出される、ネイティブ因子のアミノ酸配列の割合をいう。パーセント同一性は、当該分野において確立された任意の方法またはアルゴリズム（例えば、ＬＡＬＩＧＮまたはＢＬＡＳＴ）によって決定され得る。
【００２９】
ポリペプチドは、ネイティブ因子に対するレセプターに結合され得るか、またはネイティブ因子に対して惹起されたポリクローナル抗体によって認識され得る場合に、ネイティブ因子の「生物学的活性」を有する。好ましくは、このポリペプチドは、レセプター結合アッセイにおいて、ネイティブ因子に対するレセプターに特異的に結合し得る。
【００３０】
ネイティブ因子の「機能的アゴニスト」は、ネイティブ因子のレセプターに結合し、活性化する化合物であるが、ネイティブ因子と実質的な配列類似性を共有することは必須ではない。
【００３１】
「プロラクチン」は、（１）ネイティブな哺乳動物プロラクチン、好ましくはネイティブなヒトプロラクチン（下垂体で主に合成される１９９アミノ酸のポリペプチド）と実質的な配列類似性を共有し；（２）ネイティブな哺乳動物のプロラクチンの生物学的活性を有する、ポリペプチドである。従って、用語「プロラクチン」は、ネイティブプロラクチンの欠失改変体、挿入改変体または置換改変体であるプロラクチンアナログを含む。さらに、用語「プロラクチン」は、他の種に由来するプロラクチンおよびその天然に存在する改変体を含む。さらに、用語「プロラクチン」は、他の種および天然に存在するそれらの改変体由来のプロラクチンを含む。
【００３２】
さらに、「プロラクチン」はまた、ネイティブな哺乳動物プロラクチンレセプターの機能的アゴニストであり得る。例えば、機能的アゴニストは、以下であり得る：プロラクチンレセプターについての米国特許第６，３３３，０３１号に開示された活性化アミノ酸配列；プロラクチンレセプターに対するアゴニスト活性を有する金属錯体レセプターリガンド（米国特許第６，４１３，９５２号）；Ｇ１２０ＲｈＧＨ（これは、ヒト成長ホルモンのアナログであるが、プロラクチンアゴニストとして作用する）（Ｍｏｄｅら、１９９６）；または米国特許第５，５０６，１０７号および同第５，８３７，４６０号に記載されるようなプロラクチンレセプターに対するリガンド。
【００３３】
「ＥＧＦ」は、ネイティブなＥＧＦまたは任意のＥＧＦのアナログもしくは改変体を意味し、このアナログまたは改変体は、ネイティブなＥＧＦと実質的なアミノ酸類配列似性を共有し、そして少なくとも１つ、ネイティブＥＧＦの有する生物学的活性（例えば、ＥＧＦレセプターへの結合）を共有する。特に、ＥＧＦとしては、任意の種のネイティブＥＧＦ、ＴＧＦα、または組換え改変ＥＧＦが挙げられる。特定の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：２つのＣ末端アミノ酸の欠失および５１位での１つの中性アミノ酸置換を有する組換え改変ＥＧＦ（特に、ＥＧＦ５１ｇｌｎ５１；米国特許出願公開番号２００２００９８１７８Ａ１）、１６位のＨｉｓ残基が中性アミノ酸または酸性アミノ酸で置換されている、ＥＧＦムテイン（ＥＧＦ−Ｘ１６）（米国特許第６，１９１，１０６号）、ネイティブＥＧＦのアミノ末端残基を欠く、ＥＧＦの５２アミノ酸欠失改変体（ＥＧＦ−Ｄ）、Ｎ末端残基ならびに２つのＣ末端残基（Ａｒｇ−Ｌｅｕ）が欠失された、ＥＧＦ欠失改変体（ＥＧＦ−Ｂ）、２１位のＭｅｔ残基が酸化されているＥＧＦ−Ｄ（ＥＧＦ−Ｃ）、２１位のＭｅｔ残基が酸化されているＥＧＦ−Ｂ（ＥＧＦ−Ａ）、ヘパリン−結合ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、βセルリン、アンフィレグリン（ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）、ニューレグリン（ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ）、または上記のいずれかを含む融合タンパク質。他の有用なＥＧＦのアナログまたは改変体は、米国特許出願番号２００２００９８１７８Ａ１、ならびに米国特許第６，１９１，１０６号および同第５，５４７，９３５号に記載されている。
【００３４】
さらに、「ＥＧＦ」はまた、ネイティブの哺乳動物ＥＧＦレセプターの機能性アゴニストであり得る。例えば、機能性アゴニストは、ＥＧＦレセプターの活性化アミノ酸配列（米国特許第６，３３３，０３１号に開示される）、またはＥＧＦレセプターに対してアゴニスト活性を有する抗体（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｐｏｌ、１９８５および米国特許第５，７２３，１１５号）であり得る。
【００３５】
「ＰＡＣＡＰ」は、ネイティブＰＡＣＡＰ、あるいはネイティブＰＡＣＡＰと実質的なアミノ酸配列類似性を共有する任意のＰＡＣＡＰアナログまたは改変体、ならびにネイティブＰＡＣＡＰへの少なくとも１つの生物学的活性（例えば、ＰＡＣＡＰレセプターへの結合）を共有する任意のＰＡＣＡＰアナログまたは改変体を意味する。有用なＰＡＣＡＰアナログおよび改変体としては、以下に限定されないが、ＰＡＣＡＰの３８アミノ酸改変体および２７アミノ酸改変体（それぞれ、ＰＡＣＡＰ３８およびＰＡＣＡＰ２７）、そして例えば、米国特許第５，１２８，２４２号；同第５，１９８，５４２号；同第５，２０８，３２０号；同第５，３２６，８６０号；同第５，６２３，０５０号；同第５，８０１，１４７号；ならびに同第６，２４２，５６３号に開示されるアナログおよび改変体が挙げられる。
【００３６】
さらに、「ＰＡＣＡＰ」はまた、ネイティブの哺乳動物ＰＡＣＡＰレセプターの機能性アゴニストであり得る。例えば、機能性アゴニストは、マキサディラン（ｍａｘａｄｉｌａｎ）（ＰＡＣＡＰ１型レセプターの特異的アゴニストとして作用するポリペプチド）（Ｍｏｒｏら、１９９７）であり得る。
【００３７】
「エリスロポエチン（ＥＰＯ）」とは、ネイティブＥＰＯ、あるいはネイティブＥＰＯと実質的なアミノ酸配列類似性を共有する任意のＥＰＯアナログまたは改変体、ならびにネイティブＥＰＯへの少なくとも１つの生物学的活性（例えば、ＥＰＯレセプターへの結合）を共有する任意のＥＰＯアナログまたは改変体を意味する。エリスロポエチンアナログおよび改変体は、例えば、米国特許第６，０４８，９７１号および同第５，６１４，１８４号に開示される。
【００３８】
さらに、「ＥＰＯ」はまた、ネイティブの哺乳動物ＥＰＯレセプターの機能性アゴニストであり得る。例えば、機能性アゴニストは以下のものであり得る：ＥＭＰ１（ＥＰＯ擬態ペプチド１、Ｊｏｈｎｓｏｎら、２０００）；ＥＰＯの短いペプチド擬態の１つ（Ｗｒｉｇｈｔｏｎら、１９９６および米国特許第５，７７３，５６９号に記載される）；任意の低分子ＥＰＯ擬態（Ｋａｕｓｈａｎｓｋｙ、２００１に開示される）；ＥＰＯレセプターを活性化する抗体（米国特許第５，８８５，５７４号、ＷＯ９６／４０２３１、ＷＯ９７／４８７２９、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｐｏｌ、１９８５または米国特許第５，７２３，１１５号に記載される）；活性化アミノ酸配列（米国特許第６，３３３，０３１号にＥＰＯレセプターについて開示される）；ＥＰＯレセプターに対してアゴニスト活性を有する金属錯体化レセプターリガンド（米国特許第６，４１３，９５２号）；またはＥＰＯレセプターに対するリガンド（米国特許第５，５０６，１０７号および同第５，８３７，４６０号に記載される）。
【００３９】
細胞型の形成の「増強」または「促進」は、その細胞型の数が増加することを意味する。従って、ある因子の存在下におけるニューロン数が、その因子の不存下におけるニューロン数より大きい場合に、その因子は、ニューロン形成を増強するために使用され得る。その因子の不存下におけるニューロン数は、０以上であり得る。
【００４０】
「神経変性疾患または神経変性状態」としては、ニューロン欠損またはニューロン機能不全に関連する疾患または医学的状態である。神経変性疾患または神経変性状態の例としては、神経変性疾患、脳損傷またはＣＮＳ機能不全が挙げられる。神経変性疾患としては、例えば、以下のものが挙げられる：アルツハイマー病、多発性硬化症（ＭＳ）、黄斑変性、緑内障、糖尿病性網膜症、末梢神経障害、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、およびパーキンソン病。脳損傷としては、例えば、以下が挙げられる；発作（例えば、出血性発作、局所性の虚血性発作または全体的な虚血性発作）；および外傷性脳損傷（例えば、脳外科手術または物理的な事故により引き起こされる損傷）。ＣＮＳ機能不全としては、例えば、うつ病、てんかん、神経症および精神病が挙げられる。
【００４１】
「治療または改善」とは、疾患または医学的状態の症状の軽減あるいは完全な除去を意味する。
【００４２】
「神経変性疾患または神経変性状態を有すること疑われる」哺乳動物とは、神経変性疾患または神経変性状態と正式には診断されないが、神経変性疾患または神経変性状態の症状を示す哺乳動物であり、家族歴または遺伝素因に起因して神経変性疾患または神経変性状態と疑われるか、または、以前に神経変性疾患または神経変性状態を有しており、そして再発の危険にさらされている哺乳動物である。
【００４３】
哺乳動物への組成物の「移植」は、当該分野において確立された任意の方法によって、哺乳動物の身体内へ組成物を導入することをいう。導入される組成物は「移植片」であり、哺乳動物は「レシピエント」である。移植片およびレシピエントは、同系、同種異系、または異種であり得る。好ましくは、移植は、自己移植である。
【００４４】
「有効な量」は、意図する目的を達成するために十分な治療剤の量である。例えば、神経幹細胞の数を増加させるための因子の有効な量は、インビボまたはインビトロのいずれの場合もあり得るが、神経幹細胞数の増加という結果を生じさせるために十分な量である。神経変性疾患または神経変性状態を処置または改善するための組成物の有効な量は、神経変性疾患または神経変性状態の症状を軽減または取り除くのに十分な組成物の量である。所定の治療剤の有効な量は、因子（例えば、薬剤の性質、投与経路、治療剤を受ける動物のサイズおよび種、ならびに投与の目的）によって変化する。各個々の症例における有効な量は、当該分野において確立された方法に従って、当業者によって経験的に決定され得る。
【００４５】
（方法）
神経幹細胞（ＮＳＣ）（例えば、成体前脳において見出される神経幹細胞）は、限定された神経系前駆体およびグリア前駆体の供給源である可能性が高く、これらは、それぞれ例えば、嗅球および脳梁といった構造中に存在する。ＮＳＣが限定された前駆体を生じる機構は、本発明以前には不明である。
【００４６】
本発明者らは、ＥＧＦ応答性ＮＳＣが、グリア系列に徐々に限定されるようになることを見出した。このプロセスは、多分化能段階においてＮＳＣを維持するために、ｎｏｔｃｈ１を通じて作用するＣＮＴＦによって遮断される。本発明者らは、エリスロポエチン（ＥＰＯ）が、Ｍａｓｈ１を利用する機構を通じて、制限された神経前駆体の産生を指示することを見出した。
【００４７】
従って、本発明者らは、成体マウスの側脳室へ、ＣＮＴＦまたはＥＰＯのいずれかを６日間注入し、その後、本発明者らは、ＥＧＦ−応答性ＮＳＣの総数を調べるために、成体の上衣／上衣下を全て取り出したか、または、神経前駆体のインビボでの産生を試験した。ＣＮＴＦ注入により、ＮＳＣの数が２０〜２５％増加しており、このことは、グリア前駆体へのＮＳＣ分化を妨げることによるという可能性が最も高い。ＥＰＯ注入により、ＮＳＣの数が５０％減少し、そして、同時に神経前駆体倍加が生じた。抗ＥＰＯ抗体の注入により、ＮＳＣが２０％増加した。それゆえに、ＥＧＦ応答性ＮＳＣは、インビボで持続的にターンオーバーされ、その部分集団が、自発的に限定されたグリア前駆体へ分化し、一方、別の部分集団は、ＥＰＯによって限定された神経系列へと向う。
【００４８】
図１に、この機構が示される。従って、ＥＧＦ（またはその成体ホモログＴＧＦα）は、ＮＳＣ集団の自己再生／自己拡張を引き起こす。グリア細胞へと分化するグリア前駆細胞（ＧＰＣ）となる初期経路として、ＮＳＣは自発的な分化を受ける。この自発的な分化は、ＣＮＴＦによって減衰され得る。あるいは、ニューロンのみを産生する神経前駆細胞（ＮＰＣ）へと分化するように、ＮＳＣは、ＥＰＯおよび／またはＰＡＣＡＰ／ｃＡＭＰによって指示され得る。
【００４９】
この機構に基づいて、本発明者らは、神経系細胞を産生するための２段階の方法を開発した。第１の工程は、神経幹細胞の数を増加させることであり、それは、例えば、神経幹細胞を（例えば、ＥＧＦ、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＴＧＦα、エストロゲン、プロラクチン、ＰＡＣＡＰ、成長ホルモン、および／またはＩＧＦ−１によって）増殖させること、神経幹細胞の自発的な分化を（例えば、ＣＮＴＦによって）阻害すること、および／または神経幹細胞の生存を（例えば、エストロゲンによって）促進させることによって達成され得る。第２の工程は、神経幹細胞からの神経形成またはグリア形成を増強することである。例えば、エリスロポエチン、プロラクチン、セロトニン、ＰＡＣＡＰおよび／サイクリックＡＭＰが、ニューロン形成を増強させるために使用され得、一方、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）が、グリア形成の増強のために使用され得る。
【００５０】
本発明の方法は、インビボまたはインビトロで使用され得る。インビトロでは、本発明は、多数の神経系細胞を生じ、これは、研究または治療目的において使用され得る。特に、神経系細胞は、神経変性疾患または神経変性状態の移植処置において使用され得る。インビボでは、本発明の方法は、インサイチュで神経幹細胞の数を増加し得、そして神経幹細胞の拡大したプールからの神経形成またはグリア形成を増強し得る。生じた神経系細胞は、神経学的機能を増強するために、神経系において適切な位置へ移動し得るか、または、欠損もしくは機能不全の神経系細胞を補強し得る。さらに、インビボ適用およびインビトロ適用は、組み合わせ得る。従って、神経系細胞、特にインビトロで本発明の方法によって産生される神経幹細胞は、動物へ移植され得、そして、第２の工程の因子が、インビボで神経系細胞の分化を増強するために、動物へと提供され得る。必要に応じて、第１の工程の因子はまた、引き続いてニューロン細胞またはグリア細胞へと変換され得る神経幹細胞の数をさらに増加させるために、動物へと提供され得る。
【００５１】
１つの特に興味深い神経変性状態は、老化である。本発明者らは、脳室下帯における神経幹細胞の数が、老化したマウスにおいてはかなり減少していることを見出した。従って、本発明によって老化に関連する問題を改善することは、特に興味深いことである。
【００５２】
さらに、脳室下帯における神経幹細胞は、嗅覚ニューロンの供給源であり、そして、嗅覚機能不全は、前脳神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病およびハンチントン病）の特徴である。嗅球への神経系細胞移動の中断は、嗅覚識別の欠損へとつながり、新しい嗅覚の介在ニューロン（ｉｎｔｅｒｎｅｕｏｎ）の倍加は、新しい匂いの記憶を増強させる（Ｒｏｃｈｅｆｏｒｔら、２００２）。それゆえに、嗅覚識別または嗅覚記憶、ならびに嗅覚および嗅覚識別に関連する生理学的機能（例えば、交配、子孫認識および成育）を増強させるために、本発明は使用され得る。
【００５３】
本発明の別の特に重要な適用は、脳損傷（例えば、発作）の処置および／または改善である（実施例２）。発作を模倣する脳損傷を、ラットの運動野に導入し、そしてこの損傷されたラットは、その損傷の位置と相関する異常な行動を示した。次いで、これらのラットに７日間プロラクチンまたは成長ホルモン（これらは両方とも神経幹細胞増殖を増大し得る）を与えた。続いて、これらのラットにビヒクルコントロールまたはニューロン形成を増強するためのエリスロポエチンを７日間与えた。次いで、これらのラットを行動試験について一定期間観察し、そして解剖分析のために屠殺した。
【００５４】
この結果は、プロラクチン処置および成長ホルモン処置の両方が、損傷したラットにおける運動機能の改善をもたらしたことを示す。エリスロポエチンの追加は、特にプロラクチンと組合せた場合に、さらにこの効果を増強した。解剖分析はまた、移動するニューロンおよび／または神経幹細胞の数が、プロラクチンまたは成長ホルモンを含む処置毎に増加したことを示す。実際、プロラクチンおよびエリスロポエチンの組合せは、大部分のラットにおける脳損傷により生成された空隙の完全または部分的な充てんさえ生じた。従って、これらの因子（特に、これらの組合せ）を使用して、神経系細胞を産生し得、そして脳損傷を有する動物における神経学的機能を修復し得る。
【００５５】
興味深い知見は、プロラクチンおよび成長ホルモンが、異なる行動機能の修復をもたらしたことである。従って、これらのラットは、成長ホルモンを与えられた後のバランシングにおいて非対称的な前肢使用から回復し、一方、プロラクチンは、水泳の間の前肢の異常な位置付けを修正した。従って、異なる因子は、異なる神経機構に関与する、異なる細胞遊走パターンまたは異なる細胞の産生をもたらし得る。従って、複数の因子が、複雑な症状を有する疾患または状態の処置において組み合わされることが好ましい。好ましい組合せとしては、以下が挙げられる：
（ａ）プロラクチン、および神経分化またはグリア分化を増強する少なくとも１つの因子（例えば、ＥＰＯ、ＰＡＣＡＰ、サイクリックＡＭＰおよび／またはＢＭＰ）；
（ｂ）ＥＧＦ、および神経分化またはグリア分化を増強する少なくとも１つの因子（例えば、プロラクチン、ＥＰＯ、ＰＡＣＡＰ、サイクリックＡＭＰおよび／またはＢＭＰ、特に、プロラクチンおよび／またはＰＡＣＡＰ）；
（ｃ）プロラクチンと共に、神経幹細胞数を増加させる少なくとも１つの因子；
（ｄ）ＰＡＣＡＰと共に、神経幹細胞数を増加させる少なくとも１つの因子；
（ｅ）ＥＰＯと共に、神経幹細胞数を増加させる少なくとも１つの因子；ならびに
（ｆ）上記のものの組合せ。
【００５６】
特に好ましい組合せとしては、以下が挙げられる：ＥＧＦおよびＥＰＯ、ＥＧＦおよびプロラクチン、ＥＧＦおよびＰＡＣＡＰ、ＥＧＦおよび成長ホルモン（および／またはＩＧＦ−１）、ＥＧＦおよびプロラクチンおよび成長ホルモン（および／またはＩＧＦ−１）、ＥＧＦおよびプロラクチンおよびＰＡＣＡＰ、プロラクチンおよび成長ホルモン（および／またはＩＧＦ−１）、プロラクチンおよび成長ホルモン（および／またはＩＧＦ−１）およびＥＰＯ、プロラクチンおよびＰＡＣＡＰおよび成長ホルモン（および／またはＩＧＦ−１）。最も好ましい組合せとしては、ＥＧＦおよびＰＡＣＡＰ、ＥＧＦおよびプロラクチン、ならびにプロラクチンおよびＰＡＣＡＰが挙げられる。好ましくは、ＥＧＦは、使用されない。
【００５７】
（組成物）
本発明は、神経幹細胞数を増加し得る少なくとも１つの因子、および神経幹細胞の分化を増強し得る少なくとも１つの因子を含む組成物を提供する。いくつかの因子（例えば、プロラクチン）は、両方の機能が可能であることに留意すべきである。ＰＡＣＡＰはまた、神経分化を増強することに加えて、別のマイトジェンの存在下で神経幹細胞の増殖を増強する。
【００５８】
本発明において有用な因子には、ネイティブの因子と実質的な類似性および少なくとも１つの生物学的活性を共有するそれらのアナログおよび改変体が含まれる。例えば、下垂体において見出されるプロラクチンの主要な形態は、２３ｋＤａの分子量を有するが、プロラクチンの改変体は、多くの哺乳動物（ヒトを含む）において特徴付けられている。プロラクチン改変体は、一次転写物の選択的スプライシング、タンパク質分解切断、および他の翻訳後修飾から生じ得る。１３７アミノ酸のプロラクチン改変体は、下垂体前葉にあると記載されており、これは、選択的スプライシングの産物であるようである。プロラクチンの種々のタンパク質分解産物が特徴付けられており（特に、１４ｋＤａ、１６ｋＤａ、および２２ｋＤａのプロラクチン改変体）、これらの全ては、Ｃ末端で短縮されたプロラクチンフラグメントであるようである。プロラクチンについて報告された他の翻訳後修飾としては、二量体化、重合、リン酸化、グリコシル化、硫酸化、および脱アミド化が挙げられる。
【００５９】
本発明において有用なプロラクチンは、任意のプロラクチンアナログ、改変体または神経幹細胞数を増加し得るプロラクチン関連タンパク質を含む。プロラクチンアナログまたは改変体は、ネイティブヒトプロラクチンのアミノ酸配列の少なくとも約３０％を含むポリペプチドであり、これは、プロラクチンの生物学的活性を有する。好ましくは、プロラクチンの生物学的活性は、プロラクチンレセプターに結合する能力である。プロラクチンレセプターのいくつかのアイソフォームは、単離されているが（例えば、ラットにおける長い形態、中間の形態、および短い形態）、これらのアイソフォームは、プロラクチンに結合する同じ細胞外ドメインを共有する。従って、任意のレセプターアイソフォームを使用して、プロラクチン結合活性についてアッセイし得る。プロラクチンとしては、具体的に、以下が挙げられる：天然に存在するプロラクチン改変体、プロラクチン関連タンパク質、胎盤ラクトゲン、Ｓ１７９Ｄヒトプロラクチン（Ｂｅｒｎｉｃｈｔｅｉｎら、２００１）、種々の哺乳動物種（ヒト、他の霊長類、ラット、マウス、ヒツジ、ブタ、およびウシが揚げられるがこれらに限定されない）由来のプロラクチン、および米国特許第６，４２９，２８６号および同第５，９５５，３４６号に記載されるプロラクチン変異体。
【００６０】
同様に、ネイティブのＥＧＦに加えて、ＥＧＦアナログまたはＥＧＦ改変体もまた使用され得、これらは、ネイティブのＥＧＦと実質的なアミノ酸配列類似性を共有するべきであり、かつネイティブのＥＧＦと少なくとも１つの生物学的活性（例えば、ＥＧＦレセプターへの結合）を共有するべきである。ＥＧＦとして特に挙げられるものは、任意の主のネイティブＥＧＦ、ＴＧＦα、または組換え改変されたＥＧＦである。具体例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：２つのＣ末端アミノ酸の欠失および５１位において中性アミノ酸置換を有する組換え改変されたＥＧＦ（特にＥＧＦ５１ｇｌｎ５１；米国特許出願公開第２００２００９８１７８号Ａ１）、１６位のＨｉｓ残基が中性または酸性のアミノ酸で置き換えられているＥＧＦムテイン（ＥＧＦ−Ｘ１６）（米国特許第６，１９１，１０６号）、ネイティブＥＧＦのアミノ末端残基を欠く、ＥＧＦの５２−アミノ酸欠失変異体（ＥＧＦ−Ｄ）、Ｎ末端残基および２つのＣ末端残基（Ａｒｇ−Ｌｅｕ）が欠失されているＥＧＦ欠失変異体（ＥＧＦ−Ｂ）、２１位のＭｅｔ残基が酸化されているＥＧＦ−Ｄ（ＥＧＦ−Ｃ）、２１位のＭｅｔ残基が酸化されているＥＧＦ−Ｂ（ＥＧＦ−Ａ）、ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、βセルリン、アンフィレグリン（ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）、ニューレグリン（ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ）、または上記のうちのいずれかを含む融合タンパク質。他の有用なＥＧＦアナログまたは改変体は、米国特許出願公開第２００２００９８１７８号Ａ１、および米国特許第６，１９１，１０６号および同第５，５４７，９３５号に記載される。
【００６１】
別の例として、有用なＰＡＣＡＰアナログおよび改変体としては、限定することなく、ＰＡＣＡＰの３８アミノ酸改変体および２７アミノ酸改変体（それぞれ、ＰＡＣＡＰ３８およびＰＡＣＡＰ２７）、ならびに例えば、米国特許第５，１２８，２４２号；同第５，１９８，５４２号；同第５，２０８，３２０号；同第５，３２６，８６０号；同第５，６２３，０５０号；同第５，８０１，１４７号および同第６，２４２，５６３号に開示されるアナログおよび改変体が挙げられる。
【００６２】
エリスロポエチンアナログおよび改変体は、例えば、米国特許第６，０４８，９７１号および同第５，６１４，１８４号に開示される。
【００６３】
さらに、本発明において有用なプロラクチンの機能的アナログまたはさらなる因子が本発明において企図される。これらの機能的アゴニストは、ネイティブの因子のレセプターに結合しそして活性化するが、これらは、必ずしもネイティブの因子と実質的な配列類似性を共有する必要はない。例えば、ｍａｘａｄｉｌａｎは、ＰＡＣＡＰ１型レセプターの特異的アゴニストとして作用するポリペプチドである（Ｍｏｒｏら、１９９７）。
【００６４】
ＥＰＯの機能的アゴニストは、広く研究されている。ＥＭＰ１（ＥＰＯミメティックペプチド１）は、Ｊｏｈｎｓｏｎら、２０００に記載されるＥＰＯミメティックのうちの１つである。ＥＰＯの短いペプチドミメティックは、例えば、Ｗｒｉｇｈｔｏｎら、１９９６および米国特許第５，７７３，５６９号に記載される。低分子ＥＰＯミメティックは、例えば、Ｋａｕｓｈａｎｓｋｙ、２００１に開示される。ＥＰＯレセプターを活性化する抗体は、例えば、米国特許第５，８８５，５７４号；ＷＯ９６／４０２３１およびＷＯ９７／４８７２９に記載される。
【００６５】
ＥＧＦレセプターに対してアゴニスト活性を有する抗体は、例えば、Ｆｅｎａｎｄｅｚ−Ｐｏｌ，１９８５および米国特許第５，７２３，１１５号に記載される。さらに、ＥＰＯレセプター、ＥＧＦレセプター、プロラクチンレセプターおよび多くの他の細胞表面レセプターを活性化するアミノ酸配列もまた、米国特許第６，３３３，０３１号に開示される；プロラクチンレセプターおよびＥＰＯレセプターに対してアゴニスト活性を有する金属錯化レセプターリガンドは、米国特許第６，４１３，９５２号に見出され得る。レセプター（例えば、ＥＰＯレセプターおよびプロラクチンレセプター）に対するリガンドを同定および調製する他の方法は、例えば、米国特許第５，５０６，１０７号および同第５，８３７，４６０号に記載される。
【００６６】
各アナログ、改変体または機能的アゴニストの有効量が、ネイティブの因子または化合物についての有効量と異なり得ることに留意すべきであり、そして各々の場合における有効量は、本明細書中の開示に従って当業者により決定され得る。好ましくは、ネイティブの因子、またはそのネイティブの因子と実質的な配列類似性を共有するアナログおよび改変体は、本発明において使用される。
【００６７】
薬学的組成物もまた提供され、これは、上記の因子、および薬学的に受容可能な賦形剤および／またはキャリアを含む。
【００６８】
薬学的組成物は、以下のような当該分野で公知の任意の経路を介して送達され得る：非経口、髄腔内、脈管内、静脈内、筋内、経皮的、皮内、皮下、鼻腔内、局所的、経口、直腸、膣、肺または腹腔内。好ましくは、この組成物は、注射または灌流により中枢神経系に送達される。より好ましくは、これは、脳室、特に側脳室に送達される。あるいは、この組成物は、好ましくは全身経路（例えば、皮下投与）により送達される。例えば、本発明者らは、プロラクチン、成長ホルモン、ＩＧＦ−１、ＰＡＣＡＰおよびＥＰＯが、皮下投与により有効に送達されて、脳室下帯（ｓｕｂｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｚｏｎｅ）における神経幹細胞の数を調節し得ることを発見した。
【００６９】
組成物が、脳に直接送達されない場合、およびその組成物中の因子が、血液脳関門を容易に横切らない場合、血液脳関門浸透剤が、脳への進入を容易にするために必要に応じて含まれ得る。血液脳関門浸透剤は、当該分野で公知であり、これらとしては、例として、米国特許第５，６８６，４１６号；同第５，５０６，２０６号および同第５，２６８，１６４号に記載されるブラジキニンおよびブラジキニンアゴニスト（例えば、ＮＨ２−アルギニン−プロリン−ヒドロキシプロキシプロリン−グリシン−チエニルアラニン−セリン−プロリン−４−Ｍｅ−チロシンΨ（ＣＨ２ＮＨ）−アルギニン−ＣＯＯＨ）が挙げられる。あるいは、これらの因子は、米国特許第６，３２９，５０８号；同第６，０１５，５５５号；同第５，８３３，９８８号または同第５，５２７，５２７号に記載されるようなトランスフェリンレセプター抗体に結合体化され得る。これらの因子はまた、その因子と、脳毛細管内皮細胞レセプター（例えば、トランスフェリンレセプター）と反応性のリガンド（例えば、米国特許第５，９７７，３０７号を参照のこと）とを含む融合タンパク質として送達され得る。
【００７０】
薬学的組成物は、所望の治療剤と、意図された投与経路に適した適切なビヒクルと混合することにより調製され得る。本発明の薬学的組成物を作製する際に、治療剤は、通常、賦形剤と混合されるか、賦形剤により希釈されるか、またはカプセル、サシェ、紙または他の容器の形態であり得るようなキャリア内に包含される。薬学的に授与可能な賦形剤は、希釈剤として作用する場合、これは、固体、半固体、または液体の材料であり得、これらは、治療剤のためのビヒクル、キャリアまたは媒体として作用する。従って、組成物は、錠剤、丸剤、粉末、ロゼンジ、サシェ、カシェ剤、エリキシル、懸濁液、乳剤、液剤、シロップ、エーロゾル（固体または液体媒体中として）、例えば、１０重量％までの治療剤を含有する軟膏、軟質および硬質のゼラチンカプセル、坐剤、滅菌注射用液、ならびに滅菌パッケージングされた粉末の形態であり得る。
【００７１】
適切な賦形剤のいくつかの例としては、人工脳髄液、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギナート、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、滅菌水、シロップ、およびメチルセルロースが挙げられる。処方物は、さらに以下を含み得る：タルク、ステアリン酸マグネシウム、および鉱油のような滑沢剤；湿潤剤；乳化剤および懸濁剤；ヒドロキシ安息香酸メチルおよびヒドロキシ安息香酸プロピルのような保存剤；甘味料；ならびに香味料。本発明の組成物は、当該分野で公知の手順を使用することにより、患者への投与後に、治療剤の急速な放出、持続された放出、または遅延した放出を提供するように処方され得る。
【００７２】
錠剤のような固体組成物を調製するために、治療剤は、薬学的賦形剤と混合されて、本発明の化合物の均一な混合物を含む固体の予め配合された組成物を形成する。これらの予め配合された組成物を均一として言及する場合、これは、組成物が、等しく有効な単位投薬形態（例えば、錠剤、丸剤およびカプセル）に容易に小分けされ得るように、その組成物全体にわたって一様に治療剤が分散されることを意味する。
【００７３】
本発明の錠剤または丸剤は、被覆されるか、またはそうでなければ長期の作用という利点を提供する投薬形態を提供するように混合され得る。例えば、錠剤または丸剤は、内部投薬成分および外部投薬成分を含み得、後者は、前者を包み込む形態である。この２つの成分は、腸溶性層により隔てられ得、この腸溶層は、胃における崩壊に抵抗するように作用し、そして内部成分がインタクトなままで十二指腸に通過するかまたは放出を遅らせることを可能にする。種々の材料は、このような腸溶性層または被覆のために使用され得、このような材料としては、多数のポリマー酸、およびポリマー酸とこのような材料（シェラック、セチルアルコール、および酢酸セルロースとして）との混合物が挙げられる。
【００７４】
本発明の新規な組成物が経口投与または注射による投与のために組み込まれ得る液体形態としては、水溶液、適切に香味付けされたシロップ、水性懸濁液または油懸濁液、および食用油（例えば、トウモロコシ油、綿実油、ゴマ油、ココナッツ油、またはピーナッツ油）を用いて香味付けした乳剤、ならびにエリキシルおよび同様の薬学的ビヒクルが挙げられる。
【００７５】
吸入または吹き入れ（insufflation）のための組成物としては、薬学的に受容可能な、水性溶媒もしくは有機溶媒、またはそれらの混合物中の溶液および懸濁液、ならびに粉末が挙げられる。液体または固体の組成物は、本明細書中に記載されるような適切な薬学的に受容可能な賦形剤を含み得る。これらの組成物は、局所効果または全身効果のための経口または経鼻呼吸経路により投与される。好ましくは薬学的に受容可能な溶媒中の組成物は、不活性ガスの使用により噴霧され得る。噴霧される溶液は、噴霧デバイスから直接吸入されても、噴霧デバイスが、フェースマスクテントもしくは間欠正圧換気機に取り付けられてもよい。溶液、懸濁液または粉末の組成物は、適切な様式で処方物を送達するデバイスから好ましくは経口または経鼻で投与され得る。
【００７６】
本発明の方法において使用される別の処方物は、経皮送達デバイス（「パッチ」）を使用する。このような経皮パッチを使用して、制御された量で本発明の治療剤の連続的または不連続な注入を提供し得る。薬剤の送達のための経皮パッチの構築および使用は、当該分野で周知である。例えば、米国特許第５，０２３，２５２号（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。このようなパッチは、薬剤の連続的、拍動性、または要求に応じた送達用に構築され得る。
【００７７】
本発明に用いるための、他の適切な処方物が、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに見出され得る。
【００７８】
以下の略語は、以下の意味を有する。略語は、一般に受け入れられている意味を有するとは規定されない。
ＥＧＦ ＝表皮増殖因子
ＰＤＧＦ ＝血小板由来増殖因子
ＤＭＳＯ ＝ジメチルスルホキシド
ＣＮＴＦ ＝毛様体神経栄養性因子
ＥＰＯ ＝エリスロポエチン
ＮＳＣ ＝神経幹細胞
ＧＰＣ ＝グリア前駆細胞
ＮＰＣ ＝神経前駆細胞
ＰＡＣＡＰ＝下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド
ｃＡＭＰ ＝サイクリックＡＭＰ
【実施例】
【００７９】
（材料および方法）
（神経幹細胞培養）
神経幹細胞培養のためのプロトコルは、米国特許第５，７５０，３７６号またはＳｈｉｎｇｏら，２００１に詳細に示される。簡単にいうと、Ｅ１４内側および側方の神経節隆起から胚性神経幹細胞を調製した。成熟した神経幹細胞を、成体マウスの脳室下帯から調製した。組織を、２０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ、または各々のケースに示されるような他の成長因子を含む標準培地内で培養し、ニューロスフェア（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ）を形成した。標準培地の組成物は、以下のようである：ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）；グルコース（０．６％）；グルタミン（２ｍＭ）；重炭酸ナトリウム（３ｍＭ）；ＨＥＰＥＳ（５ｍＭ）；インスリン（２５μｇ／ｍｌ）；トランスフェリン（１００μｇ／ｍｌ）；プロゲステロン（２０ｎＭ）；プトレシン（６０μＭ）；および塩化セレン（３０ｎＭ）。
【００８０】
７日後、機械的分離によってニューロスフェア（初代のニューロスフェア）を経て、単一の細胞（初代）として再度播種した。２代目のニューロスフェアのために、次いで、この単一の細胞を７日間培養し、２代目のニューロスフェアを得た。
【００８１】
（増殖因子の注入）
２月齢のＣＤ−１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ−Ｒｉｖｅｒ，Ｌａｖａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）を、ペントバルビタールナトリウム（１２０ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｐ．）で麻酔し、浸透圧ポンプ（Ａｌｚｅｔ １００７Ｄ；Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）で移植した。カニューラを右側脳室（ブレグマに対して、前後に＋０．２ｍｍ、側方に＋０．８ｍｍ、および背腹方向に硬膜下−２．５ｍｍ、ラムダとブレグマとの間の頭蓋レベルで）に配置した。ヒト組換えＥＰＯ（１０００ＩＵ／ｍｌ）、ウサギ抗ＥＰＯ中和抗体（１００μｇ／ｍｌ）、ウサギＩｇＧ（１００μｇ／ｍｌ）、ラット組換えＣＮＴＦ（３３μｇ／ｍｌ）、またはヒト組換えＥＧＦ（３３μｇ／ｍｌ）を、０．９％生理食塩水（１ｍｇ／ｍｌ マウス血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）を含む）中に溶解した。各動物に、０．５μｌ／時間の流速で、６日間継続的に注入し、１日あたり約２５ＩＵのＥＰＯ、３μｇの抗体、あるいは４００ｎｇのＣＮＴＦまたはＥＧＦを送達した。
【００８２】
（発作の研究のための試験動物）
雄成体ロングエバンスラット（２５０〜３５０ｇ）を、Ｃｈａｒｌｓ Ｒｉｖｅｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｆａｒｍｓから入手し、任意の処理前の２週間、コロニーに適応させた。手術の１週間前に、このラットで、行動試験におけるベースライン試験を行った。
【００８３】
（局所虚血性の損傷および注入）
発作研究のための動物に、感覚運動皮質の片側の脈管遮断を施した。イソフルラン麻酔を用いて、皮膚を切開し、収縮させ、そして表面の筋膜を頭蓋から除去した。頭蓋の開口部を、硬膜を傷つけないように注意して、以下の座標に形成した：ＡＰ ＋４．０〜−２．０；Ｌ １．５〜４（傍矢状の隆線；Ｋｏｌｂら，１９９７）。この硬膜を切り、頭蓋の開口部から収縮させた。生理食塩水中に浸漬した綿棒で、露出した軟膜越しに穏やかに擦り、血管を除いた。次いで、反対側の半球に穴を開け、浸透圧ミニポンプ（ＡＰ −０．５；Ｌ １．５）を備えたカニューラのための穴を提供した。浸透圧ミニポンプを、肩甲骨の間の皮膚の下に配置し、チューブを、速乾性セメントで頭蓋に取り付けたカニューラに皮膚の下で接続した。一旦止血がなされると、頭皮を５−Ｏ 滅菌縫合糸を用いて縫合し、閉じた。この動物に、Ｂａｎａｍｉｎｅ（鎮痛薬（ａｎａｌｇｅｓｉｃ））の注射を１回与え、ホームケージに戻した。骨に穴を開けた偽手術動物には麻酔のみを与え、皮膚を切開し、そして縫合した。
【００８４】
６日後、この動物を、行動試験を用いて評価した。次の日、この動物を再度麻酔し、ミニポンプを適切な溶液を備えた第２のミニポンプと置換した。偽手術動物は、麻酔のみを行った。これらの動物を、７日後、１４日後、および２８日後に再試験し、１週間目、２週間目、３週間目、４週間目および６週間目での行動測定結果を得た。
【００８５】
（前肢抑止試験）
この試験は、新皮質前方領域の機能的な保全性の、感度の高い測定を構成することが示されている。通常のラットにおいて、泳ぎは、後肢からの推進力によってなされる。前肢は、通常、任意の動作が抑止され、動かないままであり、動物の頚部の下部と一緒にされる。前肢の抑止は、泳いでいる間、動物を撮影することによって評価した。動物を、室温の水（約２５℃）で深さ２５ｃｍまで満たした水槽（３０ｗ×９０ｌ×４３ｈ ｃｍ）の一方の端に導入し、これらの動物が泳ぐのを、９．５ｃｍ四方の可視的プラットフォームに撮影した。このプラットフォームを、水面の２ｃｍ上に投影し、そして水槽の反対側の端に配置する。水槽の長さに沿った３回の泳ぎにおいて、各前肢によってなされる場合、動作回数の計数によって抑止をスコアリングした。泳ぎは、動物が、泳ぎを試行している間に水槽の側面に接触しなかった場合にのみ、スコアリング可能であると考えられる。
【００８６】
（前肢非対称性試験）
動物の前足の非対称性を、それらの動物（直径２５ｃｍのアクリルシリンダー中、アクリルプラットフォーム上）を下から撮影することによって決定した。動物が、５分間に左前足または右前足を上げ下げした回数をそれぞれ計数することによって、姿勢の安定性の挙動における優先度を決定した。この試験は、前肢の使用における非対称性の測定を可能にし、測定結果は、外傷に対する同側の肢の使用に対する信頼できるバイアスを示す。
【００８７】
（脳の解剖学的分析）
６週の終りに、動物に過剰量のエタノール（Ｅｕｔｈａｎｏｌ）を与え、ピクリン酸中の０．９％生理食塩水および４％パラホルムアルデヒドで心臓内を灌流した。この脳を細胞保護し、そしてビブラトームで、４０ミクロンに切った。５セットの切片を、４００ミクロンごとに保持した。２セットを染色した（一方をクレシルバイオレットで、そしてもう一方をダブルコルチンで）。残りのセットは、保存した。クレシルバイオレット染色を、スライド上で実施し、一方ダブルコルチン染色は、自由なフロートの切片における免疫組織化学手順で実施した。クレシルバイオレット染色は、損傷領域の評価を可能にし、一方、ダブルコルチン染色は、移動性の神経前駆細胞（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）に存在するタンパク質と会合した。
【００８８】
（実施例１）
（インビボでのＣＮＴＦおよびＥＰＯの効果）
インビボでのＣＮＴＦおよびＥＰＯの有効性を決定するために、ＣＮＴＦまたはＥＰＯを、材料および方法に記載されるように、６日間にわたり成体マウスに注入した。次いで、その脳組織を収集し、注入後の脳における神経幹細胞の数の指標として神経幹細胞の増殖に用いた。あるいは、チロシンヒドロキシラーゼまたはＭａｓｈ１について脳組織を染色し、神経発生領域を決定した。
【００８９】
Ｓｈｉｍａｚａｋｉら，２００１に詳細に記載されるように、ＣＮＴＦ注入は、脳から得られ得る初期ニューロスフェアの有意な増加（約２５％）をもたらした。さらに、ＥＧＦおよびＣＮＴＦの同時注入は、神経幹細胞の数を４０％増加させた。従って、ＣＮＴＦは、特にＥＧＦとの組合せにおいて、神経幹細胞数を増加させ得る。ＢｒｄＵがまた動物に与えられる場合、ＣＮＴＦは、ＢｒｄＵ陽性細胞の数を増加させなかったように、ＣＮＴＦは、神経幹細胞の増殖を刺激しない。
【００９０】
ＣＮＴＦは、神経幹細胞の増殖または生存を促進しないので、本発明者らは、ＣＮＴＦが、神経幹細胞の自発的な分化を阻害するとの仮説を立てた。系統的に制限された細胞への自発的な分化により、神経幹細胞は、自己再生する能力がなく、神経幹細胞の数は、分化細胞の数が増えるにつれて減少する。従って、ＣＮＴＦが、この自発的な分化を阻害する場合、ＣＮＴＦ存在下で生成されるニューロスフェアは、ＣＮＴＦ非存在下で生成したニューロスフェアより展開可能であり、そして多能である。
【００９１】
従って、本発明者らは、ＥＧＦ単独中またはＥＧＦ＋ＣＮＴＦ中で生成したニューロスフェアの展開可能性および多能性を比較した。展開可能性について、初代ニューロスフェアを分離し、そしてクローン密度で再プレートして２代目ニューロスフェアを産生し、そして単一の初代のスフェア由来の２代目ニューロスフェアの数を計数した。この結果は、ＥＧＦ＋ＣＮＴＦ中で産生した初代ニューロスフェアが、有意なさらなる２代目スフェアをもたらしたことを表し、これらの初代スフェアが、ＥＧＦ単独中で産生したスフェアより展開可能性のある細胞を含むことを示す。多能性について、各ニューロスフェア由来のニューロン、乏突起膠細胞およびの星状膠細胞のパーセントを決定した。その結果は、ＥＧＦ単独中で生成したニューロスフェアがまた、ＥＧＦ＋ＣＮＴＦ中で生成したニューロスフェアより、４倍の数のグリア細胞が産生したことを表す。従って、神経幹細胞は、デフォルトで、グリア細胞に分化し、これはＣＮＴＦによって阻害され得る。
【００９２】
一方、ＥＰＯは、神経幹細胞の数を、約５０％減少させ、神経発生を増加させた。従って、たとえ神経幹細胞が自発的にグリア系に分化するとしても、神経幹細胞の一部は、ＥＰＯによって神経前駆細胞の形成が誘導され得る。なおさらに、抗ＥＰＯ抗体の注入は、神経幹細胞の増加をもたらすが、非特異的ＩｇＧは、神経幹細胞の増加をもたらさなかった。このことは、ＥＰＯを含む進行中のインビボでの神経発生プロセスが存在することを示す。
【００９３】
（実施例２）
（動作モデルにおける因子組合せの効果）
脳に損傷を受けた動物における因子の種々の組合せの効果を決定するために、動作のモデルとして、ラットの脳に局所的な虚血性損傷を誘導した。脳損傷の結果、この動物は、運動皮質に損傷を有し、２つの行動試験において異常な行動をした。１つは前肢抑止試験（新皮質前部の領域の機能保全性の感覚測定）である。通常のラットは、泳ぐとき、前肢の使用を抑止するが、本実験において、運動皮質の一方を損傷させた場合、運動皮質は、体の反対側を制御するので、そのラットは、反対側の前肢の使用を抑止しなかった。他の試験（前肢非対称性試験）において、正常なラットは、それらのラットが自身のバランスをとることを試行する場合と同様に、両前肢を使用する。しかし、損傷したマウスは、同側の前肢を使用することを好む。何故ならば、おそらくそれらのマウスは、自身の反対側の前肢をコントロールし得ないからである。
【００９４】
次いで、この動物に、種々の試験因子を与え、前肢の抑止試験および脳解剖学におけるこれらの因子の効果を評価した。コントロールとして、偽手術コントロール動物群に、偽脳損傷および試験に使わない因子を与え、そしてビヒクルコントロール群に脳損傷ならびに人工的な大脳脊髄液（ＣＳＦ）の注入を行った。各試験群で行った処置を、以下にまとめた：
【００９５】
【表１】
【００９６】
脳損傷、注入、行動試験および解剖学的分析のスケジュールおよび手順は、材料および方法に記載される。
【００９７】
（Ａ．プロラクチンおよびプロラクチン＋ＥＰＯの効果）
脳損傷前、全てのラットは、前肢抑止試験において両前足を抑止した。損傷後、全ての虚血性群（群２〜群６）は、反対側の前足を抑止しなかったが、同側の前足は抑止し続けた。試験因子の注入により、２つのプロラクチン群（群３および４群）は、より高い前足の抑止を示した。実際、最終週（注入完了の４週間後）の終りまでには、プロラクチン＋ＥＰＯ群（群４）は、コントロールと区別不可能であった。従って、プロラクチン、および特に、プロラクチンとＥＰＯとの組み合せは、行動の代表的な症状からの回復をもたらした。
【００９８】
解剖学的には、プロラクチン群は、脳において高度のダブルコルチン染色を示し、このことは、プロラクチンが、広範囲の神経発生を誘導したことを示す。プロラクチン＋ＥＰＯ群のラットは、拡張された脳室下帯を有し、このことは、この領域における有意な細胞増殖を示す。さらに、多くのダブルコルチン陽性細胞が、外傷領域、白質および側脳室において見られた。ダブルコルチン陽性細胞は、脳室下帯と外傷領域との間に観察される。ダブルコルチンは、移動性神経前駆細胞のマーカーであるので、これらの結果は、処理の際に神経幹細胞が神経前駆細胞を生じ、これらの前駆細胞が、外傷領域に移動したことを示す。外傷領域における新たな増殖は、非常に広範囲であり、その結果、この群の大部分のラットにおいて、虚血性外傷によって生じた空洞が、完全にまたは部分的に満たされた。従って、これらの解剖学的結果は、プロラクチン、またはプロラクチンとＥＰＯとの組合せが、脳損傷（例えば、発作）処置に用いられ得る行動学的研究を、強く支持する。
【００９９】
（Ｂ．成長ホルモンおよび成長ホルモン＋ＥＰＯの効果）
前肢非対称性試験の結果は、全ての試験群において、６週目の終りには非対称の程度は下がったが、成長ホルモンを与えた群（群３および群４）は、初めの４週間で、より速いかつ広範囲の回復が見られたことを示す。これらの結果は、解剖学的分析からの結果と一致し、成長ホルモン単独（群３）は、ダブルコルチン陽性細胞の増加をもたらし、そして成長ホルモンとＥＰＯとの組合せ（群４）は、側脳室の周囲でのダブルコルチン陽性細胞の移動をもたらした。
【０１００】
従って、成長ホルモン単独、または成長ホルモンとＥＰＯとの組合せのいずれかは、脳における発作モデルの運動神経関連機能ならびに神経の形成／移動を改善し、このことは、成長ホルモンを用いて、脳損傷を処置または改善し得ることを示す。
【０１０１】
従って、プロラクチンおよびプロラクチンとＥＰＯとの組み合せは、前肢抑止試験における損傷したラットの運動機能を改善し、前肢非対称性試験は改善しなかったが、一方、成長ホルモンおよび成長ホルモンとＥＰＯとの組合せは回復効果を有した。これらの結果は、様々な因子が、異なる神経経路を刺激し得、そして異なる神経細胞の回路の回復を促進することを立証し、より完全かつ効果的な処置結果のためには、種々の因子を組み合わせることが重要であることを示す。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】図１は、神経幹細胞（ＮＳＣ）による神経新生およびグリア新生についての模式図である。ＥＧＦ（すなわち、ＥＧＦの成体ホモログのＴＧＦα）は、ＮＳＣ集団の自己複製／増殖を誘導する。ＮＳＣは、グリア前駆細胞（ＧＰＣ）になる規定の経路において自然発生的な分化を起こす。この自然発生的な分化は、ＣＮＴＦによって減弱され得る。ＧＰＣは、アストロサイトおよび／またはオリゴデンドロサイトに分化する（この分化は、ＥＧＦによって促進される）。あるいは、ＮＳＣは、ニューロンだけを産生する神経前駆細胞（ＮＰＣ）に分化するように、ＥＰＯおよび／またはＰＡＣＡＰ／ｃＡＭＰによって指示を受け得る。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経前駆細胞および／またはグリア前駆細胞を増殖させるために、そのような処置を必要とする疾患または状態を有する哺乳動物に投与される医薬組成物であって、
（ａ）神経幹細胞の数を増加させるのに十分な量の、プロラクチン、成長ホルモン、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）および上皮成長因子（ＥＧＦ）からなる群から選択される因子、および
（ｂ）該神経幹細胞から神経前駆細胞またはグリア前駆細胞の生産を促進させるのに十分な量の、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）およびｃＡＭＰからなる群から選択される因子、
を有効成分として含む、因子（ａ）および（ｂ）の同時投与または段階的投与のための組成物（但し、因子（ａ）がＥＧＦである場合、因子（ｂ）はＰＡＣＡＰまたはｃＡＭＰである。）。
【請求項２】
因子（ａ）および（ｂ）が、同時投与により投与される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
因子（ａ）および（ｂ）が、段階的投与により投与される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
因子（ａ）および（ｂ）の段階的投与が、初めに因子（ａ）を投与し、次いで因子（ｂ）を投与することにより行なわれる、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
因子（ａ）がプロラクチンである、請求項１−４の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項６】
因子（ａ）が成長ホルモンである、請求項１−４の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項７】
因子（ａ）が毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）である、請求項１−４の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項８】
因子（ａ）が上皮成長因子（ＥＧＦ）であり、因子（ｂ）が下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）またはｃＡＭＰである、請求項１−４の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項９】
因子（ｂ）がエリスロポエチン（ＥＰＯ）である、請求項１−７の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項１０】
因子（ｂ）が下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）である、請求項１−８の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項１１】
因子（ｂ）がｃＡＭＰである、請求項１−８の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項１２】
脳内投与用である、請求項１−１１の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項１３】
該脳内投与が、哺乳動物の前脳の脳室下帯に対して行なわれる、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
該疾患または状態が脳損傷である、請求項１−１３の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項１５】
該脳損傷が発作である、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
該疾患または状態が、アルツハイマー病、多発性硬化症（ＭＳ）、ハンティングトン病、筋萎縮性側索硬化症、およびパーキンソン病からなる群より選択される、請求項１−１３の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項１７】
神経前駆細胞またはグリア前駆細胞を産生する方法であって、以下：
（ａ）少なくとも１つの神経幹細胞を提供する工程、
（ｂ）該神経幹細胞を、プロラクチン、成長ホルモン、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）および上皮成長因子（ＥＧＦ）からなる群より選択される因子の、該神経幹細胞の数を増加させるのに十分な量と接触させる工程、および
（ｃ）工程（ｂ）からの該神経幹細胞を、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）およびｃＡＭＰからなる群より選択される因子の、該神経幹細胞から神経前駆細胞またはグリア前駆細胞の産生を促進させるのに十分な量と接触させる工程、
を包含する方法（但し、工程（ｂ）の因子がＥＧＦである場合、工程（ｃ）の因子はＰＡＣＡＰまたはｃＡＭＰである。）。
【請求項１８】
工程（ｂ）が工程（ｃ）の前に実施される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
工程（ｂ）および（ｃ）が同時に実施される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
該神経幹細胞が胚性細胞ではない、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
該神経幹細胞が成体神経幹細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
該神経幹細胞が非ヒト哺乳動物細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
該神経幹細胞が非ヒト哺乳動物に神経幹細胞を移植することによって提供される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
該神経前駆細胞または該グリア前駆細胞が培地で生産され、非ヒト哺乳動物に移植される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
該移植された神経幹細胞が該非ヒト哺乳動物と同系である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
該神経幹細胞が該非ヒト哺乳動物の前脳の脳室下帯に存在する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
該非ヒト哺乳動物が、神経変性疾患または神経変性状態を有しているか、または有する疑いがある、請求項２２に記載の方法。
【請求項１】
神経前駆細胞および／またはグリア前駆細胞を増殖させるために、そのような処置を必要とする疾患または状態を有する哺乳動物に投与される医薬組成物であって、
（ａ）神経幹細胞の数を増加させるのに十分な量の、プロラクチン、成長ホルモン、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）および上皮成長因子（ＥＧＦ）からなる群から選択される因子、および
（ｂ）該神経幹細胞から神経前駆細胞またはグリア前駆細胞の生産を促進させるのに十分な量の、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）およびｃＡＭＰからなる群から選択される因子、
を有効成分として含む、因子（ａ）および（ｂ）の同時投与または段階的投与のための組成物（但し、因子（ａ）がＥＧＦである場合、因子（ｂ）はＰＡＣＡＰまたはｃＡＭＰである。）。
【請求項２】
因子（ａ）および（ｂ）が、同時投与により投与される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
因子（ａ）および（ｂ）が、段階的投与により投与される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
因子（ａ）および（ｂ）の段階的投与が、初めに因子（ａ）を投与し、次いで因子（ｂ）を投与することにより行なわれる、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
因子（ａ）がプロラクチンである、請求項１−４の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項６】
因子（ａ）が成長ホルモンである、請求項１−４の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項７】
因子（ａ）が毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）である、請求項１−４の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項８】
因子（ａ）が上皮成長因子（ＥＧＦ）であり、因子（ｂ）が下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）またはｃＡＭＰである、請求項１−４の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項９】
因子（ｂ）がエリスロポエチン（ＥＰＯ）である、請求項１−７の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項１０】
因子（ｂ）が下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）である、請求項１−８の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項１１】
因子（ｂ）がｃＡＭＰである、請求項１−８の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項１２】
脳内投与用である、請求項１−１１の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項１３】
該脳内投与が、哺乳動物の前脳の脳室下帯に対して行なわれる、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
該疾患または状態が脳損傷である、請求項１−１３の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項１５】
該脳損傷が発作である、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
該疾患または状態が、アルツハイマー病、多発性硬化症（ＭＳ）、ハンティングトン病、筋萎縮性側索硬化症、およびパーキンソン病からなる群より選択される、請求項１−１３の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項１７】
神経前駆細胞またはグリア前駆細胞を産生する方法であって、以下：
（ａ）少なくとも１つの神経幹細胞を提供する工程、
（ｂ）該神経幹細胞を、プロラクチン、成長ホルモン、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）および上皮成長因子（ＥＧＦ）からなる群より選択される因子の、該神経幹細胞の数を増加させるのに十分な量と接触させる工程、および
（ｃ）工程（ｂ）からの該神経幹細胞を、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）およびｃＡＭＰからなる群より選択される因子の、該神経幹細胞から神経前駆細胞またはグリア前駆細胞の産生を促進させるのに十分な量と接触させる工程、
を包含する方法（但し、工程（ｂ）の因子がＥＧＦである場合、工程（ｃ）の因子はＰＡＣＡＰまたはｃＡＭＰである。）。
【請求項１８】
工程（ｂ）が工程（ｃ）の前に実施される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
工程（ｂ）および（ｃ）が同時に実施される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
該神経幹細胞が胚性細胞ではない、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
該神経幹細胞が成体神経幹細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
該神経幹細胞が非ヒト哺乳動物細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
該神経幹細胞が非ヒト哺乳動物に神経幹細胞を移植することによって提供される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
該神経前駆細胞または該グリア前駆細胞が培地で生産され、非ヒト哺乳動物に移植される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
該移植された神経幹細胞が該非ヒト哺乳動物と同系である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
該神経幹細胞が該非ヒト哺乳動物の前脳の脳室下帯に存在する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
該非ヒト哺乳動物が、神経変性疾患または神経変性状態を有しているか、または有する疑いがある、請求項２２に記載の方法。
【図１】
【公開番号】特開２００７−２１１０２３（Ｐ２００７−２１１０２３Ａ）
【公開日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１２０７３９（Ｐ２００７−１２０７３９）
【出願日】平成１９年５月１日（２００７．５．１）
【分割の表示】特願２００３−５２３６３３（Ｐ２００３−５２３６３３）の分割
【原出願日】平成１４年８月３０日（２００２．８．３０）
【出願人】（５０４０７５３１５）ステム セル セラピューティクス インコーポレイテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年５月１日（２００７．５．１）
【分割の表示】特願２００３−５２３６３３（Ｐ２００３−５２３６３３）の分割
【原出願日】平成１４年８月３０日（２００２．８．３０）
【出願人】（５０４０７５３１５）ステム セル セラピューティクス インコーポレイテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
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