神経幹細胞の増殖および神経発生のための黄体化ホルモン（ＬＨ）、および絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）の使用
本発明は、フェロモン、黄体化ホルモン（ＬＨ）および／またはヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を用いることによって、神経幹細胞の数または神経発生を増加する方法を提供する。この方法は、インサイチュでより多くの神経幹細胞を得るためにインビボで実施され得、次いで、神経細胞の損失または機能不全を補償するために、より多くのニューロンまたはグリア細胞を産生し得る。この方法はまた、培養物において多数の神経幹細胞を産生するためにインビトロで実施され得る。この培養された神経幹細胞は、例えば、神経変性疾患または神経変性状態に罹患するか、あるいは神経変性疾患または神経変性状態を有すると疑われる患者または動物の移植処置のために使用され得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、３５米国特許法第１１９条（ｅ）に基づいて、２００４年２月１３日に出願された米国仮特許出願第６０／５４４，９１５号の利益を主張する。この先行出願の全開示は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、神経幹細胞の数および神経発生を増加させる方法、ならびにそれらの有用な組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
（参考文献）
【数１】
【０００４】
【数２】
【０００５】
【数３】
【０００６】
【数４】
【０００７】
【数５】
【０００８】
本出願において上記または他の部分に引用される刊行物、特許および特許出願の全ては、個々の刊行物、特許出願または特許の各々の開示が、あたかもその全体において参考として援用されることが具体的にかつ別個に示されるのと同じ程度まで、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【０００９】
（発明の背景）
近年、神経変性疾患は、これらの障害に関して最も危険である高齢者集団の増加に起因して、重大な懸念となっている。神経変性疾患としては、中枢神経系（ＣＮＳ）の特定部位における神経細胞の変性に関連付けられている疾患が挙げられ、この疾患は、意図された機能を実行するこれらの細胞の能力を不能にする。これらの疾患としては、アルツハイマー病、ハンティングトン病、筋萎縮性側索硬化症、およびパーキンソン病が挙げられる。さらに、おそらく（罹患した人の数に対する）ＣＮＳ機能不全の最も多くの部分は、神経細胞の欠損によってではなく、存在する神経細胞の異常な機能によって特徴付けられている。これは、ニューロンの不適切な発火、または神経伝達物質の異常な合成、放出、およびプロセシングに起因し得る。これらの機能不全は、うつ病および癲癇のような十分に研究され特徴付けられた障害、または神経症および精神病のようなより理解されていない障害の結果であり得る。さらに、脳損傷は、しばしば、神経細胞の欠損、罹患した脳領域の不適切な機能、およびその結果の行動異常を生じる。
【００１０】
従って、神経変性疾患または神経変性状態を処置するために、変性したニューロンまたは欠損したニューロンを補償するように脳に神経細胞を供給することが望ましい。この目標のための１つのアプローチは、患者の脳に神経細胞を移植することである。このアプローチは、好ましくは、対移植片宿主拒絶（ｈｏｓｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｇｒａｆｔ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）もしくは対宿主移植片拒絶（ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）が最小になり得るように同じ個体または非常に関連する個体に由来する、多量の神経細胞の供給源を必要とする。１人の人物から多量のニューロンまたはグリア細胞を取り出し、別の人物に移植することは現実的ではないので、多量の神経細胞を培養する方法が、このアプローチの成功には必須である。
【００１１】
別のアプローチは、欠損または変性した細胞を補償するために、インサイチュで神経細胞の産生を誘導することである。このアプローチは、脳（特に成体の脳）において神経細胞を産生することが可能であるか否か、およびその方法についての広い知識を必要とする。
【００１２】
多能性神経幹細胞の単離およびインビトロ培養についての技術（例えば、特許文献１；特許文献２；特許文献３を参照のこと）の開発は、両方のアプローチの見込みを非常に増大させた。胎児の脳は、インビトロにて多能性神経幹細胞を単離し、そして培養するために用いられ得ることが発見された。さらに、対照的に、成体の脳細胞は、脳細胞を複製または再生できないと長い間考えられてきたが、神経幹細胞は、成体の哺乳動物の脳からも単離され得ることが発見された。胎児または成体の脳のいずれかに由来するこれらの幹細胞は、自己複製し得る。子孫細胞は、再び増殖し得るか、または神経の細胞系統の任意の細胞（ニューロン、星状細胞および希突起膠細胞が挙げられる）に分化し得る。それゆえ、これらの知見は、移植に用いられ得る神経細胞の供給源を提供するだけでなく、成体脳における多能性神経幹細胞の存在およびインサイチュにおいてこれらの幹細胞からニューロンまたはグリア細胞を産生する可能性もまた、実証する。
【特許文献１】米国特許第５，７５０，３７６号明細書
【特許文献２】米国特許第５，９８０，８８５号明細書
【特許文献３】米国特許第５，８５１，８３２号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
従って、以下の２つの目的のために、神経幹細胞を効率的に産生する方法を開発することが望ましい：より多くの幹細胞、したがって移植治療において使用され得る神経細胞を得ること、ならびにインサイチュでより多くの幹細胞を産生するために使用され得る方法を同定すること。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（発明の要旨）
本発明は、フェロモン、黄体化ホルモン（ＬＨ）またはヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を使用することによって神経幹細胞の数を増加させる方法を提供する。この方法は、インサイチュでより多くの神経幹細胞を得るためにインビボで実施され得、これは、次いで、より多くのニューロンまたはグリア細胞を産生し、欠損した神経細胞または機能不全の神経細胞を補償し得る。この方法はまた、培養物中で多くの神経幹細胞を産生するために、インビトロで実施され得る。この培養された幹細胞は、例えば、神経変性疾患または神経変性状態に罹患しているか、あるいは神経変性疾患または神経変性状態を有すると疑われる患者または動物の移植処置のために使用され得る。
【００１５】
従って、本発明の１つの局面は、神経幹細胞の数を増加させる方法を提供し、この方法は、神経幹細胞の数の増加を生じる条件下で少なくとも１つの神経幹細胞に対して有効量のフェロモン、ＬＨまたはｈＣＧを提供する工程を包含する。この神経幹細胞は、哺乳動物の脳に、特に哺乳動物の脳の脳室下帯（ｓｕｂｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｚｏｎｅ）に配置され得る。あるいは、この神経幹細胞は、哺乳動物の海馬に配置され得る。あらゆる年齢の哺乳動物がこの方法に供され得るが、この哺乳動物が胚ではないことが好ましい。より好ましくは、この哺乳動物は、成体である。
【００１６】
哺乳動物は、神経変性疾患または神経変性状態に罹患しているか、あるいは神経変性疾患または神経変性状態を有すると疑われ得る。この疾患または状態は、外科手術によって引き起こされる発作または損傷のような脊髄損傷または脳損傷であり得る。この疾患または状態は、神経幹細胞の数が非常に減少することに関連する、加齢であり得る。この疾患または状態はまた、神経変性疾患、特にアルツハイマー病、ハンティングトン病、筋萎縮性側索硬化症、またはパーキンソン病であり得る。
【００１７】
あるいは、神経幹細胞は、インビトロで培養物内に存在し得る。インビトロで実施される場合、ＬＨまたはｈＣＧが、フェロモンの代わりに使用されることが、好ましい。
【００１８】
フェロモンは、哺乳動物における神経幹細胞の数を増加させ得る任意のフェロモンであり得る。物質が、神経幹細胞の数を増加させ得るか否かを決定するためのアッセイは、当該分野において確立されており、本明細書中に記載される（例えば、実施例１および実施例３を参照のこと）。このフェロモンは、好ましくは、２−ｓｅｃ−ブチル−４，５−ジヒドロチアゾール（ＳＢＴ）、２，３−デヒドロ−エキソ−ブレビコミン（ｂｒｅｖｉｃｏｍｉｎ）（ＤＨＢ）、αファルネセン（ｆａｒｎｅｓｅｎｅ）およびβファルネセン、６−ヒドロキシ−６−メチル−３−ヘプタノン、２−ヘプタノン、トランス−５−ヘプテン−２−オン、トランス−４−ヘプテン−２−オン、ｎ−ペンチルアセテート、シス−２−ペンテン−１−イル−アセテート、２，５−ジメチルピラジン、ドデシルプロピオネート、および（Ｚ）−７−ドデカン−１−イルアセテートからなる群より選択される。
【００１９】
フェロモン、ＬＨまたはｈＣＧが、インビボまたはインビトロで使用されるか否かに関わらず、他の因子が組み合わせて適用され得る（例えば、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、プロラクチン、プロラクチン放出ペプチド（ＰＲＰ）エリスロポエチン、サイクリックＡＭＰ、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）、セロトニン、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスホーミング増殖因子α（ＴＧＦα）、トランスホーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、エストロゲン、成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、インスリン様成長因子、白血病抑制因子、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、甲状腺ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、および／または血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ））。ＬＨまたはｈＣＧは、ネイティブＬＨまたはネイティブｈＣＧの活性を有する任意のＬＨアナログまたはｈＣＧアナログあるいはＬＨ改変体またはｈＣＧ改変体であり得る。
【００２０】
本発明の別の局面は、哺乳動物における神経変性疾患または神経変性状態を処置または改善する方法を提供し、この方法は、哺乳動物の脳に有効量のフェロモン、ＬＨまたはｈＣＧを提供する工程を包含する。この疾患または状態は、脳外科手術／脊髄外科手術によって引き起こされる発作または損傷のようなＣＮＳ損傷であり得る。この疾患または状態は、神経幹細胞の数の大きな減少と関連する加齢であり得る。この疾患または状態はまた、神経変性疾患、特にアルツハイマー病、ハンティングトン病、筋萎縮性側索硬化症、またはパーキンソン病であり得る。
【００２１】
哺乳動物は、必要に応じて、神経幹細胞および／または神経幹細胞子孫の移植を受容し得る。この移植は、哺乳動物がフェロモン、ＬＨまたはｈＣＧを受容する前、受容した後、または受容するのと同時に、行われ得る。好ましくは、哺乳動物は、フェロモン、ＬＨまたはｈＣＧの前に、あるいはフェロモン、ＬＨまたはｈＣＧと同時に移植を受容する。
【００２２】
哺乳動物は、必要に応じて、少なくとも１つのさらなる因子、例えば、エリスロポエチン、サイクリックＡＭＰ、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）、セロトニン、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスホーミング増殖因子α（ＴＧＦα）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、エストロゲン、成長ホルモン、インスリン様成長因子１、および／または毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）を受容し得る。
【００２３】
フェロモン、ＬＨ／ｈＣＧおよび／またはさらなる因子は、当該分野で確立された任意の方法によって提供され得る。例えば、それらは、脈管内的に、髄腔内的に、静脈内的に、筋肉内的に、皮下的に、腹腔内的に、局所的に、経口的に、経直腸的に、膣的に、鼻腔的に、吸入によって、または脳内に投与され得る。この投与は、好ましくは、全身投与（特に、皮下投与）によって行われる。フェロモン、ＬＨ／ｈＣＧまたはさらなる因子はまた、哺乳動物における内因性フェロモン、ＬＨ／ｈＣＧまたはさらなる因子の量を増加し得る有効量の因子を哺乳動物に投与することによって提供され得る。例えば、動物におけるＬＨのレベルは、ＧｎＲＨを使用することによって増加され得る。
【００２４】
フェロモン、ＬＨ／ｈＣＧまたはさらなる因子が、脳に直接送達されない場合、血液脳関門浸透剤が、脳への進入を容易にするために必要に応じて含まれ得る。血液脳関門浸透剤は、当該分野で公知であり、これらとしては、例として、米国特許第５，６８６，４１６号；同第５，５０６，２０６号および同第５，２６８，１６４号に記載されるブラジキニンおよびブラジキニンアゴニスト（例えば、ＮＨ２−アルギニン−プロリン−ヒドロキシプロキシプロリン−グリシン−チエニルアラニン−セリン−プロリン−４−Ｍｅ−チロシンψ（−ＣＨ２ＮＨ）−アルギニン−ＣＯＯＨ）が挙げられる。あるいは、送達されるべき分子は、米国特許第６，３２９，５０８号；同第６，０１５，５５５号；同第５，８３３，９８８号または同第５，５２７，５２７号に記載されるようなトランスフェリンレセプター抗体に結合体化され得る。この分子はまた、その分子と、脳毛細管内皮細胞レセプター（例えば、トランスフェリンレセプター）と反応性のリガンドとを含む融合タンパク質として送達され得る（例えば、米国特許第５，９７７，３０７号を参照のこと）。
【００２５】
本発明の別の局面は、神経幹細胞からのニューロン形成を向上させる方法を提供し、この方法は、上記神経幹細胞からの向上したニューロン形成を生じる条件下で少なくとも１つの神経幹細胞にフェロモン、ＬＨまたはｈＣＧを提供する工程を包含する。さらに、哺乳動物の嗅球における新しいニューロン形成を増加させる方法が提供され、この方法は、哺乳動物に有効量のフェロモン、ＬＨまたはｈＣＧを提供する工程を包含する。フェロモン、ＬＨまたはｈＣＧ、および少なくとも１つのさらなる因子を含む組成物および薬学的組成物もまた、提供される。
【００２６】
本発明に従って調製される細胞性組成物もまた、提供される。特に、ＬＨ／ｈＣＧに曝露された神経幹細胞培養物が、提供される。これらの培養物は、より高いレベルの神経幹細胞および／またはニューロンを有し、例えば、移植のために使用され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
（発明の詳細な説明）
本発明は、フェロモン、黄体化ホルモン（ＬＨ）またはヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を使用することによって神経幹細胞の数または神経発生を増加させる方法を提供する。この方法は、インサイチュでより多くの神経幹細胞を得るためにインビボで実施され得、次いで、欠損した神経細胞または機能不全の神経細胞を補償するためにより多くのニューロンまたはグリア細胞を産生し得る。この方法はまた、培養物における多くの神経幹細胞を産生するためにインビトロで実施され得る。この培養された幹細胞は、例えば、神経変性疾患または神経変性状態に罹患しているか、あるいは神経変性疾患または神経変性状態を有すると疑われる患者または動物の移植処置のために、使用され得る。
【００２８】
本発明をさらに詳細に記載する前に、本出願において使用される用語は、他に示されない限り、以下のように定義される。
【００２９】
（定義）
「神経幹細胞」とは、神経細胞系統における幹細胞である。幹細胞は、自己複製し得る細胞である。言い換えると、幹細胞の分裂から生じた娘細胞は、幹細胞を含む。神経幹細胞は、神経細胞系統における全ての細胞型（ニューロン、星状細胞および希突起膠細胞（星状細胞および希突起膠細胞はまとめて、グリアまたはグリア細胞と呼ばれる）を含む）に最終的に分化し得る。従って、本明細書中で言及される神経幹細胞は、多能性の神経幹細胞である。
【００３０】
「ニューロスフィア（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ）」または「スフィア（ｓｐｈｅｒｅ）」は、クローン性増殖の結果として単一の神経幹細胞に由来する細胞の一群である。「一次ニューロスフィア」とは、神経幹細胞を含む一次培養脳組織のプレーティングによって生成されるニューロスフィアをいう。ニューロスフィアを形成する神経幹細胞の培養方法は、例えば、米国特許第５，７５０，３７６号に記載されている。「二次ニューロスフィア」とは、一次ニューロスフィアを解離し、そして個々の解離した細胞がニューロスフィアを再び形成することを可能にすることによって生じるニューロスフィアをいう。
【００３１】
ネイティブ因子と「実質的な配列の類似性」を共有するポリペプチドは、ネイティブ因子とアミノ酸レベルで、少なくとも約３０％同一である。このポリペプチドは、ネイティブ因子とアミノ酸レベルで、好ましくは少なくとも約４０％、より好ましくは少なくとも約６０％、さらにより好ましくは少なくとも約７０％、そして最も好ましくは少なくとも約８０％同一である。
【００３２】
語句、ネイティブ因子とアナログまたは改変体の「パーセント同一性」または「％同一性」とは、２つの配列がアラインメントした場合に、アナログまたは改変体にもまた見出される、ネイティブ因子のアミノ酸配列の割合をいう。パーセント同一性は、当該分野において確立された任意の方法またはアルゴリズム（例えば、ＬＡＬＩＧＮまたはＢＬＡＳＴ）によって決定され得る。
【００３３】
ポリペプチドは、ネイティブ因子に対するレセプターに結合され得るか、またはネイティブ因子に対して惹起されたポリクローナル抗体によって認識され得る場合に、ネイティブ因子の「生物学的活性」を有する。好ましくは、このポリペプチドは、レセプター結合アッセイにおいて、ネイティブ因子に対するレセプターに特異的に結合し得る。
【００３４】
ネイティブ因子の「機能的アゴニスト」は、ネイティブ因子のレセプターに結合し、そしてネイティブ因子のレセプターを活性化する化合物であるが、ネイティブ因子と実質的な配列類似性を共有することは必須ではない。
【００３５】
「ＬＨ」は、（１）ネイティブな哺乳動物のＬＨ、好ましくはネイティブなヒトのＬＨと実質的な配列類似性を共有するポリペプチドを含み；そして（２）ネイティブな哺乳動物のＬＨの生物学的活性を有する、タンパク質である。このネイティブな哺乳動物のＬＨは、下垂体の前葉によって分泌されるゴナドトロピンである。ＬＨは、非共有結合αサブユニットおよび非共有結合βサブユニットからなるヘテロ二量体である。αサブユニットは、ＬＨ、ＦＳＨおよびｈＣＧの間で共通であり、そしてβサブユニットは、各ホルモンに特異的である。本発明に有用なＬＨは、ネイティブな哺乳動物のＬＨと実質的な配列類似性を共有するβサブユニットとともに、ネイティブなαサブユニットを有し得る。あるいは、このＬＨは、ネイティブな哺乳動物のＬＨと実質的な配列類似性を共有するαサブユニットとともに、ネイティブなβサブユニットを有し得る。このＬＨはまた、ネイティブな対応するサブユニットと実質的な配列類似性を共有するαサブユニットおよびβサブユニットの両方を有し得る。従って、用語「ＬＨ」は、ネイティブなＬＨサブユニットの欠失変異体、挿入変異体、または置換変異体を含むＬＨアナログを包含する。さらに、用語「ＬＨ」は、他の種に由来するＬＨおよびその天然に存在する改変体を包含する。さらに、「ＬＨ」はまた、ネイティブな哺乳動物のＬＨレセプターの機能的アゴニストであり得る。
【００３６】
「ｈＣＧ」は、（１）ネイティブなｈＣＧと実質的な配列類似性を共有するポリペプチドを含み；そして（２）ネイティブなｈＣＧの生物学的活性を有する、タンパク質である。このネイティブなｈＣＧは、非共有結合αサブユニットおよび非共有結合βサブユニットからなるヘテロ二量体である。αサブユニットは、ＬＨ、ＦＳＨおよびｈＣＧの間で共通であり、そしてβサブユニットは、各ホルモンに特異的である。しかし、ｈＣＧおよびＬＨのβサブユニットは、８５％の配列類似性を共有する。本発明に有用なｈＣＧは、ネイティブなｈＣＧと実質的な配列類似性を共有するβサブユニットとともに、ネイティブなαサブユニットを有し得る。あるいは、このｈＣＧは、ネイティブなｈＣＧと実質的な配列類似性を共有するαサブユニットとともに、ネイティブなβサブユニットを有し得る。このｈＣＧはまた、ネイティブな対応するサブユニットと実質的な配列類似性を共有するαサブユニットおよびβサブユニットの両方を有し得る。従って、用語「ｈＣＧ」は、ネイティブなｈＣＧサブユニットの欠失変異体、挿入変異体、または置換変異体を含むｈＣＧアナログを包含する。さらに、用語「ｈＣＧ」は、他の種に由来するｈＣＧ対応物およびその天然に存在する改変体を包含する。さらに、「ｈＣＧ」はまた、ネイティブな哺乳動物のｈＣＧ／ＬＨレセプターの機能的アゴニストであり得る。
【００３７】
「プロラクチン」は、（１）ネイティブな哺乳動物プロラクチン、好ましくはネイティブなヒトプロラクチンと実質的な配列類似性を共有し；そして（２）ネイティブな哺乳動物のプロラクチンの生物学的活性を有する、ポリペプチドである。このネイティブなヒトプロラクチンは、脳下垂体で主に合成される１９９アミノ酸のポリペプチドである。従って、用語「プロラクチン」は、ネイティブプロラクチンの欠失変異体、挿入変異体または置換変異体であるプロラクチンアナログを包含する。さらに、用語「プロラクチン」は、他の種に由来するプロラクチンおよびその天然に存在する改変体を包含する。
【００３８】
なおさらに、「プロラクチン」はまた、ネイティブな哺乳動物のプロラクチンレセプターの機能的アゴニストであり得る。例えば、機能的アゴニストは、プロラクチンレセプターについての米国特許第６，３３３，０３１号に開示された活性性アミノ酸配列；プロラクチンレセプターに対するアゴニスト活性を有する金属錯体レセプターリガンド（米国特許第６，４１３，９５２号）；Ｇ１２０ＲｈＧＨ（これは、ヒト成長ホルモンのアナログであるが、プロラクチンアゴニストとして作用する）（Ｍｏｄｅら、１９９６）；または米国特許第５，５０６，１０７号および同第５，８３７，４６０号に記載されるようなプロラクチンレセプターに対するリガンドであり得る。
【００３９】
「ＥＧＦ」とは、ネイティブなＥＧＦまたは任意のＥＧＦアナログもしくは改変体を意味し、このアナログまたは改変体は、ネイティブなＥＧＦと実質的なアミノ酸類配列似性を共有し、そして少なくとも１つ、ネイティブなＥＧＦの有する生物学的活性（例えば、ＥＧＦレセプターへの結合）を共有する。特に、ＥＧＦとして挙げられるのは、任意の種のネイティブＥＧＦ、ＴＧＦα、または組換え改変ＥＧＦである。特定の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：２つのＣ末端アミノ酸の欠失および５１位での１つの中性アミノ酸置換を有する組換え改変ＥＧＦ（特に、ＥＧＦ５１ ｇｌｎ５１；米国特許出願公開番号２００２００９８１７８Ａ１）、１６位のＨｉｓ残基が中性アミノ酸または酸性アミノ酸で置換されている、ＥＧＦムテイン（ＥＧＦ−Ｘ６）（米国特許第６，１９１，１０６号）、ネイティブなＥＧＦのアミノ末端残基を欠く、ＥＧＦの５２アミノ酸欠失変異体（ＥＧＦ−Ｄ）、Ｎ末端残基ならびに２つのＣ末端残基（Ａｒｇ−Ｌｅｕ）が欠失された、ＥＧＦ欠失変異体（ＥＧＦ−Ｂ）、２１位のＭｅｔ残基が酸化されているＥＧＦ−Ｄ（ＥＧＦ−Ｃ）、２１位のＭｅｔ残基が酸化されているＥＧＦ−Ｂ（ＥＧＦ−Ａ）、ヘパリン−結合ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、βセルリン、アンフィレグリン（ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）、ニューレグリン（ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ）、または上記のいずれかを含む融合タンパク質。他の有用なＥＧＦのアナログまたは改変体は、米国特許出願公開番号２００２００９８１７８Ａ１、ならびに米国特許第６，１９１，１０６号および同第５，５４７，９３５号に記載されている。
【００４０】
さらに、「ＥＧＦ」はまた、ネイティブな哺乳動物のＥＧＦレセプターの機能的アゴニストであり得る。例えば、機能的アゴニストは、ＥＧＦレセプターの活性性アミノ酸配列（米国特許第６，３３３，０３１号に開示される）、またはＥＧＦレセプターに対してアゴニスト活性を有する抗体（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｐｏｌ、１９８５および米国特許第５，７２３，１１５号）であり得る。
【００４１】
「ＰＡＣＡＰ」とは、ネイティブなＰＡＣＡＰまたは任意のＰＡＣＡＰのアナログもしくは改変体を意味し、このアナログまたは改変体は、ネイティブなＰＡＣＡＰと実質的なアミノ酸配列類似性を共有し、そして少なくとも１つ、ネイティブなＰＡＣＡＰの有する生物学的活性（例えば、ＰＡＣＡＰレセプターへの結合）を共有する。有用なＰＡＣＡＰアナログおよび改変体としては、以下に限定されないが、ＰＡＣＡＰの３８アミノ酸改変体および２７アミノ酸改変体（それぞれ、ＰＡＣＡＰ３８およびＰＡＣＡＰ２７）、そして例えば、米国特許第５，１２８，２４２号；同第５，１９８，５４２号；同第５，２０８，３２０号；同第５，３２６，８６０号；同第５，６２３，０５０号；同第５，８０１，１４７号；ならびに同第６，２４２，５６３号に開示されるアナログおよび改変体が挙げられる。
【００４２】
さらに、「ＰＡＣＡＰ」はまた、ネイティブな哺乳動物のＰＡＣＡＰレセプターの機能的アゴニストであり得る。例えば、機能的アゴニストは、マキサディラン（ｍａｘａｄｉｌａｎ）（ＰＡＣＡＰ １型レセプターの特異的アゴニストとして作用するポリペプチド）（Ｍｏｒｏら、１９９７）であり得る。
【００４３】
「エリスロポエチン（ＥＰＯ）」とは、ネイティブなＥＰＯまたは任意のＥＰＯのアナログもしくは改変体を意味し、このアナログまたは改変体は、ネイティブなＥＰＯと実質的なアミノ酸配列類似性を共有し、そして少なくとも１つ、ネイティブなＥＰＯの有する生物学的活性（例えば、ＥＰＯレセプターへの結合）を共有する。エリスロポエチンのアナログおよび改変体は、例えば、米国特許第６，０４８，９７１号および同第５，６１４，１８４号に開示される。
【００４４】
なおさらに、「ＥＰＯ」はまた、ネイティブな哺乳動物のＥＰＯレセプターの機能的アゴニストであり得る。例えば、機能的アゴニストは以下のものであり得る：ＥＭＰ１（ＥＰＯ擬態ペプチド１、Ｊｏｈｎｓｏｎら、２０００）；Ｗｒｉｇｈｔｏｎら、１９９６および米国特許第５，７７３，５６９号に記載されるようなＥＰＯの短いペプチド擬態物のうちの１つ；Ｋａｕｓｈａｎｓｋｙ、２００１に開示されるような任意の低分子ＥＰＯ擬態物；米国特許第５，８８５，５７４号、国際公開第９６／４０２３１号、国際公開第９７／４８７２９号、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｐｏｌ、１９８５または米国特許第５，７２３，１１５号に記載されるようなＥＰＯレセプターを活性化する抗体；ＥＰＯレセプターについて米国特許第６，３３３，０３１号に開示されるような活性性アミノ酸配列；ＥＰＯレセプターに対してアゴニスト活性を有する金属錯体化レセプターリガンド（米国特許第６，４１３，９５２号）；または米国特許第５，５０６，１０７号および同第５，８３７，４６０号に記載されるようなＥＰＯレセプターに対するリガンド。
【００４５】
「ＬＨ／ｈＣＧ誘発因子」は、動物に与えられた場合、その動物におけるＬＨまたはｈＣＧの量を増加し得る物質である。例えば、ＬＨ放出ホルモン（ＬＨＲＨ）は、ＬＨの分泌を刺激する。
【００４６】
「フェロモン」は、同じ種の別の動物、通常は反対の性に対するシグナルとして役立つ物質である。哺乳動物のフェロモンは、低分子のタンパク質であり得る。好ましくは、フェロモンは、２−ｓｅｃ−ブチル−４，５−ジヒドロチアゾール（ＳＢＴ）、２，３−デヒドロ−エキソ−ブレビコミン（ＤＨＢ）、αファルネセンおよびβファルネセン、６−ヒドロキシ−６−メチル−３−ヘプタノン、２−ヘプタノン、トランス−５−ヘプテン−２−オン、トランス−４−ヘプテン−２−オン、ｎ−ペンチルアセテート、シス−２−ペンテン−１−イル−アセテート、２，５−ジメチルピラジン、ドデシルプロピオネート、および（Ｚ）−７−ドデカン−１−イルアセテートからなる群より選択される（例えば、Ｄｕｌａｃら、２００３を参照のこと）。
【００４７】
細胞型の形成の「増強」とは、その細胞型の数が増加することを意味する。従って、ある因子の存在下におけるニューロン数が、その因子の非存在下におけるニューロン数より大きい場合に、その因子は、ニューロン形成を増強するために使用され得る。その因子の非存在下におけるニューロン数は、０以上であり得る。
【００４８】
「神経変性疾患または神経変性状態」は、ニューロン欠損またはニューロン機能不全に関連する疾患または医学的状態である。神経変性疾患または神経変性状態の例としては、神経変性疾患、ＣＮＳ損傷またはＣＮＳ機能不全が挙げられる。神経変性疾患としては、例えば、アルツハイマー病、黄斑変性、緑内障、糖尿病性網膜症、末梢神経障害、ハンティングトン病、筋萎縮性側索硬化症、およびパーキンソン病が挙げられる。ＣＮＳ損傷としては、例えば、発作（例えば、出血性発作、局所性の虚血性発作または全体的な虚血性発作）および外傷性の脳損傷または脊髄損傷（例えば、脳外科手術または脊髄外科手術あるいは物理的な事故により引き起こされる損傷）が挙げられる。ＣＮＳ機能不全としては、例えば、うつ病、癲癇、神経症および精神病が挙げられる。
【００４９】
「治療または改善」とは、疾患または医学的状態の症状の軽減あるいは完全な除去を意味する。
【００５０】
「神経変性疾患または神経変性状態を有すると疑われる」哺乳動物とは、神経変性疾患または神経変性状態と正式には診断されないが、神経変性疾患または神経変性状態の症状を示す哺乳動物であり、家族歴または遺伝素因に起因して神経変性疾患または神経変性状態と疑われるか、あるいは、以前に神経変性疾患または神経変性状態を有しており、そして再発の危険にさらされている哺乳動物である。
【００５１】
哺乳動物への組成物の「移植」とは、当該分野において確立された任意の方法によって、哺乳動物の身体内へ組成物を導入することをいう。導入される組成物は「移植片」であり、哺乳動物は「レシピエント」である。移植片およびレシピエントは、同系、同種異系、または異種であり得る。好ましくは、移植は、自己移植である。
【００５２】
「有効量」は、意図された目的を達成するために十分な治療剤の量である。例えば、神経幹細胞の数を増加させるためのＬＨまたはｈＣＧの有効量は、インビボでもインビトロのでも、場合に応じて、神経幹細胞の数の増加という結果を生じさせるために十分な量である。神経変性疾患または神経変性状態を処置または改善するためのＬＨまたはｈＣＧの有効量は、神経変性疾患または神経変性状態の症状を軽減または取り除くのに十分なＬＨ／ｈＣＧの量である。所定の治療剤の有効量は、因子（例えば、薬剤の性質、投与経路、治療剤を受ける動物のサイズおよび種、ならびに投与の目的）によって変化する。各個々の症例における有効量は、当該分野において確立された方法に従って、当業者によって経験的に決定され得る。
【００５３】
（方法）
神経幹細胞は、成体の哺乳動物の脳の２つの領域に存在する（ＲｅｙｎｏｌｄｓおよびＷｅｉｓｓ、１９９２）（海馬の歯状回（ｄｅｎｄａｔｅ ｇｙｒｕｓ）および側脳室の脳室下帯（ＳＶＺ）（Ｌｕｓｋｉｎ １９９３；Ｍｅｎｅｚｅｓら、１９９５；Ｆｒｉｓｅｎら、１９９８；Ｐｅｒｅｔｔｏら、１９９９；Ｇａｇｅ、２０００；Ｒｏｃｈｅｆｏｒｔら、２００２））。神経幹細胞は、それらの成長および増殖に寄与する２つの有糸分裂の経路を伴う。第１の有糸分裂の経路は、神経幹細胞が、再生および自己複製の手段として対照的に分裂する経路である。第２の有糸分裂は、非対照的であり、それは、娘神経幹細胞および前駆細胞を生じる。最終的に、前駆細胞は、中枢神経系の細胞型の１つとして終末の発生運命をとる。例えば、神経発生の場合については、ニューロンの前駆細胞は、ニューロンを生じる（Ｗｅｉｓｓら、１９９６；ＭｏｒｒｉｓｏｎおよびＳｈａｈ、１９９７；Ｐｅｒｅｔｔｏら、１９９９；Ｒａｏ、１９９９）。
【００５４】
海馬のニューロンの前駆細胞は、歯状回に存在し、増殖および顆粒細胞層に移動して、顆粒細胞に分化する能力を有する（Ｎｉｌｓｓｏｎら、１９９９；Ｇａｇｅ ２０００；Ｒｏｃｈｅｆｏｒｔら、２００２）。ＳＶＺにおいて、神経幹細胞および前駆細胞は増殖し、次いで前駆細胞は、吻側移動流（ｒｏｓｔｒａｌ ｍｉｇｒａｔｏｒｙ ｓｔｒｅａｍ）（ＲＭＳ）として公知の移動経路に従い、そこで、嗅球（ＯＢ）に向かい、介在ニューロンになるなる予定になっている（Ｌｕｓｋｉｎ １９９３；Ｍｅｎｅｚｅｓら、１９９５；Ｒａｏ、１９９９；Ｒｏｃｈｅｆｏｒｔら、２００２）。
【００５５】
新たな臭気で生じた豊かな嗅覚環境は、嗅球において神経発生を増加させ、臭気記憶を改良したことを示した（Ｒｏｃｈｅｆｏｒｔら、２００２）。嗅球介在ニューロンは、ＳＶＺにおける神経幹細胞に由来するが、豊かな嗅覚環境に対する曝露は、ＳＶＺにおける細胞増殖に対して効果がなかった（Ｒｏｃｈｅｆｏｒｔら、２００２）。しかしながら、本発明に記載したように、本発明者らは、神経幹細胞増殖および神経発生において、雄の臭気および雌の臭気の反対の性に対する驚くべき効果を観察した。
【００５６】
雄の臭気または雌の臭気の影響を測定するために、成体のマウスは、２日間、７日間または１４日間、反対の性の臭気に曝露された。コントロール群は、同じ期間、同じ性の臭気に曝露された。次いで、このマウスは、増殖性細胞を標識化するためにＢｒｄＵを受け、ＢｒｄＵ陽性細胞の位置は、免疫組織化学研究によって同定された（実施例１）。図１Ａに示されるように、雌マウスのＳＶＺにおける増殖性細胞は、２日間、７日間または１４日間、雌の臭気に曝露された後、同じレベルのままであった。しかしながら、雄の臭気に曝露された雌の群において、ＳＶＺにおける増殖性細胞は、時間とともに変化した：７日後に顕著に増加して、１４日後に顕著に減少した。２日の曝露は有意な効果がなかった。Ｋｉ６７が、増殖性細胞を標識化するために使用された場合、同じパターンが観察され（図１Ｂ）、ＢｒｄＵ陽性細胞の変化が、増殖レベルの変化を反映したことを示した。
【００５７】
雌の臭気はまた、雄マウスの脳における増殖に影響したが、異なる時間的パターンにおける増殖に影響した。雄が、２日間、雌の臭気に曝露された場合、ＢｒｄＵ陽性細胞（図２Ａ）またはＫｉ６７陽性細胞（図２Ｂ）の数の突然の増加が生じた。しかしながら、７日または１４日の曝露の後、新たに増加した細胞の数は、コントロールレベルに減少した。
【００５８】
著しいことには、海馬における神経幹細胞はまた、性に特異的な臭気に応答した。やはり、２日間の雄の臭気に対する曝露は、雌マウスに対して有意な効果がなかったが、７日の曝露は、海馬における増殖の有意な増加を生じた（図３）。１４日間の曝露の後、増殖性細胞のレベルは、雌の臭気に曝露された雌と比較した場合、雄の臭気に曝露された雌において有意に低下した。本発明者らの見解によれば、最初の時間は、成長因子（例えば、ＥＧＦさらにＦＧＦ）以外の任意の刺激が、ＳＶＺおよび海馬における神経幹細胞に同様の効果を与えることを示した。通常、この効果は、対照的である。例えば、プロラクチンは、ＳＶＺに影響を与えるが、海馬に影響を与えず（Ｓｈｉｎｇｏら、２００３）；エストロゲンは、海馬における増殖を刺激するが、ＳＶＺにおける増殖を刺激せず（Ｔａｎａｐａｔら、１９９９）；豊かな環境および身体的活動は、海馬の神経発生を促進するが、ＳＶＺの神経発生を促進しない（Ｂｒｏｗｎら、２００３）。
【００５９】
神経発生はまた、反対の性の臭気に対する曝露において増強した（実施例２）。従って、上記のマウスにおける神経発生の程度を測定するために、上記の動物からの組織切片は、ダブルコルチン（ニューロンの前駆細胞において発現される細胞質タンパク質）に対して染色された。増殖性細胞の場合のように、雌マウスは、雄の臭気に対する７日の曝露後、有意により多くのダブルコルチン陽性細胞を有し（図４）、一方、雄マウスは、雌の臭気に対する２日の曝露後、有意により多くのダブルコルチン陽性細胞を有した（図５）。
【００６０】
反対の性からのフェロモンがまた、神経細胞の生存に影響を与えるか否かを決定するために、ＴＵＮＥＬアッセイを実施した。この結果は、雄の臭気に対する７日の曝露後、雌マウスのＳＶＺ（図６Ａ）または嗅球（図６Ｂ）において有意な相違が観察され得なかったことを示す。
【００６１】
雄性フェロモンは、黄体ホルモン（ＬＨ）のレベルを増加させ、プロラクチンのレベルを減少させる一方、雌性フェロモンは、プロラクチンの増加に関連することが公知である（Ｄｕｌａｃら、２００３）。フェロモンが、反対の性において神経幹細胞増殖および神経発生を増強させる方法を調べるための試みにおいて、動物はＬＨを注入された。この結果は、ＬＨが、雌マウス（図７Ａおよび７Ｂ）および雄マウス（図８）の両方のＳＶＺにおいて増殖を有意に増加させることを示す。これらの結果と一致して、ＬＨはまた、培養物における神経幹細胞の自己複製を増加させ得る（実施例３）。
【００６２】
従って、本発明は、フェロモンおよび／またはＬＨを用いて、インビボまたはインビトロのいずれかにおいて、神経幹細胞の数を増加させる方法を提供する。ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）は、ＬＨのアナログであり、ＬＨと同じレセプターを共有するので、ｈＣＧは、ＬＨと同様の効果を有すると予想される。インビボでの神経幹細胞の数を増加させるために使用される場合、この方法は、脳における神経幹細胞の大きなプールを生じる。この神経幹細胞の大きなプールは、続いて、フェロモン、ＬＨ／ｈＣＧを含まない幹細胞の集団より多くの神経細胞、特にニューロンまたはグリア細胞を生じ得る。次いで、この神経細胞は、神経系損傷を含む、神経変性疾患および神経変性状態に関連する神経細胞の損失または変性を補償し得る。
【００６３】
フェロモンによって誘発されるＬＨ／ｈＣＧまたは他の因子はまた、インビトロで神経幹細胞の数を増加させるために使用され得る。生じた神経幹細胞は、インビトロでより多くのニューロンおよび／またはグリア細胞を産生するために使用され得るか、あるいは神経変性疾患または神経変性状態に罹患するヒトまたは動物への移植手順に使用され得る。ニューロンまたはグリア細胞よりむしろ、本発明に従って産生される神経幹細胞が移植されることが、好ましい。一旦神経幹細胞が移植されると、増殖因子および／または分化因子が、幹細胞の数をさらに増加させるため、またはニューロン形成またはグリア細胞形成を選択的に増強させるために、インビボに投与され得る。同様に、さらなる因子が、ＬＨまたはｈＣＧとともにインビトロで使用され得るか、またはフェロモン／ＬＨ／ｈＣＧと組み合わせてインビボに投与され得る。
【００６４】
例示的な分化因子としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
１．エリスロポエチン（Ｅｐｏ）：Ｅｐｏは、ニューロン細胞系統に関与するＮＳＣを増強し、これは、発作のマウスモデルおよびラットモデルを処置するために使用される得ることが実証された。
２．脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）：ＢＤＮＦは、ニューロン系統を促進する公知の生存因子および分化因子である。
３．トランスホーミング増殖因子βおよび骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）：ＢＭＰは、ニューロン系統および特定のニューロン表現型の産生を促進する公知の分化因子（例えば、脊髄における知覚介在ニューロン）である。
４．甲状腺ホルモン（Ｔ３形態およびＴ４形態の両方を含むＴＨ）：ＴＨは、希突起膠細胞の成熟および産生を促進する分化因子として公知である（例えば、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｐｅｎａ、１９９９を参照のこと。）
５．甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）および甲状腺放出ホルモン（ＴＲＨ）：ＴＳＨ／ＴＲＨは、下垂体前葉由来のＴＨの放出を促進し、増加したレベルの循環ＴＨをもたらす。この因子は、ＮＳＣからの希突起膠細胞発生（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｇｌｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）を促進するために、フェロモン／ＬＨ／ｈＣＧと組み合わせて使用され得る。
６．ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）：ＳＨＨは、発生の間に発生するＣＮＳをパターン付けるモルフォゲンであり、異なる濃度において、ニューロンの特定の型（例えば、脊髄における運動ニューロン）および希突起膠細胞の発生を促進する。この因子は、ＮＳＣからの神経発生および／または希突起膠細胞発生を促進するために、フェロモン／ＬＨ／ｈＣＧと組み合わせて使用され得る。
７．血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）：ＰＤＧＦは、ＮＳＣからの希突起膠細胞の産生および分化を促進する。この因子は、ＮＳＣからの希突起膠細胞発生を促進するために、フェロモン／ＬＨ／ｈＣＧと組み合わせて使用され得る。
８．サイクリックＡＭＰならびに脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）およびセロトニンのようなｃＡＭＰ経路を増強する因子もまた、ニューロン産生を選択的に促進するための良い候補である。
【００６５】
神経幹細胞の数を増加させ得る因子としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
９．卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）は、多くの場合、ＬＨと合わせて作用する；ＬＨレセプター発現を誘発することが公知であり、従って、ＬＨシグナル伝達の効果を増強し得る。
１０．成長ホルモン（ＧＨ）は、ＮＳＣ増殖を刺激し得る。
１１．インスリン増殖因子（ＩＧＦ）は、ＧＨに応答して多くの組織から放出されるソマトメジアン（ｓｏｍａｔｏｍｅｄｉａｎ）であり、ＧＨの増殖促進効果の多くを媒介する。ＩＧＦ−１は、ＮＳＣ増殖を刺激する。
１２．成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）は、視床下部から分泌され、下垂体前葉からのＧＨ放出を誘発し、増加したレベルの循環ＧＨを生じる。
１３．プロラクチン（ＰＲＬ）は、下垂体前葉から分泌され、ＮＳＣ増殖を促進することが公知である。ＰＲＬおよびフェロモン／ＬＨ／ｈＣＧは、ＮＳＣ増殖を最大化するために、組み合わせて使用され得る。
１４．プロラクチン放出ペプチド（ＰＲＰ）は、プロラクチンの放出を誘発し、ＮＳＣ増殖を最大化するために、フェロモン／ＬＨ／ｈＣＧと組み合わせて使用され得る。
１５．線維芽細胞増殖因子は、公知のＮＳＣについてのマイトジェン因子である。
１６．エストロゲンは、海馬におけるＮＳＣの増殖を促進することが公知である。
１７．セロトニンは、海馬におけるＮＳＣの増殖を促進することが公知である。
１８．上皮細胞増殖因子は、公知のＮＳＣについてのマイトジェン因子である。
１９．トランスホーミング増殖因子α（ＴＧＦα）は、公知のＮＳＣについてのマイトジェン因子である。
２０．性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）は、ＬＨの放出を誘発し、ＬＨの循環レベルを増加し、そしてＮＳＣ増殖を増強するために、フェロモン／ＬＨ／ｈＣＧと組み合わせて使用され得るか、またはフェロモン／ＬＨ／ｈＣＧの代わりに使用され得る。
２１．毛様体神経栄養因子および白血病抑制因子：これらの因子の両方などは、ｇｐ１３０サブユニットを介して信号を送る。このシグナル伝達経路は、ＮＳＣ自己複製を促進し、これによって脳のＮＳＣ集団を増大させることが実証している。これらの因子は、ＮＳＣ増殖を促進し、そしてＣＮＳ内のＮＳＣ集団のサイズを増加させるために、フェロモン／ＬＨ／ｈＣＧと組み合わせて使用され得る。
【００６６】
さらに、インビトロまたはインビボでの神経幹細胞からのニューロン形成を増加させる方法が、本発明によって提供される。特に、新たな嗅覚ニューロン産生を増強する方法が、提供される。
【００６７】
神経幹細胞またはニューロンの増加は、好ましくは少なくとも約１０％、より好ましくは少なくとも約２０％、さらにより好ましくは少なくとも約３０％、なおより好ましくは少なくとも約４０％、なおさらにより好ましくは少なくとも約５０％、およびさらに一層より好ましくは少なくとも約６０％である。最も好ましくは、この増加は、少なくとも約８０％である。
【００６８】
本発明はまた、動物、特に哺乳動物における神経変性疾患または神経変性状態を処置または改善する方法を提供する。これは、例えば、有効量のＬＨおよび／またはｈＣＧを哺乳動物に投与する工程、あるいは本発明に従って産生された神経幹細胞、神経幹細胞由来の前駆細胞、ニューロンおよび／またはグリア細胞を哺乳動物に移植する工程によって達成され得る。好ましくは、神経幹細胞が移植される。移植に加えて、ＬＨ／ｈＣＧおよび／またはさらなる因子が、特に移植と同時または移植後に、移植レシピエントにさらに提供され得る。
【００６９】
１つの特に興味の深い神経変性状態は、加齢である。本発明者らは、脳室下帯における神経幹細胞の数が、高齢のマウスにおいて顕著に減少したことを見出した。従って、フェロモン／ＬＨ／ｈＣＧを用いて、神経幹細胞の数を増加することによって、加齢に関する問題を改善することは、特に興味があることである。
【００７０】
例えば、脳室下帯における神経幹細胞は、嗅覚ニューロンの供給源であり、嗅覚機能不全は、前脳神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病およびハンティングトン病）の特徴である。嗅球へのニューロン移動の途絶は、嗅覚弁別の欠損をもたらし、新たな嗅覚介在ニューロンの倍加は、新たな臭気記憶を増強する（Ｒｏｃｈｅｆｏｒｔら、２００２）。従って、フェロモン／ＬＨ／ｈＣＧは、嗅覚弁別または嗅覚記憶、ならびに嗅覚および嗅覚弁別に関連する生理的機能（例えば、交配、子孫認識および子育て）を増強するために使用され得る。
【００７１】
本発明の別の特定の重要な用途は、ＣＮＳ損傷（例えば、脳卒中）の処置および／または改善である。
【００７２】
（組成物）
本発明は、フェロモン、ＬＨまたはｈＣＧ、および必要に応じて少なくとも１つのさらなる因子を含む組成物を提供する。このさらなる因子は、神経幹細胞の数を増加させ得、上記のニューロンまたはグリア細胞への神経幹細胞の分化を増強させ得る。このさらなる因子は、好ましくは、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、プロラクチン、プロラクチン放出ペプチド（ＰＲＰ）、エリスロポエチン、サイクリックＡＭＰ、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）、セロトニン、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスホーミング増殖因子α（ＴＧＦα）、トランスホーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、エストロゲン、成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、インスリン様増殖因子、白血病抑制因子、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、甲状腺ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、および／または血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）からなる群より選択される。最も好ましくは、エリスロポエチン、プロラクチン、ＥＧＦおよび／またはＰＡＣＡＰが、添加される。
【００７３】
フェロモンは、哺乳動物における神経幹細胞の数を増加させ得る任意のフェロモンであり得る。物質が、神経幹細胞の数を増加させ得るか否かを測定するためのアッセイは、当該分野において確立され、本明細書中に記載されている（例えば、実施例１および３を参照のこと）。このフェロモンは、好ましくは、２−ｓｅｃ−ブチル−４，５−ジヒドロチアゾール（ＳＢＴ）、２，３−デヒドロ−エキソ−ブレビコミン（ＤＨＢ）、αファルネセンおよびβファルネセン、６−ヒドロキシ−６−メチル−３−ヘプタノン、２−ヘプタノン、トランス−５−ヘプテン−２−オン、トランス−４−ヘプテン−２−オン、ｎ−ペンチルアセテート、シス−２−ペンテン−１−イル−アセテート、２，５−ジメチルピラジン、ドデシルプロピオネート、および（Ｚ）−７−ドデカン−１−イルアセテートからなる群より選択される（例えば、Ｄｕｌａｃら、２００３を参照のこと）。
【００７４】
本発明に有用なＬＨ／ｈＣＧとしては、あらゆるＬＨアナログまたはｈＣＧアナログあるいは神経幹細胞の数を増加させ得る改変体が挙げられる。ＬＨ／ｈＣＧのアナログまたは改変体は、ネイティブなヒトＬＨまたはｈＣＧの少なくとも１つのサブユニットの少なくとも約３０％のアミノ酸配列を含むタンパク質を含み、これは、ネイティブなＬＨまたはｈＣＧの生物学的活性を有する。好ましくは、ＬＨまたはｈＣＧの生物学的活性は、ＬＨ／ｈＣＧレセプターに結合する能力である。具体的には、ＬＨ／ｈＣＧとして挙げられるものは、天然に存在するＬＨ／ｈＣＧ改変体；種々の哺乳動物の種（例えば、ヒト、他の霊長類、ラット、マウス、ヒツジ、ブタ、およびウシが挙げられるが、これらに限定されない）に由来するＬＨ／ｈＣＧ対応物；および以下の表１に列挙される一般的に使用されるアナログである。ＧｎＲＨまたはそのアナログは、ＬＨ／ｈＣＧの代わりに、またはＬＨ／ｈＣＧに加えて使用され得る。
【００７５】
【表１】
同様に、本発明に有用な任意のさらなる組成物または因子としては、ネイティブな化合物または因子と実質的な類似性およびネイティブな化合物または因子の有する少なくとも１つの生物学的活性を共有するアナログおよび改変体が挙げられる。例えば、ＥＧＦは、本発明のＬＨ／ｈＣＧと併せて使用され得る。ネイティブなＥＧＦに加えて、ＥＧＦアナログまたは改変体もまた、使用され得、それは、ネイティブなＥＧＦと実質的なアミノ酸配列類似性、およびネイティブなＥＧＦの有する少なくとも１つの生物学的活性（例えば、ＥＦＧレセプターへの結合）を共有する。特に、ＥＧＦとしては、あらゆる種のネイティブなＥＧＦ、ＴＧＦα、または組換え改変されたＥＧＦが挙げられる。具体的な例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：２つのＣ末端アミノ酸の欠失および５１位において中性アミノ酸の置換を有する組換え改変されたＥＧＦ（特にＥＧＦ５１ｇｌｎ５１；米国特許出願公開第２００２００９８１７８Ａ１号）、１６位のＨｉｓ残基が中性アミノ酸または酸性アミノ酸で置換されているＥＧＦムテイン（ＥＧＦ−Ｘ１６）（米国特許第６，１９１，１０６号）、ネイティブなＥＧＦのアミノ末端残基を欠く、ＥＧＦの５２−アミノ酸欠失変異体（ＥＧＦ−Ｄ）、Ｎ末端残基および２つのＣ末端残基（Ａｒｇ−Ｌｅｕ）が欠失されているＥＧＦ欠失変異体（ＥＧＦ−Ｂ）、２１位のＭｅｔ残基が酸化されているＥＧＦ−Ｄ（ＥＧＦ−Ｃ）、２１位のＭｅｔ残基が酸化されているＥＧＦ−Ｂ（ＥＧＦ−Ａ）、ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、βセルリン、アンフィレグリン、ニューレグリン、または上記のうちのいずれかを含む融合タンパク質。他の有用なＥＧＦのアナログまたは改変体は、米国特許出願公開第２００２００９８１７８Ａ１号、および米国特許第６，１９１，１０６号および同第５，５４７，９３５号に記載される。
【００７６】
別の例として、ＰＡＣＡＰもまた、ＬＨ／ｈＣＧと併せて使用され得る。有用なＰＡＣＡＰのアナログおよび改変体としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＰＡＣＡＰの３８アミノ酸改変体および２７アミノ酸改変体（それぞれ、ＰＡＣＡＰ３８およびＰＡＣＡＰ２７）、ならびに例えば、米国特許第５，１２８，２４２号；同第５，１９８，５４２号；同第５，２０８，３２０号；同第５，３２６，８６０号；同第５，６２３，０５０号；同第５，８０１，１４７号および同第６，２４２，５６３号に開示されるアナログおよび改変体。
【００７７】
エリスロポエチンのアナログおよび改変体は、例えば、米国特許第６，０４８，９７１号および同第５，６１４，１８４号に開示される。
【００７８】
さらに、本発明において有用なＬＨ／ｈＣＧまたはさらなる因子の機能的アゴニストが、本発明において企図される。これらの機能的アゴニストは、そのネイティブな因子のレセプターに結合し、そして、そのネイティブな因子のレセプターを活性化するが、これらの機能的アゴニストは、そのネイティブな因子と実質的な配列類似性を共有する必要はない。例えば、マキサディランは、ＰＡＣＡＰ １型レセプターの特異的アゴニストとして機能するポリペプチドである（Ｍｏｒｏら、１９９７）。
【００７９】
ＥＰＯの機能的アゴニストは、広く研究されている。ＥＭＰ１（ＥＰＯ擬態ペプチド１）は、Ｊｏｈｎｓｏｎら、２０００に記載されるＥＰＯ擬態物のうちの１つである。ＥＰＯの短いペプチド擬態物は、例えば、Ｗｒｉｇｈｔｏｎら、１９９６および米国特許第５，７７３，５６９号に記載される。低分子ＥＰＯ擬態物は、例えば、Ｋａｕｓｈａｎｓｋｙ、２００１に開示される。ＥＰＯレセプターを活性化する抗体は、例えば、米国特許第５，８８５，５７４号；ＷＯ９６／４０２３１およびＷＯ９７／４８７２９に記載される。
【００８０】
ＥＧＦレセプターに対してアゴニスト活性を有する抗体は、例えば、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｐｏｌ、１９８５および米国特許第５，７２３，１１５号に記載される。さらに、ＥＰＯレセプター、ＥＧＦレセプター、プロラクチンレセプターおよび多くの他の細胞表面レセプターについての活性性アミノ酸配列もまた、米国特許第６，３３３，０３１号に開示される；プロラクチンレセプターおよびＥＰＯレセプターに対してアゴニスト活性を有する金属錯体レセプターリガンドは、米国特許第６，４１３，９５２号に見出され得る。レセプター（例えば、ＥＰＯレセプターおよびプロラクチンレセプター）に対するリガンドを同定および調製する他の方法は、例えば、米国特許第５，５０６，１０７号および同第５，８３７，４６０号に記載される。
【００８１】
特定のさらなる因子の一般的に使用されるアナログはまた、以下の表２に見出され得る：
【００８２】
【表２−１】
【００８３】
【表２−２】
【００８４】
各アナログ、改変体または機能的アゴニストの有効量が、ネイティブな因子または化合物についての有効量と異なり得、そして各々の場合における有効量は、本明細書中の開示に従って当業者により決定され得ることに留意すべきである。好ましくは、ネイティブな因子、またはそのネイティブな因子と実質的な配列類似性を共有するアナログおよび改変体が、本発明において使用される。
【００８５】
薬学的組成物もまた提供され、この薬学的組成物は、ＬＨ／ｈＣＧ、上記のようなさらなる因子、ならびに薬学的に受容可能な賦形剤および／またはキャリアを含む。
【００８６】
薬学的組成物は、以下のような当該分野で公知の任意の経路を介して送達され得る：非経口、髄腔内、脈管内、静脈内、筋肉内、経皮、皮内、皮下、鼻腔内、局所的、経口、直腸、経膣、肺または腹腔内。例えば、筋肉内注射が、脳にｈＣＧの機能を及ぼす、ｈＣＧを送達する効果的な経路であることが、実施例６に示される。好ましくは、この組成物は、注射または注入によって中枢神経系に送達される。より好ましくは、この組成物は、脳室、特に、側脳室に送達される。あるいは、この組成物は、好ましくは全身性経路（例えば、皮下投与）によって送達される。例えば、プロラクチン、成長ホルモン、ＩＧＦ−１、ＰＡＣＡＰおよびＥＰＯが、皮下投与により有効に送達されて、脳室下帯における神経幹細胞の数を調節し得ることを発見した。
【００８７】
この組成物が、脳に直接送達されない場合、およびこの組成物中の分子が、血液脳関門を容易に横切らない場合、血液脳関門浸透剤が、脳への進入を容易にするために必要に応じて含まれ得る。血液脳関門浸透剤は、当該分野で公知であり、これらとしては、例として、米国特許第５，６８６，４１６号；同第５，５０６，２０６号および同第５，２６８，１６４号に記載されるブラジキニンおよびブラジキニンアゴニスト（例えば、ＮＨ２−アルギニン−プロリン−ヒドロキシプロキシプロリン−グリシン−チエニルアラニン−セリン−プロリン−４−Ｍｅ−チロシンψ（ＣＨ２ＮＨ）−アルギニン−ＣＯＯＨ）が挙げられる。あるいは、この分子は、米国特許第６，３２９，５０８号；同第６，０１５，５５５号；同第５，８３３，９８８号または同第５，５２７，５２７号に記載されるようなトランスフェリンレセプター抗体に結合体化され得る。この分子はまた、その分子および脳毛細管内皮細胞レセプター（例えば、トランスフェリンレセプター）と反応性のリガンドを含む融合タンパク質として送達され得る（例えば、米国特許第５，９７７，３０７号を参照のこと）。
【００８８】
薬学的組成物は、所望の治療剤と、意図された投与経路に適した適切なビヒクルとを混合することにより調製され得る。本発明の薬学的組成物の作製において、治療剤は、通常、賦形剤と混合されるか、賦形剤により希釈されるか、またはカプセル、小袋、紙または他の容器の形態であり得るようなキャリアの内部に封入される。薬学的に受容可能な賦形剤が、希釈剤として働く場合、これは、固体、半固体、または液体の物質であり得、これらは、治療剤のためのビヒクル、キャリアまたは媒体として作用する。従って、この組成物は、錠剤、丸剤、粉末、ロゼンジ、小袋、カシェ剤、エリキシル、懸濁液、エマルジョン、液剤、シロップ、エアロゾル（固体としてまたは液体媒体中において）、軟膏（例えば、１０重量％までの治療剤を含有する）、軟質および硬質のゼラチンカプセル、坐剤、滅菌注射溶液、ならびに無菌パッケージ化された粉末の形態であり得る。
【００８９】
適切な賦形剤のいくつかの例としては、人工脳脊髄液、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギナート、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、滅菌水、シロップ、およびメチルセルロースが挙げられる。処方物は、さらに以下を含み得る：タルク、ステアリン酸マグネシウム、および鉱油のような滑沢剤；湿潤剤；乳化剤および懸濁剤；ヒドロキシ安息香酸メチルおよびヒドロキシ安息香酸プロピルのような防腐剤；甘味料；ならびに香味料。本発明の組成物は、当該分野で公知の手順を使用することにより、患者への投与後に、治療剤の迅速な放出、持続的放出、または遅延した放出を提供するように処方され得る。
【００９０】
錠剤のような固形組成物を調製するために、治療剤は、薬学的賦形剤と混合されて、本発明の化合物の均一な混合物を含む固体の予備処方された組成物を形成する。これらの予備処方された組成物を均一という場合、これは、その組成物が、同等に有効な単位投薬形態（例えば、錠剤、丸剤およびカプセル）に容易に小分けされ得るように、その組成物全体にわたって一様に治療剤が分散されていることを意味する。
【００９１】
本発明の錠剤または丸剤は、コーティングされ得るか、または他の方法で、長期作用の利点を提供する投薬形態を提供するように調合され得る。例えば、錠剤または丸剤は、内部投薬成分および外部投薬成分を含み得、後者は、前者を包み込む形態をとる。この２つの成分は、腸溶性の層により隔てられ得、この腸溶性の層は、胃における崩壊に抵抗するために役立ち、そして内部成分がインタクトなままで十二指腸に通過するかまたは放出が遅れることを可能にする。種々の材料が、このような腸溶性の層またはコーティングのために使用され得、このような材料としては、多数の高分子酸、および、高分子酸と、シェラック、セチルアルコール、および酢酸セルロースのような物質との混合物が挙げられる。
【００９２】
本発明の新規な組成物が経口投与または注射による投与のために組み込まれ得る液体形態としては、水溶液、適切に香味付けされたシロップ、水性懸濁液または油性懸濁液、および食用油（例えば、トウモロコシ油、綿実油、ゴマ油、ココナッツ油、またはピーナッツ油）を用いた香味付けされたエマルジョン、ならびにエリキシルおよび同様の薬学的ビヒクルが挙げられる。
【００９３】
吸入またはガス注入のための組成物としては、薬学的に受容可能な水性溶媒もしくは有機溶媒またはそれらの混合物中の溶液および懸濁液、ならびに粉末が挙げられる。液体または固体の組成物は、本明細書中に記載されるような適切な薬学的に受容可能な賦形剤を含み得る。この組成物は、局所作用または全身作用のために経口呼吸経路または経鼻により投与される。好ましくは、薬学的に受容可能な溶媒中にある組成物は、不活性ガスの使用により噴霧され得る。噴霧される溶液は、噴霧デバイスから直接吸入され得るか、または噴霧デバイスは、フェースマスクテント（ｆａｃｅ ｍａｓｋ ｔｅｎｔ）もしくは間欠的陽圧呼吸機に取り付けられ得る。溶液、懸濁液または粉末の組成物は、適切な様式で処方物を送達するデバイスから、好ましくは経口的または経鼻的に投与され得る。
【００９４】
本発明の方法において使用される別の処方物は、経皮送達デバイス（「パッチ」）を使用する。このような経皮パッチは、制御された量で本発明の治療剤の連続的または断続的な注入を提供するために使用され得る。薬学的因子の送達のための経皮パッチの構築および使用は、当該分野で周知である。例えば、米国特許第５，０２３，２５２号（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。このようなパッチは、薬学的因子の連続的送達、拍動性送達、または要求に応じた送達のために構築され得る。
【００９５】
本発明における使用のための他の適切な処方物が、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに見出され得る。
【００９６】
以下の実施例は、本発明を例示するために提供され、そしていかなる様式においても、本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【００９７】
下記の実施例において、以下の略語は、以下の意味を有する。定義されていない略語は、その一般に受け入れられている意味を有する。
ＴＵＮＥＬ＝末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介性ｄＵＴＰニック末端標識
℃＝摂氏温度
ｈｒ＝時間
ｍｉｎ＝分間
μＭ＝マイクロモル濃度
ｍＭ＝ミリモル濃度
Ｍ＝モル濃度ミリリットル
μｌ＝マイクロリットル
ｍｇ＝ミリグラム
μｇ＝マイクログラム
ＦＢＳ＝胎仔ウシ血清
ＰＢＳ＝リン酸緩衝化生理食塩水
ＤＭＥＭ＝ダルベッコ改変イーグル培地
ＭＥＭ＝改変イーグル培地
ＥＧＦ＝上皮増殖因子
ＮＳＣ＝神経幹細胞
ＳＶＺ＝脳室下帯
ＰＡＣＡＰ＝脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド
ｃＡＭＰ＝サイクリックＡＭＰ
ＢＭＰ＝骨形態形成タンパク質
ＣＳＦ＝脳脊髄液。
【００９８】
（材料および方法）
（雄の臭気に曝露された雌マウス）
マウス（ＣＤ１、１０週齢）を、２週間の時間経過にわたって、反対の性または同じ性の臭気に対して連続的に曝露した。社会的相互作用の構成要素は、この研究の一部ではなかった。その代わりに、マウスを、反対の性の臭気に対して曝露しただけであった。このことは、そうしない場合に生じる混同を制御するために必要であった。例えば、雄を雌と一緒に置いた場合、その動物に交配する機会を与える。プレーリーハタネズミに対するＦｏｗｌｅｒの研究（２００２）は、妊娠中の雌ハタネズミにおける神経発生の増加を示し、さらにより顕著なことには、Ｓｈｉｎｇｏらの研究（２００３）は、妊娠および交配の両方が、単独で、神経発生の増加を生じ得ることを示した。従って、神経性の影響が見られたとしても、臭気曝露単独によって媒介されたという結論を下すことはできない。
【００９９】
これによって、２週間連続の曝露プロトコルが、この研究を行うために確立され、時間経過の期間は、異なる環境条件におけるニューロンの細胞増殖の変化しやすい性質を明らかにするために選択された。以前の行動研究が１日間から２週間で変動するニューロンの前駆細胞の増加を示した（ＫｅｍｐｅｒｍａｎｎおよびＧａｇｅ、１９９９；Ｆｏｗｌｅｒら、２００２）ので、このことは、ニューロンの前駆細胞増殖の急増が、見落とされないことを確実にした。
【０１００】
簡単に言えば、雄マウスを、２日間、きれいなケージに置いた。次いで、この雄マウスを、雄の臭気化したケージから取り除き、雌マウスを所望の長さの期間、収容した。
【０１０１】
全部で１８匹の雌（ＣＤ−１、１０週齢）マウスを、雄（ＣＤ−１、１０週齢）マウスまたは雌マウスの臭気に対する連続的な曝露を経験させるために、第１に選択した。１８匹のうち３匹を、雄の臭気に対して２日間曝露するために、ランダムに割り当てた。別の３匹を、７日間の雄の臭気曝露条件に加えるために選択し、別の３匹を１４日間の雄の臭気曝露条件に加えるために選択した。同様に、さらなる３匹を、２日間の雌の臭気を経験させるためにランダムに割り当てた。別の３匹を、７日間の雌の臭気曝露条件に加えるために選択し、残りの３匹を、１４日間の雌の臭気曝露条件に置いた。
【０１０２】
従って、最初の工程において、９匹の雄マウスを、２日間、きれいなケージの中に置いた。この雄が２日間、このケージを臭気化した後、その雄を新しいきれいなケージに移動させた。次いで、雌を、反対の性の臭気を経験させるために、２日間、雄に臭気化されたケージに移動させた。２日間の曝露に割り当てられた雌に関して、時間経過は完了した；しかし、７日間および１４日間の曝露に割り当てられた雌はこの手順を繰返し、実質的に、この時間経過を完全に満たすために、同じ雄によって臭気化された新たに臭気化されたケージに移動された。
【０１０３】
この時間経過にわたって反対の性の臭気に雌を曝露することが、神経発生に対する効果を有し得るか否かを比較するために、上記で選択した残りの９匹の雌マウスをまた、上記に要点を述べたようなものと同じ概要の下で、連続的な性の臭気（しかし同じ性の臭気）に経験させた。
【０１０４】
群の時間経過の最終日に、ＢｒｄＵ注射をマウスに与えて、ＳＶＺにおける増殖性細胞を標識した。さらに、免疫組織化学分析を行った。以下に概要を述べる。
【０１０５】
（免疫組織化学）
処置後のＳＶＺにおける前駆細胞の数を調べるために、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）注射を使用して、それらの細胞を標識した。動物は、２時間ごとに１０時間、ＢｒｄＵ注射（１２０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内、リン酸緩衝液中の０．００７％ＮａＯＨに溶解した）を受けた。ＢｒｄＵの各注射は、Ｓ期における増殖性細胞を標識のみし、一連のＢｒｄＵ注射をする目的は、全取り込みの間のＢｒｄＵの持続的な利用可能性を保証するためである（Ｍｏｒｓｈｅａｄおよびｖａｎ ｄｅｒ Ｋｏｏｙ、１９９２）。
【０１０６】
この動物を麻酔薬の過剰投与によって屠殺し、ＰＢＳ中、ｐＨ７．２の４％パラホルムアルデヒドで心臓灌流した。脳を、４℃にて一晩、同じパラホルムアルデヒド溶液で後固定し、ＰＢＳ中の２０％スクロース中で２４時間凍結保護した。次いで、この脳を、１４μｍに凍結切片化する前に、Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅｋ Ｏ．Ｃ．Ｔ化合物（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｃｋ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）に包埋した。
【０１０７】
染色するために使用した抗体は、ラット抗ＢｒｄＵおよびモルモット抗ＤＣＸであった。
【０１０８】
この切片を、室温にて３０秒間アセトンで後固定した後、ＰＢＳで洗浄した。ＢｒｄＵ染色のために、この組織を、６０℃にて２２分間１Ｍ ＨＣｌで処理して、細胞のＤＮＡを変性させた。次いで、切片を、１０％ＮＧＳを含む０．３％ＰＢＳ−Ｔにおいて希釈した一次抗体（ラット抗ＢｒｄＵ、１：５０）中で室温にて２４時間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、次いで、ビオチン（１：２００）に結合体化されたヤギ抗ラット二次抗体とともに、室温にて１時間インキュベートした。ｄｄＨ２Ｏでリンスした後、染色をＣＹ３−Ｓｔｒｅｐｔａｖｏｄｉｎで可視化して、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｈｏｔ蛍光顕微鏡で観察するために、切片をＦｌｕｏｒｏｓａｖｅとともにマウントした。
【０１０９】
ＤＣＸ染色のために、切片を、１０％ＮＧＳを含む０．３％ＰＢＳ−Ｔにおいて希釈した一次抗体（ヤギ抗−ＤＣＸ、１：５００）中で室温にて２４時間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、次いで、ロバ抗ヤギビオチン二次抗体とともに、室温にて１時間インキュベートした。リンスした後、増幅手順をＰＢＳでスライドガラスを洗浄し、そしてそれらをＣＹ３−ＳｔｒｅｐｔａｖｏｄｉｎおよびＨｏｅｃｈｓｔとともに、室温にて１時間インキュベートすることによって行った。ｄｄＨ２Ｏでリンスした後、切片をＦｌｕｏｒｏｓａｖｅとともにマウントして、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｈｏｔで観察した。
【０１１０】
（免疫組織化学結果の定量化）
ＳＶＺにおけるＢｒｄＵ：側脳室の吻側の先端部からその脳室の最も尾側の面まで冠状断（１４μｍ）の連続した１０枚のうちの１枚を集めた（合計１０個の切片）。次いで、ＢｒｄＵ陽性細胞を、規定される上衣−上衣下層を中で数えた。
【０１１１】
ＳＶＺの背の端におけるＤＣＸ：側脳室の吻側の先端部からその脳室の９８０μｍ尾側までの冠状断（１４μｍ）の連続した１０枚のうちの１枚を（合計１０個の切片）実施した。次いで、ＤＣＸ陽性細胞を、背の端で数えた。
【０１１２】
（雌マウスの臭気に曝露された雄マウス）
反対の性の臭気が、雄マウスの何らかの効果を有するか否かを見るために、同じ方法論を、雌マウスの臭気に対して雄マウスを連続的に曝露するために用いた。同一の時間経過（２日間、７日間および１４日間の雌マウスに対する臭気曝露）、ならびに比較のために２日間、７日間および１４日間の雄マウスに対する臭気曝露を用いた。免疫組織化学および定量化の構成物質はまた、雌について計画したものと同一であった。
【０１１３】
（神経幹細胞培養および増殖因子）
胎児および成体の前脳からのスフィアの発生および分化を、少しの改変を用いて以前に記載したように行った（ＲｅｙｎｏｌｄｓおよびＷｅｉｓｓ、１９９２；Ｒｅｙｎｏｌｄｓら、１９９２）。簡単に言えば、線条体−淡蒼球複合体を、Ｅ１４におけるマウスの胚から取り除き、０．６％グルコース、ペニシリン（５０Ｕ／ｍｌ）、およびストレプトマイシン（５０Ｕ／ｍｌ；両方、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤから提供された）を含むＰＢＳの中に回収し、次いで、ＤＭＥＭ−Ｆ−１２（１：１）、グルコース（０．６％）、グルタミン（２ｍＭ）、重炭酸ナトリウム（３ｍＭ）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（５ｍＭ）、インスリン（２５μｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（１００μｇ／ｍｌ）、プロゲステロン（２０ｎＭ）、プトレシン（６０μＭ）、および塩化セレン（３０ｎＭ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから提供されるグルタミンを除いて、全てＳｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから提供された）からなる標準的な培地の中に移した。成体の神経幹細胞培養のために、成体の脳からの側脳室上衣下の内側および外側部分を、両方の半球から切り出し、一緒にプールし、続いて、１ｍｍ２断片に切断し、１．３３ｍｇ／ｍｌトリプシン、０．６７ｍｇ／ｍｌヒアルロニダーゼ、および０．２ｍｇ／ｍｌキヌレン酸（全てＳｉｇｍａから提供された）を含む標準的な培地の中に移した。３７℃にて３０分後、この組織を、０．７ｍｇ／ｍｌトリプシンインヒビター（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｌａｖａｌ、Ｑｕｅｂｅｃ、Ｃａｎａｄａ）を含む標準的な培地に移した。組織片をマイクロピペットで機械的に解離した。細胞を標準的な培地（ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌヒト組換え体；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ、ＮＪも含んだ）の中に種々の密度で接種した。細胞を７日間インビトロ（ＤＩＶ）で培養し、浮遊性の細胞集団（スフィア）を形成させた。培養実験のための全てのマウスを、頚椎脱臼によって屠殺した。
【０１１４】
（浸透圧ポンプの移植および増殖因子注入）
１６匹の８週齢ＣＤ−１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ−Ｒｉｖｅｒ、Ｌａｖａｌ、Ｑｕｅｂｅｃ、Ｃａｎａｄａ）を、ペントバルビタールナトリウム（１２０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）で麻酔し、浸透圧ポンプ（Ａｌｚｅｔ １００７Ｄ；Ａｌｚａ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）を移植した。カニューレを右側脳室に配置した（ブレグマに対して前後＋０．２ｍｍ、外側＋０．８ｍｍおよびラムダとブレグマとの間の同じ高さにした頭蓋骨の硬膜より下の背腹方向２．５ｍｍ）。ＬＨ（下垂体由来のヒトＬＨ３３μｇ／ｍｌ；Ｎａｔｉｏｎａｌ ｈｏｒｍｏｎｅ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｐｒｏｇｒａｍ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を、１ｍｇ／ｍｌマウス血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）を含む０．９％生理食塩水に溶解した。各動物に、０．５μｌ／時間の流速でビヒクル単独またはＬＨのいずれかを６日間注入し、４００ｎｇ／日のＬＨの送達を得た。
【０１１５】
（ＴＵＮＥＬアッセイ）
ＴＵＮＥＬ標識化を、凍結組織に対する使用のための製造業者の指示書に従って、ＲＯＣＨＥ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｋｉｔ（カタログ番号６８４７９５）を用いて行った。
【０１１６】
（実施例１）
（反対の性の臭気は増殖を刺激する）
雄の臭気または雌の臭気の影響を測定するために、成体のマウスを、２日間、７日間または１４日間、反対の性の臭気に曝露した。コントロール群を、同じ期間、同じ性の臭気に曝露した。次いで、このマウスにＢｒｄＵを与えて、増殖性細胞を標識し、ＢｒｄＵ陽性細胞の位置を免疫組織化学研究によって同定した。雌マウスまたは雄マウスをまた、７日間（雌）または２日間（雄）、並行する実験においてコントロールの臭気化されていないケージに曝露した。これらの動物は、同じ性の臭気に曝露された動物とは異ならない（データは示していない）。
【０１１７】
図１Ａに示すように、雌マウスのＳＶＺにおける増殖性細胞は、２日間、７日間または１４日間、雌の臭気に曝露された後、同じレベルのままであった。しかし、雄の臭気に曝露された雌の群において、ＳＶＺにおける増殖性細胞は、時間とともに変化した：７日後に顕著に増加し、１４日後に顕著に減少した。２日間の曝露は、顕著な効果を示さなかった。Ｋｉ６７を、増殖性細胞を標識するために使用した場合、同じパターンを観察した（図１Ｂ）。このことは、ＢｒｄＵ陽性細胞の変化が、ＢｒｄＵの優先的な取り込みよりむしろ、増殖レベルの変化を反映したことを示した。
【０１１８】
上記の実験に使用される雄マウスおよび雌マウスは、同腹子または以前に一緒に出荷されたマウスから得た。従って、これらのマウスは、実験を行う前に、互いの臭気に曝露されていた。この影響が、同腹子または目的の臭気に予め曝露されていた動物に特異的である可能性を除外するために、以前に同じ場所に存在しなかった、同腹子由来のマウスを使用して、実験を繰り返した。マウスが同腹子であろうと同腹子でなかろうと、同様の効果を観察した（図１Ｃ）。このことは、雄の臭気の効果が、特定の同腹子または予め曝露された臭気に制限されないことを示した。
【０１１９】
雌の臭気もまた、雄マウスの脳における増殖に影響を与えたが、この影響は異なる時間的パターンであった。雄を２日間、雌の臭気に曝露した場合、ＢｒｄＵ陽性細胞（図２Ａ）またはＫｉ６７陽性細胞（図２Ｂ）の数が突然増加した。しかし、７日間または１４日間の曝露の後、新たに増殖した細胞の数が、コントロールレベルまで減少した。雌マウスと同様に、異なる同腹子を使用した場合、雌の臭気の効果が、観察され得た（図２Ｃ）。
【０１２０】
著しいことに、海馬における神経幹細胞はまた、性に特異的な臭気に応答した。再び、２日間の雄の臭気に対する曝露は、雌マウスに対して顕著な効果を示さなかったが、７日間の曝露は、海馬における増殖の顕著な増加を生じた（図３）。１４日間の曝露の後、増殖性細胞のレベルは、雌の臭気に曝露された雌と比較した場合、雄の臭気に曝露された雌において顕著に低下した。本発明者らの見解によれば、成長因子（例えば、ＥＧＦさらにＦＧＦ）以外の任意の刺激物が、ＳＶＺおよび海馬における神経幹細胞に同様の効果を与えることを示すのは、これが、初めてである。
【０１２１】
さらなるコントロールとして、雌マウスを７日間、去勢した雄マウスの臭気に曝露した。この結果は、これらの雌において、偽の雄の臭気に曝露された雌と比較した場合、ＳＶＺまたは海馬のいずれかにおけるＢｒｄＵ標識された細胞の数が、増加しなかったことを示す。偽の雄の臭気は、偽の去勢手術を受けた雄マウスによって臭気化された、臭気化されたケージである。これらの偽の去勢された雄の臭気に曝露された雌は、性フェロモン誘発神経発生を示したが、去勢された雄の臭気に曝露された雌は、神経発生の増加を示さなかった。同様に、２日間、副腎摘出された雌の臭気に曝露された雄マウスもまた、偽の雌の臭気に曝露された雄と比較した場合、ＳＶＺまたは海馬においてＢｒｄＵ標識された細胞の数の増加を示さなかった。去勢および副腎摘出が、フェロモンレベルを減少させることは、公知である（Ｍａら、１９９８；Ｋｉｙｏｋａｗａら、２００４；Ｚｈａｎｇ Ｊら（２００１））。従って、これらの結果は、フェロモンが、反対の性のＳＶＺおよび海馬の両方において神経幹細胞増殖を誘発するという観察をさらに支持する。
【０１２２】
（実施例２）
（反対の性の臭気は神経発生を刺激するが、細胞生存を刺激しない）
神経発生はまた、反対の性の臭気への曝露に対して増強した。従って、実施例１からの組織切片を、ダブルコルチン（ニューロンの前駆細胞において発現される細胞質タンパク質）に対して染色し、上記のマウスにおける神経発生の程度を測定した。増殖性細胞の場合のように、雌マウスは、雄の臭気に対する７日間の曝露後、有意により多くのダブルコルチン陽性細胞を有した（図４）が、雄マウスは、雌の臭気に対する２日間の曝露後、有意により多くのダブルコルチン陽性細胞を有した（図５）。
【０１２３】
反対の性からのフェロモンがまた、神経細胞の生存に影響を与えるか否かを測定するために、ＴＵＮＥＬアッセイを行った。この結果は、雄の臭気に対する７日間の曝露後、雌マウスのＳＶＺ（図６Ａ）または嗅球（図６Ｂ）において有意な差が観察され得なかったことを示す。
【０１２４】
（実施例３）
（インビボおよびインビトロでのＬＨの効果）
雄のフェロモンは、黄体化ホルモン（ＬＨ）のレベルを増加させ、プロラクチンのレベルを減少させるが、一方、雌のフェロモンは、プロラクチンの増加に関連することが、公知である（Ｄｕｌａｃら、２００３）。フェロモンが、反対の性において神経幹細胞増殖および神経発生を増強する方法を調べるための試みにおいて、材料および方法に記載したように、動物にＬＨを注入した。実際に、ＬＨは、雌マウス（図７Ａおよび７Ｂ）および雄マウス（図８）の両方のＳＶＺにおいて増殖を有意に増加させる。
【０１２５】
ＬＨが、神経幹細胞の増殖を刺激することを確認するために、材料および方法に記載したように神経幹細胞培養物を確立した。一次スフィアを解離し、限定した密度でＥＧＦまたはＥＧＦとさらにＬＨ（３０ｎＭ）の存在下においてプレートして、二次スフィアを形成させた。二次スフィアの数を数えた。その結果を以下に示す：
【０１２６】
【表３】
【０１２７】
【表４】
【０１２８】
従って、ＬＨはまた、培養物において神経幹細胞の自己複製を増加させ得、これは、雄マウスから単離された神経幹細胞より、雌マウスから単離された神経幹細胞に対してより効果的である。
【０１２９】
（実施例４）
（インビボおよびインビトロでのｈＣＧの効果）
ＨＣＧは、ＬＨと同じ活性を有する。材料および方法に記載したプロトコルに従って、組換えｈＣＧ（絨毛性ゴナドトロピンα；Ｏｖｉｄｒｅｌ（登録商標）／Ｏｖｉｔｒｅｌｌｅ（登録商標）１）またはビヒクル単独をマウスに注入した場合、ｈＣＧが、雄マウスおよび雌マウスの両方のＳＶＺにおいて増殖を顕著に増加させることが発見される。海馬における増殖性細胞もまた、両方の性において顕著に増加する。
【０１３０】
神経発生をまた、ニューロンマーカー、ダブルコルチンまたはＮｅｕＮを用いて評価する。ＳＶＺまたは嗅球におけるダブルコルチンまたはＮｅｕＮ陽性細胞の数は、ｈＣＧを注入されたマウスにおいて顕著により高い。
【０１３１】
ｈＣＧが神経幹細胞の増殖を刺激することを確認するために、神経幹細胞培養物が、材料および方法に記載されたように確立される。一次スフィアを解離し、限定した密度でＥＧＦまたはＥＧＦとさらに絨毛性ゴナドトロピンαの存在下においてプレートして、二次抗体を形成させる。次いで、二次抗体の数を数え、その結果は、神経幹細胞が、雄の動物由来であろうとまたは雌の動物由来であろうと、ｈＣＧが二次スフィアの数を顕著に増加させることを示す。
【０１３２】
（実施例５）
（さらなる因子の効果）
さらなる因子であるプロラクチンは、実施例３または４に記載した実験に含まれる。従って、マウスに以下を注入する：
（１）ＬＨとプロラクチンとの組み合わせまたはｈＣＧとプロラクチンとの組み合わせ；
（２）ＬＨまたはｈＣＧ；あるいは
（３）ビヒクル単独（コントロール）。
【０１３３】
この結果は、ＬＨまたはｈＣＧは、コントロール群と比較して、ＳＶＺにおける増殖を増加させるが、プロラクチンの添加は、ＬＨまたはｈＣＧの効果をさらに増強させることを示す。同様に、プロラクチンが神経幹細胞培養においてＬＨまたはｈＣＧとともに添加される場合、自己複製（一次スフィア由来の二次スフィアの数）は増強する。
【０１３４】
同様に、Ｅｐｏ（ＮｅｏＲｅｃｏｒｍｏｎ）をＬＨまたはｈＣＧとともに含めて、神経発生に対するこの効果を測定した。この結果は、ＬＨまたはｈＣＧ単独によって達成されるレベルよりもＥｐｏがダブルコルチン陽性細胞の数を増強させることを示す。
【０１３５】
上記の実施例は特定の因子を用いるが、表１に列挙した化合物を含む、ＬＨ／ｈＣＧのあらゆるアナログまたは改変体が、ＬＨまたはｈＣＧとして使用され得ることは、留意されるべきである。同様に、表２に列挙した因子を含む、神経発生を増強させ得るあらゆるさらなる因子およびそれらのアナログ／改変体は、ＮｅｏＲｅｃｏｒｍｏｎの代わりに実施例５に使用され得る。グリア細胞形成は、本明細書中に記載される方法および当該分野で利用可能な知識を使用して実施され得る。
【０１３６】
（実施例６）
（ｈＣＧの筋肉内送達）
ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）および黄体化ホルモン（ＬＨ）は、ヒトの使用のために市販されている薬物であり、それぞれＰｒｅｇｎｙｌおよびＰｒｏｆａｓｉとして市場で売買されている。これらの薬物の各々についての最大安全量は、筋肉内注射によって１日あたり１０，０００ＵＳＰユニットである。これは、３０ｇのマウスに対する約５．０ＵＳＰユニットの用量に相当する。この用量が、マウスにおける前脳の神経発生を誘発するのに十分であるか否かを試験するために、本発明者らは、以下の実験を行った。
【０１３７】
６〜８週齢の雌ＣＤ−１マウスに、０．０５ｍｌ容積（生理食塩水で希釈した）中の５．０ＵＳＰ単位の組換えｈＣＧ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｃ ６３２２）の単回の筋肉内注射を与えた。コントロールマウスに生理食塩水単独の単回注射を与えた。次いで、このマウスに、ｈＣＧ注射後２時間を初めとして、２時間ごとに１回、ＢｒｄＵ（１２０ｍｇ／ｋｇ）の６回の注射を与えた。このマウスを、最後のＢｒｄＵ注射の３０分後に屠殺し、４％パラホルムアルデドで心臓灌流し、この組織を凍結切片化のために処理した。脳を、各７枚のスライドガラスの２つのセットの上（各スライドガラスの上に１２切片）に１４ミクロンで連続的に切り出した。ＢｒｄＵ陽性細胞の数を、コントロール動物およびｈＣＧ注射された動物の各々について１枚のスライドガラス上で前脳のＳＶＺにおいて数えた。以下のデータは、それぞれ、コントロールマウス（生理食塩水のみ）およびｈＣＧ注射されたマウスにおける切片あたりのＢｒｄＵ＋細胞の平均数である。
【０１３８】
生理食塩水：１６３±６（ｎ＝４）
ｈＣＧ：２０６±１３（ｎ＝４；＊Ｐ＜０．０２；対応のない ｔ−検定）
従って、単一の低い用量のｈＣＧ注射は、前脳のＳＶＺの増殖を２６％まで増加させた。
【０１３９】
（実施例７）
（ＬＨレセプターノックアウトマウス実験）
ＬＨレセプターが、ＳＶＺおよび海馬における神経幹細胞に対するＬＨの効果を直接媒介するか否かを調べるために、本発明者らは、免疫組織化学分析を用いて、両方の領域におけるＬＨレセプターのレベルを測定した。この結果は、ＬＨレセプターが、雄マウスおよび雌マウスのＳＶＺおよび海馬の両方において見出され得るが、雄は、雌と比較して、より低いレベルのＬＨレセプターを有することを示す。従って、ＬＨはおそらく、ＳＶＺおよび海馬においてそのレセプターに直接的に結合して、本明細書中に記載される生物学的機能を誘発する。
【０１４０】
ＬＨの役割をさらに調べるために、ＬＨレセプター（ＬＨＲ）ノックアウト（ＫＯ）マウスを、実施例１に記載したような臭気曝露実験において使用した。このマウスは、以前に、Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｐ．ら、２００１およびＨｕｈｔａｎｉｅｍｉら、２００２に記載されている。８〜１０週齢の成体ＬＨＲ野生型（ＷＴ）およびＫＯマウスを、２日間または７日間、反対の性の臭気に曝露した。曝露の２日目（雌の臭気に曝露された雄）および７日目（雄の臭気に曝露された雌）に、この動物に、２時間ごとに１回、ＢｒｄＵ（１２０ｍｇ／ｋｇ）の６回の注射を与えた。次いで、最後の注射の約３０分後に、このマウスを屠殺し、４％パラホルムアルデヒドで心臓灌流し、この組織を凍結切片化のために処理した。マウスの前脳を、各スライドガラスの上に１０枚の切片で、７枚のスライドガラスの上に１４ミクロンで連続的に凍結切片化した。次いで、各動物からの単一のスライドガラスをＢｒｄＵに対して免疫染色し、ＳＶＺにおけるＢｒｄＵ陽性細胞の総数を定量化した。臭気化されていないケージに曝露されたマウスを、ベースラインコントロールとして使用した。
【０１４１】
この結果を図９および図１０に示す。予想したように、雄の臭気は、雌の野生型マウス（＋／＋）のＳＶＺおよび海馬の両方において増殖の増加を生じた（図９Ａおよび９Ｂ）。しかし、ＬＨＲノックアウトマウス（−／−）において、増殖の増加は、雄の臭気に対する曝露後、海馬において観察されなかった（図９Ｂ）。これらの結果は、ＬＨレセプターシグナル伝達が、雌のマウスの海馬において雄のフェロモンの効果のために重要であることを示す。興味深いことに、ＬＨレセプターの欠失は、雄のフェロモンに応答するＳＶＺにおいて増殖に影響を与えなかった（図９Ａ）。同様に、雄のマウスにおいて、ＬＨレセプターノックアウトは、ＳＶＺまたは海馬のいずれにおいても雌性フェロモン誘発増殖に対して影響を示さなかった（図１０）。従って、ＬＨは、雌および雄の両方のＳＶＺおよび海馬において神経幹細胞増殖を誘発するのに十分であるが、ＳＶＺおよび雄の海馬において、やはりフェロモンの作用を媒介し得る因子（単数または複数）が存在する。
【図面の簡単な説明】
【０１４２】
【図１Ａ】図１Ａは、２日、７日または１４日の曝露後の雌マウスのＳＶＺにおける神経幹細胞の増殖に対する雄の臭気の効果を示す。２Ｄ、７Ｄおよび１４Ｄは、それぞれ、２日、７日および１４日の曝露を示す。Ｆ−Ｍ、雄の臭気に曝露された雌マウス；Ｆ−Ｆ、雌の臭気に曝露された雌マウス。生のデータは、各パネルの一番上に示される。図１Ａは、ＳＶＺにおけるＢｒｄＵ陽性細胞の数に対する効果を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、２日、７日または１４日の曝露後の雌マウスのＳＶＺにおける神経幹細胞の増殖に対する雄の臭気の効果を示す。２Ｄ、７Ｄおよび１４Ｄは、それぞれ、２日、７日および１４日の曝露を示す。Ｆ−Ｍ、雄の臭気に曝露された雌マウス；Ｆ−Ｆ、雌の臭気に曝露された雌マウス。生のデータは、各パネルの一番上に示される。図１Ｂは、ＳＶＺにおけるＫｉ６７陽性細胞の数に対する効果を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、２日、７日または１４日の曝露後の雌マウスのＳＶＺにおける神経幹細胞の増殖に対する雄の臭気の効果を示す。２Ｄ、７Ｄおよび１４Ｄは、それぞれ、２日、７日および１４日の曝露を示す。Ｆ−Ｍ、雄の臭気に曝露された雌マウス；Ｆ−Ｆ、雌の臭気に曝露された雌マウス。生のデータは、各パネルの一番上に示される。図１Ｃは、同腹子と非同腹子との比較を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、２日、７日または１４日の曝露後の雄マウスのＳＶＺにおける神経幹細胞の増殖に対する雌の臭気の効果を示す。２Ｄ、７Ｄおよび１４Ｄは、それぞれ、２日、７日および１４日の曝露を示す。Ｍ−Ｆ、雌の臭気に曝露された雄マウス；Ｍ−Ｍ、雄の臭気に曝露された雄マウス。生のデータは、各パネルの一番上に示される。図２Ａは、ＳＶＺにおけるＢｒｄＵ陽性細胞の数に対する効果を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、２日、７日または１４日の曝露後の雄マウスのＳＶＺにおける神経幹細胞の増殖に対する雌の臭気の効果を示す。２Ｄ、７Ｄおよび１４Ｄは、それぞれ、２日、７日および１４日の曝露を示す。Ｍ−Ｆ、雌の臭気に曝露された雄マウス；Ｍ−Ｍ、雄の臭気に曝露された雄マウス。生のデータは、各パネルの一番上に示される。図２Ｂは、ＳＶＺにおけるＫｉ６７陽性細胞の数に対する効果を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、２日、７日または１４日の曝露後の雄マウスのＳＶＺにおける神経幹細胞の増殖に対する雌の臭気の効果を示す。２Ｄ、７Ｄおよび１４Ｄは、それぞれ、２日、７日および１４日の曝露を示す。Ｍ−Ｆ、雌の臭気に曝露された雄マウス；Ｍ−Ｍ、雄の臭気に曝露された雄マウス。生のデータは、各パネルの一番上に示される。図２Ｃは、同腹子と非同腹子との比較を示す。
【図３】図３は、２日、７日または１４日の曝露後の雌マウスの海馬における神経幹細胞の増殖に対する雄の臭気の効果を示す。２Ｄ、７Ｄおよび１４Ｄは、それぞれ、２日、７日および１４日の曝露を示す。Ｆ−Ｍ、雄の臭気に曝露された雌マウス；Ｆ−Ｆ、雌の臭気に曝露された雌マウス。生のデータは、各パネルの一番上に示される。
【図４】図４は、２日、７日または１４日の曝露後の雌マウスにおける神経発生に対する雄の臭気の効果を示す。２Ｄ、７Ｄおよび１４Ｄは、それぞれ、２日、７日および１４日の曝露を示す。Ｆ−Ｍ、雄の臭気に曝露された雌マウス；Ｆ−Ｆ、雌の臭気に曝露された雌マウス。ＤＣＸ、ダブルコルチン。生のデータは、各パネルの一番上に示される。
【図５】図５は、２日、７日または１４日の曝露後の雄マウスにおける神経発生に対する雌の臭気の効果を示す。２Ｄ、７Ｄおよび１４Ｄは、それぞれ、２日、７日および１４日の曝露を示す。Ｍ−Ｆ、雌の臭気に曝露された雄マウス；Ｍ−Ｍ、雄の臭気に曝露された雄マウス。ＤＣＸ、ダブルコルチン。生のデータは、各パネルの一番上に示される。
【図６】図６は、ＴＵＮＥＬ（末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介性ｄＵＴＰニック末端標識）アッセイを示す。雌マウスは、７日間、雄の臭気に曝露された（Ｆ−Ｍ）か、または雌の臭気に曝露され（Ｆ−Ｆ）、プログラム細胞細胞死を受けた細胞の数は、ＴＵＮＥＬアッセイによって測定された。（Ａ）および（Ｂ）は、それぞれ、ＳＶＺおよび嗅球におけるアポトーシスの細胞数を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、雌マウスのＳＶＺにおけるＢｒｄＵ陽性細胞の数に対するＬＨの効果を示す。図７Ａは、ＬＨの注入２日後のＬＨの効果を示す。ＶＥＨ、ビヒクル。
【図７Ｂ】図７Ｂは、雌マウスのＳＶＺにおけるＢｒｄＵ陽性細胞の数に対するＬＨの効果を示す。図７Ｂは、ＬＨの注入６日後のＬＨの効果を示す。ＶＥＨ、ビヒクル。
【図８】図８は、ＬＨの注入２日後の雄マウスのＳＶＺにおけるＢｒｄＵ陽性細胞の数に対するＬＨの効果を示す。ＶＥＨ、ビヒクル。
【図９】図９は、雌マウスにおけるフェロモン誘発神経幹細胞増殖におけるＬＨレセプターの効果を示す。（Ａ）および（Ｂ）は、それぞれ、ＳＶＺ（Ａ）および海馬（Ｂ）におけるＬＨレセプターノックアウトの効果を示す。（−／−）：ＬＨレセプターノックアウト。（＋／＋）：野生型。ベースライン：臭気化されていないケージに曝露されたマウス。雌−雌：雌の臭気に曝露された雌マウス。雌−雄：雄の臭気に曝露された雌マウス。Ｐ＊＜０．０５；ＬＳＤ事後検定（ｐｏｓｔｈｏｃ ｔｅｓｔ）。
【図１０】図１０は、雄マウスにおけるフェロモン誘発神経幹細胞増殖におけるＬＨレセプターの効果を示す。（Ａ）および（Ｂ）は、それぞれ、ＳＶＺ（Ａ）および海馬（Ｂ）におけるＬＨレセプターノックアウトの効果を示す。（−／−）：ＬＨレセプターノックアウト。（＋／＋）：野生型。ベースライン：臭気化されていないケージに曝露されたマウス。雄−雌：雌の臭気に曝露された雄マウス。雄−雌：雌の臭気に曝露された雄マウス。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、３５米国特許法第１１９条（ｅ）に基づいて、２００４年２月１３日に出願された米国仮特許出願第６０／５４４，９１５号の利益を主張する。この先行出願の全開示は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、神経幹細胞の数および神経発生を増加させる方法、ならびにそれらの有用な組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
（参考文献）
【数１】
【０００４】
【数２】
【０００５】
【数３】
【０００６】
【数４】
【０００７】
【数５】
【０００８】
本出願において上記または他の部分に引用される刊行物、特許および特許出願の全ては、個々の刊行物、特許出願または特許の各々の開示が、あたかもその全体において参考として援用されることが具体的にかつ別個に示されるのと同じ程度まで、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【０００９】
（発明の背景）
近年、神経変性疾患は、これらの障害に関して最も危険である高齢者集団の増加に起因して、重大な懸念となっている。神経変性疾患としては、中枢神経系（ＣＮＳ）の特定部位における神経細胞の変性に関連付けられている疾患が挙げられ、この疾患は、意図された機能を実行するこれらの細胞の能力を不能にする。これらの疾患としては、アルツハイマー病、ハンティングトン病、筋萎縮性側索硬化症、およびパーキンソン病が挙げられる。さらに、おそらく（罹患した人の数に対する）ＣＮＳ機能不全の最も多くの部分は、神経細胞の欠損によってではなく、存在する神経細胞の異常な機能によって特徴付けられている。これは、ニューロンの不適切な発火、または神経伝達物質の異常な合成、放出、およびプロセシングに起因し得る。これらの機能不全は、うつ病および癲癇のような十分に研究され特徴付けられた障害、または神経症および精神病のようなより理解されていない障害の結果であり得る。さらに、脳損傷は、しばしば、神経細胞の欠損、罹患した脳領域の不適切な機能、およびその結果の行動異常を生じる。
【００１０】
従って、神経変性疾患または神経変性状態を処置するために、変性したニューロンまたは欠損したニューロンを補償するように脳に神経細胞を供給することが望ましい。この目標のための１つのアプローチは、患者の脳に神経細胞を移植することである。このアプローチは、好ましくは、対移植片宿主拒絶（ｈｏｓｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｇｒａｆｔ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）もしくは対宿主移植片拒絶（ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）が最小になり得るように同じ個体または非常に関連する個体に由来する、多量の神経細胞の供給源を必要とする。１人の人物から多量のニューロンまたはグリア細胞を取り出し、別の人物に移植することは現実的ではないので、多量の神経細胞を培養する方法が、このアプローチの成功には必須である。
【００１１】
別のアプローチは、欠損または変性した細胞を補償するために、インサイチュで神経細胞の産生を誘導することである。このアプローチは、脳（特に成体の脳）において神経細胞を産生することが可能であるか否か、およびその方法についての広い知識を必要とする。
【００１２】
多能性神経幹細胞の単離およびインビトロ培養についての技術（例えば、特許文献１；特許文献２；特許文献３を参照のこと）の開発は、両方のアプローチの見込みを非常に増大させた。胎児の脳は、インビトロにて多能性神経幹細胞を単離し、そして培養するために用いられ得ることが発見された。さらに、対照的に、成体の脳細胞は、脳細胞を複製または再生できないと長い間考えられてきたが、神経幹細胞は、成体の哺乳動物の脳からも単離され得ることが発見された。胎児または成体の脳のいずれかに由来するこれらの幹細胞は、自己複製し得る。子孫細胞は、再び増殖し得るか、または神経の細胞系統の任意の細胞（ニューロン、星状細胞および希突起膠細胞が挙げられる）に分化し得る。それゆえ、これらの知見は、移植に用いられ得る神経細胞の供給源を提供するだけでなく、成体脳における多能性神経幹細胞の存在およびインサイチュにおいてこれらの幹細胞からニューロンまたはグリア細胞を産生する可能性もまた、実証する。
【特許文献１】米国特許第５，７５０，３７６号明細書
【特許文献２】米国特許第５，９８０，８８５号明細書
【特許文献３】米国特許第５，８５１，８３２号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
従って、以下の２つの目的のために、神経幹細胞を効率的に産生する方法を開発することが望ましい：より多くの幹細胞、したがって移植治療において使用され得る神経細胞を得ること、ならびにインサイチュでより多くの幹細胞を産生するために使用され得る方法を同定すること。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（発明の要旨）
本発明は、フェロモン、黄体化ホルモン（ＬＨ）またはヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を使用することによって神経幹細胞の数を増加させる方法を提供する。この方法は、インサイチュでより多くの神経幹細胞を得るためにインビボで実施され得、これは、次いで、より多くのニューロンまたはグリア細胞を産生し、欠損した神経細胞または機能不全の神経細胞を補償し得る。この方法はまた、培養物中で多くの神経幹細胞を産生するために、インビトロで実施され得る。この培養された幹細胞は、例えば、神経変性疾患または神経変性状態に罹患しているか、あるいは神経変性疾患または神経変性状態を有すると疑われる患者または動物の移植処置のために使用され得る。
【００１５】
従って、本発明の１つの局面は、神経幹細胞の数を増加させる方法を提供し、この方法は、神経幹細胞の数の増加を生じる条件下で少なくとも１つの神経幹細胞に対して有効量のフェロモン、ＬＨまたはｈＣＧを提供する工程を包含する。この神経幹細胞は、哺乳動物の脳に、特に哺乳動物の脳の脳室下帯（ｓｕｂｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｚｏｎｅ）に配置され得る。あるいは、この神経幹細胞は、哺乳動物の海馬に配置され得る。あらゆる年齢の哺乳動物がこの方法に供され得るが、この哺乳動物が胚ではないことが好ましい。より好ましくは、この哺乳動物は、成体である。
【００１６】
哺乳動物は、神経変性疾患または神経変性状態に罹患しているか、あるいは神経変性疾患または神経変性状態を有すると疑われ得る。この疾患または状態は、外科手術によって引き起こされる発作または損傷のような脊髄損傷または脳損傷であり得る。この疾患または状態は、神経幹細胞の数が非常に減少することに関連する、加齢であり得る。この疾患または状態はまた、神経変性疾患、特にアルツハイマー病、ハンティングトン病、筋萎縮性側索硬化症、またはパーキンソン病であり得る。
【００１７】
あるいは、神経幹細胞は、インビトロで培養物内に存在し得る。インビトロで実施される場合、ＬＨまたはｈＣＧが、フェロモンの代わりに使用されることが、好ましい。
【００１８】
フェロモンは、哺乳動物における神経幹細胞の数を増加させ得る任意のフェロモンであり得る。物質が、神経幹細胞の数を増加させ得るか否かを決定するためのアッセイは、当該分野において確立されており、本明細書中に記載される（例えば、実施例１および実施例３を参照のこと）。このフェロモンは、好ましくは、２−ｓｅｃ−ブチル−４，５−ジヒドロチアゾール（ＳＢＴ）、２，３−デヒドロ−エキソ−ブレビコミン（ｂｒｅｖｉｃｏｍｉｎ）（ＤＨＢ）、αファルネセン（ｆａｒｎｅｓｅｎｅ）およびβファルネセン、６−ヒドロキシ−６−メチル−３−ヘプタノン、２−ヘプタノン、トランス−５−ヘプテン−２−オン、トランス−４−ヘプテン−２−オン、ｎ−ペンチルアセテート、シス−２−ペンテン−１−イル−アセテート、２，５−ジメチルピラジン、ドデシルプロピオネート、および（Ｚ）−７−ドデカン−１−イルアセテートからなる群より選択される。
【００１９】
フェロモン、ＬＨまたはｈＣＧが、インビボまたはインビトロで使用されるか否かに関わらず、他の因子が組み合わせて適用され得る（例えば、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、プロラクチン、プロラクチン放出ペプチド（ＰＲＰ）エリスロポエチン、サイクリックＡＭＰ、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）、セロトニン、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスホーミング増殖因子α（ＴＧＦα）、トランスホーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、エストロゲン、成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、インスリン様成長因子、白血病抑制因子、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、甲状腺ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、および／または血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ））。ＬＨまたはｈＣＧは、ネイティブＬＨまたはネイティブｈＣＧの活性を有する任意のＬＨアナログまたはｈＣＧアナログあるいはＬＨ改変体またはｈＣＧ改変体であり得る。
【００２０】
本発明の別の局面は、哺乳動物における神経変性疾患または神経変性状態を処置または改善する方法を提供し、この方法は、哺乳動物の脳に有効量のフェロモン、ＬＨまたはｈＣＧを提供する工程を包含する。この疾患または状態は、脳外科手術／脊髄外科手術によって引き起こされる発作または損傷のようなＣＮＳ損傷であり得る。この疾患または状態は、神経幹細胞の数の大きな減少と関連する加齢であり得る。この疾患または状態はまた、神経変性疾患、特にアルツハイマー病、ハンティングトン病、筋萎縮性側索硬化症、またはパーキンソン病であり得る。
【００２１】
哺乳動物は、必要に応じて、神経幹細胞および／または神経幹細胞子孫の移植を受容し得る。この移植は、哺乳動物がフェロモン、ＬＨまたはｈＣＧを受容する前、受容した後、または受容するのと同時に、行われ得る。好ましくは、哺乳動物は、フェロモン、ＬＨまたはｈＣＧの前に、あるいはフェロモン、ＬＨまたはｈＣＧと同時に移植を受容する。
【００２２】
哺乳動物は、必要に応じて、少なくとも１つのさらなる因子、例えば、エリスロポエチン、サイクリックＡＭＰ、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）、セロトニン、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスホーミング増殖因子α（ＴＧＦα）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、エストロゲン、成長ホルモン、インスリン様成長因子１、および／または毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）を受容し得る。
【００２３】
フェロモン、ＬＨ／ｈＣＧおよび／またはさらなる因子は、当該分野で確立された任意の方法によって提供され得る。例えば、それらは、脈管内的に、髄腔内的に、静脈内的に、筋肉内的に、皮下的に、腹腔内的に、局所的に、経口的に、経直腸的に、膣的に、鼻腔的に、吸入によって、または脳内に投与され得る。この投与は、好ましくは、全身投与（特に、皮下投与）によって行われる。フェロモン、ＬＨ／ｈＣＧまたはさらなる因子はまた、哺乳動物における内因性フェロモン、ＬＨ／ｈＣＧまたはさらなる因子の量を増加し得る有効量の因子を哺乳動物に投与することによって提供され得る。例えば、動物におけるＬＨのレベルは、ＧｎＲＨを使用することによって増加され得る。
【００２４】
フェロモン、ＬＨ／ｈＣＧまたはさらなる因子が、脳に直接送達されない場合、血液脳関門浸透剤が、脳への進入を容易にするために必要に応じて含まれ得る。血液脳関門浸透剤は、当該分野で公知であり、これらとしては、例として、米国特許第５，６８６，４１６号；同第５，５０６，２０６号および同第５，２６８，１６４号に記載されるブラジキニンおよびブラジキニンアゴニスト（例えば、ＮＨ２−アルギニン−プロリン−ヒドロキシプロキシプロリン−グリシン−チエニルアラニン−セリン−プロリン−４−Ｍｅ−チロシンψ（−ＣＨ２ＮＨ）−アルギニン−ＣＯＯＨ）が挙げられる。あるいは、送達されるべき分子は、米国特許第６，３２９，５０８号；同第６，０１５，５５５号；同第５，８３３，９８８号または同第５，５２７，５２７号に記載されるようなトランスフェリンレセプター抗体に結合体化され得る。この分子はまた、その分子と、脳毛細管内皮細胞レセプター（例えば、トランスフェリンレセプター）と反応性のリガンドとを含む融合タンパク質として送達され得る（例えば、米国特許第５，９７７，３０７号を参照のこと）。
【００２５】
本発明の別の局面は、神経幹細胞からのニューロン形成を向上させる方法を提供し、この方法は、上記神経幹細胞からの向上したニューロン形成を生じる条件下で少なくとも１つの神経幹細胞にフェロモン、ＬＨまたはｈＣＧを提供する工程を包含する。さらに、哺乳動物の嗅球における新しいニューロン形成を増加させる方法が提供され、この方法は、哺乳動物に有効量のフェロモン、ＬＨまたはｈＣＧを提供する工程を包含する。フェロモン、ＬＨまたはｈＣＧ、および少なくとも１つのさらなる因子を含む組成物および薬学的組成物もまた、提供される。
【００２６】
本発明に従って調製される細胞性組成物もまた、提供される。特に、ＬＨ／ｈＣＧに曝露された神経幹細胞培養物が、提供される。これらの培養物は、より高いレベルの神経幹細胞および／またはニューロンを有し、例えば、移植のために使用され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
（発明の詳細な説明）
本発明は、フェロモン、黄体化ホルモン（ＬＨ）またはヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を使用することによって神経幹細胞の数または神経発生を増加させる方法を提供する。この方法は、インサイチュでより多くの神経幹細胞を得るためにインビボで実施され得、次いで、欠損した神経細胞または機能不全の神経細胞を補償するためにより多くのニューロンまたはグリア細胞を産生し得る。この方法はまた、培養物における多くの神経幹細胞を産生するためにインビトロで実施され得る。この培養された幹細胞は、例えば、神経変性疾患または神経変性状態に罹患しているか、あるいは神経変性疾患または神経変性状態を有すると疑われる患者または動物の移植処置のために、使用され得る。
【００２８】
本発明をさらに詳細に記載する前に、本出願において使用される用語は、他に示されない限り、以下のように定義される。
【００２９】
（定義）
「神経幹細胞」とは、神経細胞系統における幹細胞である。幹細胞は、自己複製し得る細胞である。言い換えると、幹細胞の分裂から生じた娘細胞は、幹細胞を含む。神経幹細胞は、神経細胞系統における全ての細胞型（ニューロン、星状細胞および希突起膠細胞（星状細胞および希突起膠細胞はまとめて、グリアまたはグリア細胞と呼ばれる）を含む）に最終的に分化し得る。従って、本明細書中で言及される神経幹細胞は、多能性の神経幹細胞である。
【００３０】
「ニューロスフィア（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ）」または「スフィア（ｓｐｈｅｒｅ）」は、クローン性増殖の結果として単一の神経幹細胞に由来する細胞の一群である。「一次ニューロスフィア」とは、神経幹細胞を含む一次培養脳組織のプレーティングによって生成されるニューロスフィアをいう。ニューロスフィアを形成する神経幹細胞の培養方法は、例えば、米国特許第５，７５０，３７６号に記載されている。「二次ニューロスフィア」とは、一次ニューロスフィアを解離し、そして個々の解離した細胞がニューロスフィアを再び形成することを可能にすることによって生じるニューロスフィアをいう。
【００３１】
ネイティブ因子と「実質的な配列の類似性」を共有するポリペプチドは、ネイティブ因子とアミノ酸レベルで、少なくとも約３０％同一である。このポリペプチドは、ネイティブ因子とアミノ酸レベルで、好ましくは少なくとも約４０％、より好ましくは少なくとも約６０％、さらにより好ましくは少なくとも約７０％、そして最も好ましくは少なくとも約８０％同一である。
【００３２】
語句、ネイティブ因子とアナログまたは改変体の「パーセント同一性」または「％同一性」とは、２つの配列がアラインメントした場合に、アナログまたは改変体にもまた見出される、ネイティブ因子のアミノ酸配列の割合をいう。パーセント同一性は、当該分野において確立された任意の方法またはアルゴリズム（例えば、ＬＡＬＩＧＮまたはＢＬＡＳＴ）によって決定され得る。
【００３３】
ポリペプチドは、ネイティブ因子に対するレセプターに結合され得るか、またはネイティブ因子に対して惹起されたポリクローナル抗体によって認識され得る場合に、ネイティブ因子の「生物学的活性」を有する。好ましくは、このポリペプチドは、レセプター結合アッセイにおいて、ネイティブ因子に対するレセプターに特異的に結合し得る。
【００３４】
ネイティブ因子の「機能的アゴニスト」は、ネイティブ因子のレセプターに結合し、そしてネイティブ因子のレセプターを活性化する化合物であるが、ネイティブ因子と実質的な配列類似性を共有することは必須ではない。
【００３５】
「ＬＨ」は、（１）ネイティブな哺乳動物のＬＨ、好ましくはネイティブなヒトのＬＨと実質的な配列類似性を共有するポリペプチドを含み；そして（２）ネイティブな哺乳動物のＬＨの生物学的活性を有する、タンパク質である。このネイティブな哺乳動物のＬＨは、下垂体の前葉によって分泌されるゴナドトロピンである。ＬＨは、非共有結合αサブユニットおよび非共有結合βサブユニットからなるヘテロ二量体である。αサブユニットは、ＬＨ、ＦＳＨおよびｈＣＧの間で共通であり、そしてβサブユニットは、各ホルモンに特異的である。本発明に有用なＬＨは、ネイティブな哺乳動物のＬＨと実質的な配列類似性を共有するβサブユニットとともに、ネイティブなαサブユニットを有し得る。あるいは、このＬＨは、ネイティブな哺乳動物のＬＨと実質的な配列類似性を共有するαサブユニットとともに、ネイティブなβサブユニットを有し得る。このＬＨはまた、ネイティブな対応するサブユニットと実質的な配列類似性を共有するαサブユニットおよびβサブユニットの両方を有し得る。従って、用語「ＬＨ」は、ネイティブなＬＨサブユニットの欠失変異体、挿入変異体、または置換変異体を含むＬＨアナログを包含する。さらに、用語「ＬＨ」は、他の種に由来するＬＨおよびその天然に存在する改変体を包含する。さらに、「ＬＨ」はまた、ネイティブな哺乳動物のＬＨレセプターの機能的アゴニストであり得る。
【００３６】
「ｈＣＧ」は、（１）ネイティブなｈＣＧと実質的な配列類似性を共有するポリペプチドを含み；そして（２）ネイティブなｈＣＧの生物学的活性を有する、タンパク質である。このネイティブなｈＣＧは、非共有結合αサブユニットおよび非共有結合βサブユニットからなるヘテロ二量体である。αサブユニットは、ＬＨ、ＦＳＨおよびｈＣＧの間で共通であり、そしてβサブユニットは、各ホルモンに特異的である。しかし、ｈＣＧおよびＬＨのβサブユニットは、８５％の配列類似性を共有する。本発明に有用なｈＣＧは、ネイティブなｈＣＧと実質的な配列類似性を共有するβサブユニットとともに、ネイティブなαサブユニットを有し得る。あるいは、このｈＣＧは、ネイティブなｈＣＧと実質的な配列類似性を共有するαサブユニットとともに、ネイティブなβサブユニットを有し得る。このｈＣＧはまた、ネイティブな対応するサブユニットと実質的な配列類似性を共有するαサブユニットおよびβサブユニットの両方を有し得る。従って、用語「ｈＣＧ」は、ネイティブなｈＣＧサブユニットの欠失変異体、挿入変異体、または置換変異体を含むｈＣＧアナログを包含する。さらに、用語「ｈＣＧ」は、他の種に由来するｈＣＧ対応物およびその天然に存在する改変体を包含する。さらに、「ｈＣＧ」はまた、ネイティブな哺乳動物のｈＣＧ／ＬＨレセプターの機能的アゴニストであり得る。
【００３７】
「プロラクチン」は、（１）ネイティブな哺乳動物プロラクチン、好ましくはネイティブなヒトプロラクチンと実質的な配列類似性を共有し；そして（２）ネイティブな哺乳動物のプロラクチンの生物学的活性を有する、ポリペプチドである。このネイティブなヒトプロラクチンは、脳下垂体で主に合成される１９９アミノ酸のポリペプチドである。従って、用語「プロラクチン」は、ネイティブプロラクチンの欠失変異体、挿入変異体または置換変異体であるプロラクチンアナログを包含する。さらに、用語「プロラクチン」は、他の種に由来するプロラクチンおよびその天然に存在する改変体を包含する。
【００３８】
なおさらに、「プロラクチン」はまた、ネイティブな哺乳動物のプロラクチンレセプターの機能的アゴニストであり得る。例えば、機能的アゴニストは、プロラクチンレセプターについての米国特許第６，３３３，０３１号に開示された活性性アミノ酸配列；プロラクチンレセプターに対するアゴニスト活性を有する金属錯体レセプターリガンド（米国特許第６，４１３，９５２号）；Ｇ１２０ＲｈＧＨ（これは、ヒト成長ホルモンのアナログであるが、プロラクチンアゴニストとして作用する）（Ｍｏｄｅら、１９９６）；または米国特許第５，５０６，１０７号および同第５，８３７，４６０号に記載されるようなプロラクチンレセプターに対するリガンドであり得る。
【００３９】
「ＥＧＦ」とは、ネイティブなＥＧＦまたは任意のＥＧＦアナログもしくは改変体を意味し、このアナログまたは改変体は、ネイティブなＥＧＦと実質的なアミノ酸類配列似性を共有し、そして少なくとも１つ、ネイティブなＥＧＦの有する生物学的活性（例えば、ＥＧＦレセプターへの結合）を共有する。特に、ＥＧＦとして挙げられるのは、任意の種のネイティブＥＧＦ、ＴＧＦα、または組換え改変ＥＧＦである。特定の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：２つのＣ末端アミノ酸の欠失および５１位での１つの中性アミノ酸置換を有する組換え改変ＥＧＦ（特に、ＥＧＦ５１ ｇｌｎ５１；米国特許出願公開番号２００２００９８１７８Ａ１）、１６位のＨｉｓ残基が中性アミノ酸または酸性アミノ酸で置換されている、ＥＧＦムテイン（ＥＧＦ−Ｘ６）（米国特許第６，１９１，１０６号）、ネイティブなＥＧＦのアミノ末端残基を欠く、ＥＧＦの５２アミノ酸欠失変異体（ＥＧＦ−Ｄ）、Ｎ末端残基ならびに２つのＣ末端残基（Ａｒｇ−Ｌｅｕ）が欠失された、ＥＧＦ欠失変異体（ＥＧＦ−Ｂ）、２１位のＭｅｔ残基が酸化されているＥＧＦ−Ｄ（ＥＧＦ−Ｃ）、２１位のＭｅｔ残基が酸化されているＥＧＦ−Ｂ（ＥＧＦ−Ａ）、ヘパリン−結合ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、βセルリン、アンフィレグリン（ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）、ニューレグリン（ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ）、または上記のいずれかを含む融合タンパク質。他の有用なＥＧＦのアナログまたは改変体は、米国特許出願公開番号２００２００９８１７８Ａ１、ならびに米国特許第６，１９１，１０６号および同第５，５４７，９３５号に記載されている。
【００４０】
さらに、「ＥＧＦ」はまた、ネイティブな哺乳動物のＥＧＦレセプターの機能的アゴニストであり得る。例えば、機能的アゴニストは、ＥＧＦレセプターの活性性アミノ酸配列（米国特許第６，３３３，０３１号に開示される）、またはＥＧＦレセプターに対してアゴニスト活性を有する抗体（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｐｏｌ、１９８５および米国特許第５，７２３，１１５号）であり得る。
【００４１】
「ＰＡＣＡＰ」とは、ネイティブなＰＡＣＡＰまたは任意のＰＡＣＡＰのアナログもしくは改変体を意味し、このアナログまたは改変体は、ネイティブなＰＡＣＡＰと実質的なアミノ酸配列類似性を共有し、そして少なくとも１つ、ネイティブなＰＡＣＡＰの有する生物学的活性（例えば、ＰＡＣＡＰレセプターへの結合）を共有する。有用なＰＡＣＡＰアナログおよび改変体としては、以下に限定されないが、ＰＡＣＡＰの３８アミノ酸改変体および２７アミノ酸改変体（それぞれ、ＰＡＣＡＰ３８およびＰＡＣＡＰ２７）、そして例えば、米国特許第５，１２８，２４２号；同第５，１９８，５４２号；同第５，２０８，３２０号；同第５，３２６，８６０号；同第５，６２３，０５０号；同第５，８０１，１４７号；ならびに同第６，２４２，５６３号に開示されるアナログおよび改変体が挙げられる。
【００４２】
さらに、「ＰＡＣＡＰ」はまた、ネイティブな哺乳動物のＰＡＣＡＰレセプターの機能的アゴニストであり得る。例えば、機能的アゴニストは、マキサディラン（ｍａｘａｄｉｌａｎ）（ＰＡＣＡＰ １型レセプターの特異的アゴニストとして作用するポリペプチド）（Ｍｏｒｏら、１９９７）であり得る。
【００４３】
「エリスロポエチン（ＥＰＯ）」とは、ネイティブなＥＰＯまたは任意のＥＰＯのアナログもしくは改変体を意味し、このアナログまたは改変体は、ネイティブなＥＰＯと実質的なアミノ酸配列類似性を共有し、そして少なくとも１つ、ネイティブなＥＰＯの有する生物学的活性（例えば、ＥＰＯレセプターへの結合）を共有する。エリスロポエチンのアナログおよび改変体は、例えば、米国特許第６，０４８，９７１号および同第５，６１４，１８４号に開示される。
【００４４】
なおさらに、「ＥＰＯ」はまた、ネイティブな哺乳動物のＥＰＯレセプターの機能的アゴニストであり得る。例えば、機能的アゴニストは以下のものであり得る：ＥＭＰ１（ＥＰＯ擬態ペプチド１、Ｊｏｈｎｓｏｎら、２０００）；Ｗｒｉｇｈｔｏｎら、１９９６および米国特許第５，７７３，５６９号に記載されるようなＥＰＯの短いペプチド擬態物のうちの１つ；Ｋａｕｓｈａｎｓｋｙ、２００１に開示されるような任意の低分子ＥＰＯ擬態物；米国特許第５，８８５，５７４号、国際公開第９６／４０２３１号、国際公開第９７／４８７２９号、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｐｏｌ、１９８５または米国特許第５，７２３，１１５号に記載されるようなＥＰＯレセプターを活性化する抗体；ＥＰＯレセプターについて米国特許第６，３３３，０３１号に開示されるような活性性アミノ酸配列；ＥＰＯレセプターに対してアゴニスト活性を有する金属錯体化レセプターリガンド（米国特許第６，４１３，９５２号）；または米国特許第５，５０６，１０７号および同第５，８３７，４６０号に記載されるようなＥＰＯレセプターに対するリガンド。
【００４５】
「ＬＨ／ｈＣＧ誘発因子」は、動物に与えられた場合、その動物におけるＬＨまたはｈＣＧの量を増加し得る物質である。例えば、ＬＨ放出ホルモン（ＬＨＲＨ）は、ＬＨの分泌を刺激する。
【００４６】
「フェロモン」は、同じ種の別の動物、通常は反対の性に対するシグナルとして役立つ物質である。哺乳動物のフェロモンは、低分子のタンパク質であり得る。好ましくは、フェロモンは、２−ｓｅｃ−ブチル−４，５−ジヒドロチアゾール（ＳＢＴ）、２，３−デヒドロ−エキソ−ブレビコミン（ＤＨＢ）、αファルネセンおよびβファルネセン、６−ヒドロキシ−６−メチル−３−ヘプタノン、２−ヘプタノン、トランス−５−ヘプテン−２−オン、トランス−４−ヘプテン−２−オン、ｎ−ペンチルアセテート、シス−２−ペンテン−１−イル−アセテート、２，５−ジメチルピラジン、ドデシルプロピオネート、および（Ｚ）−７−ドデカン−１−イルアセテートからなる群より選択される（例えば、Ｄｕｌａｃら、２００３を参照のこと）。
【００４７】
細胞型の形成の「増強」とは、その細胞型の数が増加することを意味する。従って、ある因子の存在下におけるニューロン数が、その因子の非存在下におけるニューロン数より大きい場合に、その因子は、ニューロン形成を増強するために使用され得る。その因子の非存在下におけるニューロン数は、０以上であり得る。
【００４８】
「神経変性疾患または神経変性状態」は、ニューロン欠損またはニューロン機能不全に関連する疾患または医学的状態である。神経変性疾患または神経変性状態の例としては、神経変性疾患、ＣＮＳ損傷またはＣＮＳ機能不全が挙げられる。神経変性疾患としては、例えば、アルツハイマー病、黄斑変性、緑内障、糖尿病性網膜症、末梢神経障害、ハンティングトン病、筋萎縮性側索硬化症、およびパーキンソン病が挙げられる。ＣＮＳ損傷としては、例えば、発作（例えば、出血性発作、局所性の虚血性発作または全体的な虚血性発作）および外傷性の脳損傷または脊髄損傷（例えば、脳外科手術または脊髄外科手術あるいは物理的な事故により引き起こされる損傷）が挙げられる。ＣＮＳ機能不全としては、例えば、うつ病、癲癇、神経症および精神病が挙げられる。
【００４９】
「治療または改善」とは、疾患または医学的状態の症状の軽減あるいは完全な除去を意味する。
【００５０】
「神経変性疾患または神経変性状態を有すると疑われる」哺乳動物とは、神経変性疾患または神経変性状態と正式には診断されないが、神経変性疾患または神経変性状態の症状を示す哺乳動物であり、家族歴または遺伝素因に起因して神経変性疾患または神経変性状態と疑われるか、あるいは、以前に神経変性疾患または神経変性状態を有しており、そして再発の危険にさらされている哺乳動物である。
【００５１】
哺乳動物への組成物の「移植」とは、当該分野において確立された任意の方法によって、哺乳動物の身体内へ組成物を導入することをいう。導入される組成物は「移植片」であり、哺乳動物は「レシピエント」である。移植片およびレシピエントは、同系、同種異系、または異種であり得る。好ましくは、移植は、自己移植である。
【００５２】
「有効量」は、意図された目的を達成するために十分な治療剤の量である。例えば、神経幹細胞の数を増加させるためのＬＨまたはｈＣＧの有効量は、インビボでもインビトロのでも、場合に応じて、神経幹細胞の数の増加という結果を生じさせるために十分な量である。神経変性疾患または神経変性状態を処置または改善するためのＬＨまたはｈＣＧの有効量は、神経変性疾患または神経変性状態の症状を軽減または取り除くのに十分なＬＨ／ｈＣＧの量である。所定の治療剤の有効量は、因子（例えば、薬剤の性質、投与経路、治療剤を受ける動物のサイズおよび種、ならびに投与の目的）によって変化する。各個々の症例における有効量は、当該分野において確立された方法に従って、当業者によって経験的に決定され得る。
【００５３】
（方法）
神経幹細胞は、成体の哺乳動物の脳の２つの領域に存在する（ＲｅｙｎｏｌｄｓおよびＷｅｉｓｓ、１９９２）（海馬の歯状回（ｄｅｎｄａｔｅ ｇｙｒｕｓ）および側脳室の脳室下帯（ＳＶＺ）（Ｌｕｓｋｉｎ １９９３；Ｍｅｎｅｚｅｓら、１９９５；Ｆｒｉｓｅｎら、１９９８；Ｐｅｒｅｔｔｏら、１９９９；Ｇａｇｅ、２０００；Ｒｏｃｈｅｆｏｒｔら、２００２））。神経幹細胞は、それらの成長および増殖に寄与する２つの有糸分裂の経路を伴う。第１の有糸分裂の経路は、神経幹細胞が、再生および自己複製の手段として対照的に分裂する経路である。第２の有糸分裂は、非対照的であり、それは、娘神経幹細胞および前駆細胞を生じる。最終的に、前駆細胞は、中枢神経系の細胞型の１つとして終末の発生運命をとる。例えば、神経発生の場合については、ニューロンの前駆細胞は、ニューロンを生じる（Ｗｅｉｓｓら、１９９６；ＭｏｒｒｉｓｏｎおよびＳｈａｈ、１９９７；Ｐｅｒｅｔｔｏら、１９９９；Ｒａｏ、１９９９）。
【００５４】
海馬のニューロンの前駆細胞は、歯状回に存在し、増殖および顆粒細胞層に移動して、顆粒細胞に分化する能力を有する（Ｎｉｌｓｓｏｎら、１９９９；Ｇａｇｅ ２０００；Ｒｏｃｈｅｆｏｒｔら、２００２）。ＳＶＺにおいて、神経幹細胞および前駆細胞は増殖し、次いで前駆細胞は、吻側移動流（ｒｏｓｔｒａｌ ｍｉｇｒａｔｏｒｙ ｓｔｒｅａｍ）（ＲＭＳ）として公知の移動経路に従い、そこで、嗅球（ＯＢ）に向かい、介在ニューロンになるなる予定になっている（Ｌｕｓｋｉｎ １９９３；Ｍｅｎｅｚｅｓら、１９９５；Ｒａｏ、１９９９；Ｒｏｃｈｅｆｏｒｔら、２００２）。
【００５５】
新たな臭気で生じた豊かな嗅覚環境は、嗅球において神経発生を増加させ、臭気記憶を改良したことを示した（Ｒｏｃｈｅｆｏｒｔら、２００２）。嗅球介在ニューロンは、ＳＶＺにおける神経幹細胞に由来するが、豊かな嗅覚環境に対する曝露は、ＳＶＺにおける細胞増殖に対して効果がなかった（Ｒｏｃｈｅｆｏｒｔら、２００２）。しかしながら、本発明に記載したように、本発明者らは、神経幹細胞増殖および神経発生において、雄の臭気および雌の臭気の反対の性に対する驚くべき効果を観察した。
【００５６】
雄の臭気または雌の臭気の影響を測定するために、成体のマウスは、２日間、７日間または１４日間、反対の性の臭気に曝露された。コントロール群は、同じ期間、同じ性の臭気に曝露された。次いで、このマウスは、増殖性細胞を標識化するためにＢｒｄＵを受け、ＢｒｄＵ陽性細胞の位置は、免疫組織化学研究によって同定された（実施例１）。図１Ａに示されるように、雌マウスのＳＶＺにおける増殖性細胞は、２日間、７日間または１４日間、雌の臭気に曝露された後、同じレベルのままであった。しかしながら、雄の臭気に曝露された雌の群において、ＳＶＺにおける増殖性細胞は、時間とともに変化した：７日後に顕著に増加して、１４日後に顕著に減少した。２日の曝露は有意な効果がなかった。Ｋｉ６７が、増殖性細胞を標識化するために使用された場合、同じパターンが観察され（図１Ｂ）、ＢｒｄＵ陽性細胞の変化が、増殖レベルの変化を反映したことを示した。
【００５７】
雌の臭気はまた、雄マウスの脳における増殖に影響したが、異なる時間的パターンにおける増殖に影響した。雄が、２日間、雌の臭気に曝露された場合、ＢｒｄＵ陽性細胞（図２Ａ）またはＫｉ６７陽性細胞（図２Ｂ）の数の突然の増加が生じた。しかしながら、７日または１４日の曝露の後、新たに増加した細胞の数は、コントロールレベルに減少した。
【００５８】
著しいことには、海馬における神経幹細胞はまた、性に特異的な臭気に応答した。やはり、２日間の雄の臭気に対する曝露は、雌マウスに対して有意な効果がなかったが、７日の曝露は、海馬における増殖の有意な増加を生じた（図３）。１４日間の曝露の後、増殖性細胞のレベルは、雌の臭気に曝露された雌と比較した場合、雄の臭気に曝露された雌において有意に低下した。本発明者らの見解によれば、最初の時間は、成長因子（例えば、ＥＧＦさらにＦＧＦ）以外の任意の刺激が、ＳＶＺおよび海馬における神経幹細胞に同様の効果を与えることを示した。通常、この効果は、対照的である。例えば、プロラクチンは、ＳＶＺに影響を与えるが、海馬に影響を与えず（Ｓｈｉｎｇｏら、２００３）；エストロゲンは、海馬における増殖を刺激するが、ＳＶＺにおける増殖を刺激せず（Ｔａｎａｐａｔら、１９９９）；豊かな環境および身体的活動は、海馬の神経発生を促進するが、ＳＶＺの神経発生を促進しない（Ｂｒｏｗｎら、２００３）。
【００５９】
神経発生はまた、反対の性の臭気に対する曝露において増強した（実施例２）。従って、上記のマウスにおける神経発生の程度を測定するために、上記の動物からの組織切片は、ダブルコルチン（ニューロンの前駆細胞において発現される細胞質タンパク質）に対して染色された。増殖性細胞の場合のように、雌マウスは、雄の臭気に対する７日の曝露後、有意により多くのダブルコルチン陽性細胞を有し（図４）、一方、雄マウスは、雌の臭気に対する２日の曝露後、有意により多くのダブルコルチン陽性細胞を有した（図５）。
【００６０】
反対の性からのフェロモンがまた、神経細胞の生存に影響を与えるか否かを決定するために、ＴＵＮＥＬアッセイを実施した。この結果は、雄の臭気に対する７日の曝露後、雌マウスのＳＶＺ（図６Ａ）または嗅球（図６Ｂ）において有意な相違が観察され得なかったことを示す。
【００６１】
雄性フェロモンは、黄体ホルモン（ＬＨ）のレベルを増加させ、プロラクチンのレベルを減少させる一方、雌性フェロモンは、プロラクチンの増加に関連することが公知である（Ｄｕｌａｃら、２００３）。フェロモンが、反対の性において神経幹細胞増殖および神経発生を増強させる方法を調べるための試みにおいて、動物はＬＨを注入された。この結果は、ＬＨが、雌マウス（図７Ａおよび７Ｂ）および雄マウス（図８）の両方のＳＶＺにおいて増殖を有意に増加させることを示す。これらの結果と一致して、ＬＨはまた、培養物における神経幹細胞の自己複製を増加させ得る（実施例３）。
【００６２】
従って、本発明は、フェロモンおよび／またはＬＨを用いて、インビボまたはインビトロのいずれかにおいて、神経幹細胞の数を増加させる方法を提供する。ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）は、ＬＨのアナログであり、ＬＨと同じレセプターを共有するので、ｈＣＧは、ＬＨと同様の効果を有すると予想される。インビボでの神経幹細胞の数を増加させるために使用される場合、この方法は、脳における神経幹細胞の大きなプールを生じる。この神経幹細胞の大きなプールは、続いて、フェロモン、ＬＨ／ｈＣＧを含まない幹細胞の集団より多くの神経細胞、特にニューロンまたはグリア細胞を生じ得る。次いで、この神経細胞は、神経系損傷を含む、神経変性疾患および神経変性状態に関連する神経細胞の損失または変性を補償し得る。
【００６３】
フェロモンによって誘発されるＬＨ／ｈＣＧまたは他の因子はまた、インビトロで神経幹細胞の数を増加させるために使用され得る。生じた神経幹細胞は、インビトロでより多くのニューロンおよび／またはグリア細胞を産生するために使用され得るか、あるいは神経変性疾患または神経変性状態に罹患するヒトまたは動物への移植手順に使用され得る。ニューロンまたはグリア細胞よりむしろ、本発明に従って産生される神経幹細胞が移植されることが、好ましい。一旦神経幹細胞が移植されると、増殖因子および／または分化因子が、幹細胞の数をさらに増加させるため、またはニューロン形成またはグリア細胞形成を選択的に増強させるために、インビボに投与され得る。同様に、さらなる因子が、ＬＨまたはｈＣＧとともにインビトロで使用され得るか、またはフェロモン／ＬＨ／ｈＣＧと組み合わせてインビボに投与され得る。
【００６４】
例示的な分化因子としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
１．エリスロポエチン（Ｅｐｏ）：Ｅｐｏは、ニューロン細胞系統に関与するＮＳＣを増強し、これは、発作のマウスモデルおよびラットモデルを処置するために使用される得ることが実証された。
２．脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）：ＢＤＮＦは、ニューロン系統を促進する公知の生存因子および分化因子である。
３．トランスホーミング増殖因子βおよび骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）：ＢＭＰは、ニューロン系統および特定のニューロン表現型の産生を促進する公知の分化因子（例えば、脊髄における知覚介在ニューロン）である。
４．甲状腺ホルモン（Ｔ３形態およびＴ４形態の両方を含むＴＨ）：ＴＨは、希突起膠細胞の成熟および産生を促進する分化因子として公知である（例えば、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｐｅｎａ、１９９９を参照のこと。）
５．甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）および甲状腺放出ホルモン（ＴＲＨ）：ＴＳＨ／ＴＲＨは、下垂体前葉由来のＴＨの放出を促進し、増加したレベルの循環ＴＨをもたらす。この因子は、ＮＳＣからの希突起膠細胞発生（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｇｌｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）を促進するために、フェロモン／ＬＨ／ｈＣＧと組み合わせて使用され得る。
６．ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）：ＳＨＨは、発生の間に発生するＣＮＳをパターン付けるモルフォゲンであり、異なる濃度において、ニューロンの特定の型（例えば、脊髄における運動ニューロン）および希突起膠細胞の発生を促進する。この因子は、ＮＳＣからの神経発生および／または希突起膠細胞発生を促進するために、フェロモン／ＬＨ／ｈＣＧと組み合わせて使用され得る。
７．血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）：ＰＤＧＦは、ＮＳＣからの希突起膠細胞の産生および分化を促進する。この因子は、ＮＳＣからの希突起膠細胞発生を促進するために、フェロモン／ＬＨ／ｈＣＧと組み合わせて使用され得る。
８．サイクリックＡＭＰならびに脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）およびセロトニンのようなｃＡＭＰ経路を増強する因子もまた、ニューロン産生を選択的に促進するための良い候補である。
【００６５】
神経幹細胞の数を増加させ得る因子としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
９．卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）は、多くの場合、ＬＨと合わせて作用する；ＬＨレセプター発現を誘発することが公知であり、従って、ＬＨシグナル伝達の効果を増強し得る。
１０．成長ホルモン（ＧＨ）は、ＮＳＣ増殖を刺激し得る。
１１．インスリン増殖因子（ＩＧＦ）は、ＧＨに応答して多くの組織から放出されるソマトメジアン（ｓｏｍａｔｏｍｅｄｉａｎ）であり、ＧＨの増殖促進効果の多くを媒介する。ＩＧＦ−１は、ＮＳＣ増殖を刺激する。
１２．成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）は、視床下部から分泌され、下垂体前葉からのＧＨ放出を誘発し、増加したレベルの循環ＧＨを生じる。
１３．プロラクチン（ＰＲＬ）は、下垂体前葉から分泌され、ＮＳＣ増殖を促進することが公知である。ＰＲＬおよびフェロモン／ＬＨ／ｈＣＧは、ＮＳＣ増殖を最大化するために、組み合わせて使用され得る。
１４．プロラクチン放出ペプチド（ＰＲＰ）は、プロラクチンの放出を誘発し、ＮＳＣ増殖を最大化するために、フェロモン／ＬＨ／ｈＣＧと組み合わせて使用され得る。
１５．線維芽細胞増殖因子は、公知のＮＳＣについてのマイトジェン因子である。
１６．エストロゲンは、海馬におけるＮＳＣの増殖を促進することが公知である。
１７．セロトニンは、海馬におけるＮＳＣの増殖を促進することが公知である。
１８．上皮細胞増殖因子は、公知のＮＳＣについてのマイトジェン因子である。
１９．トランスホーミング増殖因子α（ＴＧＦα）は、公知のＮＳＣについてのマイトジェン因子である。
２０．性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）は、ＬＨの放出を誘発し、ＬＨの循環レベルを増加し、そしてＮＳＣ増殖を増強するために、フェロモン／ＬＨ／ｈＣＧと組み合わせて使用され得るか、またはフェロモン／ＬＨ／ｈＣＧの代わりに使用され得る。
２１．毛様体神経栄養因子および白血病抑制因子：これらの因子の両方などは、ｇｐ１３０サブユニットを介して信号を送る。このシグナル伝達経路は、ＮＳＣ自己複製を促進し、これによって脳のＮＳＣ集団を増大させることが実証している。これらの因子は、ＮＳＣ増殖を促進し、そしてＣＮＳ内のＮＳＣ集団のサイズを増加させるために、フェロモン／ＬＨ／ｈＣＧと組み合わせて使用され得る。
【００６６】
さらに、インビトロまたはインビボでの神経幹細胞からのニューロン形成を増加させる方法が、本発明によって提供される。特に、新たな嗅覚ニューロン産生を増強する方法が、提供される。
【００６７】
神経幹細胞またはニューロンの増加は、好ましくは少なくとも約１０％、より好ましくは少なくとも約２０％、さらにより好ましくは少なくとも約３０％、なおより好ましくは少なくとも約４０％、なおさらにより好ましくは少なくとも約５０％、およびさらに一層より好ましくは少なくとも約６０％である。最も好ましくは、この増加は、少なくとも約８０％である。
【００６８】
本発明はまた、動物、特に哺乳動物における神経変性疾患または神経変性状態を処置または改善する方法を提供する。これは、例えば、有効量のＬＨおよび／またはｈＣＧを哺乳動物に投与する工程、あるいは本発明に従って産生された神経幹細胞、神経幹細胞由来の前駆細胞、ニューロンおよび／またはグリア細胞を哺乳動物に移植する工程によって達成され得る。好ましくは、神経幹細胞が移植される。移植に加えて、ＬＨ／ｈＣＧおよび／またはさらなる因子が、特に移植と同時または移植後に、移植レシピエントにさらに提供され得る。
【００６９】
１つの特に興味の深い神経変性状態は、加齢である。本発明者らは、脳室下帯における神経幹細胞の数が、高齢のマウスにおいて顕著に減少したことを見出した。従って、フェロモン／ＬＨ／ｈＣＧを用いて、神経幹細胞の数を増加することによって、加齢に関する問題を改善することは、特に興味があることである。
【００７０】
例えば、脳室下帯における神経幹細胞は、嗅覚ニューロンの供給源であり、嗅覚機能不全は、前脳神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病およびハンティングトン病）の特徴である。嗅球へのニューロン移動の途絶は、嗅覚弁別の欠損をもたらし、新たな嗅覚介在ニューロンの倍加は、新たな臭気記憶を増強する（Ｒｏｃｈｅｆｏｒｔら、２００２）。従って、フェロモン／ＬＨ／ｈＣＧは、嗅覚弁別または嗅覚記憶、ならびに嗅覚および嗅覚弁別に関連する生理的機能（例えば、交配、子孫認識および子育て）を増強するために使用され得る。
【００７１】
本発明の別の特定の重要な用途は、ＣＮＳ損傷（例えば、脳卒中）の処置および／または改善である。
【００７２】
（組成物）
本発明は、フェロモン、ＬＨまたはｈＣＧ、および必要に応じて少なくとも１つのさらなる因子を含む組成物を提供する。このさらなる因子は、神経幹細胞の数を増加させ得、上記のニューロンまたはグリア細胞への神経幹細胞の分化を増強させ得る。このさらなる因子は、好ましくは、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、プロラクチン、プロラクチン放出ペプチド（ＰＲＰ）、エリスロポエチン、サイクリックＡＭＰ、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）、セロトニン、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスホーミング増殖因子α（ＴＧＦα）、トランスホーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、エストロゲン、成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、インスリン様増殖因子、白血病抑制因子、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、甲状腺ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、および／または血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）からなる群より選択される。最も好ましくは、エリスロポエチン、プロラクチン、ＥＧＦおよび／またはＰＡＣＡＰが、添加される。
【００７３】
フェロモンは、哺乳動物における神経幹細胞の数を増加させ得る任意のフェロモンであり得る。物質が、神経幹細胞の数を増加させ得るか否かを測定するためのアッセイは、当該分野において確立され、本明細書中に記載されている（例えば、実施例１および３を参照のこと）。このフェロモンは、好ましくは、２−ｓｅｃ−ブチル−４，５−ジヒドロチアゾール（ＳＢＴ）、２，３−デヒドロ−エキソ−ブレビコミン（ＤＨＢ）、αファルネセンおよびβファルネセン、６−ヒドロキシ−６−メチル−３−ヘプタノン、２−ヘプタノン、トランス−５−ヘプテン−２−オン、トランス−４−ヘプテン−２−オン、ｎ−ペンチルアセテート、シス−２−ペンテン−１−イル−アセテート、２，５−ジメチルピラジン、ドデシルプロピオネート、および（Ｚ）−７−ドデカン−１−イルアセテートからなる群より選択される（例えば、Ｄｕｌａｃら、２００３を参照のこと）。
【００７４】
本発明に有用なＬＨ／ｈＣＧとしては、あらゆるＬＨアナログまたはｈＣＧアナログあるいは神経幹細胞の数を増加させ得る改変体が挙げられる。ＬＨ／ｈＣＧのアナログまたは改変体は、ネイティブなヒトＬＨまたはｈＣＧの少なくとも１つのサブユニットの少なくとも約３０％のアミノ酸配列を含むタンパク質を含み、これは、ネイティブなＬＨまたはｈＣＧの生物学的活性を有する。好ましくは、ＬＨまたはｈＣＧの生物学的活性は、ＬＨ／ｈＣＧレセプターに結合する能力である。具体的には、ＬＨ／ｈＣＧとして挙げられるものは、天然に存在するＬＨ／ｈＣＧ改変体；種々の哺乳動物の種（例えば、ヒト、他の霊長類、ラット、マウス、ヒツジ、ブタ、およびウシが挙げられるが、これらに限定されない）に由来するＬＨ／ｈＣＧ対応物；および以下の表１に列挙される一般的に使用されるアナログである。ＧｎＲＨまたはそのアナログは、ＬＨ／ｈＣＧの代わりに、またはＬＨ／ｈＣＧに加えて使用され得る。
【００７５】
【表１】
同様に、本発明に有用な任意のさらなる組成物または因子としては、ネイティブな化合物または因子と実質的な類似性およびネイティブな化合物または因子の有する少なくとも１つの生物学的活性を共有するアナログおよび改変体が挙げられる。例えば、ＥＧＦは、本発明のＬＨ／ｈＣＧと併せて使用され得る。ネイティブなＥＧＦに加えて、ＥＧＦアナログまたは改変体もまた、使用され得、それは、ネイティブなＥＧＦと実質的なアミノ酸配列類似性、およびネイティブなＥＧＦの有する少なくとも１つの生物学的活性（例えば、ＥＦＧレセプターへの結合）を共有する。特に、ＥＧＦとしては、あらゆる種のネイティブなＥＧＦ、ＴＧＦα、または組換え改変されたＥＧＦが挙げられる。具体的な例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：２つのＣ末端アミノ酸の欠失および５１位において中性アミノ酸の置換を有する組換え改変されたＥＧＦ（特にＥＧＦ５１ｇｌｎ５１；米国特許出願公開第２００２００９８１７８Ａ１号）、１６位のＨｉｓ残基が中性アミノ酸または酸性アミノ酸で置換されているＥＧＦムテイン（ＥＧＦ−Ｘ１６）（米国特許第６，１９１，１０６号）、ネイティブなＥＧＦのアミノ末端残基を欠く、ＥＧＦの５２−アミノ酸欠失変異体（ＥＧＦ−Ｄ）、Ｎ末端残基および２つのＣ末端残基（Ａｒｇ−Ｌｅｕ）が欠失されているＥＧＦ欠失変異体（ＥＧＦ−Ｂ）、２１位のＭｅｔ残基が酸化されているＥＧＦ−Ｄ（ＥＧＦ−Ｃ）、２１位のＭｅｔ残基が酸化されているＥＧＦ−Ｂ（ＥＧＦ−Ａ）、ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、βセルリン、アンフィレグリン、ニューレグリン、または上記のうちのいずれかを含む融合タンパク質。他の有用なＥＧＦのアナログまたは改変体は、米国特許出願公開第２００２００９８１７８Ａ１号、および米国特許第６，１９１，１０６号および同第５，５４７，９３５号に記載される。
【００７６】
別の例として、ＰＡＣＡＰもまた、ＬＨ／ｈＣＧと併せて使用され得る。有用なＰＡＣＡＰのアナログおよび改変体としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＰＡＣＡＰの３８アミノ酸改変体および２７アミノ酸改変体（それぞれ、ＰＡＣＡＰ３８およびＰＡＣＡＰ２７）、ならびに例えば、米国特許第５，１２８，２４２号；同第５，１９８，５４２号；同第５，２０８，３２０号；同第５，３２６，８６０号；同第５，６２３，０５０号；同第５，８０１，１４７号および同第６，２４２，５６３号に開示されるアナログおよび改変体。
【００７７】
エリスロポエチンのアナログおよび改変体は、例えば、米国特許第６，０４８，９７１号および同第５，６１４，１８４号に開示される。
【００７８】
さらに、本発明において有用なＬＨ／ｈＣＧまたはさらなる因子の機能的アゴニストが、本発明において企図される。これらの機能的アゴニストは、そのネイティブな因子のレセプターに結合し、そして、そのネイティブな因子のレセプターを活性化するが、これらの機能的アゴニストは、そのネイティブな因子と実質的な配列類似性を共有する必要はない。例えば、マキサディランは、ＰＡＣＡＰ １型レセプターの特異的アゴニストとして機能するポリペプチドである（Ｍｏｒｏら、１９９７）。
【００７９】
ＥＰＯの機能的アゴニストは、広く研究されている。ＥＭＰ１（ＥＰＯ擬態ペプチド１）は、Ｊｏｈｎｓｏｎら、２０００に記載されるＥＰＯ擬態物のうちの１つである。ＥＰＯの短いペプチド擬態物は、例えば、Ｗｒｉｇｈｔｏｎら、１９９６および米国特許第５，７７３，５６９号に記載される。低分子ＥＰＯ擬態物は、例えば、Ｋａｕｓｈａｎｓｋｙ、２００１に開示される。ＥＰＯレセプターを活性化する抗体は、例えば、米国特許第５，８８５，５７４号；ＷＯ９６／４０２３１およびＷＯ９７／４８７２９に記載される。
【００８０】
ＥＧＦレセプターに対してアゴニスト活性を有する抗体は、例えば、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｐｏｌ、１９８５および米国特許第５，７２３，１１５号に記載される。さらに、ＥＰＯレセプター、ＥＧＦレセプター、プロラクチンレセプターおよび多くの他の細胞表面レセプターについての活性性アミノ酸配列もまた、米国特許第６，３３３，０３１号に開示される；プロラクチンレセプターおよびＥＰＯレセプターに対してアゴニスト活性を有する金属錯体レセプターリガンドは、米国特許第６，４１３，９５２号に見出され得る。レセプター（例えば、ＥＰＯレセプターおよびプロラクチンレセプター）に対するリガンドを同定および調製する他の方法は、例えば、米国特許第５，５０６，１０７号および同第５，８３７，４６０号に記載される。
【００８１】
特定のさらなる因子の一般的に使用されるアナログはまた、以下の表２に見出され得る：
【００８２】
【表２−１】
【００８３】
【表２−２】
【００８４】
各アナログ、改変体または機能的アゴニストの有効量が、ネイティブな因子または化合物についての有効量と異なり得、そして各々の場合における有効量は、本明細書中の開示に従って当業者により決定され得ることに留意すべきである。好ましくは、ネイティブな因子、またはそのネイティブな因子と実質的な配列類似性を共有するアナログおよび改変体が、本発明において使用される。
【００８５】
薬学的組成物もまた提供され、この薬学的組成物は、ＬＨ／ｈＣＧ、上記のようなさらなる因子、ならびに薬学的に受容可能な賦形剤および／またはキャリアを含む。
【００８６】
薬学的組成物は、以下のような当該分野で公知の任意の経路を介して送達され得る：非経口、髄腔内、脈管内、静脈内、筋肉内、経皮、皮内、皮下、鼻腔内、局所的、経口、直腸、経膣、肺または腹腔内。例えば、筋肉内注射が、脳にｈＣＧの機能を及ぼす、ｈＣＧを送達する効果的な経路であることが、実施例６に示される。好ましくは、この組成物は、注射または注入によって中枢神経系に送達される。より好ましくは、この組成物は、脳室、特に、側脳室に送達される。あるいは、この組成物は、好ましくは全身性経路（例えば、皮下投与）によって送達される。例えば、プロラクチン、成長ホルモン、ＩＧＦ−１、ＰＡＣＡＰおよびＥＰＯが、皮下投与により有効に送達されて、脳室下帯における神経幹細胞の数を調節し得ることを発見した。
【００８７】
この組成物が、脳に直接送達されない場合、およびこの組成物中の分子が、血液脳関門を容易に横切らない場合、血液脳関門浸透剤が、脳への進入を容易にするために必要に応じて含まれ得る。血液脳関門浸透剤は、当該分野で公知であり、これらとしては、例として、米国特許第５，６８６，４１６号；同第５，５０６，２０６号および同第５，２６８，１６４号に記載されるブラジキニンおよびブラジキニンアゴニスト（例えば、ＮＨ２−アルギニン−プロリン−ヒドロキシプロキシプロリン−グリシン−チエニルアラニン−セリン−プロリン−４−Ｍｅ−チロシンψ（ＣＨ２ＮＨ）−アルギニン−ＣＯＯＨ）が挙げられる。あるいは、この分子は、米国特許第６，３２９，５０８号；同第６，０１５，５５５号；同第５，８３３，９８８号または同第５，５２７，５２７号に記載されるようなトランスフェリンレセプター抗体に結合体化され得る。この分子はまた、その分子および脳毛細管内皮細胞レセプター（例えば、トランスフェリンレセプター）と反応性のリガンドを含む融合タンパク質として送達され得る（例えば、米国特許第５，９７７，３０７号を参照のこと）。
【００８８】
薬学的組成物は、所望の治療剤と、意図された投与経路に適した適切なビヒクルとを混合することにより調製され得る。本発明の薬学的組成物の作製において、治療剤は、通常、賦形剤と混合されるか、賦形剤により希釈されるか、またはカプセル、小袋、紙または他の容器の形態であり得るようなキャリアの内部に封入される。薬学的に受容可能な賦形剤が、希釈剤として働く場合、これは、固体、半固体、または液体の物質であり得、これらは、治療剤のためのビヒクル、キャリアまたは媒体として作用する。従って、この組成物は、錠剤、丸剤、粉末、ロゼンジ、小袋、カシェ剤、エリキシル、懸濁液、エマルジョン、液剤、シロップ、エアロゾル（固体としてまたは液体媒体中において）、軟膏（例えば、１０重量％までの治療剤を含有する）、軟質および硬質のゼラチンカプセル、坐剤、滅菌注射溶液、ならびに無菌パッケージ化された粉末の形態であり得る。
【００８９】
適切な賦形剤のいくつかの例としては、人工脳脊髄液、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギナート、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、滅菌水、シロップ、およびメチルセルロースが挙げられる。処方物は、さらに以下を含み得る：タルク、ステアリン酸マグネシウム、および鉱油のような滑沢剤；湿潤剤；乳化剤および懸濁剤；ヒドロキシ安息香酸メチルおよびヒドロキシ安息香酸プロピルのような防腐剤；甘味料；ならびに香味料。本発明の組成物は、当該分野で公知の手順を使用することにより、患者への投与後に、治療剤の迅速な放出、持続的放出、または遅延した放出を提供するように処方され得る。
【００９０】
錠剤のような固形組成物を調製するために、治療剤は、薬学的賦形剤と混合されて、本発明の化合物の均一な混合物を含む固体の予備処方された組成物を形成する。これらの予備処方された組成物を均一という場合、これは、その組成物が、同等に有効な単位投薬形態（例えば、錠剤、丸剤およびカプセル）に容易に小分けされ得るように、その組成物全体にわたって一様に治療剤が分散されていることを意味する。
【００９１】
本発明の錠剤または丸剤は、コーティングされ得るか、または他の方法で、長期作用の利点を提供する投薬形態を提供するように調合され得る。例えば、錠剤または丸剤は、内部投薬成分および外部投薬成分を含み得、後者は、前者を包み込む形態をとる。この２つの成分は、腸溶性の層により隔てられ得、この腸溶性の層は、胃における崩壊に抵抗するために役立ち、そして内部成分がインタクトなままで十二指腸に通過するかまたは放出が遅れることを可能にする。種々の材料が、このような腸溶性の層またはコーティングのために使用され得、このような材料としては、多数の高分子酸、および、高分子酸と、シェラック、セチルアルコール、および酢酸セルロースのような物質との混合物が挙げられる。
【００９２】
本発明の新規な組成物が経口投与または注射による投与のために組み込まれ得る液体形態としては、水溶液、適切に香味付けされたシロップ、水性懸濁液または油性懸濁液、および食用油（例えば、トウモロコシ油、綿実油、ゴマ油、ココナッツ油、またはピーナッツ油）を用いた香味付けされたエマルジョン、ならびにエリキシルおよび同様の薬学的ビヒクルが挙げられる。
【００９３】
吸入またはガス注入のための組成物としては、薬学的に受容可能な水性溶媒もしくは有機溶媒またはそれらの混合物中の溶液および懸濁液、ならびに粉末が挙げられる。液体または固体の組成物は、本明細書中に記載されるような適切な薬学的に受容可能な賦形剤を含み得る。この組成物は、局所作用または全身作用のために経口呼吸経路または経鼻により投与される。好ましくは、薬学的に受容可能な溶媒中にある組成物は、不活性ガスの使用により噴霧され得る。噴霧される溶液は、噴霧デバイスから直接吸入され得るか、または噴霧デバイスは、フェースマスクテント（ｆａｃｅ ｍａｓｋ ｔｅｎｔ）もしくは間欠的陽圧呼吸機に取り付けられ得る。溶液、懸濁液または粉末の組成物は、適切な様式で処方物を送達するデバイスから、好ましくは経口的または経鼻的に投与され得る。
【００９４】
本発明の方法において使用される別の処方物は、経皮送達デバイス（「パッチ」）を使用する。このような経皮パッチは、制御された量で本発明の治療剤の連続的または断続的な注入を提供するために使用され得る。薬学的因子の送達のための経皮パッチの構築および使用は、当該分野で周知である。例えば、米国特許第５，０２３，２５２号（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。このようなパッチは、薬学的因子の連続的送達、拍動性送達、または要求に応じた送達のために構築され得る。
【００９５】
本発明における使用のための他の適切な処方物が、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに見出され得る。
【００９６】
以下の実施例は、本発明を例示するために提供され、そしていかなる様式においても、本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【００９７】
下記の実施例において、以下の略語は、以下の意味を有する。定義されていない略語は、その一般に受け入れられている意味を有する。
ＴＵＮＥＬ＝末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介性ｄＵＴＰニック末端標識
℃＝摂氏温度
ｈｒ＝時間
ｍｉｎ＝分間
μＭ＝マイクロモル濃度
ｍＭ＝ミリモル濃度
Ｍ＝モル濃度ミリリットル
μｌ＝マイクロリットル
ｍｇ＝ミリグラム
μｇ＝マイクログラム
ＦＢＳ＝胎仔ウシ血清
ＰＢＳ＝リン酸緩衝化生理食塩水
ＤＭＥＭ＝ダルベッコ改変イーグル培地
ＭＥＭ＝改変イーグル培地
ＥＧＦ＝上皮増殖因子
ＮＳＣ＝神経幹細胞
ＳＶＺ＝脳室下帯
ＰＡＣＡＰ＝脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド
ｃＡＭＰ＝サイクリックＡＭＰ
ＢＭＰ＝骨形態形成タンパク質
ＣＳＦ＝脳脊髄液。
【００９８】
（材料および方法）
（雄の臭気に曝露された雌マウス）
マウス（ＣＤ１、１０週齢）を、２週間の時間経過にわたって、反対の性または同じ性の臭気に対して連続的に曝露した。社会的相互作用の構成要素は、この研究の一部ではなかった。その代わりに、マウスを、反対の性の臭気に対して曝露しただけであった。このことは、そうしない場合に生じる混同を制御するために必要であった。例えば、雄を雌と一緒に置いた場合、その動物に交配する機会を与える。プレーリーハタネズミに対するＦｏｗｌｅｒの研究（２００２）は、妊娠中の雌ハタネズミにおける神経発生の増加を示し、さらにより顕著なことには、Ｓｈｉｎｇｏらの研究（２００３）は、妊娠および交配の両方が、単独で、神経発生の増加を生じ得ることを示した。従って、神経性の影響が見られたとしても、臭気曝露単独によって媒介されたという結論を下すことはできない。
【００９９】
これによって、２週間連続の曝露プロトコルが、この研究を行うために確立され、時間経過の期間は、異なる環境条件におけるニューロンの細胞増殖の変化しやすい性質を明らかにするために選択された。以前の行動研究が１日間から２週間で変動するニューロンの前駆細胞の増加を示した（ＫｅｍｐｅｒｍａｎｎおよびＧａｇｅ、１９９９；Ｆｏｗｌｅｒら、２００２）ので、このことは、ニューロンの前駆細胞増殖の急増が、見落とされないことを確実にした。
【０１００】
簡単に言えば、雄マウスを、２日間、きれいなケージに置いた。次いで、この雄マウスを、雄の臭気化したケージから取り除き、雌マウスを所望の長さの期間、収容した。
【０１０１】
全部で１８匹の雌（ＣＤ−１、１０週齢）マウスを、雄（ＣＤ−１、１０週齢）マウスまたは雌マウスの臭気に対する連続的な曝露を経験させるために、第１に選択した。１８匹のうち３匹を、雄の臭気に対して２日間曝露するために、ランダムに割り当てた。別の３匹を、７日間の雄の臭気曝露条件に加えるために選択し、別の３匹を１４日間の雄の臭気曝露条件に加えるために選択した。同様に、さらなる３匹を、２日間の雌の臭気を経験させるためにランダムに割り当てた。別の３匹を、７日間の雌の臭気曝露条件に加えるために選択し、残りの３匹を、１４日間の雌の臭気曝露条件に置いた。
【０１０２】
従って、最初の工程において、９匹の雄マウスを、２日間、きれいなケージの中に置いた。この雄が２日間、このケージを臭気化した後、その雄を新しいきれいなケージに移動させた。次いで、雌を、反対の性の臭気を経験させるために、２日間、雄に臭気化されたケージに移動させた。２日間の曝露に割り当てられた雌に関して、時間経過は完了した；しかし、７日間および１４日間の曝露に割り当てられた雌はこの手順を繰返し、実質的に、この時間経過を完全に満たすために、同じ雄によって臭気化された新たに臭気化されたケージに移動された。
【０１０３】
この時間経過にわたって反対の性の臭気に雌を曝露することが、神経発生に対する効果を有し得るか否かを比較するために、上記で選択した残りの９匹の雌マウスをまた、上記に要点を述べたようなものと同じ概要の下で、連続的な性の臭気（しかし同じ性の臭気）に経験させた。
【０１０４】
群の時間経過の最終日に、ＢｒｄＵ注射をマウスに与えて、ＳＶＺにおける増殖性細胞を標識した。さらに、免疫組織化学分析を行った。以下に概要を述べる。
【０１０５】
（免疫組織化学）
処置後のＳＶＺにおける前駆細胞の数を調べるために、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）注射を使用して、それらの細胞を標識した。動物は、２時間ごとに１０時間、ＢｒｄＵ注射（１２０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内、リン酸緩衝液中の０．００７％ＮａＯＨに溶解した）を受けた。ＢｒｄＵの各注射は、Ｓ期における増殖性細胞を標識のみし、一連のＢｒｄＵ注射をする目的は、全取り込みの間のＢｒｄＵの持続的な利用可能性を保証するためである（Ｍｏｒｓｈｅａｄおよびｖａｎ ｄｅｒ Ｋｏｏｙ、１９９２）。
【０１０６】
この動物を麻酔薬の過剰投与によって屠殺し、ＰＢＳ中、ｐＨ７．２の４％パラホルムアルデヒドで心臓灌流した。脳を、４℃にて一晩、同じパラホルムアルデヒド溶液で後固定し、ＰＢＳ中の２０％スクロース中で２４時間凍結保護した。次いで、この脳を、１４μｍに凍結切片化する前に、Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅｋ Ｏ．Ｃ．Ｔ化合物（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｃｋ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）に包埋した。
【０１０７】
染色するために使用した抗体は、ラット抗ＢｒｄＵおよびモルモット抗ＤＣＸであった。
【０１０８】
この切片を、室温にて３０秒間アセトンで後固定した後、ＰＢＳで洗浄した。ＢｒｄＵ染色のために、この組織を、６０℃にて２２分間１Ｍ ＨＣｌで処理して、細胞のＤＮＡを変性させた。次いで、切片を、１０％ＮＧＳを含む０．３％ＰＢＳ−Ｔにおいて希釈した一次抗体（ラット抗ＢｒｄＵ、１：５０）中で室温にて２４時間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、次いで、ビオチン（１：２００）に結合体化されたヤギ抗ラット二次抗体とともに、室温にて１時間インキュベートした。ｄｄＨ２Ｏでリンスした後、染色をＣＹ３−Ｓｔｒｅｐｔａｖｏｄｉｎで可視化して、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｈｏｔ蛍光顕微鏡で観察するために、切片をＦｌｕｏｒｏｓａｖｅとともにマウントした。
【０１０９】
ＤＣＸ染色のために、切片を、１０％ＮＧＳを含む０．３％ＰＢＳ−Ｔにおいて希釈した一次抗体（ヤギ抗−ＤＣＸ、１：５００）中で室温にて２４時間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、次いで、ロバ抗ヤギビオチン二次抗体とともに、室温にて１時間インキュベートした。リンスした後、増幅手順をＰＢＳでスライドガラスを洗浄し、そしてそれらをＣＹ３−ＳｔｒｅｐｔａｖｏｄｉｎおよびＨｏｅｃｈｓｔとともに、室温にて１時間インキュベートすることによって行った。ｄｄＨ２Ｏでリンスした後、切片をＦｌｕｏｒｏｓａｖｅとともにマウントして、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｈｏｔで観察した。
【０１１０】
（免疫組織化学結果の定量化）
ＳＶＺにおけるＢｒｄＵ：側脳室の吻側の先端部からその脳室の最も尾側の面まで冠状断（１４μｍ）の連続した１０枚のうちの１枚を集めた（合計１０個の切片）。次いで、ＢｒｄＵ陽性細胞を、規定される上衣−上衣下層を中で数えた。
【０１１１】
ＳＶＺの背の端におけるＤＣＸ：側脳室の吻側の先端部からその脳室の９８０μｍ尾側までの冠状断（１４μｍ）の連続した１０枚のうちの１枚を（合計１０個の切片）実施した。次いで、ＤＣＸ陽性細胞を、背の端で数えた。
【０１１２】
（雌マウスの臭気に曝露された雄マウス）
反対の性の臭気が、雄マウスの何らかの効果を有するか否かを見るために、同じ方法論を、雌マウスの臭気に対して雄マウスを連続的に曝露するために用いた。同一の時間経過（２日間、７日間および１４日間の雌マウスに対する臭気曝露）、ならびに比較のために２日間、７日間および１４日間の雄マウスに対する臭気曝露を用いた。免疫組織化学および定量化の構成物質はまた、雌について計画したものと同一であった。
【０１１３】
（神経幹細胞培養および増殖因子）
胎児および成体の前脳からのスフィアの発生および分化を、少しの改変を用いて以前に記載したように行った（ＲｅｙｎｏｌｄｓおよびＷｅｉｓｓ、１９９２；Ｒｅｙｎｏｌｄｓら、１９９２）。簡単に言えば、線条体−淡蒼球複合体を、Ｅ１４におけるマウスの胚から取り除き、０．６％グルコース、ペニシリン（５０Ｕ／ｍｌ）、およびストレプトマイシン（５０Ｕ／ｍｌ；両方、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤから提供された）を含むＰＢＳの中に回収し、次いで、ＤＭＥＭ−Ｆ−１２（１：１）、グルコース（０．６％）、グルタミン（２ｍＭ）、重炭酸ナトリウム（３ｍＭ）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（５ｍＭ）、インスリン（２５μｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（１００μｇ／ｍｌ）、プロゲステロン（２０ｎＭ）、プトレシン（６０μＭ）、および塩化セレン（３０ｎＭ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから提供されるグルタミンを除いて、全てＳｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから提供された）からなる標準的な培地の中に移した。成体の神経幹細胞培養のために、成体の脳からの側脳室上衣下の内側および外側部分を、両方の半球から切り出し、一緒にプールし、続いて、１ｍｍ２断片に切断し、１．３３ｍｇ／ｍｌトリプシン、０．６７ｍｇ／ｍｌヒアルロニダーゼ、および０．２ｍｇ／ｍｌキヌレン酸（全てＳｉｇｍａから提供された）を含む標準的な培地の中に移した。３７℃にて３０分後、この組織を、０．７ｍｇ／ｍｌトリプシンインヒビター（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｌａｖａｌ、Ｑｕｅｂｅｃ、Ｃａｎａｄａ）を含む標準的な培地に移した。組織片をマイクロピペットで機械的に解離した。細胞を標準的な培地（ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌヒト組換え体；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ、ＮＪも含んだ）の中に種々の密度で接種した。細胞を７日間インビトロ（ＤＩＶ）で培養し、浮遊性の細胞集団（スフィア）を形成させた。培養実験のための全てのマウスを、頚椎脱臼によって屠殺した。
【０１１４】
（浸透圧ポンプの移植および増殖因子注入）
１６匹の８週齢ＣＤ−１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ−Ｒｉｖｅｒ、Ｌａｖａｌ、Ｑｕｅｂｅｃ、Ｃａｎａｄａ）を、ペントバルビタールナトリウム（１２０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）で麻酔し、浸透圧ポンプ（Ａｌｚｅｔ １００７Ｄ；Ａｌｚａ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）を移植した。カニューレを右側脳室に配置した（ブレグマに対して前後＋０．２ｍｍ、外側＋０．８ｍｍおよびラムダとブレグマとの間の同じ高さにした頭蓋骨の硬膜より下の背腹方向２．５ｍｍ）。ＬＨ（下垂体由来のヒトＬＨ３３μｇ／ｍｌ；Ｎａｔｉｏｎａｌ ｈｏｒｍｏｎｅ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｐｒｏｇｒａｍ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を、１ｍｇ／ｍｌマウス血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）を含む０．９％生理食塩水に溶解した。各動物に、０．５μｌ／時間の流速でビヒクル単独またはＬＨのいずれかを６日間注入し、４００ｎｇ／日のＬＨの送達を得た。
【０１１５】
（ＴＵＮＥＬアッセイ）
ＴＵＮＥＬ標識化を、凍結組織に対する使用のための製造業者の指示書に従って、ＲＯＣＨＥ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｋｉｔ（カタログ番号６８４７９５）を用いて行った。
【０１１６】
（実施例１）
（反対の性の臭気は増殖を刺激する）
雄の臭気または雌の臭気の影響を測定するために、成体のマウスを、２日間、７日間または１４日間、反対の性の臭気に曝露した。コントロール群を、同じ期間、同じ性の臭気に曝露した。次いで、このマウスにＢｒｄＵを与えて、増殖性細胞を標識し、ＢｒｄＵ陽性細胞の位置を免疫組織化学研究によって同定した。雌マウスまたは雄マウスをまた、７日間（雌）または２日間（雄）、並行する実験においてコントロールの臭気化されていないケージに曝露した。これらの動物は、同じ性の臭気に曝露された動物とは異ならない（データは示していない）。
【０１１７】
図１Ａに示すように、雌マウスのＳＶＺにおける増殖性細胞は、２日間、７日間または１４日間、雌の臭気に曝露された後、同じレベルのままであった。しかし、雄の臭気に曝露された雌の群において、ＳＶＺにおける増殖性細胞は、時間とともに変化した：７日後に顕著に増加し、１４日後に顕著に減少した。２日間の曝露は、顕著な効果を示さなかった。Ｋｉ６７を、増殖性細胞を標識するために使用した場合、同じパターンを観察した（図１Ｂ）。このことは、ＢｒｄＵ陽性細胞の変化が、ＢｒｄＵの優先的な取り込みよりむしろ、増殖レベルの変化を反映したことを示した。
【０１１８】
上記の実験に使用される雄マウスおよび雌マウスは、同腹子または以前に一緒に出荷されたマウスから得た。従って、これらのマウスは、実験を行う前に、互いの臭気に曝露されていた。この影響が、同腹子または目的の臭気に予め曝露されていた動物に特異的である可能性を除外するために、以前に同じ場所に存在しなかった、同腹子由来のマウスを使用して、実験を繰り返した。マウスが同腹子であろうと同腹子でなかろうと、同様の効果を観察した（図１Ｃ）。このことは、雄の臭気の効果が、特定の同腹子または予め曝露された臭気に制限されないことを示した。
【０１１９】
雌の臭気もまた、雄マウスの脳における増殖に影響を与えたが、この影響は異なる時間的パターンであった。雄を２日間、雌の臭気に曝露した場合、ＢｒｄＵ陽性細胞（図２Ａ）またはＫｉ６７陽性細胞（図２Ｂ）の数が突然増加した。しかし、７日間または１４日間の曝露の後、新たに増殖した細胞の数が、コントロールレベルまで減少した。雌マウスと同様に、異なる同腹子を使用した場合、雌の臭気の効果が、観察され得た（図２Ｃ）。
【０１２０】
著しいことに、海馬における神経幹細胞はまた、性に特異的な臭気に応答した。再び、２日間の雄の臭気に対する曝露は、雌マウスに対して顕著な効果を示さなかったが、７日間の曝露は、海馬における増殖の顕著な増加を生じた（図３）。１４日間の曝露の後、増殖性細胞のレベルは、雌の臭気に曝露された雌と比較した場合、雄の臭気に曝露された雌において顕著に低下した。本発明者らの見解によれば、成長因子（例えば、ＥＧＦさらにＦＧＦ）以外の任意の刺激物が、ＳＶＺおよび海馬における神経幹細胞に同様の効果を与えることを示すのは、これが、初めてである。
【０１２１】
さらなるコントロールとして、雌マウスを７日間、去勢した雄マウスの臭気に曝露した。この結果は、これらの雌において、偽の雄の臭気に曝露された雌と比較した場合、ＳＶＺまたは海馬のいずれかにおけるＢｒｄＵ標識された細胞の数が、増加しなかったことを示す。偽の雄の臭気は、偽の去勢手術を受けた雄マウスによって臭気化された、臭気化されたケージである。これらの偽の去勢された雄の臭気に曝露された雌は、性フェロモン誘発神経発生を示したが、去勢された雄の臭気に曝露された雌は、神経発生の増加を示さなかった。同様に、２日間、副腎摘出された雌の臭気に曝露された雄マウスもまた、偽の雌の臭気に曝露された雄と比較した場合、ＳＶＺまたは海馬においてＢｒｄＵ標識された細胞の数の増加を示さなかった。去勢および副腎摘出が、フェロモンレベルを減少させることは、公知である（Ｍａら、１９９８；Ｋｉｙｏｋａｗａら、２００４；Ｚｈａｎｇ Ｊら（２００１））。従って、これらの結果は、フェロモンが、反対の性のＳＶＺおよび海馬の両方において神経幹細胞増殖を誘発するという観察をさらに支持する。
【０１２２】
（実施例２）
（反対の性の臭気は神経発生を刺激するが、細胞生存を刺激しない）
神経発生はまた、反対の性の臭気への曝露に対して増強した。従って、実施例１からの組織切片を、ダブルコルチン（ニューロンの前駆細胞において発現される細胞質タンパク質）に対して染色し、上記のマウスにおける神経発生の程度を測定した。増殖性細胞の場合のように、雌マウスは、雄の臭気に対する７日間の曝露後、有意により多くのダブルコルチン陽性細胞を有した（図４）が、雄マウスは、雌の臭気に対する２日間の曝露後、有意により多くのダブルコルチン陽性細胞を有した（図５）。
【０１２３】
反対の性からのフェロモンがまた、神経細胞の生存に影響を与えるか否かを測定するために、ＴＵＮＥＬアッセイを行った。この結果は、雄の臭気に対する７日間の曝露後、雌マウスのＳＶＺ（図６Ａ）または嗅球（図６Ｂ）において有意な差が観察され得なかったことを示す。
【０１２４】
（実施例３）
（インビボおよびインビトロでのＬＨの効果）
雄のフェロモンは、黄体化ホルモン（ＬＨ）のレベルを増加させ、プロラクチンのレベルを減少させるが、一方、雌のフェロモンは、プロラクチンの増加に関連することが、公知である（Ｄｕｌａｃら、２００３）。フェロモンが、反対の性において神経幹細胞増殖および神経発生を増強する方法を調べるための試みにおいて、材料および方法に記載したように、動物にＬＨを注入した。実際に、ＬＨは、雌マウス（図７Ａおよび７Ｂ）および雄マウス（図８）の両方のＳＶＺにおいて増殖を有意に増加させる。
【０１２５】
ＬＨが、神経幹細胞の増殖を刺激することを確認するために、材料および方法に記載したように神経幹細胞培養物を確立した。一次スフィアを解離し、限定した密度でＥＧＦまたはＥＧＦとさらにＬＨ（３０ｎＭ）の存在下においてプレートして、二次スフィアを形成させた。二次スフィアの数を数えた。その結果を以下に示す：
【０１２６】
【表３】
【０１２７】
【表４】
【０１２８】
従って、ＬＨはまた、培養物において神経幹細胞の自己複製を増加させ得、これは、雄マウスから単離された神経幹細胞より、雌マウスから単離された神経幹細胞に対してより効果的である。
【０１２９】
（実施例４）
（インビボおよびインビトロでのｈＣＧの効果）
ＨＣＧは、ＬＨと同じ活性を有する。材料および方法に記載したプロトコルに従って、組換えｈＣＧ（絨毛性ゴナドトロピンα；Ｏｖｉｄｒｅｌ（登録商標）／Ｏｖｉｔｒｅｌｌｅ（登録商標）１）またはビヒクル単独をマウスに注入した場合、ｈＣＧが、雄マウスおよび雌マウスの両方のＳＶＺにおいて増殖を顕著に増加させることが発見される。海馬における増殖性細胞もまた、両方の性において顕著に増加する。
【０１３０】
神経発生をまた、ニューロンマーカー、ダブルコルチンまたはＮｅｕＮを用いて評価する。ＳＶＺまたは嗅球におけるダブルコルチンまたはＮｅｕＮ陽性細胞の数は、ｈＣＧを注入されたマウスにおいて顕著により高い。
【０１３１】
ｈＣＧが神経幹細胞の増殖を刺激することを確認するために、神経幹細胞培養物が、材料および方法に記載されたように確立される。一次スフィアを解離し、限定した密度でＥＧＦまたはＥＧＦとさらに絨毛性ゴナドトロピンαの存在下においてプレートして、二次抗体を形成させる。次いで、二次抗体の数を数え、その結果は、神経幹細胞が、雄の動物由来であろうとまたは雌の動物由来であろうと、ｈＣＧが二次スフィアの数を顕著に増加させることを示す。
【０１３２】
（実施例５）
（さらなる因子の効果）
さらなる因子であるプロラクチンは、実施例３または４に記載した実験に含まれる。従って、マウスに以下を注入する：
（１）ＬＨとプロラクチンとの組み合わせまたはｈＣＧとプロラクチンとの組み合わせ；
（２）ＬＨまたはｈＣＧ；あるいは
（３）ビヒクル単独（コントロール）。
【０１３３】
この結果は、ＬＨまたはｈＣＧは、コントロール群と比較して、ＳＶＺにおける増殖を増加させるが、プロラクチンの添加は、ＬＨまたはｈＣＧの効果をさらに増強させることを示す。同様に、プロラクチンが神経幹細胞培養においてＬＨまたはｈＣＧとともに添加される場合、自己複製（一次スフィア由来の二次スフィアの数）は増強する。
【０１３４】
同様に、Ｅｐｏ（ＮｅｏＲｅｃｏｒｍｏｎ）をＬＨまたはｈＣＧとともに含めて、神経発生に対するこの効果を測定した。この結果は、ＬＨまたはｈＣＧ単独によって達成されるレベルよりもＥｐｏがダブルコルチン陽性細胞の数を増強させることを示す。
【０１３５】
上記の実施例は特定の因子を用いるが、表１に列挙した化合物を含む、ＬＨ／ｈＣＧのあらゆるアナログまたは改変体が、ＬＨまたはｈＣＧとして使用され得ることは、留意されるべきである。同様に、表２に列挙した因子を含む、神経発生を増強させ得るあらゆるさらなる因子およびそれらのアナログ／改変体は、ＮｅｏＲｅｃｏｒｍｏｎの代わりに実施例５に使用され得る。グリア細胞形成は、本明細書中に記載される方法および当該分野で利用可能な知識を使用して実施され得る。
【０１３６】
（実施例６）
（ｈＣＧの筋肉内送達）
ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）および黄体化ホルモン（ＬＨ）は、ヒトの使用のために市販されている薬物であり、それぞれＰｒｅｇｎｙｌおよびＰｒｏｆａｓｉとして市場で売買されている。これらの薬物の各々についての最大安全量は、筋肉内注射によって１日あたり１０，０００ＵＳＰユニットである。これは、３０ｇのマウスに対する約５．０ＵＳＰユニットの用量に相当する。この用量が、マウスにおける前脳の神経発生を誘発するのに十分であるか否かを試験するために、本発明者らは、以下の実験を行った。
【０１３７】
６〜８週齢の雌ＣＤ−１マウスに、０．０５ｍｌ容積（生理食塩水で希釈した）中の５．０ＵＳＰ単位の組換えｈＣＧ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｃ ６３２２）の単回の筋肉内注射を与えた。コントロールマウスに生理食塩水単独の単回注射を与えた。次いで、このマウスに、ｈＣＧ注射後２時間を初めとして、２時間ごとに１回、ＢｒｄＵ（１２０ｍｇ／ｋｇ）の６回の注射を与えた。このマウスを、最後のＢｒｄＵ注射の３０分後に屠殺し、４％パラホルムアルデドで心臓灌流し、この組織を凍結切片化のために処理した。脳を、各７枚のスライドガラスの２つのセットの上（各スライドガラスの上に１２切片）に１４ミクロンで連続的に切り出した。ＢｒｄＵ陽性細胞の数を、コントロール動物およびｈＣＧ注射された動物の各々について１枚のスライドガラス上で前脳のＳＶＺにおいて数えた。以下のデータは、それぞれ、コントロールマウス（生理食塩水のみ）およびｈＣＧ注射されたマウスにおける切片あたりのＢｒｄＵ＋細胞の平均数である。
【０１３８】
生理食塩水：１６３±６（ｎ＝４）
ｈＣＧ：２０６±１３（ｎ＝４；＊Ｐ＜０．０２；対応のない ｔ−検定）
従って、単一の低い用量のｈＣＧ注射は、前脳のＳＶＺの増殖を２６％まで増加させた。
【０１３９】
（実施例７）
（ＬＨレセプターノックアウトマウス実験）
ＬＨレセプターが、ＳＶＺおよび海馬における神経幹細胞に対するＬＨの効果を直接媒介するか否かを調べるために、本発明者らは、免疫組織化学分析を用いて、両方の領域におけるＬＨレセプターのレベルを測定した。この結果は、ＬＨレセプターが、雄マウスおよび雌マウスのＳＶＺおよび海馬の両方において見出され得るが、雄は、雌と比較して、より低いレベルのＬＨレセプターを有することを示す。従って、ＬＨはおそらく、ＳＶＺおよび海馬においてそのレセプターに直接的に結合して、本明細書中に記載される生物学的機能を誘発する。
【０１４０】
ＬＨの役割をさらに調べるために、ＬＨレセプター（ＬＨＲ）ノックアウト（ＫＯ）マウスを、実施例１に記載したような臭気曝露実験において使用した。このマウスは、以前に、Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｐ．ら、２００１およびＨｕｈｔａｎｉｅｍｉら、２００２に記載されている。８〜１０週齢の成体ＬＨＲ野生型（ＷＴ）およびＫＯマウスを、２日間または７日間、反対の性の臭気に曝露した。曝露の２日目（雌の臭気に曝露された雄）および７日目（雄の臭気に曝露された雌）に、この動物に、２時間ごとに１回、ＢｒｄＵ（１２０ｍｇ／ｋｇ）の６回の注射を与えた。次いで、最後の注射の約３０分後に、このマウスを屠殺し、４％パラホルムアルデヒドで心臓灌流し、この組織を凍結切片化のために処理した。マウスの前脳を、各スライドガラスの上に１０枚の切片で、７枚のスライドガラスの上に１４ミクロンで連続的に凍結切片化した。次いで、各動物からの単一のスライドガラスをＢｒｄＵに対して免疫染色し、ＳＶＺにおけるＢｒｄＵ陽性細胞の総数を定量化した。臭気化されていないケージに曝露されたマウスを、ベースラインコントロールとして使用した。
【０１４１】
この結果を図９および図１０に示す。予想したように、雄の臭気は、雌の野生型マウス（＋／＋）のＳＶＺおよび海馬の両方において増殖の増加を生じた（図９Ａおよび９Ｂ）。しかし、ＬＨＲノックアウトマウス（−／−）において、増殖の増加は、雄の臭気に対する曝露後、海馬において観察されなかった（図９Ｂ）。これらの結果は、ＬＨレセプターシグナル伝達が、雌のマウスの海馬において雄のフェロモンの効果のために重要であることを示す。興味深いことに、ＬＨレセプターの欠失は、雄のフェロモンに応答するＳＶＺにおいて増殖に影響を与えなかった（図９Ａ）。同様に、雄のマウスにおいて、ＬＨレセプターノックアウトは、ＳＶＺまたは海馬のいずれにおいても雌性フェロモン誘発増殖に対して影響を示さなかった（図１０）。従って、ＬＨは、雌および雄の両方のＳＶＺおよび海馬において神経幹細胞増殖を誘発するのに十分であるが、ＳＶＺおよび雄の海馬において、やはりフェロモンの作用を媒介し得る因子（単数または複数）が存在する。
【図面の簡単な説明】
【０１４２】
【図１Ａ】図１Ａは、２日、７日または１４日の曝露後の雌マウスのＳＶＺにおける神経幹細胞の増殖に対する雄の臭気の効果を示す。２Ｄ、７Ｄおよび１４Ｄは、それぞれ、２日、７日および１４日の曝露を示す。Ｆ−Ｍ、雄の臭気に曝露された雌マウス；Ｆ−Ｆ、雌の臭気に曝露された雌マウス。生のデータは、各パネルの一番上に示される。図１Ａは、ＳＶＺにおけるＢｒｄＵ陽性細胞の数に対する効果を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、２日、７日または１４日の曝露後の雌マウスのＳＶＺにおける神経幹細胞の増殖に対する雄の臭気の効果を示す。２Ｄ、７Ｄおよび１４Ｄは、それぞれ、２日、７日および１４日の曝露を示す。Ｆ−Ｍ、雄の臭気に曝露された雌マウス；Ｆ−Ｆ、雌の臭気に曝露された雌マウス。生のデータは、各パネルの一番上に示される。図１Ｂは、ＳＶＺにおけるＫｉ６７陽性細胞の数に対する効果を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、２日、７日または１４日の曝露後の雌マウスのＳＶＺにおける神経幹細胞の増殖に対する雄の臭気の効果を示す。２Ｄ、７Ｄおよび１４Ｄは、それぞれ、２日、７日および１４日の曝露を示す。Ｆ−Ｍ、雄の臭気に曝露された雌マウス；Ｆ−Ｆ、雌の臭気に曝露された雌マウス。生のデータは、各パネルの一番上に示される。図１Ｃは、同腹子と非同腹子との比較を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、２日、７日または１４日の曝露後の雄マウスのＳＶＺにおける神経幹細胞の増殖に対する雌の臭気の効果を示す。２Ｄ、７Ｄおよび１４Ｄは、それぞれ、２日、７日および１４日の曝露を示す。Ｍ−Ｆ、雌の臭気に曝露された雄マウス；Ｍ−Ｍ、雄の臭気に曝露された雄マウス。生のデータは、各パネルの一番上に示される。図２Ａは、ＳＶＺにおけるＢｒｄＵ陽性細胞の数に対する効果を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、２日、７日または１４日の曝露後の雄マウスのＳＶＺにおける神経幹細胞の増殖に対する雌の臭気の効果を示す。２Ｄ、７Ｄおよび１４Ｄは、それぞれ、２日、７日および１４日の曝露を示す。Ｍ−Ｆ、雌の臭気に曝露された雄マウス；Ｍ−Ｍ、雄の臭気に曝露された雄マウス。生のデータは、各パネルの一番上に示される。図２Ｂは、ＳＶＺにおけるＫｉ６７陽性細胞の数に対する効果を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、２日、７日または１４日の曝露後の雄マウスのＳＶＺにおける神経幹細胞の増殖に対する雌の臭気の効果を示す。２Ｄ、７Ｄおよび１４Ｄは、それぞれ、２日、７日および１４日の曝露を示す。Ｍ−Ｆ、雌の臭気に曝露された雄マウス；Ｍ−Ｍ、雄の臭気に曝露された雄マウス。生のデータは、各パネルの一番上に示される。図２Ｃは、同腹子と非同腹子との比較を示す。
【図３】図３は、２日、７日または１４日の曝露後の雌マウスの海馬における神経幹細胞の増殖に対する雄の臭気の効果を示す。２Ｄ、７Ｄおよび１４Ｄは、それぞれ、２日、７日および１４日の曝露を示す。Ｆ−Ｍ、雄の臭気に曝露された雌マウス；Ｆ−Ｆ、雌の臭気に曝露された雌マウス。生のデータは、各パネルの一番上に示される。
【図４】図４は、２日、７日または１４日の曝露後の雌マウスにおける神経発生に対する雄の臭気の効果を示す。２Ｄ、７Ｄおよび１４Ｄは、それぞれ、２日、７日および１４日の曝露を示す。Ｆ−Ｍ、雄の臭気に曝露された雌マウス；Ｆ−Ｆ、雌の臭気に曝露された雌マウス。ＤＣＸ、ダブルコルチン。生のデータは、各パネルの一番上に示される。
【図５】図５は、２日、７日または１４日の曝露後の雄マウスにおける神経発生に対する雌の臭気の効果を示す。２Ｄ、７Ｄおよび１４Ｄは、それぞれ、２日、７日および１４日の曝露を示す。Ｍ−Ｆ、雌の臭気に曝露された雄マウス；Ｍ−Ｍ、雄の臭気に曝露された雄マウス。ＤＣＸ、ダブルコルチン。生のデータは、各パネルの一番上に示される。
【図６】図６は、ＴＵＮＥＬ（末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介性ｄＵＴＰニック末端標識）アッセイを示す。雌マウスは、７日間、雄の臭気に曝露された（Ｆ−Ｍ）か、または雌の臭気に曝露され（Ｆ−Ｆ）、プログラム細胞細胞死を受けた細胞の数は、ＴＵＮＥＬアッセイによって測定された。（Ａ）および（Ｂ）は、それぞれ、ＳＶＺおよび嗅球におけるアポトーシスの細胞数を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、雌マウスのＳＶＺにおけるＢｒｄＵ陽性細胞の数に対するＬＨの効果を示す。図７Ａは、ＬＨの注入２日後のＬＨの効果を示す。ＶＥＨ、ビヒクル。
【図７Ｂ】図７Ｂは、雌マウスのＳＶＺにおけるＢｒｄＵ陽性細胞の数に対するＬＨの効果を示す。図７Ｂは、ＬＨの注入６日後のＬＨの効果を示す。ＶＥＨ、ビヒクル。
【図８】図８は、ＬＨの注入２日後の雄マウスのＳＶＺにおけるＢｒｄＵ陽性細胞の数に対するＬＨの効果を示す。ＶＥＨ、ビヒクル。
【図９】図９は、雌マウスにおけるフェロモン誘発神経幹細胞増殖におけるＬＨレセプターの効果を示す。（Ａ）および（Ｂ）は、それぞれ、ＳＶＺ（Ａ）および海馬（Ｂ）におけるＬＨレセプターノックアウトの効果を示す。（−／−）：ＬＨレセプターノックアウト。（＋／＋）：野生型。ベースライン：臭気化されていないケージに曝露されたマウス。雌−雌：雌の臭気に曝露された雌マウス。雌−雄：雄の臭気に曝露された雌マウス。Ｐ＊＜０．０５；ＬＳＤ事後検定（ｐｏｓｔｈｏｃ ｔｅｓｔ）。
【図１０】図１０は、雄マウスにおけるフェロモン誘発神経幹細胞増殖におけるＬＨレセプターの効果を示す。（Ａ）および（Ｂ）は、それぞれ、ＳＶＺ（Ａ）および海馬（Ｂ）におけるＬＨレセプターノックアウトの効果を示す。（−／−）：ＬＨレセプターノックアウト。（＋／＋）：野生型。ベースライン：臭気化されていないケージに曝露されたマウス。雄−雌：雌の臭気に曝露された雄マウス。雄−雌：雌の臭気に曝露された雄マウス。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物において神経幹細胞を増加させる方法であって、該方法は、有効量の黄体化ホルモン（ＬＨ）またはヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を、該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２】
前記哺乳動物が、成体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記神経幹細胞が、脳室下帯に位置する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記神経幹細胞が、海馬に位置する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＬＨまたはｈＣＧが、全身に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＬＨまたはｈＣＧが、前記哺乳動物の脳に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
さらなる因子が前記哺乳動物に投与される請求項１に記載の方法であって、該さらなる因子は、ＦＳＨ、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、プロラクチン、プロラクチン放出ペプチド（ＰＲＰ）、サイクリックＡＭＰ、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスホーミング増殖因子α（ＴＧＦα）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、エストロゲン、成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、インスリン様成長因子、白血病抑制因子、および／または毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）からなる群より選択される、方法。
【請求項８】
前記哺乳動物が、神経変性疾患に罹患する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記神経幹細胞が、前記哺乳動物に移植される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
哺乳動物において神経発生を増強する方法であって、該方法は、有効量の黄体化ホルモン（ＬＨ）またはヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を、該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１１】
前記哺乳動物が、成体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記神経発生が、脳室下帯において生じる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記神経発生が、海馬において生じる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＬＨまたはｈＣＧが、全身に投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＬＨまたはｈＣＧが、前記哺乳動物の脳に投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
さらなる因子が、前記哺乳動物に投与される、請求項１０に記載の方法であって、該さらなる因子は、ＦＳＨ、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、プロラクチン、プロラクチン放出ペプチド（ＰＲＰ）、サイクリックＡＭＰ、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）、セロトニン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスホーミング増殖因子α（ＴＧＦα）、トランスホーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、エストロゲン、成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、インスリン様成長因子、白血病抑制因子、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、および／またはソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）からなる群より選択される、方法。
【請求項１７】
前記哺乳動物が、神経変性疾患に罹患する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
インビトロでの神経幹細胞の数を増加させる方法であって、該方法は、少なくとも１つの神経幹細胞と、有効量の黄体化ホルモン（ＬＨ）またはヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）とを接触させる工程を包含する、方法。
【請求項１９】
前記神経幹細胞が、成体の哺乳動物に由来する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記神経幹細胞が、哺乳動物の脳室下帯に由来する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記神経幹細胞が、哺乳動物の海馬に由来する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
インビトロでの神経発生を増強する方法であって、該方法は、少なくとも１つの神経幹細胞と、有効量の黄体化ホルモン（ＬＨ）またはヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）とを接触させる工程を包含する、方法。
【請求項２３】
前記神経幹細胞が、成体の哺乳動物に由来する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記神経幹細胞が、哺乳動物の脳室下帯に由来する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記神経幹細胞が、哺乳動物の海馬に由来する、請求項２２に記載の方法。
【請求項１】
哺乳動物において神経幹細胞を増加させる方法であって、該方法は、有効量の黄体化ホルモン（ＬＨ）またはヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を、該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２】
前記哺乳動物が、成体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記神経幹細胞が、脳室下帯に位置する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記神経幹細胞が、海馬に位置する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＬＨまたはｈＣＧが、全身に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＬＨまたはｈＣＧが、前記哺乳動物の脳に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
さらなる因子が前記哺乳動物に投与される請求項１に記載の方法であって、該さらなる因子は、ＦＳＨ、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、プロラクチン、プロラクチン放出ペプチド（ＰＲＰ）、サイクリックＡＭＰ、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスホーミング増殖因子α（ＴＧＦα）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、エストロゲン、成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、インスリン様成長因子、白血病抑制因子、および／または毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）からなる群より選択される、方法。
【請求項８】
前記哺乳動物が、神経変性疾患に罹患する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記神経幹細胞が、前記哺乳動物に移植される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
哺乳動物において神経発生を増強する方法であって、該方法は、有効量の黄体化ホルモン（ＬＨ）またはヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を、該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１１】
前記哺乳動物が、成体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記神経発生が、脳室下帯において生じる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記神経発生が、海馬において生じる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＬＨまたはｈＣＧが、全身に投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＬＨまたはｈＣＧが、前記哺乳動物の脳に投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
さらなる因子が、前記哺乳動物に投与される、請求項１０に記載の方法であって、該さらなる因子は、ＦＳＨ、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、プロラクチン、プロラクチン放出ペプチド（ＰＲＰ）、サイクリックＡＭＰ、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）、セロトニン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスホーミング増殖因子α（ＴＧＦα）、トランスホーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、エストロゲン、成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、インスリン様成長因子、白血病抑制因子、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、および／またはソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）からなる群より選択される、方法。
【請求項１７】
前記哺乳動物が、神経変性疾患に罹患する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
インビトロでの神経幹細胞の数を増加させる方法であって、該方法は、少なくとも１つの神経幹細胞と、有効量の黄体化ホルモン（ＬＨ）またはヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）とを接触させる工程を包含する、方法。
【請求項１９】
前記神経幹細胞が、成体の哺乳動物に由来する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記神経幹細胞が、哺乳動物の脳室下帯に由来する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記神経幹細胞が、哺乳動物の海馬に由来する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
インビトロでの神経発生を増強する方法であって、該方法は、少なくとも１つの神経幹細胞と、有効量の黄体化ホルモン（ＬＨ）またはヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）とを接触させる工程を包含する、方法。
【請求項２３】
前記神経幹細胞が、成体の哺乳動物に由来する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記神経幹細胞が、哺乳動物の脳室下帯に由来する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記神経幹細胞が、哺乳動物の海馬に由来する、請求項２２に記載の方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２００７−５２２１５３（Ｐ２００７−５２２１５３Ａ）
【公表日】平成１９年８月９日（２００７．８．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５５２４３８（Ｐ２００６−５５２４３８）
【出願日】平成１７年２月１４日（２００５．２．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００５／０００１８４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０７７４０４
【国際公開日】平成１７年８月２５日（２００５．８．２５）
【出願人】（５０６２７４７８５）ステム セル セラピューティクス コーポレイション (8)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年８月９日（２００７．８．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年２月１４日（２００５．２．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００５／０００１８４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０７７４０４
【国際公開日】平成１７年８月２５日（２００５．８．２５）
【出願人】（５０６２７４７８５）ステム セル セラピューティクス コーポレイション (8)
【Ｆターム（参考）】
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