種子植物の品質改良方法
【課題】従来困難であった、低カフェインでかつ飲料としての味覚や風味を兼ね備えたＧＣＡハイブリッド種の作出方法ならびにＧＣＡハイブリッド種を提供する。また、従来困難であった、低カフェインでかつ飲料としての味覚や風味を兼ね備えたコーヒー飲料などの食品を提供する。
【解決手段】ユージノイド種とカネフォラ種を交配してＧＣハイブリッド種を生産する工程、前記ＧＣハイブリッド種の染色体数を倍化して４倍体ＧＣハイブリッド種を生産する工程、および、前記４倍体ＧＣハイブリッド種とアラビカ種を交配してＧＣＡハイブリッド種を生産する工程、
を含むことを特徴とするＧＣＡハイブリッド種の作出方法。
【解決手段】ユージノイド種とカネフォラ種を交配してＧＣハイブリッド種を生産する工程、前記ＧＣハイブリッド種の染色体数を倍化して４倍体ＧＣハイブリッド種を生産する工程、および、前記４倍体ＧＣハイブリッド種とアラビカ種を交配してＧＣＡハイブリッド種を生産する工程、
を含むことを特徴とするＧＣＡハイブリッド種の作出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、種子植物の品質改良方法、より詳細には、低カフェイン含量でかつ高品質な味覚を有するＧＣＡハイブリッド種およびその作出方法に関する。また、本発明は、上記ＧＣＡハイブリッド種を用いた低カフェイン含量でかつ高品質な味覚を有するコーヒー飲料などの食品類に関する。
【背景技術】
【０００２】
茶、コーヒー、ココア、ガラナ、マテ、その他６０種類近くの天然植物にカフェインが含まれているといわれており、たとえば、茶やコーヒー、ココアはその抽出物を飲料として広く用いられている。
【０００３】
しかし、カフェインは中枢神経興奮作用、強心作用、利尿作用等の生理活性を有しており、頭痛、感冒等の医薬品に汎用されている。ところが、摂取量や個人差によってはカフェインのもつ強い生理活性作用により、排尿、下痢、不眠症、不安感、胸焼け、心悸亢進、悪心、いらいら等が起こり、カフェイン過敏症の人々にとっては飲食物中のカフェイン含有量が重大な問題となる。このような理由から、カフェインが含有していないものが望まれている。
【０００４】
従来より行われている植物性物質からのカフェイン除去の代表的な方法には、塩素系溶媒により抽出除去する方法（たとえば、特許文献１〜２参照）、超臨界二酸化炭素により抽出除去する方法（たとえば、特許文献３〜４参照）、活性炭等により吸着除去する方法（たとえば、特許文献５参照）、酸水溶液により抽出除去する方法（たとえば、特許文献６参照）などがある。
【０００５】
しかしながら、これらの方法のうち塩素系溶媒を用いる方法は、含塩素溶媒を使用する点で安全上および残留性の問題がある上、環境上も好ましくなく、超臨界二酸化炭素により抽出除去する方法は、大規模な設備を要すため、イニシアルコストが高く、かつ生産性が低いという問題がある。活性炭等により吸着除去する方法は、除去すべきカフェインとともにポリフェノール類も吸着され、ポリフェノール類の損失が大きいという欠点がある。また、酸水溶液により抽出除去する方法は、酢酸エチル等の有機溶媒を必要とする上、ポリフェノール類の回収率が低いという問題がある。
【０００６】
また一方で、より根本的に汚染物質を発生させない化学プロセスが求められており、化学物質の製造の際に、原料から副生成物に至るまで汚染原因となる危険化学物質を使用しない、発生させないことで環境汚染を未然に防止しようとする「グリーンケミストリー」という考えが急速に広まってきており、化学物質を得るプロセスにおいて、微生物の働きを利用することも積極的に行われようとしている。
【０００７】
事実、カフェインを分解する微生物としては、シュードモナス属細菌、アスペルギルス属およびペニシリウム属等の真菌類が知られており、真菌類の中にはカフェインを唯一の窒素源として生育可能な真菌が存在することも報告されている（たとえば、非特許文献１参照）。
【０００８】
しかしながら、現在用いられている方法では、カフェインの分解能力は必ずしも十分でないことから、被処理物のカフェイン含量を低く押さえる必要があり、カフェイン耐性能の低い微生物は、その働きが阻害されるという問題もある。
【０００９】
またシュードモナス属細菌においては、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａのカフェイン資化能力を利用して脱メチル化物のテオブロミンへ変換させる方法（たとえば、特許文献７参照）がある。
【００１０】
しかし、この方法では、微生物変換作用であるため、培養中に微生物細胞外へ多量のテオブロミンが放出される。テオブロミンはカフェインより興奮作用等々の生理作用は弱いが、構造が変化するのみでいわゆるプリンアルカロイドの除去はできない。
【００１１】
また、その他微生物を用いた実用的なカフェインの分解方法としては、コーヒー抽出残滓、茶抽出残滓等のカフェイン含有物を早期に土壌代替物、土壌改良資材、有機質肥料等の有機質資材へ変換させる方法（たとえば、特許文献８参照）がある。しかしながら、上記方法においてはカフェインの分解能力が低く、含有させるカフェインの濃度は、０．２重量％を超えることは不可能であり、工業的規模で行うには問題点があった。
【００１２】
さらに、上記カフェイン除去方法では、カフェインの他の成分も除去されてしまい、コーヒー飲料などにおいて必要な味覚や風味を損ねてしまうという大きな問題もあった。
【００１３】
上述のように、コーヒー飲料などにおいて必要な味覚や風味を兼ね備え、かつカフェインを十分に低減した品種や作出方法、さらにはカフェイン除去方法は今まで得られていない。
【００１４】
【特許文献１】特公平２−２２７５５号公報
【特許文献２】特公平２−１２４７４号公報
【特許文献３】特開昭４８−４６９２号公報
【特許文献４】特開平１−２８９４４８号公報
【特許文献５】特公平１−４５３４５号公報
【特許文献６】特願平５−３４４７４４号公報
【特許文献７】特開平５−９５７８１号
【特許文献８】特開２００１−４６０５７号
【非特許文献１】（Ｈａｋｉｌ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ， Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃａｆｆｅｉｎｅ ａｎｄ ｒａｌａｔｅｄ ｄｉｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅｓ ｂｙ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｎｇｉ． Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２２（５）３３５−３５９、１９９８）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
そこで、本発明の目的は、従来困難であった、低カフェインでかつ飲料としての味覚や風味を兼ね備えたＧＣＡハイブリッド種の作出方法を提供することである。
【００１６】
また、本発明の目的は、従来困難であった、低カフェインでかつ飲料としての味覚や風味を兼ね備えたＧＣＡハイブリッド種を提供することである。
【００１７】
さらに、本発明の目的は、上記作出方法により得られたＧＣＡハイブリッド種を用いることにより、従来困難であった、低カフェインでかつ飲料としての味覚や風味を兼ね備えたコーヒー飲料などの食品を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、上記目的を達成すべく、鋭意検討した結果、本発明を完成するに至った。
【００１９】
すなわち、本発明のＧＣＡハイブリッド種の作出方法は、
ユージノイド種とカネフォラ種を交配してＧＣハイブリッド種を生産する工程、
前記ＧＣハイブリッド種の染色体数を倍化して４倍体ＧＣハイブリッド種を生産する工程、および、
前記４倍体ＧＣハイブリッド種とアラビカ種を交配してＧＣＡハイブリッド種を生産する工程、
を含むことを特徴とする。
【００２０】
また、本発明は、ユージノイド種の種子のカフェイン含有量が０．２１〜０．７６（乾燥重量％）である上記ＧＣＡハイブリッド種の作出方法に関する。
【００２１】
また、本発明は、コルヒチンで染色体数を倍化する上記ＧＣＡハイブリッド種の作出方法に関する。
【００２２】
さらに、本発明は、前記ＧＣＡハイブリッド種に、さらにアラビカ種または前記ＧＣＡハイブリッド種を１回以上交配してＧＣＡハイブリッド種を生産する工程を含む上記ＧＣＡハイブリッド種の作出方法に関する。
【００２３】
さらに、本発明は、得られたＧＣＡハイブリッド種の種子のカフェイン含有量が０．２７５〜１．９７（乾燥重量％）である上記ＧＣＡハイブリッド種の作出方法に関する。
【００２４】
一方、本発明のＧＣＡハイブリッド種は、
ユージノイド種とカネフォラ種を交配してＧＣハイブリッド種を生産し、次いで前記ＧＣハイブリッド種の染色体数を倍化して４倍体ＧＣハイブリッド種を生産し、さらに前記４倍体ＧＣハイブリッド種とアラビカ種を交配して作出されることを特徴とする。
【００２５】
また、本発明は、ユージノイド種の種子のカフェイン含有量が０．２１〜０．７６（乾燥重量％）である上記ＧＣＡハイブリッド種に関する。
【００２６】
また、本発明は、コルヒチンで染色体数を倍化する上記ＧＣＡハイブリッド種に関する。
【００２７】
さらに、本発明は、前記ＧＣＡハイブリッド種に、さらにアラビカ種または前記ＧＣＡハイブリッド種を１回以上交配して作出された上記ＧＣＡハイブリッド種に関する。
【００２８】
さらに、本発明は、得られたＧＣＡハイブリッド種の種子のカフェイン含有量が０．２７５〜１．９７（乾燥重量％）である上記ＧＣＡハイブリッド種に関する。
【００２９】
他方、本発明は、上記いずれかに記載の作出方法で得られるＧＣＡハイブリッド種を用いた食品に関する。
【００３０】
また、本発明は、上記いずれかに記載の作出方法で得られるＧＣＡハイブリッド種を用いたコーヒー飲料に関する。
【発明の効果】
【００３１】
本発明のＧＣＡハイブリッド種の作出方法を用いることにより、工業的な手法でカフェインを除去する方法を用いることなく、従来困難であった、低カフェインでかつ飲料としての味覚や風味を兼ね備えたＧＣＡハイブリッド種を得ることができる。
【００３２】
さらに、本発明においては、上記作出方法により得られたＧＣＡハイブリッド種を用いることにより、従来困難であった、低カフェインでかつ飲料としての味覚や風味を兼ね備えたコーヒー飲料などの食品を容易に得る事が可能となる。
【００３３】
品種改良においては、Ｆ６からＦ１０までかけて取り込みたい形質を持った品種を選抜していくのが、従来の方法であるが、コーヒーの場合においても、さび病対抗性のために、Ｆ８くらいから選抜され、まだ品質に問題のあるカティモール種などが作られている。一方、本発明の作出方法は、これまでのブラジルでの低カフェインコーヒーのための品種改良時に問題であった不稔性、およびそのことで次世代のコーヒーが得られず、商業的栽培につなげることができなかったことにとらわれずに、アラビカ種の祖先である２つの２倍体種を使うことによって、商業的栽培に適する木の性質、すなわち増産が可能で、かつ、良好な味覚を持つ種子の性質を備え、かつ、低カフェインであるコーヒーの木を作り出したことに特異性がある。つまり、アラビカコーヒーが２倍体の祖先から４倍体の種になった自然での進化（Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）の過程を人工的な染色体倍化によって可能にし、かつ、育種交配と選抜で、低カフェインのものを得ることを可能にした。その結果、後述する官能試験におけるアラビカと変わらない味覚のコーヒーを、Ｆ２、Ｆ３の段階で得ることができたことにつながる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【００３５】
本発明のＧＣＡハイブリッド種の作出方法は、
ユージノイド種とカネフォラ種を交配してＧＣハイブリッド種を生産する工程、
前記ＧＣハイブリッド種の染色体数を倍化して４倍体ＧＣハイブリッド種を生産する工程、および、
前記４倍体ＧＣハイブリッド種とアラビカ種を交配してＧＣＡハイブリッド種を生産する工程、
を含むことを特徴とする。
【００３６】
また、本発明のＧＣＡハイブリッド種は、
ユージノイド種とカネフォラ種を交配してＧＣハイブリッド種を生産し、次いで前記ＧＣハイブリッド種の染色体数を倍化して４倍体ＧＣハイブリッド種を生産し、さらに前記４倍体ＧＣハイブリッド種とアラビカ種を交配して作出されることを特徴とする。
【００３７】
本発明のＧＣＡハイブリッド種の作出方法は、ユージノイド種とカネフォラ種を交配してＧＣハイブリッド種を生産する工程を含むことを特徴とする。また、この先さらにアラビカ種にもどし交配するか、Ｆ２，Ｆ３を作ってカフェインの低い木を選抜していくこともできる。
【００３８】
なお、本発明において、ＧＣＡハイブリッド種の雑種第１代目をＦ１、上記Ｆ１同士をかけあわせたものをＦ２、上記Ｆ２同士をかけあわせたものをＦ３とよぶものとする。
【００３９】
ユージノイド種とカネフォラ種を交配する方法は、具体的には、この両方の親を使った人工交配によって行われた。なお、コーヒーにおける人工交配は世界的に使われている（たとえば、ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｏｓｓｅｎ Ｈ． ，１９８５． Ｃｏｆｆｅｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ．Ｉｎ：Ｃｏｆｆｅｅ：Ｂｏｔａｎｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｅａｎｓ ａｎｄ Ｂｅｖｅｒａｇｅ．（ｅｄｓ）Ｍ．Ｎ．Ｃｌｉｆｆｏｒｄ ａｎｄ Ｋ．Ｃ．Ｗｉｌｌｓｏｎ．ＡＶＩ ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．Ｉｎｃ．Ｗｅｓｔｐｏｒｔ．ＣＴ ＵＳＡ参照）。カネフォラ種を雌株として使い、開花の花から雄ずいと葯を取り除き、交配用の紙製の袋を被せた。次の日にユージノイド種の開花したばかりの花の葯をカネフォラ種の雌ずいに丁寧に塗りつけることにより人工受粉させた。交配用の袋は受粉後３−７日に取り除いた。交配後、果実の成長を確認して７ヶ月後、成熟した果実（果実の表皮が緑から赤に変わった時点）を収穫した。３７の交配種子（Ｃ１−Ｃ３７）が得られた。
【００４０】
具体的には、低カフェイン含有量のコーヒー原種（染色体数２ｎ＝２２）のユージノイド（Ｃ．Ｅｕｇｅｎｏｉｄｅｓ）種とカネフォラ（Ｃ．ｃａｎｅｐｈｏｒａ）種で行い、ＧＣハイブリッド種（染色体数２ｎ＝２２）を人工交配させて行う手法をあげることができる。
【００４１】
また、本発明のＧＣＡハイブリッド種の作出方法は、前記ＧＣハイブリッド種の染色体数を倍化して４倍体ＧＣハイブリッド種を生産する工程を含むことを特徴とする。
【００４２】
前記ＧＣハイブリッド種の染色体数を倍化して４倍体ＧＣハイブリッド種を生産する方法は、コルヒチンによる染色体の倍化があり、これは、２倍体ＧＣハイブリッドの幹をカットした部位にコルヒチン１部、ラノリン５０部、ココナッツウオーター５０部の配合割合のペーストを塗布し、その後、約１週間から１ヶ月後に生育してきた４倍体の新しい葉を得る方法があげられる。ただし、４倍体を得る確率は１００％ではない。４倍体ＧＣハイブリッド種を生産する方法としては、コルヒチンによる染色体の倍化を用いることが好ましい。
【００４３】
具体的には、ＧＣハイブリッド種の中で２種を選抜しコルヒチンを用いて染色体数の倍化を行い、アラビカ種と同じ染色体数（２ｎ＝４４）にする手法をあげることができる。
【００４４】
また、本発明のＧＣＡハイブリッド種の作出方法は、前記４倍体ＧＣハイブリッド種とアラビカ種を交配してＧＣＡハイブリッド種を生産する工程を含むことを特徴とする。
【００４５】
前記４倍体ＧＣハイブリッド種（ＧＣ（２ｎ＝４４）種）とアラビカ種を交配する方法は、この両方の親を使った人工交配によって行われた。より詳細には、ＣＧ種を雌株として使い、開花の花から雄ずいと葯を取り除き、交配用の紙製の袋を被せた。次の日にアラビカ種の開花したばかりの花の葯をＧＣ（２ｎ＝４４）種ずいに丁寧に塗りつけろことにより人工受粉させた。交配用の袋は受粉後３−７日に取り除いた。交配後、果実の成長を確認して９〜１２ヶ月後、成熟した果実（果実の表皮が緑から赤に変わった時点）を収穫した。ＧＣＡハイブリッド種子は、この果実から得られた。
【００４６】
具体的には、上記倍化を行った染色体数２ｎ＝４４のＧＣハイブリッド種とＣ．ａｒａｂｉｃａ種を掛け合わせＧＣＡハイブリッド種を得る手法をあげることができる。
【００４７】
また、本発明のＧＣＡハイブリッド種の作出方法は、前記ＧＣＡハイブリッド種に、さらにアラビカ種または前記ＧＣＡハイブリッド種を１回以上交配してＧＣＡハイブリッド種を生産する工程を含むことが好ましい。
【００４８】
より具体的には、ＧＣＡハイブリッド種のＦ１（雑種第１代目）よりＦ２（自家受粉およびＧＣＡハイブリッド種同士のかけあわせＳｉｂ Ｃｒｏｓｓ）とＢａｃｋ Ｃｒｏｓｓ（戻し交配）によってＧＣＡハイブリッド種（ＧＣＡ Ｐｒｏｇｅｎｃｙ）を得ることができる。
【００４９】
また、上記Ｆ１同士をかけあわせたものをＦ２、上記Ｆ２同士をかけあわせたものをＦ３とするとき、ＧＣＡハイブリッド種のＦ２とＦ３の木から採取された葉と生豆（成熟した果実）のカフェインの含有量をＨＰＬＣ法で測定して低カフェインＧＣＡハイブリッド種を選別した。
【００５０】
低カフェインＧＣＡハイブリッド種グループ（カフェイン含有量＜０．８％）より、さらにカフェイン含有量の低い子孫を得るために、低いカフェイン同士、アラビカとしてカフェインの低い親と交配する手法を用いることができる。また、より具体的には、上記交配を繰り返し１０００本以上の遺伝子型の違うＧＣＡハイブリッド種を作成しその中から選抜によってカフェイン含有量がごく少なくアラビカタイプのコーヒーを選抜した。なお、実施例におけるＧＣＡハイブリッド種はいずれもＦ２である。
【００５１】
また、低カフェインＧＣＡハイブリッド種は接木によって栽培用に増殖することが可能である。なお、コーヒーにおいては接木によってコーヒーの味覚等に影響がないことが知られている。
【００５２】
なお、先に述べた２倍体コーヒー原種のＣ．Ｅｕｇｅｎｏｉｄｅｓ種を用いた例はなく、Ｃ．ｃａｎｅｐｈｏｒａ種と交配し、ここまで２倍体であるところにコルヒチンを用い、４倍体にして、アラビカ種と交配している例は、コーヒーでは見当たらない。
【００５３】
また、マスカロコフィア属にカフェインが含まれていないことも知られていたが、このマスカロコフィア属と他の種、あるいはアラビカ種をかけても飲料となる品質を持つ品種としては、使えないことも知られている。
【００５４】
また、上記ユージノイド種の種子のカフェイン含有量が０〜１（乾燥重量％）であるものを用いることができ、０．２１〜０．７６（乾燥重量％）であるものを用いることができ、０．３５〜０．６２（乾燥重量％）であるものを用いることができる。
【００５５】
また、得られたＧＣＡハイブリッド種の種子のカフェイン含有量が０．６（乾燥重量％）以下であるものを用いることができ、０．４５（乾燥重量％）以下であるものを用いることができ、０．３（乾燥重量％）以下であるものを用いることができる。
【００５６】
上述のＧＣＡハイブリッド種の作出方法により得られた、カフェインおよびテオブロミンが低減されたＧＣＡハイブリッド種は、低カフェインでかつ飲料としての味覚や風味を兼ね備えているために、上述したカフェインのもつデメリット、（たとえば、排尿、下痢、不眠症、不安感、胸焼け、心悸亢進、悪心、いらいら等）を懸念することなく、健康増進食品、健康維持食品、健康回復食品などの食品として簡便に利用できる。
【００５７】
抽出液としてのコーヒーには、嗜好があるが、何らかの理由、たとえば妊娠中の女性や、一般的に言われるカフェインの覚醒効果が好ましくない場面（たとえば、深夜就寝前にコーヒーを飲用したい場合）などにも、通常の抽出液のコーヒーと味覚的に差異が少ない中で、カフェインの弊害の低減または解消を可能にするものである。
【００５８】
なかでも、本発明のＧＣＡハイブリッド種は、同種の種子が低カフェインであることの特性、効果を活かしたレギュラーコーヒーやコーヒー飲料などに好適なものである。
【実施例】
【００５９】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明する。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
【００６０】
〔実施例１〕
ＧＣＡハイブリッド種の官能試験の結果を下記表１に示す。下表に示すような評価基準で、８項目について行なった。なお、評価基準は、各項目とも、良（５）〜普通（３）〜悪（１）とした。
【００６１】
この味覚評価サンプルは、マダガスカル シャンバビ試験場より、２００６年３月に日本に送られたハイブリッド種サンプルで、それらの収穫時期は、２００５年８〜１０月の間であった。また、カフェイン含有量は、０．５２％であった。
【００６２】
【表１】
【００６３】
〔実施例２〕
実施例１と同様に、別タイプのハイブリッド種の味覚評価の結果を下記表２に示す。なお、各項目の評価基準は、先に示したとおりである。
【００６４】
この味覚評価サンプルも、マダガスカル シャンバビ試験場より、２００６年３月に日本に送られたハイブリッド種サンプルで、それらの収穫時期は、２００５年８〜１０月の間であった。また、カフェイン含有量は、上記実施例１のサンプル同様、０．５２％であった。
【００６５】
【表２】
【００６６】
〔実施例３〕
実施例１と同様に、別タイプのハイブリッド種の味覚評価の結果を下記表３に示す。なお、各項目の評価基準は、先に示したとおりである。
【００６７】
この味覚評価サンプルも、マダガスカル シャンバビ試験場より、２００６年１１月に日本に送られたＧＣＡハイブリッド種サンプルで、それらの収穫時期は、２００６年８〜１０月の間であった。また、カフェイン含有量は、０．６８％であった。さらに、この味覚評価に用いた液のｐＨは、５．１４であった。
【００６８】
【表３】
【００６９】
〔実施例４〕
実施例１と同様に、別タイプのハイブリッド種の味覚評価の結果を下記表４に示す。なお、各項目の評価基準は、先に示したとおりである。
【００７０】
この味覚評価サンプルも、マダガスカル シャンバビ試験場より、２００６年１１月に日本に送られたハイブリッド種サンプルで、それらの収穫時期は、２００６年８〜１０月の間であった。また、カフェイン含有量は、０．５２％であった。さらに、この味覚評価に用いた液のｐＨは、５．２３であった。
【００７１】
【表４】
【００７２】
〔実施例５〕
実施例１と同様に、別タイプのハイブリッド種の味覚評価の結果を下記表５に示す。なお、各項目の評価基準は、先に示したとおりである。
【００７３】
この味覚評価サンプルも、マダガスカル イラカ試験場より、２００６年１１月に日本に送られたハイブリッド種サンプルで、それらの収穫時期は、２００６年８〜１０月の間であった。また、カフェイン含有量は、０．４５％であった。さらに、この味覚評価に用いた液のｐＨは、５．１５であった。
【００７４】
【表５】
【００７５】
〔比較例１〕
アラビカ種と交配する前の段階のＧＣを構成するそれぞれ（ユージノイド種とカネフォラ種）について、味覚評価を行なった結果を下記表６に示す。なお、各項目の評価基準は、先に示したとおりである。
【００７６】
この味覚評価サンプルについて、ユージノイドとしては「Ａ１６ Ｃ．Ｅｕｇｅｎｏｉｄｅｓ」（２００６年 ７月 ４日 Ｍａｄａｇａｓｃａｒ Ｋｉａｎｊａｖａｔｏ試験場にて、パーチメントを入手、現地でハリングしたサンプリング）を、カネフォラ種としては「インドネシア ＡＰ−１」（ロット：１５／１１２６／９７Ｃ）を用いた。
【００７７】
【表６】
【００７８】
〔比較例２〕
アラビカ種と交配する前の段階のＧＣについて、味覚評価を行なった結果を下記表７に示す。なお、各項目の評価基準は、先に示したとおりである。
【００７９】
味覚評価サンプルとしては、２００６年１１月に、Ｍａｄａｇａｓｃａｒ Ｋｉａｎｊａｖａｔｏ試験場から入手したサンプルを用いた。さらに、この味覚評価に用いた液のｐＨは、５．６５であった。
【００８０】
【表７】
【００８１】
〔比較例３〕
エチオピア産のコーヒーの味覚評価を行なった結果を下記表８に示す。なお、各項目の評価基準は、先に示したとおりである。
【００８２】
【表８】
【００８３】
〔比較例４〕
グアテマラ産のコーヒーの味覚評価を行なった結果を下記表９に示す。なお、各項目の評価基準は、先に示したとおりである。
【００８４】
【表９】
【００８５】
〔比較例５〕
コロンビア産のコーヒーの味覚評価を行なった結果を下記表１０に示す。なお、各項目の評価基準は、先に示したとおりである。
【００８６】
さらに、この味覚評価に用いた液のｐＨは、５．０３であった。
【００８７】
【表１０】
【００８８】
上記味覚評価の結果、アラビカ種との交配前のＧＣ種や、ＧＣ種を構成するユージノイド種、カネフォラ種との比較において、アラビカ種交配後の実施例１〜５は、いずれにおいても味覚の向上が認められた。
【００８９】
また、実施例１〜５は、通常のアラビカタイプ３種と比較した場合、２種のアラビカ種よりは、高い評価を得た。すなわち、アラビカ種の味覚にも、評価の高低において、いくつかのタイプがあるが、全タイプではないが、アラビカ種並の味覚水準まで大幅に向上していることを確認した。特に、数値化は難しいが、アラビカ種交配後の実施例１〜５は、ロブスタ種特有の香り、味覚がなくなっていることが確認できており、低カフェインでかつ飲料としての味覚や風味を兼ね備えたＧＣＡハイブリッド種が得られることがわかる。
【００９０】
さらに、上記実施例・比較例で用いたサンプルの液性の分析（液性試験）結果を以下、表１１に示す。
【００９１】
【表１１】
【００９２】
なお、上記液性試験の各項目の詳細は以下のとおりである。なお、中細挽焙煎コーヒー８ｇに対し、熱湯１５５ｇを加えて、１５分浸漬した後の上澄み液を分析用試料とした。なお、カッピングに用いたものと同様の方法での抽出である。
【００９３】
（Ｂｒｉｘ：示度）
溶液中に合まれでいるコーヒーの可溶性固形分（濃度）を測定した値である。結晶性の物質が溶液中で光を屈折する性質を利用し、その屈折率によりその合量を測定した。なお、Ｂｒｉｘの値が大きいことは、抽出溶液中に多くの可溶性固形分が含まれることを意味し、コーヒーの濃厚感が強い（濃い）ことを表す指標になる。
【００９４】
（ｐＨ）
一般的に酸味を持つ成成分（無機酸、有機酸、酸性塩など）は、水中で解離して水素イオンを生じる。コーヒー抽出液のｐＨは７以下となり酸性を示すが、コーヒー抽出液のｐＨを測定することで酸味を測る指標となる。なお、ｐＨ値が低いことは酸味が強いことを示す。
【００９５】
（酸度：ｃｉｔｒｉｃ．ｗ／ｖ％）
一般に滴定酸度といわれるが、食品中の遊離酸の含有量を測定した値である。０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で滴定し、中和に要した添加量より計算した。コーヒーの酸味の指標となる。
【００９６】
（濁度：Ｏ．Ｄ．ａｔ７２０ｎｍ）
コーヒー抽出液の濁りの程度を測定した値である。分光光度計を用いて、特定波長（７２０ｎｍ）の光のエネルギーを試料（コーヒー抽出液）が吸収する強度を測定した。また、濁度の測定においては、もともとの試料の色度の影響を考慮して、７２０ｎｍの波長に設定している。なお、濁度（Ｏ．Ｄ．ａｔ７２０ｎｍ）の値が大きいことは、コーヒー抽出液の濁りの度合いが強いことを意味する。
【００９７】
（吸光度：Ｏ．Ｄ．ａｔ４２０ｎｍ）
コーヒー抽出液の褐色の強さを測定した値である。濁度と同様に、分光光度計を用いて、特定波長（４２０ｎｍ）の光のエネルギーを試料（コーヒー抽出液）が吸収する強度を測定した。なお、吸光度（Ｏ．Ｄ．ａｔ４２０ｎｍ）の値が大きいことは、コーヒー抽出液の褐色度が強くなることを意味する。
【００９８】
上記液性試験の結果、アラビカ種との交配後の、ＳＢ１６３、ＳＢ２０４およびＩＥ１２２９は、それぞれ５．２３、５．１４、５．１５を示しており、前述のＧＣ種の値より低くなっており、この３タイプの味覚にカネフォラ特有の味覚（いわゆるロブスタ臭）がない傾向と合致していた。
【００９９】
また、ＧＣＡハイブリッド種のカフェイン代謝実験を下記のような方法で行った。
【０１００】
具体的には、２００６年１２月にマダガスカル イラカ試験場で栽培されたＧＣＡハイブリッド種ならびにその親のアラビカ種、ユージノイド種、カネフォラ種それぞれの、葉および若い果実を採集し、室温にて輸送し、４８時間後に代謝実験を開始した。なお、用いたサンプルは下記表１２に示す。
【０１０１】
【表１２】
【０１０２】
（実験方法）
Ｋｏｓｈｉｒｏ ｅｔ ａｌ．（Ｙｕｋｉｋｏ Ｋｏｓｈｉｒｏ、Ｃｈｉｆｕｍｉ Ｎａｇａｉ、Ｈｉｒｏｓｈｉ Ａｓｈｉｈａｒａら：Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ １７１、２４２〜２５０（２００６））の方法に基づいて１４Ｃで標識したアデノシンを１８時間投与し、１４Ｃのテオブロミン、カフェインへのとりこみ量から、プリンアルカロイドの生合成能を算出した。
【０１０３】
標識化合物、［８−１４Ｃ］アデノシンは、市販（Ｍｏｒａｖｅｋ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社製）のものを用いた。また、メタノール可溶性物質を濃縮後、薄層クロマトグラフィーにより分離後、バイオイメージアナライザー（富士フィルム社製）で放射活性を定量化した。
【０１０４】
また、コーヒーのカフェイン生合成経路を図１に示した。
【０１０５】
カフェインの生合成の主要経路は、ＡＭＰ（アデノシン−リン酸）から開始するが、ここでは、ＡＭＰの前駆体であるアデノシンを投与した。アデノシンはコーヒーの細胞内で、ＡＭＰに変換され、テオブロミンを経由してカフェインになる。
【０１０６】
〔実施例６〕
葉のカフェイン合成能を示す相対的生合成活性を比較すると、アラビカ種とカネフォラ種の葉でカフェインの生合成が見られたが、ユージノイド種では、見られなかった。また、低カフェインのＧＣＡハイブリッド５検体では、それぞれ少量の合成能しか認められなかった。
【０１０７】
薄層クロマトグラフィーによる分離の後の定量値の相対的生合成活性は、アラビカ種が、２０．３％、カネフォラ種が、１２．６％、ユージノイド種が０．０％であった。
低カフェインのＧＣＡハイブリッド種（ＩＥ３７−ａ）からＧＣＡハイブリッド種（ＩＥ３７−ｅ）が、それぞれ３．６％、８．３％、１１．４％、２．８％、３．４％であった。ＧＣＡハイブリッド種５検体の平均は、５．９０％、標準誤差（ＳＥ）は、１．６９１であった。
【０１０８】
アラビカ種、カネフォラ種の検体数はそれぞれ１であるが、ＧＣＡハイブリッド５検体の平均値のばらつきを考慮（９５％の確率で、平均値は２．５１８〜９．２８２％の幅の中にある）しても、ＧＣＡハイブリッド種５検体の方が、アラビカ種、カネフォラ種と比較した場合、低カフェイン合成能であった。
【０１０９】
カフェインの代謝データの中で、分解能も調査したが、その結果は、いずれのサンプルも、分解能が認められなかった。つまり、各サンプルの最終的なカフェイン含有量は、今回の実験データから、合成能に依存していると考えられる。最終的なカフェイン含有量が少ないのは。合成能が低いことと相関があることがわかる。
【０１１０】
〔実施例７〕
また、若い果実でのカフェイン合成能の比較においても、傾向は、同じであった。アラビカ種では、２６．７％のカフェイン合成能が認められたが、ＧＣＡ（ＩＥ３７−ａ）からＧＣＡ（ＩＥ３７−ｄ）においては、それぞれ、６．３％、１２．２％、８．９％、４．９％であった。また、ＧＣＡハイブリッド種４検体の平均は、８．０８％、標準誤差（ＳＥ）は、１．６０４であった。
【０１１１】
アラビカ種、カネフォラ種の検体数はそれぞれ１であるが、ＧＣＡハイブリッド種５検体の平均値のばらつきを考慮（９５％の確率で、平均値は４．８７２〜１１．２８８％の幅の中にある。）すると、ＧＣＡ４検体の方が、アラビカ種と比較した場合、低カフェイン合成能であった。
【０１１２】
〔実施例８〕
採集した葉でのカフェインとテオブロミンの相対的生合成の活性の定量値は、アラビカ種とカネフォラ種のそれぞれで、合計３６．６％、２７．０％なのに比べ、低カフェインのＧＣＡハイブリッド種５検体では、ＧＣＡ（ＩＥ３７−ａ）からＧＣＡ（ＩＥ３７−ｅ）で、それぞれ７．６％、１７．５％、２０．７％、８．０％、６．６％であった。ＧＣＡハイブリッド種５検体の平均は、１２．０８％、標準誤差（ＳＥ）は、２．９１９であった。
【０１１３】
アラビカ種、カネフォラ種の検体数はそれぞれ１であるが、ＧＣＡハイブリッド種５検体の平均値のばらつきを考慮（９５％の確率で、平均値は６．２４２〜１７．９１８％の幅の中にある。）しても、ＧＣＡハイブリッド種５検体の方が、アラビカ種、カネフォラ種と比較した場合、カフェインとテオブロミンの合計の定量値は低かった。
【０１１４】
低カフェインのＧＣＡハイブリッド種５検体は、９５％の確率の分布幅があるが、平均値で比較すると、アラビカ種、カネフォラ種のそれぞれ、約３３％、約４５％のカフェイン、テオブロミン合成能しか見られなかった。
【０１１５】
〔実施例９〕
採集した若い果実での、カフェイン、テオブロミンの相対的活性の定量値は、アラビカ種、カネフォラ種がそれぞれ、４３．２％、４２．６％なのに比べて、低カフェインのＧＣＡハイブリッド種４検体では、ＧＣＡ（ＩＥ３７−ａ）からＧＣＡ（ＩＥ３７−ｄ）で、それぞれ１６．０％、３１．８％、２７．５％、１９．５％であった。ＧＣＡ４検体の平均は、２３．７０％、標準誤差（ＳＥ）は、３．６２１であった。
【０１１６】
アラビカ種、カネフォラ種の検体数はそれぞれ１であるが、ＧＣＡ５検体の平均値のばらつきを考慮（９５％の確率で、平均値は１６．４５８〜３０．９４２％の幅の中にある。）しても、ＧＣＡハイブリッド種４検体の方が、アラビカ種、カネフォラ種と比較した場合、カフェインとテオブロミンの合計の定量値は低かった。
【０１１７】
低カフェインのＧＣＡハイブリッド種全体では、アラビカ種、カネフォラ種と比較して、約６０％のカフェイン、テオブロミン合成能しかみられなかった。
【０１１８】
低カフェインのＧＣＡハイブリッド種４検体は、９５％の確率の分布幅があるが、平均値で比較すると、アラビカ種、カネフォラ種のそれぞれ、約５５％約５６％のカフェイン、テオブロミン合成能しか見られなかった。
【０１１９】
【表１３】
【０１２０】
（作出例）
このカフェイン含有量の分布の内訳を以下に示す。２００１年から２００７年にかけて総数２６７０本のＧＣＡが低カフェインＧＣＡの選抜に使われた。このうち、５８１本、２２％（＝５８１÷２６７０）の木より収穫して得た生豆（種子）に含まれるカフェイン含有量を分析した結果、平均は０，９６％のカフェイン含有量（乾物重量％）で、最低値のそれは、０．２７５％、最高値のそれは１．９７％であった。
【０１２１】
以下、表１４〜１６とグラフ（図４）で、カフェインの含有量と検体数の関係を示す。
【０１２２】
【表１４】
【０１２３】
カフェイン含有量０．６％以下のＧＣＡが得られた確率は、５．７％（＝０．１７＋０．５２＋２．１＋２．７％）で、その他の多くのＧＣＡは、目標の低い値のカフェイン含有量ではなく、その割合は、全体の約９４．３％であった。
【０１２４】
また、次の２つの表１５、１６（ＴＡＢＬＥ−１および２）に、カフェイン分析を行ったＧＣＡ３００本のカフェイン含有量を示した。（これらの表は、ＧＣＡの世代とカフェイン含量の分布状況を示す。）この表で示す３００本のカフェイン含量のデータは、先に述べた５８１本の木のうち、Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎが、はっきりしている木が３００本あり、その木からのカフェイン含量のデータである。
【０１２５】
【表１５】
【０１２６】
【表１６】
【０１２７】
これらの表から、カフェイン含有量０．６％以下のＧＣＡの選択率は、Ｆ２において１７．２％〜４０％であるが、Ｆ３、Ｆ４では、６．１〜９．１％と著しく低くなっていることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】コーヒーのカフェイン生合成経路。
【図２】実施例における薄層クロマトグラフィーによる分離の後の定量値（葉）に関するグラフ。
【図３】実施例における薄層クロマトグラフィーによる分離の後の定量値（果実）に関するグラフ。
【図４】カフェイン含有量と検体数の関係に関するグラフ。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、種子植物の品質改良方法、より詳細には、低カフェイン含量でかつ高品質な味覚を有するＧＣＡハイブリッド種およびその作出方法に関する。また、本発明は、上記ＧＣＡハイブリッド種を用いた低カフェイン含量でかつ高品質な味覚を有するコーヒー飲料などの食品類に関する。
【背景技術】
【０００２】
茶、コーヒー、ココア、ガラナ、マテ、その他６０種類近くの天然植物にカフェインが含まれているといわれており、たとえば、茶やコーヒー、ココアはその抽出物を飲料として広く用いられている。
【０００３】
しかし、カフェインは中枢神経興奮作用、強心作用、利尿作用等の生理活性を有しており、頭痛、感冒等の医薬品に汎用されている。ところが、摂取量や個人差によってはカフェインのもつ強い生理活性作用により、排尿、下痢、不眠症、不安感、胸焼け、心悸亢進、悪心、いらいら等が起こり、カフェイン過敏症の人々にとっては飲食物中のカフェイン含有量が重大な問題となる。このような理由から、カフェインが含有していないものが望まれている。
【０００４】
従来より行われている植物性物質からのカフェイン除去の代表的な方法には、塩素系溶媒により抽出除去する方法（たとえば、特許文献１〜２参照）、超臨界二酸化炭素により抽出除去する方法（たとえば、特許文献３〜４参照）、活性炭等により吸着除去する方法（たとえば、特許文献５参照）、酸水溶液により抽出除去する方法（たとえば、特許文献６参照）などがある。
【０００５】
しかしながら、これらの方法のうち塩素系溶媒を用いる方法は、含塩素溶媒を使用する点で安全上および残留性の問題がある上、環境上も好ましくなく、超臨界二酸化炭素により抽出除去する方法は、大規模な設備を要すため、イニシアルコストが高く、かつ生産性が低いという問題がある。活性炭等により吸着除去する方法は、除去すべきカフェインとともにポリフェノール類も吸着され、ポリフェノール類の損失が大きいという欠点がある。また、酸水溶液により抽出除去する方法は、酢酸エチル等の有機溶媒を必要とする上、ポリフェノール類の回収率が低いという問題がある。
【０００６】
また一方で、より根本的に汚染物質を発生させない化学プロセスが求められており、化学物質の製造の際に、原料から副生成物に至るまで汚染原因となる危険化学物質を使用しない、発生させないことで環境汚染を未然に防止しようとする「グリーンケミストリー」という考えが急速に広まってきており、化学物質を得るプロセスにおいて、微生物の働きを利用することも積極的に行われようとしている。
【０００７】
事実、カフェインを分解する微生物としては、シュードモナス属細菌、アスペルギルス属およびペニシリウム属等の真菌類が知られており、真菌類の中にはカフェインを唯一の窒素源として生育可能な真菌が存在することも報告されている（たとえば、非特許文献１参照）。
【０００８】
しかしながら、現在用いられている方法では、カフェインの分解能力は必ずしも十分でないことから、被処理物のカフェイン含量を低く押さえる必要があり、カフェイン耐性能の低い微生物は、その働きが阻害されるという問題もある。
【０００９】
またシュードモナス属細菌においては、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａのカフェイン資化能力を利用して脱メチル化物のテオブロミンへ変換させる方法（たとえば、特許文献７参照）がある。
【００１０】
しかし、この方法では、微生物変換作用であるため、培養中に微生物細胞外へ多量のテオブロミンが放出される。テオブロミンはカフェインより興奮作用等々の生理作用は弱いが、構造が変化するのみでいわゆるプリンアルカロイドの除去はできない。
【００１１】
また、その他微生物を用いた実用的なカフェインの分解方法としては、コーヒー抽出残滓、茶抽出残滓等のカフェイン含有物を早期に土壌代替物、土壌改良資材、有機質肥料等の有機質資材へ変換させる方法（たとえば、特許文献８参照）がある。しかしながら、上記方法においてはカフェインの分解能力が低く、含有させるカフェインの濃度は、０．２重量％を超えることは不可能であり、工業的規模で行うには問題点があった。
【００１２】
さらに、上記カフェイン除去方法では、カフェインの他の成分も除去されてしまい、コーヒー飲料などにおいて必要な味覚や風味を損ねてしまうという大きな問題もあった。
【００１３】
上述のように、コーヒー飲料などにおいて必要な味覚や風味を兼ね備え、かつカフェインを十分に低減した品種や作出方法、さらにはカフェイン除去方法は今まで得られていない。
【００１４】
【特許文献１】特公平２−２２７５５号公報
【特許文献２】特公平２−１２４７４号公報
【特許文献３】特開昭４８−４６９２号公報
【特許文献４】特開平１−２８９４４８号公報
【特許文献５】特公平１−４５３４５号公報
【特許文献６】特願平５−３４４７４４号公報
【特許文献７】特開平５−９５７８１号
【特許文献８】特開２００１−４６０５７号
【非特許文献１】（Ｈａｋｉｌ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ， Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃａｆｆｅｉｎｅ ａｎｄ ｒａｌａｔｅｄ ｄｉｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅｓ ｂｙ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｎｇｉ． Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２２（５）３３５−３５９、１９９８）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
そこで、本発明の目的は、従来困難であった、低カフェインでかつ飲料としての味覚や風味を兼ね備えたＧＣＡハイブリッド種の作出方法を提供することである。
【００１６】
また、本発明の目的は、従来困難であった、低カフェインでかつ飲料としての味覚や風味を兼ね備えたＧＣＡハイブリッド種を提供することである。
【００１７】
さらに、本発明の目的は、上記作出方法により得られたＧＣＡハイブリッド種を用いることにより、従来困難であった、低カフェインでかつ飲料としての味覚や風味を兼ね備えたコーヒー飲料などの食品を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、上記目的を達成すべく、鋭意検討した結果、本発明を完成するに至った。
【００１９】
すなわち、本発明のＧＣＡハイブリッド種の作出方法は、
ユージノイド種とカネフォラ種を交配してＧＣハイブリッド種を生産する工程、
前記ＧＣハイブリッド種の染色体数を倍化して４倍体ＧＣハイブリッド種を生産する工程、および、
前記４倍体ＧＣハイブリッド種とアラビカ種を交配してＧＣＡハイブリッド種を生産する工程、
を含むことを特徴とする。
【００２０】
また、本発明は、ユージノイド種の種子のカフェイン含有量が０．２１〜０．７６（乾燥重量％）である上記ＧＣＡハイブリッド種の作出方法に関する。
【００２１】
また、本発明は、コルヒチンで染色体数を倍化する上記ＧＣＡハイブリッド種の作出方法に関する。
【００２２】
さらに、本発明は、前記ＧＣＡハイブリッド種に、さらにアラビカ種または前記ＧＣＡハイブリッド種を１回以上交配してＧＣＡハイブリッド種を生産する工程を含む上記ＧＣＡハイブリッド種の作出方法に関する。
【００２３】
さらに、本発明は、得られたＧＣＡハイブリッド種の種子のカフェイン含有量が０．２７５〜１．９７（乾燥重量％）である上記ＧＣＡハイブリッド種の作出方法に関する。
【００２４】
一方、本発明のＧＣＡハイブリッド種は、
ユージノイド種とカネフォラ種を交配してＧＣハイブリッド種を生産し、次いで前記ＧＣハイブリッド種の染色体数を倍化して４倍体ＧＣハイブリッド種を生産し、さらに前記４倍体ＧＣハイブリッド種とアラビカ種を交配して作出されることを特徴とする。
【００２５】
また、本発明は、ユージノイド種の種子のカフェイン含有量が０．２１〜０．７６（乾燥重量％）である上記ＧＣＡハイブリッド種に関する。
【００２６】
また、本発明は、コルヒチンで染色体数を倍化する上記ＧＣＡハイブリッド種に関する。
【００２７】
さらに、本発明は、前記ＧＣＡハイブリッド種に、さらにアラビカ種または前記ＧＣＡハイブリッド種を１回以上交配して作出された上記ＧＣＡハイブリッド種に関する。
【００２８】
さらに、本発明は、得られたＧＣＡハイブリッド種の種子のカフェイン含有量が０．２７５〜１．９７（乾燥重量％）である上記ＧＣＡハイブリッド種に関する。
【００２９】
他方、本発明は、上記いずれかに記載の作出方法で得られるＧＣＡハイブリッド種を用いた食品に関する。
【００３０】
また、本発明は、上記いずれかに記載の作出方法で得られるＧＣＡハイブリッド種を用いたコーヒー飲料に関する。
【発明の効果】
【００３１】
本発明のＧＣＡハイブリッド種の作出方法を用いることにより、工業的な手法でカフェインを除去する方法を用いることなく、従来困難であった、低カフェインでかつ飲料としての味覚や風味を兼ね備えたＧＣＡハイブリッド種を得ることができる。
【００３２】
さらに、本発明においては、上記作出方法により得られたＧＣＡハイブリッド種を用いることにより、従来困難であった、低カフェインでかつ飲料としての味覚や風味を兼ね備えたコーヒー飲料などの食品を容易に得る事が可能となる。
【００３３】
品種改良においては、Ｆ６からＦ１０までかけて取り込みたい形質を持った品種を選抜していくのが、従来の方法であるが、コーヒーの場合においても、さび病対抗性のために、Ｆ８くらいから選抜され、まだ品質に問題のあるカティモール種などが作られている。一方、本発明の作出方法は、これまでのブラジルでの低カフェインコーヒーのための品種改良時に問題であった不稔性、およびそのことで次世代のコーヒーが得られず、商業的栽培につなげることができなかったことにとらわれずに、アラビカ種の祖先である２つの２倍体種を使うことによって、商業的栽培に適する木の性質、すなわち増産が可能で、かつ、良好な味覚を持つ種子の性質を備え、かつ、低カフェインであるコーヒーの木を作り出したことに特異性がある。つまり、アラビカコーヒーが２倍体の祖先から４倍体の種になった自然での進化（Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）の過程を人工的な染色体倍化によって可能にし、かつ、育種交配と選抜で、低カフェインのものを得ることを可能にした。その結果、後述する官能試験におけるアラビカと変わらない味覚のコーヒーを、Ｆ２、Ｆ３の段階で得ることができたことにつながる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【００３５】
本発明のＧＣＡハイブリッド種の作出方法は、
ユージノイド種とカネフォラ種を交配してＧＣハイブリッド種を生産する工程、
前記ＧＣハイブリッド種の染色体数を倍化して４倍体ＧＣハイブリッド種を生産する工程、および、
前記４倍体ＧＣハイブリッド種とアラビカ種を交配してＧＣＡハイブリッド種を生産する工程、
を含むことを特徴とする。
【００３６】
また、本発明のＧＣＡハイブリッド種は、
ユージノイド種とカネフォラ種を交配してＧＣハイブリッド種を生産し、次いで前記ＧＣハイブリッド種の染色体数を倍化して４倍体ＧＣハイブリッド種を生産し、さらに前記４倍体ＧＣハイブリッド種とアラビカ種を交配して作出されることを特徴とする。
【００３７】
本発明のＧＣＡハイブリッド種の作出方法は、ユージノイド種とカネフォラ種を交配してＧＣハイブリッド種を生産する工程を含むことを特徴とする。また、この先さらにアラビカ種にもどし交配するか、Ｆ２，Ｆ３を作ってカフェインの低い木を選抜していくこともできる。
【００３８】
なお、本発明において、ＧＣＡハイブリッド種の雑種第１代目をＦ１、上記Ｆ１同士をかけあわせたものをＦ２、上記Ｆ２同士をかけあわせたものをＦ３とよぶものとする。
【００３９】
ユージノイド種とカネフォラ種を交配する方法は、具体的には、この両方の親を使った人工交配によって行われた。なお、コーヒーにおける人工交配は世界的に使われている（たとえば、ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｏｓｓｅｎ Ｈ． ，１９８５． Ｃｏｆｆｅｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ．Ｉｎ：Ｃｏｆｆｅｅ：Ｂｏｔａｎｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｅａｎｓ ａｎｄ Ｂｅｖｅｒａｇｅ．（ｅｄｓ）Ｍ．Ｎ．Ｃｌｉｆｆｏｒｄ ａｎｄ Ｋ．Ｃ．Ｗｉｌｌｓｏｎ．ＡＶＩ ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．Ｉｎｃ．Ｗｅｓｔｐｏｒｔ．ＣＴ ＵＳＡ参照）。カネフォラ種を雌株として使い、開花の花から雄ずいと葯を取り除き、交配用の紙製の袋を被せた。次の日にユージノイド種の開花したばかりの花の葯をカネフォラ種の雌ずいに丁寧に塗りつけることにより人工受粉させた。交配用の袋は受粉後３−７日に取り除いた。交配後、果実の成長を確認して７ヶ月後、成熟した果実（果実の表皮が緑から赤に変わった時点）を収穫した。３７の交配種子（Ｃ１−Ｃ３７）が得られた。
【００４０】
具体的には、低カフェイン含有量のコーヒー原種（染色体数２ｎ＝２２）のユージノイド（Ｃ．Ｅｕｇｅｎｏｉｄｅｓ）種とカネフォラ（Ｃ．ｃａｎｅｐｈｏｒａ）種で行い、ＧＣハイブリッド種（染色体数２ｎ＝２２）を人工交配させて行う手法をあげることができる。
【００４１】
また、本発明のＧＣＡハイブリッド種の作出方法は、前記ＧＣハイブリッド種の染色体数を倍化して４倍体ＧＣハイブリッド種を生産する工程を含むことを特徴とする。
【００４２】
前記ＧＣハイブリッド種の染色体数を倍化して４倍体ＧＣハイブリッド種を生産する方法は、コルヒチンによる染色体の倍化があり、これは、２倍体ＧＣハイブリッドの幹をカットした部位にコルヒチン１部、ラノリン５０部、ココナッツウオーター５０部の配合割合のペーストを塗布し、その後、約１週間から１ヶ月後に生育してきた４倍体の新しい葉を得る方法があげられる。ただし、４倍体を得る確率は１００％ではない。４倍体ＧＣハイブリッド種を生産する方法としては、コルヒチンによる染色体の倍化を用いることが好ましい。
【００４３】
具体的には、ＧＣハイブリッド種の中で２種を選抜しコルヒチンを用いて染色体数の倍化を行い、アラビカ種と同じ染色体数（２ｎ＝４４）にする手法をあげることができる。
【００４４】
また、本発明のＧＣＡハイブリッド種の作出方法は、前記４倍体ＧＣハイブリッド種とアラビカ種を交配してＧＣＡハイブリッド種を生産する工程を含むことを特徴とする。
【００４５】
前記４倍体ＧＣハイブリッド種（ＧＣ（２ｎ＝４４）種）とアラビカ種を交配する方法は、この両方の親を使った人工交配によって行われた。より詳細には、ＣＧ種を雌株として使い、開花の花から雄ずいと葯を取り除き、交配用の紙製の袋を被せた。次の日にアラビカ種の開花したばかりの花の葯をＧＣ（２ｎ＝４４）種ずいに丁寧に塗りつけろことにより人工受粉させた。交配用の袋は受粉後３−７日に取り除いた。交配後、果実の成長を確認して９〜１２ヶ月後、成熟した果実（果実の表皮が緑から赤に変わった時点）を収穫した。ＧＣＡハイブリッド種子は、この果実から得られた。
【００４６】
具体的には、上記倍化を行った染色体数２ｎ＝４４のＧＣハイブリッド種とＣ．ａｒａｂｉｃａ種を掛け合わせＧＣＡハイブリッド種を得る手法をあげることができる。
【００４７】
また、本発明のＧＣＡハイブリッド種の作出方法は、前記ＧＣＡハイブリッド種に、さらにアラビカ種または前記ＧＣＡハイブリッド種を１回以上交配してＧＣＡハイブリッド種を生産する工程を含むことが好ましい。
【００４８】
より具体的には、ＧＣＡハイブリッド種のＦ１（雑種第１代目）よりＦ２（自家受粉およびＧＣＡハイブリッド種同士のかけあわせＳｉｂ Ｃｒｏｓｓ）とＢａｃｋ Ｃｒｏｓｓ（戻し交配）によってＧＣＡハイブリッド種（ＧＣＡ Ｐｒｏｇｅｎｃｙ）を得ることができる。
【００４９】
また、上記Ｆ１同士をかけあわせたものをＦ２、上記Ｆ２同士をかけあわせたものをＦ３とするとき、ＧＣＡハイブリッド種のＦ２とＦ３の木から採取された葉と生豆（成熟した果実）のカフェインの含有量をＨＰＬＣ法で測定して低カフェインＧＣＡハイブリッド種を選別した。
【００５０】
低カフェインＧＣＡハイブリッド種グループ（カフェイン含有量＜０．８％）より、さらにカフェイン含有量の低い子孫を得るために、低いカフェイン同士、アラビカとしてカフェインの低い親と交配する手法を用いることができる。また、より具体的には、上記交配を繰り返し１０００本以上の遺伝子型の違うＧＣＡハイブリッド種を作成しその中から選抜によってカフェイン含有量がごく少なくアラビカタイプのコーヒーを選抜した。なお、実施例におけるＧＣＡハイブリッド種はいずれもＦ２である。
【００５１】
また、低カフェインＧＣＡハイブリッド種は接木によって栽培用に増殖することが可能である。なお、コーヒーにおいては接木によってコーヒーの味覚等に影響がないことが知られている。
【００５２】
なお、先に述べた２倍体コーヒー原種のＣ．Ｅｕｇｅｎｏｉｄｅｓ種を用いた例はなく、Ｃ．ｃａｎｅｐｈｏｒａ種と交配し、ここまで２倍体であるところにコルヒチンを用い、４倍体にして、アラビカ種と交配している例は、コーヒーでは見当たらない。
【００５３】
また、マスカロコフィア属にカフェインが含まれていないことも知られていたが、このマスカロコフィア属と他の種、あるいはアラビカ種をかけても飲料となる品質を持つ品種としては、使えないことも知られている。
【００５４】
また、上記ユージノイド種の種子のカフェイン含有量が０〜１（乾燥重量％）であるものを用いることができ、０．２１〜０．７６（乾燥重量％）であるものを用いることができ、０．３５〜０．６２（乾燥重量％）であるものを用いることができる。
【００５５】
また、得られたＧＣＡハイブリッド種の種子のカフェイン含有量が０．６（乾燥重量％）以下であるものを用いることができ、０．４５（乾燥重量％）以下であるものを用いることができ、０．３（乾燥重量％）以下であるものを用いることができる。
【００５６】
上述のＧＣＡハイブリッド種の作出方法により得られた、カフェインおよびテオブロミンが低減されたＧＣＡハイブリッド種は、低カフェインでかつ飲料としての味覚や風味を兼ね備えているために、上述したカフェインのもつデメリット、（たとえば、排尿、下痢、不眠症、不安感、胸焼け、心悸亢進、悪心、いらいら等）を懸念することなく、健康増進食品、健康維持食品、健康回復食品などの食品として簡便に利用できる。
【００５７】
抽出液としてのコーヒーには、嗜好があるが、何らかの理由、たとえば妊娠中の女性や、一般的に言われるカフェインの覚醒効果が好ましくない場面（たとえば、深夜就寝前にコーヒーを飲用したい場合）などにも、通常の抽出液のコーヒーと味覚的に差異が少ない中で、カフェインの弊害の低減または解消を可能にするものである。
【００５８】
なかでも、本発明のＧＣＡハイブリッド種は、同種の種子が低カフェインであることの特性、効果を活かしたレギュラーコーヒーやコーヒー飲料などに好適なものである。
【実施例】
【００５９】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明する。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
【００６０】
〔実施例１〕
ＧＣＡハイブリッド種の官能試験の結果を下記表１に示す。下表に示すような評価基準で、８項目について行なった。なお、評価基準は、各項目とも、良（５）〜普通（３）〜悪（１）とした。
【００６１】
この味覚評価サンプルは、マダガスカル シャンバビ試験場より、２００６年３月に日本に送られたハイブリッド種サンプルで、それらの収穫時期は、２００５年８〜１０月の間であった。また、カフェイン含有量は、０．５２％であった。
【００６２】
【表１】
【００６３】
〔実施例２〕
実施例１と同様に、別タイプのハイブリッド種の味覚評価の結果を下記表２に示す。なお、各項目の評価基準は、先に示したとおりである。
【００６４】
この味覚評価サンプルも、マダガスカル シャンバビ試験場より、２００６年３月に日本に送られたハイブリッド種サンプルで、それらの収穫時期は、２００５年８〜１０月の間であった。また、カフェイン含有量は、上記実施例１のサンプル同様、０．５２％であった。
【００６５】
【表２】
【００６６】
〔実施例３〕
実施例１と同様に、別タイプのハイブリッド種の味覚評価の結果を下記表３に示す。なお、各項目の評価基準は、先に示したとおりである。
【００６７】
この味覚評価サンプルも、マダガスカル シャンバビ試験場より、２００６年１１月に日本に送られたＧＣＡハイブリッド種サンプルで、それらの収穫時期は、２００６年８〜１０月の間であった。また、カフェイン含有量は、０．６８％であった。さらに、この味覚評価に用いた液のｐＨは、５．１４であった。
【００６８】
【表３】
【００６９】
〔実施例４〕
実施例１と同様に、別タイプのハイブリッド種の味覚評価の結果を下記表４に示す。なお、各項目の評価基準は、先に示したとおりである。
【００７０】
この味覚評価サンプルも、マダガスカル シャンバビ試験場より、２００６年１１月に日本に送られたハイブリッド種サンプルで、それらの収穫時期は、２００６年８〜１０月の間であった。また、カフェイン含有量は、０．５２％であった。さらに、この味覚評価に用いた液のｐＨは、５．２３であった。
【００７１】
【表４】
【００７２】
〔実施例５〕
実施例１と同様に、別タイプのハイブリッド種の味覚評価の結果を下記表５に示す。なお、各項目の評価基準は、先に示したとおりである。
【００７３】
この味覚評価サンプルも、マダガスカル イラカ試験場より、２００６年１１月に日本に送られたハイブリッド種サンプルで、それらの収穫時期は、２００６年８〜１０月の間であった。また、カフェイン含有量は、０．４５％であった。さらに、この味覚評価に用いた液のｐＨは、５．１５であった。
【００７４】
【表５】
【００７５】
〔比較例１〕
アラビカ種と交配する前の段階のＧＣを構成するそれぞれ（ユージノイド種とカネフォラ種）について、味覚評価を行なった結果を下記表６に示す。なお、各項目の評価基準は、先に示したとおりである。
【００７６】
この味覚評価サンプルについて、ユージノイドとしては「Ａ１６ Ｃ．Ｅｕｇｅｎｏｉｄｅｓ」（２００６年 ７月 ４日 Ｍａｄａｇａｓｃａｒ Ｋｉａｎｊａｖａｔｏ試験場にて、パーチメントを入手、現地でハリングしたサンプリング）を、カネフォラ種としては「インドネシア ＡＰ−１」（ロット：１５／１１２６／９７Ｃ）を用いた。
【００７７】
【表６】
【００７８】
〔比較例２〕
アラビカ種と交配する前の段階のＧＣについて、味覚評価を行なった結果を下記表７に示す。なお、各項目の評価基準は、先に示したとおりである。
【００７９】
味覚評価サンプルとしては、２００６年１１月に、Ｍａｄａｇａｓｃａｒ Ｋｉａｎｊａｖａｔｏ試験場から入手したサンプルを用いた。さらに、この味覚評価に用いた液のｐＨは、５．６５であった。
【００８０】
【表７】
【００８１】
〔比較例３〕
エチオピア産のコーヒーの味覚評価を行なった結果を下記表８に示す。なお、各項目の評価基準は、先に示したとおりである。
【００８２】
【表８】
【００８３】
〔比較例４〕
グアテマラ産のコーヒーの味覚評価を行なった結果を下記表９に示す。なお、各項目の評価基準は、先に示したとおりである。
【００８４】
【表９】
【００８５】
〔比較例５〕
コロンビア産のコーヒーの味覚評価を行なった結果を下記表１０に示す。なお、各項目の評価基準は、先に示したとおりである。
【００８６】
さらに、この味覚評価に用いた液のｐＨは、５．０３であった。
【００８７】
【表１０】
【００８８】
上記味覚評価の結果、アラビカ種との交配前のＧＣ種や、ＧＣ種を構成するユージノイド種、カネフォラ種との比較において、アラビカ種交配後の実施例１〜５は、いずれにおいても味覚の向上が認められた。
【００８９】
また、実施例１〜５は、通常のアラビカタイプ３種と比較した場合、２種のアラビカ種よりは、高い評価を得た。すなわち、アラビカ種の味覚にも、評価の高低において、いくつかのタイプがあるが、全タイプではないが、アラビカ種並の味覚水準まで大幅に向上していることを確認した。特に、数値化は難しいが、アラビカ種交配後の実施例１〜５は、ロブスタ種特有の香り、味覚がなくなっていることが確認できており、低カフェインでかつ飲料としての味覚や風味を兼ね備えたＧＣＡハイブリッド種が得られることがわかる。
【００９０】
さらに、上記実施例・比較例で用いたサンプルの液性の分析（液性試験）結果を以下、表１１に示す。
【００９１】
【表１１】
【００９２】
なお、上記液性試験の各項目の詳細は以下のとおりである。なお、中細挽焙煎コーヒー８ｇに対し、熱湯１５５ｇを加えて、１５分浸漬した後の上澄み液を分析用試料とした。なお、カッピングに用いたものと同様の方法での抽出である。
【００９３】
（Ｂｒｉｘ：示度）
溶液中に合まれでいるコーヒーの可溶性固形分（濃度）を測定した値である。結晶性の物質が溶液中で光を屈折する性質を利用し、その屈折率によりその合量を測定した。なお、Ｂｒｉｘの値が大きいことは、抽出溶液中に多くの可溶性固形分が含まれることを意味し、コーヒーの濃厚感が強い（濃い）ことを表す指標になる。
【００９４】
（ｐＨ）
一般的に酸味を持つ成成分（無機酸、有機酸、酸性塩など）は、水中で解離して水素イオンを生じる。コーヒー抽出液のｐＨは７以下となり酸性を示すが、コーヒー抽出液のｐＨを測定することで酸味を測る指標となる。なお、ｐＨ値が低いことは酸味が強いことを示す。
【００９５】
（酸度：ｃｉｔｒｉｃ．ｗ／ｖ％）
一般に滴定酸度といわれるが、食品中の遊離酸の含有量を測定した値である。０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で滴定し、中和に要した添加量より計算した。コーヒーの酸味の指標となる。
【００９６】
（濁度：Ｏ．Ｄ．ａｔ７２０ｎｍ）
コーヒー抽出液の濁りの程度を測定した値である。分光光度計を用いて、特定波長（７２０ｎｍ）の光のエネルギーを試料（コーヒー抽出液）が吸収する強度を測定した。また、濁度の測定においては、もともとの試料の色度の影響を考慮して、７２０ｎｍの波長に設定している。なお、濁度（Ｏ．Ｄ．ａｔ７２０ｎｍ）の値が大きいことは、コーヒー抽出液の濁りの度合いが強いことを意味する。
【００９７】
（吸光度：Ｏ．Ｄ．ａｔ４２０ｎｍ）
コーヒー抽出液の褐色の強さを測定した値である。濁度と同様に、分光光度計を用いて、特定波長（４２０ｎｍ）の光のエネルギーを試料（コーヒー抽出液）が吸収する強度を測定した。なお、吸光度（Ｏ．Ｄ．ａｔ４２０ｎｍ）の値が大きいことは、コーヒー抽出液の褐色度が強くなることを意味する。
【００９８】
上記液性試験の結果、アラビカ種との交配後の、ＳＢ１６３、ＳＢ２０４およびＩＥ１２２９は、それぞれ５．２３、５．１４、５．１５を示しており、前述のＧＣ種の値より低くなっており、この３タイプの味覚にカネフォラ特有の味覚（いわゆるロブスタ臭）がない傾向と合致していた。
【００９９】
また、ＧＣＡハイブリッド種のカフェイン代謝実験を下記のような方法で行った。
【０１００】
具体的には、２００６年１２月にマダガスカル イラカ試験場で栽培されたＧＣＡハイブリッド種ならびにその親のアラビカ種、ユージノイド種、カネフォラ種それぞれの、葉および若い果実を採集し、室温にて輸送し、４８時間後に代謝実験を開始した。なお、用いたサンプルは下記表１２に示す。
【０１０１】
【表１２】
【０１０２】
（実験方法）
Ｋｏｓｈｉｒｏ ｅｔ ａｌ．（Ｙｕｋｉｋｏ Ｋｏｓｈｉｒｏ、Ｃｈｉｆｕｍｉ Ｎａｇａｉ、Ｈｉｒｏｓｈｉ Ａｓｈｉｈａｒａら：Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ １７１、２４２〜２５０（２００６））の方法に基づいて１４Ｃで標識したアデノシンを１８時間投与し、１４Ｃのテオブロミン、カフェインへのとりこみ量から、プリンアルカロイドの生合成能を算出した。
【０１０３】
標識化合物、［８−１４Ｃ］アデノシンは、市販（Ｍｏｒａｖｅｋ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社製）のものを用いた。また、メタノール可溶性物質を濃縮後、薄層クロマトグラフィーにより分離後、バイオイメージアナライザー（富士フィルム社製）で放射活性を定量化した。
【０１０４】
また、コーヒーのカフェイン生合成経路を図１に示した。
【０１０５】
カフェインの生合成の主要経路は、ＡＭＰ（アデノシン−リン酸）から開始するが、ここでは、ＡＭＰの前駆体であるアデノシンを投与した。アデノシンはコーヒーの細胞内で、ＡＭＰに変換され、テオブロミンを経由してカフェインになる。
【０１０６】
〔実施例６〕
葉のカフェイン合成能を示す相対的生合成活性を比較すると、アラビカ種とカネフォラ種の葉でカフェインの生合成が見られたが、ユージノイド種では、見られなかった。また、低カフェインのＧＣＡハイブリッド５検体では、それぞれ少量の合成能しか認められなかった。
【０１０７】
薄層クロマトグラフィーによる分離の後の定量値の相対的生合成活性は、アラビカ種が、２０．３％、カネフォラ種が、１２．６％、ユージノイド種が０．０％であった。
低カフェインのＧＣＡハイブリッド種（ＩＥ３７−ａ）からＧＣＡハイブリッド種（ＩＥ３７−ｅ）が、それぞれ３．６％、８．３％、１１．４％、２．８％、３．４％であった。ＧＣＡハイブリッド種５検体の平均は、５．９０％、標準誤差（ＳＥ）は、１．６９１であった。
【０１０８】
アラビカ種、カネフォラ種の検体数はそれぞれ１であるが、ＧＣＡハイブリッド５検体の平均値のばらつきを考慮（９５％の確率で、平均値は２．５１８〜９．２８２％の幅の中にある）しても、ＧＣＡハイブリッド種５検体の方が、アラビカ種、カネフォラ種と比較した場合、低カフェイン合成能であった。
【０１０９】
カフェインの代謝データの中で、分解能も調査したが、その結果は、いずれのサンプルも、分解能が認められなかった。つまり、各サンプルの最終的なカフェイン含有量は、今回の実験データから、合成能に依存していると考えられる。最終的なカフェイン含有量が少ないのは。合成能が低いことと相関があることがわかる。
【０１１０】
〔実施例７〕
また、若い果実でのカフェイン合成能の比較においても、傾向は、同じであった。アラビカ種では、２６．７％のカフェイン合成能が認められたが、ＧＣＡ（ＩＥ３７−ａ）からＧＣＡ（ＩＥ３７−ｄ）においては、それぞれ、６．３％、１２．２％、８．９％、４．９％であった。また、ＧＣＡハイブリッド種４検体の平均は、８．０８％、標準誤差（ＳＥ）は、１．６０４であった。
【０１１１】
アラビカ種、カネフォラ種の検体数はそれぞれ１であるが、ＧＣＡハイブリッド種５検体の平均値のばらつきを考慮（９５％の確率で、平均値は４．８７２〜１１．２８８％の幅の中にある。）すると、ＧＣＡ４検体の方が、アラビカ種と比較した場合、低カフェイン合成能であった。
【０１１２】
〔実施例８〕
採集した葉でのカフェインとテオブロミンの相対的生合成の活性の定量値は、アラビカ種とカネフォラ種のそれぞれで、合計３６．６％、２７．０％なのに比べ、低カフェインのＧＣＡハイブリッド種５検体では、ＧＣＡ（ＩＥ３７−ａ）からＧＣＡ（ＩＥ３７−ｅ）で、それぞれ７．６％、１７．５％、２０．７％、８．０％、６．６％であった。ＧＣＡハイブリッド種５検体の平均は、１２．０８％、標準誤差（ＳＥ）は、２．９１９であった。
【０１１３】
アラビカ種、カネフォラ種の検体数はそれぞれ１であるが、ＧＣＡハイブリッド種５検体の平均値のばらつきを考慮（９５％の確率で、平均値は６．２４２〜１７．９１８％の幅の中にある。）しても、ＧＣＡハイブリッド種５検体の方が、アラビカ種、カネフォラ種と比較した場合、カフェインとテオブロミンの合計の定量値は低かった。
【０１１４】
低カフェインのＧＣＡハイブリッド種５検体は、９５％の確率の分布幅があるが、平均値で比較すると、アラビカ種、カネフォラ種のそれぞれ、約３３％、約４５％のカフェイン、テオブロミン合成能しか見られなかった。
【０１１５】
〔実施例９〕
採集した若い果実での、カフェイン、テオブロミンの相対的活性の定量値は、アラビカ種、カネフォラ種がそれぞれ、４３．２％、４２．６％なのに比べて、低カフェインのＧＣＡハイブリッド種４検体では、ＧＣＡ（ＩＥ３７−ａ）からＧＣＡ（ＩＥ３７−ｄ）で、それぞれ１６．０％、３１．８％、２７．５％、１９．５％であった。ＧＣＡ４検体の平均は、２３．７０％、標準誤差（ＳＥ）は、３．６２１であった。
【０１１６】
アラビカ種、カネフォラ種の検体数はそれぞれ１であるが、ＧＣＡ５検体の平均値のばらつきを考慮（９５％の確率で、平均値は１６．４５８〜３０．９４２％の幅の中にある。）しても、ＧＣＡハイブリッド種４検体の方が、アラビカ種、カネフォラ種と比較した場合、カフェインとテオブロミンの合計の定量値は低かった。
【０１１７】
低カフェインのＧＣＡハイブリッド種全体では、アラビカ種、カネフォラ種と比較して、約６０％のカフェイン、テオブロミン合成能しかみられなかった。
【０１１８】
低カフェインのＧＣＡハイブリッド種４検体は、９５％の確率の分布幅があるが、平均値で比較すると、アラビカ種、カネフォラ種のそれぞれ、約５５％約５６％のカフェイン、テオブロミン合成能しか見られなかった。
【０１１９】
【表１３】
【０１２０】
（作出例）
このカフェイン含有量の分布の内訳を以下に示す。２００１年から２００７年にかけて総数２６７０本のＧＣＡが低カフェインＧＣＡの選抜に使われた。このうち、５８１本、２２％（＝５８１÷２６７０）の木より収穫して得た生豆（種子）に含まれるカフェイン含有量を分析した結果、平均は０，９６％のカフェイン含有量（乾物重量％）で、最低値のそれは、０．２７５％、最高値のそれは１．９７％であった。
【０１２１】
以下、表１４〜１６とグラフ（図４）で、カフェインの含有量と検体数の関係を示す。
【０１２２】
【表１４】
【０１２３】
カフェイン含有量０．６％以下のＧＣＡが得られた確率は、５．７％（＝０．１７＋０．５２＋２．１＋２．７％）で、その他の多くのＧＣＡは、目標の低い値のカフェイン含有量ではなく、その割合は、全体の約９４．３％であった。
【０１２４】
また、次の２つの表１５、１６（ＴＡＢＬＥ−１および２）に、カフェイン分析を行ったＧＣＡ３００本のカフェイン含有量を示した。（これらの表は、ＧＣＡの世代とカフェイン含量の分布状況を示す。）この表で示す３００本のカフェイン含量のデータは、先に述べた５８１本の木のうち、Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎが、はっきりしている木が３００本あり、その木からのカフェイン含量のデータである。
【０１２５】
【表１５】
【０１２６】
【表１６】
【０１２７】
これらの表から、カフェイン含有量０．６％以下のＧＣＡの選択率は、Ｆ２において１７．２％〜４０％であるが、Ｆ３、Ｆ４では、６．１〜９．１％と著しく低くなっていることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】コーヒーのカフェイン生合成経路。
【図２】実施例における薄層クロマトグラフィーによる分離の後の定量値（葉）に関するグラフ。
【図３】実施例における薄層クロマトグラフィーによる分離の後の定量値（果実）に関するグラフ。
【図４】カフェイン含有量と検体数の関係に関するグラフ。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ユージノイド種とカネフォラ種を交配してＧＣハイブリッド種を生産する工程、
前記ＧＣハイブリッド種の染色体数を倍化して４倍体ＧＣハイブリッド種を生産する工程、および、
前記４倍体ＧＣハイブリッド種とアラビカ種を交配してＧＣＡハイブリッド種を生産する工程、
を含むことを特徴とするＧＣＡハイブリッド種の作出方法。
【請求項２】
ユージノイド種の種子のカフェイン含有量が０．２１〜０．７６（乾燥重量％）である請求項１に記載のＧＣＡハイブリッド種の作出方法。
【請求項３】
コルヒチンで染色体数を倍化する請求項１または２に記載のＧＣＡハイブリッド種の作出方法。
【請求項４】
前記ＧＣＡハイブリッド種に、さらにアラビカ種または前記ＧＣＡハイブリッド種を１回以上交配してＧＣＡハイブリッド種を生産する工程を含む請求項１〜３のいずれかに記載のＧＣＡハイブリッド種の作出方法。
【請求項５】
得られたＧＣＡハイブリッド種の種子のカフェイン含有量が０．２７５〜１．９７（乾燥重量％）である請求項１〜４のいずれかに記載のＧＣＡハイブリッド種の作出方法。
【請求項６】
ユージノイド種とカネフォラ種を交配してＧＣハイブリッド種を生産し、次いで前記ＧＣハイブリッド種の染色体数を倍化して４倍体ＧＣハイブリッド種を生産し、さらに前記４倍体ＧＣハイブリッド種とアラビカ種を交配して作出されることを特徴とするＧＣＡハイブリッド種。
【請求項７】
ユージノイド種の種子のカフェイン含有量が０．２１〜０．７６（乾燥重量％）である請求項６に記載のＧＣＡハイブリッド種。
【請求項８】
コルヒチンで染色体数を倍化する請求項６または７に記載のＧＣＡハイブリッド種。
【請求項９】
前記ＧＣＡハイブリッド種に、さらにアラビカ種または前記ＧＣＡハイブリッド種を１回以上交配して作出された請求項６〜８のいずれかに記載のＧＣＡハイブリッド種。
【請求項１０】
得られたＧＣＡハイブリッド種の種子のカフェイン含有量が０．２７５〜１．９７（乾燥重量％）である請求項６〜１０のいずれかに記載のＧＣＡハイブリッド種。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれかに記載の作出方法で得られるＧＣＡハイブリッド種を用いた食品。
【請求項１２】
請求項１〜５のいずれかに記載の作出方法で得られるＧＣＡハイブリッド種を用いたコーヒー飲料。
【請求項１】
ユージノイド種とカネフォラ種を交配してＧＣハイブリッド種を生産する工程、
前記ＧＣハイブリッド種の染色体数を倍化して４倍体ＧＣハイブリッド種を生産する工程、および、
前記４倍体ＧＣハイブリッド種とアラビカ種を交配してＧＣＡハイブリッド種を生産する工程、
を含むことを特徴とするＧＣＡハイブリッド種の作出方法。
【請求項２】
ユージノイド種の種子のカフェイン含有量が０．２１〜０．７６（乾燥重量％）である請求項１に記載のＧＣＡハイブリッド種の作出方法。
【請求項３】
コルヒチンで染色体数を倍化する請求項１または２に記載のＧＣＡハイブリッド種の作出方法。
【請求項４】
前記ＧＣＡハイブリッド種に、さらにアラビカ種または前記ＧＣＡハイブリッド種を１回以上交配してＧＣＡハイブリッド種を生産する工程を含む請求項１〜３のいずれかに記載のＧＣＡハイブリッド種の作出方法。
【請求項５】
得られたＧＣＡハイブリッド種の種子のカフェイン含有量が０．２７５〜１．９７（乾燥重量％）である請求項１〜４のいずれかに記載のＧＣＡハイブリッド種の作出方法。
【請求項６】
ユージノイド種とカネフォラ種を交配してＧＣハイブリッド種を生産し、次いで前記ＧＣハイブリッド種の染色体数を倍化して４倍体ＧＣハイブリッド種を生産し、さらに前記４倍体ＧＣハイブリッド種とアラビカ種を交配して作出されることを特徴とするＧＣＡハイブリッド種。
【請求項７】
ユージノイド種の種子のカフェイン含有量が０．２１〜０．７６（乾燥重量％）である請求項６に記載のＧＣＡハイブリッド種。
【請求項８】
コルヒチンで染色体数を倍化する請求項６または７に記載のＧＣＡハイブリッド種。
【請求項９】
前記ＧＣＡハイブリッド種に、さらにアラビカ種または前記ＧＣＡハイブリッド種を１回以上交配して作出された請求項６〜８のいずれかに記載のＧＣＡハイブリッド種。
【請求項１０】
得られたＧＣＡハイブリッド種の種子のカフェイン含有量が０．２７５〜１．９７（乾燥重量％）である請求項６〜１０のいずれかに記載のＧＣＡハイブリッド種。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれかに記載の作出方法で得られるＧＣＡハイブリッド種を用いた食品。
【請求項１２】
請求項１〜５のいずれかに記載の作出方法で得られるＧＣＡハイブリッド種を用いたコーヒー飲料。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１０−３５４１９（Ｐ２０１０−３５４１９Ａ）
【公開日】平成２２年２月１８日（２０１０．２．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１１５８６７（Ｐ２００７−１１５８６７）
【出願日】平成１９年４月２５日（２００７．４．２５）
【出願人】（３９０００６６００）ユーシーシー上島珈琲株式会社 (28)
【出願人】（５０７１３８０２２）ザ ナショナル リサーチ センター フォー ルーラル ディベロプメント (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年２月１８日（２０１０．２．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年４月２５日（２００７．４．２５）
【出願人】（３９０００６６００）ユーシーシー上島珈琲株式会社 (28)
【出願人】（５０７１３８０２２）ザ ナショナル リサーチ センター フォー ルーラル ディベロプメント (1)
【Ｆターム（参考）】
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