等電沈殿を含むキャノーラタンパク質単離物の調製
主に７Ｓキャノーラタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物を、キャノーラ油糧種子粗粉の塩水溶液抽出物から等電沈殿によって形成する。主に２Ｓキャノーラタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物は、等電沈殿ステップからの上澄み液から回収する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の参照）
本出願は、米国特許法第１１９条(ｅ)の下、２００５年９月２１日出願の米国仮特許出願第６０／７１８７５４号の優先権を主張するものである。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、油糧種子粗粉、特にキャノーラ油糧種子粗粉からのタンパク質単離物の調製に関する。
【０００３】
（発明の背景）
本発明の譲渡人に譲渡され、その開示が参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第５８４４０８６号および同第６００５０７６号(「ＭｕｒｒａｙＩＩ」)には、著しい脂肪含量を有するキャノーラ油糧種子粗粉を含めたこのような著しい脂肪含量を有する油糧種子粗粉から、タンパク質単離物を単離する方法が記載されている。この方法に伴うステップには、油糧種子粗粉からタンパク質性物質を可溶化するステップが含まれ、それによって粗粉の脂肪も可溶化され、得られるタンパク質水溶液から脂肪が除去される。脂肪除去ステップの前または後に、残留油糧種子粗粉からタンパク質水溶液を分離することができる。次いで、脱脂したタンパク質溶液を濃縮してタンパク質濃度を高めると同時に、イオン強度を実質的に一定に維持し、その後、濃縮タンパク質溶液をさらなる脂肪除去ステップにかけることができる。次いで、濃縮タンパク質溶液を希釈して、高度に凝集したタンパク質分子の雲状の塊を、ミセル形態の個別のタンパク質液滴として形成させる。タンパク質ミセルを沈降させて、「タンパク質ミセル塊」またはＰＭＭと呼ばれる、凝集し合体した、濃い非晶質の粘着性グルテン様タンパク質単離物塊を形成し、それを残留水相から分離し、乾燥する。
【０００４】
該タンパク質単離物は、少なくとも約９０ｗｔ％のタンパク質含量を有し(ケルダールまたは同等の方法Ｎ×６．２５によって決定される)、実質的に非変性であり(示差走査熱量測定によって決定される)、残留脂肪含量が低い。本発明で使用される「タンパク質含量」という用語は、乾燥重量ベースで表したタンパク質単離物中のタンパク質の量を指す。この手順を使用して得られたタンパク質単離物の収率は、乾燥タンパク質単離物として回収される油糧種子粗粉から抽出されたタンパク質の割合から見て、一般に４０ｗｔ％未満、典型的には約２０ｗｔ％であった。
【０００５】
前記特許に記載された手順は、その開示が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第４２０８３２３号(ＭｕｒｒａｙＩＢ）に記載のように、油糧種子を含めた様々なタンパク質供給材料からタンパク質単離物を形成する手順の改変法および改善法として開発された。１９８０年、米国特許第４２０８３２３号が発行されたときに利用可能であった油糧種子粗粉は、ＭｕｒｒａｙＩＩ特許の時点ではキャノーラ油糧種子粗粉の脂肪汚染濃度を有しておらず、その結果、米国特許第４２０８３２３号の手順では、ＭｕｒｒａｙＩＩの方法に従って処理したこのような油糧種子粗粉から９０ｗｔ％以上のタンパク質含量を有するタンパク質性物質を生成することができない。米国特許第４２０８３２３号には、菜種(キャノーラ)を出発材料として使用して実施したという具体的な実験は記載されていない。
【０００６】
米国特許第４２０８３２３号それ自体は、希釈してＰＭＭを形成する前に濃縮ステップを導入することによって、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第４１６９０９０号および同第４２８５８６２号(ＭｕｒｒａｙＩＡ)に記載の方法の改善法となるように設計された。後者のステップは、ＭｕｒｒａｙＩＡの方法に関して、タンパク質単離物の収率を約２０％から改善する働きをした。
【０００７】
本発明の譲渡人に譲渡され、その開示が参照によって本明細書に組み込まれる、２００２年５月３日出願の同時係属中の米国特許出願第１０／１３７３９１号(米国特許出願公開第２００３０１２５５２６号)、２００４年６月９日出願の第１０／４７６２３０号(米国特許出願公開第２００４０２５４３５３号)(ＷＯ０２／０８９５９７）には、少なくとも約１００ｗｔ％のタンパク質(Ｎ×６．２５)を含有する高純度のタンパク質単離物を生成する方法が記載されている。前記米国特許出願において、タンパク質単離物は、食品用塩溶液を用いて油糧種子粗粉を抽出する方法によって生成され、得られたタンパク質溶液を、色素吸着剤での最初の処理後に所望ならば少なくとも約２００ｇ／Ｌのタンパク質含量に濃縮し、濃縮したタンパク質溶液を冷水で希釈してタンパク質ミセルを形成し、それを沈降させて、「タンパク質ミセル塊」またはＰＭＭと呼ばれる、凝集し合体した、濃い非晶質の粘着性グルテン様タンパク質単離物塊を形成し、それを残留水相から分離し、そのままでまたは乾燥して使用することができる。
【０００８】
上記方法の一実施形態では、特に米国特許出願第１０／１３７３９１号および同第１０／４７６２３０号に記載のように、ＰＭＭ沈降ステップからの上澄み液を処理して、湿潤ＰＭＭおよび上澄み液から、乾燥タンパク質を含むタンパク質単離物を回収する。この手順は、最初に限外濾過膜を使用して上澄み液を濃縮し、濃縮上澄み液を湿潤ＰＭＭと混合し、その混合物を乾燥することによって行うことができる。得られたキャノーラタンパク質単離物は、少なくとも約９０ｗｔ％のタンパク質、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％のタンパク質(Ｎ×６．２５)の高い純度を有する。
【０００９】
上記方法の別の実施形態では、特に米国特許出願第１０／１３７３９１号および同第１０／４７６２３０号に記載のように、ＰＭＭ沈降ステップからの上澄み液を処理して、上澄み液からタンパク質を回収する。この手順は、最初に限外濾過膜を使用して上澄み液を濃縮し、その濃縮物を乾燥することによって行うことができる。得られたキャノーラタンパク質単離物は、少なくとも約９０ｗｔ％、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％のタンパク質(Ｎ×６．２５)の高い純度を有する。
【００１０】
上記の米国特許出願の手順は、本質的には回分式手順である。本発明の譲渡人に譲渡され、その開示が参照によって本明細書に組み込まれる、２００２年１１月１９日出願の同時係属中の米国特許出願第１０／２９８６７８号(米国特許出願公開第２００４００３９１７４号)(ＷＯ０３／０４３４３９）には、キャノーラタンパク質単離物を生成するための連続法が記載されている。それによれば、キャノーラ油糧種子粗粉を塩溶液と連続的に混合し、その混合物をパイプを介して搬送しながら、キャノーラ油糧種子粗粉からタンパク質を抽出してタンパク質水溶液を形成し、そのタンパク質水溶液を残留キャノーラ油糧種子粗粉から連続的に分離し、そのタンパク質水溶液を選択的膜操作によって連続的に搬送して、タンパク質水溶液のタンパク質含量を少なくとも約２００ｇ／Ｌに増大すると同時にイオン強度を実質的に一定に維持し、得られた濃縮タンパク質溶液を冷水と連続的に混合してタンパク質ミセルを形成させ、沈降容器に所望の量のＰＭＭが蓄積するまで、タンパク質ミセルを連続的に沈降させると同時に上澄み液を連側的にオーバーフローさせる。ＰＭＭを沈降容器から取り出し乾燥することができる。そのＰＭＭは、少なくとも約９０ｗｔ％(Ｎ×６．２５)、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％のタンパク質含量を有する。
【００１１】
このような手順では、濃縮タンパク質溶液を冷却水で希釈してＰＭＭを沈殿させることによって、キャノーラタンパク質単離物を回収する。さらに、ＰＭＭ沈殿ステップからの上澄み液から、さらなるキャノーラタンパク質単離物を回収することができる。
【００１２】
本発明の譲渡人に譲渡され、その証拠が参照によって本明細書に組み込まれる、同時係属中の米国特許出願第１１／０３８０８６号(米国特許出願公開第２００５０１８１１１２号)(ＷＯ００５／０６７７２９)に記載のように、ＰＭＭ沈殿ステップからの上澄み液を熱処理して、その上澄み液から７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を沈殿させることができる。熱処理した上澄み液から続いて回収した２Ｓタンパク質は、様々なｐＨ値の水性媒体への溶解度が改善されており、清涼飲料に溶液の透明性の改善を付与し、したがってタンパク質強化清涼飲料を提供することができる。
【００１３】
（発明の概要）
驚くべきことに、濃縮キャノーラタンパク質溶液を酸性化した場合、ＰＭＭ経路によって得られるキャノーラタンパク質単離物に組成上類似したキャノーラタンパク質単離物が沈殿し、次いで沈殿したキャノーラタンパク質単離物を分離した後、上澄み液を処理して、ＰＭＭ沈殿からの上澄み液から得られるものに組成上類似したさらなるキャノーラタンパク質単離物が得られることがここで見出された。したがってこの手順は、濃縮タンパク質溶液からキャノーラタンパク質単離物を得る代替方式となっている。等電沈殿手順の結果生じる１つの利益は、ＰＭＭ由来のタンパク質単離物よりも著しく高い水結合能を有するキャノーラタンパク質単離物が生成されることである。
【００１４】
本発明の別の態様による代替手順では、ＰＭＭを塩水溶液に再懸濁し、得られた溶液を酸性化することによって、ＰＭＭを等電沈殿物に変換することができる。ＰＭＭは、湿潤ペレットから、またはあまり好ましくはないが乾燥単離物から再懸濁することができる。この手順によって、等電沈殿物に変換されるＰＭＭ材料よりもかなり高い水結合能を有する等電沈殿キャノーラタンパク質単離物が生成される。
【００１５】
本発明の別の態様では、等電沈殿を濃縮ステップの前に行い、等電沈殿からの上澄み液を処理して、さらなるタンパク質単離物をそれから回収する。
【００１６】
したがって、本発明の一態様において、（ａ）油糧種子粗粉を抽出して、油糧種子粗粉のタンパク質を可溶化し、約５〜約６．８のｐＨを有するタンパク質水溶液を形成するステップ、（ｂ）残留油糧種子粗粉からタンパク質水溶液を分離するステップ、（ｃ）タンパク質水溶液を酸性化して、少なくとも約９０ｗｔ％(Ｎ×６．２５)のタンパク質含量を有するタンパク質単離物をそれから沈殿させるステップ、および（ｄ）上澄み液から沈殿タンパク質単離物を分離するステップを含む、タンパク質単離物の調製方法が提供される。
【００１７】
本発明は、特に、キャノーラタンパク質単離物の調製に関する。したがって、本発明の別の態様において、（ａ）キャノーラ油糧種子粗粉を抽出して、キャノーラ油糧種子粗粉のキャノーラタンパク質を可溶化し、約５〜約６．８のｐＨを有するタンパク質水溶液を形成するステップ、（ｂ）残留キャノーラ油糧種子粗粉からタンパク質水溶液を分離するステップ、（ｃ）タンパク質水溶液を約３〜約４のｐＨに酸性化して、少なくとも約９０ｗｔ％(Ｎ×６．２５)のタンパク質含量を有し、主に７Ｓキャノーラタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物をそれから沈殿させるステップ、および（ｄ）上澄み液から沈殿キャノーラタンパク質単離物を分離するステップを含む、キャノーラタンパク質単離物の調製方法が提供される。
【００１８】
本発明のさらなる一態様において、（ａ）油糧種子粗粉を抽出して、油糧種子粗粉のタンパク質を可溶化し、約５〜約６．８のｐＨを有するタンパク質水溶液を形成するステップ、（ｂ）残留油糧種子粗粉からタンパク質水溶液を分離するステップ、（ｃ）選択的膜技術を使用して、タンパク質水溶液のタンパク質濃度を増大すると同時にイオン強度を実質的に一定に維持して、濃縮タンパク質溶液を提供するステップ、（ｄ）濃縮タンパク質溶液を約１５℃未満の温度を有する冷却水で希釈して、水溶液中にミセル形態の個別のタンパク質粒子を形成させるステップ、（ｅ）タンパク質ミセルを沈降させて、非晶質で粘着性の、ゼラチン質のグルテン様タンパク質ミセル塊を形成するステップ、（ｆ）少なくとも約９０ｗｔ％、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％(Ｎ×６．２５)のタンパク質含量を有するタンパク質ミセル塊を、上澄み液から分離するステップ、（ｇ）タンパク質ミセル塊の水溶液を形成するステップ、（ｈ）タンパク質ミセル塊の水溶液を酸性化して、少なくとも約９０ｗｔ％、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有するタンパク質単離物をそれから沈殿させるステップ、および（ｉ）上澄み液から沈殿タンパク質単離物を分離するステップを含む、タンパク質単離物の調製方法が提供される。
【００１９】
本発明の方法に従って生成されたキャノーラタンパク質単離物は、加工食品のタンパク質強化、油の乳化、焼成食品の質量増し(ｂｏｄｙ ｆｏｒｍｅｒ)、および製品にガスを封入する発泡剤などの、タンパク質単離物の通常の用途および新規用途に使用することができる。さらに、タンパク質単離物は、粗粉類似物に有用なタンパク質繊維に形成することができ、結合剤として卵白が使用される食品の卵白代用物または増量剤として使用することができる。以下に示したデータから分かるように、等電沈殿したキャノーラタンパク質単離物は、特に水結合剤／増粘剤としての使用が見出されている。上澄み液由来のキャノーラタンパク質単離物は、特に透明タンパク質強化清涼飲料を含めた酸性化飲料への使用が見出されている。キャノーラタンパク質単離物は、栄養補助食品として使用することができる。キャノーラタンパク質単離物の他の使用には、ペットフード、飼料、ならびに工業用途および化粧品用途、および個人用手入れ用品における使用がある。
【００２０】
（発明の一般的な説明）
キャノーラタンパク質単離物を分離する方法の最初のステップには、油糧種子粗粉、特にキャノーラ粗粉からタンパク質性物質を可溶化することが含まれるが、この方法は、大豆、従来の菜種、従来の亜麻、Ｌｉｎｏｌａ(登録商標)、ヒマワリ、およびカラシナ油糧種子粗粉などの他の油糧種子粗粉に適用することができる。本発明は、より具体的には、キャノーラ種子粗粉に関して本明細書に記載される。
【００２１】
キャノーラ種子粗粉から回収したタンパク質性物質は、キャノーラ種子に天然に存在するタンパク質でよく、またはそのタンパク質材料は、遺伝子操作によって改変されてはいるが、天然タンパク質の特徴的な疎水性および極性を有するタンパク質でよい。キャノーラ油糧種子は、菜種または菜種油としても知られている。
【００２２】
塩の存在によって、油糧種子粗粉からの可溶性タンパク質の除去が増進されるため、タンパク質の可溶化は、食品用塩溶液を使用することによって最も効果的に行われる。キャノーラタンパク質単離物が食品以外の使用に企図される場合には、非食品用化学物質を使用することができる。食品用塩は、通常塩化ナトリウムであるが、塩化カリウムなどの他の塩を使用することもできる。相当多量のタンパク質の可溶化を実施可能にするために、食品用塩溶液は、少なくとも約０．０５、好ましくは少なくとも約０．１のイオン強度を有する。塩溶液のイオン強度が増大するに従って、油糧種子粗粉中のタンパク質の可溶化の度合いは最初増大し、その後最大値に達する。その後はイオン強度がいくら増大しようとも可溶化タンパク質全体を増加することはない。タンパク質の可溶化を最大にする食品用塩溶液のイオン強度は、当該の塩および選択される油糧種子粗粉に応じて変わる。
【００２３】
食品用塩水溶液中に酸化防止剤が存在してもよい。酸化防止剤は、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸などの任意の好都合な酸化防止剤が可能である。可溶化ステップで使用する酸化防止剤の量は、約０．０１〜約１ｗｔ％で変わることができ、好ましくは約０．０５ｗｔ％である。酸化防止剤は、タンパク質水溶液に存在するフェノール成分の酸化を抑制する働きをする。
【００２４】
回分式方法では、タンパク質の塩可溶化を、少なくとも約５℃、好ましくは最大約３５℃の温度で、好ましくは可溶化時間を短縮するために攪拌を伴って通常約１０〜約６０分行う。可溶化は、全体的に高い生成収率を得るために、油糧種子粗粉から実質的に最大量のタンパク質を抽出するように行うことが好ましい。
【００２５】
可溶化は、約５℃の温度より低いと実際的ではない程に遅くなるので、約５℃の下限温度が選択されると同時に、回分式モードにおいて温度レベルが高くなるとこの方法が非経済的となることから、約３５℃の好ましい上限温度が選択される。
【００２６】
連続式方法では、キャノーラ油糧種子粗粉からのタンパク質の抽出を、キャノーラ油糧種子粗粉からのタンパク質の連続抽出の実施に合致する任意の方式で行う。一実施形態では、キャノーラ油糧種子粗粉を塩溶液と連続的に混合し、その混合物を、ある長さを有するパイプまたは導管を介して、本明細書に記載のパラメータによる所望の抽出を行うのに十分な滞留時間に合わせた流速で搬送する。このような連続手順では、好ましくは、キャノーラ油糧種子粗粉から実質的に最大量のタンパク質を抽出するように可溶化を行うために、塩可溶化ステップを迅速に最大約１０分間行う。連続手順における可溶化は、高温で、好ましくは約３５℃を超え、一般には最大約６５℃、またはそれ以上で行うことが好ましい。
【００２７】
塩水溶液およびキャノーラ油糧種子粗粉は、約５〜約６．８の中性ｐＨを有し、約５．３〜約６．２のｐＨ値が好ましい。
【００２８】
食品用塩溶液のｐＨは、抽出ステップで使用するために、必要に応じて任意の好都合な食品用の酸、通常は塩酸、または食品用アルカリ、通常は水酸化ナトリウムを使用することによって、約５〜約６．８の範囲の任意の所望の値に調節することができる。キャノーラタンパク質単離物が食品以外の使用に企図される場合には、非食品用化学物質を使用することができる。
【００２９】
可溶化ステップの際の食品用塩溶液中の油糧種子粗粉の濃度は、幅広く変わり得る。一般的な濃度値は約５〜約１５％ｗ／ｖである。
【００３０】
塩水溶液を用いたタンパク質抽出ステップは、キャノーラ粗粉に存在し得る脂肪を可溶化するという追加の効果を有し、結果として該脂肪は水相中に存在する。
【００３１】
抽出ステップから得られたタンパク質溶液は、一般に約５〜約４０ｇ／Ｌ、好ましくは約１０〜約３０ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する。
【００３２】
次いで、抽出ステップから得られた水相を、デカンタ型遠心分離機を使用するなどの任意の好都合な方式で残留キャノーラ粗粉から分離し、その後ディスク型遠心分離および／または濾過によって残留粗粉を除去することができる。分離した残留粗粉は乾燥して処分することができる。
【００３３】
粉末状活性炭または他の色素吸着剤を分離タンパク質水溶液と混合し、次いで濾過によって吸着剤を好都合に除去してタンパク質溶液を提供することによって、最終キャノーラタンパク質単離物の色を、薄い色で、より淡い黄色に改善することができる。色素を除去するために、分離タンパク質水溶液のダイアフィルトレーションを、濃縮の前または後に、以下に記載のように用いることもできる。
【００３４】
このような色素除去ステップは、任意の好都合な条件下、一般には分離タンパク質水溶液の周囲温度で、任意の適切な色素吸着剤を使用して実施することができる。粉末状活性炭については、約０．０２５％〜約５％ｗ／ｖ、好ましくは約０．０５％〜約２％ｗ／ｖの量が使用される。
【００３５】
前記米国特許第５８４４０８６号および同第６００５０７６号のように、キャノーラ種子粗粉が相当多量の脂肪を含む場合、分離タンパク質水溶液および以下に述べる濃縮タンパク質水溶液に対して、前記特許に記載の脱脂ステップを行うことができる。色を改善するステップが実施される場合、かかるステップは第１の脱脂ステップの後に行うことができる。
【００３６】
食品用塩水溶液を用いて油糧種子粗粉を抽出する代わりに、水だけを使用してかかる抽出を行うこともできるが、水だけを使用する場合、油糧種子粗粉からのタンパク質抽出量が、食品用塩水溶液の場合よりも減少する傾向にある。このような代替案を用いる場合、以下に記載の濃縮ステップ中、溶液にタンパク質を維持するために、残留油糧種子粗粉から分離した後のタンパク質溶液に上記の濃度の食品用塩を添加することができる。色除去ステップおよび／または第１の脂肪除去ステップを実施する場合、食品用塩は、一般にこのような操作の完了後に添加される。
【００３７】
次いで、タンパク質水溶液を濃縮してそのタンパク質濃度を増大すると同時に、そのイオン強度を実質的に一定に維持する。このような濃縮は、一般に１０〜約３００ｇ／Ｌまたはそれ以上、好ましくは約５０〜約１００ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する濃縮タンパク質溶液を提供するように行われる。
【００３８】
濃縮ステップは、回分式または連続式操作に合致する任意の好都合な方式で、例えば、限外濾過またはダイアフィルトレーションなどの任意の好都合な選択的膜技術を用いて、異なる膜材料および構成を考慮して、約３０００〜約１０００００ダルトン、好ましくは約５０００〜約１００００ダルトンなどの適切な分子量カットオフを有し、連続式操作に関してはタンパク質水溶液が膜を通過する際に所望の濃度を可能にする寸法の、中空糸膜またはスパイラル膜などの膜を使用して行うことができる。
【００３９】
次いで濃縮タンパク質溶液を、抽出溶液と同じモル濃度およびｐＨの塩水溶液を使用して、ダイアフィルトレーションステップにかけることができる。このようなダイアフィルトレーションは、約２〜約２０体積のダイアフィルトレーション溶液、好ましくは約５〜約１０体積のダイアフィルトレーション溶液を使用して行うことができる。ダイアフィルトレーション操作では、透過液と共に膜に通すことによってさらなる量の汚染物質をタンパク質水溶液から除去する。ダイアフィルトレーション操作は、透過液中に相当多量のさらなるフェノール成分および可視色が存在しなくなるまで行うことができる。このようなダイアフィルトレーションは、異なる膜材料および構成を考慮して、約３０００〜約１０００００ダルトン、好ましくは約５０００〜約１００００ダルトンの範囲の分子量カットオフを有する膜を使用して行うことができる。
【００４０】
ダイアフィルトレーションステップの少なくとも一部の間、ダイアフィルトレーション媒体中に酸化防止剤が存在してもよい。酸化防止剤は、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸などの任意の好都合な酸化防止剤が可能である。ダイアフィルトレーション媒体中に使用する酸化防止剤の量は、使用する材料に依存し、約０．０１〜約１ｗｔ％で変わることができ、好ましくは約０．０５ｗｔ％である。酸化防止剤は、濃縮キャノーラタンパク質単離物溶液に存在するフェノール成分の酸化を抑制する働きをする。
【００４１】
濃縮ステップおよびダイアフィルトレーションステップは、任意の好都合な温度で、一般には約２０℃〜約６０℃、好ましくは約２０〜約３０℃で、所望の濃度を実現する時間をかけて行うことができる。使用する温度および他の条件は、濃縮を行うために使用する膜装置および溶液の所望のタンパク質濃度にある程度依存する。
【００４２】
周知のように、限外濾過および類似の選択的膜技術は、低分子量種をそれに通すと同時に、それより高い分子量種が通るのを防止する。低分子量種には、食品用塩のイオン種だけでなく、炭水化物、色素、および非栄養因子などの供給材料から抽出された低分子量材料、ならびにタンパク質の低分子量形態も含まれる。膜の分子量カットオフは、通常、溶液中に相当高い割合のタンパク質を確実に保持すると同時に汚染物質を通すように、異なる膜材料および構成を考慮して選択される。
【００４３】
濃縮し、場合によってはダイアフィルトレーションしたタンパク質溶液を、米国特許第５８４４０８６号および第６００５０７６号に記載のように、必要に応じてさらなる脱脂操作にかけることができる。
【００４４】
濃縮し、場合によってはダイアフィルトレーションしたタンパク質溶液を、上記の色除去操作の代替としての色除去操作にかけることができる。本明細書では、粉末状活性炭も、顆粒状活性炭（ＧＡＣ）と同様に使用することができる。色吸収剤として使用できる別の材料は、ポリビニルピロリドンである。
【００４５】
色吸収剤処理ステップは、任意の好都合な条件下、一般にはキャノーラタンパク質溶液の周囲温度で実施することができる。粉末状活性炭については、約０．０２５％〜約５％ｗ/ｖ、好ましくは約０．０５％〜約２％ｗ/ｖの量を使用することができる。色吸収剤としてポリビニルピロリドンを使用する場合、約０．５％〜約５％ｗ/ｖ、好ましくは約２％〜約３％ｗ/ｖの量を使用することができる。色吸収剤は、濾過などの任意の好都合な手段によって、キャノーラタンパク質溶液から除去することができる。
【００４６】
任意選択の色除去ステップから得られた、濃縮し、場合によってはダイアフィルトレーションしたタンパク質溶液を、低温殺菌にかけて、保存またはその他の結果として元の粗粉に存在し得る細菌を死滅させ、抽出ステップでその粗粉からキャノーラタンパク質単離物溶液に抽出することができる。かかる低温殺菌は任意の所望の低温殺菌条件下で行うことができる。一般に、濃縮し、場合によってはダイアフィルトレーションしたタンパク質溶液を、約５５℃〜約７０℃、好ましくは約６０℃〜約６５℃の温度に約１０〜約１５分、好ましくは約１０分間加熱する。次いで、低温殺菌した濃縮タンパク質溶液を、以下に記載のさらなる処理のために、好ましくは約２５℃〜約４０℃の温度まで冷却することができる。
【００４７】
濃縮し、場合によってはダイアフィルトレーションし、場合によっては低温殺菌したタンパク質水溶液の最適なタンパク質濃度は約５〜約１０ｗｔ％である。というのは、これより高い濃度では、酸性化ステップで溶液を均質に酸性化し、沈殿した固体を分離することを困難にする粘性が生じるからである。この最適なタンパク質濃度は、タンパク質水溶液を必要な濃度に濃縮することによって、または最初にタンパク質水溶液を約２０〜約２５ｗｔ％それ以上の高い濃度に濃縮し、次いで濃縮タンパク質溶液を食品用塩水溶液で約５〜約１０ｗｔ％の範囲に希釈することによって達成することができる。
【００４８】
本明細書でもたらされる等電沈殿物の形成に関して、濃縮し、場合によってはダイアフィルトレーションし、場合によっては低温殺菌したタンパク質溶液は、少なくとも約１ｍＳ、好ましくは約１０〜約２０ｍＳの導電率を有するべきである。
【００４９】
次いで、濃縮し、場合によってはダイアフィルトレーションし、場合によっては低温殺菌したタンパク質溶液を、塩酸などの任意の好都合な酸を使用して、約１０℃〜約７０℃、好ましくは約２０℃〜約４０℃の温度で、約３．０〜約４．０、好ましくは約３．５のｐＨに酸性化して、キャノーラタンパク質単離物の沈殿物を形成させる。その沈殿物を上澄み液から回収し、噴霧乾燥、凍結乾燥、または真空式ドラム乾燥などの任意の好都合な技術によって乾燥して、キャノーラタンパク質単離物を提供することができる。乾燥等電沈殿(ＩＰ)由来のキャノーラタンパク質単離物は、少なくとも約９０ｗｔ％(Ｎ×６．２５)、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％の高いタンパク質含量を有する。
【００５０】
所望ならば、等電沈殿ステップは、濃縮ステップを行わずに直接キャノーラタンパク質溶液で行うことができる。前記の色除去、ダイフィルトレーション、および低温殺菌の任意ステップの１つまたは複数を、等電沈殿ステップの前にキャノーラタンパク質溶液で行うことができる。沈殿キャノーラタンパク質単離物を上澄み液から回収し、乾燥する。
【００５１】
等電沈殿からの上澄み液は、沈殿ステップで沈殿しなかった著しく多量のキャノーラタンパク質を含有しており、主に２Ｓタンパク質の形態のキャノーラタンパク質単離物をそれから回収するために処理される。等電沈殿物の除去後、酸性化ステップからの上澄み液を濃縮して、そのタンパク質濃度を増大することができる。このような濃縮は、限外濾過などの任意の好都合な選択的膜技術を使用し、タンパク質供給材料から抽出された塩および他の低分子量の非タンパク質材料を含む低分子量種を膜に通すと同時に、キャノーラタンパク質を溶液に保持する適切な分子量カットオフを有する膜を使用して行われる。異なる膜材料および構成を考慮して、約３０００〜１０００００ダルトン、好ましくは約５０００〜約１００００ダルトンの分子量カットオフを有する限外濾過膜を使用することができる。この方式で上澄み液を濃縮することによって、タンパク質を回収するために乾燥を要する液体の体積も低減される。上澄み液は一般に、乾燥前に約１００〜約４００ｇ／Ｌ、より好ましくは約２００〜約３００ｇ／Ｌのタンパク質濃度に濃縮される。このような濃縮操作は、タンパク質溶液濃縮ステップに関して先に記載したように、回分式モードまたは連続操作で実施することができる。
【００５２】
濃縮上澄み液を、抽出溶液として水を使用するダイアフィルトレーションステップにかけて、濃縮上澄み液から塩および他の汚染物質を除去することができる。このようなダイアフィルトレーションは、約２〜約２０体積の水、好ましくは約５〜約１０体積の水を使用して行うことができる。このようなダイアフィルトレーションは、異なる膜材料および構成を考慮して、約３０００〜約１０００００ダルトン、好ましくは約５０００〜約１００００ダルトンの範囲の分子量カットオフを有する膜を使用して行うことができる。
【００５３】
ダイアフィルトレーションステップの少なくとも一部の間、ダイアフィルトレーション媒体中に酸化防止剤が存在してもよい。酸化防止剤は、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸などの任意の好都合な酸化防止剤であってよい。ダイアフィルトレーション媒体中に使用する酸化防止剤の量は、約０．０１〜約１ｗｔ％で変わることができ、好ましくは約０．０５ｗｔ％である。
【００５４】
濃縮し、場合によってはダイアフィルトレーションした上澄み液を、噴霧乾燥、凍結乾燥、または真空式ドラム乾燥などの任意の好都合な技術によって乾燥して乾燥形態にし、さらなるキャノーラタンパク質単離物を提供する。かかるさらなるキャノーラタンパク質単離物は、約９０ｗｔ％を超える高いタンパク質含量を有し、好ましくはタンパク質を少なくとも約１００ｗｔ％有する（ケルダールＮ×６．２５として算出）。
【００５５】
所望ならば、上澄み液を前記米国特許出願第１１／０３８０８６号の熱処理ステップにかけて、存在する７Ｓタンパク質および任意の１２Ｓタンパク質を上澄み液から沈殿させて、高い割合の２Ｓタンパク質を有する２Ｓタンパク質単離物を回収することができる。
【００５６】
このような熱処理は、濃縮上澄み液に存在する７Ｓの割合を低減するのに十分な、好ましくは７Ｓタンパク質の割合をかなり大きな程度低減するのに十分な温度および時間プロファイルを使用して行うことができる。一般に、上澄み液の７Ｓタンパク質含量は、熱処理によって、少なくとも約５０ｗｔ％、好ましくは少なくとも約７５ｗｔ％低減される。一般に、熱処理は、約７０℃〜約１００℃、好ましくは約７５℃〜約９５℃の温度で、約２〜約３０分間、好ましくは約５〜約１５分間行うことができる。沈殿した７Ｓタンパク質は、遠心分離または濾過などの任意の好都合な方式で除去することができる。
【００５７】
熱処理操作は、上澄み液の濃縮の前に行うことができるが、好ましくは濃縮ステップの後に行われる。熱処理ステップは、等電沈殿ステップから得られた上澄み液で行ってもよく、あるいは７Ｓおよび１２Ｓタンパク質が低い酸性値ではより分解しやすく、したがって沈殿しやすいことから、上澄み液のｐＨを低い酸性値に調節した後に行ってもよい。上澄み液のｐＨは、約５〜約６．８、好ましくは約５．８〜約６．２のｐＨに調節することができる。このようなｐＨ調節は、水酸化ナトリウム水溶液などの通常の任意のアルカリ化剤を使用して実施することができる。このような熱処理後、ｐＨはより酸性値に調節され、好ましくは約５〜約１０ｗｔ％の範囲にすることができる。
【００５８】
さらに上澄み液は、濃縮前もしくは濃縮後、および／または熱処理前もしくは熱処理後に、上記の量の粉末状活性炭、顆粒状活性炭、および／またはポリビニルピロリドンなどの任意の通常の色素吸着剤を使用する上記の色除去操作の代替として、またはそれに追加されるステップとしての、最終生成物の色を改善する色除去操作にかけることができる。
【００５９】
所望ならば、湿潤等電沈殿物の少なくとも一部を、混合タンパク質ストリームを乾燥する前に、任意の好都合な技術によって濃縮上澄み液の少なくとも一部分と混合し、混合キャノーラタンパク質単離物組成物を提供することができる。一緒に混合したタンパク質性物質の相対割合は、所望のプロファイルの２Ｓ/７Ｓ/１２Ｓタンパク質を有する生成キャノーラタンパク質単離物組成物を提供するように選択することができる。あるいは、乾燥タンパク質単離物は、任意の所望の割合で混合して、所望のいかなる特定の２Ｓ/７Ｓ/１２Ｓタンパク質プロファイルもその混合物に付与することができる。混合したキャノーラタンパク質単離物組成物は、約９０ｗｔ％超、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％の高いタンパク質含量を有する(ケルダールＮ×６．２５として算出)。
【００６０】
濃縮上澄み液のわずか一部を等電沈殿物のわずか一部と混合し、得られた混合物を乾燥する別の代替手順では、濃縮上澄み液の残りを、等電沈殿物の残りのいずれかとして乾燥することができる。さらに、乾燥等電沈殿物および乾燥上澄み液を、上記の任意の所望の相対割合で乾燥混合することもできる。
【００６１】
この方式で操作することによって、多くのキャノーラタンパク質単離物を、乾燥等電沈殿物、乾燥上澄み液の形態で回収することができ、等電沈殿由来のキャノーラタンパク質単離物および上澄み液由来のキャノーラタンパク質単離物が、組成物における２Ｓ/７Ｓ/１２Ｓタンパク質の異なる割合を基にして異なる機能特性および栄養特性を得るのに望ましい、一般には重量で約５：９５〜約９５：５の様々な重量割合の乾燥混合物の形態で回収することもできる。
【００６２】
先に記載したように、等電沈殿に由来すると同時に少なくとも約９０ｗｔ％(Ｎ×６．２５)、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％のタンパク質含量を有するキャノーラタンパク質は、前記米国特許出願第１０／１３７３９１号および同第１０／４７６６３０号の手順に従って、濃縮し、場合によってはダイアフィルトレーションし、場合によっては低温殺菌したタンパク質溶液を希釈することによって生成したＰＭＭから生成することができる。
【００６３】
好ましくは湿潤形態であるが乾燥形態も可能であるＰＭＭを、高温を用いることもできるが好ましくは周囲温度で、少なくとも約０．０５、好ましくは少なくとも約０．１のイオン強度を有する塩化ナトリウムなどの食品用塩溶液に溶かして、一般に約１〜約３０ｗｔ％、またはそれ以上、好ましくは約５〜約１０ｗｔ％のタンパク質濃度を有するタンパク質水溶液を形成することができる。次いで、得られたタンパク質水溶液を上記の等電沈殿ステップにかける。
【００６４】
上記のように、また以下の実施例に示すように、等電沈殿したキャノーラタンパク質単離物は、ＰＭＭ由来のキャノーラタンパク質単離物よりもかなり高い水結合能を有する。この手順を使用すると、ＰＭＭを等電沈殿物に変換することによって、ＰＭＭ沈殿ステップからの上澄み液に由来する高度可溶性のキャノーラタンパク質単離物、および高い水結合能のキャノーラタンパク質単離物の生成が可能になる。
【００６５】
（実施例）
実施例１：
この実施例は、本発明の一実施形態のキャノーラタンパク質単離物の調製を示すものである。
【００６６】
市販のキャノーラ油糧種子粗粉１５０ｋｇを、０．１ＭのＮａＣｌ１０００Ｌに６０℃で添加し、５分間攪拌して、タンパク質水溶液を提供する。
【００６７】
タンパク質含量１６．８ｇ／Ｌを有する浄化したキャノーラタンパク質溶液を、それぞれ５０００および１００００ダルトンの分子量カットオフを有する二フッ化ポリビニルジエン(ＰＶＤＦ)膜およびポリエーテルスルホン(ＰＥＳ)膜を有する限外濾過システム(ＵＦ１)で、６０℃で濃縮することによって体積を６０Ｌに低減した。次いで、限外濾過したキャノーラタンパク質溶液を、それぞれ５０００および１００００ダルトンの分子量カットオフを有するＰＶＤＦ膜およびＰＥＳ膜を使用するダイアフィルトレーションシステムで、アスコルビン酸０．０５ｗｔ％を含有する０．１ＭのＮａＣｌ溶液を使用して６０℃で５回ダイアフィルトレーションして、タンパク質含量が１７４．７ｇ／Ｌの最終体積４５Ｌにした。
【００６８】
濃縮し、ダイアフィルトレーションしたキャノーラタンパク質溶液(ＵＦ１保持液)のサンプル４Ｌを、０．１ＮａＣｌの１２Ｌと混合して、タンパク質濃度を４６．８ｇ／Ｌに調節した。酸性化キャノーラタンパク質溶液のｐＨが３．５になるまで、濃縮ＨＣＬを希釈溶液に２２℃で添加して等電沈殿を行った。
【００６９】
サンプルが濁り、１５分間静置した。次いでサンプルを、４×１Ｌの回分で、７１００ｇで１５分間の遠心分離にかけて沈殿物を収集した。収集した沈殿物(ＩＥＰ沈殿物)を、上澄み液から分離し凍結乾燥した。乾燥沈殿物(Ｃ３０２)は、１０２．４３ｗｔ％(Ｎ×６．２５)ｄ.ｂ.のタンパク質含量を有していることが見出された(タンパク質のパーセンテージ値は、ＬＥＣＯ ＦＰ３２８ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｏｒを使用して決定した）。
【００７０】
遠心分離からの上澄み液約１６Ｌ(ＩＥＰ上澄み液)を、１０００００ダルトンの分子量カットオフを有するＰＥＳ膜を使用する限外濾過システム(ＵＦ２)で３Ｌに濃縮した。次いで濃縮上澄み液を、１０００００ダルトンの分子量カットオフを有するＰＥＳ膜を使用するダイアフィルトレーションシステムで、９体積の水を用いてダイアフィルトレーションして、タンパク質含量が７２．１ｇ／Ｌの最終体積３．５Ｌにした。タンパク質溶液を噴霧乾燥した。
【００７１】
乾燥タンパク質(Ｃ２０２)は、１０４．０５ｗｔ％(Ｎ×６．２５）ｄ.ｂ.のタンパク質含量を有していることが見出された。
【００７２】
実施例２：
この実施例は、前記米国特許出願第１０/１３７３９１号の手順による、キャノーラタンパク質単離物のサンプルの調製を記載するものである。
【００７３】
キャノーラ粗粉「ａ」ｋｇを、０．１ＭのＮａＣｌ溶液「ｂ」Ｌに６０℃で添加し、５分の保持時間で連続抽出してタンパク質水溶液を提供した。残留キャノーラ粗粉を除去し、得られたタンパク質溶液を遠心分離および濾過によって浄化して、「ｄ」重量％のタンパク質含量を有する濾過タンパク質溶液「ｃ」Ｌを生成した。
【００７４】
タンパク質抽出溶液の一定分量「ｅ」Ｌを、それぞれ５０００および１００００ダルトンの分子量カットオフを有するＰＶＤＦ膜およびＰＥＳ膜を使用する限外濾過システムで濃縮することによって、体積を「ｆ」Ｌに低減し、次いでアスコルビン酸０．０５％を含有する０．１ＭのＮａＣｌ溶液「ｇ」Ｌでダイアフィルトレーションした。得られた濃縮タンパク質溶液は、「ｈ」重量％のタンパク質含量を有していた。
【００７５】
「ｉ」℃の濃縮溶液（等電沈殿で除去されたより少ない部分）を、温度「ｋ」℃を有する冷却ＲＯ水に希釈した「ｊ」。直ちに白雲色が生じ、静置して沈降させた。上部の希釈水を除去し、沈殿した粘稠、粘着性の塊(ＰＭＭ)を、濾過タンパク質溶液に対して「ｌ」ｗｔ％の収率で、容器の底から回収した。乾燥ＰＭＭ由来のタンパク質は、「ｍ」％(Ｎ×６．２５)ｄ.ｂ.のタンパク質含量を有していることが見出された。該生成物を「ｎ」で示した(Ｃ３００)。
【００７６】
パラメータ「ａ」〜「ｎ」を、以下の表Ｉに示す。
【００７７】
【表１】
【００７８】
除去した希釈水を、１００００ダルトンの分子量カットオフを有するＰＥＳ膜を使用して限外濾過することによって、体積を「ｏ」Ｌに低減した。濃縮物は、タンパク質「ｐ」重量％を含有していた。上澄み液からさらなるタンパク質を回収し、濾過タンパク質溶液の全タンパク質回収量は「ｑ」ｗｔ％となった。濃縮物を噴霧乾燥して、「ｎ」で示され、「ｒ」％(Ｎ×６．２５)ｄ.ｂ.のタンパク質含量を有する最終生成物(Ｃ２００)を形成した。
【００７９】
パラメータ「ｎ」〜「ｒ」を、以下の表ＩＩに示す。
【００８０】
【表２】
【００８１】
実施例３：
この実施例は、等電沈殿によって生成したタンパク質単離物(Ｃ３０２)および得られた上澄み液から生成したタンパク質単離物(Ｃ２０２)の分析を行うものである。
【００８２】
実施例１の方法によって生成した等電沈殿物は水に溶けず、したがってＨＰＬＣではそのタンパク質プロファイルを決定することができなかった。しかし、１２Ｓ、７Ｓ、および２Ｓキャノーラタンパク質のＨＰＬＣ分析は、手順のいくつかの段階で提供された材料で行った。その結果を以下の表ＩＩＩにまとめて示す。タンパク質プロファイルはタンパク質に起因する全ピーク領域のパーセンテージとして表す。
【００８３】
【表３】
【００８４】
このデータから分かるように、等電沈殿によって、溶液中の１２Ｓおよび７Ｓの割合が大きく減少した。これらの種は沈殿したが、低ｐＨ環境によって１２Ｓおよび７Ｓタンパク質がより小さいサブユニットに解離し、それが２Ｓ領域に重複して溶出したと考えられる。
【００８５】
ＡＬ０２２−Ｈ２３−０４Ａ生成物の質的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を実施して、これらの組成をさらに洞察した。Ｃ３０２は、電気泳動緩衝液に完全には溶けず、したがってサンプルの一部はゲルに入らず元のままであった。Ｃ３０２について解明されたバンドによって、主に７Ｓ/１２Ｓが存在し、２Ｓは低濃度であることが示され、これはＣ３００の分析で認められたものに類似していた。Ｃ２０２およびＣ２００は両方完全に溶解し、したがって確実に比較することができた。Ｃ２０２に残っていた７Ｓ/１２Ｓの割合は、Ｃ２００に認められたものよりも高かったことが明らかとなった。このことは、ＨＰＬＣ分析の結果に反し、ＨＰＬＣ分析においては、いくらか分解した７Ｓ/１２Ｓが２Ｓと共溶出するという仮説を裏付けるものである。ＨＰＬＣ分析の結果を、以下の表ＩＶに示す。
【００８６】
【表４】
【００８７】
Ｃ３０２およびＣ２０２単離物の色はかなり濃かったが、実施例２に記載のように調製したＣ３００およびＣ２００に、それぞれ依然として類似していた。ＤＰ３０１データ処理装置に接続したＭｉｎｏｔａＣＲ３１０色彩色差計を使用して得られた結果を、以下の表Ｖに示す。
【００８８】
【表５】
【００８９】
実施例４：
この実施例は、実施例１に従って生成した、等電沈殿によって生成されたタンパク質(Ｃ３０２)および得られた上澄み液から生成されたタンパク質(Ｃ２０２)の溶解度と、実施例２の手順に従って生成した、ＰＭＭに由来するタンパク質(Ｃ３００)およびＰＭＭ沈殿からの上澄み液に由来するタンパク質(Ｃ２００)の溶解度とを比較するものである。
【００９０】
溶解度は、Morr等、J.Food Sci.、50：1715〜1718に基づく方法を使用して決定した。タンパク質０．５ｇを供給するのに十分なタンパク質粉末を秤量してビーカーに入れ、次いで少量の逆浸透(ＲＯ)精製水を添加し、滑らかなペーストが形成されるまでその混合物を攪拌した。次いで、さらなる水を添加して、体積を約４５ｍｌにした。次いで磁気攪拌器を使用して、ビーカーの内容物を６０分間ゆっくり攪拌した。
【００９１】
タンパク質が分散した直後に各サンプルのｐＨを決定し、次いでＮａＯＨまたはＨＣＬを使用して、ｐＨを４、５、６、または７に調節した。攪拌の６０分の間に、ｐＨを２回測定し補正した。攪拌が完了した後、サンプルを、ＲＯ水で全体積が５０ｍｌになるようにし、１％ｗ／ｖのタンパク質分散液を得た。タンパク質分散液の一定分量を、タンパク質含量の決定のために備蓄した。サンプルの別の部分を、８０００ｇで１０分間の遠心分離にかけ、それによって溶解しなかった材料が沈降し、透明な上澄み液が得られた。次いで、上澄み液のタンパク質含量を決定し、溶解度を以下のように算出した
溶解度（％）＝（上澄み液のタンパク質濃度／元の分散液のタンパク質濃度）×１００。
【００９２】
さらに、Ｃ３０２およびＣ２０２サンプルの０．１ＭのＮａＣｌへの溶解度を、上記の手順を使用し、水の代わりに食塩水を用いて決定した。
【００９３】
Ｃ３０２サンプルの水および０．１ＭのＮａＣｌへの溶解度、ならびにＣ３００サンプルの水への溶解度を、それぞれ以下の表ＶＩおよびＶＩＩに示す。
【００９４】
【表６】
【００９５】
【表７】
【００９６】
これらの表から分かるように、Ｃ３０２サンプルの水および０．１Ｍの食塩水への溶解度は、ｐＨにかかわらず共に不十分であった。Ｃ３０２サンプルの水への溶解度はＣ３００よりかなり低かった。
【００９７】
Ｃ２０２サンプルの水および０．１ＭのＮａＣｌへの溶解度、ならびにＣ２００サンプルの水への溶解度を、それぞれ以下の表ＶＩＩＩおよびＩＸに示す。
【００９８】
【表８】
【００９９】
【表９】
【０１００】
このデータから分かるように、Ｃ２０２サンプルの溶解度は、Ｃ３０２サンプルのものよりかなり良好であった。Ｃ２０２サンプルの水への溶解度は、ｐＨ４および５においてはＣ２００サンプルと同等であったが、ｐＨ６および７では劣っていた。
【０１０１】
実施例５：
この実施例は、実施例１の手順に従って生成したＣ３０２およびＣ２０２キャノーラタンパク質単離物サンプルの気泡性を、実施例２の手順に従って生成したＣ３００およびＣ２００キャノーラタンパク質単離物サンプルと比較して示すものである。
【０１０２】
タンパク質７．５ｇを供給するのに十分なタンパク質粉末を秤量して、ビーカーに入れた。少量の０．０７５ＭのＮａＣｌ溶液を、タンパク質粉末に攪拌しながら入れて、ペーストを生成した。次いで、体積を約１４０ｍｌにするのに十分な食塩水溶液を添加し、その混合物を磁気攪拌器で攪拌した。気泡の形成を回避するように、攪拌速度を制御した。攪拌の１０分後、溶液のｐＨを、必要に応じてＮａＯＨまたはＨＣｌを使用して７の値に調節した。次いでその混合物をさらに１０分間攪拌し、ｐＨを補正した。次いで、サンプルを０．０７５ＭのＮａＣｌで１５０ｍｌにして、５％ｗ／ｖの分散液を得た。
【０１０３】
タンパク質分散液のサンプル(７５ｍｌ)を、Ｈｏｂａｒｔ Ｎ−５０ミキサー(Hobart Corporation、Troy、OH)のボウルに入れ、泡立て器アタッチメントを使用して、ミキサーの最高速度(設定３)で１５分間泡立てた。５分毎に泡立てるのを止め、２つの計量カップ(１２５ｍｌ)に気泡を満たし、秤量した。次いで、これらの気泡サンプルをボウルに戻した後、泡立てを継続した。以下の等式(Phillips等、J.Food Sci.、55(5)；1441〜1444、1453)を使用して、各時点での超過量を算出した
超過量（％）＝［（ｗｔ液体サンプル（１２５ｍｌ）−ｗｔ気泡（１２５ｍｌ））／ｗｔ気泡（１２５ｍｌ）］×１００。
【０１０４】
気泡の安定性を測定するために、タンパク質分散液の第２のサンプル(７５ｍｌ)を、Ｈｏｂａｒｔ Ｎ−５０ミキサーの特別ボウルに入れ、泡立て器アタッチメントを使用して、ミキサーの最高速度(設定３)で１５分間泡立てた。この特別ボウルは、ビーターの経路のちょうど外側に、ボウル底部に開けられた６ｍｍの穴を含んでいる。泡立てる間、テープ片でこの穴を被覆した。泡立てが完了すると、そのテープを除去し、攪拌棒でその穴をはっきりとさせた。ボウルから排出した材料の重量を、１５分間５分毎に決定した。排出したサンプルの重量を、気泡の初めの重量で割って、ボウルから排出した材料のパーセンテージを算出した。
【０１０５】
Ｃ３０２の気泡の超過量および気泡の安定性を、それぞれ表Ｘおよび表ＸＩに示す。
【０１０６】
【表１０】
【０１０７】
【表１１】
【０１０８】
以上のように、Ｃ３０２生成物は、不十分な気泡形成および不十分な気泡安定性を示したが、このことは、実施例３から分かるように、同生成物の溶解度が不十分であることに起因し得る。
【０１０９】
Ｃ２００と比較したＣ２０２の気泡超過量および気泡安定性を、それぞれ以下の表ＸＩＩおよびＸＩＩＩに示す。
【０１１０】
【表１２】
【０１１１】
【表１３】
【０１１２】
これらの表から分かるように、Ｃ２０２は良好な気泡性と共に、多量の超過量および優れた安定性を有していた。しかし、気泡の体積はＣ２００のものより少なかった。Ｃ２０２の気泡の外観も、Ｃ２００のものより劣っていた。Ｃ２００は、滑らかな気泡を形成したが、Ｃ２０２の気泡はより乾燥した外観であり、分散していないタンパク質粒子をいくらか有していたが、これはｐＨ７の食塩水へのＣ２０２の部分的な溶解度に起因した可能性が高い。
【０１１３】
実施例５：
この実施例は、実施例１の手順に従って生成したＣ３０２およびＣ２０２キャノーラタンパク質単離物サンプルの乳化活性を示すものである。
【０１１４】
タンパク質１．５ｇを供給するのに十分なタンパク質粉末を、ＲＯ水を添加することによって１５０ｇにした。そのサンプルを、タンパク質が完全に分散するまで、Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎミキサーを用いて４５００ｒｐｍで処理した。次いで、サンプルのｐＨを、必要に応じてＮａＯＨまたはＨＣｌを使用して、ｐＨ７に調節した。キャノーラ油(１５０ｇ)を添加して、５０％ｗ／ｗ油および０．５％ｗ／ｗタンパク質になる混合物を得た。Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎミキサーを用いて、５０００ｒｐｍで５分間処理することによって、混合物の乳化を実現した。
【０１１５】
エマルジョンのサンプルを、０．１％のＳＤＳ溶液で１：５００に希釈し、５００ｎｍにおける吸光度を読み取った(少なくとも２回行った)。エマルジョンサンプルの含水量も算出した。次いで、濁度および乳化の活性指数(安定化した脂肪小滴表面積ｍ2／タンパク質ｇ)を、Hill(1996)Emulsions.In：Methods of Testing Protein Functionality.Hall、G.M.(ed).pp.153〜185に詳説されているように算出した。
【０１１６】
サンプルＣ３０２、Ｃ３００、Ｃ２０２、およびＣ２００の乳化活性を、以下の表ＸＩＶに示す。
【０１１７】
【表１４】
【０１１８】
このデータから分かるように、Ｃ３０２サンプルは乳化活性が非常に乏しく、Ｃ３００サンプルよりも著しく低かった。
【０１１９】
実施例７：
この実施例は、実施例１の手順に従って生成したＣ３０２およびＣ２０２サンプルの水結合能を、実施例２の手順に従って生成したＣ３００およびＣ２００サンプルと比較して示すものである。
【０１２０】
タンパク質粉末(１ｇ)を秤量して、知られている重量の遠心分離管(５０ｍｌ)に入れた。この粉末に中性ｐＨの脱イオン水２０ｍｌを添加した。ボルテックスミキサーを使用して、試験管の内容物を中程度の速度で１分間混合した。次いで、５分後と１０分後に３０秒のボルテックス混合を行い、サンプルを室温で合計１０分間インキュベートした。次にそのサンプルを２０℃において１０００ｇで１５分間の遠心分離にかけた。遠心分離後、試験管にすべての固体材料を確実に残しながら、上澄み液を注意深く除去した。次いで、遠心分離管を再び秤量し、水飽和サンプルの重量を決定した。
【０１２１】
水結合能（ＷＢＣ）を以下のように算出した
ＷＢＣ（ｍｌ／ｇ）＝（湿潤サンプルの質量−乾燥サンプルの質量）／（乾燥サンプルの質量×サンプルの全固体含量）。
【０１２２】
Ｃ３００およびＣ２００サンプルと比較したＣ３０２およびＣ２０２サンプルの水結合能を、以下の表ＸＶに示す。
【０１２３】
【表１５】
【０１２４】
このデータから分かるように、Ｃ３０２サンプルの水結合能は優れており、Ｃ３００サンプルよりはるかに高かった。実施例３に記載のように、Ｃ２０２およびＣ２００サンプルは水への溶解度が高く、したがって水を排出した後に試験管に残る材料の重量は、タンパク質粉末の元の重量より少なかった。したがって、これらのサンプルの水結合能を零とする。
【０１２５】
実施例８：
この実施例は、実施例１に従って生成したＣ３０２およびＣ２０２サンプルの油結合能を、実施例２に従って生成したＣ３００およびＣ２００サンプルと比較して示すものである。
【０１２６】
油結合能は、水２０ｍｌの代わりに油２０ｍｌを使用したことを除いて、実施例６に記載の水結合能と同じ方法によって評価し、油結合能(ＯＢＣ)は以下のように算出した
ＯＢＣ（ｍｌ／ｇ）＝［（湿潤サンプルの塊−乾燥サンプルの塊）／油密度］／（乾燥サンプルの塊×サンプルの全固体量）。
【０１２７】
Ｃ３０２およびＣ２０２サンプルについて得られた結果を、Ｃ３００およびＣ２００サンプルと比較して以下の表ＸＶＩに示した。
【０１２８】
【表１６】
【０１２９】
このデータから分かるように、Ｃ２０２サンプルの油結合能は、Ｃ２００サンプルのものよりも良好であったが、Ｃ３０２の油結合能はＣ３００サンプルのものよりわずかに劣っていた。
【０１３０】
実施例９：
この実施例は、実施例２の手順に従って生成したＰＭＭからの等電沈殿物の調製を示すものである。
【０１３１】
実施例２に記載の手順後に行った、プロセスＢＷ−ＡＬ０２２−Ｌ１５−０４Ａの流れからのＰＭＭ含有希釈ペレット(１００．４７ｇ、２３．１５％タンパク質)を、０．１ＭのＮａＣｌ溶液(３６４．７３ｇ)と混合して、４．５４％のタンパク質含量を有するサンプルを産出した。５％のＨＣｌを使用して、溶液のｐＨを初期値の６．０２から３．５０まで低減した。サンプルを１５分間静置し、次いで７１００ｇで１５分間の遠心分離にかけて、上澄み液から沈殿タンパク質を分離した。湿潤沈殿物(２６．０１ｇ)を凍結乾燥して、Ｃ３０２タンパク質５．４５ｇを生成した。Ｃ３０２タンパク質のタンパク質含量は、湿潤ベースで９０．１７％であり(含水量は決定されず)、そのことはタンパク質が単離物であったことを示すものである。
【０１３２】
Ｃ３０２タンパク質の水結合能を、同じ流れからのＣ３００タンパク質と比較して、実施例７の手順に従って決定した。結果を以下の表ＸＶＩＩに記載する。
【０１３３】
【表１７】
【０１３４】
この表から分かるように、Ｃ３０２生成物は、同じ回分で生成したＣ３００タンパク質よりも多くの水に結合し、Ｃ３００生成物と比較して、実施例７のＣ３０２タンパク質によって示されたのと同じ高い水結合能を示した。
【０１３５】
実施例１０：
この実施例は、濃縮ステップなしにタンパク質水溶液の等電沈殿を行い、上澄み液を処理して、主に２Ｓタンパク質であるキャノーラタンパク質単離物を回収することを示すものである。
【０１３６】
キャノーラ油糧種子粗粉１５ｋｇを、０．１５ＭのＮａＣｌ１５０Ｌを用いて、室温で３０分間攪拌することによって抽出した。デカンタに通過させることによって、使用済み粗粉から抽出物を分離し、その抽出物を、２．０μｍおよび０．８μｍの孔径を有する濾紙に逐次的に通過させることによってさらに浄化した。次いで、２ＭのＨＣｌを添加することによって、濾液のｐＨを初期値の５．６６から３．５に低減し、その結果沈殿物が形成され、それを２．０μｍおよび０．８μｍの孔径を有する濾紙に逐次的に通過させることによって除去した。沈殿物はこの実験では回収しなかった。
【０１３７】
次いで、等電沈殿からの上澄み液を、１００００ＤａのＭＷＣＯを有するＰＥＳ膜を使用して、小さい膜単位で濃縮した。サンプルを１０６Ｌから約５Ｌの体積に低減した。次いで、ｐＨ３．５の７体積の水を用いて濃縮サンプルをダイアフィルトレーションして含塩量を低減した。次いで、ダイアフィルトレーションした保持液を３つのサンプルに分けた。
【０１３８】
第１のサンプル(対照)を、６０℃で１０分間低温殺菌し、２５℃に冷却し、１０２００ｇで１０分間の遠心分離にかけ、３番(極細目)の濾紙で濾過した。第２のサンプルを、８５℃で１０分間熱処理し、２５℃に冷却し、１０２００ｇで１０分間の遠心分離にかけ、続いて３番の濾紙で濾過した。水酸化ナトリウム水溶液を添加することによって、第３のサンプルのｐＨを６まで上げ、そのサンプルを８０℃で１０分間熱処理し、次いで２５℃に冷却した。形成された沈殿物を、１０２００ｇで１０分間の遠心分離にかけ、次いで３番の濾紙で濾過することによって回収した。次いで、３つの生成物を噴霧乾燥し、Ｃ２０２(対照)、Ｃ２０２Ｈ ｐＨ３．５(ｐＨ３．５で熱処理)、およびＣ２０２Ｈ ｐＨ６(ｐＨ６で熱処理）の記号を付した。
【０１３９】
プロセスサンプルを、遊離フェノール成分(３３０ｎｍにおける吸光度)、可視色(３９０ｎｍにおける吸光度)、タンパク質含量(ＬＥＣＯ)、および／またはタンパク質プロファイル(ＳＥＣ ＨＰＬＣ)について分析した。低ｐＨ条件によって、７Ｓおよび１２Ｓがより小さいサブユニットに変換され、それが２Ｓピークと重複して溶出するため、酸性化サンプルのＨＰＬＣクロマトグラムは解明困難であった。最終生成物を、含水量(オーブン法）、乾き色(Ｍｉｎｏｌｔａ色差計)についても分析し、濡れ色分析のために溶液を調製した。ボルテックスミキサーを使用して、タンパク質粉末(０．３５ｇ)を水(１０ｍｌ)に溶かした。Ｃ２０２ ｐＨ６の生成物について、ＨＣｌを添加することによって、濡れ色サンプルのｐＨを４に低減した。湿潤サンプルの可視色を、Ａ３９０によって評価し、６００ｎｍにおける透明性およびｐＨを測定した。
【０１４０】
等電沈殿ステップの結果、浄化した抽出物から４６％の窒素が除去された。酸性化前の濾液のタンパク質プロファイルは、７Ｓ４８．９％：１２Ｓ１．７％：２Ｓ４９．４％であり、等電沈殿物の除去後では、７Ｓ２．０％：１２Ｓ０．４％：２Ｓ９７．６％であった。７Ｓおよび１２Ｓは、沈殿した主な種であったが、その除去は、ＨＰＬＣデータに示されるほど完全ではないと考えられている。先に述べたように、低ｐＨ条件によって、７Ｓおよび１２Ｓがより小さいサブユニットに変換され、それが２Ｓピークと重複して溶出する。したがって、酸性化サンプルの「２Ｓ」のいくらかは、分解した７Ｓおよび１２Ｓであり得る。ｐＨ３．５における濃縮サンプルの熱処理によって、混濁はわずかに増大したが、著しい沈殿物の形成はなかった。ｐＨ６における熱処理の結果、著しく多量のタンパク質が沈殿した。
【０１４１】
生成したＣ２０２生成物のすべては、表ＸＶＩＩＩで示す単離物であった。
【０１４２】
【表１８】
【０１４３】
Ｃ２０２生成物の乾き色を、表ＸＩＸに示す。結果は極めて類似していたが、ｐＨ３．５で熱処理したサンプルは、対照サンプルよりも赤く、黄色味が少なかった。他のサンプルと比較して７Ｓおよび１２Ｓが激減したＣ２０２Ｈ ｐＨ６サンプルは、最も淡く、最も緑色であり(最も赤色ではない)、対照よりもやはり黄色味が少なかった。
【０１４４】
【表１９】
【０１４５】
Ｃ２０２サンプルの濡れ色は、非常に類似しているように見えた。Ｃ２０２Ｈ ｐＨ６サンプルの透明性は、最良に見えた。吸光度測定によって評価した場合、Ｃ２０２Ｈ ｐＨ６サンプルは、最も淡く最も透明であることが見出された。しかし、３つのサンプルの差異は極めて小さく、すべて許容できるものであった(表ＸＸ)。すべてのサンプルの透明性は、サンプルを冷凍温度に冷却した場合も依然として安定であることが見出された。
【０１４６】
【表２０】
【０１４７】
実施例１１：
この実施例は、実施例１０に記載のように調製した上澄み液由来のキャノーラタンパク質単離物の機能性を、溶解度、気泡超過量、および気泡安定性について示すものである。
【０１４８】
実施例１０に記載のように調製したキャノーラタンパク質単離物のサンプルを、機能性について評価した。
【０１４９】
溶解度：
生成物の溶解度は、Ｍｏｒｒ等によって報告されたものに基づく方法を使用して決定した。タンパク質０．５ｇを供給するのに十分なタンパク質粉末を秤量して、５つのビーカーのそれぞれに入れ、次いで各サンプルに少量の逆浸透(ＲＯ)精製水を添加し、滑らかなペーストが形成されるまでその混合物を攪拌した。次いで、さらなる水を添加して、サンプルの体積を約４０ｍｌにした。次いで、磁気攪拌器を使用して、ビーカーの内容物を６０分間ゆっくり攪拌した。タンパク質が分散した直後にｐＨを決定し、１つのサンプルを中性ｐＨで攪拌し、その他を、ＮａＯＨまたはＨＣｌを用いてｐＨ４、５、６、または７に調節した。６０分の攪拌の間、調節したサンプルのｐＨを２回測定し補正した。６０分の攪拌の後、サンプルをＲＯ水で全体積が５０ｍｌになるようにし、１％ｗ／ｖのタンパク質分散液を得た。各タンパク質分散液の一定分量を、ＬＥＣＯによってタンパク質含量を決定するために備蓄した。サンプルの別の部分を、７８００ｇで１０分間の遠心分離にかけた。これによって、溶解しなかった材料が沈降し、透明な上澄み液が得られた。次いで上澄み液のタンパク質含量を決定した。
【０１５０】
溶解度（％）＝（上澄み液のタンパク質濃度／元の分散液のタンパク質濃度）×１００
Ｃ２０２対照の溶解度を、以下の表ＸＸＩに示す。
【０１５１】
【表２１】
【０１５２】
この表から分かるように、Ｃ２０２対照の溶解度は、考慮される全ｐＨ範囲にわたって非常に良好であることが見出された。
【０１５３】
気泡超過量：
タンパク質８ｇを供給するのに十分なタンパク質粉末を秤量して、ビーカーに入れた。少量の水をタンパク質粉末に攪拌しながら入れて、ペーストを生成した。次いで、体積を約１５０ｍｌにするのに十分な水を添加し、その混合物を磁気攪拌器で攪拌した。気泡の形成を回避するように攪拌速度を制御した。攪拌の約２０分後、必要に応じてＮａＯＨまたはＨＣｌを使用して溶液のｐＨを７の値に調節した。次いでその混合物をさらに１０分間攪拌し、ｐＨを補正した。次いで、サンプルを水で１６０ｍｌにして、５％ｗ／ｖの分散液を得た。
【０１５４】
タンパク質分散液のサンプル(７５ｍｌ)を、Ｈｏｂａｒｔ Ｎ−５０ミキサー(Hobart Corporation、Troy、OH)のボウルに入れ、泡立て器アタッチメントを使用して、５分間、ミキサーの最高速度(設定３)で泡立てた。泡立ての２、３．５、および５分後に泡立てるのを止め、２つの計量カップ(１２５ｍｌ)に気泡を満たし、秤量した。次いで、これらの気泡サンプルをボウルに戻した後、泡立てを継続した。以下の等式(Phillips等)を使用して、各時点での超過量を算出した
超過量（％）＝［（ｗｔ液体サンプル（１２５ｍｌ）−ｗｔ気泡（１２５ｍｌ））／ｗｔ気泡（１２５ｍｌ）］×１００。
【０１５５】
気泡安定性：
気泡の安定性を測定するために、タンパク質分散液の第２のサンプル(７５ｍｌ)を、Ｈｏｂａｒｔ Ｎ−５０ミキサーの特別ボウルに入れ、泡立て器アタッチメントを使用して、５分間、ミキサーの最高速度(設定３)で泡立てた。この特別ボウルは、ビーターの経路のちょうど外側に、ボウル底部に開けられた６ｍｍの穴を含んでいる(Phillips等、１９９０)。泡立てる間、テープ片でこの穴を被覆した。泡立てが完了すると、そのテープを除去し、攪拌棒でその穴をはっきりさせた。ボウルから排出した材料の重量を、１５分間５分毎に決定した。排出したサンプルの重量を、気泡の初めの重量で割って、ボウルから排出した材料のパーセンテージを算出した。
【０１５６】
Ｃ２０２生成物の超過量に対する泡立て時間の効果を、以下の表ＸＸＩＩに示す。
【０１５７】
【表２２】
【０１５８】
試験したＣ２０２生成物の気泡性は優れており、多量の超過量（表ＸＸＩＩ）および良好な安定性を伴っていた。Ｃ２０２対照およびＣ２０２Ｈ ｐＨ６サンプルに関して、気泡を泡立てた後１５分間、質量損失は記録されなかった。Ｃ２０２Ｈ ｐＨ６サンプルでは、１５分の刻時点においてボウルから懸滴したのに対して、同じ時間が経過した後の対照サンプルでは液滴の形成は確認されなかったため、Ｃ２０２対照の安定性はＣ２０２Ｈ ｐＨ６サンプルよりも良好であると認められた。
【０１５９】
実施例１２：
この実施例は、濃縮ステップなしにタンパク質水溶液の等電沈殿を行い、主に７Ｓタンパク質であるキャノーラタンパク質単離物を回収し、上澄み液を処理して、主に２Ｓタンパク質であるキャノーラタンパク質単離物を回収することを示すものである。
【０１６０】
キャノーラ粗粉１８０ｇを、０．１５ＭのＮａＣｌ１８００ｍｌを用いて、室温で３０分間、オーバーヘッド攪拌機で攪拌することによって抽出した。７１００ｇで１０分間の遠心分離にかけることによって、使用済み粗粉から抽出物を分離し、その抽出物を、１組の３番（極細目）の濾紙で濾過することによってさらに浄化した。次いで、６ＭのＨＣｌを添加することによって、濾液のｐＨを初期値の５．７２から３．５に低減し、サンプルを１５分間静置した。形成された沈殿物を、７１００ｇで１０分間の遠心分離にかけることによって除去し、次いで凍結乾燥した。この生成物にＣ３０２の記号を付した。
【０１６１】
等電上澄み液を、１組の３番濾紙に通すことによってさらに浄化した。次いで、浄化した上澄み液を、１００００ＤａのＭＷＣＯを有するＨｙｄｒｏｓａｒｔ膜を備えるＶｉｖａｆｌｏｗ膜ユニットで濃縮した。サンプルを、約９５０ｍｌから約２６．５ｍｌの体積に低減した。次いで、濃縮サンプルをｐＨ３．５の水５体積でダイアフィルトレーションして含塩量を低減した。次いで、ダイアフィルトレーションした保持液を２つのサンプルに分けた。第１のサンプル(対照)を、そのまま凍結乾燥した(製品コードＣ２０２)。第２のサンプルを、８５℃で５分間熱処理し、２５℃に冷却し、次いで凍結乾燥した(製品コードＣ２０２Ｈ)。
【０１６２】
プロセスサンプルを、遊離フェノール成分(３３０ｎｍにおける吸光度)、可視色(３９０ｎｍにおける吸光度)、タンパク質含量(ＬＥＣＯ)、および／またはタンパク質プロファイル(ＳＥＣ ＨＰＬＣ)について分析した。低ｐＨ条件によって、７Ｓおよび１２Ｓがより小さいサブユニットに変換され、それが２Ｓピークと重複して溶出するため、酸性化サンプルのＨＰＬＣクロマトグラムは解明困難であることに留意されたい。最終生成物を、含水量(オーブン法)、乾き色(Ｍｉｎｏｌｔａ色差計)についても分析し、濡れ色分析のためにＣ２０２およびＣ２０２Ｈの溶液を調製した。ボルテックスミキサーを使用して、タンパク質粉末(０．３５ｇ)を水(１０ｍｌ)に溶かした。湿潤サンプルの可視色を、Ａ３９０によって評価し、６００ｎｍにおける吸光度によって透明性を評価した。
【０１６３】
等電沈殿ステップの結果、浄化した抽出物から５３．７％の窒素が除去された。酸性化前の濾液のタンパク質プロファイル(全タンパク質粗粉領域のパーセンテージとして表す)は、７Ｓ６２．３％：１２Ｓ３．４％：２Ｓ３４．３％であり、等電沈殿物の除去後では、７Ｓ３．０％：１２Ｓ０．８％：２Ｓ９６．２％であった。７Ｓおよび１２Ｓは、沈殿した主な種であったが、その除去は、ＨＰＬＣデータが示すほどは完全でないと考えられている。先に述べたように、低ｐＨ条件によって、７Ｓおよび１２Ｓがより小さいサブユニットに変換され、それが２Ｓピークと重複して溶出する。したがって、酸性化サンプルの「２Ｓ」のいくらかは、分解した７Ｓおよび１２Ｓであり得る。ｐＨ３．５における濃縮上澄み液の熱処理によって、混濁はわずかに増大したが、著しい沈殿物の形成はなかった。
【０１６４】
この試験で生成した生成物のすべてが、単離物であり、タンパク質含量(ｄ.ｂ.)は、９０％を超えていた(表ＸＸＩＩＩ)。
【０１６５】
【表２３】
【０１６６】
生成物の乾き色を表ＸＸＩＶに示す。Ｃ３０２の明度数値は良好であったが、Ｃ２０２の明度数値は低かった。Ｃ３０２は、Ｃ２０２生成物より黄色く、緑色であった。熱処理したＣ２０２Ｈは、熱処理していないＣ２０２よりも濃く、黄色味が少なかった。
【０１６７】
【表２４】
【０１６８】
Ｃ２０２およびＣ２０２Ｈの濡れ色サンプルは、いくらか濁っていた。ダイアフィルトレーション保持液サンプルが、特に熱処理後にいくらか濁っていたことから(Ｃ２０２Ｈ)、透明性は、凍結乾燥前にサンプルを濾過することによって改善できる可能性が高い。可視色に関して、サンプルは見た目には類似していた。吸光度の読み取りによれば、Ｃ２０２Ｈは、Ｃ２０２よりも少し色が濃く、また濁っていた(表ＸＸＶ)。
【０１６９】
【表２５】
【０１７０】
ダイアフィルトレーションし濃縮した、ｐＨ３．５の上澄み液の熱処理は、色または透明性に関して何の利点ももたらさなかったように見えた。したがって、これらのサンプルに熱処理ステップは必要なかった。
【０１７１】
Ｃ３０２単離物の水結合能を決定した。
【０１７２】
タンパク質粉末(１ｇ)を秤量して、知られている重量の遠心分離管(５０ｍｌ)に入れた。この粉末に、中性ｐＨの逆浸透精製水約２０ｍｌを添加した。ボルテックスミキサーを使用して、試験管の内容物を中程度の速度で１分間混合した。次いで、５分後と１０分後に３０秒のボルテックス混合を行い、サンプルを室温で合計１０分間インキュベートした。次にそのサンプルを、２０℃において１０００ｇで１５分間の遠心分離にかけた。遠心分離後、試験管にすべての固体材料を確実に残しながら、上澄み液を注意深く除去した。次いで、遠心分離管を再び秤量し、水飽和サンプルの重量を決定した。
【０１７３】
水結合能（ＷＢＣ）を以下のように算出した
ＷＢＣ（ｍｌ／ｇ）＝（湿潤サンプルの質量−乾燥サンプルの質量）／（乾燥サンプルの質量×サンプルの全固体含量）。
【０１７４】
Ｃ３０２の水結合能は、２．９５ｍｌ／ｇであることが見出された。これは、先のＩＥＰ試験でＣ３０２生成物に関して認められたもの(約５〜９ｍｌ/ｇ、例えば実施例７参照)よりも低いレベルである。この差異は、この実施例においてＩＥＰステップが、ＵＦ１保持液の希釈ペレットまたは再び可溶化したＣ３００などの、より精製されたストリームの代わりに抽出物で実施されたことに起因し得る。この実施例のＣ３０２について認められた水結合能は、他のＣ３０２生成物よりも低かったが、その値はＣ３００生成物について一般に認められたものよりもなお高い(約１〜２ｍｌ/ｇ)。
【０１７５】
（開示の概要）
本開示を概説すると、等電沈殿は、Ｃ３０２およびＣ２０２で示される２つの新規キャノーラタンパク質単離生成物を生成するために、首尾よく利用された。Ｃ３０２およびＣ２０２生成物は、色および純度において、Ｃ３００およびＣ２００生成物に類似していた。Ｃ２０２生成物の機能性はＣ２００生成物に通ずるものであった。Ｃ３０２生成物は、乳化剤ほど可溶性ではなく十分に機能せず、Ｃ３００生成物とは異なっていた。しかしＣ３０２生成物は、水結合剤としては極めて良好に機能し、Ｃ３００生成物を著しく凌いでいた。本発明の範囲においては改変が可能である。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の参照）
本出願は、米国特許法第１１９条(ｅ)の下、２００５年９月２１日出願の米国仮特許出願第６０／７１８７５４号の優先権を主張するものである。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、油糧種子粗粉、特にキャノーラ油糧種子粗粉からのタンパク質単離物の調製に関する。
【０００３】
（発明の背景）
本発明の譲渡人に譲渡され、その開示が参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第５８４４０８６号および同第６００５０７６号(「ＭｕｒｒａｙＩＩ」)には、著しい脂肪含量を有するキャノーラ油糧種子粗粉を含めたこのような著しい脂肪含量を有する油糧種子粗粉から、タンパク質単離物を単離する方法が記載されている。この方法に伴うステップには、油糧種子粗粉からタンパク質性物質を可溶化するステップが含まれ、それによって粗粉の脂肪も可溶化され、得られるタンパク質水溶液から脂肪が除去される。脂肪除去ステップの前または後に、残留油糧種子粗粉からタンパク質水溶液を分離することができる。次いで、脱脂したタンパク質溶液を濃縮してタンパク質濃度を高めると同時に、イオン強度を実質的に一定に維持し、その後、濃縮タンパク質溶液をさらなる脂肪除去ステップにかけることができる。次いで、濃縮タンパク質溶液を希釈して、高度に凝集したタンパク質分子の雲状の塊を、ミセル形態の個別のタンパク質液滴として形成させる。タンパク質ミセルを沈降させて、「タンパク質ミセル塊」またはＰＭＭと呼ばれる、凝集し合体した、濃い非晶質の粘着性グルテン様タンパク質単離物塊を形成し、それを残留水相から分離し、乾燥する。
【０００４】
該タンパク質単離物は、少なくとも約９０ｗｔ％のタンパク質含量を有し(ケルダールまたは同等の方法Ｎ×６．２５によって決定される)、実質的に非変性であり(示差走査熱量測定によって決定される)、残留脂肪含量が低い。本発明で使用される「タンパク質含量」という用語は、乾燥重量ベースで表したタンパク質単離物中のタンパク質の量を指す。この手順を使用して得られたタンパク質単離物の収率は、乾燥タンパク質単離物として回収される油糧種子粗粉から抽出されたタンパク質の割合から見て、一般に４０ｗｔ％未満、典型的には約２０ｗｔ％であった。
【０００５】
前記特許に記載された手順は、その開示が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第４２０８３２３号(ＭｕｒｒａｙＩＢ）に記載のように、油糧種子を含めた様々なタンパク質供給材料からタンパク質単離物を形成する手順の改変法および改善法として開発された。１９８０年、米国特許第４２０８３２３号が発行されたときに利用可能であった油糧種子粗粉は、ＭｕｒｒａｙＩＩ特許の時点ではキャノーラ油糧種子粗粉の脂肪汚染濃度を有しておらず、その結果、米国特許第４２０８３２３号の手順では、ＭｕｒｒａｙＩＩの方法に従って処理したこのような油糧種子粗粉から９０ｗｔ％以上のタンパク質含量を有するタンパク質性物質を生成することができない。米国特許第４２０８３２３号には、菜種(キャノーラ)を出発材料として使用して実施したという具体的な実験は記載されていない。
【０００６】
米国特許第４２０８３２３号それ自体は、希釈してＰＭＭを形成する前に濃縮ステップを導入することによって、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第４１６９０９０号および同第４２８５８６２号(ＭｕｒｒａｙＩＡ)に記載の方法の改善法となるように設計された。後者のステップは、ＭｕｒｒａｙＩＡの方法に関して、タンパク質単離物の収率を約２０％から改善する働きをした。
【０００７】
本発明の譲渡人に譲渡され、その開示が参照によって本明細書に組み込まれる、２００２年５月３日出願の同時係属中の米国特許出願第１０／１３７３９１号(米国特許出願公開第２００３０１２５５２６号)、２００４年６月９日出願の第１０／４７６２３０号(米国特許出願公開第２００４０２５４３５３号)(ＷＯ０２／０８９５９７）には、少なくとも約１００ｗｔ％のタンパク質(Ｎ×６．２５)を含有する高純度のタンパク質単離物を生成する方法が記載されている。前記米国特許出願において、タンパク質単離物は、食品用塩溶液を用いて油糧種子粗粉を抽出する方法によって生成され、得られたタンパク質溶液を、色素吸着剤での最初の処理後に所望ならば少なくとも約２００ｇ／Ｌのタンパク質含量に濃縮し、濃縮したタンパク質溶液を冷水で希釈してタンパク質ミセルを形成し、それを沈降させて、「タンパク質ミセル塊」またはＰＭＭと呼ばれる、凝集し合体した、濃い非晶質の粘着性グルテン様タンパク質単離物塊を形成し、それを残留水相から分離し、そのままでまたは乾燥して使用することができる。
【０００８】
上記方法の一実施形態では、特に米国特許出願第１０／１３７３９１号および同第１０／４７６２３０号に記載のように、ＰＭＭ沈降ステップからの上澄み液を処理して、湿潤ＰＭＭおよび上澄み液から、乾燥タンパク質を含むタンパク質単離物を回収する。この手順は、最初に限外濾過膜を使用して上澄み液を濃縮し、濃縮上澄み液を湿潤ＰＭＭと混合し、その混合物を乾燥することによって行うことができる。得られたキャノーラタンパク質単離物は、少なくとも約９０ｗｔ％のタンパク質、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％のタンパク質(Ｎ×６．２５)の高い純度を有する。
【０００９】
上記方法の別の実施形態では、特に米国特許出願第１０／１３７３９１号および同第１０／４７６２３０号に記載のように、ＰＭＭ沈降ステップからの上澄み液を処理して、上澄み液からタンパク質を回収する。この手順は、最初に限外濾過膜を使用して上澄み液を濃縮し、その濃縮物を乾燥することによって行うことができる。得られたキャノーラタンパク質単離物は、少なくとも約９０ｗｔ％、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％のタンパク質(Ｎ×６．２５)の高い純度を有する。
【００１０】
上記の米国特許出願の手順は、本質的には回分式手順である。本発明の譲渡人に譲渡され、その開示が参照によって本明細書に組み込まれる、２００２年１１月１９日出願の同時係属中の米国特許出願第１０／２９８６７８号(米国特許出願公開第２００４００３９１７４号)(ＷＯ０３／０４３４３９）には、キャノーラタンパク質単離物を生成するための連続法が記載されている。それによれば、キャノーラ油糧種子粗粉を塩溶液と連続的に混合し、その混合物をパイプを介して搬送しながら、キャノーラ油糧種子粗粉からタンパク質を抽出してタンパク質水溶液を形成し、そのタンパク質水溶液を残留キャノーラ油糧種子粗粉から連続的に分離し、そのタンパク質水溶液を選択的膜操作によって連続的に搬送して、タンパク質水溶液のタンパク質含量を少なくとも約２００ｇ／Ｌに増大すると同時にイオン強度を実質的に一定に維持し、得られた濃縮タンパク質溶液を冷水と連続的に混合してタンパク質ミセルを形成させ、沈降容器に所望の量のＰＭＭが蓄積するまで、タンパク質ミセルを連続的に沈降させると同時に上澄み液を連側的にオーバーフローさせる。ＰＭＭを沈降容器から取り出し乾燥することができる。そのＰＭＭは、少なくとも約９０ｗｔ％(Ｎ×６．２５)、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％のタンパク質含量を有する。
【００１１】
このような手順では、濃縮タンパク質溶液を冷却水で希釈してＰＭＭを沈殿させることによって、キャノーラタンパク質単離物を回収する。さらに、ＰＭＭ沈殿ステップからの上澄み液から、さらなるキャノーラタンパク質単離物を回収することができる。
【００１２】
本発明の譲渡人に譲渡され、その証拠が参照によって本明細書に組み込まれる、同時係属中の米国特許出願第１１／０３８０８６号(米国特許出願公開第２００５０１８１１１２号)(ＷＯ００５／０６７７２９)に記載のように、ＰＭＭ沈殿ステップからの上澄み液を熱処理して、その上澄み液から７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を沈殿させることができる。熱処理した上澄み液から続いて回収した２Ｓタンパク質は、様々なｐＨ値の水性媒体への溶解度が改善されており、清涼飲料に溶液の透明性の改善を付与し、したがってタンパク質強化清涼飲料を提供することができる。
【００１３】
（発明の概要）
驚くべきことに、濃縮キャノーラタンパク質溶液を酸性化した場合、ＰＭＭ経路によって得られるキャノーラタンパク質単離物に組成上類似したキャノーラタンパク質単離物が沈殿し、次いで沈殿したキャノーラタンパク質単離物を分離した後、上澄み液を処理して、ＰＭＭ沈殿からの上澄み液から得られるものに組成上類似したさらなるキャノーラタンパク質単離物が得られることがここで見出された。したがってこの手順は、濃縮タンパク質溶液からキャノーラタンパク質単離物を得る代替方式となっている。等電沈殿手順の結果生じる１つの利益は、ＰＭＭ由来のタンパク質単離物よりも著しく高い水結合能を有するキャノーラタンパク質単離物が生成されることである。
【００１４】
本発明の別の態様による代替手順では、ＰＭＭを塩水溶液に再懸濁し、得られた溶液を酸性化することによって、ＰＭＭを等電沈殿物に変換することができる。ＰＭＭは、湿潤ペレットから、またはあまり好ましくはないが乾燥単離物から再懸濁することができる。この手順によって、等電沈殿物に変換されるＰＭＭ材料よりもかなり高い水結合能を有する等電沈殿キャノーラタンパク質単離物が生成される。
【００１５】
本発明の別の態様では、等電沈殿を濃縮ステップの前に行い、等電沈殿からの上澄み液を処理して、さらなるタンパク質単離物をそれから回収する。
【００１６】
したがって、本発明の一態様において、（ａ）油糧種子粗粉を抽出して、油糧種子粗粉のタンパク質を可溶化し、約５〜約６．８のｐＨを有するタンパク質水溶液を形成するステップ、（ｂ）残留油糧種子粗粉からタンパク質水溶液を分離するステップ、（ｃ）タンパク質水溶液を酸性化して、少なくとも約９０ｗｔ％(Ｎ×６．２５)のタンパク質含量を有するタンパク質単離物をそれから沈殿させるステップ、および（ｄ）上澄み液から沈殿タンパク質単離物を分離するステップを含む、タンパク質単離物の調製方法が提供される。
【００１７】
本発明は、特に、キャノーラタンパク質単離物の調製に関する。したがって、本発明の別の態様において、（ａ）キャノーラ油糧種子粗粉を抽出して、キャノーラ油糧種子粗粉のキャノーラタンパク質を可溶化し、約５〜約６．８のｐＨを有するタンパク質水溶液を形成するステップ、（ｂ）残留キャノーラ油糧種子粗粉からタンパク質水溶液を分離するステップ、（ｃ）タンパク質水溶液を約３〜約４のｐＨに酸性化して、少なくとも約９０ｗｔ％(Ｎ×６．２５)のタンパク質含量を有し、主に７Ｓキャノーラタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物をそれから沈殿させるステップ、および（ｄ）上澄み液から沈殿キャノーラタンパク質単離物を分離するステップを含む、キャノーラタンパク質単離物の調製方法が提供される。
【００１８】
本発明のさらなる一態様において、（ａ）油糧種子粗粉を抽出して、油糧種子粗粉のタンパク質を可溶化し、約５〜約６．８のｐＨを有するタンパク質水溶液を形成するステップ、（ｂ）残留油糧種子粗粉からタンパク質水溶液を分離するステップ、（ｃ）選択的膜技術を使用して、タンパク質水溶液のタンパク質濃度を増大すると同時にイオン強度を実質的に一定に維持して、濃縮タンパク質溶液を提供するステップ、（ｄ）濃縮タンパク質溶液を約１５℃未満の温度を有する冷却水で希釈して、水溶液中にミセル形態の個別のタンパク質粒子を形成させるステップ、（ｅ）タンパク質ミセルを沈降させて、非晶質で粘着性の、ゼラチン質のグルテン様タンパク質ミセル塊を形成するステップ、（ｆ）少なくとも約９０ｗｔ％、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％(Ｎ×６．２５)のタンパク質含量を有するタンパク質ミセル塊を、上澄み液から分離するステップ、（ｇ）タンパク質ミセル塊の水溶液を形成するステップ、（ｈ）タンパク質ミセル塊の水溶液を酸性化して、少なくとも約９０ｗｔ％、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有するタンパク質単離物をそれから沈殿させるステップ、および（ｉ）上澄み液から沈殿タンパク質単離物を分離するステップを含む、タンパク質単離物の調製方法が提供される。
【００１９】
本発明の方法に従って生成されたキャノーラタンパク質単離物は、加工食品のタンパク質強化、油の乳化、焼成食品の質量増し(ｂｏｄｙ ｆｏｒｍｅｒ)、および製品にガスを封入する発泡剤などの、タンパク質単離物の通常の用途および新規用途に使用することができる。さらに、タンパク質単離物は、粗粉類似物に有用なタンパク質繊維に形成することができ、結合剤として卵白が使用される食品の卵白代用物または増量剤として使用することができる。以下に示したデータから分かるように、等電沈殿したキャノーラタンパク質単離物は、特に水結合剤／増粘剤としての使用が見出されている。上澄み液由来のキャノーラタンパク質単離物は、特に透明タンパク質強化清涼飲料を含めた酸性化飲料への使用が見出されている。キャノーラタンパク質単離物は、栄養補助食品として使用することができる。キャノーラタンパク質単離物の他の使用には、ペットフード、飼料、ならびに工業用途および化粧品用途、および個人用手入れ用品における使用がある。
【００２０】
（発明の一般的な説明）
キャノーラタンパク質単離物を分離する方法の最初のステップには、油糧種子粗粉、特にキャノーラ粗粉からタンパク質性物質を可溶化することが含まれるが、この方法は、大豆、従来の菜種、従来の亜麻、Ｌｉｎｏｌａ(登録商標)、ヒマワリ、およびカラシナ油糧種子粗粉などの他の油糧種子粗粉に適用することができる。本発明は、より具体的には、キャノーラ種子粗粉に関して本明細書に記載される。
【００２１】
キャノーラ種子粗粉から回収したタンパク質性物質は、キャノーラ種子に天然に存在するタンパク質でよく、またはそのタンパク質材料は、遺伝子操作によって改変されてはいるが、天然タンパク質の特徴的な疎水性および極性を有するタンパク質でよい。キャノーラ油糧種子は、菜種または菜種油としても知られている。
【００２２】
塩の存在によって、油糧種子粗粉からの可溶性タンパク質の除去が増進されるため、タンパク質の可溶化は、食品用塩溶液を使用することによって最も効果的に行われる。キャノーラタンパク質単離物が食品以外の使用に企図される場合には、非食品用化学物質を使用することができる。食品用塩は、通常塩化ナトリウムであるが、塩化カリウムなどの他の塩を使用することもできる。相当多量のタンパク質の可溶化を実施可能にするために、食品用塩溶液は、少なくとも約０．０５、好ましくは少なくとも約０．１のイオン強度を有する。塩溶液のイオン強度が増大するに従って、油糧種子粗粉中のタンパク質の可溶化の度合いは最初増大し、その後最大値に達する。その後はイオン強度がいくら増大しようとも可溶化タンパク質全体を増加することはない。タンパク質の可溶化を最大にする食品用塩溶液のイオン強度は、当該の塩および選択される油糧種子粗粉に応じて変わる。
【００２３】
食品用塩水溶液中に酸化防止剤が存在してもよい。酸化防止剤は、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸などの任意の好都合な酸化防止剤が可能である。可溶化ステップで使用する酸化防止剤の量は、約０．０１〜約１ｗｔ％で変わることができ、好ましくは約０．０５ｗｔ％である。酸化防止剤は、タンパク質水溶液に存在するフェノール成分の酸化を抑制する働きをする。
【００２４】
回分式方法では、タンパク質の塩可溶化を、少なくとも約５℃、好ましくは最大約３５℃の温度で、好ましくは可溶化時間を短縮するために攪拌を伴って通常約１０〜約６０分行う。可溶化は、全体的に高い生成収率を得るために、油糧種子粗粉から実質的に最大量のタンパク質を抽出するように行うことが好ましい。
【００２５】
可溶化は、約５℃の温度より低いと実際的ではない程に遅くなるので、約５℃の下限温度が選択されると同時に、回分式モードにおいて温度レベルが高くなるとこの方法が非経済的となることから、約３５℃の好ましい上限温度が選択される。
【００２６】
連続式方法では、キャノーラ油糧種子粗粉からのタンパク質の抽出を、キャノーラ油糧種子粗粉からのタンパク質の連続抽出の実施に合致する任意の方式で行う。一実施形態では、キャノーラ油糧種子粗粉を塩溶液と連続的に混合し、その混合物を、ある長さを有するパイプまたは導管を介して、本明細書に記載のパラメータによる所望の抽出を行うのに十分な滞留時間に合わせた流速で搬送する。このような連続手順では、好ましくは、キャノーラ油糧種子粗粉から実質的に最大量のタンパク質を抽出するように可溶化を行うために、塩可溶化ステップを迅速に最大約１０分間行う。連続手順における可溶化は、高温で、好ましくは約３５℃を超え、一般には最大約６５℃、またはそれ以上で行うことが好ましい。
【００２７】
塩水溶液およびキャノーラ油糧種子粗粉は、約５〜約６．８の中性ｐＨを有し、約５．３〜約６．２のｐＨ値が好ましい。
【００２８】
食品用塩溶液のｐＨは、抽出ステップで使用するために、必要に応じて任意の好都合な食品用の酸、通常は塩酸、または食品用アルカリ、通常は水酸化ナトリウムを使用することによって、約５〜約６．８の範囲の任意の所望の値に調節することができる。キャノーラタンパク質単離物が食品以外の使用に企図される場合には、非食品用化学物質を使用することができる。
【００２９】
可溶化ステップの際の食品用塩溶液中の油糧種子粗粉の濃度は、幅広く変わり得る。一般的な濃度値は約５〜約１５％ｗ／ｖである。
【００３０】
塩水溶液を用いたタンパク質抽出ステップは、キャノーラ粗粉に存在し得る脂肪を可溶化するという追加の効果を有し、結果として該脂肪は水相中に存在する。
【００３１】
抽出ステップから得られたタンパク質溶液は、一般に約５〜約４０ｇ／Ｌ、好ましくは約１０〜約３０ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する。
【００３２】
次いで、抽出ステップから得られた水相を、デカンタ型遠心分離機を使用するなどの任意の好都合な方式で残留キャノーラ粗粉から分離し、その後ディスク型遠心分離および／または濾過によって残留粗粉を除去することができる。分離した残留粗粉は乾燥して処分することができる。
【００３３】
粉末状活性炭または他の色素吸着剤を分離タンパク質水溶液と混合し、次いで濾過によって吸着剤を好都合に除去してタンパク質溶液を提供することによって、最終キャノーラタンパク質単離物の色を、薄い色で、より淡い黄色に改善することができる。色素を除去するために、分離タンパク質水溶液のダイアフィルトレーションを、濃縮の前または後に、以下に記載のように用いることもできる。
【００３４】
このような色素除去ステップは、任意の好都合な条件下、一般には分離タンパク質水溶液の周囲温度で、任意の適切な色素吸着剤を使用して実施することができる。粉末状活性炭については、約０．０２５％〜約５％ｗ／ｖ、好ましくは約０．０５％〜約２％ｗ／ｖの量が使用される。
【００３５】
前記米国特許第５８４４０８６号および同第６００５０７６号のように、キャノーラ種子粗粉が相当多量の脂肪を含む場合、分離タンパク質水溶液および以下に述べる濃縮タンパク質水溶液に対して、前記特許に記載の脱脂ステップを行うことができる。色を改善するステップが実施される場合、かかるステップは第１の脱脂ステップの後に行うことができる。
【００３６】
食品用塩水溶液を用いて油糧種子粗粉を抽出する代わりに、水だけを使用してかかる抽出を行うこともできるが、水だけを使用する場合、油糧種子粗粉からのタンパク質抽出量が、食品用塩水溶液の場合よりも減少する傾向にある。このような代替案を用いる場合、以下に記載の濃縮ステップ中、溶液にタンパク質を維持するために、残留油糧種子粗粉から分離した後のタンパク質溶液に上記の濃度の食品用塩を添加することができる。色除去ステップおよび／または第１の脂肪除去ステップを実施する場合、食品用塩は、一般にこのような操作の完了後に添加される。
【００３７】
次いで、タンパク質水溶液を濃縮してそのタンパク質濃度を増大すると同時に、そのイオン強度を実質的に一定に維持する。このような濃縮は、一般に１０〜約３００ｇ／Ｌまたはそれ以上、好ましくは約５０〜約１００ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する濃縮タンパク質溶液を提供するように行われる。
【００３８】
濃縮ステップは、回分式または連続式操作に合致する任意の好都合な方式で、例えば、限外濾過またはダイアフィルトレーションなどの任意の好都合な選択的膜技術を用いて、異なる膜材料および構成を考慮して、約３０００〜約１０００００ダルトン、好ましくは約５０００〜約１００００ダルトンなどの適切な分子量カットオフを有し、連続式操作に関してはタンパク質水溶液が膜を通過する際に所望の濃度を可能にする寸法の、中空糸膜またはスパイラル膜などの膜を使用して行うことができる。
【００３９】
次いで濃縮タンパク質溶液を、抽出溶液と同じモル濃度およびｐＨの塩水溶液を使用して、ダイアフィルトレーションステップにかけることができる。このようなダイアフィルトレーションは、約２〜約２０体積のダイアフィルトレーション溶液、好ましくは約５〜約１０体積のダイアフィルトレーション溶液を使用して行うことができる。ダイアフィルトレーション操作では、透過液と共に膜に通すことによってさらなる量の汚染物質をタンパク質水溶液から除去する。ダイアフィルトレーション操作は、透過液中に相当多量のさらなるフェノール成分および可視色が存在しなくなるまで行うことができる。このようなダイアフィルトレーションは、異なる膜材料および構成を考慮して、約３０００〜約１０００００ダルトン、好ましくは約５０００〜約１００００ダルトンの範囲の分子量カットオフを有する膜を使用して行うことができる。
【００４０】
ダイアフィルトレーションステップの少なくとも一部の間、ダイアフィルトレーション媒体中に酸化防止剤が存在してもよい。酸化防止剤は、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸などの任意の好都合な酸化防止剤が可能である。ダイアフィルトレーション媒体中に使用する酸化防止剤の量は、使用する材料に依存し、約０．０１〜約１ｗｔ％で変わることができ、好ましくは約０．０５ｗｔ％である。酸化防止剤は、濃縮キャノーラタンパク質単離物溶液に存在するフェノール成分の酸化を抑制する働きをする。
【００４１】
濃縮ステップおよびダイアフィルトレーションステップは、任意の好都合な温度で、一般には約２０℃〜約６０℃、好ましくは約２０〜約３０℃で、所望の濃度を実現する時間をかけて行うことができる。使用する温度および他の条件は、濃縮を行うために使用する膜装置および溶液の所望のタンパク質濃度にある程度依存する。
【００４２】
周知のように、限外濾過および類似の選択的膜技術は、低分子量種をそれに通すと同時に、それより高い分子量種が通るのを防止する。低分子量種には、食品用塩のイオン種だけでなく、炭水化物、色素、および非栄養因子などの供給材料から抽出された低分子量材料、ならびにタンパク質の低分子量形態も含まれる。膜の分子量カットオフは、通常、溶液中に相当高い割合のタンパク質を確実に保持すると同時に汚染物質を通すように、異なる膜材料および構成を考慮して選択される。
【００４３】
濃縮し、場合によってはダイアフィルトレーションしたタンパク質溶液を、米国特許第５８４４０８６号および第６００５０７６号に記載のように、必要に応じてさらなる脱脂操作にかけることができる。
【００４４】
濃縮し、場合によってはダイアフィルトレーションしたタンパク質溶液を、上記の色除去操作の代替としての色除去操作にかけることができる。本明細書では、粉末状活性炭も、顆粒状活性炭（ＧＡＣ）と同様に使用することができる。色吸収剤として使用できる別の材料は、ポリビニルピロリドンである。
【００４５】
色吸収剤処理ステップは、任意の好都合な条件下、一般にはキャノーラタンパク質溶液の周囲温度で実施することができる。粉末状活性炭については、約０．０２５％〜約５％ｗ/ｖ、好ましくは約０．０５％〜約２％ｗ/ｖの量を使用することができる。色吸収剤としてポリビニルピロリドンを使用する場合、約０．５％〜約５％ｗ/ｖ、好ましくは約２％〜約３％ｗ/ｖの量を使用することができる。色吸収剤は、濾過などの任意の好都合な手段によって、キャノーラタンパク質溶液から除去することができる。
【００４６】
任意選択の色除去ステップから得られた、濃縮し、場合によってはダイアフィルトレーションしたタンパク質溶液を、低温殺菌にかけて、保存またはその他の結果として元の粗粉に存在し得る細菌を死滅させ、抽出ステップでその粗粉からキャノーラタンパク質単離物溶液に抽出することができる。かかる低温殺菌は任意の所望の低温殺菌条件下で行うことができる。一般に、濃縮し、場合によってはダイアフィルトレーションしたタンパク質溶液を、約５５℃〜約７０℃、好ましくは約６０℃〜約６５℃の温度に約１０〜約１５分、好ましくは約１０分間加熱する。次いで、低温殺菌した濃縮タンパク質溶液を、以下に記載のさらなる処理のために、好ましくは約２５℃〜約４０℃の温度まで冷却することができる。
【００４７】
濃縮し、場合によってはダイアフィルトレーションし、場合によっては低温殺菌したタンパク質水溶液の最適なタンパク質濃度は約５〜約１０ｗｔ％である。というのは、これより高い濃度では、酸性化ステップで溶液を均質に酸性化し、沈殿した固体を分離することを困難にする粘性が生じるからである。この最適なタンパク質濃度は、タンパク質水溶液を必要な濃度に濃縮することによって、または最初にタンパク質水溶液を約２０〜約２５ｗｔ％それ以上の高い濃度に濃縮し、次いで濃縮タンパク質溶液を食品用塩水溶液で約５〜約１０ｗｔ％の範囲に希釈することによって達成することができる。
【００４８】
本明細書でもたらされる等電沈殿物の形成に関して、濃縮し、場合によってはダイアフィルトレーションし、場合によっては低温殺菌したタンパク質溶液は、少なくとも約１ｍＳ、好ましくは約１０〜約２０ｍＳの導電率を有するべきである。
【００４９】
次いで、濃縮し、場合によってはダイアフィルトレーションし、場合によっては低温殺菌したタンパク質溶液を、塩酸などの任意の好都合な酸を使用して、約１０℃〜約７０℃、好ましくは約２０℃〜約４０℃の温度で、約３．０〜約４．０、好ましくは約３．５のｐＨに酸性化して、キャノーラタンパク質単離物の沈殿物を形成させる。その沈殿物を上澄み液から回収し、噴霧乾燥、凍結乾燥、または真空式ドラム乾燥などの任意の好都合な技術によって乾燥して、キャノーラタンパク質単離物を提供することができる。乾燥等電沈殿(ＩＰ)由来のキャノーラタンパク質単離物は、少なくとも約９０ｗｔ％(Ｎ×６．２５)、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％の高いタンパク質含量を有する。
【００５０】
所望ならば、等電沈殿ステップは、濃縮ステップを行わずに直接キャノーラタンパク質溶液で行うことができる。前記の色除去、ダイフィルトレーション、および低温殺菌の任意ステップの１つまたは複数を、等電沈殿ステップの前にキャノーラタンパク質溶液で行うことができる。沈殿キャノーラタンパク質単離物を上澄み液から回収し、乾燥する。
【００５１】
等電沈殿からの上澄み液は、沈殿ステップで沈殿しなかった著しく多量のキャノーラタンパク質を含有しており、主に２Ｓタンパク質の形態のキャノーラタンパク質単離物をそれから回収するために処理される。等電沈殿物の除去後、酸性化ステップからの上澄み液を濃縮して、そのタンパク質濃度を増大することができる。このような濃縮は、限外濾過などの任意の好都合な選択的膜技術を使用し、タンパク質供給材料から抽出された塩および他の低分子量の非タンパク質材料を含む低分子量種を膜に通すと同時に、キャノーラタンパク質を溶液に保持する適切な分子量カットオフを有する膜を使用して行われる。異なる膜材料および構成を考慮して、約３０００〜１０００００ダルトン、好ましくは約５０００〜約１００００ダルトンの分子量カットオフを有する限外濾過膜を使用することができる。この方式で上澄み液を濃縮することによって、タンパク質を回収するために乾燥を要する液体の体積も低減される。上澄み液は一般に、乾燥前に約１００〜約４００ｇ／Ｌ、より好ましくは約２００〜約３００ｇ／Ｌのタンパク質濃度に濃縮される。このような濃縮操作は、タンパク質溶液濃縮ステップに関して先に記載したように、回分式モードまたは連続操作で実施することができる。
【００５２】
濃縮上澄み液を、抽出溶液として水を使用するダイアフィルトレーションステップにかけて、濃縮上澄み液から塩および他の汚染物質を除去することができる。このようなダイアフィルトレーションは、約２〜約２０体積の水、好ましくは約５〜約１０体積の水を使用して行うことができる。このようなダイアフィルトレーションは、異なる膜材料および構成を考慮して、約３０００〜約１０００００ダルトン、好ましくは約５０００〜約１００００ダルトンの範囲の分子量カットオフを有する膜を使用して行うことができる。
【００５３】
ダイアフィルトレーションステップの少なくとも一部の間、ダイアフィルトレーション媒体中に酸化防止剤が存在してもよい。酸化防止剤は、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸などの任意の好都合な酸化防止剤であってよい。ダイアフィルトレーション媒体中に使用する酸化防止剤の量は、約０．０１〜約１ｗｔ％で変わることができ、好ましくは約０．０５ｗｔ％である。
【００５４】
濃縮し、場合によってはダイアフィルトレーションした上澄み液を、噴霧乾燥、凍結乾燥、または真空式ドラム乾燥などの任意の好都合な技術によって乾燥して乾燥形態にし、さらなるキャノーラタンパク質単離物を提供する。かかるさらなるキャノーラタンパク質単離物は、約９０ｗｔ％を超える高いタンパク質含量を有し、好ましくはタンパク質を少なくとも約１００ｗｔ％有する（ケルダールＮ×６．２５として算出）。
【００５５】
所望ならば、上澄み液を前記米国特許出願第１１／０３８０８６号の熱処理ステップにかけて、存在する７Ｓタンパク質および任意の１２Ｓタンパク質を上澄み液から沈殿させて、高い割合の２Ｓタンパク質を有する２Ｓタンパク質単離物を回収することができる。
【００５６】
このような熱処理は、濃縮上澄み液に存在する７Ｓの割合を低減するのに十分な、好ましくは７Ｓタンパク質の割合をかなり大きな程度低減するのに十分な温度および時間プロファイルを使用して行うことができる。一般に、上澄み液の７Ｓタンパク質含量は、熱処理によって、少なくとも約５０ｗｔ％、好ましくは少なくとも約７５ｗｔ％低減される。一般に、熱処理は、約７０℃〜約１００℃、好ましくは約７５℃〜約９５℃の温度で、約２〜約３０分間、好ましくは約５〜約１５分間行うことができる。沈殿した７Ｓタンパク質は、遠心分離または濾過などの任意の好都合な方式で除去することができる。
【００５７】
熱処理操作は、上澄み液の濃縮の前に行うことができるが、好ましくは濃縮ステップの後に行われる。熱処理ステップは、等電沈殿ステップから得られた上澄み液で行ってもよく、あるいは７Ｓおよび１２Ｓタンパク質が低い酸性値ではより分解しやすく、したがって沈殿しやすいことから、上澄み液のｐＨを低い酸性値に調節した後に行ってもよい。上澄み液のｐＨは、約５〜約６．８、好ましくは約５．８〜約６．２のｐＨに調節することができる。このようなｐＨ調節は、水酸化ナトリウム水溶液などの通常の任意のアルカリ化剤を使用して実施することができる。このような熱処理後、ｐＨはより酸性値に調節され、好ましくは約５〜約１０ｗｔ％の範囲にすることができる。
【００５８】
さらに上澄み液は、濃縮前もしくは濃縮後、および／または熱処理前もしくは熱処理後に、上記の量の粉末状活性炭、顆粒状活性炭、および／またはポリビニルピロリドンなどの任意の通常の色素吸着剤を使用する上記の色除去操作の代替として、またはそれに追加されるステップとしての、最終生成物の色を改善する色除去操作にかけることができる。
【００５９】
所望ならば、湿潤等電沈殿物の少なくとも一部を、混合タンパク質ストリームを乾燥する前に、任意の好都合な技術によって濃縮上澄み液の少なくとも一部分と混合し、混合キャノーラタンパク質単離物組成物を提供することができる。一緒に混合したタンパク質性物質の相対割合は、所望のプロファイルの２Ｓ/７Ｓ/１２Ｓタンパク質を有する生成キャノーラタンパク質単離物組成物を提供するように選択することができる。あるいは、乾燥タンパク質単離物は、任意の所望の割合で混合して、所望のいかなる特定の２Ｓ/７Ｓ/１２Ｓタンパク質プロファイルもその混合物に付与することができる。混合したキャノーラタンパク質単離物組成物は、約９０ｗｔ％超、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％の高いタンパク質含量を有する(ケルダールＮ×６．２５として算出)。
【００６０】
濃縮上澄み液のわずか一部を等電沈殿物のわずか一部と混合し、得られた混合物を乾燥する別の代替手順では、濃縮上澄み液の残りを、等電沈殿物の残りのいずれかとして乾燥することができる。さらに、乾燥等電沈殿物および乾燥上澄み液を、上記の任意の所望の相対割合で乾燥混合することもできる。
【００６１】
この方式で操作することによって、多くのキャノーラタンパク質単離物を、乾燥等電沈殿物、乾燥上澄み液の形態で回収することができ、等電沈殿由来のキャノーラタンパク質単離物および上澄み液由来のキャノーラタンパク質単離物が、組成物における２Ｓ/７Ｓ/１２Ｓタンパク質の異なる割合を基にして異なる機能特性および栄養特性を得るのに望ましい、一般には重量で約５：９５〜約９５：５の様々な重量割合の乾燥混合物の形態で回収することもできる。
【００６２】
先に記載したように、等電沈殿に由来すると同時に少なくとも約９０ｗｔ％(Ｎ×６．２５)、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％のタンパク質含量を有するキャノーラタンパク質は、前記米国特許出願第１０／１３７３９１号および同第１０／４７６６３０号の手順に従って、濃縮し、場合によってはダイアフィルトレーションし、場合によっては低温殺菌したタンパク質溶液を希釈することによって生成したＰＭＭから生成することができる。
【００６３】
好ましくは湿潤形態であるが乾燥形態も可能であるＰＭＭを、高温を用いることもできるが好ましくは周囲温度で、少なくとも約０．０５、好ましくは少なくとも約０．１のイオン強度を有する塩化ナトリウムなどの食品用塩溶液に溶かして、一般に約１〜約３０ｗｔ％、またはそれ以上、好ましくは約５〜約１０ｗｔ％のタンパク質濃度を有するタンパク質水溶液を形成することができる。次いで、得られたタンパク質水溶液を上記の等電沈殿ステップにかける。
【００６４】
上記のように、また以下の実施例に示すように、等電沈殿したキャノーラタンパク質単離物は、ＰＭＭ由来のキャノーラタンパク質単離物よりもかなり高い水結合能を有する。この手順を使用すると、ＰＭＭを等電沈殿物に変換することによって、ＰＭＭ沈殿ステップからの上澄み液に由来する高度可溶性のキャノーラタンパク質単離物、および高い水結合能のキャノーラタンパク質単離物の生成が可能になる。
【００６５】
（実施例）
実施例１：
この実施例は、本発明の一実施形態のキャノーラタンパク質単離物の調製を示すものである。
【００６６】
市販のキャノーラ油糧種子粗粉１５０ｋｇを、０．１ＭのＮａＣｌ１０００Ｌに６０℃で添加し、５分間攪拌して、タンパク質水溶液を提供する。
【００６７】
タンパク質含量１６．８ｇ／Ｌを有する浄化したキャノーラタンパク質溶液を、それぞれ５０００および１００００ダルトンの分子量カットオフを有する二フッ化ポリビニルジエン(ＰＶＤＦ)膜およびポリエーテルスルホン(ＰＥＳ)膜を有する限外濾過システム(ＵＦ１)で、６０℃で濃縮することによって体積を６０Ｌに低減した。次いで、限外濾過したキャノーラタンパク質溶液を、それぞれ５０００および１００００ダルトンの分子量カットオフを有するＰＶＤＦ膜およびＰＥＳ膜を使用するダイアフィルトレーションシステムで、アスコルビン酸０．０５ｗｔ％を含有する０．１ＭのＮａＣｌ溶液を使用して６０℃で５回ダイアフィルトレーションして、タンパク質含量が１７４．７ｇ／Ｌの最終体積４５Ｌにした。
【００６８】
濃縮し、ダイアフィルトレーションしたキャノーラタンパク質溶液(ＵＦ１保持液)のサンプル４Ｌを、０．１ＮａＣｌの１２Ｌと混合して、タンパク質濃度を４６．８ｇ／Ｌに調節した。酸性化キャノーラタンパク質溶液のｐＨが３．５になるまで、濃縮ＨＣＬを希釈溶液に２２℃で添加して等電沈殿を行った。
【００６９】
サンプルが濁り、１５分間静置した。次いでサンプルを、４×１Ｌの回分で、７１００ｇで１５分間の遠心分離にかけて沈殿物を収集した。収集した沈殿物(ＩＥＰ沈殿物)を、上澄み液から分離し凍結乾燥した。乾燥沈殿物(Ｃ３０２)は、１０２．４３ｗｔ％(Ｎ×６．２５)ｄ.ｂ.のタンパク質含量を有していることが見出された(タンパク質のパーセンテージ値は、ＬＥＣＯ ＦＰ３２８ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｏｒを使用して決定した）。
【００７０】
遠心分離からの上澄み液約１６Ｌ(ＩＥＰ上澄み液)を、１０００００ダルトンの分子量カットオフを有するＰＥＳ膜を使用する限外濾過システム(ＵＦ２)で３Ｌに濃縮した。次いで濃縮上澄み液を、１０００００ダルトンの分子量カットオフを有するＰＥＳ膜を使用するダイアフィルトレーションシステムで、９体積の水を用いてダイアフィルトレーションして、タンパク質含量が７２．１ｇ／Ｌの最終体積３．５Ｌにした。タンパク質溶液を噴霧乾燥した。
【００７１】
乾燥タンパク質(Ｃ２０２)は、１０４．０５ｗｔ％(Ｎ×６．２５）ｄ.ｂ.のタンパク質含量を有していることが見出された。
【００７２】
実施例２：
この実施例は、前記米国特許出願第１０/１３７３９１号の手順による、キャノーラタンパク質単離物のサンプルの調製を記載するものである。
【００７３】
キャノーラ粗粉「ａ」ｋｇを、０．１ＭのＮａＣｌ溶液「ｂ」Ｌに６０℃で添加し、５分の保持時間で連続抽出してタンパク質水溶液を提供した。残留キャノーラ粗粉を除去し、得られたタンパク質溶液を遠心分離および濾過によって浄化して、「ｄ」重量％のタンパク質含量を有する濾過タンパク質溶液「ｃ」Ｌを生成した。
【００７４】
タンパク質抽出溶液の一定分量「ｅ」Ｌを、それぞれ５０００および１００００ダルトンの分子量カットオフを有するＰＶＤＦ膜およびＰＥＳ膜を使用する限外濾過システムで濃縮することによって、体積を「ｆ」Ｌに低減し、次いでアスコルビン酸０．０５％を含有する０．１ＭのＮａＣｌ溶液「ｇ」Ｌでダイアフィルトレーションした。得られた濃縮タンパク質溶液は、「ｈ」重量％のタンパク質含量を有していた。
【００７５】
「ｉ」℃の濃縮溶液（等電沈殿で除去されたより少ない部分）を、温度「ｋ」℃を有する冷却ＲＯ水に希釈した「ｊ」。直ちに白雲色が生じ、静置して沈降させた。上部の希釈水を除去し、沈殿した粘稠、粘着性の塊(ＰＭＭ)を、濾過タンパク質溶液に対して「ｌ」ｗｔ％の収率で、容器の底から回収した。乾燥ＰＭＭ由来のタンパク質は、「ｍ」％(Ｎ×６．２５)ｄ.ｂ.のタンパク質含量を有していることが見出された。該生成物を「ｎ」で示した(Ｃ３００)。
【００７６】
パラメータ「ａ」〜「ｎ」を、以下の表Ｉに示す。
【００７７】
【表１】
【００７８】
除去した希釈水を、１００００ダルトンの分子量カットオフを有するＰＥＳ膜を使用して限外濾過することによって、体積を「ｏ」Ｌに低減した。濃縮物は、タンパク質「ｐ」重量％を含有していた。上澄み液からさらなるタンパク質を回収し、濾過タンパク質溶液の全タンパク質回収量は「ｑ」ｗｔ％となった。濃縮物を噴霧乾燥して、「ｎ」で示され、「ｒ」％(Ｎ×６．２５)ｄ.ｂ.のタンパク質含量を有する最終生成物(Ｃ２００)を形成した。
【００７９】
パラメータ「ｎ」〜「ｒ」を、以下の表ＩＩに示す。
【００８０】
【表２】
【００８１】
実施例３：
この実施例は、等電沈殿によって生成したタンパク質単離物(Ｃ３０２)および得られた上澄み液から生成したタンパク質単離物(Ｃ２０２)の分析を行うものである。
【００８２】
実施例１の方法によって生成した等電沈殿物は水に溶けず、したがってＨＰＬＣではそのタンパク質プロファイルを決定することができなかった。しかし、１２Ｓ、７Ｓ、および２Ｓキャノーラタンパク質のＨＰＬＣ分析は、手順のいくつかの段階で提供された材料で行った。その結果を以下の表ＩＩＩにまとめて示す。タンパク質プロファイルはタンパク質に起因する全ピーク領域のパーセンテージとして表す。
【００８３】
【表３】
【００８４】
このデータから分かるように、等電沈殿によって、溶液中の１２Ｓおよび７Ｓの割合が大きく減少した。これらの種は沈殿したが、低ｐＨ環境によって１２Ｓおよび７Ｓタンパク質がより小さいサブユニットに解離し、それが２Ｓ領域に重複して溶出したと考えられる。
【００８５】
ＡＬ０２２−Ｈ２３−０４Ａ生成物の質的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を実施して、これらの組成をさらに洞察した。Ｃ３０２は、電気泳動緩衝液に完全には溶けず、したがってサンプルの一部はゲルに入らず元のままであった。Ｃ３０２について解明されたバンドによって、主に７Ｓ/１２Ｓが存在し、２Ｓは低濃度であることが示され、これはＣ３００の分析で認められたものに類似していた。Ｃ２０２およびＣ２００は両方完全に溶解し、したがって確実に比較することができた。Ｃ２０２に残っていた７Ｓ/１２Ｓの割合は、Ｃ２００に認められたものよりも高かったことが明らかとなった。このことは、ＨＰＬＣ分析の結果に反し、ＨＰＬＣ分析においては、いくらか分解した７Ｓ/１２Ｓが２Ｓと共溶出するという仮説を裏付けるものである。ＨＰＬＣ分析の結果を、以下の表ＩＶに示す。
【００８６】
【表４】
【００８７】
Ｃ３０２およびＣ２０２単離物の色はかなり濃かったが、実施例２に記載のように調製したＣ３００およびＣ２００に、それぞれ依然として類似していた。ＤＰ３０１データ処理装置に接続したＭｉｎｏｔａＣＲ３１０色彩色差計を使用して得られた結果を、以下の表Ｖに示す。
【００８８】
【表５】
【００８９】
実施例４：
この実施例は、実施例１に従って生成した、等電沈殿によって生成されたタンパク質(Ｃ３０２)および得られた上澄み液から生成されたタンパク質(Ｃ２０２)の溶解度と、実施例２の手順に従って生成した、ＰＭＭに由来するタンパク質(Ｃ３００)およびＰＭＭ沈殿からの上澄み液に由来するタンパク質(Ｃ２００)の溶解度とを比較するものである。
【００９０】
溶解度は、Morr等、J.Food Sci.、50：1715〜1718に基づく方法を使用して決定した。タンパク質０．５ｇを供給するのに十分なタンパク質粉末を秤量してビーカーに入れ、次いで少量の逆浸透(ＲＯ)精製水を添加し、滑らかなペーストが形成されるまでその混合物を攪拌した。次いで、さらなる水を添加して、体積を約４５ｍｌにした。次いで磁気攪拌器を使用して、ビーカーの内容物を６０分間ゆっくり攪拌した。
【００９１】
タンパク質が分散した直後に各サンプルのｐＨを決定し、次いでＮａＯＨまたはＨＣＬを使用して、ｐＨを４、５、６、または７に調節した。攪拌の６０分の間に、ｐＨを２回測定し補正した。攪拌が完了した後、サンプルを、ＲＯ水で全体積が５０ｍｌになるようにし、１％ｗ／ｖのタンパク質分散液を得た。タンパク質分散液の一定分量を、タンパク質含量の決定のために備蓄した。サンプルの別の部分を、８０００ｇで１０分間の遠心分離にかけ、それによって溶解しなかった材料が沈降し、透明な上澄み液が得られた。次いで、上澄み液のタンパク質含量を決定し、溶解度を以下のように算出した
溶解度（％）＝（上澄み液のタンパク質濃度／元の分散液のタンパク質濃度）×１００。
【００９２】
さらに、Ｃ３０２およびＣ２０２サンプルの０．１ＭのＮａＣｌへの溶解度を、上記の手順を使用し、水の代わりに食塩水を用いて決定した。
【００９３】
Ｃ３０２サンプルの水および０．１ＭのＮａＣｌへの溶解度、ならびにＣ３００サンプルの水への溶解度を、それぞれ以下の表ＶＩおよびＶＩＩに示す。
【００９４】
【表６】
【００９５】
【表７】
【００９６】
これらの表から分かるように、Ｃ３０２サンプルの水および０．１Ｍの食塩水への溶解度は、ｐＨにかかわらず共に不十分であった。Ｃ３０２サンプルの水への溶解度はＣ３００よりかなり低かった。
【００９７】
Ｃ２０２サンプルの水および０．１ＭのＮａＣｌへの溶解度、ならびにＣ２００サンプルの水への溶解度を、それぞれ以下の表ＶＩＩＩおよびＩＸに示す。
【００９８】
【表８】
【００９９】
【表９】
【０１００】
このデータから分かるように、Ｃ２０２サンプルの溶解度は、Ｃ３０２サンプルのものよりかなり良好であった。Ｃ２０２サンプルの水への溶解度は、ｐＨ４および５においてはＣ２００サンプルと同等であったが、ｐＨ６および７では劣っていた。
【０１０１】
実施例５：
この実施例は、実施例１の手順に従って生成したＣ３０２およびＣ２０２キャノーラタンパク質単離物サンプルの気泡性を、実施例２の手順に従って生成したＣ３００およびＣ２００キャノーラタンパク質単離物サンプルと比較して示すものである。
【０１０２】
タンパク質７．５ｇを供給するのに十分なタンパク質粉末を秤量して、ビーカーに入れた。少量の０．０７５ＭのＮａＣｌ溶液を、タンパク質粉末に攪拌しながら入れて、ペーストを生成した。次いで、体積を約１４０ｍｌにするのに十分な食塩水溶液を添加し、その混合物を磁気攪拌器で攪拌した。気泡の形成を回避するように、攪拌速度を制御した。攪拌の１０分後、溶液のｐＨを、必要に応じてＮａＯＨまたはＨＣｌを使用して７の値に調節した。次いでその混合物をさらに１０分間攪拌し、ｐＨを補正した。次いで、サンプルを０．０７５ＭのＮａＣｌで１５０ｍｌにして、５％ｗ／ｖの分散液を得た。
【０１０３】
タンパク質分散液のサンプル(７５ｍｌ)を、Ｈｏｂａｒｔ Ｎ−５０ミキサー(Hobart Corporation、Troy、OH)のボウルに入れ、泡立て器アタッチメントを使用して、ミキサーの最高速度(設定３)で１５分間泡立てた。５分毎に泡立てるのを止め、２つの計量カップ(１２５ｍｌ)に気泡を満たし、秤量した。次いで、これらの気泡サンプルをボウルに戻した後、泡立てを継続した。以下の等式(Phillips等、J.Food Sci.、55(5)；1441〜1444、1453)を使用して、各時点での超過量を算出した
超過量（％）＝［（ｗｔ液体サンプル（１２５ｍｌ）−ｗｔ気泡（１２５ｍｌ））／ｗｔ気泡（１２５ｍｌ）］×１００。
【０１０４】
気泡の安定性を測定するために、タンパク質分散液の第２のサンプル(７５ｍｌ)を、Ｈｏｂａｒｔ Ｎ−５０ミキサーの特別ボウルに入れ、泡立て器アタッチメントを使用して、ミキサーの最高速度(設定３)で１５分間泡立てた。この特別ボウルは、ビーターの経路のちょうど外側に、ボウル底部に開けられた６ｍｍの穴を含んでいる。泡立てる間、テープ片でこの穴を被覆した。泡立てが完了すると、そのテープを除去し、攪拌棒でその穴をはっきりとさせた。ボウルから排出した材料の重量を、１５分間５分毎に決定した。排出したサンプルの重量を、気泡の初めの重量で割って、ボウルから排出した材料のパーセンテージを算出した。
【０１０５】
Ｃ３０２の気泡の超過量および気泡の安定性を、それぞれ表Ｘおよび表ＸＩに示す。
【０１０６】
【表１０】
【０１０７】
【表１１】
【０１０８】
以上のように、Ｃ３０２生成物は、不十分な気泡形成および不十分な気泡安定性を示したが、このことは、実施例３から分かるように、同生成物の溶解度が不十分であることに起因し得る。
【０１０９】
Ｃ２００と比較したＣ２０２の気泡超過量および気泡安定性を、それぞれ以下の表ＸＩＩおよびＸＩＩＩに示す。
【０１１０】
【表１２】
【０１１１】
【表１３】
【０１１２】
これらの表から分かるように、Ｃ２０２は良好な気泡性と共に、多量の超過量および優れた安定性を有していた。しかし、気泡の体積はＣ２００のものより少なかった。Ｃ２０２の気泡の外観も、Ｃ２００のものより劣っていた。Ｃ２００は、滑らかな気泡を形成したが、Ｃ２０２の気泡はより乾燥した外観であり、分散していないタンパク質粒子をいくらか有していたが、これはｐＨ７の食塩水へのＣ２０２の部分的な溶解度に起因した可能性が高い。
【０１１３】
実施例５：
この実施例は、実施例１の手順に従って生成したＣ３０２およびＣ２０２キャノーラタンパク質単離物サンプルの乳化活性を示すものである。
【０１１４】
タンパク質１．５ｇを供給するのに十分なタンパク質粉末を、ＲＯ水を添加することによって１５０ｇにした。そのサンプルを、タンパク質が完全に分散するまで、Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎミキサーを用いて４５００ｒｐｍで処理した。次いで、サンプルのｐＨを、必要に応じてＮａＯＨまたはＨＣｌを使用して、ｐＨ７に調節した。キャノーラ油(１５０ｇ)を添加して、５０％ｗ／ｗ油および０．５％ｗ／ｗタンパク質になる混合物を得た。Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎミキサーを用いて、５０００ｒｐｍで５分間処理することによって、混合物の乳化を実現した。
【０１１５】
エマルジョンのサンプルを、０．１％のＳＤＳ溶液で１：５００に希釈し、５００ｎｍにおける吸光度を読み取った(少なくとも２回行った)。エマルジョンサンプルの含水量も算出した。次いで、濁度および乳化の活性指数(安定化した脂肪小滴表面積ｍ2／タンパク質ｇ)を、Hill(1996)Emulsions.In：Methods of Testing Protein Functionality.Hall、G.M.(ed).pp.153〜185に詳説されているように算出した。
【０１１６】
サンプルＣ３０２、Ｃ３００、Ｃ２０２、およびＣ２００の乳化活性を、以下の表ＸＩＶに示す。
【０１１７】
【表１４】
【０１１８】
このデータから分かるように、Ｃ３０２サンプルは乳化活性が非常に乏しく、Ｃ３００サンプルよりも著しく低かった。
【０１１９】
実施例７：
この実施例は、実施例１の手順に従って生成したＣ３０２およびＣ２０２サンプルの水結合能を、実施例２の手順に従って生成したＣ３００およびＣ２００サンプルと比較して示すものである。
【０１２０】
タンパク質粉末(１ｇ)を秤量して、知られている重量の遠心分離管(５０ｍｌ)に入れた。この粉末に中性ｐＨの脱イオン水２０ｍｌを添加した。ボルテックスミキサーを使用して、試験管の内容物を中程度の速度で１分間混合した。次いで、５分後と１０分後に３０秒のボルテックス混合を行い、サンプルを室温で合計１０分間インキュベートした。次にそのサンプルを２０℃において１０００ｇで１５分間の遠心分離にかけた。遠心分離後、試験管にすべての固体材料を確実に残しながら、上澄み液を注意深く除去した。次いで、遠心分離管を再び秤量し、水飽和サンプルの重量を決定した。
【０１２１】
水結合能（ＷＢＣ）を以下のように算出した
ＷＢＣ（ｍｌ／ｇ）＝（湿潤サンプルの質量−乾燥サンプルの質量）／（乾燥サンプルの質量×サンプルの全固体含量）。
【０１２２】
Ｃ３００およびＣ２００サンプルと比較したＣ３０２およびＣ２０２サンプルの水結合能を、以下の表ＸＶに示す。
【０１２３】
【表１５】
【０１２４】
このデータから分かるように、Ｃ３０２サンプルの水結合能は優れており、Ｃ３００サンプルよりはるかに高かった。実施例３に記載のように、Ｃ２０２およびＣ２００サンプルは水への溶解度が高く、したがって水を排出した後に試験管に残る材料の重量は、タンパク質粉末の元の重量より少なかった。したがって、これらのサンプルの水結合能を零とする。
【０１２５】
実施例８：
この実施例は、実施例１に従って生成したＣ３０２およびＣ２０２サンプルの油結合能を、実施例２に従って生成したＣ３００およびＣ２００サンプルと比較して示すものである。
【０１２６】
油結合能は、水２０ｍｌの代わりに油２０ｍｌを使用したことを除いて、実施例６に記載の水結合能と同じ方法によって評価し、油結合能(ＯＢＣ)は以下のように算出した
ＯＢＣ（ｍｌ／ｇ）＝［（湿潤サンプルの塊−乾燥サンプルの塊）／油密度］／（乾燥サンプルの塊×サンプルの全固体量）。
【０１２７】
Ｃ３０２およびＣ２０２サンプルについて得られた結果を、Ｃ３００およびＣ２００サンプルと比較して以下の表ＸＶＩに示した。
【０１２８】
【表１６】
【０１２９】
このデータから分かるように、Ｃ２０２サンプルの油結合能は、Ｃ２００サンプルのものよりも良好であったが、Ｃ３０２の油結合能はＣ３００サンプルのものよりわずかに劣っていた。
【０１３０】
実施例９：
この実施例は、実施例２の手順に従って生成したＰＭＭからの等電沈殿物の調製を示すものである。
【０１３１】
実施例２に記載の手順後に行った、プロセスＢＷ−ＡＬ０２２−Ｌ１５−０４Ａの流れからのＰＭＭ含有希釈ペレット(１００．４７ｇ、２３．１５％タンパク質)を、０．１ＭのＮａＣｌ溶液(３６４．７３ｇ)と混合して、４．５４％のタンパク質含量を有するサンプルを産出した。５％のＨＣｌを使用して、溶液のｐＨを初期値の６．０２から３．５０まで低減した。サンプルを１５分間静置し、次いで７１００ｇで１５分間の遠心分離にかけて、上澄み液から沈殿タンパク質を分離した。湿潤沈殿物(２６．０１ｇ)を凍結乾燥して、Ｃ３０２タンパク質５．４５ｇを生成した。Ｃ３０２タンパク質のタンパク質含量は、湿潤ベースで９０．１７％であり(含水量は決定されず)、そのことはタンパク質が単離物であったことを示すものである。
【０１３２】
Ｃ３０２タンパク質の水結合能を、同じ流れからのＣ３００タンパク質と比較して、実施例７の手順に従って決定した。結果を以下の表ＸＶＩＩに記載する。
【０１３３】
【表１７】
【０１３４】
この表から分かるように、Ｃ３０２生成物は、同じ回分で生成したＣ３００タンパク質よりも多くの水に結合し、Ｃ３００生成物と比較して、実施例７のＣ３０２タンパク質によって示されたのと同じ高い水結合能を示した。
【０１３５】
実施例１０：
この実施例は、濃縮ステップなしにタンパク質水溶液の等電沈殿を行い、上澄み液を処理して、主に２Ｓタンパク質であるキャノーラタンパク質単離物を回収することを示すものである。
【０１３６】
キャノーラ油糧種子粗粉１５ｋｇを、０．１５ＭのＮａＣｌ１５０Ｌを用いて、室温で３０分間攪拌することによって抽出した。デカンタに通過させることによって、使用済み粗粉から抽出物を分離し、その抽出物を、２．０μｍおよび０．８μｍの孔径を有する濾紙に逐次的に通過させることによってさらに浄化した。次いで、２ＭのＨＣｌを添加することによって、濾液のｐＨを初期値の５．６６から３．５に低減し、その結果沈殿物が形成され、それを２．０μｍおよび０．８μｍの孔径を有する濾紙に逐次的に通過させることによって除去した。沈殿物はこの実験では回収しなかった。
【０１３７】
次いで、等電沈殿からの上澄み液を、１００００ＤａのＭＷＣＯを有するＰＥＳ膜を使用して、小さい膜単位で濃縮した。サンプルを１０６Ｌから約５Ｌの体積に低減した。次いで、ｐＨ３．５の７体積の水を用いて濃縮サンプルをダイアフィルトレーションして含塩量を低減した。次いで、ダイアフィルトレーションした保持液を３つのサンプルに分けた。
【０１３８】
第１のサンプル(対照)を、６０℃で１０分間低温殺菌し、２５℃に冷却し、１０２００ｇで１０分間の遠心分離にかけ、３番(極細目)の濾紙で濾過した。第２のサンプルを、８５℃で１０分間熱処理し、２５℃に冷却し、１０２００ｇで１０分間の遠心分離にかけ、続いて３番の濾紙で濾過した。水酸化ナトリウム水溶液を添加することによって、第３のサンプルのｐＨを６まで上げ、そのサンプルを８０℃で１０分間熱処理し、次いで２５℃に冷却した。形成された沈殿物を、１０２００ｇで１０分間の遠心分離にかけ、次いで３番の濾紙で濾過することによって回収した。次いで、３つの生成物を噴霧乾燥し、Ｃ２０２(対照)、Ｃ２０２Ｈ ｐＨ３．５(ｐＨ３．５で熱処理)、およびＣ２０２Ｈ ｐＨ６(ｐＨ６で熱処理）の記号を付した。
【０１３９】
プロセスサンプルを、遊離フェノール成分(３３０ｎｍにおける吸光度)、可視色(３９０ｎｍにおける吸光度)、タンパク質含量(ＬＥＣＯ)、および／またはタンパク質プロファイル(ＳＥＣ ＨＰＬＣ)について分析した。低ｐＨ条件によって、７Ｓおよび１２Ｓがより小さいサブユニットに変換され、それが２Ｓピークと重複して溶出するため、酸性化サンプルのＨＰＬＣクロマトグラムは解明困難であった。最終生成物を、含水量(オーブン法）、乾き色(Ｍｉｎｏｌｔａ色差計)についても分析し、濡れ色分析のために溶液を調製した。ボルテックスミキサーを使用して、タンパク質粉末(０．３５ｇ)を水(１０ｍｌ)に溶かした。Ｃ２０２ ｐＨ６の生成物について、ＨＣｌを添加することによって、濡れ色サンプルのｐＨを４に低減した。湿潤サンプルの可視色を、Ａ３９０によって評価し、６００ｎｍにおける透明性およびｐＨを測定した。
【０１４０】
等電沈殿ステップの結果、浄化した抽出物から４６％の窒素が除去された。酸性化前の濾液のタンパク質プロファイルは、７Ｓ４８．９％：１２Ｓ１．７％：２Ｓ４９．４％であり、等電沈殿物の除去後では、７Ｓ２．０％：１２Ｓ０．４％：２Ｓ９７．６％であった。７Ｓおよび１２Ｓは、沈殿した主な種であったが、その除去は、ＨＰＬＣデータに示されるほど完全ではないと考えられている。先に述べたように、低ｐＨ条件によって、７Ｓおよび１２Ｓがより小さいサブユニットに変換され、それが２Ｓピークと重複して溶出する。したがって、酸性化サンプルの「２Ｓ」のいくらかは、分解した７Ｓおよび１２Ｓであり得る。ｐＨ３．５における濃縮サンプルの熱処理によって、混濁はわずかに増大したが、著しい沈殿物の形成はなかった。ｐＨ６における熱処理の結果、著しく多量のタンパク質が沈殿した。
【０１４１】
生成したＣ２０２生成物のすべては、表ＸＶＩＩＩで示す単離物であった。
【０１４２】
【表１８】
【０１４３】
Ｃ２０２生成物の乾き色を、表ＸＩＸに示す。結果は極めて類似していたが、ｐＨ３．５で熱処理したサンプルは、対照サンプルよりも赤く、黄色味が少なかった。他のサンプルと比較して７Ｓおよび１２Ｓが激減したＣ２０２Ｈ ｐＨ６サンプルは、最も淡く、最も緑色であり(最も赤色ではない)、対照よりもやはり黄色味が少なかった。
【０１４４】
【表１９】
【０１４５】
Ｃ２０２サンプルの濡れ色は、非常に類似しているように見えた。Ｃ２０２Ｈ ｐＨ６サンプルの透明性は、最良に見えた。吸光度測定によって評価した場合、Ｃ２０２Ｈ ｐＨ６サンプルは、最も淡く最も透明であることが見出された。しかし、３つのサンプルの差異は極めて小さく、すべて許容できるものであった(表ＸＸ)。すべてのサンプルの透明性は、サンプルを冷凍温度に冷却した場合も依然として安定であることが見出された。
【０１４６】
【表２０】
【０１４７】
実施例１１：
この実施例は、実施例１０に記載のように調製した上澄み液由来のキャノーラタンパク質単離物の機能性を、溶解度、気泡超過量、および気泡安定性について示すものである。
【０１４８】
実施例１０に記載のように調製したキャノーラタンパク質単離物のサンプルを、機能性について評価した。
【０１４９】
溶解度：
生成物の溶解度は、Ｍｏｒｒ等によって報告されたものに基づく方法を使用して決定した。タンパク質０．５ｇを供給するのに十分なタンパク質粉末を秤量して、５つのビーカーのそれぞれに入れ、次いで各サンプルに少量の逆浸透(ＲＯ)精製水を添加し、滑らかなペーストが形成されるまでその混合物を攪拌した。次いで、さらなる水を添加して、サンプルの体積を約４０ｍｌにした。次いで、磁気攪拌器を使用して、ビーカーの内容物を６０分間ゆっくり攪拌した。タンパク質が分散した直後にｐＨを決定し、１つのサンプルを中性ｐＨで攪拌し、その他を、ＮａＯＨまたはＨＣｌを用いてｐＨ４、５、６、または７に調節した。６０分の攪拌の間、調節したサンプルのｐＨを２回測定し補正した。６０分の攪拌の後、サンプルをＲＯ水で全体積が５０ｍｌになるようにし、１％ｗ／ｖのタンパク質分散液を得た。各タンパク質分散液の一定分量を、ＬＥＣＯによってタンパク質含量を決定するために備蓄した。サンプルの別の部分を、７８００ｇで１０分間の遠心分離にかけた。これによって、溶解しなかった材料が沈降し、透明な上澄み液が得られた。次いで上澄み液のタンパク質含量を決定した。
【０１５０】
溶解度（％）＝（上澄み液のタンパク質濃度／元の分散液のタンパク質濃度）×１００
Ｃ２０２対照の溶解度を、以下の表ＸＸＩに示す。
【０１５１】
【表２１】
【０１５２】
この表から分かるように、Ｃ２０２対照の溶解度は、考慮される全ｐＨ範囲にわたって非常に良好であることが見出された。
【０１５３】
気泡超過量：
タンパク質８ｇを供給するのに十分なタンパク質粉末を秤量して、ビーカーに入れた。少量の水をタンパク質粉末に攪拌しながら入れて、ペーストを生成した。次いで、体積を約１５０ｍｌにするのに十分な水を添加し、その混合物を磁気攪拌器で攪拌した。気泡の形成を回避するように攪拌速度を制御した。攪拌の約２０分後、必要に応じてＮａＯＨまたはＨＣｌを使用して溶液のｐＨを７の値に調節した。次いでその混合物をさらに１０分間攪拌し、ｐＨを補正した。次いで、サンプルを水で１６０ｍｌにして、５％ｗ／ｖの分散液を得た。
【０１５４】
タンパク質分散液のサンプル(７５ｍｌ)を、Ｈｏｂａｒｔ Ｎ−５０ミキサー(Hobart Corporation、Troy、OH)のボウルに入れ、泡立て器アタッチメントを使用して、５分間、ミキサーの最高速度(設定３)で泡立てた。泡立ての２、３．５、および５分後に泡立てるのを止め、２つの計量カップ(１２５ｍｌ)に気泡を満たし、秤量した。次いで、これらの気泡サンプルをボウルに戻した後、泡立てを継続した。以下の等式(Phillips等)を使用して、各時点での超過量を算出した
超過量（％）＝［（ｗｔ液体サンプル（１２５ｍｌ）−ｗｔ気泡（１２５ｍｌ））／ｗｔ気泡（１２５ｍｌ）］×１００。
【０１５５】
気泡安定性：
気泡の安定性を測定するために、タンパク質分散液の第２のサンプル(７５ｍｌ)を、Ｈｏｂａｒｔ Ｎ−５０ミキサーの特別ボウルに入れ、泡立て器アタッチメントを使用して、５分間、ミキサーの最高速度(設定３)で泡立てた。この特別ボウルは、ビーターの経路のちょうど外側に、ボウル底部に開けられた６ｍｍの穴を含んでいる(Phillips等、１９９０)。泡立てる間、テープ片でこの穴を被覆した。泡立てが完了すると、そのテープを除去し、攪拌棒でその穴をはっきりさせた。ボウルから排出した材料の重量を、１５分間５分毎に決定した。排出したサンプルの重量を、気泡の初めの重量で割って、ボウルから排出した材料のパーセンテージを算出した。
【０１５６】
Ｃ２０２生成物の超過量に対する泡立て時間の効果を、以下の表ＸＸＩＩに示す。
【０１５７】
【表２２】
【０１５８】
試験したＣ２０２生成物の気泡性は優れており、多量の超過量（表ＸＸＩＩ）および良好な安定性を伴っていた。Ｃ２０２対照およびＣ２０２Ｈ ｐＨ６サンプルに関して、気泡を泡立てた後１５分間、質量損失は記録されなかった。Ｃ２０２Ｈ ｐＨ６サンプルでは、１５分の刻時点においてボウルから懸滴したのに対して、同じ時間が経過した後の対照サンプルでは液滴の形成は確認されなかったため、Ｃ２０２対照の安定性はＣ２０２Ｈ ｐＨ６サンプルよりも良好であると認められた。
【０１５９】
実施例１２：
この実施例は、濃縮ステップなしにタンパク質水溶液の等電沈殿を行い、主に７Ｓタンパク質であるキャノーラタンパク質単離物を回収し、上澄み液を処理して、主に２Ｓタンパク質であるキャノーラタンパク質単離物を回収することを示すものである。
【０１６０】
キャノーラ粗粉１８０ｇを、０．１５ＭのＮａＣｌ１８００ｍｌを用いて、室温で３０分間、オーバーヘッド攪拌機で攪拌することによって抽出した。７１００ｇで１０分間の遠心分離にかけることによって、使用済み粗粉から抽出物を分離し、その抽出物を、１組の３番（極細目）の濾紙で濾過することによってさらに浄化した。次いで、６ＭのＨＣｌを添加することによって、濾液のｐＨを初期値の５．７２から３．５に低減し、サンプルを１５分間静置した。形成された沈殿物を、７１００ｇで１０分間の遠心分離にかけることによって除去し、次いで凍結乾燥した。この生成物にＣ３０２の記号を付した。
【０１６１】
等電上澄み液を、１組の３番濾紙に通すことによってさらに浄化した。次いで、浄化した上澄み液を、１００００ＤａのＭＷＣＯを有するＨｙｄｒｏｓａｒｔ膜を備えるＶｉｖａｆｌｏｗ膜ユニットで濃縮した。サンプルを、約９５０ｍｌから約２６．５ｍｌの体積に低減した。次いで、濃縮サンプルをｐＨ３．５の水５体積でダイアフィルトレーションして含塩量を低減した。次いで、ダイアフィルトレーションした保持液を２つのサンプルに分けた。第１のサンプル(対照)を、そのまま凍結乾燥した(製品コードＣ２０２)。第２のサンプルを、８５℃で５分間熱処理し、２５℃に冷却し、次いで凍結乾燥した(製品コードＣ２０２Ｈ)。
【０１６２】
プロセスサンプルを、遊離フェノール成分(３３０ｎｍにおける吸光度)、可視色(３９０ｎｍにおける吸光度)、タンパク質含量(ＬＥＣＯ)、および／またはタンパク質プロファイル(ＳＥＣ ＨＰＬＣ)について分析した。低ｐＨ条件によって、７Ｓおよび１２Ｓがより小さいサブユニットに変換され、それが２Ｓピークと重複して溶出するため、酸性化サンプルのＨＰＬＣクロマトグラムは解明困難であることに留意されたい。最終生成物を、含水量(オーブン法)、乾き色(Ｍｉｎｏｌｔａ色差計)についても分析し、濡れ色分析のためにＣ２０２およびＣ２０２Ｈの溶液を調製した。ボルテックスミキサーを使用して、タンパク質粉末(０．３５ｇ)を水(１０ｍｌ)に溶かした。湿潤サンプルの可視色を、Ａ３９０によって評価し、６００ｎｍにおける吸光度によって透明性を評価した。
【０１６３】
等電沈殿ステップの結果、浄化した抽出物から５３．７％の窒素が除去された。酸性化前の濾液のタンパク質プロファイル(全タンパク質粗粉領域のパーセンテージとして表す)は、７Ｓ６２．３％：１２Ｓ３．４％：２Ｓ３４．３％であり、等電沈殿物の除去後では、７Ｓ３．０％：１２Ｓ０．８％：２Ｓ９６．２％であった。７Ｓおよび１２Ｓは、沈殿した主な種であったが、その除去は、ＨＰＬＣデータが示すほどは完全でないと考えられている。先に述べたように、低ｐＨ条件によって、７Ｓおよび１２Ｓがより小さいサブユニットに変換され、それが２Ｓピークと重複して溶出する。したがって、酸性化サンプルの「２Ｓ」のいくらかは、分解した７Ｓおよび１２Ｓであり得る。ｐＨ３．５における濃縮上澄み液の熱処理によって、混濁はわずかに増大したが、著しい沈殿物の形成はなかった。
【０１６４】
この試験で生成した生成物のすべてが、単離物であり、タンパク質含量(ｄ.ｂ.)は、９０％を超えていた(表ＸＸＩＩＩ)。
【０１６５】
【表２３】
【０１６６】
生成物の乾き色を表ＸＸＩＶに示す。Ｃ３０２の明度数値は良好であったが、Ｃ２０２の明度数値は低かった。Ｃ３０２は、Ｃ２０２生成物より黄色く、緑色であった。熱処理したＣ２０２Ｈは、熱処理していないＣ２０２よりも濃く、黄色味が少なかった。
【０１６７】
【表２４】
【０１６８】
Ｃ２０２およびＣ２０２Ｈの濡れ色サンプルは、いくらか濁っていた。ダイアフィルトレーション保持液サンプルが、特に熱処理後にいくらか濁っていたことから(Ｃ２０２Ｈ)、透明性は、凍結乾燥前にサンプルを濾過することによって改善できる可能性が高い。可視色に関して、サンプルは見た目には類似していた。吸光度の読み取りによれば、Ｃ２０２Ｈは、Ｃ２０２よりも少し色が濃く、また濁っていた(表ＸＸＶ)。
【０１６９】
【表２５】
【０１７０】
ダイアフィルトレーションし濃縮した、ｐＨ３．５の上澄み液の熱処理は、色または透明性に関して何の利点ももたらさなかったように見えた。したがって、これらのサンプルに熱処理ステップは必要なかった。
【０１７１】
Ｃ３０２単離物の水結合能を決定した。
【０１７２】
タンパク質粉末(１ｇ)を秤量して、知られている重量の遠心分離管(５０ｍｌ)に入れた。この粉末に、中性ｐＨの逆浸透精製水約２０ｍｌを添加した。ボルテックスミキサーを使用して、試験管の内容物を中程度の速度で１分間混合した。次いで、５分後と１０分後に３０秒のボルテックス混合を行い、サンプルを室温で合計１０分間インキュベートした。次にそのサンプルを、２０℃において１０００ｇで１５分間の遠心分離にかけた。遠心分離後、試験管にすべての固体材料を確実に残しながら、上澄み液を注意深く除去した。次いで、遠心分離管を再び秤量し、水飽和サンプルの重量を決定した。
【０１７３】
水結合能（ＷＢＣ）を以下のように算出した
ＷＢＣ（ｍｌ／ｇ）＝（湿潤サンプルの質量−乾燥サンプルの質量）／（乾燥サンプルの質量×サンプルの全固体含量）。
【０１７４】
Ｃ３０２の水結合能は、２．９５ｍｌ／ｇであることが見出された。これは、先のＩＥＰ試験でＣ３０２生成物に関して認められたもの(約５〜９ｍｌ/ｇ、例えば実施例７参照)よりも低いレベルである。この差異は、この実施例においてＩＥＰステップが、ＵＦ１保持液の希釈ペレットまたは再び可溶化したＣ３００などの、より精製されたストリームの代わりに抽出物で実施されたことに起因し得る。この実施例のＣ３０２について認められた水結合能は、他のＣ３０２生成物よりも低かったが、その値はＣ３００生成物について一般に認められたものよりもなお高い(約１〜２ｍｌ/ｇ)。
【０１７５】
（開示の概要）
本開示を概説すると、等電沈殿は、Ｃ３０２およびＣ２０２で示される２つの新規キャノーラタンパク質単離生成物を生成するために、首尾よく利用された。Ｃ３０２およびＣ２０２生成物は、色および純度において、Ｃ３００およびＣ２００生成物に類似していた。Ｃ２０２生成物の機能性はＣ２００生成物に通ずるものであった。Ｃ３０２生成物は、乳化剤ほど可溶性ではなく十分に機能せず、Ｃ３００生成物とは異なっていた。しかしＣ３０２生成物は、水結合剤としては極めて良好に機能し、Ｃ３００生成物を著しく凌いでいた。本発明の範囲においては改変が可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）油糧種子粗粉を抽出して、油糧種子粗粉のタンパク質を可溶化し、約５〜約６．８のｐＨを有するタンパク質水溶液を形成するステップ、
（ｂ）残留油糧種子粗粉から前記タンパク質水溶液を分離するステップ、
（ｃ）前記タンパク質水溶液を酸性化して、少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有するタンパク質単離物を沈殿させるステップ、ならびに
（ｄ）上澄み液から前記沈殿タンパク質単離物を分離するステップ
を含む、タンパク質単離物の調製方法。
【請求項２】
前記上澄み液を処理して、少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有するさらなるタンパク質単離物を回収する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酸性化ステップの前に選択的膜技術を使用することによって、前記タンパク質水溶液を濃縮すると同時にイオン強度を実質的に一定に維持する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記油糧種子粗粉の前記抽出を、少なくとも約０．０５、好ましくは約０．１〜約０．６のイオン強度、および約５〜約６．８、好ましくは約５．３〜約６．２のｐＨを有する塩水溶液を使用して行う、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
（ａ）キャノーラ油糧種子粗粉を抽出して、キャノーラ油糧種子粗粉のキャノーラタンパク質を可溶化し、約５〜約６．８のｐＨを有するタンパク質水溶液を形成するステップ、
（ｂ）残留キャノーラ油糧種子粗粉から前記タンパク質水溶液を分離するステップ、
（ｃ）前記タンパク質水溶液を約３〜約４のｐＨに酸性化して、少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有し、主に７Ｓキャノーラタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物を沈殿させるステップ、ならびに
（ｄ）上澄み液から前記沈殿キャノーラタンパク質単離物を分離するステップ
を含む、キャノーラタンパク質単離物の調製方法。
【請求項６】
前記上澄み液を処理して、少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有し、主に２Ｓキャノーラタンパク質からなるさらなるキャノーラタンパク質単離物を回収する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記上澄み液を熱処理して、７Ｓおよび任意の１２Ｓタンパク質を前記上澄み液から沈殿させ、分解した７Ｓ／１２Ｓタンパク質を前記熱処理した上澄み液から分離する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記熱処理ステップの前に前記上澄み液を濃縮する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記熱処理ステップの前に、前記上澄み液のｐＨを約５〜約６．８、好ましくは約５〜約６．２の範囲に調節する、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記分解した７Ｓ／１２Ｓタンパク質を分離した後、および主に２Ｓキャノーラタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物を回収する前、および／または前記濃縮ステップの前もしくは後に、前記上澄み液を色除去操作にかける、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記タンパク質水溶液が、約５〜約１０ｗｔ％のタンパク質濃度を有する、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
前記酸性化ステップの前に選択した膜技術を使用することによって、前記キャノーラタンパク質水溶液を濃縮すると同時にイオン強度を実質的に一定に維持する、請求項５に記載の方法。
【請求項１３】
前記キャノーラタンパク質水溶液を濃縮して、約１０〜約３００ｇ／Ｌ、好ましくは約５０〜約１００ｇ／Ｌの濃度にする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記キャノーラタンパク質水溶液を濃縮して、約２０〜約２５ｗｔ％のタンパク質濃度にし、前記酸性化ステップの前に塩水溶液を添加することによって、キャノーラタンパク質溶液の濃度を約５〜約１０ｗｔ％に調節する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記酸性化ステップにかけた前記タンパク質水溶液が、少なくとも約１ｍＳ、好ましくは約１０〜約２０ｍＳの導電率を有する、請求項１２または１４に記載の方法。
【請求項１６】
（ａ）油糧種子粗粉を抽出して、油糧種子粗粉のタンパク質を可溶化し、約５〜約６．８のｐＨを有するタンパク質水溶液を形成するステップ、
（ｂ）前記残留油糧種子粗粉から前記タンパク質水溶液を分離するステップ、
（ｃ）選択的膜技術を使用して、前記タンパク質水溶液のタンパク質濃度を増大すると同時にイオン強度を実質的に一定に維持して、濃縮タンパク質溶液を提供するステップ、
（ｄ）前記濃縮タンパク質溶液を、約１５℃未満の温度を有する冷却水で希釈して、前記水溶液中にミセル形態の個別のタンパク質粒子を形成させるステップ、
（ｅ）タンパク質ミセルを沈降させて、非晶質で粘着性の、ゼラチン質のグルテン様タンパク質ミセル塊を形成するステップ、
（ｆ）少なくとも約９０ｗｔ％、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有するタンパク質ミセル塊を、上澄み液から分離するステップ、
（ｇ）前記タンパク質ミセル塊の水溶液を形成するステップ、
（ｈ）前記タンパク質ミセル塊の水溶液を酸性化して、少なくとも約９０ｗｔ％、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有するタンパク質単離物を沈殿させるステップ、ならびに
（ｉ）上澄み液から前記沈殿タンパク質単離物を分離するステップ
を含む、タンパク質単離物の調製方法。
【請求項１７】
前記タンパク質ミセル塊の沈殿物からの前記上澄み液を処理して、少なくとも約９０ｗｔ％、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質単離物を有する追加のタンパク質単離物を回収する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
乾燥形態でよいタンパク質ミセル塊を、少なくとも約０．０５、好ましくは少なくとも約０．１のイオン強度を有する塩水溶液で可溶化することによって、タンパク質ミセル塊の前記水溶液を形成する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記油糧種子粗粉が、キャノーラ油糧種子に由来し、タンパク質ミセル塊の前記水溶液が、約５〜約１０ｗｔ％のタンパク質濃度を有し、タンパク質ミセル塊の前記水溶液を、約３〜約４のｐＨに酸性化する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
請求項６に記載の方法によって生成されるキャノーラタンパク質単離物。
【請求項２１】
請求項２０に記載のキャノーラタンパク質単離物を含む酸性化飲料。
【請求項２２】
透明なタンパク質強化清涼飲料である、請求項２１に記載の飲料。
【請求項１】
（ａ）油糧種子粗粉を抽出して、油糧種子粗粉のタンパク質を可溶化し、約５〜約６．８のｐＨを有するタンパク質水溶液を形成するステップ、
（ｂ）残留油糧種子粗粉から前記タンパク質水溶液を分離するステップ、
（ｃ）前記タンパク質水溶液を酸性化して、少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有するタンパク質単離物を沈殿させるステップ、ならびに
（ｄ）上澄み液から前記沈殿タンパク質単離物を分離するステップ
を含む、タンパク質単離物の調製方法。
【請求項２】
前記上澄み液を処理して、少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有するさらなるタンパク質単離物を回収する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酸性化ステップの前に選択的膜技術を使用することによって、前記タンパク質水溶液を濃縮すると同時にイオン強度を実質的に一定に維持する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記油糧種子粗粉の前記抽出を、少なくとも約０．０５、好ましくは約０．１〜約０．６のイオン強度、および約５〜約６．８、好ましくは約５．３〜約６．２のｐＨを有する塩水溶液を使用して行う、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
（ａ）キャノーラ油糧種子粗粉を抽出して、キャノーラ油糧種子粗粉のキャノーラタンパク質を可溶化し、約５〜約６．８のｐＨを有するタンパク質水溶液を形成するステップ、
（ｂ）残留キャノーラ油糧種子粗粉から前記タンパク質水溶液を分離するステップ、
（ｃ）前記タンパク質水溶液を約３〜約４のｐＨに酸性化して、少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有し、主に７Ｓキャノーラタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物を沈殿させるステップ、ならびに
（ｄ）上澄み液から前記沈殿キャノーラタンパク質単離物を分離するステップ
を含む、キャノーラタンパク質単離物の調製方法。
【請求項６】
前記上澄み液を処理して、少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有し、主に２Ｓキャノーラタンパク質からなるさらなるキャノーラタンパク質単離物を回収する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記上澄み液を熱処理して、７Ｓおよび任意の１２Ｓタンパク質を前記上澄み液から沈殿させ、分解した７Ｓ／１２Ｓタンパク質を前記熱処理した上澄み液から分離する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記熱処理ステップの前に前記上澄み液を濃縮する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記熱処理ステップの前に、前記上澄み液のｐＨを約５〜約６．８、好ましくは約５〜約６．２の範囲に調節する、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記分解した７Ｓ／１２Ｓタンパク質を分離した後、および主に２Ｓキャノーラタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物を回収する前、および／または前記濃縮ステップの前もしくは後に、前記上澄み液を色除去操作にかける、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記タンパク質水溶液が、約５〜約１０ｗｔ％のタンパク質濃度を有する、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
前記酸性化ステップの前に選択した膜技術を使用することによって、前記キャノーラタンパク質水溶液を濃縮すると同時にイオン強度を実質的に一定に維持する、請求項５に記載の方法。
【請求項１３】
前記キャノーラタンパク質水溶液を濃縮して、約１０〜約３００ｇ／Ｌ、好ましくは約５０〜約１００ｇ／Ｌの濃度にする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記キャノーラタンパク質水溶液を濃縮して、約２０〜約２５ｗｔ％のタンパク質濃度にし、前記酸性化ステップの前に塩水溶液を添加することによって、キャノーラタンパク質溶液の濃度を約５〜約１０ｗｔ％に調節する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記酸性化ステップにかけた前記タンパク質水溶液が、少なくとも約１ｍＳ、好ましくは約１０〜約２０ｍＳの導電率を有する、請求項１２または１４に記載の方法。
【請求項１６】
（ａ）油糧種子粗粉を抽出して、油糧種子粗粉のタンパク質を可溶化し、約５〜約６．８のｐＨを有するタンパク質水溶液を形成するステップ、
（ｂ）前記残留油糧種子粗粉から前記タンパク質水溶液を分離するステップ、
（ｃ）選択的膜技術を使用して、前記タンパク質水溶液のタンパク質濃度を増大すると同時にイオン強度を実質的に一定に維持して、濃縮タンパク質溶液を提供するステップ、
（ｄ）前記濃縮タンパク質溶液を、約１５℃未満の温度を有する冷却水で希釈して、前記水溶液中にミセル形態の個別のタンパク質粒子を形成させるステップ、
（ｅ）タンパク質ミセルを沈降させて、非晶質で粘着性の、ゼラチン質のグルテン様タンパク質ミセル塊を形成するステップ、
（ｆ）少なくとも約９０ｗｔ％、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有するタンパク質ミセル塊を、上澄み液から分離するステップ、
（ｇ）前記タンパク質ミセル塊の水溶液を形成するステップ、
（ｈ）前記タンパク質ミセル塊の水溶液を酸性化して、少なくとも約９０ｗｔ％、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有するタンパク質単離物を沈殿させるステップ、ならびに
（ｉ）上澄み液から前記沈殿タンパク質単離物を分離するステップ
を含む、タンパク質単離物の調製方法。
【請求項１７】
前記タンパク質ミセル塊の沈殿物からの前記上澄み液を処理して、少なくとも約９０ｗｔ％、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質単離物を有する追加のタンパク質単離物を回収する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
乾燥形態でよいタンパク質ミセル塊を、少なくとも約０．０５、好ましくは少なくとも約０．１のイオン強度を有する塩水溶液で可溶化することによって、タンパク質ミセル塊の前記水溶液を形成する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記油糧種子粗粉が、キャノーラ油糧種子に由来し、タンパク質ミセル塊の前記水溶液が、約５〜約１０ｗｔ％のタンパク質濃度を有し、タンパク質ミセル塊の前記水溶液を、約３〜約４のｐＨに酸性化する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
請求項６に記載の方法によって生成されるキャノーラタンパク質単離物。
【請求項２１】
請求項２０に記載のキャノーラタンパク質単離物を含む酸性化飲料。
【請求項２２】
透明なタンパク質強化清涼飲料である、請求項２１に記載の飲料。
【公表番号】特表２００９−５０８８８２（Ｐ２００９−５０８８８２Ａ）
【公表日】平成２１年３月５日（２００９．３．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５３１４９４（Ｐ２００８−５３１４９４）
【出願日】平成１８年９月２１日（２００６．９．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００６／００１５５３
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０３３４８１
【国際公開日】平成１９年３月２９日（２００７．３．２９）
【出願人】（５０３４０３８６９）バーコン ニュートラサイエンス （エムビー） コーポレイション (25)
【氏名又は名称原語表記】ＢＵＲＣＯＮ ＮＵＴＲＡＳＣＩＥＮＣＥ （ＭＢ） ＣＯＲＰ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年３月５日（２００９．３．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年９月２１日（２００６．９．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００６／００１５５３
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０３３４８１
【国際公開日】平成１９年３月２９日（２００７．３．２９）
【出願人】（５０３４０３８６９）バーコン ニュートラサイエンス （エムビー） コーポレイション (25)
【氏名又は名称原語表記】ＢＵＲＣＯＮ ＮＵＴＲＡＳＣＩＥＮＣＥ （ＭＢ） ＣＯＲＰ．
【Ｆターム（参考）】
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