粒子を含む実質的に均一なエマルジョンを調製するための機器および方法
油中水型エマルジョンを形成するための方法およびシステムを記載する。例えば、水相中に分散した複数の粒子を含有する第１の区画；油相を含有する第２の区画；第１の区画と第２の区画とを分離する多孔質層；および圧力を第１の区画に対して適用するための装置を含む機器を記載する。多孔質層表面に対して油相を移動させるステップと、同時に、粒子を含む水性組成物を多孔質層を通して流れる分散媒体中に押し出し、それによって、油相中に分散した、粒子を含有する水性組成物の液滴を形成するステップとを含む方法を記載する。水性組成物は、１以上の核酸の鋳型およびＰＣＲ試薬類等の核酸を増幅するための試薬類を含むことができる。第１および第２の主要表面、ならびに多角形、卵形、楕円形、亜鈴型、蝶ネクタイ型、およびそれらの不規則な形状から選択された横断面の形状を含む、少なくとも２つの真直ぐに通り抜ける孔を含む多孔質の仕切りを記載する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００７年５月１８日に出願された米国仮出願第６０／９２４，５４４号および２００７年５月２４日に出願された米国仮出願第６０／９２４，６６４号に対する優先権の利益を主張する。これらの出願の各々は、それらの全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
本明細書で使用するセクションの見出しは、組織化の目的に限られ、いずれの場合であっても本明細書に記載する対象を限定すると解釈してはならない。
【０００３】
分野
本出願は一般に、実質的に均一な油中水型エマルジョンを形成するためのシステムおよび方法に関し、このエマルジョンは、連続的な油相、および粒子に結合しているオリゴヌクレオチドを含有する水相の離散的な液滴を含む。
【背景技術】
【０００４】
緒言
エマルジョンは、２つの非混和性の液体を組み合わせる、食品の調製、化学薬品、化粧品および医薬品のプロセスにおいて活用される。均一サイズのエマルジョン液滴を有するエマルジョンはまた、単分散エマルジョンとも呼ばれ、多分散エマルジョンよりも安定である。エマルジョン液滴の内部に含有される粒子によって、追加の特性をエマルジョンにもたらすことができる。
【０００５】
エマルジョンは、２つの非混和性の液体をボルテックスおよび撹拌することによって、または第１の非混和性の相を膜中の孔を通して第２の非混和性の連続的な相中に押し出すことによって調製することができる。いずれの過程においても、エマルジョン液滴のサイズおよびエマルジョンの安定性の変動が見られる。エマルジョンの均一性および安定性を改善するための多数の手順が開発されている。
【０００６】
Ｔａｄａｏ Ｎａｋａｓｈｉｍａらが最初に、エマルジョンを調製するためのシラス多孔質ガラス（ＳＰＧ）膜の使用を報告した（非特許文献１；特許文献１（１９８７年））。水相を膜の孔を通過させることによって逆エマルジョン（油中水型）を調製するためには、少なくとも連続的な油相に面している膜表面が、疎水性でなければならない（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。膜および内部の孔の表面の疎水性が、エマルジョンのサイズ、安定性および形成速度に対して影響を及ぼす。膜および膜の孔の内部表面の表面特性を変化させるための方法は、多種多様であり得る。
【０００７】
Ｎａｎｏｍｉ Ｅｍｕｌｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｅｎｓｃｈｅｄｅ、オランダ）は、シリコンウエハを膜のために使用してトラックエッチング多孔質膜を調製する（Ｊ． Ｗｉｓｓｉｎｋら、特許文献２）。縦軸に沿って補助的な構造を含む≧２μの直径を有する孔が、シリコンウエハ中に反応性イオンエッチングまたはその他のリソグラフィーの技法によって形成される。これに続いて、シラン試薬を用いて膜に対する化学蒸着（ＣＶＤ）を実施して、孔の内部表面を含めた全ての膜表面を疎水性にする。水相を孔を通して押し出し、膜の反対側まで通過させる際には、疎水性によって水相は膜表面上に水たまりに代わって液滴を形成することができる。臨界圧力Ｐｃが膜上の離散的な相の接触角ｃｏｓθに比例するので、水相を孔を通して押し出すためには比較的高い圧力が必要であり、内壁が疎水性である場合、孔のうちのごく一部によって水相が膜を押し通るのが可能になるに過ぎず、その結果、形成速度が異なり、エマルジョン液滴のサイズが変動する（非特許文献５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第４，６５７，８７５号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００７／０２２７５９１号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｔａｄａｏ Ｎａｋａｓｈｉｍａら、Ｃｅｒａｍ． Ｊｐｎ． １９８６年、２１巻、４０８頁
【非特許文献２】Ｃ．−Ｊ． Ｃｈｅｎｇら、Ｊ． Ｃｏｌｌｏｉｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉ． ２００６年、３００巻：３７５〜３８２頁
【非特許文献３】Ｎ． Ｙａｍａｚａｋｉら、Ｊ． Ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ Ｓｃｉ． ＆ Ｔｅｃｈ． ２００３年、２４巻：２４９〜２５７頁
【非特許文献４】Ｋ． Ｓｕｚｕｋｉ、Ｒｅｚａ Ｋｅｎｋｙｕ １９９３年、２１巻：２６〜３１頁
【非特許文献５】Ｃ． Ｃｈａｒｃｏｓｓｅｔら、Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｔｅｃｈ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２００４年、７９巻、２０９〜２１８頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
概要
本実施形態により、複数の実質的に均一サイズのエマルジョン液滴（少なくとも１つのエマルジョン液滴は粒子を含む）を形成するための装置を開示し、この装置は複数の粒子を含む水相を含有する第１のチャンバー；水非混和性の液体を含む油相を含有する第２のチャンバー；ならびに第１のチャンバーと第２のチャンバーとを分離する仕切りであって、少なくとも第１の主要表面、第１の主要表面に対向する第２の主要表面、および少なくとも２つの、第１の主要表面を第２の主要表面に接続する画定された真直ぐに通り抜ける孔を含み、該第１の主要表面は第１のチャンバーの壁を形成し、該第２の主要表面は第２のチャンバーの壁を形成する仕切りを含み、前記水相が前記少なくとも２つの真直ぐに通り抜ける孔のうちの２つを通過して前記油相に至る際に、該水相は複数の離散的な実質的に均一サイズのエマルジョン液滴を形成し、その複数の液滴のうちの少なくとも１つは複数の粒子のうちの少なくとも１つの粒子を含み、該少なくとも１つの粒子は、少なくとも１つの、粒子に結合している核酸を含む。
【００１１】
また、別の実施形態では、実質的に均一サイズのエマルジョン液滴を形成するための第１の相を第２の相中に通過させる仕切りも開示し、この仕切りは第１の主要表面；第１の主要表面に対向する第２の主要表面；さらに多角形、卵形、楕円形、亜鈴型、蝶ネクタイ型およびそれらの不規則な形状からなる群から選択された横断面の形状、ならびに第１の主要表面と第２の主要表面との間の仕切りを横断する内壁を含む、少なくとも２つの真直ぐに通り抜ける孔を含み、第２の相中において第１の相を含む実質的に均一サイズのエマルジョン液滴を形成するように構成される。
【００１２】
さらに別の実施形態では、実質的に均一サイズのエマルジョン液滴を形成する方法を開示し、この方法は、仕切りの第１の主要表面と接触している複数の粒子を含む水相を仕切り中の少なくとも２つの真直ぐに通り抜ける孔を通して分散媒体中に押し出すステップと、同時に、仕切りの第２の主要表面に対して平行にかつそれと接触した状態で分散媒体を移動させるステップであって、第２の主要表面が第１の主要表面に対向しており、それによって、分散媒体中に分散した水相の実質的に均一サイズのエマルジョン液滴を形成するステップとを含み、複数の液滴は少なくとも１つの粒子を含む。
【００１３】
以下の説明において、特定の態様および実施形態が明らかになる。所与の実施形態が、本明細書に記載する全ての態様および特色を必ずしも有する必要はないことを理解されたい。これらの態様および実施形態は例示および説明のためのものに過ぎず、本発明を制限するものではないことを理解されたい。
【００１４】
前記の一般的な記載および以下の詳細な記載の両方は、例示および説明のためのものに過ぎず、請求する本発明を制限するものではないことを理解されたい。
【００１５】
本明細書中に組み込まれ、その一部を構成する付随の図面は本開示のいくつかの例示的な実施形態を例証し、記載と一緒になって特定の教示を説明する役目を果たす。
【００１６】
油相中に分散した少なくとも１つの粒子を含有する水相の均一サイズの液滴、すなわち、逆エマルジョンを形成するためのシステムおよび方法の改善が依然として求められている。したがって、連続的な油相と接触している膜表面が疎水性であり、一方、膜の内壁表面は親水性であって、その結果、逆エマルジョン液滴の調製のために水相を多孔質膜の仕切りを通して押し出すのに必要な適用圧力が低下するようになることが望ましい。水相に面する多孔質膜表面、および内壁表面が親水性の特徴を有し、かつ油相に面する膜表面が疎水性の特徴を有するように調製する方法によって、実質的に均一な逆エマルジョン液滴の形成が改善される。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅等の核酸の増幅を実施するための微小反応装置として粒子を含有する逆エマルジョン液滴を使用することができる。
【００１７】
本教示のこれらおよびその他の特色を本明細書に記載する。
【００１８】
以下に記載する図面は例証のためのものに過ぎないことを当業者であれば理解する。図面は、いずれの場合であっても本教示の範囲を制限するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１はエマルジョンを形成するための装置の斜視図を示す。
【図２】図２は、エマルジョンを形成するための装置の横断面図を示す。
【図３】図３は、図２の横断面図を拡大した部分を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、真直ぐに通り抜ける孔の形状および仕切り内の孔の配置の例を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、真直ぐに通り抜ける孔の形状および仕切り内の孔の配置の例を示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、真直ぐに通り抜ける孔の形状および仕切り内の孔の配置の例を示す。
【図４Ｄ】図４Ｄは、真直ぐに通り抜ける孔の形状および仕切り内の孔の配置の例を示す。
【図４Ｅ】図４Ｅは、真直ぐに通り抜ける孔の形状および仕切り内の孔の配置の例を示す。
【図４Ｆ】図４Ｆは、真直ぐに通り抜ける孔の形状および仕切り内の孔の配置の例を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、例示的な孔の形状の横断面図を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、例示的な孔の形状の横断面図を示す。
【図６】図６は、図３の仕切りの表面処理の横断面図を示す。
【図７】図７は、図６の横断面図を拡大した部分を示す。
【図８】図８は、実質的に均一サイズの逆エマルジョンを形成する一般的な方法を示すブロック図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
詳細な説明
本明細書を解釈するために以下の定義が適用され、適切である限り単数で使用する用語はまた複数も含み、逆も同様である。以下に記載するいずれかの定義が、参照により本明細書に組み込まれている任意の文献を含めた何らかのその他の文献中におけるその語の使用法と対立する場合、本明細書およびそれに伴う特許請求の範囲を解釈するためには、（例えば、その用語の元々使用されている文献中の）相反する意味が明確に意図されない限り以下に記載する定義が常に優先すべきである。本明細書および付随の特許請求の範囲において使用するように、単数形である「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、１つの指示対象に明白にかつはっきりと限定されない限り複数の指示対象を含むことに留意されたい。「または（ｏｒ）」の使用は、別段の記載がない限り、「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を意味する。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用には、互換性があり、制限する意図はない。さらに、１つまたは複数の実施形態の記載が、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語を使用する場合、いくつかの特異的な場合においては、１つまたは複数の実施形態を「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」および／または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という言葉を使用して選択的に記載することができることは当業者であれば理解する。
【００２１】
本明細書で使用する場合、「膜」、「仕切り」、「層」および「被膜」という句には、互換性があり、制限する意図はない。
【００２２】
本明細書で使用する場合、「核酸」、「オリゴヌクレオチド」および「（１つまたは複数の）ポリヌクレオチド」という句には、互換性があり、制限する意図はない。
【００２３】
本明細書で使用する場合、「離散的な水相」、「水相」および「油非混和性の液体」には、互換性があり、制限する意図はない。
【００２４】
本明細書で使用する場合、「水相」という句は、油非混和性の液体を指す。
【００２５】
本明細書で使用する場合、「油相」という句は、水非混和性の液体を指す。本明細書で使用する場合、「連続的な相」、「連続的な油相」、「油相」、「水非混和性の液体」および分散媒体には、互換性があり、制限する意図はない。
【００２６】
本明細書で使用する場合、「離散的な相」という句は、油相内に乳化させた水相を指す。
【００２７】
本明細書で使用する場合、「分散相（ｄｉｓｐｅｒｓｅｄ ｐｈａｓｅ）」および「分散相（ｄｉｓｐｅｒｓｅ ｐｈａｓｅ）」という句は、非混和性の液体内に乳化させた相を指す。説明すると、通常のエマルジョン中では、油相を水相中に乳化させ、水相中に「分散」したということができる。逆に、逆エマルジョン中では、水相を油相中に乳化させ、油相中に「分散」したということができる。
【００２８】
本明細書で使用する場合、「通り抜ける孔」という句は、多孔質層の第１の主要表面を第２の主要表面に接続する孔を指す。
【００２９】
本明細書で使用する場合、「真直ぐに通り抜ける孔」という句は、多孔質層の第１の主要表面を第２の主要表面に接続し、孔の壁には接触も交差もしない、それを通る直線を描くことができる孔を指す。また、「真直ぐに通り抜ける」孔は、「トラックエッチングした」孔も指す。
【００３０】
本明細書で使用する場合、「縦軸」（ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ ａｘｉｓ）という句は、真直ぐに通り抜ける孔を通して描いた直線を指し、これは、真直ぐに通り抜ける孔の内壁には接触も交差もしない。
【００３１】
本明細書で使用する場合、「内壁」という句は、多孔質層の第１の主要表面を第２の主要表面に接続する、多孔質膜内の真直ぐに通り抜ける孔の表面を指す。
【００３２】
本明細書で使用する場合、「実質的に均一な」という句は、本明細書に開示する装置および方法によって形成したエマルジョン液滴のサイズおよび体積を指す。形成した複数のエマルジョン液滴は、サイズおよび体積に関して、少なくとも５％〜２０％および少なくとも１０％〜１５％の変動係数パーセントを有する。
【００３３】
本明細書に記載するシステムおよび方法は、通常の、すなわち、水中油型エマルジョン、または逆の、すなわち、油中水型エマルジョンのいずれにも等しく適合できる。粒子に結合しているオリゴヌクレオチドを含有するエマルジョン液滴を形成するための、開示する方法は、オリゴヌクレオチドが結合している粒子を含有する水相を２つの非混和性の相を分離する、真直ぐに通り抜ける孔を有する仕切りを通して押し出すステップを含む。
【００３４】
膜エマルジョン装置によって形成したエマルジョン液滴は、単分散の、サイズおよび形状が実質的に均一な液滴であり得る。所望のエマルジョンを得るために適した膜表面、内壁、および孔の形状の改変形態および処理ならびに２つの非混和性の相を当業者であれば理解する。
【００３５】
水性の液滴中に封入された粒子を含む逆（すなわち、油中水型）エマルジョンを調製するためのシステムおよび方法を本明細書に記載する。核酸増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応）の過程を実施するために水性の液滴を含有する粒子を使用することができる。
【００３６】
ここで、付随する図面に示されている、本開示のいくつかの例示的な態様を詳細に参照する。可能な限り同一の参照番号を図面全体にわたり使用して、同一または類似の部分を指す。
【００３７】
図１は、本開示の種々の例示的な態様による、単分散の実質的に均一サイズのエマルジョンおよび逆エマルジョンの形成において使用するための例示的な装置を模式的に示す。
【００３８】
機器は、連続的な油相４２を含有する、少なくとも１つの区画４０を含むことができる。油相４２はまた、界面活性剤を含むこともできる。界面活性剤は、イオン性界面活性剤であっても、または非イオン性界面活性剤であってもよい。この区画４０は、真直ぐに通り抜ける孔１１４を含む多孔質の仕切り１００によって、水相３２、すなわち、第１の組成物（その中には少なくとも複数の粒子２１０が懸濁している）を含有する少なくとも１つの区画３０から分離することができる。
【００３９】
機器は、水相３２を含有する区画３０の内容物を加圧するための装置１０を含むことができる。この装置１０は、水相３２を含有する区画３０に開口部１４において接続している、加圧されたガスを含有するタンクを含むことができる。装置はまた、多孔質の仕切り１００に対して移動可能であり、水相３２を含有する区画３０の容積を減少させるために移動させることができる壁３４を含むこともできる。また、水相３２を含有する区画の内容物を加圧するための、その他の装置も使用することができる。
【００４０】
機器はまた、水相３２の機械的な撹拌をもたらすために、水相３２を移動させる装置を含むこともできる。機械的な撹拌部は、シャフト２２を有するモーター２０を含むことができ、シャフト２２は、モーター２０から、水相３２を含有する区画３０の内部に位置する翼板２４に至る。
【００４１】
機器はまた、連続的な油相４２を多孔質の仕切り１００の表面１０４に対して移動させるための装置５０を含むこともできる。この装置５０は、連続的な油相４２を多孔質の仕切り１００の表面１０４上にポンプで送るように構成されたポンプを含むことができる。油相４２の流れは、多孔質の仕切り１００の第２の主要表面１０４に対して平行であり、水相３２の、多孔質の仕切り１００の真直ぐに通り抜ける孔１１４を通る流れ１６に対して直交する層流４４であってよい。装置はまた、乳化の間に連続的な油相４２を撹拌するまたはそれに揺れを起こすように構成された撹拌装置または揺れを起こす装置を含むこともできる。揺れを起こす装置は、これらに限定されないが、ボルテックス装置、ロッカー、シェイカー、オービットシェイカーまたは超音波処理器を含めた、機械的な装置であってよい。このリストには制限する意図はなく、また、乳化の間に連続的な相を多孔質の仕切りの表面上に流すまたはそれ以外の様式で移動させる、その他の装置を使用することもできる。
【００４２】
機器はまた、実質的に均一サイズのエマルジョン液滴２００を収集するためのリザーバ６０を含むこともでき、エマルジョン液滴２００は、区画４０から、連続的な油相４２によってリザーバ６０に運ばれる。
【００４３】
図２は、本開示の種々の例示的な態様による、単分散の実質的に均一サイズの逆エマルジョン液滴２００の形成において使用するための図１の例示的な装置の横断面を模式的に示す。図２は、逆エマルショの形成を示すが、当業者であれば、通常のエマルジョンを形成するために、図１および２の装置の改変形態を思い浮かべることができる。
【００４４】
機器は、連続的な油相４２を含有する少なくとも１つの区画４０を含むことができる。油相４２はまた、界面活性剤を含むこともできる。界面活性剤はイオン性界面活性剤であっても、または非イオン性界面活性剤であってもよい。真直ぐに通り抜ける孔１１４を含む多孔質の仕切り１００によって、水相３２を含有する少なくとも１つの区画３０からこの区画４０を分離することができ、水相３２中には複数の粒子２１０が懸濁している。複数の粒子２１０のうちの少なくともいくつかには、少なくとも１つのオリゴヌクレオチド２１２が結合している。
【００４５】
連続的な相４２は、水非混和性の液体（例えば、油相）を含む。例示的な水非混和性の液体として、これらに限定されないが、シリコン油類（これらに限定されないが、ポリ（ジメチルシロキサン）、ポリ（メチルフェニルシロキサン）、およびそれらのコポリマーを含む）、ペトロレウムスペシャル（ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ ｓｐｅｃｉａｌ）（Ｆｌｕｋａ）、飽和または不飽和の脂肪族炭化水素類、そのハロゲン化誘導体、およびそれらの組合せが挙げられる。脂肪族炭化水素類は、直鎖状であっても、または分枝状であってもよく、例として、これらに限定されないが、ヘキサン、イソオクタン、デカン、ドデカン、１−ドデセン、ペンタデカン、ヘキサデカン、石油エーテル類および鉱油類）、ヘプタデカン（ｂｐ３０２℃）、ヘプタメチルノナン（ｂｐ２４０℃）、ヘプタデセン（ｂｐ１５９℃／１１ｍｍＨｇ）、ペルフロウロトリデカン（ｐｅｒｆｌｏｕｒｏｔｒｉｄｅｃａｎｅ）（ｂｐ１９６℃）、およびＦＬＵＯＲＩＮＥＲＴ（商標）Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｌｉｑｕｉｄ ＦＣ−７７０（３Ｍ、Ｓｔ．Ｐａｕｌ、ミネソタ州から入手）、芳香族炭化水素類（これらに限定されないが、ベンゼン、トルエン、クメン、アルキルベンゼン類およびアルキルアリールベンゼン類を含む）、エステル類（これらに限定されないが、フタル酸１，４−ジオクチルを含む）、フッ素化炭化水素類（これらに限定されないが、ＦＬＵＯＲＩＮＥＲＴ（商標）ＦＣ−７５（３Ｍ）およびＣＴＳＯＬＶ−１００（Ａｓａｈｉ Ｇｌａｓｓ）を含む）、ならびにその他のハロゲン化炭化水素類、さらに、これらに限定されないが、ＦＯＭＢＬＩＮ（登録商標）、（ｄ１．８８〜１．９２ｇ／ｃｍ３、粘度６０〜１５００ｃＳｔ、Ａｕｓｉｍｏｎｔ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．（Ｔｈｏｒｏｆａｒｅ、ニュージャージー州）から入手）、およびＤＥＭＮＵＭ（商標）（Ｄａｉｋｉｎ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、日本）を含めた、ペルフルオロポリエーテル類であってよい。使用することができる、追加の水非混和性の液体には、これらに限定されないが、植物油（すなわち、飽和および不飽和の脂肪酸類および誘導体）等の天然に存在する油類が含まれる。
【００４６】
９６℃超の沸点（ｂｐ）を有する水非混和性の液体であればいずれも、連続的な相４２として使用することができることは、当業者であれば理解することができる。連続的な相の液体は、芳香族炭化水素、その誘導体、およびそれらの組合せであってよく、例として、これらに限定されないが、２，３，４，５，６−ペンタフルオロアニソール（ｂｐ１３９℃）、１，３，５−トリメチルベンゼン（ｂｐ１６６℃）、ヘキシルベンゼン（ｂｐ２２６℃）であってよい。連続的な液体の相は、エステルであってよく、例として、これらに限定されないが、テレフタル酸ジオクチル（ｂｐ４００℃）およびフタル酸ジイソブチル（ｂｐ３２７℃）であってよい。連続的な液体の相は、０．５〜３．０ｇ／ｃｍ３の範囲の密度を有することができ、例として、これらに限定されないが、ヘキサン（ｄ０．６６ｇ／ｃｍ３、ｂｐ６９℃）、ブロモベンゼン（ｄ１．４９ｇ／ｃｍ３、ｂｐ１５９℃）、ペルフルオロケロセン（ｄ１．９４ｇ／ｃｍ３、ｂｐ２１０〜２４０℃）、およびテトラブロモエタン（ｄ２．９７ｇ／ｃｍ３、ｂｐ１９０℃）を挙げることができ、０．５〜１００ｍＰａ・ｓの範囲の粘度を有することができ、例として、これらに限定されないが、トリクロロエチレン（０．５４５ｍＰａ・ｓ、ｂｐ８７℃）、ペンタクロレタン（ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｅｔｈａｎｅ）（２．２５４ｍＰａ・ｓ、ｂｐ１６２℃）、ヘキサデカン（３．０３ｍＰａ・ｓ、ｂｐ２８７℃）、フタル酸ジメチル（１４．４ｍＰａ・ｓ、ｂｐ２８２℃）、および重質鉱油類（約７０ｍＰａ・ｓ）が挙げられる。
【００４７】
連続的な相４２はまた、イオン性界面活性剤または非イオン性界面活性剤を含有することもできる。連続的な相中で使用することができる、例示的な非イオン性界面活性剤として、これらに限定されないが、ＳＰＡＮ（商標）系界面活性剤、例えば、ＳＰＡＮ（商標）８０、ＢＲＩＬ（商標）系界面活性剤、例えば、ＢＲＩＬ（商標）７２、ＴＥＴＲＯＮＩＣ（商標）系界面活性剤、例えば、ＴＥＴＲＯＮＩＣ（商標）９０１、モノステアリン酸ポリエチレングリコール（２ｅ．ｏ．）（Ｗａｋｏ、日本）、およびＡＢＩＬ（登録商標）ＥＭ−９０（Ｄｅｇｕｓｓａ）が挙げられる。この例示的なリストには制限する意図はなく、また、フッ素化部分を含むその他の界面活性剤を含めて、その他のイオン性界面活性剤および非イオン性界面活性剤を使用することもできる。イオン性界面活性剤または非イオン性界面活性剤の親水親油バランス（ＨＬＢ）の値は、１〜１０、２〜６、３〜５等であってよい。
【００４８】
水相３２は、試薬（例えば、核酸を増幅するための試薬）を含む水溶液であってよい。例示的な試薬として、これらに限定されないが、塩化マグネシウム、およびデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、酵素等の生体分子、共有結合または非共有結合で結合したオリゴヌクレオチドを有するビーズまたは粒子、鋳型、緩衝剤、ならびにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の効率および／または特異性を増強するために有用である、その他の添加剤が挙げられる。水相３２はまた、イオン性界面活性剤または非イオン性界面活性剤を含有することもできる。非界面活性剤には、これらに限定されないが、ＴＷＥＥＮ（商標）系界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）２０、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）系界面活性剤（両親媒性ブロックコポリマー）、例えば、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｆ３８、ＳＰＡＮ（商標）系界面活性剤、例えば、ＳＰＡＮ（商標）２０、これらに限定されないが、ポリ（ジメチルシロキサン−ブロック−エチレンオキシド）、ポリ（メチルフェニルシロキサン−ブロック−エチレンオキシド）、ポリ（ジメチルシロキサン−ブロック−２−ヒドロキシエチルアクリレート）、およびポリ（アルキレン−ブロック−２−ヒドロキシエチルアクリレート）を含めた両親媒性ジブロックコポリマーが挙げられる。水相３２中のイオン性界面活性剤または非イオン性界面活性剤は、５〜４０、１０〜４０、２０〜４０、５〜１０、１０〜２０等の範囲の親水親油バランス（ＨＬＢ）の値を有することができる。
【００４９】
水相３２は、水溶性ポリマーを含むことができる。乳化の有効性を制御するためおよび／またはエマルジョンの安定性を改善するために、水溶性ポリマーを水相３２に添加して、水相３２の密度および／または粘度を調整することができる。例えば、水溶性の、臭素または塩素で置換したポリマーを水相３２に添加して、水相の密度を増加させることができる。比較的大きな分子量、例えば、１，０００，０００〜１０，０００，０００ＭＷを有する水溶性ポリマーを添加して、水相３２の粘度を増加させることができる。水相に添加することができる水溶性ポリマーには、これらに限定されないが、水溶性ポリアクリルアミド類、水溶性ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）、水溶性ポリ（エチレングリコール類）、水溶性ポリ（エチレンオキシド類）、それらの誘導体、およびそれらの組合せが挙げられる。
【００５０】
装置は、水相３２にも連続的な相４２にも不溶性である固体の材料であってよい粒子２１０を含むことができる。図１および２に示すように、水相３２は、膜１００を通過し、得られたエマルジョン液滴２００にまたはその内部に組み込まれる粒子２１０を含む。粒子は、例えば、これらに限定されないが、金属、金属酸化物、金属ハロゲン化物、金属水酸化物、ケイ素、二酸化ケイ素、シリカ、石英、ガラス、ガラス状炭素、炭素、ポリマー、またはそれらのブレンドおよび組合せ等の材料を含むことができる。粒子は、不規則な形状を有しても、または円柱、球体または円盤等の規則的な形状を有してもよい。粒子のサイズは０．１〜１００ミクロンの範囲であってよい。粒子の表面は物理的または化学的に改変することができる。例えば、固定化ポリヌクレオチド２１２を含むように粒子の表面を改変することができる。固定化ポリヌクレオチドは、例えば、エマルジョンＰＣＲ（ｅＰＣＲ）反応におけるＰＣＲプライマーとしての役目を果たすことができる。粒子の表面はまた、それに続く、例えば、バイオコンジュゲーション等の反応のために、その他の反応性の基を含有するように改変することもできる。粒子の表面はまた、アレイに共有結合または非共有結合で結合させるために改変することもできる。
【００５１】
水相中に捕捉した粒子が、乳化の間に膜の孔に詰まるのを阻止するために、膜１００の孔１１０は、真直ぐに通り抜ける孔１１４であり得る。真直ぐに通り抜ける孔を有する膜は、例えば、Ｗｈａｔｍａｎ（英国）、ＰＡＬＬ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（米国）、Ｍｉｃｒｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（英国）、およびＮａｎｏｍｉ Ｅｍｕｌｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（オランダ）から入手可能である。上記のリストには網羅的である意図はなく、また、真直ぐに通り抜ける孔を有する膜は、その他の供給元からも入手可能である。多孔質の仕切りの孔の一部または全部が、真直ぐに通り抜ける孔であってよい。さらに、膜を（例えば、スクリーンまたはハウジングによって）支持または補強することもできる。孔は、粒子が、乳化の間に捕捉されてしまわないようなサイズにすることできる。真直ぐに通り抜ける孔を有する膜を使用する膜乳化法を使用して、所望のサイズおよび実質的に均一な分布の液滴を生み出すことができる。
【００５２】
装置は、仕切り１００を形成する膜を含むことができる。多孔質の仕切り１００は、仕切りホルダー１２２内の仕切りホルダーの突起１２０によって支持される。仕切り１００は、ある形状を有する画定された孔の開口部１１０を有する、少なくとも２つの真直ぐに通り抜ける孔１１４を有する。仕切り１００は、水相３２に面する第１の主要表面１０２および油相４２に面する第２の主要表面１０４を含む。
【００５３】
図３は、装置内の仕切り１００の拡大図の例を示す。仕切り１００は、親水性であってよい第１の主要表面１０２および疎水性であってよい第２の主要表面１０４を含み、孔の内壁表面１１２は独立に、疎水性または親水性である。仕切り１００は、親水性である第１の分散する水相３２と疎水性である第２の連続的な相４２とを分離する役割を果たす。第１の相３２が、親水性の表面１０２から真直ぐに通り抜ける孔１１４を通過して疎水性の相４２の中に入ると、実質的に均一サイズの逆エマルジョン液滴２００が形成される。逆に、疎水性の相４２が、疎水性の表面１０４から真直ぐに通り抜ける孔１１４を通過して親水性の相３２の中に入ると、実質的に均一サイズの通常のエマルジョン液滴が形成されることが、当業者であれば分かる。
【００５４】
図４は、例示的な孔の形状の横断面および例示的な膜１００の内部における孔の配置の両方を示す。孔１１０の形状および横断面において見られる孔１１０の形状は、多角形、卵形、楕円形、亜鈴型、蝶ネクタイ型、凧型、およびそれらの不規則な形状であってよい。多角形は、四辺形、五角形、六角形、七角形、八角形、九角形、十角形の形状、およびそれらの不規則な形状であってよく、四辺形は、凧型、ひし形、不等辺四辺形、台形、二等辺四辺形、平行四辺形、長方形の形状、およびそれらの不規則な形状であってよい。多角形および蝶ネクタイ型の形状は、角の丸み（ｒａｄｉｕｓ ｃｏｒｎｅｒ）１１１を有し得る、図５Ａ。孔１１０の形状は、孔が、少なくとも４ミクロンから少なくとも１６ミクロンまでの画定された長さ１３２、および少なくとも１ミクロンから少なくとも４ミクロンまでの画定された幅１３０を有するようになされる、図５Ｂ。
【００５５】
多孔質の仕切り１００は、２〜９８％の範囲に制御された多孔率および１．０〜２００μｍの範囲に制御された孔のサイズを有する多孔質膜であってよい。面積当たりの孔の数は、多数の構成があり得る。孔の密度の配置例には、４３．８９ｍｍ２当たり９１，５００個または１８３，０００個の孔、４ｍｍ２当たり１５，２００個または３０，４００個の孔、２．１ｍｍ２当たり４２００個の孔、および１．８ｍｍ２当たり７０００個の孔がある。所与の面積当たりの孔の数は、孔と孔の間の距離（ピッチ）および孔の列と列の間の距離に依存する。孔と孔の間のピッチの距離は、２０から、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９および３０μｍまで、ならびにそれらの間であってよく、孔の列と列の間の距離は、１０、１５、２０、２５または３０μｍ、およびそれらの間であってよい。膜の厚さは、２５、３０、４５または５０μｍ、およびそれらの間であってよく、一方、仕切りの非多孔質の領域の厚さは、４００〜５００μｍである。孔の寸法の例には、１〜４μｍの幅、４〜１６μｍの長さ、およびそれらの間の範囲がある。横断面において測定した孔（幅×長さ）の例として、１．５×７．３μｍ、１．７×７．５μｍ、２．５×８．６μｍ等が挙げられる。多孔質の仕切り１００は、多孔質膜のセクション間または多孔質膜内で、例えば、突起部またはスクリーンを使用して補強することができる。
【００５６】
図５Ａおよび図５Ｂは、角の丸み１１１を有する長方形の孔ならびに丸型突出形状の第１の孔１０９および第２の孔１１８を有する亜鈴型の形状の孔の両方の長さおよび幅を示す。孔１１０は、孔１１０の長さ１３２と該孔の幅１３０との比の測定値である縦横比を有する。これは、ｌ／ｓとして示すことができ、ただし、「ｌ」は、孔の長さであり、「ｓ」は、孔の幅である。
【００５７】
孔の縦横比は、少なくとも３：１、少なくとも３．１：１、少なくとも３．２：１、少なくとも３．３：１、少なくとも３．４：１、少なくとも３．５：１、少なくとも３．６：１１、少なくとも３．７：１、少なくとも３．８：１、少なくとも３．９：１、少なくとも４：１、少なくとも４．１：１、少なくとも４．２：１、少なくとも４．３：１、少なくとも４．４：１、少なくとも４．５：１、少なくとも４．６：１、少なくとも４．７：１、少なくとも４．８：１、少なくとも４．９：１、少なくとも５．０：１、少なくとも５．１：１、少なくとも５．２：１、少なくとも５．３：１、少なくとも５．４：１、少なくとも５．５：１、少なくとも５．６：１、少なくとも５．７：１、少なくとも５．８：１、少なくとも５．９：１、少なくとも６．０：１、少なくとも６．１：１、少なくとも６．２：１、少なくとも６．３：１、少なくとも６．４：１、少なくとも６．５：１、少なくとも６．７：１、少なくとも６．８：１、少なくとも６．９：１、少なくとも７．０：１、およびこれらの範囲内の間である。孔１１０の幅１３０は、少なくとも１．０マイクロメートルであり、最大では２００マイクロメートルであり得る。可能なｌ×ｓの値は、３．３：１の縦横比の場合、６ミクロン×１．８ミクロン、４．４：１の縦横比の場合、７．９ミクロン×１．８ミクロン、および３．５：１の縦横比の場合、９．５ミクロン×２．７ミクロンである。
【００５８】
０．１ミクロンから１００ミクロンまでの範囲のサイズを有する粒子が真直ぐに通り抜ける孔１１４中に詰まってしまい、したがって、第１の相が第２の相中に流れるのを遮断するようなことなく膜を通過できるように真直ぐに通り抜ける孔１１４を設計することができる。粒子２１０は、１．０〜４．０ミクロン、およびそれらの間のサイズを有することができ、仕切り１００の孔は、１．０〜２００ミクロン、およびそれらの間の孔１１０のサイズを有することができる。真直ぐに通り抜ける孔１１４は、仕切り１００を横断する縦軸１１５を有すると説明することができる。図５Ｂは、横断面において、亜鈴型の形状の、丸型突出形状の孔の構造を示す。丸型突出形状の孔は、丸型突出形状の孔の軸としての中心部１０８、および中心部１０８に隣接し、縦軸１１５から半径方向に伸長する、少なくとも１つの丸型突出形状１０９を有する。丸型突出形状の孔は、真直ぐに通り抜ける孔１１４の中心の縦軸１１５に対して平行して存在し、かつ第１の丸型突出形状１０９に対して対称的に位置し、縦軸１１５から半径方向に伸長し、第１の丸型突出部１０９から、中心部１０８によって分離される第２の丸型突出部１１８を含むことができる。左右対称な丸型突出形状の孔の縦横比は、第１の丸型突出部と第２の丸型突出部とを分離する中心部１０８の幅１３０よりも大きい、第１の丸型突出部と第２の丸型突出部との間の長さ１３２から決定される、図５Ｂ。横断面において見られるように、中心部１０８の幅（ｓ）１３０は、中心部１０８の長さ１３２に対して直角に測定し、長さ（ｌ）１３２は、中心部１０８の幅（ｓ）１３０に対して直角に、かつ孔の長さの対向する末端間に描いた想像上の直線の距離にわたって測定する。丸型突出形状の孔の例示的な例には、蝶ネクタイ型および亜鈴型の形状がある。丸型突出形状の（ｌｏｐｅｄ ｓｈａｐｅｄ）孔は、左右対称であっても、非対称であってもよい。丸型突出形状の孔は、少なくとも１つの丸型突出部を有する孔を含むことができる。
【００５９】
第１の相３２、すなわち、親水性の相は、粒子２１０をさらに含むことができる。粒子は、ビーズ、円盤、立方体、ピラミッド、球体、多面体、およびそれらの不規則な形状から選択された形状を有することができる。粒子２１０はまた、磁性であってもよく、またはそれに結合しているビオチン／ストレプトアビジン様の部分を有してもよいし、当該粒子に結合しているオリゴヌクレオチド２１２をさらに含んでもよい。水相３２は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施するための試薬をさらに含むことができる。単分散の実質的に均一サイズのエマルジョン液滴２００の逆エマルジョンの内部の離散的な相２１４の内部でＰＣＲ反応を起こすことができる。ＰＣＲ試薬は、緩衝剤、塩化マグネシウム等の塩、少なくとも１つのプライマー、ｄＮＴＰ、鋳型、ポリメラーゼ、およびエマルジョン液滴２００の内部の粒子２１０に結合しているオリゴヌクレオチド２１２の増幅のための、その他の試薬類を含むことができる。
【００６０】
膜をポリマーから作製することができる。例示的なポリマーとして、これらに限定されないが、ポリ（エーテルスルホン）、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリイミド、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ならびにその他のフッ素化ポリマー類および全フッ素置換されたポリマー類が挙げられる。ポリマーの膜表面を（例えば、ナノメートルスケールで）粗面化することができる。表面の粗面化は、機械的または化学的に達成することができる。例えば、超疎水性を達成するために、多孔質の仕切りの表面を酸素プラズマによって粗面化することができる。また、多孔質の仕切りの表面を疎水性にする、その他の方法を利用することもできる。この型の方法が、Ｌｉら、Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｒｅｖ．、２００７年、３６巻（８号）、１３５０〜１３６８頁に開示されている。
【００６１】
膜はまた、例えば、これらに限定されないが、ソーダ石灰ガラスまたはシラスガラス等のガラスから作製することもできる。膜はまた、例えば、ステンレス鋼または別の金属合金の薄い金属箔であってもよい。膜はまた、ケイ素から作製することもできる。膜はまた、（例えば、シリカもしくはアルミナの粉末を焼結することによって作製した）シリカもしくはアルミナの膜であっても、または多孔質のセラミックの膜であってもよい。多孔質の仕切りの表面を物理的または化学的に改変して、その親水性を調整することができる。
【００６２】
フォトリソグラフィー、化学エッチング、および反応イオンエッチング、ＲＩＥ）を使用して（トラックエッチングした）多孔質ケイ素膜を作ることができる。そのような方法は、当業者にはよく知られている。１．５〜１０μｍの穴を有するフォトマスクを使用して、下部の金の層を化学的にエッチングする。それに続くステップでは、反応性イオンエッチングによって、膜のバルクに穴を開ける。
【００６３】
別の実施形態では、仕切り１００の表面１０２および１０４は、両面が疎水性もしくは親水性であっても、または独立に疎水性もしくは親水性であってもよい。例えば、フォトマスクをケイ素膜表面１０２または１０４の上に置くためにフォトリソグラフィーの技法を使用し、真直ぐに通り抜ける孔１１４を形成するためにケイ素膜を化学的に処理し、個別に親水性および疎水性の表面１０２および１０４、または共に親水性または疎水性の表面１０２および１０４を得るために、それぞれの表面を段階的にシリル化して、仕切り中に孔を形成する。真直ぐに通り抜ける孔１１４の内壁１１２は、マスクされていない表面とともにその表面１１３を改変することができる。
【００６４】
図６は、逆エマルジョンを形成するための、多孔質の仕切り１００の可能な表面処理を示す。仕切りの第１の主要表面１０２を化学的に改変して、表面１０２および内壁表面１１２の両方を親水性にすることができる。第２の主要表面１０４をマスクによって全体的（孔の開口部１１０を含む）に覆って、表面１０２および１１２に対する化学処理の場合のバリアを作製することができる。そのような処理には、ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）部分またはポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分の、ケイ素および二酸化ケイ素等の表面への化学的な結合（以降、「ペグ化」と呼ぶ過程）が含まれる。油相に面する第２の主要表面１０４を疎水性にするための化学処理に対して感受性とすることによって、表面１０４を処理することができる。
【００６５】
図７に示すように、貨幣金属１０７、例えば、金、または当業者に既知のその他の材料の層を適用する調製において、接着増強剤１４０、例えば、これに限定されないが、クロムの層を適用することによって、第２の主要表面１０４を化学的な表面の改変のために調製することができる。貨幣金属の例として、これらに限定されないが、銅、ニッケル、金、白金、青銅および亜鉛が挙げられる。この例示的なリストには、制限する意図はなく、また、当業者に既知のその他の金属を使用することもできる。裸の金表面１０７に対して、ペルフルオロアルキルチオールのアルキルチオールを使用してチオール化を行い、その表面を疎水性１０６にすることができる。その他の硫黄含有化合物、例えばこれらに限定されないが、ジアルキルスルフィド類およびそのフッ素化バージョンならびにチオール基および／またはジスルフィド基を含むその他のオリゴマー化合物およびポリマー化合物を使用して、金表面を疎水性にすることができることは、当業者であれば理解することができる。種々の型の直鎖アルキルチオール類および分枝アルキルチオール類は、米国特許第５，３９５，５５０号（１９９５年）に従って合成することができる。全フッ素置換されたチオール化合物は、（Ｃ． Ｓ． Ｒｏｎｄｅｓｔｖｅｄｔら、Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ４２巻：２６８０〜２６８３頁（１９７７年））によって報告されている手順に従って合成することができる。これらの参照文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれている。金のチオール化の典型的な例を以下に示す。
【００６６】
【化１】
【００６７】
金表面１０７を疎水性１０６にするためのチオール化の後、孔１１４の内部の内壁表面１１２を含めた残りの表面１０２をペグ化して、親水性１１３とすることができる。
【００６８】
表面１０２および１１２の表面ペグ化は、約５〜約１００００個の反復単位、例えば、約６〜約３００個の反復単位、または例えば、約１０〜約２００個の反復単位を含むω−メトキシ−ポリ（エチレンオキシド）、ＭｅＯ−ＰＥＯ部分またはポリ（エチレングリコール）、ＰＥＧ部分を含むモノ−、ジ−、またはトリ−アルコキシシランを用いて実行することができる。当業者であれば、所望の表面の特色を達成するための、ＰＥＯ部分またはＰＥＧ部分の反復単位の数を決定することができる。
【００６９】
本開示によれば、表面をペグ化するために、種々の反応を起こすことができる。ペグ化は、本明細書において具体的には論じないが、本発明の範囲に属する、多くのその他の反応によって達成することができることは、当業者であれば理解する。以下の反応は、ケイ素基材上における、ＭｅＯ−ＰＥＯ部分を有するトリメトキシシランを使用する表面ペグ化の例である。
【００７０】
【化２】
【００７１】
図７は、実質的に均一サイズの逆エマルジョン液滴の形成を促進するための、仕切り１００表面の表面処理の例を示す。第１の主要表面１０２および真直ぐに通り抜ける孔１１４の内壁１１２に対してペグ化を行い、第１の主要表面および真直ぐに通り抜ける孔１１４の内壁表面１１３を親水性１０３にする。例示的なペグ化のプロトコールが、ＵＳ２００６００９１０１５Ａ１（２００６年）およびＵＳ２００７００９５６６Ａ１（２００７年））に教示されており、それぞれの参照文献全体が、参照により本明細書に組み込まれている。チオール基またはジスルフィド基を含むＰＥＧまたはＰＥＯを用いて金表面１０７を親水性にすることができ、アルキルアルコキシシランまたはペルフルオロアルキルアルコキシシランを用いて残りの表面１０２および１１２を疎水性にすることができ、その結果、通常のエマルジョンの調製のための膜が得られることは、当業者であれば理解する。
【００７２】
図１および図２に示すように、外圧１６を粒子２１０が懸濁している水相３２に適用すると、水相３２は、膜１００の真直ぐに通り抜ける孔１１４の経路を通って、連続的な相４２中に押し出される。連続的な相４２は、流れている４４（例えば、渦巻いている）であり得、膜１００の表面１０４を横切って流れ、それによって、被包されている粒子２１０を有するまたは有しない液滴２００をリザーバ６０まで運ぶことができる。あらかじめ決定した孔のサイズを有する所与の膜の場合、これらに限定されないが、水相に対して適用する圧力、水相の粘度、連続的な油相の粘度、連続的な相の流れによって生じるせん断力、孔１１０の縦横比、ならびに使用する（１つまたは複数の）界面活性剤の性質および濃度を含めた一連のパラメータによって液滴のサイズを制御することができる。
【００７３】
さらに、多孔質膜１００の表面の親水性および疎水性はまた、液滴、すなわち、サイズ、形成、形成速度および均一性に影響を及ぼすこともできる。したがって、逆エマルジョンの調製のために適用する圧力を低下させるためには、連続的な油相と接触している膜表面は、疎水性であり、一方、内壁表面は、親水性であることが望ましい。
【００７４】
【数１】
【００７５】
例えば、水相に面する表面１０３が親水性であり、かつ内壁表面１１３も親水性であれば、全ての表面が疎水性である多孔質膜と比較して、粘度および（１つまたは複数の）用いる界面活性剤等のその他の変数が一致している場合、より低い適用圧力でも、水相３２の多孔質膜１００の通過が促進される。
【００７６】
離散的な液滴２００はそれぞれ、試薬類をその分散している水溶液２１４中に含み、粒子２１０をその中に封入しており、この液滴２００を使用してポリメラーゼ連鎖反応（例えば、エマルジョンＰＣＲ）または連結反応等の反応を実施することができる。エマルジョンＰＣＲのプロトコールは、Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３巻（７号）：５４５〜５５０頁（２００６年）；Ｄｉｅｈｌら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３巻（７号）：５５１〜５５９頁（２００６年）；およびＭｉｌｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３巻（７号）：５６１〜５７０頁（２００６年）に記載されている。
【００７７】
本明細書に記載する乳化の機器および方法を使用して実質的に均一な液滴サイズを有する油中水型エマルジョンをもたらすことができる。真直ぐに通り抜ける孔の内部表面を改変して親水性にすると、水相を膜を通して押し出すのに必要な圧力が低下する。さらに、大部分の孔は、水相の、油相中への通過、したがって、液滴の形成を促進するために使用でき、機能する。この結果、エマルジョンの形成速度が改善され、より均一なサイズの液滴が生成し、液滴サイズの分布が改善される。横断面において見られる、４対１超の縦横比を有する改変した孔の形状はまた、均一サイズの、再現性のある逆エマルジョン液滴の形成の簡素化も促進し、逆エマルジョン液滴の形成速度も増強する。
【００７８】
粒子が液滴中に封入されており、その後の反応（例えば、ＰＣＲ）を液滴の内部で実施する適用においては、実質的に均一な液滴サイズによって、結果の信頼性を改善することができる。例えば、均一な液滴サイズによって、全ての粒子が、ほぼ同一の全含有量の反応物を含有する環境によって囲まれる可能性が改善され、それによって、より均一な反応結果を液滴中で得ることができる。さらに、全ての液滴が実質的に均一サイズであると、単一の粒子を有する液滴がポアソン分布モデルに従うエマルジョン生成システムを得ることができる。液滴のサイズが、広い分布範囲にわたって変動すると、エマルジョン生成システムの、ポアソンモデルからの、複雑なかつ予測できない様式での逸脱が生じ、結果の予測可能性に悪影響を及ぼす。分布範囲が変動すれば、結果も変動し、結果の予測は経験的な方法によらざるを得ない。
【００７９】
本明細書に記載する方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるタンパク質類およびＲＮＡ類の発生（例えば、米国特許第６，４８９，１０３Ｂ１号を参照されたい）、無細胞クローニング、ならびに配列決定を含めた多様な有望な適用例において使用することができる。これらの技法は、ＤＮＡまたはＲＮＡの断片の多種多様なコレクションを相互に単離して一連の増幅試薬類または改変試薬類を使用して増幅または改変する任意の適用例において使用することができる。
【００８０】
多くの改変物、代替物および等価物が可能であることは、当業者であれば理解する。全てのそのような改変物、代替物および等価物は、本明細書に包含されるものとする。
【実施例】
【００８１】
（実施例１）
多孔質のケイ素の層の表面改変
上記に記載したように、多孔質の仕切りは多孔質のケイ素の層であってよい。多孔質のケイ素の仕切りの表面を改変して疎水性とすることができる。疎水性表面を有する多孔質のケイ素の仕切りは、疎水性表面が連続的な油相に面する状態で、本明細書に記載する機器中で使用することができる。
【００８２】
多孔質のケイ素の層（膜）の表面は、自然の酸化物または化学的手段によって産生させた酸化物の表面の層を含有することができる。この酸化物の表面の層をアルキルアルキルシランおよび／またはフッ素化アルキルシラン（１）を用いて改変して、疎水性の特徴を有する表面を得ることができる。
Ｒ１−Ｓｉ（Ｒ２）ｘ（Ｒ３）ｙ （１）
式中、
Ｒ１＝ＣｎＨ２ｎ＋１またはＣＨ２ＣＨ２（ＣＦ２）ｍＣＦ３であり；
Ｒ２＝ＣｑＨ２ｑ＋１であり；
Ｒ３＝ＯＲ２またはＣｌであり；
Ｘ＝０〜２であり；
ｘ＋ｙ＝３であり；
ｎおよびｍは独立に、４〜２５の整数であり；かつ
ｑ＝１〜５である。
【００８３】
シリル化すると、表面のフッ素化アルキル基により表面が疎水性になる。これらのフッ素化アルキル基はまた、ＴＥＦＬＯＮ（登録商標）ＡＦまたはＣＹＴＯＰ等、全フッ素置換されたポリマーの追加の上面被覆の接着性を増強するためのつなぎの層としての役割も果たすことができる。それらの構造を以下に示す。
【００８４】
【化３】
【００８５】
これら２つの全フッ素置換されたポリマーは、全フッ素置換された炭化水素の溶媒に可溶であり、その溶液を表面上にスピンキャスト、浸漬被覆またはスプレーして（ｓｐａｙｅｄ）、表面の疎水性を改善することができる。これらのポリマーの単層をナノメートルスケールの粗さを有する表面上に被覆することによって、超疎水性の表面を達成することができる（Ｌｉら、Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｒｅｖ． ３６巻（８号）：１３５０〜１３６８頁（２００７年））。
【００８６】
以下の手順は、ケイ素のウエハ／膜の表面改変のために利用することができる代表的な手順である。
【００８７】
（実施例２）
表面の化学的改変に先立つ前処理ための手順
鏡面を有するケイ素ウエハまたは多孔質ケイ素膜、例えば、１７ｍｍ×１７ｍｍを３０ｍｌの１．０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）中で、２０〜６０分間超音波処理することができる。次いで、ウエハ／膜を脱イオン水を用いて十分に濯ぐことができる。それに続いて、ウエハ／膜を５ｍＬの２９％ＮＨ４ＯＨ、５ｍｌの３０％Ｈ２Ｏ２、および２０ｍＬのＤＩ水の混合液中で、２０〜６０分間超音波処理することができる。次いで、これをＤＩ水を用いて十分に濯ぐことができる。次いで、ケイ素のウエハ／膜を５ｍＬの３８％ＨＣｌ．、５ｍＬの３０％Ｈ２Ｏ２、および２０ｍＬのＤＩ水の混合液中で、２０〜６０分間超音波処理し、ＤＩ水を用いて十分に濯ぐことができる。次いで、ケイ素のウエハ／膜を窒素を用いて乾燥し（例えば、送風乾燥し）、即時に使用することができる。前処理したウエハ／膜の場合、典型的な水に対する静的接触角（２μＬの水、マイクロピペットにより手作業で置く）は、≦１０度である。
【００８８】
（実施例３）
アルキルシラン試薬類を使用する表面の化学的改変のための手順
３５ｍｌの１００％ＥｔＯＨ中に、１．０ｍＬのデシルトリエトキシシランを添加し、撹拌して溶解させることができる。次いで、前処理したケイ素ウエハまたは多孔質ケイ素膜をこのシラン溶液中に、（例えば、オービットシェイカーを用いて）撹拌しながら３０分間浸すことができる。次いで、ウエハ／膜を取り出して、１００％エタノール中に一時的に浸漬することができ、過剰な溶媒を振り落とす。次いで、ウエハ／膜を１１０℃で２０分間硬化させることができる。アルキルシリル化したチップの場合、典型的な水に対する静的接触角（２μＬの水、マイクロピペットにより手作業で置く）は、約９０度である。
【００８９】
（実施例４）
フッ素化シランを使用する表面改変のための手順
ねじ蓋を有する１５ｍｌのガラス製バイアル中に、４ｍＬのフッ素化された溶媒、例えば、ペルフルオロ−（２−ペルフルオロ−ｎ−ブチル）テトラヒドロフラン（ＦＣ−７５、３Ｍから入手）、および０．５ｍＬのフルオロシリル化試薬、例えば、（ヘペタデカフルオロ（ｈｅｐｅｔａｄｅｃａｆｌｕｏｒｏ）−１，１，２，２−テトラヒドロデシル）トリメトキシシランまたは（ヘペタデカフルオロ（ｈｅｐｅｔａｄｅｃａｆｌｕｏｒｏ）−１，１，２，２−テトラヒドロデシル）ジメチルクロロシラン（Ｇｅｌｅｓｔから入手）を混合して溶解させることができる。前処理し、送風乾燥した鏡面を有するケイ素ウエハまたは多孔質ケイ素膜をこのシラン溶液中に、時折撹拌しながら２０分間浸すことができる。次いで、ウエハ／膜を取り出し、過剰なシラン溶液を振って取り除き、窒素を用いて乾燥する（例えば、送風乾燥する）ことができる。次いで、チップを１１０℃で２０分間硬化させることができる。フルオロシリル化したケイ素のウエハ／膜の場合、典型的な水に対する静的接触角（２μＬの水、マイクロピペットにより手作業で置く）は、約１１０度である。
【００９０】
（実施例５）
全フッ素置換されたポリマーを用いてフルオロシリル化されたケイ素のチップを被覆するための手順
全フッ素置換されたポリマー、例えば、ＴＥＦＬＯＮ（登録商標）ＡＦ−１６００（ＤｕＰｏｎｔから入手）またはＣＹＴＯＰ（Ａｓａｈｉ Ｇｌａｓｓから入手）の、０．５％ｗ／ｖ溶液は、フッ素化された溶媒、例えば、ＦＣ−７５（３Ｍから入手）またはＣＴＳＯＬＶ−１８０（Ａｓａｈｉ Ｇｌａｓｓから入手）を使用して調製することができる。フルオロシリル化された鏡面を有するケイ素ウエハまたは多孔質ケイ素膜をこの溶液中に一時的に浸漬し、過剰な溶液を振り落とし、被覆されたウエハ／膜を１１０℃で２０分間硬化させることができる。被覆されたウエハ／膜の場合、典型的な水に対する静的接触角（２μＬの水、マイクロピペットにより手作業で置く）は、約１２０度である。
【００９１】
（実施例６）
多孔質ケイ素膜の表面を親水性にするための溶液ペグ化のための一般的な手順
典型的には、多孔質ケイ素膜は、ペグ化に先立って前処理する。膜を有機溶媒、例えば、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒから入手するＰＲＳ−３０００（商標）Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｐｈｏｔｏ ｒｅｓｉｓｔ Ｓｔｒｉｐｐｅｒ中で超音波処理することによって、フォトレジストを除去した後、表面を多量のエタノールを用いて十分に濯ぎ、窒素を流しながら送風乾燥し、次いで、対流式オーブン中、１１０℃で３０分間焼く。次いで、清浄したケイ素膜を実施例２に従って処理する。前処理したケイ素膜をペグ化のために即時に使用した。
【００９２】
【化４】
【００９３】
３５ｍＬの空洞、および底部に、１７ｍｍ×１７ｍｍのサイズの多孔質ケイ素膜１０枚を垂直な位置で保持するためのスロットを有するように構築したＴＥＦＬＯＮ（商標）の箱を溶液ペグ化のために使用した。このＴＥＦＬＯＮ（商標）の箱の寸法および容量をスケールアップして、より多くの膜を保持することができる。膜をＴＥＦＬＯＮ（商標）のペグ化用の箱の中に置いた後、ゴム製の中隔で蓋をした入口および出口を含有する気密キャップが元に戻され密封された。次いで、超純粋アルゴンを用いて、１分当たり５００ｍＬで２分間ペグ化用の箱をパージした。３０ｍＬの無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中の０．５ｍＬの２−［メトキシ（ポリエチレンオキシ）プロピル］トリメトキシシラン、ＭＷ：５，９１０Ｄａ（Ｎｅｋｔａｒ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、アラバマ州）の溶液をシリンジを使用して添加した。これに続いて、１．０ｍＬのトリエチルアミンを添加した。密封したペグ化用の箱をＣｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ Ｒｏｃｋｉｎｇ Ｐｌａｔｆｏｒｍ上、５５ｒｐｍで揺り動かした。２０時間揺り動かした後、膜を取り出し、ＴＨＦを用いて手早く濯ぎ、窒素を流しながら送風乾燥し、対流式オーブン中、１１０℃で１０分間焼いた。蓋をしたペトリ皿中に周囲条件下でペグ化した膜を使用まで保った。Ｋｒｕｓｓ（Ｍａｔｔｈｅｗｓ、ノースカロライナ州）から入手したＤｒｏｐ Ｓｈａｄｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ＤＳＡ１００を使用して水に対する静的接触角を測定した。３つの無作為に抽出した試料から、全部で１２個のデータポイントを得た。水に対する静的接触角の平均は、３２．１度であり、標準偏差は、０．５度であった。
【００９４】
（実施例７）
金蒸着に先立つケイ素膜のメルカプトシリル化
多孔質ケイ素膜を拭き取り、次いで、洗浄瓶を使用して分析グレードのアセトンを用いて濯ぐことによって調製する。次いで、膜を０．５ｗｔ％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を有するＭｉｌｌｉ−Ｑ水中で、１５分間超音波処理し、次いで、多量のＭｉｌｌｉ−Ｑ水を用いて濯ぎ、次いで、窒素を用いて送風乾燥してから使用する。
【００９５】
改変を加えたＡ． Ｒｏｓｓら、Ｊ． Ｍａｔｅｒ． Ｃｈｅｍ．、１３巻：７２２〜７２６頁（２００３年）の方法を用いて膜のシリル化を行う。９０．１μＬの３−メルカプトプロピル（メチル）ジメトキシシラン、６．６μＬのヘキシルアミン、および１００ｍＬのトルエンの新鮮な溶液を調製し、窒素下で混合する。この溶液中に膜を１５分間浸す。膜を溶液から取り出し、ＨＰＬＣグレードのトルエンを用いて濯ぎ、Ｎ２を流しながら送風乾燥した。シリル化された膜を金蒸着のために即時に使用した。
【００９６】
（実施例８）
金表面を疎水性にするためのチオアルキル化のための一般的な手順
金層の添加を含めた、化学的な表面改変のために、クロム等の接着増強剤を適用することによって多孔質ケイ素膜の表面を調製する。金を蒸着の過程によって沈積させることができ、次いで、チオール化をアルキルチオールまたはペルフルオロアルキルチオールを使用して行って、表面を疎水性にする。
【００９７】
（実施例９）
金表面を親水性にする一般的な手順
最初に、ケイ素基材に結合したＯＨ基を用いてシラノール基の表面密度を増強するために、金表面をＰｉｒａｎａｈ溶液を用いて清浄する。続いて、シリル化の過程を行って、金層を沈積しようとする、多孔質ケイ素膜の表面を処理する。メルカプト含有シリル化剤（Ｇｅｌｅｓｔ，Ｉｎｃ．から入手）を膜表面上のＯＨ基と反応させると、表面に硫化水素基（ＨＳ）が組み込まれる。シリル化の過程は、金の、多孔質ケイ素膜に対する良好な接着を最終的にもたらす。これは、形成されたＨＳ基（例えば、メルカプト基）が、金と反応し、金との化学結合を形成することによる。シリル化後、金を基板上に蒸着の過程によって沈積する。メルカプト官能基はまた、透明な金層の、膜表面に対する強力な接着ももたらす。これは、共有結合が、沈積した金と硫黄（Ｓ）との間に形成されることによる。
【００９８】
次いで、沈積した金層に対してペグ化の過程を行って、金表面を親水性にする。メルカプトで官能化されたポリ（エチレングリコール）（分子量：５，７２３Ｄａ、Ｎｅｋｔａｒから入手）を含有するテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）の水溶液に金表面を曝す。メルカプト基が、金層と、硫黄（Ｓ）の結合を介して強力な共有結合を形成する。得られた金の表面層は、金に結合したポリ（エチレングリコール）基（ＰＥＧ）を有する。
【００９９】
（実施例１０）
仕切り内の真直ぐに通り抜ける穴の調製
当業者に知られている通常の化学的な慣行を使用して、ケイ素のウエハまたはケイ素の仕切りが、真直ぐに通り抜ける孔を含むように作ることができる（多孔質膜）。例えば、厚さ３０〜５０ミクロンの間の上部のケイ素の層を有するシリコン−オン−インシュレータ（ＳＯＩ）ウエハから開始し、フォトレジスト（ＰＲ）マスクを上部表面上にスピンする。このケイ素の層は、２ミクロンの酸化物の層の上に存在し、この酸化物の層は、３５０〜４５０ミクロンのケイ素の層の上にある。フォトリソグラフィーを実施して、孔の形状、密度およびレイアウトに関するＰＲマスクのパターンを生成する。乾式反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）を上部の層に行って、上部の３０〜５０ミクロンのケイ素の層を下の酸化物の層に達するまでエッチングする。この状態では、ケイ素は、ＰＲによって被覆されていない。次いで、このＰＲマスクを取り除き、第２のＰＲマスクをＳＯＩウエハ（表面の厚さは３５０〜４５０ミクロンである）の裏側に適用し、フォトリソグラフィーを実施して、仕切りの膜（すなわち、多孔質の領域）に関するＰＲマスクのパターンを生成する。ＤＲＩＥを使用して、３５０〜４５０ミクロンのケイ素の層を上の酸化物の層に達するまでエッチングして、それに続いて、マスクを取り除く。次いで、ケイ素のウエハまたはケイ素の仕切りをフッ化水素酸中に浸漬して、酸化物の層を取り除くと、上部のケイ素の層の中の孔が、厚いケイ素の層の内部に開通し、仕切りの多孔質膜領域が形成される。
【０１００】
（実施例１１）
連続的な相および水相の調製
連続的な相は、鉱油またはその他の適切な溶媒中の４〜１０ｗｔ％ＳＰＡＮ−８０および０．２〜１．５ｗｔ％ＴＷＥＥＮ−８０をそれぞれ含むことができる。以下の表に、１〜２×１０９個のビーズ、例えば、ＰＣＲ反応における使用のための１．６〜１．７×１０９個のＰ１ビーズを含有する水相の組成を示す。Ｐ１およびＰ２は、プライマーを指定している。水相は、必要に応じて、スケールアップすることができる。
【０１０１】
【表１】
【０１０２】
上記の手順は、表面が、これらに限定されないが、穴、真直ぐに通り抜ける穴、柱（ｐｏｓｔ）、柱（ｐｉｌｌａｒ）、スパイク、溝、くぼみ、刻み目またはフラクタルの構造を含む、人工的な造作を含むケイ素のウエハ／膜またはチップに適用できることは、当業者であれば理解する。ケイ素のウエハ／マスクの表面はまた、機械的または化学的に粗面化して、ナノメートルスケールからマイクロメートルスケールまでの表面粗さを有することができる。
【０１０３】
前記の明細書は、例証のために提供した実施例と共に、本発明の原理を教示するが、当業者であれば、本開示を読み取ることによって、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、形態および詳細の点で、種々の変形物を作製することができることを理解する。
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００７年５月１８日に出願された米国仮出願第６０／９２４，５４４号および２００７年５月２４日に出願された米国仮出願第６０／９２４，６６４号に対する優先権の利益を主張する。これらの出願の各々は、それらの全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
本明細書で使用するセクションの見出しは、組織化の目的に限られ、いずれの場合であっても本明細書に記載する対象を限定すると解釈してはならない。
【０００３】
分野
本出願は一般に、実質的に均一な油中水型エマルジョンを形成するためのシステムおよび方法に関し、このエマルジョンは、連続的な油相、および粒子に結合しているオリゴヌクレオチドを含有する水相の離散的な液滴を含む。
【背景技術】
【０００４】
緒言
エマルジョンは、２つの非混和性の液体を組み合わせる、食品の調製、化学薬品、化粧品および医薬品のプロセスにおいて活用される。均一サイズのエマルジョン液滴を有するエマルジョンはまた、単分散エマルジョンとも呼ばれ、多分散エマルジョンよりも安定である。エマルジョン液滴の内部に含有される粒子によって、追加の特性をエマルジョンにもたらすことができる。
【０００５】
エマルジョンは、２つの非混和性の液体をボルテックスおよび撹拌することによって、または第１の非混和性の相を膜中の孔を通して第２の非混和性の連続的な相中に押し出すことによって調製することができる。いずれの過程においても、エマルジョン液滴のサイズおよびエマルジョンの安定性の変動が見られる。エマルジョンの均一性および安定性を改善するための多数の手順が開発されている。
【０００６】
Ｔａｄａｏ Ｎａｋａｓｈｉｍａらが最初に、エマルジョンを調製するためのシラス多孔質ガラス（ＳＰＧ）膜の使用を報告した（非特許文献１；特許文献１（１９８７年））。水相を膜の孔を通過させることによって逆エマルジョン（油中水型）を調製するためには、少なくとも連続的な油相に面している膜表面が、疎水性でなければならない（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。膜および内部の孔の表面の疎水性が、エマルジョンのサイズ、安定性および形成速度に対して影響を及ぼす。膜および膜の孔の内部表面の表面特性を変化させるための方法は、多種多様であり得る。
【０００７】
Ｎａｎｏｍｉ Ｅｍｕｌｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｅｎｓｃｈｅｄｅ、オランダ）は、シリコンウエハを膜のために使用してトラックエッチング多孔質膜を調製する（Ｊ． Ｗｉｓｓｉｎｋら、特許文献２）。縦軸に沿って補助的な構造を含む≧２μの直径を有する孔が、シリコンウエハ中に反応性イオンエッチングまたはその他のリソグラフィーの技法によって形成される。これに続いて、シラン試薬を用いて膜に対する化学蒸着（ＣＶＤ）を実施して、孔の内部表面を含めた全ての膜表面を疎水性にする。水相を孔を通して押し出し、膜の反対側まで通過させる際には、疎水性によって水相は膜表面上に水たまりに代わって液滴を形成することができる。臨界圧力Ｐｃが膜上の離散的な相の接触角ｃｏｓθに比例するので、水相を孔を通して押し出すためには比較的高い圧力が必要であり、内壁が疎水性である場合、孔のうちのごく一部によって水相が膜を押し通るのが可能になるに過ぎず、その結果、形成速度が異なり、エマルジョン液滴のサイズが変動する（非特許文献５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第４，６５７，８７５号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００７／０２２７５９１号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｔａｄａｏ Ｎａｋａｓｈｉｍａら、Ｃｅｒａｍ． Ｊｐｎ． １９８６年、２１巻、４０８頁
【非特許文献２】Ｃ．−Ｊ． Ｃｈｅｎｇら、Ｊ． Ｃｏｌｌｏｉｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉ． ２００６年、３００巻：３７５〜３８２頁
【非特許文献３】Ｎ． Ｙａｍａｚａｋｉら、Ｊ． Ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ Ｓｃｉ． ＆ Ｔｅｃｈ． ２００３年、２４巻：２４９〜２５７頁
【非特許文献４】Ｋ． Ｓｕｚｕｋｉ、Ｒｅｚａ Ｋｅｎｋｙｕ １９９３年、２１巻：２６〜３１頁
【非特許文献５】Ｃ． Ｃｈａｒｃｏｓｓｅｔら、Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｔｅｃｈ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２００４年、７９巻、２０９〜２１８頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
概要
本実施形態により、複数の実質的に均一サイズのエマルジョン液滴（少なくとも１つのエマルジョン液滴は粒子を含む）を形成するための装置を開示し、この装置は複数の粒子を含む水相を含有する第１のチャンバー；水非混和性の液体を含む油相を含有する第２のチャンバー；ならびに第１のチャンバーと第２のチャンバーとを分離する仕切りであって、少なくとも第１の主要表面、第１の主要表面に対向する第２の主要表面、および少なくとも２つの、第１の主要表面を第２の主要表面に接続する画定された真直ぐに通り抜ける孔を含み、該第１の主要表面は第１のチャンバーの壁を形成し、該第２の主要表面は第２のチャンバーの壁を形成する仕切りを含み、前記水相が前記少なくとも２つの真直ぐに通り抜ける孔のうちの２つを通過して前記油相に至る際に、該水相は複数の離散的な実質的に均一サイズのエマルジョン液滴を形成し、その複数の液滴のうちの少なくとも１つは複数の粒子のうちの少なくとも１つの粒子を含み、該少なくとも１つの粒子は、少なくとも１つの、粒子に結合している核酸を含む。
【００１１】
また、別の実施形態では、実質的に均一サイズのエマルジョン液滴を形成するための第１の相を第２の相中に通過させる仕切りも開示し、この仕切りは第１の主要表面；第１の主要表面に対向する第２の主要表面；さらに多角形、卵形、楕円形、亜鈴型、蝶ネクタイ型およびそれらの不規則な形状からなる群から選択された横断面の形状、ならびに第１の主要表面と第２の主要表面との間の仕切りを横断する内壁を含む、少なくとも２つの真直ぐに通り抜ける孔を含み、第２の相中において第１の相を含む実質的に均一サイズのエマルジョン液滴を形成するように構成される。
【００１２】
さらに別の実施形態では、実質的に均一サイズのエマルジョン液滴を形成する方法を開示し、この方法は、仕切りの第１の主要表面と接触している複数の粒子を含む水相を仕切り中の少なくとも２つの真直ぐに通り抜ける孔を通して分散媒体中に押し出すステップと、同時に、仕切りの第２の主要表面に対して平行にかつそれと接触した状態で分散媒体を移動させるステップであって、第２の主要表面が第１の主要表面に対向しており、それによって、分散媒体中に分散した水相の実質的に均一サイズのエマルジョン液滴を形成するステップとを含み、複数の液滴は少なくとも１つの粒子を含む。
【００１３】
以下の説明において、特定の態様および実施形態が明らかになる。所与の実施形態が、本明細書に記載する全ての態様および特色を必ずしも有する必要はないことを理解されたい。これらの態様および実施形態は例示および説明のためのものに過ぎず、本発明を制限するものではないことを理解されたい。
【００１４】
前記の一般的な記載および以下の詳細な記載の両方は、例示および説明のためのものに過ぎず、請求する本発明を制限するものではないことを理解されたい。
【００１５】
本明細書中に組み込まれ、その一部を構成する付随の図面は本開示のいくつかの例示的な実施形態を例証し、記載と一緒になって特定の教示を説明する役目を果たす。
【００１６】
油相中に分散した少なくとも１つの粒子を含有する水相の均一サイズの液滴、すなわち、逆エマルジョンを形成するためのシステムおよび方法の改善が依然として求められている。したがって、連続的な油相と接触している膜表面が疎水性であり、一方、膜の内壁表面は親水性であって、その結果、逆エマルジョン液滴の調製のために水相を多孔質膜の仕切りを通して押し出すのに必要な適用圧力が低下するようになることが望ましい。水相に面する多孔質膜表面、および内壁表面が親水性の特徴を有し、かつ油相に面する膜表面が疎水性の特徴を有するように調製する方法によって、実質的に均一な逆エマルジョン液滴の形成が改善される。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅等の核酸の増幅を実施するための微小反応装置として粒子を含有する逆エマルジョン液滴を使用することができる。
【００１７】
本教示のこれらおよびその他の特色を本明細書に記載する。
【００１８】
以下に記載する図面は例証のためのものに過ぎないことを当業者であれば理解する。図面は、いずれの場合であっても本教示の範囲を制限するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１はエマルジョンを形成するための装置の斜視図を示す。
【図２】図２は、エマルジョンを形成するための装置の横断面図を示す。
【図３】図３は、図２の横断面図を拡大した部分を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、真直ぐに通り抜ける孔の形状および仕切り内の孔の配置の例を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、真直ぐに通り抜ける孔の形状および仕切り内の孔の配置の例を示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、真直ぐに通り抜ける孔の形状および仕切り内の孔の配置の例を示す。
【図４Ｄ】図４Ｄは、真直ぐに通り抜ける孔の形状および仕切り内の孔の配置の例を示す。
【図４Ｅ】図４Ｅは、真直ぐに通り抜ける孔の形状および仕切り内の孔の配置の例を示す。
【図４Ｆ】図４Ｆは、真直ぐに通り抜ける孔の形状および仕切り内の孔の配置の例を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、例示的な孔の形状の横断面図を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、例示的な孔の形状の横断面図を示す。
【図６】図６は、図３の仕切りの表面処理の横断面図を示す。
【図７】図７は、図６の横断面図を拡大した部分を示す。
【図８】図８は、実質的に均一サイズの逆エマルジョンを形成する一般的な方法を示すブロック図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
詳細な説明
本明細書を解釈するために以下の定義が適用され、適切である限り単数で使用する用語はまた複数も含み、逆も同様である。以下に記載するいずれかの定義が、参照により本明細書に組み込まれている任意の文献を含めた何らかのその他の文献中におけるその語の使用法と対立する場合、本明細書およびそれに伴う特許請求の範囲を解釈するためには、（例えば、その用語の元々使用されている文献中の）相反する意味が明確に意図されない限り以下に記載する定義が常に優先すべきである。本明細書および付随の特許請求の範囲において使用するように、単数形である「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、１つの指示対象に明白にかつはっきりと限定されない限り複数の指示対象を含むことに留意されたい。「または（ｏｒ）」の使用は、別段の記載がない限り、「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を意味する。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用には、互換性があり、制限する意図はない。さらに、１つまたは複数の実施形態の記載が、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語を使用する場合、いくつかの特異的な場合においては、１つまたは複数の実施形態を「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」および／または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という言葉を使用して選択的に記載することができることは当業者であれば理解する。
【００２１】
本明細書で使用する場合、「膜」、「仕切り」、「層」および「被膜」という句には、互換性があり、制限する意図はない。
【００２２】
本明細書で使用する場合、「核酸」、「オリゴヌクレオチド」および「（１つまたは複数の）ポリヌクレオチド」という句には、互換性があり、制限する意図はない。
【００２３】
本明細書で使用する場合、「離散的な水相」、「水相」および「油非混和性の液体」には、互換性があり、制限する意図はない。
【００２４】
本明細書で使用する場合、「水相」という句は、油非混和性の液体を指す。
【００２５】
本明細書で使用する場合、「油相」という句は、水非混和性の液体を指す。本明細書で使用する場合、「連続的な相」、「連続的な油相」、「油相」、「水非混和性の液体」および分散媒体には、互換性があり、制限する意図はない。
【００２６】
本明細書で使用する場合、「離散的な相」という句は、油相内に乳化させた水相を指す。
【００２７】
本明細書で使用する場合、「分散相（ｄｉｓｐｅｒｓｅｄ ｐｈａｓｅ）」および「分散相（ｄｉｓｐｅｒｓｅ ｐｈａｓｅ）」という句は、非混和性の液体内に乳化させた相を指す。説明すると、通常のエマルジョン中では、油相を水相中に乳化させ、水相中に「分散」したということができる。逆に、逆エマルジョン中では、水相を油相中に乳化させ、油相中に「分散」したということができる。
【００２８】
本明細書で使用する場合、「通り抜ける孔」という句は、多孔質層の第１の主要表面を第２の主要表面に接続する孔を指す。
【００２９】
本明細書で使用する場合、「真直ぐに通り抜ける孔」という句は、多孔質層の第１の主要表面を第２の主要表面に接続し、孔の壁には接触も交差もしない、それを通る直線を描くことができる孔を指す。また、「真直ぐに通り抜ける」孔は、「トラックエッチングした」孔も指す。
【００３０】
本明細書で使用する場合、「縦軸」（ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ ａｘｉｓ）という句は、真直ぐに通り抜ける孔を通して描いた直線を指し、これは、真直ぐに通り抜ける孔の内壁には接触も交差もしない。
【００３１】
本明細書で使用する場合、「内壁」という句は、多孔質層の第１の主要表面を第２の主要表面に接続する、多孔質膜内の真直ぐに通り抜ける孔の表面を指す。
【００３２】
本明細書で使用する場合、「実質的に均一な」という句は、本明細書に開示する装置および方法によって形成したエマルジョン液滴のサイズおよび体積を指す。形成した複数のエマルジョン液滴は、サイズおよび体積に関して、少なくとも５％〜２０％および少なくとも１０％〜１５％の変動係数パーセントを有する。
【００３３】
本明細書に記載するシステムおよび方法は、通常の、すなわち、水中油型エマルジョン、または逆の、すなわち、油中水型エマルジョンのいずれにも等しく適合できる。粒子に結合しているオリゴヌクレオチドを含有するエマルジョン液滴を形成するための、開示する方法は、オリゴヌクレオチドが結合している粒子を含有する水相を２つの非混和性の相を分離する、真直ぐに通り抜ける孔を有する仕切りを通して押し出すステップを含む。
【００３４】
膜エマルジョン装置によって形成したエマルジョン液滴は、単分散の、サイズおよび形状が実質的に均一な液滴であり得る。所望のエマルジョンを得るために適した膜表面、内壁、および孔の形状の改変形態および処理ならびに２つの非混和性の相を当業者であれば理解する。
【００３５】
水性の液滴中に封入された粒子を含む逆（すなわち、油中水型）エマルジョンを調製するためのシステムおよび方法を本明細書に記載する。核酸増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応）の過程を実施するために水性の液滴を含有する粒子を使用することができる。
【００３６】
ここで、付随する図面に示されている、本開示のいくつかの例示的な態様を詳細に参照する。可能な限り同一の参照番号を図面全体にわたり使用して、同一または類似の部分を指す。
【００３７】
図１は、本開示の種々の例示的な態様による、単分散の実質的に均一サイズのエマルジョンおよび逆エマルジョンの形成において使用するための例示的な装置を模式的に示す。
【００３８】
機器は、連続的な油相４２を含有する、少なくとも１つの区画４０を含むことができる。油相４２はまた、界面活性剤を含むこともできる。界面活性剤は、イオン性界面活性剤であっても、または非イオン性界面活性剤であってもよい。この区画４０は、真直ぐに通り抜ける孔１１４を含む多孔質の仕切り１００によって、水相３２、すなわち、第１の組成物（その中には少なくとも複数の粒子２１０が懸濁している）を含有する少なくとも１つの区画３０から分離することができる。
【００３９】
機器は、水相３２を含有する区画３０の内容物を加圧するための装置１０を含むことができる。この装置１０は、水相３２を含有する区画３０に開口部１４において接続している、加圧されたガスを含有するタンクを含むことができる。装置はまた、多孔質の仕切り１００に対して移動可能であり、水相３２を含有する区画３０の容積を減少させるために移動させることができる壁３４を含むこともできる。また、水相３２を含有する区画の内容物を加圧するための、その他の装置も使用することができる。
【００４０】
機器はまた、水相３２の機械的な撹拌をもたらすために、水相３２を移動させる装置を含むこともできる。機械的な撹拌部は、シャフト２２を有するモーター２０を含むことができ、シャフト２２は、モーター２０から、水相３２を含有する区画３０の内部に位置する翼板２４に至る。
【００４１】
機器はまた、連続的な油相４２を多孔質の仕切り１００の表面１０４に対して移動させるための装置５０を含むこともできる。この装置５０は、連続的な油相４２を多孔質の仕切り１００の表面１０４上にポンプで送るように構成されたポンプを含むことができる。油相４２の流れは、多孔質の仕切り１００の第２の主要表面１０４に対して平行であり、水相３２の、多孔質の仕切り１００の真直ぐに通り抜ける孔１１４を通る流れ１６に対して直交する層流４４であってよい。装置はまた、乳化の間に連続的な油相４２を撹拌するまたはそれに揺れを起こすように構成された撹拌装置または揺れを起こす装置を含むこともできる。揺れを起こす装置は、これらに限定されないが、ボルテックス装置、ロッカー、シェイカー、オービットシェイカーまたは超音波処理器を含めた、機械的な装置であってよい。このリストには制限する意図はなく、また、乳化の間に連続的な相を多孔質の仕切りの表面上に流すまたはそれ以外の様式で移動させる、その他の装置を使用することもできる。
【００４２】
機器はまた、実質的に均一サイズのエマルジョン液滴２００を収集するためのリザーバ６０を含むこともでき、エマルジョン液滴２００は、区画４０から、連続的な油相４２によってリザーバ６０に運ばれる。
【００４３】
図２は、本開示の種々の例示的な態様による、単分散の実質的に均一サイズの逆エマルジョン液滴２００の形成において使用するための図１の例示的な装置の横断面を模式的に示す。図２は、逆エマルショの形成を示すが、当業者であれば、通常のエマルジョンを形成するために、図１および２の装置の改変形態を思い浮かべることができる。
【００４４】
機器は、連続的な油相４２を含有する少なくとも１つの区画４０を含むことができる。油相４２はまた、界面活性剤を含むこともできる。界面活性剤はイオン性界面活性剤であっても、または非イオン性界面活性剤であってもよい。真直ぐに通り抜ける孔１１４を含む多孔質の仕切り１００によって、水相３２を含有する少なくとも１つの区画３０からこの区画４０を分離することができ、水相３２中には複数の粒子２１０が懸濁している。複数の粒子２１０のうちの少なくともいくつかには、少なくとも１つのオリゴヌクレオチド２１２が結合している。
【００４５】
連続的な相４２は、水非混和性の液体（例えば、油相）を含む。例示的な水非混和性の液体として、これらに限定されないが、シリコン油類（これらに限定されないが、ポリ（ジメチルシロキサン）、ポリ（メチルフェニルシロキサン）、およびそれらのコポリマーを含む）、ペトロレウムスペシャル（ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ ｓｐｅｃｉａｌ）（Ｆｌｕｋａ）、飽和または不飽和の脂肪族炭化水素類、そのハロゲン化誘導体、およびそれらの組合せが挙げられる。脂肪族炭化水素類は、直鎖状であっても、または分枝状であってもよく、例として、これらに限定されないが、ヘキサン、イソオクタン、デカン、ドデカン、１−ドデセン、ペンタデカン、ヘキサデカン、石油エーテル類および鉱油類）、ヘプタデカン（ｂｐ３０２℃）、ヘプタメチルノナン（ｂｐ２４０℃）、ヘプタデセン（ｂｐ１５９℃／１１ｍｍＨｇ）、ペルフロウロトリデカン（ｐｅｒｆｌｏｕｒｏｔｒｉｄｅｃａｎｅ）（ｂｐ１９６℃）、およびＦＬＵＯＲＩＮＥＲＴ（商標）Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｌｉｑｕｉｄ ＦＣ−７７０（３Ｍ、Ｓｔ．Ｐａｕｌ、ミネソタ州から入手）、芳香族炭化水素類（これらに限定されないが、ベンゼン、トルエン、クメン、アルキルベンゼン類およびアルキルアリールベンゼン類を含む）、エステル類（これらに限定されないが、フタル酸１，４−ジオクチルを含む）、フッ素化炭化水素類（これらに限定されないが、ＦＬＵＯＲＩＮＥＲＴ（商標）ＦＣ−７５（３Ｍ）およびＣＴＳＯＬＶ−１００（Ａｓａｈｉ Ｇｌａｓｓ）を含む）、ならびにその他のハロゲン化炭化水素類、さらに、これらに限定されないが、ＦＯＭＢＬＩＮ（登録商標）、（ｄ１．８８〜１．９２ｇ／ｃｍ３、粘度６０〜１５００ｃＳｔ、Ａｕｓｉｍｏｎｔ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．（Ｔｈｏｒｏｆａｒｅ、ニュージャージー州）から入手）、およびＤＥＭＮＵＭ（商標）（Ｄａｉｋｉｎ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、日本）を含めた、ペルフルオロポリエーテル類であってよい。使用することができる、追加の水非混和性の液体には、これらに限定されないが、植物油（すなわち、飽和および不飽和の脂肪酸類および誘導体）等の天然に存在する油類が含まれる。
【００４６】
９６℃超の沸点（ｂｐ）を有する水非混和性の液体であればいずれも、連続的な相４２として使用することができることは、当業者であれば理解することができる。連続的な相の液体は、芳香族炭化水素、その誘導体、およびそれらの組合せであってよく、例として、これらに限定されないが、２，３，４，５，６−ペンタフルオロアニソール（ｂｐ１３９℃）、１，３，５−トリメチルベンゼン（ｂｐ１６６℃）、ヘキシルベンゼン（ｂｐ２２６℃）であってよい。連続的な液体の相は、エステルであってよく、例として、これらに限定されないが、テレフタル酸ジオクチル（ｂｐ４００℃）およびフタル酸ジイソブチル（ｂｐ３２７℃）であってよい。連続的な液体の相は、０．５〜３．０ｇ／ｃｍ３の範囲の密度を有することができ、例として、これらに限定されないが、ヘキサン（ｄ０．６６ｇ／ｃｍ３、ｂｐ６９℃）、ブロモベンゼン（ｄ１．４９ｇ／ｃｍ３、ｂｐ１５９℃）、ペルフルオロケロセン（ｄ１．９４ｇ／ｃｍ３、ｂｐ２１０〜２４０℃）、およびテトラブロモエタン（ｄ２．９７ｇ／ｃｍ３、ｂｐ１９０℃）を挙げることができ、０．５〜１００ｍＰａ・ｓの範囲の粘度を有することができ、例として、これらに限定されないが、トリクロロエチレン（０．５４５ｍＰａ・ｓ、ｂｐ８７℃）、ペンタクロレタン（ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｅｔｈａｎｅ）（２．２５４ｍＰａ・ｓ、ｂｐ１６２℃）、ヘキサデカン（３．０３ｍＰａ・ｓ、ｂｐ２８７℃）、フタル酸ジメチル（１４．４ｍＰａ・ｓ、ｂｐ２８２℃）、および重質鉱油類（約７０ｍＰａ・ｓ）が挙げられる。
【００４７】
連続的な相４２はまた、イオン性界面活性剤または非イオン性界面活性剤を含有することもできる。連続的な相中で使用することができる、例示的な非イオン性界面活性剤として、これらに限定されないが、ＳＰＡＮ（商標）系界面活性剤、例えば、ＳＰＡＮ（商標）８０、ＢＲＩＬ（商標）系界面活性剤、例えば、ＢＲＩＬ（商標）７２、ＴＥＴＲＯＮＩＣ（商標）系界面活性剤、例えば、ＴＥＴＲＯＮＩＣ（商標）９０１、モノステアリン酸ポリエチレングリコール（２ｅ．ｏ．）（Ｗａｋｏ、日本）、およびＡＢＩＬ（登録商標）ＥＭ−９０（Ｄｅｇｕｓｓａ）が挙げられる。この例示的なリストには制限する意図はなく、また、フッ素化部分を含むその他の界面活性剤を含めて、その他のイオン性界面活性剤および非イオン性界面活性剤を使用することもできる。イオン性界面活性剤または非イオン性界面活性剤の親水親油バランス（ＨＬＢ）の値は、１〜１０、２〜６、３〜５等であってよい。
【００４８】
水相３２は、試薬（例えば、核酸を増幅するための試薬）を含む水溶液であってよい。例示的な試薬として、これらに限定されないが、塩化マグネシウム、およびデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、酵素等の生体分子、共有結合または非共有結合で結合したオリゴヌクレオチドを有するビーズまたは粒子、鋳型、緩衝剤、ならびにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の効率および／または特異性を増強するために有用である、その他の添加剤が挙げられる。水相３２はまた、イオン性界面活性剤または非イオン性界面活性剤を含有することもできる。非界面活性剤には、これらに限定されないが、ＴＷＥＥＮ（商標）系界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）２０、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）系界面活性剤（両親媒性ブロックコポリマー）、例えば、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｆ３８、ＳＰＡＮ（商標）系界面活性剤、例えば、ＳＰＡＮ（商標）２０、これらに限定されないが、ポリ（ジメチルシロキサン−ブロック−エチレンオキシド）、ポリ（メチルフェニルシロキサン−ブロック−エチレンオキシド）、ポリ（ジメチルシロキサン−ブロック−２−ヒドロキシエチルアクリレート）、およびポリ（アルキレン−ブロック−２−ヒドロキシエチルアクリレート）を含めた両親媒性ジブロックコポリマーが挙げられる。水相３２中のイオン性界面活性剤または非イオン性界面活性剤は、５〜４０、１０〜４０、２０〜４０、５〜１０、１０〜２０等の範囲の親水親油バランス（ＨＬＢ）の値を有することができる。
【００４９】
水相３２は、水溶性ポリマーを含むことができる。乳化の有効性を制御するためおよび／またはエマルジョンの安定性を改善するために、水溶性ポリマーを水相３２に添加して、水相３２の密度および／または粘度を調整することができる。例えば、水溶性の、臭素または塩素で置換したポリマーを水相３２に添加して、水相の密度を増加させることができる。比較的大きな分子量、例えば、１，０００，０００〜１０，０００，０００ＭＷを有する水溶性ポリマーを添加して、水相３２の粘度を増加させることができる。水相に添加することができる水溶性ポリマーには、これらに限定されないが、水溶性ポリアクリルアミド類、水溶性ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）、水溶性ポリ（エチレングリコール類）、水溶性ポリ（エチレンオキシド類）、それらの誘導体、およびそれらの組合せが挙げられる。
【００５０】
装置は、水相３２にも連続的な相４２にも不溶性である固体の材料であってよい粒子２１０を含むことができる。図１および２に示すように、水相３２は、膜１００を通過し、得られたエマルジョン液滴２００にまたはその内部に組み込まれる粒子２１０を含む。粒子は、例えば、これらに限定されないが、金属、金属酸化物、金属ハロゲン化物、金属水酸化物、ケイ素、二酸化ケイ素、シリカ、石英、ガラス、ガラス状炭素、炭素、ポリマー、またはそれらのブレンドおよび組合せ等の材料を含むことができる。粒子は、不規則な形状を有しても、または円柱、球体または円盤等の規則的な形状を有してもよい。粒子のサイズは０．１〜１００ミクロンの範囲であってよい。粒子の表面は物理的または化学的に改変することができる。例えば、固定化ポリヌクレオチド２１２を含むように粒子の表面を改変することができる。固定化ポリヌクレオチドは、例えば、エマルジョンＰＣＲ（ｅＰＣＲ）反応におけるＰＣＲプライマーとしての役目を果たすことができる。粒子の表面はまた、それに続く、例えば、バイオコンジュゲーション等の反応のために、その他の反応性の基を含有するように改変することもできる。粒子の表面はまた、アレイに共有結合または非共有結合で結合させるために改変することもできる。
【００５１】
水相中に捕捉した粒子が、乳化の間に膜の孔に詰まるのを阻止するために、膜１００の孔１１０は、真直ぐに通り抜ける孔１１４であり得る。真直ぐに通り抜ける孔を有する膜は、例えば、Ｗｈａｔｍａｎ（英国）、ＰＡＬＬ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（米国）、Ｍｉｃｒｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（英国）、およびＮａｎｏｍｉ Ｅｍｕｌｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（オランダ）から入手可能である。上記のリストには網羅的である意図はなく、また、真直ぐに通り抜ける孔を有する膜は、その他の供給元からも入手可能である。多孔質の仕切りの孔の一部または全部が、真直ぐに通り抜ける孔であってよい。さらに、膜を（例えば、スクリーンまたはハウジングによって）支持または補強することもできる。孔は、粒子が、乳化の間に捕捉されてしまわないようなサイズにすることできる。真直ぐに通り抜ける孔を有する膜を使用する膜乳化法を使用して、所望のサイズおよび実質的に均一な分布の液滴を生み出すことができる。
【００５２】
装置は、仕切り１００を形成する膜を含むことができる。多孔質の仕切り１００は、仕切りホルダー１２２内の仕切りホルダーの突起１２０によって支持される。仕切り１００は、ある形状を有する画定された孔の開口部１１０を有する、少なくとも２つの真直ぐに通り抜ける孔１１４を有する。仕切り１００は、水相３２に面する第１の主要表面１０２および油相４２に面する第２の主要表面１０４を含む。
【００５３】
図３は、装置内の仕切り１００の拡大図の例を示す。仕切り１００は、親水性であってよい第１の主要表面１０２および疎水性であってよい第２の主要表面１０４を含み、孔の内壁表面１１２は独立に、疎水性または親水性である。仕切り１００は、親水性である第１の分散する水相３２と疎水性である第２の連続的な相４２とを分離する役割を果たす。第１の相３２が、親水性の表面１０２から真直ぐに通り抜ける孔１１４を通過して疎水性の相４２の中に入ると、実質的に均一サイズの逆エマルジョン液滴２００が形成される。逆に、疎水性の相４２が、疎水性の表面１０４から真直ぐに通り抜ける孔１１４を通過して親水性の相３２の中に入ると、実質的に均一サイズの通常のエマルジョン液滴が形成されることが、当業者であれば分かる。
【００５４】
図４は、例示的な孔の形状の横断面および例示的な膜１００の内部における孔の配置の両方を示す。孔１１０の形状および横断面において見られる孔１１０の形状は、多角形、卵形、楕円形、亜鈴型、蝶ネクタイ型、凧型、およびそれらの不規則な形状であってよい。多角形は、四辺形、五角形、六角形、七角形、八角形、九角形、十角形の形状、およびそれらの不規則な形状であってよく、四辺形は、凧型、ひし形、不等辺四辺形、台形、二等辺四辺形、平行四辺形、長方形の形状、およびそれらの不規則な形状であってよい。多角形および蝶ネクタイ型の形状は、角の丸み（ｒａｄｉｕｓ ｃｏｒｎｅｒ）１１１を有し得る、図５Ａ。孔１１０の形状は、孔が、少なくとも４ミクロンから少なくとも１６ミクロンまでの画定された長さ１３２、および少なくとも１ミクロンから少なくとも４ミクロンまでの画定された幅１３０を有するようになされる、図５Ｂ。
【００５５】
多孔質の仕切り１００は、２〜９８％の範囲に制御された多孔率および１．０〜２００μｍの範囲に制御された孔のサイズを有する多孔質膜であってよい。面積当たりの孔の数は、多数の構成があり得る。孔の密度の配置例には、４３．８９ｍｍ２当たり９１，５００個または１８３，０００個の孔、４ｍｍ２当たり１５，２００個または３０，４００個の孔、２．１ｍｍ２当たり４２００個の孔、および１．８ｍｍ２当たり７０００個の孔がある。所与の面積当たりの孔の数は、孔と孔の間の距離（ピッチ）および孔の列と列の間の距離に依存する。孔と孔の間のピッチの距離は、２０から、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９および３０μｍまで、ならびにそれらの間であってよく、孔の列と列の間の距離は、１０、１５、２０、２５または３０μｍ、およびそれらの間であってよい。膜の厚さは、２５、３０、４５または５０μｍ、およびそれらの間であってよく、一方、仕切りの非多孔質の領域の厚さは、４００〜５００μｍである。孔の寸法の例には、１〜４μｍの幅、４〜１６μｍの長さ、およびそれらの間の範囲がある。横断面において測定した孔（幅×長さ）の例として、１．５×７．３μｍ、１．７×７．５μｍ、２．５×８．６μｍ等が挙げられる。多孔質の仕切り１００は、多孔質膜のセクション間または多孔質膜内で、例えば、突起部またはスクリーンを使用して補強することができる。
【００５６】
図５Ａおよび図５Ｂは、角の丸み１１１を有する長方形の孔ならびに丸型突出形状の第１の孔１０９および第２の孔１１８を有する亜鈴型の形状の孔の両方の長さおよび幅を示す。孔１１０は、孔１１０の長さ１３２と該孔の幅１３０との比の測定値である縦横比を有する。これは、ｌ／ｓとして示すことができ、ただし、「ｌ」は、孔の長さであり、「ｓ」は、孔の幅である。
【００５７】
孔の縦横比は、少なくとも３：１、少なくとも３．１：１、少なくとも３．２：１、少なくとも３．３：１、少なくとも３．４：１、少なくとも３．５：１、少なくとも３．６：１１、少なくとも３．７：１、少なくとも３．８：１、少なくとも３．９：１、少なくとも４：１、少なくとも４．１：１、少なくとも４．２：１、少なくとも４．３：１、少なくとも４．４：１、少なくとも４．５：１、少なくとも４．６：１、少なくとも４．７：１、少なくとも４．８：１、少なくとも４．９：１、少なくとも５．０：１、少なくとも５．１：１、少なくとも５．２：１、少なくとも５．３：１、少なくとも５．４：１、少なくとも５．５：１、少なくとも５．６：１、少なくとも５．７：１、少なくとも５．８：１、少なくとも５．９：１、少なくとも６．０：１、少なくとも６．１：１、少なくとも６．２：１、少なくとも６．３：１、少なくとも６．４：１、少なくとも６．５：１、少なくとも６．７：１、少なくとも６．８：１、少なくとも６．９：１、少なくとも７．０：１、およびこれらの範囲内の間である。孔１１０の幅１３０は、少なくとも１．０マイクロメートルであり、最大では２００マイクロメートルであり得る。可能なｌ×ｓの値は、３．３：１の縦横比の場合、６ミクロン×１．８ミクロン、４．４：１の縦横比の場合、７．９ミクロン×１．８ミクロン、および３．５：１の縦横比の場合、９．５ミクロン×２．７ミクロンである。
【００５８】
０．１ミクロンから１００ミクロンまでの範囲のサイズを有する粒子が真直ぐに通り抜ける孔１１４中に詰まってしまい、したがって、第１の相が第２の相中に流れるのを遮断するようなことなく膜を通過できるように真直ぐに通り抜ける孔１１４を設計することができる。粒子２１０は、１．０〜４．０ミクロン、およびそれらの間のサイズを有することができ、仕切り１００の孔は、１．０〜２００ミクロン、およびそれらの間の孔１１０のサイズを有することができる。真直ぐに通り抜ける孔１１４は、仕切り１００を横断する縦軸１１５を有すると説明することができる。図５Ｂは、横断面において、亜鈴型の形状の、丸型突出形状の孔の構造を示す。丸型突出形状の孔は、丸型突出形状の孔の軸としての中心部１０８、および中心部１０８に隣接し、縦軸１１５から半径方向に伸長する、少なくとも１つの丸型突出形状１０９を有する。丸型突出形状の孔は、真直ぐに通り抜ける孔１１４の中心の縦軸１１５に対して平行して存在し、かつ第１の丸型突出形状１０９に対して対称的に位置し、縦軸１１５から半径方向に伸長し、第１の丸型突出部１０９から、中心部１０８によって分離される第２の丸型突出部１１８を含むことができる。左右対称な丸型突出形状の孔の縦横比は、第１の丸型突出部と第２の丸型突出部とを分離する中心部１０８の幅１３０よりも大きい、第１の丸型突出部と第２の丸型突出部との間の長さ１３２から決定される、図５Ｂ。横断面において見られるように、中心部１０８の幅（ｓ）１３０は、中心部１０８の長さ１３２に対して直角に測定し、長さ（ｌ）１３２は、中心部１０８の幅（ｓ）１３０に対して直角に、かつ孔の長さの対向する末端間に描いた想像上の直線の距離にわたって測定する。丸型突出形状の孔の例示的な例には、蝶ネクタイ型および亜鈴型の形状がある。丸型突出形状の（ｌｏｐｅｄ ｓｈａｐｅｄ）孔は、左右対称であっても、非対称であってもよい。丸型突出形状の孔は、少なくとも１つの丸型突出部を有する孔を含むことができる。
【００５９】
第１の相３２、すなわち、親水性の相は、粒子２１０をさらに含むことができる。粒子は、ビーズ、円盤、立方体、ピラミッド、球体、多面体、およびそれらの不規則な形状から選択された形状を有することができる。粒子２１０はまた、磁性であってもよく、またはそれに結合しているビオチン／ストレプトアビジン様の部分を有してもよいし、当該粒子に結合しているオリゴヌクレオチド２１２をさらに含んでもよい。水相３２は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施するための試薬をさらに含むことができる。単分散の実質的に均一サイズのエマルジョン液滴２００の逆エマルジョンの内部の離散的な相２１４の内部でＰＣＲ反応を起こすことができる。ＰＣＲ試薬は、緩衝剤、塩化マグネシウム等の塩、少なくとも１つのプライマー、ｄＮＴＰ、鋳型、ポリメラーゼ、およびエマルジョン液滴２００の内部の粒子２１０に結合しているオリゴヌクレオチド２１２の増幅のための、その他の試薬類を含むことができる。
【００６０】
膜をポリマーから作製することができる。例示的なポリマーとして、これらに限定されないが、ポリ（エーテルスルホン）、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリイミド、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ならびにその他のフッ素化ポリマー類および全フッ素置換されたポリマー類が挙げられる。ポリマーの膜表面を（例えば、ナノメートルスケールで）粗面化することができる。表面の粗面化は、機械的または化学的に達成することができる。例えば、超疎水性を達成するために、多孔質の仕切りの表面を酸素プラズマによって粗面化することができる。また、多孔質の仕切りの表面を疎水性にする、その他の方法を利用することもできる。この型の方法が、Ｌｉら、Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｒｅｖ．、２００７年、３６巻（８号）、１３５０〜１３６８頁に開示されている。
【００６１】
膜はまた、例えば、これらに限定されないが、ソーダ石灰ガラスまたはシラスガラス等のガラスから作製することもできる。膜はまた、例えば、ステンレス鋼または別の金属合金の薄い金属箔であってもよい。膜はまた、ケイ素から作製することもできる。膜はまた、（例えば、シリカもしくはアルミナの粉末を焼結することによって作製した）シリカもしくはアルミナの膜であっても、または多孔質のセラミックの膜であってもよい。多孔質の仕切りの表面を物理的または化学的に改変して、その親水性を調整することができる。
【００６２】
フォトリソグラフィー、化学エッチング、および反応イオンエッチング、ＲＩＥ）を使用して（トラックエッチングした）多孔質ケイ素膜を作ることができる。そのような方法は、当業者にはよく知られている。１．５〜１０μｍの穴を有するフォトマスクを使用して、下部の金の層を化学的にエッチングする。それに続くステップでは、反応性イオンエッチングによって、膜のバルクに穴を開ける。
【００６３】
別の実施形態では、仕切り１００の表面１０２および１０４は、両面が疎水性もしくは親水性であっても、または独立に疎水性もしくは親水性であってもよい。例えば、フォトマスクをケイ素膜表面１０２または１０４の上に置くためにフォトリソグラフィーの技法を使用し、真直ぐに通り抜ける孔１１４を形成するためにケイ素膜を化学的に処理し、個別に親水性および疎水性の表面１０２および１０４、または共に親水性または疎水性の表面１０２および１０４を得るために、それぞれの表面を段階的にシリル化して、仕切り中に孔を形成する。真直ぐに通り抜ける孔１１４の内壁１１２は、マスクされていない表面とともにその表面１１３を改変することができる。
【００６４】
図６は、逆エマルジョンを形成するための、多孔質の仕切り１００の可能な表面処理を示す。仕切りの第１の主要表面１０２を化学的に改変して、表面１０２および内壁表面１１２の両方を親水性にすることができる。第２の主要表面１０４をマスクによって全体的（孔の開口部１１０を含む）に覆って、表面１０２および１１２に対する化学処理の場合のバリアを作製することができる。そのような処理には、ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）部分またはポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分の、ケイ素および二酸化ケイ素等の表面への化学的な結合（以降、「ペグ化」と呼ぶ過程）が含まれる。油相に面する第２の主要表面１０４を疎水性にするための化学処理に対して感受性とすることによって、表面１０４を処理することができる。
【００６５】
図７に示すように、貨幣金属１０７、例えば、金、または当業者に既知のその他の材料の層を適用する調製において、接着増強剤１４０、例えば、これに限定されないが、クロムの層を適用することによって、第２の主要表面１０４を化学的な表面の改変のために調製することができる。貨幣金属の例として、これらに限定されないが、銅、ニッケル、金、白金、青銅および亜鉛が挙げられる。この例示的なリストには、制限する意図はなく、また、当業者に既知のその他の金属を使用することもできる。裸の金表面１０７に対して、ペルフルオロアルキルチオールのアルキルチオールを使用してチオール化を行い、その表面を疎水性１０６にすることができる。その他の硫黄含有化合物、例えばこれらに限定されないが、ジアルキルスルフィド類およびそのフッ素化バージョンならびにチオール基および／またはジスルフィド基を含むその他のオリゴマー化合物およびポリマー化合物を使用して、金表面を疎水性にすることができることは、当業者であれば理解することができる。種々の型の直鎖アルキルチオール類および分枝アルキルチオール類は、米国特許第５，３９５，５５０号（１９９５年）に従って合成することができる。全フッ素置換されたチオール化合物は、（Ｃ． Ｓ． Ｒｏｎｄｅｓｔｖｅｄｔら、Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ４２巻：２６８０〜２６８３頁（１９７７年））によって報告されている手順に従って合成することができる。これらの参照文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれている。金のチオール化の典型的な例を以下に示す。
【００６６】
【化１】
【００６７】
金表面１０７を疎水性１０６にするためのチオール化の後、孔１１４の内部の内壁表面１１２を含めた残りの表面１０２をペグ化して、親水性１１３とすることができる。
【００６８】
表面１０２および１１２の表面ペグ化は、約５〜約１００００個の反復単位、例えば、約６〜約３００個の反復単位、または例えば、約１０〜約２００個の反復単位を含むω−メトキシ−ポリ（エチレンオキシド）、ＭｅＯ−ＰＥＯ部分またはポリ（エチレングリコール）、ＰＥＧ部分を含むモノ−、ジ−、またはトリ−アルコキシシランを用いて実行することができる。当業者であれば、所望の表面の特色を達成するための、ＰＥＯ部分またはＰＥＧ部分の反復単位の数を決定することができる。
【００６９】
本開示によれば、表面をペグ化するために、種々の反応を起こすことができる。ペグ化は、本明細書において具体的には論じないが、本発明の範囲に属する、多くのその他の反応によって達成することができることは、当業者であれば理解する。以下の反応は、ケイ素基材上における、ＭｅＯ−ＰＥＯ部分を有するトリメトキシシランを使用する表面ペグ化の例である。
【００７０】
【化２】
【００７１】
図７は、実質的に均一サイズの逆エマルジョン液滴の形成を促進するための、仕切り１００表面の表面処理の例を示す。第１の主要表面１０２および真直ぐに通り抜ける孔１１４の内壁１１２に対してペグ化を行い、第１の主要表面および真直ぐに通り抜ける孔１１４の内壁表面１１３を親水性１０３にする。例示的なペグ化のプロトコールが、ＵＳ２００６００９１０１５Ａ１（２００６年）およびＵＳ２００７００９５６６Ａ１（２００７年））に教示されており、それぞれの参照文献全体が、参照により本明細書に組み込まれている。チオール基またはジスルフィド基を含むＰＥＧまたはＰＥＯを用いて金表面１０７を親水性にすることができ、アルキルアルコキシシランまたはペルフルオロアルキルアルコキシシランを用いて残りの表面１０２および１１２を疎水性にすることができ、その結果、通常のエマルジョンの調製のための膜が得られることは、当業者であれば理解する。
【００７２】
図１および図２に示すように、外圧１６を粒子２１０が懸濁している水相３２に適用すると、水相３２は、膜１００の真直ぐに通り抜ける孔１１４の経路を通って、連続的な相４２中に押し出される。連続的な相４２は、流れている４４（例えば、渦巻いている）であり得、膜１００の表面１０４を横切って流れ、それによって、被包されている粒子２１０を有するまたは有しない液滴２００をリザーバ６０まで運ぶことができる。あらかじめ決定した孔のサイズを有する所与の膜の場合、これらに限定されないが、水相に対して適用する圧力、水相の粘度、連続的な油相の粘度、連続的な相の流れによって生じるせん断力、孔１１０の縦横比、ならびに使用する（１つまたは複数の）界面活性剤の性質および濃度を含めた一連のパラメータによって液滴のサイズを制御することができる。
【００７３】
さらに、多孔質膜１００の表面の親水性および疎水性はまた、液滴、すなわち、サイズ、形成、形成速度および均一性に影響を及ぼすこともできる。したがって、逆エマルジョンの調製のために適用する圧力を低下させるためには、連続的な油相と接触している膜表面は、疎水性であり、一方、内壁表面は、親水性であることが望ましい。
【００７４】
【数１】
【００７５】
例えば、水相に面する表面１０３が親水性であり、かつ内壁表面１１３も親水性であれば、全ての表面が疎水性である多孔質膜と比較して、粘度および（１つまたは複数の）用いる界面活性剤等のその他の変数が一致している場合、より低い適用圧力でも、水相３２の多孔質膜１００の通過が促進される。
【００７６】
離散的な液滴２００はそれぞれ、試薬類をその分散している水溶液２１４中に含み、粒子２１０をその中に封入しており、この液滴２００を使用してポリメラーゼ連鎖反応（例えば、エマルジョンＰＣＲ）または連結反応等の反応を実施することができる。エマルジョンＰＣＲのプロトコールは、Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３巻（７号）：５４５〜５５０頁（２００６年）；Ｄｉｅｈｌら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３巻（７号）：５５１〜５５９頁（２００６年）；およびＭｉｌｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３巻（７号）：５６１〜５７０頁（２００６年）に記載されている。
【００７７】
本明細書に記載する乳化の機器および方法を使用して実質的に均一な液滴サイズを有する油中水型エマルジョンをもたらすことができる。真直ぐに通り抜ける孔の内部表面を改変して親水性にすると、水相を膜を通して押し出すのに必要な圧力が低下する。さらに、大部分の孔は、水相の、油相中への通過、したがって、液滴の形成を促進するために使用でき、機能する。この結果、エマルジョンの形成速度が改善され、より均一なサイズの液滴が生成し、液滴サイズの分布が改善される。横断面において見られる、４対１超の縦横比を有する改変した孔の形状はまた、均一サイズの、再現性のある逆エマルジョン液滴の形成の簡素化も促進し、逆エマルジョン液滴の形成速度も増強する。
【００７８】
粒子が液滴中に封入されており、その後の反応（例えば、ＰＣＲ）を液滴の内部で実施する適用においては、実質的に均一な液滴サイズによって、結果の信頼性を改善することができる。例えば、均一な液滴サイズによって、全ての粒子が、ほぼ同一の全含有量の反応物を含有する環境によって囲まれる可能性が改善され、それによって、より均一な反応結果を液滴中で得ることができる。さらに、全ての液滴が実質的に均一サイズであると、単一の粒子を有する液滴がポアソン分布モデルに従うエマルジョン生成システムを得ることができる。液滴のサイズが、広い分布範囲にわたって変動すると、エマルジョン生成システムの、ポアソンモデルからの、複雑なかつ予測できない様式での逸脱が生じ、結果の予測可能性に悪影響を及ぼす。分布範囲が変動すれば、結果も変動し、結果の予測は経験的な方法によらざるを得ない。
【００７９】
本明細書に記載する方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるタンパク質類およびＲＮＡ類の発生（例えば、米国特許第６，４８９，１０３Ｂ１号を参照されたい）、無細胞クローニング、ならびに配列決定を含めた多様な有望な適用例において使用することができる。これらの技法は、ＤＮＡまたはＲＮＡの断片の多種多様なコレクションを相互に単離して一連の増幅試薬類または改変試薬類を使用して増幅または改変する任意の適用例において使用することができる。
【００８０】
多くの改変物、代替物および等価物が可能であることは、当業者であれば理解する。全てのそのような改変物、代替物および等価物は、本明細書に包含されるものとする。
【実施例】
【００８１】
（実施例１）
多孔質のケイ素の層の表面改変
上記に記載したように、多孔質の仕切りは多孔質のケイ素の層であってよい。多孔質のケイ素の仕切りの表面を改変して疎水性とすることができる。疎水性表面を有する多孔質のケイ素の仕切りは、疎水性表面が連続的な油相に面する状態で、本明細書に記載する機器中で使用することができる。
【００８２】
多孔質のケイ素の層（膜）の表面は、自然の酸化物または化学的手段によって産生させた酸化物の表面の層を含有することができる。この酸化物の表面の層をアルキルアルキルシランおよび／またはフッ素化アルキルシラン（１）を用いて改変して、疎水性の特徴を有する表面を得ることができる。
Ｒ１−Ｓｉ（Ｒ２）ｘ（Ｒ３）ｙ （１）
式中、
Ｒ１＝ＣｎＨ２ｎ＋１またはＣＨ２ＣＨ２（ＣＦ２）ｍＣＦ３であり；
Ｒ２＝ＣｑＨ２ｑ＋１であり；
Ｒ３＝ＯＲ２またはＣｌであり；
Ｘ＝０〜２であり；
ｘ＋ｙ＝３であり；
ｎおよびｍは独立に、４〜２５の整数であり；かつ
ｑ＝１〜５である。
【００８３】
シリル化すると、表面のフッ素化アルキル基により表面が疎水性になる。これらのフッ素化アルキル基はまた、ＴＥＦＬＯＮ（登録商標）ＡＦまたはＣＹＴＯＰ等、全フッ素置換されたポリマーの追加の上面被覆の接着性を増強するためのつなぎの層としての役割も果たすことができる。それらの構造を以下に示す。
【００８４】
【化３】
【００８５】
これら２つの全フッ素置換されたポリマーは、全フッ素置換された炭化水素の溶媒に可溶であり、その溶液を表面上にスピンキャスト、浸漬被覆またはスプレーして（ｓｐａｙｅｄ）、表面の疎水性を改善することができる。これらのポリマーの単層をナノメートルスケールの粗さを有する表面上に被覆することによって、超疎水性の表面を達成することができる（Ｌｉら、Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｒｅｖ． ３６巻（８号）：１３５０〜１３６８頁（２００７年））。
【００８６】
以下の手順は、ケイ素のウエハ／膜の表面改変のために利用することができる代表的な手順である。
【００８７】
（実施例２）
表面の化学的改変に先立つ前処理ための手順
鏡面を有するケイ素ウエハまたは多孔質ケイ素膜、例えば、１７ｍｍ×１７ｍｍを３０ｍｌの１．０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）中で、２０〜６０分間超音波処理することができる。次いで、ウエハ／膜を脱イオン水を用いて十分に濯ぐことができる。それに続いて、ウエハ／膜を５ｍＬの２９％ＮＨ４ＯＨ、５ｍｌの３０％Ｈ２Ｏ２、および２０ｍＬのＤＩ水の混合液中で、２０〜６０分間超音波処理することができる。次いで、これをＤＩ水を用いて十分に濯ぐことができる。次いで、ケイ素のウエハ／膜を５ｍＬの３８％ＨＣｌ．、５ｍＬの３０％Ｈ２Ｏ２、および２０ｍＬのＤＩ水の混合液中で、２０〜６０分間超音波処理し、ＤＩ水を用いて十分に濯ぐことができる。次いで、ケイ素のウエハ／膜を窒素を用いて乾燥し（例えば、送風乾燥し）、即時に使用することができる。前処理したウエハ／膜の場合、典型的な水に対する静的接触角（２μＬの水、マイクロピペットにより手作業で置く）は、≦１０度である。
【００８８】
（実施例３）
アルキルシラン試薬類を使用する表面の化学的改変のための手順
３５ｍｌの１００％ＥｔＯＨ中に、１．０ｍＬのデシルトリエトキシシランを添加し、撹拌して溶解させることができる。次いで、前処理したケイ素ウエハまたは多孔質ケイ素膜をこのシラン溶液中に、（例えば、オービットシェイカーを用いて）撹拌しながら３０分間浸すことができる。次いで、ウエハ／膜を取り出して、１００％エタノール中に一時的に浸漬することができ、過剰な溶媒を振り落とす。次いで、ウエハ／膜を１１０℃で２０分間硬化させることができる。アルキルシリル化したチップの場合、典型的な水に対する静的接触角（２μＬの水、マイクロピペットにより手作業で置く）は、約９０度である。
【００８９】
（実施例４）
フッ素化シランを使用する表面改変のための手順
ねじ蓋を有する１５ｍｌのガラス製バイアル中に、４ｍＬのフッ素化された溶媒、例えば、ペルフルオロ−（２−ペルフルオロ−ｎ−ブチル）テトラヒドロフラン（ＦＣ−７５、３Ｍから入手）、および０．５ｍＬのフルオロシリル化試薬、例えば、（ヘペタデカフルオロ（ｈｅｐｅｔａｄｅｃａｆｌｕｏｒｏ）−１，１，２，２−テトラヒドロデシル）トリメトキシシランまたは（ヘペタデカフルオロ（ｈｅｐｅｔａｄｅｃａｆｌｕｏｒｏ）−１，１，２，２−テトラヒドロデシル）ジメチルクロロシラン（Ｇｅｌｅｓｔから入手）を混合して溶解させることができる。前処理し、送風乾燥した鏡面を有するケイ素ウエハまたは多孔質ケイ素膜をこのシラン溶液中に、時折撹拌しながら２０分間浸すことができる。次いで、ウエハ／膜を取り出し、過剰なシラン溶液を振って取り除き、窒素を用いて乾燥する（例えば、送風乾燥する）ことができる。次いで、チップを１１０℃で２０分間硬化させることができる。フルオロシリル化したケイ素のウエハ／膜の場合、典型的な水に対する静的接触角（２μＬの水、マイクロピペットにより手作業で置く）は、約１１０度である。
【００９０】
（実施例５）
全フッ素置換されたポリマーを用いてフルオロシリル化されたケイ素のチップを被覆するための手順
全フッ素置換されたポリマー、例えば、ＴＥＦＬＯＮ（登録商標）ＡＦ−１６００（ＤｕＰｏｎｔから入手）またはＣＹＴＯＰ（Ａｓａｈｉ Ｇｌａｓｓから入手）の、０．５％ｗ／ｖ溶液は、フッ素化された溶媒、例えば、ＦＣ−７５（３Ｍから入手）またはＣＴＳＯＬＶ−１８０（Ａｓａｈｉ Ｇｌａｓｓから入手）を使用して調製することができる。フルオロシリル化された鏡面を有するケイ素ウエハまたは多孔質ケイ素膜をこの溶液中に一時的に浸漬し、過剰な溶液を振り落とし、被覆されたウエハ／膜を１１０℃で２０分間硬化させることができる。被覆されたウエハ／膜の場合、典型的な水に対する静的接触角（２μＬの水、マイクロピペットにより手作業で置く）は、約１２０度である。
【００９１】
（実施例６）
多孔質ケイ素膜の表面を親水性にするための溶液ペグ化のための一般的な手順
典型的には、多孔質ケイ素膜は、ペグ化に先立って前処理する。膜を有機溶媒、例えば、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒから入手するＰＲＳ−３０００（商標）Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｐｈｏｔｏ ｒｅｓｉｓｔ Ｓｔｒｉｐｐｅｒ中で超音波処理することによって、フォトレジストを除去した後、表面を多量のエタノールを用いて十分に濯ぎ、窒素を流しながら送風乾燥し、次いで、対流式オーブン中、１１０℃で３０分間焼く。次いで、清浄したケイ素膜を実施例２に従って処理する。前処理したケイ素膜をペグ化のために即時に使用した。
【００９２】
【化４】
【００９３】
３５ｍＬの空洞、および底部に、１７ｍｍ×１７ｍｍのサイズの多孔質ケイ素膜１０枚を垂直な位置で保持するためのスロットを有するように構築したＴＥＦＬＯＮ（商標）の箱を溶液ペグ化のために使用した。このＴＥＦＬＯＮ（商標）の箱の寸法および容量をスケールアップして、より多くの膜を保持することができる。膜をＴＥＦＬＯＮ（商標）のペグ化用の箱の中に置いた後、ゴム製の中隔で蓋をした入口および出口を含有する気密キャップが元に戻され密封された。次いで、超純粋アルゴンを用いて、１分当たり５００ｍＬで２分間ペグ化用の箱をパージした。３０ｍＬの無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中の０．５ｍＬの２−［メトキシ（ポリエチレンオキシ）プロピル］トリメトキシシラン、ＭＷ：５，９１０Ｄａ（Ｎｅｋｔａｒ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、アラバマ州）の溶液をシリンジを使用して添加した。これに続いて、１．０ｍＬのトリエチルアミンを添加した。密封したペグ化用の箱をＣｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ Ｒｏｃｋｉｎｇ Ｐｌａｔｆｏｒｍ上、５５ｒｐｍで揺り動かした。２０時間揺り動かした後、膜を取り出し、ＴＨＦを用いて手早く濯ぎ、窒素を流しながら送風乾燥し、対流式オーブン中、１１０℃で１０分間焼いた。蓋をしたペトリ皿中に周囲条件下でペグ化した膜を使用まで保った。Ｋｒｕｓｓ（Ｍａｔｔｈｅｗｓ、ノースカロライナ州）から入手したＤｒｏｐ Ｓｈａｄｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ＤＳＡ１００を使用して水に対する静的接触角を測定した。３つの無作為に抽出した試料から、全部で１２個のデータポイントを得た。水に対する静的接触角の平均は、３２．１度であり、標準偏差は、０．５度であった。
【００９４】
（実施例７）
金蒸着に先立つケイ素膜のメルカプトシリル化
多孔質ケイ素膜を拭き取り、次いで、洗浄瓶を使用して分析グレードのアセトンを用いて濯ぐことによって調製する。次いで、膜を０．５ｗｔ％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を有するＭｉｌｌｉ−Ｑ水中で、１５分間超音波処理し、次いで、多量のＭｉｌｌｉ−Ｑ水を用いて濯ぎ、次いで、窒素を用いて送風乾燥してから使用する。
【００９５】
改変を加えたＡ． Ｒｏｓｓら、Ｊ． Ｍａｔｅｒ． Ｃｈｅｍ．、１３巻：７２２〜７２６頁（２００３年）の方法を用いて膜のシリル化を行う。９０．１μＬの３−メルカプトプロピル（メチル）ジメトキシシラン、６．６μＬのヘキシルアミン、および１００ｍＬのトルエンの新鮮な溶液を調製し、窒素下で混合する。この溶液中に膜を１５分間浸す。膜を溶液から取り出し、ＨＰＬＣグレードのトルエンを用いて濯ぎ、Ｎ２を流しながら送風乾燥した。シリル化された膜を金蒸着のために即時に使用した。
【００９６】
（実施例８）
金表面を疎水性にするためのチオアルキル化のための一般的な手順
金層の添加を含めた、化学的な表面改変のために、クロム等の接着増強剤を適用することによって多孔質ケイ素膜の表面を調製する。金を蒸着の過程によって沈積させることができ、次いで、チオール化をアルキルチオールまたはペルフルオロアルキルチオールを使用して行って、表面を疎水性にする。
【００９７】
（実施例９）
金表面を親水性にする一般的な手順
最初に、ケイ素基材に結合したＯＨ基を用いてシラノール基の表面密度を増強するために、金表面をＰｉｒａｎａｈ溶液を用いて清浄する。続いて、シリル化の過程を行って、金層を沈積しようとする、多孔質ケイ素膜の表面を処理する。メルカプト含有シリル化剤（Ｇｅｌｅｓｔ，Ｉｎｃ．から入手）を膜表面上のＯＨ基と反応させると、表面に硫化水素基（ＨＳ）が組み込まれる。シリル化の過程は、金の、多孔質ケイ素膜に対する良好な接着を最終的にもたらす。これは、形成されたＨＳ基（例えば、メルカプト基）が、金と反応し、金との化学結合を形成することによる。シリル化後、金を基板上に蒸着の過程によって沈積する。メルカプト官能基はまた、透明な金層の、膜表面に対する強力な接着ももたらす。これは、共有結合が、沈積した金と硫黄（Ｓ）との間に形成されることによる。
【００９８】
次いで、沈積した金層に対してペグ化の過程を行って、金表面を親水性にする。メルカプトで官能化されたポリ（エチレングリコール）（分子量：５，７２３Ｄａ、Ｎｅｋｔａｒから入手）を含有するテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）の水溶液に金表面を曝す。メルカプト基が、金層と、硫黄（Ｓ）の結合を介して強力な共有結合を形成する。得られた金の表面層は、金に結合したポリ（エチレングリコール）基（ＰＥＧ）を有する。
【００９９】
（実施例１０）
仕切り内の真直ぐに通り抜ける穴の調製
当業者に知られている通常の化学的な慣行を使用して、ケイ素のウエハまたはケイ素の仕切りが、真直ぐに通り抜ける孔を含むように作ることができる（多孔質膜）。例えば、厚さ３０〜５０ミクロンの間の上部のケイ素の層を有するシリコン−オン−インシュレータ（ＳＯＩ）ウエハから開始し、フォトレジスト（ＰＲ）マスクを上部表面上にスピンする。このケイ素の層は、２ミクロンの酸化物の層の上に存在し、この酸化物の層は、３５０〜４５０ミクロンのケイ素の層の上にある。フォトリソグラフィーを実施して、孔の形状、密度およびレイアウトに関するＰＲマスクのパターンを生成する。乾式反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）を上部の層に行って、上部の３０〜５０ミクロンのケイ素の層を下の酸化物の層に達するまでエッチングする。この状態では、ケイ素は、ＰＲによって被覆されていない。次いで、このＰＲマスクを取り除き、第２のＰＲマスクをＳＯＩウエハ（表面の厚さは３５０〜４５０ミクロンである）の裏側に適用し、フォトリソグラフィーを実施して、仕切りの膜（すなわち、多孔質の領域）に関するＰＲマスクのパターンを生成する。ＤＲＩＥを使用して、３５０〜４５０ミクロンのケイ素の層を上の酸化物の層に達するまでエッチングして、それに続いて、マスクを取り除く。次いで、ケイ素のウエハまたはケイ素の仕切りをフッ化水素酸中に浸漬して、酸化物の層を取り除くと、上部のケイ素の層の中の孔が、厚いケイ素の層の内部に開通し、仕切りの多孔質膜領域が形成される。
【０１００】
（実施例１１）
連続的な相および水相の調製
連続的な相は、鉱油またはその他の適切な溶媒中の４〜１０ｗｔ％ＳＰＡＮ−８０および０．２〜１．５ｗｔ％ＴＷＥＥＮ−８０をそれぞれ含むことができる。以下の表に、１〜２×１０９個のビーズ、例えば、ＰＣＲ反応における使用のための１．６〜１．７×１０９個のＰ１ビーズを含有する水相の組成を示す。Ｐ１およびＰ２は、プライマーを指定している。水相は、必要に応じて、スケールアップすることができる。
【０１０１】
【表１】
【０１０２】
上記の手順は、表面が、これらに限定されないが、穴、真直ぐに通り抜ける穴、柱（ｐｏｓｔ）、柱（ｐｉｌｌａｒ）、スパイク、溝、くぼみ、刻み目またはフラクタルの構造を含む、人工的な造作を含むケイ素のウエハ／膜またはチップに適用できることは、当業者であれば理解する。ケイ素のウエハ／マスクの表面はまた、機械的または化学的に粗面化して、ナノメートルスケールからマイクロメートルスケールまでの表面粗さを有することができる。
【０１０３】
前記の明細書は、例証のために提供した実施例と共に、本発明の原理を教示するが、当業者であれば、本開示を読み取ることによって、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、形態および詳細の点で、種々の変形物を作製することができることを理解する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の実質的に均一サイズのエマルジョン液滴を形成するための装置であって、少なくとも１つのエマルジョン液滴は粒子を含み、
ａ．）複数の粒子を含む水相を含有する第１のチャンバー；
ｂ．）水非混和性の液体を含む油相を含有する第２のチャンバー；ならびに
ｃ．）該第１のチャンバーと該第２のチャンバーとを分離する仕切りであって、少なくとも第１の主要表面、該第１の主要表面に対向する第２の主要表面、および少なくとも２つの、該第１の主要表面を該第２の主要表面に接続する画定された真直ぐに通り抜ける孔を含み、該第１の主要表面は、該第１のチャンバーの壁を形成し、該第２の主要表面は、該第２のチャンバーの壁を形成する仕切り
を含み、
該水相が、該少なくとも２つの真直ぐに通り抜ける孔のうちの２つを通過して該油相に至る際に、該水相は、複数の離散的な実質的に均一サイズのエマルジョン液滴を形成し、該複数の液滴のうちの少なくとも１つは、該複数の粒子のうちの少なくとも１つの粒子を含む装置。
【請求項２】
前記画定された孔が、ある横断面の形状を有する、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記横断面の形状が、多角形、卵形、楕円形、亜鈴型、蝶ネクタイ型、凧型、およびそれらの不規則な形状を含む、請求項２に記載の装置。
【請求項４】
前記横断面の形状が、少なくとも１．０〜４．０マイクロメートルの最小孔寸法を含む、請求項２に記載の装置。
【請求項５】
前記横断面の形状の孔が、少なくとも４対１の縦横比を有する、請求項３に記載の装置。
【請求項６】
前記第１の主要表面および前記第２の主要表面のうちの少なくとも１つ、ならびに前記少なくとも２つの真直ぐに通り抜ける孔のうちの２つが、少なくとも１つの疎水性表面または少なくとも１つの親水性表面を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項７】
実質的に均一サイズのエマルジョン液滴を形成するための、第１の相を第２の相中に通過させる仕切りであって、
ａ．）第１の主要表面；
ｂ．）該第１の主要表面に対向する第２の主要表面；ならびに
ｃ．）少なくとも２つの真直ぐに通り抜ける孔であって、それぞれが、多角形、卵形、楕円形、亜鈴型、蝶ネクタイ型およびそれらの不規則な形状からなる群から選択された横断面の形状、ならびに該第１の主要表面と該第２の主要表面との間の仕切りを横断する内壁を含む、少なくとも２つの真直ぐに通り抜ける孔
を含み、
該第２の相中において、該第１の相を含む、実質的に均一サイズのエマルジョン液滴を形成するように構成された仕切り。
【請求項８】
前記横断面の形状が、約４〜１６ミクロンの画定された長さ（ｌ）および約１〜４ミクロンの画定された幅（ｓ）を含む、請求項７に記載の仕切り。
【請求項９】
前記横断面の形状の長さ対幅の縦横比が、少なくとも４対１である、請求項８に記載の仕切り。
【請求項１０】
前記多角形が、四辺形、五角形、六角形、七角形、八角形、九角形、十角形の形状、およびそれらの不規則な形状からなる群から選択される、請求項７に記載の仕切り。
【請求項１１】
前記四辺形が、凧型、ひし形、不等辺四辺形、台形、二等辺四辺形、平行四辺形、長方形、およびそれらの不規則な形状からなる群から選択される、請求項１０に記載の仕切り。
【請求項１２】
前記横断面の形状が、前記真直ぐに通り抜ける孔の中心の縦軸に対して平行である、請求項７に記載の仕切り。
【請求項１３】
前記横断面の形状が、前記中心の縦軸に関して左右対称である、請求項１２に記載の仕切り。
【請求項１４】
前記第１の相が、複数の粒子を含み、該粒子は、それに結合している少なくとも１つの核酸を含む、請求項７に記載の仕切り。
【請求項１５】
実質的に均一サイズのエマルジョン液滴を形成する方法であって、
仕切りの第１の主要表面と接触している複数の粒子を含む水相を、仕切り中の少なくとも２つの真直ぐに通り抜ける孔を通して分散媒体中に押し出すステップと、
同時に、
該仕切りの第２の主要表面に対して平行にかつそれと接触した状態で該分散媒体を移動させるステップであって、該第２の主要表面が該第１の主要表面に対向しており、それによって、該分散媒体中に分散した、該水相の実質的に均一サイズのエマルジョン液滴を形成するステップと
を含み、
複数の該液滴は、少なくとも１つの粒子を含む方法。
【請求項１６】
前記真直ぐに通り抜ける孔が、内壁を含み、該内壁の一部分が、前記実質的に均一サイズのエマルジョン液滴を形成するために設計されている、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記真直ぐに通り抜ける孔が、ある横断面形状を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記横断面の形状が、約４〜１６ミクロンの画定された長さ（ｌ）および約１〜４ミクロンの画定された幅（ｓ）を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記横断面の形状の長さ対幅の縦横比が、少なくとも４対１である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記横断面の形状が、多角形、円形、卵形、楕円形、亜鈴型、蝶ネクタイ型およびそれらの不規則な形状からなる群から選択された形状を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも１つの核酸が、前記複数の粒子のうちの少なくともいくつかのそれぞれに結合している、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記水相が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施するための試薬類をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ポリメラーゼ連鎖反応が、前記実質的に均一サイズのエマルジョン液滴の内部で起こる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記核酸が、前記ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅される、請求項２３に記載の方法。
【請求項１】
複数の実質的に均一サイズのエマルジョン液滴を形成するための装置であって、少なくとも１つのエマルジョン液滴は粒子を含み、
ａ．）複数の粒子を含む水相を含有する第１のチャンバー；
ｂ．）水非混和性の液体を含む油相を含有する第２のチャンバー；ならびに
ｃ．）該第１のチャンバーと該第２のチャンバーとを分離する仕切りであって、少なくとも第１の主要表面、該第１の主要表面に対向する第２の主要表面、および少なくとも２つの、該第１の主要表面を該第２の主要表面に接続する画定された真直ぐに通り抜ける孔を含み、該第１の主要表面は、該第１のチャンバーの壁を形成し、該第２の主要表面は、該第２のチャンバーの壁を形成する仕切り
を含み、
該水相が、該少なくとも２つの真直ぐに通り抜ける孔のうちの２つを通過して該油相に至る際に、該水相は、複数の離散的な実質的に均一サイズのエマルジョン液滴を形成し、該複数の液滴のうちの少なくとも１つは、該複数の粒子のうちの少なくとも１つの粒子を含む装置。
【請求項２】
前記画定された孔が、ある横断面の形状を有する、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記横断面の形状が、多角形、卵形、楕円形、亜鈴型、蝶ネクタイ型、凧型、およびそれらの不規則な形状を含む、請求項２に記載の装置。
【請求項４】
前記横断面の形状が、少なくとも１．０〜４．０マイクロメートルの最小孔寸法を含む、請求項２に記載の装置。
【請求項５】
前記横断面の形状の孔が、少なくとも４対１の縦横比を有する、請求項３に記載の装置。
【請求項６】
前記第１の主要表面および前記第２の主要表面のうちの少なくとも１つ、ならびに前記少なくとも２つの真直ぐに通り抜ける孔のうちの２つが、少なくとも１つの疎水性表面または少なくとも１つの親水性表面を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項７】
実質的に均一サイズのエマルジョン液滴を形成するための、第１の相を第２の相中に通過させる仕切りであって、
ａ．）第１の主要表面；
ｂ．）該第１の主要表面に対向する第２の主要表面；ならびに
ｃ．）少なくとも２つの真直ぐに通り抜ける孔であって、それぞれが、多角形、卵形、楕円形、亜鈴型、蝶ネクタイ型およびそれらの不規則な形状からなる群から選択された横断面の形状、ならびに該第１の主要表面と該第２の主要表面との間の仕切りを横断する内壁を含む、少なくとも２つの真直ぐに通り抜ける孔
を含み、
該第２の相中において、該第１の相を含む、実質的に均一サイズのエマルジョン液滴を形成するように構成された仕切り。
【請求項８】
前記横断面の形状が、約４〜１６ミクロンの画定された長さ（ｌ）および約１〜４ミクロンの画定された幅（ｓ）を含む、請求項７に記載の仕切り。
【請求項９】
前記横断面の形状の長さ対幅の縦横比が、少なくとも４対１である、請求項８に記載の仕切り。
【請求項１０】
前記多角形が、四辺形、五角形、六角形、七角形、八角形、九角形、十角形の形状、およびそれらの不規則な形状からなる群から選択される、請求項７に記載の仕切り。
【請求項１１】
前記四辺形が、凧型、ひし形、不等辺四辺形、台形、二等辺四辺形、平行四辺形、長方形、およびそれらの不規則な形状からなる群から選択される、請求項１０に記載の仕切り。
【請求項１２】
前記横断面の形状が、前記真直ぐに通り抜ける孔の中心の縦軸に対して平行である、請求項７に記載の仕切り。
【請求項１３】
前記横断面の形状が、前記中心の縦軸に関して左右対称である、請求項１２に記載の仕切り。
【請求項１４】
前記第１の相が、複数の粒子を含み、該粒子は、それに結合している少なくとも１つの核酸を含む、請求項７に記載の仕切り。
【請求項１５】
実質的に均一サイズのエマルジョン液滴を形成する方法であって、
仕切りの第１の主要表面と接触している複数の粒子を含む水相を、仕切り中の少なくとも２つの真直ぐに通り抜ける孔を通して分散媒体中に押し出すステップと、
同時に、
該仕切りの第２の主要表面に対して平行にかつそれと接触した状態で該分散媒体を移動させるステップであって、該第２の主要表面が該第１の主要表面に対向しており、それによって、該分散媒体中に分散した、該水相の実質的に均一サイズのエマルジョン液滴を形成するステップと
を含み、
複数の該液滴は、少なくとも１つの粒子を含む方法。
【請求項１６】
前記真直ぐに通り抜ける孔が、内壁を含み、該内壁の一部分が、前記実質的に均一サイズのエマルジョン液滴を形成するために設計されている、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記真直ぐに通り抜ける孔が、ある横断面形状を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記横断面の形状が、約４〜１６ミクロンの画定された長さ（ｌ）および約１〜４ミクロンの画定された幅（ｓ）を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記横断面の形状の長さ対幅の縦横比が、少なくとも４対１である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記横断面の形状が、多角形、円形、卵形、楕円形、亜鈴型、蝶ネクタイ型およびそれらの不規則な形状からなる群から選択された形状を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも１つの核酸が、前記複数の粒子のうちの少なくともいくつかのそれぞれに結合している、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記水相が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施するための試薬類をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ポリメラーゼ連鎖反応が、前記実質的に均一サイズのエマルジョン液滴の内部で起こる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記核酸が、前記ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅される、請求項２３に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図４Ｆ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図４Ｆ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２０１０−５３２７０６（Ｐ２０１０−５３２７０６Ａ）
【公表日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５０８５２７（Ｐ２０１０−５０８５２７）
【出願日】平成２０年６月６日（２００８．６．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６３４８０
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１４４２８８
【国際公開日】平成２０年１１月２７日（２００８．１１．２７）
【出願人】（５０００６９０５７）アプライド バイオシステムズ インコーポレイテッド (120)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月６日（２００８．６．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６３４８０
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１４４２８８
【国際公開日】平成２０年１１月２７日（２００８．１１．２７）
【出願人】（５０００６９０５７）アプライド バイオシステムズ インコーポレイテッド (120)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]