精製インフルエンザウイルス抗原の製造方法
【課題】インフルエンザウイルス培養液から簡便な方法により効率よく宿主蛋白質等の夾雑物を除去し、インフルエンザウイルス抗原を分離・精製することができる手段を提供すること。
【解決手段】本発明の精製インフルエンザウイルス抗原の製造方法は、インフルエンザウイルスを含有する試料を界面活性剤で処理する工程と、前記処理後の試料を前記界面活性剤の共存下でヒドロキシアパタイトと接触させる工程と、ヒドロキシアパタイト非吸着画分を回収する工程を含む。
【解決手段】本発明の精製インフルエンザウイルス抗原の製造方法は、インフルエンザウイルスを含有する試料を界面活性剤で処理する工程と、前記処理後の試料を前記界面活性剤の共存下でヒドロキシアパタイトと接触させる工程と、ヒドロキシアパタイト非吸着画分を回収する工程を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、精製インフルエンザウイルス抗原の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザウイルスはオルトミクソウイルス科に属するＲＮＡウイルスであり、Ａ型、Ｂ型およびＣ型が知られている。
【０００３】
インフルエンザウイルスは脂質二重膜構造をもつエンベロープを持つ。エンベロープの内層は主としてマトリックスタンパク質及びＲＮＡとタンパク質の複合体であるＲＮＰより成る。外層にはいわゆる表面タンパク質であるインフルエンザＮＡ蛋白（ノイラミニダーゼ）及びインフルエンザＨＡ蛋白（ヘマグルチニン）（以下、それぞれ「ＮＡ蛋白」「ＨＡ蛋白」と略称する）が突起物として存在している。
【０００４】
同じ型のウイルスであっても、ＨＡ蛋白とＮＡ蛋白の抗原性の違いから、それぞれ複数の亜型と株に分類されている。インフルエンザワクチンとしては、ＮＡ蛋白及びＨＡ蛋白を含む原液にアジュバントや防腐剤等を添加したものが広く利用されている。
【０００５】
インフルエンザワクチンに使用されるインフルエンザウイルスは主として胚含有鶏卵により培養されたものが用いられている。また、近年動物細胞培養系でインフルエンザウイルスを培養する方法も確立されている。
【０００６】
一般にこれらの方法により得られるインフルエンザウイルスは単独で存在するものではなく、培養細胞、夾雑蛋白質等とともに存在しているため、培養液等からインフルエンザウイルスを分離する必要がある。インフルエンザウイルスの分離、精製は超遠心法、限外ろ過法、密度勾配遠心法等により行われている。
【０００７】
しかしながら、これらの方法によって分離、精製したインフルエンザウイルス中においても宿主由来の夾雑蛋白質がしばしば確認される。これらの夾雑蛋白質が存在するインフルエンザワクチンを接種した場合、アナフィラキシーショックやギランバレー症候群などの副作用を示す懸念があるため、さらなる精製が必要となる。
【０００８】
また、インフルエンザ抗原の製造方法として、動物細胞や昆虫細胞に、インフルエンザウイルスに含まれるタンパク質抗原を製造する遺伝子を組み込む方法が知られている。
【０００９】
インフルエンザウイルスを精製する方法としては、例えばヒドロキシアパタイトを用いてインフルエンザウイルスまたはインフルエンザウイルス抗原を精製する方法が既に知られている（特許文献１）。特許文献１の方法は、ウイルスまたはウイルス抗原をヒドロキシアパタイトに吸着させる工程、および溶出液により溶出させる工程から成る。しかしながら、インフルエンザウイルスには種々の株が存在し、それぞれの株でＨＡ蛋白やＮＡ蛋白の配列が異なっていることから、溶出条件を一定にした場合、インフルエンザウイルスの株によって溶出位置が変化し、精製度が株毎に異なってしまう可能性がある。このため、吸着した蛋白質の溶出条件をインフルエンザウイルス株毎に厳密に規定する必要があり、製造上非常に煩雑である。
【００１０】
特許文献２には、ＨＡ蛋白が特定の糖鎖へ特異的に吸着する性質を利用して、シアロ糖鎖保有化合物を固定化した担体を用いた組換ＨＡ蛋白の精製方法が示されている。しかしながら、この方法では、シアロ糖鎖保有化合物を固定化した担体の作成に多大な労力を必要とすること、インフルエンザウイルス株においてＨＡ蛋白に大きな変異が生じた場合に精製困難となる可能性があるなどの問題点があった。
【００１１】
非特許文献１には、動物細胞（昆虫細胞）にインフルエンザウイルスのＨＡ蛋白を生成する情報を持った遺伝子を、遺伝子組み換え法で組み込んだ遺伝子組換え細胞を製造し、この細胞を培養して、ＨＡ蛋白を製造する方法が記載されている。この方法は、遺伝子組換え細胞に由来する夾雑蛋白質を徹底的に除去する必要があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２０００−２６２２８０号公報
【特許文献２】特許第３４７６２４２号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Vaccine 24 (2006) 2176-2185 Expression and purification of an influenza hemagglutinin−one step closer to a recombinant protein-based influenza vaccine
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、インフルエンザウイルス抗原を含むインフルエンザウイルス培養液や、インフルエンザ抗原を生成する遺伝子を組み込んだ遺伝子組換え細胞の培養液から、簡便な方法により効率よく宿主蛋白質等の夾雑物を除去し、インフルエンザウイルス抗原を分離・精製することができる手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、鋭意研究の結果、鶏卵培養系や動物細胞培養系により培養されたインフルエンザウイルス培養液等のインフルエンザ抗原を含有する試料を粗精製後、界面活性剤で処理し、適宜遠心分離やフィルター分離等を行なった後、界面活性剤の共存下でヒドロキシアパタイトと接触させると、培養液中の夾雑物がヒドロキシアパタイトに吸着され、ＨＡ蛋白等のインフルエンザウイルス抗原が非吸着画分中に高精製度で得られることを見出し、本願発明を完成した。
【００１６】
すなわち、本発明は、インフルエンザウイルス抗原を含有する試料を界面活性剤で処理する工程と、前記処理後の試料を前記界面活性剤の共存下でヒドロキシアパタイトと接触させる工程と、ヒドロキシアパタイト非吸着画分を回収する工程を含む、精製インフルエンザウイルス抗原の製造方法を提供する。また、本発明は、上記本発明の方法により精製インフルエンザウイルス抗原を製造することを含む、インフルエンザワクチンの製造方法を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の方法により製造された精製インフルエンザウイルス抗原を含むインフルエンザワクチンと、インフルエンザワクチンを接種可能な容器に充填したプレフィルドキットを提供する。さらに、本発明は、上記本発明の方法により製造された精製インフルエンザウイルス抗原を含むインフルエンザ診断試薬を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の方法により製造された精製インフルエンザウイルス抗原を含むインフルエンザ診断キットを提供する。
【００１７】
なお、本明細書では特に断りのない限り、試料中の各成分の濃度及びｐＨ値は試料とヒドロキシアパタイトと接触させる直前の濃度を指す。また、濃度の単位の％は特に断りのない限りｗ／ｖ％である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、種々の夾雑物を含むインフルエンザウイルス抗原を含む試料からＨＡ蛋白等の抗原タンパク質を簡単な操作で、高精製度の精製インフルエンザウイルス抗原とすることができ、しかもこれを高回収率で取得することができる。本発明の方法によれば、アナフィラキシーショックなど重篤な副作用を示す懸念の少ない、ワクチンとして有用な安全性および有効性の高い精製インフルエンザウイルス抗原を経済的に得ることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】実施例１におけるヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーの結果及び各フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元銀染色）の結果を示す図である。
【図２】実施例１におけるヒドロキシアパタイトによる精製前後の試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元銀染色）の結果を示す図である。
【図３】実施例２におけるヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーの結果及び各フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元銀染色）の結果を示す図である。
【図４】実施例３におけるヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーの結果及び各フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元銀染色）の結果を示す図である。
【図５】実施例３における各精製工程サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元、ＣＢＢ染色）の結果を示す図である。
【図６】実施例４で得られた各画分についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元、ＣＢＢ染色）を行った結果を示す図である。
【図７】実施例５で得られた各上清及び各沈殿画分についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元， ＣＢＢ染色）を行った結果を示す図である。
【図８】実施例６で得られた各画分についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元銀染色）を行った結果を示す図である。
【図９】実施例７におけるヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーの結果及び各フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元銀染色）の結果を示す図である。
【図１０】参考例におけるＣＨＡＰＳ非添加試料のヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーの結果及び各フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元、ＣＢＢ染色）の結果を示す図である。
【図１１】参考例におけるＣＨＡＰＳ添加試料のヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーの結果及び各フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元、ＣＢＢ染色）の結果を示す図である。
【図１２】実施例８におけるヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーの結果及び各フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元銀染色）の結果を示す図である。
【図１３】実施例８におけるヒドロキシアパタイトによる精製前後の試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元銀染色）の結果を示す図である。
【図１４】実施例９で得られた各画分についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元、ＣＢＢ染色）を行った結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
インフルエンザウイルス抗原は、インフルエンザウイルスの一部又はその同等物であればよい。インフルエンザウイルス抗原は、例えばＨＡ蛋白、ＮＡ蛋白、Ｍ２蛋白等のウイルス表面に存在する蛋白やＭ１蛋白、ＮＰ蛋白等のウイルス内部に存在する蛋白のいずれも使用可能であり、ＨＡ蛋白が好適に用いられる。ＨＡ蛋白の製造はインフルエンザウイルスの培養液を原料としてもよく、ＨＡ蛋白合成遺伝子を組み込んだ遺伝子組換え細胞の培養液を原料としてもよい。
【００２１】
本発明の精製インフルエンザウイルス抗原の製造方法は、インフルエンザウイルス抗原を含む試料を界面活性剤で処理する工程と、前記処理後の試料を前記界面活性剤の共存下でヒドロキシアパタイトと接触させる工程と、ヒドロキシアパタイト非吸着画分を回収する工程を含む。本発明の方法では、ヒドロキシアパタイトは、試料中の夾雑物を吸着させて除去するために用いられ、インフルエンザウイルス抗原は非吸着画分中に得られる。
【００２２】
本発明の方法に供されるインフルエンザウイルス抗原を含む試料としては、動物細胞を宿主として用いる動物細胞培養系又は鶏卵を宿主として用いる鶏卵培養系によりインフルエンザウイルスを増殖させた培養液や、ＨＡ蛋白合成遺伝子などのインフルエンザウイルス抗原を製造する遺伝子を組み込んだ遺伝子組換え細胞培養系の培養液等が挙げられる。
【００２３】
鶏卵培養系や動物細胞培養系でインフルエンザウイルスを増殖させた培養液中には、宿主に由来するタンパク質等の夾雑物が多量に含まれている。本発明の方法によれば、このような夾雑物を簡便な操作で効率良く除去し、精製度の高いインフルエンザウイルス抗原を得ることができる。
【００２４】
動物細胞培養系及び鶏卵培養系はこの分野で公知であり、そのような公知の培養系のいずれを用いてもよい。動物細胞培養系では、例えば牛、馬、豚、羊、イヌ、サル等の哺乳類、ニワトリ、ガチョウ、アヒル等の鳥類、及びマウス等から単離された組織又は培養細胞が使用可能であり、ＣＨＯ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｐｅｒ.Ｃ６細胞、ＥＢ６６細胞等が好適に用いられる。
【００２５】
培養液中で増殖させたインフルエンザウイルスは、通常、一般に用いられる精製工程、例えば限外ろ過法、密度勾配遠心法等により培養液から分離され、粗精製インフルエンザウイルス液として調製される。本発明の方法では、このような粗精製インフルエンザウイルス液がインフルエンザウイルス抗原を含む試料として好適に用いることができる。
【００２６】
本発明の方法に供されるインフルエンザウイルス抗原を含む試料は、インフルエンザウイルス培養液に限定されない。昆虫細胞や動物細胞にインフルエンザウイルス抗原を生成する遺伝子を遺伝子組換え法により導入し、生成したインフルエンザウイルス抗原についても本発明の方法により精製することができる。
【００２７】
ＨＡ蛋白遺伝子を組み込む動物細胞や昆虫細胞は特に限定されず、昆虫細胞はヨトウガ、カイコ、動物細胞はイヌ、ネコ、サル、ブタ、ウシ、マウス等の哺乳類や、ニワトリ、ガチョウ、アヒル等の鳥類が挙げられる。宿主細胞は、増殖効率が高い昆虫細胞や、アレルギーの発生源が少ない哺乳類が好ましく、動物細胞としてはＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＭＤＣＫ細胞等が、昆虫細胞としてはＳＦ−９細胞、ＳＦ−２１細胞等が好適に用いられる。また、インフルエンザウイルス抗原の遺伝子の塩基配列は周知であり、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＥＵ１０３８２４等に記載されている。この塩基配列に基づき、インフルエンザウイルス抗原を遺伝子組換え法により調製することが可能である（例えば非特許文献１参照）。また、遺伝子組換え法により調製されたインフルエンザウイルス抗原は市販されているので、このような市販品を本発明の方法に適用することもできる。
【００２８】
インフルエンザウイルス抗原含有試料を処理する界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤及び陰イオン性界面活性剤から選択される１種以上を用いることができる。
【００２９】
非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（例えば、商品名エマルゲン２２０、エマルゲン１０４Ｐ、エマルゲン１０８、エマルゲン４０８など＜花王社製＞）、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（例えば、商品名エマルゲン９０３、エマルゲン９０９、エマルゲン９１３など＜花王社製＞）、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン縮合物（例えば、商品名プルロニックＦ８８（旭電化社製））、アシルポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えば、商品名Ｔｗｅｅｎ２１、Ｔｗｅｅｎ８１、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ８５、Ｅｍａｓｏｌ４１３０など）、アルキルポリオキシエチレンエーテル（例えば、商品名ＡｔｌａｓＧ２１２７、Ｂｒｉｊ３６Ｔ、Ｂｒｉｊ５６など）、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、シュークロースモノラウレート、ポリオキシエチレンラウリルエーテル（商品名エマルゲン１２０など＜花王社製＞）、ポリオキシエチレンアルキレンフェニルエーテル（商品名エマルゲンＡ６０など）、ポリオキシエチレンアルキレントリベンジルフェニルエーテル（商品名エマルゲンＢ６６など）、ポリオキシエチレングリコールp-t-オクチルフェニルエーテルポリオキシエチレングリコール（商品名Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、ポリオキシエチレン高級アルコールエーテル（商品名エマルゲン７０５、エマルゲン７０９など＜花王社製＞）、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルアミン、グリセリン脂肪酸エステル、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ポリオキシエチレングリコールモノドデシルエーテル、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシド、ポリオキシエチレンモノラウレート等が挙げられる。特に好ましくは、ポリオキシエチレングリコールｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテルが挙げられる。
【００３０】
両性界面活性剤としてはベタイン誘導体、アルキルベタイン誘導体、イミダゾリウムベタイン誘導体、スルホベタイン誘導体、アミノカルボン酸誘導体、イミダゾリン誘導体、アミンオキサノイド誘導体、胆汁酸誘導体等であることが挙げられ、特に好ましくはＤＤＡ ［（２−（Ｎ−Ｄｏｄｅｃｙｌ−Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ） Ａｃｅｔａｔｅ］、ＤＤＳＡ ［Ｄｏｄｅｃｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌ （３−ｓｕｌｆｏｐｒｏｐｙｌ）ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ］、ＣＨＡＰＳ［３−（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｅｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｐＨｏｎａｔｅ］が挙げられる。
【００３１】
陰イオン性界面活性剤としては、ラウリル硫酸、ドデシルスルホン酸、ラウロサルコシン、ドデシルベンゼンスルホン酸、カゼイン酸、ラウロイル−β−アラニン、コール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、脂肪酸塩等が挙げられる。陰イオン性界面活性剤は、これらの化合物のナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩であってもよい。デオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ）が好適に用いられる。
【００３２】
これらの界面活性剤は単独で用いてもよく、また複数を組み合わせて用いてもよい。複数を組み合わせる場合は、非イオン系界面活性剤と両性界面活性剤を組み合わせて用いてもよいし、非イオン系界面活性剤と陰イオン性界面活性剤を組み合わせて用いてもよいし、両性界面活性剤と陰イオン性界面活性剤を組み合わせて用いてもよいし、三者を組み合わせて用いてもよい。また、非イオン性界面活性剤同士又は両性界面活性剤同士又は陰イオン性界面活性剤同士を組み合わせて用いてもよい。
【００３３】
界面活性剤による処理は、例えば、インフルエンザウイルス抗原含有試料中に界面活性剤を添加し、０℃〜室温程度で３０分間〜２時間程度撹拌することにより行なうことができる。界面活性剤による処理濃度（ヒドロキシアパタイトに接触させる直前の濃度）は、通常、インフルエンザウイルス抗原含有試料全体に対する界面活性剤の有効成分の濃度として０．０５％〜２０％が好ましく、０．１％〜２０％が更に好ましく、０．１％〜５％が更に好ましい。ただし、処理に適した界面活性剤濃度は界面活性剤の種類によって異なり、必ずしもこの範囲には限定されない。例えば、ＣＨＡＰＳでは０．５％〜２０％が好ましく、１％〜１５％が更に好ましい。ポリオキシエチレングリコールp-t-オクチルフェニルエーテルでは０．０５％〜３％が好ましく、０．１％〜２％が更に好ましい。デオキシコール酸又はデオキシコール酸塩では１％〜２０％が好ましく、１．５％〜１５％が更に好ましい。
【００３４】
必要に応じて界面活性剤処理後の試料から試料溶液中の不溶物を除去する。不溶物を除去する方法としては、遠心分離、超遠心分離、フィルター濾過等を挙げることができる。この不溶物除去工程により、夾雑物の多くを除去することができるので、ヒドロキシアパタイトによる夾雑物の吸着除去と組み合わせることで非常に効率の良い精製が可能となる。
【００３５】
次いで、界面活性剤処理後の試料溶液をヒドロキシアパタイトと接触させる。本発明では、界面活性剤共存下でヒドロキシアパタイトとインフルエンザウイルス抗原含有試料溶液とを接触させることが重要である。界面活性剤が存在しない状態でヒドロキシアパタイトとインフルエンザウイルス抗原とを接触させると、インフルエンザウイルス抗原がヒドロキシアパタイトに吸着することが確認されている（下記参考例参照）。本発明において、界面活性剤処理後の試料溶液中にはすでに界面活性剤が存在しているため、処理後の溶液をそのままヒドロキシアパタイトと接触させればよい。ただし、処理後の溶液にさらに界面活性剤を追加することは差し支えない。
【００３６】
好ましくは、界面活性剤処理後の試料は、ｐＨ６〜１０、より好ましくはｐＨ６〜９、さらに好ましくはｐＨ６．５〜９の条件下でヒドロキシアパタイトと接触させる。ｐＨがこの範囲よりも低いとインフルエンザウイルス抗原を非吸着画分中に得ることが困難になり、また、ｐＨがこの範囲よりも高いと夾雑物の吸着除去の効率が低下する（下記実施例参照）。
【００３７】
本発明で用いるヒドロキシアパタイトの種類は特に限定されず、商業的に入手可能ないずれのヒドロキシアパタイトを用いてもよい。例えば、カラムの充填剤として市販されているヒドロキシアパタイトを使用することができる。好ましい例としては、約２０〜５０μｍの粒径および約８００オングストロームの孔径を有するセラミックヒドロキシアパタイトが挙げられる。そのような商業的に入手可能なヒドロキシアパタイトは、例えばＢｉｏ−Ｒａｄから「セラミック・ヒドロキシアパタイトＩ型」あるいは「セラミック・ヒドロキシアパタイトＩＩ型」として販売されているものが挙げられる。
【００３８】
界面活性剤処理後の試料とヒドロキシアパタイトとを接触させる具体的な操作は限定されず、サンプルの濃度や量、使用するヒドロキシアパタイトの形態等により適宜選択可能である。例えば、試料中にヒドロキシアパタイトを投入するバッチ式や、ヒドロキシアパタイトが充填されたカラム内に試料を添加する方法等が挙げられる。
【００３９】
バッチ法では、例えば、界面活性剤処理後の試料から濾過、遠心分離等により不溶物を除去した後、試料中にヒドロキシアパタイトを投入する。このとき試料はあらかじめ適当な緩衝液等を用いてｐＨ６〜１０程度、好ましくはｐＨ６〜９程度、より好ましくはｐＨ６．５〜９に調整しても良い。界面活性剤をさらに試料に追加してもよいが、処理後の溶液中に界面活性剤がすでに存在しているため、そのまま界面活性剤を追加せずにヒドロキシアパタイトを投入することが簡便である。ヒドロキシアパタイトを投入後、０℃〜室温程度にて適宜撹拌下１５分間〜１時間程度接触させて、試料中の夾雑物を吸着させる。精製インフルエンザウイルス抗原は非吸着画分中に得ることができるので、ヒドロキシアパタイトを濾過等により除去して上清を得ればよい。
【００４０】
ヒドロキシアパタイトをカラムに充填させて用いる方法では、例えば、リン酸緩衝液等の緩衝液でカラムを平衡化した後、界面活性剤処理後の試料をカラムに添加し、平衡化に用いた緩衝液等で展開する。インフルエンザウイルス抗原はヒドロキシアパタイトに吸着せずに素通りするため、非吸着画分を分取して精製インフルエンザウイルス抗原を得ることができる。この溶出した画分は主としてＨＡ蛋白を含んでおり、このままでもかなり精製されているが、再度同じクロマトグラフィーによりさらに精製してもよく、また必要により限外ろ過、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過等の手段により更に精製してもよい。緩衝液のｐＨは６〜１０が好ましく、ｐＨ６〜９がより好ましく、ｐＨ６．５〜９がさらに好ましい。
【００４１】
使用できる緩衝液としては、リン酸緩衝液の他、例えば、ＭＥＳ ［２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸］、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ ［ビス−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ］トリス−（ヒドロキシメチル）メタン］、ＡＤＡ ［Ｎ−２−アセトアミドイミノ二酢酸・一ナトリウム塩］、ＡＣＥＳ ［Ｎ−２−アセトアミド−２−アミノエタンスルホン酸］、ＰＩＰＥＳ［ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタン−スルホン酸）］、ＭＯＰＳＯ ［（３−Ｎ−モルホリノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸］、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ ＰＲＯＰＡＮＥ ［１，３−ビス［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］プロパン］、ＢＥＳ ［Ｎ，Ｎ−ビス−（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノ−エタンスルホン酸］、ＴＥＳ ［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタン−スルホン酸および２−２（［２−ヒドロキシ−１，１−ビス（ヒドロキシメチル）エチル］アミノ）エタンスルホン酸］、ＨＥＰＥＳ ［Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタン−スルホン酸］、ＤＩＰＳＯ ［３−（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ）−２−ヒドロキシ−プロパンスルホン酸］、ＴＡＰＳＯ ［３−Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］−２−ヒドロキシ−プロパンスルホン酸］、ＴＲＩＳ ［トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン］、ＨＥＰＰＳＯ ［Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン−Ｎ’−［２−ヒドロキシ−プロパンスルホン酸］］、ＰＯＰＳＯ ［（ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス［２−（ヒドロキシプロパンスルホン酸）］、ＥＰＰＳ ［Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］−ピペラジン−Ｎ’−［３−プロパンスルホン酸およびＨＥＰＰＳ］、ＴＥＡ ［トリエタノールアミン］、ＴＲＩＣＩＮＥ ［Ｎ［トリス−（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン］、ＢＩＣＩＮＥ ［Ｎ，Ｎ−ビス−（２−ヒドロキシエチル）］−グリシン）、ＴＡＰＳ ［３−｛［トリス−（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝−プロパンスルホン酸］、イミダゾール、ＨＥＰＰＳ ［Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−３−プロパン−スルホン酸］、グリシンアミド塩酸塩、グリシルグリシン、クエン酸塩、酢酸塩、ホウ酸塩、およびコハク酸塩緩衝液が挙げられる。
【００４２】
また、これらの緩衝液には塩類及び／又は界面活性剤を含んでも良い。使用できる塩類としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、塩化物、臭化物、酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩が挙げられる。具体的には、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、臭化アンモニウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、クエン酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸カルシウム、酢酸マグネシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸アンモニウム等が挙げられる。界面活性剤については先に挙げたものが使用可能であるが、これらに限定されない。
【００４３】
緩衝液の適切な組成については、当業者は当技術分野での既知の知識を指針として、適宜選択することできる。
【００４４】
ヒドロキシアパタイトと接触後の非吸着画分に含まれる界面活性剤は、適宜限外濾過等により除去することができる。
【００４５】
以上のようにして精製されたインフルエンザウイルス抗原は、その精製度が高く、界面活性剤、鶏卵や動物細胞や遺伝子組み換え細胞由来のＤＮＡ等の夾雑物がほとんど含まれていない。、インフルエンザウイルス抗原にアジュバントや防腐剤等を添加し、インフルエンザワクチンとして使用できる。インフルエンザワクチンは、シリンジや接種作業に使用可能なカートリッジ等に充填し、プレフィルドシリンジ等、接種可能なプレフィルドキットとしてもよい。
【００４６】
非吸着画分として得られる精製インフルエンザウイルス抗原液は、原液のまま、又は診断用組成物等として、インフルエンザ診断キットの一部として使用できる。また、周知の方法により精製インフルエンザウイルス抗原を免疫原として用いて抗インフルエンザ抗体を作製し、この抗体を含む試薬をインフルエンザ診断試薬の一部や、インフルエンザ診断キットの一部として使用することもできる。
【実施例】
【００４７】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００４８】
実施例１
培養したメディン−ダービーイヌ腎（ＭＤＣＫ）細胞にインフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１株）を接種し増殖させた。得られた培養上清をろ過、限外ろ過、ショ糖密度勾配遠心法により粗精製し、β−プロピオラクトンによりインフルエンザウイルスの不活化を行った。不活化されたインフルエンザウイルス液について限外ろ過を行い、溶媒を６．７ｍＭリン酸緩衝生理食塩水に置換し、粗精製インフルエンザウイルス液を得た。
【００４９】
粗精製インフルエンザウイルス液１０ｍＬに１０％ＣＨＡＰＳを含む６．７ｍＭリン酸緩衝生理食塩水１０ｍＬを加えて、室温で１時間攪拌後、２００，０００×ｇ、３０分、１５℃の条件で超遠心した。超遠心後、上清を回収し、カラムクロマトグラフィーの試料とした。
【００５０】
内径０．５ｃｍ、高さ１６ｃｍのカラムにヒドロキシアパタイト樹脂（Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ Ｔｙｐｅ Ｉ ４０μｍ， Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を１．８ｍＬ充填し、５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）流速０．５ｍＬ／ｍｉｎで平衡化した後、試料２０ｍＬを添加し、５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で展開した。素通り画分（非吸着画分）を分取して精製インフルエンザウイルス抗原液とした。吸着した画分は５ｍＭから４００ｍＭのリン酸緩衝液のリニアグラジエントにより溶出した。精製インフルエンザウイルス抗原液は、さらにＶＩＶＡＦＬＯＷ５０（ザルトリウス社製）を用いた限外ろ過によりＣＨＡＰＳを除去し、溶媒を６．７ｍＭリン酸緩衝生理食塩水に置換した後、０．２２μｍフィルター（ミリポア社製、ＳＬＬＧ０２５ＳＳ）を用いてフィルターろ過を行い、１５ｍＬの精製インフルエンザウイルス抗原液を得た。
【００５１】
ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー及び各フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元銀染色）の結果を図１に示す。なお、グラジエントはＡ液（５ｍＭリン酸緩衝液）とＢ液（４００ｍＭリン酸緩衝液）を混合して作製しており、図中のＣｏｎｃＢ（％）はＢ液の混合割合を示す（例えば、ＣｏｎｃＢ ０％溶液：Ａ液１００％＋Ｂ液０％、ＣｏｎｃＢ ５０％溶液：Ａ液５０％＋Ｂ液５０％、ＣｏｎｃＢ １００％溶液：Ａ液０％＋Ｂ液１００％を意味する）。また、精製前後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元銀染色）の結果を図２に、精製されたインフルエンザ抗原についてＤＮＡ分析、ＣＨＡＰＳ分析、総蛋白質量分析を行った結果を表１に示す。表１中のＨＡ蛋白含量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後ＣＢＢ染色を行い、画像解析によりＨＡ蛋白含量率を計算し、その値を総蛋白質量に乗じた値である。
【００５２】
ＨＡ含量から計算されるＨＡ蛋白の回収率は７２％であった。また宿主由来のＤＮＡや、精製工程で添加したＣＨＡＰＳなどの不純物は一連の精製工程において非常に低いレベルまで除去されていた。
【００５３】
【表１】
【００５４】
実施例２
実施例１と同様にして、ＭＤＣＫ細胞により増殖させたインフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１株）培養液から粗精製インフルエンザウイルス液を調製した。該粗精製液１ｍＬに１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む６．７ｍＭリン酸緩衝生理食塩水１ｍＬを加えて、室温で１時間攪拌後、２００，０００×ｇ、３０分、１５℃の条件で超遠心した。超遠心後、上清を回収し、カラムクロマトグラフィーの試料とした。
【００５５】
内径０．５ｃｍ、高さ９ｃｍのカラムにヒドロキシアパタイト樹脂（Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ Ｔｙｐｅ Ｉ ４０μｍ， Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を１ｍＬ充填し、５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）流速０．５ｍＬ／ｍｉｎで平衡化した後、試料２ｍＬを添加し、４００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で展開した。素通り画分（非吸着画分）を分取して精製インフルエンザウイルス抗原液を得た。吸着した画分は５ｍＭから４００ｍＭのリン酸緩衝液のリニアグラジエントにより溶出した。
【００５６】
ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー及び各フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元銀染色）の結果を図３に示す。なお、図中のＣｏｎｃＢ（％）の意味は実施例１と同様である。
【００５７】
界面活性剤としてＴｒｉｔｏｎＸ−１００を用いた場合でも、ヒドロキシアパタイトを用いることにより、効率よく精製インフルエンザウイルス抗原の製造が可能であることが示された。
【００５８】
実施例３
インフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１株）を孵化鶏卵に接種して増殖させて、尿膜腔液中に遊出したインフルエンザウイルス培養液を限外ろ過、バリウム処理、ショ糖密度勾配遠心法により粗精製し、β−プロピオラクトンによりインフルエンザウイルスの不活化を行った。不活化されたインフルエンザウイルス液について限外ろ過を行い、溶媒を６．７ｍＭリン酸緩衝生理食塩水に置換し、粗精製インフルエンザウイルス液を得た。
【００５９】
粗精製インフルエンザウイルス液５ｍＬに１０％ＣＨＡＰＳを含む６．７ｍＭリン酸緩衝生理食塩水５ｍＬを加えて、室温で１時間攪拌後、孔径０．２２μｍのメンブレンフィルターによりろ過し、ろ液をカラムクロマトグラフィーの試料とした。
【００６０】
内径０．５ｃｍ、高さ１６ｃｍのカラムにヒドロキシアパタイト樹脂（Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ Ｔｙｐｅ Ｉ ４０μｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製））を１．８ｍＬ充填し、５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）流速０．５ｍＬ／ｍｉｎで平衡化した後、試料６ｍＬを添加し、５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で展開した。素通り画分（非吸着画分）を分取して精製インフルエンザウイルス抗原液とした。精製インフルエンザウイルス抗原液は、さらにＶＩＶＡＦＬＯＷ５０（ザルトリウス社製）を用いた限外ろ過によりＣＨＡＰＳを除去し、溶媒を６．７ｍＭリン酸緩衝生理食塩水に置換した後、０．２２μｍフィルター（ミリポア社製、ＳＬＬＧ０２５ＳＳ）を用いてフィルターろ過（無菌ろ過）を行い、１５ｍＬの精製インフルエンザウイルス抗原液を得た。吸着した画分は４００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で、次いで０Ｍから１Ｍ ＮａＯＨのリニアグラジエントにより溶出し、溶出画分を得た。
【００６１】
ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー及び各フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元銀染色）の結果を図４に示す。なお、グラジエントはＡ液（４００ｍＭリン酸緩衝液）とＢ液（１Ｍ ＮａＯＨ）を混合して作成しており、図中のＣｏｎｃＢ（％）はＢ液の混合割合を示す。各精製工程サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元、ＣＢＢ染色）の結果を図５に示す。また、精製されたインフルエンザウイルス抗原について総蛋白質量、ＣＨＡＰＳ分析を行った結果を表２に示す。表中のＨＡ蛋白含有量はＳＤＳ−ＰＡＧＥ後ＣＢＢ染色を行い画像解析によりＨＡ蛋白含有率を計算し、その値を総蛋白質量に乗じた値である。
【００６２】
ＨＡ蛋白含量から計算されるＨＡ蛋白の回収率は４２％であった。また精製工程で添加したＣＨＡＰＳは一連の精製工程において非常に低いレベルまで除去されていた。
【００６３】
【表２】
【００６４】
実施例４
実施例１と同様にして、ＭＤＣＫ細胞により増殖させたインフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１株）から粗精製インフルエンザウイルス液を調製した。該粗精製液１ｍＬに１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む６．７ｍＭリン酸緩衝生理食塩水１ｍＬを加えて、室温で１時間攪拌後、２００，０００×ｇ、３０分、１５℃の条件で超遠心法で分離し、上清を回収した。上清０．２ｍＬにヒドロキシアパタイト樹脂（Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ Ｔｙｐｅ Ｉ ４０μｍ， Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を０．２ｍＬ添加し、３０分間攪拌した後、遠心ろ過フィルター（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ，ミリポア社製）に移し、１５，０００×ｇ、３０秒間遠心し、透過液を非吸着画分として採取した。上部に残ったヒドロキシアパタイト樹脂は０．２５ｍＬの６．７ｍＭリン酸緩衝生理食塩水を加えて攪拌後、同様に遠心して洗浄する操作を３回繰り返し、透過液を洗浄画分として採取した。次に２５０ｍＭリン酸緩衝液を加えて攪拌後、同様に遠心して溶出を行い、透過液を溶出画分（リン酸）として採取した。さらに０．１Ｍ ＮａＯＨ溶液０．２５ｍＬを加え同様に遠心して溶出を行い、透過液を溶出画分（ＮａＯＨ）として採取した。得られた透過液についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元、ＣＢＢ染色）を行った。結果を図６に示す。
【００６５】
実施例５
実施例１と同様にして、ＭＤＣＫ細胞により増殖させたインフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１株）から粗精製インフルエンザウイルス液を調製した。該粗精製液０．１５ｍＬに、表３に示した濃度の各種界面活性剤を添加した６．７ｍＭリン酸緩衝生理食塩水０．１５ｍＬを添加した。すなわち、界面活性剤処理系内の界面活性剤濃度は表３記載の濃度の２分の１であった。室温で１時間攪拌後、５５０，０００×ｇ、１５℃、３０分の条件で超遠心した。超遠心後、上清及び沈殿画分をそれぞれ回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元， ＣＢＢ染色）を行った結果を図７に示す。図７から明らかなように、ＣＨＡＰＳを添加し、超遠心を行った上清が最もＨＡ蛋白以外の夾雑蛋白が少なかった。ＣＨＡＰＳを用いた場合には、界面活性剤処理の段階からインフルエンザウイルス抗原を高度に精製することが可能であることが示された。なお、表中の「ＤＯＣ」はデオキシコール酸ナトリウムを表す。
【００６６】
【表３】
【００６７】
実施例６
実施例１と同様にして、ＭＤＣＫ細胞により増殖させたインフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１株）から粗精製インフルエンザウイルス液を調製した。該粗精製液１ｍＬに１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む６．７ｍＭリン酸緩衝液１０ｍＬを加えて、室温で１時間攪拌後、２００，０００ ×ｇ、３０分、１５℃の条件で超遠心した。超遠心後、上清を回収し、カラムクロマトグラフィーの試料とした。
【００６８】
内径０．５ｃｍ、高さ９ｃｍのカラムにヒドロキシアパタイト樹脂（Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ Ｔｙｐｅ Ｉ ４０μｍ， Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を１ｍＬ充填し、各種ｐＨの５ｍＭリン酸緩衝液を用いて流速０．５ｍＬ／ｍｉｎで平衡化した後、試料１ｍＬを添加した。各種ｐＨの５ｍＭリン酸緩衝液で展開し、素通り画分（非吸着画分）を分取した。吸着した画分は０Ｍから０．１ＭのＮａＯＨのステップワイズグラジエント（Ａ液：５ｍＭリン酸緩衝液、Ｂ液：０．１ＭのＮａＯＨ溶液）により溶出し、吸着画分１、２を得た。これらの画分についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元銀染色）を行った結果を図８に示す。ｐＨ５．８では素通り画分に蛋白質はほとんど認められず、インフルエンザウイルス抗原も含め大部分の蛋白質がヒドロキシアパタイト樹脂に吸着していた。ｐＨ６．２以上では素通り画分にＨＡ蛋白を主とする蛋白質の存在が確認された。
【００６９】
実施例７
実施例３と同様にして、孵化鶏卵に接種して増殖させたインフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１株）から粗精製インフルエンザウイルス液を調製した。該粗精製液１ｍＬに５％デオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ）を含む６．７ｍＭリン酸緩衝液１ｍＬを加えて、室温で１時間攪拌後、孔径０．２２μｍのメンブレンフィルターによりろ過し、ろ液をカラムクロマトグラフィーの試料とした。
【００７０】
内径０．５ｃｍ、高さ９ｃｍのカラムにヒドロキシアパタイト樹脂（Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ Ｔｙｐｅ ＩＩ ４０μｍ， Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を０．９ｍＬ充填し、６０ｍＭ ＮａＣｌを含む５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で流速０．５ｍＬ／ｍｉｎで平衡化した後、試料１ｍＬを添加し、６０ｍＭ ＮａＣｌを含む５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で展開した。素通り画分を分取して精製インフルエンザウイルス抗原液を得た。吸着した画分は、実施例３と同様にして、４００ｍＭリン酸緩衝液により溶出し、次いで０Ｍから１Ｍ ＮａＯＨのリニアグラジエントにより溶出した。
【００７１】
ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー及び各フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元銀染色）の結果を図９に示す。なお、図中のＣｏｎｃＢ（％）の意味は実施例３と同様である。
【００７２】
界面活性剤としてＤＯＣを用いた場合でもヒドロキシアパタイトを用いることにより、効率よくインフルエンザウイルス抗原の精製が可能であることが示された。
【００７３】
参考例
実施例１と同様の方法でヒドロキシアパタイト樹脂を用いて精製し、ＣＨＡＰＳを除去した精製インフルエンザウイルス抗原０．５ｍＬに、６．７ｍＭリン酸緩衝液０．５ｍＬを添加したものをＣＨＡＰＳ非添加試料、１０％ＣＨＡＰＳを含む６．７ｍＭリン酸緩衝液０．５ｍＬを添加したものをＣＨＡＰＳ添加試料とした。
【００７４】
内径０．５ｃｍ、高さ９ｃｍのカラムにヒドロキシアパタイト樹脂（Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ Ｔｙｐｅ Ｉ ４０μｍ， Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を０．９ｍＬ充填し、５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて流速０．５ｍＬ／ｍｉｎで平衡化した後、試料０．５ｍＬを添加し、５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で展開した。素通り画分（非吸着画分）を１ｍＬずつ分取した。吸着した画分は、実施例１と同様の５ｍＭから４００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）のリニアグラジエントにより溶出し、１ｍＬずつ分取した。
【００７５】
ＣＨＡＰＳ非添加試料のヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー及び各フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元、ＣＢＢ染色）の結果を図１０に、ＣＨＡＰＳ添加試料の結果を図１１に示す。なお、図中のＣｏｎｃＢ（％）の意味は実施例１と同様である。
【００７６】
ＣＨＡＰＳ非添加試料ではほとんどのＨＡ蛋白が吸着し、４００ｍＭリン酸緩衝液による溶出でも僅かに溶出される程度であったが、ＣＨＡＰＳ添加試料では素通り画分にＨＡ蛋白が溶出された。
【００７７】
実施例８
培養したメディン−ダービーイヌ腎（ＭＤＣＫ）細胞にインフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ１株）を接種し増殖させた。得られた培養上清をろ過、限外ろ過、ショ糖密度勾配遠心法により粗精製し、β−プロピオラクトンによりインフルエンザウイルスの不活化を行った。不活化されたインフルエンザウイルス液について限外ろ過を行い、溶媒を６．７ｍＭリン酸緩衝生理食塩水に置換し、粗精製インフルエンザウイルス液を得た。
【００７８】
粗精製インフルエンザウイルス液７５ｍＬに１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む６．７ｍＭリン酸緩衝液７５ｍＬを加えて、室温で９０分間攪拌後、０．２２μｍフィルター（ミリポア社製、ステリカップ−ＧＶ）を用いてフィルターろ過を行い、カラムクロマトグラフィーの試料とした。
【００７９】
内径２．６ｃｍ、高さ２０ｃｍのカラムにヒドロキシアパタイト樹脂（Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ Ｔｙｐｅ Ｉ ４０μｍ， Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を５６ｍＬ充填し、６０ｍＭ ＮａＣｌ及び０．５％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で流速０．５ｍＬ／ｍｉｎで平衡化した後、試料１５０ｍＬを添加し、平衡化に用いた緩衝液で展開した。素通り画分（非吸着画分）を分取して精製インフルエンザウイルス抗原液とした。吸着した画分は４００ ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で、次いで０Ｍから１Ｍ ＮａＯＨのリニアグラジエントにより溶出し、溶出画分を得た。精製インフルエンザウイルス抗原液は、さらにイオン交換クロマトグラフィーによりＴｒｉｔｏｎＸ−１００を除去し、ＶＩＶＡＦＬＯＷ５０（ザルトリウス社製）を用いた限外ろ過により溶媒を６．７ｍＭリン酸緩衝生理食塩水に置換した後、０．２２μｍフィルター（ミリポア社製、ＭＩＬＬＥＸ−ＧＶ）を用いてフィルターろ過を行い、２０ｍＬの精製インフルエンザウイルス抗原液を得た。
【００８０】
ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー及び各フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元銀染色）の結果を図１２に示す。なお、図中のＣｏｎｃＢ（％）の意味は実施例３と同様である。また、精製前後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元銀染色）の結果を図１３に示す。
【００８１】
Ｈ５Ｎ１型のインフルエンザウイルス由来のインフルエンザウイルス抗原でもＨ１Ｎ１型のインフルエンザウイルス由来のインフルエンザウイルス抗原と同様に精製できることが示された。
【００８２】
実施例９
インフルエンザウイルス抗原としてＨＡ蛋白を生成する遺伝子を組み込んだ昆虫細胞により製造したＨ１型のＨＡ蛋白（アブカム社製、Ｃａｔ．Ｎｏ．ａｂ６９７４１、１．６７ｍｇ／ｍＬ、市販品）０．００９ｍＬに、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む２０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水０．０７２ｍＬを加えて攪拌し、試料とした。遠心ろ過フィルター（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ，ミリポア社製）の膜上にヒドロキシアパタイト樹脂（Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ Ｔｙｐｅ Ｉ ４０μｍ， Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）０．０５ｍＬをのせ、試料を０．０５ｍＬ添加し、１５，０００ ×ｇ、３０秒間遠心した。透過液を非吸着画分として採取した。上部に残ったヒドロキシアパタイト樹脂は０．０５ｍＬの２０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水を加えて攪拌後、同様に遠心して洗浄する操作を３回繰り返し、透過液を洗浄画分として採取した。次に０．０５ｍＬの２５０ｍＭリン酸緩衝液を加えて攪拌後、同様に遠心して溶出を行い、透過液を溶出画分（リン酸）として採取した。さらに０．１Ｍ ＮａＯＨ溶液０．０５ｍＬを加え同様に遠心して溶出を行い、透過液を溶出画分（ＮａＯＨ）として採取した。得られた透過液についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元、ＣＢＢ染色）を行った結果を図１４に示す。
インフルエンザウイルス抗原としてＨＡ蛋白を生成する遺伝子を組み込んだ昆虫細胞により生成させたＨＡ蛋白も、一部樹脂への吸着が認められたものの、ＨＡ蛋白を非吸着画分、洗浄画分として回収することができた。このことから、遺伝子組み換えした昆虫細胞を用いて製造したＨ１型のＨＡ蛋白も、鶏卵や動物細胞で培養したＨＡ蛋白と同様に非吸着画分及び洗浄画分として回収することにより精製できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
以上に示されるように、本発明の方法により、培養された種々の夾雑物を含むインフルエンザウイルス抗原を含有する培養液等の試料から、ＨＡ蛋白等のインフルエンザウイルス抗原を簡単な操作で、高精製度に、かつ高回収率で得ることができた。また、本発明の製造法によれば、安全性および有効性の高い精製インフルエンザウイルス抗原を経済的に得ることが可能となった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、精製インフルエンザウイルス抗原の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザウイルスはオルトミクソウイルス科に属するＲＮＡウイルスであり、Ａ型、Ｂ型およびＣ型が知られている。
【０００３】
インフルエンザウイルスは脂質二重膜構造をもつエンベロープを持つ。エンベロープの内層は主としてマトリックスタンパク質及びＲＮＡとタンパク質の複合体であるＲＮＰより成る。外層にはいわゆる表面タンパク質であるインフルエンザＮＡ蛋白（ノイラミニダーゼ）及びインフルエンザＨＡ蛋白（ヘマグルチニン）（以下、それぞれ「ＮＡ蛋白」「ＨＡ蛋白」と略称する）が突起物として存在している。
【０００４】
同じ型のウイルスであっても、ＨＡ蛋白とＮＡ蛋白の抗原性の違いから、それぞれ複数の亜型と株に分類されている。インフルエンザワクチンとしては、ＮＡ蛋白及びＨＡ蛋白を含む原液にアジュバントや防腐剤等を添加したものが広く利用されている。
【０００５】
インフルエンザワクチンに使用されるインフルエンザウイルスは主として胚含有鶏卵により培養されたものが用いられている。また、近年動物細胞培養系でインフルエンザウイルスを培養する方法も確立されている。
【０００６】
一般にこれらの方法により得られるインフルエンザウイルスは単独で存在するものではなく、培養細胞、夾雑蛋白質等とともに存在しているため、培養液等からインフルエンザウイルスを分離する必要がある。インフルエンザウイルスの分離、精製は超遠心法、限外ろ過法、密度勾配遠心法等により行われている。
【０００７】
しかしながら、これらの方法によって分離、精製したインフルエンザウイルス中においても宿主由来の夾雑蛋白質がしばしば確認される。これらの夾雑蛋白質が存在するインフルエンザワクチンを接種した場合、アナフィラキシーショックやギランバレー症候群などの副作用を示す懸念があるため、さらなる精製が必要となる。
【０００８】
また、インフルエンザ抗原の製造方法として、動物細胞や昆虫細胞に、インフルエンザウイルスに含まれるタンパク質抗原を製造する遺伝子を組み込む方法が知られている。
【０００９】
インフルエンザウイルスを精製する方法としては、例えばヒドロキシアパタイトを用いてインフルエンザウイルスまたはインフルエンザウイルス抗原を精製する方法が既に知られている（特許文献１）。特許文献１の方法は、ウイルスまたはウイルス抗原をヒドロキシアパタイトに吸着させる工程、および溶出液により溶出させる工程から成る。しかしながら、インフルエンザウイルスには種々の株が存在し、それぞれの株でＨＡ蛋白やＮＡ蛋白の配列が異なっていることから、溶出条件を一定にした場合、インフルエンザウイルスの株によって溶出位置が変化し、精製度が株毎に異なってしまう可能性がある。このため、吸着した蛋白質の溶出条件をインフルエンザウイルス株毎に厳密に規定する必要があり、製造上非常に煩雑である。
【００１０】
特許文献２には、ＨＡ蛋白が特定の糖鎖へ特異的に吸着する性質を利用して、シアロ糖鎖保有化合物を固定化した担体を用いた組換ＨＡ蛋白の精製方法が示されている。しかしながら、この方法では、シアロ糖鎖保有化合物を固定化した担体の作成に多大な労力を必要とすること、インフルエンザウイルス株においてＨＡ蛋白に大きな変異が生じた場合に精製困難となる可能性があるなどの問題点があった。
【００１１】
非特許文献１には、動物細胞（昆虫細胞）にインフルエンザウイルスのＨＡ蛋白を生成する情報を持った遺伝子を、遺伝子組み換え法で組み込んだ遺伝子組換え細胞を製造し、この細胞を培養して、ＨＡ蛋白を製造する方法が記載されている。この方法は、遺伝子組換え細胞に由来する夾雑蛋白質を徹底的に除去する必要があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２０００−２６２２８０号公報
【特許文献２】特許第３４７６２４２号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Vaccine 24 (2006) 2176-2185 Expression and purification of an influenza hemagglutinin−one step closer to a recombinant protein-based influenza vaccine
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、インフルエンザウイルス抗原を含むインフルエンザウイルス培養液や、インフルエンザ抗原を生成する遺伝子を組み込んだ遺伝子組換え細胞の培養液から、簡便な方法により効率よく宿主蛋白質等の夾雑物を除去し、インフルエンザウイルス抗原を分離・精製することができる手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、鋭意研究の結果、鶏卵培養系や動物細胞培養系により培養されたインフルエンザウイルス培養液等のインフルエンザ抗原を含有する試料を粗精製後、界面活性剤で処理し、適宜遠心分離やフィルター分離等を行なった後、界面活性剤の共存下でヒドロキシアパタイトと接触させると、培養液中の夾雑物がヒドロキシアパタイトに吸着され、ＨＡ蛋白等のインフルエンザウイルス抗原が非吸着画分中に高精製度で得られることを見出し、本願発明を完成した。
【００１６】
すなわち、本発明は、インフルエンザウイルス抗原を含有する試料を界面活性剤で処理する工程と、前記処理後の試料を前記界面活性剤の共存下でヒドロキシアパタイトと接触させる工程と、ヒドロキシアパタイト非吸着画分を回収する工程を含む、精製インフルエンザウイルス抗原の製造方法を提供する。また、本発明は、上記本発明の方法により精製インフルエンザウイルス抗原を製造することを含む、インフルエンザワクチンの製造方法を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の方法により製造された精製インフルエンザウイルス抗原を含むインフルエンザワクチンと、インフルエンザワクチンを接種可能な容器に充填したプレフィルドキットを提供する。さらに、本発明は、上記本発明の方法により製造された精製インフルエンザウイルス抗原を含むインフルエンザ診断試薬を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の方法により製造された精製インフルエンザウイルス抗原を含むインフルエンザ診断キットを提供する。
【００１７】
なお、本明細書では特に断りのない限り、試料中の各成分の濃度及びｐＨ値は試料とヒドロキシアパタイトと接触させる直前の濃度を指す。また、濃度の単位の％は特に断りのない限りｗ／ｖ％である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、種々の夾雑物を含むインフルエンザウイルス抗原を含む試料からＨＡ蛋白等の抗原タンパク質を簡単な操作で、高精製度の精製インフルエンザウイルス抗原とすることができ、しかもこれを高回収率で取得することができる。本発明の方法によれば、アナフィラキシーショックなど重篤な副作用を示す懸念の少ない、ワクチンとして有用な安全性および有効性の高い精製インフルエンザウイルス抗原を経済的に得ることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】実施例１におけるヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーの結果及び各フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元銀染色）の結果を示す図である。
【図２】実施例１におけるヒドロキシアパタイトによる精製前後の試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元銀染色）の結果を示す図である。
【図３】実施例２におけるヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーの結果及び各フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元銀染色）の結果を示す図である。
【図４】実施例３におけるヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーの結果及び各フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元銀染色）の結果を示す図である。
【図５】実施例３における各精製工程サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元、ＣＢＢ染色）の結果を示す図である。
【図６】実施例４で得られた各画分についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元、ＣＢＢ染色）を行った結果を示す図である。
【図７】実施例５で得られた各上清及び各沈殿画分についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元， ＣＢＢ染色）を行った結果を示す図である。
【図８】実施例６で得られた各画分についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元銀染色）を行った結果を示す図である。
【図９】実施例７におけるヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーの結果及び各フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元銀染色）の結果を示す図である。
【図１０】参考例におけるＣＨＡＰＳ非添加試料のヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーの結果及び各フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元、ＣＢＢ染色）の結果を示す図である。
【図１１】参考例におけるＣＨＡＰＳ添加試料のヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーの結果及び各フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元、ＣＢＢ染色）の結果を示す図である。
【図１２】実施例８におけるヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーの結果及び各フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元銀染色）の結果を示す図である。
【図１３】実施例８におけるヒドロキシアパタイトによる精製前後の試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元銀染色）の結果を示す図である。
【図１４】実施例９で得られた各画分についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元、ＣＢＢ染色）を行った結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
インフルエンザウイルス抗原は、インフルエンザウイルスの一部又はその同等物であればよい。インフルエンザウイルス抗原は、例えばＨＡ蛋白、ＮＡ蛋白、Ｍ２蛋白等のウイルス表面に存在する蛋白やＭ１蛋白、ＮＰ蛋白等のウイルス内部に存在する蛋白のいずれも使用可能であり、ＨＡ蛋白が好適に用いられる。ＨＡ蛋白の製造はインフルエンザウイルスの培養液を原料としてもよく、ＨＡ蛋白合成遺伝子を組み込んだ遺伝子組換え細胞の培養液を原料としてもよい。
【００２１】
本発明の精製インフルエンザウイルス抗原の製造方法は、インフルエンザウイルス抗原を含む試料を界面活性剤で処理する工程と、前記処理後の試料を前記界面活性剤の共存下でヒドロキシアパタイトと接触させる工程と、ヒドロキシアパタイト非吸着画分を回収する工程を含む。本発明の方法では、ヒドロキシアパタイトは、試料中の夾雑物を吸着させて除去するために用いられ、インフルエンザウイルス抗原は非吸着画分中に得られる。
【００２２】
本発明の方法に供されるインフルエンザウイルス抗原を含む試料としては、動物細胞を宿主として用いる動物細胞培養系又は鶏卵を宿主として用いる鶏卵培養系によりインフルエンザウイルスを増殖させた培養液や、ＨＡ蛋白合成遺伝子などのインフルエンザウイルス抗原を製造する遺伝子を組み込んだ遺伝子組換え細胞培養系の培養液等が挙げられる。
【００２３】
鶏卵培養系や動物細胞培養系でインフルエンザウイルスを増殖させた培養液中には、宿主に由来するタンパク質等の夾雑物が多量に含まれている。本発明の方法によれば、このような夾雑物を簡便な操作で効率良く除去し、精製度の高いインフルエンザウイルス抗原を得ることができる。
【００２４】
動物細胞培養系及び鶏卵培養系はこの分野で公知であり、そのような公知の培養系のいずれを用いてもよい。動物細胞培養系では、例えば牛、馬、豚、羊、イヌ、サル等の哺乳類、ニワトリ、ガチョウ、アヒル等の鳥類、及びマウス等から単離された組織又は培養細胞が使用可能であり、ＣＨＯ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｐｅｒ.Ｃ６細胞、ＥＢ６６細胞等が好適に用いられる。
【００２５】
培養液中で増殖させたインフルエンザウイルスは、通常、一般に用いられる精製工程、例えば限外ろ過法、密度勾配遠心法等により培養液から分離され、粗精製インフルエンザウイルス液として調製される。本発明の方法では、このような粗精製インフルエンザウイルス液がインフルエンザウイルス抗原を含む試料として好適に用いることができる。
【００２６】
本発明の方法に供されるインフルエンザウイルス抗原を含む試料は、インフルエンザウイルス培養液に限定されない。昆虫細胞や動物細胞にインフルエンザウイルス抗原を生成する遺伝子を遺伝子組換え法により導入し、生成したインフルエンザウイルス抗原についても本発明の方法により精製することができる。
【００２７】
ＨＡ蛋白遺伝子を組み込む動物細胞や昆虫細胞は特に限定されず、昆虫細胞はヨトウガ、カイコ、動物細胞はイヌ、ネコ、サル、ブタ、ウシ、マウス等の哺乳類や、ニワトリ、ガチョウ、アヒル等の鳥類が挙げられる。宿主細胞は、増殖効率が高い昆虫細胞や、アレルギーの発生源が少ない哺乳類が好ましく、動物細胞としてはＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＭＤＣＫ細胞等が、昆虫細胞としてはＳＦ−９細胞、ＳＦ−２１細胞等が好適に用いられる。また、インフルエンザウイルス抗原の遺伝子の塩基配列は周知であり、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＥＵ１０３８２４等に記載されている。この塩基配列に基づき、インフルエンザウイルス抗原を遺伝子組換え法により調製することが可能である（例えば非特許文献１参照）。また、遺伝子組換え法により調製されたインフルエンザウイルス抗原は市販されているので、このような市販品を本発明の方法に適用することもできる。
【００２８】
インフルエンザウイルス抗原含有試料を処理する界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤及び陰イオン性界面活性剤から選択される１種以上を用いることができる。
【００２９】
非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（例えば、商品名エマルゲン２２０、エマルゲン１０４Ｐ、エマルゲン１０８、エマルゲン４０８など＜花王社製＞）、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（例えば、商品名エマルゲン９０３、エマルゲン９０９、エマルゲン９１３など＜花王社製＞）、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン縮合物（例えば、商品名プルロニックＦ８８（旭電化社製））、アシルポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えば、商品名Ｔｗｅｅｎ２１、Ｔｗｅｅｎ８１、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ８５、Ｅｍａｓｏｌ４１３０など）、アルキルポリオキシエチレンエーテル（例えば、商品名ＡｔｌａｓＧ２１２７、Ｂｒｉｊ３６Ｔ、Ｂｒｉｊ５６など）、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、シュークロースモノラウレート、ポリオキシエチレンラウリルエーテル（商品名エマルゲン１２０など＜花王社製＞）、ポリオキシエチレンアルキレンフェニルエーテル（商品名エマルゲンＡ６０など）、ポリオキシエチレンアルキレントリベンジルフェニルエーテル（商品名エマルゲンＢ６６など）、ポリオキシエチレングリコールp-t-オクチルフェニルエーテルポリオキシエチレングリコール（商品名Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、ポリオキシエチレン高級アルコールエーテル（商品名エマルゲン７０５、エマルゲン７０９など＜花王社製＞）、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルアミン、グリセリン脂肪酸エステル、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ポリオキシエチレングリコールモノドデシルエーテル、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシド、ポリオキシエチレンモノラウレート等が挙げられる。特に好ましくは、ポリオキシエチレングリコールｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテルが挙げられる。
【００３０】
両性界面活性剤としてはベタイン誘導体、アルキルベタイン誘導体、イミダゾリウムベタイン誘導体、スルホベタイン誘導体、アミノカルボン酸誘導体、イミダゾリン誘導体、アミンオキサノイド誘導体、胆汁酸誘導体等であることが挙げられ、特に好ましくはＤＤＡ ［（２−（Ｎ−Ｄｏｄｅｃｙｌ−Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ） Ａｃｅｔａｔｅ］、ＤＤＳＡ ［Ｄｏｄｅｃｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌ （３−ｓｕｌｆｏｐｒｏｐｙｌ）ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ］、ＣＨＡＰＳ［３−（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｅｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｐＨｏｎａｔｅ］が挙げられる。
【００３１】
陰イオン性界面活性剤としては、ラウリル硫酸、ドデシルスルホン酸、ラウロサルコシン、ドデシルベンゼンスルホン酸、カゼイン酸、ラウロイル−β−アラニン、コール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、脂肪酸塩等が挙げられる。陰イオン性界面活性剤は、これらの化合物のナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩であってもよい。デオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ）が好適に用いられる。
【００３２】
これらの界面活性剤は単独で用いてもよく、また複数を組み合わせて用いてもよい。複数を組み合わせる場合は、非イオン系界面活性剤と両性界面活性剤を組み合わせて用いてもよいし、非イオン系界面活性剤と陰イオン性界面活性剤を組み合わせて用いてもよいし、両性界面活性剤と陰イオン性界面活性剤を組み合わせて用いてもよいし、三者を組み合わせて用いてもよい。また、非イオン性界面活性剤同士又は両性界面活性剤同士又は陰イオン性界面活性剤同士を組み合わせて用いてもよい。
【００３３】
界面活性剤による処理は、例えば、インフルエンザウイルス抗原含有試料中に界面活性剤を添加し、０℃〜室温程度で３０分間〜２時間程度撹拌することにより行なうことができる。界面活性剤による処理濃度（ヒドロキシアパタイトに接触させる直前の濃度）は、通常、インフルエンザウイルス抗原含有試料全体に対する界面活性剤の有効成分の濃度として０．０５％〜２０％が好ましく、０．１％〜２０％が更に好ましく、０．１％〜５％が更に好ましい。ただし、処理に適した界面活性剤濃度は界面活性剤の種類によって異なり、必ずしもこの範囲には限定されない。例えば、ＣＨＡＰＳでは０．５％〜２０％が好ましく、１％〜１５％が更に好ましい。ポリオキシエチレングリコールp-t-オクチルフェニルエーテルでは０．０５％〜３％が好ましく、０．１％〜２％が更に好ましい。デオキシコール酸又はデオキシコール酸塩では１％〜２０％が好ましく、１．５％〜１５％が更に好ましい。
【００３４】
必要に応じて界面活性剤処理後の試料から試料溶液中の不溶物を除去する。不溶物を除去する方法としては、遠心分離、超遠心分離、フィルター濾過等を挙げることができる。この不溶物除去工程により、夾雑物の多くを除去することができるので、ヒドロキシアパタイトによる夾雑物の吸着除去と組み合わせることで非常に効率の良い精製が可能となる。
【００３５】
次いで、界面活性剤処理後の試料溶液をヒドロキシアパタイトと接触させる。本発明では、界面活性剤共存下でヒドロキシアパタイトとインフルエンザウイルス抗原含有試料溶液とを接触させることが重要である。界面活性剤が存在しない状態でヒドロキシアパタイトとインフルエンザウイルス抗原とを接触させると、インフルエンザウイルス抗原がヒドロキシアパタイトに吸着することが確認されている（下記参考例参照）。本発明において、界面活性剤処理後の試料溶液中にはすでに界面活性剤が存在しているため、処理後の溶液をそのままヒドロキシアパタイトと接触させればよい。ただし、処理後の溶液にさらに界面活性剤を追加することは差し支えない。
【００３６】
好ましくは、界面活性剤処理後の試料は、ｐＨ６〜１０、より好ましくはｐＨ６〜９、さらに好ましくはｐＨ６．５〜９の条件下でヒドロキシアパタイトと接触させる。ｐＨがこの範囲よりも低いとインフルエンザウイルス抗原を非吸着画分中に得ることが困難になり、また、ｐＨがこの範囲よりも高いと夾雑物の吸着除去の効率が低下する（下記実施例参照）。
【００３７】
本発明で用いるヒドロキシアパタイトの種類は特に限定されず、商業的に入手可能ないずれのヒドロキシアパタイトを用いてもよい。例えば、カラムの充填剤として市販されているヒドロキシアパタイトを使用することができる。好ましい例としては、約２０〜５０μｍの粒径および約８００オングストロームの孔径を有するセラミックヒドロキシアパタイトが挙げられる。そのような商業的に入手可能なヒドロキシアパタイトは、例えばＢｉｏ−Ｒａｄから「セラミック・ヒドロキシアパタイトＩ型」あるいは「セラミック・ヒドロキシアパタイトＩＩ型」として販売されているものが挙げられる。
【００３８】
界面活性剤処理後の試料とヒドロキシアパタイトとを接触させる具体的な操作は限定されず、サンプルの濃度や量、使用するヒドロキシアパタイトの形態等により適宜選択可能である。例えば、試料中にヒドロキシアパタイトを投入するバッチ式や、ヒドロキシアパタイトが充填されたカラム内に試料を添加する方法等が挙げられる。
【００３９】
バッチ法では、例えば、界面活性剤処理後の試料から濾過、遠心分離等により不溶物を除去した後、試料中にヒドロキシアパタイトを投入する。このとき試料はあらかじめ適当な緩衝液等を用いてｐＨ６〜１０程度、好ましくはｐＨ６〜９程度、より好ましくはｐＨ６．５〜９に調整しても良い。界面活性剤をさらに試料に追加してもよいが、処理後の溶液中に界面活性剤がすでに存在しているため、そのまま界面活性剤を追加せずにヒドロキシアパタイトを投入することが簡便である。ヒドロキシアパタイトを投入後、０℃〜室温程度にて適宜撹拌下１５分間〜１時間程度接触させて、試料中の夾雑物を吸着させる。精製インフルエンザウイルス抗原は非吸着画分中に得ることができるので、ヒドロキシアパタイトを濾過等により除去して上清を得ればよい。
【００４０】
ヒドロキシアパタイトをカラムに充填させて用いる方法では、例えば、リン酸緩衝液等の緩衝液でカラムを平衡化した後、界面活性剤処理後の試料をカラムに添加し、平衡化に用いた緩衝液等で展開する。インフルエンザウイルス抗原はヒドロキシアパタイトに吸着せずに素通りするため、非吸着画分を分取して精製インフルエンザウイルス抗原を得ることができる。この溶出した画分は主としてＨＡ蛋白を含んでおり、このままでもかなり精製されているが、再度同じクロマトグラフィーによりさらに精製してもよく、また必要により限外ろ過、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過等の手段により更に精製してもよい。緩衝液のｐＨは６〜１０が好ましく、ｐＨ６〜９がより好ましく、ｐＨ６．５〜９がさらに好ましい。
【００４１】
使用できる緩衝液としては、リン酸緩衝液の他、例えば、ＭＥＳ ［２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸］、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ ［ビス−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ］トリス−（ヒドロキシメチル）メタン］、ＡＤＡ ［Ｎ−２−アセトアミドイミノ二酢酸・一ナトリウム塩］、ＡＣＥＳ ［Ｎ−２−アセトアミド−２−アミノエタンスルホン酸］、ＰＩＰＥＳ［ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタン−スルホン酸）］、ＭＯＰＳＯ ［（３−Ｎ−モルホリノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸］、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ ＰＲＯＰＡＮＥ ［１，３−ビス［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］プロパン］、ＢＥＳ ［Ｎ，Ｎ−ビス−（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノ−エタンスルホン酸］、ＴＥＳ ［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタン−スルホン酸および２−２（［２−ヒドロキシ−１，１−ビス（ヒドロキシメチル）エチル］アミノ）エタンスルホン酸］、ＨＥＰＥＳ ［Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタン−スルホン酸］、ＤＩＰＳＯ ［３−（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ）−２−ヒドロキシ−プロパンスルホン酸］、ＴＡＰＳＯ ［３−Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］−２−ヒドロキシ−プロパンスルホン酸］、ＴＲＩＳ ［トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン］、ＨＥＰＰＳＯ ［Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン−Ｎ’−［２−ヒドロキシ−プロパンスルホン酸］］、ＰＯＰＳＯ ［（ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス［２−（ヒドロキシプロパンスルホン酸）］、ＥＰＰＳ ［Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］−ピペラジン−Ｎ’−［３−プロパンスルホン酸およびＨＥＰＰＳ］、ＴＥＡ ［トリエタノールアミン］、ＴＲＩＣＩＮＥ ［Ｎ［トリス−（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン］、ＢＩＣＩＮＥ ［Ｎ，Ｎ−ビス−（２−ヒドロキシエチル）］−グリシン）、ＴＡＰＳ ［３−｛［トリス−（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝−プロパンスルホン酸］、イミダゾール、ＨＥＰＰＳ ［Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−３−プロパン−スルホン酸］、グリシンアミド塩酸塩、グリシルグリシン、クエン酸塩、酢酸塩、ホウ酸塩、およびコハク酸塩緩衝液が挙げられる。
【００４２】
また、これらの緩衝液には塩類及び／又は界面活性剤を含んでも良い。使用できる塩類としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、塩化物、臭化物、酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩が挙げられる。具体的には、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、臭化アンモニウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、クエン酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸カルシウム、酢酸マグネシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸アンモニウム等が挙げられる。界面活性剤については先に挙げたものが使用可能であるが、これらに限定されない。
【００４３】
緩衝液の適切な組成については、当業者は当技術分野での既知の知識を指針として、適宜選択することできる。
【００４４】
ヒドロキシアパタイトと接触後の非吸着画分に含まれる界面活性剤は、適宜限外濾過等により除去することができる。
【００４５】
以上のようにして精製されたインフルエンザウイルス抗原は、その精製度が高く、界面活性剤、鶏卵や動物細胞や遺伝子組み換え細胞由来のＤＮＡ等の夾雑物がほとんど含まれていない。、インフルエンザウイルス抗原にアジュバントや防腐剤等を添加し、インフルエンザワクチンとして使用できる。インフルエンザワクチンは、シリンジや接種作業に使用可能なカートリッジ等に充填し、プレフィルドシリンジ等、接種可能なプレフィルドキットとしてもよい。
【００４６】
非吸着画分として得られる精製インフルエンザウイルス抗原液は、原液のまま、又は診断用組成物等として、インフルエンザ診断キットの一部として使用できる。また、周知の方法により精製インフルエンザウイルス抗原を免疫原として用いて抗インフルエンザ抗体を作製し、この抗体を含む試薬をインフルエンザ診断試薬の一部や、インフルエンザ診断キットの一部として使用することもできる。
【実施例】
【００４７】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００４８】
実施例１
培養したメディン−ダービーイヌ腎（ＭＤＣＫ）細胞にインフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１株）を接種し増殖させた。得られた培養上清をろ過、限外ろ過、ショ糖密度勾配遠心法により粗精製し、β−プロピオラクトンによりインフルエンザウイルスの不活化を行った。不活化されたインフルエンザウイルス液について限外ろ過を行い、溶媒を６．７ｍＭリン酸緩衝生理食塩水に置換し、粗精製インフルエンザウイルス液を得た。
【００４９】
粗精製インフルエンザウイルス液１０ｍＬに１０％ＣＨＡＰＳを含む６．７ｍＭリン酸緩衝生理食塩水１０ｍＬを加えて、室温で１時間攪拌後、２００，０００×ｇ、３０分、１５℃の条件で超遠心した。超遠心後、上清を回収し、カラムクロマトグラフィーの試料とした。
【００５０】
内径０．５ｃｍ、高さ１６ｃｍのカラムにヒドロキシアパタイト樹脂（Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ Ｔｙｐｅ Ｉ ４０μｍ， Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を１．８ｍＬ充填し、５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）流速０．５ｍＬ／ｍｉｎで平衡化した後、試料２０ｍＬを添加し、５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で展開した。素通り画分（非吸着画分）を分取して精製インフルエンザウイルス抗原液とした。吸着した画分は５ｍＭから４００ｍＭのリン酸緩衝液のリニアグラジエントにより溶出した。精製インフルエンザウイルス抗原液は、さらにＶＩＶＡＦＬＯＷ５０（ザルトリウス社製）を用いた限外ろ過によりＣＨＡＰＳを除去し、溶媒を６．７ｍＭリン酸緩衝生理食塩水に置換した後、０．２２μｍフィルター（ミリポア社製、ＳＬＬＧ０２５ＳＳ）を用いてフィルターろ過を行い、１５ｍＬの精製インフルエンザウイルス抗原液を得た。
【００５１】
ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー及び各フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元銀染色）の結果を図１に示す。なお、グラジエントはＡ液（５ｍＭリン酸緩衝液）とＢ液（４００ｍＭリン酸緩衝液）を混合して作製しており、図中のＣｏｎｃＢ（％）はＢ液の混合割合を示す（例えば、ＣｏｎｃＢ ０％溶液：Ａ液１００％＋Ｂ液０％、ＣｏｎｃＢ ５０％溶液：Ａ液５０％＋Ｂ液５０％、ＣｏｎｃＢ １００％溶液：Ａ液０％＋Ｂ液１００％を意味する）。また、精製前後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元銀染色）の結果を図２に、精製されたインフルエンザ抗原についてＤＮＡ分析、ＣＨＡＰＳ分析、総蛋白質量分析を行った結果を表１に示す。表１中のＨＡ蛋白含量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後ＣＢＢ染色を行い、画像解析によりＨＡ蛋白含量率を計算し、その値を総蛋白質量に乗じた値である。
【００５２】
ＨＡ含量から計算されるＨＡ蛋白の回収率は７２％であった。また宿主由来のＤＮＡや、精製工程で添加したＣＨＡＰＳなどの不純物は一連の精製工程において非常に低いレベルまで除去されていた。
【００５３】
【表１】
【００５４】
実施例２
実施例１と同様にして、ＭＤＣＫ細胞により増殖させたインフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１株）培養液から粗精製インフルエンザウイルス液を調製した。該粗精製液１ｍＬに１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む６．７ｍＭリン酸緩衝生理食塩水１ｍＬを加えて、室温で１時間攪拌後、２００，０００×ｇ、３０分、１５℃の条件で超遠心した。超遠心後、上清を回収し、カラムクロマトグラフィーの試料とした。
【００５５】
内径０．５ｃｍ、高さ９ｃｍのカラムにヒドロキシアパタイト樹脂（Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ Ｔｙｐｅ Ｉ ４０μｍ， Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を１ｍＬ充填し、５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）流速０．５ｍＬ／ｍｉｎで平衡化した後、試料２ｍＬを添加し、４００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で展開した。素通り画分（非吸着画分）を分取して精製インフルエンザウイルス抗原液を得た。吸着した画分は５ｍＭから４００ｍＭのリン酸緩衝液のリニアグラジエントにより溶出した。
【００５６】
ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー及び各フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元銀染色）の結果を図３に示す。なお、図中のＣｏｎｃＢ（％）の意味は実施例１と同様である。
【００５７】
界面活性剤としてＴｒｉｔｏｎＸ−１００を用いた場合でも、ヒドロキシアパタイトを用いることにより、効率よく精製インフルエンザウイルス抗原の製造が可能であることが示された。
【００５８】
実施例３
インフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１株）を孵化鶏卵に接種して増殖させて、尿膜腔液中に遊出したインフルエンザウイルス培養液を限外ろ過、バリウム処理、ショ糖密度勾配遠心法により粗精製し、β−プロピオラクトンによりインフルエンザウイルスの不活化を行った。不活化されたインフルエンザウイルス液について限外ろ過を行い、溶媒を６．７ｍＭリン酸緩衝生理食塩水に置換し、粗精製インフルエンザウイルス液を得た。
【００５９】
粗精製インフルエンザウイルス液５ｍＬに１０％ＣＨＡＰＳを含む６．７ｍＭリン酸緩衝生理食塩水５ｍＬを加えて、室温で１時間攪拌後、孔径０．２２μｍのメンブレンフィルターによりろ過し、ろ液をカラムクロマトグラフィーの試料とした。
【００６０】
内径０．５ｃｍ、高さ１６ｃｍのカラムにヒドロキシアパタイト樹脂（Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ Ｔｙｐｅ Ｉ ４０μｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製））を１．８ｍＬ充填し、５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）流速０．５ｍＬ／ｍｉｎで平衡化した後、試料６ｍＬを添加し、５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で展開した。素通り画分（非吸着画分）を分取して精製インフルエンザウイルス抗原液とした。精製インフルエンザウイルス抗原液は、さらにＶＩＶＡＦＬＯＷ５０（ザルトリウス社製）を用いた限外ろ過によりＣＨＡＰＳを除去し、溶媒を６．７ｍＭリン酸緩衝生理食塩水に置換した後、０．２２μｍフィルター（ミリポア社製、ＳＬＬＧ０２５ＳＳ）を用いてフィルターろ過（無菌ろ過）を行い、１５ｍＬの精製インフルエンザウイルス抗原液を得た。吸着した画分は４００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で、次いで０Ｍから１Ｍ ＮａＯＨのリニアグラジエントにより溶出し、溶出画分を得た。
【００６１】
ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー及び各フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元銀染色）の結果を図４に示す。なお、グラジエントはＡ液（４００ｍＭリン酸緩衝液）とＢ液（１Ｍ ＮａＯＨ）を混合して作成しており、図中のＣｏｎｃＢ（％）はＢ液の混合割合を示す。各精製工程サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元、ＣＢＢ染色）の結果を図５に示す。また、精製されたインフルエンザウイルス抗原について総蛋白質量、ＣＨＡＰＳ分析を行った結果を表２に示す。表中のＨＡ蛋白含有量はＳＤＳ−ＰＡＧＥ後ＣＢＢ染色を行い画像解析によりＨＡ蛋白含有率を計算し、その値を総蛋白質量に乗じた値である。
【００６２】
ＨＡ蛋白含量から計算されるＨＡ蛋白の回収率は４２％であった。また精製工程で添加したＣＨＡＰＳは一連の精製工程において非常に低いレベルまで除去されていた。
【００６３】
【表２】
【００６４】
実施例４
実施例１と同様にして、ＭＤＣＫ細胞により増殖させたインフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１株）から粗精製インフルエンザウイルス液を調製した。該粗精製液１ｍＬに１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む６．７ｍＭリン酸緩衝生理食塩水１ｍＬを加えて、室温で１時間攪拌後、２００，０００×ｇ、３０分、１５℃の条件で超遠心法で分離し、上清を回収した。上清０．２ｍＬにヒドロキシアパタイト樹脂（Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ Ｔｙｐｅ Ｉ ４０μｍ， Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を０．２ｍＬ添加し、３０分間攪拌した後、遠心ろ過フィルター（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ，ミリポア社製）に移し、１５，０００×ｇ、３０秒間遠心し、透過液を非吸着画分として採取した。上部に残ったヒドロキシアパタイト樹脂は０．２５ｍＬの６．７ｍＭリン酸緩衝生理食塩水を加えて攪拌後、同様に遠心して洗浄する操作を３回繰り返し、透過液を洗浄画分として採取した。次に２５０ｍＭリン酸緩衝液を加えて攪拌後、同様に遠心して溶出を行い、透過液を溶出画分（リン酸）として採取した。さらに０．１Ｍ ＮａＯＨ溶液０．２５ｍＬを加え同様に遠心して溶出を行い、透過液を溶出画分（ＮａＯＨ）として採取した。得られた透過液についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元、ＣＢＢ染色）を行った。結果を図６に示す。
【００６５】
実施例５
実施例１と同様にして、ＭＤＣＫ細胞により増殖させたインフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１株）から粗精製インフルエンザウイルス液を調製した。該粗精製液０．１５ｍＬに、表３に示した濃度の各種界面活性剤を添加した６．７ｍＭリン酸緩衝生理食塩水０．１５ｍＬを添加した。すなわち、界面活性剤処理系内の界面活性剤濃度は表３記載の濃度の２分の１であった。室温で１時間攪拌後、５５０，０００×ｇ、１５℃、３０分の条件で超遠心した。超遠心後、上清及び沈殿画分をそれぞれ回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元， ＣＢＢ染色）を行った結果を図７に示す。図７から明らかなように、ＣＨＡＰＳを添加し、超遠心を行った上清が最もＨＡ蛋白以外の夾雑蛋白が少なかった。ＣＨＡＰＳを用いた場合には、界面活性剤処理の段階からインフルエンザウイルス抗原を高度に精製することが可能であることが示された。なお、表中の「ＤＯＣ」はデオキシコール酸ナトリウムを表す。
【００６６】
【表３】
【００６７】
実施例６
実施例１と同様にして、ＭＤＣＫ細胞により増殖させたインフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１株）から粗精製インフルエンザウイルス液を調製した。該粗精製液１ｍＬに１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む６．７ｍＭリン酸緩衝液１０ｍＬを加えて、室温で１時間攪拌後、２００，０００ ×ｇ、３０分、１５℃の条件で超遠心した。超遠心後、上清を回収し、カラムクロマトグラフィーの試料とした。
【００６８】
内径０．５ｃｍ、高さ９ｃｍのカラムにヒドロキシアパタイト樹脂（Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ Ｔｙｐｅ Ｉ ４０μｍ， Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を１ｍＬ充填し、各種ｐＨの５ｍＭリン酸緩衝液を用いて流速０．５ｍＬ／ｍｉｎで平衡化した後、試料１ｍＬを添加した。各種ｐＨの５ｍＭリン酸緩衝液で展開し、素通り画分（非吸着画分）を分取した。吸着した画分は０Ｍから０．１ＭのＮａＯＨのステップワイズグラジエント（Ａ液：５ｍＭリン酸緩衝液、Ｂ液：０．１ＭのＮａＯＨ溶液）により溶出し、吸着画分１、２を得た。これらの画分についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元銀染色）を行った結果を図８に示す。ｐＨ５．８では素通り画分に蛋白質はほとんど認められず、インフルエンザウイルス抗原も含め大部分の蛋白質がヒドロキシアパタイト樹脂に吸着していた。ｐＨ６．２以上では素通り画分にＨＡ蛋白を主とする蛋白質の存在が確認された。
【００６９】
実施例７
実施例３と同様にして、孵化鶏卵に接種して増殖させたインフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１株）から粗精製インフルエンザウイルス液を調製した。該粗精製液１ｍＬに５％デオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ）を含む６．７ｍＭリン酸緩衝液１ｍＬを加えて、室温で１時間攪拌後、孔径０．２２μｍのメンブレンフィルターによりろ過し、ろ液をカラムクロマトグラフィーの試料とした。
【００７０】
内径０．５ｃｍ、高さ９ｃｍのカラムにヒドロキシアパタイト樹脂（Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ Ｔｙｐｅ ＩＩ ４０μｍ， Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を０．９ｍＬ充填し、６０ｍＭ ＮａＣｌを含む５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で流速０．５ｍＬ／ｍｉｎで平衡化した後、試料１ｍＬを添加し、６０ｍＭ ＮａＣｌを含む５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で展開した。素通り画分を分取して精製インフルエンザウイルス抗原液を得た。吸着した画分は、実施例３と同様にして、４００ｍＭリン酸緩衝液により溶出し、次いで０Ｍから１Ｍ ＮａＯＨのリニアグラジエントにより溶出した。
【００７１】
ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー及び各フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元銀染色）の結果を図９に示す。なお、図中のＣｏｎｃＢ（％）の意味は実施例３と同様である。
【００７２】
界面活性剤としてＤＯＣを用いた場合でもヒドロキシアパタイトを用いることにより、効率よくインフルエンザウイルス抗原の精製が可能であることが示された。
【００７３】
参考例
実施例１と同様の方法でヒドロキシアパタイト樹脂を用いて精製し、ＣＨＡＰＳを除去した精製インフルエンザウイルス抗原０．５ｍＬに、６．７ｍＭリン酸緩衝液０．５ｍＬを添加したものをＣＨＡＰＳ非添加試料、１０％ＣＨＡＰＳを含む６．７ｍＭリン酸緩衝液０．５ｍＬを添加したものをＣＨＡＰＳ添加試料とした。
【００７４】
内径０．５ｃｍ、高さ９ｃｍのカラムにヒドロキシアパタイト樹脂（Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ Ｔｙｐｅ Ｉ ４０μｍ， Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を０．９ｍＬ充填し、５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて流速０．５ｍＬ／ｍｉｎで平衡化した後、試料０．５ｍＬを添加し、５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で展開した。素通り画分（非吸着画分）を１ｍＬずつ分取した。吸着した画分は、実施例１と同様の５ｍＭから４００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）のリニアグラジエントにより溶出し、１ｍＬずつ分取した。
【００７５】
ＣＨＡＰＳ非添加試料のヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー及び各フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元、ＣＢＢ染色）の結果を図１０に、ＣＨＡＰＳ添加試料の結果を図１１に示す。なお、図中のＣｏｎｃＢ（％）の意味は実施例１と同様である。
【００７６】
ＣＨＡＰＳ非添加試料ではほとんどのＨＡ蛋白が吸着し、４００ｍＭリン酸緩衝液による溶出でも僅かに溶出される程度であったが、ＣＨＡＰＳ添加試料では素通り画分にＨＡ蛋白が溶出された。
【００７７】
実施例８
培養したメディン−ダービーイヌ腎（ＭＤＣＫ）細胞にインフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ１株）を接種し増殖させた。得られた培養上清をろ過、限外ろ過、ショ糖密度勾配遠心法により粗精製し、β−プロピオラクトンによりインフルエンザウイルスの不活化を行った。不活化されたインフルエンザウイルス液について限外ろ過を行い、溶媒を６．７ｍＭリン酸緩衝生理食塩水に置換し、粗精製インフルエンザウイルス液を得た。
【００７８】
粗精製インフルエンザウイルス液７５ｍＬに１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む６．７ｍＭリン酸緩衝液７５ｍＬを加えて、室温で９０分間攪拌後、０．２２μｍフィルター（ミリポア社製、ステリカップ−ＧＶ）を用いてフィルターろ過を行い、カラムクロマトグラフィーの試料とした。
【００７９】
内径２．６ｃｍ、高さ２０ｃｍのカラムにヒドロキシアパタイト樹脂（Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ Ｔｙｐｅ Ｉ ４０μｍ， Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を５６ｍＬ充填し、６０ｍＭ ＮａＣｌ及び０．５％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で流速０．５ｍＬ／ｍｉｎで平衡化した後、試料１５０ｍＬを添加し、平衡化に用いた緩衝液で展開した。素通り画分（非吸着画分）を分取して精製インフルエンザウイルス抗原液とした。吸着した画分は４００ ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で、次いで０Ｍから１Ｍ ＮａＯＨのリニアグラジエントにより溶出し、溶出画分を得た。精製インフルエンザウイルス抗原液は、さらにイオン交換クロマトグラフィーによりＴｒｉｔｏｎＸ−１００を除去し、ＶＩＶＡＦＬＯＷ５０（ザルトリウス社製）を用いた限外ろ過により溶媒を６．７ｍＭリン酸緩衝生理食塩水に置換した後、０．２２μｍフィルター（ミリポア社製、ＭＩＬＬＥＸ−ＧＶ）を用いてフィルターろ過を行い、２０ｍＬの精製インフルエンザウイルス抗原液を得た。
【００８０】
ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー及び各フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元銀染色）の結果を図１２に示す。なお、図中のＣｏｎｃＢ（％）の意味は実施例３と同様である。また、精製前後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元銀染色）の結果を図１３に示す。
【００８１】
Ｈ５Ｎ１型のインフルエンザウイルス由来のインフルエンザウイルス抗原でもＨ１Ｎ１型のインフルエンザウイルス由来のインフルエンザウイルス抗原と同様に精製できることが示された。
【００８２】
実施例９
インフルエンザウイルス抗原としてＨＡ蛋白を生成する遺伝子を組み込んだ昆虫細胞により製造したＨ１型のＨＡ蛋白（アブカム社製、Ｃａｔ．Ｎｏ．ａｂ６９７４１、１．６７ｍｇ／ｍＬ、市販品）０．００９ｍＬに、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む２０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水０．０７２ｍＬを加えて攪拌し、試料とした。遠心ろ過フィルター（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ，ミリポア社製）の膜上にヒドロキシアパタイト樹脂（Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ Ｔｙｐｅ Ｉ ４０μｍ， Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）０．０５ｍＬをのせ、試料を０．０５ｍＬ添加し、１５，０００ ×ｇ、３０秒間遠心した。透過液を非吸着画分として採取した。上部に残ったヒドロキシアパタイト樹脂は０．０５ｍＬの２０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水を加えて攪拌後、同様に遠心して洗浄する操作を３回繰り返し、透過液を洗浄画分として採取した。次に０．０５ｍＬの２５０ｍＭリン酸緩衝液を加えて攪拌後、同様に遠心して溶出を行い、透過液を溶出画分（リン酸）として採取した。さらに０．１Ｍ ＮａＯＨ溶液０．０５ｍＬを加え同様に遠心して溶出を行い、透過液を溶出画分（ＮａＯＨ）として採取した。得られた透過液についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元、ＣＢＢ染色）を行った結果を図１４に示す。
インフルエンザウイルス抗原としてＨＡ蛋白を生成する遺伝子を組み込んだ昆虫細胞により生成させたＨＡ蛋白も、一部樹脂への吸着が認められたものの、ＨＡ蛋白を非吸着画分、洗浄画分として回収することができた。このことから、遺伝子組み換えした昆虫細胞を用いて製造したＨ１型のＨＡ蛋白も、鶏卵や動物細胞で培養したＨＡ蛋白と同様に非吸着画分及び洗浄画分として回収することにより精製できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
以上に示されるように、本発明の方法により、培養された種々の夾雑物を含むインフルエンザウイルス抗原を含有する培養液等の試料から、ＨＡ蛋白等のインフルエンザウイルス抗原を簡単な操作で、高精製度に、かつ高回収率で得ることができた。また、本発明の製造法によれば、安全性および有効性の高い精製インフルエンザウイルス抗原を経済的に得ることが可能となった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インフルエンザウイルス抗原を含有する試料を界面活性剤で処理する工程と、前記処理後の試料を前記界面活性剤の共存下でヒドロキシアパタイトと接触させる工程と、ヒドロキシアパタイト非吸着画分を回収する工程を含む、精製インフルエンザウイルス抗原の製造方法。
【請求項２】
前記インフルエンザウイルス抗原を含有する試料が動物細胞培養又は鶏卵培養により増殖させたインフルエンザウイルスである請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記インフルエンザウイルス抗原を含有する試料が、動物細胞又は昆虫細胞にインフルエンザウイルス抗原を生成する遺伝子を組み込んだ遺伝子組換え細胞の培養液である請求項１記載の製造方法。
【請求項４】
０．０５％〜２０％の界面活性剤濃度で前記界面活性剤処理を行なう請求項１ないし３記載の製造方法。
【請求項５】
前記界面活性剤は両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤及び陰イオン性界面活性剤から選択される少なくとも１種である請求項１ないし４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
前記両性界面活性剤がＣＨＡＰＳである請求項５記載の製造方法。
【請求項７】
前記非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレングリコールp-t-オクチルフェニルエーテルである請求項５記載の製造方法。
【請求項８】
前記陰イオン性界面活性剤がデオキシコール酸またはその塩である請求項５記載の製造方法。
【請求項９】
前記両性界面活性剤がＣＨＡＰＳであり、０．５％〜２０％の界面活性剤濃度で前記界面活性剤処理を行なう請求項６記載の製造方法。
【請求項１０】
前記非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレングリコールp-t-オクチルフェニルエーテルであり、０．０５％〜３％の界面活性剤濃度で前記界面活性剤処理を行なう請求項７記載の製造方法。
【請求項１１】
前記陰イオン性界面活性剤がデオキシコール酸またはその塩であり、１％〜２０％の界面活性剤濃度で前記界面活性剤処理を行なう請求項８記載の製造方法。
【請求項１２】
界面活性剤処理後の試料から不溶物を除去した後にヒドロキシアパタイトと接触させる請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１３】
界面活性剤処理後の試料をヒドロキシアパタイトとｐＨ６〜１０の条件下で接触させる請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１４】
界面活性剤とヒドロキシアパタイトと接触させる前記工程で、前記処理後の試料中にヒドロキシアパタイトをバッチ式に添加し、ヒドロキシアパタイト非吸着画分として上清を回収する請求項１ないし１３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１５】
前記ヒドロキシアパタイトと接触させる工程で、ヒドロキシアパタイトを充填したカラムに前記処理後の試料を添加し、カラムから溶出する非吸着画分を回収する請求項１ないし１３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１６】
前記インフルエンザウイルス抗原はＨＡ蛋白である請求項１ないし１５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１７】
請求項１ないし１６のいずれか１項に記載の方法により精製インフルエンザウイルス抗原を製造することを含む、インフルエンザワクチンの製造方法。
【請求項１８】
請求項１ないし１６のいずれか１項に記載の方法により製造した精製インフルエンザウイルス抗原を含むインフルエンザワクチン。
【請求項１９】
請求項１８に記載のインフルエンザワクチンを接種可能な容器に充填したプレフィルドキット。
【請求項２０】
請求項１ないし１６のいずれか１項に記載の方法により製造した精製インフルエンザウイルス抗原。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法により製造された精製インフルエンザウイルス抗原を用いて製造した抗インフルエンザウイルス抗体。
【請求項２２】
請求項１ないし１６のいずれか１項に記載の方法により製造した精製インフルエンザウイルス抗原、又は請求項２１に記載の抗インフルエンザウイルス抗体を用いたインフルエンザ診断試薬。
【請求項２３】
請求項１ないし１６のいずれか１項に記載の方法により製造した精製インフルエンザウイルス抗原、又は請求項２１に記載の抗インフルエンザウイルス抗体を用いたインフルエンザ診断キット。
【請求項１】
インフルエンザウイルス抗原を含有する試料を界面活性剤で処理する工程と、前記処理後の試料を前記界面活性剤の共存下でヒドロキシアパタイトと接触させる工程と、ヒドロキシアパタイト非吸着画分を回収する工程を含む、精製インフルエンザウイルス抗原の製造方法。
【請求項２】
前記インフルエンザウイルス抗原を含有する試料が動物細胞培養又は鶏卵培養により増殖させたインフルエンザウイルスである請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記インフルエンザウイルス抗原を含有する試料が、動物細胞又は昆虫細胞にインフルエンザウイルス抗原を生成する遺伝子を組み込んだ遺伝子組換え細胞の培養液である請求項１記載の製造方法。
【請求項４】
０．０５％〜２０％の界面活性剤濃度で前記界面活性剤処理を行なう請求項１ないし３記載の製造方法。
【請求項５】
前記界面活性剤は両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤及び陰イオン性界面活性剤から選択される少なくとも１種である請求項１ないし４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
前記両性界面活性剤がＣＨＡＰＳである請求項５記載の製造方法。
【請求項７】
前記非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレングリコールp-t-オクチルフェニルエーテルである請求項５記載の製造方法。
【請求項８】
前記陰イオン性界面活性剤がデオキシコール酸またはその塩である請求項５記載の製造方法。
【請求項９】
前記両性界面活性剤がＣＨＡＰＳであり、０．５％〜２０％の界面活性剤濃度で前記界面活性剤処理を行なう請求項６記載の製造方法。
【請求項１０】
前記非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレングリコールp-t-オクチルフェニルエーテルであり、０．０５％〜３％の界面活性剤濃度で前記界面活性剤処理を行なう請求項７記載の製造方法。
【請求項１１】
前記陰イオン性界面活性剤がデオキシコール酸またはその塩であり、１％〜２０％の界面活性剤濃度で前記界面活性剤処理を行なう請求項８記載の製造方法。
【請求項１２】
界面活性剤処理後の試料から不溶物を除去した後にヒドロキシアパタイトと接触させる請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１３】
界面活性剤処理後の試料をヒドロキシアパタイトとｐＨ６〜１０の条件下で接触させる請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１４】
界面活性剤とヒドロキシアパタイトと接触させる前記工程で、前記処理後の試料中にヒドロキシアパタイトをバッチ式に添加し、ヒドロキシアパタイト非吸着画分として上清を回収する請求項１ないし１３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１５】
前記ヒドロキシアパタイトと接触させる工程で、ヒドロキシアパタイトを充填したカラムに前記処理後の試料を添加し、カラムから溶出する非吸着画分を回収する請求項１ないし１３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１６】
前記インフルエンザウイルス抗原はＨＡ蛋白である請求項１ないし１５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１７】
請求項１ないし１６のいずれか１項に記載の方法により精製インフルエンザウイルス抗原を製造することを含む、インフルエンザワクチンの製造方法。
【請求項１８】
請求項１ないし１６のいずれか１項に記載の方法により製造した精製インフルエンザウイルス抗原を含むインフルエンザワクチン。
【請求項１９】
請求項１８に記載のインフルエンザワクチンを接種可能な容器に充填したプレフィルドキット。
【請求項２０】
請求項１ないし１６のいずれか１項に記載の方法により製造した精製インフルエンザウイルス抗原。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法により製造された精製インフルエンザウイルス抗原を用いて製造した抗インフルエンザウイルス抗体。
【請求項２２】
請求項１ないし１６のいずれか１項に記載の方法により製造した精製インフルエンザウイルス抗原、又は請求項２１に記載の抗インフルエンザウイルス抗体を用いたインフルエンザ診断試薬。
【請求項２３】
請求項１ないし１６のいずれか１項に記載の方法により製造した精製インフルエンザウイルス抗原、又は請求項２１に記載の抗インフルエンザウイルス抗体を用いたインフルエンザ診断キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公開番号】特開２０１０−１０４３６５（Ｐ２０１０−１０４３６５Ａ）
【公開日】平成２２年５月１３日（２０１０．５．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２２３７４０（Ｐ２００９−２２３７４０）
【出願日】平成２１年９月２９日（２００９．９．２９）
【出願人】（５９１１２５３７１）デンカ生研株式会社 (72)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年５月１３日（２０１０．５．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月２９日（２００９．９．２９）
【出願人】（５９１１２５３７１）デンカ生研株式会社 (72)
【Ｆターム（参考）】
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