糖尿病性腎症のための医薬組成物、並びにその調製及び適用
本発明は、桑白皮（Cortex Mori）から抽出及び単離された４，４′−ジフェニルメタン−ビス（メチル）カルバメート（ＤＰＭＣ）の適用、並びに糖尿病性腎症のための医薬の調製に関する。医薬組成物は、活性成分としてのＤＰＭＣ及び通常の薬剤担体から構成され、活性成分の重量％は０．１〜９９．５％である。糖尿病性腎症の予防及び治癒に対する顕著な効果及び便利な使用のため、患者にとって新たな選択薬剤となる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、伝統的な漢方薬の調製の分野に関し、特に活性成分が４，４′−ジフェニルメタン−ビス（メチル）カルバメート（ＤＰＭＣ）である糖尿病性腎症のための医薬組成物の調製及びその適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
真性糖尿病及びその慢性合併症は、ヒトの健康及び生活の質に深刻な影響を与えてきた。近年、患者の数が増加しており、全ての年齢群において糖尿病性腎症の発症率は、世界中で、２０００年は２．８％であり、２０３０年には４．４％になると予測され、このことは、糖尿病患者の数が２０００年の１億７千百万人から２０３０年には３億３千３百万人に増加することを意味する。発症率が毎年増加しているので、中国における患者の数は、インドに次いで第２位である。したがって、糖尿病及びその合併症の予防及び治癒は、最近は非常に重要な話題になっている。糖尿病性腎症（ＤＮ）は、糖尿病の重要な合併症の１つであり、腎不全の最終段階をもたらす疾患の第１位である。世界保険機構のデータにより示されているように、Ｉ型糖尿病患者の約３０％及びＩＩ型糖尿病患者の２５％〜４０％は、血中グルコースが管理されないとＤＮ患者に進行する。潜伏期のため及びより早い時期にＤＮを発見することが困難であるため、腎臓罹患の症状が現れたときには、逆転することができない。糖尿病が１年間続けば、腎臓の濾過機能が破壊され、微量のタンパク尿として表れる。疾患の経過が長引くとタンパク尿は増加し、血中の毒素を排除する腎臓の能力が徐々に減衰し、末期腎疾患（ＥＳＲＤ）をもたらし、患者は、血液透析又は腎臓移植により生命を維持するしかなくなる。したがって、ＤＮの機構を徹底的に解明すること、並びに予防及び治癒の手段を充実させて完成させることがどうしても必要である。
【０００３】
終末糖化産物（ＡＧＥｓ）は、酵素の触媒作用なしで生じる巨大分子とグリコ−カルボニルとの共有結合体である。非酵素性触媒作用の条件下において、第１に、可逆性シッフ塩基がブドウ糖分子の遊離アルデヒド及びタンパク質のアミノ基により形成され、第２に、固定ケトアミン化合物（アマドリ生成物）がシッフ塩基の構造転位により形成され、次に、固定した非可逆性のＡＧＥが、脱水、酸化及び縮合の反応の後で形成される。ＡＧＥは、タンパク質、核酸、脂質などの生体巨大分子と容易に架橋剤を形成し、次に細胞内に蓄積し、細胞の正常な機能を妨げるので、糖尿病の合併症に密接に関連する。炎症促進因子及び線維症促進因子の多くのサイトカインの産生又は活性化をもたらし、細胞肥大の病的変化、塩基性物質の付着成長及び糸球体の線維症をもたらす、ＡＧＥとＲＡＧＥの相互作用は、糖尿病性腎症の発症及び進展に対して大きな影響を及ぼし、病因の１つである。したがって、ＡＧＥＳ形成への介入、構成されたＡＧＥの排除、ＡＧＥにより誘導された腎疾患の症状の修正は、ＤＮを予防及び治癒することができる（Bohlender JM, Franke S, Stein G, et al. Advanced glycation end products and the kidney. Am J Physiol Renal Physiol, 2005, 289(4): 645-659）。
【０００４】
クワ（Morus alba L.）の乾燥根皮層である桑白皮（Cortex Mori）は、甘味があり、冷感性であって、肺から熱を除去し、喘息を緩和し、利尿を誘導して浮腫を軽減する機能を有する。桑白皮は、通常、肺の熱に起因する呼吸困難症及び咳、水症及び膨張に起因する乏尿症、顔面の筋肉及び皮膚の腫脹に使用される。最近の薬理学研究は、桑白皮が、血糖及び血圧の低下、利尿、咳の予防及び喘息の緩和、抗ＨＩＶ、抗腫瘍などの活性を有することを示した。血糖を低下する活性成分である１−デオキシノジリマイシン及びモランＡが桑白皮から単離されて以来、ますます多くの研究者たちが、血糖を低下する新たな活性成分を桑白皮から探しており、次いで糖尿病のために新たな薬剤の改善を探求している。ＤＰＭＣは、桑白皮の抽出物から初めて単離された新たな天然産物であり、以前は化学工学の分野でのみ使用されたＤＰＭＣの合成生成物は、ポリウレタンの主要材料であるジフェニルメタンジイソシアネート（ＭＤＩ）を調製するためのものである。現在まで、国内又は海外の文献で医薬分野に使用されるＤＰＭＣについて報告したものはほとんどない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
糖尿病性腎症のための医薬組成物及びその調製を提供することが本発明の目的であり、ここで、本医薬組成物の活性成分は、桑白皮から抽出したＤＰＭＣである。
【０００６】
上記の目的を達成するための技術的解決は以下である：
ＤＰＭＣ及び従来の薬剤担体から構成され、活性成分は０．１〜９９．５重量％の割合で含まれる、糖尿病性腎症のための医薬組成物。
【０００７】
好ましくは、本活性成分は、５〜７０重量％の割合で含まれる。
【０００８】
本発明の医薬組成物に使用される従来の薬剤担体は、医薬分野の従来の薬剤担体である。例えば、希釈剤及び賦形剤は水であり、充填剤は、デンプン、スクロース、ラクトースなどであり、接着剤は、セルロース誘導体、アルギン酸塩、ゼラチン又はポリビニルピロリドンであり、湿潤剤はグリセリンであり、崩壊剤は、寒天、炭酸カルシウム又は重炭酸ナトリウムから選択され、吸収促進剤は、第四級アンモニウム化合物であり、界面活性剤は、パルミチルアルコールであり、吸収担体は、カオリン粘土又は石けん粘土であり、潤滑剤は、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム又はポリエチレングルコールである。加えて、風味剤、甘味料などの他の佐剤を組成物に加えることもできる。
【０００９】
通常の調製方法を使用することよって、本発明の医薬組成物を通常の投与形態に調製することができるが、この投与形態は主に経口調合剤であって、例えば固体調合剤は、ペレット剤、顆粒剤、粒剤、粉末剤、顆粒化剤、カプセル剤であり、液体調合剤は、水性又は油性懸濁剤、エリキシル剤などである。
【００１０】
好ましくは、本医薬組成物は、ペレット剤、顆粒剤、粒剤又はカプセル剤である。
【００１１】
医薬組成物の投与量は、投与方法及び疾患の重篤度によって調整することができる。通常、診療所の経口基準投与量は、２０〜１２０mg/dである。
【００１２】
本発明の更なる目的は、４，４′−ジフェニルメタン−ビス（メチル）カルバメートを従来の薬剤担体と混合することと、医薬組成物を得るために、特定の調製方法に従って調製することを含む、請求項１記載の医薬組成物の調製方法を提供することである。
【００１３】
好ましくは、４，４′−ジフェニルメタン−ビス（メチル）カルバメートを調製する方法は、以下の通りである：
Ａ．桑白皮の乾燥根皮層を粉末に粉砕し、水を加え、還流下で抽出し、抽出物をまとめ、真空下で濃縮して、特定の容量にする；
Ｂ．マクロ孔質樹脂に加え、水、次に９５％ＥｔＯＨで溶離し、９５％ＥｔＯＨ溶離液を収集し、真空下で濃縮する；
Ｃ．シリカゲルに加え、石油、石油−酢酸エーテル１００：１、石油−酢酸エーテル５０：１のそれぞれで溶離し、石油−酢酸エーテル５０：１の溶離によって無色の層状結晶を得る。
【００１４】
本医薬組成物は、薬剤学の分野における通常の調製方法に従って調製することができる。例えば、活性成分を複数の担体と混合し、次に所望の投与形態に調製する。
【００１５】
本発明は、糖尿病性腎症及びその合併症のための医薬組成物の調製におけるＤＰＭＣの適用も提供する。好ましくは、本適用は、糖尿病性腎症のための医薬組成物の調製におけるＤＰＭＣの適用である。
【発明の効果】
【００１６】
１．本発明において、ＤＰＭＣは、初めて、桑白皮から単離され、血糖を低下する機能を有することが証明されたが、このことは、糖尿病及び糖尿病の合併症の患者にとって新たな薬剤を提供することを示している。
【００１７】
２．本医薬組成物は、顆粒剤、滴下剤（dripping pill）、注入用の粉末調合剤、ペレット剤のような経口投与形態に調製することができ、使用するのに都合が良い。
【００１８】
３．本医薬組成物は、糖尿病における糸球体の損傷の予防又は治癒において際立った効果を有する。本医薬組成物は、顕著に血清クレアチニンの上昇を防ぎ、糖尿病のラットの尿量、尿タンパク質及び腎指数を低下することができ、このことは、本医薬組成物が糖尿病性腎症の予防及び治癒に対して顕著な効果があることを証明している。
【００１９】
４．本医薬組成物は、糖尿病性腎症に対して、桑白皮の水抽出物よりも明らかに有効である。加えて、確定した活性成分及び容易な品質管理のおかげで、不確定な活性成分、粗悪な品質管理、多くの特定の毒性副作用などのような伝統的な漢方薬の欠点を克服することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＡＧＥにより誘導されるラットメサンギウム細胞のＴＧＦβ−１の発現に対する、ＤＰＭＣの効果を示す（２００×）； 図中、Ａ：正常対照群、Ｂ：ＡＧＥ（５mM/L）、Ｃ：陰性対照群、Ｄ：桑白皮の水抽出物（０．１mg/ml）、Ｅ：ＤＰＭＣ（０．５nM/L）、Ｆ：ＤＰＭＣ（５nM/L）、Ｇ：ＤＰＭＣ（２５nM/L）、Ｈ：ＤＰＭＣ（１２５nM/L）。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明を以下の実施態様において更に説明する。
【００２２】
〔実施例１：ＤＰＭＣの調製〕
１０kgの桑白皮の乾燥根皮層を微細粉末に粉砕し、１００Lの水を加え、還流下で２時間に３回抽出する。抽出物をまとめ、真空下で特定の容量に濃縮し、Ｄ１０１マクロ孔質樹脂に加え、水、次に９５％ＥｔＯＨで溶離し、９５％ＥｔＯＨ溶離液を収集し、真空下で濃縮し、次にシリカゲルに加え、石油、石油−酢酸エーテル１００：１、石油−酢酸エーテル５０：１のそれぞれにより溶離する。無色の層状結晶が石油−酢酸エーテル５０：１の溶離によって得られる。その構造は、赤外線スペクトル、紫外線スペクトル、核磁気共鳴及び質量スペクトルによって、４，４′−ジフェニルメタン−ビス（メチル）カルバメート（ＤＰＭＣ）であると同定された。分子式：Ｃ１７Ｈ１８Ｎ２Ｏ４；分子量：３１４。構造を下記に示す：
【化１】
【００２３】
〔実施例２：医薬組成物のペレット粒剤の調製〕
粒剤１個あたりの構成成分：
ＤＰＭＣ １２mg
ラクトース １７５mg
トウモロコシデンプン ５０mg
ステアリン酸マグネシウム ３mg
【００２４】
調製方法：ＤＭＰＣ、ラクトース及びデンプンを混合し、水で均一に湿潤し、混合物を篩にかけ、乾燥し、再び篩にかけ、ステアリン酸マグネシウムを加え、次に混合物を砕いて、粒剤１個当たり２４０mgで活性成分が１２mgの錠剤にする。ペレット粒剤（pellet pill）は、高尿タンパク質及び糖尿病性の腎症に対して十分な効果を発揮する。
【００２５】
〔実施例３：医薬組成物のカプセル剤の調製〕
工程：
Ａ ４．２ｇのミツロウを取り、１２５ｇのエファモルを加え、８０℃の湯浴で溶融及び混合し、室温（２５℃）に冷却し、次に十分な量のジブチルヒドロキシアニソールを加え、均一に混合する。
Ｂ １００メッシュの篩にかけた０．２５ｇのＤＰＭＣ及び５ｇのレシチンを加え、２５０ｇのエファモルを加え、十分に混合してカプセル剤のコア液とし、１０００個のカプセル剤を調製する。
【００２６】
この実施例で調製したカプセル剤は、高血糖症及び糖尿病性腎症に対して十分な効果を発揮する。
【００２７】
〔実施例４：医薬組成物の滴剤の調製〕
１５ｇのＤＰＭＣを取り、微細粉末に粉砕し、２００メッシュの篩にかけ、１５ｇの溶融ポリグリコール６０００基材に加え、十分に撹拌し、チラーとしてジメチルベンゼンシリコーン油を用いて滴剤（drop pill）を調製し、乾燥して、７−ヒドロキシクマリンの滴剤を完成させる。滴剤は、血清クレアチニンを上昇させ、尿クレアチニンを下降させる疾患、及び糖尿病性腎症に対して十分な効果を発揮する。
【００２８】
〔実施例５：医薬組成物の分散性錠剤の調製〕
処方用量：２８０ｇのＤＭＰＣ、４０ｇのラクトース、７０ｇの微晶質セルロース、５．２５ｇのポリビニルピロリドン、２．５ｇのアスパルテーム、６ｇのポリビドン及び４ｇの重炭酸カリウム、の量を正確に計量し、主剤及び佐剤を等量ずつ増やして十分に混合し、８０メッシュの篩で２回篩にかけ、混合物を適切な容器に入れ、７５％ＥｔＯＨに溶解した１５％（ｇ／１００ml）ポリエチレン６０００の十分な量を加えて軟質にし、２０メッシュの篩によって砕いて湿潤顆粒にし、ほうろうプレートの上に塗布し、送風オーブンにより７０℃で２時間乾燥し、乾燥した顆粒を正確に計量し、２．２５ｇの残りのポリビニルピロリドン及び１％（w/w）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を加え、均一に混合し、φ７mmの円形打抜ダイで１０００個の粒剤に砕いて、１０００個のＤＰＭＣの分散性錠剤を作製する。本分散性錠剤は、糖尿病性腎症及びその合併症に対して十分な効果を発揮する。
【００２９】
〔実施例６：医薬組成物のペレット粒剤の調製〕
活性成分： ７０ｇ
微晶質セルロース： ０．４ｇ
砕いて１０００個の粒剤にする
【００３０】
調製方法：活性成分を微晶質セルロースと混合し、水で均一に湿潤して軟質にし、混合物を顆粒にし、２０メッシュの篩にかけ、８０℃で乾燥し、再び篩にかけ、次に砕いて、粒剤１個あたり７０．４mgであって粒剤１個あたり７０mgの活性成分を有する粒剤にする。本粒剤は、糖尿病性腎症及びその合併症に対して十分な効果を発揮する。
【００３１】
ＤＰＭＣは、本発明の医薬分野において使用されるが、糖尿病性腎症に対するその効果を証明するために、ＡＧＥにより誘導されるメサンギウム細胞のマトリックス増殖に対する効果及びＳＴＺ糖尿病性腎症モデルラットの病理変化に対する効果についての実験に、ＤＰＭＣを適用する。
【００３２】
＜実験１＞
ＡＧＥにより誘導されるメサンギウム細胞のマトリックス増殖に対するＤＰＭＣの効果
糖尿病性腎症の特異的な疾患兆候は、メサンギウム領域における細胞外マトリックスの増大により誘導される糸球体毛細血管間細胞のマトリックス硬化である。メサンギウム細胞は、糸球体腸間膜の主要な構成成分であり、収縮、内分泌、分化増殖、免疫及び食菌作用の多くの機能を有する糸球体の生理学的機能を維持する重要な役割を果たす。ＡＧＥは、メサンギウム細胞の細胞外マトリックス増殖を誘導することができ、このことは糖尿病性腎症の重要な病理変化である。
【００３３】
１．材料及び薬剤
ラットのメサンギウム細胞株ＨＢＺＹ−１（Wuhan cell & biology institute）；ＤＰＭＣ、桑白皮の水抽出物；ウシ血清アルブミン、Ｄ−ブドウ糖（sigma company）；仔牛血清（Sijiqing serum factory, Hangzhou）；ＴＧＦβ−１抗体（Canta Cruz）；ＤＡＢ発色システム（Gene Tech Biotechnology CompanyLimited）；ヒドロキシプロリン含有量測定キット（Nanjing Jiancheng company）。
【００３４】
２．実験方法
２．１ 桑白皮及びＡＧＥの水抽出物の調製
桑白皮の水抽出物の調製
十分な量の桑白皮の乾燥根皮質を粉末に粉砕し、１０倍の水を加え、還流下で２時間毎に３回抽出し、抽出物をまとめ、真空下で濃縮して使用のための特定の容量にする。
【００３５】
ＡＧＥの水抽出物の調製
グロブリン不含有５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び０．５mol/LのＤ−ブドウ糖を０．２mol/Lのリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ、ＰＨ＝７．２）に溶解し、０．２２μmの微細孔膜で濾過し、３７℃で６０日間インキュベートした。終末糖化産物（ＡＧＥ）のインキュベーションが終了した後、非結合材料を拡張透過法により清浄した。必要な濃度に希釈し、０．２２μmの微細孔膜で濾過した。
【００３６】
２．２ メサンギウム細胞の培養及び染色
メサンギウム細胞の病理変化を誘導するＡＧＥの濃度及び時間測定
対数増殖期のＨＢＺＹ−１細胞及び５％仔牛血清含有ＤＭＥＭ培地により単細胞懸濁液を調製し、１００μl／ウエル（細胞量：１×１０４／ウエル）を取り出して、９６ウエルプレートに入れ、５％ＣＯ２インキュベーターにより３７℃で２４時間インキュベートし、血清不含有ＤＭＥＭの１００μlに変えて、更に２４時間インキュベートして、細胞を休止期にする（同期化）。上清を廃棄し、５％仔牛血清、及び段階希釈による異なる濃度のＡＧＥの１０μlを含有するＤＥＭＥ培地の９０μlを、１群あたり６回繰り返して加え、それぞれ勾配時間によりインキュベートし、ＭＴＴによりラットのメサンギウム細胞の繁殖程度を測定する。その結果は、０．２５mg/mlのＡＧＥ及び４８時間のインキュベーションが実験にとって最高の条件であったことを示す。
【００３７】
ＨＢＺＹ−１細胞を同期化まで増殖させるために、ポリ−Ｌ−リシンで前処理したカバーガラスを２４ウエル細胞培養プレートに入れる。上清を廃棄し、８００μlのＤＭＥＭ培地、１００μlのＡＧＥ（最終濃度は０．２５mg/mlである）を各薬剤群に加え、次に、桑白皮の水抽出物（最終濃度は０．１g/Lである）又はＤＰＭＣ（最終濃度は０．５、５、２５又は１２５nM/Lである）の１００μlを加える。ＡＧＥ群に９００μlのＤＭＥＭ培地及び１００μlのＡＧＥ（最終濃度は０．２５mg/mlであった）を加えたとき、正常対照群には１mlのＤＭＥＭ培地を加える。各群では６回繰り返す。次に全ての群を５％ＣＯ２インキュベーターにより３７℃で４８時間インキュベートする。細胞をカバーガラスで完全に覆った後、ヒドロキシプロリンの含有量測定のために細胞上清の吸引を行い、カバーガラスを取り出して免疫細胞化学染色を行う。
【００３８】
ＴＧＦβ−１染色の工程：細胞で覆われたカバーガラスを４％パラホルムアルデヒドにより３０分間固定し、内因性ホースラディッシュペルオキシダーゼを、その都度調製した３％Ｈ２Ｏ２メタノール溶液で１０分間不活性化し、蒸留水で３回清浄し、非特異的抗原を、５％ＢＳＡで２０分間ブロックし、ＴＧＦβ−１（１：５００）を滴加し、４０℃で一晩維持し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）により２分間で３回洗浄し、ヤギの抗マウスビオチン化抗体を滴加し、３７℃で３０分間保持し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）により２分間で３回洗浄し、ＨＲＰで標識されたアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体を滴加し、３７℃で３０分間保持し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）により５分間で４回洗浄し、５０μlのＤＡＢ発色液を滴加し、室温で１５分間発色させ、蒸留水で均一に清浄し、ヘマトキシリンで１分間再び軽く染色し、水で洗浄し、アルコールで脱水する。
【００３９】
ジメチルベンゼンで透過化処理し、カバーガラスをneutro-gummiで覆う。
【００４０】
３ 統計分析
ラットのメサンギウム細胞の培養液のヒドロキシプロリンの含有量を測定し、ｔ−検定で分析してｘ(平均)±ｓで表し、顕微鏡によりラットのメサンギウム細胞の免疫組織化学写真におけるＴＧＦβ−１発現を観察する。
【００４１】
４ 結果
ＡＧＥにより誘導されるラットのメサンギウム細胞の上清におけるヒドロキシプロリンの含有量の増加に対するＤＰＭＣの効果
表１に示されているように、桑白皮の水抽出物及び異なる用量のＤＰＭＣは、全て、ＡＧＥにより誘導されるラットのメサンギウム細胞の上清におけるヒドロキシプロリンの含有量増加を減少することができる。更に、大用量のＤＰＭＣ（１２５nM/L）は、最高の成果をあげ、桑白皮の水抽出物よりも明らかに良好である。
【００４２】
表１ ＡＧＥにより誘導されるラットのメサンギウム細胞の上清におけるヒドロキシプロリンの含有量の増加に対するＤＰＭＣの効果
【表１】
【００４３】
４．２ ＡＧＥにより誘導されるラットのメサンギウム細胞のＴＧＦβ−１発現に対するＤＰＭＣの効果
図１に示されているように、ＡＧＥは、ラットのメサンギウム細胞のＴＧＦβ−１発現を増加させることができる。桑白皮の水抽出物及び異なる用量のＤＰＭＣは、全て、ラットのメサンギウム細胞のＴＧＦβ−１発現の増加を抑制することができる。更に、大用量のＤＰＭＣ（１２５nM/L）は、最高の成果をあげ、異なる用量のＤＰＭＣは、桑白皮の水抽出物と比べてより良好であるか又は同等である。
【００４４】
＜実験２＞
ＳＴＺ糖尿病性腎症ラットの病理変化に対する効果
１ 材料及び試薬
ストレプトゾトシン（Sigma）；ウィスターラット（南医科大学の実験動物センターから提供された）；BIOBASE-PEARL分離自動生化学分析機（Shandong BIOBASE Company）。
【００４５】
２ 実験方法
２．１ 桑白皮の水抽出物の調製
十分な量の桑白皮の乾燥根皮質を粉末に粉砕し、１０倍の水を加え、還流下で２時間毎に３回抽出し、抽出物をまとめ、使用するために、真空下で濃縮して特定の容量にする。
【００４６】
２．２ 投与
低用量のＳＴＺを数回投与することによりモデル化し、糖尿病性腎症のモデルラットとして測定し、１０匹のマウス／群で以下の６群に分ける：モデル群、陽性薬剤対照群（アミノグアニジン、１００mg/kg）、桑白皮の水抽出物群、３つの異なる濃度用量のＤＰＭＣ群（高用量群：４mg/kg；中用量群：２mg/kg；低用量：１mg/kg）、正常対照群。
【００４７】
各群には、異なる濃度で同じ容量の対応する薬剤又は生理食塩水を、１４週間にわたって毎日胃内投与により与える。
【００４８】
３ 統計分析
投与が終了した後、２４時間の尿を収集し、尿量を計算し、尿の総タンパク質、微量アルブミン及び尿クレアチニンの含有量を測定し、眼窩から血液を得て、自動生化学分析機により生化学的指標を測定し、２つの腎臓を取り出し、ホルマリンで固定し、組織病理学実験まで維持する。
【００４９】
全ての測定の統計分析を、クラス間ｔ−検定により計算して、ｘ(平均)±ｓで表す。
【００５０】
４ 結果
４．１ ＳＴＺにより誘導される糖尿病性腎症のラットモデルの２４時間尿量、尿の総タンパク質、微量アルブミン及び尿クレアチニンに対するＤＰＭＣの効果
表２に示されているように、モデル群において、２４時間尿量、尿総タンパク質の排出量及び微量アルブミンが増加し、尿中のクレアチニンの排出量は明らかに減少しているが、それにもかかわらず、桑白皮の抽出物及び異なる用量は、全て、上記の変化を抑制することができる、すなわち、糖尿病性腎症のラットの２４時間尿量を減少させ、尿総タンパク質及び微量アルブミンの排出量を低下させ、クレアチニンの排出量を増加させることができる。これらの群のうち、ＤＰＭＣ用量の上昇につれて効果は強化され、用量効果関係が明らかである。更に、大用量のＤＰＭＣの効果は、桑白皮の水抽出物よりも明らかに良好である。
【００５１】
表２ ラットの尿量、尿の総タンパク質、微量アルブミン及び尿クレアチニンに対するＤＰＭＣの効果（ｘ(平均)±ｓ、ｎ＝１０）。
【表２】
【００５２】
４．２ 糖尿病性腎症のラットの血清の生化学的指標に対するＤＰＭＣの効果
表３に示されているように、桑白皮の水抽出物及び異なる用量のＤＰＭＣは、全て、糖尿病性腎症のラットの血清総コレステロール（ＴＣ）、マロンアルデヒド（ＭＤＡ）、血清クレアチニン（ＳＣ）、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、ＡＧＥ及び低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）のレベルを減少し、血清スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）のレベルを上昇させることができる。用量の上昇につれてＤＰＭＣの効果は強化され、更に、ＤＰＭＣの全ての濃度の効果は、桑白皮の水抽出物と比べてより良好であるか又は同等である。
【００５３】
表３ 糖尿病性腎症のラットの血清の生化学的指標に対するＤＰＭＣの効果（ｘ(平均)±ｓ、ｎ＝１０）
【表３】
【００５４】
４．３ 糖尿病性腎症モデルのラット糸球体のＣＴＧＦ発現及び病理組織学に対するＤＰＭＣの効果
表４に示されているように、正常対照群と比較すると、糖尿病性腎症モデルの糸球体ＣＴＧＦ発現は増加し（Ｐ＜０．０１）、病理組織の損傷も増加し、桑白皮の水抽出物及び異なる用量のＤＰＭＣは、全て、ＳＴＺにより誘導された糖尿病性腎症のラットモデルの糸球体ＣＴＧＦ発現を減少することができ、損傷の病理スコアを下げることができる。用量の上昇につれてＤＰＭＣの効果は強化され、更に、ＤＰＭＣの全ての濃度の効果は、桑白皮の水抽出物と比べてより良好であるか又は同等である。
【００５５】
表４ 糖尿病性腎症モデルのラット糸球体のＣＴＧＦ発現及び病理組織学に対するＤＰＭＣの効果（ｘ(平均)±ｓ、ｎ＝１０）
【表４】
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図１Ｆ】
【図１Ｇ】
【図１Ｈ】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、伝統的な漢方薬の調製の分野に関し、特に活性成分が４，４′−ジフェニルメタン−ビス（メチル）カルバメート（ＤＰＭＣ）である糖尿病性腎症のための医薬組成物の調製及びその適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
真性糖尿病及びその慢性合併症は、ヒトの健康及び生活の質に深刻な影響を与えてきた。近年、患者の数が増加しており、全ての年齢群において糖尿病性腎症の発症率は、世界中で、２０００年は２．８％であり、２０３０年には４．４％になると予測され、このことは、糖尿病患者の数が２０００年の１億７千百万人から２０３０年には３億３千３百万人に増加することを意味する。発症率が毎年増加しているので、中国における患者の数は、インドに次いで第２位である。したがって、糖尿病及びその合併症の予防及び治癒は、最近は非常に重要な話題になっている。糖尿病性腎症（ＤＮ）は、糖尿病の重要な合併症の１つであり、腎不全の最終段階をもたらす疾患の第１位である。世界保険機構のデータにより示されているように、Ｉ型糖尿病患者の約３０％及びＩＩ型糖尿病患者の２５％〜４０％は、血中グルコースが管理されないとＤＮ患者に進行する。潜伏期のため及びより早い時期にＤＮを発見することが困難であるため、腎臓罹患の症状が現れたときには、逆転することができない。糖尿病が１年間続けば、腎臓の濾過機能が破壊され、微量のタンパク尿として表れる。疾患の経過が長引くとタンパク尿は増加し、血中の毒素を排除する腎臓の能力が徐々に減衰し、末期腎疾患（ＥＳＲＤ）をもたらし、患者は、血液透析又は腎臓移植により生命を維持するしかなくなる。したがって、ＤＮの機構を徹底的に解明すること、並びに予防及び治癒の手段を充実させて完成させることがどうしても必要である。
【０００３】
終末糖化産物（ＡＧＥｓ）は、酵素の触媒作用なしで生じる巨大分子とグリコ−カルボニルとの共有結合体である。非酵素性触媒作用の条件下において、第１に、可逆性シッフ塩基がブドウ糖分子の遊離アルデヒド及びタンパク質のアミノ基により形成され、第２に、固定ケトアミン化合物（アマドリ生成物）がシッフ塩基の構造転位により形成され、次に、固定した非可逆性のＡＧＥが、脱水、酸化及び縮合の反応の後で形成される。ＡＧＥは、タンパク質、核酸、脂質などの生体巨大分子と容易に架橋剤を形成し、次に細胞内に蓄積し、細胞の正常な機能を妨げるので、糖尿病の合併症に密接に関連する。炎症促進因子及び線維症促進因子の多くのサイトカインの産生又は活性化をもたらし、細胞肥大の病的変化、塩基性物質の付着成長及び糸球体の線維症をもたらす、ＡＧＥとＲＡＧＥの相互作用は、糖尿病性腎症の発症及び進展に対して大きな影響を及ぼし、病因の１つである。したがって、ＡＧＥＳ形成への介入、構成されたＡＧＥの排除、ＡＧＥにより誘導された腎疾患の症状の修正は、ＤＮを予防及び治癒することができる（Bohlender JM, Franke S, Stein G, et al. Advanced glycation end products and the kidney. Am J Physiol Renal Physiol, 2005, 289(4): 645-659）。
【０００４】
クワ（Morus alba L.）の乾燥根皮層である桑白皮（Cortex Mori）は、甘味があり、冷感性であって、肺から熱を除去し、喘息を緩和し、利尿を誘導して浮腫を軽減する機能を有する。桑白皮は、通常、肺の熱に起因する呼吸困難症及び咳、水症及び膨張に起因する乏尿症、顔面の筋肉及び皮膚の腫脹に使用される。最近の薬理学研究は、桑白皮が、血糖及び血圧の低下、利尿、咳の予防及び喘息の緩和、抗ＨＩＶ、抗腫瘍などの活性を有することを示した。血糖を低下する活性成分である１−デオキシノジリマイシン及びモランＡが桑白皮から単離されて以来、ますます多くの研究者たちが、血糖を低下する新たな活性成分を桑白皮から探しており、次いで糖尿病のために新たな薬剤の改善を探求している。ＤＰＭＣは、桑白皮の抽出物から初めて単離された新たな天然産物であり、以前は化学工学の分野でのみ使用されたＤＰＭＣの合成生成物は、ポリウレタンの主要材料であるジフェニルメタンジイソシアネート（ＭＤＩ）を調製するためのものである。現在まで、国内又は海外の文献で医薬分野に使用されるＤＰＭＣについて報告したものはほとんどない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
糖尿病性腎症のための医薬組成物及びその調製を提供することが本発明の目的であり、ここで、本医薬組成物の活性成分は、桑白皮から抽出したＤＰＭＣである。
【０００６】
上記の目的を達成するための技術的解決は以下である：
ＤＰＭＣ及び従来の薬剤担体から構成され、活性成分は０．１〜９９．５重量％の割合で含まれる、糖尿病性腎症のための医薬組成物。
【０００７】
好ましくは、本活性成分は、５〜７０重量％の割合で含まれる。
【０００８】
本発明の医薬組成物に使用される従来の薬剤担体は、医薬分野の従来の薬剤担体である。例えば、希釈剤及び賦形剤は水であり、充填剤は、デンプン、スクロース、ラクトースなどであり、接着剤は、セルロース誘導体、アルギン酸塩、ゼラチン又はポリビニルピロリドンであり、湿潤剤はグリセリンであり、崩壊剤は、寒天、炭酸カルシウム又は重炭酸ナトリウムから選択され、吸収促進剤は、第四級アンモニウム化合物であり、界面活性剤は、パルミチルアルコールであり、吸収担体は、カオリン粘土又は石けん粘土であり、潤滑剤は、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム又はポリエチレングルコールである。加えて、風味剤、甘味料などの他の佐剤を組成物に加えることもできる。
【０００９】
通常の調製方法を使用することよって、本発明の医薬組成物を通常の投与形態に調製することができるが、この投与形態は主に経口調合剤であって、例えば固体調合剤は、ペレット剤、顆粒剤、粒剤、粉末剤、顆粒化剤、カプセル剤であり、液体調合剤は、水性又は油性懸濁剤、エリキシル剤などである。
【００１０】
好ましくは、本医薬組成物は、ペレット剤、顆粒剤、粒剤又はカプセル剤である。
【００１１】
医薬組成物の投与量は、投与方法及び疾患の重篤度によって調整することができる。通常、診療所の経口基準投与量は、２０〜１２０mg/dである。
【００１２】
本発明の更なる目的は、４，４′−ジフェニルメタン−ビス（メチル）カルバメートを従来の薬剤担体と混合することと、医薬組成物を得るために、特定の調製方法に従って調製することを含む、請求項１記載の医薬組成物の調製方法を提供することである。
【００１３】
好ましくは、４，４′−ジフェニルメタン−ビス（メチル）カルバメートを調製する方法は、以下の通りである：
Ａ．桑白皮の乾燥根皮層を粉末に粉砕し、水を加え、還流下で抽出し、抽出物をまとめ、真空下で濃縮して、特定の容量にする；
Ｂ．マクロ孔質樹脂に加え、水、次に９５％ＥｔＯＨで溶離し、９５％ＥｔＯＨ溶離液を収集し、真空下で濃縮する；
Ｃ．シリカゲルに加え、石油、石油−酢酸エーテル１００：１、石油−酢酸エーテル５０：１のそれぞれで溶離し、石油−酢酸エーテル５０：１の溶離によって無色の層状結晶を得る。
【００１４】
本医薬組成物は、薬剤学の分野における通常の調製方法に従って調製することができる。例えば、活性成分を複数の担体と混合し、次に所望の投与形態に調製する。
【００１５】
本発明は、糖尿病性腎症及びその合併症のための医薬組成物の調製におけるＤＰＭＣの適用も提供する。好ましくは、本適用は、糖尿病性腎症のための医薬組成物の調製におけるＤＰＭＣの適用である。
【発明の効果】
【００１６】
１．本発明において、ＤＰＭＣは、初めて、桑白皮から単離され、血糖を低下する機能を有することが証明されたが、このことは、糖尿病及び糖尿病の合併症の患者にとって新たな薬剤を提供することを示している。
【００１７】
２．本医薬組成物は、顆粒剤、滴下剤（dripping pill）、注入用の粉末調合剤、ペレット剤のような経口投与形態に調製することができ、使用するのに都合が良い。
【００１８】
３．本医薬組成物は、糖尿病における糸球体の損傷の予防又は治癒において際立った効果を有する。本医薬組成物は、顕著に血清クレアチニンの上昇を防ぎ、糖尿病のラットの尿量、尿タンパク質及び腎指数を低下することができ、このことは、本医薬組成物が糖尿病性腎症の予防及び治癒に対して顕著な効果があることを証明している。
【００１９】
４．本医薬組成物は、糖尿病性腎症に対して、桑白皮の水抽出物よりも明らかに有効である。加えて、確定した活性成分及び容易な品質管理のおかげで、不確定な活性成分、粗悪な品質管理、多くの特定の毒性副作用などのような伝統的な漢方薬の欠点を克服することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＡＧＥにより誘導されるラットメサンギウム細胞のＴＧＦβ−１の発現に対する、ＤＰＭＣの効果を示す（２００×）； 図中、Ａ：正常対照群、Ｂ：ＡＧＥ（５mM/L）、Ｃ：陰性対照群、Ｄ：桑白皮の水抽出物（０．１mg/ml）、Ｅ：ＤＰＭＣ（０．５nM/L）、Ｆ：ＤＰＭＣ（５nM/L）、Ｇ：ＤＰＭＣ（２５nM/L）、Ｈ：ＤＰＭＣ（１２５nM/L）。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明を以下の実施態様において更に説明する。
【００２２】
〔実施例１：ＤＰＭＣの調製〕
１０kgの桑白皮の乾燥根皮層を微細粉末に粉砕し、１００Lの水を加え、還流下で２時間に３回抽出する。抽出物をまとめ、真空下で特定の容量に濃縮し、Ｄ１０１マクロ孔質樹脂に加え、水、次に９５％ＥｔＯＨで溶離し、９５％ＥｔＯＨ溶離液を収集し、真空下で濃縮し、次にシリカゲルに加え、石油、石油−酢酸エーテル１００：１、石油−酢酸エーテル５０：１のそれぞれにより溶離する。無色の層状結晶が石油−酢酸エーテル５０：１の溶離によって得られる。その構造は、赤外線スペクトル、紫外線スペクトル、核磁気共鳴及び質量スペクトルによって、４，４′−ジフェニルメタン−ビス（メチル）カルバメート（ＤＰＭＣ）であると同定された。分子式：Ｃ１７Ｈ１８Ｎ２Ｏ４；分子量：３１４。構造を下記に示す：
【化１】
【００２３】
〔実施例２：医薬組成物のペレット粒剤の調製〕
粒剤１個あたりの構成成分：
ＤＰＭＣ １２mg
ラクトース １７５mg
トウモロコシデンプン ５０mg
ステアリン酸マグネシウム ３mg
【００２４】
調製方法：ＤＭＰＣ、ラクトース及びデンプンを混合し、水で均一に湿潤し、混合物を篩にかけ、乾燥し、再び篩にかけ、ステアリン酸マグネシウムを加え、次に混合物を砕いて、粒剤１個当たり２４０mgで活性成分が１２mgの錠剤にする。ペレット粒剤（pellet pill）は、高尿タンパク質及び糖尿病性の腎症に対して十分な効果を発揮する。
【００２５】
〔実施例３：医薬組成物のカプセル剤の調製〕
工程：
Ａ ４．２ｇのミツロウを取り、１２５ｇのエファモルを加え、８０℃の湯浴で溶融及び混合し、室温（２５℃）に冷却し、次に十分な量のジブチルヒドロキシアニソールを加え、均一に混合する。
Ｂ １００メッシュの篩にかけた０．２５ｇのＤＰＭＣ及び５ｇのレシチンを加え、２５０ｇのエファモルを加え、十分に混合してカプセル剤のコア液とし、１０００個のカプセル剤を調製する。
【００２６】
この実施例で調製したカプセル剤は、高血糖症及び糖尿病性腎症に対して十分な効果を発揮する。
【００２７】
〔実施例４：医薬組成物の滴剤の調製〕
１５ｇのＤＰＭＣを取り、微細粉末に粉砕し、２００メッシュの篩にかけ、１５ｇの溶融ポリグリコール６０００基材に加え、十分に撹拌し、チラーとしてジメチルベンゼンシリコーン油を用いて滴剤（drop pill）を調製し、乾燥して、７−ヒドロキシクマリンの滴剤を完成させる。滴剤は、血清クレアチニンを上昇させ、尿クレアチニンを下降させる疾患、及び糖尿病性腎症に対して十分な効果を発揮する。
【００２８】
〔実施例５：医薬組成物の分散性錠剤の調製〕
処方用量：２８０ｇのＤＭＰＣ、４０ｇのラクトース、７０ｇの微晶質セルロース、５．２５ｇのポリビニルピロリドン、２．５ｇのアスパルテーム、６ｇのポリビドン及び４ｇの重炭酸カリウム、の量を正確に計量し、主剤及び佐剤を等量ずつ増やして十分に混合し、８０メッシュの篩で２回篩にかけ、混合物を適切な容器に入れ、７５％ＥｔＯＨに溶解した１５％（ｇ／１００ml）ポリエチレン６０００の十分な量を加えて軟質にし、２０メッシュの篩によって砕いて湿潤顆粒にし、ほうろうプレートの上に塗布し、送風オーブンにより７０℃で２時間乾燥し、乾燥した顆粒を正確に計量し、２．２５ｇの残りのポリビニルピロリドン及び１％（w/w）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を加え、均一に混合し、φ７mmの円形打抜ダイで１０００個の粒剤に砕いて、１０００個のＤＰＭＣの分散性錠剤を作製する。本分散性錠剤は、糖尿病性腎症及びその合併症に対して十分な効果を発揮する。
【００２９】
〔実施例６：医薬組成物のペレット粒剤の調製〕
活性成分： ７０ｇ
微晶質セルロース： ０．４ｇ
砕いて１０００個の粒剤にする
【００３０】
調製方法：活性成分を微晶質セルロースと混合し、水で均一に湿潤して軟質にし、混合物を顆粒にし、２０メッシュの篩にかけ、８０℃で乾燥し、再び篩にかけ、次に砕いて、粒剤１個あたり７０．４mgであって粒剤１個あたり７０mgの活性成分を有する粒剤にする。本粒剤は、糖尿病性腎症及びその合併症に対して十分な効果を発揮する。
【００３１】
ＤＰＭＣは、本発明の医薬分野において使用されるが、糖尿病性腎症に対するその効果を証明するために、ＡＧＥにより誘導されるメサンギウム細胞のマトリックス増殖に対する効果及びＳＴＺ糖尿病性腎症モデルラットの病理変化に対する効果についての実験に、ＤＰＭＣを適用する。
【００３２】
＜実験１＞
ＡＧＥにより誘導されるメサンギウム細胞のマトリックス増殖に対するＤＰＭＣの効果
糖尿病性腎症の特異的な疾患兆候は、メサンギウム領域における細胞外マトリックスの増大により誘導される糸球体毛細血管間細胞のマトリックス硬化である。メサンギウム細胞は、糸球体腸間膜の主要な構成成分であり、収縮、内分泌、分化増殖、免疫及び食菌作用の多くの機能を有する糸球体の生理学的機能を維持する重要な役割を果たす。ＡＧＥは、メサンギウム細胞の細胞外マトリックス増殖を誘導することができ、このことは糖尿病性腎症の重要な病理変化である。
【００３３】
１．材料及び薬剤
ラットのメサンギウム細胞株ＨＢＺＹ−１（Wuhan cell & biology institute）；ＤＰＭＣ、桑白皮の水抽出物；ウシ血清アルブミン、Ｄ−ブドウ糖（sigma company）；仔牛血清（Sijiqing serum factory, Hangzhou）；ＴＧＦβ−１抗体（Canta Cruz）；ＤＡＢ発色システム（Gene Tech Biotechnology CompanyLimited）；ヒドロキシプロリン含有量測定キット（Nanjing Jiancheng company）。
【００３４】
２．実験方法
２．１ 桑白皮及びＡＧＥの水抽出物の調製
桑白皮の水抽出物の調製
十分な量の桑白皮の乾燥根皮質を粉末に粉砕し、１０倍の水を加え、還流下で２時間毎に３回抽出し、抽出物をまとめ、真空下で濃縮して使用のための特定の容量にする。
【００３５】
ＡＧＥの水抽出物の調製
グロブリン不含有５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び０．５mol/LのＤ−ブドウ糖を０．２mol/Lのリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ、ＰＨ＝７．２）に溶解し、０．２２μmの微細孔膜で濾過し、３７℃で６０日間インキュベートした。終末糖化産物（ＡＧＥ）のインキュベーションが終了した後、非結合材料を拡張透過法により清浄した。必要な濃度に希釈し、０．２２μmの微細孔膜で濾過した。
【００３６】
２．２ メサンギウム細胞の培養及び染色
メサンギウム細胞の病理変化を誘導するＡＧＥの濃度及び時間測定
対数増殖期のＨＢＺＹ−１細胞及び５％仔牛血清含有ＤＭＥＭ培地により単細胞懸濁液を調製し、１００μl／ウエル（細胞量：１×１０４／ウエル）を取り出して、９６ウエルプレートに入れ、５％ＣＯ２インキュベーターにより３７℃で２４時間インキュベートし、血清不含有ＤＭＥＭの１００μlに変えて、更に２４時間インキュベートして、細胞を休止期にする（同期化）。上清を廃棄し、５％仔牛血清、及び段階希釈による異なる濃度のＡＧＥの１０μlを含有するＤＥＭＥ培地の９０μlを、１群あたり６回繰り返して加え、それぞれ勾配時間によりインキュベートし、ＭＴＴによりラットのメサンギウム細胞の繁殖程度を測定する。その結果は、０．２５mg/mlのＡＧＥ及び４８時間のインキュベーションが実験にとって最高の条件であったことを示す。
【００３７】
ＨＢＺＹ−１細胞を同期化まで増殖させるために、ポリ−Ｌ−リシンで前処理したカバーガラスを２４ウエル細胞培養プレートに入れる。上清を廃棄し、８００μlのＤＭＥＭ培地、１００μlのＡＧＥ（最終濃度は０．２５mg/mlである）を各薬剤群に加え、次に、桑白皮の水抽出物（最終濃度は０．１g/Lである）又はＤＰＭＣ（最終濃度は０．５、５、２５又は１２５nM/Lである）の１００μlを加える。ＡＧＥ群に９００μlのＤＭＥＭ培地及び１００μlのＡＧＥ（最終濃度は０．２５mg/mlであった）を加えたとき、正常対照群には１mlのＤＭＥＭ培地を加える。各群では６回繰り返す。次に全ての群を５％ＣＯ２インキュベーターにより３７℃で４８時間インキュベートする。細胞をカバーガラスで完全に覆った後、ヒドロキシプロリンの含有量測定のために細胞上清の吸引を行い、カバーガラスを取り出して免疫細胞化学染色を行う。
【００３８】
ＴＧＦβ−１染色の工程：細胞で覆われたカバーガラスを４％パラホルムアルデヒドにより３０分間固定し、内因性ホースラディッシュペルオキシダーゼを、その都度調製した３％Ｈ２Ｏ２メタノール溶液で１０分間不活性化し、蒸留水で３回清浄し、非特異的抗原を、５％ＢＳＡで２０分間ブロックし、ＴＧＦβ−１（１：５００）を滴加し、４０℃で一晩維持し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）により２分間で３回洗浄し、ヤギの抗マウスビオチン化抗体を滴加し、３７℃で３０分間保持し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）により２分間で３回洗浄し、ＨＲＰで標識されたアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体を滴加し、３７℃で３０分間保持し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）により５分間で４回洗浄し、５０μlのＤＡＢ発色液を滴加し、室温で１５分間発色させ、蒸留水で均一に清浄し、ヘマトキシリンで１分間再び軽く染色し、水で洗浄し、アルコールで脱水する。
【００３９】
ジメチルベンゼンで透過化処理し、カバーガラスをneutro-gummiで覆う。
【００４０】
３ 統計分析
ラットのメサンギウム細胞の培養液のヒドロキシプロリンの含有量を測定し、ｔ−検定で分析してｘ(平均)±ｓで表し、顕微鏡によりラットのメサンギウム細胞の免疫組織化学写真におけるＴＧＦβ−１発現を観察する。
【００４１】
４ 結果
ＡＧＥにより誘導されるラットのメサンギウム細胞の上清におけるヒドロキシプロリンの含有量の増加に対するＤＰＭＣの効果
表１に示されているように、桑白皮の水抽出物及び異なる用量のＤＰＭＣは、全て、ＡＧＥにより誘導されるラットのメサンギウム細胞の上清におけるヒドロキシプロリンの含有量増加を減少することができる。更に、大用量のＤＰＭＣ（１２５nM/L）は、最高の成果をあげ、桑白皮の水抽出物よりも明らかに良好である。
【００４２】
表１ ＡＧＥにより誘導されるラットのメサンギウム細胞の上清におけるヒドロキシプロリンの含有量の増加に対するＤＰＭＣの効果
【表１】
【００４３】
４．２ ＡＧＥにより誘導されるラットのメサンギウム細胞のＴＧＦβ−１発現に対するＤＰＭＣの効果
図１に示されているように、ＡＧＥは、ラットのメサンギウム細胞のＴＧＦβ−１発現を増加させることができる。桑白皮の水抽出物及び異なる用量のＤＰＭＣは、全て、ラットのメサンギウム細胞のＴＧＦβ−１発現の増加を抑制することができる。更に、大用量のＤＰＭＣ（１２５nM/L）は、最高の成果をあげ、異なる用量のＤＰＭＣは、桑白皮の水抽出物と比べてより良好であるか又は同等である。
【００４４】
＜実験２＞
ＳＴＺ糖尿病性腎症ラットの病理変化に対する効果
１ 材料及び試薬
ストレプトゾトシン（Sigma）；ウィスターラット（南医科大学の実験動物センターから提供された）；BIOBASE-PEARL分離自動生化学分析機（Shandong BIOBASE Company）。
【００４５】
２ 実験方法
２．１ 桑白皮の水抽出物の調製
十分な量の桑白皮の乾燥根皮質を粉末に粉砕し、１０倍の水を加え、還流下で２時間毎に３回抽出し、抽出物をまとめ、使用するために、真空下で濃縮して特定の容量にする。
【００４６】
２．２ 投与
低用量のＳＴＺを数回投与することによりモデル化し、糖尿病性腎症のモデルラットとして測定し、１０匹のマウス／群で以下の６群に分ける：モデル群、陽性薬剤対照群（アミノグアニジン、１００mg/kg）、桑白皮の水抽出物群、３つの異なる濃度用量のＤＰＭＣ群（高用量群：４mg/kg；中用量群：２mg/kg；低用量：１mg/kg）、正常対照群。
【００４７】
各群には、異なる濃度で同じ容量の対応する薬剤又は生理食塩水を、１４週間にわたって毎日胃内投与により与える。
【００４８】
３ 統計分析
投与が終了した後、２４時間の尿を収集し、尿量を計算し、尿の総タンパク質、微量アルブミン及び尿クレアチニンの含有量を測定し、眼窩から血液を得て、自動生化学分析機により生化学的指標を測定し、２つの腎臓を取り出し、ホルマリンで固定し、組織病理学実験まで維持する。
【００４９】
全ての測定の統計分析を、クラス間ｔ−検定により計算して、ｘ(平均)±ｓで表す。
【００５０】
４ 結果
４．１ ＳＴＺにより誘導される糖尿病性腎症のラットモデルの２４時間尿量、尿の総タンパク質、微量アルブミン及び尿クレアチニンに対するＤＰＭＣの効果
表２に示されているように、モデル群において、２４時間尿量、尿総タンパク質の排出量及び微量アルブミンが増加し、尿中のクレアチニンの排出量は明らかに減少しているが、それにもかかわらず、桑白皮の抽出物及び異なる用量は、全て、上記の変化を抑制することができる、すなわち、糖尿病性腎症のラットの２４時間尿量を減少させ、尿総タンパク質及び微量アルブミンの排出量を低下させ、クレアチニンの排出量を増加させることができる。これらの群のうち、ＤＰＭＣ用量の上昇につれて効果は強化され、用量効果関係が明らかである。更に、大用量のＤＰＭＣの効果は、桑白皮の水抽出物よりも明らかに良好である。
【００５１】
表２ ラットの尿量、尿の総タンパク質、微量アルブミン及び尿クレアチニンに対するＤＰＭＣの効果（ｘ(平均)±ｓ、ｎ＝１０）。
【表２】
【００５２】
４．２ 糖尿病性腎症のラットの血清の生化学的指標に対するＤＰＭＣの効果
表３に示されているように、桑白皮の水抽出物及び異なる用量のＤＰＭＣは、全て、糖尿病性腎症のラットの血清総コレステロール（ＴＣ）、マロンアルデヒド（ＭＤＡ）、血清クレアチニン（ＳＣ）、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、ＡＧＥ及び低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）のレベルを減少し、血清スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）のレベルを上昇させることができる。用量の上昇につれてＤＰＭＣの効果は強化され、更に、ＤＰＭＣの全ての濃度の効果は、桑白皮の水抽出物と比べてより良好であるか又は同等である。
【００５３】
表３ 糖尿病性腎症のラットの血清の生化学的指標に対するＤＰＭＣの効果（ｘ(平均)±ｓ、ｎ＝１０）
【表３】
【００５４】
４．３ 糖尿病性腎症モデルのラット糸球体のＣＴＧＦ発現及び病理組織学に対するＤＰＭＣの効果
表４に示されているように、正常対照群と比較すると、糖尿病性腎症モデルの糸球体ＣＴＧＦ発現は増加し（Ｐ＜０．０１）、病理組織の損傷も増加し、桑白皮の水抽出物及び異なる用量のＤＰＭＣは、全て、ＳＴＺにより誘導された糖尿病性腎症のラットモデルの糸球体ＣＴＧＦ発現を減少することができ、損傷の病理スコアを下げることができる。用量の上昇につれてＤＰＭＣの効果は強化され、更に、ＤＰＭＣの全ての濃度の効果は、桑白皮の水抽出物と比べてより良好であるか又は同等である。
【００５５】
表４ 糖尿病性腎症モデルのラット糸球体のＣＴＧＦ発現及び病理組織学に対するＤＰＭＣの効果（ｘ(平均)±ｓ、ｎ＝１０）
【表４】
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図１Ｆ】
【図１Ｇ】
【図１Ｈ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性成分としての４，４′−ジフェニルメタン−ビス（メチル）カルバメート、及び、従来の薬剤担体から構成され、活性成分が０．１〜９９．５重量％の割合で含まれる、糖尿病性腎症のための医薬組成物。
【請求項２】
活性成分が、５〜７０重量％の割合で含まれる、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
従来の薬剤担体が、希釈剤、賦形剤、充填剤、接着剤、湿潤剤、崩壊剤、吸収促進剤、界面活性剤、吸収担体、潤滑剤、風味剤及び甘味料のうちの少なくとも１つを含み、ここで、賦形剤が水であり、充填剤が、デンプン、スクロース又はラクトースであり、接着剤が、セルロース誘導体、アルギン酸塩、ゼラチン及びポリビニルピロリドンからなる群より選択されるうちの少なくとも１つであり、湿潤剤がグリセリンであり、崩壊剤が、寒天、炭酸カルシウム又は重炭酸ナトリウムであり、吸収促進剤が第四級アンモニウム化合物であり、界面活性剤がパルミチルアルコールであり、吸収担体が、カオリン粘土又は石けん粘土であり、潤滑剤が、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム又はポリエチレングリコールである、請求項１又は２記載の医薬組成物。
【請求項４】
ペレット剤、顆粒剤、粒剤、カプセル剤又は液剤のような臨床投与形態に調製することができる、請求項１又は２記載の医薬組成物。
【請求項５】
４，４′−ジフェニルメタン−ビス（メチル）カルバメートを従来の薬剤担体と混合すること、及び、医薬組成物を得るために、特定の調製方法に従って調製することを含む、請求項１記載の医薬組成物の調製方法。
【請求項６】
４，４′−ジフェニルメタン−ビス（メチル）カルバメートを調製する方法が、以下：
Ｄ．桑白皮（Cortex Mori）の乾燥根皮層を粉末に粉砕し、水を加え、還流下で抽出し、抽出物をまとめ、必要な容量にまで真空下で濃縮すること；
Ｅ．マクロ孔質樹脂に加え、水、続いて９５％ＥｔＯＨで溶離し、９５％ＥｔＯＨ溶離液を収集し、真空下で濃縮すること；
Ｆ．シリカゲルに加え、石油、石油−酢酸エーテル１００：１、石油−酢酸エーテル５０：１のそれぞれで溶離し、石油−酢酸エーテル５０：１の溶離によって無色の層状結晶を得ること
を含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
糖尿病性腎症のための医薬組成物の調製における４，４′−ジフェニルメタン−ビス（メチル）カルバメートの使用。
【請求項１】
活性成分としての４，４′−ジフェニルメタン−ビス（メチル）カルバメート、及び、従来の薬剤担体から構成され、活性成分が０．１〜９９．５重量％の割合で含まれる、糖尿病性腎症のための医薬組成物。
【請求項２】
活性成分が、５〜７０重量％の割合で含まれる、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
従来の薬剤担体が、希釈剤、賦形剤、充填剤、接着剤、湿潤剤、崩壊剤、吸収促進剤、界面活性剤、吸収担体、潤滑剤、風味剤及び甘味料のうちの少なくとも１つを含み、ここで、賦形剤が水であり、充填剤が、デンプン、スクロース又はラクトースであり、接着剤が、セルロース誘導体、アルギン酸塩、ゼラチン及びポリビニルピロリドンからなる群より選択されるうちの少なくとも１つであり、湿潤剤がグリセリンであり、崩壊剤が、寒天、炭酸カルシウム又は重炭酸ナトリウムであり、吸収促進剤が第四級アンモニウム化合物であり、界面活性剤がパルミチルアルコールであり、吸収担体が、カオリン粘土又は石けん粘土であり、潤滑剤が、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム又はポリエチレングリコールである、請求項１又は２記載の医薬組成物。
【請求項４】
ペレット剤、顆粒剤、粒剤、カプセル剤又は液剤のような臨床投与形態に調製することができる、請求項１又は２記載の医薬組成物。
【請求項５】
４，４′−ジフェニルメタン−ビス（メチル）カルバメートを従来の薬剤担体と混合すること、及び、医薬組成物を得るために、特定の調製方法に従って調製することを含む、請求項１記載の医薬組成物の調製方法。
【請求項６】
４，４′−ジフェニルメタン−ビス（メチル）カルバメートを調製する方法が、以下：
Ｄ．桑白皮（Cortex Mori）の乾燥根皮層を粉末に粉砕し、水を加え、還流下で抽出し、抽出物をまとめ、必要な容量にまで真空下で濃縮すること；
Ｅ．マクロ孔質樹脂に加え、水、続いて９５％ＥｔＯＨで溶離し、９５％ＥｔＯＨ溶離液を収集し、真空下で濃縮すること；
Ｆ．シリカゲルに加え、石油、石油−酢酸エーテル１００：１、石油−酢酸エーテル５０：１のそれぞれで溶離し、石油−酢酸エーテル５０：１の溶離によって無色の層状結晶を得ること
を含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
糖尿病性腎症のための医薬組成物の調製における４，４′−ジフェニルメタン−ビス（メチル）カルバメートの使用。
【公表番号】特表２０１１−５２８３２０（Ｐ２０１１−５２８３２０Ａ）
【公表日】平成２３年１１月１７日（２０１１．１１．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５４６２０１（Ｐ２０１０−５４６２０１）
【出願日】平成２１年４月１日（２００９．４．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００９／０００３５１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０８１２６３
【国際公開日】平成２２年７月２２日（２０１０．７．２２）
【出願人】（５１０１７８３４５）グアンヂョウ コンスン メディスン アール アンド ディー カンパニー リミテッド (2)
【氏名又は名称原語表記】ＧＵＡＮＧＺＨＯＵ ＣＯＮＳＵＮ ＭＥＤＩＣＩＮＥ Ｒ ＆ Ｄ Ｃｏ．，ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．７１，Ｄｏｎｇｐｅｎｇ Ｒｏａｄ，Ｅａｓｔｅｒｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，Ｅｃｏｎｏｍｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｐａｒｋ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０ ５３０，Ｐ．Ｒ．ＣＨＩＮＡ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１１月１７日（２０１１．１１．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年４月１日（２００９．４．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００９／０００３５１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０８１２６３
【国際公開日】平成２２年７月２２日（２０１０．７．２２）
【出願人】（５１０１７８３４５）グアンヂョウ コンスン メディスン アール アンド ディー カンパニー リミテッド (2)
【氏名又は名称原語表記】ＧＵＡＮＧＺＨＯＵ ＣＯＮＳＵＮ ＭＥＤＩＣＩＮＥ Ｒ ＆ Ｄ Ｃｏ．，ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．７１，Ｄｏｎｇｐｅｎｇ Ｒｏａｄ，Ｅａｓｔｅｒｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，Ｅｃｏｎｏｍｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｐａｒｋ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０ ５３０，Ｐ．Ｒ．ＣＨＩＮＡ
【Ｆターム（参考）】
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