糖脂質の製造方法
【課題】生分解性が高く、低毒性で環境に優しい、糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体を、食品工業、化粧品工業、医薬品工業、化学工業、環境分野等に広く普及をはかるため、安価で容易に製造する方法を提供する。
【解決手段】エステル化反応またはエステル交換反応により、糖脂質型バイオサーファクタントに脂肪酸または脂肪酸誘導体を導入する。脂質等が添加され、糖脂質型バイオサーファクタント生産微生物が培養されている培養液の凍結乾燥物を有機溶媒に溶解して反応させることにより、副生成物の少ない糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体を低コストで製造できる。
【解決手段】エステル化反応またはエステル交換反応により、糖脂質型バイオサーファクタントに脂肪酸または脂肪酸誘導体を導入する。脂質等が添加され、糖脂質型バイオサーファクタント生産微生物が培養されている培養液の凍結乾燥物を有機溶媒に溶解して反応させることにより、副生成物の少ない糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体を低コストで製造できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖脂質の製造方法に関するものである。より詳細には、微生物が生産する糖脂質型バイオサーファクタントであるマンノシルエリスリトールリピッドのエリスリトールの水酸基に脂肪酸エステルを有するトリアシル体糖脂質の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
糖脂質等のバイオサーファクタントは、生分解性が高く、低毒性で環境に優しく、新規な生理機能を持つといわれている。それゆえ、食品工業、化粧品工業、医薬品工業、化学工業、環境分野等に広く普及することが期待されており、そのためには、多くの種類のバイオサーファクタントが必要である。しかしながら、現在までに発見されているバイオサーファクタントの種類は、２０数種類と少ない。
【０００３】
大豆油を炭素源とする選択培地を用いて生産菌の探索を行いＣａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ Ｔ−３４株がマンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）を大量に生産することが見出されている（非特許文献１）。マンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）は酵母が作る天然系の界面活性剤であり種々の生理作用が報告されている（非特許文献２）。また最近ではエリスリトールがマンニトールに代わったマンノシルマンニトールリピッド（ＭＭＬ）が見出されている（特許文献１）。バイオサーファクタントの用途としては、抗炎症剤及び抗アレルギー剤（特許文献２）、養毛・育毛剤（特許文献３）としての有用性や、抗菌作用（特許文献４）や表面張力低下作用（特許文献５）が知られている。
【特許文献１】特開２００５−１０４８３７号公報
【特許文献２】特開２００５−６８０１５号公報
【特許文献３】特開２００３−２６１４２４号公報
【特許文献４】特開昭５７−１４５８９６号公報
【特許文献５】特開昭６１−２０５４５０号公報
【非特許文献１】バイオテクノロジー レター、２３，１７０９（２００１）
【非特許文献２】ジャーナル オブ バイオサイエンス アンド バイオエンジニアリング、９４，１８７（２００２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
生分解性が高く、低毒性で環境に優しい、糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体を、食品工業、化粧品工業、医薬品工業、化学工業、環境分野等に広く普及をはかるため、安価で容易に製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ＭＥＬ生産微生物の培養液中に存在するＭＥＬ、脂肪および加水分解酵素を利用することにより、高効率かつ安価にトリアシルＭＥＬを製造できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００６】
すなわち本発明は、以下の発明を提供するものである。
【０００７】
（１）エステル化反応またはエステル交換反応により、糖脂質型バイオサーファクタントに脂肪酸または脂肪酸誘導体を導入することを特徴とする糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体製造方法。
【０００８】
（２）糖脂質型バイオサーファクタントが、マンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）またはマンノシルマンニトールリピッド（ＭＭＬ）であることを特徴とする（１）に記載の糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体製造方法。
【０００９】
（３）糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体が、式（Ｉ）
【００１０】
【化１】
【００１１】
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ独立して炭化水素基または酸素原子含有炭化水素基を示し、マンノースの４位および６位の水酸基のいずれか一方、あるいは両方の水素原子がアセチル基に置換されていてもよい。）で表される糖脂質であることを特徴とする（２）に記載の糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体製造方法。
【００１２】
（４）上記式（Ｉ）のＲ１、Ｒ２およびＲ３の炭素数が６〜２０であることを特徴とする（３）に記載の糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体製造方法。
【００１３】
（５）上記脂肪酸または脂肪酸誘導体が、油類、高級脂肪酸または合成エステル由来であることを特徴とする（１）〜（４）のいずれかに記載の糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体製造方法。
【００１４】
（６）疎水性環境下において、以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を混和することにより上記エステル化反応またはエステル交換反応が進行することを特徴とする（５）に記載の糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体製造方法。
（ａ）糖脂質型バイオサーファクタント；
（ｂ）油類、高級脂肪酸および合成エステルから選択される１種または２種以上の混合物；
（ｃ）加水分解酵素。
【００１５】
（７）糖脂質型バイオサーファクタント生産微生物を培養している培養液であって、油類、高級脂肪酸および合成エステルから選択される１種または２種以上の混合物が添加された培養液の凍結乾燥物中に含有される上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を用いることを特徴とする（６）に記載の糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体製造方法。
【００１６】
（８）糖脂質型バイオサーファクタント生産微生物を培養している培養液であって、油類、高級脂肪酸および合成エステルから選択される１種または２種以上の混合物が添加された培養液中に生成する沈殿物に含有される上記（ａ）および（ｂ）を用いることを特徴とする（６）に記載の糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体製造方法。
【００１７】
（９）糖脂質型バイオサーファクタント生産微生物を培養している培養液であって、油類、高級脂肪酸および合成エステルから選択される１種または２種以上の混合物が添加された培養液の上清の凍結乾燥物に含有される上記（ｃ）を用いることを特徴とする（６）に記載の糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体製造方法。
【００１８】
（１０）上記加水分解酵素が、リパーゼ、プロテアーゼおよびエステラーゼから選択される少なくとも１種以上であることを特徴とする（６）に記載の糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体製造方法。
【００１９】
（１１）上記エステル化反応またはエステル交換反応が、有機溶媒中で進行することを特徴とする（６）に記載の糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体製造方法。
【発明の効果】
【００２０】
本発明により、糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体を高効率かつ安価に製造することができる。また、糖脂質型バイオサーファクタントに任意の脂肪酸が結合したトリアシル体を容易に製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明に係る糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体製造方法（以下「本発明に係る製造方法」と記載する）は、エステル化反応またはエステル交換反応により、糖脂質型バイオサーファクタントに脂肪酸または脂肪酸誘導体を導入するものであればよい。
【００２２】
「バイオサーファクタント」とは生物によって生み出される界面活性能力や乳化能力を有する物質の総称であり、優れた界面活性や，高い生分解性を示すばかりでなく，様々な生理作用を有していることから合成界面活性剤とは異なる挙動・機能を発現する可能性がある。
【００２３】
「糖脂質型バイオサーファクタント」とは、微生物によって生産される天然系の界面活性剤のうち、糖質と脂肪酸部分からなるサーファクタントである。マンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）、マンノシルマンニトールリピッド（ＭＭＬ）、ソホロリピッド、ラムノリピッド、トレハロースリピッドなどが知られている。いずれも生分解性が高く環境に負荷が少ない、生体に対しても安全性の高い素材である。なかでも、本発明に係る製造方法に用いられる糖脂質型バイオサーファクタントとしては、ＭＥＬまたはＭＭＬが好適である。
【００２４】
ＭＥＬは、マンノースの４位および６位のアセチル基の有無からＭＥＬ−Ａ、ＭＥＬ−Ｂ、ＭＥＬ−ＣおよびＭＥＬ−Ｄの４種類が知られている。式（ＩＩ）にＭＥＬ−Ａの構造を示す。式（ＩＩ）中、Ｒ１およびＲ２は炭化水素基を示す。すなわち、ＭＥＬ−Ａは、式（ＩＩ）中、マンノースの２位、３位に炭素数５〜１９のアルカノイル基を有し、マンノースの４位、６位にアセチル基を有する化合物である。なお、ＭＥＬ−Ｂは式（ＩＩ）においてマンノースの４位のＡｃがＨであり、ＭＥＬ−Ｃは式（ＩＩ）においてマンノースの６位のＡｃがＨであり、ＭＥＬ−Ｄは式（ＩＩ）においてマンノースの４位および６位のＡｃがいずれもＨである。
【００２５】
【化２】
【００２６】
ＭＭＬは上記式（ＩＩ）において、エリスリトールが炭素数の２個多いマンニトールに置換された構造を有する。
【００２７】
「糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体を製造する」とは、例えばＭＥＬのエリスリトール部の水酸基やＭＭＬのマンニトール部の水酸基に脂肪酸または脂肪酸誘導体を導入し、３つの脂肪酸側鎖を有する糖脂質を製造することであり、「糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル化」と同義である。
【００２８】
上記ＭＥＬのエリスリトール部の水酸基やＭＭＬのマンニトール部の水酸基への脂肪酸または脂肪酸誘導体の導入は、エステル化反応またはエステル交換反応により行われる。ただし、製造された糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体の脂肪酸側鎖がＭＥＬのエリスリトール部の水酸基やＭＭＬのマンニトール部の水酸基とエステル結合していれば、その反応がエステル化反応であるかエステル交換反応であるかが特定される必要はない。
【００２９】
導入される脂肪酸は特に限定されず、飽和脂肪酸でも不飽和脂肪酸でもよい。不飽和脂肪酸の場合、複数の二重結合を有していてもよい。炭素鎖の炭素数は特に限定されないが、６〜２０が好ましい。また、炭素鎖は直鎖状であってもよく分岐鎖状であってもよい。脂肪酸誘導体としては、酸素原子を含む脂肪酸を挙げることができる。含まれる酸素原子の数および位置は限定されない。
【００３０】
以下、ＭＥＬを例として、本発明に係る製造方法について説明するが、これに限定されるものではない。
【００３１】
本発明に係る製造方法により製造されるＭＥＬのトリアシル体は、式（Ｉ）で表される構造を有する。
【００３２】
【化３】
【００３３】
式（Ｉ）中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ独立して炭化水素基または酸素原子含有炭化水素基を示し、マンノースの４位および６位の水酸基のいずれか一方、あるいは両方の水素原子がアセチル基に置換されていてもよい。炭化水素基は飽和結合のみを有していてもよく、不飽和結合を有していてもよい。不飽和結合を有している場合、複数の二重結合を有していてもよい。炭素鎖は直鎖状であってもよく分岐鎖状であってもよい。また、酸素原子含有炭化水素基の場合、含まれる酸素原子の数および位置は限定されない。
【００３４】
式（Ｉ）中、Ｒ１、Ｒ２は炭素数が６〜２０であることが好ましく、脂肪族アシル基（ＲＣＯ−）としてマンノースの２位および３位の水酸基とエステル結合をしており、残りの水酸基にはアセチル基がエステル結合していてもよい。Ｒ３は炭素数が６〜２０であることが好ましく、脂肪族アシル基（ＲＣＯ−）としてエリスリトールの一級水酸基とエステル結合をしている。
【００３５】
本発明に係る製造方法において、ＭＥＬのエリスリトール部の水酸基に導入される脂肪酸または脂肪酸誘導体は油類、高級脂肪酸または合成エステル由来であることが好ましい。
【００３６】
「油類」としては、植物油、動物油、鉱物油およびその硬化油であればよい。具体的には、アボカド油、オリーブ油、ゴマ油、ツバキ油、月見草油、タートル油、マカデミアンナッツ油、トウモロコシ油、ミンク油、ナタネ油、卵黄油、パーシック油、小麦胚芽油、サザンカ油、ヒマシ油、アマニ油、サフラワー油、綿実油、エノ油、大豆油、落花生油、茶実油、カヤ油、コメヌカ油、キリ油、ホホバ油、カカオ脂、ヤシ油、馬油、パーム油、パーム核油、牛脂、羊脂、豚脂、ラノリン、鯨ロウ、ミツロウ、カルナウバロウ、モクロウ、キャンデリラロウ、スクワラン等の動植物油およびその硬化油。流動パラフィン、ワセリン等の鉱物油、トリパルミチン酸グリセリン等の合成トリグリセリンが挙げられる。好ましくはアボカド油、オリーブ油、ゴマ油、ツバキ油、月見草油、タートル油、マカデミアンナッツ油、トウモロコシ油、ミンク油、ナタネ油、卵黄油、パーシック油、小麦胚芽油、サザンカ油、ヒマシ油、アマニ油、サフラワー油、綿実油、エノ油、大豆油、落花生油、茶実油、カヤ油、コメヌカ油、より好ましくはオリーブ油、大豆油である。
【００３７】
「高級脂肪酸」としては、例えばカプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、１２−ヒドロキシステアリン酸、イソステアリン酸、ウンデシン酸、トール酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸などが挙げられる。好ましくはラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ステアリン酸、ウンデシレン酸、より好ましくはオレイン酸、リノール酸、ウンデシレン酸である。
【００３８】
「合成エステル」としては、例えば、カプロン酸メチル、カプリル酸メチル、カプリン酸メチル、ラウリン酸メチル、ミリスチン酸メチル、パルミチン酸メチル、オレイン酸メチル、リノール酸メチル、リノレン酸メチル、ステアリン酸メチル、ウンデシン酸メチル、カプロン酸エチル、カプリル酸エチル、カプリン酸エチル、ラウリン酸エチル、ミリスチン酸エチル、パルミチン酸エチル、オレイン酸エチル、リノール酸エチル、リノレン酸エチル、ステアリン酸エチル、ウンデシン酸エチル、カプロン酸ビニル、カプリル酸ビニル、カプリン酸ビニル、ラウリン酸ビニル、ミリスチン酸ビニル、パルミチン酸ビニル、オレイン酸ビニル、リノール酸ビニル、リノレン酸ビニル、ステアリン酸ビニル、ウンデシン酸ビニル、オクタン酸セチル、ミリスチン酸オクチルドデシル、ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸ミリスチル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、ラウリン酸ヘキシル、オレンイ酸デシル、ジメチルオクタン酸、乳酸セチル、乳酸ミリスチル等が挙げられる。好ましくはラウリン酸メチル、ミリスチン酸メチル、パルミチン酸メチル、オレイン酸メチル、リノール酸メチル、リノレン酸メチル、ステアリン酸メチル、ウンデシレン酸メチル、より好ましくはオレイン酸メチル、リノール酸メチル、ウンデシレン酸メチルである。
【００３９】
本発明に係る製造方法は、疎水性環境下において、（ａ）糖脂質型バイオサーファクタント；（ｂ）油類、高級脂肪酸および合成エステルから選択される１種または２種以上の混合物；および（ｃ）加水分解酵素を混和することによりエステル化反応またはエステル交換反応が進行するものであればよい。
【００４０】
疎水性環境下は特に限定されないが、有機溶媒中において上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を反応させることを挙げることができる。さらに、反応溶液中にモレキュラーシーブスを加えてもよい。有機溶媒としては、上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を可溶化できるものであれば限定されない。全部を可溶化できなくても一部を可溶化できるものであればよい。また、有機溶媒は複数の有機溶媒の混合物でもよい。具体的には、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、アセトン、プロパノン、ブタノン、ペンタン−２−オン、１，２−エタンジオール、２，３−ブタンジオール、ジオキサン、アセトニトリル、２−メチル−ブタン−２−オール、第３級ブタノール、２−メチルプロパノール、４−ヒドロキシ−２−メチルペンタノン、テトラヒドロフラン、ヘキサン、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ピリジン、メチルエチルケトンなどを挙げることができる。好ましくはアセトン、テトラヒドロフラン、第３級ブタノール、アセトニトリル、ジオキサン、より好ましくはアセトンである。
【００４１】
また、疎水性環境は無溶媒でも構わない。
【００４２】
加水分解酵素としては、リパーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼが挙げられる。これらの中から選択される少なくとも１種を用いることが好ましく、複数の加水分解酵素を用いてもよい。好ましくはリパーゼ、エステラーゼ、より好ましくはリパーゼである。
【００４３】
本発明に係る製造方法においては、糖脂質型バイオサーファクタント生産微生物を培養している培養液であって、油類、高級脂肪酸および合成エステルから選択される１種または２種以上の混合物が添加された培養液の凍結乾燥物に含有される上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を用いることが好ましい。
【００４４】
また、上記培養液中に生成する沈殿物に含有される上記（ａ）および（ｂ）を用い、（ｃ）を外部から添加してもよい。
【００４５】
さらに、上記培養液の上清に含有される上記（ｃ）を用いることができる。
【００４６】
ＭＥＬ生産微生物としては、本発明者らはPseudozyma antarctica NBRC 10736 を用いているがこれに限定されず、Candida antarctica、Candida sp.、等を用いることができる。これらの微生物の培養により、容易にＭＥＬが得られることは当業者に周知である。
【００４７】
上記ＭＥＬ生産微生物の培養に用いる培養液としては、酵母エキス、ペプトン等のＮ源、グルコース、フルクトース等のＣ源、および硝酸ナトリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム７水塩等の無機塩類からなる一般的な組成の培養液を用いることができ、さらに油類、高級脂肪酸および合成エステルから選択される１種または２種以上の混合物が添加される。なかでも植物油脂を添加することが好ましい。植物油脂は特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、大豆油、菜種油、コーン油、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、パーム油などが挙げられ、これらの中でも、大豆油がＭＥＬの生産効率（生産量、生産速度、および収率）を向上させることができる点で特に好ましい。これらは、１種を単独で、または２種以上を併用しても構わない。
【００４８】
培養条件（培養温度、培養時間など）は、任意に設定できる。例えば、本発明者らは、Pseudozyma antarctica NBRC 10736 を３０℃、２００ｒｐｍ（攪拌回転）、０．５Ｌ／ｍｉｎ（Ａｉｒ）の条件で５Ｌ−ｊａｒを用いて１１日間培養し、大豆油を２日おきに追加添加するという条件で培養している。ただし、これに限定されるものではない。
【００４９】
ＭＥＬを製造するためにＭＥＬ生産微生物を上記のようにして培養した培養液（菌体を含む）を凍結乾燥すれば、上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含有する凍結乾燥物が得られる。培養液の凍結乾燥方法は特に限定されず、市販の凍結乾燥装置等を用いて公知の方法により行うことができる。培養液を凍結乾燥する理由は、加水分解酵素を触媒としてエステル化反応またはエステル交換反応を行う場合、水が存在していると加水分解反応が生じるためエステル化反応またはエステル交換反応が進行し難くなるためである。
【００５０】
また、培養液中に生成される沈殿物は、培養液を遠心分離し上清を除去することにより取得することができる。この沈殿物には上記（ａ）および（ｂ）が含まれている。得られた沈殿物は、そのままトリアシル体の製造に用いることができる。あるいは、沈殿物に酢酸エチル等の適当な抽出溶媒を添加し、十分攪拌後遠心分離して得られた上清をトリアシル体の製造に用いてもよい。さらに当該上清をエバポレーターで濃縮したものをトリアシル体の製造に用いてもよい。なお、遠心分離により除去した培養液上清中にも（ａ）が含まれるため、上清を酢酸エチルで抽出して得られた（ａ）をトリアシル体の製造に用いることができる。
【００５１】
また、培養液を遠心分離して上清を取得し、これを凍結乾燥することにより上記（ｃ）を含有する凍結乾燥物が得られる。培養液の凍結乾燥方法は特に限定されず、市販の凍結乾燥装置等を用いて公知の方法により行うことができる。
【００５２】
また、培養液からＭＥＬを抽出または精製し、これを上記（ａ）として用いることができる。ＭＥＬの抽出（回収）、精製方法としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができるが、例えば、培養液を遠心分離して油分を回収し、酢酸エチルエステルで抽出濃縮することにより回収できる。
【００５３】
抽出溶媒としては、水、アルコール類（例えば、メタノール、無水エタノール、エタノールなどの低級アルコール、またはプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコールなどの多価アルコール）、アセトンなどのケトン類、ジエチルエーテル、ジオキサン、アセトニトリル、酢酸エチルなどのエステル類、キシレン、ベンゼン、クロロホルムなどの有機溶媒を、単独であるいは２種類以上の混液を任意に組み合わせて使用することができ、また、各々の溶媒抽出物が組み合わされたものでも使用することができる。
【００５４】
抽出方法は特に制限されるものはないが、通常、常温から常圧下での溶媒の沸点の範囲であればよく、抽出後は濾過またはイオン交換樹脂を用い、吸着・脱色・精製して溶液状、ペースト状、ゲル状、粉末状とすればよい。多くの場合は、そのままの状態で利用できるが、必要であれば、その効力に影響のない範囲でさらに脱臭、脱色などの精製処理を加えてもよい。脱臭・脱色等の精製処理手段としては、活性炭カラムなどを用いればよく、抽出物質により一般的に適用される通常の手段を任意に選択して行えばよい。必要に応じて、シリカゲルカラムを用いて精製することにより、純度の高いＭＥＬを得ることができる。なお、得られるＭＥＬの中に少量のトリアシルＭＥＬが含まれる。
【００５５】
以下に、具体的なトリアシルＭＥＬ製造方法について説明するが、これらに限定されるものではない。
【００５６】
（i）精製ＭＥＬの有機溶媒溶液に、油類、高級脂肪酸および合成エステルから選択される１種または２種以上の混合物（以下「油脂等」と記載する）並びに加水分解酵素を添加して反応させる場合
精製ＭＥＬは上述のように培養液から精製したＭＥＬを用いることができる。なお、最終的に活性炭カラムやシリカゲルカラムを用いて脱臭、脱色処理をした精製ＭＥＬに限定されず、その前段階において抽出後濾過またはイオン交換樹脂処理を施した粗精製ＭＥＬも使用できる。
【００５７】
有機溶媒は特に限定されないが、アセトンが好ましい。
【００５８】
加水分解酵素は、市販のリパーゼ（例えば、ノボザイム４３５（ノボザイムズ社製）など）を好適に用いることができる。または、上述の培養液上清の凍結乾燥物（以下「上清凍結乾燥物」と記載する）を用いてもよい。上清凍結乾燥物を用いると加水分解酵素を購入する必要がないためコストを低く抑えることができる。
【００５９】
添加する油脂等は特に限定されない。ＭＥＬ製造用培養液に添加した油脂等と同一のものを添加してもよく、異なるものを添加してもよい。ここで添加した油脂等によりＭＥＬのエリスリトール部に導入される脂肪酸基が決定されるので、添加する油脂等を適宜選択することにより、所望の脂肪酸がエリスリトール部に導入されたトリアシルＭＥＬを製造することが可能となる。
【００６０】
この製造方法の場合、反応温度は１０〜１００℃、好ましくは２０〜５０℃、より好ましくは２５〜４０℃で、１日〜７日間攪拌すればよい。また、反応液にモレキュラーシーブスを添加してもよい。この製造方法により、材料として添加したＭＥＬがほぼ定量的にトリアシル体となる。この知見は当業者でも容易に予測できないことであった。
【００６１】
（ii）上述の培養液中の沈殿物（以下「培養沈殿物」と記載する）を用いる場合
培養沈殿物中にはＭＥＬおよび油脂等が含まれている。この培養沈殿物を有機溶媒に溶解し、これに加水分解酵素を添加して反応させればよい。さらにモレキュラーシーブスを添加してもよい。
【００６２】
有機溶媒は特に限定されないが、アセトンが好ましい。加水分解酵素は、市販のリパーゼ（例えば、ノボザイム４３５（ノボザイムズ社製）など）を好適に用いることができる。または、上記上清凍結乾燥物を用いてもよい。
【００６３】
この製造方法の場合、反応温度は１０〜１００℃、好ましくは２０〜５０℃、より好ましくは２５〜４０℃で、１日〜７日間攪拌すればよい。これにより、材料として添加したＭＥＬがほぼ定量的にトリアシル体となる。この知見は当業者でも容易に予測できないことであった。
【００６４】
この製造方法において、市販の加水分解酵素を用いずに上清凍結乾燥物を用いれば、ＭＥＬを製造するための培養液のみからトリアシルＭＥＬを製造することができ、何ら他の原料を購入する必要がないため、安価にトリアシルＭＥＬを製造することが可能となる。
【００６５】
（iii）上述の培養液の凍結乾燥物（以下「培養液凍結乾燥物」と記載する）を用いる場合
培養液凍結乾燥物にはＭＥＬ、油脂等および加水分解酵素が含まれている。したがって、培養液凍結乾燥物を有機溶媒に溶解し、反応させればよい。さらにモレキュラーシーブスを添加してもよい。有機溶媒は特に限定されないが、アセトンが好ましい。
【００６６】
この製造方法の場合、反応温度は１０〜１００℃、好ましくは２０〜５０℃、より好ましくは２５〜４０℃で、１日〜７日間攪拌すればよい。
【００６７】
この製造方法は、ＭＥＬを製造するための培養液を凍結乾燥するのみで、何ら他の原料を購入する必要がない。また、培養液を上清と沈殿物とに分けてそれぞれ別の操作を行う必要もない。したがって、非常に簡便かつ低コストで効率よくトリアシルＭＥＬを製造することが可能となる。
【００６８】
以上のように、本発明に係る製造方法を用いれば、副生成物がほとんど生成しないトリアシルＭＥＬの低コスト製造が可能となる。また、便宜上ＭＥＬを例として本発明を説明したが、トリアシルＭＥＬの事例を示せば、他の糖脂質型バイオサーファクタント（例えば、ＭＭＬなど）に応用できることを、当業者は容易に理解する。
【００６９】
また、本発明に係る製造方法を用いれば、添加する油類や高級脂肪酸や合成エステルを任意に変えることにより、培養液中から得られない新規なトリアシルＭＥＬも容易にデザインできる。この点で、本発明は、糖脂質型バイオサーファクタントを応用していく上で、単品ではなくいくつかの物性が異なる材を提供する方法を示したものである。一例として挙げたトリアシルＭＥＬは、従来のＭＥＬに比べて疎水性が高く、疎水性を必要とする用途に応じたＭＥＬ類の一つとして産業に寄与するものである。
【００７０】
なお、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様および以下の実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、当業者は、本発明の精神および添付の特許請求の範囲内で変更して実施することができる。
【実施例】
【００７１】
以下の実施例により、本発明を更に詳細に説明するが、本発明は、これらに何ら限定されるものではない。
【００７２】
〔実施例１：大豆油を原料にしたＭＥＬ―Ａ、トリアシルＭＥＬの製造〕
種菌培養はＰｓｅｕｄｏｚｙｍａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ ＮＢＲＣ １０７３６を種培地（２０ｍｌ／５００ｍｌ容坂口フラスコ×４本）に１ｒｏｏｐ植菌して実施した。３０℃、１８０ｒｐｍにて一晩培養した。得られた培養液を種菌とした。種培地組成は４％ Ｇｌｕｃｏｓｅ、０．３％ ＮａＮＯ３、０．０２％ ＭｇＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．０２％ ＫＨ２ＰＯ４、０．１％ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔとした。ＭＥＬ製造培養は上記種菌１００ｍｌを生産培地２．０Ｌ（５Ｌ−ｊａｒ）に植菌し、３０℃、２００ｒｐｍ（攪拌回転）、０．５Ｌ／ｍｉｎ（Ａｉｒ）の条件で５Ｌ−ｊａｒを用いて１１日間培養し、大豆油３０ｇに等量の水を加え２日おきに追加添加をした。生産培地組成は、３％ 大豆油、０．０２％ ＭｇＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．０２％ ＫＨ２ＰＯ４、０．１％ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔとした。得られた培養液２Ｌを５００ｍｌ容遠心管×６本に分注し、遠心分離（６５００ｒｐｍ、３０ｍｉｎ）した。上清を取り除き、沈殿（菌体）を回収した。沈殿に、５０ｍｌの酢酸エチルを加え、十分攪拌後、遠心（８５００ｒｐｍ、３０ｍｉｎ）し、沈殿と上清に分け、上清をエバポーレーターで濃縮し、粗抽出物８６ｇを得た。シリカゲルを用いて、ヘキサン：アセトン＝５：１、ヘキサン：アセトン＝１：２で溶出し、ＭＥＬ―Ａ８０ｇとトリアシルＭＥＬとしてＭＥＬのエリスリトールリノール酸エステル体（ＬＩ−ＭＥＬ（ＳＢ））３．５ｇを単離し、その構造をＮＭＲで確認した。Ｃ−ＮＭＲ解析の結果、すなわち、大豆油から製造したＭＥＬのトリアシル体のＣ−ＮＭＲ（溶媒：ＤＭＳＯ−ｄ６における各炭素原子のケミカルシフト値（ｐｐｍ）を、表１に示した。なお、表１のＥ１，Ｅ２，Ｅ３，Ｅ４，Ｍ１，Ｍ２，Ｍ３，Ｍ４，Ｍ５，Ｍ６は下記式（ＩＩＩ）のマンノシルエリスリトール骨格の炭素原子を示す。
【００７３】
【化４】
【００７４】
【表１】
【００７５】
〔実施例２：オリーブ油を原料にしたＭＥＬ―Ａ、トリアシルＭＥＬの製造〕
種菌培養はＰｓｅｕｄｏｚｙｍａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ ＮＢＲＣ １０７３６を種培地（２０ｍｌ／５００ｍｌ容坂口フラスコ×４本）に１ｒｏｏｐ植菌して実施した。３０℃、１８０ｒｐｍにて一晩培養した。得られた培養液を種菌とした。種培地組成は４％ Ｇｌｕｃｏｓｅ、０．３％ ＮａＮＯ３、０．０２％ ＭｇＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．０２％ ＫＨ２ＰＯ４、０．１％ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔとした。ＭＥＬ製造培養は上記種菌１００ｍｌを生産培地２．０Ｌ（５Ｌ−ｊａｒ）に植菌し、３０℃、２００ｒｐｍ（攪拌回転）、０．５Ｌ／ｍｉｎ（Ａｉｒ）の条件で５Ｌ−ｊａｒを用いて１１日間培養し、オリーブ油３０ｇに等量の水を加え２日おきに追加添加をした。生産培地組成は、３％ オリーブ油、０．０２％ ＭｇＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．０２％ ＫＨ２ＰＯ４、０．１％ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔとした。得られた培養液２Ｌを５００ｍｌ容遠心管×６本に分注し、遠心分離（６５００ｒｐｍ、３０ｍｉｎ）した。上清を取り除き、沈殿（菌体）を回収した。沈殿に、５０ｍｌの酢酸エチルを加え、十分攪拌後、遠心（８５００ｒｐｍ、３０ｍｉｎ）し、沈殿と上清に分け、上清をエバポレーターで濃縮し、粗抽出物７０ｇを得た。シリカゲルを用いて、ヘキサン：アセトン＝５：１、ヘキサン：アセトン＝１：２で溶出し、ＭＥＬ―Ａ６０ｇとトリアシルＭＥＬとしてＭＥＬのエリスリトールオレイン酸エステル体（ＯＬ−ＭＥＬ（ＯＬ））２．５ｇを単離し、その構造をＮＭＲで確認した。Ｃ−ＮＭＲ解析の結果、すなわち、オリーブ油から製造したＭＥＬのトリシル体のＣ−ＮＭＲ（溶媒：ＤＭＳＯ−ｄ６における各炭素原子のケミカルシフト値（ｐｐｍ）を、表２に示した。表２のＥ１，Ｅ２，Ｅ３，Ｅ４，Ｍ１，Ｍ２，Ｍ３，Ｍ４，Ｍ５，Ｍ６は下記式（ＩＶ）のマンノシルエリスリトール骨格の炭素原子を示す。
【００７６】
【化５】
【００７７】
【表２】
【００７８】
〔実施例３：培養粗抽出物への酵素添加によるトリアシルＭＥＬの合成〕
実施例１の大豆油で培養して得られた粗抽出物１．５ｇをアセトン１０ｍｌに溶かし、モレキュラーシーブス４Ａ １ｇ、ノボザイム４３５ ２００ｍｇを加え、室温（２０℃）で３日間撹拌した。反応液を濾過して酵素粒子を除去した後、エバポレーターを用いてアセトンを留去し、シリカゲルカラムを用いて酢酸エチル：ヘキサン（１：５）で流して生成物を単離した。トリアシルＭＥＬとしてＭＥＬのエリスリトールリノール酸エステル体（ＬＩ−ＭＥＬ（ＳＢ））の淡黄色油状生成物１．５ｇを得た。なお、モレキュラーシーブスを加えなくてもよいがその場合は反応液中にフリーの脂肪酸が残存するので、反応液を酢酸エチルと水で分液し、水層を除去する操作が必要である。Ｃ−ＮＭＲ解析の結果は、上記実施例１で単離したＬＩ−ＭＥＬ（ＳＢ）の値（表１参照）と同様の値であった。
【００７９】
〔実施例４：培養液を用いたトリアシルＭＥＬの合成〕
実施例１で得られた大豆油培養液２０ｍｌをそのまま凍結乾燥後、アセトン１０ｍｌに溶かし、モレキュラーシーブス４Ａ １ｇを加え、室温（２０℃）で３日間撹拌した。エバポレーターを用いてアセトンを留去し、シリカゲルカラムを用いて酢酸エチル：ヘキサン（１：５）で流して生成物を単離した。トリアシルＭＥＬとしてＭＥＬのエリスリトールリノール酸エステル体（ＬＩ−ＭＥＬ（ＳＢ））の淡黄色油状生成物０．８ｇを得た。なお、モレキュラーシーブスを加えなくてもよいがその場合は反応液中にフリーの脂肪酸が残存するので、反応液を酢酸エチルと水で分液し、水層を除去する操作が必要である。Ｃ−ＮＭＲ解析の結果は、上記実施例１で単離したＬＩ−ＭＥＬ（ＳＢ）の値（表１参照）と同様の値であった。
【００８０】
〔実施例５：オレイン酸を有するトリアシルＭＥＬの酵素合成〕
（１）大豆油を原料に実施例１で得られたＭＥＬ−Ａ１．４８ｇをアセトン１０ｍｌに溶かし、オリーブ油４ｍｌ、モレキュラーシーブス４Ａ １ｇ、ノボザイム４３５ ２００ｍｇを加え、室温（２０℃）で３日間撹拌した。反応液を濾過して酵素粒子を除去した後、エバポレーターを用いてアセトンを留去し、シリカゲルカラムを用いて酢酸エチル：ヘキサン（１：５）で流して生成物を単離した。トリアシルＭＥＬとしてＭＥＬのエリスリトールオレイン酸エステル体（ＯＬ−ＭＥＬ（ＳＢ））の淡黄色油状生成物１．４ｇを得た。Ｃ−ＮＭＲ解析の結果は表１に示した。なお、モレキュラーシーブスを加えなくてもよいがその場合は反応液中にフリーの脂肪酸が残存するので、反応液を酢酸エチルと水で分液し、水層を除去する操作が必要である。
【００８１】
（２）オリーブ油を原料に実施例２で得られたＭＥＬ−Ａを用いる以外は上記（１）と同様に行った場合も、トリアシルＭＥＬとしてエリスリトールオレイン酸エステル体（ＯＬ−ＭＥＬ（ＯＬ））１．４ｇが得られた。Ｃ−ＮＭＲ解析の結果は、上記実施例２で単離したＯＬ−ＭＥＬ（ＯＬ）の値（表２参照）と同様の値であった。
【００８２】
〔実施例６：リノール酸を有するトリアシルＭＥＬの酵素合成〕
（１）上記実施例５（１）において、オリーブ油を大豆油に変更した以外は同様の方法で反応を行い、トリアシルＭＥＬとしてエリスリトールリノール酸エステル体（ＬＩ−ＭＥＬ（ＳＢ））の淡黄色油状生成物１．３ｇを得た。Ｃ−ＮＭＲ解析の結果は、上記実施例１で単離したＬＩ−ＭＥＬ（ＳＢ）の値（表１参照）と同様の値であった。
【００８３】
（２）上記（１）において、実施例１で得られたＭＥＬ−Ａを実施例２で得られたＭＥＬ−Ａに変更した以外は同様の方法で反応行った場合も、トリアシルＭＥＬとしてエリスリトールリノール酸エステル体（ＬＩ−ＭＥＬ（ＯＬ））１．４５ｇが得られた。Ｃ−ＮＭＲ解析の結果は表２に示した。
【００８４】
〔実施例７：ウンデシレン酸を有するトリアシルＭＥＬの酵素合成〕
（１）上記実施例５（１）において、オリーブ油をウンデシレン酸に変更した以外は同様の方法で反応を行い、ウンデシレン酸エステルをエリスリトール部に有するトリアシルＭＥＬ（ＵＮＤＥ−ＭＥＬ（ＳＢ））の淡黄色油状生成物１．３５ｇを得た。Ｃ−ＮＭＲ解析の結果は表１に示した。
【００８５】
（２）上記（１）において、実施例１で得られたＭＥＬ−Ａを実施例２で得られたＭＥＬ−Ａに変更した以外は同様の方法で反応行った場合も、ウンデシレン酸エステルをエリスリトール部に有するトリアシルＭＥＬ（ＵＮＤＥ−ＭＥＬ（ＯＬ））１．２５ｇが得られた。Ｃ−ＮＭＲ解析の結果は表２に示した。
【００８６】
〔実施例８：ステアリン酸を有するトリアシルＭＥＬの酵素合成〕
上記実施例５（２）において、オリーブ油をステアリン酸変更した以外は同様の方法で反応を行い、ステアリン酸エステルをエリスリトール部に有するトリアシルＭＥＬ（ＳＴＥ−ＭＥＬ（ＯＬ））の淡黄色油状生成物１．５ｇを得た。Ｃ−ＮＭＲ解析の結果は表２に示した。
【００８７】
表１および表２より、大豆油あるいはオリーブ油を原料に製造したＭＥＬのケミカルシフト値とトリアシルＭＥＬのシフト値を比べ、Ｅ４炭素原子が低磁場シフトし隣接するＥ３，Ｅ２炭素が高磁場シフトしていることから、エリスルトールの末端の一級水酸基に脂肪酸が結合していることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
本発明は、糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体を低コストで製造できる技術を提供するものであり、食品産業、化粧品産業、医薬品産業、化学産業、環境分野等に広く利用可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖脂質の製造方法に関するものである。より詳細には、微生物が生産する糖脂質型バイオサーファクタントであるマンノシルエリスリトールリピッドのエリスリトールの水酸基に脂肪酸エステルを有するトリアシル体糖脂質の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
糖脂質等のバイオサーファクタントは、生分解性が高く、低毒性で環境に優しく、新規な生理機能を持つといわれている。それゆえ、食品工業、化粧品工業、医薬品工業、化学工業、環境分野等に広く普及することが期待されており、そのためには、多くの種類のバイオサーファクタントが必要である。しかしながら、現在までに発見されているバイオサーファクタントの種類は、２０数種類と少ない。
【０００３】
大豆油を炭素源とする選択培地を用いて生産菌の探索を行いＣａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ Ｔ−３４株がマンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）を大量に生産することが見出されている（非特許文献１）。マンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）は酵母が作る天然系の界面活性剤であり種々の生理作用が報告されている（非特許文献２）。また最近ではエリスリトールがマンニトールに代わったマンノシルマンニトールリピッド（ＭＭＬ）が見出されている（特許文献１）。バイオサーファクタントの用途としては、抗炎症剤及び抗アレルギー剤（特許文献２）、養毛・育毛剤（特許文献３）としての有用性や、抗菌作用（特許文献４）や表面張力低下作用（特許文献５）が知られている。
【特許文献１】特開２００５−１０４８３７号公報
【特許文献２】特開２００５−６８０１５号公報
【特許文献３】特開２００３−２６１４２４号公報
【特許文献４】特開昭５７−１４５８９６号公報
【特許文献５】特開昭６１−２０５４５０号公報
【非特許文献１】バイオテクノロジー レター、２３，１７０９（２００１）
【非特許文献２】ジャーナル オブ バイオサイエンス アンド バイオエンジニアリング、９４，１８７（２００２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
生分解性が高く、低毒性で環境に優しい、糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体を、食品工業、化粧品工業、医薬品工業、化学工業、環境分野等に広く普及をはかるため、安価で容易に製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ＭＥＬ生産微生物の培養液中に存在するＭＥＬ、脂肪および加水分解酵素を利用することにより、高効率かつ安価にトリアシルＭＥＬを製造できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００６】
すなわち本発明は、以下の発明を提供するものである。
【０００７】
（１）エステル化反応またはエステル交換反応により、糖脂質型バイオサーファクタントに脂肪酸または脂肪酸誘導体を導入することを特徴とする糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体製造方法。
【０００８】
（２）糖脂質型バイオサーファクタントが、マンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）またはマンノシルマンニトールリピッド（ＭＭＬ）であることを特徴とする（１）に記載の糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体製造方法。
【０００９】
（３）糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体が、式（Ｉ）
【００１０】
【化１】
【００１１】
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ独立して炭化水素基または酸素原子含有炭化水素基を示し、マンノースの４位および６位の水酸基のいずれか一方、あるいは両方の水素原子がアセチル基に置換されていてもよい。）で表される糖脂質であることを特徴とする（２）に記載の糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体製造方法。
【００１２】
（４）上記式（Ｉ）のＲ１、Ｒ２およびＲ３の炭素数が６〜２０であることを特徴とする（３）に記載の糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体製造方法。
【００１３】
（５）上記脂肪酸または脂肪酸誘導体が、油類、高級脂肪酸または合成エステル由来であることを特徴とする（１）〜（４）のいずれかに記載の糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体製造方法。
【００１４】
（６）疎水性環境下において、以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を混和することにより上記エステル化反応またはエステル交換反応が進行することを特徴とする（５）に記載の糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体製造方法。
（ａ）糖脂質型バイオサーファクタント；
（ｂ）油類、高級脂肪酸および合成エステルから選択される１種または２種以上の混合物；
（ｃ）加水分解酵素。
【００１５】
（７）糖脂質型バイオサーファクタント生産微生物を培養している培養液であって、油類、高級脂肪酸および合成エステルから選択される１種または２種以上の混合物が添加された培養液の凍結乾燥物中に含有される上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を用いることを特徴とする（６）に記載の糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体製造方法。
【００１６】
（８）糖脂質型バイオサーファクタント生産微生物を培養している培養液であって、油類、高級脂肪酸および合成エステルから選択される１種または２種以上の混合物が添加された培養液中に生成する沈殿物に含有される上記（ａ）および（ｂ）を用いることを特徴とする（６）に記載の糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体製造方法。
【００１７】
（９）糖脂質型バイオサーファクタント生産微生物を培養している培養液であって、油類、高級脂肪酸および合成エステルから選択される１種または２種以上の混合物が添加された培養液の上清の凍結乾燥物に含有される上記（ｃ）を用いることを特徴とする（６）に記載の糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体製造方法。
【００１８】
（１０）上記加水分解酵素が、リパーゼ、プロテアーゼおよびエステラーゼから選択される少なくとも１種以上であることを特徴とする（６）に記載の糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体製造方法。
【００１９】
（１１）上記エステル化反応またはエステル交換反応が、有機溶媒中で進行することを特徴とする（６）に記載の糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体製造方法。
【発明の効果】
【００２０】
本発明により、糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体を高効率かつ安価に製造することができる。また、糖脂質型バイオサーファクタントに任意の脂肪酸が結合したトリアシル体を容易に製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明に係る糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体製造方法（以下「本発明に係る製造方法」と記載する）は、エステル化反応またはエステル交換反応により、糖脂質型バイオサーファクタントに脂肪酸または脂肪酸誘導体を導入するものであればよい。
【００２２】
「バイオサーファクタント」とは生物によって生み出される界面活性能力や乳化能力を有する物質の総称であり、優れた界面活性や，高い生分解性を示すばかりでなく，様々な生理作用を有していることから合成界面活性剤とは異なる挙動・機能を発現する可能性がある。
【００２３】
「糖脂質型バイオサーファクタント」とは、微生物によって生産される天然系の界面活性剤のうち、糖質と脂肪酸部分からなるサーファクタントである。マンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）、マンノシルマンニトールリピッド（ＭＭＬ）、ソホロリピッド、ラムノリピッド、トレハロースリピッドなどが知られている。いずれも生分解性が高く環境に負荷が少ない、生体に対しても安全性の高い素材である。なかでも、本発明に係る製造方法に用いられる糖脂質型バイオサーファクタントとしては、ＭＥＬまたはＭＭＬが好適である。
【００２４】
ＭＥＬは、マンノースの４位および６位のアセチル基の有無からＭＥＬ−Ａ、ＭＥＬ−Ｂ、ＭＥＬ−ＣおよびＭＥＬ−Ｄの４種類が知られている。式（ＩＩ）にＭＥＬ−Ａの構造を示す。式（ＩＩ）中、Ｒ１およびＲ２は炭化水素基を示す。すなわち、ＭＥＬ−Ａは、式（ＩＩ）中、マンノースの２位、３位に炭素数５〜１９のアルカノイル基を有し、マンノースの４位、６位にアセチル基を有する化合物である。なお、ＭＥＬ−Ｂは式（ＩＩ）においてマンノースの４位のＡｃがＨであり、ＭＥＬ−Ｃは式（ＩＩ）においてマンノースの６位のＡｃがＨであり、ＭＥＬ−Ｄは式（ＩＩ）においてマンノースの４位および６位のＡｃがいずれもＨである。
【００２５】
【化２】
【００２６】
ＭＭＬは上記式（ＩＩ）において、エリスリトールが炭素数の２個多いマンニトールに置換された構造を有する。
【００２７】
「糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体を製造する」とは、例えばＭＥＬのエリスリトール部の水酸基やＭＭＬのマンニトール部の水酸基に脂肪酸または脂肪酸誘導体を導入し、３つの脂肪酸側鎖を有する糖脂質を製造することであり、「糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル化」と同義である。
【００２８】
上記ＭＥＬのエリスリトール部の水酸基やＭＭＬのマンニトール部の水酸基への脂肪酸または脂肪酸誘導体の導入は、エステル化反応またはエステル交換反応により行われる。ただし、製造された糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体の脂肪酸側鎖がＭＥＬのエリスリトール部の水酸基やＭＭＬのマンニトール部の水酸基とエステル結合していれば、その反応がエステル化反応であるかエステル交換反応であるかが特定される必要はない。
【００２９】
導入される脂肪酸は特に限定されず、飽和脂肪酸でも不飽和脂肪酸でもよい。不飽和脂肪酸の場合、複数の二重結合を有していてもよい。炭素鎖の炭素数は特に限定されないが、６〜２０が好ましい。また、炭素鎖は直鎖状であってもよく分岐鎖状であってもよい。脂肪酸誘導体としては、酸素原子を含む脂肪酸を挙げることができる。含まれる酸素原子の数および位置は限定されない。
【００３０】
以下、ＭＥＬを例として、本発明に係る製造方法について説明するが、これに限定されるものではない。
【００３１】
本発明に係る製造方法により製造されるＭＥＬのトリアシル体は、式（Ｉ）で表される構造を有する。
【００３２】
【化３】
【００３３】
式（Ｉ）中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ独立して炭化水素基または酸素原子含有炭化水素基を示し、マンノースの４位および６位の水酸基のいずれか一方、あるいは両方の水素原子がアセチル基に置換されていてもよい。炭化水素基は飽和結合のみを有していてもよく、不飽和結合を有していてもよい。不飽和結合を有している場合、複数の二重結合を有していてもよい。炭素鎖は直鎖状であってもよく分岐鎖状であってもよい。また、酸素原子含有炭化水素基の場合、含まれる酸素原子の数および位置は限定されない。
【００３４】
式（Ｉ）中、Ｒ１、Ｒ２は炭素数が６〜２０であることが好ましく、脂肪族アシル基（ＲＣＯ−）としてマンノースの２位および３位の水酸基とエステル結合をしており、残りの水酸基にはアセチル基がエステル結合していてもよい。Ｒ３は炭素数が６〜２０であることが好ましく、脂肪族アシル基（ＲＣＯ−）としてエリスリトールの一級水酸基とエステル結合をしている。
【００３５】
本発明に係る製造方法において、ＭＥＬのエリスリトール部の水酸基に導入される脂肪酸または脂肪酸誘導体は油類、高級脂肪酸または合成エステル由来であることが好ましい。
【００３６】
「油類」としては、植物油、動物油、鉱物油およびその硬化油であればよい。具体的には、アボカド油、オリーブ油、ゴマ油、ツバキ油、月見草油、タートル油、マカデミアンナッツ油、トウモロコシ油、ミンク油、ナタネ油、卵黄油、パーシック油、小麦胚芽油、サザンカ油、ヒマシ油、アマニ油、サフラワー油、綿実油、エノ油、大豆油、落花生油、茶実油、カヤ油、コメヌカ油、キリ油、ホホバ油、カカオ脂、ヤシ油、馬油、パーム油、パーム核油、牛脂、羊脂、豚脂、ラノリン、鯨ロウ、ミツロウ、カルナウバロウ、モクロウ、キャンデリラロウ、スクワラン等の動植物油およびその硬化油。流動パラフィン、ワセリン等の鉱物油、トリパルミチン酸グリセリン等の合成トリグリセリンが挙げられる。好ましくはアボカド油、オリーブ油、ゴマ油、ツバキ油、月見草油、タートル油、マカデミアンナッツ油、トウモロコシ油、ミンク油、ナタネ油、卵黄油、パーシック油、小麦胚芽油、サザンカ油、ヒマシ油、アマニ油、サフラワー油、綿実油、エノ油、大豆油、落花生油、茶実油、カヤ油、コメヌカ油、より好ましくはオリーブ油、大豆油である。
【００３７】
「高級脂肪酸」としては、例えばカプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、１２−ヒドロキシステアリン酸、イソステアリン酸、ウンデシン酸、トール酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸などが挙げられる。好ましくはラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ステアリン酸、ウンデシレン酸、より好ましくはオレイン酸、リノール酸、ウンデシレン酸である。
【００３８】
「合成エステル」としては、例えば、カプロン酸メチル、カプリル酸メチル、カプリン酸メチル、ラウリン酸メチル、ミリスチン酸メチル、パルミチン酸メチル、オレイン酸メチル、リノール酸メチル、リノレン酸メチル、ステアリン酸メチル、ウンデシン酸メチル、カプロン酸エチル、カプリル酸エチル、カプリン酸エチル、ラウリン酸エチル、ミリスチン酸エチル、パルミチン酸エチル、オレイン酸エチル、リノール酸エチル、リノレン酸エチル、ステアリン酸エチル、ウンデシン酸エチル、カプロン酸ビニル、カプリル酸ビニル、カプリン酸ビニル、ラウリン酸ビニル、ミリスチン酸ビニル、パルミチン酸ビニル、オレイン酸ビニル、リノール酸ビニル、リノレン酸ビニル、ステアリン酸ビニル、ウンデシン酸ビニル、オクタン酸セチル、ミリスチン酸オクチルドデシル、ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸ミリスチル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、ラウリン酸ヘキシル、オレンイ酸デシル、ジメチルオクタン酸、乳酸セチル、乳酸ミリスチル等が挙げられる。好ましくはラウリン酸メチル、ミリスチン酸メチル、パルミチン酸メチル、オレイン酸メチル、リノール酸メチル、リノレン酸メチル、ステアリン酸メチル、ウンデシレン酸メチル、より好ましくはオレイン酸メチル、リノール酸メチル、ウンデシレン酸メチルである。
【００３９】
本発明に係る製造方法は、疎水性環境下において、（ａ）糖脂質型バイオサーファクタント；（ｂ）油類、高級脂肪酸および合成エステルから選択される１種または２種以上の混合物；および（ｃ）加水分解酵素を混和することによりエステル化反応またはエステル交換反応が進行するものであればよい。
【００４０】
疎水性環境下は特に限定されないが、有機溶媒中において上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を反応させることを挙げることができる。さらに、反応溶液中にモレキュラーシーブスを加えてもよい。有機溶媒としては、上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を可溶化できるものであれば限定されない。全部を可溶化できなくても一部を可溶化できるものであればよい。また、有機溶媒は複数の有機溶媒の混合物でもよい。具体的には、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、アセトン、プロパノン、ブタノン、ペンタン−２−オン、１，２−エタンジオール、２，３−ブタンジオール、ジオキサン、アセトニトリル、２−メチル−ブタン−２−オール、第３級ブタノール、２−メチルプロパノール、４−ヒドロキシ−２−メチルペンタノン、テトラヒドロフラン、ヘキサン、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ピリジン、メチルエチルケトンなどを挙げることができる。好ましくはアセトン、テトラヒドロフラン、第３級ブタノール、アセトニトリル、ジオキサン、より好ましくはアセトンである。
【００４１】
また、疎水性環境は無溶媒でも構わない。
【００４２】
加水分解酵素としては、リパーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼが挙げられる。これらの中から選択される少なくとも１種を用いることが好ましく、複数の加水分解酵素を用いてもよい。好ましくはリパーゼ、エステラーゼ、より好ましくはリパーゼである。
【００４３】
本発明に係る製造方法においては、糖脂質型バイオサーファクタント生産微生物を培養している培養液であって、油類、高級脂肪酸および合成エステルから選択される１種または２種以上の混合物が添加された培養液の凍結乾燥物に含有される上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を用いることが好ましい。
【００４４】
また、上記培養液中に生成する沈殿物に含有される上記（ａ）および（ｂ）を用い、（ｃ）を外部から添加してもよい。
【００４５】
さらに、上記培養液の上清に含有される上記（ｃ）を用いることができる。
【００４６】
ＭＥＬ生産微生物としては、本発明者らはPseudozyma antarctica NBRC 10736 を用いているがこれに限定されず、Candida antarctica、Candida sp.、等を用いることができる。これらの微生物の培養により、容易にＭＥＬが得られることは当業者に周知である。
【００４７】
上記ＭＥＬ生産微生物の培養に用いる培養液としては、酵母エキス、ペプトン等のＮ源、グルコース、フルクトース等のＣ源、および硝酸ナトリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム７水塩等の無機塩類からなる一般的な組成の培養液を用いることができ、さらに油類、高級脂肪酸および合成エステルから選択される１種または２種以上の混合物が添加される。なかでも植物油脂を添加することが好ましい。植物油脂は特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、大豆油、菜種油、コーン油、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、パーム油などが挙げられ、これらの中でも、大豆油がＭＥＬの生産効率（生産量、生産速度、および収率）を向上させることができる点で特に好ましい。これらは、１種を単独で、または２種以上を併用しても構わない。
【００４８】
培養条件（培養温度、培養時間など）は、任意に設定できる。例えば、本発明者らは、Pseudozyma antarctica NBRC 10736 を３０℃、２００ｒｐｍ（攪拌回転）、０．５Ｌ／ｍｉｎ（Ａｉｒ）の条件で５Ｌ−ｊａｒを用いて１１日間培養し、大豆油を２日おきに追加添加するという条件で培養している。ただし、これに限定されるものではない。
【００４９】
ＭＥＬを製造するためにＭＥＬ生産微生物を上記のようにして培養した培養液（菌体を含む）を凍結乾燥すれば、上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含有する凍結乾燥物が得られる。培養液の凍結乾燥方法は特に限定されず、市販の凍結乾燥装置等を用いて公知の方法により行うことができる。培養液を凍結乾燥する理由は、加水分解酵素を触媒としてエステル化反応またはエステル交換反応を行う場合、水が存在していると加水分解反応が生じるためエステル化反応またはエステル交換反応が進行し難くなるためである。
【００５０】
また、培養液中に生成される沈殿物は、培養液を遠心分離し上清を除去することにより取得することができる。この沈殿物には上記（ａ）および（ｂ）が含まれている。得られた沈殿物は、そのままトリアシル体の製造に用いることができる。あるいは、沈殿物に酢酸エチル等の適当な抽出溶媒を添加し、十分攪拌後遠心分離して得られた上清をトリアシル体の製造に用いてもよい。さらに当該上清をエバポレーターで濃縮したものをトリアシル体の製造に用いてもよい。なお、遠心分離により除去した培養液上清中にも（ａ）が含まれるため、上清を酢酸エチルで抽出して得られた（ａ）をトリアシル体の製造に用いることができる。
【００５１】
また、培養液を遠心分離して上清を取得し、これを凍結乾燥することにより上記（ｃ）を含有する凍結乾燥物が得られる。培養液の凍結乾燥方法は特に限定されず、市販の凍結乾燥装置等を用いて公知の方法により行うことができる。
【００５２】
また、培養液からＭＥＬを抽出または精製し、これを上記（ａ）として用いることができる。ＭＥＬの抽出（回収）、精製方法としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができるが、例えば、培養液を遠心分離して油分を回収し、酢酸エチルエステルで抽出濃縮することにより回収できる。
【００５３】
抽出溶媒としては、水、アルコール類（例えば、メタノール、無水エタノール、エタノールなどの低級アルコール、またはプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコールなどの多価アルコール）、アセトンなどのケトン類、ジエチルエーテル、ジオキサン、アセトニトリル、酢酸エチルなどのエステル類、キシレン、ベンゼン、クロロホルムなどの有機溶媒を、単独であるいは２種類以上の混液を任意に組み合わせて使用することができ、また、各々の溶媒抽出物が組み合わされたものでも使用することができる。
【００５４】
抽出方法は特に制限されるものはないが、通常、常温から常圧下での溶媒の沸点の範囲であればよく、抽出後は濾過またはイオン交換樹脂を用い、吸着・脱色・精製して溶液状、ペースト状、ゲル状、粉末状とすればよい。多くの場合は、そのままの状態で利用できるが、必要であれば、その効力に影響のない範囲でさらに脱臭、脱色などの精製処理を加えてもよい。脱臭・脱色等の精製処理手段としては、活性炭カラムなどを用いればよく、抽出物質により一般的に適用される通常の手段を任意に選択して行えばよい。必要に応じて、シリカゲルカラムを用いて精製することにより、純度の高いＭＥＬを得ることができる。なお、得られるＭＥＬの中に少量のトリアシルＭＥＬが含まれる。
【００５５】
以下に、具体的なトリアシルＭＥＬ製造方法について説明するが、これらに限定されるものではない。
【００５６】
（i）精製ＭＥＬの有機溶媒溶液に、油類、高級脂肪酸および合成エステルから選択される１種または２種以上の混合物（以下「油脂等」と記載する）並びに加水分解酵素を添加して反応させる場合
精製ＭＥＬは上述のように培養液から精製したＭＥＬを用いることができる。なお、最終的に活性炭カラムやシリカゲルカラムを用いて脱臭、脱色処理をした精製ＭＥＬに限定されず、その前段階において抽出後濾過またはイオン交換樹脂処理を施した粗精製ＭＥＬも使用できる。
【００５７】
有機溶媒は特に限定されないが、アセトンが好ましい。
【００５８】
加水分解酵素は、市販のリパーゼ（例えば、ノボザイム４３５（ノボザイムズ社製）など）を好適に用いることができる。または、上述の培養液上清の凍結乾燥物（以下「上清凍結乾燥物」と記載する）を用いてもよい。上清凍結乾燥物を用いると加水分解酵素を購入する必要がないためコストを低く抑えることができる。
【００５９】
添加する油脂等は特に限定されない。ＭＥＬ製造用培養液に添加した油脂等と同一のものを添加してもよく、異なるものを添加してもよい。ここで添加した油脂等によりＭＥＬのエリスリトール部に導入される脂肪酸基が決定されるので、添加する油脂等を適宜選択することにより、所望の脂肪酸がエリスリトール部に導入されたトリアシルＭＥＬを製造することが可能となる。
【００６０】
この製造方法の場合、反応温度は１０〜１００℃、好ましくは２０〜５０℃、より好ましくは２５〜４０℃で、１日〜７日間攪拌すればよい。また、反応液にモレキュラーシーブスを添加してもよい。この製造方法により、材料として添加したＭＥＬがほぼ定量的にトリアシル体となる。この知見は当業者でも容易に予測できないことであった。
【００６１】
（ii）上述の培養液中の沈殿物（以下「培養沈殿物」と記載する）を用いる場合
培養沈殿物中にはＭＥＬおよび油脂等が含まれている。この培養沈殿物を有機溶媒に溶解し、これに加水分解酵素を添加して反応させればよい。さらにモレキュラーシーブスを添加してもよい。
【００６２】
有機溶媒は特に限定されないが、アセトンが好ましい。加水分解酵素は、市販のリパーゼ（例えば、ノボザイム４３５（ノボザイムズ社製）など）を好適に用いることができる。または、上記上清凍結乾燥物を用いてもよい。
【００６３】
この製造方法の場合、反応温度は１０〜１００℃、好ましくは２０〜５０℃、より好ましくは２５〜４０℃で、１日〜７日間攪拌すればよい。これにより、材料として添加したＭＥＬがほぼ定量的にトリアシル体となる。この知見は当業者でも容易に予測できないことであった。
【００６４】
この製造方法において、市販の加水分解酵素を用いずに上清凍結乾燥物を用いれば、ＭＥＬを製造するための培養液のみからトリアシルＭＥＬを製造することができ、何ら他の原料を購入する必要がないため、安価にトリアシルＭＥＬを製造することが可能となる。
【００６５】
（iii）上述の培養液の凍結乾燥物（以下「培養液凍結乾燥物」と記載する）を用いる場合
培養液凍結乾燥物にはＭＥＬ、油脂等および加水分解酵素が含まれている。したがって、培養液凍結乾燥物を有機溶媒に溶解し、反応させればよい。さらにモレキュラーシーブスを添加してもよい。有機溶媒は特に限定されないが、アセトンが好ましい。
【００６６】
この製造方法の場合、反応温度は１０〜１００℃、好ましくは２０〜５０℃、より好ましくは２５〜４０℃で、１日〜７日間攪拌すればよい。
【００６７】
この製造方法は、ＭＥＬを製造するための培養液を凍結乾燥するのみで、何ら他の原料を購入する必要がない。また、培養液を上清と沈殿物とに分けてそれぞれ別の操作を行う必要もない。したがって、非常に簡便かつ低コストで効率よくトリアシルＭＥＬを製造することが可能となる。
【００６８】
以上のように、本発明に係る製造方法を用いれば、副生成物がほとんど生成しないトリアシルＭＥＬの低コスト製造が可能となる。また、便宜上ＭＥＬを例として本発明を説明したが、トリアシルＭＥＬの事例を示せば、他の糖脂質型バイオサーファクタント（例えば、ＭＭＬなど）に応用できることを、当業者は容易に理解する。
【００６９】
また、本発明に係る製造方法を用いれば、添加する油類や高級脂肪酸や合成エステルを任意に変えることにより、培養液中から得られない新規なトリアシルＭＥＬも容易にデザインできる。この点で、本発明は、糖脂質型バイオサーファクタントを応用していく上で、単品ではなくいくつかの物性が異なる材を提供する方法を示したものである。一例として挙げたトリアシルＭＥＬは、従来のＭＥＬに比べて疎水性が高く、疎水性を必要とする用途に応じたＭＥＬ類の一つとして産業に寄与するものである。
【００７０】
なお、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様および以下の実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、当業者は、本発明の精神および添付の特許請求の範囲内で変更して実施することができる。
【実施例】
【００７１】
以下の実施例により、本発明を更に詳細に説明するが、本発明は、これらに何ら限定されるものではない。
【００７２】
〔実施例１：大豆油を原料にしたＭＥＬ―Ａ、トリアシルＭＥＬの製造〕
種菌培養はＰｓｅｕｄｏｚｙｍａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ ＮＢＲＣ １０７３６を種培地（２０ｍｌ／５００ｍｌ容坂口フラスコ×４本）に１ｒｏｏｐ植菌して実施した。３０℃、１８０ｒｐｍにて一晩培養した。得られた培養液を種菌とした。種培地組成は４％ Ｇｌｕｃｏｓｅ、０．３％ ＮａＮＯ３、０．０２％ ＭｇＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．０２％ ＫＨ２ＰＯ４、０．１％ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔとした。ＭＥＬ製造培養は上記種菌１００ｍｌを生産培地２．０Ｌ（５Ｌ−ｊａｒ）に植菌し、３０℃、２００ｒｐｍ（攪拌回転）、０．５Ｌ／ｍｉｎ（Ａｉｒ）の条件で５Ｌ−ｊａｒを用いて１１日間培養し、大豆油３０ｇに等量の水を加え２日おきに追加添加をした。生産培地組成は、３％ 大豆油、０．０２％ ＭｇＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．０２％ ＫＨ２ＰＯ４、０．１％ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔとした。得られた培養液２Ｌを５００ｍｌ容遠心管×６本に分注し、遠心分離（６５００ｒｐｍ、３０ｍｉｎ）した。上清を取り除き、沈殿（菌体）を回収した。沈殿に、５０ｍｌの酢酸エチルを加え、十分攪拌後、遠心（８５００ｒｐｍ、３０ｍｉｎ）し、沈殿と上清に分け、上清をエバポーレーターで濃縮し、粗抽出物８６ｇを得た。シリカゲルを用いて、ヘキサン：アセトン＝５：１、ヘキサン：アセトン＝１：２で溶出し、ＭＥＬ―Ａ８０ｇとトリアシルＭＥＬとしてＭＥＬのエリスリトールリノール酸エステル体（ＬＩ−ＭＥＬ（ＳＢ））３．５ｇを単離し、その構造をＮＭＲで確認した。Ｃ−ＮＭＲ解析の結果、すなわち、大豆油から製造したＭＥＬのトリアシル体のＣ−ＮＭＲ（溶媒：ＤＭＳＯ−ｄ６における各炭素原子のケミカルシフト値（ｐｐｍ）を、表１に示した。なお、表１のＥ１，Ｅ２，Ｅ３，Ｅ４，Ｍ１，Ｍ２，Ｍ３，Ｍ４，Ｍ５，Ｍ６は下記式（ＩＩＩ）のマンノシルエリスリトール骨格の炭素原子を示す。
【００７３】
【化４】
【００７４】
【表１】
【００７５】
〔実施例２：オリーブ油を原料にしたＭＥＬ―Ａ、トリアシルＭＥＬの製造〕
種菌培養はＰｓｅｕｄｏｚｙｍａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ ＮＢＲＣ １０７３６を種培地（２０ｍｌ／５００ｍｌ容坂口フラスコ×４本）に１ｒｏｏｐ植菌して実施した。３０℃、１８０ｒｐｍにて一晩培養した。得られた培養液を種菌とした。種培地組成は４％ Ｇｌｕｃｏｓｅ、０．３％ ＮａＮＯ３、０．０２％ ＭｇＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．０２％ ＫＨ２ＰＯ４、０．１％ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔとした。ＭＥＬ製造培養は上記種菌１００ｍｌを生産培地２．０Ｌ（５Ｌ−ｊａｒ）に植菌し、３０℃、２００ｒｐｍ（攪拌回転）、０．５Ｌ／ｍｉｎ（Ａｉｒ）の条件で５Ｌ−ｊａｒを用いて１１日間培養し、オリーブ油３０ｇに等量の水を加え２日おきに追加添加をした。生産培地組成は、３％ オリーブ油、０．０２％ ＭｇＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．０２％ ＫＨ２ＰＯ４、０．１％ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔとした。得られた培養液２Ｌを５００ｍｌ容遠心管×６本に分注し、遠心分離（６５００ｒｐｍ、３０ｍｉｎ）した。上清を取り除き、沈殿（菌体）を回収した。沈殿に、５０ｍｌの酢酸エチルを加え、十分攪拌後、遠心（８５００ｒｐｍ、３０ｍｉｎ）し、沈殿と上清に分け、上清をエバポレーターで濃縮し、粗抽出物７０ｇを得た。シリカゲルを用いて、ヘキサン：アセトン＝５：１、ヘキサン：アセトン＝１：２で溶出し、ＭＥＬ―Ａ６０ｇとトリアシルＭＥＬとしてＭＥＬのエリスリトールオレイン酸エステル体（ＯＬ−ＭＥＬ（ＯＬ））２．５ｇを単離し、その構造をＮＭＲで確認した。Ｃ−ＮＭＲ解析の結果、すなわち、オリーブ油から製造したＭＥＬのトリシル体のＣ−ＮＭＲ（溶媒：ＤＭＳＯ−ｄ６における各炭素原子のケミカルシフト値（ｐｐｍ）を、表２に示した。表２のＥ１，Ｅ２，Ｅ３，Ｅ４，Ｍ１，Ｍ２，Ｍ３，Ｍ４，Ｍ５，Ｍ６は下記式（ＩＶ）のマンノシルエリスリトール骨格の炭素原子を示す。
【００７６】
【化５】
【００７７】
【表２】
【００７８】
〔実施例３：培養粗抽出物への酵素添加によるトリアシルＭＥＬの合成〕
実施例１の大豆油で培養して得られた粗抽出物１．５ｇをアセトン１０ｍｌに溶かし、モレキュラーシーブス４Ａ １ｇ、ノボザイム４３５ ２００ｍｇを加え、室温（２０℃）で３日間撹拌した。反応液を濾過して酵素粒子を除去した後、エバポレーターを用いてアセトンを留去し、シリカゲルカラムを用いて酢酸エチル：ヘキサン（１：５）で流して生成物を単離した。トリアシルＭＥＬとしてＭＥＬのエリスリトールリノール酸エステル体（ＬＩ−ＭＥＬ（ＳＢ））の淡黄色油状生成物１．５ｇを得た。なお、モレキュラーシーブスを加えなくてもよいがその場合は反応液中にフリーの脂肪酸が残存するので、反応液を酢酸エチルと水で分液し、水層を除去する操作が必要である。Ｃ−ＮＭＲ解析の結果は、上記実施例１で単離したＬＩ−ＭＥＬ（ＳＢ）の値（表１参照）と同様の値であった。
【００７９】
〔実施例４：培養液を用いたトリアシルＭＥＬの合成〕
実施例１で得られた大豆油培養液２０ｍｌをそのまま凍結乾燥後、アセトン１０ｍｌに溶かし、モレキュラーシーブス４Ａ １ｇを加え、室温（２０℃）で３日間撹拌した。エバポレーターを用いてアセトンを留去し、シリカゲルカラムを用いて酢酸エチル：ヘキサン（１：５）で流して生成物を単離した。トリアシルＭＥＬとしてＭＥＬのエリスリトールリノール酸エステル体（ＬＩ−ＭＥＬ（ＳＢ））の淡黄色油状生成物０．８ｇを得た。なお、モレキュラーシーブスを加えなくてもよいがその場合は反応液中にフリーの脂肪酸が残存するので、反応液を酢酸エチルと水で分液し、水層を除去する操作が必要である。Ｃ−ＮＭＲ解析の結果は、上記実施例１で単離したＬＩ−ＭＥＬ（ＳＢ）の値（表１参照）と同様の値であった。
【００８０】
〔実施例５：オレイン酸を有するトリアシルＭＥＬの酵素合成〕
（１）大豆油を原料に実施例１で得られたＭＥＬ−Ａ１．４８ｇをアセトン１０ｍｌに溶かし、オリーブ油４ｍｌ、モレキュラーシーブス４Ａ １ｇ、ノボザイム４３５ ２００ｍｇを加え、室温（２０℃）で３日間撹拌した。反応液を濾過して酵素粒子を除去した後、エバポレーターを用いてアセトンを留去し、シリカゲルカラムを用いて酢酸エチル：ヘキサン（１：５）で流して生成物を単離した。トリアシルＭＥＬとしてＭＥＬのエリスリトールオレイン酸エステル体（ＯＬ−ＭＥＬ（ＳＢ））の淡黄色油状生成物１．４ｇを得た。Ｃ−ＮＭＲ解析の結果は表１に示した。なお、モレキュラーシーブスを加えなくてもよいがその場合は反応液中にフリーの脂肪酸が残存するので、反応液を酢酸エチルと水で分液し、水層を除去する操作が必要である。
【００８１】
（２）オリーブ油を原料に実施例２で得られたＭＥＬ−Ａを用いる以外は上記（１）と同様に行った場合も、トリアシルＭＥＬとしてエリスリトールオレイン酸エステル体（ＯＬ−ＭＥＬ（ＯＬ））１．４ｇが得られた。Ｃ−ＮＭＲ解析の結果は、上記実施例２で単離したＯＬ−ＭＥＬ（ＯＬ）の値（表２参照）と同様の値であった。
【００８２】
〔実施例６：リノール酸を有するトリアシルＭＥＬの酵素合成〕
（１）上記実施例５（１）において、オリーブ油を大豆油に変更した以外は同様の方法で反応を行い、トリアシルＭＥＬとしてエリスリトールリノール酸エステル体（ＬＩ−ＭＥＬ（ＳＢ））の淡黄色油状生成物１．３ｇを得た。Ｃ−ＮＭＲ解析の結果は、上記実施例１で単離したＬＩ−ＭＥＬ（ＳＢ）の値（表１参照）と同様の値であった。
【００８３】
（２）上記（１）において、実施例１で得られたＭＥＬ−Ａを実施例２で得られたＭＥＬ−Ａに変更した以外は同様の方法で反応行った場合も、トリアシルＭＥＬとしてエリスリトールリノール酸エステル体（ＬＩ−ＭＥＬ（ＯＬ））１．４５ｇが得られた。Ｃ−ＮＭＲ解析の結果は表２に示した。
【００８４】
〔実施例７：ウンデシレン酸を有するトリアシルＭＥＬの酵素合成〕
（１）上記実施例５（１）において、オリーブ油をウンデシレン酸に変更した以外は同様の方法で反応を行い、ウンデシレン酸エステルをエリスリトール部に有するトリアシルＭＥＬ（ＵＮＤＥ−ＭＥＬ（ＳＢ））の淡黄色油状生成物１．３５ｇを得た。Ｃ−ＮＭＲ解析の結果は表１に示した。
【００８５】
（２）上記（１）において、実施例１で得られたＭＥＬ−Ａを実施例２で得られたＭＥＬ−Ａに変更した以外は同様の方法で反応行った場合も、ウンデシレン酸エステルをエリスリトール部に有するトリアシルＭＥＬ（ＵＮＤＥ−ＭＥＬ（ＯＬ））１．２５ｇが得られた。Ｃ−ＮＭＲ解析の結果は表２に示した。
【００８６】
〔実施例８：ステアリン酸を有するトリアシルＭＥＬの酵素合成〕
上記実施例５（２）において、オリーブ油をステアリン酸変更した以外は同様の方法で反応を行い、ステアリン酸エステルをエリスリトール部に有するトリアシルＭＥＬ（ＳＴＥ−ＭＥＬ（ＯＬ））の淡黄色油状生成物１．５ｇを得た。Ｃ−ＮＭＲ解析の結果は表２に示した。
【００８７】
表１および表２より、大豆油あるいはオリーブ油を原料に製造したＭＥＬのケミカルシフト値とトリアシルＭＥＬのシフト値を比べ、Ｅ４炭素原子が低磁場シフトし隣接するＥ３，Ｅ２炭素が高磁場シフトしていることから、エリスルトールの末端の一級水酸基に脂肪酸が結合していることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
本発明は、糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体を低コストで製造できる技術を提供するものであり、食品産業、化粧品産業、医薬品産業、化学産業、環境分野等に広く利用可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エステル化反応またはエステル交換反応により、糖脂質型バイオサーファクタントに脂肪酸または脂肪酸誘導体を導入することを特徴とする糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体製造方法。
【請求項２】
糖脂質型バイオサーファクタントが、マンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）またはマンノシルマンニトールリピッド（ＭＭＬ）であることを特徴とする請求項１に記載の糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体製造方法。
【請求項３】
糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体が、式（Ｉ）
【化１】
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ独立して炭化水素基または酸素原子含有炭化水素基を示し、マンノースの４位および６位の水酸基のいずれか一方、あるいは両方の水素原子がアセチル基に置換されていてもよい。）で表される糖脂質であることを特徴とする請求項２に記載の糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体製造方法。
【請求項４】
上記式（Ｉ）のＲ１、Ｒ２およびＲ３の炭素数が６〜２０であることを特徴とする請求項３に記載の糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体製造方法。
【請求項５】
上記脂肪酸または脂肪酸誘導体が、油類、高級脂肪酸または合成エステル由来であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体製造方法。
【請求項６】
疎水性環境下において、以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を混和することにより上記エステル化反応またはエステル交換反応が進行することを特徴とする請求項５に記載の糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体製造方法。
（ａ）糖脂質型バイオサーファクタント；
（ｂ）油類、高級脂肪酸および合成エステルから選択される１種または２種以上の混合物；
（ｃ）加水分解酵素
【請求項７】
糖脂質型バイオサーファクタント生産微生物を培養している培養液であって、油類、高級脂肪酸および合成エステルから選択される１種または２種以上の混合物が添加された培養液の凍結乾燥物に含有される上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を用いることを特徴とする請求項６に記載の糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体製造方法。
【請求項８】
糖脂質型バイオサーファクタント生産微生物を培養している培養液であって、油類、高級脂肪酸および合成エステルから選択される１種または２種以上の混合物が添加された培養液中に生成する沈殿物に含有される上記（ａ）および（ｂ）を用いることを特徴とする請求項６に記載の糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体製造方法。
【請求項９】
糖脂質型バイオサーファクタント生産微生物を培養している培養液であって、油類、高級脂肪酸および合成エステルから選択される１種または２種以上の混合物が添加された培養液の上清の凍結乾燥物に含有される上記（ｃ）を用いることを特徴とする請求項６に記載の糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体製造方法。
【請求項１０】
上記加水分解酵素が、リパーゼ、プロテアーゼおよびエステラーゼから選択される少なくとも１種以上であることを特徴とする請求項６に記載の糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体製造方法。
【請求項１１】
上記エステル化反応またはエステル交換反応が、有機溶媒中で進行することを特徴とする請求項６に記載の糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体製造方法。
【請求項１】
エステル化反応またはエステル交換反応により、糖脂質型バイオサーファクタントに脂肪酸または脂肪酸誘導体を導入することを特徴とする糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体製造方法。
【請求項２】
糖脂質型バイオサーファクタントが、マンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）またはマンノシルマンニトールリピッド（ＭＭＬ）であることを特徴とする請求項１に記載の糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体製造方法。
【請求項３】
糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体が、式（Ｉ）
【化１】
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ独立して炭化水素基または酸素原子含有炭化水素基を示し、マンノースの４位および６位の水酸基のいずれか一方、あるいは両方の水素原子がアセチル基に置換されていてもよい。）で表される糖脂質であることを特徴とする請求項２に記載の糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体製造方法。
【請求項４】
上記式（Ｉ）のＲ１、Ｒ２およびＲ３の炭素数が６〜２０であることを特徴とする請求項３に記載の糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体製造方法。
【請求項５】
上記脂肪酸または脂肪酸誘導体が、油類、高級脂肪酸または合成エステル由来であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体製造方法。
【請求項６】
疎水性環境下において、以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を混和することにより上記エステル化反応またはエステル交換反応が進行することを特徴とする請求項５に記載の糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体製造方法。
（ａ）糖脂質型バイオサーファクタント；
（ｂ）油類、高級脂肪酸および合成エステルから選択される１種または２種以上の混合物；
（ｃ）加水分解酵素
【請求項７】
糖脂質型バイオサーファクタント生産微生物を培養している培養液であって、油類、高級脂肪酸および合成エステルから選択される１種または２種以上の混合物が添加された培養液の凍結乾燥物に含有される上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を用いることを特徴とする請求項６に記載の糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体製造方法。
【請求項８】
糖脂質型バイオサーファクタント生産微生物を培養している培養液であって、油類、高級脂肪酸および合成エステルから選択される１種または２種以上の混合物が添加された培養液中に生成する沈殿物に含有される上記（ａ）および（ｂ）を用いることを特徴とする請求項６に記載の糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体製造方法。
【請求項９】
糖脂質型バイオサーファクタント生産微生物を培養している培養液であって、油類、高級脂肪酸および合成エステルから選択される１種または２種以上の混合物が添加された培養液の上清の凍結乾燥物に含有される上記（ｃ）を用いることを特徴とする請求項６に記載の糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体製造方法。
【請求項１０】
上記加水分解酵素が、リパーゼ、プロテアーゼおよびエステラーゼから選択される少なくとも１種以上であることを特徴とする請求項６に記載の糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体製造方法。
【請求項１１】
上記エステル化反応またはエステル交換反応が、有機溶媒中で進行することを特徴とする請求項６に記載の糖脂質型バイオサーファクタントのトリアシル体製造方法。
【公開番号】特開２００８−４３２１０（Ｐ２００８−４３２１０Ａ）
【公開日】平成２０年２月２８日（２００８．２．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２１９１６６（Ｐ２００６−２１９１６６）
【出願日】平成１８年８月１１日（２００６．８．１１）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年２月２８日（２００８．２．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年８月１１日（２００６．８．１１）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
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