糖鎖ライブラリー、その作製方法、およびそれを固定した糖鎖アレイ
【課題】 本発明は、簡便に糖鎖ライブラリーを作製し、該糖鎖ライブラリーを用いた糖鎖アレイを、吸着防止剤をコーティングすることなく、固定化できるバイオアッセイ用の高分子化合物及びこれを用いた各種糖鎖アレイ基板を提供することを目的とする。
【解決手段】 糖鎖を精製するための一級アミノ基を有する糖鎖精製用基材の、該一級アミノ基で糖鎖または糖の誘導体を捕捉、回収、精製した糖鎖で糖鎖ライブラリーを構築し、糖該糖鎖ライブラリーの糖鎖を糖類捕捉用高分子化合物を基板表面に塗布したアレイ状に固定化し、糖鎖アレイを作製した。
【解決手段】 糖鎖を精製するための一級アミノ基を有する糖鎖精製用基材の、該一級アミノ基で糖鎖または糖の誘導体を捕捉、回収、精製した糖鎖で糖鎖ライブラリーを構築し、糖該糖鎖ライブラリーの糖鎖を糖類捕捉用高分子化合物を基板表面に塗布したアレイ状に固定化し、糖鎖アレイを作製した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖鎖ライブラリーとその作成方法および糖鎖ライブラリーの糖鎖を固定化した糖鎖アレイに関する。
【背景技術】
【０００２】
生化学分野において、近年、核酸、タンパク質に続く第三の鎖として糖鎖分子が注目されている。特に細胞の分化や癌化、免疫反応や受精などのかかわりが研究され、新たな医薬や医療材料を創製しようとする試みが続けられている。
また、糖鎖は多くの毒素、ウィルス及びバクテリアなどの病原性外来因子受容体であり、また、癌のマーカーとしても注目されており、こちらの分野においても、同様に新たな医薬や医療材料を創製しようとする試みが続けられている。
【０００３】
しかしながら、糖鎖は、研究の重要性を認識されながら、その複雑な構造や多様性から、第一、第二の鎖である核酸、タンパク質に比較して研究の進行が著しく遅れている。
この研究を推進する目的で、糖鎖を精製する方法が種々開発されている。一方、糖鎖は、それ単独で機能を発揮するというより、細胞レセプターに対するリガンドとして機能する場合も多く確認され、それゆえに糖鎖に対するレセプターの解析に供するために、種々の糖鎖を固定化するための基材が開発されている。
【０００４】
前記基材を用いて、各種の糖鎖群をライブラリー化する試みがなされており、一般的に、生体由来の糖、糖鎖、糖ペプチド、糖タンパク、糖脂質などの複合糖類から作製される。
【０００５】
また、特許文献１に記載されるように、カーゴレセプターの糖鎖認識部位を改変することにより糖結合タンパク質の糖鎖を改変して合成する方法などが開発され、合成糖鎖も多数作製され、飛躍的に糖鎖配列が増え、糖鎖ライブラリーとしての種類を確保することができた。
【０００６】
さらに、特許文献１には、前記の糖鎖ライブラリーを用いて糖鎖アレイを作製するための方法が記載されており、三官能性スペーサーを用いて、第１の官能基を糖鎖、第２の官能基を固相担体、第３の官能基を発色団と結合させ糖鎖アレイを作製する方法が示されている。
しかしながら、この方法により作製された糖鎖ライブラリーは、夾雑物が多く、直ちに糖鎖アレイを作製することは難しい。
【０００７】
また、特許文献２には、スペーサーを介して糖鎖を基材に固定化する方法が記載されており、スペーサーに親水性化合物を用いることで、非特異的吸着を抑制することが示されている。特許文献２においては、糖鎖固定後に非特異吸着を防ぐために実施例において３％ウシ血清アルブミンを用いたブロッッキング操作が記載されている。
しかしながらウシ血清アルブミンには既に糖鎖が存在して生理的機能を果たしていることは明白であり、目的とする糖鎖との区別が困難である。
【０００８】
また、特許文献３には、スペーサーを介して複数の複合糖質を基材に固定化しライブラリー化する方法が記載されておりスペーサーに親水性化合物を用いることで、非特異的吸着を抑制することが示されている。
しかしながら、該発明においては、固相担体にハロゲン化アセチル基を導入する必要があり、材質がガラスの場合においては、比較的容易であるが、汎用性に乏しい方法である。また、前述のように糖鎖は多くの毒素、ウィルス及びバクテリアなどの受容体の研究にも使用されていることから、廃棄に際しては焼却処理が好ましく、材質がガラスであることは不利である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００４／０１６７８９
【特許文献２】特表２００７−５２７５３９号公報
【特許文献３】特表２００２−５３７５６２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、簡便に糖鎖ライブラリーを作製し、該糖鎖ライブラリーを用いた糖鎖アレイを、吸着防止剤をコーティングすることなく、固定化できるバイオアッセイ用の高分子化合物及びこれを用いた各種糖鎖アレイ基板を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
このような目的は、下記（１）〜（１５）に記載の本発明により達成される。
（１）糖鎖を含有する精製原料を
一級アミノ基を有する糖鎖精製用基材と接触させて糖鎖を捕捉し、
当該基材ごと回収し、
所定の特性を有する糖鎖群ごとに分けることを
特徴とする糖鎖ライブラリー作製方法。
（２）前記基材ごと回収した糖鎖を、当該基材から遊離し、液体クロマトグラフィーにより、分画する（１）記載の糖鎖ライブラリー作製方法。
（３）前記精製原料が、有機合成物、酵素合成物または生体由来物質である（１）または（２）に記載の糖鎖ライブラリー作製方法。
（４）前記分離する糖鎖類が、２糖以上の糖鎖、またはそれを含む化合物、糖アミノ酸、糖ペプチド、糖タンパク質、糖脂質、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、グリコシルホスファチジルイノシトール、ペプチドグリカン、リポ多糖、およびそれらの誘導体から選ばれる（１）ないし（３）のいずれか１項に記載の糖鎖ライブラリー作製方法。
（５）前記一級アミノ基がオキシルアミノ基および/又はヒドラジド基である（１）ないし（４）のいずれか１項に記載の糖鎖ライブラリー作製方法。
（６）前記糖鎖精製用基材が、下記一般式〔１〕で表される糖鎖捕捉用高分子化合物を含む（１）〜（５）のいずれか１項に記載の糖鎖ライブラリー作製方法。
【化１】
（Ｒは−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−ＣＯ−、−ＣＯＮＨ−が挿入されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖を示す。）
（７）前記糖鎖精製用基材が、ビーズまたはプレート状の形態である（１）ないし（６）のいずれか１項に記載の糖鎖ライブラリー作製方法。
（８）前記糖鎖精製用基材が、下記一般式〔２〕の構造を有する架橋ポリマー構造を有するポリマーマトリックスで構成される粒子である（１）ないし（７）のいずれか１項に記載の糖鎖ライブラリー作製方法。
【化２】
（Ｒ１，Ｒ２は−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−が挿入されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５はＨ，ＣＨ３，または炭素数２〜５の炭化水素鎖を示す。ｍ，ｎはモノマーユニット数を示す。）
（９）（１）ないし（８）のいずれか１項に記載の糖鎖ライブラリー作製方法で作製したことを特徴とする糖鎖ライブラリー。
（１０）前記糖鎖ライブラリーの糖鎖を基板の表面に固定化したことを特徴とする糖鎖アレイ。
（１１）前記糖鎖アレイが、下記一般式〔３〕で表される糖類固定用高分子化合物を基板表面に塗布し、高分子化合物の固定化層を介して前記糖鎖が、固定化した（１０）記載の糖鎖アレイ
【化３】
（式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は水素原子またはメチル基を、Ｒ４は疎水性基を示す。Ｘは炭素数１〜１０のアルキレンオキシ基を示し、ｐは１〜２０の整数を示す。ｐが２以上２０以下の整数である場合、繰り返されるＸは、同一であっても、または異なっていてもよい。Ｙはアルキレングリコール残基を含むスペーサーであり、Ｚは酸素原子またはＮＨである。Ｍｅはメチル基である。ｌ、ｍ、ｎは自然数である。）
（１２）前記疎水性基Ｒ４が環状アルキル基であることを特徴とすることを特徴とする（１１）記載の糖類アレイ。
（１３）前記環状アルキル基がシクロヘキシル基であることを特徴とする（１２）記載の糖類アレイ。
（１４）前記基板の材質がプラスチックである（１０）ないし（１３）のいずれか１項に記載の糖鎖アレイ。
（１５）前記プラスチックが飽和環状ポリオレフィンまたはポリスチレンを含むものである（１４）記載の糖鎖アレイ。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、生体由来材料のように夾雑物混在状態から糖鎖を簡便に精製し、精製糖鎖ライブラリーを構築でき、さらに該糖鎖ライブラリーを用いた糖鎖アレイを調製することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＩｇＧ遊離糖鎖のＨＰＬＣのチャート
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明に述べるところの糖鎖ライブラリーとは、種々の動物細胞、血清糖タンパク質等の精製原料である糖鎖リソースから糖鎖のみを回収・精製・分離したもので構成されている。ライブラリー構築のためには、糖鎖の精製・分離諸条件をもとに量産化する技術が必要となる。
【００１５】
（糖鎖ライブラリーの作製方法の説明）
まず、糖鎖ライブラリーを作製する方法は以下のステップにより構成される。
（１）前記精製原料を、一級アミノ基を有する糖鎖精製用基材と接触させることにより、糖鎖の還元末端と一級アミノ基との間で、化学結合が生じ基材に糖鎖のみを捕捉する。
（２）この糖鎖を捕捉した基材は、洗浄により、精製原料中の糖鎖以外の夾雑物を簡単に除去することが可能で、糖鎖のみを基材ごと回収する。
（３）基材ごと回収した糖鎖を、基材から遊離させ、所定の特性を有する糖鎖群ごとに分け、糖鎖ライブラリーを作製する。
【００１６】
本発明における糖鎖とは、２糖類以上の狭義の糖鎖、またはそれを含む化合物、例えば、糖アミノ酸、糖ペプチド、糖タンパク質、糖脂質、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、グリコシルホスファチジルイノシトール、ペプチドグリカン、リポ多糖、およびそれらの誘導体を示す。
【００１７】
（精製原料について）
次にステップごとに詳細に説明する。
まず、前記精製原料は、有機合成物、酵素合成物または生体由来物質であり、糖鎖を含む混合物である場合が多い。有機合成物の場合は、反応触媒や反応中間体を含み、酵素合成物の場合は、合成酵素を含んでいる。また、生体由来物質の場合は、組織由来、動物細胞由来や血液などの体液由来物質であったり、粗精製された血清糖タンパク質であったりと、糖鎖を含む物質以外の夾雑物を多く含む混合物である。
【００１８】
前記精製原料から、糖鎖のみを捕捉する方法について述べる。
糖鎖は生体の中で唯一、還元処理により、末端にアルデヒド基を生じる物質である。該糖鎖を、表面に一級アミノ基を有する糖鎖精製用基材と接触させることにより糖鎖精製用基材表面に化学結合により固定化することが出来る。
接触の方法は還元末端糖鎖を含む混合物の溶液中に糖鎖精製用基材を投入する、または糖鎖精製用基材で作製した容器内に混合物溶液を入れて接触させることにより、アルデヒド基と一級アミノ基を反応させ、化学結合を生じせしめ、糖鎖捕捉用基材に共有結合で糖鎖を結合させる。
【００１９】
（糖鎖精製用基材について）
当該糖鎖精製基材は、糖鎖を捕捉するための反応性の一級アミノ基をその表面に有する基材であり、該一級アミノとしてオキシルアミノ基またはヒドラジド基を有することが望ましい。これは、酵素やカップリング試薬などの非存在下においても糖鎖還元末端であるアルデヒド基と反応し結合可能であるから好適である。
【００２０】
前記糖鎖精製用基材は、下記一般式〔１〕で表される構造が好ましい。
【化１】
式１中のＲは−Ｏ−，−Ｓ−、−ＮＨ−、−ＣＯ−、−ＣＯＮＨ−が挿入されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素を示す。
前記担体は、下記一般式〔２〕の構造を有する架橋ポリマー構造を有するポリマーマトリックスで構成される粒子であることが好ましい。
【化２】
（Ｒ１，Ｒ２は−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−が挿入されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５はＨ，ＣＨ３，または炭素数２〜５の炭化水素鎖を示す。ｍ，ｎはモノマーユニット数を示す。）
前記、一般式〔２〕の担体は、式〔１〕のＲ−ＮＨ−ＮＨ２の構造を含むため、担体が式〔１〕の構造体そのものとなる。
【００２１】
また、前記担体は、水溶液や有機溶媒に不溶性の担体であることがのぞましく、材質は特に限定するものではないが、ガラスや耐有機溶剤性に優れた樹脂、例えばシリコン、ポリスチレン、エチレン−無水マレイン酸共重合物、ポリメタクリル酸メチル等を選ぶことができる。
【００２２】
前記糖鎖精製用基材の形態は、特に限定するものではないが、ビーズまたはプレート状の形態であることが好ましい。糖鎖ライブラリーを作製するためには、同時に多数の試料を処理する可能性があり、その際には、カラムにビーズを充填したものを使用する事で連続的な処理が可能である。また、マルチウェルプレートであれば同時に多検体を処理することが可能である。マルチウェルプレートとしては、６、１２、２４，４８、９６，３８４ウェルなどのマルチウェルプレートを適宜使用することが出来る。
【００２３】
式〔２〕の担体以外では、ビーズとして無機物質を用いることができる。該担体としては、粒子状のものを用いることができ、例えばシリカ粒子、アルミナ粒子、ガラス粒子、金属粒子などが挙げられる。また、有機高分子物質としては、アガロース、セファロースに代表される多糖類ゲル、ビニル化合物の重合体であるポリマーを粒子状にしたものを使用することが出来る。
【００２４】
また、粒子としたときの形状は球であることが好ましく、平均粒径０．１μｍ以上５００μｍ以下のポリマー粒子である。この場合の平均粒径は光学顕微鏡視野において観察される各粒子の直径を計測することにより求めたものである。このような範囲の粒径を有する担体の粒子は、遠心分離、 フィルタなどによる回収が容易であり、かつ、充分な表面積を有しているために糖鎖との反応効率も高いと考えられる。粒径が上記の範囲よりも大幅に大きい場合、表面積が小さくなるために糖鎖との反応効率が低くなることがある。また、粒径が上記の範囲よりも大幅に小さい場合、特にフィルタによる粒子の回収が難しくなることがある。さらに、粒子をカラムに充填して用いる場合、粒径が過小であると通液の際の圧力損失が大きくなってしまうことがある。
【００２５】
（糖鎖捕捉について）
前記糖鎖精製基材で末端還元糖鎖と一級アミノ基の結合反応の条件の一具体例は、ｐＨが４〜７、反応温度が２５〜９０℃、好ましくは６０〜８５℃、より好ましくは７５〜８０℃、反応時間が１〜１６時間である。最も好ましい条件はｐＨ４．５〜５．５、反応温度が８０℃、反応時間が１時間である。
ｐＨが４未満、または７を越える場合は、捕捉糖鎖の解離反応が同時に生じ、捕捉効率が落ちる。反応温度は、２５℃未満の場合、反応効率が著しく悪化する場合があり、糖鎖を十分に捕捉することができない。
また、９０℃を超える場合は、化合物自身に悪影響を及ぼすと共に、基材がプラスチックの場合は種類によって変形、溶融を発生することがある。
反応時間が１時間より短い場合は十分な結合反応が得られない場合があり、糖鎖を十分に捕捉することが出来ない。また１６時間を超えた反応は、更なる糖鎖の捕捉は見られず時間をかけただけの効果がない。
【００２６】
（糖鎖回収について）
ここで、洗浄液に用いられる溶液としては、界面活性剤を含む水溶液、メタノール、エタノールなどのアルコール類；水および水性緩衝液などが使用される。ここで、洗浄に水溶液が用いられる場合、この水溶液のｐＨは中性付近であることが好ましく、そのｐＨは４〜１０、より好ましくは６〜８である。
前期糖鎖捕捉した基材は、洗浄により、精製原料中の糖鎖以外の夾雑物を簡単に除去することが可能で、糖鎖のみを基材ごと回収することができる。
洗浄方法としては、ビーズの場合は、洗浄液に浸漬し、洗浄液の交換を繰り返すことで洗浄することができる。
また、プレートの場合は、各ウェル内に洗浄液を分注、吸引除去を繰り返すことで簡便に洗浄することができる。
【００２７】
前記界面活性剤は特に限定はしないが、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液等のｐＨが制御できる緩衝液が好ましい。また、各種アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、中性界面活性剤を用いることができ、特に限定しないが、ＴｒｉｔｏｎＸ、各種Ｔｗｅｅｎ、ドデシル硫酸ナトリウムを使用することが好ましい。洗浄液のｐＨは、４〜７が好ましい。これはｐＨ４より低い場合とｐＨ７より高い場合は、ｐＨにより糖鎖の脱離反応が生じることによる。
【００２８】
この洗浄処理は、連続式にて糖鎖捕捉反応を行った場合には、カラムに洗浄溶液を通して糖鎖捕捉反応から連続的に処理してもよい。また、マルチプレートを用いた場合には、ろ過操作あるいは遠心操作により糖鎖捕捉物質以外の物質を除去してもよい。
【００２９】
なお、前記洗浄工程は、当初の生体試料の状態、例えば糖鎖以外の物質の混在の程度によっては行わなくても構わない。
【００３０】
（糖鎖分離、精製について）
次のステップとして、基材ごと回収した糖鎖を基材から遊離させ、所定の特性を有する糖鎖群ごとに分けることについて述べる。
ここでいう所定の特性とは、例えば糖鎖の分子量、糖鎖結合様式、特定糖鎖の有無糖鎖以外の結合分子などが挙げられるがこれらに限定するものではない。
【００３１】
前記のように基材ごと回収した糖鎖は、基材から遊離させて、該遊離糖鎖を糖鎖ライブラリーとして使用することができる。この遊離操作について以下で説明する。
【００３２】
遊離操作の基本は、基材ごと回収した糖鎖を酸性溶媒中、還元剤の存在下で加熱反応を行うことで糖鎖を基材から切り出すことができる。
具体的な方法を以下に示す。
【００３３】
反応を行う溶媒は、酸と有機溶媒の混合溶媒あるいは酸と水と有機溶媒の混合溶媒で遊離反応を行うのが好ましい。酸と水と有機溶媒の混合溶媒の場合、水の含有率は好ましくは０．１％〜９０％、より好ましくは０．１％〜８０％、さらに好ましくは０．１％〜５０％である。水の代わりに水性緩衝液を含有しても良い。混合前の緩衝液の濃度は好ましくは０．１ｍＭ〜１Ｍ、より好ましくは０．１ｍＭ〜５００ｍＭ、さらに好ましくは１ｍＭ〜１００ｍＭである。反応溶液のｐＨは好ましくは２〜９、より好ましくは２〜７であり、さらに好ましくは２〜６である。使用する酸は例えば、酢酸、ギ酸、トリフルオロ酢酸、塩酸、クエン酸、リン酸、硫酸が好ましく、より好ましくは酢酸、ギ酸、トリフルオロ酢酸、リン酸、さらに好ましくは酢酸、トリフルオロ酢酸である。
【００３４】
還元剤としては、水酸化ホウ素ナトリウムを好適に用いることができる。
ここで、アミノ基を含む化合物として、アミノオキシ基、またはヒドラジド基を含む化合物を用いれば、還元剤を必ずしも使用する必要はない。
【００３５】
反応温度に関しては４〜９０℃が好ましく、好ましくは２５〜９０℃で、さらに好ましくは４０〜９０℃である。反応時間は、１０分間〜２４時間、好ましくは１０分間〜８時間、より好ましくは１０分間〜３時間である。反応は、開放系で行って溶媒を完全に蒸発させることが好ましい。
ｐＨ２の酸性から中性付近で、糖鎖切り出し反応を行うことができるため、従来の強酸性処理、たとえば１０％トリフルオロ酢酸処理による切出しのような強酸の存在下での切出し反応に比べて、シアル酸残基の脱離など糖鎖の加水分解などを引き起こすことを抑制することができるようになる。
【００３６】
また、基材ごと回収した糖鎖を遊離させ、さらに、高速液体クロマトグラフィーなどの方法で分子量分画をする場合には、糖鎖を蛍光標識する必要がある。糖鎖の遊離ならびに蛍光標識について以下に記載する。
【００３７】
前記の蛍光標識方法としては、アミノ基を含むフルオロフォアまたはクロロフォアを接触させ糖鎖を遊離させると同時にフルオロフォアまたはクロロフォアで糖鎖を標識する方法である。反応の溶媒、還元剤、反応温度、時間の詳細は前記の通りであるが、アミノ基を含む化合物、例えば糖鎖に対して１０等量以上の化合物を添加することで達成できる。
【００３８】
前記のアミノ基を含むクロロフォアまたはフルオロフォアは、具体的にはクロロフォアまたはフルオロフォアが、下記のヒドラジド基を含む物質またはアミノオキシ基を含む物質からなる群から選ぶことが、還元剤の使用を抑えることが出来るのでより好ましい。
（ ヒドラジド基を含む物質）
5-Dimethylaminonaphthalene-1-sulfonyl hydrazine (Dansylhydrazine)； 2-hydrazinopyridine；9-fluorenylmethyl carbazate (Fmoc hydrazine)；benzylhydrazine； 4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-propionoc acid, hydrazide； 2-(6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin)acetohydrazide； 7-diethylaminocoumarin-3-carboxylic acid, hydrazide (DCCH)； phenylhydrazine； 1-Naphthaleneacethydrazide； 2-hydrazinobenzoic acid； phenylacetic hydrazide；
（ アミノオキシ基を含む物質） O-benzylhydroxylamine； O-phenylhydroxylamine； O-(2,3,4,5,6-pentafluorobenzyl)hydroxylamine； O-(4-nitrobenzyl)hydroxylamine；2-aminooxypyridine； 2-aminooxymethylpyridine； 4-[(aminooxyacetyl)amino]benzoic acid methyl ester； 4-[(aminooxyacetyl)amino]benzoic acid ethyl ester； 4-[(aminooxyacetyl)amino]benzoic acid n-butyl ester
【００３９】
こちらの方法の場合は、標識を利用して糖鎖を分子量分画した後は、更に標識を外す操作が必要となる。
標識を外す方法は、前記の基材から糖鎖を分離するのと同じ方法で行うことができる。
【００４０】
（糖鎖ライブラリー保存方法）
前記のように糖鎖は溶液状態で回収され糖鎖ライブラリーとして作製さる。この溶液状の糖鎖ライブラリーは、目的に応じて、すぐに使用してもよいし、必要時まで保存しておいてよい。保存方法は、そのまま市販の蓋付きチューブなど、密閉容器に移し冷凍保存することが好ましい。さらに好ましくは凍結乾燥させてから冷凍保存する方法である。冷凍保存の温度は、−２０℃以下が好ましく、より好ましくは−８０℃である。
【００４１】
（糖鎖アレイの全体像説明）
次に、本発明の糖鎖ライブラリーを用いて、糖鎖アレイを作製する方法について述べる。
糖鎖アレイは、アレイ基板上に糖鎖を固定化したものの総称であるが、本発明においては、アレイ基板の上に該基板と糖鎖の結合を仲介する高分子化合物をアレイ基板上に塗布して、その後、高分子化合物中に設けた糖鎖結合官能基を用いてアレイ基板上に糖鎖を固定化するものである。
【００４２】
（糖鎖ライブラリーアレイ）
前述の高分子化合物は、具体的には、少なくとも親水性を保持するためのユニットＡ、糖類を捕捉するための疎水性基を有するユニットＢ、および糖類を捕捉するための一級アミノ基を有するユニットＣからなる高分子化合物である。この高分子化合物は、生理活性物質を固定化する性質と、検出対象物のアレイ基板への物理的吸着（非特異敵吸着）を抑制する性質を有する。すなわち、一級アミノ基が糖、糖鎖、糖ペプチド、糖脂質またはこれらを有する生理活性物質を固定する役割を果たし、親水性を保持するためのユニットが検出対象物への基材への物理的吸着（非特異吸着）を抑制する性質を併せ持つ。また、疎水性のユニットＢは、該高分子化合物のプラスチックアレイ基板やガラスアレイ基板への吸着に関与している。
【００４３】
このような固定化のための高分子化合物としては、下記式で表されるものが好ましく用いられる。高分子化合物に含まれる親水性のユニットＡはホスホリルコリン基に代表されるもので、特に構造を限定するものではないが、下記一般式〔３〕において、ユニットＡは、左部の構成単位で示されように、（メタ）アクリル残基とホスホリルコリン基が炭素数１〜１０のアルキレンオキシ基Ｘの連鎖を介して結合した構造であることが最も好ましい。中でもＸはエチレンオキシ基であることが最も最も好ましい。式中のアルキレンオキシ基の繰り返し数は１〜２０の整数であり、繰り返し数２以上２０以下の場合は、繰り返されるアルキレンオキシ基の炭素数は同一であっても、異なっていてもよい。ｌは本来自然数であるが、各構成成分の組成割合として表記される場合がある。
【００４４】
【化３】
（式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は水素原子またはメチル基を、Ｒ４は疎水性基を示す。Ｘは炭素数１〜１０のアルキレンオキシ基を示し、ｐは１〜２０の整数を示す。ｐが２以上２０以下の整数である場合、繰り返されるＸは、同一であっても、または異なっていてもよい。Ｙはアルキレングリコール残基を含むスペーサーであり、Ｚは酸素原子またはＮＨである。Ｍｅはメチル基である。ｌ、ｍ、ｎは自然数である。）
【００４５】
本発明の高分子化合物に含まれるホスホリルコリン基を有するユニットＡの組成割合（ｌ，ｍ，ｎの和に対するｌの比率）は、高分子の全ユニットに対して、５〜９８ｍｏｌ％が好ましくより好ましくは１０〜８０ｍｏｌ％、最も好ましくは、１０〜８０％である。組成比が下限値を下回ると親水性が弱くなり非特異吸着が多くなる。一方、上限値を上回ると水溶性が高まり、アッセイ中に高分子化合物が溶出してしまう可能性がある。
【００４６】
本発明の高分子化合物に含まれる疎水性基を有するユニットＢの組成割合（ｌ，ｍ，ｎの和に対するｍの比率）は、高分子の全ユニットに対して、１０〜９０ｍｏｌ％が好ましくより好ましくは１０〜８０ｍｏｌ％、最も好ましくは、２０〜８０％である。上限値を上回ると非特異吸着が増加する恐れが出てくる。
【００４７】
本発明の高分子化合物に含まれる一級アミノ基を有するユニットＣは、特に構造を限定されるものではないが、前記一般式〔３〕においての右部の構成単位で表されるように、（メタ）アクリル残基とオキシルアミノ残基を含むスペーサーＹを介した構造であることが好ましい。オキシルアミノ基の場合、Ｚは酸素原子を、ヒドラジド基の場合、ＺはＮＨを示す。ｎは本来自然数であるが、各成分の組成割合として標記される場合がある。アルキレングリコール残基を含むスペーサーＹの構造は、特に制限されるものではないが、下記一般式〔４〕または〔５〕であることがこのましく、より好ましくは〔２〕である。
【００４８】
【化４】
(式中ｑは１〜２０の整数)
【００４９】
【化５】
(式中ｒは１〜２０の整数)
【００５０】
一級アミノ酸を有するユニットＣの成分の組成割合（ｌ，ｍ，ｎの和に対するｎの比率）は、高分子の全ユニットに対して、１〜９４ｍｏｌ％が好ましくより好ましくは２〜９０ｍｏｌ％、最も好ましくは、２０〜４０％である。組成値が下限地を下回ると糖、糖鎖、および／またはこれらを有する生理活性物質を十分量固定化できなくなる。また、上限値を上回ると非特異吸着が増加する。
【００５１】
本発明の高分子化合物の合成方法は、特に限定されるものではないが、合成の容易さから、少なくともユニットＡとしてホスホリルコリン基を有するモノマー、ユニットＢとして疎水性基を有するモノマー、ユニットＣとして一級アミノ基を予め保護基にて保護したモノマーをラジカル共重合する工程、該工程により得られた高分子化合物から保護基を除去する工程、を含む製造方法が好ましい。あるいは、少なくともホスホリルコリン基を有するモノマー、疎水性基を有するモノマー、および一級アミノ基を導入しうる官能基を有するモノマーをラジカル共重合する工程、該工程により得られた高分子化合物に一級アミノ基を導入する工程、を含む製造方法が好ましい。
【００５２】
ユニットＡであるホスホリルコリン基を有する単量体としては、特に構造を限定しないが、例えば２−（メタ）アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、２−（メタ）アクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン、６−（メタ）アクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン、１０−（メタ）アクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン、２−（メタ）アクリロイルオキシプロピルホスホリルコリン等を挙げられるが、入手性から２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが好ましい。
【００５３】
ユニットＢである疎水性基を有するモノマーの具体的な例としては、ｎ−ブチル（メタ）アクリレート、i s o−ブチル（メタ）アクリレート、s e c−ブチル（メタ）アクリレート、t−ブチル（メタ）アクリレート、ｎ−ネオペンチル（メタ）アクリレート、i s o−ネオペンチル（メタ）アクリレート、s e c−ネオペンチル（メタ）アクリレート、ネオペンチル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、ｎ−ヘキシル（メタ）アクリレート、i s o−ヘキシル（メタ）アクリレート、ヘプチル（メタ）アクリレート、ｎ−オクチル（メタ）アクリレート、i s o−オクチル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、ｎ−ノニル（メタ）アクリレート、i s o−ノニル（メタ）アクリレート、ｎ−デシル（メタ）アクリレート、is o−デシル（メタ）アクリレート、ｎ−ドデシル（メタ）アクリレート、i s o−ドデシル（メタ）アクリレート、ｎ−トリデシル（メタ） アクリレート、i s o−トリデシル（メタ）アクリレート、ｎ−テトラデシル（メタ） アクリレート、i s o−テトラデシル（メタ）アクリレート、ｎ−ペンタデシル（メタ）アクリレート、i s o−ペンタデシル（メタ）アクリレート、ｎ−ヘキサデシル（メタ）アクリレート、i s o−ヘキサデシル（メタ）アクリレート、ｎ−オクタデシル（メタ）アクリレート、i s o−オクタデシル（メタ）アクリレート、イソボニル（ メタ） アクリレートなどが挙げられる。これらのなかで最も好ましいのが、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、ｎ―ブチルメタクリレート、ｎ−ドデシルメタクリレート、ｎ−オクチルメタクリレートである。
【００５４】
一級アミノ基を予め保護基にて保護したモノマーは、特に構造を限定しないが、下記一般式［６］（式中、Ｒ３は水素原子またはメチル基、Ｙはアルキレングリコール残基を含むスペーサー、Ｚは酸素原子またはＮ、Ｈ、Ｗは保護基を示す。）で表されるように、（メタ） アクリル基と、オキシルアミノ基またはヒドラジド基が、アルキレングリコール残基を含むスペーサーＹを介した構造であることが好ましい。
【００５５】
【化６】
【００５６】
保護基Ｗ としてはアミノ基を保護基できるものであれば何ら制限を受けるものではなく、例えば酸無水物から任意に用いることができる。なかでもｔ―ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）やベンジロキシカルボニル基（Ｚ基、Ｃｂｚ基）、９−フルオレニルメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）などが好適に用いられる。
【００５７】
具体的なモノマーの例としては、下記式〔７〕で表されるようなものである。
【００５８】
【化７】
【００５９】
脱保護化は、トリフルオロ酢酸や塩酸、無水フッ化水素を用いれば、一般的な条件で行うことができる。
【００６０】
一方、高分子化合物を重合した後に一級アミノ基を導入する方法としては、何ら制限を受けるものではないが、少なくともホスホリルコリン基を有するモノマー、疎水性基を有するモノマー、およびアルコキシ基を有するモノマーをラジカル共重合した後に、該高分子化合物に導入されたアルコキシ基とヒドラジンを反応させて、ヒドラジド基を生成する方法が簡便で好ましい。アルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ｔ−ブトキシ基等が好適である。
【００６１】
具体的なアルコキシ基を有するモノマーの例としては、下記式〔８〕で表されるようなものである。
【００６２】
【化８】
【００６３】
本発明の高分子化合物の合成溶媒としては、それぞれの単量体が溶解するものであればよく、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｔ−ブチルアルコール、ｎ−ペンタノール等アルコール類、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、シクロヘキサノン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、メチルエチルケトン、メチルブチルケトン、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル等を挙げることができる。これらの溶媒は、単独または２ 種以上の組み合わせで用いられる。
【００６４】
重合開始剤としては通常のラジカル開始剤ならいずれでもよく、例えば、２，２ ’−アゾビスイソブチルニトリル（以下「ＡＩＢＮ」という）、１，１’−アゾビス（シクロヘキサン−１−カルボニトリル）等のアゾ化合物、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウリル等の有機過酸化物等を挙げることができる。
【００６５】
本発明の高分子化合物の分子量は、高分子化合物と未反応の単量体との分離精製が容易になることから、数平均分子量は５０００以上が好ましく、１００００以上がより好ましい。前記数平均分子量は高速液体クロマトグラフィーの測定により算出される
【００６６】
脱保護は前述のトリフルオロ酢酸や塩酸、無水フッ化水素を用いれば、一般的な条件で行うことができるが、脱保護の時期に関しては、以下の通りである。
通常は重合が完了し、高分子化合物が作製できた段階で行うことが一般的であり、本発明の高分子化合物を得るには、重合終了後に脱保護を行うことで該高分子化合物を得ることができる。
【００６７】
基材表面に該高分子化合物を被覆することにより生理活性物質の非特異的吸着を抑制する性質、及び生理活性物質を固定化する性質を容易に付与することが可能である。
この場合、脱保護を行った一級アミノ基を持つ高分子化合物を被覆することも可能であるが、反応性の高い一級アミノ基を持つ高分子材料を溶液にして皮膜することは、場合によっては作業中に一級アミノ基が反応して不活化することも考えられる。
従って、脱保護する直前で高分子化合物を精製し、基材表面を皮膜して後に、脱保護の反応を行い、基材表面上に一級アミノ基が存在する状態を形成することが望ましい。
【００６８】
アレイ基板表面への高分子化合物の被覆は、例えば有機溶剤に高分子化合物を０．０５〜５０重量％濃度になるように溶解した高分子溶液を調製し、浸漬、吹きつけ等の公知の方法で基材表面に塗布した後、室温下ないしは加温下にて乾燥させることにより行われる。
【００６９】
有機溶剤としてはエタノール、メタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｔ−ブチルアルコール、ｎ−ペンタノール、シクロヘキサノール等アルコール類、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトン、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、メチルエチルケトン、メチルブチルケトン、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、シクロヘキサノン等を挙げることができる。これらの溶媒は、単独または２ 種以上の組み合わせで用いられる。中でも、エタノール、メタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｔ−ブチルアルコール、ｎ−ペンタノールシクロヘキサノール等アルコール類がプラスチック基材を変性させず、乾燥させやすいため好ましい。
【００７０】
本発明に用いるアレイ基板としては、スライド形状基板、６、１２、２４，４８、９６、３８４穴プレート、容器、マイクロフルイディスク基板が好ましい。例えばプラスチック製基板、ガラス製基板、金属蒸着膜を有する基板などがあげられるが、スライド形状基板が最もふさわしい。プラスチック製基板の具体例としては、ポリスチレン、環状ポリオレフィンポリマー、シクロオレフィンポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリサルフォン、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレートを素材とした基板などがあげられる。
【００７１】
特に、蛍光観察に用いる基材としては、環状ポリオレフィンポリマー、シクロオレフィンポリマーが有用である。前記基材を用いる場合においては、前記高分子化合物の疎水基が、シクロヘキシルキ基であると、基材との相互作用が良好で、同じ組成比の高分子材料を他の基材（例えばポリスチレンやガラス基材）に塗布した場合に比べ、吸着量が高くバックグランド値が低い良好な結果となる。
【００７２】
また、環状ポリオレフィンポリマーからなるアレイ基板に、前記高分子化合物を塗布する場合、アミノオキシモノマー１００ｍｏｌ％の高分子化合物に関しては、塗布することができない。一方、ポリスチレンポリマーには塗布が可能であるが、夾雑物の非特異的吸着は抑制されず汎用性に乏しい。
【００７３】
前記高分子化合物を塗布した基材は、糖鎖ライブラリー中の糖鎖群を固定化することができ、バイオアッセイ用途に好適に用いることができる。
糖鎖群としては、２糖以上の糖鎖、またはそれを含む化合物、糖アミノ酸、糖ペプチド、糖タンパク質、糖脂質、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、グリコシルホスファチジルイノシトール、ペプチドグリカン、リポ多糖、およびそれらの誘導体などが挙げられる。これらの糖鎖群の基材への固定化方法としては、スポッターを使用して生理活性物質が溶解した溶液を点着する方法、糖鎖群が溶解した溶液を容器などに分注して固定化する方法などがある。
【００７４】
糖鎖ライブラリー中の糖鎖群を前記の基板表面に固定化する方法は、前述の糖鎖精製基材で末端還元糖鎖と一級アミノ基との反応と同じ反応で固定化できる。すなわち、糖鎖ライブライリー中の糖鎖の末端還元糖鎖と、アレイ基板上の一級アミノ基とを、ｐＨが４〜７、反応温度が２５〜９０℃、好ましくは６０〜８５℃、より好ましくは７５〜８０℃、反応時間が１〜１６時間で反応させる。最も好ましい条件はｐＨ４．５〜５．５、反応温度が８０℃、反応時間が１時間である。
【００７５】
前記の凍結乾燥保存した糖鎖ライブラリーを用いる場合には、糖鎖ライブラリー中の糖鎖群を溶解する溶液としては各種緩衝材が好適に用いられる。特に限定されないが、たとえば炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸水素二カリウム、トリス塩酸緩衝剤、トリス酢酸緩衝剤、ＰＢＳ緩衝剤、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎe−Ｎ’−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝剤、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｐｈｏｎｉｃａｃｉｄ） 緩衝剤などが用いられる。
【００７６】
糖鎖ライブラリー中の糖鎖群を溶解する溶液のｐＨとしては、糖又は狭義の糖鎖を溶解する場合はｐＨが２〜８であることが好ましい。糖タンパク質を溶解する場合はｐＨが４〜９であることが好ましい。糖核酸を溶解する場合はｐＨが２〜８であることが好ましい。糖脂質を溶解する場合はｐＨ２〜８ であることが好ましい。
【００７７】
糖鎖ライブラリー中の糖鎖群を溶液中の濃度としては特に限定されないが、０．０００１ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌであることが好ましい。
【００７８】
糖鎖ライブラリー中の糖鎖群を固定化する温度としては０℃から１００℃が好ましい。
【実施例】
【００７９】
以下、本発明を実施例および比較例に基づいて詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００８０】
＜糖鎖ライブラリーの作製＞
（糖鎖の遊離）
ＩｇＧ １ｍｇ(Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ由来)を糖鎖精製キットＢｌｏｔＧｌｙｃｏ（住友ベークライト製ＢＳ−４５６０３）に添付のプロトコルに従って、還元アルキル化処理、トリプシン処理、Ｎ−グリコシダーゼ（ＰＮＧａｓｅＦ）処理を実施し、ＩｇＧより糖鎖を遊離させた。詳細は以下の通り。
【００８１】
ＩｇＧ（１ｍｇ）の入ったチューブに下記の溶液を加え、撹拌して完全に溶解させた。
・１Ｍ重炭酸アンモニウム水溶液（５μＬ）
・純水（５０μＬ）
・１２０ｍＭヂチオトレイトール（ＤＴＴ、シグマ社、Ｄ９７７９） 水溶液（５μＬ）
【００８２】
前記溶液を６０℃ で３０分間静置した後、１２３ｍＭヨードアセトアミド（ＩＡＡ、和光純薬製、０９３−０２１５２）水溶液（１０μＬ）を加え、遮光下、室温で １時間静置。
静置終了後、トリプシン（４００ｕｎｉｔ）を加えた。（トリプシンを４０ｕｎｉｔ／μＬで１ｍＭ塩酸に溶解し、１０μＬをサンプル溶液に加えて調製）
３７℃のインキュベーターで １時間以上静置し反応させた。その後、９０℃のヒートブロックで５分間加熱し、トリプシンを失活させた。前記溶液を３７℃まで冷やした後、Ｎ−グリコシダーゼ（ＰＮＧａｓｅ Ｆ、Ｒｏｃｈｅ社製、１１−３６５−１９３−００１）（５μＬ＝５ｕｎｉｔ）を加え３７℃のインキュベーターで一晩 (１２時間以上) 反応させた。反応後、９０℃で５分間加熱し、ＰＮＧａｓｅＦを失活させた。
【００８３】
（糖鎖精製）
前記ＢｌｏｔＧｌｙｃｏプロトコルに従って、ＩｇＧ２００μｇ相当量の糖鎖をビーズに捕捉した
ＢｌｏｔＧｌｙｃｏビーズ分散液５０μＬ をピペットで取り、キット付属の反応用チューブの底部に注入した。反応用チューブを卓上遠心機(チビタン、日本ミリポア社製)で数秒間遠心し，水を除去し、ビーズ上に糖鎖サンプル溶液 (２０μＬ) を添加し、さらに２％酢酸／アセトニトリル(１８０μＬ)を添加した。反応チューブを８０℃のヒートブロックに挿入し、１時間加熱し、溶媒が完全に蒸発し、ビーズが完全に乾燥していることを確認した。反応終了後、反応用チューブを２ｍＬエッペンドルフチューブに挿入し、反応用チューブに２Ｍグアニジン溶液(２００μＬ)を加え，卓上遠心機で数秒間遠心した。この作業を３回繰り返したのち、エッペンドルフチューブに溜まった溶液を除去した。反応用チューブを純水(２００μＬ)で３回洗浄、続けて１％トリエチルアミン／メタノール(２００μＬ)で３回洗浄、最後にメタノール(２００μＬ)で３回洗浄した。
反応用チューブのビーズに１００μLの１０％無水酢酸／メタノール溶液を加え、室温で３０分間反応。反応後、反応用チューブを再度２ｍLエッペンドルフチューブに挿入し、遠心して無水酢酸溶液を除去した。
さらにビーズをメタノール(２００μＬ)で３回洗浄、続けて１０ｍＭ塩酸(２００μＬ) で３回洗浄、最後に純水(２００μＬ)で３回洗浄した。
【００８４】
（糖鎖の標識）
２０ｍＭの２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚｈｙｄｒａｚｉｄｅ（２−ＡＢｈ、和光純薬製、５７４−９２４４１）溶液２０μＬと２％酢酸/アセニトリル溶液１８０μＬを加えて、８０℃で１時間加熱し、ＢｌｏｔｏＧｌｙｃｏからの糖鎖の脱離と標識を行った。
具体的には以下の通り。
【００８５】
次に、過剰の未反応２−ＡＢｈ試薬を除去した。
回収した糖鎖溶液 （約５０μＬ) に、アセトニトリル（９５０μＬ）を加え、混合、ＢｌｏｔＧｌｙｃｏキット内のクリーンアップカラムを遠心機にセットし、カラムに純水２００μＬを加え、数秒の遠心をしてろ過した。
カラムにアセトニトリル２００μＬを加え、遠心してろ過した．これを３回繰り返しクリーンアップカラムを洗浄した。
廃液を捨てた後、クリーンナップカラムに糖鎖溶液／アセトニトリル溶液を全量加え、そのまま静置して溶液を自然落下で通過させた。
アセトニトリル４００μＬを加え、遠心して通過させ、これを３回繰り返した。
カラムにアセトニトリル／純水（９５：５，ｖ／ｖ）４００μＬを加え、遠心して通過させ、これを３回繰り返した。
クリーンナップカラムを新しいエッペンチューブに挿し、純水５０μＬを加えて遠心し、ラベル化糖鎖を溶出させた。
回収した溶液をもちいて、ＨＰＬＣを用いて分取を行った。
【００８６】
（ＨＰＬＣによる分取）
前記で得られた２ＡＢｈ標識糖鎖をＨＰＬＣで分取した。
分取は２分毎にフラクション１本分取し、計１４本得た。
ＨＰＬＣ条件は以下の通りである。
・カラム：ＴＳＫ−ＧＥＬ Ａｍｉｄｅ−８０（東ソー株式会社製）
・溶媒Ａ：５０ｍＭ ギ酸水溶液（アンモニア水でｐＨ４．４に調製）
・溶媒Ｂ：アクリロニトリル
・勾配：Ａ２０％（０ｍｉｎ）→Ａ５８％（１５８ｍｉｎ）
・流速：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
・カラム温度：３０℃
・装置：Ｗａｔｅｒｓ Ｄｅｌｔａ６００（日本ウォーターズ社製）
前記で得られた各フラクションを濃縮、乾燥した
【００８７】
（糖鎖からの２ＡＢｈの除去）
前記のように得られた糖鎖は２ＡＢｈ標識されている。このまま保存してもよいが、標識を外して保存することで、ライブライリーをすぐに使用することが可能となるので、以下にその標識を外す方法を記載する。
【００８８】
得られた糖鎖を０．５％ＴＦＡで３７℃、1時間処理して２ＡＢｈを遊離させた後、シリカカラムを用いて２ＡＢｈを除去した。得られた溶液を濃縮、乾燥した。
前記の回収した糖鎖に、アセトニトリルを加え、混合し１０００μＬにした。
ＢｌｏｔＧｌｙｃｏキット内のクリーンアップカラムを遠心機にセットし、カラムに純水２００μＬを加え、数秒の遠心をしてろ過した。
カラムにアセトニトリル２００μＬを加え、遠心してろ過した。これを３回繰り返しクリーンアップカラムを洗浄した。
廃液を捨てた後、クリーンナップカラムに糖鎖溶液／アセトニトリル溶液を全量加え、そのまま静置して溶液を自然落下で通過させた。
アセトニトリル４００μＬを加え、遠心して通過させ、これを３回繰り返した。
カラムにアセトニトリル／純水（９５：５，ｖ／ｖ）４００μＬを加え、遠心して通過させ、これを３回繰り返した。
クリーンナップカラムを新しいエッペンチューブに挿し、純水５０μＬを加えて遠心し、糖鎖を溶出させた。
【００８９】
＜糖鎖アレイの作製＞
以下の方法で、糖鎖の固定化と、レクチンとの結合評価を実施した。
（アレイ基板の作製）
マイクロアレイの作製には住友ベークライト製、環状ポリオレフィン樹脂製のスライドガラス形状のプラスチックス基板を使用した。
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−シクロヘキシルメタクリレート−Ｎ−[２−[２−[２−ｔ−ブトキシカルボニルアミノオキシアセチルアミノ]エトキシ]エトキシ]エチル]−メタクリルアミド共重合体の１．０重量％エタノール溶液にスライドを浸漬して高分子化合物を塗布した。
塗布後、２Ｍ ＨＣｌで３７℃、２時間処理し、ｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）を脱保護し、基板表面にアミノ基を作製した。
【００９０】
（糖鎖の固定化）
ＨＰＬＣで分取して得られたＩｇＧ由来糖鎖に下記溶液を２０ｕＬ加え溶解し、基板にスポッティングし、８０℃、１時間反応させて基板に糖鎖を固定化した。
溶液：１００ｍＭ ＮａＯＡｃ ｂｕｆｆｅｒ(ｐＨ５．０)＋０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（和光純薬、Ａ１６０４６）、０．０１％ＰＶＡ（重合度＝１５００）
【００９１】
（固定糖鎖の検出）
ＩｇＧ由来糖鎖の多くと結合するレクチンであるＣｏｎＡレクチンのビオチン標識体であるＢｉｏｔｉｎ標識ＣｏｎＡレクチン(ＳＩＧＭＡ、Ｃ２２７２)を下記溶液で５ｕｇ／ｍＬに調製した。
溶液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１００ｍＭ ＮａＣｌ、
１ｍＭ ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０
【００９２】
基板上に溶液を反応させ、室温で２時間反応した。
反応後、前記洗浄剤で洗浄した。
Ｃｙ３−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＧＥヘルスケア、ＰＡ４３００１）を下記溶液で２ｕｇ／ｍＬに調製したものを基板状に展開し、室温で１時間反応した。
溶液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１００ｍＭ ＮａＣｌ、
１ｍＭ ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０
反応後、前記洗浄液で洗浄。測定はＸ−１００マイクロアレイリーダー、ＳｃａｎＡｒｒａｙＬｉｔｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ製）を用いてＣｙ３の蛍光強度を測定。（Ｌａｓｅｒ＝９０、ＰＭＴ＝６５）
【００９３】
結果を下表に示す。
【表１】
【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明により、簡単に糖鎖ライブラリーを作製することが可能で、検出対象物質の非特異的な吸着・結合を抑制した糖鎖捕捉基板も用いて、糖、狭義の糖鎖、糖ペプチド、糖タンパク、糖脂質またはこれらを有する糖鎖を固定化できるバイオアッセイ用の各種糖鎖アレイを提供することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖鎖ライブラリーとその作成方法および糖鎖ライブラリーの糖鎖を固定化した糖鎖アレイに関する。
【背景技術】
【０００２】
生化学分野において、近年、核酸、タンパク質に続く第三の鎖として糖鎖分子が注目されている。特に細胞の分化や癌化、免疫反応や受精などのかかわりが研究され、新たな医薬や医療材料を創製しようとする試みが続けられている。
また、糖鎖は多くの毒素、ウィルス及びバクテリアなどの病原性外来因子受容体であり、また、癌のマーカーとしても注目されており、こちらの分野においても、同様に新たな医薬や医療材料を創製しようとする試みが続けられている。
【０００３】
しかしながら、糖鎖は、研究の重要性を認識されながら、その複雑な構造や多様性から、第一、第二の鎖である核酸、タンパク質に比較して研究の進行が著しく遅れている。
この研究を推進する目的で、糖鎖を精製する方法が種々開発されている。一方、糖鎖は、それ単独で機能を発揮するというより、細胞レセプターに対するリガンドとして機能する場合も多く確認され、それゆえに糖鎖に対するレセプターの解析に供するために、種々の糖鎖を固定化するための基材が開発されている。
【０００４】
前記基材を用いて、各種の糖鎖群をライブラリー化する試みがなされており、一般的に、生体由来の糖、糖鎖、糖ペプチド、糖タンパク、糖脂質などの複合糖類から作製される。
【０００５】
また、特許文献１に記載されるように、カーゴレセプターの糖鎖認識部位を改変することにより糖結合タンパク質の糖鎖を改変して合成する方法などが開発され、合成糖鎖も多数作製され、飛躍的に糖鎖配列が増え、糖鎖ライブラリーとしての種類を確保することができた。
【０００６】
さらに、特許文献１には、前記の糖鎖ライブラリーを用いて糖鎖アレイを作製するための方法が記載されており、三官能性スペーサーを用いて、第１の官能基を糖鎖、第２の官能基を固相担体、第３の官能基を発色団と結合させ糖鎖アレイを作製する方法が示されている。
しかしながら、この方法により作製された糖鎖ライブラリーは、夾雑物が多く、直ちに糖鎖アレイを作製することは難しい。
【０００７】
また、特許文献２には、スペーサーを介して糖鎖を基材に固定化する方法が記載されており、スペーサーに親水性化合物を用いることで、非特異的吸着を抑制することが示されている。特許文献２においては、糖鎖固定後に非特異吸着を防ぐために実施例において３％ウシ血清アルブミンを用いたブロッッキング操作が記載されている。
しかしながらウシ血清アルブミンには既に糖鎖が存在して生理的機能を果たしていることは明白であり、目的とする糖鎖との区別が困難である。
【０００８】
また、特許文献３には、スペーサーを介して複数の複合糖質を基材に固定化しライブラリー化する方法が記載されておりスペーサーに親水性化合物を用いることで、非特異的吸着を抑制することが示されている。
しかしながら、該発明においては、固相担体にハロゲン化アセチル基を導入する必要があり、材質がガラスの場合においては、比較的容易であるが、汎用性に乏しい方法である。また、前述のように糖鎖は多くの毒素、ウィルス及びバクテリアなどの受容体の研究にも使用されていることから、廃棄に際しては焼却処理が好ましく、材質がガラスであることは不利である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００４／０１６７８９
【特許文献２】特表２００７−５２７５３９号公報
【特許文献３】特表２００２−５３７５６２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、簡便に糖鎖ライブラリーを作製し、該糖鎖ライブラリーを用いた糖鎖アレイを、吸着防止剤をコーティングすることなく、固定化できるバイオアッセイ用の高分子化合物及びこれを用いた各種糖鎖アレイ基板を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
このような目的は、下記（１）〜（１５）に記載の本発明により達成される。
（１）糖鎖を含有する精製原料を
一級アミノ基を有する糖鎖精製用基材と接触させて糖鎖を捕捉し、
当該基材ごと回収し、
所定の特性を有する糖鎖群ごとに分けることを
特徴とする糖鎖ライブラリー作製方法。
（２）前記基材ごと回収した糖鎖を、当該基材から遊離し、液体クロマトグラフィーにより、分画する（１）記載の糖鎖ライブラリー作製方法。
（３）前記精製原料が、有機合成物、酵素合成物または生体由来物質である（１）または（２）に記載の糖鎖ライブラリー作製方法。
（４）前記分離する糖鎖類が、２糖以上の糖鎖、またはそれを含む化合物、糖アミノ酸、糖ペプチド、糖タンパク質、糖脂質、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、グリコシルホスファチジルイノシトール、ペプチドグリカン、リポ多糖、およびそれらの誘導体から選ばれる（１）ないし（３）のいずれか１項に記載の糖鎖ライブラリー作製方法。
（５）前記一級アミノ基がオキシルアミノ基および/又はヒドラジド基である（１）ないし（４）のいずれか１項に記載の糖鎖ライブラリー作製方法。
（６）前記糖鎖精製用基材が、下記一般式〔１〕で表される糖鎖捕捉用高分子化合物を含む（１）〜（５）のいずれか１項に記載の糖鎖ライブラリー作製方法。
【化１】
（Ｒは−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−ＣＯ−、−ＣＯＮＨ−が挿入されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖を示す。）
（７）前記糖鎖精製用基材が、ビーズまたはプレート状の形態である（１）ないし（６）のいずれか１項に記載の糖鎖ライブラリー作製方法。
（８）前記糖鎖精製用基材が、下記一般式〔２〕の構造を有する架橋ポリマー構造を有するポリマーマトリックスで構成される粒子である（１）ないし（７）のいずれか１項に記載の糖鎖ライブラリー作製方法。
【化２】
（Ｒ１，Ｒ２は−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−が挿入されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５はＨ，ＣＨ３，または炭素数２〜５の炭化水素鎖を示す。ｍ，ｎはモノマーユニット数を示す。）
（９）（１）ないし（８）のいずれか１項に記載の糖鎖ライブラリー作製方法で作製したことを特徴とする糖鎖ライブラリー。
（１０）前記糖鎖ライブラリーの糖鎖を基板の表面に固定化したことを特徴とする糖鎖アレイ。
（１１）前記糖鎖アレイが、下記一般式〔３〕で表される糖類固定用高分子化合物を基板表面に塗布し、高分子化合物の固定化層を介して前記糖鎖が、固定化した（１０）記載の糖鎖アレイ
【化３】
（式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は水素原子またはメチル基を、Ｒ４は疎水性基を示す。Ｘは炭素数１〜１０のアルキレンオキシ基を示し、ｐは１〜２０の整数を示す。ｐが２以上２０以下の整数である場合、繰り返されるＸは、同一であっても、または異なっていてもよい。Ｙはアルキレングリコール残基を含むスペーサーであり、Ｚは酸素原子またはＮＨである。Ｍｅはメチル基である。ｌ、ｍ、ｎは自然数である。）
（１２）前記疎水性基Ｒ４が環状アルキル基であることを特徴とすることを特徴とする（１１）記載の糖類アレイ。
（１３）前記環状アルキル基がシクロヘキシル基であることを特徴とする（１２）記載の糖類アレイ。
（１４）前記基板の材質がプラスチックである（１０）ないし（１３）のいずれか１項に記載の糖鎖アレイ。
（１５）前記プラスチックが飽和環状ポリオレフィンまたはポリスチレンを含むものである（１４）記載の糖鎖アレイ。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、生体由来材料のように夾雑物混在状態から糖鎖を簡便に精製し、精製糖鎖ライブラリーを構築でき、さらに該糖鎖ライブラリーを用いた糖鎖アレイを調製することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＩｇＧ遊離糖鎖のＨＰＬＣのチャート
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明に述べるところの糖鎖ライブラリーとは、種々の動物細胞、血清糖タンパク質等の精製原料である糖鎖リソースから糖鎖のみを回収・精製・分離したもので構成されている。ライブラリー構築のためには、糖鎖の精製・分離諸条件をもとに量産化する技術が必要となる。
【００１５】
（糖鎖ライブラリーの作製方法の説明）
まず、糖鎖ライブラリーを作製する方法は以下のステップにより構成される。
（１）前記精製原料を、一級アミノ基を有する糖鎖精製用基材と接触させることにより、糖鎖の還元末端と一級アミノ基との間で、化学結合が生じ基材に糖鎖のみを捕捉する。
（２）この糖鎖を捕捉した基材は、洗浄により、精製原料中の糖鎖以外の夾雑物を簡単に除去することが可能で、糖鎖のみを基材ごと回収する。
（３）基材ごと回収した糖鎖を、基材から遊離させ、所定の特性を有する糖鎖群ごとに分け、糖鎖ライブラリーを作製する。
【００１６】
本発明における糖鎖とは、２糖類以上の狭義の糖鎖、またはそれを含む化合物、例えば、糖アミノ酸、糖ペプチド、糖タンパク質、糖脂質、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、グリコシルホスファチジルイノシトール、ペプチドグリカン、リポ多糖、およびそれらの誘導体を示す。
【００１７】
（精製原料について）
次にステップごとに詳細に説明する。
まず、前記精製原料は、有機合成物、酵素合成物または生体由来物質であり、糖鎖を含む混合物である場合が多い。有機合成物の場合は、反応触媒や反応中間体を含み、酵素合成物の場合は、合成酵素を含んでいる。また、生体由来物質の場合は、組織由来、動物細胞由来や血液などの体液由来物質であったり、粗精製された血清糖タンパク質であったりと、糖鎖を含む物質以外の夾雑物を多く含む混合物である。
【００１８】
前記精製原料から、糖鎖のみを捕捉する方法について述べる。
糖鎖は生体の中で唯一、還元処理により、末端にアルデヒド基を生じる物質である。該糖鎖を、表面に一級アミノ基を有する糖鎖精製用基材と接触させることにより糖鎖精製用基材表面に化学結合により固定化することが出来る。
接触の方法は還元末端糖鎖を含む混合物の溶液中に糖鎖精製用基材を投入する、または糖鎖精製用基材で作製した容器内に混合物溶液を入れて接触させることにより、アルデヒド基と一級アミノ基を反応させ、化学結合を生じせしめ、糖鎖捕捉用基材に共有結合で糖鎖を結合させる。
【００１９】
（糖鎖精製用基材について）
当該糖鎖精製基材は、糖鎖を捕捉するための反応性の一級アミノ基をその表面に有する基材であり、該一級アミノとしてオキシルアミノ基またはヒドラジド基を有することが望ましい。これは、酵素やカップリング試薬などの非存在下においても糖鎖還元末端であるアルデヒド基と反応し結合可能であるから好適である。
【００２０】
前記糖鎖精製用基材は、下記一般式〔１〕で表される構造が好ましい。
【化１】
式１中のＲは−Ｏ−，−Ｓ−、−ＮＨ−、−ＣＯ−、−ＣＯＮＨ−が挿入されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素を示す。
前記担体は、下記一般式〔２〕の構造を有する架橋ポリマー構造を有するポリマーマトリックスで構成される粒子であることが好ましい。
【化２】
（Ｒ１，Ｒ２は−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−が挿入されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５はＨ，ＣＨ３，または炭素数２〜５の炭化水素鎖を示す。ｍ，ｎはモノマーユニット数を示す。）
前記、一般式〔２〕の担体は、式〔１〕のＲ−ＮＨ−ＮＨ２の構造を含むため、担体が式〔１〕の構造体そのものとなる。
【００２１】
また、前記担体は、水溶液や有機溶媒に不溶性の担体であることがのぞましく、材質は特に限定するものではないが、ガラスや耐有機溶剤性に優れた樹脂、例えばシリコン、ポリスチレン、エチレン−無水マレイン酸共重合物、ポリメタクリル酸メチル等を選ぶことができる。
【００２２】
前記糖鎖精製用基材の形態は、特に限定するものではないが、ビーズまたはプレート状の形態であることが好ましい。糖鎖ライブラリーを作製するためには、同時に多数の試料を処理する可能性があり、その際には、カラムにビーズを充填したものを使用する事で連続的な処理が可能である。また、マルチウェルプレートであれば同時に多検体を処理することが可能である。マルチウェルプレートとしては、６、１２、２４，４８、９６，３８４ウェルなどのマルチウェルプレートを適宜使用することが出来る。
【００２３】
式〔２〕の担体以外では、ビーズとして無機物質を用いることができる。該担体としては、粒子状のものを用いることができ、例えばシリカ粒子、アルミナ粒子、ガラス粒子、金属粒子などが挙げられる。また、有機高分子物質としては、アガロース、セファロースに代表される多糖類ゲル、ビニル化合物の重合体であるポリマーを粒子状にしたものを使用することが出来る。
【００２４】
また、粒子としたときの形状は球であることが好ましく、平均粒径０．１μｍ以上５００μｍ以下のポリマー粒子である。この場合の平均粒径は光学顕微鏡視野において観察される各粒子の直径を計測することにより求めたものである。このような範囲の粒径を有する担体の粒子は、遠心分離、 フィルタなどによる回収が容易であり、かつ、充分な表面積を有しているために糖鎖との反応効率も高いと考えられる。粒径が上記の範囲よりも大幅に大きい場合、表面積が小さくなるために糖鎖との反応効率が低くなることがある。また、粒径が上記の範囲よりも大幅に小さい場合、特にフィルタによる粒子の回収が難しくなることがある。さらに、粒子をカラムに充填して用いる場合、粒径が過小であると通液の際の圧力損失が大きくなってしまうことがある。
【００２５】
（糖鎖捕捉について）
前記糖鎖精製基材で末端還元糖鎖と一級アミノ基の結合反応の条件の一具体例は、ｐＨが４〜７、反応温度が２５〜９０℃、好ましくは６０〜８５℃、より好ましくは７５〜８０℃、反応時間が１〜１６時間である。最も好ましい条件はｐＨ４．５〜５．５、反応温度が８０℃、反応時間が１時間である。
ｐＨが４未満、または７を越える場合は、捕捉糖鎖の解離反応が同時に生じ、捕捉効率が落ちる。反応温度は、２５℃未満の場合、反応効率が著しく悪化する場合があり、糖鎖を十分に捕捉することができない。
また、９０℃を超える場合は、化合物自身に悪影響を及ぼすと共に、基材がプラスチックの場合は種類によって変形、溶融を発生することがある。
反応時間が１時間より短い場合は十分な結合反応が得られない場合があり、糖鎖を十分に捕捉することが出来ない。また１６時間を超えた反応は、更なる糖鎖の捕捉は見られず時間をかけただけの効果がない。
【００２６】
（糖鎖回収について）
ここで、洗浄液に用いられる溶液としては、界面活性剤を含む水溶液、メタノール、エタノールなどのアルコール類；水および水性緩衝液などが使用される。ここで、洗浄に水溶液が用いられる場合、この水溶液のｐＨは中性付近であることが好ましく、そのｐＨは４〜１０、より好ましくは６〜８である。
前期糖鎖捕捉した基材は、洗浄により、精製原料中の糖鎖以外の夾雑物を簡単に除去することが可能で、糖鎖のみを基材ごと回収することができる。
洗浄方法としては、ビーズの場合は、洗浄液に浸漬し、洗浄液の交換を繰り返すことで洗浄することができる。
また、プレートの場合は、各ウェル内に洗浄液を分注、吸引除去を繰り返すことで簡便に洗浄することができる。
【００２７】
前記界面活性剤は特に限定はしないが、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液等のｐＨが制御できる緩衝液が好ましい。また、各種アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、中性界面活性剤を用いることができ、特に限定しないが、ＴｒｉｔｏｎＸ、各種Ｔｗｅｅｎ、ドデシル硫酸ナトリウムを使用することが好ましい。洗浄液のｐＨは、４〜７が好ましい。これはｐＨ４より低い場合とｐＨ７より高い場合は、ｐＨにより糖鎖の脱離反応が生じることによる。
【００２８】
この洗浄処理は、連続式にて糖鎖捕捉反応を行った場合には、カラムに洗浄溶液を通して糖鎖捕捉反応から連続的に処理してもよい。また、マルチプレートを用いた場合には、ろ過操作あるいは遠心操作により糖鎖捕捉物質以外の物質を除去してもよい。
【００２９】
なお、前記洗浄工程は、当初の生体試料の状態、例えば糖鎖以外の物質の混在の程度によっては行わなくても構わない。
【００３０】
（糖鎖分離、精製について）
次のステップとして、基材ごと回収した糖鎖を基材から遊離させ、所定の特性を有する糖鎖群ごとに分けることについて述べる。
ここでいう所定の特性とは、例えば糖鎖の分子量、糖鎖結合様式、特定糖鎖の有無糖鎖以外の結合分子などが挙げられるがこれらに限定するものではない。
【００３１】
前記のように基材ごと回収した糖鎖は、基材から遊離させて、該遊離糖鎖を糖鎖ライブラリーとして使用することができる。この遊離操作について以下で説明する。
【００３２】
遊離操作の基本は、基材ごと回収した糖鎖を酸性溶媒中、還元剤の存在下で加熱反応を行うことで糖鎖を基材から切り出すことができる。
具体的な方法を以下に示す。
【００３３】
反応を行う溶媒は、酸と有機溶媒の混合溶媒あるいは酸と水と有機溶媒の混合溶媒で遊離反応を行うのが好ましい。酸と水と有機溶媒の混合溶媒の場合、水の含有率は好ましくは０．１％〜９０％、より好ましくは０．１％〜８０％、さらに好ましくは０．１％〜５０％である。水の代わりに水性緩衝液を含有しても良い。混合前の緩衝液の濃度は好ましくは０．１ｍＭ〜１Ｍ、より好ましくは０．１ｍＭ〜５００ｍＭ、さらに好ましくは１ｍＭ〜１００ｍＭである。反応溶液のｐＨは好ましくは２〜９、より好ましくは２〜７であり、さらに好ましくは２〜６である。使用する酸は例えば、酢酸、ギ酸、トリフルオロ酢酸、塩酸、クエン酸、リン酸、硫酸が好ましく、より好ましくは酢酸、ギ酸、トリフルオロ酢酸、リン酸、さらに好ましくは酢酸、トリフルオロ酢酸である。
【００３４】
還元剤としては、水酸化ホウ素ナトリウムを好適に用いることができる。
ここで、アミノ基を含む化合物として、アミノオキシ基、またはヒドラジド基を含む化合物を用いれば、還元剤を必ずしも使用する必要はない。
【００３５】
反応温度に関しては４〜９０℃が好ましく、好ましくは２５〜９０℃で、さらに好ましくは４０〜９０℃である。反応時間は、１０分間〜２４時間、好ましくは１０分間〜８時間、より好ましくは１０分間〜３時間である。反応は、開放系で行って溶媒を完全に蒸発させることが好ましい。
ｐＨ２の酸性から中性付近で、糖鎖切り出し反応を行うことができるため、従来の強酸性処理、たとえば１０％トリフルオロ酢酸処理による切出しのような強酸の存在下での切出し反応に比べて、シアル酸残基の脱離など糖鎖の加水分解などを引き起こすことを抑制することができるようになる。
【００３６】
また、基材ごと回収した糖鎖を遊離させ、さらに、高速液体クロマトグラフィーなどの方法で分子量分画をする場合には、糖鎖を蛍光標識する必要がある。糖鎖の遊離ならびに蛍光標識について以下に記載する。
【００３７】
前記の蛍光標識方法としては、アミノ基を含むフルオロフォアまたはクロロフォアを接触させ糖鎖を遊離させると同時にフルオロフォアまたはクロロフォアで糖鎖を標識する方法である。反応の溶媒、還元剤、反応温度、時間の詳細は前記の通りであるが、アミノ基を含む化合物、例えば糖鎖に対して１０等量以上の化合物を添加することで達成できる。
【００３８】
前記のアミノ基を含むクロロフォアまたはフルオロフォアは、具体的にはクロロフォアまたはフルオロフォアが、下記のヒドラジド基を含む物質またはアミノオキシ基を含む物質からなる群から選ぶことが、還元剤の使用を抑えることが出来るのでより好ましい。
（ ヒドラジド基を含む物質）
5-Dimethylaminonaphthalene-1-sulfonyl hydrazine (Dansylhydrazine)； 2-hydrazinopyridine；9-fluorenylmethyl carbazate (Fmoc hydrazine)；benzylhydrazine； 4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-propionoc acid, hydrazide； 2-(6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin)acetohydrazide； 7-diethylaminocoumarin-3-carboxylic acid, hydrazide (DCCH)； phenylhydrazine； 1-Naphthaleneacethydrazide； 2-hydrazinobenzoic acid； phenylacetic hydrazide；
（ アミノオキシ基を含む物質） O-benzylhydroxylamine； O-phenylhydroxylamine； O-(2,3,4,5,6-pentafluorobenzyl)hydroxylamine； O-(4-nitrobenzyl)hydroxylamine；2-aminooxypyridine； 2-aminooxymethylpyridine； 4-[(aminooxyacetyl)amino]benzoic acid methyl ester； 4-[(aminooxyacetyl)amino]benzoic acid ethyl ester； 4-[(aminooxyacetyl)amino]benzoic acid n-butyl ester
【００３９】
こちらの方法の場合は、標識を利用して糖鎖を分子量分画した後は、更に標識を外す操作が必要となる。
標識を外す方法は、前記の基材から糖鎖を分離するのと同じ方法で行うことができる。
【００４０】
（糖鎖ライブラリー保存方法）
前記のように糖鎖は溶液状態で回収され糖鎖ライブラリーとして作製さる。この溶液状の糖鎖ライブラリーは、目的に応じて、すぐに使用してもよいし、必要時まで保存しておいてよい。保存方法は、そのまま市販の蓋付きチューブなど、密閉容器に移し冷凍保存することが好ましい。さらに好ましくは凍結乾燥させてから冷凍保存する方法である。冷凍保存の温度は、−２０℃以下が好ましく、より好ましくは−８０℃である。
【００４１】
（糖鎖アレイの全体像説明）
次に、本発明の糖鎖ライブラリーを用いて、糖鎖アレイを作製する方法について述べる。
糖鎖アレイは、アレイ基板上に糖鎖を固定化したものの総称であるが、本発明においては、アレイ基板の上に該基板と糖鎖の結合を仲介する高分子化合物をアレイ基板上に塗布して、その後、高分子化合物中に設けた糖鎖結合官能基を用いてアレイ基板上に糖鎖を固定化するものである。
【００４２】
（糖鎖ライブラリーアレイ）
前述の高分子化合物は、具体的には、少なくとも親水性を保持するためのユニットＡ、糖類を捕捉するための疎水性基を有するユニットＢ、および糖類を捕捉するための一級アミノ基を有するユニットＣからなる高分子化合物である。この高分子化合物は、生理活性物質を固定化する性質と、検出対象物のアレイ基板への物理的吸着（非特異敵吸着）を抑制する性質を有する。すなわち、一級アミノ基が糖、糖鎖、糖ペプチド、糖脂質またはこれらを有する生理活性物質を固定する役割を果たし、親水性を保持するためのユニットが検出対象物への基材への物理的吸着（非特異吸着）を抑制する性質を併せ持つ。また、疎水性のユニットＢは、該高分子化合物のプラスチックアレイ基板やガラスアレイ基板への吸着に関与している。
【００４３】
このような固定化のための高分子化合物としては、下記式で表されるものが好ましく用いられる。高分子化合物に含まれる親水性のユニットＡはホスホリルコリン基に代表されるもので、特に構造を限定するものではないが、下記一般式〔３〕において、ユニットＡは、左部の構成単位で示されように、（メタ）アクリル残基とホスホリルコリン基が炭素数１〜１０のアルキレンオキシ基Ｘの連鎖を介して結合した構造であることが最も好ましい。中でもＸはエチレンオキシ基であることが最も最も好ましい。式中のアルキレンオキシ基の繰り返し数は１〜２０の整数であり、繰り返し数２以上２０以下の場合は、繰り返されるアルキレンオキシ基の炭素数は同一であっても、異なっていてもよい。ｌは本来自然数であるが、各構成成分の組成割合として表記される場合がある。
【００４４】
【化３】
（式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は水素原子またはメチル基を、Ｒ４は疎水性基を示す。Ｘは炭素数１〜１０のアルキレンオキシ基を示し、ｐは１〜２０の整数を示す。ｐが２以上２０以下の整数である場合、繰り返されるＸは、同一であっても、または異なっていてもよい。Ｙはアルキレングリコール残基を含むスペーサーであり、Ｚは酸素原子またはＮＨである。Ｍｅはメチル基である。ｌ、ｍ、ｎは自然数である。）
【００４５】
本発明の高分子化合物に含まれるホスホリルコリン基を有するユニットＡの組成割合（ｌ，ｍ，ｎの和に対するｌの比率）は、高分子の全ユニットに対して、５〜９８ｍｏｌ％が好ましくより好ましくは１０〜８０ｍｏｌ％、最も好ましくは、１０〜８０％である。組成比が下限値を下回ると親水性が弱くなり非特異吸着が多くなる。一方、上限値を上回ると水溶性が高まり、アッセイ中に高分子化合物が溶出してしまう可能性がある。
【００４６】
本発明の高分子化合物に含まれる疎水性基を有するユニットＢの組成割合（ｌ，ｍ，ｎの和に対するｍの比率）は、高分子の全ユニットに対して、１０〜９０ｍｏｌ％が好ましくより好ましくは１０〜８０ｍｏｌ％、最も好ましくは、２０〜８０％である。上限値を上回ると非特異吸着が増加する恐れが出てくる。
【００４７】
本発明の高分子化合物に含まれる一級アミノ基を有するユニットＣは、特に構造を限定されるものではないが、前記一般式〔３〕においての右部の構成単位で表されるように、（メタ）アクリル残基とオキシルアミノ残基を含むスペーサーＹを介した構造であることが好ましい。オキシルアミノ基の場合、Ｚは酸素原子を、ヒドラジド基の場合、ＺはＮＨを示す。ｎは本来自然数であるが、各成分の組成割合として標記される場合がある。アルキレングリコール残基を含むスペーサーＹの構造は、特に制限されるものではないが、下記一般式〔４〕または〔５〕であることがこのましく、より好ましくは〔２〕である。
【００４８】
【化４】
(式中ｑは１〜２０の整数)
【００４９】
【化５】
(式中ｒは１〜２０の整数)
【００５０】
一級アミノ酸を有するユニットＣの成分の組成割合（ｌ，ｍ，ｎの和に対するｎの比率）は、高分子の全ユニットに対して、１〜９４ｍｏｌ％が好ましくより好ましくは２〜９０ｍｏｌ％、最も好ましくは、２０〜４０％である。組成値が下限地を下回ると糖、糖鎖、および／またはこれらを有する生理活性物質を十分量固定化できなくなる。また、上限値を上回ると非特異吸着が増加する。
【００５１】
本発明の高分子化合物の合成方法は、特に限定されるものではないが、合成の容易さから、少なくともユニットＡとしてホスホリルコリン基を有するモノマー、ユニットＢとして疎水性基を有するモノマー、ユニットＣとして一級アミノ基を予め保護基にて保護したモノマーをラジカル共重合する工程、該工程により得られた高分子化合物から保護基を除去する工程、を含む製造方法が好ましい。あるいは、少なくともホスホリルコリン基を有するモノマー、疎水性基を有するモノマー、および一級アミノ基を導入しうる官能基を有するモノマーをラジカル共重合する工程、該工程により得られた高分子化合物に一級アミノ基を導入する工程、を含む製造方法が好ましい。
【００５２】
ユニットＡであるホスホリルコリン基を有する単量体としては、特に構造を限定しないが、例えば２−（メタ）アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、２−（メタ）アクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン、６−（メタ）アクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン、１０−（メタ）アクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン、２−（メタ）アクリロイルオキシプロピルホスホリルコリン等を挙げられるが、入手性から２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが好ましい。
【００５３】
ユニットＢである疎水性基を有するモノマーの具体的な例としては、ｎ−ブチル（メタ）アクリレート、i s o−ブチル（メタ）アクリレート、s e c−ブチル（メタ）アクリレート、t−ブチル（メタ）アクリレート、ｎ−ネオペンチル（メタ）アクリレート、i s o−ネオペンチル（メタ）アクリレート、s e c−ネオペンチル（メタ）アクリレート、ネオペンチル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、ｎ−ヘキシル（メタ）アクリレート、i s o−ヘキシル（メタ）アクリレート、ヘプチル（メタ）アクリレート、ｎ−オクチル（メタ）アクリレート、i s o−オクチル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、ｎ−ノニル（メタ）アクリレート、i s o−ノニル（メタ）アクリレート、ｎ−デシル（メタ）アクリレート、is o−デシル（メタ）アクリレート、ｎ−ドデシル（メタ）アクリレート、i s o−ドデシル（メタ）アクリレート、ｎ−トリデシル（メタ） アクリレート、i s o−トリデシル（メタ）アクリレート、ｎ−テトラデシル（メタ） アクリレート、i s o−テトラデシル（メタ）アクリレート、ｎ−ペンタデシル（メタ）アクリレート、i s o−ペンタデシル（メタ）アクリレート、ｎ−ヘキサデシル（メタ）アクリレート、i s o−ヘキサデシル（メタ）アクリレート、ｎ−オクタデシル（メタ）アクリレート、i s o−オクタデシル（メタ）アクリレート、イソボニル（ メタ） アクリレートなどが挙げられる。これらのなかで最も好ましいのが、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、ｎ―ブチルメタクリレート、ｎ−ドデシルメタクリレート、ｎ−オクチルメタクリレートである。
【００５４】
一級アミノ基を予め保護基にて保護したモノマーは、特に構造を限定しないが、下記一般式［６］（式中、Ｒ３は水素原子またはメチル基、Ｙはアルキレングリコール残基を含むスペーサー、Ｚは酸素原子またはＮ、Ｈ、Ｗは保護基を示す。）で表されるように、（メタ） アクリル基と、オキシルアミノ基またはヒドラジド基が、アルキレングリコール残基を含むスペーサーＹを介した構造であることが好ましい。
【００５５】
【化６】
【００５６】
保護基Ｗ としてはアミノ基を保護基できるものであれば何ら制限を受けるものではなく、例えば酸無水物から任意に用いることができる。なかでもｔ―ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）やベンジロキシカルボニル基（Ｚ基、Ｃｂｚ基）、９−フルオレニルメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）などが好適に用いられる。
【００５７】
具体的なモノマーの例としては、下記式〔７〕で表されるようなものである。
【００５８】
【化７】
【００５９】
脱保護化は、トリフルオロ酢酸や塩酸、無水フッ化水素を用いれば、一般的な条件で行うことができる。
【００６０】
一方、高分子化合物を重合した後に一級アミノ基を導入する方法としては、何ら制限を受けるものではないが、少なくともホスホリルコリン基を有するモノマー、疎水性基を有するモノマー、およびアルコキシ基を有するモノマーをラジカル共重合した後に、該高分子化合物に導入されたアルコキシ基とヒドラジンを反応させて、ヒドラジド基を生成する方法が簡便で好ましい。アルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ｔ−ブトキシ基等が好適である。
【００６１】
具体的なアルコキシ基を有するモノマーの例としては、下記式〔８〕で表されるようなものである。
【００６２】
【化８】
【００６３】
本発明の高分子化合物の合成溶媒としては、それぞれの単量体が溶解するものであればよく、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｔ−ブチルアルコール、ｎ−ペンタノール等アルコール類、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、シクロヘキサノン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、メチルエチルケトン、メチルブチルケトン、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル等を挙げることができる。これらの溶媒は、単独または２ 種以上の組み合わせで用いられる。
【００６４】
重合開始剤としては通常のラジカル開始剤ならいずれでもよく、例えば、２，２ ’−アゾビスイソブチルニトリル（以下「ＡＩＢＮ」という）、１，１’−アゾビス（シクロヘキサン−１−カルボニトリル）等のアゾ化合物、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウリル等の有機過酸化物等を挙げることができる。
【００６５】
本発明の高分子化合物の分子量は、高分子化合物と未反応の単量体との分離精製が容易になることから、数平均分子量は５０００以上が好ましく、１００００以上がより好ましい。前記数平均分子量は高速液体クロマトグラフィーの測定により算出される
【００６６】
脱保護は前述のトリフルオロ酢酸や塩酸、無水フッ化水素を用いれば、一般的な条件で行うことができるが、脱保護の時期に関しては、以下の通りである。
通常は重合が完了し、高分子化合物が作製できた段階で行うことが一般的であり、本発明の高分子化合物を得るには、重合終了後に脱保護を行うことで該高分子化合物を得ることができる。
【００６７】
基材表面に該高分子化合物を被覆することにより生理活性物質の非特異的吸着を抑制する性質、及び生理活性物質を固定化する性質を容易に付与することが可能である。
この場合、脱保護を行った一級アミノ基を持つ高分子化合物を被覆することも可能であるが、反応性の高い一級アミノ基を持つ高分子材料を溶液にして皮膜することは、場合によっては作業中に一級アミノ基が反応して不活化することも考えられる。
従って、脱保護する直前で高分子化合物を精製し、基材表面を皮膜して後に、脱保護の反応を行い、基材表面上に一級アミノ基が存在する状態を形成することが望ましい。
【００６８】
アレイ基板表面への高分子化合物の被覆は、例えば有機溶剤に高分子化合物を０．０５〜５０重量％濃度になるように溶解した高分子溶液を調製し、浸漬、吹きつけ等の公知の方法で基材表面に塗布した後、室温下ないしは加温下にて乾燥させることにより行われる。
【００６９】
有機溶剤としてはエタノール、メタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｔ−ブチルアルコール、ｎ−ペンタノール、シクロヘキサノール等アルコール類、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトン、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、メチルエチルケトン、メチルブチルケトン、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、シクロヘキサノン等を挙げることができる。これらの溶媒は、単独または２ 種以上の組み合わせで用いられる。中でも、エタノール、メタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｔ−ブチルアルコール、ｎ−ペンタノールシクロヘキサノール等アルコール類がプラスチック基材を変性させず、乾燥させやすいため好ましい。
【００７０】
本発明に用いるアレイ基板としては、スライド形状基板、６、１２、２４，４８、９６、３８４穴プレート、容器、マイクロフルイディスク基板が好ましい。例えばプラスチック製基板、ガラス製基板、金属蒸着膜を有する基板などがあげられるが、スライド形状基板が最もふさわしい。プラスチック製基板の具体例としては、ポリスチレン、環状ポリオレフィンポリマー、シクロオレフィンポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリサルフォン、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレートを素材とした基板などがあげられる。
【００７１】
特に、蛍光観察に用いる基材としては、環状ポリオレフィンポリマー、シクロオレフィンポリマーが有用である。前記基材を用いる場合においては、前記高分子化合物の疎水基が、シクロヘキシルキ基であると、基材との相互作用が良好で、同じ組成比の高分子材料を他の基材（例えばポリスチレンやガラス基材）に塗布した場合に比べ、吸着量が高くバックグランド値が低い良好な結果となる。
【００７２】
また、環状ポリオレフィンポリマーからなるアレイ基板に、前記高分子化合物を塗布する場合、アミノオキシモノマー１００ｍｏｌ％の高分子化合物に関しては、塗布することができない。一方、ポリスチレンポリマーには塗布が可能であるが、夾雑物の非特異的吸着は抑制されず汎用性に乏しい。
【００７３】
前記高分子化合物を塗布した基材は、糖鎖ライブラリー中の糖鎖群を固定化することができ、バイオアッセイ用途に好適に用いることができる。
糖鎖群としては、２糖以上の糖鎖、またはそれを含む化合物、糖アミノ酸、糖ペプチド、糖タンパク質、糖脂質、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、グリコシルホスファチジルイノシトール、ペプチドグリカン、リポ多糖、およびそれらの誘導体などが挙げられる。これらの糖鎖群の基材への固定化方法としては、スポッターを使用して生理活性物質が溶解した溶液を点着する方法、糖鎖群が溶解した溶液を容器などに分注して固定化する方法などがある。
【００７４】
糖鎖ライブラリー中の糖鎖群を前記の基板表面に固定化する方法は、前述の糖鎖精製基材で末端還元糖鎖と一級アミノ基との反応と同じ反応で固定化できる。すなわち、糖鎖ライブライリー中の糖鎖の末端還元糖鎖と、アレイ基板上の一級アミノ基とを、ｐＨが４〜７、反応温度が２５〜９０℃、好ましくは６０〜８５℃、より好ましくは７５〜８０℃、反応時間が１〜１６時間で反応させる。最も好ましい条件はｐＨ４．５〜５．５、反応温度が８０℃、反応時間が１時間である。
【００７５】
前記の凍結乾燥保存した糖鎖ライブラリーを用いる場合には、糖鎖ライブラリー中の糖鎖群を溶解する溶液としては各種緩衝材が好適に用いられる。特に限定されないが、たとえば炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸水素二カリウム、トリス塩酸緩衝剤、トリス酢酸緩衝剤、ＰＢＳ緩衝剤、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎe−Ｎ’−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝剤、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｐｈｏｎｉｃａｃｉｄ） 緩衝剤などが用いられる。
【００７６】
糖鎖ライブラリー中の糖鎖群を溶解する溶液のｐＨとしては、糖又は狭義の糖鎖を溶解する場合はｐＨが２〜８であることが好ましい。糖タンパク質を溶解する場合はｐＨが４〜９であることが好ましい。糖核酸を溶解する場合はｐＨが２〜８であることが好ましい。糖脂質を溶解する場合はｐＨ２〜８ であることが好ましい。
【００７７】
糖鎖ライブラリー中の糖鎖群を溶液中の濃度としては特に限定されないが、０．０００１ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌであることが好ましい。
【００７８】
糖鎖ライブラリー中の糖鎖群を固定化する温度としては０℃から１００℃が好ましい。
【実施例】
【００７９】
以下、本発明を実施例および比較例に基づいて詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００８０】
＜糖鎖ライブラリーの作製＞
（糖鎖の遊離）
ＩｇＧ １ｍｇ(Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ由来)を糖鎖精製キットＢｌｏｔＧｌｙｃｏ（住友ベークライト製ＢＳ−４５６０３）に添付のプロトコルに従って、還元アルキル化処理、トリプシン処理、Ｎ−グリコシダーゼ（ＰＮＧａｓｅＦ）処理を実施し、ＩｇＧより糖鎖を遊離させた。詳細は以下の通り。
【００８１】
ＩｇＧ（１ｍｇ）の入ったチューブに下記の溶液を加え、撹拌して完全に溶解させた。
・１Ｍ重炭酸アンモニウム水溶液（５μＬ）
・純水（５０μＬ）
・１２０ｍＭヂチオトレイトール（ＤＴＴ、シグマ社、Ｄ９７７９） 水溶液（５μＬ）
【００８２】
前記溶液を６０℃ で３０分間静置した後、１２３ｍＭヨードアセトアミド（ＩＡＡ、和光純薬製、０９３−０２１５２）水溶液（１０μＬ）を加え、遮光下、室温で １時間静置。
静置終了後、トリプシン（４００ｕｎｉｔ）を加えた。（トリプシンを４０ｕｎｉｔ／μＬで１ｍＭ塩酸に溶解し、１０μＬをサンプル溶液に加えて調製）
３７℃のインキュベーターで １時間以上静置し反応させた。その後、９０℃のヒートブロックで５分間加熱し、トリプシンを失活させた。前記溶液を３７℃まで冷やした後、Ｎ−グリコシダーゼ（ＰＮＧａｓｅ Ｆ、Ｒｏｃｈｅ社製、１１−３６５−１９３−００１）（５μＬ＝５ｕｎｉｔ）を加え３７℃のインキュベーターで一晩 (１２時間以上) 反応させた。反応後、９０℃で５分間加熱し、ＰＮＧａｓｅＦを失活させた。
【００８３】
（糖鎖精製）
前記ＢｌｏｔＧｌｙｃｏプロトコルに従って、ＩｇＧ２００μｇ相当量の糖鎖をビーズに捕捉した
ＢｌｏｔＧｌｙｃｏビーズ分散液５０μＬ をピペットで取り、キット付属の反応用チューブの底部に注入した。反応用チューブを卓上遠心機(チビタン、日本ミリポア社製)で数秒間遠心し，水を除去し、ビーズ上に糖鎖サンプル溶液 (２０μＬ) を添加し、さらに２％酢酸／アセトニトリル(１８０μＬ)を添加した。反応チューブを８０℃のヒートブロックに挿入し、１時間加熱し、溶媒が完全に蒸発し、ビーズが完全に乾燥していることを確認した。反応終了後、反応用チューブを２ｍＬエッペンドルフチューブに挿入し、反応用チューブに２Ｍグアニジン溶液(２００μＬ)を加え，卓上遠心機で数秒間遠心した。この作業を３回繰り返したのち、エッペンドルフチューブに溜まった溶液を除去した。反応用チューブを純水(２００μＬ)で３回洗浄、続けて１％トリエチルアミン／メタノール(２００μＬ)で３回洗浄、最後にメタノール(２００μＬ)で３回洗浄した。
反応用チューブのビーズに１００μLの１０％無水酢酸／メタノール溶液を加え、室温で３０分間反応。反応後、反応用チューブを再度２ｍLエッペンドルフチューブに挿入し、遠心して無水酢酸溶液を除去した。
さらにビーズをメタノール(２００μＬ)で３回洗浄、続けて１０ｍＭ塩酸(２００μＬ) で３回洗浄、最後に純水(２００μＬ)で３回洗浄した。
【００８４】
（糖鎖の標識）
２０ｍＭの２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚｈｙｄｒａｚｉｄｅ（２−ＡＢｈ、和光純薬製、５７４−９２４４１）溶液２０μＬと２％酢酸/アセニトリル溶液１８０μＬを加えて、８０℃で１時間加熱し、ＢｌｏｔｏＧｌｙｃｏからの糖鎖の脱離と標識を行った。
具体的には以下の通り。
【００８５】
次に、過剰の未反応２−ＡＢｈ試薬を除去した。
回収した糖鎖溶液 （約５０μＬ) に、アセトニトリル（９５０μＬ）を加え、混合、ＢｌｏｔＧｌｙｃｏキット内のクリーンアップカラムを遠心機にセットし、カラムに純水２００μＬを加え、数秒の遠心をしてろ過した。
カラムにアセトニトリル２００μＬを加え、遠心してろ過した．これを３回繰り返しクリーンアップカラムを洗浄した。
廃液を捨てた後、クリーンナップカラムに糖鎖溶液／アセトニトリル溶液を全量加え、そのまま静置して溶液を自然落下で通過させた。
アセトニトリル４００μＬを加え、遠心して通過させ、これを３回繰り返した。
カラムにアセトニトリル／純水（９５：５，ｖ／ｖ）４００μＬを加え、遠心して通過させ、これを３回繰り返した。
クリーンナップカラムを新しいエッペンチューブに挿し、純水５０μＬを加えて遠心し、ラベル化糖鎖を溶出させた。
回収した溶液をもちいて、ＨＰＬＣを用いて分取を行った。
【００８６】
（ＨＰＬＣによる分取）
前記で得られた２ＡＢｈ標識糖鎖をＨＰＬＣで分取した。
分取は２分毎にフラクション１本分取し、計１４本得た。
ＨＰＬＣ条件は以下の通りである。
・カラム：ＴＳＫ−ＧＥＬ Ａｍｉｄｅ−８０（東ソー株式会社製）
・溶媒Ａ：５０ｍＭ ギ酸水溶液（アンモニア水でｐＨ４．４に調製）
・溶媒Ｂ：アクリロニトリル
・勾配：Ａ２０％（０ｍｉｎ）→Ａ５８％（１５８ｍｉｎ）
・流速：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
・カラム温度：３０℃
・装置：Ｗａｔｅｒｓ Ｄｅｌｔａ６００（日本ウォーターズ社製）
前記で得られた各フラクションを濃縮、乾燥した
【００８７】
（糖鎖からの２ＡＢｈの除去）
前記のように得られた糖鎖は２ＡＢｈ標識されている。このまま保存してもよいが、標識を外して保存することで、ライブライリーをすぐに使用することが可能となるので、以下にその標識を外す方法を記載する。
【００８８】
得られた糖鎖を０．５％ＴＦＡで３７℃、1時間処理して２ＡＢｈを遊離させた後、シリカカラムを用いて２ＡＢｈを除去した。得られた溶液を濃縮、乾燥した。
前記の回収した糖鎖に、アセトニトリルを加え、混合し１０００μＬにした。
ＢｌｏｔＧｌｙｃｏキット内のクリーンアップカラムを遠心機にセットし、カラムに純水２００μＬを加え、数秒の遠心をしてろ過した。
カラムにアセトニトリル２００μＬを加え、遠心してろ過した。これを３回繰り返しクリーンアップカラムを洗浄した。
廃液を捨てた後、クリーンナップカラムに糖鎖溶液／アセトニトリル溶液を全量加え、そのまま静置して溶液を自然落下で通過させた。
アセトニトリル４００μＬを加え、遠心して通過させ、これを３回繰り返した。
カラムにアセトニトリル／純水（９５：５，ｖ／ｖ）４００μＬを加え、遠心して通過させ、これを３回繰り返した。
クリーンナップカラムを新しいエッペンチューブに挿し、純水５０μＬを加えて遠心し、糖鎖を溶出させた。
【００８９】
＜糖鎖アレイの作製＞
以下の方法で、糖鎖の固定化と、レクチンとの結合評価を実施した。
（アレイ基板の作製）
マイクロアレイの作製には住友ベークライト製、環状ポリオレフィン樹脂製のスライドガラス形状のプラスチックス基板を使用した。
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−シクロヘキシルメタクリレート−Ｎ−[２−[２−[２−ｔ−ブトキシカルボニルアミノオキシアセチルアミノ]エトキシ]エトキシ]エチル]−メタクリルアミド共重合体の１．０重量％エタノール溶液にスライドを浸漬して高分子化合物を塗布した。
塗布後、２Ｍ ＨＣｌで３７℃、２時間処理し、ｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）を脱保護し、基板表面にアミノ基を作製した。
【００９０】
（糖鎖の固定化）
ＨＰＬＣで分取して得られたＩｇＧ由来糖鎖に下記溶液を２０ｕＬ加え溶解し、基板にスポッティングし、８０℃、１時間反応させて基板に糖鎖を固定化した。
溶液：１００ｍＭ ＮａＯＡｃ ｂｕｆｆｅｒ(ｐＨ５．０)＋０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（和光純薬、Ａ１６０４６）、０．０１％ＰＶＡ（重合度＝１５００）
【００９１】
（固定糖鎖の検出）
ＩｇＧ由来糖鎖の多くと結合するレクチンであるＣｏｎＡレクチンのビオチン標識体であるＢｉｏｔｉｎ標識ＣｏｎＡレクチン(ＳＩＧＭＡ、Ｃ２２７２)を下記溶液で５ｕｇ／ｍＬに調製した。
溶液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１００ｍＭ ＮａＣｌ、
１ｍＭ ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０
【００９２】
基板上に溶液を反応させ、室温で２時間反応した。
反応後、前記洗浄剤で洗浄した。
Ｃｙ３−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＧＥヘルスケア、ＰＡ４３００１）を下記溶液で２ｕｇ／ｍＬに調製したものを基板状に展開し、室温で１時間反応した。
溶液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１００ｍＭ ＮａＣｌ、
１ｍＭ ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０
反応後、前記洗浄液で洗浄。測定はＸ−１００マイクロアレイリーダー、ＳｃａｎＡｒｒａｙＬｉｔｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ製）を用いてＣｙ３の蛍光強度を測定。（Ｌａｓｅｒ＝９０、ＰＭＴ＝６５）
【００９３】
結果を下表に示す。
【表１】
【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明により、簡単に糖鎖ライブラリーを作製することが可能で、検出対象物質の非特異的な吸着・結合を抑制した糖鎖捕捉基板も用いて、糖、狭義の糖鎖、糖ペプチド、糖タンパク、糖脂質またはこれらを有する糖鎖を固定化できるバイオアッセイ用の各種糖鎖アレイを提供することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖鎖を含有する精製原料を
一級アミノ基を有する糖鎖精製用基材と接触させて糖鎖を捕捉し、
当該基材ごと回収し、
所定の特性を有する糖鎖群ごとに分けることを
特徴とする糖鎖ライブラリー作製方法。
【請求項２】
前記基材ごと回収した糖鎖を、当該基材から遊離し、液体クロマトグラフィーにより、分画する請求項１記載の糖鎖ライブラリー作製方法。
【請求項３】
前記精製原料が、有機合成物、酵素合成物または生体由来物質である請求項１または２に記載の糖鎖ライブラリー作製方法。
【請求項４】
前記分離する糖鎖類が、２糖以上の糖鎖、またはそれを含む化合物、糖アミノ酸、糖ペプチド、糖タンパク質、糖脂質、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、グリコシルホスファチジルイノシトール、ペプチドグリカン、リポ多糖、およびそれらの誘導体から選ばれる請求項１ないし３のいずれか１項に記載の糖鎖ライブラリー作製方法。
【請求項５】
前記一級アミノ基がオキシルアミノ基および/又はヒドラジド基である請求項１ないし４のいずれか１項に記載の糖鎖ライブラリー作製方法。
【請求項６】
前記糖鎖精製用基材が、下記一般式〔１〕で表される糖鎖捕捉用高分子化合物を含む請求項１ないし５のいずれか１項に記載の糖鎖ライブラリー作製方法。
【化１】
（Ｒは−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−ＣＯ−、−ＣＯＮＨ−が挿入されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖を示す。）
【請求項７】
前記糖鎖精製用基材が、ビーズまたはプレート状の形態である請求項１ないし６のいずれか１項に記載の糖鎖ライブラリー作製方法。
【請求項８】
前記糖鎖精製用基材が、下記一般式〔２〕の構造を有する架橋ポリマー構造を有するポリマーマトリックスで構成される粒子である請求項１ないし７のいずれか１項に記載の糖鎖ライブラリー作製方法。
【化２】
（Ｒ１，Ｒ２は−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−が挿入されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５はＨ，ＣＨ３，または炭素数２〜５の炭化水素鎖を示す。ｍ，ｎはモノマーユニット数を示す。）
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか１項に記載の糖鎖ライブラリー作製方法で作製したことを特徴とする糖鎖ライブラリー。
【請求項１０】
前記糖鎖ライブラリーの糖鎖を基板の表面に固定化したことを特徴とする糖鎖アレイ。
【請求項１１】
前記糖鎖アレイが、下記一般式〔３〕で表される糖類固定用高分子化合物を基板表面に塗布し、高分子化合物の固定化層を介して前記糖鎖が、固定化した請求項１０記載の糖鎖アレイ
【化３】
（式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は水素原子またはメチル基を、Ｒ４は疎水性基を示す。Ｘは炭素数１〜１０のアルキレンオキシ基を示し、ｐは１〜２０の整数を示す。ｐが２以上２０以下の整数である場合、繰り返されるＸは、同一であっても、または異なっていてもよい。Ｙはアルキレングリコール残基を含むスペーサーであり、Ｚは酸素原子またはＮＨである。Ｍｅはメチル基である。ｌ、ｍ、ｎは自然数である。）
【請求項１２】
前記疎水性基Ｒ４が環状アルキル基であることを特徴とすることを特徴とする請求項１１記載の糖類アレイ。
【請求項１３】
前記環状アルキル基がシクロヘキシル基であることを特徴とする請求項１２記載の糖類アレイ。
【請求項１４】
前記基板の材質がプラスチックである請求項１０ないし１３のいずれか１項に記載の糖鎖アレイ。
【請求項１５】
前記プラスチックが飽和環状ポリオレフィンまたはポリスチレンを含むものである請求項１４記載の糖鎖アレイ。
【請求項１】
糖鎖を含有する精製原料を
一級アミノ基を有する糖鎖精製用基材と接触させて糖鎖を捕捉し、
当該基材ごと回収し、
所定の特性を有する糖鎖群ごとに分けることを
特徴とする糖鎖ライブラリー作製方法。
【請求項２】
前記基材ごと回収した糖鎖を、当該基材から遊離し、液体クロマトグラフィーにより、分画する請求項１記載の糖鎖ライブラリー作製方法。
【請求項３】
前記精製原料が、有機合成物、酵素合成物または生体由来物質である請求項１または２に記載の糖鎖ライブラリー作製方法。
【請求項４】
前記分離する糖鎖類が、２糖以上の糖鎖、またはそれを含む化合物、糖アミノ酸、糖ペプチド、糖タンパク質、糖脂質、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、グリコシルホスファチジルイノシトール、ペプチドグリカン、リポ多糖、およびそれらの誘導体から選ばれる請求項１ないし３のいずれか１項に記載の糖鎖ライブラリー作製方法。
【請求項５】
前記一級アミノ基がオキシルアミノ基および/又はヒドラジド基である請求項１ないし４のいずれか１項に記載の糖鎖ライブラリー作製方法。
【請求項６】
前記糖鎖精製用基材が、下記一般式〔１〕で表される糖鎖捕捉用高分子化合物を含む請求項１ないし５のいずれか１項に記載の糖鎖ライブラリー作製方法。
【化１】
（Ｒは−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−ＣＯ−、−ＣＯＮＨ−が挿入されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖を示す。）
【請求項７】
前記糖鎖精製用基材が、ビーズまたはプレート状の形態である請求項１ないし６のいずれか１項に記載の糖鎖ライブラリー作製方法。
【請求項８】
前記糖鎖精製用基材が、下記一般式〔２〕の構造を有する架橋ポリマー構造を有するポリマーマトリックスで構成される粒子である請求項１ないし７のいずれか１項に記載の糖鎖ライブラリー作製方法。
【化２】
（Ｒ１，Ｒ２は−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−が挿入されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５はＨ，ＣＨ３，または炭素数２〜５の炭化水素鎖を示す。ｍ，ｎはモノマーユニット数を示す。）
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか１項に記載の糖鎖ライブラリー作製方法で作製したことを特徴とする糖鎖ライブラリー。
【請求項１０】
前記糖鎖ライブラリーの糖鎖を基板の表面に固定化したことを特徴とする糖鎖アレイ。
【請求項１１】
前記糖鎖アレイが、下記一般式〔３〕で表される糖類固定用高分子化合物を基板表面に塗布し、高分子化合物の固定化層を介して前記糖鎖が、固定化した請求項１０記載の糖鎖アレイ
【化３】
（式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は水素原子またはメチル基を、Ｒ４は疎水性基を示す。Ｘは炭素数１〜１０のアルキレンオキシ基を示し、ｐは１〜２０の整数を示す。ｐが２以上２０以下の整数である場合、繰り返されるＸは、同一であっても、または異なっていてもよい。Ｙはアルキレングリコール残基を含むスペーサーであり、Ｚは酸素原子またはＮＨである。Ｍｅはメチル基である。ｌ、ｍ、ｎは自然数である。）
【請求項１２】
前記疎水性基Ｒ４が環状アルキル基であることを特徴とすることを特徴とする請求項１１記載の糖類アレイ。
【請求項１３】
前記環状アルキル基がシクロヘキシル基であることを特徴とする請求項１２記載の糖類アレイ。
【請求項１４】
前記基板の材質がプラスチックである請求項１０ないし１３のいずれか１項に記載の糖鎖アレイ。
【請求項１５】
前記プラスチックが飽和環状ポリオレフィンまたはポリスチレンを含むものである請求項１４記載の糖鎖アレイ。
【図１】
【公開番号】特開２０１２−２０１６５３（Ｐ２０１２−２０１６５３Ａ）
【公開日】平成２４年１０月２２日（２０１２．１０．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−６９５７８（Ｐ２０１１−６９５７８）
【出願日】平成２３年３月２８日（２０１１．３．２８）
【出願人】（０００００２１４１）住友ベークライト株式会社 (2,927)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１０月２２日（２０１２．１０．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月２８日（２０１１．３．２８）
【出願人】（０００００２１４１）住友ベークライト株式会社 (2,927)
【Ｆターム（参考）】
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