細胞ベースの発光及び非発光プロテアソームアッセイ
透過処理した細胞中のプロテアソーム活性を検出するため、及び場合によっては異なる酵素介在反応の少なくとも１つの分子の存在又は量を、多重化アッセイにおいて検出するための方法を提供する。この方法は、プロテアソーム関連プロテアーゼの発光基質の使用を含み、この場合プロテアーゼによる発光基質のタンパク質分解によって甲虫ルシフェラーゼの基質が生成する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その全容が参照として本明細書に組み込まれる２００５年９月１日に出願された米国仮出願第６０／７１３，９０６号の、米国特許法第１１９条（ｅ）の下での特典を特許請求するものである。
【背景技術】
【０００２】
ルシフェラーゼ介在酸化反応の結果として、幾つかの生物において発光が生じる。広く様々な非常に異なる種由来のルシフェラーゼ遺伝子、特にフォチナス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）及びホチュリス・ペンシルバニカ（Ｐｈｏｔｕｒｉｓ ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃａ）（北アメリカのホタル）、ピロフォラス・プラジオフタラムス（Ｐｙｒｏｐｈｏｒｕｓ ｐｌａｇｉｏｐｈｔｈａｌａｍｕｓ）（ジャマイカのコメツキムシ）、Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（ウミシイタケ）、並びに幾つかの細菌（例えば、ゼノラブダス・ルミネッセンス（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）及びビブリオ属種（Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐｐ））のルシフェラーゼ遺伝子は、非常に一般的な発光レポーター遺伝子である。ホタルルシフェラーゼもＡＴＰ濃度を測定するための一般的なレポーターであり、その役割において、バイオマスを検出するために広く使用されている。他の酵素が幾つかの合成基質、例えばアルカリホスファターゼ及びアダマンチルジオキセタンホスフェート、又はホースラディッシュペルオキシダーゼ及びルミノールと混合されるとき、それらの酵素によっても発光は生じる。
【０００３】
ルシフェラーゼ遺伝子は、その非放射活性、感受性、及び発光アッセイの極端な直線範囲のために遺伝子レポーターとして広く使用されている。例えば、わずか１０−２０モルのホタルルシフェラーゼを検出することができる。したがって、遺伝子活性のルシフェラーゼアッセイは、原核生物細胞と真核生物細胞の両方の培養、トランスジェニック植物及び動物、並びに無細胞発現系を含めた、ほぼ全ての実験生物系において使用されている。同様に、ＡＴＰ濃度を測定するために使用されるルシフェラーゼアッセイは非常に感度が良く、１０−１６モル未満の検出を可能にする。
【０００４】
ルシフェラーゼは、酵素特異的基質、例えばルシフェリンの酸化によって光を生成することができる。ホタルルシフェラーゼ及び全ての他の甲虫ルシフェラーゼに関して、光の生成はマグネシウムイオン、酸素、及びＡＴＰの存在下で起こる。ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼを含めた花虫類ルシフェラーゼに関しては、基質セレンテラジンと共に酸素のみが必要とされる。一般に、遺伝子活性を測定するための発光アッセイでは、反応基質及び他の発光活性試薬を、レポーター酵素を発現すると推測される生物系中に導入する。結果として生じる発光が存在する場合、照度計又は任意の適切な放射エネルギー測定デバイスを使用して次いで測定する。このアッセイは非常に迅速で感度が良く、放射性試薬を必要とせずに、早急且つ容易に遺伝子発現データを与える。
【０００５】
レポーターは、細胞又は上清内の分子の存在又は活性を検出するのにも有用である。例えばプロテアーゼは、血液凝固におけるタンパク質の代謝回転、炎症、生殖、繊維素溶解、及び免疫応答などの多様な生理プロセスと関連する酵素の大部分の重要な群を構成する。特異的プロテアーゼ及びそれらの阻害剤の活性の変化によって多数の病状が引き起こされ、それらによって特徴付けることができる。研究又は臨床設定において、これらのプロテアーゼを測定する能力は、病状の調査、治療及び管理にとって重要である。例えば、カスパーゼ−３及びカスパーゼ−７は、（アスパラギン酸特異的システインプロテアーゼ、「ＡＳＣＰ」としても知られる）システインアスパルチル特異的プロテアーゼファミリーのメンバーであり、哺乳動物細胞の細胞死において重要なエフェクターの役割を果たしている（Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙら、１９９２；Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら、１９９５；Ｔｅｗａｒｉら、１９９５；及びＦｅｒｎａｎｄｅｓ−Ａｌｎｅｍｒｉら、１９９６）。
【０００６】
しかしながらプロテアーゼは、それらの本来存在する基質でアッセイするのは容易ではない。さらに、多くの現在利用可能な合成基質は高価で、感度が悪く、且つ非選択的である。
【０００７】
多数の発色及び蛍光基質を使用してプロテアーゼが測定されてきており（Ｍｏｎｓｅｅｓら、１９９４；Ｍｏｎｓｅｅｓら、１９９５）、且つ修飾型ルシフェリンは蛍光指標の代替をもたらしてきている（米国特許第５，０３５，９９９号及び米国特許第５，０９８，８２８号）。前基質としてヒドロラーゼの認識部位を有する修飾型ルシフェリンを使用するための方法はＭｉｓｋａ及びＧｅｉｇｅｒ（１９８９）によって最初に記載され、この場合修飾型ルシフェリン及びヒドロラーゼを指定の期間インキュベートし、次いで混合物の等分試料をルシフェラーゼを含む溶液に移すことによって、異種間アッセイが実施された。Ｍａｓｕｄａ−Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら（２０００）は、β−ガラクトシダーゼ基質修飾型ルシフェリンを利用する、１本の試験管（同種間）アッセイの使用を報告した。
【０００８】
プロテアソームは、真核生物細胞の細胞質及び核中で多触媒性ユビキチン−プロテアソーム経路のタンパク質分解機能を果たす、（タンパク質分解装置とも呼ばれる）大きなマルチサブユニット酵素複合体である。２０Ｓプロテアソームは、４つのスタックリングから構成される中空シリンダーを形成する大きな２６Ｓプロテアソーム複合体の一部分である。２つの内部β−リングはそれぞれ、３つの異なるタンパク質分解部位、疎水性残基の後ろに２つのキモトリプシン様部位切断ペプチド結合、塩基性残基の後ろに２つのトリプシン様切断部位、及び酸性残基の後ろに２つのカスパーゼ様（酸性／ペプチジルグルタミルペプチドヒドロラーゼ）切断部位を含む。プロテアソームは、サイトゾルと核の両方において見られる。
【０００９】
多触媒性ユビキチン−プロテアソーム経路は、正常な細胞周期及びＮＦ−ｋＢを活性化させるのに必要なＩ−ｋＢの分解などのシグナル変換事象と関連する、タンパク質の代謝回転を強く制御する。この経路は、抗原のプロセシング及び提示とも関係がある。プロテアソーム活性は、正常な細胞の生存及び機能に重要である。プロテアソーム経路の阻害は、アポトーシスによる細胞死をもたらす。ユビキチン−プロテアソーム経路は、細胞周期、機能、及び生存に不可欠なので、それは癌における治療標的として認められている。何故なら悪性、形質転換、及び増殖細胞は正常細胞よりプロテアソーム阻害を受けやすいからである。正常細胞の相対物と比較して腫瘍細胞に対する毒性がより強い、幾つかのプロテアソーム阻害剤が同定されてきている。さらに、これらの阻害剤の１つである（ＰＳ−３４１又はＶｅＩｃａｄｅとしても知られている）ボルテゾミブは、進行した多発性骨髄腫の治療に関してＦＤＡの承認を得ている。この成功によって、癌療法を開発するための有効な標的としてのプロテアソームを確認している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
例えば阻害剤をスクリーニングするための、現在のプロテアソームアッセイは、血液又は凍結細胞調製物から精製されており、したがって無処理の細胞の活性と関連する可能性はない調製物の使用を含む。したがって、改善されたプロテアソームアッセイが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、細胞ベースの発光又は非発光、例えば蛍光アッセイにおける、プロテアソームと関連する１つ又は複数のタンパク質分解活性の検出を提供する。本発明はさらに、例えば同じウエルにおける非発光及び発光アッセイの多重化を提供し、そのアッセイの少なくとも１つが、１つ又は複数のタンパク質分解プロテアソーム活性を検出するための細胞ベースのアッセイである。例えば、細胞ベースのプロテアソームアッセイは、ＡＴＰなどの酵素反応の補助因子；分子と結合するタンパク質及び／又は分子の高次構造を改変するタンパク質（ペプチド又はポリペプチド）、例えばペプチド又はポリペプチド基質を修飾又は切断するタンパク質；又はタンパク質と結合する分子及び／又はタンパク質によって改変される分子、例えば基質を含めた、細胞によって発現されるプロテアソーム以外の１つ又は複数の部分（分子又は活性）の量（例えば、活性）又は存在を検出するためのアッセイと多重化させることができる。他のアッセイは細胞ベースであってよく、或いは細胞溶解後に実施することもできる。さらに、本明細書に記載するアッセイは、レポーターアッセイ、核酸ベースのアッセイ又は免疫学ベースのアッセイを含めた他のアッセイと共に利用することができる。細胞中の細胞内膜結合オルガネラ又は区画を実質的に害さない量の細胞膜透過処理試薬を利用する、１つ又は複数のサイトゾル酵素（膜と結合した細胞オルガネラ又は区画中に存在しない細胞内酵素）を検出するための細胞ベースの非発光又は発光アッセイをさらに提供する。
【００１２】
したがって、本発明は、細胞中のプロテアソームと関連するタンパク質分解活性を検出するための方法を提供する。本発明の方法で利用する試料には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養した細胞又は生理的試料から得た試料を含めた、透過処理済みである真核生物細胞試料を含む。一実施形態では方法は、真核生物細胞、細胞中の細胞内膜結合オルガネラ又は区画を実質的に害さない量の細胞膜透過処理試薬、及びプロテアソーム関連プロテアーゼの発光基質を含む甲虫ルシフェラーゼ介在反応の反応混合物を用意することを含む。プロテアーゼによる発光基質のタンパク質分解によって、甲虫ルシフェラーゼの基質である発光産物が生成する。次いで、混合物中の発光を検出又は測定する。本発明は、無処理の真核生物細胞及び細胞中の細胞内膜結合オルガネラ又は区画を実質的に害さない量の細胞膜透過処理試薬を含む試料を、プロテアソーム関連プロテアーゼの発光基質を含む甲虫ルシフェラーゼ介在反応の反応混合物と接触させる方法も提供する。このプロテアーゼによる発光基質のタンパク質分解によって、甲虫ルシフェラーゼの基質である産物が生成する。次いで混合物中の発光を、検出又は測定する。
【００１３】
例えば一実施形態では、プロテアソームと関連するプロテアーゼ活性の１つのプロテアーゼ認識部位を含むように修飾した（例えば、共有結合によって修飾した）、甲虫ルシフェラーゼ及び適切なルシフェリン、アミノルシフェリン、又はこれらの誘導体を発光アッセイで利用して、細胞中のプロテアソームの活性を検出することができる。一実施形態では、発光アッセイ試薬はＬＬＶＹ−アミノルシフェリン（ＬＬＶＹ；配列番号１）、ＬＲＲ−アミノルシフェリン、ｎＬＰｎＬＤ−アミノルシフェリン（ｎＬＰｎＬＤ；配列番号２）であってよく、或いは他の発光プロテアソーム関連プロテアーゼ基質、例えば、ルシフェリン、アミノルシフェリン、又はこれらの誘導体と結合した異なるペプチド又はポリペプチド基質であってよい。本発明の範囲内のルシフェリン誘導体には、その開示が参照として本明細書に組み込まれる米国出願第６０／６８５，９５７号、同６０／６９３，０３４号、及び同６０／６９２，９２５号、並びに米国出願公開２００４０１７１０９９号に記載された誘導体などの、甲虫ルシフェラーゼの基質である誘導体があるが、これらだけには限られない。
【００１４】
他の実施形態では本発明は、真核生物細胞、細胞中の細胞内膜結合オルガネラ又は区画を実質的に害さない量の細胞膜透過処理試薬、及びプロテアソーム関連プロテアーゼの発光基質を含む反応混合物を提供する。次いで、混合物中の蛍光を検出又は測定する。例えば、プロテアソーム関連プロテアーゼの基質を修飾して、酵素が基質と反応した後のみ一定波長の光を発する蛍光団を含ませることができ、蛍光団を一定波長又は波長範囲の光に接触（曝露）させ、例えばＬＬＶＹ−ＡＭＣ（配列番号１）はプロテアソームのキモトリプシン活性を検出するのに有用な蛍光基質であり、プロテアソーム関連プロテアーゼによるその基質の切断はＡＭＣの蛍光によって調べることができる。
【００１５】
したがって本発明は、透過処理した真核生物細胞中のプロテアソーム活性をモニタリングすることができる、１つの他の同種のアッセイを提供する。ジギトニン透過処理細胞などの透過処理細胞中の、プロテアソームの非常に近辺の成分などの他の細胞成分の存在は、細胞抽出物又は精製プロテアソーム中のプロテアソーム活性の測定に優る利点をもたらす可能性がある。さらに透過処理細胞は、他の分子又は細胞質酵素活性などの活性、例えば選択的Ｐ４５０活性を測定するのに有用である可能性がある。本発明のアッセイは、発光又は蛍光を使用して、プロテアソーム活性を単独で、或いは発光／蛍光多重化アッセイ又は他の多重化アッセイにより、別の分子の測定又は検出、例えばカスパーゼ活性又は核酸の測定又は検出と組み合わせて測定するように形式を整えることができる。したがって、細胞の生存の測定（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（商標）、又はＣｙｔｏＴｏｘ−ＯＮＥ（商標））又はアポトーシス細胞毒性の特異的測定（Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ（商標）３／７、−８、−９又はＡｐｏ−ＯＮＥ（商標））を、プロテアソームアッセイと多重化させることができる。これらの他の分子を検出するために、透過処理細胞はこれらの細胞を溶かす条件を施すことができ、溶解物は１つ又は複数の分子に関してアッセイすることができ、或いは１つ又は複数の分子に関してアッセイすることができる１つ又は複数の分画の分画化及び／又は精製を施すことができる。他の実施形態では、透過処理の前に、細胞試料を細胞表面分子及び／又は細胞表面と結合しない分子、例えば上清中の分子に関してアッセイすることができる。１つ又は多重化アッセイ中の検出において検出又は利用される分子は、天然分子、又は例えば融合タンパク質を含めた組換え体分子であってよい。例えば、ルシフェラーゼ介在反応に関しては、ルシフェラーゼは天然又は組換え体であってよい。
【００１６】
したがって一実施形態では、本発明の組合せ発光／非発光アッセイ形式は、１つ又は複数のペプチド又はポリペプチド、例えば酵素；ペプチド又はポリペプチドと結合する、及び／又はそれによって改変される１つ又は複数の分子、例えば少なくとも１つの酵素のペプチド又はポリペプチド基質；及び／又は１つ又は複数の酵素介在反応の補助因子；又は他の分子若しくは状態；又はこれらの組合せに関するアッセイの多重化を可能にする。一実施形態では本発明は、プロテアソームと関連するプロテアーゼの活性（第１の酵素介在反応）及び第２の酵素介在反応の第２の分子、及び場合によっては他の酵素介在反応の分子を含めた他の分子の存在又は量を検出するための方法を提供する。この方法は、細胞試料を、第１の酵素介在反応及び第２の酵素介在反応の反応混合物と接触させることを含む。一実施形態では、細胞内膜結合オルガネラ又は区画を実質的に害さない量の細胞膜透過処理試薬を、細胞を反応混合物と接触させる前に細胞に加える。他の実施形態では、細胞内膜結合オルガネラ又は区画を実質的に害さない量の細胞膜透過処理試薬を、反応混合物を細胞と接触させる前に反応混合物に加える。一実施形態では、発光を利用してプロテアソーム活性を検出し、蛍光又は比色定量を利用して第２の酵素介在反応の分子を検出する。次いで、プロテアソームの活性及び第２の分子の存在又は量を検出する。
【００１７】
或いは、第１の反応と第２の反応の反応混合物を連続的に加えることができ、この場合第１の反応混合物は、細胞内膜結合オルガネラ又は区画を実質的に害さない量の細胞膜透過処理試薬を含むことができる。具体的なバッファー条件は検出する分子によって変わる可能性があるので、このような２ステップアッセイは試薬調節を含み得る。例えば試薬調節は、第１の反応用に消光物質、及び／又は第２の反応用に増強物質の添加を含み得る。少なくとも２つの酵素活性を検出する一実施形態では、その２つの酵素は同じ活性を有しておらず、例えばそれらは同じ基質と結合又は反応せず、或いはそれらが同じ基質と結合又は反応する場合、酵素の１つが他の酵素の基質とは実質的に反応せず、それによって特異性が得られるように、条件又は基質を利用する。例えば、ＬＬＶＹ（配列番号１）含有基質は、キモトリプシン又はカルパインの基質であってよい。しかしながら、カルパイン介在反応はカルシウムを必要とするが、キモトリプシン介在反応は必要としない。したがって、実質的に無カルシウム条件下で実施されるアッセイにおいて、ＬＬＶＹ（配列番号１）含有基質を用いてキモトリプシン活性を検出することができる。
【００１８】
本発明は、反応の１つの停止又は反応の１つの増強／加速を場合によっては含まない、同時反応又は連続反応中の少なくとも２つの分子の活性、存在又は量の同時又は連続的検出を含めた、多重化アッセイにおける分子又は活性の同時又は連続的検出も提供する。一実施形態では、プロテアソーム関連プロテアーゼの基質と、他の分子を検出するのに、例えば核酸を検出するのに有用な試薬を、細胞試料に同時に加え、他の分子の量又は存在を検出する前にプロテアソーム活性を検出する。他の実施形態では、２つの異なる酵素介在反応の基質を細胞試料に同時に加え、異なる酵素介在反応の酵素、基質及び／又は補助因子の量又は存在を検出する前にプロテアソーム活性を検出する。なお他の実施形態では、プロテアソーム関連プロテアーゼの基質と、他の分子を検出するのに有用な試薬を試料に同時に加え、プロテアーゼ活性と他の分子の存在又は量を同時に検出する。他の実施形態では、２つの異なる酵素介在反応の基質を試料に同時に加え、異なる酵素介在反応の酵素、基質及び／又は補助因子の存在又は量を、プロテアソーム活性を検出するのと同時に検出する。或いは、プロテアソーム関連プロテアーゼの基質を反応混合物に加え、そのプロテアーゼの活性を検出し、次いで他の分子を検出するのに有用な試薬を加え、その分子の存在又は量を検出する。他の実施形態では、プロテアソーム関連プロテアーゼの基質を反応混合物に加え、そのプロテアーゼの活性を検出し、次いで他の酵素介在反応の基質を加え、その第２の反応の酵素、基質及び／又は補助因子の存在又は量を検出する。酵素、基質、補助因子及び／又は他の分子の活性、存在又は量は、１つの容器、例えばウエル中での反応において検出することが好ましい。
【００１９】
したがって本発明は、細胞膜透過処理細胞を含む混合物中の１つ又は複数のプロテアソーム関連プロテアーゼ活性の検出又は測定以外に、他の酵素介在反応の補助因子、基質又は酵素の存在又は量を検出又は測定することができる、多重化アッセイを提供する。他の実施形態では、細胞膜透過処理細胞を含む混合物中の１つ又は複数のプロテアソーム関連プロテアーゼ活性の検出又は測定以外に、非酵素反応と関連する部分の存在又は量を検出又は測定することができる。なお他の実施形態では、細胞膜透過処理細胞を含む混合物中の１つ又は複数のプロテアソーム関連プロテアーゼ活性の検出又は測定以外に、異なる細胞分子、例えば核酸又はタンパク質の存在又は量を、例えばこの混合物を、その細胞分子を検出するのに有用な試薬と接触させることによって検出又は測定する。このような試薬は、特定の細胞分子と結合する試薬を含む。したがって一実施形態では、核酸結合色素を利用して、プロテアソーム特異的タンパク質分解活性のアッセイにおいて核酸の存在又は量を検出することができる。
【００２０】
さらに、幾つかの細胞透過処理試薬は異なる可溶化を可能にするので、本発明は、少なくとも２つの分子のサイトゾル活性を検出又は測定することができる多重化アッセイを提供する。
【００２１】
本発明のアッセイ中で使用するための１つ又は複数の試薬を含む組成物及びキットも提供する。一実施形態では、組成物は溶液、例えば１つ又は複数の基質が０．００５〜約１．０Ｍ、例えば０．０５〜約０．２Ｍで存在する溶液である。
【００２２】
アッセイには、薬剤発見ツールとしての使用もある。したがって、調節物質、例えばプロテアソームと関連するプロテアーゼの阻害剤の存在又は量は、本発明のアッセイ、例えば蛍光又は発光アッセイを使用して検出することができる。したがって本発明は、１つ又は複数の作用物質を、細胞、細胞中の細胞内膜結合オルガネラ又は区画を実質的に害さない量の細胞膜透過処理試薬、及びプロテアソームと関連するプロテアソームの発光又は蛍光基質を含む反応混合物と接触させて、混合物を生成する方法を提供する。１つ又は複数の作用物質を細胞と接触させ、その混合物を、細胞中の細胞内膜結合オルガネラ又は区画を実質的に害さない量の細胞膜透過処理試薬、及びプロテアソームと関連するプロテアーゼの発光又は蛍光基質を含む反応混合物と接触させる方法も提供する。混合物中の発光又は蛍光は、１つ又は複数の作用物質を欠く対応する混合物中の発光又は蛍光と比較する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
定義
本明細書で使用する「発光アッセイ」は、第１の分子、例えば第１の酵素のペプチド又はポリペプチド基質、第１の分子と適切な（第１の）タンパク質の間の反応の生成物、及び／又は異なるタンパク質と第１の反応の生成物の間の反応の生成物が発光性である反応を含む。したがって発光アッセイは、プロテアソームの１つ又は複数の活性、或いはその部分が酵素反応と関連し得る、例えば反応の補助因子、反応又は酵素の基質である、或いは部分と結合する且つ／或いはそれによって改変する分子であるプロテアソーム以外の部分の量又は存在を直接又は間接的に検出、例えば測定することができる。発光アッセイは、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−ラクタマーゼ、プロテアーゼ、アルカリホスファターゼ、又はペルオキシダーゼ、及び適切な対応する酵素、例えば修飾形のルシフェリン、セレンテラジン、ルミノール、ペプチド又はポリペプチド、ジオキセタン、ジオキセタノン、及び関連アクリジニウムエステルを利用又は検出するアッセイだけには限られないが、それらを含めた化学発光及び生物発光アッセイを含む。
【００２４】
本明細書で使用する「発光アッセイ試薬」は、発光反応用の基質、及び補助因子又はタンパク質、例えば酵素などの他の分子を含む。
【００２５】
「非発光アッセイ」は、第１の分子、例えばタンパク質（ペプチド又はポリペプチド）、第１の分子と適切な（第１の）タンパク質（ペプチド又はポリペプチド）の間の反応の（第１の）生成物、又は異なるタンパク質と第１の生成物の間の反応の生成物が発光性ではないが、他の場合検出できる可能性がある、例えば基質及び／又は生成物を、プロテアソームの１つ又は複数の活性、或いはその部分が酵素反応と関連し得る、例えば部分が補助因子、プロテアソームと関連する他の活性などの反応の基質又は酵素、或いは部分と相互作用する分子であるプロテアソーム以外の部分の量又は存在を直接又は間接的に測定する、蛍光又は比色定量アッセイを使用して検出する反応を含む。
【００２６】
本明細書で使用する「蛍光アッセイ試薬」は、蛍光反応用の基質、及び補助因子又は他の分子、例えばタンパク質を含む。
【００２７】
本明細書で使用する「細胞膜透過処理試薬」は、細胞と接触すると細胞膜を部分的に害し、試薬、例えばトリパンブルー、ヨウ化プロピジウム、又は臭化エチジウムなどの試薬に曝されていない生きた細胞中への進入から通常排除されるはずである物質の、細胞中への進入を可能にする任意の試薬を含む。
【００２８】
本明細書で使用する「プロテアソーム特異的タンパク質分解活性」は、プロテアソーム特異的阻害剤、例えばラクタシスチンによって阻害され得るトリプシン様、キモトリプシン様又はカスパーゼ様活性である。
【００２９】
本発明の方法
本発明は、その１つがプロテアソーム活性を他の分子又は活性と同時或いは連続的に検出することを含む、少なくとも２つの異なる分子又は活性を検出するための多重化アッセイ法を含めた、透過処理細胞中のプロテアソームの１つ又は複数の活性を検出するための同種間アッセイを提供する。例えば、１つ又は複数の酵素介在反応を、少なくとも１つの酵素基質を基質と酵素の間の反応の生成物に転換するのに有効な条件下で実施し、その生成物は基質由来の異なる特徴（シグナル）を有する。２つの基質を伴う２酵素介在反応に関しては、基質と対応する酵素の間の反応の生成物に各基質を転換するのに有効な条件下で同時或いは連続的に反応を実施し、この場合各基質及び／又は生成物は異なる特徴を有する。生成するシグナルは、検出する分子の活性、存在又は量と関連する。本発明の発光又は蛍光法は、酵素介在反応の基質を含むように修飾されており、酵素反応の酵素、補助因子、酵素基質、酵素阻害剤、及び／又は酵素活性剤を検出するのに有用である、ルシフェリン、アミノルシフェリン、又はこれらの誘導体、又は蛍光団を利用する。
【００３０】
一実施形態では、本発明による方法は、細胞の等分試料などの１試料中のプロテアソーム活性を含めた多数の部分又は活性を同時或いは連続的に検出するための、迅速で非常に感度の良い方法をもたらす。一実施形態では方法は、発光アッセイ中の第１の酵素、基質又は補助因子の存在又は量（活性）を定量化すること、及び蛍光アッセイなどの非発光アッセイ中の第２の酵素、基質又は補助因子の存在又は量を定量化することを含む。一実施形態では、各反応用に試薬、例えば基質を同時或いは連続的に加えることができる。他の実施形態では方法は、蛍光アッセイ中の第１の酵素、基質又は補助因子の存在又は量を定量化すること、及び発光アッセイ中の第２の酵素、基質又は補助因子の存在又は量を定量化することを含む。発光又は非発光シグナルの強度は、各分子の存在又は量の関数である。
【００３１】
一実施形態では、当該の酵素を検出するために、方法は少なくとも２つの異なる反応を利用し、この場合第１の反応は、甲虫ルシフェラーゼの基質を生成する当該の酵素の基質を伴う非ルシフェラーゼ酵素介在反応であり、第２の反応は甲虫ルシフェラーゼ介在反応である。したがって発光アッセイは、例えば非甲虫ルシフェラーゼ介在反応の酵素、補助因子又は基質、非甲虫ルシフェラーゼ介在反応の阻害剤、又は非甲虫ルシフェラーゼ介在反応の活性剤の量、存在又は特異的活性を間接的に検出する、例えば測定することができる。これらの反応では、非甲虫ルシフェラーゼ酵素の基質である修飾ルシフェリン、アミノルシフェリン又はこれらの誘導体を利用し、その反応の生成物は甲虫ルシフェラーゼの基質である。
【００３２】
１ステップアッセイに関しては、反応混合物は２つの反応用の試薬、非甲虫ルシフェラーゼ酵素介在反応及び甲虫ルシフェラーゼ介在反応用の試薬など、又は一反応、例えば酵素の基質を含むように修飾された蛍光団と酵素の間の反応の反応混合物を含み得る。少なくとも２つの反応を利用するアッセイに関しては、アッセイ用の分子を加える順序は変わる可能性がある。連続的に開始し実施する場合（同じ容器中であろうとそうでなかろうと）、反応条件、例えば試薬濃度、温度又は他の試薬に対する調節を実施することができる。例えば、消光物質又は増強物質を反応間に加えることができる（例えば、その開示が参照として本明細書に詳細に組み込まれる、米国特許第５，７７４，３２０号及び同６，５８６，１９６号を参照）。一実施形態では、２つ以上の反応を１つの反応混合物において同時に実施する。場合によっては、アッセイは同種間アッセイであり、例えば試料に混合物を加える前に成分を混合させる。追加的な試薬の移動なしで結果を読むことができる。
【００３３】
２つの一般的な型の多重化アッセイが企図される。第１のアッセイでは、多数の部分、例えば酵素介在反応の１つ又は複数の酵素、１つ又は複数の基質及び／又は１つ又は複数の補助因子を、同じ反応混合物においてアッセイする。各酵素は基質の少なくとも１つを対応する生成物に転換することができ、この場合基質及び／又は対応する生成物、又は対応する生成物の１つと他の酵素の間の反応の生成物は、同じ反応混合物中に存在するとき基質及び／又は生成物を個々に検出するのを可能にする、異なる検出可能な特徴を有する。これらのアッセイ用の分子を加える順序は変わる可能性がある。したがって個々の反応は、同時或いは連続的に開始及び／又は実施することができる。連続的に開始し実施する場合、異なる検出可能な特徴は異なる検出法を必要とする可能性があり、且つ／又は反応条件、例えば試薬濃度、温度又は他の試薬に対する調節を実施することができる。例えば、前に記載したのと同様に、消光物質又は増強物質を反応間に加えることができる。好ましい一実施形態では、２つ以上の反応を１つの反応混合物において同時に実施し、この場合それぞれの酵素は、反応混合物中の基質の１つを生成物に転換するのに有効である。この実施形態を使用して、例えば細胞中の少なくとも２つの異なる酵素、基質及び／又は補助因子、或いはその少なくとも１つが透過処理細胞中、及び他の無処理の細胞、透過処理細胞、細胞溶解物又は細胞上清中で検出される、２つの異なる反応の少なくとも２つの異なる酵素、基質又は補助因子の活性、存在又は量を測定することができる。さらに反応混合物は、１つ又は複数の試験物質、例えば酵素阻害剤又は活性剤、及び／又は異なる濃度の阻害剤、活性剤、又は基質を含むことができる。場合によっては、アッセイは同種間アッセイとして利用され、例えば試料に混合物を加える前に、１つ又は複数の基質と他の成分を混合させる。追加的な試薬の移動なしで結果を読むことができる。
【００３４】
第２のアッセイ型では、２つ以上の酵素介在反応をタンデムで実施する。同時又は異なる時間で、別の反応を実施することができる。反応混合物は、１つ又は複数の同じ又は異なる酵素、１つ又は複数の同じ又は異なる試験物質、例えば酵素阻害剤又は活性剤、及び／又は異なる濃度の阻害剤、活性剤、又は基質を含むことができる。一実施形態では、それぞれの反応混合物は、生成物に転換され得る少なくとも２つの基質を含み、この場合基質及び／又は対応する生成物、及び／又は酵素／基質対の１つの生成物と異なる酵素の間の反応の生成物は、異なる検出可能な特徴を有する。
【００３５】
したがって本発明のアッセイは、試料、例えば真核生物細胞、例えば酵母、鳥類、植物、昆虫、又はヒト、サル、ネズミ、イヌ、ウシ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ヤギ又はブタ細胞だけには限られないが、これらを含めた哺乳動物細胞、又は２つ以上の異なる生物由来の細胞を含む試料中の多数の酵素又は補助因子を含めた多数の部分を検出することができ、この場合少なくともプロテアソーム活性を透過処理細胞において検出し、他の分子の活性、存在又は量は非透過処理細胞、非透過処理細胞の上清、透過処理細胞、細胞溶解物又は細胞溶解物の分画において検出する。これらの細胞は組換え技法によって遺伝的に改変されなかった可能性があり（非組換え細胞）、或いは組換えＤＮＡで一過的にトランスフェクトされている及び／又はそのゲノムが組換えＤＮＡで安定的に増大している、或いはそのゲノムが修飾されて遺伝子が破壊されている、例えばプロモーター、イントロン又はオープンリーディングフレームが破壊されている、或いは１つのＤＮＡ断片が他のＤＮＡ断片に置換されている組換え細胞であってよい。組換えＤＮＡ又は置換ＤＮＡ断片は検出される分子のレベル又は活性を変える部分、及び／又は分子のレベル又は活性を変える分子又は部分と無関係な遺伝子産物は、本発明の方法によって検出される分子をコードし得る。
【００３６】
一実施形態では本発明は、細胞又は細胞溶解物の１つの等分試料中の１つ又は複数の酵素の、存在又は量を測定する方法に関する。一実施形態では、酵素の１つが、プロテアソームと関連するプロテアーゼなどのサイトゾル中で見られる内因性プロテアーゼ、及び場合によってはサイトゾル又は他の場所中で見られる他の酵素である。分泌プロテアーゼ及び細胞内サイトゾルプロテアーゼなどの、異なる細胞の場所に存在する酵素に関しては、各酵素の基質は無処理の細胞を含むウエルに加えることができる。分泌プロテアーゼの存在又は量はサイトゾルプロテアーゼを検出する前に検出することができ、これは細胞膜透過処理後に検出される。一実施形態では、サイトゾルプロテアーゼの非細胞透過基質及び分泌又は放出プロテアーゼの基質を、細胞を含む試料に加え、次いで細胞を透過処理する。分泌又は放出プロテアーゼの検出は、透過処理の前又は後であってよい。他の実施形態では、サイトゾルプロテアーゼ或いは分泌又は放出プロテアーゼの非細胞透過基質、及び細胞内酵素の細胞透過基質を、細胞を含む試料に加える。細胞内酵素及び分泌又は放出プロテアーゼの存在は、透過処理なしで検出することができる。一実施形態では、分泌又は放出タンパク質は蛍光、発光又は分光測光法を使用して検出される。
【００３７】
本発明の方法を利用して、プロテアソーム活性以外に、組換え及び内因性（天然）酵素を含む酵素の任意の組合せから選択される任意の酵素又は任意の酵素セットを含めた、任意の部分を検出することができる。一実施形態では、検出する酵素の全てが内因性酵素である。他の実施形態では、検出する２つの酵素が内因性酵素であり、その１つはプロテアソームと関連し、もう１つの酵素は組換え酵素である。他の実施形態では、１つの酵素が、プロテアソームと関連する活性などの内因性酵素であり、他の酵素が組換え酵素である。当業者に明らかである他の組合せを、本明細書の教示に従う本発明のアッセイ及び方法において使用することができる。酵素にはプロテアーゼ、ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、スルファターゼ、ペルオキシダーゼ、及びグリコシダーゼがあるが、これらだけには限られない。酵素は、触媒反応の性質に基づいて異なる群、ヒドロラーゼ、オキシドレダクターゼ、リアーゼ、トランスフェラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、又はシンターゼだけには限られないがこれらを含む群に由来してよく、或いは酵素は、少なくとも１つの酵素が少なくとも１つの他の酵素に対して、部分的に重複するか或いは好ましくは実質的に異なる基質特異性を有する限り同じ群に由来してよい。特に興味深いのは、生理的意義を有する酵素のクラスである。これらの酵素には、タンパク質キナーゼ、ペプチダーゼ、エステラーゼ、タンパク質ホスファターゼ、イソメラーゼ、グリコシラーゼ、シンセターゼ、プロテアーゼ、デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、レダクターゼ、メチラーゼなどがある。当該の酵素には、有機及び無機エステルの生成又は加水分解、グリコシル化、及びアミドの加水分解と関連する酵素がある。任意のクラスにおいて、キナーゼと同様にさらなる下位区分が存在する可能性があり、この場合キナーゼはペプチド及びタンパク質中のセリン、スレオニン及び／又はチロシン残基のリン酸化に特異的である可能性がある。したがって、酵素は例えば、環状ヌクレオチド制御型タンパク質キナーゼ、タンパク質キナーゼＣ、Ｃａ２＋／ＣａＭによって制御されるキナーゼ、サイクリン依存性キナーゼ、ＥＲＫ／ＭＡＰキナーゼ、及びタンパク質−チロシンキナーゼを含めた異なる機能群のキナーゼ由来のキナーゼであってよい。キナーゼは、ＥＲＫキナーゼ、Ｓ６キナーゼ、ＩＲキナーゼ、Ｐ３８キナーゼ、及びＡｂＩキナーゼなどの、オリゴペプチド基質をリン酸化するのに有効なシグナル経路中のタンパク質キナーゼ酵素であってよい。これらに関して、基質はオリゴペプチド基質を含み得る。他の当該のキナーゼは、例えばＳｒｃキナーゼ、ＪＮＫ、ＭＡＰキナーゼ、サイクリン依存性キナーゼ、Ｐ５３キナーゼ、血小板由来増殖因子受容体、上皮増殖因子受容体、及びＭＥＫを含み得る。
【００３８】
特に、本発明中で有用である酵素には、酵素活性を示す任意のタンパク質、例えば酸性ホスファターゼ、グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ガラクトシダーゼ、カルボキシルエステラーゼ、及びルシフェラーゼを含めた、リパーゼ、ホスホリパーゼ、スルファターゼ、ウレアーゼ、ペプチダーゼ、プロテアーゼ及びエステラーゼがある。一実施形態では、酵素の１つが加水分解酵素である。他の実施形態では、酵素の少なくとも２つが加水分解酵素である。加水分解酵素の例には、アルカリ及び酸性ホスファターゼ、エステラーゼ、デカルボキシラーゼ、ホスホリパーゼＤ、Ｐ−キシロシダーゼ、β−Ｄ−フコシダーゼ、チオグルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ、α−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−グルクロニダーゼ、α−Ｄ−マンノシダーゼ、β−Ｄ−マンノシダーゼ、β−Ｄ−フルクトフラノシダーゼ、及びβ−Ｄ−グルコシドウロナーゼがある。
【００３９】
任意の特定の酵素介在反応の基質又は補助因子は、当業者に知られている。幾つかのプロテアーゼの代表的な切断部位を、表１中に述べる。
【００４０】
【表１】
Ｘは１つ又は複数のアミノ酸である
【００４１】
アルカリホスファターゼに関しては、基質はホスフェート含有ジオキセタン、３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３’’−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタンなど、二ナトリウム塩、又は二ナトリウム３−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’（５’−クロロ）−トリシクロ−［３．３．１．１３，７］デカン］−４−イル）フェニルリン酸、又は二ナトリウム２−クロロ−５−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２’（５’−クロロ）−トリシクロ｛３．３．１．１３，７｝デカン｝−４−イル｝−１−フェニルリン酸又は二ナトリウム２−クロロ−５−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２’−トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン｝−４−イル）−１−フェニジルリン酸（それぞれＡＭＰＰＤ、ＣＳＰＤ、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）及びＡＤＰ−Ｓｔａｒ（商標））を含むことが好ましい。
【００４２】
β−ガラクトシダーゼに関しては、基質はガラクトシダーゼ切断又はガラクトピラノシド基を含むジオキセタンを含むことが好ましい。アッセイ中の発光は、ジオキセタン基質由来の糖部分の酵素による切断に原因がある。このような基質の例には、３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３’’−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）フェニル−１，２−ジオキセタン（ＡＭＰＧＤ）、３−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］−デカン］−４−イル−フェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｇａｌａｃｔｏｎ（登録商標））、５−クロロ−３−（メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１３，７］−デカン−４−イル−フェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｇａｌａｃｔｏｎ−Ｐｌｕｓ（登録商標））、及び２−クロロ−５−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）−トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン−４−イル］フェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｇａｌａｃｔｏｎ−Ｓｔａｒ（登録商標））がある。
【００４３】
β−グルクロニダーゼ及びβ−グルコシダーゼのアッセイでは、基質はβ−グルクロニダーゼ切断基を含むジオキセタン、グルクロニドなど、例えばナトリウム３−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）−トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン｝−４−イル）フェニル−β−Ｄ−グルクロネート（Ｇｌｕｃｕｒｏｎ（商標））を含む。カルボキシルエステラーゼのアッセイでは、基質はジオキセタンと結合した適切なエステル基を含む。プロテアーゼ及びホスホリパーゼのアッセイでは、基質はジオキセタンと結合した適切な酵素切断基を含む。
【００４４】
１ジオキセタン含有基質を含むアッセイに関しては、基質は場合によっては、置換又は非置換アダマンチル基、置換状態又は非置換状態及び酵素切断基であってよいＹ基を含む。好ましいジオキセタンの例には、前述のジオキセタン、例えばＧａｌａｃｔｏｎ（登録商標）、Ｇａｌａｃｔｏｎ−Ｐｌｕｓ（登録商標）、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）、Ｇｌｕｃｕｒｏｎ（商標）、ＡＭＰＰＤ、Ｇａｌａｃｔｏｎ−Ｓｔａｒ（登録商標）、及びＡＤＰ−Ｓｔａｒ（商標）、並びに３−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）−トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン｝−４−イル）フェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（Ｇｌｕｃｏｎ（商標））、ＣＳＰＤ、二ナトリウム３−クロロ−５−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２’（５’−クロロ）−トリシクロ−［３．３．１．１３，７］デカン｝−４−イル）−１−フェニルリン酸（ＣＤＰ）と呼ばれるジオキセタンがある。
【００４５】
他の部分の基質、プロテアソームと関連しないプロテアーゼの基質などは、蛍光団などの光学分子、吸収性着色粒子又は色素、放射標識、適切な反応成分の存在下で検出可能な反応を触媒するのに有効である触媒部分などの酵素、他のサブユニット又は断片と結合すると機能的である酵素のサブユニット又は断片、又は後の反応、例えばその反応の生成物が検出可能である反応の基質だけには限られないが、これらを含めたレポーター分子で修飾することができる。
【００４６】
したがって、プロテアソームと関連するプロテアーゼの基質と他の部分の基質の両方を、蛍光団で標識することができる。本明細書で使用する「蛍光団」は、一定波長範囲でエネルギーを吸収することができ、吸収範囲以外の波長範囲でエネルギーを放出することができる分子を含む。用語「励起波長」は、蛍光団がエネルギーを吸収する波長の範囲を指す。用語「発光波長」は、蛍光団がエネルギー又は蛍光物質を放出する波長の範囲を指す。
【００４７】
蛍光物質の一群はキサンタン系色素であり、これはフルオレセイン、ローザミン及びローダミンを含む。これらの化合物は市販されており、結合部位又は結合官能基として使用することができるフェニル基が置換されている。例えば、アミノ及びイソチオシアネート置換フルオレセイン化合物が入手可能である。
【００４８】
他群の蛍光化合物は、α又はβ位置、通常はα位置にアミノ基を有するナフチルアミンである。ナフチルアミノ化合物中に含まれるのは、１−ジメチルアミノナフチル−５−スルホン酸、１−アニリノ−８−ナフタレンスルホン酸及び２−ｐ−トルイジニル−６−ナフタレンスルホン酸である。幾つかのナフタレン化合物は、タンパク質と幾らかの非特異的結合を有することが分かっており、したがってそれらの使用は、タンパク質の量が最小であるアッセイ培地の利用を必要とする。他の蛍光物質は、パイ電子との結合環系を有する窒素含有大員環を含む多座配位子である。これらの大員環は、架橋炭素又は窒素の置換を含めて、場合によっては置換されていてよい。適切な大員環には、ポルフィリン、アザポルフィリン、コリン、サフィリン及びポルフィセンの誘導体、及び広く非局在化する電子を含む他の同様の大員環がある。アザポルフィリン誘導体には、フタロシアニン、ベンゾトリアザポルフィリン及びナフタロシアニン及びこれらの誘導体がある。
【００４９】
幾つかの場合、蛍光融合タンパク質、例えば緑色、赤色又は青色蛍光タンパク質、又はポリペプチド基質と融合した他の蛍光タンパク質を利用することができる。他の実施形態では、蛍光タンパク質自体が加水分解酵素の基質であってよい。「蛍光タンパク質」は、完全長蛍光タンパク質又はその蛍光断片である。
【００５０】
本発明中で使用する化学蛍光団、並びにその励起波長及び発光波長の非制限的なリストは表２中に示す。励起及び発光の値はｐＨ、バッファー系、又は溶媒などの反応条件に応じて変わり得る。
【００５１】
【表２】
【００５２】
一実施形態では、修飾が酵素の基質を含むアミノ修飾ルシフェリン又はそのカルボキシ保護誘導体を含む基質を使用して、酵素の１つを検出する。一実施形態では修飾は、プロテアーゼの認識部位を含む１つ又は複数のアミノ酸残基である。一実施形態では、その認識部位を有するペプチドは、ペプチド結合によってアミノルシフェリン又はそのカルボキシ修飾誘導体のアミノ基と共有結合する。一実施形態では、例えばアミノ末端保護基を使用して、アミノペプチダーゼによる分解を妨げるために、ペプチド又はタンパク質基質のＮ末端を修飾する。適切な酵素又は補助因子の不在下では、最少のアミノルシフェリンが存在するので、このような基質及びルシフェラーゼを含む混合物は最少の光を生成する。適切な酵素の存在下では、基質とアミノルシフェリンを結び付ける結合を酵素によって切断して、アミノルシフェリン、ルシフェラーゼの基質を生成することができる。したがってルシフェリンの存在下では、例えば、天然、組換え又は突然変異ルシフェラーゼ、並びに任意の補助因子及び適切な反応条件の存在下では、光が生成し、これは酵素の存在又は活性に比例する。
【００５３】
一実施形態では、蛍光団を含む基質を使用して酵素の１つを検出する。一実施形態では基質は、プロテアーゼの認識部位を含む１つ又は複数のアミノ酸残基を含む。一実施形態では、基質は１つ又は複数の蛍光団と共有結合する。適切な酵素又は補助因子の不在下では、このような基質を含む混合物は発光波長で最少の光を生成する。何故なら蛍光団の蛍光性が例えば消光基の近辺で消失し、したがって基質−蛍光団複合体の性質が変化し、蛍光団単独と比較して複合体の改変された、例えば低下した蛍光性をもたらすからである。適切な酵素の存在下では、複合体の切断によって蛍光団が生成する。他の実施形態では、切断前は、複合体は蛍光性であるが、酵素による切断後は、生成物は改変されたスペクトルを有する。
【００５４】
一実施形態では、少なくとも２つの反応に関する条件が適合している。例えば、少なくとも２つの酵素に関する条件、及び好ましくは３つ以上の酵素、例えば４つ以上の酵素に関する条件が適合している。一群の類似の酵素は一般に、ｐＨ及びイオン強度などの適合性のある反応条件を有するはずであるが、しかしながら、補助因子の要件、金属イオンの要件など、比較的低い質量濃度を有するアッセイ要素、例えば補助因子に関する要件は共通である必要はない。一般的条件は、他の酵素に加える成分から著しく干渉されずに、それぞれの酵素が反応の工程中に測定可能な率をもたらし、一般にそれぞれの酵素が特定基質のその最大代謝回転率の少なくとも約１０％、通常少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約５０％を有するような条件を含む。
【００５５】
或いは、２つの反応の基質が存在する場合でも、１つの反応に関する条件が他の反応と適合しない可能性がある。このような実施形態では、１つの酵素は活性があるが、その基質とは反応することはできない。例えば、２つの反応に関する条件が適合しない一実施形態では、個々の酵素−アッセイ反応は連続的及び／又は別の反応混合物において実施する。酵素アッセイの後、反応混合物（又はその一部分）は、他の反応混合物と組み合わせることができる。それぞれ個々の反応混合物は、１つ又は複数の酵素及び１つ又は複数の基質を含み得る。その最も単純な形で、アッセイする一酵素及びその酵素の基質は、それぞれの反応混合物中に存在する。反応中で利用する基質の組は、一反応多重化アッセイにおいて必要とされるのと同じ一般的性質を有する。即ち、それぞれの基質及び／又は対応する生成物は独特の特徴を有しており、それらを互いに区別することができる。
【００５６】
反応中の分子の検出の順序は変わる可能性がある。一実施形態では、反応を同時に開始させるか開始させないかとは無関係に、発光アッセイによって検出される分子を検出し、次いで非発光アッセイによって検出される分子を検出する。或いは、反応を同時に開始させるか開始させないかとは無関係に、非発光アッセイによって検出される分子を検出し、次いで発光アッセイによって検出される分子を検出する。他の実施形態では、２つ以上の分子の存在又は量をほぼ同時に検出する。一実施形態では、第２の分子の存在又は活性を検出する前に、例えば第１のシグナルが例えば少なくとも５０％低下するまで待つことによって、或いは第１の反応用の消光物質を加えることによって、検出する一分子の存在又は活性が実質的に低下する。したがって幾つかの実施形態では、１つ又は複数の反応を、例えば検出前にその反応の酵素を阻害することによって停止させる。１つのアッセイによって生成するシグナルは、少なくとも１つの他のアッセイによって生成するシグナルの定量化に実質的に干渉しないことが好ましい。
【００５７】
本発明のキット
本発明は、１つ又は複数のペプチド又はタンパク質、ペプチド又はタンパク質と結合する分子及び／又はこれらによって改変される分子、補助因子、無処理の細胞、細胞溶解物、例えば少なくとも部分的に精製された溶解物、及び／又は細胞上清を含めた試料などの試料中の核酸又は他の分子を含めた１つ又は複数の部分であって、少なくとも１つが透過処理細胞中で検出される部分の存在、量又は活性を検出するためのキットも提供する。このようなキットは、部分、例えば１つ又は複数のペプチド及び／又はタンパク質、ペプチド及び／又はタンパク質と結合する分子及び／又はそれによって改変される分子、補助因子、又は他の分子の少なくとも１つを定量化するための少なくとも１つの試薬を含み、例えば、少なくとも１つの酵素の基質及び細胞膜透過処理試薬、又は少なくとも１つの酵素の基質、細胞膜透過処理試薬、及び生命力、又は他の分子を検出するための試薬、例えばトリパンブルー、例えば核酸結合色素である。
【００５８】
本明細書に記載するキット及び方法中で使用するための細胞膜透過処理試薬は、有効量で細胞中の細胞内膜結合オルガネラ又は区画を実質的に害さずに真核生物細胞を透過することができ、したがってプロテアソーム活性及び適切なプロテアーゼ基質の特異性を保つことができる試薬である。一実施形態では、細胞膜透過処理試薬はジギトニン、サポニン（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ）、ストレプトリシンＯ、洗浄剤及び／又は界面活性剤から選択される。使用する個々の細胞膜透過処理試薬の量は、透過処理する細胞型、望ましい透過処理の速度、細胞数に関する直線性の程度、及び／又は試薬を加える培養培地に基づいて選択する。その量は様々な濃度の個々の細胞膜透過処理試薬を調製すること、及びそれぞれの濃度と選択した細胞を組み合わせること、及びラクタシスチン及び／又はエポキソマイシンなどの非常に特異的なプロテアソーム阻害剤で阻害することができる活性をアッセイすることによって決定することができる。ジギトニン又はサポニンを用いた透過処理に関する濃度範囲は、約１０μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌ、例えば約２０μｇ／ｍｌ〜約４０μｇ／ｍｌ、及び約０．０５％〜約０．１％の洗浄剤及び／又は界面活性剤濃度を含むが、これらだけには限られない。適切な細胞膜透過処理試薬の例には、ジギトニン、サポニン、Ｔｈｅｓｉｔ（登録商標）、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（登録商標）ＴＭＮ−６、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（登録商標）ＮＰ−９、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００及びＮｏｎＩｄｅｔ−４０がある。プロテアソーム／ルシフェラーゼ反応と適合性がなかった洗浄剤又は界面活性剤の例には、ＳＤＳ、ＣＨＡＰＳ、ＴＯＭＡＨ（登録商標）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０、Ｇｅｒｏｐｏｎ（登録商標）Ｔ−７７、ＢｉｏＴｅｒｇｅ及びＢｒｉｊ−３５がある。好ましい細胞膜透過処理試薬は、プロテアソーム及び／又はルシフェラーゼ活性に実質的に影響を与えない量で利用する。
【００５９】
細胞ベースのアッセイにおいてプロテアソーム活性を検出するために、細胞透過試薬を使用することによって細胞に異なる透過処理を施す。例えば、低濃度の（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ由来の）ジギトニン又はサポニン（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｂａｒｋ）によって、サイトゾルタンパク質からなる分画が生じる（Ｒａｍｓｂｙら、１９９４）。原形質膜のコレステロール脂質とのジギトニン複合体は孔を形成し、サイトゾルタンパク質の放出を可能にする。低濃度のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００は、核の完全性を保ちながら膜及びオルガネラのタンパク質を豊富にする（Ｒａｍｓｂｙら、１９９４）。Ｔｗｅｅｎ−４０／デオキシコレートは細胞を溶かし、核の完全性を損ね、洗浄剤耐性サイトゾルとゆるく結合したタンパク質を放出させ、且つＳＤＳ又はＣＨＡＰＳは細胞を溶かし、細胞骨格、不溶性核タンパク質及び他の疎水性タンパク質を抽出する（Ｒａｍｓｂｙら、１９９４）。
【００６０】
以下の非制限的な実施例によって本発明をさらに記載する。全ての実施例に関して、適切な対照反応が当業者によって容易に設計される。
【実施例】
【００６１】
（実施例Ｉ）
プロテアーゼ保持及び放出細胞生命力多重化アッセイ
生存細胞及び死細胞のアッセイは、特定の化学的、生物学的又は物理学的処理に応答する細胞生命力の変化を調べるために広く使用されている。生命力と細胞毒性アッセイは一般に逆のものであり、異なるバイオマーカーを測定する。細胞毒性による細胞生命力の一般的変化を評価するための方法は、歴史的に外膜透過性の変化と関連づけられてきている。害された膜構造を検出する古典的方法には、トリパンブルー排除、核酸染色、及び乳酸デヒドロゲナーゼ放出がある（Ｒｉｓｓら、２００４；Ｍｙｅｒｓら、１９９８）。細胞の機能又は増殖を評価するためのアッセイには、トリチウム化チミジンの取り込み、ＡＴＰ含有量、テトラゾリウム色素変換又はフルオレセインジアセテートがある（Ｃｏｏｋら、１９８９）。無処理の細胞膜は、大きな帯電分子又はペプチドを細胞外空間からサイトゾル中に進入させないと仮定する。逆に、損傷した膜は、色素又は化合物を細胞中に、或いは細胞成分を細胞外に自由に透過させる。この透過現象は、色素標識（「不可欠な」色素、ＤＮＡ挿入剤又はエステラーゼ修飾フルオレセイン）とＬＤＨ放出アッセイの両方に基づくものである。
【００６２】
細胞生命力を測定するための既存の技法は依然として有用でコスト効率が良い適用例であるが、これらの技法には高含有量、多重化又は高スループット形式においてそれらの有用性を制限する、幾つかの技術的又は実施上の欠点がある。例えば、ＬＤＨ放出（ＣｙｔｏＴｏｘ−ＯＮＥ（商標））又は色素還元能力（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂ１ｕｅ（商標））による細胞膜完全性の現在の測定法は、共通のレサズリン基質及び重複するＥｘ／Ｅｍスペクトルのために、一対（データを標準化するための手段）にすることができない。さらに、両方のアッセイで使用した着色レサズリン基質は、第２アッセイのシグナルウインドウ強度（及び感度）及び他の終点アッセイ測定を制限し（消色）、濃度及び形式は第２アッセイの試薬対用に最適化されていない（例えば体積が制限されている）。
【００６３】
既存の生存／死細胞形式はカルボキシフルオレセイン及びエチジウムホモ二量体を使用し、後者は知られている強力な突然変異原である。その形式は、細胞培養培地の洗浄及び置換を必要とする。さらに、カルボキシフルオレセインは水溶液中で自発的加水分解を示し、ＤＮＡを染色するエチジウムホモ二量体の挿入は下流部門データの標準化に干渉する可能性がある。
【００６４】
培養した哺乳動物細胞は、プロテアーゼ、エステラーゼ、リパーゼ、及びヌクレアーゼが豊富な環境を含む。例えば、４つの一般的なクラスのプロテアーゼ（アスパラギン酸、システイン、セリン、及び金属依存性）が示され、これらは恒常性維持の特異的機能と関連する。これらのサイトゾル、リソソーム及び膜貫通型結合プロテアーゼは、細胞内タンパク質分解、免疫原性ペプチドの生成、翻訳後修飾、及び細胞分裂と関連する（Ｔｒａｎら、２００２、Ｃｏｎｓｔａｍら、１９９５、Ｖｉｎｉｔｓｋｙら、１９９７）。これらの酵素の活性は、特異的区画化を含めた様々なメカニズムによって制御される（Ｂｏｎｄら、１９８７）。極度のストレス、環境的災難、又は拘束されたアポトーシスプログラムの進行に応答して、区画化及び膜完全性の対応した消失が観察される（Ｓｙｎｔｉｃｈａｋｉら、２００３、Ｈａｕｎｓｔｅｔｔｅｒら、１９９８）。したがって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞モデルにおける細胞培養培地中への安定状態のタンパク質分解メディエーターの放出は、細胞死の考えられる代替を表す。逆に、保持されたタンパク質分解酵素の細胞酵素染色は、細胞の健康状態の表現型の観察結果と平行する。まとめると、このようなタンパク質分解活性は、細胞培養集団、例えば「生存／死亡」アッセイにおいて生存又は損傷細胞の相対数の確認を手助けすることができる。
【００６５】
プロテアーゼベースの生存／死亡細胞アッセイに関して、一実施形態では、（死細胞の）一基質は、サイトゾルｐＨ、例えば７．０〜７．２において安定状態で活性がありスペクトルが明確である読み取り値（Ｒ／Ｏ）を有する標識を有する、比較的多量の、活性がある保存プロテアーゼの基質である。その基質の切断の動態はＬＤＨ放出と平行し、活性条件は毒性又は膜改変物質、例えば塩又はチオールを含まず、迅速なアッセイ時間をもたらすことが好ましい。（生存細胞の）他の基質は、比較的多量の保存プロテアーゼの基質であり、生存細胞に関して細胞透過性であり、プロテアーゼは生存細胞のサイトゾル環境中では活性があるが、細胞外環境では不安定である。その基質はスペクトルが明確であるＲ／Ｏを有する標識を有しており、迅速なアッセイ時間をもたらすように切断反応が進行する。非破壊アッセイにおいて２つの基質を使用することによって、望ましくない増殖事象を検出することができ、異なるスペクトルで相補的且つ別個の代替を使用するため、誤った結論を減らすことができ、細胞凝集による誤り又はピペッティングの誤りを減らすことができる。何故なら生命力と細胞毒性の比は、そのウエル中の細胞数の変動とは無関係だからである。
【００６６】
Ａ．ＡＭＣ又はＲ１１０蛍光又はアミノルシフェリン発光レポーターを用いるプロテアーゼ放出アッセイ形式
ＨＬ−６０細胞を２倍に連続希釈し、次いでＴｒｉｔｏｎ Ｘを加えることによって０．２％の最終濃度まで溶かし、或いは賦形剤を加えることによって維持した。１００ｍＭの酢酸ナトリウム溶液、ｐＨ４．５に溶かした１０分の１体積の２００μＭのＡｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−ＡＭＣ基質を溶解物又は細胞に加え、さらに１時間３７℃でインキュベートした。溶解又は生存細胞と関係があった蛍光を、次いでＣｙｔｏＦｌｕｏｒＩＩを使用してＥｘ．３６０Ｅｍ．４６０で測定した。
【００６７】
活発に倍加していたジャーカット細胞をトリパンブルー排除によって計数すると、９５％を超えて生存していたことが分かった。細胞はＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ中に１ｍｌ当たり１００，０００個の細胞に調節し、２つの等分試料に分けた。１つの等分試料は、３×５秒間のパルスで３０％の動力において、マイクロチップを備えるＭｉｓｏｎｉｘ３０００を使用して超音波処理した。他方の分画は、超音波処理手順中３７℃の水浴中でインキュベートした（合計約５分間）。次いで細胞懸濁液と溶解物分画を、０〜１００％の生命力を表す比に混合することによって様々な生命力の細胞に配合した。配合した細胞試料は、次いで白壁透明底の９６ウエルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に１００μｌ体積で加えた。（Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ）２−Ｒ１１０はＲＰＭＩ−１６４０中に１０００μＭに希釈し、１０分の１体積でプレートに加えた。ＣｙｔｏＦｌｕｏｒＩＩを使用してＥｘ．４８５Ｅｍ．５３０で蛍光を測定する前に、プレートを３０分間インキュベートした。
【００６８】
活発に倍加していたジャーカット細胞をトリパンブルー排除によって計数すると、９５％を超えて生存していたことが分かった。細胞はＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ中に１ｍｌ当たり１００，０００個の細胞に調節し、２つの等分試料に分けた。１つの等分試料は、３×５秒間のパルスで３０％の動力において、マイクロチップを備えるＭｉｓｏｎｉｘ３０００を使用して超音波処理した。他方の分画は、超音波処理手順中３７℃の水浴中でインキュベートした（合計約５分間）。次いで細胞懸濁液と溶解物分画を、０〜１００％の生命力を表す比に混合することによって様々な生命力の細胞に配合した。配合した細胞試料は、次いで白壁透明底の９６ウエルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に１００μｌ体積で加えた。発光プロテアーゼ放出アッセイ試薬は、ルシフェリン検出試薬の塊（ＰｒｏｍｅｇａＶ８５９Ａ）を１０ｍｌの１０ｍＭＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．５で再水和し、その試薬にＡｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−アミノルシフェリンを１００μＭの最終濃度まで補うことによって調製した。１００μｌの発光プロテアーゼ放出アッセイ試薬をプレートのウエルに加え、ＢＭＧ ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｐｔｉｍａを使用する動態形式で発光を測定した。
【００６９】
ＡＭＣ蛍光形式の実際の感度は約２４０細胞と計算し、ＣｙｔｏＴｏｘ−ＯＮＥ（商標）に匹敵する感度値であった。Ｒ１１０形式のアッセイは同様に感度が良く、多重化用途のさらに他の蛍光団をもたらした。特に、下流部門の多重化用途におけるＣｙｔｏＴｏｘ−ＯＮＥ（商標）又は他のレサズリン系アッセイの使用の重大な障害である蛍光の消滅なしで、これらのアッセイから感度を得た。この発光形式の正確な直線性及び範囲は、９８００の生存細胞集団においてわずか２００細胞の統計的検出を可能にした。非溶解性発光形式は、細胞毒性検出用の他の代替を与える。
【００７０】
Ｂ．異なる酵素標的を用いるプロテアーゼ放出アッセイ形式
活発に倍加していたＨＬ−６０細胞を１ｍｌ当たり１００，０００個の細胞に調節し、２つの等分試料に分けた。１つの等分試料は、３×５秒間のパルスで３０％の動力において、マイクロチップを備えるＭｉｓｏｎｉｘ３０００を使用して超音波処理した。他の等分試料は３７℃に保った。次いで細胞懸濁液と溶解物を、ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ中１００μｌ体積に２倍に連続希釈した。培地は無細胞対照としてのみ働いた。ルシフェリン検出試薬の塊（ＰｒｏｍｅｇａＶ８５９Ａ）は、２．０ｍｌの１０ｍＭＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．５で再懸濁させた。次いでルシフェリン検出試薬を分離して、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−アミノルシフェリン又はＡｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−アミノルシフェリンのいずれかを用いて１ｍＭにした。各試薬を別個の反復実験のプレートに１０分の１体積で加え、ＢＭＧ ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｐｔｉｍａを使用する発光測定前に、Ｍｅ’Ｃｏｕｒサーマルジャケット付き水浴ホルダー中で３７℃において１５分間インキュベートした。
【００７１】
Ｚ−ＬＬＶＹ−アミノルシフェリン（配列番号１）アッセイは、ＡＡＦ−アミノルシフェリン配列ほど最適には働かなかったが、他のプロテアーゼを完全性が損なわれた代替として使用することができることは実証された。この場合、ＬＬＶＹ（配列番号１）の活性は、プロテアソームのキモトリプシン活性に原因がある可能性がある。
【００７２】
Ｃ．プロテアーゼ放出の時間行程
透明底白壁の９６ウエルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）中で５％ＣＯ２３７℃において７時間の時間行程で、ＨＬ−６０細胞（２５，０００／ウエル）を１０μＭのスタウロスポリンで処理し、或いはＤＭＳＯ賦形剤対照と競合させた。２００μＭのＡｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−ＡＭＣ基質溶液を、１００ｍＭの酢酸ナトリウム溶液、ｐＨ４．５中に作製した。１０μｌ体積の基質（１０分１体積の試料）をウエルに加え、さらに１時間インキュベートした。「プロテアーゼ放出」活性は、ＣｙｔｏＦｌｕｏｒＩＩにおいてＥｘ．３６０Ｅｍ．４６０で測定した。平行した組のウエル中では、ＣｙｔｏＴｏｘ−ＯＮＥ（商標）試薬が膜完全性アッセイの対照として働いた。Ｅｘ．５６０Ｅｍ．５８０での蛍光の測定前に、この試薬を１０分間加えた。
【００７３】
細胞透過の動態、即ちＬＤＨ及びプロテアーゼ放出は互いを反映し、細胞集団中の二次的な壊死の形態観察と一致した。酸性酢酸ナトリウム配合物（試料中の最終ｐＨ約６．５）中でアミノペプチダーゼ基質の提示を実施して、考えられるリソソームプロテアーゼ活性を適応させた。
【００７４】
Ｄ．プロテアーゼ放出活性のｐＨ要件
プロテアーゼ放出活性のｐＨ要件を、ｐＨ２．５、３．５、及び４．５に調節した１００ｍＭの酢酸ナトリウムを使用して調べ、非調節培養培地（水媒体）と比較した。Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−ＡＭＣはこれらのバッファーに２００μＭまで加えた。１０分１体積の溶液をプレートに加え、回転攪拌によって軽く混合した。プレートは３７℃で４０分間インキュベートし、次いでＣｙｔｏＦｌｕｏｒＩＩを使用してＥｘ．３６０Ｅｍ．４６０で蛍光を測定した。
【００７５】
１０分１体積の酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５を加えることによって、培養培地が約６．５の最終ｐＨに低下した。最終ｐＨの他の低ｐＨ溶液／培地の組合せは試験しなかったが、前の実験は、１０分１体積のｐＨ２．５の酢酸ナトリウムを加えることによって、細胞培地のｐＨが約５．５に低下したことを示唆した。非ｐＨ調節媒体が、プロテアーゼ放出活性に最も好ましいことが証明されたことが分かった。この活性はサイトゾルアミノペプチダーゼと一致し、おそらくリソソームプロテアーゼ（カテプシンなど）とは一致しない。プロテアーゼ放出活性を測定するのに有害又はおそらく細胞毒性である付属物は必要とされないので、このことは有意である。これはインキュベーション時間枠のさらなる柔軟性を与え、考えられる発光ベースのアッセイにより影響を受けやすい。
【００７６】
Ｅ．プロテアーゼ放出酵素亜細胞レベルの位置
ＨＬ−６０細胞は１ｍｌ当たり１００，０００個の細胞に調節し、２つの等分試料に分けた。１つの等分試料は、３×５秒間のパルスで３０％の動力において、マイクロチップを備えるＭｉｓｏｎｉｘ３０００を使用して超音波処理した。（形態によって確認した）この溶解物１００μｌを透明底の９６ウエルプレートの多数のウエルに加え、ＲＰＭＩ１６４０及び１０％ＦＢＳ中に２倍に連続希釈した。同様に、１００μｌの非超音波処理細胞の懸濁液を加え、プレートの多数のウエルに連続希釈した。それぞれ０．２％及び３０μｇ／ｍｌの最終濃度にウエルを分離するために、ＮＰ−９及びジギトニンを加えた。未処理対照は、生命力のある細胞及び調節した体積の水媒体からなっていた。ルシフェリン検出試薬の塊（ＰｒｏｍｅｇａＶ８５９Ａ）を２ｍｌの１０ｍＭＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．５で再水和し、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−アミノルシフェリン（Ｐｒｏｍｅｇａ）で５００μＭにした。２０μｌのこの発光前プロテアーゼ放出溶液を全てのウエルに加え、ＢＭＧ ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｐｔｉｍａを使用して１５分間３７℃でインキュベートした後に発光を測定した。
【００７７】
ＮＰ−９、及び前述のパラメーター及び濃度を用いた超音波処理は、（カテプシン放出により測定して）外膜だけでなく、リソソーム含有物も破壊することが知られている。ジギトニンによる選択的破壊はトリパンブルー染色を可能にするが、リソソーム破裂の証拠は存在しない。したがって、超音波処理又は差別的な界面活性剤による溶解の間の活性は同様であったので、且つｐＨの最適条件を一緒に考えて、プロテアーゼ放出アッセイにおいて測定したプロテアーゼは、おそらくサイトゾル及び無処理のオルガネラの外側に存在すると推測することができた。
【００７８】
Ｆ．プロテアーゼ放出又は保持、酵素の基質選択性
Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−ＡＭＣはＰｒｏｍｅｇａから入手した。Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−アミノルシフェリン（配列番号１）、Ｚ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−アミノルシフェリン、Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−アミノルシフェリン、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−アミノルシフェリン、（Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ）２−Ｒ１１０（（Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ）２；配列番号１２）、及び（Ｇｌｙ−Ｐｈｅ）２−Ｒ１１０（Ｇｌｙ−Ｐｈｅ）２；配列番号１３）は、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって合成された。Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−ＡＭＣ、Ｈ−Ｐｈｅ−ＡＭＣ、ＨＴｙｒ−ＡＭＣ、グルチル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−ＡＭＣ（グルチル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ；配列番号１４）、Ｈ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−ＡＭＣ、Ｚ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−ＡＭＣ、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＡＭＣ（配列番号１）、Ｄ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ＡＭＣ、Ｈ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−ＡＭＣ、Ｈ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＡＭＣ、Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−ＡＭＣ、Ｚ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＡＭＣ（Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ；配列番号１５）、Ｚ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＡＭＣ（Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ；配列番号１６）及びＡｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−ＡＭＣは、Ｂａｃｈｅｍから供給された。Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−ＡＦＣ、Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＡＭＣ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＡＭＣ、及びＳｅｒ−Ｔｙｒ−ＡＦＣはＣａｌｂｉｏｃｈｅｍから入手した。Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＡＭＣ及びＳｕｃ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＡＭＣ（Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ；配列番号１７）はＳｉｇｍａから購入した。
【００７９】
全ての基質を、固有の溶解性に応じて１０〜１００ｍＭでＤＭＳＯに溶かした。蛍光基質は１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．５又は１０％血清を含む調節した細胞培養培地中に１００μＭ〜１ｍＭで希釈し、白壁透明底の９６ウエルプレート中の溶解（凍結割断、超音波処理、又は界面活性剤）又は未処理の生命力のある細胞に１０分の１体積で加えた。ＨＬ−６０又はジャーカット細胞を、その容易に操作可能な懸濁培養中の表現型のため実験中交換して使用した。ＣｙｔｏＦｌｕｏｒＩＩによって蛍光を測定する前に、プレートは３７℃で１５〜３０分間インキュベートした。
【００８０】
発光基質をルシフェリン検出試薬の塊（ＰｒｏｍｅｇａＶ８５９Ａ）に加え、２ｍｌの１０ｍＭＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．５に５００μＭまで再懸濁した。５分１体積の発光前反応混合物を、白壁透明底の９６ウエルプレート中の溶解（凍結割断、超音波処理、又は界面活性剤）又は未処理の生命力のある細胞に加えた。再度、ＨＬ−６０又はジャーカット細胞を実験中交換して使用した。Ｃａｒｏｎ２０５０Ｗ交換ユニットによって制御されるＭｅＣｏｕｒの循環熱ブロックにおいて、３７℃でプレートをインキュベートした。発光は１５分と３０分の間（シグナル定常状態）で測定した。
【００８１】
広く様々なタンパク質分解性基質を、傷害状態又は生命力のある細胞中のプロテアーゼ放出又は保持に関する考えられる基質優先性を特徴付けるための作業において調べた（表３参照）。アミノ末端阻害基質（Ｚ、Ｓｕｃ−、又はＡｃ−）を選択して、エンド又はエクソペプチダーゼ活性が優性であったかどうかを示した。非阻害基質（Ｈ−など）を調べて、アミノペプチダーゼ活性の貢献を含めて考えた。この表から、少なくとも３つのタンパク質分解プロファイル：非阻害Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅトリペプチドを好むアミノペプチダーゼ様活性、阻害Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ（配列番号１）ペプチドの放出によって測定したプロテオソーム（キモトリプシン様）活性、及びＧｌｙ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ−Ａｌａ、Ｐｈｅ−、Ｔｙｒ−又はＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ基質による非常に不安定な活性が明らかになった。後者の活性は、生命力のある無処理の細胞中でのみ測定可能であった。さらに重要なのは、幾つかの蛍光団又は発光前標識を使用してこれらの活性を検出することができ、最終的に増大した下流部門の多重化の柔軟性を与えることができることである。
【表３】
【００８２】
Ｇ．多重化プロテアーゼ放出及び保持アッセイ
１．ジャーカット細胞の用量応答性
活発に倍加していたジャーカット細胞を、５０μｌ体積中に２０，０００細胞／１ウエルの細胞密度で９６ウエルプレートに接種した。ＲＰＭＩ１６４０に希釈したアポトーシス誘導リガンド、ｒＴＲＡＩＬの連続希釈液を、他の５０μｌ体積中に２５０ｎｇ〜２４４ｐｇ／ｍｌの最終濃度で各ウエルに加えた。ＲＰＭＩは非誘導対照としてのみ働いた。プレートは４時間の間５％ＣＯ２中で３７℃においてインキュベートした。Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−ＡＦＣ及びＡｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−ＡＭＣは同時にＲＰＭＩ中に１ｍＭに希釈し、１０分の１体積でプレートに加え、３７℃においてさらに３０分間インキュベートした。生成した蛍光は、ＣｙｔｏＦｌｕｏｒＩＩを使用してＥｘ３６０Ｅｍ４６０及びＥｘ４０５Ｅｍ５３０で測定した。蛍光測定を終えた後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）を等しい添加でウエルに加え、ＢＭＧ ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｐｔｉｍａを使用して発光を測定した。
【００８３】
細胞健康状態の２つの別個の非破壊的代替（プロテアーゼ放出及び保持）を多重化させて、マイクロタイタープレート形式で集団の生命力を調べた（参照として本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００２１５８を参照）。生成するデータは、その細胞集団の健康状態の逆の指標である。この関係は対照の使用を可能にし、一定レベルの標準化をもたらす。さらに、生命力の第３の指標（ＡＴＰ含有量）を干渉又は消光なしで連続多重化形式に加えて、データの解釈においてさらなる信頼性を与えることができる。
【００８４】
２．ＳＫ−ＭＥＬ−２８及びＡＣＨＮ細胞
ＳＫ−ＭＢＬ−２８又はＡＣＨＮ細胞を１００μｌ体積中に１０，０００細胞／１ウエルの細胞密度で白壁透明底の９６ウエルプレート中に接種し、２時間の間５％ＣＯ２中で３７℃において接着させた。接着後、５０μｌの培地を注意深く除去し、ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳにイオノマイシン又はスタウロスポリンのいずれかを希釈した連続希釈液と交換した。培地は対照としてのみ働いた。プレートはさらに５時間インキュベートした。Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−ＡＦＣの１ｍＭ溶液をＭＥＭ中に作製し、１０分の１体積でウエルに加えた。生成した蛍光は、ＣｙｔｏＦｌｕｏｒＩＩを使用して測定した。カスパーゼ−Ｇｌｏ（商標）３／７試薬を次いで加え、ＢＭＧ ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｐｔｉｍａを使用して発光を測定した。
【００８５】
プロテアーゼ保持基質はウエル中で一般的な生命力を示し、一方カスパーゼ特異的試薬は特異的経路の細胞毒性を示した。この点において、カスパーゼ活性化（及びしたがってアポトーシス誘導）はＳＫ−ＭＥＬ−２８においてスタウロスポリンを用いて明らかであり、一方イオノマイシンは壊死型プロファイルと似ている。アポトーシスのプロファイルも、スタウロスポリンで処理したＡＣＨＮに関して観察する。
【００８６】
３．ＨｅＬａ細胞及びタモキシフェン処理
ＨｅＬａ細胞を１００μｌ体積中に１０，０００細胞／１ウエルの細胞密度で白壁透明底の９６ウエルプレート中に接種し、２時間の間５％ＣＯ２中で３７℃において接着させた。接着後、５０μｌの培地を露出時間の２４、７、５、３、１及び０時間で注意深く除去し、ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳに溶かした５０μＭのタモキシフェンと交換した。培地は対照としてのみ働いた。プロテアーゼ保持及び放出試薬は、ルシフェリン検出試薬の塊を２ｍｌの１０ｍＭＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．５で再水和することによって調製した。次いでこの溶液を、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−アミノルシフェリンとＧｌｙ−Ｐｈｅ−ＡＦＣの両方を用いて５００μＭにした。５分１体積の溶液を全てのウエルに加え、Ｍｅ’Ｃｏｕｒサーモユニット中で３７℃において１５分間インキュベートした。発光はＢＭＧ ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｐｔｉｍａによって測定し、蛍光はＣｙｔｏＦｌｕｏｒＩＩを使用して測定した。
【００８７】
この実施例は、混合型形式（蛍光と発光）が、設計したプロテアーゼ保持及び放出アッセイにおいて可能であることを実証する。これらの試薬が非溶解性であり明らかに非毒性であることは注目に値し、Ａｐｏ−ＯＮＥ（商標）アッセイによるカスパーゼ−３／７検出などのスペクトルによって明確である他の下流部門用途に、これらの試薬を施しやすいことを示唆する。
【００８８】
４．ＤＮＡ染色を用いた生存／死亡細胞のプロテアーゼアッセイの使用
ＨｅＬａ又はＨｅｐＧ２細胞を１００μｌ体積中に１０，０００細胞／１ウエルの細胞密度で白壁透明底の９６ウエルプレート中に接種し、２時間の間５％ＣＯ２中で３７℃において接着させた。接着後、５０μｌの培地を注意深く除去し、ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳにタモキシフェン又はイオノマイシンのいずれかを希釈した連続希釈液と交換した。培地は対照としてのみ働いた。これらの化合物と共にインキュベーションをさらに５時間続けた。プロテアーゼ保持及び放出試薬は、ルシフェリン検出試薬の塊（ＰｒｏｍｅｇａＶ８５９Ａ）を２ｍｌの１０ｍＭＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．５で再水和することによって調製した。次いでこの溶液を、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−アミノルシフェリンとＧｌｙ−Ｐｈｅ−ＡＦＣの両方を用いて５００μＭにした。５分１体積の溶液を全てのウエルに加え、Ｍｅ’Ｃｏｕｒサーモユニット中で３７℃において１５分間インキュベートした。発光はＢＭＧ ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｐｔｉｍａによって測定し、蛍光はＣｙｔｏＦｌｕｏｒＩＩを使用して測定した。次に、残存していた生命力のある細胞を０．４％のＮＰ−９洗浄剤を加えることによって溶かした。回転式攪拌機によって軽く混合した後、ＭＥＭにＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を希釈した１：２０希釈液を、さらに１０分の１体積で加えた。ＤＮＡ／色素結合と関係があった蛍光は、ＣｙｔｏＦｌｕｏｒＩＩを使用してＥｘ．４８５Ｅｍ．５３０で測定した。
【００８９】
この実験は、スクリーニング向きの２つの他の接着細胞型に対するプロテアーゼに基づく生命力の試験の有用性を広げるだけでなく、ＤＮＡ染色によって「全体の」測定値を得る。スペクトルの違い及び混合形式の読み出しのため、全ての測定値は非干渉性で非消光性である。
【００９０】
考察
薬剤発見と基礎研究の尽力の両方が、一層精巧な細胞モデル系を利用し続けている。実験操作後のこれらのｉｎ ｖｉｔｒｏ系における、細胞数及び生命力を測定するための絶対的必要性は十分理解されている。この要件は測定の有効性を検証し、複雑な生物系の文脈内でこれらの応答を標準化するのに必要である。
【００９１】
残念ながら、細胞の生命力及び細胞毒性を定義するための現在の化学は、生物研究の新たな方法及び技法に追いついておらず、したがって限られた実験オプションを有する。例えば、アッセイ多重化、即ち同一ウエルにおける組合せアッセイの出現によって、アッセイ性能を著しく低下させない適合性がありスペクトルで区別するアッセイの組合せに関する要件が必要とされてきている。細胞健康状態の一般的な相補的な測定法と、カスパーゼ活性化又はレポーター遺伝子の調節などのより特異的な事象を結び付ける点において、この義務は特に重要である。
【００９２】
細胞の生命力及び／又は細胞毒性レポーターを測定するための前述の方法は、多くの下流部門のアッセイ用途と適合性がある。これは分岐励起及び発光スペクトルを有する別個の蛍光団によって、或いは発光などの他のレポーター形式を組み込むことによって実施する。終点測定のアッセイウインドウの柔軟性を与える非溶解性でおそらく非毒性である環境中で、これを実施することは注目に値する。さらに、この技術はスループット、小型化及び自動化を適応させるほど充分感度が良くコスト効率が良い。様々なアッセイによって与えられる利点の比較は表４中に与える。
【００９３】
【表４】
【００９４】
結論として今日まで、哺乳動物プロテアーゼの試験における公開済みの尽力のバランスは、主に容易に精製、分泌、或いは分泌精製されるプロテアーゼを中心に考えられている。これらの試験から与えられる情報はタンパク質分解機構、構造及び機能の見識を与えているが、プロテオミクスの予想から推測されている以外の他のプロテアーゼに関しては、ほとんど知られていない。
【００９５】
ますます多くの証拠が、幾つかのサイトゾルプロテアーゼは、細胞恒常性の機構と関連することを示唆している。プロテアソームはサイトゾルペプチドの遊離と明らかに関係があるが、幾つかの発見は、他の保存的サイトゾルプロテアーゼの役割を示唆している（Ｖｉｔｉｔｓｋｙら、１９９７；Ｃｏｎｓｔａｍら、１９９５）。
【００９６】
本明細書に記載する、個々のプロテアーゼアッセイ及びプロテアーゼベースの生存／死亡細胞のアッセイは、スペクトルの違いのため多重化に関して一層柔軟であり、アッセイの相補性又は他の終点アッセイの組合せ、例えばＡＭＣ、ＡＦＣ、Ｒ１１０、クレシルバイオレット又は発光、色素による消光なし、体積制限なし、逆方向工学処理なしのアッセイの化学的性質、短いインキュベーション時間、同様又はより良い実用感度（スクリーニング環境中の細胞生命力の変化の割合）、下流部門のＤＮＡ結合による干渉がないアッセイ、及び洗浄又は遠心分離の必要がないアッセイ、例えば同種間アッセイをもたらす。さらに、プロテアーゼの基質は比較的単純であってよく、例えばジ又はトリペプチドは、よく知られている化学法によって蛍光又は発光基質と結合させ、非毒性及び／又は非突然変異誘発性、安定性基質を様々な形式で、例えばＤＭＳＯ中又は乾燥中で与えることができる。
【００９７】
（実施例ＩＩ）
プロテアソーム活性の細胞ベースのアッセイ
材料及び方法
プレート調製
ＮＣＩ−Ｈ２２６細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−５８２６）を、ＲＰＭＩ１６４０（Ｓｉｇｍａ番号Ｒ−８００５）及び１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ番号ＳＨ３００７０）を使用して付着線として保ち、必要に応じて継代した。ジャーカット細胞、ＨＬ−６０及びＵ９３７懸濁細胞系も同様に保ち、継代した。細胞ベースのプロテアソームアッセイ用の細胞を調製するために、接着細胞は培地を除去し、Ｄ−ＰＢＳでフラスコを洗浄することによって親フラスコから採取し、３７℃で３〜４分間トリプシン−ＥＤＴＡ（ＳｉｇｍａＴ−４０４０）と共にインキュベートした。トリプシン反応は血清を含む完全培地を加えることによって停止させ、次いで細胞は２００×Ｇで４分間遠心分離にかけた。細胞ペレットは新たな培地に懸濁させ、トリパンブルー排除によって細胞を計数し、１．１１×１０５個細胞／ｍｌに調節した。９６ウエルの透明底／白壁プレート（Ｃｏｓｔａｒ番号３６１０）を入手し、９０μｌ／ウエルの細胞懸濁液又は培地のみを分注した。接着細胞に関して一晩３７℃において、加湿した５％ＣＯ２インキュベーター中でプレートを培養した。懸濁細胞は薬剤処理前に約１．５時間平衡状態にした。
【００９８】
薬剤添加
ラクタシスチン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ番号０３−３４−００５１）を水中に５ｍＭに最初に懸濁させ、これを使用して細胞に加えるための濃縮希釈液を調製した。ラクタシスチンの１０×濃縮希釈液を、１０μｌ／ウエルの添加後の最終濃度が０〜２５μＭの範囲になるように培養培地に調製した。連続希釈液を調製して、一連の中間希釈液を得た。他の阻害剤、カルペプチン及びＡｄａＡｈｘ３Ｌ３ＶＳ（アダマンタン−アセチル−（６−アミノヘキサノイル）３−（ロイシニル）３−ビニル−（メチル）−スルホン）などのストックを、同様に調製し希釈した。細胞ベースの阻害用に、薬剤をウエルに加え（１０μｌ／ウエル）、次いでプレートを、プレート攪拌機において６０秒間攪拌することによって軽く混合させた。プレートを３７℃のインキュベーターに１．５時間戻して、薬剤を細胞に進入させた。
【００９９】
２×試薬の調製
試薬は以下のように調製した：ルシフェリン検出試薬（Ｐｒａｍｅｇａ番号Ｖ８５９Ａ）を
１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６、ＫＯＨを使用して調節）（ＳｉｇｍａＨ４０３４）
１ｍＭのＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）
６０ｍＭのＭｇＳＯ４（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ番号Ｍ６３−５００）
４０μｇ／ｍｌのジギトニン（ＳｉｇｍａＤ−１４１）で懸濁させた。
【０１００】
ルシフェリン検出試薬（ＬＤＲ）は、還元したとき以下のものを含む：
０．６％のＰｒｉｏｎｅｘ（Ｐｅｎｔａｐｈａｍａ、Ｂａｓｅｌ、スイス）
０．４ｍＭのＡＴＰ
１００μｇ／ｍｌの組換えルシフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｅ１４０Ｘ）
２Ｕ／ｍｌの無機ピロリン酸
【０１０１】
例えば、Ｖ８５９Ａ（ルシフェリン検出試薬）の１つのバイアルを１０ｍｌのバッファーで懸濁させ、それに５０〜１００μの基質を加え、１００μｌの細胞を１００μｌの基質含有試薬と組み合わせる。アミノルシフェリン系基質用に、プレインキュベーションステップを使用することができる。例えば、４０μＭ又は８０μＭのＳｕｃ−ＬＬＶＹ−アミノルシフェリン（Ｐｒｏｍｅｇａ；配列番号１）プロテアーゼ基質を還元ＬＤＲに加えて、３０分間２２℃でインキュベートした。このプレインキュベーションは基質中に存在する遊離アミノルシフェリンを枯渇させ、これによって考えられるバックグラウンド発光を低下させる。
【０１０２】
細胞への添加
様々な濃度のラクタシスチン又は他の阻害剤で１〜２時間、例えば１．５時間処理した細胞を含む細胞培養プレートをインキュベーターから除去し、３０分間２２℃で平衡状態にして、均一に中身を平衡状態にした。等しい体積（１００μｌ／ウエル）の試薬を各ウエルに加え、１分間回転式プレート攪拌機を使用してプレートを混合した。次いでアッセイプレートは、水浴を使用して２２℃に保った。発光読み取りのために、発光はＤＹＮＥＸ＠ＭＬＸ照度計を使用して経時的に測定し、プレートはそれぞれの読み取り後に２２℃の水浴に戻して、一定温度を保った。
【０１０３】
結果
発光基質を使用して、プロテアソームのキモトリプシン様（ＬＬＶＹ；配列番号１）、トリプシン様（ＬＲＲ）及びカスパーゼ様（ｎＬＰｎＬＤ；配列番号２）活性を、これらの活性に対して影響がある様々な量の細胞透過性プロテアソーム阻害剤（ＡｄａＡｈｘ３Ｌ３ＶＳ；図１）を用いた処理後に検出した。細胞は１．５時間培養して、阻害剤を細胞に進入させ、プロテアソームと結合させた。短時間のインキュベーション（１〜２時間）は細胞に対して毒性はなかったが、長時間のインキュベーション時間はアポトーシスを誘導したことが分かった。
【０１０４】
基質をジギトニンと共に、甲虫ルシフェラーゼ介在反応の反応混合物に加えた。ジギトニンの濃度は、原形質膜を選択的に透過し、一群のプロテアーゼを放出するはずである他のオルガネラ、特にリソソームを害さずにサイトゾル分子へのアクセスを可能にするように選択した。選択的透過は培地除去後に無血清条件下で典型的には行い、ジギトニンによる血清干渉を最小にするが、以下に記載するように、血清含有培地中で選択的透過を実施することもできる。さらに、ジギトニン抽出の有効性はＥＤＴＡによって改善され、これは他のプロテアーゼ、特にカルパインの活性を最小にするのを助ける可能性もある（図１２参照）。これらの結果は、ＬＬＶＹ（配列番号１）基質は広い動的範囲を有していたことを示す。
【０１０５】
ラクタシスチンは、哺乳動物プロテアソームサブユニットＸ（ＭＢ１）の高度に保存されたアミノ末端スレオニンと共有結合し、それを修飾するＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓの代謝産物である（Ｍｅｌｌｇｒｅｎ、１９９７；Ｆｅｎｔｅａｎｙら、１９９５）。精製カルパインＩに対するラクタシスチンの影響は、図２Ａ中に示す。これらの結果は、ラクタシスチンはカルパインＩに対して最小の影響があり、カルシウムを活性化することを必要とすることを示す。ＨＬ−６０細胞におけるプロテアソーム活性に対するカルパインＩの阻害剤、カルペプチンの影響は図２Ｂ中に示す。カルペプチンは、ラクタシスチンと対照的に、１．５時間の処理後にプロテアソーム活性に対して最小の影響があった。（カルパインＩの活性を助長するための）ＤＴＴの封入によって、２０μＭでプロテアソームの不完全な阻害をもたらした。
【０１０６】
ＡｄａＡｈｘ３Ｌ３ＶＳ処理後のジャーカット細胞中のＬＬＶＹ（配列番号１）活性は、図３中に示す。ＡｄａＡｈｘ３Ｌ３ＶＳは３つ全ての活性を阻害したが、しかしながら、示された唯一の結果はＬＬＶＹ（配列番号１）活性に関するものだけである。
【０１０７】
それぞれアミノルシフェリン−ＬＬＶＹ（配列番号１）基質及びＬＬＶＹ−ＡＭＣ（配列番号１）基質を用いた、発光及び蛍光アッセイ（図４Ａ〜Ｂ）は、最大発光感度に約１０〜１５分で達し、その後シグナルは低下したが、一方で蛍光感度は１〜３時間までの間増大したことを示した。
【０１０８】
ＬＬＶＹ（配列番号１）活性に関する発光アッセイの直線性及び動態を測定した（図５Ａ〜Ｃ）。試験した条件下で、細胞数に関して全時間地点でアッセイは直線的ではなかったが、プロテアソームアッセイ条件を、アッセイ混合物中のＭｇ及び／又は基質濃度を増大させることによって改善して、プロテアソームを安定化させる、活性を増大させる、且つ／或いは長時間の発光又は「白熱光」をアッセイに与えることができる。
【０１０９】
図６Ａ〜Ｂは、Ｕ９３７（Ａ）及びＨＬ−６０（Ｂ）細胞中でのラクタシスチンによる経時的な発光の阻害を示す。類似したＩＣ５０値を広い枠で得た。
【０１１０】
図７Ａ〜Ｂは、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１５〜３０μｇ／ｍｌのジギトニンを含む培地におけるラクタシスチンで処理した同じプレートの多数の読み取り値を示す。細胞が５％又は１０％ウシ胎児血清のいずれか中に存在したとき、様々な低濃度でジギトニンは細胞を透過し、ほぼ全体のプロテアーゼ活性がラクタシスチンによって阻害され続けた。
【０１１１】
ジギトニンの存在下又は不在下での（０及び２０μｇ／ｍｌのジギトニン）様々な濃度のラクタシスチンで処理したＨＬ−６０細胞又はＵ９３７細胞中での、プロテアソームキモトリプシン活性の比較を図８Ａ〜Ｂ中に示す。試験したラクタシスチンの濃度において、（ＡＴＰアッセイ、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（登録商標）、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩにより測定して）薬剤処理によって細胞を殺傷することはなかった。
【０１１２】
発光プロテアソーム基質及び蛍光（Ｒ１１０）カスパーゼ−３基質を使用した多重化アッセイの結果は、図９中に示す。細胞はラクタシスチンで長時間処理して、カスパーゼ活性を誘導した。グラフは、発光プロテアソーム基質を含む試薬中に存在する蛍光カスパーゼ基質ありとなしで、類似したプロテアソーム阻害曲線を得たことを示し、プロテアソーム活性とアポトーシス活性の両方を測定することができることを示す。
【０１１３】
細胞ベースのアッセイ中のプロテアソーム活性を検出するのに適した、他の透過剤をスクリーニングした（図１０Ａ〜Ｃ）。低濃度の様々な界面活性剤（０．０５及び０．１％の最終濃度）を含む試薬を調製した。完全培地中に２５，０００個のＨＬ−６０細胞を含む１００μｌ／ウエルの試料を９６ウエルプレートに加え、３７℃で平衡状態にした。プレート及び試薬は２２℃に冷却し、等しい体積の試薬をそれぞれの試料に加えた。プレートは１分間攪拌し、次いで２２℃でインキュベートした。次いで発光を経時的に測定した。ＳＤＳ、ＣＨＡＰＳ、ＴＯＭＡＨ（登録商標）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０、Ｇｅｒｏｐｏｎ（登録商標）Ｔ−７７、ＢｉｏＴｅｒｇｅ及びＢｒｉｊ−３５は、プロテアソーム又はルシフェラーゼに対して負の影響を有していた。Ｔｈｅｓｉｔ（登録商標）、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（登録商標）ＴＭＮ−６、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（登録商標）ＮＰ−９、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００及びＮｏｒＩｄｅｔ−４０を含めた幾つかの界面活性剤はプロテアソーム又はルシフェラーゼ活性に実質的に影響を与えなかったが、このアッセイはＬＬＶＹ−アミノルシフェリン（配列番号１）基質を切断するプロテアーゼの供給源は示さない。
【０１１４】
図１１は、ラクタシスチン、ＬＬＶＹ−アミノルシフェリン（配列番号１）及び０．０４％のＴＭＮ−６で処理したＨ２２６細胞からの発光を示す。Ｕ９３７細胞中では０．０５％でのＴＭＮ−６は２０μｇ／ｍｌのジギトニンに匹敵したが、Ｈ２２６細胞と共に０．０４％の濃度で存在するとプロテアソームアッセイには不充分であった。Ｕ９３７細胞も１００μｇ／ｍｌのサポニンで処理したが、しかしながら、後の時間地点では発光シグナルは直線的ではなかった。
【０１１５】
Ｍｇ、ＥＤＴＡ濃度、及びｐＨを変えて反応条件を最適化した。特に、Ｍｇ濃度はキモトリプシン活性に影響を与えるようであり、且つＥＤＴＡ濃度は多数のタンパク質分解活性を変えるようである。プロテアソームを検出するための、発光又は蛍光アッセイに対するＭｇ濃度、又は発光アッセイに対するＥＤＴＡ濃度の影響に関するデータは、図１２及び１３中に示す。
【０１１６】
ｐＨ及び基質濃度を変えた結果は図１４〜１５中に示す。このデータに基づくと、高い基質濃度は半減期を明らかに改善した。
（参考文献）
【０１１７】
全ての刊行物、特許及び特許出願は、参照として本明細書に組み込まれる。前述の明細書中、その幾つかの好ましい実施形態に関して本発明を記載し、多くの詳細を例示の目的で述べてきたが、本発明は他の実施形態が可能であること、及び本明細書に記載した詳細の幾つかは、本発明の基本原理から逸脱せずに大幅に変えることができることは、当業者には明らかであるはずである。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】阻害剤処理（ＡｄａＡｈｘＬ３ＶＳ）後のＵ２６６細胞中の発光キモトリプシン、トリプシン、及びカスパーゼ様プロテアソーム活性の図である。約３５，０００個のＵ２６６細胞を１．５時間阻害剤に曝して、次いで１０μＭの基質と接触させた。
【図２Ａ】プロテアソーム又はカルパインに対するラクタシスチン活性の図である。２５ｍＭのＨＥＰＥＳ／０．５ｍＭのＥＤＴＡ／１ｍＭのＤＴＴ中での０．５時間のプレインキュベーション後、２×試薬を加えた（２０μＭのＬＬＶＹ−アミノルシフェリン（配列番号１）／３ｍＭのＣａＣｌ２／１０ｍＭのＭｇＳＯ４）。
【図２Ｂ】プロテアソームに対するラクタシスチン又はカルパイン活性の図である。基質を加える前にラクタシスチン又はカルペプチンを用いて、３７℃で１．５時間ＨＬ−６０細胞を処理した。
【図３】ジャーカット細胞中のプロテアソーム阻害剤濃度と発光の図である。ジャーカット細胞は阻害剤（ＡｄａＡｈｘＬ３ＶＳ）に１．５時間曝し、次いでＬＬＶＹ−アミノルシフェリン（１０μＭの最終濃度；配列番号１）と接触させた。
【図４Ａ】それぞれ２０μＭのアミノルシフェリン−ＬＬＶＹ（配列番号１）又は２０μＭのＬＬＶＹ−ＡＭＣ（配列番号１）、及びＨＬ−６０細胞での、発光感度と蛍光感度の比較の図である。細胞は２０μｇ／ｍｌのジギトニンで透過処理した。ＨＬ−６０細胞は２２℃に保った。
【図４Ｂ】それぞれ２０μＭのアミノルシフェリン−ＬＬＶＹ（配列番号１）又は２０μＭのＬＬＶＹ−ＡＭＣ（配列番号１）、及びＵ９３７細胞での、発光感度と蛍光感度の比較の図である。Ｕ９３７細胞の蛍光データは、４５分の時間地点からのものであった。
【図５Ａ】発光と細胞数の図である。ＨＬ−６０細胞は２２℃に保ち、２０μｇ／ｍｌのジギトニンで透過処理して、２０μＭのＬＬＶＹ−アミノルシフェリン（配列番号１）と接触させた。
【図５Ｂ】２２℃に保ち２０μｇ／ｍｌのジギトニンで透過処理したＵ９３７細胞中での、発光及びアミノルシフェリン−ＬＬＶＹ（配列番号１）基質（２０μＭ）の動態の図である。
【図５Ｃ】２２℃に保ち２０μｇ／ｍｌのジギトニンで透過処理したＨＬ−６０細胞中での、発光及びアミノルシフェリン−ＬＬＶＹ（配列番号１）基質（２０μＭ）の動態の図である。
【図６Ａ】ラクタシスチンによるＵ９３７細胞中での発光の阻害の図である。約５０，０００個のＵ９３７細胞を、２０μＭのＬＬＶＹ−アミノルシフェリン（配列番号１）及び２０μｇ／ｍｌのジギトニンで処理した。
【図６Ｂ】ラクタシスチンによるＨＬ−６０細胞中での発光の阻害の図である。１０％ＦＢＳを含む培地中の約２５，０００個のＨＬ−６０細胞を、基質及び２０μｇ／ｍｌのジギトニンで処理した。
【図７Ａ】５％ＦＢＳを含む培地中でのジギトニン滴定の図である。５％ＦＢＳを含む培地中の約２５，０００個のラクタシスチン処理ＨＬ−６０細胞を、基質及び様々な量のジギトニンと接触させた。データは、１５分の時間地点からのものである。
【図７Ｂ】１０％ＦＢＳを含む培地中でのジギトニン滴定の図である。１０％ＦＢＳを含む培地中の約２５，０００個のラクタシスチン処理ＨＬ−６０細胞を、基質及び様々な量のジギトニンと接触させた。データは、１５分の時間地点からのものである。
【図８Ａ】様々な濃度のラクタシスチンの存在下及びジギトニンの存在（２０μｇ／ｍｌ）又は不在下での、ＨＬ−６０細胞中でのプロテアソームキモトリプシン活性及びＡＴＰ含有量（生命力）の図である。ラクタシスチン処理は１．５時間であり、データはＨＬ−６０細胞に関して、１６分の時間地点からのものである。細胞の生命力の測定は、平行した一連の試料においてＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）を使用して実施して、生命力はラクタシスチン処理によって影響を受けなかったことを確認した。
【図８Ｂ】様々な濃度のラクタシスチンの存在下及びジギトニンの存在（２０μｇ／ｍｌ）又は不在下での、Ｕ９３７細胞中でのプロテアソームキモトリプシン活性及びＡＴＰ含有量（生命力）の図である。ラクタシスチン処理は１．５時間であり、データはＵ９３７細胞に関して、１８分の時間地点からのものである。細胞の生命力の測定は、平行した一連の試料においてＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）を使用して実施して、生命力はラクタシスチン処理によって影響を受けなかったことを確認した。
【図９Ａ】プロテアソームキモトリプシン様活性及びカスパーゼ３／７活性を測定した、多重化アッセイの図である。ラクタシスチン、及びＬＬＶＹ−アミノルシフェリン（配列番号１）及び（Ｚ−ＤＥＶＤ２）−Ｒ１１０（各基質（ＤＥＶＤ）２；配列番号３に関して１０μＭの最終濃度）で４．５時間処理した、約５０，０００個のジャーカット細胞からの発光データ。
【図９Ｂ】プロテアソームキモトリプシン様活性及びカスパーゼ３／７活性を測定した、多重化アッセイの図である。ラクタシスチン、及びＬＬＶＹ−アミノルシフェリン（配列番号１）及び（Ｚ−ＤＥＶＤ２）−Ｒ１１０（各基質；配列番号３に関して１０μＭの最終濃度）で４．５時間処理した、約５０，０００個のジャーカット細胞からの蛍光データ。
【図１０Ａ】細胞ベースの発光反応中のプロテアソームを検出するのに適した細胞膜透過処理試薬のスクリーニングの図である。ラクタシスチン処理の不在下で約２５，０００個のＨＬ−６０細胞を、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６／０．５ｍＭのＥＤＴＡ／３０ｍＭのＭｇＳＯ４（ＨＬ−６０細胞に関して１０μＭの基質）中で界面活性剤及び基質と共に２２℃でインキュベートした。
【図１０Ｂ】細胞ベースの発光反応中のプロテアソームを検出するのに適した細胞膜透過処理試薬のスクリーニングの図である。ラクタシスチン処理の不在下で約２５，０００個のＨＬ−６０細胞を、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６／０．５ｍＭのＥＤＴＡ／３０ｍＭのＭｇＳＯ４（ＨＬ−６０細胞に関して１０μＭの基質）中で界面活性剤及び基質と共に２２℃でインキュベートした。
【図１０Ｃ】細胞ベースの発光反応中のプロテアソームを検出するのに適した細胞膜透過処理試薬のスクリーニングの図である。ラクタシスチン処理後に２５，０００個のＵ９３７細胞を、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６／０．５ｍＭのＥＤＴＡ／３０ｍＭのＭｇＳＯ４（Ｕ９３７細胞に関して２０μＭの基質）中で界面活性剤及び基質と共に２２℃でインキュベートした。
【図１１】２２℃で５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６／０．５ｍＭのＥＤＴＡ／３０ｍＭのＭｇＳＯ４中においてラクタシスチン、０．０４％のＴＭＮ−６及び２０μＭのＬＬＶＹ−アミノルシフェリン（配列番号１）で処理したＨ２２６細胞からの発光の図である。
【図１２Ａ】発光アッセイ中のＭｇ濃度の影響の図である。約２５，０００個のＨＬ−６０細胞を、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、２０μｇ／ｍｌのジギトニン及び２０μＭの基質で処理した。
【図１２Ｂ】発光アッセイ中の半減期動態に対するＭｇの影響の図である。約２５，０００個のＨＬ−６０細胞を、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、２０μｇ／ｍｌのジギトニン及び２０μＭの基質で処理した。
【図１２Ｃ】Ｕ９３７細胞を用いた発光アッセイ中のＭｇ濃度の影響の図である。細胞は２０μｇ／ｍｌのジギトニン及び２０μＭの基質で処理した。
【図１２Ｄ】Ｕ９３７細胞を用いた発光アッセイ中のＭｇ濃度の影響の図である。細胞は２０μｇ／ｍｌのジギトニン及び２０μＭの基質で処理した。
【図１２Ｅ】蛍光アッセイ中のＭｇ濃度の影響の図である。ラクタシスチンの不在下で２２℃において、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６／０．５ｍＭのＥＤＴＡ、及び様々な濃度のＭｇＳＯ４中で、ＨＬ−６０細胞を２０μｇ／ｍｌのジギトニン、２０μＭのＬＬＶＹ−ＡＭＣ（配列番号１）と接触させた。
【図１２Ｆ】発光とＭｇ濃度の図である。ラクタシスチンの不在下で２２℃において、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６／０．５ｍＭのＥＤＴＡ、及び様々な濃度のＭｇＳＯ４中で、ＨＬ−６０細胞を２０μｇ／ｍｌのジギトニン、２０μＭのＬＬＶＹ−アミノルシフェリン（配列番号１）と接触させた。
【図１３Ａ】発光とＥＤＴＡ濃度の図である。ラクタシスチンの不在下で２２℃において、Ｕ９３７細胞を２０μｇ／ｍｌのジギトニン、２０μＭの基質、３０ｍＭのＭｇＳＯ４及び様々な濃度のＥＤＴＡと接触させた。
【図１３Ｂ】ラクタシスチンで処理したＵ９３７細胞中の発光とＥＤＴＡ濃度の図である。細胞は２０μｇ／ｍｌのジギトニン、２０μＭの基質、３０ｍＭのＭｇＳＯ４及び様々な濃度のＥＤＴＡと接触させた。データは、３０分の時間地点からのものである。
【図１３Ｃ】ラクタシスチンで処理したＰＡ−１細胞中の発光とＥＤＴＡ濃度の図である。細胞は２０μｇ／ｍｌのジギトニン、２０μＭの基質、及び３０ｍＭのＭｇＳＯ４と接触させた。データは、３０分の時間地点からのものである。
【図１４】様々なｐＨでの発光プロテアソームアッセイの動態の図である。２２℃において約２５，０００個のジャーカット細胞を、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ／０．５ｍＭのＥＤＴＡ／３０ｍＭのＭｇＳＯ４中で２０μＭの基質と接触させた。
【図１５】発光プロテアソームアッセイ中のｐＨ及び基質濃度の影響の図である。２２℃において約２５，０００個のジャーカット細胞を、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６又は８．２／０．５ｍＭのＥＤＴＡ／３０ｍＭのＭｇＳＯ４中で様々な量の基質と接触させた。
【図１６】多重化アッセイにおいて有用である可能性がある３つの蛍光団のプロファイルの図である。Ｅｘ＝励起スペクトル；ｅｍ＝放射スペクトル。
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その全容が参照として本明細書に組み込まれる２００５年９月１日に出願された米国仮出願第６０／７１３，９０６号の、米国特許法第１１９条（ｅ）の下での特典を特許請求するものである。
【背景技術】
【０００２】
ルシフェラーゼ介在酸化反応の結果として、幾つかの生物において発光が生じる。広く様々な非常に異なる種由来のルシフェラーゼ遺伝子、特にフォチナス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）及びホチュリス・ペンシルバニカ（Ｐｈｏｔｕｒｉｓ ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃａ）（北アメリカのホタル）、ピロフォラス・プラジオフタラムス（Ｐｙｒｏｐｈｏｒｕｓ ｐｌａｇｉｏｐｈｔｈａｌａｍｕｓ）（ジャマイカのコメツキムシ）、Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（ウミシイタケ）、並びに幾つかの細菌（例えば、ゼノラブダス・ルミネッセンス（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）及びビブリオ属種（Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐｐ））のルシフェラーゼ遺伝子は、非常に一般的な発光レポーター遺伝子である。ホタルルシフェラーゼもＡＴＰ濃度を測定するための一般的なレポーターであり、その役割において、バイオマスを検出するために広く使用されている。他の酵素が幾つかの合成基質、例えばアルカリホスファターゼ及びアダマンチルジオキセタンホスフェート、又はホースラディッシュペルオキシダーゼ及びルミノールと混合されるとき、それらの酵素によっても発光は生じる。
【０００３】
ルシフェラーゼ遺伝子は、その非放射活性、感受性、及び発光アッセイの極端な直線範囲のために遺伝子レポーターとして広く使用されている。例えば、わずか１０−２０モルのホタルルシフェラーゼを検出することができる。したがって、遺伝子活性のルシフェラーゼアッセイは、原核生物細胞と真核生物細胞の両方の培養、トランスジェニック植物及び動物、並びに無細胞発現系を含めた、ほぼ全ての実験生物系において使用されている。同様に、ＡＴＰ濃度を測定するために使用されるルシフェラーゼアッセイは非常に感度が良く、１０−１６モル未満の検出を可能にする。
【０００４】
ルシフェラーゼは、酵素特異的基質、例えばルシフェリンの酸化によって光を生成することができる。ホタルルシフェラーゼ及び全ての他の甲虫ルシフェラーゼに関して、光の生成はマグネシウムイオン、酸素、及びＡＴＰの存在下で起こる。ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼを含めた花虫類ルシフェラーゼに関しては、基質セレンテラジンと共に酸素のみが必要とされる。一般に、遺伝子活性を測定するための発光アッセイでは、反応基質及び他の発光活性試薬を、レポーター酵素を発現すると推測される生物系中に導入する。結果として生じる発光が存在する場合、照度計又は任意の適切な放射エネルギー測定デバイスを使用して次いで測定する。このアッセイは非常に迅速で感度が良く、放射性試薬を必要とせずに、早急且つ容易に遺伝子発現データを与える。
【０００５】
レポーターは、細胞又は上清内の分子の存在又は活性を検出するのにも有用である。例えばプロテアーゼは、血液凝固におけるタンパク質の代謝回転、炎症、生殖、繊維素溶解、及び免疫応答などの多様な生理プロセスと関連する酵素の大部分の重要な群を構成する。特異的プロテアーゼ及びそれらの阻害剤の活性の変化によって多数の病状が引き起こされ、それらによって特徴付けることができる。研究又は臨床設定において、これらのプロテアーゼを測定する能力は、病状の調査、治療及び管理にとって重要である。例えば、カスパーゼ−３及びカスパーゼ−７は、（アスパラギン酸特異的システインプロテアーゼ、「ＡＳＣＰ」としても知られる）システインアスパルチル特異的プロテアーゼファミリーのメンバーであり、哺乳動物細胞の細胞死において重要なエフェクターの役割を果たしている（Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙら、１９９２；Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら、１９９５；Ｔｅｗａｒｉら、１９９５；及びＦｅｒｎａｎｄｅｓ−Ａｌｎｅｍｒｉら、１９９６）。
【０００６】
しかしながらプロテアーゼは、それらの本来存在する基質でアッセイするのは容易ではない。さらに、多くの現在利用可能な合成基質は高価で、感度が悪く、且つ非選択的である。
【０００７】
多数の発色及び蛍光基質を使用してプロテアーゼが測定されてきており（Ｍｏｎｓｅｅｓら、１９９４；Ｍｏｎｓｅｅｓら、１９９５）、且つ修飾型ルシフェリンは蛍光指標の代替をもたらしてきている（米国特許第５，０３５，９９９号及び米国特許第５，０９８，８２８号）。前基質としてヒドロラーゼの認識部位を有する修飾型ルシフェリンを使用するための方法はＭｉｓｋａ及びＧｅｉｇｅｒ（１９８９）によって最初に記載され、この場合修飾型ルシフェリン及びヒドロラーゼを指定の期間インキュベートし、次いで混合物の等分試料をルシフェラーゼを含む溶液に移すことによって、異種間アッセイが実施された。Ｍａｓｕｄａ−Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら（２０００）は、β−ガラクトシダーゼ基質修飾型ルシフェリンを利用する、１本の試験管（同種間）アッセイの使用を報告した。
【０００８】
プロテアソームは、真核生物細胞の細胞質及び核中で多触媒性ユビキチン−プロテアソーム経路のタンパク質分解機能を果たす、（タンパク質分解装置とも呼ばれる）大きなマルチサブユニット酵素複合体である。２０Ｓプロテアソームは、４つのスタックリングから構成される中空シリンダーを形成する大きな２６Ｓプロテアソーム複合体の一部分である。２つの内部β−リングはそれぞれ、３つの異なるタンパク質分解部位、疎水性残基の後ろに２つのキモトリプシン様部位切断ペプチド結合、塩基性残基の後ろに２つのトリプシン様切断部位、及び酸性残基の後ろに２つのカスパーゼ様（酸性／ペプチジルグルタミルペプチドヒドロラーゼ）切断部位を含む。プロテアソームは、サイトゾルと核の両方において見られる。
【０００９】
多触媒性ユビキチン−プロテアソーム経路は、正常な細胞周期及びＮＦ−ｋＢを活性化させるのに必要なＩ−ｋＢの分解などのシグナル変換事象と関連する、タンパク質の代謝回転を強く制御する。この経路は、抗原のプロセシング及び提示とも関係がある。プロテアソーム活性は、正常な細胞の生存及び機能に重要である。プロテアソーム経路の阻害は、アポトーシスによる細胞死をもたらす。ユビキチン−プロテアソーム経路は、細胞周期、機能、及び生存に不可欠なので、それは癌における治療標的として認められている。何故なら悪性、形質転換、及び増殖細胞は正常細胞よりプロテアソーム阻害を受けやすいからである。正常細胞の相対物と比較して腫瘍細胞に対する毒性がより強い、幾つかのプロテアソーム阻害剤が同定されてきている。さらに、これらの阻害剤の１つである（ＰＳ−３４１又はＶｅＩｃａｄｅとしても知られている）ボルテゾミブは、進行した多発性骨髄腫の治療に関してＦＤＡの承認を得ている。この成功によって、癌療法を開発するための有効な標的としてのプロテアソームを確認している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
例えば阻害剤をスクリーニングするための、現在のプロテアソームアッセイは、血液又は凍結細胞調製物から精製されており、したがって無処理の細胞の活性と関連する可能性はない調製物の使用を含む。したがって、改善されたプロテアソームアッセイが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、細胞ベースの発光又は非発光、例えば蛍光アッセイにおける、プロテアソームと関連する１つ又は複数のタンパク質分解活性の検出を提供する。本発明はさらに、例えば同じウエルにおける非発光及び発光アッセイの多重化を提供し、そのアッセイの少なくとも１つが、１つ又は複数のタンパク質分解プロテアソーム活性を検出するための細胞ベースのアッセイである。例えば、細胞ベースのプロテアソームアッセイは、ＡＴＰなどの酵素反応の補助因子；分子と結合するタンパク質及び／又は分子の高次構造を改変するタンパク質（ペプチド又はポリペプチド）、例えばペプチド又はポリペプチド基質を修飾又は切断するタンパク質；又はタンパク質と結合する分子及び／又はタンパク質によって改変される分子、例えば基質を含めた、細胞によって発現されるプロテアソーム以外の１つ又は複数の部分（分子又は活性）の量（例えば、活性）又は存在を検出するためのアッセイと多重化させることができる。他のアッセイは細胞ベースであってよく、或いは細胞溶解後に実施することもできる。さらに、本明細書に記載するアッセイは、レポーターアッセイ、核酸ベースのアッセイ又は免疫学ベースのアッセイを含めた他のアッセイと共に利用することができる。細胞中の細胞内膜結合オルガネラ又は区画を実質的に害さない量の細胞膜透過処理試薬を利用する、１つ又は複数のサイトゾル酵素（膜と結合した細胞オルガネラ又は区画中に存在しない細胞内酵素）を検出するための細胞ベースの非発光又は発光アッセイをさらに提供する。
【００１２】
したがって、本発明は、細胞中のプロテアソームと関連するタンパク質分解活性を検出するための方法を提供する。本発明の方法で利用する試料には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養した細胞又は生理的試料から得た試料を含めた、透過処理済みである真核生物細胞試料を含む。一実施形態では方法は、真核生物細胞、細胞中の細胞内膜結合オルガネラ又は区画を実質的に害さない量の細胞膜透過処理試薬、及びプロテアソーム関連プロテアーゼの発光基質を含む甲虫ルシフェラーゼ介在反応の反応混合物を用意することを含む。プロテアーゼによる発光基質のタンパク質分解によって、甲虫ルシフェラーゼの基質である発光産物が生成する。次いで、混合物中の発光を検出又は測定する。本発明は、無処理の真核生物細胞及び細胞中の細胞内膜結合オルガネラ又は区画を実質的に害さない量の細胞膜透過処理試薬を含む試料を、プロテアソーム関連プロテアーゼの発光基質を含む甲虫ルシフェラーゼ介在反応の反応混合物と接触させる方法も提供する。このプロテアーゼによる発光基質のタンパク質分解によって、甲虫ルシフェラーゼの基質である産物が生成する。次いで混合物中の発光を、検出又は測定する。
【００１３】
例えば一実施形態では、プロテアソームと関連するプロテアーゼ活性の１つのプロテアーゼ認識部位を含むように修飾した（例えば、共有結合によって修飾した）、甲虫ルシフェラーゼ及び適切なルシフェリン、アミノルシフェリン、又はこれらの誘導体を発光アッセイで利用して、細胞中のプロテアソームの活性を検出することができる。一実施形態では、発光アッセイ試薬はＬＬＶＹ−アミノルシフェリン（ＬＬＶＹ；配列番号１）、ＬＲＲ−アミノルシフェリン、ｎＬＰｎＬＤ−アミノルシフェリン（ｎＬＰｎＬＤ；配列番号２）であってよく、或いは他の発光プロテアソーム関連プロテアーゼ基質、例えば、ルシフェリン、アミノルシフェリン、又はこれらの誘導体と結合した異なるペプチド又はポリペプチド基質であってよい。本発明の範囲内のルシフェリン誘導体には、その開示が参照として本明細書に組み込まれる米国出願第６０／６８５，９５７号、同６０／６９３，０３４号、及び同６０／６９２，９２５号、並びに米国出願公開２００４０１７１０９９号に記載された誘導体などの、甲虫ルシフェラーゼの基質である誘導体があるが、これらだけには限られない。
【００１４】
他の実施形態では本発明は、真核生物細胞、細胞中の細胞内膜結合オルガネラ又は区画を実質的に害さない量の細胞膜透過処理試薬、及びプロテアソーム関連プロテアーゼの発光基質を含む反応混合物を提供する。次いで、混合物中の蛍光を検出又は測定する。例えば、プロテアソーム関連プロテアーゼの基質を修飾して、酵素が基質と反応した後のみ一定波長の光を発する蛍光団を含ませることができ、蛍光団を一定波長又は波長範囲の光に接触（曝露）させ、例えばＬＬＶＹ−ＡＭＣ（配列番号１）はプロテアソームのキモトリプシン活性を検出するのに有用な蛍光基質であり、プロテアソーム関連プロテアーゼによるその基質の切断はＡＭＣの蛍光によって調べることができる。
【００１５】
したがって本発明は、透過処理した真核生物細胞中のプロテアソーム活性をモニタリングすることができる、１つの他の同種のアッセイを提供する。ジギトニン透過処理細胞などの透過処理細胞中の、プロテアソームの非常に近辺の成分などの他の細胞成分の存在は、細胞抽出物又は精製プロテアソーム中のプロテアソーム活性の測定に優る利点をもたらす可能性がある。さらに透過処理細胞は、他の分子又は細胞質酵素活性などの活性、例えば選択的Ｐ４５０活性を測定するのに有用である可能性がある。本発明のアッセイは、発光又は蛍光を使用して、プロテアソーム活性を単独で、或いは発光／蛍光多重化アッセイ又は他の多重化アッセイにより、別の分子の測定又は検出、例えばカスパーゼ活性又は核酸の測定又は検出と組み合わせて測定するように形式を整えることができる。したがって、細胞の生存の測定（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（商標）、又はＣｙｔｏＴｏｘ−ＯＮＥ（商標））又はアポトーシス細胞毒性の特異的測定（Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ（商標）３／７、−８、−９又はＡｐｏ−ＯＮＥ（商標））を、プロテアソームアッセイと多重化させることができる。これらの他の分子を検出するために、透過処理細胞はこれらの細胞を溶かす条件を施すことができ、溶解物は１つ又は複数の分子に関してアッセイすることができ、或いは１つ又は複数の分子に関してアッセイすることができる１つ又は複数の分画の分画化及び／又は精製を施すことができる。他の実施形態では、透過処理の前に、細胞試料を細胞表面分子及び／又は細胞表面と結合しない分子、例えば上清中の分子に関してアッセイすることができる。１つ又は多重化アッセイ中の検出において検出又は利用される分子は、天然分子、又は例えば融合タンパク質を含めた組換え体分子であってよい。例えば、ルシフェラーゼ介在反応に関しては、ルシフェラーゼは天然又は組換え体であってよい。
【００１６】
したがって一実施形態では、本発明の組合せ発光／非発光アッセイ形式は、１つ又は複数のペプチド又はポリペプチド、例えば酵素；ペプチド又はポリペプチドと結合する、及び／又はそれによって改変される１つ又は複数の分子、例えば少なくとも１つの酵素のペプチド又はポリペプチド基質；及び／又は１つ又は複数の酵素介在反応の補助因子；又は他の分子若しくは状態；又はこれらの組合せに関するアッセイの多重化を可能にする。一実施形態では本発明は、プロテアソームと関連するプロテアーゼの活性（第１の酵素介在反応）及び第２の酵素介在反応の第２の分子、及び場合によっては他の酵素介在反応の分子を含めた他の分子の存在又は量を検出するための方法を提供する。この方法は、細胞試料を、第１の酵素介在反応及び第２の酵素介在反応の反応混合物と接触させることを含む。一実施形態では、細胞内膜結合オルガネラ又は区画を実質的に害さない量の細胞膜透過処理試薬を、細胞を反応混合物と接触させる前に細胞に加える。他の実施形態では、細胞内膜結合オルガネラ又は区画を実質的に害さない量の細胞膜透過処理試薬を、反応混合物を細胞と接触させる前に反応混合物に加える。一実施形態では、発光を利用してプロテアソーム活性を検出し、蛍光又は比色定量を利用して第２の酵素介在反応の分子を検出する。次いで、プロテアソームの活性及び第２の分子の存在又は量を検出する。
【００１７】
或いは、第１の反応と第２の反応の反応混合物を連続的に加えることができ、この場合第１の反応混合物は、細胞内膜結合オルガネラ又は区画を実質的に害さない量の細胞膜透過処理試薬を含むことができる。具体的なバッファー条件は検出する分子によって変わる可能性があるので、このような２ステップアッセイは試薬調節を含み得る。例えば試薬調節は、第１の反応用に消光物質、及び／又は第２の反応用に増強物質の添加を含み得る。少なくとも２つの酵素活性を検出する一実施形態では、その２つの酵素は同じ活性を有しておらず、例えばそれらは同じ基質と結合又は反応せず、或いはそれらが同じ基質と結合又は反応する場合、酵素の１つが他の酵素の基質とは実質的に反応せず、それによって特異性が得られるように、条件又は基質を利用する。例えば、ＬＬＶＹ（配列番号１）含有基質は、キモトリプシン又はカルパインの基質であってよい。しかしながら、カルパイン介在反応はカルシウムを必要とするが、キモトリプシン介在反応は必要としない。したがって、実質的に無カルシウム条件下で実施されるアッセイにおいて、ＬＬＶＹ（配列番号１）含有基質を用いてキモトリプシン活性を検出することができる。
【００１８】
本発明は、反応の１つの停止又は反応の１つの増強／加速を場合によっては含まない、同時反応又は連続反応中の少なくとも２つの分子の活性、存在又は量の同時又は連続的検出を含めた、多重化アッセイにおける分子又は活性の同時又は連続的検出も提供する。一実施形態では、プロテアソーム関連プロテアーゼの基質と、他の分子を検出するのに、例えば核酸を検出するのに有用な試薬を、細胞試料に同時に加え、他の分子の量又は存在を検出する前にプロテアソーム活性を検出する。他の実施形態では、２つの異なる酵素介在反応の基質を細胞試料に同時に加え、異なる酵素介在反応の酵素、基質及び／又は補助因子の量又は存在を検出する前にプロテアソーム活性を検出する。なお他の実施形態では、プロテアソーム関連プロテアーゼの基質と、他の分子を検出するのに有用な試薬を試料に同時に加え、プロテアーゼ活性と他の分子の存在又は量を同時に検出する。他の実施形態では、２つの異なる酵素介在反応の基質を試料に同時に加え、異なる酵素介在反応の酵素、基質及び／又は補助因子の存在又は量を、プロテアソーム活性を検出するのと同時に検出する。或いは、プロテアソーム関連プロテアーゼの基質を反応混合物に加え、そのプロテアーゼの活性を検出し、次いで他の分子を検出するのに有用な試薬を加え、その分子の存在又は量を検出する。他の実施形態では、プロテアソーム関連プロテアーゼの基質を反応混合物に加え、そのプロテアーゼの活性を検出し、次いで他の酵素介在反応の基質を加え、その第２の反応の酵素、基質及び／又は補助因子の存在又は量を検出する。酵素、基質、補助因子及び／又は他の分子の活性、存在又は量は、１つの容器、例えばウエル中での反応において検出することが好ましい。
【００１９】
したがって本発明は、細胞膜透過処理細胞を含む混合物中の１つ又は複数のプロテアソーム関連プロテアーゼ活性の検出又は測定以外に、他の酵素介在反応の補助因子、基質又は酵素の存在又は量を検出又は測定することができる、多重化アッセイを提供する。他の実施形態では、細胞膜透過処理細胞を含む混合物中の１つ又は複数のプロテアソーム関連プロテアーゼ活性の検出又は測定以外に、非酵素反応と関連する部分の存在又は量を検出又は測定することができる。なお他の実施形態では、細胞膜透過処理細胞を含む混合物中の１つ又は複数のプロテアソーム関連プロテアーゼ活性の検出又は測定以外に、異なる細胞分子、例えば核酸又はタンパク質の存在又は量を、例えばこの混合物を、その細胞分子を検出するのに有用な試薬と接触させることによって検出又は測定する。このような試薬は、特定の細胞分子と結合する試薬を含む。したがって一実施形態では、核酸結合色素を利用して、プロテアソーム特異的タンパク質分解活性のアッセイにおいて核酸の存在又は量を検出することができる。
【００２０】
さらに、幾つかの細胞透過処理試薬は異なる可溶化を可能にするので、本発明は、少なくとも２つの分子のサイトゾル活性を検出又は測定することができる多重化アッセイを提供する。
【００２１】
本発明のアッセイ中で使用するための１つ又は複数の試薬を含む組成物及びキットも提供する。一実施形態では、組成物は溶液、例えば１つ又は複数の基質が０．００５〜約１．０Ｍ、例えば０．０５〜約０．２Ｍで存在する溶液である。
【００２２】
アッセイには、薬剤発見ツールとしての使用もある。したがって、調節物質、例えばプロテアソームと関連するプロテアーゼの阻害剤の存在又は量は、本発明のアッセイ、例えば蛍光又は発光アッセイを使用して検出することができる。したがって本発明は、１つ又は複数の作用物質を、細胞、細胞中の細胞内膜結合オルガネラ又は区画を実質的に害さない量の細胞膜透過処理試薬、及びプロテアソームと関連するプロテアソームの発光又は蛍光基質を含む反応混合物と接触させて、混合物を生成する方法を提供する。１つ又は複数の作用物質を細胞と接触させ、その混合物を、細胞中の細胞内膜結合オルガネラ又は区画を実質的に害さない量の細胞膜透過処理試薬、及びプロテアソームと関連するプロテアーゼの発光又は蛍光基質を含む反応混合物と接触させる方法も提供する。混合物中の発光又は蛍光は、１つ又は複数の作用物質を欠く対応する混合物中の発光又は蛍光と比較する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
定義
本明細書で使用する「発光アッセイ」は、第１の分子、例えば第１の酵素のペプチド又はポリペプチド基質、第１の分子と適切な（第１の）タンパク質の間の反応の生成物、及び／又は異なるタンパク質と第１の反応の生成物の間の反応の生成物が発光性である反応を含む。したがって発光アッセイは、プロテアソームの１つ又は複数の活性、或いはその部分が酵素反応と関連し得る、例えば反応の補助因子、反応又は酵素の基質である、或いは部分と結合する且つ／或いはそれによって改変する分子であるプロテアソーム以外の部分の量又は存在を直接又は間接的に検出、例えば測定することができる。発光アッセイは、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−ラクタマーゼ、プロテアーゼ、アルカリホスファターゼ、又はペルオキシダーゼ、及び適切な対応する酵素、例えば修飾形のルシフェリン、セレンテラジン、ルミノール、ペプチド又はポリペプチド、ジオキセタン、ジオキセタノン、及び関連アクリジニウムエステルを利用又は検出するアッセイだけには限られないが、それらを含めた化学発光及び生物発光アッセイを含む。
【００２４】
本明細書で使用する「発光アッセイ試薬」は、発光反応用の基質、及び補助因子又はタンパク質、例えば酵素などの他の分子を含む。
【００２５】
「非発光アッセイ」は、第１の分子、例えばタンパク質（ペプチド又はポリペプチド）、第１の分子と適切な（第１の）タンパク質（ペプチド又はポリペプチド）の間の反応の（第１の）生成物、又は異なるタンパク質と第１の生成物の間の反応の生成物が発光性ではないが、他の場合検出できる可能性がある、例えば基質及び／又は生成物を、プロテアソームの１つ又は複数の活性、或いはその部分が酵素反応と関連し得る、例えば部分が補助因子、プロテアソームと関連する他の活性などの反応の基質又は酵素、或いは部分と相互作用する分子であるプロテアソーム以外の部分の量又は存在を直接又は間接的に測定する、蛍光又は比色定量アッセイを使用して検出する反応を含む。
【００２６】
本明細書で使用する「蛍光アッセイ試薬」は、蛍光反応用の基質、及び補助因子又は他の分子、例えばタンパク質を含む。
【００２７】
本明細書で使用する「細胞膜透過処理試薬」は、細胞と接触すると細胞膜を部分的に害し、試薬、例えばトリパンブルー、ヨウ化プロピジウム、又は臭化エチジウムなどの試薬に曝されていない生きた細胞中への進入から通常排除されるはずである物質の、細胞中への進入を可能にする任意の試薬を含む。
【００２８】
本明細書で使用する「プロテアソーム特異的タンパク質分解活性」は、プロテアソーム特異的阻害剤、例えばラクタシスチンによって阻害され得るトリプシン様、キモトリプシン様又はカスパーゼ様活性である。
【００２９】
本発明の方法
本発明は、その１つがプロテアソーム活性を他の分子又は活性と同時或いは連続的に検出することを含む、少なくとも２つの異なる分子又は活性を検出するための多重化アッセイ法を含めた、透過処理細胞中のプロテアソームの１つ又は複数の活性を検出するための同種間アッセイを提供する。例えば、１つ又は複数の酵素介在反応を、少なくとも１つの酵素基質を基質と酵素の間の反応の生成物に転換するのに有効な条件下で実施し、その生成物は基質由来の異なる特徴（シグナル）を有する。２つの基質を伴う２酵素介在反応に関しては、基質と対応する酵素の間の反応の生成物に各基質を転換するのに有効な条件下で同時或いは連続的に反応を実施し、この場合各基質及び／又は生成物は異なる特徴を有する。生成するシグナルは、検出する分子の活性、存在又は量と関連する。本発明の発光又は蛍光法は、酵素介在反応の基質を含むように修飾されており、酵素反応の酵素、補助因子、酵素基質、酵素阻害剤、及び／又は酵素活性剤を検出するのに有用である、ルシフェリン、アミノルシフェリン、又はこれらの誘導体、又は蛍光団を利用する。
【００３０】
一実施形態では、本発明による方法は、細胞の等分試料などの１試料中のプロテアソーム活性を含めた多数の部分又は活性を同時或いは連続的に検出するための、迅速で非常に感度の良い方法をもたらす。一実施形態では方法は、発光アッセイ中の第１の酵素、基質又は補助因子の存在又は量（活性）を定量化すること、及び蛍光アッセイなどの非発光アッセイ中の第２の酵素、基質又は補助因子の存在又は量を定量化することを含む。一実施形態では、各反応用に試薬、例えば基質を同時或いは連続的に加えることができる。他の実施形態では方法は、蛍光アッセイ中の第１の酵素、基質又は補助因子の存在又は量を定量化すること、及び発光アッセイ中の第２の酵素、基質又は補助因子の存在又は量を定量化することを含む。発光又は非発光シグナルの強度は、各分子の存在又は量の関数である。
【００３１】
一実施形態では、当該の酵素を検出するために、方法は少なくとも２つの異なる反応を利用し、この場合第１の反応は、甲虫ルシフェラーゼの基質を生成する当該の酵素の基質を伴う非ルシフェラーゼ酵素介在反応であり、第２の反応は甲虫ルシフェラーゼ介在反応である。したがって発光アッセイは、例えば非甲虫ルシフェラーゼ介在反応の酵素、補助因子又は基質、非甲虫ルシフェラーゼ介在反応の阻害剤、又は非甲虫ルシフェラーゼ介在反応の活性剤の量、存在又は特異的活性を間接的に検出する、例えば測定することができる。これらの反応では、非甲虫ルシフェラーゼ酵素の基質である修飾ルシフェリン、アミノルシフェリン又はこれらの誘導体を利用し、その反応の生成物は甲虫ルシフェラーゼの基質である。
【００３２】
１ステップアッセイに関しては、反応混合物は２つの反応用の試薬、非甲虫ルシフェラーゼ酵素介在反応及び甲虫ルシフェラーゼ介在反応用の試薬など、又は一反応、例えば酵素の基質を含むように修飾された蛍光団と酵素の間の反応の反応混合物を含み得る。少なくとも２つの反応を利用するアッセイに関しては、アッセイ用の分子を加える順序は変わる可能性がある。連続的に開始し実施する場合（同じ容器中であろうとそうでなかろうと）、反応条件、例えば試薬濃度、温度又は他の試薬に対する調節を実施することができる。例えば、消光物質又は増強物質を反応間に加えることができる（例えば、その開示が参照として本明細書に詳細に組み込まれる、米国特許第５，７７４，３２０号及び同６，５８６，１９６号を参照）。一実施形態では、２つ以上の反応を１つの反応混合物において同時に実施する。場合によっては、アッセイは同種間アッセイであり、例えば試料に混合物を加える前に成分を混合させる。追加的な試薬の移動なしで結果を読むことができる。
【００３３】
２つの一般的な型の多重化アッセイが企図される。第１のアッセイでは、多数の部分、例えば酵素介在反応の１つ又は複数の酵素、１つ又は複数の基質及び／又は１つ又は複数の補助因子を、同じ反応混合物においてアッセイする。各酵素は基質の少なくとも１つを対応する生成物に転換することができ、この場合基質及び／又は対応する生成物、又は対応する生成物の１つと他の酵素の間の反応の生成物は、同じ反応混合物中に存在するとき基質及び／又は生成物を個々に検出するのを可能にする、異なる検出可能な特徴を有する。これらのアッセイ用の分子を加える順序は変わる可能性がある。したがって個々の反応は、同時或いは連続的に開始及び／又は実施することができる。連続的に開始し実施する場合、異なる検出可能な特徴は異なる検出法を必要とする可能性があり、且つ／又は反応条件、例えば試薬濃度、温度又は他の試薬に対する調節を実施することができる。例えば、前に記載したのと同様に、消光物質又は増強物質を反応間に加えることができる。好ましい一実施形態では、２つ以上の反応を１つの反応混合物において同時に実施し、この場合それぞれの酵素は、反応混合物中の基質の１つを生成物に転換するのに有効である。この実施形態を使用して、例えば細胞中の少なくとも２つの異なる酵素、基質及び／又は補助因子、或いはその少なくとも１つが透過処理細胞中、及び他の無処理の細胞、透過処理細胞、細胞溶解物又は細胞上清中で検出される、２つの異なる反応の少なくとも２つの異なる酵素、基質又は補助因子の活性、存在又は量を測定することができる。さらに反応混合物は、１つ又は複数の試験物質、例えば酵素阻害剤又は活性剤、及び／又は異なる濃度の阻害剤、活性剤、又は基質を含むことができる。場合によっては、アッセイは同種間アッセイとして利用され、例えば試料に混合物を加える前に、１つ又は複数の基質と他の成分を混合させる。追加的な試薬の移動なしで結果を読むことができる。
【００３４】
第２のアッセイ型では、２つ以上の酵素介在反応をタンデムで実施する。同時又は異なる時間で、別の反応を実施することができる。反応混合物は、１つ又は複数の同じ又は異なる酵素、１つ又は複数の同じ又は異なる試験物質、例えば酵素阻害剤又は活性剤、及び／又は異なる濃度の阻害剤、活性剤、又は基質を含むことができる。一実施形態では、それぞれの反応混合物は、生成物に転換され得る少なくとも２つの基質を含み、この場合基質及び／又は対応する生成物、及び／又は酵素／基質対の１つの生成物と異なる酵素の間の反応の生成物は、異なる検出可能な特徴を有する。
【００３５】
したがって本発明のアッセイは、試料、例えば真核生物細胞、例えば酵母、鳥類、植物、昆虫、又はヒト、サル、ネズミ、イヌ、ウシ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ヤギ又はブタ細胞だけには限られないが、これらを含めた哺乳動物細胞、又は２つ以上の異なる生物由来の細胞を含む試料中の多数の酵素又は補助因子を含めた多数の部分を検出することができ、この場合少なくともプロテアソーム活性を透過処理細胞において検出し、他の分子の活性、存在又は量は非透過処理細胞、非透過処理細胞の上清、透過処理細胞、細胞溶解物又は細胞溶解物の分画において検出する。これらの細胞は組換え技法によって遺伝的に改変されなかった可能性があり（非組換え細胞）、或いは組換えＤＮＡで一過的にトランスフェクトされている及び／又はそのゲノムが組換えＤＮＡで安定的に増大している、或いはそのゲノムが修飾されて遺伝子が破壊されている、例えばプロモーター、イントロン又はオープンリーディングフレームが破壊されている、或いは１つのＤＮＡ断片が他のＤＮＡ断片に置換されている組換え細胞であってよい。組換えＤＮＡ又は置換ＤＮＡ断片は検出される分子のレベル又は活性を変える部分、及び／又は分子のレベル又は活性を変える分子又は部分と無関係な遺伝子産物は、本発明の方法によって検出される分子をコードし得る。
【００３６】
一実施形態では本発明は、細胞又は細胞溶解物の１つの等分試料中の１つ又は複数の酵素の、存在又は量を測定する方法に関する。一実施形態では、酵素の１つが、プロテアソームと関連するプロテアーゼなどのサイトゾル中で見られる内因性プロテアーゼ、及び場合によってはサイトゾル又は他の場所中で見られる他の酵素である。分泌プロテアーゼ及び細胞内サイトゾルプロテアーゼなどの、異なる細胞の場所に存在する酵素に関しては、各酵素の基質は無処理の細胞を含むウエルに加えることができる。分泌プロテアーゼの存在又は量はサイトゾルプロテアーゼを検出する前に検出することができ、これは細胞膜透過処理後に検出される。一実施形態では、サイトゾルプロテアーゼの非細胞透過基質及び分泌又は放出プロテアーゼの基質を、細胞を含む試料に加え、次いで細胞を透過処理する。分泌又は放出プロテアーゼの検出は、透過処理の前又は後であってよい。他の実施形態では、サイトゾルプロテアーゼ或いは分泌又は放出プロテアーゼの非細胞透過基質、及び細胞内酵素の細胞透過基質を、細胞を含む試料に加える。細胞内酵素及び分泌又は放出プロテアーゼの存在は、透過処理なしで検出することができる。一実施形態では、分泌又は放出タンパク質は蛍光、発光又は分光測光法を使用して検出される。
【００３７】
本発明の方法を利用して、プロテアソーム活性以外に、組換え及び内因性（天然）酵素を含む酵素の任意の組合せから選択される任意の酵素又は任意の酵素セットを含めた、任意の部分を検出することができる。一実施形態では、検出する酵素の全てが内因性酵素である。他の実施形態では、検出する２つの酵素が内因性酵素であり、その１つはプロテアソームと関連し、もう１つの酵素は組換え酵素である。他の実施形態では、１つの酵素が、プロテアソームと関連する活性などの内因性酵素であり、他の酵素が組換え酵素である。当業者に明らかである他の組合せを、本明細書の教示に従う本発明のアッセイ及び方法において使用することができる。酵素にはプロテアーゼ、ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、スルファターゼ、ペルオキシダーゼ、及びグリコシダーゼがあるが、これらだけには限られない。酵素は、触媒反応の性質に基づいて異なる群、ヒドロラーゼ、オキシドレダクターゼ、リアーゼ、トランスフェラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、又はシンターゼだけには限られないがこれらを含む群に由来してよく、或いは酵素は、少なくとも１つの酵素が少なくとも１つの他の酵素に対して、部分的に重複するか或いは好ましくは実質的に異なる基質特異性を有する限り同じ群に由来してよい。特に興味深いのは、生理的意義を有する酵素のクラスである。これらの酵素には、タンパク質キナーゼ、ペプチダーゼ、エステラーゼ、タンパク質ホスファターゼ、イソメラーゼ、グリコシラーゼ、シンセターゼ、プロテアーゼ、デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、レダクターゼ、メチラーゼなどがある。当該の酵素には、有機及び無機エステルの生成又は加水分解、グリコシル化、及びアミドの加水分解と関連する酵素がある。任意のクラスにおいて、キナーゼと同様にさらなる下位区分が存在する可能性があり、この場合キナーゼはペプチド及びタンパク質中のセリン、スレオニン及び／又はチロシン残基のリン酸化に特異的である可能性がある。したがって、酵素は例えば、環状ヌクレオチド制御型タンパク質キナーゼ、タンパク質キナーゼＣ、Ｃａ２＋／ＣａＭによって制御されるキナーゼ、サイクリン依存性キナーゼ、ＥＲＫ／ＭＡＰキナーゼ、及びタンパク質−チロシンキナーゼを含めた異なる機能群のキナーゼ由来のキナーゼであってよい。キナーゼは、ＥＲＫキナーゼ、Ｓ６キナーゼ、ＩＲキナーゼ、Ｐ３８キナーゼ、及びＡｂＩキナーゼなどの、オリゴペプチド基質をリン酸化するのに有効なシグナル経路中のタンパク質キナーゼ酵素であってよい。これらに関して、基質はオリゴペプチド基質を含み得る。他の当該のキナーゼは、例えばＳｒｃキナーゼ、ＪＮＫ、ＭＡＰキナーゼ、サイクリン依存性キナーゼ、Ｐ５３キナーゼ、血小板由来増殖因子受容体、上皮増殖因子受容体、及びＭＥＫを含み得る。
【００３８】
特に、本発明中で有用である酵素には、酵素活性を示す任意のタンパク質、例えば酸性ホスファターゼ、グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ガラクトシダーゼ、カルボキシルエステラーゼ、及びルシフェラーゼを含めた、リパーゼ、ホスホリパーゼ、スルファターゼ、ウレアーゼ、ペプチダーゼ、プロテアーゼ及びエステラーゼがある。一実施形態では、酵素の１つが加水分解酵素である。他の実施形態では、酵素の少なくとも２つが加水分解酵素である。加水分解酵素の例には、アルカリ及び酸性ホスファターゼ、エステラーゼ、デカルボキシラーゼ、ホスホリパーゼＤ、Ｐ−キシロシダーゼ、β−Ｄ−フコシダーゼ、チオグルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ、α−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−グルクロニダーゼ、α−Ｄ−マンノシダーゼ、β−Ｄ−マンノシダーゼ、β−Ｄ−フルクトフラノシダーゼ、及びβ−Ｄ−グルコシドウロナーゼがある。
【００３９】
任意の特定の酵素介在反応の基質又は補助因子は、当業者に知られている。幾つかのプロテアーゼの代表的な切断部位を、表１中に述べる。
【００４０】
【表１】
Ｘは１つ又は複数のアミノ酸である
【００４１】
アルカリホスファターゼに関しては、基質はホスフェート含有ジオキセタン、３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３’’−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタンなど、二ナトリウム塩、又は二ナトリウム３−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’（５’−クロロ）−トリシクロ−［３．３．１．１３，７］デカン］−４−イル）フェニルリン酸、又は二ナトリウム２−クロロ−５−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２’（５’−クロロ）−トリシクロ｛３．３．１．１３，７｝デカン｝−４−イル｝−１−フェニルリン酸又は二ナトリウム２−クロロ−５−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２’−トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン｝−４−イル）−１−フェニジルリン酸（それぞれＡＭＰＰＤ、ＣＳＰＤ、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）及びＡＤＰ−Ｓｔａｒ（商標））を含むことが好ましい。
【００４２】
β−ガラクトシダーゼに関しては、基質はガラクトシダーゼ切断又はガラクトピラノシド基を含むジオキセタンを含むことが好ましい。アッセイ中の発光は、ジオキセタン基質由来の糖部分の酵素による切断に原因がある。このような基質の例には、３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３’’−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）フェニル−１，２−ジオキセタン（ＡＭＰＧＤ）、３−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］−デカン］−４−イル−フェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｇａｌａｃｔｏｎ（登録商標））、５−クロロ−３−（メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１３，７］−デカン−４−イル−フェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｇａｌａｃｔｏｎ−Ｐｌｕｓ（登録商標））、及び２−クロロ−５−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）−トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン−４−イル］フェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｇａｌａｃｔｏｎ−Ｓｔａｒ（登録商標））がある。
【００４３】
β−グルクロニダーゼ及びβ−グルコシダーゼのアッセイでは、基質はβ−グルクロニダーゼ切断基を含むジオキセタン、グルクロニドなど、例えばナトリウム３−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）−トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン｝−４−イル）フェニル−β−Ｄ−グルクロネート（Ｇｌｕｃｕｒｏｎ（商標））を含む。カルボキシルエステラーゼのアッセイでは、基質はジオキセタンと結合した適切なエステル基を含む。プロテアーゼ及びホスホリパーゼのアッセイでは、基質はジオキセタンと結合した適切な酵素切断基を含む。
【００４４】
１ジオキセタン含有基質を含むアッセイに関しては、基質は場合によっては、置換又は非置換アダマンチル基、置換状態又は非置換状態及び酵素切断基であってよいＹ基を含む。好ましいジオキセタンの例には、前述のジオキセタン、例えばＧａｌａｃｔｏｎ（登録商標）、Ｇａｌａｃｔｏｎ−Ｐｌｕｓ（登録商標）、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）、Ｇｌｕｃｕｒｏｎ（商標）、ＡＭＰＰＤ、Ｇａｌａｃｔｏｎ−Ｓｔａｒ（登録商標）、及びＡＤＰ−Ｓｔａｒ（商標）、並びに３−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）−トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン｝−４−イル）フェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（Ｇｌｕｃｏｎ（商標））、ＣＳＰＤ、二ナトリウム３−クロロ−５−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２’（５’−クロロ）−トリシクロ−［３．３．１．１３，７］デカン｝−４−イル）−１−フェニルリン酸（ＣＤＰ）と呼ばれるジオキセタンがある。
【００４５】
他の部分の基質、プロテアソームと関連しないプロテアーゼの基質などは、蛍光団などの光学分子、吸収性着色粒子又は色素、放射標識、適切な反応成分の存在下で検出可能な反応を触媒するのに有効である触媒部分などの酵素、他のサブユニット又は断片と結合すると機能的である酵素のサブユニット又は断片、又は後の反応、例えばその反応の生成物が検出可能である反応の基質だけには限られないが、これらを含めたレポーター分子で修飾することができる。
【００４６】
したがって、プロテアソームと関連するプロテアーゼの基質と他の部分の基質の両方を、蛍光団で標識することができる。本明細書で使用する「蛍光団」は、一定波長範囲でエネルギーを吸収することができ、吸収範囲以外の波長範囲でエネルギーを放出することができる分子を含む。用語「励起波長」は、蛍光団がエネルギーを吸収する波長の範囲を指す。用語「発光波長」は、蛍光団がエネルギー又は蛍光物質を放出する波長の範囲を指す。
【００４７】
蛍光物質の一群はキサンタン系色素であり、これはフルオレセイン、ローザミン及びローダミンを含む。これらの化合物は市販されており、結合部位又は結合官能基として使用することができるフェニル基が置換されている。例えば、アミノ及びイソチオシアネート置換フルオレセイン化合物が入手可能である。
【００４８】
他群の蛍光化合物は、α又はβ位置、通常はα位置にアミノ基を有するナフチルアミンである。ナフチルアミノ化合物中に含まれるのは、１−ジメチルアミノナフチル−５−スルホン酸、１−アニリノ−８−ナフタレンスルホン酸及び２−ｐ−トルイジニル−６−ナフタレンスルホン酸である。幾つかのナフタレン化合物は、タンパク質と幾らかの非特異的結合を有することが分かっており、したがってそれらの使用は、タンパク質の量が最小であるアッセイ培地の利用を必要とする。他の蛍光物質は、パイ電子との結合環系を有する窒素含有大員環を含む多座配位子である。これらの大員環は、架橋炭素又は窒素の置換を含めて、場合によっては置換されていてよい。適切な大員環には、ポルフィリン、アザポルフィリン、コリン、サフィリン及びポルフィセンの誘導体、及び広く非局在化する電子を含む他の同様の大員環がある。アザポルフィリン誘導体には、フタロシアニン、ベンゾトリアザポルフィリン及びナフタロシアニン及びこれらの誘導体がある。
【００４９】
幾つかの場合、蛍光融合タンパク質、例えば緑色、赤色又は青色蛍光タンパク質、又はポリペプチド基質と融合した他の蛍光タンパク質を利用することができる。他の実施形態では、蛍光タンパク質自体が加水分解酵素の基質であってよい。「蛍光タンパク質」は、完全長蛍光タンパク質又はその蛍光断片である。
【００５０】
本発明中で使用する化学蛍光団、並びにその励起波長及び発光波長の非制限的なリストは表２中に示す。励起及び発光の値はｐＨ、バッファー系、又は溶媒などの反応条件に応じて変わり得る。
【００５１】
【表２】
【００５２】
一実施形態では、修飾が酵素の基質を含むアミノ修飾ルシフェリン又はそのカルボキシ保護誘導体を含む基質を使用して、酵素の１つを検出する。一実施形態では修飾は、プロテアーゼの認識部位を含む１つ又は複数のアミノ酸残基である。一実施形態では、その認識部位を有するペプチドは、ペプチド結合によってアミノルシフェリン又はそのカルボキシ修飾誘導体のアミノ基と共有結合する。一実施形態では、例えばアミノ末端保護基を使用して、アミノペプチダーゼによる分解を妨げるために、ペプチド又はタンパク質基質のＮ末端を修飾する。適切な酵素又は補助因子の不在下では、最少のアミノルシフェリンが存在するので、このような基質及びルシフェラーゼを含む混合物は最少の光を生成する。適切な酵素の存在下では、基質とアミノルシフェリンを結び付ける結合を酵素によって切断して、アミノルシフェリン、ルシフェラーゼの基質を生成することができる。したがってルシフェリンの存在下では、例えば、天然、組換え又は突然変異ルシフェラーゼ、並びに任意の補助因子及び適切な反応条件の存在下では、光が生成し、これは酵素の存在又は活性に比例する。
【００５３】
一実施形態では、蛍光団を含む基質を使用して酵素の１つを検出する。一実施形態では基質は、プロテアーゼの認識部位を含む１つ又は複数のアミノ酸残基を含む。一実施形態では、基質は１つ又は複数の蛍光団と共有結合する。適切な酵素又は補助因子の不在下では、このような基質を含む混合物は発光波長で最少の光を生成する。何故なら蛍光団の蛍光性が例えば消光基の近辺で消失し、したがって基質−蛍光団複合体の性質が変化し、蛍光団単独と比較して複合体の改変された、例えば低下した蛍光性をもたらすからである。適切な酵素の存在下では、複合体の切断によって蛍光団が生成する。他の実施形態では、切断前は、複合体は蛍光性であるが、酵素による切断後は、生成物は改変されたスペクトルを有する。
【００５４】
一実施形態では、少なくとも２つの反応に関する条件が適合している。例えば、少なくとも２つの酵素に関する条件、及び好ましくは３つ以上の酵素、例えば４つ以上の酵素に関する条件が適合している。一群の類似の酵素は一般に、ｐＨ及びイオン強度などの適合性のある反応条件を有するはずであるが、しかしながら、補助因子の要件、金属イオンの要件など、比較的低い質量濃度を有するアッセイ要素、例えば補助因子に関する要件は共通である必要はない。一般的条件は、他の酵素に加える成分から著しく干渉されずに、それぞれの酵素が反応の工程中に測定可能な率をもたらし、一般にそれぞれの酵素が特定基質のその最大代謝回転率の少なくとも約１０％、通常少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約５０％を有するような条件を含む。
【００５５】
或いは、２つの反応の基質が存在する場合でも、１つの反応に関する条件が他の反応と適合しない可能性がある。このような実施形態では、１つの酵素は活性があるが、その基質とは反応することはできない。例えば、２つの反応に関する条件が適合しない一実施形態では、個々の酵素−アッセイ反応は連続的及び／又は別の反応混合物において実施する。酵素アッセイの後、反応混合物（又はその一部分）は、他の反応混合物と組み合わせることができる。それぞれ個々の反応混合物は、１つ又は複数の酵素及び１つ又は複数の基質を含み得る。その最も単純な形で、アッセイする一酵素及びその酵素の基質は、それぞれの反応混合物中に存在する。反応中で利用する基質の組は、一反応多重化アッセイにおいて必要とされるのと同じ一般的性質を有する。即ち、それぞれの基質及び／又は対応する生成物は独特の特徴を有しており、それらを互いに区別することができる。
【００５６】
反応中の分子の検出の順序は変わる可能性がある。一実施形態では、反応を同時に開始させるか開始させないかとは無関係に、発光アッセイによって検出される分子を検出し、次いで非発光アッセイによって検出される分子を検出する。或いは、反応を同時に開始させるか開始させないかとは無関係に、非発光アッセイによって検出される分子を検出し、次いで発光アッセイによって検出される分子を検出する。他の実施形態では、２つ以上の分子の存在又は量をほぼ同時に検出する。一実施形態では、第２の分子の存在又は活性を検出する前に、例えば第１のシグナルが例えば少なくとも５０％低下するまで待つことによって、或いは第１の反応用の消光物質を加えることによって、検出する一分子の存在又は活性が実質的に低下する。したがって幾つかの実施形態では、１つ又は複数の反応を、例えば検出前にその反応の酵素を阻害することによって停止させる。１つのアッセイによって生成するシグナルは、少なくとも１つの他のアッセイによって生成するシグナルの定量化に実質的に干渉しないことが好ましい。
【００５７】
本発明のキット
本発明は、１つ又は複数のペプチド又はタンパク質、ペプチド又はタンパク質と結合する分子及び／又はこれらによって改変される分子、補助因子、無処理の細胞、細胞溶解物、例えば少なくとも部分的に精製された溶解物、及び／又は細胞上清を含めた試料などの試料中の核酸又は他の分子を含めた１つ又は複数の部分であって、少なくとも１つが透過処理細胞中で検出される部分の存在、量又は活性を検出するためのキットも提供する。このようなキットは、部分、例えば１つ又は複数のペプチド及び／又はタンパク質、ペプチド及び／又はタンパク質と結合する分子及び／又はそれによって改変される分子、補助因子、又は他の分子の少なくとも１つを定量化するための少なくとも１つの試薬を含み、例えば、少なくとも１つの酵素の基質及び細胞膜透過処理試薬、又は少なくとも１つの酵素の基質、細胞膜透過処理試薬、及び生命力、又は他の分子を検出するための試薬、例えばトリパンブルー、例えば核酸結合色素である。
【００５８】
本明細書に記載するキット及び方法中で使用するための細胞膜透過処理試薬は、有効量で細胞中の細胞内膜結合オルガネラ又は区画を実質的に害さずに真核生物細胞を透過することができ、したがってプロテアソーム活性及び適切なプロテアーゼ基質の特異性を保つことができる試薬である。一実施形態では、細胞膜透過処理試薬はジギトニン、サポニン（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ）、ストレプトリシンＯ、洗浄剤及び／又は界面活性剤から選択される。使用する個々の細胞膜透過処理試薬の量は、透過処理する細胞型、望ましい透過処理の速度、細胞数に関する直線性の程度、及び／又は試薬を加える培養培地に基づいて選択する。その量は様々な濃度の個々の細胞膜透過処理試薬を調製すること、及びそれぞれの濃度と選択した細胞を組み合わせること、及びラクタシスチン及び／又はエポキソマイシンなどの非常に特異的なプロテアソーム阻害剤で阻害することができる活性をアッセイすることによって決定することができる。ジギトニン又はサポニンを用いた透過処理に関する濃度範囲は、約１０μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌ、例えば約２０μｇ／ｍｌ〜約４０μｇ／ｍｌ、及び約０．０５％〜約０．１％の洗浄剤及び／又は界面活性剤濃度を含むが、これらだけには限られない。適切な細胞膜透過処理試薬の例には、ジギトニン、サポニン、Ｔｈｅｓｉｔ（登録商標）、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（登録商標）ＴＭＮ−６、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（登録商標）ＮＰ−９、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００及びＮｏｎＩｄｅｔ−４０がある。プロテアソーム／ルシフェラーゼ反応と適合性がなかった洗浄剤又は界面活性剤の例には、ＳＤＳ、ＣＨＡＰＳ、ＴＯＭＡＨ（登録商標）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０、Ｇｅｒｏｐｏｎ（登録商標）Ｔ−７７、ＢｉｏＴｅｒｇｅ及びＢｒｉｊ−３５がある。好ましい細胞膜透過処理試薬は、プロテアソーム及び／又はルシフェラーゼ活性に実質的に影響を与えない量で利用する。
【００５９】
細胞ベースのアッセイにおいてプロテアソーム活性を検出するために、細胞透過試薬を使用することによって細胞に異なる透過処理を施す。例えば、低濃度の（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ由来の）ジギトニン又はサポニン（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｂａｒｋ）によって、サイトゾルタンパク質からなる分画が生じる（Ｒａｍｓｂｙら、１９９４）。原形質膜のコレステロール脂質とのジギトニン複合体は孔を形成し、サイトゾルタンパク質の放出を可能にする。低濃度のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００は、核の完全性を保ちながら膜及びオルガネラのタンパク質を豊富にする（Ｒａｍｓｂｙら、１９９４）。Ｔｗｅｅｎ−４０／デオキシコレートは細胞を溶かし、核の完全性を損ね、洗浄剤耐性サイトゾルとゆるく結合したタンパク質を放出させ、且つＳＤＳ又はＣＨＡＰＳは細胞を溶かし、細胞骨格、不溶性核タンパク質及び他の疎水性タンパク質を抽出する（Ｒａｍｓｂｙら、１９９４）。
【００６０】
以下の非制限的な実施例によって本発明をさらに記載する。全ての実施例に関して、適切な対照反応が当業者によって容易に設計される。
【実施例】
【００６１】
（実施例Ｉ）
プロテアーゼ保持及び放出細胞生命力多重化アッセイ
生存細胞及び死細胞のアッセイは、特定の化学的、生物学的又は物理学的処理に応答する細胞生命力の変化を調べるために広く使用されている。生命力と細胞毒性アッセイは一般に逆のものであり、異なるバイオマーカーを測定する。細胞毒性による細胞生命力の一般的変化を評価するための方法は、歴史的に外膜透過性の変化と関連づけられてきている。害された膜構造を検出する古典的方法には、トリパンブルー排除、核酸染色、及び乳酸デヒドロゲナーゼ放出がある（Ｒｉｓｓら、２００４；Ｍｙｅｒｓら、１９９８）。細胞の機能又は増殖を評価するためのアッセイには、トリチウム化チミジンの取り込み、ＡＴＰ含有量、テトラゾリウム色素変換又はフルオレセインジアセテートがある（Ｃｏｏｋら、１９８９）。無処理の細胞膜は、大きな帯電分子又はペプチドを細胞外空間からサイトゾル中に進入させないと仮定する。逆に、損傷した膜は、色素又は化合物を細胞中に、或いは細胞成分を細胞外に自由に透過させる。この透過現象は、色素標識（「不可欠な」色素、ＤＮＡ挿入剤又はエステラーゼ修飾フルオレセイン）とＬＤＨ放出アッセイの両方に基づくものである。
【００６２】
細胞生命力を測定するための既存の技法は依然として有用でコスト効率が良い適用例であるが、これらの技法には高含有量、多重化又は高スループット形式においてそれらの有用性を制限する、幾つかの技術的又は実施上の欠点がある。例えば、ＬＤＨ放出（ＣｙｔｏＴｏｘ−ＯＮＥ（商標））又は色素還元能力（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂ１ｕｅ（商標））による細胞膜完全性の現在の測定法は、共通のレサズリン基質及び重複するＥｘ／Ｅｍスペクトルのために、一対（データを標準化するための手段）にすることができない。さらに、両方のアッセイで使用した着色レサズリン基質は、第２アッセイのシグナルウインドウ強度（及び感度）及び他の終点アッセイ測定を制限し（消色）、濃度及び形式は第２アッセイの試薬対用に最適化されていない（例えば体積が制限されている）。
【００６３】
既存の生存／死細胞形式はカルボキシフルオレセイン及びエチジウムホモ二量体を使用し、後者は知られている強力な突然変異原である。その形式は、細胞培養培地の洗浄及び置換を必要とする。さらに、カルボキシフルオレセインは水溶液中で自発的加水分解を示し、ＤＮＡを染色するエチジウムホモ二量体の挿入は下流部門データの標準化に干渉する可能性がある。
【００６４】
培養した哺乳動物細胞は、プロテアーゼ、エステラーゼ、リパーゼ、及びヌクレアーゼが豊富な環境を含む。例えば、４つの一般的なクラスのプロテアーゼ（アスパラギン酸、システイン、セリン、及び金属依存性）が示され、これらは恒常性維持の特異的機能と関連する。これらのサイトゾル、リソソーム及び膜貫通型結合プロテアーゼは、細胞内タンパク質分解、免疫原性ペプチドの生成、翻訳後修飾、及び細胞分裂と関連する（Ｔｒａｎら、２００２、Ｃｏｎｓｔａｍら、１９９５、Ｖｉｎｉｔｓｋｙら、１９９７）。これらの酵素の活性は、特異的区画化を含めた様々なメカニズムによって制御される（Ｂｏｎｄら、１９８７）。極度のストレス、環境的災難、又は拘束されたアポトーシスプログラムの進行に応答して、区画化及び膜完全性の対応した消失が観察される（Ｓｙｎｔｉｃｈａｋｉら、２００３、Ｈａｕｎｓｔｅｔｔｅｒら、１９９８）。したがって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞モデルにおける細胞培養培地中への安定状態のタンパク質分解メディエーターの放出は、細胞死の考えられる代替を表す。逆に、保持されたタンパク質分解酵素の細胞酵素染色は、細胞の健康状態の表現型の観察結果と平行する。まとめると、このようなタンパク質分解活性は、細胞培養集団、例えば「生存／死亡」アッセイにおいて生存又は損傷細胞の相対数の確認を手助けすることができる。
【００６５】
プロテアーゼベースの生存／死亡細胞アッセイに関して、一実施形態では、（死細胞の）一基質は、サイトゾルｐＨ、例えば７．０〜７．２において安定状態で活性がありスペクトルが明確である読み取り値（Ｒ／Ｏ）を有する標識を有する、比較的多量の、活性がある保存プロテアーゼの基質である。その基質の切断の動態はＬＤＨ放出と平行し、活性条件は毒性又は膜改変物質、例えば塩又はチオールを含まず、迅速なアッセイ時間をもたらすことが好ましい。（生存細胞の）他の基質は、比較的多量の保存プロテアーゼの基質であり、生存細胞に関して細胞透過性であり、プロテアーゼは生存細胞のサイトゾル環境中では活性があるが、細胞外環境では不安定である。その基質はスペクトルが明確であるＲ／Ｏを有する標識を有しており、迅速なアッセイ時間をもたらすように切断反応が進行する。非破壊アッセイにおいて２つの基質を使用することによって、望ましくない増殖事象を検出することができ、異なるスペクトルで相補的且つ別個の代替を使用するため、誤った結論を減らすことができ、細胞凝集による誤り又はピペッティングの誤りを減らすことができる。何故なら生命力と細胞毒性の比は、そのウエル中の細胞数の変動とは無関係だからである。
【００６６】
Ａ．ＡＭＣ又はＲ１１０蛍光又はアミノルシフェリン発光レポーターを用いるプロテアーゼ放出アッセイ形式
ＨＬ−６０細胞を２倍に連続希釈し、次いでＴｒｉｔｏｎ Ｘを加えることによって０．２％の最終濃度まで溶かし、或いは賦形剤を加えることによって維持した。１００ｍＭの酢酸ナトリウム溶液、ｐＨ４．５に溶かした１０分の１体積の２００μＭのＡｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−ＡＭＣ基質を溶解物又は細胞に加え、さらに１時間３７℃でインキュベートした。溶解又は生存細胞と関係があった蛍光を、次いでＣｙｔｏＦｌｕｏｒＩＩを使用してＥｘ．３６０Ｅｍ．４６０で測定した。
【００６７】
活発に倍加していたジャーカット細胞をトリパンブルー排除によって計数すると、９５％を超えて生存していたことが分かった。細胞はＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ中に１ｍｌ当たり１００，０００個の細胞に調節し、２つの等分試料に分けた。１つの等分試料は、３×５秒間のパルスで３０％の動力において、マイクロチップを備えるＭｉｓｏｎｉｘ３０００を使用して超音波処理した。他方の分画は、超音波処理手順中３７℃の水浴中でインキュベートした（合計約５分間）。次いで細胞懸濁液と溶解物分画を、０〜１００％の生命力を表す比に混合することによって様々な生命力の細胞に配合した。配合した細胞試料は、次いで白壁透明底の９６ウエルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に１００μｌ体積で加えた。（Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ）２−Ｒ１１０はＲＰＭＩ−１６４０中に１０００μＭに希釈し、１０分の１体積でプレートに加えた。ＣｙｔｏＦｌｕｏｒＩＩを使用してＥｘ．４８５Ｅｍ．５３０で蛍光を測定する前に、プレートを３０分間インキュベートした。
【００６８】
活発に倍加していたジャーカット細胞をトリパンブルー排除によって計数すると、９５％を超えて生存していたことが分かった。細胞はＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ中に１ｍｌ当たり１００，０００個の細胞に調節し、２つの等分試料に分けた。１つの等分試料は、３×５秒間のパルスで３０％の動力において、マイクロチップを備えるＭｉｓｏｎｉｘ３０００を使用して超音波処理した。他方の分画は、超音波処理手順中３７℃の水浴中でインキュベートした（合計約５分間）。次いで細胞懸濁液と溶解物分画を、０〜１００％の生命力を表す比に混合することによって様々な生命力の細胞に配合した。配合した細胞試料は、次いで白壁透明底の９６ウエルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に１００μｌ体積で加えた。発光プロテアーゼ放出アッセイ試薬は、ルシフェリン検出試薬の塊（ＰｒｏｍｅｇａＶ８５９Ａ）を１０ｍｌの１０ｍＭＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．５で再水和し、その試薬にＡｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−アミノルシフェリンを１００μＭの最終濃度まで補うことによって調製した。１００μｌの発光プロテアーゼ放出アッセイ試薬をプレートのウエルに加え、ＢＭＧ ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｐｔｉｍａを使用する動態形式で発光を測定した。
【００６９】
ＡＭＣ蛍光形式の実際の感度は約２４０細胞と計算し、ＣｙｔｏＴｏｘ−ＯＮＥ（商標）に匹敵する感度値であった。Ｒ１１０形式のアッセイは同様に感度が良く、多重化用途のさらに他の蛍光団をもたらした。特に、下流部門の多重化用途におけるＣｙｔｏＴｏｘ−ＯＮＥ（商標）又は他のレサズリン系アッセイの使用の重大な障害である蛍光の消滅なしで、これらのアッセイから感度を得た。この発光形式の正確な直線性及び範囲は、９８００の生存細胞集団においてわずか２００細胞の統計的検出を可能にした。非溶解性発光形式は、細胞毒性検出用の他の代替を与える。
【００７０】
Ｂ．異なる酵素標的を用いるプロテアーゼ放出アッセイ形式
活発に倍加していたＨＬ−６０細胞を１ｍｌ当たり１００，０００個の細胞に調節し、２つの等分試料に分けた。１つの等分試料は、３×５秒間のパルスで３０％の動力において、マイクロチップを備えるＭｉｓｏｎｉｘ３０００を使用して超音波処理した。他の等分試料は３７℃に保った。次いで細胞懸濁液と溶解物を、ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ中１００μｌ体積に２倍に連続希釈した。培地は無細胞対照としてのみ働いた。ルシフェリン検出試薬の塊（ＰｒｏｍｅｇａＶ８５９Ａ）は、２．０ｍｌの１０ｍＭＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．５で再懸濁させた。次いでルシフェリン検出試薬を分離して、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−アミノルシフェリン又はＡｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−アミノルシフェリンのいずれかを用いて１ｍＭにした。各試薬を別個の反復実験のプレートに１０分の１体積で加え、ＢＭＧ ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｐｔｉｍａを使用する発光測定前に、Ｍｅ’Ｃｏｕｒサーマルジャケット付き水浴ホルダー中で３７℃において１５分間インキュベートした。
【００７１】
Ｚ−ＬＬＶＹ−アミノルシフェリン（配列番号１）アッセイは、ＡＡＦ−アミノルシフェリン配列ほど最適には働かなかったが、他のプロテアーゼを完全性が損なわれた代替として使用することができることは実証された。この場合、ＬＬＶＹ（配列番号１）の活性は、プロテアソームのキモトリプシン活性に原因がある可能性がある。
【００７２】
Ｃ．プロテアーゼ放出の時間行程
透明底白壁の９６ウエルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）中で５％ＣＯ２３７℃において７時間の時間行程で、ＨＬ−６０細胞（２５，０００／ウエル）を１０μＭのスタウロスポリンで処理し、或いはＤＭＳＯ賦形剤対照と競合させた。２００μＭのＡｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−ＡＭＣ基質溶液を、１００ｍＭの酢酸ナトリウム溶液、ｐＨ４．５中に作製した。１０μｌ体積の基質（１０分１体積の試料）をウエルに加え、さらに１時間インキュベートした。「プロテアーゼ放出」活性は、ＣｙｔｏＦｌｕｏｒＩＩにおいてＥｘ．３６０Ｅｍ．４６０で測定した。平行した組のウエル中では、ＣｙｔｏＴｏｘ−ＯＮＥ（商標）試薬が膜完全性アッセイの対照として働いた。Ｅｘ．５６０Ｅｍ．５８０での蛍光の測定前に、この試薬を１０分間加えた。
【００７３】
細胞透過の動態、即ちＬＤＨ及びプロテアーゼ放出は互いを反映し、細胞集団中の二次的な壊死の形態観察と一致した。酸性酢酸ナトリウム配合物（試料中の最終ｐＨ約６．５）中でアミノペプチダーゼ基質の提示を実施して、考えられるリソソームプロテアーゼ活性を適応させた。
【００７４】
Ｄ．プロテアーゼ放出活性のｐＨ要件
プロテアーゼ放出活性のｐＨ要件を、ｐＨ２．５、３．５、及び４．５に調節した１００ｍＭの酢酸ナトリウムを使用して調べ、非調節培養培地（水媒体）と比較した。Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−ＡＭＣはこれらのバッファーに２００μＭまで加えた。１０分１体積の溶液をプレートに加え、回転攪拌によって軽く混合した。プレートは３７℃で４０分間インキュベートし、次いでＣｙｔｏＦｌｕｏｒＩＩを使用してＥｘ．３６０Ｅｍ．４６０で蛍光を測定した。
【００７５】
１０分１体積の酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５を加えることによって、培養培地が約６．５の最終ｐＨに低下した。最終ｐＨの他の低ｐＨ溶液／培地の組合せは試験しなかったが、前の実験は、１０分１体積のｐＨ２．５の酢酸ナトリウムを加えることによって、細胞培地のｐＨが約５．５に低下したことを示唆した。非ｐＨ調節媒体が、プロテアーゼ放出活性に最も好ましいことが証明されたことが分かった。この活性はサイトゾルアミノペプチダーゼと一致し、おそらくリソソームプロテアーゼ（カテプシンなど）とは一致しない。プロテアーゼ放出活性を測定するのに有害又はおそらく細胞毒性である付属物は必要とされないので、このことは有意である。これはインキュベーション時間枠のさらなる柔軟性を与え、考えられる発光ベースのアッセイにより影響を受けやすい。
【００７６】
Ｅ．プロテアーゼ放出酵素亜細胞レベルの位置
ＨＬ−６０細胞は１ｍｌ当たり１００，０００個の細胞に調節し、２つの等分試料に分けた。１つの等分試料は、３×５秒間のパルスで３０％の動力において、マイクロチップを備えるＭｉｓｏｎｉｘ３０００を使用して超音波処理した。（形態によって確認した）この溶解物１００μｌを透明底の９６ウエルプレートの多数のウエルに加え、ＲＰＭＩ１６４０及び１０％ＦＢＳ中に２倍に連続希釈した。同様に、１００μｌの非超音波処理細胞の懸濁液を加え、プレートの多数のウエルに連続希釈した。それぞれ０．２％及び３０μｇ／ｍｌの最終濃度にウエルを分離するために、ＮＰ−９及びジギトニンを加えた。未処理対照は、生命力のある細胞及び調節した体積の水媒体からなっていた。ルシフェリン検出試薬の塊（ＰｒｏｍｅｇａＶ８５９Ａ）を２ｍｌの１０ｍＭＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．５で再水和し、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−アミノルシフェリン（Ｐｒｏｍｅｇａ）で５００μＭにした。２０μｌのこの発光前プロテアーゼ放出溶液を全てのウエルに加え、ＢＭＧ ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｐｔｉｍａを使用して１５分間３７℃でインキュベートした後に発光を測定した。
【００７７】
ＮＰ−９、及び前述のパラメーター及び濃度を用いた超音波処理は、（カテプシン放出により測定して）外膜だけでなく、リソソーム含有物も破壊することが知られている。ジギトニンによる選択的破壊はトリパンブルー染色を可能にするが、リソソーム破裂の証拠は存在しない。したがって、超音波処理又は差別的な界面活性剤による溶解の間の活性は同様であったので、且つｐＨの最適条件を一緒に考えて、プロテアーゼ放出アッセイにおいて測定したプロテアーゼは、おそらくサイトゾル及び無処理のオルガネラの外側に存在すると推測することができた。
【００７８】
Ｆ．プロテアーゼ放出又は保持、酵素の基質選択性
Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−ＡＭＣはＰｒｏｍｅｇａから入手した。Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−アミノルシフェリン（配列番号１）、Ｚ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−アミノルシフェリン、Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−アミノルシフェリン、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−アミノルシフェリン、（Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ）２−Ｒ１１０（（Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ）２；配列番号１２）、及び（Ｇｌｙ−Ｐｈｅ）２−Ｒ１１０（Ｇｌｙ−Ｐｈｅ）２；配列番号１３）は、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって合成された。Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−ＡＭＣ、Ｈ−Ｐｈｅ−ＡＭＣ、ＨＴｙｒ−ＡＭＣ、グルチル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−ＡＭＣ（グルチル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ；配列番号１４）、Ｈ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−ＡＭＣ、Ｚ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−ＡＭＣ、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＡＭＣ（配列番号１）、Ｄ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ＡＭＣ、Ｈ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−ＡＭＣ、Ｈ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＡＭＣ、Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−ＡＭＣ、Ｚ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＡＭＣ（Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ；配列番号１５）、Ｚ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＡＭＣ（Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ；配列番号１６）及びＡｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−ＡＭＣは、Ｂａｃｈｅｍから供給された。Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−ＡＦＣ、Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＡＭＣ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＡＭＣ、及びＳｅｒ−Ｔｙｒ−ＡＦＣはＣａｌｂｉｏｃｈｅｍから入手した。Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＡＭＣ及びＳｕｃ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＡＭＣ（Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ；配列番号１７）はＳｉｇｍａから購入した。
【００７９】
全ての基質を、固有の溶解性に応じて１０〜１００ｍＭでＤＭＳＯに溶かした。蛍光基質は１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．５又は１０％血清を含む調節した細胞培養培地中に１００μＭ〜１ｍＭで希釈し、白壁透明底の９６ウエルプレート中の溶解（凍結割断、超音波処理、又は界面活性剤）又は未処理の生命力のある細胞に１０分の１体積で加えた。ＨＬ−６０又はジャーカット細胞を、その容易に操作可能な懸濁培養中の表現型のため実験中交換して使用した。ＣｙｔｏＦｌｕｏｒＩＩによって蛍光を測定する前に、プレートは３７℃で１５〜３０分間インキュベートした。
【００８０】
発光基質をルシフェリン検出試薬の塊（ＰｒｏｍｅｇａＶ８５９Ａ）に加え、２ｍｌの１０ｍＭＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．５に５００μＭまで再懸濁した。５分１体積の発光前反応混合物を、白壁透明底の９６ウエルプレート中の溶解（凍結割断、超音波処理、又は界面活性剤）又は未処理の生命力のある細胞に加えた。再度、ＨＬ−６０又はジャーカット細胞を実験中交換して使用した。Ｃａｒｏｎ２０５０Ｗ交換ユニットによって制御されるＭｅＣｏｕｒの循環熱ブロックにおいて、３７℃でプレートをインキュベートした。発光は１５分と３０分の間（シグナル定常状態）で測定した。
【００８１】
広く様々なタンパク質分解性基質を、傷害状態又は生命力のある細胞中のプロテアーゼ放出又は保持に関する考えられる基質優先性を特徴付けるための作業において調べた（表３参照）。アミノ末端阻害基質（Ｚ、Ｓｕｃ−、又はＡｃ−）を選択して、エンド又はエクソペプチダーゼ活性が優性であったかどうかを示した。非阻害基質（Ｈ−など）を調べて、アミノペプチダーゼ活性の貢献を含めて考えた。この表から、少なくとも３つのタンパク質分解プロファイル：非阻害Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅトリペプチドを好むアミノペプチダーゼ様活性、阻害Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ（配列番号１）ペプチドの放出によって測定したプロテオソーム（キモトリプシン様）活性、及びＧｌｙ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ−Ａｌａ、Ｐｈｅ−、Ｔｙｒ−又はＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ基質による非常に不安定な活性が明らかになった。後者の活性は、生命力のある無処理の細胞中でのみ測定可能であった。さらに重要なのは、幾つかの蛍光団又は発光前標識を使用してこれらの活性を検出することができ、最終的に増大した下流部門の多重化の柔軟性を与えることができることである。
【表３】
【００８２】
Ｇ．多重化プロテアーゼ放出及び保持アッセイ
１．ジャーカット細胞の用量応答性
活発に倍加していたジャーカット細胞を、５０μｌ体積中に２０，０００細胞／１ウエルの細胞密度で９６ウエルプレートに接種した。ＲＰＭＩ１６４０に希釈したアポトーシス誘導リガンド、ｒＴＲＡＩＬの連続希釈液を、他の５０μｌ体積中に２５０ｎｇ〜２４４ｐｇ／ｍｌの最終濃度で各ウエルに加えた。ＲＰＭＩは非誘導対照としてのみ働いた。プレートは４時間の間５％ＣＯ２中で３７℃においてインキュベートした。Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−ＡＦＣ及びＡｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−ＡＭＣは同時にＲＰＭＩ中に１ｍＭに希釈し、１０分の１体積でプレートに加え、３７℃においてさらに３０分間インキュベートした。生成した蛍光は、ＣｙｔｏＦｌｕｏｒＩＩを使用してＥｘ３６０Ｅｍ４６０及びＥｘ４０５Ｅｍ５３０で測定した。蛍光測定を終えた後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）を等しい添加でウエルに加え、ＢＭＧ ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｐｔｉｍａを使用して発光を測定した。
【００８３】
細胞健康状態の２つの別個の非破壊的代替（プロテアーゼ放出及び保持）を多重化させて、マイクロタイタープレート形式で集団の生命力を調べた（参照として本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００２１５８を参照）。生成するデータは、その細胞集団の健康状態の逆の指標である。この関係は対照の使用を可能にし、一定レベルの標準化をもたらす。さらに、生命力の第３の指標（ＡＴＰ含有量）を干渉又は消光なしで連続多重化形式に加えて、データの解釈においてさらなる信頼性を与えることができる。
【００８４】
２．ＳＫ−ＭＥＬ−２８及びＡＣＨＮ細胞
ＳＫ−ＭＢＬ−２８又はＡＣＨＮ細胞を１００μｌ体積中に１０，０００細胞／１ウエルの細胞密度で白壁透明底の９６ウエルプレート中に接種し、２時間の間５％ＣＯ２中で３７℃において接着させた。接着後、５０μｌの培地を注意深く除去し、ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳにイオノマイシン又はスタウロスポリンのいずれかを希釈した連続希釈液と交換した。培地は対照としてのみ働いた。プレートはさらに５時間インキュベートした。Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−ＡＦＣの１ｍＭ溶液をＭＥＭ中に作製し、１０分の１体積でウエルに加えた。生成した蛍光は、ＣｙｔｏＦｌｕｏｒＩＩを使用して測定した。カスパーゼ−Ｇｌｏ（商標）３／７試薬を次いで加え、ＢＭＧ ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｐｔｉｍａを使用して発光を測定した。
【００８５】
プロテアーゼ保持基質はウエル中で一般的な生命力を示し、一方カスパーゼ特異的試薬は特異的経路の細胞毒性を示した。この点において、カスパーゼ活性化（及びしたがってアポトーシス誘導）はＳＫ−ＭＥＬ−２８においてスタウロスポリンを用いて明らかであり、一方イオノマイシンは壊死型プロファイルと似ている。アポトーシスのプロファイルも、スタウロスポリンで処理したＡＣＨＮに関して観察する。
【００８６】
３．ＨｅＬａ細胞及びタモキシフェン処理
ＨｅＬａ細胞を１００μｌ体積中に１０，０００細胞／１ウエルの細胞密度で白壁透明底の９６ウエルプレート中に接種し、２時間の間５％ＣＯ２中で３７℃において接着させた。接着後、５０μｌの培地を露出時間の２４、７、５、３、１及び０時間で注意深く除去し、ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳに溶かした５０μＭのタモキシフェンと交換した。培地は対照としてのみ働いた。プロテアーゼ保持及び放出試薬は、ルシフェリン検出試薬の塊を２ｍｌの１０ｍＭＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．５で再水和することによって調製した。次いでこの溶液を、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−アミノルシフェリンとＧｌｙ−Ｐｈｅ−ＡＦＣの両方を用いて５００μＭにした。５分１体積の溶液を全てのウエルに加え、Ｍｅ’Ｃｏｕｒサーモユニット中で３７℃において１５分間インキュベートした。発光はＢＭＧ ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｐｔｉｍａによって測定し、蛍光はＣｙｔｏＦｌｕｏｒＩＩを使用して測定した。
【００８７】
この実施例は、混合型形式（蛍光と発光）が、設計したプロテアーゼ保持及び放出アッセイにおいて可能であることを実証する。これらの試薬が非溶解性であり明らかに非毒性であることは注目に値し、Ａｐｏ−ＯＮＥ（商標）アッセイによるカスパーゼ−３／７検出などのスペクトルによって明確である他の下流部門用途に、これらの試薬を施しやすいことを示唆する。
【００８８】
４．ＤＮＡ染色を用いた生存／死亡細胞のプロテアーゼアッセイの使用
ＨｅＬａ又はＨｅｐＧ２細胞を１００μｌ体積中に１０，０００細胞／１ウエルの細胞密度で白壁透明底の９６ウエルプレート中に接種し、２時間の間５％ＣＯ２中で３７℃において接着させた。接着後、５０μｌの培地を注意深く除去し、ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳにタモキシフェン又はイオノマイシンのいずれかを希釈した連続希釈液と交換した。培地は対照としてのみ働いた。これらの化合物と共にインキュベーションをさらに５時間続けた。プロテアーゼ保持及び放出試薬は、ルシフェリン検出試薬の塊（ＰｒｏｍｅｇａＶ８５９Ａ）を２ｍｌの１０ｍＭＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．５で再水和することによって調製した。次いでこの溶液を、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−アミノルシフェリンとＧｌｙ−Ｐｈｅ−ＡＦＣの両方を用いて５００μＭにした。５分１体積の溶液を全てのウエルに加え、Ｍｅ’Ｃｏｕｒサーモユニット中で３７℃において１５分間インキュベートした。発光はＢＭＧ ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｐｔｉｍａによって測定し、蛍光はＣｙｔｏＦｌｕｏｒＩＩを使用して測定した。次に、残存していた生命力のある細胞を０．４％のＮＰ−９洗浄剤を加えることによって溶かした。回転式攪拌機によって軽く混合した後、ＭＥＭにＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を希釈した１：２０希釈液を、さらに１０分の１体積で加えた。ＤＮＡ／色素結合と関係があった蛍光は、ＣｙｔｏＦｌｕｏｒＩＩを使用してＥｘ．４８５Ｅｍ．５３０で測定した。
【００８９】
この実験は、スクリーニング向きの２つの他の接着細胞型に対するプロテアーゼに基づく生命力の試験の有用性を広げるだけでなく、ＤＮＡ染色によって「全体の」測定値を得る。スペクトルの違い及び混合形式の読み出しのため、全ての測定値は非干渉性で非消光性である。
【００９０】
考察
薬剤発見と基礎研究の尽力の両方が、一層精巧な細胞モデル系を利用し続けている。実験操作後のこれらのｉｎ ｖｉｔｒｏ系における、細胞数及び生命力を測定するための絶対的必要性は十分理解されている。この要件は測定の有効性を検証し、複雑な生物系の文脈内でこれらの応答を標準化するのに必要である。
【００９１】
残念ながら、細胞の生命力及び細胞毒性を定義するための現在の化学は、生物研究の新たな方法及び技法に追いついておらず、したがって限られた実験オプションを有する。例えば、アッセイ多重化、即ち同一ウエルにおける組合せアッセイの出現によって、アッセイ性能を著しく低下させない適合性がありスペクトルで区別するアッセイの組合せに関する要件が必要とされてきている。細胞健康状態の一般的な相補的な測定法と、カスパーゼ活性化又はレポーター遺伝子の調節などのより特異的な事象を結び付ける点において、この義務は特に重要である。
【００９２】
細胞の生命力及び／又は細胞毒性レポーターを測定するための前述の方法は、多くの下流部門のアッセイ用途と適合性がある。これは分岐励起及び発光スペクトルを有する別個の蛍光団によって、或いは発光などの他のレポーター形式を組み込むことによって実施する。終点測定のアッセイウインドウの柔軟性を与える非溶解性でおそらく非毒性である環境中で、これを実施することは注目に値する。さらに、この技術はスループット、小型化及び自動化を適応させるほど充分感度が良くコスト効率が良い。様々なアッセイによって与えられる利点の比較は表４中に与える。
【００９３】
【表４】
【００９４】
結論として今日まで、哺乳動物プロテアーゼの試験における公開済みの尽力のバランスは、主に容易に精製、分泌、或いは分泌精製されるプロテアーゼを中心に考えられている。これらの試験から与えられる情報はタンパク質分解機構、構造及び機能の見識を与えているが、プロテオミクスの予想から推測されている以外の他のプロテアーゼに関しては、ほとんど知られていない。
【００９５】
ますます多くの証拠が、幾つかのサイトゾルプロテアーゼは、細胞恒常性の機構と関連することを示唆している。プロテアソームはサイトゾルペプチドの遊離と明らかに関係があるが、幾つかの発見は、他の保存的サイトゾルプロテアーゼの役割を示唆している（Ｖｉｔｉｔｓｋｙら、１９９７；Ｃｏｎｓｔａｍら、１９９５）。
【００９６】
本明細書に記載する、個々のプロテアーゼアッセイ及びプロテアーゼベースの生存／死亡細胞のアッセイは、スペクトルの違いのため多重化に関して一層柔軟であり、アッセイの相補性又は他の終点アッセイの組合せ、例えばＡＭＣ、ＡＦＣ、Ｒ１１０、クレシルバイオレット又は発光、色素による消光なし、体積制限なし、逆方向工学処理なしのアッセイの化学的性質、短いインキュベーション時間、同様又はより良い実用感度（スクリーニング環境中の細胞生命力の変化の割合）、下流部門のＤＮＡ結合による干渉がないアッセイ、及び洗浄又は遠心分離の必要がないアッセイ、例えば同種間アッセイをもたらす。さらに、プロテアーゼの基質は比較的単純であってよく、例えばジ又はトリペプチドは、よく知られている化学法によって蛍光又は発光基質と結合させ、非毒性及び／又は非突然変異誘発性、安定性基質を様々な形式で、例えばＤＭＳＯ中又は乾燥中で与えることができる。
【００９７】
（実施例ＩＩ）
プロテアソーム活性の細胞ベースのアッセイ
材料及び方法
プレート調製
ＮＣＩ−Ｈ２２６細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−５８２６）を、ＲＰＭＩ１６４０（Ｓｉｇｍａ番号Ｒ−８００５）及び１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ番号ＳＨ３００７０）を使用して付着線として保ち、必要に応じて継代した。ジャーカット細胞、ＨＬ−６０及びＵ９３７懸濁細胞系も同様に保ち、継代した。細胞ベースのプロテアソームアッセイ用の細胞を調製するために、接着細胞は培地を除去し、Ｄ−ＰＢＳでフラスコを洗浄することによって親フラスコから採取し、３７℃で３〜４分間トリプシン−ＥＤＴＡ（ＳｉｇｍａＴ−４０４０）と共にインキュベートした。トリプシン反応は血清を含む完全培地を加えることによって停止させ、次いで細胞は２００×Ｇで４分間遠心分離にかけた。細胞ペレットは新たな培地に懸濁させ、トリパンブルー排除によって細胞を計数し、１．１１×１０５個細胞／ｍｌに調節した。９６ウエルの透明底／白壁プレート（Ｃｏｓｔａｒ番号３６１０）を入手し、９０μｌ／ウエルの細胞懸濁液又は培地のみを分注した。接着細胞に関して一晩３７℃において、加湿した５％ＣＯ２インキュベーター中でプレートを培養した。懸濁細胞は薬剤処理前に約１．５時間平衡状態にした。
【００９８】
薬剤添加
ラクタシスチン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ番号０３−３４−００５１）を水中に５ｍＭに最初に懸濁させ、これを使用して細胞に加えるための濃縮希釈液を調製した。ラクタシスチンの１０×濃縮希釈液を、１０μｌ／ウエルの添加後の最終濃度が０〜２５μＭの範囲になるように培養培地に調製した。連続希釈液を調製して、一連の中間希釈液を得た。他の阻害剤、カルペプチン及びＡｄａＡｈｘ３Ｌ３ＶＳ（アダマンタン−アセチル−（６−アミノヘキサノイル）３−（ロイシニル）３−ビニル−（メチル）−スルホン）などのストックを、同様に調製し希釈した。細胞ベースの阻害用に、薬剤をウエルに加え（１０μｌ／ウエル）、次いでプレートを、プレート攪拌機において６０秒間攪拌することによって軽く混合させた。プレートを３７℃のインキュベーターに１．５時間戻して、薬剤を細胞に進入させた。
【００９９】
２×試薬の調製
試薬は以下のように調製した：ルシフェリン検出試薬（Ｐｒａｍｅｇａ番号Ｖ８５９Ａ）を
１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６、ＫＯＨを使用して調節）（ＳｉｇｍａＨ４０３４）
１ｍＭのＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）
６０ｍＭのＭｇＳＯ４（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ番号Ｍ６３−５００）
４０μｇ／ｍｌのジギトニン（ＳｉｇｍａＤ−１４１）で懸濁させた。
【０１００】
ルシフェリン検出試薬（ＬＤＲ）は、還元したとき以下のものを含む：
０．６％のＰｒｉｏｎｅｘ（Ｐｅｎｔａｐｈａｍａ、Ｂａｓｅｌ、スイス）
０．４ｍＭのＡＴＰ
１００μｇ／ｍｌの組換えルシフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｅ１４０Ｘ）
２Ｕ／ｍｌの無機ピロリン酸
【０１０１】
例えば、Ｖ８５９Ａ（ルシフェリン検出試薬）の１つのバイアルを１０ｍｌのバッファーで懸濁させ、それに５０〜１００μの基質を加え、１００μｌの細胞を１００μｌの基質含有試薬と組み合わせる。アミノルシフェリン系基質用に、プレインキュベーションステップを使用することができる。例えば、４０μＭ又は８０μＭのＳｕｃ−ＬＬＶＹ−アミノルシフェリン（Ｐｒｏｍｅｇａ；配列番号１）プロテアーゼ基質を還元ＬＤＲに加えて、３０分間２２℃でインキュベートした。このプレインキュベーションは基質中に存在する遊離アミノルシフェリンを枯渇させ、これによって考えられるバックグラウンド発光を低下させる。
【０１０２】
細胞への添加
様々な濃度のラクタシスチン又は他の阻害剤で１〜２時間、例えば１．５時間処理した細胞を含む細胞培養プレートをインキュベーターから除去し、３０分間２２℃で平衡状態にして、均一に中身を平衡状態にした。等しい体積（１００μｌ／ウエル）の試薬を各ウエルに加え、１分間回転式プレート攪拌機を使用してプレートを混合した。次いでアッセイプレートは、水浴を使用して２２℃に保った。発光読み取りのために、発光はＤＹＮＥＸ＠ＭＬＸ照度計を使用して経時的に測定し、プレートはそれぞれの読み取り後に２２℃の水浴に戻して、一定温度を保った。
【０１０３】
結果
発光基質を使用して、プロテアソームのキモトリプシン様（ＬＬＶＹ；配列番号１）、トリプシン様（ＬＲＲ）及びカスパーゼ様（ｎＬＰｎＬＤ；配列番号２）活性を、これらの活性に対して影響がある様々な量の細胞透過性プロテアソーム阻害剤（ＡｄａＡｈｘ３Ｌ３ＶＳ；図１）を用いた処理後に検出した。細胞は１．５時間培養して、阻害剤を細胞に進入させ、プロテアソームと結合させた。短時間のインキュベーション（１〜２時間）は細胞に対して毒性はなかったが、長時間のインキュベーション時間はアポトーシスを誘導したことが分かった。
【０１０４】
基質をジギトニンと共に、甲虫ルシフェラーゼ介在反応の反応混合物に加えた。ジギトニンの濃度は、原形質膜を選択的に透過し、一群のプロテアーゼを放出するはずである他のオルガネラ、特にリソソームを害さずにサイトゾル分子へのアクセスを可能にするように選択した。選択的透過は培地除去後に無血清条件下で典型的には行い、ジギトニンによる血清干渉を最小にするが、以下に記載するように、血清含有培地中で選択的透過を実施することもできる。さらに、ジギトニン抽出の有効性はＥＤＴＡによって改善され、これは他のプロテアーゼ、特にカルパインの活性を最小にするのを助ける可能性もある（図１２参照）。これらの結果は、ＬＬＶＹ（配列番号１）基質は広い動的範囲を有していたことを示す。
【０１０５】
ラクタシスチンは、哺乳動物プロテアソームサブユニットＸ（ＭＢ１）の高度に保存されたアミノ末端スレオニンと共有結合し、それを修飾するＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓの代謝産物である（Ｍｅｌｌｇｒｅｎ、１９９７；Ｆｅｎｔｅａｎｙら、１９９５）。精製カルパインＩに対するラクタシスチンの影響は、図２Ａ中に示す。これらの結果は、ラクタシスチンはカルパインＩに対して最小の影響があり、カルシウムを活性化することを必要とすることを示す。ＨＬ−６０細胞におけるプロテアソーム活性に対するカルパインＩの阻害剤、カルペプチンの影響は図２Ｂ中に示す。カルペプチンは、ラクタシスチンと対照的に、１．５時間の処理後にプロテアソーム活性に対して最小の影響があった。（カルパインＩの活性を助長するための）ＤＴＴの封入によって、２０μＭでプロテアソームの不完全な阻害をもたらした。
【０１０６】
ＡｄａＡｈｘ３Ｌ３ＶＳ処理後のジャーカット細胞中のＬＬＶＹ（配列番号１）活性は、図３中に示す。ＡｄａＡｈｘ３Ｌ３ＶＳは３つ全ての活性を阻害したが、しかしながら、示された唯一の結果はＬＬＶＹ（配列番号１）活性に関するものだけである。
【０１０７】
それぞれアミノルシフェリン−ＬＬＶＹ（配列番号１）基質及びＬＬＶＹ−ＡＭＣ（配列番号１）基質を用いた、発光及び蛍光アッセイ（図４Ａ〜Ｂ）は、最大発光感度に約１０〜１５分で達し、その後シグナルは低下したが、一方で蛍光感度は１〜３時間までの間増大したことを示した。
【０１０８】
ＬＬＶＹ（配列番号１）活性に関する発光アッセイの直線性及び動態を測定した（図５Ａ〜Ｃ）。試験した条件下で、細胞数に関して全時間地点でアッセイは直線的ではなかったが、プロテアソームアッセイ条件を、アッセイ混合物中のＭｇ及び／又は基質濃度を増大させることによって改善して、プロテアソームを安定化させる、活性を増大させる、且つ／或いは長時間の発光又は「白熱光」をアッセイに与えることができる。
【０１０９】
図６Ａ〜Ｂは、Ｕ９３７（Ａ）及びＨＬ−６０（Ｂ）細胞中でのラクタシスチンによる経時的な発光の阻害を示す。類似したＩＣ５０値を広い枠で得た。
【０１１０】
図７Ａ〜Ｂは、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１５〜３０μｇ／ｍｌのジギトニンを含む培地におけるラクタシスチンで処理した同じプレートの多数の読み取り値を示す。細胞が５％又は１０％ウシ胎児血清のいずれか中に存在したとき、様々な低濃度でジギトニンは細胞を透過し、ほぼ全体のプロテアーゼ活性がラクタシスチンによって阻害され続けた。
【０１１１】
ジギトニンの存在下又は不在下での（０及び２０μｇ／ｍｌのジギトニン）様々な濃度のラクタシスチンで処理したＨＬ−６０細胞又はＵ９３７細胞中での、プロテアソームキモトリプシン活性の比較を図８Ａ〜Ｂ中に示す。試験したラクタシスチンの濃度において、（ＡＴＰアッセイ、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（登録商標）、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩにより測定して）薬剤処理によって細胞を殺傷することはなかった。
【０１１２】
発光プロテアソーム基質及び蛍光（Ｒ１１０）カスパーゼ−３基質を使用した多重化アッセイの結果は、図９中に示す。細胞はラクタシスチンで長時間処理して、カスパーゼ活性を誘導した。グラフは、発光プロテアソーム基質を含む試薬中に存在する蛍光カスパーゼ基質ありとなしで、類似したプロテアソーム阻害曲線を得たことを示し、プロテアソーム活性とアポトーシス活性の両方を測定することができることを示す。
【０１１３】
細胞ベースのアッセイ中のプロテアソーム活性を検出するのに適した、他の透過剤をスクリーニングした（図１０Ａ〜Ｃ）。低濃度の様々な界面活性剤（０．０５及び０．１％の最終濃度）を含む試薬を調製した。完全培地中に２５，０００個のＨＬ−６０細胞を含む１００μｌ／ウエルの試料を９６ウエルプレートに加え、３７℃で平衡状態にした。プレート及び試薬は２２℃に冷却し、等しい体積の試薬をそれぞれの試料に加えた。プレートは１分間攪拌し、次いで２２℃でインキュベートした。次いで発光を経時的に測定した。ＳＤＳ、ＣＨＡＰＳ、ＴＯＭＡＨ（登録商標）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０、Ｇｅｒｏｐｏｎ（登録商標）Ｔ−７７、ＢｉｏＴｅｒｇｅ及びＢｒｉｊ−３５は、プロテアソーム又はルシフェラーゼに対して負の影響を有していた。Ｔｈｅｓｉｔ（登録商標）、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（登録商標）ＴＭＮ−６、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（登録商標）ＮＰ−９、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００及びＮｏｒＩｄｅｔ−４０を含めた幾つかの界面活性剤はプロテアソーム又はルシフェラーゼ活性に実質的に影響を与えなかったが、このアッセイはＬＬＶＹ−アミノルシフェリン（配列番号１）基質を切断するプロテアーゼの供給源は示さない。
【０１１４】
図１１は、ラクタシスチン、ＬＬＶＹ−アミノルシフェリン（配列番号１）及び０．０４％のＴＭＮ−６で処理したＨ２２６細胞からの発光を示す。Ｕ９３７細胞中では０．０５％でのＴＭＮ−６は２０μｇ／ｍｌのジギトニンに匹敵したが、Ｈ２２６細胞と共に０．０４％の濃度で存在するとプロテアソームアッセイには不充分であった。Ｕ９３７細胞も１００μｇ／ｍｌのサポニンで処理したが、しかしながら、後の時間地点では発光シグナルは直線的ではなかった。
【０１１５】
Ｍｇ、ＥＤＴＡ濃度、及びｐＨを変えて反応条件を最適化した。特に、Ｍｇ濃度はキモトリプシン活性に影響を与えるようであり、且つＥＤＴＡ濃度は多数のタンパク質分解活性を変えるようである。プロテアソームを検出するための、発光又は蛍光アッセイに対するＭｇ濃度、又は発光アッセイに対するＥＤＴＡ濃度の影響に関するデータは、図１２及び１３中に示す。
【０１１６】
ｐＨ及び基質濃度を変えた結果は図１４〜１５中に示す。このデータに基づくと、高い基質濃度は半減期を明らかに改善した。
（参考文献）
【０１１７】
全ての刊行物、特許及び特許出願は、参照として本明細書に組み込まれる。前述の明細書中、その幾つかの好ましい実施形態に関して本発明を記載し、多くの詳細を例示の目的で述べてきたが、本発明は他の実施形態が可能であること、及び本明細書に記載した詳細の幾つかは、本発明の基本原理から逸脱せずに大幅に変えることができることは、当業者には明らかであるはずである。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】阻害剤処理（ＡｄａＡｈｘＬ３ＶＳ）後のＵ２６６細胞中の発光キモトリプシン、トリプシン、及びカスパーゼ様プロテアソーム活性の図である。約３５，０００個のＵ２６６細胞を１．５時間阻害剤に曝して、次いで１０μＭの基質と接触させた。
【図２Ａ】プロテアソーム又はカルパインに対するラクタシスチン活性の図である。２５ｍＭのＨＥＰＥＳ／０．５ｍＭのＥＤＴＡ／１ｍＭのＤＴＴ中での０．５時間のプレインキュベーション後、２×試薬を加えた（２０μＭのＬＬＶＹ−アミノルシフェリン（配列番号１）／３ｍＭのＣａＣｌ２／１０ｍＭのＭｇＳＯ４）。
【図２Ｂ】プロテアソームに対するラクタシスチン又はカルパイン活性の図である。基質を加える前にラクタシスチン又はカルペプチンを用いて、３７℃で１．５時間ＨＬ−６０細胞を処理した。
【図３】ジャーカット細胞中のプロテアソーム阻害剤濃度と発光の図である。ジャーカット細胞は阻害剤（ＡｄａＡｈｘＬ３ＶＳ）に１．５時間曝し、次いでＬＬＶＹ−アミノルシフェリン（１０μＭの最終濃度；配列番号１）と接触させた。
【図４Ａ】それぞれ２０μＭのアミノルシフェリン−ＬＬＶＹ（配列番号１）又は２０μＭのＬＬＶＹ−ＡＭＣ（配列番号１）、及びＨＬ−６０細胞での、発光感度と蛍光感度の比較の図である。細胞は２０μｇ／ｍｌのジギトニンで透過処理した。ＨＬ−６０細胞は２２℃に保った。
【図４Ｂ】それぞれ２０μＭのアミノルシフェリン−ＬＬＶＹ（配列番号１）又は２０μＭのＬＬＶＹ−ＡＭＣ（配列番号１）、及びＵ９３７細胞での、発光感度と蛍光感度の比較の図である。Ｕ９３７細胞の蛍光データは、４５分の時間地点からのものであった。
【図５Ａ】発光と細胞数の図である。ＨＬ−６０細胞は２２℃に保ち、２０μｇ／ｍｌのジギトニンで透過処理して、２０μＭのＬＬＶＹ−アミノルシフェリン（配列番号１）と接触させた。
【図５Ｂ】２２℃に保ち２０μｇ／ｍｌのジギトニンで透過処理したＵ９３７細胞中での、発光及びアミノルシフェリン−ＬＬＶＹ（配列番号１）基質（２０μＭ）の動態の図である。
【図５Ｃ】２２℃に保ち２０μｇ／ｍｌのジギトニンで透過処理したＨＬ−６０細胞中での、発光及びアミノルシフェリン−ＬＬＶＹ（配列番号１）基質（２０μＭ）の動態の図である。
【図６Ａ】ラクタシスチンによるＵ９３７細胞中での発光の阻害の図である。約５０，０００個のＵ９３７細胞を、２０μＭのＬＬＶＹ−アミノルシフェリン（配列番号１）及び２０μｇ／ｍｌのジギトニンで処理した。
【図６Ｂ】ラクタシスチンによるＨＬ−６０細胞中での発光の阻害の図である。１０％ＦＢＳを含む培地中の約２５，０００個のＨＬ−６０細胞を、基質及び２０μｇ／ｍｌのジギトニンで処理した。
【図７Ａ】５％ＦＢＳを含む培地中でのジギトニン滴定の図である。５％ＦＢＳを含む培地中の約２５，０００個のラクタシスチン処理ＨＬ−６０細胞を、基質及び様々な量のジギトニンと接触させた。データは、１５分の時間地点からのものである。
【図７Ｂ】１０％ＦＢＳを含む培地中でのジギトニン滴定の図である。１０％ＦＢＳを含む培地中の約２５，０００個のラクタシスチン処理ＨＬ−６０細胞を、基質及び様々な量のジギトニンと接触させた。データは、１５分の時間地点からのものである。
【図８Ａ】様々な濃度のラクタシスチンの存在下及びジギトニンの存在（２０μｇ／ｍｌ）又は不在下での、ＨＬ−６０細胞中でのプロテアソームキモトリプシン活性及びＡＴＰ含有量（生命力）の図である。ラクタシスチン処理は１．５時間であり、データはＨＬ−６０細胞に関して、１６分の時間地点からのものである。細胞の生命力の測定は、平行した一連の試料においてＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）を使用して実施して、生命力はラクタシスチン処理によって影響を受けなかったことを確認した。
【図８Ｂ】様々な濃度のラクタシスチンの存在下及びジギトニンの存在（２０μｇ／ｍｌ）又は不在下での、Ｕ９３７細胞中でのプロテアソームキモトリプシン活性及びＡＴＰ含有量（生命力）の図である。ラクタシスチン処理は１．５時間であり、データはＵ９３７細胞に関して、１８分の時間地点からのものである。細胞の生命力の測定は、平行した一連の試料においてＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）を使用して実施して、生命力はラクタシスチン処理によって影響を受けなかったことを確認した。
【図９Ａ】プロテアソームキモトリプシン様活性及びカスパーゼ３／７活性を測定した、多重化アッセイの図である。ラクタシスチン、及びＬＬＶＹ−アミノルシフェリン（配列番号１）及び（Ｚ−ＤＥＶＤ２）−Ｒ１１０（各基質（ＤＥＶＤ）２；配列番号３に関して１０μＭの最終濃度）で４．５時間処理した、約５０，０００個のジャーカット細胞からの発光データ。
【図９Ｂ】プロテアソームキモトリプシン様活性及びカスパーゼ３／７活性を測定した、多重化アッセイの図である。ラクタシスチン、及びＬＬＶＹ−アミノルシフェリン（配列番号１）及び（Ｚ−ＤＥＶＤ２）−Ｒ１１０（各基質；配列番号３に関して１０μＭの最終濃度）で４．５時間処理した、約５０，０００個のジャーカット細胞からの蛍光データ。
【図１０Ａ】細胞ベースの発光反応中のプロテアソームを検出するのに適した細胞膜透過処理試薬のスクリーニングの図である。ラクタシスチン処理の不在下で約２５，０００個のＨＬ−６０細胞を、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６／０．５ｍＭのＥＤＴＡ／３０ｍＭのＭｇＳＯ４（ＨＬ−６０細胞に関して１０μＭの基質）中で界面活性剤及び基質と共に２２℃でインキュベートした。
【図１０Ｂ】細胞ベースの発光反応中のプロテアソームを検出するのに適した細胞膜透過処理試薬のスクリーニングの図である。ラクタシスチン処理の不在下で約２５，０００個のＨＬ−６０細胞を、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６／０．５ｍＭのＥＤＴＡ／３０ｍＭのＭｇＳＯ４（ＨＬ−６０細胞に関して１０μＭの基質）中で界面活性剤及び基質と共に２２℃でインキュベートした。
【図１０Ｃ】細胞ベースの発光反応中のプロテアソームを検出するのに適した細胞膜透過処理試薬のスクリーニングの図である。ラクタシスチン処理後に２５，０００個のＵ９３７細胞を、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６／０．５ｍＭのＥＤＴＡ／３０ｍＭのＭｇＳＯ４（Ｕ９３７細胞に関して２０μＭの基質）中で界面活性剤及び基質と共に２２℃でインキュベートした。
【図１１】２２℃で５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６／０．５ｍＭのＥＤＴＡ／３０ｍＭのＭｇＳＯ４中においてラクタシスチン、０．０４％のＴＭＮ−６及び２０μＭのＬＬＶＹ−アミノルシフェリン（配列番号１）で処理したＨ２２６細胞からの発光の図である。
【図１２Ａ】発光アッセイ中のＭｇ濃度の影響の図である。約２５，０００個のＨＬ−６０細胞を、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、２０μｇ／ｍｌのジギトニン及び２０μＭの基質で処理した。
【図１２Ｂ】発光アッセイ中の半減期動態に対するＭｇの影響の図である。約２５，０００個のＨＬ−６０細胞を、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、２０μｇ／ｍｌのジギトニン及び２０μＭの基質で処理した。
【図１２Ｃ】Ｕ９３７細胞を用いた発光アッセイ中のＭｇ濃度の影響の図である。細胞は２０μｇ／ｍｌのジギトニン及び２０μＭの基質で処理した。
【図１２Ｄ】Ｕ９３７細胞を用いた発光アッセイ中のＭｇ濃度の影響の図である。細胞は２０μｇ／ｍｌのジギトニン及び２０μＭの基質で処理した。
【図１２Ｅ】蛍光アッセイ中のＭｇ濃度の影響の図である。ラクタシスチンの不在下で２２℃において、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６／０．５ｍＭのＥＤＴＡ、及び様々な濃度のＭｇＳＯ４中で、ＨＬ−６０細胞を２０μｇ／ｍｌのジギトニン、２０μＭのＬＬＶＹ−ＡＭＣ（配列番号１）と接触させた。
【図１２Ｆ】発光とＭｇ濃度の図である。ラクタシスチンの不在下で２２℃において、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６／０．５ｍＭのＥＤＴＡ、及び様々な濃度のＭｇＳＯ４中で、ＨＬ−６０細胞を２０μｇ／ｍｌのジギトニン、２０μＭのＬＬＶＹ−アミノルシフェリン（配列番号１）と接触させた。
【図１３Ａ】発光とＥＤＴＡ濃度の図である。ラクタシスチンの不在下で２２℃において、Ｕ９３７細胞を２０μｇ／ｍｌのジギトニン、２０μＭの基質、３０ｍＭのＭｇＳＯ４及び様々な濃度のＥＤＴＡと接触させた。
【図１３Ｂ】ラクタシスチンで処理したＵ９３７細胞中の発光とＥＤＴＡ濃度の図である。細胞は２０μｇ／ｍｌのジギトニン、２０μＭの基質、３０ｍＭのＭｇＳＯ４及び様々な濃度のＥＤＴＡと接触させた。データは、３０分の時間地点からのものである。
【図１３Ｃ】ラクタシスチンで処理したＰＡ−１細胞中の発光とＥＤＴＡ濃度の図である。細胞は２０μｇ／ｍｌのジギトニン、２０μＭの基質、及び３０ｍＭのＭｇＳＯ４と接触させた。データは、３０分の時間地点からのものである。
【図１４】様々なｐＨでの発光プロテアソームアッセイの動態の図である。２２℃において約２５，０００個のジャーカット細胞を、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ／０．５ｍＭのＥＤＴＡ／３０ｍＭのＭｇＳＯ４中で２０μＭの基質と接触させた。
【図１５】発光プロテアソームアッセイ中のｐＨ及び基質濃度の影響の図である。２２℃において約２５，０００個のジャーカット細胞を、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６又は８．２／０．５ｍＭのＥＤＴＡ／３０ｍＭのＭｇＳＯ４中で様々な量の基質と接触させた。
【図１６】多重化アッセイにおいて有用である可能性がある３つの蛍光団のプロファイルの図である。Ｅｘ＝励起スペクトル；ｅｍ＝放射スペクトル。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテアソームと関連する１つ又は複数のプロテアソーム特異的タンパク質分解活性を検出するための方法であって、
ａ）真核生物細胞、細胞中の細胞内膜結合オルガネラ又は区画を実質的に害さない量の細胞膜透過処理試薬、及びプロテアソーム関連プロテアーゼの発光基質を含む甲虫ルシフェラーゼ介在反応の反応混合物を用意することであって、前記プロテアーゼによる発光基質のタンパク質分解によって甲虫ルシフェラーゼの基質が生成すること、及び
ｂ）反応混合物中の発光を検出すること
を含む、上記方法。
【請求項２】
プロテアソームと関連する１つ又は複数のプロテアソーム特異的タンパク質分解活性を検出するための方法であって、
ａ）無処理の真核生物細胞を含む試料を、プロテアソーム関連プロテアーゼの発光基質及び細胞中の細胞内膜結合オルガネラ又は区画を実質的に害さない量の細胞膜透過処理試薬を含む甲虫ルシフェラーゼ介在反応の反応混合物と接触させて、混合物を生成することであって、前記プロテアーゼによる発光基質のタンパク質分解によって甲虫ルシフェラーゼの基質が生成すること、及び
ｂ）混合物中の発光を検出すること
を含む、上記方法。
【請求項３】
発光基質がキモトリプシン基質である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
発光基質がトリプシン基質である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
発光基質がカスパーゼ基質である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
発光基質がＬＬＶＹ（配列番号１）を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項７】
発光基質がＬＲＲを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項８】
発光基質がｎＬＰｎＬＤ（配列番号２）を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項９】
前記混合物を、第２の酵素の蛍光基質を含む第２の酵素介在反応の第２の反応混合物と接触させることをさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１０】
蛍光を検出することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
蛍光を使用して第２の酵素介在反応の補助因子、基質又は酵素の存在又は量を検出する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
発光と蛍光を連続的に検出する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
反応混合物が第２の酵素介在反応の蛍光基質をさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１４】
蛍光を検出することをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
蛍光を使用して第２の酵素介在反応の補助因子、基質又は酵素の存在又は量を検出する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
発光と蛍光を同時に検出する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
発光と蛍光を同時に検出する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
発光と蛍光を連続的に検出する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
発光を検出した後に細胞を溶解させる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項２０】
蛍光基質が臭化エチジウム、フルオレセイン、Ｃｙ３、ＢＯＤＩＰＹ、ロドール、Ｒｏｘ、５−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、アントラセン、２−アミノ−４−メトキシナフタレン、フェナレノン、アクリドン、フッ素化キサンテン系誘導体、α−ナフトール、β−ナフトール、１−ヒドロキシピレン、クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（ＡＦＣ）、テキサスレッド、テトラメチルローダミン、カルボキシローダミン、ローダミン、クレシルバイオレット、ローダミン−１１０又はレゾルフィンを含む、請求項９又は１３に記載の方法。
【請求項２１】
第２の酵素介在反応がグリコシダーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、デヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、スルファターゼ、ペプチダーゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロキシラーゼ、デアルキラーゼ、デハロゲナーゼ、デアミダーゼ、又はヒドロラーゼによって介在される、請求項９又は１３に記載の方法。
【請求項２２】
第２の酵素介在反応がプロテアーゼによって介在される、請求項９又は１３に記載の方法。
【請求項２３】
第２の酵素がカスパーゼである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
カスパーゼがカスパーゼ−３又はカスパーゼ−７を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記混合物を、細胞分子を検出するための試薬を含む組成物と接触させることをさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項２６】
細胞分子を検出する試薬が核酸又はタンパク質を検出する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
細胞分子を検出することをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
蛍光を使用して細胞分子を検出する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
試薬が蛍光性である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
試薬が臭化エチジウム、ヨウ化プロピジウム、又はアクリジンオレンジを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
試薬が核酸結合色素を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
前記混合物を、非酵素反応と関連する部分を検出するために第２の反応混合物と接触させることをさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項３３】
非酵素反応が前記部分と別の分子の結合を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
細胞中の２つ以上のサイトゾル活性を検出するための方法であって、
ａ）真核生物細胞、プロテアソーム関連プロテアーゼの蛍光又は発光基質、プロテアソームと関連しないサイトゾル酵素の第２の基質、及び細胞中の細胞内膜結合オルガネラ又は区画を実質的に害さない量の細胞膜透過処理試薬を含む反応混合物を用意すること、及び
ｂ）発光又は蛍光及びプロテアソームと関連しないサイトゾル酵素の存在又は量を反応混合物中において検出することであって、発光又は蛍光がプロテアソーム関連プロテアーゼの活性と関連すること
を含む、上記方法。
【請求項３５】
細胞中の２つ以上のサイトゾル活性を検出するための方法であって、
ａ）無処理の真核生物細胞を含む試料を、プロテアソーム特異的プロテアーゼの蛍光又は発光基質、プロテアソームと関連しないサイトゾル酵素の基質、及び細胞中の細胞内膜結合オルガネラ又は区画を実質的に害さない量の細胞膜透過処理試薬を含む反応混合物と接触させて、混合物を生成すること、及び
ｂ）発光又は蛍光及びプロテアソームと関連しないサイトゾル酵素の存在又は量を混合物中において検出することであって、発光又は蛍光がプロテアソーム関連プロテアーゼの活性と関連すること
を含む、上記方法。
【請求項３６】
蛍光又は発光基質がキモトリプシン基質である、請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項３７】
蛍光又は発光基質がトリプシン基質である、請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項３８】
蛍光又は発光基質がカスパーゼ基質である、請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項３９】
蛍光又は発光基質がＬＬＶＹ（配列番号１）を含む、請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項４０】
蛍光又は発光基質がＬＲＲを含む、請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項４１】
蛍光又は発光基質がｎＬＰｎＬＤ（配列番号２）を含む、請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項４２】
プロテアソームと関連するプロテアーゼの基質が、プロテアーゼによるタンパク質分解後に甲虫ルシフェラーゼの基質を生成する発光基質であり、第２の基質が蛍光基質である、請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項４３】
発光と蛍光を連続的に検出する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
発光と蛍光を同時に検出する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
プロテアソームと関連するプロテアーゼの基質が蛍光基質であり、プロテアーゼによるタンパク質分解後に基質を生成する第２の基質が甲虫ルシフェラーゼの発光基質である、請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項４６】
発光と蛍光を連続的に検出する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
発光と蛍光を同時に検出する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
蛍光を検出した後に細胞を溶解させる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
発光を検出した後に細胞を溶解させる、請求項４２に記載の方法。
【請求項５０】
蛍光基質が臭化エチジウム、フルオレセイン、Ｃｙ３、ＢＯＤＩＰＹ、ロドール、Ｒｏｘ、５−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、アントラセン、２−アミノ−４−メトキシナフタレン、フェナレノン、アクリドン、フッ素化キサンテン系誘導体、α−ナフトール、β−ナフトール、１−ヒドロキシピレン、クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（ＡＦＣ）、テキサスレッド、テトラメチルローダミン、カルボキシローダミン、ローダミン、クレシルバイオレット、ローダミン−１１０又はレゾルフィンを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項５１】
蛍光基質が臭化エチジウム、フルオレセイン、Ｃｙ３、ＢＯＤＩＰＹ、ロドール、Ｒｏｘ、５−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、アントラセン、２−アミノ−４−メトキシナフタレン、フェナレノン、アクリドン、フッ素化キサンテン系誘導体、α−ナフトール、β−ナフトール、１−ヒドロキシピレン、クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（ＡＦＣ）、テキサスレッド、テトラメチルローダミン、カルボキシローダミン、ローダミン、クレシルバイオレット、ローダミン−１１０又はレゾルフィンを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項５２】
サイトゾル酵素がグリコシダーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、デヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、スルファターゼ、ペプチダーゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロキシラーゼ、デアルキラーゼ、デハロゲナーゼ、デアミダーゼ、又はヒドロラーゼである、請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項５３】
発光基質を含む反応混合物が甲虫ルシフェラーゼ介在反応の反応混合物である、請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項５４】
細胞膜透過処理試薬がジギトニンである、請求項１、２、３４又は３５に記載の方法。
【請求項５５】
ジギトニンが約１０μｇ／ｍｌ〜４０μｇ／ｍｌで存在する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
プロテアソーム特異的タンパク質分解活性の調節物質を同定するための方法であって、
ａ）１つ又は複数の作用物質と、真核生物細胞と、細胞中の細胞内膜結合オルガネラ又は区画を実質的に害さない量の細胞膜透過処理試薬、及びプロテアソーム関連プロテアーゼの発光基質を含む甲虫ルシフェラーゼ介在反応の反応混合物とを接触させて、混合物を生成することであって、プロテアーゼによる発光基質のタンパク質分解によって甲虫ルシフェラーゼの基質が生成すること、及び
ｂ）混合物中の発光を１つ又は複数の作用物質を欠く対応する混合物中の発光と比較すること
を含む、上記方法。
【請求項５７】
１つ又は複数の作用物質がプロテアソームの活性を阻害する、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
真核生物細胞を含む反応混合物中において有効量で、細胞中の細胞内膜結合オルガネラ又は区画を実質的に害さない量の細胞膜透過処理試薬を含むバッファー、及び
プロテアソーム関連プロテアーゼの発光又は蛍光基質を含むキット。
【請求項５９】
プロテアソームと関連しない酵素の基質をさらに含む、請求項５８に記載のキット。
【請求項６０】
発光基質が、プロテアソームと関連するプロテアーゼによって切断されると甲虫ルシフェラーゼの基質を生成する、請求項５８に記載のキット。
【請求項１】
プロテアソームと関連する１つ又は複数のプロテアソーム特異的タンパク質分解活性を検出するための方法であって、
ａ）真核生物細胞、細胞中の細胞内膜結合オルガネラ又は区画を実質的に害さない量の細胞膜透過処理試薬、及びプロテアソーム関連プロテアーゼの発光基質を含む甲虫ルシフェラーゼ介在反応の反応混合物を用意することであって、前記プロテアーゼによる発光基質のタンパク質分解によって甲虫ルシフェラーゼの基質が生成すること、及び
ｂ）反応混合物中の発光を検出すること
を含む、上記方法。
【請求項２】
プロテアソームと関連する１つ又は複数のプロテアソーム特異的タンパク質分解活性を検出するための方法であって、
ａ）無処理の真核生物細胞を含む試料を、プロテアソーム関連プロテアーゼの発光基質及び細胞中の細胞内膜結合オルガネラ又は区画を実質的に害さない量の細胞膜透過処理試薬を含む甲虫ルシフェラーゼ介在反応の反応混合物と接触させて、混合物を生成することであって、前記プロテアーゼによる発光基質のタンパク質分解によって甲虫ルシフェラーゼの基質が生成すること、及び
ｂ）混合物中の発光を検出すること
を含む、上記方法。
【請求項３】
発光基質がキモトリプシン基質である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
発光基質がトリプシン基質である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
発光基質がカスパーゼ基質である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
発光基質がＬＬＶＹ（配列番号１）を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項７】
発光基質がＬＲＲを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項８】
発光基質がｎＬＰｎＬＤ（配列番号２）を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項９】
前記混合物を、第２の酵素の蛍光基質を含む第２の酵素介在反応の第２の反応混合物と接触させることをさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１０】
蛍光を検出することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
蛍光を使用して第２の酵素介在反応の補助因子、基質又は酵素の存在又は量を検出する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
発光と蛍光を連続的に検出する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
反応混合物が第２の酵素介在反応の蛍光基質をさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１４】
蛍光を検出することをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
蛍光を使用して第２の酵素介在反応の補助因子、基質又は酵素の存在又は量を検出する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
発光と蛍光を同時に検出する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
発光と蛍光を同時に検出する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
発光と蛍光を連続的に検出する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
発光を検出した後に細胞を溶解させる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項２０】
蛍光基質が臭化エチジウム、フルオレセイン、Ｃｙ３、ＢＯＤＩＰＹ、ロドール、Ｒｏｘ、５−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、アントラセン、２−アミノ−４−メトキシナフタレン、フェナレノン、アクリドン、フッ素化キサンテン系誘導体、α−ナフトール、β−ナフトール、１−ヒドロキシピレン、クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（ＡＦＣ）、テキサスレッド、テトラメチルローダミン、カルボキシローダミン、ローダミン、クレシルバイオレット、ローダミン−１１０又はレゾルフィンを含む、請求項９又は１３に記載の方法。
【請求項２１】
第２の酵素介在反応がグリコシダーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、デヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、スルファターゼ、ペプチダーゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロキシラーゼ、デアルキラーゼ、デハロゲナーゼ、デアミダーゼ、又はヒドロラーゼによって介在される、請求項９又は１３に記載の方法。
【請求項２２】
第２の酵素介在反応がプロテアーゼによって介在される、請求項９又は１３に記載の方法。
【請求項２３】
第２の酵素がカスパーゼである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
カスパーゼがカスパーゼ−３又はカスパーゼ−７を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記混合物を、細胞分子を検出するための試薬を含む組成物と接触させることをさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項２６】
細胞分子を検出する試薬が核酸又はタンパク質を検出する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
細胞分子を検出することをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
蛍光を使用して細胞分子を検出する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
試薬が蛍光性である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
試薬が臭化エチジウム、ヨウ化プロピジウム、又はアクリジンオレンジを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
試薬が核酸結合色素を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
前記混合物を、非酵素反応と関連する部分を検出するために第２の反応混合物と接触させることをさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項３３】
非酵素反応が前記部分と別の分子の結合を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
細胞中の２つ以上のサイトゾル活性を検出するための方法であって、
ａ）真核生物細胞、プロテアソーム関連プロテアーゼの蛍光又は発光基質、プロテアソームと関連しないサイトゾル酵素の第２の基質、及び細胞中の細胞内膜結合オルガネラ又は区画を実質的に害さない量の細胞膜透過処理試薬を含む反応混合物を用意すること、及び
ｂ）発光又は蛍光及びプロテアソームと関連しないサイトゾル酵素の存在又は量を反応混合物中において検出することであって、発光又は蛍光がプロテアソーム関連プロテアーゼの活性と関連すること
を含む、上記方法。
【請求項３５】
細胞中の２つ以上のサイトゾル活性を検出するための方法であって、
ａ）無処理の真核生物細胞を含む試料を、プロテアソーム特異的プロテアーゼの蛍光又は発光基質、プロテアソームと関連しないサイトゾル酵素の基質、及び細胞中の細胞内膜結合オルガネラ又は区画を実質的に害さない量の細胞膜透過処理試薬を含む反応混合物と接触させて、混合物を生成すること、及び
ｂ）発光又は蛍光及びプロテアソームと関連しないサイトゾル酵素の存在又は量を混合物中において検出することであって、発光又は蛍光がプロテアソーム関連プロテアーゼの活性と関連すること
を含む、上記方法。
【請求項３６】
蛍光又は発光基質がキモトリプシン基質である、請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項３７】
蛍光又は発光基質がトリプシン基質である、請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項３８】
蛍光又は発光基質がカスパーゼ基質である、請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項３９】
蛍光又は発光基質がＬＬＶＹ（配列番号１）を含む、請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項４０】
蛍光又は発光基質がＬＲＲを含む、請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項４１】
蛍光又は発光基質がｎＬＰｎＬＤ（配列番号２）を含む、請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項４２】
プロテアソームと関連するプロテアーゼの基質が、プロテアーゼによるタンパク質分解後に甲虫ルシフェラーゼの基質を生成する発光基質であり、第２の基質が蛍光基質である、請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項４３】
発光と蛍光を連続的に検出する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
発光と蛍光を同時に検出する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
プロテアソームと関連するプロテアーゼの基質が蛍光基質であり、プロテアーゼによるタンパク質分解後に基質を生成する第２の基質が甲虫ルシフェラーゼの発光基質である、請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項４６】
発光と蛍光を連続的に検出する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
発光と蛍光を同時に検出する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
蛍光を検出した後に細胞を溶解させる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
発光を検出した後に細胞を溶解させる、請求項４２に記載の方法。
【請求項５０】
蛍光基質が臭化エチジウム、フルオレセイン、Ｃｙ３、ＢＯＤＩＰＹ、ロドール、Ｒｏｘ、５−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、アントラセン、２−アミノ−４−メトキシナフタレン、フェナレノン、アクリドン、フッ素化キサンテン系誘導体、α−ナフトール、β−ナフトール、１−ヒドロキシピレン、クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（ＡＦＣ）、テキサスレッド、テトラメチルローダミン、カルボキシローダミン、ローダミン、クレシルバイオレット、ローダミン−１１０又はレゾルフィンを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項５１】
蛍光基質が臭化エチジウム、フルオレセイン、Ｃｙ３、ＢＯＤＩＰＹ、ロドール、Ｒｏｘ、５−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、アントラセン、２−アミノ−４−メトキシナフタレン、フェナレノン、アクリドン、フッ素化キサンテン系誘導体、α−ナフトール、β−ナフトール、１−ヒドロキシピレン、クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（ＡＦＣ）、テキサスレッド、テトラメチルローダミン、カルボキシローダミン、ローダミン、クレシルバイオレット、ローダミン−１１０又はレゾルフィンを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項５２】
サイトゾル酵素がグリコシダーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、デヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、スルファターゼ、ペプチダーゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロキシラーゼ、デアルキラーゼ、デハロゲナーゼ、デアミダーゼ、又はヒドロラーゼである、請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項５３】
発光基質を含む反応混合物が甲虫ルシフェラーゼ介在反応の反応混合物である、請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項５４】
細胞膜透過処理試薬がジギトニンである、請求項１、２、３４又は３５に記載の方法。
【請求項５５】
ジギトニンが約１０μｇ／ｍｌ〜４０μｇ／ｍｌで存在する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
プロテアソーム特異的タンパク質分解活性の調節物質を同定するための方法であって、
ａ）１つ又は複数の作用物質と、真核生物細胞と、細胞中の細胞内膜結合オルガネラ又は区画を実質的に害さない量の細胞膜透過処理試薬、及びプロテアソーム関連プロテアーゼの発光基質を含む甲虫ルシフェラーゼ介在反応の反応混合物とを接触させて、混合物を生成することであって、プロテアーゼによる発光基質のタンパク質分解によって甲虫ルシフェラーゼの基質が生成すること、及び
ｂ）混合物中の発光を１つ又は複数の作用物質を欠く対応する混合物中の発光と比較すること
を含む、上記方法。
【請求項５７】
１つ又は複数の作用物質がプロテアソームの活性を阻害する、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
真核生物細胞を含む反応混合物中において有効量で、細胞中の細胞内膜結合オルガネラ又は区画を実質的に害さない量の細胞膜透過処理試薬を含むバッファー、及び
プロテアソーム関連プロテアーゼの発光又は蛍光基質を含むキット。
【請求項５９】
プロテアソームと関連しない酵素の基質をさらに含む、請求項５８に記載のキット。
【請求項６０】
発光基質が、プロテアソームと関連するプロテアーゼによって切断されると甲虫ルシフェラーゼの基質を生成する、請求項５８に記載のキット。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１２Ｄ】
【図１２Ｅ】
【図１２Ｆ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１２Ｄ】
【図１２Ｅ】
【図１２Ｆ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【公表番号】特表２００９−５０６７７２（Ｐ２００９−５０６７７２Ａ）
【公表日】平成２１年２月１９日（２００９．２．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５２９１８１（Ｐ２００８−５２９１８１）
【出願日】平成１８年８月２５日（２００６．８．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０３３６２２
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０２７６５３
【国際公開日】平成１９年３月８日（２００７．３．８）
【出願人】（５９３０８９１４９）プロメガ コーポレイション (57)
【氏名又は名称原語表記】Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年２月１９日（２００９．２．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年８月２５日（２００６．８．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０３３６２２
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０２７６５３
【国際公開日】平成１９年３月８日（２００７．３．８）
【出願人】（５９３０８９１４９）プロメガ コーポレイション (57)
【氏名又は名称原語表記】Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
【Ｆターム（参考）】
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