細胞内ヌクレオチドアデニリルに基づく細胞数の検知及び計量のためのＡＴＰ法、特に無ＡＴＰ菌の決定のための利用及び方法
【解決手段】本発明は、所与の種の試料液中に存在し得る生きた細胞数の検知及び計量のための反応式（１）ルシフェリン＋ＡＴＰ＋Ｏ2 ＋Ｍｇ2+＋ルシフェラーゼ→オキシルシフェリン＋光子による生物発光の利用に関するもので、本利用は、所与の非ウィルス種の生きた細胞のＡＴＰの形で表される細胞内の自由ヌクレオチドアデニリル（ＡＮ）の全含有量の測定が、(i) ＡＴＰの添加無しと(ii)既知量のＡＴＰの添加後とに行われ、前記族の細胞内の自由なＡＴＰ、ＡＤＰ及びＡＭＰの総計が、ミオキナーゼ及びピルビル酸キナーゼによって細胞内自由ＡＤＰ及びＡＭＰがＡＴＰに転換した後、関係式（２）[AN]=[ATP]+[ADP]+[AMP]=Cteにより一定であるという点が利用されることが特徴である。また、ＡＴＰ法による細胞数の検知及び計量の方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞数の検知及び計量のための細胞内自由ヌクレオチドアデニリル（ＡＮ）をもとにしたＡＴＰ法の新技術に関する。また、この新技術の利用及び菌、特にＡＴＰの全く無い菌の数の決定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
反応式
（１）ルシフェリン＋ＡＴＰ＋Ｏ2 ＋Ｍｇ2+＋ルシフェラーゼ→オキシルシフェリン＋光子
を基礎にしているＡＴＰ法により、培地のＡＴＰ含有量を効率的に測定することが可能であることは知られている。ルシフェリン（基質）／ルシフェラーゼ（酵素）が利用される方式が何であれこの反応はＡＴＰに特有なものである。これによりＡＴＰ含有時の生きた細胞と死んだ細胞（無ＡＴＰ）との区別が可能となる。
【０００３】
過去には、同一種の菌の溶解から生まれる細胞内ＡＴＰ含有量の識別により、前記菌の個体群の検知及び計量（すなわち単位体積当たりの株数）が可能になると（無駄にも）信じられていた。この点では米国特許第６２００７６７号明細書、欧州特許第１３３３０９７号明細書、米国特許第６４６５２０１号明細書、ステンダー エイチ（Stender H.）等による「微生物学法ジャーナル（Journal of Microbilogical Methods）」，2001年，第46号，Ｐ．69−75、リー ジェイ−ワイ（Lee J-Y.）等による「ルミネッセンス（Luminescence）」，2004年，第19号，Ｐ．31−36の公表文献を参照されたい。
【特許文献１】米国特許第６２００７６７号明細書
【特許文献２】欧州特許第１３３３０９７号明細書
【特許文献３】米国特許第６４６５２０１号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
これらの出版物で説明された方法は、同一の集団培養から生じると同時にすべて同一の発達状態にある（すなわち、停止していないと同時に同一のＡＴＰ全含有量を含む）菌の調査には有効である。これに対して、これらは、実際上、特に自然において遭遇するその他すべての菌、すなわち、特に(i) ＡＴＰを含まない菌（これは胞子の形態にあるつまりは停止している菌の場合である）及び(ii)様々な発達状態にあると同時にこの点でＡＴＰ含有量が全く同一でない菌に対しては有効でない。
【０００５】
更に、細胞の同一種又は変種の内部においては、細胞内自由ＡＮ全含有量が関係式（２）
（２） [AN]=[ATP]+[ADP]+[AMP]=Cte
を考慮して一定であることが知られている。これについては、一方で、ピルビル酸キナーゼ、ミオキナーゼをそれぞれ用いたＡＭＰ、ＡＤＰそれぞれのＡＴＰへの転換が、他方で、ＡＴＰの添加無しで次いで10μlのＡＴＰの追加添加後の放出光の（ＲＬＵ、すなわち、光に関する単位での）測定が提案されているシャンピアット ディー（Champiat D）等による「ルミネッセンス（Luminescence）」，2001年，第16号，Ｐ．193−198の論文を参照されたい。
【０００６】
シャンピアット ディー（Champiat D）の前記論文に加えて、海水、飲み物の水分、又は食物を元とする水性試料中の微小有機物（特に菌）の感染物質の存在の評価技術が知られている。この技術には、ＡＴＰの追加添加が一方では無く、他方で有る、ＡＤＰ、ＡＭＰのＡＴＰへの転換が利用されており、ＡＤＰ及び／又はＡＭＰからＡＴＰが放出される微小有機物の存在状態における前述の反応式（１）による放散光（すなわち、光子生成物の増幅を使った測定）の測定のためにルシフェリン＋ルシフェラーゼ集合を伴う試験試料との接触が含まれる。前記論文ではこの技術が３つのＡＮのうちの１つが含まれる細胞数の検知及び計量に応用可能である点が説明も示唆もされていない。実は、この論文は、得られる値を細胞内自由ＡＮ全含有量に次いで前記細胞内全自由ＡＮを供給した細胞数に相関させ得る点の考慮も、この相関の示唆もせずに、放出光のＲＬＵの測定しか目的としていない。
【０００７】
細胞、特に菌類、黴類、微小藻類の数の迅速、効率的なだけでなく、現在推奨されているＥＩＡ、ＲＩＡ、ＦＩＡ及びＰＣＲ法よりも明らかに多大な手間を必要としない検知及び計量を可能にする技術に関するニーズが存在する。
【０００８】
このニーズは無ＡＴＰ微小有機物数又はＡＮの計量を試みたい場合に高まる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
従って、このニーズを満たすために、ＡＴＰの形で示される細胞内全自由ＡＮ集合を対象とするＡＴＰ法を利用した新たな技術的解決策の提供が提案される。
【００１０】
本発明によりＡＴＰを含まないウィルス（事実、ＡＮを持たないウィルスにより感染する細胞のＡＴＰが発達に利用される）を除く全細胞に関して前記ニーズが満足され得る。
【００１１】
本発明の第１発明によると、試料液中に存在し得る、所与の種の生きた細胞数の検知及び計量のために反応式（１）
（１）ルシフェリン＋ＡＴＰ＋Ｏ2 ＋Ｍｇ2+＋ルシフェラーゼ→オキシルシフェリン＋光子
による生物発光の利用が提供され、この利用は、所与の非ウィルス種の生きた細胞のＡＴＰの形で表される細胞内自由ヌクレオチドアデニリル（ＡＮ）の含有量の測定が、(i) ＡＴＰの添加無しと(ii)既知量のＡＴＰの添加後とに行われて、細胞内自由ＡＤＰ及びＡＭＰがピルビル酸キナーゼ及びミオキナーゼによりＡＴＰに転換した後、前記族の細胞内自由ＡＴＰ、ＡＤＰ、及びＡＭＰの総計が関係式（２）
（２） [AN]=[ATP]+[ADP]+[AMP]=Cte
により一定である点が利用されることを特徴とする。
【００１２】
本発明の第２発明によると、所与の非ウィルス種の生きた細胞に関して、細胞内ヌクレオチドアデニリル（ＡＮ）の総量が関係式（２）
（２）[AN]=[ATP]+[ADP]+[AMP]=Cte
により一定である点に基づく反応式（１）
（１）ルシフェリン＋ＡＴＰ＋Ｏ2 ＋Ｍｇ2+＋ルシフェラーゼ→オキシルシフェリン＋光子
による生物発光の方法を通じて試料液（Ｅ）中に存在し得る、所与の非ウィルス種の細胞、特に菌の数の検知及び計量のための方法が提供され、以下の連続する段階が含まれる点を特徴とする。すなわち、
（１°）前記試料中に存在し得る細胞外ＡＮの除去後に試料（Ｅ）中に存在し得る前記所与の種の細胞の分離及び濃縮
（２°）細胞壁の溶解
（３°）培地に含まれると同時に前記細胞を起源とする細胞内ＡＤＰ及びＡＭＰのＡＴＰへの転換を生じさせる処理
（４°）段階（３°）から生ずる培地への最初は(i) ＡＴＰ添加無しに、次いで(ii)既知量のＡＴＰの添加後のルシフェリン及びルシフェラーゼの導入
（５°）ＡＴＰの添加無し及び既知量のＡＴＰの添加後の反応式（１）による放出光の増幅信号の測定
（６°）前記細胞から分かる個体群の（１°）から（５°）までの段階の繁殖との比較によるＡＴＰの形の細胞内自由全ＡＮ含有量の決定
【００１３】
本発明の別の発明によると、一方では、ＡＴＰの全く無い胞子の形態での菌数計量のための前記方法の利用が、他方では前記方法に用いる定量決定要素が提供される。
【００１４】
前記定量決定要素は、ルシオール、添加用ＡＴＰ、ピルビル酸キナーゼ及びミオキナーゼ等のルシフェラーゼ／ルシフェリンの集合並びに必要に応じてピルビル酸オルトリン酸塩ジキナーゼ及び／又はアデノシンリン酸塩デアミナーゼを含むことを特徴とする。
【００１５】
略号
便宜により本発明に使用される略語及び頭字語の一覧表を以下に示す。
ＡＤＰ：アデノシン二リン酸塩
ＡＭＰ：アデノシン一リン酸塩
ＡＮ：ヌクレオチドアデニリル（別の用語すなわちアデノシンヌクレオチドが使用可能）、ここでは、ＡＴＰ、ＡＤＰ及びＡＭＰが含まれるＡＮの集合
ＡＴＰ：アデノシン三リン酸塩
ｃＡＭＰ：アデノシン一リン酸塩環式化合物
ＧＤＰ：グアノシン二リン酸塩
ＧＴＰ：グアノシン三リン酸塩
ＲＬＵ：光の関連単位
【００１６】
水性又は有機性の液体組成である試料（Ｅ）は、水性組成である方が都合良いと同時に試験細胞が菌であるのが都合良い。この試料（Ｅ）は、水性の液体により、ガス（特に洗浄を通じて）、固体（特に接触、溶解若しくは分散を通じて）又は液体（特に抽出、溶解若しくは乳化を通じて）から採取される。
【００１７】
前述の反応式（１）によりオキシルシフェリン、光子、ＡＭＰ、１種及び／又は複数種のリン酸塩、主としてピロリン酸塩が供給される。この反応は、反応する培地中に放出される細胞内ＡＴＰの生存期間が長くない限り生きている物の特徴である。この反応はＡＴＰに特有のものであり、最適濃度にあるルシフェリン及びルシフェラーゼ、これらの三物質が存在するようになるとすぐ放出される光子の数はＡＴＰ量に直接比例する。有機物及び前述の反応する培地内では、細胞外ＡＴＰは、再循環により、又は主たる分解により比較的急速に消える。
【００１８】
細胞内自由ＡＮとは、細胞内に自由状態で存在するＡＮ、更に正確には細胞形質と理解される。従って、本発明は細胞内にあると同時にＤＮＡ又はＲＮＡのレベルで結合される非自由ＡＮには関係しない。
【００１９】
ＡＴＰは、エネルギー源（機械エネルギー、浸透エネルギー、化学エネルギー、熱エネルギー、光エネルギー）として、リン酸塩ドナー、ピロリン酸塩ドナー、ＡＭＰドナー及びアデノシンドナーを細胞内に介在する。
【００２０】
同一種の細胞中のＡＴＰ含有量は物理的状態に応じて大きく変動し、検知閾値は一般的に103 個の菌数に限られる。本発明によると、ＡＴＰが１アトモル（放出光信号の安定化無しで）から0.5 アトモル（前記信号の安定化有りで）まで最上の感度が達成され、これは菌１個の全細胞内自由ＡＮの平均含有量にほぼ相当する。
【００２１】
関係式（２）を考慮すると、(i) この生成物の細胞内濃度は比較的低く、なかでも(ii)はるかに前に提案された技術はＡＤＰのＡＭＰへ次いでＡＭＰのＡＴＰへの転換を意味するので、ここでは、ＡＭＰの合成中に介在する前駆物質である自由アデノシン一リン酸塩環式化合物（ｃＡＭＰ）の細胞内含有量は無視され、この点により前記ｃＡＭＰ含有量が減る。
【００２２】
本発明によると、酵素（ルシフェラーゼ）、光胞子基質（ルシフェリン）、及び補酵素（ＡＴＰの場合に）と共に機能するルシオール（フォチナス・ピラリス）から良く知られた原理が利用される。結果は、光度計（又は輝度計）にＲＬＵで表示され、ＡＴＰ量に比例するにもかかわらず、これによって試料の本当のＡＴＰ濃度決定は可能ではない。
【００２３】
この問題を改善するために、最初の読み取り（ＡＴＰの提供無しで実施）後に、既知量（例えば、102 から10ピコモルまでのＡＴＰ）の提供が推奨される。しかしながら、前記細胞内のＡＴＰ含有量は、生理学的状態に応じた急速な「逆転」があって一定に留まらないので、提供される技術では定量的な数量決定が可能ではない。
【００２４】
これに対して、所与の種の細胞はすべて同一のＡＮ含有量を示す。本発明によれば、ＡＴＰの形で示されるＡＮ含有量が決定されながら、ウィルスの様々な細胞の数の定量的決定の実現が可能になる。
【００２５】
有利な方法では、分離及び濃縮に関する本発明の方法の段階（１°）は、
・薄膜の濾過、
・特に、真空かつ雰囲気温度（15〜25℃）下の蒸発・遠心分離、及び／又は
・免疫捕捉
により行われる。
【００２６】
免疫捕捉技術は好ましい。この技術により、不動化された抗体によりこの細胞の固定による細胞の濃縮及び純化が可能となる。実用的な方法では、これらの抗体は前記細胞を傷めることなくこの細胞表面の抗原体に向けられ得る。また同様に実用的な方法では、これらの抗体は磁場内における細胞−抗体−球タイプの接合生成物の濃縮及び純化並びに前記接合生成物の回収のための磁気乳液球に不動化される。変型例では、細胞が固定される抗体に結合される非磁気又は非磁化の球により、また、上澄みの移し取りにより細胞の濃縮及び純化が可能となる。また変型例では、濃縮／純化の段階は親和性の柱上で行われ得る。
【００２７】
前記接合生成物は、引き続き必要な場合には、抗体にもはや結合されない細胞の濃縮された液体組成を処理するために特に溶離により分離される。必要に応じて、感度が下がる希釈が制限されるよう、生成物のロス無しに数分間で大量の試料の乾燥を可能にする蒸発−遠心分離装置（2,000 〜10,000回転／15分から2,000 〜10,000回転／分までの運転）により前記液体組成を濃縮することが賢明である。屋内温度での蒸気−遠心分離により細胞が含まれる培地の水分の大部分が除去可能となる利点がある。
【００２８】
同じく有利な方法では、細胞壁の溶解に関する段階（２°）は、
(i) TrisプラスＥＤＴＡ、及び／又は、
(ii) ＤＭＳＯ
が含まれる水性緩衝剤の追加、次いで、(a) 細胞を開くためのマイクロ波処理（約１分間）、(b) 急速冷却（特に、冷蔵庫における）、及び必要な場合には、(c) 生ずる液体培地を回収するための遠心分離により段階（１°）から生ずる培地で行われる。
【００２９】
溶解は細胞内自由ＡＮへの接近、ＡＤＰ及びＡＭＰのＡＴＰへの転換並びに前記溶解及び／又は前記転換から生じるＡＴＰの基質（ルシフェリン）及び酵素（ルシフェラーゼ）との接触が可能となるために必要である。
【００３０】
これまで示したように、ＡＤＰ及びＡＭＰのＡＴＰへの転換に関する段階（３°）は、ミオキナーゼ及びピルビル酸キナーゼを用いて行われる。反応機構を以下に示す。
【００３１】
【数１】
【００３２】
時間が節約されるよう、ＡＤＰ及びＡＭＰのＡＴＰへの転換に関する本発明の方法の段階（３°）は段階（２°）と同時に行われ得る。
【００３３】
都合の良い方法では、本発明の方法の段階（４°）はルシオール（フォチナス・ピラリス）のルシフェリン及びルシフェラーゼを使用して行われる。基質及び酵素はルシオールから一緒に抽出され得る。
【００３４】
実用的な方法では、少なくとも１０分間ほぼ一定値の光子の放出を安定化させる物質の存在状態において反応式（１）により放出される光の測定に関する段階（５°）が行われることが推奨される。このために相応しい物質の中には、以下のものが挙げられる。すなわち、
・前述の反応式（１）の最中に生成され、ＡＭＰ及びピロリン酸をＡＴＰに転換させるピルビル酸オルトリン酸塩ジキナーゼ（ＰＰＤＫ）
・反応する培地に存在し得る残留ＡＤＰ及び／又はＡＭＰを分解させるアデノシンリン酸塩ジアミナーゼ
【００３５】
最初の酵素はほぼ連続してＡＴＰを発生させながら安定した信号をもたらす。第２の酵素により、光エネルギー源としてのＡＴＰの利用方法が攪乱されずに、ＡＤＰ及び／又はＡＭＰの残留物の存在による少量の液体からの雑音を小さくすることが可能となる。
【００３６】
前記第２の酵素、アデノシンリン酸塩ジアミナーゼは更に都合良いことに、反応する培地内のヌクレオチド残留物の除去のためだけでなく、特に、場合に応じて前述の段階（１°）時に存在する試料に存在する細胞外ヌクレオチド残留物を消滅させながら排除するために利用される。
【００３７】
実際には、反応式（１）による光子の放出を安定化させるために、特に段階（５°）におけるＰＰＤＫの利用が推奨される。
【００３８】
本発明の方法は、特に、(i) 炭疽菌といった胞子形成された菌、及び、(ii)レジオネラ菌、サルモネラ菌、アメーバといったその他の単一細胞有機物の検知及び計量に適用される。
【００３９】
本発明のその他の利点及び特徴は実施例に沿った説明を読めば更に良く理解される。勿論、これらの要素は限定的なものではなく、例示として提供されるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
（実施例１）
炭疽菌数の計量
計量すべき炭疽菌株が含まれる空気１lを採取して、洗浄により水性試料が得られる。多柱状抗体、不動化された抗（炭疽菌）が含まれる柱状に存在する株の免疫捕捉が行われる。減少した水性緩衝剤の容積にこうして純化されかつ濃縮された炭疽菌株が集められる。更に、室温の真空下での蒸気遠心分離により濃縮される。次に非活性化されるアデノシンリン酸塩ジアミナーゼにより生ずる水性培地中に存在し得るＡＮといったヌクレオチドの残留物が除去される。
【００４１】
Tris及びＥＤＴＡの添加により炭疽菌の株壁の溶解、次いでマイクロ波による処理が行われる。遠心分離により細胞内ＡＮが含まれる液体培地が集められる。ＡＤＰ及びＡＭＰをＡＴＰに転換させるためにミオキナーゼ及びピルビル酸キナーゼが添加される。ルシオールのルシフェリン及びルシオールのルシフラーゼが光子の放出を安定化させるためのＰＰＤＫと一緒に添加される。
【００４２】
ＲＬＵ単位の既知の装置により増加された光子が測定される。２μl のＡＴＰが添加されると同時に増加した光子がＲＬＵ単位で再測定される。
【００４３】
同一操作が炭疽菌の既知量（50株）をもとに繰り返されると同時に開始時の空気１リットルに炭疽菌65株が含まれていたことが測定される。
【００４４】
（実施例２）
大便連鎖球菌
大便連鎖球菌に感染したと思われる羊小屋の土壌をもとにして実施例１に示されたものと同様に行われた。
【００４５】
土壌に大便連鎖球菌が260 ＣＦＵ／l 含まれることが観察された。
【００４６】
（実施例３）
レジオネラ菌を特定するための手順の開発
Ｉ．純粋培養状態の菌に関するＮＡ／細胞相関の入手
Ａ−レジオネラ菌の信号／数の相関強さの作成
目的は培養による計数及び最適操作条件の選択が行われるための細胞当たりの生きたレジオネラ菌・ニューモフィラ菌のＡＮの平均値が得られることにある。
調査パラメータは以下の通り。
温度：室温
緩衝剤の条件：Tris
ｐＨ：7.75
溶解条件又は反応容積：100 μl ＤＭＳＯ、次いで、500 μl Tris ｐＨ7.75 600 μl 沸騰Tris（マイクロ波３分）、１UIピルビル酸キナーゼ及び１UIアデノシンキナーゼ＋ＰＥＰ（時間10分間）を伴う200 μl 試料
10μl ＬＬの添加剤（ルシオールのルシフェリン／ルシフェラーゼの複合材）
信号の入手時間：10秒間（ＲＬＵ ＮＡ）
10μl ＡＴＰの添加（100 ピコモル）：10秒間（ＲＬＵ ＮＡ＋ＡＴＰｓ）
免疫分離後：最終結果は少なくとも15分間で得られた。
【００４７】
Ｂ−磁気球に不動化された菌での試験
検討パラメータは以下の通り。
磁気球の性質
捕獲緩衝剤の条件
超微粉での溶解条件
感度の調査
目的
−信号の様々な性質（シリカ、ポリスチレン、磁性流体）の磁気球との干渉評価
−測定（溶離）以前の超微粉のレジオネラ菌からの分離の必要・不必要
【００４８】
ＩＩ．自然条件での菌に関する信号の入手及び最適化
Ａ−試料の少量の液体からの雑音レベルの評価
検討パラメータ
試料の性質
試料内の捕獲条件
超微粉の洗浄条件
感度調査
目的
−試料の性質及び信号の干渉評価 給排温水、空冷循環水、河川水、脱イオン化水
−これらの干渉が取り除かれるための捕獲後の球の洗浄条件の開発
【００４９】
Ｂ−天然試料での試験及び最適化
Ｂ１−濃度
生水の試料が予め濃縮される。（１〜５mlまで還元される容積50mlから１l ）
この段階では感度が上がると同時に免疫分離（ＩＭＳ）手段の節約が可能である。利用される試料は、従って、
−遠心分離を通じて、
−濾過により、
−ApoHを使った磁気分離により、及び／又は、
−シリカ球上の磁気分離により、
濃縮される。
【００５０】
レジオネラ菌の場合には、球との結合からレジオネラ菌が放出されると同時に免疫捕獲ＩＭＳの最適化が可能であるので好ましいのはこの後者の濃縮技術である。
【００５１】
球及びレジオネラ菌複合物の濃縮と回収とは当技術に関する既知の様々な技術により行われ得る。磁気球から放出されるレジオネラ菌は、後に続くように最適化されるＩＭＳの手順を受けるために懸濁状態で放出される。
【００５２】
Ｂ２−１ml中での捕獲後の手順の最適化
捕獲中に介在するパラメータは以下の通り。
−捕獲抗体：抗Lp１〜14、又は、抗Lp１
−ＩＭＳ緩衝剤
−球表面における抗体状態の負荷
−球容積
−捕獲後の洗浄回数
−培養時間
【００５３】
Ｂ３−１から５mlの容積による捕獲手順の適用
１mlの容積に関して最適化された手順が１から５mlまで増加する容積に適用される。
【００５４】
得られた捕獲の効率に応じて球容積又は培養時間といったパラメータ類は開発が必要である。
【００５５】
Ｂ４−定量化
−測定された免疫捕獲の段階が終わると、球が（磁力により）レジオネラニューモフィラ菌（死んでいるか又は生きている）とともに回収される。
−球は、30秒間攪拌され、次いでｐＨ7.75のTris緩衝剤500μl が100 μl のＤＭＳＯに再添加され、マイクロ波で１から２分間沸騰される緩衝剤Tris ＥＤＴＡ600 μl である溶解液中に置かれる。
−冷却後、必要であれば、ＡＭＰ及びＡＤＰをＡＴＰに転換させる酵素、１〜３UIの割合のPK及びAK、緩衝剤Tris（Mg及びＫ）の塩、フォスフォエノールピルビル酸塩が含まれる溶液10μl が再添加される。
−屋内温度（15〜25℃）で５分から10分間培養される。
−200 μl ／チューブの割合で３チューブに分割される。
−ルシフェリン及びルシフェラーゼの複合剤（「Ste Controlife」）10μl
−光度計内へチューブが導入される。
−10秒間ＲＬＵ＝ＲＬＵ ＮＡが一体化される。
−直後に、ＡＴＰ標準溶液10μl （10〜100 ピコモル）が直後に注入される。
−10秒間ＲＬＵ＝ＲＬＵ ＮＡ＋ＡＴＰｓが一体化される。
−試料内のＡＴＰ等価のピコモルのＮＡ数量がこうして算定される。
−既知のＡＮ／レジオネラ菌の濃度を使って生きているレジオネラ菌の数量（ＡＴＰ分子量は551 である）が算定される。
【００５６】
採取から最終結果までの操作継続時間は生きたレジオネラ菌10個の検知に関して60分を越えない。
【００５７】
ＩＩＩ．レジオネラ菌又は腸管出血性大腸菌と等価状態となったバイオマスの全体測定
これは迅速かつ経済的にスクリーニングすることを可能にする前述の実施例から派生する方法の問題である。つまり、例えば、
(a) １回の空気冷却により1000レジオネラ菌／l 以上が提供されるかどうかの検査が望まれる。
・シリカの入った磁気球によりレジオネラ菌が濃縮される。
・球は100 μl のＤＭＳＯ内に直接投入されると同時に定量決定が前述のように行われる。
・得られる値が1,000 個のレジオネラ菌と等価未満である場合には、個別の数量算出（時間と費用の節約）及び処置は必要としない。
・例えば、1,500 個レジオネラ菌等価菌が処置閾値として設定可能である。
【００５８】
(b) 100 個未満の腸管出血性大腸菌の水浴水の場合に検査が望まれる。
・この場合には、既に有利であって、複数の微小有機物とともにその反応能力を更に高めるだけでなく、医療診断分野でこれが尚更貴重なものになるという特徴が示される蛋白ApoHを用いた磁気球による濃縮が好ましい。この蛋白は感染状態、つまり、繁殖の最中の病原菌だけを識別する。
・発達具合は前述のものと同様となる。
【００５９】
全体的には、この発達具合は個々の数量算出と一致しない。しかしながら、この発達により操作継続時間及び費用の削減という利点がもたらされる。ここで興味がそそられる点は１個の細胞と等価な測定がもたらされるということである。
【００６０】
（実施例４）
ＡＮと細胞との相関
実施例３で作成された手順により、Arthrobacter NS48株を用いて、菌個体数が開始時に５×106 個細胞／ml及び3.5 ×108 個細胞／mlであるこの株の培養持続時間に応じたＡＮ／細胞関係の発達が調査された。
【００６１】
得られた結果は、NaClが存在しない場合（曲線１）及びNaClが７％（ｐ／ｖ）存在する場合（曲線２）における数時間の培養継続時間（横軸）に応じた菌細胞当たりのＡＮのフェントグラム（１fg＝10-15g）（縦軸）を示した図１に記録された。ＡＮの変動値は曲線１及び曲線２間の細胞当たり2.2 から2.5 fgである点が認められる。これらの二曲線は実用上等しくかつほぼ平行である。
【００６２】
（実施例５）
ＡＴＰ／細胞及びＡＮ／細胞の関係の相関
実施例３で作成された前記手順によると、ＡＴＰ／細胞間の関係（ＡＴＰの含有量は時間につれて変動し得るもので、所与の菌種に関するＡＮ全含有量だけの間の相関付けが前述の方程式（２）を考慮して一定である）が示された。
【００６３】
得られた静的結果は続く表１に記録されている。これらによりＡＴＰ／細胞関係に関するよりもＡＮ／細胞関係の値に関する方がより良好な相関があることが明らかである。この相関は細胞及びその環境の生理学的状態がどんなものであってもＡＮの場合には一定である。計算図表が作られる必要はなく、最初の近似でＡＮ及び数多くの要望される有機物の培養後に得られる平均値のＡＮ／細胞関係について考慮することで十分である。
【００６４】
例えば、腸管出血性大腸菌に関する平均値は、同じ期間内にＡＴＰの含有量は0.1 から1.5 fg／細胞まで変動するが、増殖段階がどんなものであれNa／細胞で5.27fgである。
【００６５】
【表１】
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】ＡＮと細胞との相関を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞数の検知及び計量のための細胞内自由ヌクレオチドアデニリル（ＡＮ）をもとにしたＡＴＰ法の新技術に関する。また、この新技術の利用及び菌、特にＡＴＰの全く無い菌の数の決定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
反応式
（１）ルシフェリン＋ＡＴＰ＋Ｏ2 ＋Ｍｇ2+＋ルシフェラーゼ→オキシルシフェリン＋光子
を基礎にしているＡＴＰ法により、培地のＡＴＰ含有量を効率的に測定することが可能であることは知られている。ルシフェリン（基質）／ルシフェラーゼ（酵素）が利用される方式が何であれこの反応はＡＴＰに特有なものである。これによりＡＴＰ含有時の生きた細胞と死んだ細胞（無ＡＴＰ）との区別が可能となる。
【０００３】
過去には、同一種の菌の溶解から生まれる細胞内ＡＴＰ含有量の識別により、前記菌の個体群の検知及び計量（すなわち単位体積当たりの株数）が可能になると（無駄にも）信じられていた。この点では米国特許第６２００７６７号明細書、欧州特許第１３３３０９７号明細書、米国特許第６４６５２０１号明細書、ステンダー エイチ（Stender H.）等による「微生物学法ジャーナル（Journal of Microbilogical Methods）」，2001年，第46号，Ｐ．69−75、リー ジェイ−ワイ（Lee J-Y.）等による「ルミネッセンス（Luminescence）」，2004年，第19号，Ｐ．31−36の公表文献を参照されたい。
【特許文献１】米国特許第６２００７６７号明細書
【特許文献２】欧州特許第１３３３０９７号明細書
【特許文献３】米国特許第６４６５２０１号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
これらの出版物で説明された方法は、同一の集団培養から生じると同時にすべて同一の発達状態にある（すなわち、停止していないと同時に同一のＡＴＰ全含有量を含む）菌の調査には有効である。これに対して、これらは、実際上、特に自然において遭遇するその他すべての菌、すなわち、特に(i) ＡＴＰを含まない菌（これは胞子の形態にあるつまりは停止している菌の場合である）及び(ii)様々な発達状態にあると同時にこの点でＡＴＰ含有量が全く同一でない菌に対しては有効でない。
【０００５】
更に、細胞の同一種又は変種の内部においては、細胞内自由ＡＮ全含有量が関係式（２）
（２） [AN]=[ATP]+[ADP]+[AMP]=Cte
を考慮して一定であることが知られている。これについては、一方で、ピルビル酸キナーゼ、ミオキナーゼをそれぞれ用いたＡＭＰ、ＡＤＰそれぞれのＡＴＰへの転換が、他方で、ＡＴＰの添加無しで次いで10μlのＡＴＰの追加添加後の放出光の（ＲＬＵ、すなわち、光に関する単位での）測定が提案されているシャンピアット ディー（Champiat D）等による「ルミネッセンス（Luminescence）」，2001年，第16号，Ｐ．193−198の論文を参照されたい。
【０００６】
シャンピアット ディー（Champiat D）の前記論文に加えて、海水、飲み物の水分、又は食物を元とする水性試料中の微小有機物（特に菌）の感染物質の存在の評価技術が知られている。この技術には、ＡＴＰの追加添加が一方では無く、他方で有る、ＡＤＰ、ＡＭＰのＡＴＰへの転換が利用されており、ＡＤＰ及び／又はＡＭＰからＡＴＰが放出される微小有機物の存在状態における前述の反応式（１）による放散光（すなわち、光子生成物の増幅を使った測定）の測定のためにルシフェリン＋ルシフェラーゼ集合を伴う試験試料との接触が含まれる。前記論文ではこの技術が３つのＡＮのうちの１つが含まれる細胞数の検知及び計量に応用可能である点が説明も示唆もされていない。実は、この論文は、得られる値を細胞内自由ＡＮ全含有量に次いで前記細胞内全自由ＡＮを供給した細胞数に相関させ得る点の考慮も、この相関の示唆もせずに、放出光のＲＬＵの測定しか目的としていない。
【０００７】
細胞、特に菌類、黴類、微小藻類の数の迅速、効率的なだけでなく、現在推奨されているＥＩＡ、ＲＩＡ、ＦＩＡ及びＰＣＲ法よりも明らかに多大な手間を必要としない検知及び計量を可能にする技術に関するニーズが存在する。
【０００８】
このニーズは無ＡＴＰ微小有機物数又はＡＮの計量を試みたい場合に高まる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
従って、このニーズを満たすために、ＡＴＰの形で示される細胞内全自由ＡＮ集合を対象とするＡＴＰ法を利用した新たな技術的解決策の提供が提案される。
【００１０】
本発明によりＡＴＰを含まないウィルス（事実、ＡＮを持たないウィルスにより感染する細胞のＡＴＰが発達に利用される）を除く全細胞に関して前記ニーズが満足され得る。
【００１１】
本発明の第１発明によると、試料液中に存在し得る、所与の種の生きた細胞数の検知及び計量のために反応式（１）
（１）ルシフェリン＋ＡＴＰ＋Ｏ2 ＋Ｍｇ2+＋ルシフェラーゼ→オキシルシフェリン＋光子
による生物発光の利用が提供され、この利用は、所与の非ウィルス種の生きた細胞のＡＴＰの形で表される細胞内自由ヌクレオチドアデニリル（ＡＮ）の含有量の測定が、(i) ＡＴＰの添加無しと(ii)既知量のＡＴＰの添加後とに行われて、細胞内自由ＡＤＰ及びＡＭＰがピルビル酸キナーゼ及びミオキナーゼによりＡＴＰに転換した後、前記族の細胞内自由ＡＴＰ、ＡＤＰ、及びＡＭＰの総計が関係式（２）
（２） [AN]=[ATP]+[ADP]+[AMP]=Cte
により一定である点が利用されることを特徴とする。
【００１２】
本発明の第２発明によると、所与の非ウィルス種の生きた細胞に関して、細胞内ヌクレオチドアデニリル（ＡＮ）の総量が関係式（２）
（２）[AN]=[ATP]+[ADP]+[AMP]=Cte
により一定である点に基づく反応式（１）
（１）ルシフェリン＋ＡＴＰ＋Ｏ2 ＋Ｍｇ2+＋ルシフェラーゼ→オキシルシフェリン＋光子
による生物発光の方法を通じて試料液（Ｅ）中に存在し得る、所与の非ウィルス種の細胞、特に菌の数の検知及び計量のための方法が提供され、以下の連続する段階が含まれる点を特徴とする。すなわち、
（１°）前記試料中に存在し得る細胞外ＡＮの除去後に試料（Ｅ）中に存在し得る前記所与の種の細胞の分離及び濃縮
（２°）細胞壁の溶解
（３°）培地に含まれると同時に前記細胞を起源とする細胞内ＡＤＰ及びＡＭＰのＡＴＰへの転換を生じさせる処理
（４°）段階（３°）から生ずる培地への最初は(i) ＡＴＰ添加無しに、次いで(ii)既知量のＡＴＰの添加後のルシフェリン及びルシフェラーゼの導入
（５°）ＡＴＰの添加無し及び既知量のＡＴＰの添加後の反応式（１）による放出光の増幅信号の測定
（６°）前記細胞から分かる個体群の（１°）から（５°）までの段階の繁殖との比較によるＡＴＰの形の細胞内自由全ＡＮ含有量の決定
【００１３】
本発明の別の発明によると、一方では、ＡＴＰの全く無い胞子の形態での菌数計量のための前記方法の利用が、他方では前記方法に用いる定量決定要素が提供される。
【００１４】
前記定量決定要素は、ルシオール、添加用ＡＴＰ、ピルビル酸キナーゼ及びミオキナーゼ等のルシフェラーゼ／ルシフェリンの集合並びに必要に応じてピルビル酸オルトリン酸塩ジキナーゼ及び／又はアデノシンリン酸塩デアミナーゼを含むことを特徴とする。
【００１５】
略号
便宜により本発明に使用される略語及び頭字語の一覧表を以下に示す。
ＡＤＰ：アデノシン二リン酸塩
ＡＭＰ：アデノシン一リン酸塩
ＡＮ：ヌクレオチドアデニリル（別の用語すなわちアデノシンヌクレオチドが使用可能）、ここでは、ＡＴＰ、ＡＤＰ及びＡＭＰが含まれるＡＮの集合
ＡＴＰ：アデノシン三リン酸塩
ｃＡＭＰ：アデノシン一リン酸塩環式化合物
ＧＤＰ：グアノシン二リン酸塩
ＧＴＰ：グアノシン三リン酸塩
ＲＬＵ：光の関連単位
【００１６】
水性又は有機性の液体組成である試料（Ｅ）は、水性組成である方が都合良いと同時に試験細胞が菌であるのが都合良い。この試料（Ｅ）は、水性の液体により、ガス（特に洗浄を通じて）、固体（特に接触、溶解若しくは分散を通じて）又は液体（特に抽出、溶解若しくは乳化を通じて）から採取される。
【００１７】
前述の反応式（１）によりオキシルシフェリン、光子、ＡＭＰ、１種及び／又は複数種のリン酸塩、主としてピロリン酸塩が供給される。この反応は、反応する培地中に放出される細胞内ＡＴＰの生存期間が長くない限り生きている物の特徴である。この反応はＡＴＰに特有のものであり、最適濃度にあるルシフェリン及びルシフェラーゼ、これらの三物質が存在するようになるとすぐ放出される光子の数はＡＴＰ量に直接比例する。有機物及び前述の反応する培地内では、細胞外ＡＴＰは、再循環により、又は主たる分解により比較的急速に消える。
【００１８】
細胞内自由ＡＮとは、細胞内に自由状態で存在するＡＮ、更に正確には細胞形質と理解される。従って、本発明は細胞内にあると同時にＤＮＡ又はＲＮＡのレベルで結合される非自由ＡＮには関係しない。
【００１９】
ＡＴＰは、エネルギー源（機械エネルギー、浸透エネルギー、化学エネルギー、熱エネルギー、光エネルギー）として、リン酸塩ドナー、ピロリン酸塩ドナー、ＡＭＰドナー及びアデノシンドナーを細胞内に介在する。
【００２０】
同一種の細胞中のＡＴＰ含有量は物理的状態に応じて大きく変動し、検知閾値は一般的に103 個の菌数に限られる。本発明によると、ＡＴＰが１アトモル（放出光信号の安定化無しで）から0.5 アトモル（前記信号の安定化有りで）まで最上の感度が達成され、これは菌１個の全細胞内自由ＡＮの平均含有量にほぼ相当する。
【００２１】
関係式（２）を考慮すると、(i) この生成物の細胞内濃度は比較的低く、なかでも(ii)はるかに前に提案された技術はＡＤＰのＡＭＰへ次いでＡＭＰのＡＴＰへの転換を意味するので、ここでは、ＡＭＰの合成中に介在する前駆物質である自由アデノシン一リン酸塩環式化合物（ｃＡＭＰ）の細胞内含有量は無視され、この点により前記ｃＡＭＰ含有量が減る。
【００２２】
本発明によると、酵素（ルシフェラーゼ）、光胞子基質（ルシフェリン）、及び補酵素（ＡＴＰの場合に）と共に機能するルシオール（フォチナス・ピラリス）から良く知られた原理が利用される。結果は、光度計（又は輝度計）にＲＬＵで表示され、ＡＴＰ量に比例するにもかかわらず、これによって試料の本当のＡＴＰ濃度決定は可能ではない。
【００２３】
この問題を改善するために、最初の読み取り（ＡＴＰの提供無しで実施）後に、既知量（例えば、102 から10ピコモルまでのＡＴＰ）の提供が推奨される。しかしながら、前記細胞内のＡＴＰ含有量は、生理学的状態に応じた急速な「逆転」があって一定に留まらないので、提供される技術では定量的な数量決定が可能ではない。
【００２４】
これに対して、所与の種の細胞はすべて同一のＡＮ含有量を示す。本発明によれば、ＡＴＰの形で示されるＡＮ含有量が決定されながら、ウィルスの様々な細胞の数の定量的決定の実現が可能になる。
【００２５】
有利な方法では、分離及び濃縮に関する本発明の方法の段階（１°）は、
・薄膜の濾過、
・特に、真空かつ雰囲気温度（15〜25℃）下の蒸発・遠心分離、及び／又は
・免疫捕捉
により行われる。
【００２６】
免疫捕捉技術は好ましい。この技術により、不動化された抗体によりこの細胞の固定による細胞の濃縮及び純化が可能となる。実用的な方法では、これらの抗体は前記細胞を傷めることなくこの細胞表面の抗原体に向けられ得る。また同様に実用的な方法では、これらの抗体は磁場内における細胞−抗体−球タイプの接合生成物の濃縮及び純化並びに前記接合生成物の回収のための磁気乳液球に不動化される。変型例では、細胞が固定される抗体に結合される非磁気又は非磁化の球により、また、上澄みの移し取りにより細胞の濃縮及び純化が可能となる。また変型例では、濃縮／純化の段階は親和性の柱上で行われ得る。
【００２７】
前記接合生成物は、引き続き必要な場合には、抗体にもはや結合されない細胞の濃縮された液体組成を処理するために特に溶離により分離される。必要に応じて、感度が下がる希釈が制限されるよう、生成物のロス無しに数分間で大量の試料の乾燥を可能にする蒸発−遠心分離装置（2,000 〜10,000回転／15分から2,000 〜10,000回転／分までの運転）により前記液体組成を濃縮することが賢明である。屋内温度での蒸気−遠心分離により細胞が含まれる培地の水分の大部分が除去可能となる利点がある。
【００２８】
同じく有利な方法では、細胞壁の溶解に関する段階（２°）は、
(i) TrisプラスＥＤＴＡ、及び／又は、
(ii) ＤＭＳＯ
が含まれる水性緩衝剤の追加、次いで、(a) 細胞を開くためのマイクロ波処理（約１分間）、(b) 急速冷却（特に、冷蔵庫における）、及び必要な場合には、(c) 生ずる液体培地を回収するための遠心分離により段階（１°）から生ずる培地で行われる。
【００２９】
溶解は細胞内自由ＡＮへの接近、ＡＤＰ及びＡＭＰのＡＴＰへの転換並びに前記溶解及び／又は前記転換から生じるＡＴＰの基質（ルシフェリン）及び酵素（ルシフェラーゼ）との接触が可能となるために必要である。
【００３０】
これまで示したように、ＡＤＰ及びＡＭＰのＡＴＰへの転換に関する段階（３°）は、ミオキナーゼ及びピルビル酸キナーゼを用いて行われる。反応機構を以下に示す。
【００３１】
【数１】
【００３２】
時間が節約されるよう、ＡＤＰ及びＡＭＰのＡＴＰへの転換に関する本発明の方法の段階（３°）は段階（２°）と同時に行われ得る。
【００３３】
都合の良い方法では、本発明の方法の段階（４°）はルシオール（フォチナス・ピラリス）のルシフェリン及びルシフェラーゼを使用して行われる。基質及び酵素はルシオールから一緒に抽出され得る。
【００３４】
実用的な方法では、少なくとも１０分間ほぼ一定値の光子の放出を安定化させる物質の存在状態において反応式（１）により放出される光の測定に関する段階（５°）が行われることが推奨される。このために相応しい物質の中には、以下のものが挙げられる。すなわち、
・前述の反応式（１）の最中に生成され、ＡＭＰ及びピロリン酸をＡＴＰに転換させるピルビル酸オルトリン酸塩ジキナーゼ（ＰＰＤＫ）
・反応する培地に存在し得る残留ＡＤＰ及び／又はＡＭＰを分解させるアデノシンリン酸塩ジアミナーゼ
【００３５】
最初の酵素はほぼ連続してＡＴＰを発生させながら安定した信号をもたらす。第２の酵素により、光エネルギー源としてのＡＴＰの利用方法が攪乱されずに、ＡＤＰ及び／又はＡＭＰの残留物の存在による少量の液体からの雑音を小さくすることが可能となる。
【００３６】
前記第２の酵素、アデノシンリン酸塩ジアミナーゼは更に都合良いことに、反応する培地内のヌクレオチド残留物の除去のためだけでなく、特に、場合に応じて前述の段階（１°）時に存在する試料に存在する細胞外ヌクレオチド残留物を消滅させながら排除するために利用される。
【００３７】
実際には、反応式（１）による光子の放出を安定化させるために、特に段階（５°）におけるＰＰＤＫの利用が推奨される。
【００３８】
本発明の方法は、特に、(i) 炭疽菌といった胞子形成された菌、及び、(ii)レジオネラ菌、サルモネラ菌、アメーバといったその他の単一細胞有機物の検知及び計量に適用される。
【００３９】
本発明のその他の利点及び特徴は実施例に沿った説明を読めば更に良く理解される。勿論、これらの要素は限定的なものではなく、例示として提供されるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
（実施例１）
炭疽菌数の計量
計量すべき炭疽菌株が含まれる空気１lを採取して、洗浄により水性試料が得られる。多柱状抗体、不動化された抗（炭疽菌）が含まれる柱状に存在する株の免疫捕捉が行われる。減少した水性緩衝剤の容積にこうして純化されかつ濃縮された炭疽菌株が集められる。更に、室温の真空下での蒸気遠心分離により濃縮される。次に非活性化されるアデノシンリン酸塩ジアミナーゼにより生ずる水性培地中に存在し得るＡＮといったヌクレオチドの残留物が除去される。
【００４１】
Tris及びＥＤＴＡの添加により炭疽菌の株壁の溶解、次いでマイクロ波による処理が行われる。遠心分離により細胞内ＡＮが含まれる液体培地が集められる。ＡＤＰ及びＡＭＰをＡＴＰに転換させるためにミオキナーゼ及びピルビル酸キナーゼが添加される。ルシオールのルシフェリン及びルシオールのルシフラーゼが光子の放出を安定化させるためのＰＰＤＫと一緒に添加される。
【００４２】
ＲＬＵ単位の既知の装置により増加された光子が測定される。２μl のＡＴＰが添加されると同時に増加した光子がＲＬＵ単位で再測定される。
【００４３】
同一操作が炭疽菌の既知量（50株）をもとに繰り返されると同時に開始時の空気１リットルに炭疽菌65株が含まれていたことが測定される。
【００４４】
（実施例２）
大便連鎖球菌
大便連鎖球菌に感染したと思われる羊小屋の土壌をもとにして実施例１に示されたものと同様に行われた。
【００４５】
土壌に大便連鎖球菌が260 ＣＦＵ／l 含まれることが観察された。
【００４６】
（実施例３）
レジオネラ菌を特定するための手順の開発
Ｉ．純粋培養状態の菌に関するＮＡ／細胞相関の入手
Ａ−レジオネラ菌の信号／数の相関強さの作成
目的は培養による計数及び最適操作条件の選択が行われるための細胞当たりの生きたレジオネラ菌・ニューモフィラ菌のＡＮの平均値が得られることにある。
調査パラメータは以下の通り。
温度：室温
緩衝剤の条件：Tris
ｐＨ：7.75
溶解条件又は反応容積：100 μl ＤＭＳＯ、次いで、500 μl Tris ｐＨ7.75 600 μl 沸騰Tris（マイクロ波３分）、１UIピルビル酸キナーゼ及び１UIアデノシンキナーゼ＋ＰＥＰ（時間10分間）を伴う200 μl 試料
10μl ＬＬの添加剤（ルシオールのルシフェリン／ルシフェラーゼの複合材）
信号の入手時間：10秒間（ＲＬＵ ＮＡ）
10μl ＡＴＰの添加（100 ピコモル）：10秒間（ＲＬＵ ＮＡ＋ＡＴＰｓ）
免疫分離後：最終結果は少なくとも15分間で得られた。
【００４７】
Ｂ−磁気球に不動化された菌での試験
検討パラメータは以下の通り。
磁気球の性質
捕獲緩衝剤の条件
超微粉での溶解条件
感度の調査
目的
−信号の様々な性質（シリカ、ポリスチレン、磁性流体）の磁気球との干渉評価
−測定（溶離）以前の超微粉のレジオネラ菌からの分離の必要・不必要
【００４８】
ＩＩ．自然条件での菌に関する信号の入手及び最適化
Ａ−試料の少量の液体からの雑音レベルの評価
検討パラメータ
試料の性質
試料内の捕獲条件
超微粉の洗浄条件
感度調査
目的
−試料の性質及び信号の干渉評価 給排温水、空冷循環水、河川水、脱イオン化水
−これらの干渉が取り除かれるための捕獲後の球の洗浄条件の開発
【００４９】
Ｂ−天然試料での試験及び最適化
Ｂ１−濃度
生水の試料が予め濃縮される。（１〜５mlまで還元される容積50mlから１l ）
この段階では感度が上がると同時に免疫分離（ＩＭＳ）手段の節約が可能である。利用される試料は、従って、
−遠心分離を通じて、
−濾過により、
−ApoHを使った磁気分離により、及び／又は、
−シリカ球上の磁気分離により、
濃縮される。
【００５０】
レジオネラ菌の場合には、球との結合からレジオネラ菌が放出されると同時に免疫捕獲ＩＭＳの最適化が可能であるので好ましいのはこの後者の濃縮技術である。
【００５１】
球及びレジオネラ菌複合物の濃縮と回収とは当技術に関する既知の様々な技術により行われ得る。磁気球から放出されるレジオネラ菌は、後に続くように最適化されるＩＭＳの手順を受けるために懸濁状態で放出される。
【００５２】
Ｂ２−１ml中での捕獲後の手順の最適化
捕獲中に介在するパラメータは以下の通り。
−捕獲抗体：抗Lp１〜14、又は、抗Lp１
−ＩＭＳ緩衝剤
−球表面における抗体状態の負荷
−球容積
−捕獲後の洗浄回数
−培養時間
【００５３】
Ｂ３−１から５mlの容積による捕獲手順の適用
１mlの容積に関して最適化された手順が１から５mlまで増加する容積に適用される。
【００５４】
得られた捕獲の効率に応じて球容積又は培養時間といったパラメータ類は開発が必要である。
【００５５】
Ｂ４−定量化
−測定された免疫捕獲の段階が終わると、球が（磁力により）レジオネラニューモフィラ菌（死んでいるか又は生きている）とともに回収される。
−球は、30秒間攪拌され、次いでｐＨ7.75のTris緩衝剤500μl が100 μl のＤＭＳＯに再添加され、マイクロ波で１から２分間沸騰される緩衝剤Tris ＥＤＴＡ600 μl である溶解液中に置かれる。
−冷却後、必要であれば、ＡＭＰ及びＡＤＰをＡＴＰに転換させる酵素、１〜３UIの割合のPK及びAK、緩衝剤Tris（Mg及びＫ）の塩、フォスフォエノールピルビル酸塩が含まれる溶液10μl が再添加される。
−屋内温度（15〜25℃）で５分から10分間培養される。
−200 μl ／チューブの割合で３チューブに分割される。
−ルシフェリン及びルシフェラーゼの複合剤（「Ste Controlife」）10μl
−光度計内へチューブが導入される。
−10秒間ＲＬＵ＝ＲＬＵ ＮＡが一体化される。
−直後に、ＡＴＰ標準溶液10μl （10〜100 ピコモル）が直後に注入される。
−10秒間ＲＬＵ＝ＲＬＵ ＮＡ＋ＡＴＰｓが一体化される。
−試料内のＡＴＰ等価のピコモルのＮＡ数量がこうして算定される。
−既知のＡＮ／レジオネラ菌の濃度を使って生きているレジオネラ菌の数量（ＡＴＰ分子量は551 である）が算定される。
【００５６】
採取から最終結果までの操作継続時間は生きたレジオネラ菌10個の検知に関して60分を越えない。
【００５７】
ＩＩＩ．レジオネラ菌又は腸管出血性大腸菌と等価状態となったバイオマスの全体測定
これは迅速かつ経済的にスクリーニングすることを可能にする前述の実施例から派生する方法の問題である。つまり、例えば、
(a) １回の空気冷却により1000レジオネラ菌／l 以上が提供されるかどうかの検査が望まれる。
・シリカの入った磁気球によりレジオネラ菌が濃縮される。
・球は100 μl のＤＭＳＯ内に直接投入されると同時に定量決定が前述のように行われる。
・得られる値が1,000 個のレジオネラ菌と等価未満である場合には、個別の数量算出（時間と費用の節約）及び処置は必要としない。
・例えば、1,500 個レジオネラ菌等価菌が処置閾値として設定可能である。
【００５８】
(b) 100 個未満の腸管出血性大腸菌の水浴水の場合に検査が望まれる。
・この場合には、既に有利であって、複数の微小有機物とともにその反応能力を更に高めるだけでなく、医療診断分野でこれが尚更貴重なものになるという特徴が示される蛋白ApoHを用いた磁気球による濃縮が好ましい。この蛋白は感染状態、つまり、繁殖の最中の病原菌だけを識別する。
・発達具合は前述のものと同様となる。
【００５９】
全体的には、この発達具合は個々の数量算出と一致しない。しかしながら、この発達により操作継続時間及び費用の削減という利点がもたらされる。ここで興味がそそられる点は１個の細胞と等価な測定がもたらされるということである。
【００６０】
（実施例４）
ＡＮと細胞との相関
実施例３で作成された手順により、Arthrobacter NS48株を用いて、菌個体数が開始時に５×106 個細胞／ml及び3.5 ×108 個細胞／mlであるこの株の培養持続時間に応じたＡＮ／細胞関係の発達が調査された。
【００６１】
得られた結果は、NaClが存在しない場合（曲線１）及びNaClが７％（ｐ／ｖ）存在する場合（曲線２）における数時間の培養継続時間（横軸）に応じた菌細胞当たりのＡＮのフェントグラム（１fg＝10-15g）（縦軸）を示した図１に記録された。ＡＮの変動値は曲線１及び曲線２間の細胞当たり2.2 から2.5 fgである点が認められる。これらの二曲線は実用上等しくかつほぼ平行である。
【００６２】
（実施例５）
ＡＴＰ／細胞及びＡＮ／細胞の関係の相関
実施例３で作成された前記手順によると、ＡＴＰ／細胞間の関係（ＡＴＰの含有量は時間につれて変動し得るもので、所与の菌種に関するＡＮ全含有量だけの間の相関付けが前述の方程式（２）を考慮して一定である）が示された。
【００６３】
得られた静的結果は続く表１に記録されている。これらによりＡＴＰ／細胞関係に関するよりもＡＮ／細胞関係の値に関する方がより良好な相関があることが明らかである。この相関は細胞及びその環境の生理学的状態がどんなものであってもＡＮの場合には一定である。計算図表が作られる必要はなく、最初の近似でＡＮ及び数多くの要望される有機物の培養後に得られる平均値のＡＮ／細胞関係について考慮することで十分である。
【００６４】
例えば、腸管出血性大腸菌に関する平均値は、同じ期間内にＡＴＰの含有量は0.1 から1.5 fg／細胞まで変動するが、増殖段階がどんなものであれNa／細胞で5.27fgである。
【００６５】
【表１】
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】ＡＮと細胞との相関を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料液中に存在し得る、所与の種の生きた細胞数の検知及び計量のための、反応式（１）
（１）ルシフェリン＋ＡＴＰ＋Ｏ2 ＋Ｍｇ2+＋ルシフェラーゼ→オキシルシフェリン＋光子
による生物発光の利用において、
所与の非ウィルス種の生きた細胞の、ＡＴＰの形で表される細胞内自由ヌクレオチドアデニリル（ＡＮ）の全含有量の測定が、(i) ＡＴＰの添加無しで次いで(ii) 既知量のＡＴＰの添加後に行われ、前記族の細胞内自由ＡＴＰ、ＡＤＰ及びＡＭＰの総量が、ミオキナーゼ及びピルビル酸キナーゼにより細胞内自由ＡＤＰ及びＡＭＰがＡＴＰに転換した後、関係式（２）
（２）[AN]=[ATP]+[ADP]+[AMP]=Cte
により一定である点が利用されることを特徴とする利用。
【請求項２】
所与の非ウィルス種の生きた細胞について、細胞内ヌクレオチドアデニリル（ＡＮ）の全含有量が関係式（２）
（２）[AN]=[ATP]+[ADP]+[AMP]=Cte
により一定であるという点に基づく、反応式（１）
（１）ルシフェリン＋ＡＴＰ＋Ｏ2 ＋Ｍｇ2+＋ルシフェラーゼ→オキシルシフェリン＋光子
による生物発光に関する方法による、所与の非ウィルス種の試料液（Ｅ）中に存在し得る細胞、特に菌の検知及び計量の方法において、
（１°）試料に含まれ得る細胞外ＡＮの除去後の試料液（Ｅ）中に存在し得る、所与の種の細胞の分離及び濃縮、
（２°）細胞壁の溶解、
（３°）培地液に含まれる細胞内ＡＤＰ及びＡＭＰのＡＴＰへの転換のための前記培地液の処理、
（４°）段階（３°）から生ずる培地へのルシフェラーゼ及びルシフェリンの最初に(i) ＡＴＰの添加無しで次いで(ii) 既知量のＡＴＰの添加後の導入、
（５°）まずはＡＴＰ添加無しで次いで既知量のＡＴＰの添加後の反応式（１）により放出される光の増幅信号の測定、及び
（６°）（１°）から（５°）までの段階の繁殖量と前記細胞の既知個体群量との比較によるＡＴＰの形の細胞内自由ＡＮ全含有量の決定、
からなる連続した段階を含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
分離及び濃縮の段階（１°）が薄膜濾過、特に真空下及び／又は免疫捕獲下の蒸発・遠心分離により行われることを特徴とする特に菌（Ｂ）の数量検知に適用される請求項２記載の方法。
【請求項４】
細胞壁の溶解の段階（２°）が
(i) TrisプラスＥＤＴＡ及び／又は
(ii)ＤＭＳＯ
が含まれる水性緩衝剤の追加、次いで(a) 細胞を開くためのマイクロ波処理、(b) 急速冷却、そして必要ならば、(c) 生ずる培地液の回収のための遠心分離により段階（１°）から生ずる培地中で行われることを特徴とする特に菌（Ｂ）の数量検知に適用される請求項２記載の方法。
【請求項５】
ＡＤＰ及びＡＭＰのＡＴＰへの転換の段階（３°）がミオキナーゼ及びピルビル酸キナーゼを用いて行われることを特徴とする特に菌（Ｂ）の数量検知に適用される請求項２記載の方法。
【請求項６】
段階（３°）が段階（２°）と同時に行われることを特徴とする特に菌（Ｂ）の数量検知に適用される請求項２記載の方法。
【請求項７】
段階（４°）がルシオールのルシフェラーゼ及びルシフェリン（フォチナス・ピラリス）により行われることを特徴とする特に菌（Ｂ）の数量検知に適用される請求項２記載の方法。
【請求項８】
反応式（１）により放出される光の測定の段階（５°）が少なくとも１０分間ほぼ一定値の光子放出を安定化する物質が存在して行われることを特徴とする特に菌（Ｂ）の数量検知に適用される請求項２記載の方法。
【請求項９】
段階（６°）が、前記細胞群から既知の複数個体群数及びそれらのＡＴＰの形で表される細胞内自由ＡＮの全含有量から作成される計算図表方式との比較により行われることを特徴とする特に菌（Ｂ）の数量検知に適用される請求項２記載の方法。
【請求項１０】
感度閾値が0.5 から１アトモルのＡＴＰであることを特徴とする請求項２乃至請求項９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
胞子の形態での菌数を算出する請求項２乃至請求項１０のいずれかに記載の方法の利用。
【請求項１２】
ルシオール、添加用ＡＴＰ、ミオキナーゼ、 ピルビル酸キナーゼ、及び必要に応じてピルビル酸オルトリン酸塩ジキナーゼ、ルシフェラーゼ／ルシフェリン混合物を含むことを特徴とする請求項２乃至請求項１０のいずれかに記載の方法に用いる定量決定要素。
【請求項１】
試料液中に存在し得る、所与の種の生きた細胞数の検知及び計量のための、反応式（１）
（１）ルシフェリン＋ＡＴＰ＋Ｏ2 ＋Ｍｇ2+＋ルシフェラーゼ→オキシルシフェリン＋光子
による生物発光の利用において、
所与の非ウィルス種の生きた細胞の、ＡＴＰの形で表される細胞内自由ヌクレオチドアデニリル（ＡＮ）の全含有量の測定が、(i) ＡＴＰの添加無しで次いで(ii) 既知量のＡＴＰの添加後に行われ、前記族の細胞内自由ＡＴＰ、ＡＤＰ及びＡＭＰの総量が、ミオキナーゼ及びピルビル酸キナーゼにより細胞内自由ＡＤＰ及びＡＭＰがＡＴＰに転換した後、関係式（２）
（２）[AN]=[ATP]+[ADP]+[AMP]=Cte
により一定である点が利用されることを特徴とする利用。
【請求項２】
所与の非ウィルス種の生きた細胞について、細胞内ヌクレオチドアデニリル（ＡＮ）の全含有量が関係式（２）
（２）[AN]=[ATP]+[ADP]+[AMP]=Cte
により一定であるという点に基づく、反応式（１）
（１）ルシフェリン＋ＡＴＰ＋Ｏ2 ＋Ｍｇ2+＋ルシフェラーゼ→オキシルシフェリン＋光子
による生物発光に関する方法による、所与の非ウィルス種の試料液（Ｅ）中に存在し得る細胞、特に菌の検知及び計量の方法において、
（１°）試料に含まれ得る細胞外ＡＮの除去後の試料液（Ｅ）中に存在し得る、所与の種の細胞の分離及び濃縮、
（２°）細胞壁の溶解、
（３°）培地液に含まれる細胞内ＡＤＰ及びＡＭＰのＡＴＰへの転換のための前記培地液の処理、
（４°）段階（３°）から生ずる培地へのルシフェラーゼ及びルシフェリンの最初に(i) ＡＴＰの添加無しで次いで(ii) 既知量のＡＴＰの添加後の導入、
（５°）まずはＡＴＰ添加無しで次いで既知量のＡＴＰの添加後の反応式（１）により放出される光の増幅信号の測定、及び
（６°）（１°）から（５°）までの段階の繁殖量と前記細胞の既知個体群量との比較によるＡＴＰの形の細胞内自由ＡＮ全含有量の決定、
からなる連続した段階を含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
分離及び濃縮の段階（１°）が薄膜濾過、特に真空下及び／又は免疫捕獲下の蒸発・遠心分離により行われることを特徴とする特に菌（Ｂ）の数量検知に適用される請求項２記載の方法。
【請求項４】
細胞壁の溶解の段階（２°）が
(i) TrisプラスＥＤＴＡ及び／又は
(ii)ＤＭＳＯ
が含まれる水性緩衝剤の追加、次いで(a) 細胞を開くためのマイクロ波処理、(b) 急速冷却、そして必要ならば、(c) 生ずる培地液の回収のための遠心分離により段階（１°）から生ずる培地中で行われることを特徴とする特に菌（Ｂ）の数量検知に適用される請求項２記載の方法。
【請求項５】
ＡＤＰ及びＡＭＰのＡＴＰへの転換の段階（３°）がミオキナーゼ及びピルビル酸キナーゼを用いて行われることを特徴とする特に菌（Ｂ）の数量検知に適用される請求項２記載の方法。
【請求項６】
段階（３°）が段階（２°）と同時に行われることを特徴とする特に菌（Ｂ）の数量検知に適用される請求項２記載の方法。
【請求項７】
段階（４°）がルシオールのルシフェラーゼ及びルシフェリン（フォチナス・ピラリス）により行われることを特徴とする特に菌（Ｂ）の数量検知に適用される請求項２記載の方法。
【請求項８】
反応式（１）により放出される光の測定の段階（５°）が少なくとも１０分間ほぼ一定値の光子放出を安定化する物質が存在して行われることを特徴とする特に菌（Ｂ）の数量検知に適用される請求項２記載の方法。
【請求項９】
段階（６°）が、前記細胞群から既知の複数個体群数及びそれらのＡＴＰの形で表される細胞内自由ＡＮの全含有量から作成される計算図表方式との比較により行われることを特徴とする特に菌（Ｂ）の数量検知に適用される請求項２記載の方法。
【請求項１０】
感度閾値が0.5 から１アトモルのＡＴＰであることを特徴とする請求項２乃至請求項９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
胞子の形態での菌数を算出する請求項２乃至請求項１０のいずれかに記載の方法の利用。
【請求項１２】
ルシオール、添加用ＡＴＰ、ミオキナーゼ、 ピルビル酸キナーゼ、及び必要に応じてピルビル酸オルトリン酸塩ジキナーゼ、ルシフェラーゼ／ルシフェリン混合物を含むことを特徴とする請求項２乃至請求項１０のいずれかに記載の方法に用いる定量決定要素。
【図１】
【公表番号】特表２００８−５１６６２５（Ｐ２００８−５１６６２５Ａ）
【公表日】平成２０年５月２２日（２００８．５．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５３７３３３（Ｐ２００７−５３７３３３）
【出願日】平成１７年１０月１９日（２００５．１０．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００５／００２５９５
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０４２９６８
【国際公開日】平成１８年４月２７日（２００６．４．２７）
【出願人】（５０７１３０４４０）テストライフ テクノロジーズ (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年５月２２日（２００８．５．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１０月１９日（２００５．１０．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００５／００２５９５
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０４２９６８
【国際公開日】平成１８年４月２７日（２００６．４．２７）
【出願人】（５０７１３０４４０）テストライフ テクノロジーズ (2)
【Ｆターム（参考）】
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