細胞周期フェーズマーカー
【課題】動的な読み取りをもたらす非破壊的なプロセスで、個々の生細胞について細胞周期の状態を決定する新規の手段を提供すること。
【解決手段】本発明は、哺乳類細胞の細胞周期の状態を決定するために有用なポリペプチド及び核酸構築物に関する。これら核酸構築物にトランスフェクトされた宿主細胞は、試薬が哺乳類細胞周期に与える影響を決定するために使用できる。
【解決手段】本発明は、哺乳類細胞の細胞周期の状態を決定するために有用なポリペプチド及び核酸構築物に関する。これら核酸構築物にトランスフェクトされた宿主細胞は、試薬が哺乳類細胞周期に与える影響を決定するために使用できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞周期に特異的なマーカー、及び哺乳類細胞における細胞周期の異なる期間の移行を決定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
真核細胞分裂は、Ｇ１、Ｓ、Ｇ２及びＭと呼ばれる連続期を含む、高度に調節された細胞周期に沿って進行する。細胞周期又は細胞周期制御の破壊の結果、増殖制限細胞を、増殖の正常な制御に対して非応答性である高浸潤性細胞へと形質転換する複数の遺伝的変化から生じる、癌のような病態又は細胞異常が引き起こされうる。正常細胞の癌細胞への移行は、ＤＮＡ複製及びＤＮＡ修復機構における正しい機能の喪失によって惹起されうる。分裂中の細胞はすべて、細胞周期チェックポイントとして知られる多くの制御機構の支配下にあり、これらが異常細胞を停止させるか又は破壊を誘発することによって遺伝的な完全性を維持する。細胞周期の進行及び制御の研究は、結果的に抗癌剤の設計に非常に重要なものである（Ｆｌａｔｔ ＰＭ ａｎｄ Ｐｉｅｔｅｎｐｏｌ ＪＡ ２０００ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｒｅｖ ３２（３−４）：２８３−３０５； Ｂｕｏｌａｍｗｉｎｉ ＪＫ ２０００ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｅｓｉｇｎ ６， ３７９−３９２）。
【０００３】
細胞周期の進行は、細胞周期の間に高度に動的な挙動を呈する多くの細胞周期調節因子の、確定的な一時的で空間的な発現、局在、及び破壊によって厳密に調節されている（Ｐｉｎｅｓ， Ｊ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， （１９９９）， １， Ｅ７３−Ｅ７９）。例えば、特定の細胞周期段階で、タンパク質のあるものは核から細胞質に、又はその逆に転位置し、またあるものは急速に分解する。既知の細胞周期制御成分及び相互作用の詳細については、Ｋｏｈｎ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ （１９９９）， １０， ２７０３−２７３４を参照されたい。
【０００４】
細胞周期の状態の正確な決定は、細胞周期に影響するか又は細胞周期位置に依存する細胞プロセスを研究するための重要な要件である。このような測定は、以下のような薬物スクリーニング用途で特に重要である。
ｉ）例えば、潜在性のある抗癌治療薬としての研究のために、直接若しくは間接的に細胞周期の進行を修飾する物質が望まれる場合；
ｉｉ）薬物候補が、細胞周期の進行に対する望ましくない効果についてチェックされるべき場合；及び／又は
ｉｉｉ）ある薬剤が、細胞周期の特定の期にある細胞に対して活性か若しくは不活性であると推測される場合。
【０００５】
従来、細胞集団に対する細胞周期の状態は、細胞核のＤＮＡ含量を染色する蛍光染料を用い、フローサイトメトリーによって決定されている（Ｂａｒｌｏｇｉｅ Ｂ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９８３ ４３（９）：３９８２−９７）。フローサイトメトリーは、細胞のＤＮＡ含量に対する定量的な情報をもたらし、従って細胞周期のＧ１、Ｓ及びＧ２＋Ｍ期にある細胞の相対数の決定が可能になる。しかし、本分析は、破壊的な非動的プロセスであり、経時的に細胞周期の状態を決定するには集団を連続的にサンプリングする必要がある。フローサイトメトリー技術のさらなる不都合は、ＤＮＡ含有量に基づく、細胞の細胞周期位置の間接的及び推定的な割り当てに関するものである。細胞核のＤＮＡ含有量は、妥当に予測可能な様式にて細胞周期を通じて変動する（すなわち、Ｇ２又はＭの細胞はＧ１の細胞のＤＮＡ含有量の２倍であり、またＳ期にＤＮＡ合成を行っている細胞はその中間のＤＮＡ量を有する）ので、細胞周期の異なる期間で細胞の相対的な分布をモニターすることが可能である。しかし、Ｇ２又はＭ期に細胞を割り当てる際の曖昧さや、細胞周期の隣接期間の境界に近い細胞同士を正確に識別することを妨げる可能性がある集団内での細胞ごとのＤＮＡ含有量の固有な変動から生じるさらなる不正確さのために、この技術で個々のいずれの細胞の細胞周期位置でも決定するような精度は得られない。さらに、異なる組織又は生物体由来の異なる細胞型の間でのＤＮＡ含有量及びＤＮＡ染色の変動のために、この技術が各細胞型に対して至適化される必要があり、細胞型間又は実験間のデータを直接比較することが困難になりうる（Ｈｅｒｍａｎ， Ｃａｎｃｅｒ （１９９２）， ６９（６）， １５５３−１５５６）。フローサイトメトリーは従って、一集団内の細胞の全体的な細胞周期分布を調べるのには好適であるが、経時的に個々の細胞の正確な細胞周期の状態をモニターするのに使用することはできない。
【０００６】
欧州特許出願公開第７９８３８６号には、異種細胞試料中に存在する細胞亜集団の細胞周期を分析するための方法が記載されている。この方法では、蛍光標識したモノクローナル抗体と試料との逐次インキュベーションを用い、特異的な細胞型、及び核酸に特異的に結合する蛍光色素を同定する。これにより、試料中に存在する細胞の亜集団の細胞周期分布の決定が可能となる。しかし、この方法はフローサイトメトリーを利用するので非動的データしか得られず、細胞周期の進行に対する効果についての検討対象の薬剤に曝した後に経時的に細胞集団の細胞周期の状態の変化を決定するため、細胞の別々の試料に対して連続的に測定を行う必要がある。
【０００７】
多くの研究者が、細胞の固定または溶解を必要とする旧来のレポーター酵素を使用して、細胞周期を研究している。例えば、Ｈａｕｓｅｒ及びＢａｕｅｒ（Ｐｌａｎｔ ａｎｄ Ｓｏｉｌ， （２０００）， ２２６， １−１０） は、植物成長点における細胞分裂を調研究するのにβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）を用い、そしてＢｒａｎｄｅｉｓ及びＨｕｎｔ（ＥＭＢＯ Ｊ．， （１９９６）， １５， ５２８０−５２８９）は、サイクリンレベルの変動を研究するのにクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）融合タンパク質を使用した。米国特許第６０４８６９３号には、細胞周期調節タンパク質に影響を及ぼす化合物をスクリーニングするための方法が記載されており、この方法では、レポーター遺伝子の発現が、サイクリン又はその他の細胞周期制御タンパク質による作用を受ける制御エレメントに結び付けられる。この方法において、レポーター遺伝子産物の一時的な発現が細胞周期特異的に駆動され、１以上の細胞周期制御成分に作用する化合物が発現レベルを増減しうる。
【０００８】
米国特許第６１５９６９１号は、細胞周期に特異的な転写因子ＤＰ−３及びＥ２Ｆ−１に由来する核局在化シグナル（ＮＬＳ）を記載しており、細胞周期の進行の推定調節因子について分析するための方法を請求している。この方法において、細胞周期に特異的な転写因子ＤＰ−３及びＥ２Ｆ−１に由来する核局在化シグナル（ＮＬＳ）は、検出可能なマーカーに融合したＤＰ−３及びＥ２Ｆ−１由来の特異的なＮＬＳ配列の核局在化の増減に作用する化合物の活性を分析するのに使用されうる。
【０００９】
Ｊｏｎｅｓ他 （Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ．， （２００４）， ２３， ３０６−３１２） は、血漿膜標的化シグナル及びＥＹＦＰに融合したＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳに基づく、有糸分裂の蛍光バイオセンサーを記載している。細胞周期の全体にわたり、レポーターは核内に存在しているが、有糸分裂の際、核エンベロープの崩壊と再構成との間には、血漿膜へ転位置する。
【００１０】
国際公開第０３／０３１６１２号には、細胞周期に特異的な発現制御エレメント及び破壊制御エレメントによる哺乳類生細胞の細胞周期位置を決定するためのＤＮＡレポーター構築物、及び方法が記載されている。
【００１１】
Ｇｕ他（Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｃｅｌｌ．， （２００４）， １５， ３３２０−３３３２）は最近、ヒトＤＮＡヘリカーゼＢ（ＨＤＨＢ）の機能を精査して、Ｇ１期には主に核に、そしてＳ及びＧ２期には細胞質にあること、それがＤＮＡ損傷によって誘発される核点状構造（ｎｕｃｌｅａｒ ｆｏｃｉ）内に存在していること、点状構造パターンがＨＤＨＢ活性を要求すること、及びＨＤＨＢの局在化はＣＤＫリン酸化によって調節されていることを示している。
【００１２】
以上の方法のいずれも、ゲノムに安定的に一体化されえ、細胞周期のＧ１、Ｓ及びＧ２の期を示すのに使用されうるセンサを具体的に記載するものではない。従って、細胞周期のこれらの期を単一の哺乳類生細胞において非破壊的に決定し、同じ細胞を経時的に繰り返して調べることを可能とし、また細胞周期に対して望ましいか又は望ましくない効果を潜在的に有する薬剤の効果を研究することを可能とする方法が必要とされている。また、複数の薬剤に対するこれらの効果を平行に評価することができるようになる方法も必要とされている。
【特許文献１】欧州特許出願公開第７９８３８６号明細書
【特許文献２】米国特許第６０４８６９３号明細書
【特許文献３】米国特許第６１５９６９１号明細書
【特許文献４】国際公開第０３／０３１６１２号パンフレット
【非特許文献１】Ｆｌａｔｔ ＰＭ ａｎｄ Ｐｉｅｔｅｎｐｏｌ ＪＡ ２０００ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｒｅｖ ３２（３−４）：２８３−３０５
【非特許文献２】Ｂｕｏｌａｍｗｉｎｉ ＪＫ ２０００ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｅｓｉｇｎ ６， ３７９−３９２
【非特許文献３】Ｐｉｎｅｓ， Ｊ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， （１９９９）， １， Ｅ７３−Ｅ７９
【非特許文献４】Ｋｏｈｎ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ （１９９９）， １０， ２７０３−２７３４
【非特許文献５】Ｂａｒｌｏｇｉｅ Ｂ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９８３ ４３（９）：３９８２−９７
【非特許文献６】Ｈｅｒｍａｎ， Ｃａｎｃｅｒ （１９９２）， ６９（６）， １５５３−１５５６
【非特許文献７】Ｈａｕｓｅｒ ａｎｄ Ｂａｕｅｒ， Ｐｌａｎｔ ａｎｄ Ｓｏｉｌ， （２０００）， ２２６， １−１０
【非特許文献８】Ｂｒａｎｄｅｉｓ ａｎｄ Ｈｕｎｔ， ＥＭＢＯ Ｊ．， （１９９６）， １５， ５２８０−５２８９
【非特許文献９】Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ．， （２００４）， ２３， ３０６−３１２
【非特許文献１０】Ｇｕ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｃｅｌｌ．， （２００４）， １５， ３３２０−３３３２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明に記載するのは、動的な読み取りをもたらす非破壊的なプロセスで、個々の生細胞について細胞周期の状態を決定する新規の手段を提供する、規定の組み合わせにおける細胞周期調節機構の主要な成分を利用する方法である。
【００１４】
本発明はさらに、タンパク質、ＤＮＡ構築物、ベクター、及びかかるタンパク質を安定に発現する細胞であって、Ｇ１／Ｓ細胞周期依存性の位置制御配列へのレポーターシグナルの直接的な結合により、細胞周期に特異的に検出可能なレポーター分子の転位置を呈するものを提供する。これによって、細胞周期状態の決定の精度が大幅に改善され、個々の細胞における細胞周期の進行を継続的にモニターすることが可能になる。さらに、細胞周期制御機構の機能性エレメントから主要な制御エレメントを単離及び抽出でき、動的に調節され、しかも内在性細胞周期制御成分と連携するものの独立して作用する細胞周期レポーターの設計が許容されることが見出されており、これにより、細胞周期の自然な進行に影響したり妨害したりすることなく細胞周期位置をモニターするための手段が提供される。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の第一の特徴によれば、１１２０００ダルトン未満の分子量を有する基を介して、１以上の細胞周期依存性の位置制御エレメントと連結した検出可能な生細胞レポーター分子を含むポリペプチド構築物であって、前記エレメントの位置はＧ１及びＳ期に変化し、哺乳類細胞内での前記構築物の転位置が細胞周期位置を示すものであるポリペプチド構築物が提供される。
【００１６】
転位置とは、細胞内のある位置から別の位置への、典型的には核から細胞質への、又はその逆の、レポーターの検出可能な移動と定義されることは理解されよう。さらに、「生細胞」の用語で、レポーター分子に関連して、生細胞において検出可能なシグナルを生じるレポーター分子、又は抗原性タグなどの、生細胞で発現され、免疫学的方法にて固定した後に検出されえ、このためＩＮセルアナライザ（ＧＥヘルスケア）のような画像化システムでの使用に好適であるレポーターを定義することが理解されよう。
【００１７】
好適には、上記基は１０００００ダルトン未満の分子量を有する。
【００１８】
好適には、この基は５００００ダルトン未満の分子量を有する。
【００１９】
好適には、この基は２５０００ダルトン未満の分子量を有する。
【００２０】
好適には、この基は１００００ダルトン未満の分子量を有する。
【００２１】
好適には、この基は１０００ダルトン未満の分子量を有する。
【００２２】
好適には、この基は７００ダルトン未満の分子量を有する。
【００２３】
好適には、この基は５００ダルトン未満の分子量を有する。
【００２４】
好ましくは、この基はポリペプチドである。かかるポリペプチド基は比較的小さいものであるとよく、柔軟性及び／又は細胞周期依存性の位置制御エレメントに対するレポーター分子の回転を許容するアミノ酸を含んでいるとよい。さらに好ましくは、ポリペプチド基はヘプタペプチドである。最も好ましくは、前記ヘプタペプチド基は、グリシン−アスパラギン−グリシン−グリシン−アスパラギン−アラニン−セリン（ＧＮＧＧＮＡＳ）である。上述の通り、柔軟性及び／又は位置制御エレメントに対するレポーター分子の回転を許容するものであればいかなるアミノ酸でも、ポリペプチドで使用してよい。
【００２５】
好適には、細胞周期特異的な依存性位置制御エレメントは、Ｒａｇ２、Ｃｈａｆ１Ｂ、Ｆｅｎ１、ＰＰＰ１Ｒ２、ヘリカーゼＢ、ｓｇｋ、ＣＤＣ６、又はヘリカーゼＢのＣ末端の特殊な制御領域のリン酸化依存性細胞内局在化ドメイン（ＰＳＬＤ）などといった、それらの中のモチーフからなるペプチドの群から選択される。ヘリカーゼＢは、非制御のＤＮＡライセンシングを引き起こすことが知られており、過剰に発現された場合には細胞の生存に有害になることがある。従って、細胞周期依存性の位置制御エレメントは、好ましくはヘリカーゼＢのＣ末端特殊制御領域のリン酸化依存性細胞内局在化ドメイン（ＰＳＬＤ）である。
【００２６】
ヒトヘリカーゼＢ相同体が報告されて、特徴付けがなされており（Ｔａｎｅｊａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、（２００２）、２７７、４０８５３−４０８６１）、核酸配列（ＮＭ ０３３６４７）、並びに対応するタンパク質配列はそれぞれ配列番号：１及び配列番号：２に示されている。この報告では、Ｇ１／Ｓ移行を促進するにはＧ１の間にヘリカーゼ活性が必要であることが示されている。Ｇｕら（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．、（２００４）、１５、３３２０−３３３２）は、リン酸化依存性細胞内局在化ドメイン（ＰＳＬＤ）と命名されたヘリカーゼＢ遺伝子の小さなＣ末端領域が、Ｃｄｋ２／サイクリンＥによってリン酸化され、ＮＬＳ及びＮＥＳ配列を含むことを示している。Ｇｕら（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．、（２００４）、１５、３３２０−３３３２）は、ＣＭＶプロモーターから発現されるＥＧＦＰ−βＧａｌ−ＰＳＬＤ融合体（融合タンパク質全体のサイズが完全体のヘリカーゼＢと同様になるよう、ベータ−ガラクトシダーゼ（βＧａｌ）が不活性基として構築物に含められたもの）をコードするプラスミドで一過性にトランスフェクトされた細胞の研究を行った。Ｇ１の細胞は、主に核でＥＧＦＰシグナルを呈したが、細胞周期の他の期の細胞は、主に細胞質のＥＧＦＰシグナルを呈した。これらの研究者らは、ＰＳＬＤが細胞周期のＧ１／Ｓ期移行のあたりで、核から細胞質へとレポーターの転位置を指向すると結論付けた。
【００２７】
好適には、生細胞レポーター分子は、蛍光タンパク質、酵素及び抗原性タグからなる群から選択される。好ましくは、蛍光タンパク質はＡｅｑｕｏｒｉａ Ｖｉｃｔｏｒｉａ、Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、又はＨｙｄｒｏｚｏａ及びＡｎｔｈｏｚｏａ類に属するその他のものに由来する（Ｌａｂａｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、（２００２）、９９、４２５６−４２６１）。さらに好ましくは、蛍光タンパク質はＥＧＦＰ（ＢＤクロンテック）、Ｅｍｅｒａｌｄ（Ｔｓｉｅｎ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、（１９９８）、６７、５０９−５４４）又はＪ−Ｒｅｄ（Ｅｖｒｏｇｅｎ）である。最も好ましくは、蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、増強型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、Ｅｍｅｒａｌｄ及びＪ−Ｒｅｄからなる群から選択される。
【００２８】
好適には、レポーターはハロ−タグ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）のような酵素レポーターである。
【００２９】
好適には、レポーター分子はＥＧＦＰ又はＪ−Ｒｅｄであり、また細胞周期依存性の位置制御エレメントはＰＳＬＤである。
【００３０】
好適には、レポーター分子はタンデム化されている（すなわち、タンデムリピートとして存在している）。
【００３１】
配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチド構築物。
【００３２】
本発明の第二の特徴によれば、上述のポリペプチド構築物のいずれかをコードする核酸構築物が提供される。
【００３３】
好適には、前記核酸構築物はさらに、１以上の細胞周期非依存性の発現制御エレメントを含み、それに作動可能に連結され、その制御下にある。
【００３４】
「作動可能に連結される」の用語は、エレメントが意図された目的のために連携して機能するように、例えば、転写がプラスミドで開始して、本発明のレポーター分子をコードするＤＮＡ配列を進行するように、それらが位置されることを示している。
【００３５】
好適には、発現制御エレメントは、細胞周期の間中、転写のレベルの変動を限定しつつ、長期間にわたって転写を制御する。好ましくは、発現制御エレメントは、安定細胞系の生産のために必要な長期間にわたって転写をもたらす、ユビキチンＣ又はＣＭＶ Ｉ／Ｅプロモーターである。
【００３６】
好ましくは、核酸構築物は、ユビキチンＣプロモーター、並びにＰＳＬＤ及びＥＧＦＰ又はＪ−Ｒｅｄをコードする配列を含む。
【００３７】
場合によっては、核酸構築物は、ＣＭＶプロモーター、並びにＰＳＬＤ及びＥＧＦＰ又はＪ−Ｒｅｄをコードする配列を含む。
【００３８】
本発明の第三の特徴において、上述の核酸構築物のいずれかを含むベクターが提供される。好適には、前記ベクターはウイルスベクター、又はプラスミドのいずれかである。好適には、前記ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、又はレンチウイルスベクターである。
【００３９】
任意に、ベクターは真核細胞で機性を有する薬物抵抗性遺伝子、好ましくは哺乳類細胞で機能性を有する薬物抵抗性遺伝子をさらに含む。
【００４０】
発現ベクターはまた、ポリアデニル化シグナル、スプライスドナー／スプライスアクセプターシグナル、介在配列、転写エンハンサー配列、翻訳エンハンサー配列のような他の核酸配列も含みうる。任意に、薬物抵抗性遺伝子とレポーター遺伝子は、これらの２つの遺伝子が別々のプロモーターによって駆動されるよりもむしろ、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）（Ｊａｎｇら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、（１９８８）、６２、２６３６−２６４３）によって作動可能に連結されるとよい。クロンテックより市販されているｐＩＲＥＳ−ｎｅｏ及びｐＩＲＥＳベクターを使用しうる。
【００４１】
本発明の第四の特徴において、上述の核酸構築物でトランスフェクトされた宿主細胞が提供される。当該構築物、又はこのような構築物を含む発現ベクターが導入される宿主細胞は、この構築物を発現することができるいずれの哺乳類細胞であってもよい。
【００４２】
調製したＤＮＡレポーター構築物は、当業者によって良く知られた技術を用いて宿主細胞にトランスフェクトされうる。これらの技術には、エレクトロポレーション（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（１９８６）、６、７１６−７１８）、リン酸カルシウム法（例えば、Ｇｒａｈａｍ及びＶａｎ ｄｅｒ Ｅｂ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、（１９７３）、５２、４５６−４６７）、直接マイクロインジェクション、陽イオン性脂質法（例えば、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（キアゲン）又はＦｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ社）、及びガンによる遺伝子移入の使用（Ｊｉａｏら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、（１９９３）、１１、４９７−５０２）が含まれうる。細胞にＤＮＡ構築物をトランスフェクトするためのさらなる代替法では、ウイルスが細胞に進入する自然の能力が利用される。かかる方法では、例えば、単純ヘルペスウイルス（米国特許第５２８８６４１号）、サイトメガロウイルス（Ｍｉｌｌｅｒ、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、（１９９２）、１５８、１）、ワクシニアウイルス（Ｂａｉｃｈｗａｌ及びＳｕｇｄｅｎ、１９８６、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ、Ｒ．Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ編、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、第１１７−１４８頁）、並びにアデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス（Ｍｕｚｙｃｚｋａ、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、（１９９２）、１５８、９７−１２９）に基づいた、ベクター及びトランスフェクションプロトコルが包含される。
【００４３】
好適な組換え宿主細胞の例としては、ＨｅＬａ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、チャーニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、Ｕ２ＯＳ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、ＨｅｐＧ２、ＮＩＨ３Ｔ３ ＭＤＣＫ、ＲＩＮ、ＨＥＫ２９３及びインビトロで生育するその他の哺乳類細胞系が挙げられる。好ましくは、宿主細胞はヒト細胞である。かかる細胞系は、アメリカン・ティッシュ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ、ベセズダ、メリーランド、米国）より入手可能である。哺乳類から細胞を取り出した後に樹立され、その後所定期間細胞培養されている初代細胞系由来の細胞もまた、本発明に含まれることが意図される。
【００４４】
好ましい実施形態において、細胞系は第四の特徴にかかる複数の宿主細胞を含む安定細胞系である。
【００４５】
細胞周期位置レポーターの安定な発現を呈する細胞系もまた、標準法を用い、宿主動物において操作された細胞の異種移植片を樹立するのに使用されうる（Ｋｒａｓａｇａｋｉｓ，Ｋ．Ｊら、Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、（２００１）、１８７（３）、３８６−９１；Ｐａｒｉｓ，Ｓ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ、（１９９９）、１７（１０）、８１７−２２）。細胞周期位置レポーターを発現するように操作された腫瘍細胞系の異種移植片によって、腫瘍細胞分裂、鬱血及び転移を研究するモデル系を確立すること、並びに新しい抗癌剤をスクリーニングすることが可能になるであろう。
【００４６】
本発明の第五の特徴によれば、哺乳類細胞の細胞周期位置を決定するための、上述のポリペプチドの使用が提供される。
【００４７】
宿主動物における同種移植片としての、細胞周期位置レポーターを発現している操作された細胞系又はトランスジェニック組織の使用によって、組織移植片の寛容性又は拒絶に影響する機構を研究できるようになるであろう（Ｐｙｅ及びＷａｔｔ，Ｊ．Ａｎａｔ．、（２００１）、１９８（Ｐｔ２）、１６３−７３；Ｂｒｏｄ，Ｓ．Ａ．ら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（２０００）、６９（１０）、２１６２−６）。
【００４８】
本発明の第六の特徴によれば、哺乳類細胞の細胞周期位置を決定するための方法が提供され、この方法は、
ａ）細胞中で上述の核酸構築物を発現させ；
ｂ）レポーター分子によって発生するシグナルをモニターすることにより細胞周期位置を決定する工程を含む。
【００４９】
第六の特徴による、細胞の細胞周期位置を決定するための方法を実施するには、ＤＮＡレポーター構築物がトランスフェクトされた細胞を、細胞周期の特定の段階でレポーター分子を発現させるのに充分な条件下、時間で培養するとよい。典型的には、レポーター分子の発現は、トランスフェクション後１６〜７２時間の間に起こるはずであるが、培養条件によって異なりうる。レポーター分子が緑色蛍光タンパク質配列を基にしたものである場合、レポーターが蛍光性たる高次構造へと折り畳まれるのに規定時間かかることがある。この時間は、使用される緑色蛍光タンパク質誘導体の一次配列に依存するものである。蛍光レポータータンパク質はまた、経時的に変色しえ（例えば、Ｔｅｒｓｋｉｋｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、（２０００）、２９０、１５８５−８を参照されたい）この場合、トランスフェクション後、所定時間間隔で画像化する必要がある。
【００５０】
第六の特徴にかかる方法で、レポーター分子が蛍光シグナルを生じる場合、発せられたシグナルをモニターするのに、従来の蛍光顕微鏡、又は共焦点蛍光顕微鏡のいずれかを使用するとよい。これらの技術を使用して、レポーター分子を発現している細胞の比率や、レポーターの位置を決定することができる。本発明にかかる方法において、ＤＮＡ構築物で形質転換またはトランスフェクトされた細胞の蛍光は、例えば、分光光度計、蛍光光度計、蛍光顕微鏡、冷却電荷結合素子（ＣＣＤ）イメージャ（走査イメージャ若しくはエリアイメージャなど）、蛍光標示式細胞分取器、共焦点顕微鏡、又は走査共焦点装置で、培養中の細胞の分光特性が光の励起及び発光の走査として決定しうるものでの光学的手段によって好適に測定しうる。
【００５１】
核酸レポーター構築物が薬物抵抗性遺伝子を含む本発明の実施形態において、薬物抵抗性遺伝子のトランスフェクション及び発現後（通常、１〜２日）、選択可能なマーカー遺伝子の存在のために、トランスフェクトされた細胞が耐性となる対象の抗生物質の存在下での細胞の生育によって、修飾されたレポーター遺伝子を発現している細胞を選択するとよい。抗生物質を添加する目的は、レポーター遺伝子を発現し、そして場合によってはその細胞系のゲノム内にレポーター遺伝子をその関連プロモーターと共に組み込んでいる細胞を選択することにある。選択の後、構築物を発現しているクローン細胞系は、標準技術を用いて単離することができる。クローン細胞系は次いで、標準的な条件下に生育されるとよく、そうすればレポーター分子を発現して細胞周期の特定の点で検出可能なシグナルを生じることになるであろう。
【００５２】
本発明の核酸レポーター構築物をトランスフェクトした細胞は、検討を加えるべきであって細胞の細胞周期に対するその効果を決定すべき被検薬剤の非存在下及び／又は存在下に生育させるとよい。レポーター分子を発現している細胞の比率、及び細胞内でのシグナルの局在を決定することによって、細胞の細胞周期に対する被検薬剤の効果、例えば、細胞周期の特定の段階で被検システムが細胞を停止させるか、又はその効果が細胞分裂を加速若しくは減速するものであるのかなどを決定することができる。
【００５３】
従って、本発明の第七の特徴によれば、哺乳類細胞の細胞周期位置に対する被検薬剤の効果を決定する方法が提供され、この方法は、
ａ）上述の核酸レポーター構築物を、被検薬剤の非存在下及び存在下に細胞中で発現させ；並びに
ｂ）レポーター分子が発生するシグナルをモニターすることによって細胞周期位置を決定する工程を含み、ここで、被検薬剤の非存在下と存在下に測定された発生シグナル間の差が、細胞の細胞周期位置に対する被検薬剤の効果の指標となる。
【００５４】
「被検薬剤」なる用語は、電磁放射線の形態として、又は化学成分として解釈されるべきである。好ましくは、被検薬剤は、薬物、核酸、ホルモン、タンパク質及びペプチドからなる群から選択される化学成分である。被検薬剤は、細胞に外因的に適用されてもよいし、又は研究対象の細胞において発現されるペプチド若しくはタンパク質であってもよい。
【００５５】
本発明の第八の特徴において、哺乳類細胞の細胞周期位置に対する被検薬剤の効果を決定する方法が提供され、この方法は、
ａ）当該被検薬剤の存在下に、上述の核酸レポーター構築物を当該細胞中で発現させ；
ｂ）レポーター分子が発生するシグナルをモニターすることによって細胞周期位置を決定し；並びに
ｃ）被検薬剤の存在下に発生するシグナルを、被検薬剤の非存在下に発生するシグナルに対する既知の数値と比較する工程を含み、
ここで、被検薬剤の存在下に測定された発生シグナルと、被検薬剤の非存在下での既知の数値との差が、細胞の細胞周期位置に対する被検薬剤の効果の指標となる。
【００５６】
本発明の第九の特徴において、哺乳類細胞の細胞周期位置に対する被検薬剤の効果を決定する方法が提供され、この方法は、
ａ）上述の核酸レポーター構築物を含む細胞を用意し；
ｂ）細胞の第一及び第二集団を、被検薬剤の存在下及び非存在下、核酸レポーター構築物の発現を許容する条件下にそれぞれ培養し；並びに
ｃ）第一及び第二細胞集団において、レポーター分子が発生するシグナルを測定する工程を含み、
ここで、第一及び第二細胞集団で測定された発生シグナル間の差が、細胞の細胞周期位置に対する被検薬剤の効果の指標となる。
【００５７】
本発明の第十の特徴において、被検薬剤に応答して変動することが知られている第一の検出可能なレポーターによって測定できる細胞プロセスに対する哺乳類細胞周期の効果を決定する方法が提供され、この方法は、
ａ）被検薬剤の存在下に、上述の第二核酸レポーター構築物を、細胞中で発現させ；
ｂ）第二レポーター分子が発生するシグナルをモニターすることによって細胞周期位置を決定し；並びに
ｃ）第一の検出可能なレポーターが発生するシグナルをモニターする工程を含み、
ここで、工程ｂ）によって決定された細胞周期位置と第一の検出可能なレポーターが発生するシグナルとの関係が、当該細胞プロセスが細胞周期依存性であるか否かの指標となる。
【００５８】
本発明の第十一の特徴において、細胞中のＣＤＫ２活性を測定するための、上述のポリペプチドの使用が提供される。
【００５９】
本発明の第十二の特徴によれば、細胞中のＣＤＫ２活性を測定するための方法が提供され、この方法は、
ａ）上述の細胞中で核酸構築物を発現させ；及び
ｂ）レポーター分子が発生するシグナルをモニターすることによってＣＤＫ２活性を決定する工程を含む。
【００６０】
本発明の第十三の特徴によれば、哺乳類細胞のＣＤＫ２活性に対する被検薬剤の効果を決定するための方法が提供され、この方法は、
ａ）当該被検薬剤の非存在下及び存在下に、上述の核酸構築物を当該細胞中で発現させ；並びに
ｂ）レポーター分子が発生するシグナルをモニターすることによってＣＤＫ２活性を決定する工程を含み、ここで、当該被検薬剤の非存在下及び存在下で測定された発生シグナル間の差が、ＣＤＫ２活性に対する被検薬剤の効果の指標となる。
【００６１】
本発明の第十四の特徴において、哺乳類細胞のＣＤＫ２活性に対する被検薬剤の効果を決定する方法が提供され、この方法は、
ａ）当該被検薬剤の存在下に、上述の核酸構築物を当該細胞中で発現させ；及び
ｂ）レポーター分子が発生するシグナルをモニターすることによって細胞周期位置を決定し；
ｃ）被検薬剤の存在下に発生するシグナルを、被検薬剤の非存在下に発生するシグナルに対する既知の数値と比較する工程を含み、
ここで、被検薬剤の存在下に測定された発生シグナルと、被検薬剤の非存在下での当該既知の数値との差が、細胞のＣＤＫ２活性に対する被検薬剤の効果の指標となる。
【００６２】
図面の簡単な説明
図１は、核又は細胞質におけるＨＤＨＢの局在を示す図である。
（Ａ）Ｕ２ＯＳ細胞の細胞質及び核抽出物を、変性ゲル電気泳動、並びに組換えＨＤＨＢ、α−チューブリン、及びＰＣＮＡに対する抗体を用いたウェスタンブロッティングによって分析した。免疫反応性タンパク質は、化学発光によって検出した。
（Ｂ）Ｕ２ＯＳ細胞に微量注入して一過性に発現されたＧＦＰタグ付きＨＤＨＢを、蛍光顕微鏡によって可視化した。核は、ヘキスト染料で染色した。棒：１０μｍ。
（Ｃ）Ｕ２ＯＳ細胞に微量注入して一過性に発現されたＦＬＡＧタグ付きＨＤＨＢを、蛍光顕微鏡によって可視化した。
【００６３】
図２は、ＧＦＰ−ＨＤＨＢの細胞内局在化は、細胞周期依存性であることを示す図である。
（Ａ）非同調性、Ｇ１、及びＳ期のＵ２ＯＳ細胞における、一過性に発現されたＧＦＰタグ付きＨＤＨＢの細胞内局在化を数量化した。所定の分布パターンを備えたＧＦＰ陽性細胞の数を、ＧＦＰ陽性細胞の総数（＞１００個細胞）の百分率として表した。
（Ｂ）同調性Ｕ２ＯＳ細胞（Ｇ１及びＳ期）の細胞質及び核抽出物を、変性ゲル電気泳動、並びに組換えＨＤＨＢ、α−チューブリン、及びＰＣＮＡに対する抗体を用いたウェスタンブロッティングによって分析した。免疫反応性タンパク質は、化学発光によって検出した。
【００６４】
図３は、ＨＤＨＢの核局在化に必要なドメインの同定を示す図である。
（Ａ）ＣＤＫ（ＳＰ又はＴＰ）に対する７つの潜在的リン酸化部位、推定細胞内局在化ドメイン（ＳＬＤ）及びリン酸化ＳＬＤ（ＰＳＬＤ）、ウォーカーＡ及びウォーカーＢヘリカーゼモチーフを示す、ＨＤＨＢタンパク質の模式図。アミノ酸残基数を、タンパク質の下に示す。
（Ｂ）研究にて作製した、ＧＦＰ−及びＦＬＡＧ−タグ付きＨＤＨＢ、並びにＣ末端切欠変異体。ＨＤＨＢ ＳＬＤ（残基１０４０〜１０８７）及びＰＳＬＤ（残基９５７〜１０８７）のＣ末端を、ＧＦＰ−βＧａｌレポーターに融合させて、それぞれＧＦＰ−βＧａｌ−ＳＬＤ及びＧＦＰ−βＧａｌ−ＰＳＬＤを作出した。
（Ｃ）非同調性、Ｇ１、及びＳ期Ｕ２ＯＳ細胞における、一過性に発現されたＧＦＰ−ＨＤＨＢ−ΔＳＬＤの細胞内局在化を数量化して、ＧＦＰ陽性細胞の総数の百分率として表した。
【００６５】
図４は、ＧＦＰ−βＧａｌ−ＰＳＬＤ細胞内局在化パターンは、細胞周期で変動することを示す図である。
（Ａ）非同調性、Ｇ１、及びＳ期Ｕ２ＯＳ細胞で一過性に発現されたＧＦＰ−βＧａｌ、ＧＦＰ−βＧａｌ−ＳＬＤ、及びＧＦＰ−βＧａｌ−ＰＳＬＤの細胞内局在化を数量化して、ＧＦＰ陽性細胞の総数の百分率として表した。
【００６６】
図５は、ＨＤＨＢのＳＬＤにおける機能性ｒｅｖ型核外移出シグナル（ＮＥＳ）の同定を示す図である。
（Ａ）ＨＤＨＢ内推定ＮＥＳの、他の細胞周期関連タンパク質で同定されたもの（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ及びＥｌｅｆｔｈｅｒｉｏｕ、２０００；Ｆａｂｂｒｏ及びＨｅｎｄｅｒｓｏｎ、２００３）とのアラインメント。アミノ酸配列の上方の上付き添字は、残基数を示す。太矢印は、ＮＥＳの保存された脂肪族残基を指し示す。ＨＤＨＢ内推定ＮＥＳの二対の残基を、細矢印によって示すようにアラニンに変異させてＭｕｔ１及びＭｕｔ２を作出した。
（Ｂ）ＧＦＰ−及びＦＬＡＧ−タグ付きＨＤＨＢを、ＣＲＭ１によって媒介される核外移出を阻害するＬＭＢを、添加して（＋）又は添加せずに（−）、非同調的に成長しているＵ２ＯＳ細胞で一過性に発現させた。非同調性、Ｇ１、及びＳ期細胞における、ＧＦＰ−ＨＤＨＢ及びＦＬＡＧ−ＨＤＨＢの細胞内局在化を数量化して、その試料中のＧＦＰ陽性細胞の総数の百分率として表した。
【００６７】
（Ｃ）非同調性Ｕ２ＯＳ細胞での野生型、並びに変異型ＧＦＰ−ＨＤＨＢ及びＧＦＰ−βＧａｌ−ＰＳＬＤの細胞内局在化を数量化して、その試料中のＧＦＰ陽性細胞の総数の百分率として表した。
【００６８】
図６は、インビボでのＦＬＡＧ−ＨＤＨＢの細胞周期依存的なリン酸化を示す図である。
（Ａ）ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢ（レーン１）、並びにその切欠変異体１−１０３９（レーン２）及び１−８７４（レーン３）を一過性に発現しているＵ２ＯＳ細胞を、［３２Ｐ］オルソ−ホスフェートで標識化した。細胞抽出物を抗ＦＬＡＧレジンで免疫沈降させた。沈降したタンパク質は、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦ膜に転写して、オートラジオグラフィー（上方）又はウェスタンブロッティング（下方）によって検出した。既知分子量のマーカータンパク質の位置を、左側に示す。
（Ｂ）Ｕ２ＯＳ細胞で発現させたＦＬＡＧ−ＨＤＨＢを抗ＦＬＡＧレジンで免疫沈降させ、示した通りにホスファターゼインヒビターの存在下（＋）又は非存在下（−）に、λ−ホスファターゼ（λ−ＰＰａｓｅ）を添加して（＋）又は添加せずに（−）インキュベートして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び抗ＨＤＨＢ抗体を用いたイムノブロッティングによって分析した。
（Ｃ）ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢを発現しているＵ２ＯＳ細胞を、Ｇ１／Ｓ（上方）又はＧ２／Ｍ（下方）で停止させて、その後遮断から復帰させた。表示の時点でＦＬＡＧ−ＨＤＨＢを回収し、抗ＦＬＡＧレジンで免疫沈降させ、λ−ＰＰａｓｅを添加して（＋）又は添加せずに（−）処理して、（Ｂ）におけると同様に分析した。
【００６９】
図７は、ＨＤＨＢ内インビボ主要リン酸化部位としてのＳ９６７の同定を示す図である。
（Ａ）ホスホアミノ酸マーカー（左側）、及びインビボで３２Ｐにて標識化したＦＬＡＧ−ＨＤＨＢからのホスホアミノ酸（右側）を、二次元で分離し、オートラジオグラフィーによって可視化した。加水分解が不完全であったホスホペプチドのあるものは、起点の近傍に残っていた（＋）。
（Ｂ）野生型及び変異型ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢタンパク質を、インビボでオルトホスフェートにて放射標識化し、免疫沈降させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離して、オートラジオグラフィー（上方）及び抗ＨＤＨＢを用いたイムノブロッティング（下方）により分析した。
（Ｃ）３２Ｐにて標識化した野生型及びＳ９６７Ａ変異型ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢのトリプシンで生じたホスホペプチドを二次元に分離して、オートラジオグラフィーによって可視化した。
【００７０】
図８は、ＨＤＨＢ Ｓ９６７の潜在的Ｇ１／ＳキナーゼとしてのサイクリンＥ／ＣＤＫ２の同定を示す図である。
（Ａ）図７Ｃにおけると同様にインビボでリン酸化したＦＬＡＧ−ＨＤＨＢ、又は精製したサイクリンＥ／ＣＤＫ２若しくはサイクリンＡ／ＣＤＫ２によってインビトロでリン酸化した組換えＨＤＨＢ由来の、トリプシンで生じたホスホペプチドを、別個に、又は混合物としてのいずれかで二次元に分離して、オートラジオグラフィーによって可視化した。
（Ｂ）ＦＬＡＧベクターを用いて共免疫沈降させたタンパク質（レーン１、４）、又はＵ２ＯＳ細胞において発現させたＦＬＡＧ−ＨＤＨＢ（レーン２、５）を、ＨＤＨＢ（レーン１〜６）、サイクリンＥ（レーン１〜３）、又はサイクリンＡ（レーン４〜６）に対する抗体を用いてイムノブロッティングによって分析した。免疫沈降のために使用した細胞溶解液の１０分の１を、陽性コントロールとして平行して分析した（レーン３、６）。
【００７１】
図９は、ＨＤＨＢの細胞内局在化は、Ｓ９６７のリン酸化によって調節されることを示す図である。
（Ａ）非同調性、Ｇ１、及びＳ期Ｕ２ＯＳ細胞において発現したＧＦＰ−ＨＤＨＢ Ｓ９６７Ａ及びＳ９６７Ｄの細胞内局在化を数量化した。
【００７２】
図１０は、ｐＣＯＲＯＮ１００２−ＥＧＦＰ−Ｃ１−ＰＳＬＤベクターの安定な発現を呈する非同調性Ｕ２ＯＳ細胞でのＥＧＦＰ−ＰＳＬＤの局在化は細胞周期依存性であることを示す図である。
【００７３】
細胞の同じ部分視野の蛍光顕微鏡で、（Ａ）核をヘキスト染料で染色したもの、（Ｂ）ＥＧＦＰ−ＰＳＬＤを可視化したもの、（Ｃ）固定する前に核を１時間、ＢｒｄＵに曝露し、Ｃｙ−５で標識化した抗体を用いて検出してＳ期の細胞を示したもの。（Ｄ）視野全体に存在する個々の細胞についての、赤色（ＢｒｄＵのＣｙ−５免疫蛍光検出）及び緑色（ＥＧＦＰ−ＰＳＬＤ）双方における核の蛍光強度のグラフ。
【００７４】
図１１は、ｐＣＯＲＯＮ１００２−ＥＧＦＰ−Ｃ１−ＰＳＬＤのベクターマップを示す図である。
【００７５】
図１２は、ｐＣＯＲＯＮ１００２−ＥＧＦＰ−Ｃ１−βＧａｌ−ＰＳＬＤのベクターマップを示す図である。
【００７６】
図１３は、ｐＣＯＲＯＮ１００２−ＥＧＦＰ−Ｃ１−ＰＳＬＤ、ｐＣＯＲＯＮ１００２−ＥＧＦＰ−Ｃ１−βＧａｌ−ＰＳＬＤを用いて発生させた代表的な安定細胞系、並びに親のＵ２ＯＳ細胞系に対するシグナルの輝度及び均一性を比較したフローサイトメトリーのデータを示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７７】
方法
プラスミド
ＢｇｌＩＩ／ＮｏｔＩ断片とした全長のＨＤＨＢ ｃＤＮＡを（Ｔａｎｅｊａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、（２００２）２７７、４０８５３−４０８６１）を、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１ベクター（クロンテック、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）のＮｏｔＩ部位に挿入することにより、ｐＧＦＰ−ＨＤＨＢ、及び変異誘導体（図４及び６参照）を作出した。ｐＦＬＡＧ−ＨＤＨＢは、全長のＨＤＨＢ ｃＤＮＡを含むＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩ断片をｐＦｌａｇ−ＣＭＶ２ベクター（イーストマンコダック社、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）のＮｏｔＩ部位に挿入することによって構築した。タグ付きＨＤＨＢプラスミドを、残基１０３４のコーディング配列の後をＮｒｕＩで、及びポリリンカー内をＮｏｔＩで切断し、そして残基１０３５〜１０３９、終止コドン、及び突出しているＮｏｔＩ−適合性５’端をコードする、平滑末端を持つ二重鎖アダプタオリゴヌクレオチドにより、小断片を置換することによって、タグ付きＨＤＨＢ−ＳＬＤ（１〜１０３９）を構築した。ｐＦＬＡＧ−ＨＤＨＢ（１〜８７４）を作出するために、ＳｔｕＩで消化したｐＦＬＡＧ−ＨＤＨＢ ＤＮＡをクレノウポリメラーゼで処理して平滑末端を作り、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ２ベクターに連結させた。ｐＥＧＦＰ−βＧａｌを作るために、大腸菌β−ガラクトシダーゼ（βＧａｌ）をコードするＤＮＡ断片をｐβＧａｌ−コントロール（クロンテック）からのＰＣＲによって増幅させて、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１内のＧＦＰをコードする配列の３’端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を用いて挿入した。アミノ酸残基１０４０〜１０８７（ＳＬＤ）及び９５７〜１０８７（ＰＳＬＤ）に対するＨＤＨＢ配列をＰＣＲで増幅して、ｐＥＧＦＰ−βＧａｌ内のβＧａｌ ｃＤＮＡの３’端で挿入して、ｐＧＦＰ−βＧａｌ−ＳＬＤ及びｐＧＦＰ−βＧａｌ−ＰＳＬＤをそれぞれ作出した。ＮＥＳ変異体、及びリン酸化部位変異体は、ＨＤＨＢ ｃＤＮＡで、部位特異的突然変異誘発（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ、ストラタジーン、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）によって作出した。
【００７８】
ｐＣＯＲＯＮ１００２−ＥＧＦＰ−Ｃ１−ＰＳＬＤは、ＤＮＡ構築物ｐＧＦＰ−ＣＩ−βＧａｌ−ＰＳＬＤからの３９０塩基対のＰＳＬＤ領域をＰＣＲで増幅することによって構築した。ＰＳＬＤ断片への５’ＮｈｅＩ及び３’ＳａｌＩ制限酵素部位の導入で、ベクターｐＣＯＲＯＮ１００２−ＥＧＦＰ−Ｃ１（ＧＥヘルスケア、アマシャム、ＵＫ）へのサブクローニングが可能になった。この結果得られた６７０４塩基対のＤＮＡ構築物ｐＣＯＲＯＮ１００２−ＥＧＦＰ−Ｃ１−ＰＳＬＤは、ユビキチンＣプロモーター、細菌アンピシリン抵抗性遺伝子、及び哺乳類ネオマイシン抵抗性遺伝子を含んでいる（図１１）。このベクターの核酸配列を、配列番号：３に示す。このベクターのさらに３つのバージョンを、標準クローニング技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．ら（１９８９））を使用して作出した。すなわち、ＥＧＦＰ遺伝子を先ずＪ−Ｒｅｄ（Ｅｖｒｏｇｅｎ）で置換し、ネオマイシン耐性遺伝子をハイグロマイシン抵抗性遺伝子で置換し、そしてユビキチンＣプロモーターをＣＭＶ Ｉ／Ｅプロモーターで置換した。
【００７９】
ｐＣＯＲＯＮ１００２−ＥＧＦＰ−Ｃ１−βＧａｌ−ＰＳＬＤは、ｐＥＧＦＰ−ＣＩ−βＧａｌ−ＰＳＬＤのＮｈｅＩ及びＸｍａＩ制限酵素消化、並びに４２４２塩基対のＥＧＦＰ−βＧａｌ−ＰＳＬＤ断片のｐＣＯＲＯＮ１００２ベクター（ＧＥヘルスケア）への挿入によって構築した。この結果得られた９９３７塩基対のＤＮＡ構築物ｐＣＯＲＯＮ１００２−ＥＧＦＰ−Ｃ１−βＧａｌ−ＰＳＬＤ（図１２）は、ユビキチンＣプロモーター、細菌アンピシリン抵抗性遺伝子、及び哺乳類ネオマイシン抵抗性遺伝子を含んでいる。このベクターの核酸配列を、配列番号：４に示す。
【００８０】
ＥＧＦＰ−ＰＳＬＤ融合タンパク質に対するタンパク質及び核酸配列を、配列番号：５及び６にそれぞれ示す。
【００８１】
すべての構築物及び置換変異体の正しいＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列決定によって確認した。
【００８２】
抗体
抗ＨＤＨＢ抗体は、精製した組換えＨＤＨＢ（ベチルラボラトリーズ、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ、ＴＸ）に対して作製して、固定化ＨＤＨＢにてアフィニティ精製した（Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、抗体：実験室マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー研究所）。
【００８３】
細胞培養、同調、微量注入、エレクトロポレーション、トランスフェクション及び安定細胞系の作製
Ｕ２ＯＳ細胞を、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）（アトランタバイオロジーズ、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、ＧＡ）を追加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ギブコＢＲＬライフテクノロジーズ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中で、指数関数的に生育する単層として３７°Ｃにて培養した。指数関数的に成長しているＵ２ＯＳ細胞は、５ｍＭチミジン（シグマ−アルドリッチ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含有するＤＭＥＭ中でのインキュベーションによって２４時間、Ｇ１／Ｓで停止させた。細胞をＳ期へと復帰させるために、培地を吸引し、１０％ＦＢＳを含む暖かいＤＭＥＭで細胞を３回洗浄して、１０％ＦＢＳを含む新鮮なＤＭＥＭ中でインキュベートした。指数関数的に成長しているＵ２ＯＳ細胞を、３０ｎｇ／ｍｌのノコダゾール（シグマ−アルドリッチ）を含有するＤＭＥＭ中で１６時間、Ｇ２／Ｍで停止させた。Ｇ１へと細胞を復帰させるために、穏やかにシェイクオフすることによって有糸分裂細胞を集め、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで３回洗浄し、次いで微量注入用のカバーガラス上、又はさらに操作するために培養ディッシュ内で平板培養した。
【００８４】
細胞周期同調は、以前報告された通りに（Ｔａｎｅｊａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、（２００２）２７７、４０８５３−４０８６１）フローサイトメトリーによって検証した。核タンパク質の移出を阻止する実験において、１０ｎｇ／ｍｌのレプトマイシンＢ（ＬＭＢ）及び１０μＭのシクロヘキシミド（カルバイオケム、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）を含有するＤＭＥＭ中で３時間培養して、新しいタンパク質合成を阻止した。カバーガラス上に平板培養した細胞を、タンパク質でなくプラスミドＤＮＡを注入したことを除いてはＨｅｒｂｉｇら、１９９９に記載された通りに微量注入した。
【００８５】
エレクトロポレーションのために、非同調的に成長しているＵ２ＯＳ細胞（５×１０６）をトリプシン処理し、遠心分離によって集めて、８００μｌの２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．７ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、６ｍＭグルコースに、最終ｐＨ７．４で再懸濁させた。１０μｇのＤＮＡを添加し、０．４ｃｍのエレクトロポレーションキュベット（バイオラッド、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）に移して、ジーンパルサーＩＩ装置（バイオラッド）を用いてエレクトロポレーションを行った。細胞を組織培養ディッシュ内で１時間、平板培養し、新鮮な培地で洗浄してさらに２３時間培養した。
【００８６】
一過性にトランスフェクトした細胞での作業は、トランスフェクション効率の低さ、発現の不均一性、及びこのようなデータのハイスループット分析により生じる問題のために、マルチウェルプレート形式では困難であることがわかった。従って、細胞周期に対する数多くのｓｉＲＮＡ又は薬剤の効果をスクリーニングするには、均一な安定細胞系の生産が必要であった。長期間過剰発現された場合のＨＤＨＢの毒性効果のゆえに、レポーターに連結したＰＳＬＤ領域を用いて安定細胞系を作った。Ｕ−２ＯＳ細胞を、ｐＣＯＲＯＮ１００２−ＥＧＦＰ−Ｃ１−ＰＳＬＤ（図１１）、ｐＣＯＲＯＮ１００２−ＥＧＦＰ−Ｃ１−βＧａｌ−ＰＳＬＤ（図１２）、又は前記ベクターのＪ−Ｒｅｄ誘導体で一過性にトランスフェクトした。組換え融合タンパク質を発現している安定なクローンを、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（シグマ）又はハイグロマイシンを適宜に用いて選択した。センサの発現のレベル及び均一性を確認するために、単離した初代クローン（構築物当たり〜６０）を、フローサイトメトリーによって分析し、そして必要に応じ第二代のクローンを上記方法を使用して発生させた。
【００８７】
蛍光顕微鏡
間接免疫蛍光染色のために、細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、３．７％ホルムアルデヒドを含むＰＢＳで２０分間固定して、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で５分間透過化処理をし、そして１０％ＦＢＳを含むＰＢＳ中で４５分間インキュベートした。ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢは、マウスモノクローナル抗ＦＬＡＧ抗体（シグマ−アルドリッチ、１０％ＦＢＳを含むＰＢＳ中、１：１００）を用いて２時間、室温で検出した。洗浄後、細胞をＴｅｘａｓ Ｒｅｄが接合したヤギ抗マウス二次抗体（ジャクソンイムノリサーチラボラトリーズ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ、１０％ＦＢＳを含むＰＢＳ中、１：１００）と、室温で１時間インキュベートした。３回洗浄した後、細胞をヘキスト３３２５８（ＰＢＳ中２μＭ）と１０分間インキュベートした。カバーガラスをＰｒｏＬｏｎｇ Ａｎｔｉｆａｄｅ（モレキュラープローブズ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）に取り付けた。浜松デジタルカメラで、Ｏｐｅｎｌａｂ３．０ソフトウェア（インプロビジョン、Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）を用い、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｌａｎ２画像化システム（カールツァイス社）にて画像を得た。細胞内局在化の各パターンを示す細胞の数を計数して、評点した細胞の総数（各実験で１００〜１５０細胞）の百分率として表した。各タンパク質の細胞内分布を、少なくとも二度の独立した実験で定量的に評価した。
【００８８】
ＧＦＰ蛍光については、細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、２μＭのヘキスト３３２５８を含有する３．７％ホルムアルデヒドで２０分間固定して、前記と同様に画像化及び評価した。
【００８９】
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００での抽出については、細胞を冷細胞骨格緩衝液（ＣＳＫ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、３００ｍＭスクロース、１００ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２）で２回洗浄して、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＣＳＫ緩衝液（１Ｘプロテアーゼインヒビターを追加したもの）で氷上にて５分間抽出し、その後前記と同様に固定した。
【００９０】
必要であれば、ハイスループット画像化のために、動的画像化（２４時間）、及び安定細胞系の蛍光顕微鏡のマルチウェルプレート形式での分析を、ハイスループット共焦点画像化システム（ＩＮセルアナライザー１０００又はＩＮセルアナライザー３０００、ＧＥヘルスケア、アマシャム、ＵＫ）を用い、ｐＣＯＲＯＮ１００２−ＥＧＦＰ−Ｃ１−ＰＳＬＤ、ｐＣＯＲＯＮ１００２−ＥＧＦＰ−Ｃ１−βＧａｌ−ＰＳＬＤ又はこれらのベクターのｒｅｄＦＰ誘導体をトランスフェクトした細胞について行った。画像は、細胞周期フェーズマーカー・アルゴリズム（ＧＥヘルスケア）を使用して分析した。
【００９１】
代謝的ホスフェート標識化
Ｕ２ＯＳ細胞（２．５ｘ１０６）を、野生型又は変異型ＦＬＡＧＨＤＨＢで一過性にトランスフェクトした。２４時間後に、ホスフェートが枯渇したＤＭＥＭ（ギブコＢＲＬライフテクノロジーズ）中で細胞を１５分間インキュベートして、３２Ｐ−Ｈ３ＰＯ４（０．３５ｍＣｉ／ｍｌの培地；ＩＣＮファーマシューティカルズ社．、Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ、ＣＡ）で４時間放射標識化した。ホスフェートで標識化したＦＬＡＧ−ＨＤＨＢを抽出物から免疫沈降させ、７．５％ＳＤＳ／ＰＡＧＥによって分離して、下記の通りにポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜に転写した。
【００９２】
細胞抽出、免疫沈降、及びウェスタンブロッティング
トランスフェクションから２４時間後に、免疫沈降及びイムノブロッティングによる分析を行う対象となる、ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢでトランスフェクトした培養物を、溶解用緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０％グリセロール、０．１％ＮＰ−４０、１ｍＭ ＤＴＴ、２５ｍＭ ＮａＦ、１００μｇ／ｍｌ ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌアプロチニン、１μｇ／ｍｌロイペプチン）（３５ｍｍディッシュ当たり０．５ｍｌ、又は６０ｍｍディッシュ若しくは７５ｃｍフラスコ当たり１ｍｌ）で溶解させた。抽出物をディッシュから掻き取り、氷上で５分間インキュベートして、１４０００ｇで１０分間遠心分離した。上清の試料（０．５〜１ｍｇのタンパク質）を、回転体の上で１０μｌの抗ＦＬＡＧアガロース（シグマ）と４°Ｃにて２時間インキュベートした。アガロースビーズを、溶解緩衝液で３回洗浄した。免疫沈降したタンパク質をＰＶＤＦ膜に転写して、抗ＨＤＨＢ−ペプチド血清（１：５０００）、抗サイクリンＥ抗体（１：１０００）、及び抗サイクリンＡ抗体（１：１０００）（サンタクルーズバイオテクノロジー社、サンタクルーズ、ＣＡ）、並びに化学発光（スーパーシグナル、ピアスバイオテクノロジー社、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いたウェスタンブロッティングによって分析した。
【００９３】
選択的な核、及び細胞質タンパク質の抽出のためには、８０〜９０％集密のＵ２ＯＳ細胞をトリプシン処理によって収集して、ＰＢＳで洗浄した。細胞を１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２５Ｍスクロース、１０％グリセロール、７５μｇ／ｍｌジギトニン、１ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１００μｇ／ｍｌ ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌアプロチニン、及び１μｇ／ｍｌ ロイペプチンに再懸濁し、氷上で１０分間溶解させて、１０００ｘｇで５分間遠心分離した。上清画分を、細胞質ゾルの抽出物として集めた。ペレットを洗浄し、高塩緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、４００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、１％ＮＰ−４０、１００μｇ／ｍｌ ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌアプロチニン、及び１μｇ／ｍｌロイペプチン）に再懸濁して、４℃で１０分間振動させた。音波処理後に、可溶性及びクロマチン結合性タンパク質の双方を含有する懸濁物を、核抽出物として分析した。核及び細胞質抽出物中のタンパク質を、８．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、α−チューブリン、ＰＣＮＡ（双方ともサンタクルーズバイオテクノロジー）、及び組換えＨＤＨＢに対する抗体を用いたウェスタンブロッティングを行って分析した。
【００９４】
タンパク質ホスファターゼ反応
抗ＦＬＡＧビーズに結合したＦＬＡＧ−ＨＤＨＢを、１００Ｕのλ−ホスファターゼ（ニューイングランドバイオラボズ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を含むホスファターゼ緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％ＮＰ−４０）と３０℃で１時間インキュベートした。反応は、ホスファターゼインヒビター（５ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、５０ｍＭ ＮａＦ）の存在下又は非存在下で行った。タンパク質を７．５％ＳＤＳＰＡＧＥ（アクリルアミド−ビスアクリルアミド比、３０：０．３６）によって分離して、抗ＨＤＨＢ−ペプチド血清及び化学発光を用いたウェスタンブロッティングによってＨＤＨＢを検出した。
【００９５】
トリプシン分解ペプチドマッピング及びホスホアミノ酸分析
トランスフェクション後２４時間に、免疫沈降及びホスホアミノ酸又はホスホペプチドのマッピングに使用すべき放射標識化ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢをトランスフェクトした培養物を、溶解緩衝液をＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸、１％ＳＤＳ、５０ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１００μｇ／ｍｌＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌアプロチニン、及び１μｇ／ｍｌロイペプチン）に置き換えたことを除いては前記と同様に処理した。免疫沈降したタンパク質を、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離して、ＰＶＤＦ膜に転写した。放射標識化ＨＤＨＢを含む膜を、脱イオン水で２回、よく濯いで、その後オートラジオグラフィーによってホスホタンパク質を可視化した。次いでホスホタンパク質を切り出して、膜片をメタノール、その後水で再度湿潤化した。膜を、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（シグマ−アルドリッチ）を含有する５０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３で室温にて３０分間ブロッキングして、５０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３で３回洗浄し、その後ＰＶＤＦからのホスホタンパク質の酵素的切断を、Ｌ−（トシルアミド−２−フェニル）エチルクロロメチルケトンで処理したウシ膵臓トリプシン（ウォージントン、Ｌａｋｅｗｏｏｄ、ＮＪ）を用いて行った。ペプチドは次いで、他の文献（Ｂｏｙｌｅら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、（１９９１）、２０１、１１０−１４９）で詳説されている二次元ホスホペプチドマッピング又はホスホアミノ酸分析に供した。
【００９６】
インビトロでのサイクリン依存性キナーゼ反応
精製したサイクリン／ＣＤＫ（２００ｐｍｏｌ／時）（Ｒ．Ｏｔｔ及びＣ．Ｖｏｉｔｅｎｌｅｉｔｎｅｒにより提供）、及び精製した組換えＨＤＨＢ（Ｔａｎｅｊａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、（２００２）２７７、４０８５３−４０８６１）を基質として使用し、以前に報告されたように（Ｖｏｉｔｅｎｌｅｉｔｎｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、（１９９９）、１９、６４６−５６）キナーゼ反応を実施した。
【００９７】
ＢｒｄＵ標識化、化学的細胞周期遮断の同定、及び安定細胞系のＲＮＡｉ実験
ｐＣＯＲＯＮ１００２−ＥＧＦＰ−Ｃ１−ＰＳＬＤ構築物を発現している安定な細胞を、抗生物質不含の培地（１００μｌ／ウェル）を使用し、９６ウェルのグライナープレートに０．３ｘ１０５／ｍｌで播種して、１６時間インキュベートした。
【００９８】
Ｓ期のＥＧＦＰ−ＰＳＬＤの分布を調べるために、細胞増殖キット（アマシャムバイオサイエンシズ、ＧＥヘルスケア）を用い、安定な細胞をＢｒｄＵで１時間マーキングした。細胞を２％ホルマリンで固定して、取り込まれたＢｒｄＵを、Ｃｙ−５で標識化した二次抗体システム（細胞増殖キット；ＧＥヘルスケア）を用いた免疫蛍光によって検出した。核はヘキスト（２μＭ）で染色した。
【００９９】
化学的遮断の研究（表１）には、安定な細胞をオロモウシン、ロスコビチン、ノコダゾール、ミモシン、コルセミド又はコルヒチン（シグマ）に曝した。細胞を２％ホルマリンで固定して、核をヘキスト（２μＭ）で染色した。
【０１００】
ｓｉＲＮＡの研究には、特定のサイクリン、ＭＣＭタンパク質、ＣＤＫ、ｐｏｌｏ様キナーゼ（ＰＬＫ）、及び無作為コントロール二重鎖（表２）に対するｓｉＲＮＡプール（ダーマコン）を、リポフェクタミン／オプティメムＩ（インビトロジェン）中、２５ｎＭに希釈して、安定な細胞に４時間添加した。培地を交換して、プレートを４８時間インキュベートした。細胞を２％ホルマリンで固定し、核をヘキスト（２μＭ）で染色した。
【０１０１】
ＩＮセルアナライザーシステム（ＧＥＨＣ）でのハイスループット画像化及び分析の後に、平均の核の強度及びＮ：Ｃ比（ＥＧＦＰシグナル）、核サイズ（ヘキストシグナル）、並びに、必要に応じて核シグナル強度（ＢｒｄＵ）についての視野内の個々の細胞の総数に対するデータを、核マスクとしてヘキスト、及びＩＮセルアナライザー３０００細胞周期フェーズマーカーアルゴリズム（ＧＥＨＣ）を用いて得た。各ウェルにつき、視野当たりの細胞の総数を、Ｇ１期（主に核にＥＧＦＰが分布している；ＥＧＦＰ−ＰＳＬＤ核強度及びＮ：Ｃ比が高い）、Ｓ期（核のＢｒｄＵシグナル＞３ＳＤｓがバックグラウンドを超える；ＥＧＦＰ−ＰＳＬＤ Ｎ：Ｃ比がおよそ１である）、並びにＧ２期（核サイズが大きい；ＥＧＦＰ−ＰＳＬＤ Ｎ：Ｃ比が低い）に分類した。Ｍ期細胞を（小さい核のサイズと非常に強いＥＧＦＰシグナルに基づき）区別することは可能であったが、このような細胞は洗浄及び固定のプロセスの間に除去されたため、ごくわずかしかホルマリンで固定したウェルに認められなかった。
【０１０２】
結果
ＨＤＨＢは、核点状構造内又は細胞質内に存在する
内在性のＨＤＨＢの細胞内局在化を決定するために、核及び細胞質性のタンパク質をヒトＵ２ＯＳ細胞から選択的に抽出し、変性ゲル電気泳動によって分離して、ウェスタンブロッティングにより分析した（図１）。各抽出物中のＰＣＮＡ及びα−チューブリンの存在を先ずモニターして、抽出手順を評価した。ＰＣＮＡは細胞質画分でなく核抽出物に濃縮されており、一方α−チューブリンは主として細胞質画分に認められ、分画が確認された。ＨＤＨＢは、核及び細胞質画分の双方に検出された（図１）。細胞質のＨＤＨＢは、核画分よりもゆっくりと移動し（図１）、翻訳後修飾の可能性が示唆された。
【０１０３】
これらの結果は、ＨＤＨＢが細胞全体にわたって分布していることか、又は核若しくは細胞質のいずれかで細胞の混合集団がＨＤＨＢを含んでいることのどちらかを示しうるものであった。これらの選択肢を識別するために、ＨＤＨＢを単一細胞において原位置で局在化させ；ＧＦＰ−及びＦＬＡＧ−のタグ付きＨＤＨＢを一過性のトランスフェクションによってヒトＵ２ＯＳ細胞で発現させた。タグ付き又はタグなしのＨＤＨＢの長期間過剰発現は細胞毒性があったので、すべての実験は可能な限り最短時間（通常、２４時間）で行った。タグ付きＨＤＨＢの局在を、蛍光顕微鏡により個々の細胞において分析した。ＧＦＰ−ＨＤＨＢ及びＦＬＡＧ−ＨＤＨＢの双方とも、核の分散した点状構造内か、又は細胞質内（図１）のいずれかという、局在の二種の主要パターンを呈した。初代ヒト線維芽細胞で一過性に発現されたＧＦＰ−ＨＤＨＢもまた、核又は細胞質のいずれかで観察された。
【０１０４】
ＨＤＨＢにおける細胞周期依存性の細胞内局在化ドメインの同定
Ｕ２ＯＳ細胞をノコダゾールでＧ２／Ｍにて停止させ、３時間Ｇ１に復帰させて、その後それらの核内にｐＧＦＰ−ＨＤＨＢ ＤＮＡを微量注入した。ＧＦＰ−ＨＤＨＢの発現は、６時間後に容易に検出でき、この際およそ７０％のＧ１期細胞が、主に核内に融合タンパク質を蓄積していた（図２）。一方、細胞をＧ１／Ｓでチミジンで同調させ、Ｓ期に復帰させて、その後ｐＧＦＰ−ＨＤＨＢ ＤＮＡを微量注入した場合、７０％より多くのＳ期細胞が、主に細胞質に融合タンパク質を蓄積していた（図２）。Ｇ１及びＳ期のＵ２ＯＳ細胞の選択的な抽出で、内在性のＨＤＨＢは、Ｇ１ではほとんど核に、Ｓ期では細胞質にあることが明らかになった（図２ｂ）。しかし、内在性のＨＤＨＢは、双方の細胞内画分で明らかに検出できた。Ｓ期のＨＤＨＢの移動性は、Ｇ１期タンパク質に比べてわずかに遅延していた。これらの結果から、ＨＤＨＢの細胞内局在化は細胞周期において調節されており、またＧＦＰタグ付きＨＤＨＢは内在性のタグなしヘリカーゼの局在を反映することが示唆される。
【０１０５】
ブルーム症候群ヘリカーゼ及びその他のＲｅｃＱ−ファミリーのヘリカーゼのＣ末端核位置シグナルの同定（Ｈｉｃｋｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ、（２００３）３、１６９−１７８）による示唆を受けて、可能性のある細胞内局在化ドメイン（ＳＬＤ）をＨＤＨＢのＣ末端の最端部で同定した（図３）。この推定ＳＬＤがＨＤＨＢ局在化にとって重要であるか否かを決定するために、ＳＬＤを含むＣ末端の４８残基を欠くＨＤＨＢの切欠変異体（ＧＦＰ−ＨＤＨＢ−．ＳＬＤ）を作製した（図３）。Ｇ１又はＳ期のＵ２ＯＳ細胞に発現ベクターを微量注入して、融合タンパク質の細胞内局在化を６時間後に蛍光顕微鏡によって調べた。ＨＤＨＢ発現の細胞周期でのタイミングに関わらず、９５％を超える細胞が細胞質に融合タンパク質を蓄積していた（図３ｃ）。この結果は、ＧＦＰ−ＨＤＨＢ−ΔＳＬＤにおけるＣ末端欠失によって損なわれるか又は喪失されるＮＬＳをＨＤＨＢが担持しているかもしれないことを示唆している。
【０１０６】
ＨＤＨＢのＣ−末端ドメインが核局在化に充分なものであるか否かを決定するために、細菌のβ−ガラクトシダーゼ（βＧａｌ）がＨＤＨＢに近似した分子量（１１２ｋＤａ）を有しており、細胞内局在化シグナルを有していない（Ｋａｌｄｅｒｏｎら、Ｃｅｌｌ、（１９８４）、３９、４９９−５０９）ので、これをレポータータンパク質として用いた。コントロールとして、ＧＦＰ−βＧａｌ発現ベクター（図３）を作出して、発現ベクターをＵ２ＯＳ細胞へ微量注入した後に融合タンパク質の細胞内局在化をモニターした。予想通り、ＧＦＰ−βＧａｌタンパク質は主に細胞質に蓄積していた（図４）。これに対して、ＧＦＰ−βＧａｌ−ＳＬＤは、非同調性又は同調性Ｕ２ＯＳ細胞の核及び細胞質の双方に認められ（図４）、ＳＬＤはＮＬＳを含むものの、レポータータンパク質の核局在化に充分なものではないことが示唆された。ことによると隣接する潜在的ＣＤＫリン酸化部位が、細胞周期における細胞内局在化（図３）に影響を及ぼすかもしれないと類推して、ＧＦＰ−βＧａｌ−ＰＳＬＤを構築したが、これは、ＨＤＨＢの推定ＳＬＤ及び潜在的ＣＤＫリン酸化部位のクラスタを含むＣ末端１３１残基をＧＦＰ−βＧａｌのＣ末端に付加したものであった（図３）。ＧＦＰ−βＧａｌ−ＰＳＬＤプラスミドＤＮＡを、非同調性及び同調性Ｕ２ＯＳ細胞で一過性に発現させた場合、ＧＦＰ−βＧａｌ−ＰＳＬＤは、９０％より多くのＧ１期細胞で核に認められ、また７０％より多くのＳ期細胞で細胞質に認められた（図４）。Ｇ１の核内ＧＦＰ−ＨＤＨＢについて観察された限局的なパターンと対照的に、ＧＦＰ−βＧａｌ−ＰＳＬＤ及びＥＧＦＰ−ＰＳＬＤタンパク質は、核小体のみ割愛して、Ｇ１の核全体に均一に分布していた。ＢｒｄＵでマーク付けされているｐＣＯＲＯＮ１００２−ＥＧＦＰ−Ｃ１−ＰＳＬＤを発現している安定細胞系の分析で、Ｓ期の細胞（非同調集団のおよそ６０％に等しい）は、ＥＧＦＰ−ＰＳＬＤシグナルの均等分布（ｅｑｕｉｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）、又は主に細胞質への分布を呈する（図１０）ことが明示された。Ｇ１細胞に伴うＥＧＦＰ−ＰＳＬＤの主として核への分布を、Ｓ期の細胞は示さなかった。細胞によっては、ＥＧＦＰ−ＰＳＬＤレポーターが絶対的に核で排除されていることを示すものも見られたが（図１０）、これらの細胞はＢｒｄＵを取り込んでいなかった。我々は、核からのＥＧＦＰ−ＰＳＬＤの絶対的なクリアランスを示す細胞はＧ２にあるとの仮説を立てた。２４時間にわたるＥＧＦＰ−ＰＳＬＤの安定細胞系の動的な画像化により、ＥＧＦＰ−ＰＳＬＤは有糸分裂後、Ｇ１では主に核内にあり、Ｇ１／Ｓ移行期の頃（細胞質分裂後、３．５時間まで）に核から細胞質への迅速な移動を、さらにＧ１／ＳからＧ２の終点にわたって（およそ１９時間）核から細胞質への累進的な転位置を呈すことが示され；この時点で再分裂の前に細胞のラウンディングが起こった。これらの観察により、Ｇ２細胞がＥＧＦＰ−ＰＳＬＤレポーターの絶対的な細胞質への分布を呈する可能性が確証されるものと考える。ＥＧＦＰ−ＰＳＬＤ融合体の安定な発現は、Ｕ２ＯＳ細胞又はＧ２Ｍ細胞周期フェーズマーカー細胞系（ＧＥＨＣ）と比較して、細胞周期全長（およそ２４時間）で影響を及ぼすことは認められなかった。これらのデータをまとめると、ＨＤＨＢの細胞内局在化は細胞周期に依存的であり、ＨＤＨＢのＣ末端ＰＳＬＤドメインは細胞周期依存的にタンパク質の細胞内局在化を調節する上で主要な役割を果たし、またＨＤＨＢはＧ１で核内にあるがＳ期の間と、おそらくはＧ２で細胞質に累進的に転位置することが示唆される。
【０１０７】
ＨＤＨＢの機能性ｒｅｖ型ＮＥＳの同定
核と細胞質との間を行き来する数多くのタンパク質は、ＨＩＶｒｅｖタンパク質のプロトタイプのＮＥＳに類似したＮＥＳを含むことが実証されている（図５）。ｒｅｖ型ＮＥＳを含むタンパク質は、移出因子ＣＲＭ１（エクスポーチン１とも称される）が結合して核から細胞質までタンパク質を輸送することを必要とする（Ｗｅｉｓによる総説、Ｃｅｌｌ、（２００３）、１１２、４４１−４５１）。レプトマイシンＢ（ＬＭＢ）は、核タンパク質移出におけるＣＲＭ１活性を特異的に阻害する（Ｗｏｌｆｆら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、（１９９７）、４、１３９−１４７；Ｋｕｄｏら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．、（１９９８）、２４２、５４０−５４７）。ＨＤＨＢのＰＳＬＤ配列の検査によって、推定ｒｅｖ型ＮＥＳ（ＬｘｘｘＬｘｘＬｘＬ；図５）が明らかになった。ＨＤＨＢの細胞質への局在化が機能性ＮＥＳを必要とするか否かを決定するために、ＧＦＰ−ＨＤＨＢ又はＦＬＡＧ−ＨＤＨＢ ＤＮＡに対する発現プラスミドをＬＭＢの存在下及び非存在下に、非同調性のＧ１、及びＳ期細胞へ微量注入した。融合タンパク質の局在化は、蛍光顕微鏡によって調べて数量化した。ＬＭＢの存在下では、双方の融合タンパク質が細胞周期と無関係に核内に蓄積し（図５）、これはＣＲＭ１を通じて機能するｒｅｖ型ＮＥＳをＨＤＨＢが含む可能性と符合している。しかし、ＨＤＨＢはＣＲＭ１の直接的な積荷にならないかもしれず、またその移出はいくつかの他のタンパク質（単数又は複数）を通じて間接的に媒介されるかもしれないという可能性もある。ＨＤＨＢ内の推定ＮＥＳが機能性であるかを評価するために、我々はＮＥＳモチーフのＶａｌ／Ｌｅｕ及びＬｅｕ／Ｌｅｕをアラニンに変異誘発して、ＮＥＳ変異体１及び２（図５）を作出した。これらのＮＥＳ変異を内包するＧＦＰ−ＨＤＨＢ及びＧＦＰ−βＧａｌ−ＰＳＬＤを、非同調性又は同調性のいずれかのＵ２ＯＳ細胞で一過性に発現させた。双方のＮＥＳ変異型融合タンパク質は、非同調性又は同調性細胞でいつ発現されても、８０％を超える細胞で核に蓄積していた（図５）。この結果から、ＮＥＳの変異がＧＦＰ−ＨＤＨＢ及びＧＦＰ−βＧａｌ−ＰＳＬＤの双方の移出を特異的に損なったことが示され、ＨＤＨＢのＰＳＬＤ領域が機能性ＮＥＳを含むと論じられる。
【０１０８】
ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢはインビボで細胞周期依存的にリン酸化される
ＨＤＨＢのＰＳＬＤドメイン内の潜在的ＣＤＫリン酸化部位のクラスタ（図３）により、ＨＤＨＢのリン酸化が細胞周期におけるその細胞内局在化を調節するかもしれないことが示唆された。そうであれば、ＨＤＨＢのＰＳＬＤ領域は細胞周期依存的にリン酸化されることが予想されよう。ＨＤＨＢがＰＳＬＤ内のリン酸化を行うかをどうか試験するために、ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢの野生型及びＣ末端切欠型に対する発現プラスミドでＵ２ＯＳ細胞を一過性にトランスフェクトし、ホスフェートで放射標識化して、その後細胞抽出物からＦＬＡＧ−ＨＤＨＢを免疫沈降させた。免疫沈降させたタンパク質を変性ゲル電気泳動、イムノブロッティング、及びオートラジオグラフィーによって分析した（図６）。ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢの放射標識化バンドは、免疫反応性のＨＤＨＢバンドと同じ位置に検出された（図６Ａ、レーン１）。ＳＬＤを欠損した切欠ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢは、インビボでも確実にリン酸化されたが（レーン２）、一方ＰＳＬＤを欠損した切欠ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢ（１〜８７４）は、有意にリン酸化されなかった（レーン３）。これらの結果から、ＳＬＤはＨＤＨＢのリン酸化に必要でなく、ＰＳＬＤが必要であることが実証され、リン酸化部位はおそらくＰＳＬＤ内に存在することが示唆される。
【０１０９】
細胞周期におけるＨＤＨＢのリン酸化のタイミングを調べるには、放射標識を使用せずにリン酸化を検出するのが好都合であろう。リン酸化は変性ゲルでタンパク質の電気泳動度を低減することが多いので、一過性に発現されたＦＬＡＧ−ＨＤＨＢを免疫沈降させて、その移動度をλ−ホスファターゼ（λ−ＰＰａｓｅ）を用いた処理の前後に調べた（図６Ｂ）。λ−ＰＰａｓｅ処理をしない場合、ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢはウェスタンブロットで非常に近くに移動する２つのバンドに検出されたが（レーン１）、一方脱リン酸化したＦＬＡＧ−ＨＤＨＢは単一バンドとしてダブレットの高速の方のバンドの移動度にて移動していた（レーン２）。λ−ＰＰａｓｅインヒビターが反応中に存在する場合、ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢはモック処理タンパク質と同じダブレットとして移動していた（レーン３）。これらのデータは、ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢの電気泳動度がリン酸化によって低減すること、そしてこのアッセイは細胞周期におけるＨＤＨＢのリン酸化を追跡するのに好適でありうることを示唆するものである。
【０１１０】
ＨＤＨＢが細胞周期依存的にリン酸化されるのかを決定するために、ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢを一過性に発現しているＵ２ＯＳ細胞を、培地にチミジンを添加することによりＧ１／Ｓで、又は培地にノコダゾールを添加することによりＧ２／Ｍで停止させた。細胞を、異なる時間で遮断から復帰させて、細胞抽出物からＦＬＡＧ−ＨＤＨＢを免疫沈降させた。
【０１１１】
免疫沈降させたものをλ−Ｐｐａｓｅ添加又は無添加でインキュベートし、次いで変性ゲル電気泳動及びウェスタンブロッティングによって分析した（図６Ｃ）。Ｇ１／Ｓで停止させた細胞由来のＦＬＡＧ−ＨＤＨＢの移動度はλ−ＰＰａｓｅ処理によって増大しており、このタンパク質はＧ１／Ｓでリン酸化されたことが示唆された（図６Ｃ、上方パネル）。類似の移動度の変化が、Ｇ１／Ｓの遮断から復帰した後少なくとも９時間ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢのホスファターゼ処理をした後に（上方パネル）、またＧ２／Ｍで停止した細胞でも（図６Ｃ、下方パネル）検出された。しかし、４時間及び８時間で細胞をＧ１に復帰させた後は、ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢはホスファターゼ処理による影響が随分小さい単一バンドとして移動した（図６Ｃ、下方パネル）。Ｇ２／Ｍ遮断から復帰後１２時間までで、細胞のほとんどがＳ期に入っているときに（データは示さず）、ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢの移動度はやはりホスファターゼ処理によって増大し、ノコダゾールで停止した細胞で観察されたパターンに復元していた（下方パネル）。これらの結果は、ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢのリン酸化が細胞周期依存性であって、Ｇ１／ＳからＧ２／Ｍまででリン酸化が最大であり、Ｇ１の間はリン酸化が最小であることを強く示唆するものである。
【０１１２】
セリン９６７は、異所的に発現されるＨＤＨＢの主要リン酸化部位である
ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢにおけるリン酸化部位をマッピングするために、先ず、修飾されたアミノ酸残基が何であるかを決定したいと考えた。インビボで放射標識化したＦＬＡＧ−ＨＤＨＢのホスホアミノ酸分析により、インビボではＦＬＡＧ−ＨＤＨＢの主要なホスホアミノ酸がホスホセリン（単数又は複数）であることが明らかになった（図７Ａ）。ＨＤＨＢの細胞周期依存的性リン酸化部位がＰＳＬＤ中、残基８７４と１０３９の間に位置しており（図３Ａ）、これらの部位はＣＤＫによって修飾され、ホスホセリンが主要な修飾アミノ酸である（図７Ａ）と想定すると、７つの潜在的ＣＤＫ部位のうち４つだけが、候補部位として残ることになるであろう。これらの部位の各々を個々に試験するために、対応するセリンのアラニンへの変異を施したＦＬＡＧ−ＨＤＨＢ発現プラスミドを構築した。これらのプラスミドを一過性にトランスフェクトした細胞を、オルトホスフェートでインビボに放射標識化して、ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢを免疫沈降させ、オートラジオグラフィー及びウェスタンブロッティングによって分析した（図７Ｂ）。この結果、ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢ及び変異型タンパク質の３つがほぼ同等にリン酸化されており、一方Ｓ９６７Ａ変異タンパク質は弱くリン酸化されているだけであることが示された（図７Ｂ）。この結果は、Ｓ９６７がインビボでのＨＤＨＢリン酸化の主要な部位であるかもしれないことを示唆していた。この解釈と符合して、免疫沈降させたＦＬＡＧ−ＨＤＨＢのホスファターゼ処理後の電気泳動度の変化が、変異型タンパク質の３つで検出されたが、Ｓ９６７Ａタンパク質では検出されなかった。
【０１１３】
Ｓ９６７がインビボでの主要なＨＤＨＢ内リン酸化部位であることを確認するために、トリプシンで生じたホスホペプチドのマッピングを、オルトホスフェートを用いて代謝的に放射標識化しておいた、野生型及びＳ９６７Ａ変異型ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢで実施した（図７Ｃ）。１つの優勢な放射標識化ペプチドと、弱く標識化されたペプチドが、野生型タンパク質（左側パネル）で観察された。優勢なホスホペプチドはＳ９６７Ａタンパク質に存在していなかったが、弱く標識化されたペプチドは検出可能なままであった（図７Ｃ、右側パネル）。この結果は、セリン９６７がインビボで優勢なＨＤＨＢ内リン酸化部位インビボであることのさらなる証拠をもたらすものである。
【０１１４】
Ｇ１／ＳにおいてＨＤＨＢを潜在的に修飾するキナーゼとしてのサイクリンＥ／ＣＤＫ２の同定
細胞周期におけるＨＤＨＢのリン酸化のタイミングと、修飾の主要部位としてのＳ９６７の同定により示唆されるように、ＣＤＫが実際にＨＤＨＢを修飾することができるのかを試験するために、精製サイクリンＥ／ＣＤＫ２又はサイクリンＡ／ＣＤＫ２を、精製組換えＨＤＨＢ及び放射標識化したＡＴＰとインビトロでインキュベートした。キナーゼ反応の後、タンパク質を変性ゲル電気泳動によって分離し、ＰＶＤＦ膜に転写して、オートラジオグラフィーにより検出した。この結果、組換えＨＤＨＢはサイクリンＥ／ＣＤＫ２及びサイクリンＡ／ＣＤＫ２の双方によって強くリン酸化されうることが明らかになった。放射標識化ＨＤＨＢのバンドは、その後さらに、トリプシンで生じるホスホペプチドのマッピングのために処理した。各消化物由来のペプチドを、個々に、又はインビボでリン酸化したＦＬＡＧ−ＨＤＨＢ由来の、トリプシンで生じたペプチドと混合した後に、のいずれかで二次元にて分離して、オートラジオグラフィーにより可視化した（図８Ａ）。サイクリンＥ／ＣＤＫ２及びサイクリンＡ／ＣＤＫ２によってリン酸化されたＨＤＨＢペプチドでは、インビボで標識化したペプチドのマップで観察されるもの（１つの主要スポットと１つの微弱スポット）と本質的に同じパターンが得られた（図８Ａ）。インビトロ及びインビボで標識化されたペプチドを混合して、１つのクロマトグラムで分離した場合、それらは共遊走した（図８Ａ、右側）。これらのデータから、精製組換えＨＤＨＢにおいてインビトロでサイクリンＥ／ＣＤＫ２及びサイクリンＡ／ＣＤＫ２により修飾された主要なホスホペプチドは、ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢにおいてインビボで修飾された場合と同じものであったと論じることができる。
【０１１５】
ヒト細胞におけるサイクリンＥ活性はＧ１後期に上昇し、一方サイクリンＡ活性はＳ期の開始に一致して、もっと後から上昇する（Ｐｉｎｅｓ、１９９９；Ｅｒｌａｎｄｓｓｏｎら、２０００）ので、これらのキナーゼのうち１つが優先的にＨＤＨＢを修飾するのかもしれないのか、識別してみることが重要であった。サイクリンサブユニットは、リン酸化の標的とする基質タンパク質と複合体を形成することが多い（Ｅｎｄｉｃｏｔｔら、１９９９；Ｔａｋｅｄａら、２００１）。サイクリンＥ又はサイクリンＡがＤＨＢと会合しうるかを試験するために、ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢ発現ベクター又はコントロールとしての空のＦＬＡＧベクターのいずれかをトランスフェクトした細胞の抽出物から、ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢ及び会合タンパク質を免疫沈降させた。細胞抽出物と、免疫沈降させたものを、ウェスタンブロッティングによって分析した（図８Ｂ）。サイクリンＥは明らかにＦＬＡＧ−ＨＤＨＢと共沈降したが、サイクリンＡは共沈降せず（図８Ｂ、レーン２及び５）、ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢがインビボでサイクリンＥと優先的に相互作用しうることを示唆していた。この相互作用はインビボでのサイクリンＥ／ＣＤＫ２によるＨＤＨＢのリン酸化に必要とされるのかもしれないと考えられ、そうであるならば、サイクリンＥとのその相互作用を妨げるようなＨＤＨＢにおける変異は、サイクリンＥ／ＣＤＫ２によるリン酸化を抑止するはずである。サイクリンＥに結合できないことに起因して、ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢ変異型Ｓ９６７Ａがインビボでリン酸化されなかった（図７Ｂ、Ｃ）可能性を試験するために、ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢ−Ｓ９６７Ａ及び会合タンパク質を、トランスフェクトした細胞の抽出物から免疫沈降させて、ウェスタンブロッティングによって分析した。変異タンパク質とのサイクリンＥの共沈降は、野生型ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢの場合と同程度に強かった。
【０１１６】
セリン９６７のリン酸化はＨＤＨＢ局在化の調節にとって重要である。
【０１１７】
上記のデータは、異所的に発現されたＨＤＨＢの細胞内局在化及びリン酸化が細胞周期依存的に調節され、Ｇ１／ＳからＧ２／Ｍまででリン酸化が最高であったことを示しており、これはＨＤＨＢが細胞質に蓄積していた期間と符合している。これらの結果は、インビボでの主要なＨＤＨＢ内リン酸化部位としてのＳ９６７の同定と合わせて、Ｓ９６７のリン酸化がＨＤＨＢの細胞内局在化を調節しうることを示唆するものである。この着想を試験するために、野生型ＧＦＰ−ＨＤＨＢ、並びに変異体Ｓ９６７Ａ、Ｓ９８４Ａ、Ｓ１００５Ａ、及びＳ１０２１Ａに対する発現プラスミドを、同調性Ｕ２ＯＳ細胞へ微量注入した。予想通り、野生型ＧＦＰ−ＨＤＨＢは、Ｇ１で細胞の核点状構造内に蓄積したが、Ｓ期には細胞の細胞質に蓄積した。しかし、細胞周期のタイミングに関係なく、ＧＦＰ−ＨＤＨＢ−Ｓ９６７Ａは蛍光細胞の約７０％で核点状構造に局在化していた（図９）。その他の３種の置換変異体は、野生型ＧＦＰ−ＨＤＨＢのように核又は細胞質のいずれかに局在化していた。Ｓ９６７のリン酸化を模倣しようとして、セリン９６７をアスパラギン酸に変異させ、ＧＦＰ−ＨＤＨＢ−Ｓ９６７Ｄを非同調性及び同調性Ｕ２ＯＳ細胞で発現させて、変異型融合タンパク質の細胞内分布を調べた。
【０１１８】
ＧＦＰ−ＨＤＨＢ−Ｓ９６７Ｄを発現している細胞の約６０％が、非同調性、Ｇ１期、及びＳ期細胞において細胞質に蛍光を示し（図９Ａ）、Ｓ９６７Ｄ突然変異は、リン酸化されたＳ９６７を模倣したことが立証された。このデータは、セリン９６７のリン酸化がＨＤＨＢの細胞内局在化を調節するのに重要であることを強く示唆している。
【０１１９】
ＨＤＨＢのＣ末端ドメインは細胞周期依存性の局在化に関与する
１３１残基のドメイン、ＰＳＬＤは、ＨＤＨＢ、ＥＧＦＰ又はβＧａｌレポーターを、核又は細胞質のいずれかに細胞周期依存的に標的化するのに足るものである（図４及び１０）。ｒｅｖ型ＮＥＳがこのドメイン内に存在している（図５）が、Ｇ１／Ｓ移行において、核外移出の機構に対するその活性又は接触性はＰＳＬＤ（主にセリン９６７）のリン酸化に依存している（図６〜９）。Ｓ９６７は、コンセンサスＣＤＫ基質認識モチーフ（Ｓ／Ｔ）ＰＸ（Ｋ／Ｒ）と完全に一致する。サイクリンＥ／ＣＤＫ２及びサイクリンＡ／ＣＤＫ２の双方は、インビトロでＨＤＨＢを修飾することができるが、細胞抽出物中のＨＤＨＢとのサイクリンＥ／ＣＤＫ２の複合能から、それがＧ１／Ｓ移行にてＨＤＨＢを修飾する初期のキナーゼであるかもしれないことが示唆される（図８）。既知のＣｄｋ２インヒビターであるオロモウシン及びロスコビチン（表１）、又はサイクリンＥに対するｓｉＲＮＡ（表２）の添加の結果、ＥＧＦＰ−ＰＳＬＤの主に核への分布と、安定なＥＧＦＰ−ＰＳＬＤ細胞系に対してＧ１の停止が引き起こされ、観察された細胞周期に基づくリン酸化依存性の細胞内局在化の制御に、Ｃｄｋ２／サイクリンＥが関与する可能性がさらに支持された。ＰＳＬＤのリン酸化は、細胞周期の終盤に及ぶまで持続するようであり、これはＳ及びＧ２での主に細胞質へのＨＤＨＢの局在化に良く呼応していた。２４時間にわたってオロモウシンで処理した安定細胞系の動的な画像化によって、Ｇ２で停止した細胞については、ＥＧＦＰ−ＰＳＬＤシグナルが４時間を超え８時間にわたって細胞質から核に再分布する（細胞が有糸分裂を経ることなく）ことが示され、ｃｄｋ２活性がなければＥＧＦＰ−ＰＳＬＤは脱リン酸化されて核に再び入るか、又は破壊されて新しく合成されたタンパク質がｃｄｋ２阻害のためにリン酸化されず、従って核に局在するか、のどちらかであることを示唆していた。
【０１２０】
【表１】
【０１２１】
【表２】
ＨＤＨＢがＭ／Ｇ１移行で脱リン酸化を行うのか（図６Ｃ）、又はおそらくはタンパク質分解の標的にされてＧ１初期に迅速に再合成され、この際に核に入るのか、どちらかを識別するのは可能でなかった。しかし、２４時間にわたる安定細胞系の動的画像化によって、ＥＧＦＰ−ＰＳＬＤシグナルはＭ期の間又はＭ／Ｇ１境界で大幅に低減しないものの、細胞質分裂後およそ３０分間で主に核のシグナルになる（この状態はその後Ｇ１の間３時間まで持続する）ことが示され、これは核膜形成に符合していた。このことは、ＥＧＦＰ−ＰＳＬＤ構築物がＭ／Ｇ１境界近辺で著しい破壊を起こすのでなく脱リン酸化されることを示唆している。
【０１２２】
これらのデータにより、ＰＳＬＤがタンパク質の関係性から独立した活性なターゲティングシグナルを含むこと（図２〜５、１０）の強力な証拠がもたらされる。不活性化されたＮＥＳを備えた変異型ＨＤＨＢは、Ｓ期の間にそれが発現され、従っておそらくはリン酸化されたとしても核内にある（図５）ので、ＮＬＳはリン酸化によって不活性化されず、ＣＤＫの調節の第一の標的はＮＥＳであろうと思われる。この推論を広げていくと、ＰＳＬＤ内のＣＤＫモチーフが修飾されていない場合にＮＥＳはＧ１の間マスクされているかもしれず、またＳ９６７がリン酸化されるとＮＥＳが遊離されて、核外移出因子によるＮＥＳ認識へと導かれることになる（図３〜５）。ｒｅｖ型ＮＥＳの構造研究で、それが両親媒性のα−ヘリックスを形成している、すなわちヘリックスの片側にロイシンが並び、もう一方の側に荷電残基が並んでいることが示されている（Ｒｉｔｔｉｎｇｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９９）、４、１５３−１６６）。ＨＤＨＢのＳＬＤはｒｅｖ型ＮＥＳ及びＮＬＳの双方を含んでおり、ＮＬＳとしての機能を果たすらしき塩基性残基がＮＥＳ全体に散在しているので、ＮＥＳとＮＬＳは、両親媒性のヘリックスの対向面に存在しているのかもしれない。ＰＳＬＤ内のさらなる配列は、ＮＥＳを分子内でマスクしているはずであり、ＮＬＳのみが認識できるようになっている。Ｓ９６７のリン酸化により、ＰＳＬＤでのマスクの高次構造が変化することになって、ＮＬＳの曝露に影響を及ぼすことなくＮＥＳが曝露される。
【０１２３】
ＥＧＦＰ−ＰＳＬＤ安定細胞系を用いた細胞周期のインヒビターに対するハイスループットスクリーニング
上述の通り、一過性にトランスフェクトした細胞での作業は、トランスフェクション効率の低さ、発現の不均一性、及びこのようなデータのハイスループット分析により生じる問題のために、マルチウェルプレート形式では困難であることがわかった。従って、細胞周期に対する数多くのｓｉＲＮＡ又は薬剤の効果をスクリーニングするには、均一な安定細胞系の生産が必要であった。適応性のある７つのアミノ酸リンカーを介して（ｐＣＯＲＯＮ１００２−ＥＧＦＰ−Ｃ１−ＰＳＬＤを使用）レポーター（ＥＧＦＰ）に連結したＰＳＬＤ領域で、安定細胞系を作った。図１３からわかるように、ｐＣＯＲＯＮ１００２−ＥＧＦＰ−Ｃ１−βＧａｌ−ＰＳＬＤを用いて発生させた安定細胞系が発生する蛍光シグナルは、適応性のある７つのアミノ酸リンカーを有する細胞系により生成されるものよりもかなり小さかった（およそ１０倍）。これはおそらく、細胞の転写及び翻訳機構に対して多大な要求を課している、βＧａｌタンパク質のサイズに起因しているようである。
【０１２４】
ｐＣＯＲＯＮ１００２−ＥＧＦＰ−Ｃ１−ＰＳＬＤを用いて発生させた安定細胞系（図１３参照）は、事実上均質であって（平均総細胞ＲＦＵ：４３５、ＳＤ：５８；ｎ＝２７１；図１０参照）、細胞周期を研究するため、及びマルチウェルプレート形式で細胞周期に対する薬剤の効果を迅速にスクリーニングするための、好感度で、安定で均一なアッセイを提供した（表１及び２；及び図１０）。
【０１２５】
以上に開示した本発明のいくつかの特徴は、モレキュラー・バイオロジー・オブ・ザ・セル（１５：３３２０−３３３２、２００４年７月）に発表され、またＭＢＣ（近刊）１０．１０９１／ｍｂｃ．Ｅ０４−０３−０２２７として２００４年５月１４日に「ＤＮＡ損傷点状構造に局在するヒトＤＮＡヘリカーゼの細胞周期依存的な調節（“Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｈｕｍａｎ ＤＮＡ Ｈｅｌｉｃａｓｅ Ｔｈａｔ Ｌｏｃａｌｉｚｅｓ ｉｎ ＤＮＡ Ｄａｍａｇｅ Ｆｏｃｉ”）」の表題で電子出版されており、その開示内容の全体を、引用することによって本明細書に援用する。
【０１２６】
以上に記載したのは本発明の例示であり、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。本発明の例証的ないくつかの実施形態を記載しているが、当業者であれば、本発明の新規教示及び利点を実質的に逸脱することなく、これら例証的な実施形態に多くの変更を施すことが可能であると容易に理解するであろう。よって、このような変更のすべてが、特許請求の範囲で定義した本発明の範囲に含まれることを意図する。従って、以上に記載したのは本発明の例示であり、開示された具体的な実施形態に限定されるものと解釈されるべきでなく、また開示された実施形態への変更や、その他の実施形態が、添付の特許請求の範囲の範囲に含まれるように意図されることは、理解されるべきである。本発明は、以下の特許請求の範囲によって定義され、特許請求の範囲の均等物もその中に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】核又は細胞質におけるＨＤＨＢの局在を示す図。
【図２】ＧＦＰ−ＨＤＨＢの細胞内局在化は、細胞周期依存性であることを示す図。
【図３】ＨＤＨＢの核局在化に必要なドメインの同定を示す図。
【図４】ＧＦＰ−βＧａｌ−ＰＳＬＤ細胞内局在化パターンは、細胞周期で変動することを示す図。
【図５】ＨＤＨＢのＳＬＤにおける機能性ｒｅｖ型核外移出シグナル（ＮＥＳ）の同定を示す図。
【図６】インビボでのＦＬＡＧ−ＨＤＨＢの細胞周期依存的なリン酸化を示す図。
【図７】ＨＤＨＢ内インビボ主要リン酸化部位としてのＳ９６７の同定を示す図。
【図８】ＨＤＨＢ Ｓ９６７の潜在的Ｇ１／ＳキナーゼとしてのサイクリンＥ／ＣＤＫ２の同定を示す図。
【図９】ＨＤＨＢの細胞内局在化は、Ｓ９６７のリン酸化によって調節されることを示す図。
【図１０】ｐＣＯＲＯＮ１００２−ＥＧＦＰ−Ｃ１−ＰＳＬＤベクターの安定な発現を呈する非同調性Ｕ２ＯＳ細胞でのＥＧＦＰ−ＰＳＬＤの局在化は細胞周期依存性であることを示す図。
【図１１】ｐＣＯＲＯＮ１００２−ＥＧＦＰ−Ｃ１−ＰＳＬＤのベクターマップを示す図。
【図１２】ｐＣＯＲＯＮ１００２−ＥＧＦＰ−Ｃ１−βＧａｌ−ＰＳＬＤのベクターマップを示す図。
【図１３】ｐＣＯＲＯＮ１００２−ＥＧＦＰ−Ｃ１−ＰＳＬＤ、ｐＣＯＲＯＮ１００２−ＥＧＦＰ−Ｃ１−βＧａｌ−ＰＳＬＤを用いて発生させた代表的な安定細胞系、並びに親のＵ２ＯＳ細胞系に対するシグナルの輝度及び均一性を比較したフローサイトメトリーのデータを示す図。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞周期に特異的なマーカー、及び哺乳類細胞における細胞周期の異なる期間の移行を決定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
真核細胞分裂は、Ｇ１、Ｓ、Ｇ２及びＭと呼ばれる連続期を含む、高度に調節された細胞周期に沿って進行する。細胞周期又は細胞周期制御の破壊の結果、増殖制限細胞を、増殖の正常な制御に対して非応答性である高浸潤性細胞へと形質転換する複数の遺伝的変化から生じる、癌のような病態又は細胞異常が引き起こされうる。正常細胞の癌細胞への移行は、ＤＮＡ複製及びＤＮＡ修復機構における正しい機能の喪失によって惹起されうる。分裂中の細胞はすべて、細胞周期チェックポイントとして知られる多くの制御機構の支配下にあり、これらが異常細胞を停止させるか又は破壊を誘発することによって遺伝的な完全性を維持する。細胞周期の進行及び制御の研究は、結果的に抗癌剤の設計に非常に重要なものである（Ｆｌａｔｔ ＰＭ ａｎｄ Ｐｉｅｔｅｎｐｏｌ ＪＡ ２０００ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｒｅｖ ３２（３−４）：２８３−３０５； Ｂｕｏｌａｍｗｉｎｉ ＪＫ ２０００ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｅｓｉｇｎ ６， ３７９−３９２）。
【０００３】
細胞周期の進行は、細胞周期の間に高度に動的な挙動を呈する多くの細胞周期調節因子の、確定的な一時的で空間的な発現、局在、及び破壊によって厳密に調節されている（Ｐｉｎｅｓ， Ｊ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， （１９９９）， １， Ｅ７３−Ｅ７９）。例えば、特定の細胞周期段階で、タンパク質のあるものは核から細胞質に、又はその逆に転位置し、またあるものは急速に分解する。既知の細胞周期制御成分及び相互作用の詳細については、Ｋｏｈｎ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ （１９９９）， １０， ２７０３−２７３４を参照されたい。
【０００４】
細胞周期の状態の正確な決定は、細胞周期に影響するか又は細胞周期位置に依存する細胞プロセスを研究するための重要な要件である。このような測定は、以下のような薬物スクリーニング用途で特に重要である。
ｉ）例えば、潜在性のある抗癌治療薬としての研究のために、直接若しくは間接的に細胞周期の進行を修飾する物質が望まれる場合；
ｉｉ）薬物候補が、細胞周期の進行に対する望ましくない効果についてチェックされるべき場合；及び／又は
ｉｉｉ）ある薬剤が、細胞周期の特定の期にある細胞に対して活性か若しくは不活性であると推測される場合。
【０００５】
従来、細胞集団に対する細胞周期の状態は、細胞核のＤＮＡ含量を染色する蛍光染料を用い、フローサイトメトリーによって決定されている（Ｂａｒｌｏｇｉｅ Ｂ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９８３ ４３（９）：３９８２−９７）。フローサイトメトリーは、細胞のＤＮＡ含量に対する定量的な情報をもたらし、従って細胞周期のＧ１、Ｓ及びＧ２＋Ｍ期にある細胞の相対数の決定が可能になる。しかし、本分析は、破壊的な非動的プロセスであり、経時的に細胞周期の状態を決定するには集団を連続的にサンプリングする必要がある。フローサイトメトリー技術のさらなる不都合は、ＤＮＡ含有量に基づく、細胞の細胞周期位置の間接的及び推定的な割り当てに関するものである。細胞核のＤＮＡ含有量は、妥当に予測可能な様式にて細胞周期を通じて変動する（すなわち、Ｇ２又はＭの細胞はＧ１の細胞のＤＮＡ含有量の２倍であり、またＳ期にＤＮＡ合成を行っている細胞はその中間のＤＮＡ量を有する）ので、細胞周期の異なる期間で細胞の相対的な分布をモニターすることが可能である。しかし、Ｇ２又はＭ期に細胞を割り当てる際の曖昧さや、細胞周期の隣接期間の境界に近い細胞同士を正確に識別することを妨げる可能性がある集団内での細胞ごとのＤＮＡ含有量の固有な変動から生じるさらなる不正確さのために、この技術で個々のいずれの細胞の細胞周期位置でも決定するような精度は得られない。さらに、異なる組織又は生物体由来の異なる細胞型の間でのＤＮＡ含有量及びＤＮＡ染色の変動のために、この技術が各細胞型に対して至適化される必要があり、細胞型間又は実験間のデータを直接比較することが困難になりうる（Ｈｅｒｍａｎ， Ｃａｎｃｅｒ （１９９２）， ６９（６）， １５５３−１５５６）。フローサイトメトリーは従って、一集団内の細胞の全体的な細胞周期分布を調べるのには好適であるが、経時的に個々の細胞の正確な細胞周期の状態をモニターするのに使用することはできない。
【０００６】
欧州特許出願公開第７９８３８６号には、異種細胞試料中に存在する細胞亜集団の細胞周期を分析するための方法が記載されている。この方法では、蛍光標識したモノクローナル抗体と試料との逐次インキュベーションを用い、特異的な細胞型、及び核酸に特異的に結合する蛍光色素を同定する。これにより、試料中に存在する細胞の亜集団の細胞周期分布の決定が可能となる。しかし、この方法はフローサイトメトリーを利用するので非動的データしか得られず、細胞周期の進行に対する効果についての検討対象の薬剤に曝した後に経時的に細胞集団の細胞周期の状態の変化を決定するため、細胞の別々の試料に対して連続的に測定を行う必要がある。
【０００７】
多くの研究者が、細胞の固定または溶解を必要とする旧来のレポーター酵素を使用して、細胞周期を研究している。例えば、Ｈａｕｓｅｒ及びＢａｕｅｒ（Ｐｌａｎｔ ａｎｄ Ｓｏｉｌ， （２０００）， ２２６， １−１０） は、植物成長点における細胞分裂を調研究するのにβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）を用い、そしてＢｒａｎｄｅｉｓ及びＨｕｎｔ（ＥＭＢＯ Ｊ．， （１９９６）， １５， ５２８０−５２８９）は、サイクリンレベルの変動を研究するのにクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）融合タンパク質を使用した。米国特許第６０４８６９３号には、細胞周期調節タンパク質に影響を及ぼす化合物をスクリーニングするための方法が記載されており、この方法では、レポーター遺伝子の発現が、サイクリン又はその他の細胞周期制御タンパク質による作用を受ける制御エレメントに結び付けられる。この方法において、レポーター遺伝子産物の一時的な発現が細胞周期特異的に駆動され、１以上の細胞周期制御成分に作用する化合物が発現レベルを増減しうる。
【０００８】
米国特許第６１５９６９１号は、細胞周期に特異的な転写因子ＤＰ−３及びＥ２Ｆ−１に由来する核局在化シグナル（ＮＬＳ）を記載しており、細胞周期の進行の推定調節因子について分析するための方法を請求している。この方法において、細胞周期に特異的な転写因子ＤＰ−３及びＥ２Ｆ−１に由来する核局在化シグナル（ＮＬＳ）は、検出可能なマーカーに融合したＤＰ−３及びＥ２Ｆ−１由来の特異的なＮＬＳ配列の核局在化の増減に作用する化合物の活性を分析するのに使用されうる。
【０００９】
Ｊｏｎｅｓ他 （Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ．， （２００４）， ２３， ３０６−３１２） は、血漿膜標的化シグナル及びＥＹＦＰに融合したＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳに基づく、有糸分裂の蛍光バイオセンサーを記載している。細胞周期の全体にわたり、レポーターは核内に存在しているが、有糸分裂の際、核エンベロープの崩壊と再構成との間には、血漿膜へ転位置する。
【００１０】
国際公開第０３／０３１６１２号には、細胞周期に特異的な発現制御エレメント及び破壊制御エレメントによる哺乳類生細胞の細胞周期位置を決定するためのＤＮＡレポーター構築物、及び方法が記載されている。
【００１１】
Ｇｕ他（Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｃｅｌｌ．， （２００４）， １５， ３３２０−３３３２）は最近、ヒトＤＮＡヘリカーゼＢ（ＨＤＨＢ）の機能を精査して、Ｇ１期には主に核に、そしてＳ及びＧ２期には細胞質にあること、それがＤＮＡ損傷によって誘発される核点状構造（ｎｕｃｌｅａｒ ｆｏｃｉ）内に存在していること、点状構造パターンがＨＤＨＢ活性を要求すること、及びＨＤＨＢの局在化はＣＤＫリン酸化によって調節されていることを示している。
【００１２】
以上の方法のいずれも、ゲノムに安定的に一体化されえ、細胞周期のＧ１、Ｓ及びＧ２の期を示すのに使用されうるセンサを具体的に記載するものではない。従って、細胞周期のこれらの期を単一の哺乳類生細胞において非破壊的に決定し、同じ細胞を経時的に繰り返して調べることを可能とし、また細胞周期に対して望ましいか又は望ましくない効果を潜在的に有する薬剤の効果を研究することを可能とする方法が必要とされている。また、複数の薬剤に対するこれらの効果を平行に評価することができるようになる方法も必要とされている。
【特許文献１】欧州特許出願公開第７９８３８６号明細書
【特許文献２】米国特許第６０４８６９３号明細書
【特許文献３】米国特許第６１５９６９１号明細書
【特許文献４】国際公開第０３／０３１６１２号パンフレット
【非特許文献１】Ｆｌａｔｔ ＰＭ ａｎｄ Ｐｉｅｔｅｎｐｏｌ ＪＡ ２０００ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｒｅｖ ３２（３−４）：２８３−３０５
【非特許文献２】Ｂｕｏｌａｍｗｉｎｉ ＪＫ ２０００ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｅｓｉｇｎ ６， ３７９−３９２
【非特許文献３】Ｐｉｎｅｓ， Ｊ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， （１９９９）， １， Ｅ７３−Ｅ７９
【非特許文献４】Ｋｏｈｎ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ （１９９９）， １０， ２７０３−２７３４
【非特許文献５】Ｂａｒｌｏｇｉｅ Ｂ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９８３ ４３（９）：３９８２−９７
【非特許文献６】Ｈｅｒｍａｎ， Ｃａｎｃｅｒ （１９９２）， ６９（６）， １５５３−１５５６
【非特許文献７】Ｈａｕｓｅｒ ａｎｄ Ｂａｕｅｒ， Ｐｌａｎｔ ａｎｄ Ｓｏｉｌ， （２０００）， ２２６， １−１０
【非特許文献８】Ｂｒａｎｄｅｉｓ ａｎｄ Ｈｕｎｔ， ＥＭＢＯ Ｊ．， （１９９６）， １５， ５２８０−５２８９
【非特許文献９】Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ．， （２００４）， ２３， ３０６−３１２
【非特許文献１０】Ｇｕ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｃｅｌｌ．， （２００４）， １５， ３３２０−３３３２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明に記載するのは、動的な読み取りをもたらす非破壊的なプロセスで、個々の生細胞について細胞周期の状態を決定する新規の手段を提供する、規定の組み合わせにおける細胞周期調節機構の主要な成分を利用する方法である。
【００１４】
本発明はさらに、タンパク質、ＤＮＡ構築物、ベクター、及びかかるタンパク質を安定に発現する細胞であって、Ｇ１／Ｓ細胞周期依存性の位置制御配列へのレポーターシグナルの直接的な結合により、細胞周期に特異的に検出可能なレポーター分子の転位置を呈するものを提供する。これによって、細胞周期状態の決定の精度が大幅に改善され、個々の細胞における細胞周期の進行を継続的にモニターすることが可能になる。さらに、細胞周期制御機構の機能性エレメントから主要な制御エレメントを単離及び抽出でき、動的に調節され、しかも内在性細胞周期制御成分と連携するものの独立して作用する細胞周期レポーターの設計が許容されることが見出されており、これにより、細胞周期の自然な進行に影響したり妨害したりすることなく細胞周期位置をモニターするための手段が提供される。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の第一の特徴によれば、１１２０００ダルトン未満の分子量を有する基を介して、１以上の細胞周期依存性の位置制御エレメントと連結した検出可能な生細胞レポーター分子を含むポリペプチド構築物であって、前記エレメントの位置はＧ１及びＳ期に変化し、哺乳類細胞内での前記構築物の転位置が細胞周期位置を示すものであるポリペプチド構築物が提供される。
【００１６】
転位置とは、細胞内のある位置から別の位置への、典型的には核から細胞質への、又はその逆の、レポーターの検出可能な移動と定義されることは理解されよう。さらに、「生細胞」の用語で、レポーター分子に関連して、生細胞において検出可能なシグナルを生じるレポーター分子、又は抗原性タグなどの、生細胞で発現され、免疫学的方法にて固定した後に検出されえ、このためＩＮセルアナライザ（ＧＥヘルスケア）のような画像化システムでの使用に好適であるレポーターを定義することが理解されよう。
【００１７】
好適には、上記基は１０００００ダルトン未満の分子量を有する。
【００１８】
好適には、この基は５００００ダルトン未満の分子量を有する。
【００１９】
好適には、この基は２５０００ダルトン未満の分子量を有する。
【００２０】
好適には、この基は１００００ダルトン未満の分子量を有する。
【００２１】
好適には、この基は１０００ダルトン未満の分子量を有する。
【００２２】
好適には、この基は７００ダルトン未満の分子量を有する。
【００２３】
好適には、この基は５００ダルトン未満の分子量を有する。
【００２４】
好ましくは、この基はポリペプチドである。かかるポリペプチド基は比較的小さいものであるとよく、柔軟性及び／又は細胞周期依存性の位置制御エレメントに対するレポーター分子の回転を許容するアミノ酸を含んでいるとよい。さらに好ましくは、ポリペプチド基はヘプタペプチドである。最も好ましくは、前記ヘプタペプチド基は、グリシン−アスパラギン−グリシン−グリシン−アスパラギン−アラニン−セリン（ＧＮＧＧＮＡＳ）である。上述の通り、柔軟性及び／又は位置制御エレメントに対するレポーター分子の回転を許容するものであればいかなるアミノ酸でも、ポリペプチドで使用してよい。
【００２５】
好適には、細胞周期特異的な依存性位置制御エレメントは、Ｒａｇ２、Ｃｈａｆ１Ｂ、Ｆｅｎ１、ＰＰＰ１Ｒ２、ヘリカーゼＢ、ｓｇｋ、ＣＤＣ６、又はヘリカーゼＢのＣ末端の特殊な制御領域のリン酸化依存性細胞内局在化ドメイン（ＰＳＬＤ）などといった、それらの中のモチーフからなるペプチドの群から選択される。ヘリカーゼＢは、非制御のＤＮＡライセンシングを引き起こすことが知られており、過剰に発現された場合には細胞の生存に有害になることがある。従って、細胞周期依存性の位置制御エレメントは、好ましくはヘリカーゼＢのＣ末端特殊制御領域のリン酸化依存性細胞内局在化ドメイン（ＰＳＬＤ）である。
【００２６】
ヒトヘリカーゼＢ相同体が報告されて、特徴付けがなされており（Ｔａｎｅｊａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、（２００２）、２７７、４０８５３−４０８６１）、核酸配列（ＮＭ ０３３６４７）、並びに対応するタンパク質配列はそれぞれ配列番号：１及び配列番号：２に示されている。この報告では、Ｇ１／Ｓ移行を促進するにはＧ１の間にヘリカーゼ活性が必要であることが示されている。Ｇｕら（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．、（２００４）、１５、３３２０−３３３２）は、リン酸化依存性細胞内局在化ドメイン（ＰＳＬＤ）と命名されたヘリカーゼＢ遺伝子の小さなＣ末端領域が、Ｃｄｋ２／サイクリンＥによってリン酸化され、ＮＬＳ及びＮＥＳ配列を含むことを示している。Ｇｕら（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．、（２００４）、１５、３３２０−３３３２）は、ＣＭＶプロモーターから発現されるＥＧＦＰ−βＧａｌ−ＰＳＬＤ融合体（融合タンパク質全体のサイズが完全体のヘリカーゼＢと同様になるよう、ベータ−ガラクトシダーゼ（βＧａｌ）が不活性基として構築物に含められたもの）をコードするプラスミドで一過性にトランスフェクトされた細胞の研究を行った。Ｇ１の細胞は、主に核でＥＧＦＰシグナルを呈したが、細胞周期の他の期の細胞は、主に細胞質のＥＧＦＰシグナルを呈した。これらの研究者らは、ＰＳＬＤが細胞周期のＧ１／Ｓ期移行のあたりで、核から細胞質へとレポーターの転位置を指向すると結論付けた。
【００２７】
好適には、生細胞レポーター分子は、蛍光タンパク質、酵素及び抗原性タグからなる群から選択される。好ましくは、蛍光タンパク質はＡｅｑｕｏｒｉａ Ｖｉｃｔｏｒｉａ、Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、又はＨｙｄｒｏｚｏａ及びＡｎｔｈｏｚｏａ類に属するその他のものに由来する（Ｌａｂａｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、（２００２）、９９、４２５６−４２６１）。さらに好ましくは、蛍光タンパク質はＥＧＦＰ（ＢＤクロンテック）、Ｅｍｅｒａｌｄ（Ｔｓｉｅｎ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、（１９９８）、６７、５０９−５４４）又はＪ−Ｒｅｄ（Ｅｖｒｏｇｅｎ）である。最も好ましくは、蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、増強型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、Ｅｍｅｒａｌｄ及びＪ−Ｒｅｄからなる群から選択される。
【００２８】
好適には、レポーターはハロ−タグ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）のような酵素レポーターである。
【００２９】
好適には、レポーター分子はＥＧＦＰ又はＪ−Ｒｅｄであり、また細胞周期依存性の位置制御エレメントはＰＳＬＤである。
【００３０】
好適には、レポーター分子はタンデム化されている（すなわち、タンデムリピートとして存在している）。
【００３１】
配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチド構築物。
【００３２】
本発明の第二の特徴によれば、上述のポリペプチド構築物のいずれかをコードする核酸構築物が提供される。
【００３３】
好適には、前記核酸構築物はさらに、１以上の細胞周期非依存性の発現制御エレメントを含み、それに作動可能に連結され、その制御下にある。
【００３４】
「作動可能に連結される」の用語は、エレメントが意図された目的のために連携して機能するように、例えば、転写がプラスミドで開始して、本発明のレポーター分子をコードするＤＮＡ配列を進行するように、それらが位置されることを示している。
【００３５】
好適には、発現制御エレメントは、細胞周期の間中、転写のレベルの変動を限定しつつ、長期間にわたって転写を制御する。好ましくは、発現制御エレメントは、安定細胞系の生産のために必要な長期間にわたって転写をもたらす、ユビキチンＣ又はＣＭＶ Ｉ／Ｅプロモーターである。
【００３６】
好ましくは、核酸構築物は、ユビキチンＣプロモーター、並びにＰＳＬＤ及びＥＧＦＰ又はＪ−Ｒｅｄをコードする配列を含む。
【００３７】
場合によっては、核酸構築物は、ＣＭＶプロモーター、並びにＰＳＬＤ及びＥＧＦＰ又はＪ−Ｒｅｄをコードする配列を含む。
【００３８】
本発明の第三の特徴において、上述の核酸構築物のいずれかを含むベクターが提供される。好適には、前記ベクターはウイルスベクター、又はプラスミドのいずれかである。好適には、前記ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、又はレンチウイルスベクターである。
【００３９】
任意に、ベクターは真核細胞で機性を有する薬物抵抗性遺伝子、好ましくは哺乳類細胞で機能性を有する薬物抵抗性遺伝子をさらに含む。
【００４０】
発現ベクターはまた、ポリアデニル化シグナル、スプライスドナー／スプライスアクセプターシグナル、介在配列、転写エンハンサー配列、翻訳エンハンサー配列のような他の核酸配列も含みうる。任意に、薬物抵抗性遺伝子とレポーター遺伝子は、これらの２つの遺伝子が別々のプロモーターによって駆動されるよりもむしろ、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）（Ｊａｎｇら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、（１９８８）、６２、２６３６−２６４３）によって作動可能に連結されるとよい。クロンテックより市販されているｐＩＲＥＳ−ｎｅｏ及びｐＩＲＥＳベクターを使用しうる。
【００４１】
本発明の第四の特徴において、上述の核酸構築物でトランスフェクトされた宿主細胞が提供される。当該構築物、又はこのような構築物を含む発現ベクターが導入される宿主細胞は、この構築物を発現することができるいずれの哺乳類細胞であってもよい。
【００４２】
調製したＤＮＡレポーター構築物は、当業者によって良く知られた技術を用いて宿主細胞にトランスフェクトされうる。これらの技術には、エレクトロポレーション（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（１９８６）、６、７１６−７１８）、リン酸カルシウム法（例えば、Ｇｒａｈａｍ及びＶａｎ ｄｅｒ Ｅｂ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、（１９７３）、５２、４５６−４６７）、直接マイクロインジェクション、陽イオン性脂質法（例えば、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（キアゲン）又はＦｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ社）、及びガンによる遺伝子移入の使用（Ｊｉａｏら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、（１９９３）、１１、４９７−５０２）が含まれうる。細胞にＤＮＡ構築物をトランスフェクトするためのさらなる代替法では、ウイルスが細胞に進入する自然の能力が利用される。かかる方法では、例えば、単純ヘルペスウイルス（米国特許第５２８８６４１号）、サイトメガロウイルス（Ｍｉｌｌｅｒ、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、（１９９２）、１５８、１）、ワクシニアウイルス（Ｂａｉｃｈｗａｌ及びＳｕｇｄｅｎ、１９８６、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ、Ｒ．Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ編、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、第１１７−１４８頁）、並びにアデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス（Ｍｕｚｙｃｚｋａ、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、（１９９２）、１５８、９７−１２９）に基づいた、ベクター及びトランスフェクションプロトコルが包含される。
【００４３】
好適な組換え宿主細胞の例としては、ＨｅＬａ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、チャーニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、Ｕ２ＯＳ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、ＨｅｐＧ２、ＮＩＨ３Ｔ３ ＭＤＣＫ、ＲＩＮ、ＨＥＫ２９３及びインビトロで生育するその他の哺乳類細胞系が挙げられる。好ましくは、宿主細胞はヒト細胞である。かかる細胞系は、アメリカン・ティッシュ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ、ベセズダ、メリーランド、米国）より入手可能である。哺乳類から細胞を取り出した後に樹立され、その後所定期間細胞培養されている初代細胞系由来の細胞もまた、本発明に含まれることが意図される。
【００４４】
好ましい実施形態において、細胞系は第四の特徴にかかる複数の宿主細胞を含む安定細胞系である。
【００４５】
細胞周期位置レポーターの安定な発現を呈する細胞系もまた、標準法を用い、宿主動物において操作された細胞の異種移植片を樹立するのに使用されうる（Ｋｒａｓａｇａｋｉｓ，Ｋ．Ｊら、Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、（２００１）、１８７（３）、３８６−９１；Ｐａｒｉｓ，Ｓ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ、（１９９９）、１７（１０）、８１７−２２）。細胞周期位置レポーターを発現するように操作された腫瘍細胞系の異種移植片によって、腫瘍細胞分裂、鬱血及び転移を研究するモデル系を確立すること、並びに新しい抗癌剤をスクリーニングすることが可能になるであろう。
【００４６】
本発明の第五の特徴によれば、哺乳類細胞の細胞周期位置を決定するための、上述のポリペプチドの使用が提供される。
【００４７】
宿主動物における同種移植片としての、細胞周期位置レポーターを発現している操作された細胞系又はトランスジェニック組織の使用によって、組織移植片の寛容性又は拒絶に影響する機構を研究できるようになるであろう（Ｐｙｅ及びＷａｔｔ，Ｊ．Ａｎａｔ．、（２００１）、１９８（Ｐｔ２）、１６３−７３；Ｂｒｏｄ，Ｓ．Ａ．ら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（２０００）、６９（１０）、２１６２−６）。
【００４８】
本発明の第六の特徴によれば、哺乳類細胞の細胞周期位置を決定するための方法が提供され、この方法は、
ａ）細胞中で上述の核酸構築物を発現させ；
ｂ）レポーター分子によって発生するシグナルをモニターすることにより細胞周期位置を決定する工程を含む。
【００４９】
第六の特徴による、細胞の細胞周期位置を決定するための方法を実施するには、ＤＮＡレポーター構築物がトランスフェクトされた細胞を、細胞周期の特定の段階でレポーター分子を発現させるのに充分な条件下、時間で培養するとよい。典型的には、レポーター分子の発現は、トランスフェクション後１６〜７２時間の間に起こるはずであるが、培養条件によって異なりうる。レポーター分子が緑色蛍光タンパク質配列を基にしたものである場合、レポーターが蛍光性たる高次構造へと折り畳まれるのに規定時間かかることがある。この時間は、使用される緑色蛍光タンパク質誘導体の一次配列に依存するものである。蛍光レポータータンパク質はまた、経時的に変色しえ（例えば、Ｔｅｒｓｋｉｋｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、（２０００）、２９０、１５８５−８を参照されたい）この場合、トランスフェクション後、所定時間間隔で画像化する必要がある。
【００５０】
第六の特徴にかかる方法で、レポーター分子が蛍光シグナルを生じる場合、発せられたシグナルをモニターするのに、従来の蛍光顕微鏡、又は共焦点蛍光顕微鏡のいずれかを使用するとよい。これらの技術を使用して、レポーター分子を発現している細胞の比率や、レポーターの位置を決定することができる。本発明にかかる方法において、ＤＮＡ構築物で形質転換またはトランスフェクトされた細胞の蛍光は、例えば、分光光度計、蛍光光度計、蛍光顕微鏡、冷却電荷結合素子（ＣＣＤ）イメージャ（走査イメージャ若しくはエリアイメージャなど）、蛍光標示式細胞分取器、共焦点顕微鏡、又は走査共焦点装置で、培養中の細胞の分光特性が光の励起及び発光の走査として決定しうるものでの光学的手段によって好適に測定しうる。
【００５１】
核酸レポーター構築物が薬物抵抗性遺伝子を含む本発明の実施形態において、薬物抵抗性遺伝子のトランスフェクション及び発現後（通常、１〜２日）、選択可能なマーカー遺伝子の存在のために、トランスフェクトされた細胞が耐性となる対象の抗生物質の存在下での細胞の生育によって、修飾されたレポーター遺伝子を発現している細胞を選択するとよい。抗生物質を添加する目的は、レポーター遺伝子を発現し、そして場合によってはその細胞系のゲノム内にレポーター遺伝子をその関連プロモーターと共に組み込んでいる細胞を選択することにある。選択の後、構築物を発現しているクローン細胞系は、標準技術を用いて単離することができる。クローン細胞系は次いで、標準的な条件下に生育されるとよく、そうすればレポーター分子を発現して細胞周期の特定の点で検出可能なシグナルを生じることになるであろう。
【００５２】
本発明の核酸レポーター構築物をトランスフェクトした細胞は、検討を加えるべきであって細胞の細胞周期に対するその効果を決定すべき被検薬剤の非存在下及び／又は存在下に生育させるとよい。レポーター分子を発現している細胞の比率、及び細胞内でのシグナルの局在を決定することによって、細胞の細胞周期に対する被検薬剤の効果、例えば、細胞周期の特定の段階で被検システムが細胞を停止させるか、又はその効果が細胞分裂を加速若しくは減速するものであるのかなどを決定することができる。
【００５３】
従って、本発明の第七の特徴によれば、哺乳類細胞の細胞周期位置に対する被検薬剤の効果を決定する方法が提供され、この方法は、
ａ）上述の核酸レポーター構築物を、被検薬剤の非存在下及び存在下に細胞中で発現させ；並びに
ｂ）レポーター分子が発生するシグナルをモニターすることによって細胞周期位置を決定する工程を含み、ここで、被検薬剤の非存在下と存在下に測定された発生シグナル間の差が、細胞の細胞周期位置に対する被検薬剤の効果の指標となる。
【００５４】
「被検薬剤」なる用語は、電磁放射線の形態として、又は化学成分として解釈されるべきである。好ましくは、被検薬剤は、薬物、核酸、ホルモン、タンパク質及びペプチドからなる群から選択される化学成分である。被検薬剤は、細胞に外因的に適用されてもよいし、又は研究対象の細胞において発現されるペプチド若しくはタンパク質であってもよい。
【００５５】
本発明の第八の特徴において、哺乳類細胞の細胞周期位置に対する被検薬剤の効果を決定する方法が提供され、この方法は、
ａ）当該被検薬剤の存在下に、上述の核酸レポーター構築物を当該細胞中で発現させ；
ｂ）レポーター分子が発生するシグナルをモニターすることによって細胞周期位置を決定し；並びに
ｃ）被検薬剤の存在下に発生するシグナルを、被検薬剤の非存在下に発生するシグナルに対する既知の数値と比較する工程を含み、
ここで、被検薬剤の存在下に測定された発生シグナルと、被検薬剤の非存在下での既知の数値との差が、細胞の細胞周期位置に対する被検薬剤の効果の指標となる。
【００５６】
本発明の第九の特徴において、哺乳類細胞の細胞周期位置に対する被検薬剤の効果を決定する方法が提供され、この方法は、
ａ）上述の核酸レポーター構築物を含む細胞を用意し；
ｂ）細胞の第一及び第二集団を、被検薬剤の存在下及び非存在下、核酸レポーター構築物の発現を許容する条件下にそれぞれ培養し；並びに
ｃ）第一及び第二細胞集団において、レポーター分子が発生するシグナルを測定する工程を含み、
ここで、第一及び第二細胞集団で測定された発生シグナル間の差が、細胞の細胞周期位置に対する被検薬剤の効果の指標となる。
【００５７】
本発明の第十の特徴において、被検薬剤に応答して変動することが知られている第一の検出可能なレポーターによって測定できる細胞プロセスに対する哺乳類細胞周期の効果を決定する方法が提供され、この方法は、
ａ）被検薬剤の存在下に、上述の第二核酸レポーター構築物を、細胞中で発現させ；
ｂ）第二レポーター分子が発生するシグナルをモニターすることによって細胞周期位置を決定し；並びに
ｃ）第一の検出可能なレポーターが発生するシグナルをモニターする工程を含み、
ここで、工程ｂ）によって決定された細胞周期位置と第一の検出可能なレポーターが発生するシグナルとの関係が、当該細胞プロセスが細胞周期依存性であるか否かの指標となる。
【００５８】
本発明の第十一の特徴において、細胞中のＣＤＫ２活性を測定するための、上述のポリペプチドの使用が提供される。
【００５９】
本発明の第十二の特徴によれば、細胞中のＣＤＫ２活性を測定するための方法が提供され、この方法は、
ａ）上述の細胞中で核酸構築物を発現させ；及び
ｂ）レポーター分子が発生するシグナルをモニターすることによってＣＤＫ２活性を決定する工程を含む。
【００６０】
本発明の第十三の特徴によれば、哺乳類細胞のＣＤＫ２活性に対する被検薬剤の効果を決定するための方法が提供され、この方法は、
ａ）当該被検薬剤の非存在下及び存在下に、上述の核酸構築物を当該細胞中で発現させ；並びに
ｂ）レポーター分子が発生するシグナルをモニターすることによってＣＤＫ２活性を決定する工程を含み、ここで、当該被検薬剤の非存在下及び存在下で測定された発生シグナル間の差が、ＣＤＫ２活性に対する被検薬剤の効果の指標となる。
【００６１】
本発明の第十四の特徴において、哺乳類細胞のＣＤＫ２活性に対する被検薬剤の効果を決定する方法が提供され、この方法は、
ａ）当該被検薬剤の存在下に、上述の核酸構築物を当該細胞中で発現させ；及び
ｂ）レポーター分子が発生するシグナルをモニターすることによって細胞周期位置を決定し；
ｃ）被検薬剤の存在下に発生するシグナルを、被検薬剤の非存在下に発生するシグナルに対する既知の数値と比較する工程を含み、
ここで、被検薬剤の存在下に測定された発生シグナルと、被検薬剤の非存在下での当該既知の数値との差が、細胞のＣＤＫ２活性に対する被検薬剤の効果の指標となる。
【００６２】
図面の簡単な説明
図１は、核又は細胞質におけるＨＤＨＢの局在を示す図である。
（Ａ）Ｕ２ＯＳ細胞の細胞質及び核抽出物を、変性ゲル電気泳動、並びに組換えＨＤＨＢ、α−チューブリン、及びＰＣＮＡに対する抗体を用いたウェスタンブロッティングによって分析した。免疫反応性タンパク質は、化学発光によって検出した。
（Ｂ）Ｕ２ＯＳ細胞に微量注入して一過性に発現されたＧＦＰタグ付きＨＤＨＢを、蛍光顕微鏡によって可視化した。核は、ヘキスト染料で染色した。棒：１０μｍ。
（Ｃ）Ｕ２ＯＳ細胞に微量注入して一過性に発現されたＦＬＡＧタグ付きＨＤＨＢを、蛍光顕微鏡によって可視化した。
【００６３】
図２は、ＧＦＰ−ＨＤＨＢの細胞内局在化は、細胞周期依存性であることを示す図である。
（Ａ）非同調性、Ｇ１、及びＳ期のＵ２ＯＳ細胞における、一過性に発現されたＧＦＰタグ付きＨＤＨＢの細胞内局在化を数量化した。所定の分布パターンを備えたＧＦＰ陽性細胞の数を、ＧＦＰ陽性細胞の総数（＞１００個細胞）の百分率として表した。
（Ｂ）同調性Ｕ２ＯＳ細胞（Ｇ１及びＳ期）の細胞質及び核抽出物を、変性ゲル電気泳動、並びに組換えＨＤＨＢ、α−チューブリン、及びＰＣＮＡに対する抗体を用いたウェスタンブロッティングによって分析した。免疫反応性タンパク質は、化学発光によって検出した。
【００６４】
図３は、ＨＤＨＢの核局在化に必要なドメインの同定を示す図である。
（Ａ）ＣＤＫ（ＳＰ又はＴＰ）に対する７つの潜在的リン酸化部位、推定細胞内局在化ドメイン（ＳＬＤ）及びリン酸化ＳＬＤ（ＰＳＬＤ）、ウォーカーＡ及びウォーカーＢヘリカーゼモチーフを示す、ＨＤＨＢタンパク質の模式図。アミノ酸残基数を、タンパク質の下に示す。
（Ｂ）研究にて作製した、ＧＦＰ−及びＦＬＡＧ−タグ付きＨＤＨＢ、並びにＣ末端切欠変異体。ＨＤＨＢ ＳＬＤ（残基１０４０〜１０８７）及びＰＳＬＤ（残基９５７〜１０８７）のＣ末端を、ＧＦＰ−βＧａｌレポーターに融合させて、それぞれＧＦＰ−βＧａｌ−ＳＬＤ及びＧＦＰ−βＧａｌ−ＰＳＬＤを作出した。
（Ｃ）非同調性、Ｇ１、及びＳ期Ｕ２ＯＳ細胞における、一過性に発現されたＧＦＰ−ＨＤＨＢ−ΔＳＬＤの細胞内局在化を数量化して、ＧＦＰ陽性細胞の総数の百分率として表した。
【００６５】
図４は、ＧＦＰ−βＧａｌ−ＰＳＬＤ細胞内局在化パターンは、細胞周期で変動することを示す図である。
（Ａ）非同調性、Ｇ１、及びＳ期Ｕ２ＯＳ細胞で一過性に発現されたＧＦＰ−βＧａｌ、ＧＦＰ−βＧａｌ−ＳＬＤ、及びＧＦＰ−βＧａｌ−ＰＳＬＤの細胞内局在化を数量化して、ＧＦＰ陽性細胞の総数の百分率として表した。
【００６６】
図５は、ＨＤＨＢのＳＬＤにおける機能性ｒｅｖ型核外移出シグナル（ＮＥＳ）の同定を示す図である。
（Ａ）ＨＤＨＢ内推定ＮＥＳの、他の細胞周期関連タンパク質で同定されたもの（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ及びＥｌｅｆｔｈｅｒｉｏｕ、２０００；Ｆａｂｂｒｏ及びＨｅｎｄｅｒｓｏｎ、２００３）とのアラインメント。アミノ酸配列の上方の上付き添字は、残基数を示す。太矢印は、ＮＥＳの保存された脂肪族残基を指し示す。ＨＤＨＢ内推定ＮＥＳの二対の残基を、細矢印によって示すようにアラニンに変異させてＭｕｔ１及びＭｕｔ２を作出した。
（Ｂ）ＧＦＰ−及びＦＬＡＧ−タグ付きＨＤＨＢを、ＣＲＭ１によって媒介される核外移出を阻害するＬＭＢを、添加して（＋）又は添加せずに（−）、非同調的に成長しているＵ２ＯＳ細胞で一過性に発現させた。非同調性、Ｇ１、及びＳ期細胞における、ＧＦＰ−ＨＤＨＢ及びＦＬＡＧ−ＨＤＨＢの細胞内局在化を数量化して、その試料中のＧＦＰ陽性細胞の総数の百分率として表した。
【００６７】
（Ｃ）非同調性Ｕ２ＯＳ細胞での野生型、並びに変異型ＧＦＰ−ＨＤＨＢ及びＧＦＰ−βＧａｌ−ＰＳＬＤの細胞内局在化を数量化して、その試料中のＧＦＰ陽性細胞の総数の百分率として表した。
【００６８】
図６は、インビボでのＦＬＡＧ−ＨＤＨＢの細胞周期依存的なリン酸化を示す図である。
（Ａ）ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢ（レーン１）、並びにその切欠変異体１−１０３９（レーン２）及び１−８７４（レーン３）を一過性に発現しているＵ２ＯＳ細胞を、［３２Ｐ］オルソ−ホスフェートで標識化した。細胞抽出物を抗ＦＬＡＧレジンで免疫沈降させた。沈降したタンパク質は、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦ膜に転写して、オートラジオグラフィー（上方）又はウェスタンブロッティング（下方）によって検出した。既知分子量のマーカータンパク質の位置を、左側に示す。
（Ｂ）Ｕ２ＯＳ細胞で発現させたＦＬＡＧ−ＨＤＨＢを抗ＦＬＡＧレジンで免疫沈降させ、示した通りにホスファターゼインヒビターの存在下（＋）又は非存在下（−）に、λ−ホスファターゼ（λ−ＰＰａｓｅ）を添加して（＋）又は添加せずに（−）インキュベートして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び抗ＨＤＨＢ抗体を用いたイムノブロッティングによって分析した。
（Ｃ）ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢを発現しているＵ２ＯＳ細胞を、Ｇ１／Ｓ（上方）又はＧ２／Ｍ（下方）で停止させて、その後遮断から復帰させた。表示の時点でＦＬＡＧ−ＨＤＨＢを回収し、抗ＦＬＡＧレジンで免疫沈降させ、λ−ＰＰａｓｅを添加して（＋）又は添加せずに（−）処理して、（Ｂ）におけると同様に分析した。
【００６９】
図７は、ＨＤＨＢ内インビボ主要リン酸化部位としてのＳ９６７の同定を示す図である。
（Ａ）ホスホアミノ酸マーカー（左側）、及びインビボで３２Ｐにて標識化したＦＬＡＧ−ＨＤＨＢからのホスホアミノ酸（右側）を、二次元で分離し、オートラジオグラフィーによって可視化した。加水分解が不完全であったホスホペプチドのあるものは、起点の近傍に残っていた（＋）。
（Ｂ）野生型及び変異型ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢタンパク質を、インビボでオルトホスフェートにて放射標識化し、免疫沈降させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離して、オートラジオグラフィー（上方）及び抗ＨＤＨＢを用いたイムノブロッティング（下方）により分析した。
（Ｃ）３２Ｐにて標識化した野生型及びＳ９６７Ａ変異型ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢのトリプシンで生じたホスホペプチドを二次元に分離して、オートラジオグラフィーによって可視化した。
【００７０】
図８は、ＨＤＨＢ Ｓ９６７の潜在的Ｇ１／ＳキナーゼとしてのサイクリンＥ／ＣＤＫ２の同定を示す図である。
（Ａ）図７Ｃにおけると同様にインビボでリン酸化したＦＬＡＧ−ＨＤＨＢ、又は精製したサイクリンＥ／ＣＤＫ２若しくはサイクリンＡ／ＣＤＫ２によってインビトロでリン酸化した組換えＨＤＨＢ由来の、トリプシンで生じたホスホペプチドを、別個に、又は混合物としてのいずれかで二次元に分離して、オートラジオグラフィーによって可視化した。
（Ｂ）ＦＬＡＧベクターを用いて共免疫沈降させたタンパク質（レーン１、４）、又はＵ２ＯＳ細胞において発現させたＦＬＡＧ−ＨＤＨＢ（レーン２、５）を、ＨＤＨＢ（レーン１〜６）、サイクリンＥ（レーン１〜３）、又はサイクリンＡ（レーン４〜６）に対する抗体を用いてイムノブロッティングによって分析した。免疫沈降のために使用した細胞溶解液の１０分の１を、陽性コントロールとして平行して分析した（レーン３、６）。
【００７１】
図９は、ＨＤＨＢの細胞内局在化は、Ｓ９６７のリン酸化によって調節されることを示す図である。
（Ａ）非同調性、Ｇ１、及びＳ期Ｕ２ＯＳ細胞において発現したＧＦＰ−ＨＤＨＢ Ｓ９６７Ａ及びＳ９６７Ｄの細胞内局在化を数量化した。
【００７２】
図１０は、ｐＣＯＲＯＮ１００２−ＥＧＦＰ−Ｃ１−ＰＳＬＤベクターの安定な発現を呈する非同調性Ｕ２ＯＳ細胞でのＥＧＦＰ−ＰＳＬＤの局在化は細胞周期依存性であることを示す図である。
【００７３】
細胞の同じ部分視野の蛍光顕微鏡で、（Ａ）核をヘキスト染料で染色したもの、（Ｂ）ＥＧＦＰ−ＰＳＬＤを可視化したもの、（Ｃ）固定する前に核を１時間、ＢｒｄＵに曝露し、Ｃｙ−５で標識化した抗体を用いて検出してＳ期の細胞を示したもの。（Ｄ）視野全体に存在する個々の細胞についての、赤色（ＢｒｄＵのＣｙ−５免疫蛍光検出）及び緑色（ＥＧＦＰ−ＰＳＬＤ）双方における核の蛍光強度のグラフ。
【００７４】
図１１は、ｐＣＯＲＯＮ１００２−ＥＧＦＰ−Ｃ１−ＰＳＬＤのベクターマップを示す図である。
【００７５】
図１２は、ｐＣＯＲＯＮ１００２−ＥＧＦＰ−Ｃ１−βＧａｌ−ＰＳＬＤのベクターマップを示す図である。
【００７６】
図１３は、ｐＣＯＲＯＮ１００２−ＥＧＦＰ−Ｃ１−ＰＳＬＤ、ｐＣＯＲＯＮ１００２−ＥＧＦＰ−Ｃ１−βＧａｌ−ＰＳＬＤを用いて発生させた代表的な安定細胞系、並びに親のＵ２ＯＳ細胞系に対するシグナルの輝度及び均一性を比較したフローサイトメトリーのデータを示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７７】
方法
プラスミド
ＢｇｌＩＩ／ＮｏｔＩ断片とした全長のＨＤＨＢ ｃＤＮＡを（Ｔａｎｅｊａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、（２００２）２７７、４０８５３−４０８６１）を、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１ベクター（クロンテック、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）のＮｏｔＩ部位に挿入することにより、ｐＧＦＰ−ＨＤＨＢ、及び変異誘導体（図４及び６参照）を作出した。ｐＦＬＡＧ−ＨＤＨＢは、全長のＨＤＨＢ ｃＤＮＡを含むＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩ断片をｐＦｌａｇ−ＣＭＶ２ベクター（イーストマンコダック社、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）のＮｏｔＩ部位に挿入することによって構築した。タグ付きＨＤＨＢプラスミドを、残基１０３４のコーディング配列の後をＮｒｕＩで、及びポリリンカー内をＮｏｔＩで切断し、そして残基１０３５〜１０３９、終止コドン、及び突出しているＮｏｔＩ−適合性５’端をコードする、平滑末端を持つ二重鎖アダプタオリゴヌクレオチドにより、小断片を置換することによって、タグ付きＨＤＨＢ−ＳＬＤ（１〜１０３９）を構築した。ｐＦＬＡＧ−ＨＤＨＢ（１〜８７４）を作出するために、ＳｔｕＩで消化したｐＦＬＡＧ−ＨＤＨＢ ＤＮＡをクレノウポリメラーゼで処理して平滑末端を作り、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ２ベクターに連結させた。ｐＥＧＦＰ−βＧａｌを作るために、大腸菌β−ガラクトシダーゼ（βＧａｌ）をコードするＤＮＡ断片をｐβＧａｌ−コントロール（クロンテック）からのＰＣＲによって増幅させて、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１内のＧＦＰをコードする配列の３’端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を用いて挿入した。アミノ酸残基１０４０〜１０８７（ＳＬＤ）及び９５７〜１０８７（ＰＳＬＤ）に対するＨＤＨＢ配列をＰＣＲで増幅して、ｐＥＧＦＰ−βＧａｌ内のβＧａｌ ｃＤＮＡの３’端で挿入して、ｐＧＦＰ−βＧａｌ−ＳＬＤ及びｐＧＦＰ−βＧａｌ−ＰＳＬＤをそれぞれ作出した。ＮＥＳ変異体、及びリン酸化部位変異体は、ＨＤＨＢ ｃＤＮＡで、部位特異的突然変異誘発（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ、ストラタジーン、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）によって作出した。
【００７８】
ｐＣＯＲＯＮ１００２−ＥＧＦＰ−Ｃ１−ＰＳＬＤは、ＤＮＡ構築物ｐＧＦＰ−ＣＩ−βＧａｌ−ＰＳＬＤからの３９０塩基対のＰＳＬＤ領域をＰＣＲで増幅することによって構築した。ＰＳＬＤ断片への５’ＮｈｅＩ及び３’ＳａｌＩ制限酵素部位の導入で、ベクターｐＣＯＲＯＮ１００２−ＥＧＦＰ−Ｃ１（ＧＥヘルスケア、アマシャム、ＵＫ）へのサブクローニングが可能になった。この結果得られた６７０４塩基対のＤＮＡ構築物ｐＣＯＲＯＮ１００２−ＥＧＦＰ−Ｃ１−ＰＳＬＤは、ユビキチンＣプロモーター、細菌アンピシリン抵抗性遺伝子、及び哺乳類ネオマイシン抵抗性遺伝子を含んでいる（図１１）。このベクターの核酸配列を、配列番号：３に示す。このベクターのさらに３つのバージョンを、標準クローニング技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．ら（１９８９））を使用して作出した。すなわち、ＥＧＦＰ遺伝子を先ずＪ−Ｒｅｄ（Ｅｖｒｏｇｅｎ）で置換し、ネオマイシン耐性遺伝子をハイグロマイシン抵抗性遺伝子で置換し、そしてユビキチンＣプロモーターをＣＭＶ Ｉ／Ｅプロモーターで置換した。
【００７９】
ｐＣＯＲＯＮ１００２−ＥＧＦＰ−Ｃ１−βＧａｌ−ＰＳＬＤは、ｐＥＧＦＰ−ＣＩ−βＧａｌ−ＰＳＬＤのＮｈｅＩ及びＸｍａＩ制限酵素消化、並びに４２４２塩基対のＥＧＦＰ−βＧａｌ−ＰＳＬＤ断片のｐＣＯＲＯＮ１００２ベクター（ＧＥヘルスケア）への挿入によって構築した。この結果得られた９９３７塩基対のＤＮＡ構築物ｐＣＯＲＯＮ１００２−ＥＧＦＰ−Ｃ１−βＧａｌ−ＰＳＬＤ（図１２）は、ユビキチンＣプロモーター、細菌アンピシリン抵抗性遺伝子、及び哺乳類ネオマイシン抵抗性遺伝子を含んでいる。このベクターの核酸配列を、配列番号：４に示す。
【００８０】
ＥＧＦＰ−ＰＳＬＤ融合タンパク質に対するタンパク質及び核酸配列を、配列番号：５及び６にそれぞれ示す。
【００８１】
すべての構築物及び置換変異体の正しいＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列決定によって確認した。
【００８２】
抗体
抗ＨＤＨＢ抗体は、精製した組換えＨＤＨＢ（ベチルラボラトリーズ、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ、ＴＸ）に対して作製して、固定化ＨＤＨＢにてアフィニティ精製した（Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、抗体：実験室マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー研究所）。
【００８３】
細胞培養、同調、微量注入、エレクトロポレーション、トランスフェクション及び安定細胞系の作製
Ｕ２ＯＳ細胞を、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）（アトランタバイオロジーズ、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、ＧＡ）を追加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ギブコＢＲＬライフテクノロジーズ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中で、指数関数的に生育する単層として３７°Ｃにて培養した。指数関数的に成長しているＵ２ＯＳ細胞は、５ｍＭチミジン（シグマ−アルドリッチ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含有するＤＭＥＭ中でのインキュベーションによって２４時間、Ｇ１／Ｓで停止させた。細胞をＳ期へと復帰させるために、培地を吸引し、１０％ＦＢＳを含む暖かいＤＭＥＭで細胞を３回洗浄して、１０％ＦＢＳを含む新鮮なＤＭＥＭ中でインキュベートした。指数関数的に成長しているＵ２ＯＳ細胞を、３０ｎｇ／ｍｌのノコダゾール（シグマ−アルドリッチ）を含有するＤＭＥＭ中で１６時間、Ｇ２／Ｍで停止させた。Ｇ１へと細胞を復帰させるために、穏やかにシェイクオフすることによって有糸分裂細胞を集め、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで３回洗浄し、次いで微量注入用のカバーガラス上、又はさらに操作するために培養ディッシュ内で平板培養した。
【００８４】
細胞周期同調は、以前報告された通りに（Ｔａｎｅｊａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、（２００２）２７７、４０８５３−４０８６１）フローサイトメトリーによって検証した。核タンパク質の移出を阻止する実験において、１０ｎｇ／ｍｌのレプトマイシンＢ（ＬＭＢ）及び１０μＭのシクロヘキシミド（カルバイオケム、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）を含有するＤＭＥＭ中で３時間培養して、新しいタンパク質合成を阻止した。カバーガラス上に平板培養した細胞を、タンパク質でなくプラスミドＤＮＡを注入したことを除いてはＨｅｒｂｉｇら、１９９９に記載された通りに微量注入した。
【００８５】
エレクトロポレーションのために、非同調的に成長しているＵ２ＯＳ細胞（５×１０６）をトリプシン処理し、遠心分離によって集めて、８００μｌの２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．７ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、６ｍＭグルコースに、最終ｐＨ７．４で再懸濁させた。１０μｇのＤＮＡを添加し、０．４ｃｍのエレクトロポレーションキュベット（バイオラッド、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）に移して、ジーンパルサーＩＩ装置（バイオラッド）を用いてエレクトロポレーションを行った。細胞を組織培養ディッシュ内で１時間、平板培養し、新鮮な培地で洗浄してさらに２３時間培養した。
【００８６】
一過性にトランスフェクトした細胞での作業は、トランスフェクション効率の低さ、発現の不均一性、及びこのようなデータのハイスループット分析により生じる問題のために、マルチウェルプレート形式では困難であることがわかった。従って、細胞周期に対する数多くのｓｉＲＮＡ又は薬剤の効果をスクリーニングするには、均一な安定細胞系の生産が必要であった。長期間過剰発現された場合のＨＤＨＢの毒性効果のゆえに、レポーターに連結したＰＳＬＤ領域を用いて安定細胞系を作った。Ｕ−２ＯＳ細胞を、ｐＣＯＲＯＮ１００２−ＥＧＦＰ−Ｃ１−ＰＳＬＤ（図１１）、ｐＣＯＲＯＮ１００２−ＥＧＦＰ−Ｃ１−βＧａｌ−ＰＳＬＤ（図１２）、又は前記ベクターのＪ−Ｒｅｄ誘導体で一過性にトランスフェクトした。組換え融合タンパク質を発現している安定なクローンを、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（シグマ）又はハイグロマイシンを適宜に用いて選択した。センサの発現のレベル及び均一性を確認するために、単離した初代クローン（構築物当たり〜６０）を、フローサイトメトリーによって分析し、そして必要に応じ第二代のクローンを上記方法を使用して発生させた。
【００８７】
蛍光顕微鏡
間接免疫蛍光染色のために、細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、３．７％ホルムアルデヒドを含むＰＢＳで２０分間固定して、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で５分間透過化処理をし、そして１０％ＦＢＳを含むＰＢＳ中で４５分間インキュベートした。ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢは、マウスモノクローナル抗ＦＬＡＧ抗体（シグマ−アルドリッチ、１０％ＦＢＳを含むＰＢＳ中、１：１００）を用いて２時間、室温で検出した。洗浄後、細胞をＴｅｘａｓ Ｒｅｄが接合したヤギ抗マウス二次抗体（ジャクソンイムノリサーチラボラトリーズ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ、１０％ＦＢＳを含むＰＢＳ中、１：１００）と、室温で１時間インキュベートした。３回洗浄した後、細胞をヘキスト３３２５８（ＰＢＳ中２μＭ）と１０分間インキュベートした。カバーガラスをＰｒｏＬｏｎｇ Ａｎｔｉｆａｄｅ（モレキュラープローブズ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）に取り付けた。浜松デジタルカメラで、Ｏｐｅｎｌａｂ３．０ソフトウェア（インプロビジョン、Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）を用い、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｌａｎ２画像化システム（カールツァイス社）にて画像を得た。細胞内局在化の各パターンを示す細胞の数を計数して、評点した細胞の総数（各実験で１００〜１５０細胞）の百分率として表した。各タンパク質の細胞内分布を、少なくとも二度の独立した実験で定量的に評価した。
【００８８】
ＧＦＰ蛍光については、細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、２μＭのヘキスト３３２５８を含有する３．７％ホルムアルデヒドで２０分間固定して、前記と同様に画像化及び評価した。
【００８９】
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００での抽出については、細胞を冷細胞骨格緩衝液（ＣＳＫ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、３００ｍＭスクロース、１００ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２）で２回洗浄して、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＣＳＫ緩衝液（１Ｘプロテアーゼインヒビターを追加したもの）で氷上にて５分間抽出し、その後前記と同様に固定した。
【００９０】
必要であれば、ハイスループット画像化のために、動的画像化（２４時間）、及び安定細胞系の蛍光顕微鏡のマルチウェルプレート形式での分析を、ハイスループット共焦点画像化システム（ＩＮセルアナライザー１０００又はＩＮセルアナライザー３０００、ＧＥヘルスケア、アマシャム、ＵＫ）を用い、ｐＣＯＲＯＮ１００２−ＥＧＦＰ−Ｃ１−ＰＳＬＤ、ｐＣＯＲＯＮ１００２−ＥＧＦＰ−Ｃ１−βＧａｌ−ＰＳＬＤ又はこれらのベクターのｒｅｄＦＰ誘導体をトランスフェクトした細胞について行った。画像は、細胞周期フェーズマーカー・アルゴリズム（ＧＥヘルスケア）を使用して分析した。
【００９１】
代謝的ホスフェート標識化
Ｕ２ＯＳ細胞（２．５ｘ１０６）を、野生型又は変異型ＦＬＡＧＨＤＨＢで一過性にトランスフェクトした。２４時間後に、ホスフェートが枯渇したＤＭＥＭ（ギブコＢＲＬライフテクノロジーズ）中で細胞を１５分間インキュベートして、３２Ｐ−Ｈ３ＰＯ４（０．３５ｍＣｉ／ｍｌの培地；ＩＣＮファーマシューティカルズ社．、Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ、ＣＡ）で４時間放射標識化した。ホスフェートで標識化したＦＬＡＧ−ＨＤＨＢを抽出物から免疫沈降させ、７．５％ＳＤＳ／ＰＡＧＥによって分離して、下記の通りにポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜に転写した。
【００９２】
細胞抽出、免疫沈降、及びウェスタンブロッティング
トランスフェクションから２４時間後に、免疫沈降及びイムノブロッティングによる分析を行う対象となる、ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢでトランスフェクトした培養物を、溶解用緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０％グリセロール、０．１％ＮＰ−４０、１ｍＭ ＤＴＴ、２５ｍＭ ＮａＦ、１００μｇ／ｍｌ ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌアプロチニン、１μｇ／ｍｌロイペプチン）（３５ｍｍディッシュ当たり０．５ｍｌ、又は６０ｍｍディッシュ若しくは７５ｃｍフラスコ当たり１ｍｌ）で溶解させた。抽出物をディッシュから掻き取り、氷上で５分間インキュベートして、１４０００ｇで１０分間遠心分離した。上清の試料（０．５〜１ｍｇのタンパク質）を、回転体の上で１０μｌの抗ＦＬＡＧアガロース（シグマ）と４°Ｃにて２時間インキュベートした。アガロースビーズを、溶解緩衝液で３回洗浄した。免疫沈降したタンパク質をＰＶＤＦ膜に転写して、抗ＨＤＨＢ−ペプチド血清（１：５０００）、抗サイクリンＥ抗体（１：１０００）、及び抗サイクリンＡ抗体（１：１０００）（サンタクルーズバイオテクノロジー社、サンタクルーズ、ＣＡ）、並びに化学発光（スーパーシグナル、ピアスバイオテクノロジー社、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いたウェスタンブロッティングによって分析した。
【００９３】
選択的な核、及び細胞質タンパク質の抽出のためには、８０〜９０％集密のＵ２ＯＳ細胞をトリプシン処理によって収集して、ＰＢＳで洗浄した。細胞を１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２５Ｍスクロース、１０％グリセロール、７５μｇ／ｍｌジギトニン、１ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１００μｇ／ｍｌ ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌアプロチニン、及び１μｇ／ｍｌ ロイペプチンに再懸濁し、氷上で１０分間溶解させて、１０００ｘｇで５分間遠心分離した。上清画分を、細胞質ゾルの抽出物として集めた。ペレットを洗浄し、高塩緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、４００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、１％ＮＰ−４０、１００μｇ／ｍｌ ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌアプロチニン、及び１μｇ／ｍｌロイペプチン）に再懸濁して、４℃で１０分間振動させた。音波処理後に、可溶性及びクロマチン結合性タンパク質の双方を含有する懸濁物を、核抽出物として分析した。核及び細胞質抽出物中のタンパク質を、８．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、α−チューブリン、ＰＣＮＡ（双方ともサンタクルーズバイオテクノロジー）、及び組換えＨＤＨＢに対する抗体を用いたウェスタンブロッティングを行って分析した。
【００９４】
タンパク質ホスファターゼ反応
抗ＦＬＡＧビーズに結合したＦＬＡＧ−ＨＤＨＢを、１００Ｕのλ−ホスファターゼ（ニューイングランドバイオラボズ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を含むホスファターゼ緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％ＮＰ−４０）と３０℃で１時間インキュベートした。反応は、ホスファターゼインヒビター（５ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、５０ｍＭ ＮａＦ）の存在下又は非存在下で行った。タンパク質を７．５％ＳＤＳＰＡＧＥ（アクリルアミド−ビスアクリルアミド比、３０：０．３６）によって分離して、抗ＨＤＨＢ−ペプチド血清及び化学発光を用いたウェスタンブロッティングによってＨＤＨＢを検出した。
【００９５】
トリプシン分解ペプチドマッピング及びホスホアミノ酸分析
トランスフェクション後２４時間に、免疫沈降及びホスホアミノ酸又はホスホペプチドのマッピングに使用すべき放射標識化ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢをトランスフェクトした培養物を、溶解緩衝液をＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸、１％ＳＤＳ、５０ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１００μｇ／ｍｌＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌアプロチニン、及び１μｇ／ｍｌロイペプチン）に置き換えたことを除いては前記と同様に処理した。免疫沈降したタンパク質を、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離して、ＰＶＤＦ膜に転写した。放射標識化ＨＤＨＢを含む膜を、脱イオン水で２回、よく濯いで、その後オートラジオグラフィーによってホスホタンパク質を可視化した。次いでホスホタンパク質を切り出して、膜片をメタノール、その後水で再度湿潤化した。膜を、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（シグマ−アルドリッチ）を含有する５０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３で室温にて３０分間ブロッキングして、５０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３で３回洗浄し、その後ＰＶＤＦからのホスホタンパク質の酵素的切断を、Ｌ−（トシルアミド−２−フェニル）エチルクロロメチルケトンで処理したウシ膵臓トリプシン（ウォージントン、Ｌａｋｅｗｏｏｄ、ＮＪ）を用いて行った。ペプチドは次いで、他の文献（Ｂｏｙｌｅら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、（１９９１）、２０１、１１０−１４９）で詳説されている二次元ホスホペプチドマッピング又はホスホアミノ酸分析に供した。
【００９６】
インビトロでのサイクリン依存性キナーゼ反応
精製したサイクリン／ＣＤＫ（２００ｐｍｏｌ／時）（Ｒ．Ｏｔｔ及びＣ．Ｖｏｉｔｅｎｌｅｉｔｎｅｒにより提供）、及び精製した組換えＨＤＨＢ（Ｔａｎｅｊａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、（２００２）２７７、４０８５３−４０８６１）を基質として使用し、以前に報告されたように（Ｖｏｉｔｅｎｌｅｉｔｎｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、（１９９９）、１９、６４６−５６）キナーゼ反応を実施した。
【００９７】
ＢｒｄＵ標識化、化学的細胞周期遮断の同定、及び安定細胞系のＲＮＡｉ実験
ｐＣＯＲＯＮ１００２−ＥＧＦＰ−Ｃ１−ＰＳＬＤ構築物を発現している安定な細胞を、抗生物質不含の培地（１００μｌ／ウェル）を使用し、９６ウェルのグライナープレートに０．３ｘ１０５／ｍｌで播種して、１６時間インキュベートした。
【００９８】
Ｓ期のＥＧＦＰ−ＰＳＬＤの分布を調べるために、細胞増殖キット（アマシャムバイオサイエンシズ、ＧＥヘルスケア）を用い、安定な細胞をＢｒｄＵで１時間マーキングした。細胞を２％ホルマリンで固定して、取り込まれたＢｒｄＵを、Ｃｙ−５で標識化した二次抗体システム（細胞増殖キット；ＧＥヘルスケア）を用いた免疫蛍光によって検出した。核はヘキスト（２μＭ）で染色した。
【００９９】
化学的遮断の研究（表１）には、安定な細胞をオロモウシン、ロスコビチン、ノコダゾール、ミモシン、コルセミド又はコルヒチン（シグマ）に曝した。細胞を２％ホルマリンで固定して、核をヘキスト（２μＭ）で染色した。
【０１００】
ｓｉＲＮＡの研究には、特定のサイクリン、ＭＣＭタンパク質、ＣＤＫ、ｐｏｌｏ様キナーゼ（ＰＬＫ）、及び無作為コントロール二重鎖（表２）に対するｓｉＲＮＡプール（ダーマコン）を、リポフェクタミン／オプティメムＩ（インビトロジェン）中、２５ｎＭに希釈して、安定な細胞に４時間添加した。培地を交換して、プレートを４８時間インキュベートした。細胞を２％ホルマリンで固定し、核をヘキスト（２μＭ）で染色した。
【０１０１】
ＩＮセルアナライザーシステム（ＧＥＨＣ）でのハイスループット画像化及び分析の後に、平均の核の強度及びＮ：Ｃ比（ＥＧＦＰシグナル）、核サイズ（ヘキストシグナル）、並びに、必要に応じて核シグナル強度（ＢｒｄＵ）についての視野内の個々の細胞の総数に対するデータを、核マスクとしてヘキスト、及びＩＮセルアナライザー３０００細胞周期フェーズマーカーアルゴリズム（ＧＥＨＣ）を用いて得た。各ウェルにつき、視野当たりの細胞の総数を、Ｇ１期（主に核にＥＧＦＰが分布している；ＥＧＦＰ−ＰＳＬＤ核強度及びＮ：Ｃ比が高い）、Ｓ期（核のＢｒｄＵシグナル＞３ＳＤｓがバックグラウンドを超える；ＥＧＦＰ−ＰＳＬＤ Ｎ：Ｃ比がおよそ１である）、並びにＧ２期（核サイズが大きい；ＥＧＦＰ−ＰＳＬＤ Ｎ：Ｃ比が低い）に分類した。Ｍ期細胞を（小さい核のサイズと非常に強いＥＧＦＰシグナルに基づき）区別することは可能であったが、このような細胞は洗浄及び固定のプロセスの間に除去されたため、ごくわずかしかホルマリンで固定したウェルに認められなかった。
【０１０２】
結果
ＨＤＨＢは、核点状構造内又は細胞質内に存在する
内在性のＨＤＨＢの細胞内局在化を決定するために、核及び細胞質性のタンパク質をヒトＵ２ＯＳ細胞から選択的に抽出し、変性ゲル電気泳動によって分離して、ウェスタンブロッティングにより分析した（図１）。各抽出物中のＰＣＮＡ及びα−チューブリンの存在を先ずモニターして、抽出手順を評価した。ＰＣＮＡは細胞質画分でなく核抽出物に濃縮されており、一方α−チューブリンは主として細胞質画分に認められ、分画が確認された。ＨＤＨＢは、核及び細胞質画分の双方に検出された（図１）。細胞質のＨＤＨＢは、核画分よりもゆっくりと移動し（図１）、翻訳後修飾の可能性が示唆された。
【０１０３】
これらの結果は、ＨＤＨＢが細胞全体にわたって分布していることか、又は核若しくは細胞質のいずれかで細胞の混合集団がＨＤＨＢを含んでいることのどちらかを示しうるものであった。これらの選択肢を識別するために、ＨＤＨＢを単一細胞において原位置で局在化させ；ＧＦＰ−及びＦＬＡＧ−のタグ付きＨＤＨＢを一過性のトランスフェクションによってヒトＵ２ＯＳ細胞で発現させた。タグ付き又はタグなしのＨＤＨＢの長期間過剰発現は細胞毒性があったので、すべての実験は可能な限り最短時間（通常、２４時間）で行った。タグ付きＨＤＨＢの局在を、蛍光顕微鏡により個々の細胞において分析した。ＧＦＰ−ＨＤＨＢ及びＦＬＡＧ−ＨＤＨＢの双方とも、核の分散した点状構造内か、又は細胞質内（図１）のいずれかという、局在の二種の主要パターンを呈した。初代ヒト線維芽細胞で一過性に発現されたＧＦＰ−ＨＤＨＢもまた、核又は細胞質のいずれかで観察された。
【０１０４】
ＨＤＨＢにおける細胞周期依存性の細胞内局在化ドメインの同定
Ｕ２ＯＳ細胞をノコダゾールでＧ２／Ｍにて停止させ、３時間Ｇ１に復帰させて、その後それらの核内にｐＧＦＰ−ＨＤＨＢ ＤＮＡを微量注入した。ＧＦＰ−ＨＤＨＢの発現は、６時間後に容易に検出でき、この際およそ７０％のＧ１期細胞が、主に核内に融合タンパク質を蓄積していた（図２）。一方、細胞をＧ１／Ｓでチミジンで同調させ、Ｓ期に復帰させて、その後ｐＧＦＰ−ＨＤＨＢ ＤＮＡを微量注入した場合、７０％より多くのＳ期細胞が、主に細胞質に融合タンパク質を蓄積していた（図２）。Ｇ１及びＳ期のＵ２ＯＳ細胞の選択的な抽出で、内在性のＨＤＨＢは、Ｇ１ではほとんど核に、Ｓ期では細胞質にあることが明らかになった（図２ｂ）。しかし、内在性のＨＤＨＢは、双方の細胞内画分で明らかに検出できた。Ｓ期のＨＤＨＢの移動性は、Ｇ１期タンパク質に比べてわずかに遅延していた。これらの結果から、ＨＤＨＢの細胞内局在化は細胞周期において調節されており、またＧＦＰタグ付きＨＤＨＢは内在性のタグなしヘリカーゼの局在を反映することが示唆される。
【０１０５】
ブルーム症候群ヘリカーゼ及びその他のＲｅｃＱ−ファミリーのヘリカーゼのＣ末端核位置シグナルの同定（Ｈｉｃｋｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ、（２００３）３、１６９−１７８）による示唆を受けて、可能性のある細胞内局在化ドメイン（ＳＬＤ）をＨＤＨＢのＣ末端の最端部で同定した（図３）。この推定ＳＬＤがＨＤＨＢ局在化にとって重要であるか否かを決定するために、ＳＬＤを含むＣ末端の４８残基を欠くＨＤＨＢの切欠変異体（ＧＦＰ−ＨＤＨＢ−．ＳＬＤ）を作製した（図３）。Ｇ１又はＳ期のＵ２ＯＳ細胞に発現ベクターを微量注入して、融合タンパク質の細胞内局在化を６時間後に蛍光顕微鏡によって調べた。ＨＤＨＢ発現の細胞周期でのタイミングに関わらず、９５％を超える細胞が細胞質に融合タンパク質を蓄積していた（図３ｃ）。この結果は、ＧＦＰ−ＨＤＨＢ−ΔＳＬＤにおけるＣ末端欠失によって損なわれるか又は喪失されるＮＬＳをＨＤＨＢが担持しているかもしれないことを示唆している。
【０１０６】
ＨＤＨＢのＣ−末端ドメインが核局在化に充分なものであるか否かを決定するために、細菌のβ−ガラクトシダーゼ（βＧａｌ）がＨＤＨＢに近似した分子量（１１２ｋＤａ）を有しており、細胞内局在化シグナルを有していない（Ｋａｌｄｅｒｏｎら、Ｃｅｌｌ、（１９８４）、３９、４９９−５０９）ので、これをレポータータンパク質として用いた。コントロールとして、ＧＦＰ−βＧａｌ発現ベクター（図３）を作出して、発現ベクターをＵ２ＯＳ細胞へ微量注入した後に融合タンパク質の細胞内局在化をモニターした。予想通り、ＧＦＰ−βＧａｌタンパク質は主に細胞質に蓄積していた（図４）。これに対して、ＧＦＰ−βＧａｌ−ＳＬＤは、非同調性又は同調性Ｕ２ＯＳ細胞の核及び細胞質の双方に認められ（図４）、ＳＬＤはＮＬＳを含むものの、レポータータンパク質の核局在化に充分なものではないことが示唆された。ことによると隣接する潜在的ＣＤＫリン酸化部位が、細胞周期における細胞内局在化（図３）に影響を及ぼすかもしれないと類推して、ＧＦＰ−βＧａｌ−ＰＳＬＤを構築したが、これは、ＨＤＨＢの推定ＳＬＤ及び潜在的ＣＤＫリン酸化部位のクラスタを含むＣ末端１３１残基をＧＦＰ−βＧａｌのＣ末端に付加したものであった（図３）。ＧＦＰ−βＧａｌ−ＰＳＬＤプラスミドＤＮＡを、非同調性及び同調性Ｕ２ＯＳ細胞で一過性に発現させた場合、ＧＦＰ−βＧａｌ−ＰＳＬＤは、９０％より多くのＧ１期細胞で核に認められ、また７０％より多くのＳ期細胞で細胞質に認められた（図４）。Ｇ１の核内ＧＦＰ−ＨＤＨＢについて観察された限局的なパターンと対照的に、ＧＦＰ−βＧａｌ−ＰＳＬＤ及びＥＧＦＰ−ＰＳＬＤタンパク質は、核小体のみ割愛して、Ｇ１の核全体に均一に分布していた。ＢｒｄＵでマーク付けされているｐＣＯＲＯＮ１００２−ＥＧＦＰ−Ｃ１−ＰＳＬＤを発現している安定細胞系の分析で、Ｓ期の細胞（非同調集団のおよそ６０％に等しい）は、ＥＧＦＰ−ＰＳＬＤシグナルの均等分布（ｅｑｕｉｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）、又は主に細胞質への分布を呈する（図１０）ことが明示された。Ｇ１細胞に伴うＥＧＦＰ−ＰＳＬＤの主として核への分布を、Ｓ期の細胞は示さなかった。細胞によっては、ＥＧＦＰ−ＰＳＬＤレポーターが絶対的に核で排除されていることを示すものも見られたが（図１０）、これらの細胞はＢｒｄＵを取り込んでいなかった。我々は、核からのＥＧＦＰ−ＰＳＬＤの絶対的なクリアランスを示す細胞はＧ２にあるとの仮説を立てた。２４時間にわたるＥＧＦＰ−ＰＳＬＤの安定細胞系の動的な画像化により、ＥＧＦＰ−ＰＳＬＤは有糸分裂後、Ｇ１では主に核内にあり、Ｇ１／Ｓ移行期の頃（細胞質分裂後、３．５時間まで）に核から細胞質への迅速な移動を、さらにＧ１／ＳからＧ２の終点にわたって（およそ１９時間）核から細胞質への累進的な転位置を呈すことが示され；この時点で再分裂の前に細胞のラウンディングが起こった。これらの観察により、Ｇ２細胞がＥＧＦＰ−ＰＳＬＤレポーターの絶対的な細胞質への分布を呈する可能性が確証されるものと考える。ＥＧＦＰ−ＰＳＬＤ融合体の安定な発現は、Ｕ２ＯＳ細胞又はＧ２Ｍ細胞周期フェーズマーカー細胞系（ＧＥＨＣ）と比較して、細胞周期全長（およそ２４時間）で影響を及ぼすことは認められなかった。これらのデータをまとめると、ＨＤＨＢの細胞内局在化は細胞周期に依存的であり、ＨＤＨＢのＣ末端ＰＳＬＤドメインは細胞周期依存的にタンパク質の細胞内局在化を調節する上で主要な役割を果たし、またＨＤＨＢはＧ１で核内にあるがＳ期の間と、おそらくはＧ２で細胞質に累進的に転位置することが示唆される。
【０１０７】
ＨＤＨＢの機能性ｒｅｖ型ＮＥＳの同定
核と細胞質との間を行き来する数多くのタンパク質は、ＨＩＶｒｅｖタンパク質のプロトタイプのＮＥＳに類似したＮＥＳを含むことが実証されている（図５）。ｒｅｖ型ＮＥＳを含むタンパク質は、移出因子ＣＲＭ１（エクスポーチン１とも称される）が結合して核から細胞質までタンパク質を輸送することを必要とする（Ｗｅｉｓによる総説、Ｃｅｌｌ、（２００３）、１１２、４４１−４５１）。レプトマイシンＢ（ＬＭＢ）は、核タンパク質移出におけるＣＲＭ１活性を特異的に阻害する（Ｗｏｌｆｆら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、（１９９７）、４、１３９−１４７；Ｋｕｄｏら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．、（１９９８）、２４２、５４０−５４７）。ＨＤＨＢのＰＳＬＤ配列の検査によって、推定ｒｅｖ型ＮＥＳ（ＬｘｘｘＬｘｘＬｘＬ；図５）が明らかになった。ＨＤＨＢの細胞質への局在化が機能性ＮＥＳを必要とするか否かを決定するために、ＧＦＰ−ＨＤＨＢ又はＦＬＡＧ−ＨＤＨＢ ＤＮＡに対する発現プラスミドをＬＭＢの存在下及び非存在下に、非同調性のＧ１、及びＳ期細胞へ微量注入した。融合タンパク質の局在化は、蛍光顕微鏡によって調べて数量化した。ＬＭＢの存在下では、双方の融合タンパク質が細胞周期と無関係に核内に蓄積し（図５）、これはＣＲＭ１を通じて機能するｒｅｖ型ＮＥＳをＨＤＨＢが含む可能性と符合している。しかし、ＨＤＨＢはＣＲＭ１の直接的な積荷にならないかもしれず、またその移出はいくつかの他のタンパク質（単数又は複数）を通じて間接的に媒介されるかもしれないという可能性もある。ＨＤＨＢ内の推定ＮＥＳが機能性であるかを評価するために、我々はＮＥＳモチーフのＶａｌ／Ｌｅｕ及びＬｅｕ／Ｌｅｕをアラニンに変異誘発して、ＮＥＳ変異体１及び２（図５）を作出した。これらのＮＥＳ変異を内包するＧＦＰ−ＨＤＨＢ及びＧＦＰ−βＧａｌ−ＰＳＬＤを、非同調性又は同調性のいずれかのＵ２ＯＳ細胞で一過性に発現させた。双方のＮＥＳ変異型融合タンパク質は、非同調性又は同調性細胞でいつ発現されても、８０％を超える細胞で核に蓄積していた（図５）。この結果から、ＮＥＳの変異がＧＦＰ−ＨＤＨＢ及びＧＦＰ−βＧａｌ−ＰＳＬＤの双方の移出を特異的に損なったことが示され、ＨＤＨＢのＰＳＬＤ領域が機能性ＮＥＳを含むと論じられる。
【０１０８】
ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢはインビボで細胞周期依存的にリン酸化される
ＨＤＨＢのＰＳＬＤドメイン内の潜在的ＣＤＫリン酸化部位のクラスタ（図３）により、ＨＤＨＢのリン酸化が細胞周期におけるその細胞内局在化を調節するかもしれないことが示唆された。そうであれば、ＨＤＨＢのＰＳＬＤ領域は細胞周期依存的にリン酸化されることが予想されよう。ＨＤＨＢがＰＳＬＤ内のリン酸化を行うかをどうか試験するために、ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢの野生型及びＣ末端切欠型に対する発現プラスミドでＵ２ＯＳ細胞を一過性にトランスフェクトし、ホスフェートで放射標識化して、その後細胞抽出物からＦＬＡＧ−ＨＤＨＢを免疫沈降させた。免疫沈降させたタンパク質を変性ゲル電気泳動、イムノブロッティング、及びオートラジオグラフィーによって分析した（図６）。ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢの放射標識化バンドは、免疫反応性のＨＤＨＢバンドと同じ位置に検出された（図６Ａ、レーン１）。ＳＬＤを欠損した切欠ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢは、インビボでも確実にリン酸化されたが（レーン２）、一方ＰＳＬＤを欠損した切欠ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢ（１〜８７４）は、有意にリン酸化されなかった（レーン３）。これらの結果から、ＳＬＤはＨＤＨＢのリン酸化に必要でなく、ＰＳＬＤが必要であることが実証され、リン酸化部位はおそらくＰＳＬＤ内に存在することが示唆される。
【０１０９】
細胞周期におけるＨＤＨＢのリン酸化のタイミングを調べるには、放射標識を使用せずにリン酸化を検出するのが好都合であろう。リン酸化は変性ゲルでタンパク質の電気泳動度を低減することが多いので、一過性に発現されたＦＬＡＧ−ＨＤＨＢを免疫沈降させて、その移動度をλ−ホスファターゼ（λ−ＰＰａｓｅ）を用いた処理の前後に調べた（図６Ｂ）。λ−ＰＰａｓｅ処理をしない場合、ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢはウェスタンブロットで非常に近くに移動する２つのバンドに検出されたが（レーン１）、一方脱リン酸化したＦＬＡＧ−ＨＤＨＢは単一バンドとしてダブレットの高速の方のバンドの移動度にて移動していた（レーン２）。λ−ＰＰａｓｅインヒビターが反応中に存在する場合、ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢはモック処理タンパク質と同じダブレットとして移動していた（レーン３）。これらのデータは、ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢの電気泳動度がリン酸化によって低減すること、そしてこのアッセイは細胞周期におけるＨＤＨＢのリン酸化を追跡するのに好適でありうることを示唆するものである。
【０１１０】
ＨＤＨＢが細胞周期依存的にリン酸化されるのかを決定するために、ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢを一過性に発現しているＵ２ＯＳ細胞を、培地にチミジンを添加することによりＧ１／Ｓで、又は培地にノコダゾールを添加することによりＧ２／Ｍで停止させた。細胞を、異なる時間で遮断から復帰させて、細胞抽出物からＦＬＡＧ−ＨＤＨＢを免疫沈降させた。
【０１１１】
免疫沈降させたものをλ−Ｐｐａｓｅ添加又は無添加でインキュベートし、次いで変性ゲル電気泳動及びウェスタンブロッティングによって分析した（図６Ｃ）。Ｇ１／Ｓで停止させた細胞由来のＦＬＡＧ−ＨＤＨＢの移動度はλ−ＰＰａｓｅ処理によって増大しており、このタンパク質はＧ１／Ｓでリン酸化されたことが示唆された（図６Ｃ、上方パネル）。類似の移動度の変化が、Ｇ１／Ｓの遮断から復帰した後少なくとも９時間ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢのホスファターゼ処理をした後に（上方パネル）、またＧ２／Ｍで停止した細胞でも（図６Ｃ、下方パネル）検出された。しかし、４時間及び８時間で細胞をＧ１に復帰させた後は、ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢはホスファターゼ処理による影響が随分小さい単一バンドとして移動した（図６Ｃ、下方パネル）。Ｇ２／Ｍ遮断から復帰後１２時間までで、細胞のほとんどがＳ期に入っているときに（データは示さず）、ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢの移動度はやはりホスファターゼ処理によって増大し、ノコダゾールで停止した細胞で観察されたパターンに復元していた（下方パネル）。これらの結果は、ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢのリン酸化が細胞周期依存性であって、Ｇ１／ＳからＧ２／Ｍまででリン酸化が最大であり、Ｇ１の間はリン酸化が最小であることを強く示唆するものである。
【０１１２】
セリン９６７は、異所的に発現されるＨＤＨＢの主要リン酸化部位である
ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢにおけるリン酸化部位をマッピングするために、先ず、修飾されたアミノ酸残基が何であるかを決定したいと考えた。インビボで放射標識化したＦＬＡＧ−ＨＤＨＢのホスホアミノ酸分析により、インビボではＦＬＡＧ−ＨＤＨＢの主要なホスホアミノ酸がホスホセリン（単数又は複数）であることが明らかになった（図７Ａ）。ＨＤＨＢの細胞周期依存的性リン酸化部位がＰＳＬＤ中、残基８７４と１０３９の間に位置しており（図３Ａ）、これらの部位はＣＤＫによって修飾され、ホスホセリンが主要な修飾アミノ酸である（図７Ａ）と想定すると、７つの潜在的ＣＤＫ部位のうち４つだけが、候補部位として残ることになるであろう。これらの部位の各々を個々に試験するために、対応するセリンのアラニンへの変異を施したＦＬＡＧ−ＨＤＨＢ発現プラスミドを構築した。これらのプラスミドを一過性にトランスフェクトした細胞を、オルトホスフェートでインビボに放射標識化して、ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢを免疫沈降させ、オートラジオグラフィー及びウェスタンブロッティングによって分析した（図７Ｂ）。この結果、ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢ及び変異型タンパク質の３つがほぼ同等にリン酸化されており、一方Ｓ９６７Ａ変異タンパク質は弱くリン酸化されているだけであることが示された（図７Ｂ）。この結果は、Ｓ９６７がインビボでのＨＤＨＢリン酸化の主要な部位であるかもしれないことを示唆していた。この解釈と符合して、免疫沈降させたＦＬＡＧ−ＨＤＨＢのホスファターゼ処理後の電気泳動度の変化が、変異型タンパク質の３つで検出されたが、Ｓ９６７Ａタンパク質では検出されなかった。
【０１１３】
Ｓ９６７がインビボでの主要なＨＤＨＢ内リン酸化部位であることを確認するために、トリプシンで生じたホスホペプチドのマッピングを、オルトホスフェートを用いて代謝的に放射標識化しておいた、野生型及びＳ９６７Ａ変異型ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢで実施した（図７Ｃ）。１つの優勢な放射標識化ペプチドと、弱く標識化されたペプチドが、野生型タンパク質（左側パネル）で観察された。優勢なホスホペプチドはＳ９６７Ａタンパク質に存在していなかったが、弱く標識化されたペプチドは検出可能なままであった（図７Ｃ、右側パネル）。この結果は、セリン９６７がインビボで優勢なＨＤＨＢ内リン酸化部位インビボであることのさらなる証拠をもたらすものである。
【０１１４】
Ｇ１／ＳにおいてＨＤＨＢを潜在的に修飾するキナーゼとしてのサイクリンＥ／ＣＤＫ２の同定
細胞周期におけるＨＤＨＢのリン酸化のタイミングと、修飾の主要部位としてのＳ９６７の同定により示唆されるように、ＣＤＫが実際にＨＤＨＢを修飾することができるのかを試験するために、精製サイクリンＥ／ＣＤＫ２又はサイクリンＡ／ＣＤＫ２を、精製組換えＨＤＨＢ及び放射標識化したＡＴＰとインビトロでインキュベートした。キナーゼ反応の後、タンパク質を変性ゲル電気泳動によって分離し、ＰＶＤＦ膜に転写して、オートラジオグラフィーにより検出した。この結果、組換えＨＤＨＢはサイクリンＥ／ＣＤＫ２及びサイクリンＡ／ＣＤＫ２の双方によって強くリン酸化されうることが明らかになった。放射標識化ＨＤＨＢのバンドは、その後さらに、トリプシンで生じるホスホペプチドのマッピングのために処理した。各消化物由来のペプチドを、個々に、又はインビボでリン酸化したＦＬＡＧ−ＨＤＨＢ由来の、トリプシンで生じたペプチドと混合した後に、のいずれかで二次元にて分離して、オートラジオグラフィーにより可視化した（図８Ａ）。サイクリンＥ／ＣＤＫ２及びサイクリンＡ／ＣＤＫ２によってリン酸化されたＨＤＨＢペプチドでは、インビボで標識化したペプチドのマップで観察されるもの（１つの主要スポットと１つの微弱スポット）と本質的に同じパターンが得られた（図８Ａ）。インビトロ及びインビボで標識化されたペプチドを混合して、１つのクロマトグラムで分離した場合、それらは共遊走した（図８Ａ、右側）。これらのデータから、精製組換えＨＤＨＢにおいてインビトロでサイクリンＥ／ＣＤＫ２及びサイクリンＡ／ＣＤＫ２により修飾された主要なホスホペプチドは、ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢにおいてインビボで修飾された場合と同じものであったと論じることができる。
【０１１５】
ヒト細胞におけるサイクリンＥ活性はＧ１後期に上昇し、一方サイクリンＡ活性はＳ期の開始に一致して、もっと後から上昇する（Ｐｉｎｅｓ、１９９９；Ｅｒｌａｎｄｓｓｏｎら、２０００）ので、これらのキナーゼのうち１つが優先的にＨＤＨＢを修飾するのかもしれないのか、識別してみることが重要であった。サイクリンサブユニットは、リン酸化の標的とする基質タンパク質と複合体を形成することが多い（Ｅｎｄｉｃｏｔｔら、１９９９；Ｔａｋｅｄａら、２００１）。サイクリンＥ又はサイクリンＡがＤＨＢと会合しうるかを試験するために、ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢ発現ベクター又はコントロールとしての空のＦＬＡＧベクターのいずれかをトランスフェクトした細胞の抽出物から、ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢ及び会合タンパク質を免疫沈降させた。細胞抽出物と、免疫沈降させたものを、ウェスタンブロッティングによって分析した（図８Ｂ）。サイクリンＥは明らかにＦＬＡＧ−ＨＤＨＢと共沈降したが、サイクリンＡは共沈降せず（図８Ｂ、レーン２及び５）、ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢがインビボでサイクリンＥと優先的に相互作用しうることを示唆していた。この相互作用はインビボでのサイクリンＥ／ＣＤＫ２によるＨＤＨＢのリン酸化に必要とされるのかもしれないと考えられ、そうであるならば、サイクリンＥとのその相互作用を妨げるようなＨＤＨＢにおける変異は、サイクリンＥ／ＣＤＫ２によるリン酸化を抑止するはずである。サイクリンＥに結合できないことに起因して、ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢ変異型Ｓ９６７Ａがインビボでリン酸化されなかった（図７Ｂ、Ｃ）可能性を試験するために、ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢ−Ｓ９６７Ａ及び会合タンパク質を、トランスフェクトした細胞の抽出物から免疫沈降させて、ウェスタンブロッティングによって分析した。変異タンパク質とのサイクリンＥの共沈降は、野生型ＦＬＡＧ−ＨＤＨＢの場合と同程度に強かった。
【０１１６】
セリン９６７のリン酸化はＨＤＨＢ局在化の調節にとって重要である。
【０１１７】
上記のデータは、異所的に発現されたＨＤＨＢの細胞内局在化及びリン酸化が細胞周期依存的に調節され、Ｇ１／ＳからＧ２／Ｍまででリン酸化が最高であったことを示しており、これはＨＤＨＢが細胞質に蓄積していた期間と符合している。これらの結果は、インビボでの主要なＨＤＨＢ内リン酸化部位としてのＳ９６７の同定と合わせて、Ｓ９６７のリン酸化がＨＤＨＢの細胞内局在化を調節しうることを示唆するものである。この着想を試験するために、野生型ＧＦＰ−ＨＤＨＢ、並びに変異体Ｓ９６７Ａ、Ｓ９８４Ａ、Ｓ１００５Ａ、及びＳ１０２１Ａに対する発現プラスミドを、同調性Ｕ２ＯＳ細胞へ微量注入した。予想通り、野生型ＧＦＰ−ＨＤＨＢは、Ｇ１で細胞の核点状構造内に蓄積したが、Ｓ期には細胞の細胞質に蓄積した。しかし、細胞周期のタイミングに関係なく、ＧＦＰ−ＨＤＨＢ−Ｓ９６７Ａは蛍光細胞の約７０％で核点状構造に局在化していた（図９）。その他の３種の置換変異体は、野生型ＧＦＰ−ＨＤＨＢのように核又は細胞質のいずれかに局在化していた。Ｓ９６７のリン酸化を模倣しようとして、セリン９６７をアスパラギン酸に変異させ、ＧＦＰ−ＨＤＨＢ−Ｓ９６７Ｄを非同調性及び同調性Ｕ２ＯＳ細胞で発現させて、変異型融合タンパク質の細胞内分布を調べた。
【０１１８】
ＧＦＰ−ＨＤＨＢ−Ｓ９６７Ｄを発現している細胞の約６０％が、非同調性、Ｇ１期、及びＳ期細胞において細胞質に蛍光を示し（図９Ａ）、Ｓ９６７Ｄ突然変異は、リン酸化されたＳ９６７を模倣したことが立証された。このデータは、セリン９６７のリン酸化がＨＤＨＢの細胞内局在化を調節するのに重要であることを強く示唆している。
【０１１９】
ＨＤＨＢのＣ末端ドメインは細胞周期依存性の局在化に関与する
１３１残基のドメイン、ＰＳＬＤは、ＨＤＨＢ、ＥＧＦＰ又はβＧａｌレポーターを、核又は細胞質のいずれかに細胞周期依存的に標的化するのに足るものである（図４及び１０）。ｒｅｖ型ＮＥＳがこのドメイン内に存在している（図５）が、Ｇ１／Ｓ移行において、核外移出の機構に対するその活性又は接触性はＰＳＬＤ（主にセリン９６７）のリン酸化に依存している（図６〜９）。Ｓ９６７は、コンセンサスＣＤＫ基質認識モチーフ（Ｓ／Ｔ）ＰＸ（Ｋ／Ｒ）と完全に一致する。サイクリンＥ／ＣＤＫ２及びサイクリンＡ／ＣＤＫ２の双方は、インビトロでＨＤＨＢを修飾することができるが、細胞抽出物中のＨＤＨＢとのサイクリンＥ／ＣＤＫ２の複合能から、それがＧ１／Ｓ移行にてＨＤＨＢを修飾する初期のキナーゼであるかもしれないことが示唆される（図８）。既知のＣｄｋ２インヒビターであるオロモウシン及びロスコビチン（表１）、又はサイクリンＥに対するｓｉＲＮＡ（表２）の添加の結果、ＥＧＦＰ−ＰＳＬＤの主に核への分布と、安定なＥＧＦＰ−ＰＳＬＤ細胞系に対してＧ１の停止が引き起こされ、観察された細胞周期に基づくリン酸化依存性の細胞内局在化の制御に、Ｃｄｋ２／サイクリンＥが関与する可能性がさらに支持された。ＰＳＬＤのリン酸化は、細胞周期の終盤に及ぶまで持続するようであり、これはＳ及びＧ２での主に細胞質へのＨＤＨＢの局在化に良く呼応していた。２４時間にわたってオロモウシンで処理した安定細胞系の動的な画像化によって、Ｇ２で停止した細胞については、ＥＧＦＰ−ＰＳＬＤシグナルが４時間を超え８時間にわたって細胞質から核に再分布する（細胞が有糸分裂を経ることなく）ことが示され、ｃｄｋ２活性がなければＥＧＦＰ−ＰＳＬＤは脱リン酸化されて核に再び入るか、又は破壊されて新しく合成されたタンパク質がｃｄｋ２阻害のためにリン酸化されず、従って核に局在するか、のどちらかであることを示唆していた。
【０１２０】
【表１】
【０１２１】
【表２】
ＨＤＨＢがＭ／Ｇ１移行で脱リン酸化を行うのか（図６Ｃ）、又はおそらくはタンパク質分解の標的にされてＧ１初期に迅速に再合成され、この際に核に入るのか、どちらかを識別するのは可能でなかった。しかし、２４時間にわたる安定細胞系の動的画像化によって、ＥＧＦＰ−ＰＳＬＤシグナルはＭ期の間又はＭ／Ｇ１境界で大幅に低減しないものの、細胞質分裂後およそ３０分間で主に核のシグナルになる（この状態はその後Ｇ１の間３時間まで持続する）ことが示され、これは核膜形成に符合していた。このことは、ＥＧＦＰ−ＰＳＬＤ構築物がＭ／Ｇ１境界近辺で著しい破壊を起こすのでなく脱リン酸化されることを示唆している。
【０１２２】
これらのデータにより、ＰＳＬＤがタンパク質の関係性から独立した活性なターゲティングシグナルを含むこと（図２〜５、１０）の強力な証拠がもたらされる。不活性化されたＮＥＳを備えた変異型ＨＤＨＢは、Ｓ期の間にそれが発現され、従っておそらくはリン酸化されたとしても核内にある（図５）ので、ＮＬＳはリン酸化によって不活性化されず、ＣＤＫの調節の第一の標的はＮＥＳであろうと思われる。この推論を広げていくと、ＰＳＬＤ内のＣＤＫモチーフが修飾されていない場合にＮＥＳはＧ１の間マスクされているかもしれず、またＳ９６７がリン酸化されるとＮＥＳが遊離されて、核外移出因子によるＮＥＳ認識へと導かれることになる（図３〜５）。ｒｅｖ型ＮＥＳの構造研究で、それが両親媒性のα−ヘリックスを形成している、すなわちヘリックスの片側にロイシンが並び、もう一方の側に荷電残基が並んでいることが示されている（Ｒｉｔｔｉｎｇｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９９）、４、１５３−１６６）。ＨＤＨＢのＳＬＤはｒｅｖ型ＮＥＳ及びＮＬＳの双方を含んでおり、ＮＬＳとしての機能を果たすらしき塩基性残基がＮＥＳ全体に散在しているので、ＮＥＳとＮＬＳは、両親媒性のヘリックスの対向面に存在しているのかもしれない。ＰＳＬＤ内のさらなる配列は、ＮＥＳを分子内でマスクしているはずであり、ＮＬＳのみが認識できるようになっている。Ｓ９６７のリン酸化により、ＰＳＬＤでのマスクの高次構造が変化することになって、ＮＬＳの曝露に影響を及ぼすことなくＮＥＳが曝露される。
【０１２３】
ＥＧＦＰ−ＰＳＬＤ安定細胞系を用いた細胞周期のインヒビターに対するハイスループットスクリーニング
上述の通り、一過性にトランスフェクトした細胞での作業は、トランスフェクション効率の低さ、発現の不均一性、及びこのようなデータのハイスループット分析により生じる問題のために、マルチウェルプレート形式では困難であることがわかった。従って、細胞周期に対する数多くのｓｉＲＮＡ又は薬剤の効果をスクリーニングするには、均一な安定細胞系の生産が必要であった。適応性のある７つのアミノ酸リンカーを介して（ｐＣＯＲＯＮ１００２−ＥＧＦＰ−Ｃ１−ＰＳＬＤを使用）レポーター（ＥＧＦＰ）に連結したＰＳＬＤ領域で、安定細胞系を作った。図１３からわかるように、ｐＣＯＲＯＮ１００２−ＥＧＦＰ−Ｃ１−βＧａｌ−ＰＳＬＤを用いて発生させた安定細胞系が発生する蛍光シグナルは、適応性のある７つのアミノ酸リンカーを有する細胞系により生成されるものよりもかなり小さかった（およそ１０倍）。これはおそらく、細胞の転写及び翻訳機構に対して多大な要求を課している、βＧａｌタンパク質のサイズに起因しているようである。
【０１２４】
ｐＣＯＲＯＮ１００２−ＥＧＦＰ−Ｃ１−ＰＳＬＤを用いて発生させた安定細胞系（図１３参照）は、事実上均質であって（平均総細胞ＲＦＵ：４３５、ＳＤ：５８；ｎ＝２７１；図１０参照）、細胞周期を研究するため、及びマルチウェルプレート形式で細胞周期に対する薬剤の効果を迅速にスクリーニングするための、好感度で、安定で均一なアッセイを提供した（表１及び２；及び図１０）。
【０１２５】
以上に開示した本発明のいくつかの特徴は、モレキュラー・バイオロジー・オブ・ザ・セル（１５：３３２０−３３３２、２００４年７月）に発表され、またＭＢＣ（近刊）１０．１０９１／ｍｂｃ．Ｅ０４−０３−０２２７として２００４年５月１４日に「ＤＮＡ損傷点状構造に局在するヒトＤＮＡヘリカーゼの細胞周期依存的な調節（“Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｈｕｍａｎ ＤＮＡ Ｈｅｌｉｃａｓｅ Ｔｈａｔ Ｌｏｃａｌｉｚｅｓ ｉｎ ＤＮＡ Ｄａｍａｇｅ Ｆｏｃｉ”）」の表題で電子出版されており、その開示内容の全体を、引用することによって本明細書に援用する。
【０１２６】
以上に記載したのは本発明の例示であり、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。本発明の例証的ないくつかの実施形態を記載しているが、当業者であれば、本発明の新規教示及び利点を実質的に逸脱することなく、これら例証的な実施形態に多くの変更を施すことが可能であると容易に理解するであろう。よって、このような変更のすべてが、特許請求の範囲で定義した本発明の範囲に含まれることを意図する。従って、以上に記載したのは本発明の例示であり、開示された具体的な実施形態に限定されるものと解釈されるべきでなく、また開示された実施形態への変更や、その他の実施形態が、添付の特許請求の範囲の範囲に含まれるように意図されることは、理解されるべきである。本発明は、以下の特許請求の範囲によって定義され、特許請求の範囲の均等物もその中に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】核又は細胞質におけるＨＤＨＢの局在を示す図。
【図２】ＧＦＰ−ＨＤＨＢの細胞内局在化は、細胞周期依存性であることを示す図。
【図３】ＨＤＨＢの核局在化に必要なドメインの同定を示す図。
【図４】ＧＦＰ−βＧａｌ−ＰＳＬＤ細胞内局在化パターンは、細胞周期で変動することを示す図。
【図５】ＨＤＨＢのＳＬＤにおける機能性ｒｅｖ型核外移出シグナル（ＮＥＳ）の同定を示す図。
【図６】インビボでのＦＬＡＧ−ＨＤＨＢの細胞周期依存的なリン酸化を示す図。
【図７】ＨＤＨＢ内インビボ主要リン酸化部位としてのＳ９６７の同定を示す図。
【図８】ＨＤＨＢ Ｓ９６７の潜在的Ｇ１／ＳキナーゼとしてのサイクリンＥ／ＣＤＫ２の同定を示す図。
【図９】ＨＤＨＢの細胞内局在化は、Ｓ９６７のリン酸化によって調節されることを示す図。
【図１０】ｐＣＯＲＯＮ１００２−ＥＧＦＰ−Ｃ１−ＰＳＬＤベクターの安定な発現を呈する非同調性Ｕ２ＯＳ細胞でのＥＧＦＰ−ＰＳＬＤの局在化は細胞周期依存性であることを示す図。
【図１１】ｐＣＯＲＯＮ１００２−ＥＧＦＰ−Ｃ１−ＰＳＬＤのベクターマップを示す図。
【図１２】ｐＣＯＲＯＮ１００２−ＥＧＦＰ−Ｃ１−βＧａｌ−ＰＳＬＤのベクターマップを示す図。
【図１３】ｐＣＯＲＯＮ１００２−ＥＧＦＰ−Ｃ１−ＰＳＬＤ、ｐＣＯＲＯＮ１００２−ＥＧＦＰ−Ｃ１−βＧａｌ−ＰＳＬＤを用いて発生させた代表的な安定細胞系、並びに親のＵ２ＯＳ細胞系に対するシグナルの輝度及び均一性を比較したフローサイトメトリーのデータを示す図。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１１２０００ダルトン未満の分子量を有する基を介して、検出可能な生細胞レポーター分子を１以上の細胞周期依存性の位置制御エレメントに連結してなるポリペプチド構築物であって、前記エレメントの位置はＧ１及びＳ期に変化し、哺乳類細胞内での前記構築物の転位置は、細胞周期位置を示すものであるポリペプチド構築物。
【請求項２】
前記基は、１０００００ダルトン未満の分子量を有する請求項１記載のポリペプチド構築物。
【請求項３】
前記基は、５００００ダルトン未満の分子量を有する請求項１記載のポリペプチド構築物。
【請求項４】
前記基は、２５０００ダルトン未満の分子量を有する請求項１記載のポリペプチド構築物。
【請求項５】
前記基は、１００００ダルトン未満の分子量を有する請求項１記載のポリペプチド構築物。
【請求項６】
前記基は、１０００ダルトン未満の分子量を有する請求項１記載のポリペプチド構築物。
【請求項７】
前記基は、７００ダルトン未満の分子量を有する請求項１記載のポリペプチド構築物。
【請求項８】
前記基は、５００ダルトン未満の分子量を有する請求項１記載のポリペプチド構築物。
【請求項９】
前記基はポリペプチドである請求項１記載のポリペプチド構築物。
【請求項１０】
前記ポリペプチドはヘプタペプチドである請求項９記載のポリペプチド構築物。
【請求項１１】
前記ヘプタペプチドは、グリシン−アスパラギン−グリシン−グリシン−アスパラギン−アラニン−セリン（ＧＮＧＧＮＡＳ）である請求項１０記載のポリペプチド構築物。
【請求項１２】
前記細胞周期特異的な依存性位置制御エレメントは、Ｒａｇ２、Ｃｈａｆ１Ｂ、Ｆｅｎ１、ＰＰＰ１Ｒ２、ヘリカーゼＢ、ｓｇｋ、ＣＤＣ６、又はヘリカーゼＢのＣ末端の特殊な制御領域のリン酸化依存性細胞内局在化ドメイン（ＰＳＬＤ）のような、それらの中のモチーフからなるペプチドの群から選択される請求項１乃至請求項１１のいずれか１項記載のポリペプチド構築物。
【請求項１３】
前記生細胞レポーター分子は、蛍光タンパク質、酵素、及び抗原性タグからなる群から選択される請求項１乃至請求項１２のいずれか１項記載のポリペプチド構築物。
【請求項１４】
前記蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、増強型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、Ｅｍｅｒａｌｄ、及びＪ−Ｒｅｄからなる群から選択される請求項１３記載のポリペプチド構築物。
【請求項１５】
前記酵素レポーターは、ハロ−タグ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）である請求項１３記載のポリペプチド構築物。
【請求項１６】
前記細胞周期依存性の位置制御エレメントは、ＰＳＬＤである請求項１乃至請求項１５のいずれか１項記載のポリペプチド構築物。
【請求項１７】
前記レポーター分子はＥＧＦＰであり、前記細胞周期依存性の位置制御エレメントは、ＰＳＬＤである請求項１乃至請求項１６のいずれか１項記載のポリペプチド構築物。
【請求項１８】
配列番号５のアミノ酸配列を備えるポリペプチド構築物。
【請求項１９】
請求項１乃至請求項１８のいずれか１項記載のポリペプチド構築物をコードする核酸構築物。
【請求項２０】
前記核酸構築物は、更に、１以上の細胞周期非依存性の発現制御エレメントを含み、この発現制御エレメントに作動可能に連結され、その制御下にある請求項１９記載の核酸構築物。
【請求項２１】
前記発現制御エレメントは、ユビキチンＣ又はＣＭＶプロモーターである請求項２０記載の核酸構築物。
【請求項２２】
ＣＭＶプロモーターと、ＰＳＬＤ及びＥＧＦＰ又はＪ−Ｒｅｄをコードする配列とを備える請求項１９乃至請求項２１のいずれか１項記載の核酸構築物。
【請求項２３】
ユビキチンＣプロモーターと、ＰＳＬＤ及びＥＧＦＰ又はＪ−Ｒｅｄをコードする配列とを備える請求項１９乃至請求項２１のいずれか１項記載の核酸構築物。
【請求項２４】
請求項１９乃至請求項２３のいずれか１項記載の核酸構築物を備えるベクター。
【請求項２５】
前記ベクターは、ウイルスベクター又はプラスミドである請求項２４記載のベクター。
【請求項２６】
前記ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター又はレンチウイルスベクターである請求項２５記載のベクター。
【請求項２７】
請求項１９乃至請求項２３のいずれか１項記載の核酸構築物がトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項２８】
前記細胞はヒト細胞である請求項２７記載の宿主細胞。
【請求項２９】
請求項２７又は請求項２８記載の宿主細胞の１又は複数を備える安定細胞系。
【請求項３０】
請求項１乃至請求項１８のいずれか１項記載のポリペプチド構築物の、哺乳類細胞の細胞周期位置を決定するための使用。
【請求項３１】
哺乳類細胞の細胞周期位置を決定する方法であって、
ａ）細胞中で請求項１９乃至請求項２３のいずれか１項記載の核酸構築物を発現させ、
ｂ）前記レポーター分子によって発生するシグナルをモニターすることによって、細胞周期位置を決定する工程を含む方法。
【請求項３２】
哺乳類細胞の細胞周期位置に対する被検薬剤の効果を決定する方法であって、
ａ）請求項１９乃至請求項２３のいずれか１項記載の核酸構築物を、前記被検薬剤の非存在下及び存在下、前記細胞中で発現させ、
ｂ）前記レポーター分子が発生するシグナルをモニターすることによって細胞周期位置を決定する工程を含み、前記被検薬剤の非存在下及び存在下で測定された発生シグナル間の差が、前記細胞の細胞周期位置に対する前記被検薬剤の効果の指標となる方法。
【請求項３３】
哺乳類細胞の細胞周期位置に対する被検薬剤の効果を決定する方法であって、
ａ）請求項１９乃至請求項２３のいずれか１項記載の核酸構築物を、前記被検薬剤の存在下、前記細胞中で発現させ、
ｂ）前記レポーター分子が発生するシグナルをモニターすることによって細胞周期位置を決定し、
ｃ）前記被検薬剤の存在下で発生するシグナルを、前記被検薬剤の非存在下で発生するシグナルとして既知の数値と比較する工程を含み、
前記被検薬剤の存在下で測定された発生シグナルと、前記被検薬剤の非存在下での既知の数値との差が、前記細胞の細胞周期位置に対する前記被検薬剤の効果の指標となる方法。
【請求項３４】
哺乳類細胞の細胞周期位置に対する被検薬剤の効果を決定する方法であって、
ａ）請求項１９乃至請求項２３のいずれか１項記載の核酸構築物を含む細胞を用意し、
ｂ）前記被検薬剤の存在下及び非存在下、核酸レポーター構築物の発現を許容する条件下で、前記細胞の第一及び第二集団をそれぞれ培養し、
ｃ）第一及び第二細胞集団において、前記レポーター分子が発生するシグナルを測定する工程を含み、
第一及び第二細胞集団で測定された発生シグナル間の差が、前記細胞の細胞周期位置に対する前記被検薬剤の効果の指標となる方法。
【請求項３５】
被検薬剤に応答して変動することが知られている第一の検出可能なレポーターによって測定できる細胞プロセスに対する哺乳類細胞周期の効果を決定する方法であって、
ａ）請求項１９乃至請求項２３のいずれか１項記載の第二の核酸レポーター構築物を、前記被検薬剤の存在下、前記細胞中で発現させ、
ｂ）第二のレポーター分子が発生するシグナルをモニターすることによって、細胞周期位置を決定し、
ｃ）第一の検出可能なレポーターが発生するシグナルをモニターする工程を含み、
工程ｂ）で決定された細胞周期位置と、第一の検出可能なレポーターが発生するシグナルとの関係が、前記細胞プロセスが細胞周期依存性であるか否かの指標となる方法。
【請求項３６】
細胞中のＣＤＫ２活性を測定するための、請求項１乃至請求項１８のいずれか１項記載のポリペプチド構築物の使用。
【請求項３７】
細胞中のＣＤＫ２活性を測定するための方法であって、
ａ）細胞中で請求項１９乃至請求項２３のいずれか１項記載の核酸構築物を発現させ、
ｂ）前記レポーター分子が発生するシグナルをモニターすることによって、ＣＤＫ２活性を決定する工程を含む方法。
【請求項３８】
哺乳類細胞のＣＤＫ２活性に対する被検薬剤の効果を決定するための方法であって、
ａ）請求項１９乃至請求項２３のいずれか１項記載の核酸構築物を、前記被検薬剤の非存在下及び存在下、前記細胞中で発現させ、
ｂ）前記レポーター分子が発生するシグナルをモニターすることによって、ＣＤＫ２活性を決定する工程を含み、前記被検薬剤の非存在下及び存在下で測定された発生シグナル間の差が、ＣＤＫ２活性に対する前記被検薬剤の効果の指標となる方法。
【請求項３９】
哺乳類細胞のＣＤＫ２活性に対する被検薬剤の効果を決定する方法であって、
ａ）請求項１９乃至請求項２３のいずれか１項記載の核酸構築物を、前記被検薬剤の存在下、前記細胞中で発現させ、
ｂ）前記レポーター分子が発生するシグナルをモニターすることによって、細胞周期位置を決定し、
ｃ）前記被検薬剤の存在下で発生するシグナルを、前記被検薬剤の非存在下で発生するシグナルの既知の数値と比較する工程を含み、
前記被検薬剤の存在下で測定された発生シグナルと、前記被検薬剤の非存在下での既知の数値との差が、前記細胞のＣＤＫ２活性に対する前記被検薬剤の効果の指標となる方法。
【請求項４０】
前記被検薬剤は、電磁放射線の形態又は化学成分である請求項３７乃至請求項３９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１】
１１２０００ダルトン未満の分子量を有する基を介して、検出可能な生細胞レポーター分子を１以上の細胞周期依存性の位置制御エレメントに連結してなるポリペプチド構築物であって、前記エレメントの位置はＧ１及びＳ期に変化し、哺乳類細胞内での前記構築物の転位置は、細胞周期位置を示すものであるポリペプチド構築物。
【請求項２】
前記基は、１０００００ダルトン未満の分子量を有する請求項１記載のポリペプチド構築物。
【請求項３】
前記基は、５００００ダルトン未満の分子量を有する請求項１記載のポリペプチド構築物。
【請求項４】
前記基は、２５０００ダルトン未満の分子量を有する請求項１記載のポリペプチド構築物。
【請求項５】
前記基は、１００００ダルトン未満の分子量を有する請求項１記載のポリペプチド構築物。
【請求項６】
前記基は、１０００ダルトン未満の分子量を有する請求項１記載のポリペプチド構築物。
【請求項７】
前記基は、７００ダルトン未満の分子量を有する請求項１記載のポリペプチド構築物。
【請求項８】
前記基は、５００ダルトン未満の分子量を有する請求項１記載のポリペプチド構築物。
【請求項９】
前記基はポリペプチドである請求項１記載のポリペプチド構築物。
【請求項１０】
前記ポリペプチドはヘプタペプチドである請求項９記載のポリペプチド構築物。
【請求項１１】
前記ヘプタペプチドは、グリシン−アスパラギン−グリシン−グリシン−アスパラギン−アラニン−セリン（ＧＮＧＧＮＡＳ）である請求項１０記載のポリペプチド構築物。
【請求項１２】
前記細胞周期特異的な依存性位置制御エレメントは、Ｒａｇ２、Ｃｈａｆ１Ｂ、Ｆｅｎ１、ＰＰＰ１Ｒ２、ヘリカーゼＢ、ｓｇｋ、ＣＤＣ６、又はヘリカーゼＢのＣ末端の特殊な制御領域のリン酸化依存性細胞内局在化ドメイン（ＰＳＬＤ）のような、それらの中のモチーフからなるペプチドの群から選択される請求項１乃至請求項１１のいずれか１項記載のポリペプチド構築物。
【請求項１３】
前記生細胞レポーター分子は、蛍光タンパク質、酵素、及び抗原性タグからなる群から選択される請求項１乃至請求項１２のいずれか１項記載のポリペプチド構築物。
【請求項１４】
前記蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、増強型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、Ｅｍｅｒａｌｄ、及びＪ−Ｒｅｄからなる群から選択される請求項１３記載のポリペプチド構築物。
【請求項１５】
前記酵素レポーターは、ハロ−タグ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）である請求項１３記載のポリペプチド構築物。
【請求項１６】
前記細胞周期依存性の位置制御エレメントは、ＰＳＬＤである請求項１乃至請求項１５のいずれか１項記載のポリペプチド構築物。
【請求項１７】
前記レポーター分子はＥＧＦＰであり、前記細胞周期依存性の位置制御エレメントは、ＰＳＬＤである請求項１乃至請求項１６のいずれか１項記載のポリペプチド構築物。
【請求項１８】
配列番号５のアミノ酸配列を備えるポリペプチド構築物。
【請求項１９】
請求項１乃至請求項１８のいずれか１項記載のポリペプチド構築物をコードする核酸構築物。
【請求項２０】
前記核酸構築物は、更に、１以上の細胞周期非依存性の発現制御エレメントを含み、この発現制御エレメントに作動可能に連結され、その制御下にある請求項１９記載の核酸構築物。
【請求項２１】
前記発現制御エレメントは、ユビキチンＣ又はＣＭＶプロモーターである請求項２０記載の核酸構築物。
【請求項２２】
ＣＭＶプロモーターと、ＰＳＬＤ及びＥＧＦＰ又はＪ−Ｒｅｄをコードする配列とを備える請求項１９乃至請求項２１のいずれか１項記載の核酸構築物。
【請求項２３】
ユビキチンＣプロモーターと、ＰＳＬＤ及びＥＧＦＰ又はＪ−Ｒｅｄをコードする配列とを備える請求項１９乃至請求項２１のいずれか１項記載の核酸構築物。
【請求項２４】
請求項１９乃至請求項２３のいずれか１項記載の核酸構築物を備えるベクター。
【請求項２５】
前記ベクターは、ウイルスベクター又はプラスミドである請求項２４記載のベクター。
【請求項２６】
前記ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター又はレンチウイルスベクターである請求項２５記載のベクター。
【請求項２７】
請求項１９乃至請求項２３のいずれか１項記載の核酸構築物がトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項２８】
前記細胞はヒト細胞である請求項２７記載の宿主細胞。
【請求項２９】
請求項２７又は請求項２８記載の宿主細胞の１又は複数を備える安定細胞系。
【請求項３０】
請求項１乃至請求項１８のいずれか１項記載のポリペプチド構築物の、哺乳類細胞の細胞周期位置を決定するための使用。
【請求項３１】
哺乳類細胞の細胞周期位置を決定する方法であって、
ａ）細胞中で請求項１９乃至請求項２３のいずれか１項記載の核酸構築物を発現させ、
ｂ）前記レポーター分子によって発生するシグナルをモニターすることによって、細胞周期位置を決定する工程を含む方法。
【請求項３２】
哺乳類細胞の細胞周期位置に対する被検薬剤の効果を決定する方法であって、
ａ）請求項１９乃至請求項２３のいずれか１項記載の核酸構築物を、前記被検薬剤の非存在下及び存在下、前記細胞中で発現させ、
ｂ）前記レポーター分子が発生するシグナルをモニターすることによって細胞周期位置を決定する工程を含み、前記被検薬剤の非存在下及び存在下で測定された発生シグナル間の差が、前記細胞の細胞周期位置に対する前記被検薬剤の効果の指標となる方法。
【請求項３３】
哺乳類細胞の細胞周期位置に対する被検薬剤の効果を決定する方法であって、
ａ）請求項１９乃至請求項２３のいずれか１項記載の核酸構築物を、前記被検薬剤の存在下、前記細胞中で発現させ、
ｂ）前記レポーター分子が発生するシグナルをモニターすることによって細胞周期位置を決定し、
ｃ）前記被検薬剤の存在下で発生するシグナルを、前記被検薬剤の非存在下で発生するシグナルとして既知の数値と比較する工程を含み、
前記被検薬剤の存在下で測定された発生シグナルと、前記被検薬剤の非存在下での既知の数値との差が、前記細胞の細胞周期位置に対する前記被検薬剤の効果の指標となる方法。
【請求項３４】
哺乳類細胞の細胞周期位置に対する被検薬剤の効果を決定する方法であって、
ａ）請求項１９乃至請求項２３のいずれか１項記載の核酸構築物を含む細胞を用意し、
ｂ）前記被検薬剤の存在下及び非存在下、核酸レポーター構築物の発現を許容する条件下で、前記細胞の第一及び第二集団をそれぞれ培養し、
ｃ）第一及び第二細胞集団において、前記レポーター分子が発生するシグナルを測定する工程を含み、
第一及び第二細胞集団で測定された発生シグナル間の差が、前記細胞の細胞周期位置に対する前記被検薬剤の効果の指標となる方法。
【請求項３５】
被検薬剤に応答して変動することが知られている第一の検出可能なレポーターによって測定できる細胞プロセスに対する哺乳類細胞周期の効果を決定する方法であって、
ａ）請求項１９乃至請求項２３のいずれか１項記載の第二の核酸レポーター構築物を、前記被検薬剤の存在下、前記細胞中で発現させ、
ｂ）第二のレポーター分子が発生するシグナルをモニターすることによって、細胞周期位置を決定し、
ｃ）第一の検出可能なレポーターが発生するシグナルをモニターする工程を含み、
工程ｂ）で決定された細胞周期位置と、第一の検出可能なレポーターが発生するシグナルとの関係が、前記細胞プロセスが細胞周期依存性であるか否かの指標となる方法。
【請求項３６】
細胞中のＣＤＫ２活性を測定するための、請求項１乃至請求項１８のいずれか１項記載のポリペプチド構築物の使用。
【請求項３７】
細胞中のＣＤＫ２活性を測定するための方法であって、
ａ）細胞中で請求項１９乃至請求項２３のいずれか１項記載の核酸構築物を発現させ、
ｂ）前記レポーター分子が発生するシグナルをモニターすることによって、ＣＤＫ２活性を決定する工程を含む方法。
【請求項３８】
哺乳類細胞のＣＤＫ２活性に対する被検薬剤の効果を決定するための方法であって、
ａ）請求項１９乃至請求項２３のいずれか１項記載の核酸構築物を、前記被検薬剤の非存在下及び存在下、前記細胞中で発現させ、
ｂ）前記レポーター分子が発生するシグナルをモニターすることによって、ＣＤＫ２活性を決定する工程を含み、前記被検薬剤の非存在下及び存在下で測定された発生シグナル間の差が、ＣＤＫ２活性に対する前記被検薬剤の効果の指標となる方法。
【請求項３９】
哺乳類細胞のＣＤＫ２活性に対する被検薬剤の効果を決定する方法であって、
ａ）請求項１９乃至請求項２３のいずれか１項記載の核酸構築物を、前記被検薬剤の存在下、前記細胞中で発現させ、
ｂ）前記レポーター分子が発生するシグナルをモニターすることによって、細胞周期位置を決定し、
ｃ）前記被検薬剤の存在下で発生するシグナルを、前記被検薬剤の非存在下で発生するシグナルの既知の数値と比較する工程を含み、
前記被検薬剤の存在下で測定された発生シグナルと、前記被検薬剤の非存在下での既知の数値との差が、前記細胞のＣＤＫ２活性に対する前記被検薬剤の効果の指標となる方法。
【請求項４０】
前記被検薬剤は、電磁放射線の形態又は化学成分である請求項３７乃至請求項３９のいずれか１項記載の方法。
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１】
【図６】
【図３】
【図４】
【図５】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１】
【図６】
【公表番号】特表２００８−５１１２８９（Ｐ２００８−５１１２８９Ａ）
【公表日】平成２０年４月１７日（２００８．４．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５２２０３０（Ｐ２００７−５２２０３０）
【出願日】平成１７年７月２２日（２００５．７．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００５／００２８８４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／００８５４２
【国際公開日】平成１８年１月２６日（２００６．１．２６）
【出願人】（３９８０４８９１４）ジーイー・ヘルスケア・ユーケイ・リミテッド (30)
【出願人】（５９１２１９７７３）ヴァンダービルト ユニバーシティ (2)
【氏名又は名称原語表記】ＶＡＮＤＥＲＢＩＬＴ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年４月１７日（２００８．４．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年７月２２日（２００５．７．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００５／００２８８４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／００８５４２
【国際公開日】平成１８年１月２６日（２００６．１．２６）
【出願人】（３９８０４８９１４）ジーイー・ヘルスケア・ユーケイ・リミテッド (30)
【出願人】（５９１２１９７７３）ヴァンダービルト ユニバーシティ (2)
【氏名又は名称原語表記】ＶＡＮＤＥＲＢＩＬＴ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【Ｆターム（参考）】
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