細菌叢の解析方法およびキット
【課題】試料中の細菌叢の総菌数を簡便に測定する方法を提供する。
【解決手段】試料から抽出した細菌のＤＮＡ又はその一部を、特定の塩基配列の１０塩基以上の配列又はそれらの相補的配列を含むＰＣＲプライマーの少なくとも１つを用いて増幅する工程、増幅したＤＮＡ断片を定量する工程、および定量結果に基づいて細菌叢を分析する工程を含むことを特徴とする細菌叢の解析方法、並びにそのためのキット。
【解決手段】試料から抽出した細菌のＤＮＡ又はその一部を、特定の塩基配列の１０塩基以上の配列又はそれらの相補的配列を含むＰＣＲプライマーの少なくとも１つを用いて増幅する工程、増幅したＤＮＡ断片を定量する工程、および定量結果に基づいて細菌叢を分析する工程を含むことを特徴とする細菌叢の解析方法、並びにそのためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＰＣＲプライマーを用いて試料中の細菌叢を解析するための方法及びキットに関し、具体的には、試料中の細菌叢における総菌数、或いは特定の細菌種又は細菌属の占有率を正確に測定し得ることを特徴とする、医療、食品および環境などの分野で有用な、細菌叢を解析するための方法およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医療、食品および環境などの分野において、細菌叢を解析し、制御することが重要視されてきている。細菌叢を構成する細菌は多種多様であり、複雑な生態系を形成している。特に医療、食品分野では、ヒトの消化管における細菌叢、例えば大腸内細菌叢は古くから解析が行われており、生理学上有用な細菌群は、必須ビタミンの合成、病原性細菌の腸管上皮細胞への定着阻止、腸管上皮細胞の増殖因子である酪酸などの単鎖脂肪酸の合成、および免疫賦活などの機能を持ついわゆる善玉菌と、食物成分や生体成分を代謝し、ニトロソアミン、インドール、二次胆汁酸等の発癌性物質を生産する悪玉菌とに二分される。乳酸菌やビフィズス菌などのプロバイオティクスや、オリゴ糖などのプロバイオティクスを含む食品によって善玉菌と悪玉菌のバランスをコントロールし、便秘の改善や様々な生活習慣病を予防する試みが数多くなされており、これらの食品による腸内細菌叢の変化を解析することが重要視されている（非特許文献１参照）。腸内細菌叢の制御はヒトのみならず愛玩動物、家畜などの動物の健康維持（非特許文献２参照）や、養殖漁業における感染防御（非特許文献３参照）においても重要な因子として認識されつつある。
【０００３】
食品産業分野では、発酵食品の製造過程における発酵槽内の細菌叢のモニタリングや、食品の品質や腐敗を防ぐ微生物制御においても、細菌叢の解析が重要視されている（非特許文献４参照）。
【０００４】
また、環境分野においては、汚染土壌の浄化に微生物を用いるバイオレメディエーション法、バイオスティミュレーション法、バイオオーギュメンテーション法などが用いられているが、土壌細菌叢をモニタリングすることで、土壌への栄養素や空気の注入のタイミングを最適化し、処理時間を短縮し、コストを低減する試みがなされている（非特許文献５参照）。
【０００５】
細菌叢の解析手法としては、これまで細菌を単離・同定する培養法が用いられてきた（非特許文献１参照）。しかし、培養法は、人工の栄養培地を用いる為、実際の細菌叢の生態系と比較して微生物の成育に選択がかかることや、腸内細菌や土壌細菌は一般的に高度な嫌気的環境が必要であること、更に操作が煩雑で多大な時間を費やすこと等、精度、定量性、簡便性の面で多くの問題を残している（非特許文献６参照）。
【０００６】
近年、分子生物学の発展に伴い、微生物の１６ＳｒＲＮＡの塩基配列が微生物の系統解析に用いられ、多くの情報が蓄積されてきている。この塩基配列を比較することによって、菌属、菌種特異的なプローブやプライマーが設計され、これらを応用した培養法に代わる細菌叢の解析方法が提案されている。特に、ＦＩＳＨ法、クローンライブラリー法、ＤＧＧＥ法、Ｔ−ＲＦＬＰ法、定量ＰＣＲ法は、煩雑な培養操作無しで細菌叢を解析できる方法として多くの研究に用いられている（非特許文献６参照）。
【０００７】
このうち定量ＰＣＲ法は、現在培養可能な細菌を菌種、および菌属特異的に、更に定量的に検出するための手法として有効であり、培養法の代替として用いられている。しかし、定量ＰＣＲ法では、定量した細菌属や細菌種の、細菌叢における占有率を算出する上での分母となる総菌数の定量方法が確立されておらず、総菌数を測定するために、直接検鏡法やＤＡＰＩ染色法が用いられているのが現状である（非特許文献６参照）。直接検鏡法やＤＡＰＩ染色法は操作に時間を要し、特にＤＡＰＩ法では煩雑な操作も必要である為、多検体の分析には不向きである。そのため、定量ＰＣＲ法によって、細菌属や細菌種と同様に総菌数を測定する方法の確立、およびキットの開発が望まれていた。
【０００８】
【非特許文献１】「ビフィズス菌の研究」、光岡知足編著、日本ビフィズス菌センター出版
【非特許文献２】Journal of Applied Microbiology誌、2002年、10月号、640〜646頁
【非特許文献３】「魚類腸内細菌の生産する抗病因子に関する研究」、文部省科学研究費補助金研究成果報告書、1997〜1999年
【非特許文献４】日本食品微生物学会誌、2004年、第21巻、第3号、187〜192頁
【非特許文献５】「バイオレメディエーションの基礎と実際」、児玉徹監修、シーエムシー出版
【非特許文献６】「腸内フローラシンポジウム10 21世紀腸内フローラ研究の新しい動向」、光岡知足編、学会出版センター
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、定量ＰＣＲ法によって、試料中の細菌叢の解析、より具体的には総菌数の測定或いは試料中の特定の細菌属又は細菌種の全細菌に占める占有率の測定、のための方法、並びに該方法に使用するためのキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意研究した結果、特定のＰＣＲプライマーを用いる定量ＰＣＲ法によって、細菌属又は細菌種と同様に全細菌の総菌数を測定する方法を見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１１】
したがって、本発明は以下の特徴を有する。
本発明は、第１の態様において、試料から抽出した細菌のＤＮＡ又はその一部を、配列番号１〜７に示される塩基配列（ここで、y, m, r, s, d, n, h, v, kまたはbで表される塩基は、特許庁編「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（平成14年7月）に規定される塩基の他に、イノシン(i)でもよい）の１０塩基以上の配列又はそれらの相補的配列を含むＰＣＲプライマーの少なくとも１つを用いて増幅する工程、増幅したＤＮＡ断片を定量する工程、および定量結果に基づいて細菌叢を分析する工程を含むことを特徴とする細菌叢の解析方法を提供する。
【００１２】
その一の実施形態において、本発明の方法は、試料中の細菌叢における総菌数を決定する。より具体的には、総菌数は、増幅産物ＤＮＡを精製し、所定濃度の精製ＤＮＡについて２６０ｎｍの吸光度を測定し、所定量の増幅産物ＤＮＡあたりのコピー数を決定することを含む手段によって決定される。
【００１３】
或いは、本発明の方法は、試料中の個々の属もしくは種の細菌の占有率を決定することを特徴とする。より具体的には、占有率は、試料中の特定の属もしくは種の細菌に特異的な１６ＳｒＲＮＡ配列由来のＰＣＲプライマーを用いて得られた所定量の増幅産物ＤＮＡあたりのコピー数を決定し、試料中の全細菌の増幅産物ＤＮＡあたりのコピー数に対する該特定の属の細菌のコピー数のパーセンテージを算出することを含む手段によって決定される。
【００１４】
別の実施形態により、本発明の方法で使用可能なＰＣＲプライマーは、例えば配列番号８〜１９に示される塩基配列又はその相補的配列からなる。これらのＰＣＲプライマーの組み合わせの例は、配列番号８と１１、配列番号９と１１、配列番号１０と１３、配列番号１２と１５、配列番号１４と１７、配列番号１６と１８、及び配列番号１６と１９からなる群から選択される配列の組み合わせである。
【００１５】
別の実施形態により、ＰＣＲ増幅産物は、リアルタイムＰＣＲによって定量される。
別の実施形態により、試料は、例えば食品、生体試料、環境試料、及び工業プロセスからの試料を含む。より具体的には、試料は、例えば活性汚泥、土壌、河川水、海水、温泉水、飲料水、加工食品、発酵槽培養物、並びに、ヒトを含む哺乳類や他の真核生物の組織、細胞または体液からなる群から選択される。
【００１６】
本発明はまた、第２の態様において、配列番号１〜７に示される塩基配列（ここで、y, m, r, s, d, n, h, v, kまたはbで表される塩基は、特許庁編「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（平成14年7月）に規定される塩基の他に、イノシン(i)でもよい）の１０塩基以上の配列又はそれらの相補的配列を含むＰＣＲプライマーの少なくとも１つを含むことを特徴とする、細菌叢を解析するためのキットを提供する。
【００１７】
その一の実施形態により、本発明のキットは、前記プライマーを用いるリアルタイムＰＣＲによってＰＣＲ産物を定量し、細菌叢を解析するためのものである。
【００１８】
或いは、本発明のキットは、試料中の細菌叢における総菌数を決定する、及び／又は試料中の個々の属もしくは種の細菌の占有率を決定するためのものである。
【００１９】
別の実施形態により、ＰＣＲプライマーが、配列番号８〜１９に示される塩基配列又はその相補的配列からなることを特徴とする。これらのＰＣＲプライマーの組み合わせの例は、配列番号８と１１、配列番号９と１１、配列番号１０と１３、配列番号１２と１５、配列番号１４と１７、配列番号１６と１８、及び配列番号１６と１９からなる群から選択される配列の組み合わせである。
【００２０】
別の実施形態により、本発明のキットは、ＰＣＲ反応を行うための試薬をさらに含むことができる。
【００２１】
別の実施形態により、本発明のキットは、試料からＤＮＡを調製または抽出するための試薬をさらに含むことができる。
【発明の効果】
【００２２】
本発明により、操作に多くの時間を要する、煩雑であるなどの従来の測定法に代わる、細菌叢中の総菌数の新規定量法が提供される。この方法は、例えば９６ウエルプレートなどの複数ウエルからなる固相を利用した測定を可能とするため、一度に多数の試料を測定することができるし、また従来よりも短い時間での測定を可能にするし、測定における細菌属や細菌種間の増幅効率のバラツキが非常に少ない、という利点がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明について詳述する。
本発明は、試料から抽出した細菌のＤＮＡ又はその一部を、配列番号１〜７に示される塩基配列の１０塩基以上の配列又はそれらの相補的配列を含むＰＣＲプライマーの少なくとも１つを用いて増幅する工程、増幅したＤＮＡ断片を定量する工程、および定量結果に基づいて細菌叢を分析する工程を含むことを特徴とする細菌叢の解析方法を提供する。
【００２４】
本発明の方法で使用される試料は、液体、固体、半固体、気体などのいずれでもよいが、水を溶媒もしくは分散媒として含む任意の水性試料が望ましい。水分を含まない試料においては、ＴＥ緩衝液のような緩衝液に懸濁し、完全に溶解、もしくは均一に分散させて試料として供することもできる。また、気相における細菌叢の解析に本発明の方法を用いる場合は、一定体積の気相をエアフィルターに通し、フィルターに付着した細菌を緩衝液で洗浄し、その洗浄液を試料として供することも可能である。
【００２５】
試料は、細菌が含有すると推定されるいずれのものでもよく特に制限されない。試料には、例えば食品、生体試料、環境試料、及び工業プロセスからの試料を含むことができる。具体的には、試料の例は、活性汚泥、土壌、井戸水、地下水、下水、河川水、海水、温泉水、飲料水、加工食品、発酵食品、野菜、肉、鶏卵などの食品、発酵槽培養物、並びに、ヒトを含む動物（哺乳類、鳥類、魚類など）や植物からの組織、細胞または体液、例えば動物の消化管内物質、皮膚、粘膜、糞便、尿、血液、血漿、血清、乳、唾液、汗、粘液など、を含む。これらを適宜、水またはＴＥ 緩衝液のような緩衝液に懸濁し、均一とした物を試料として供する。
【００２６】
検出・定量対象となる細菌の例としては、以下の分類のいずれかに属する細菌が挙げられる。
Aquificaceae、Thermotogaceae、Thermodesulfobacteriaceae、Deinococcaceae、Thermaceae、Chrysiogenaceae、Chloroflexaceae、Herpetosiphonaceae、Thermomicrobiaceae、Nitrospiraceae、Deferribacteraceae、Cyanobacteria、Chlorobiaceae、Rhodospirillaceae、Acetobacteraceae、Rickettsiaceae、Anaplasmataceae、Rhodobacteraceae、Sphingomonadaceae、Caulobacteraceae、Rhizobiaceae、Bartonellaceae、Brucellaceae、Phyllobacteriaceae、Methylocystaceae、Beijerinckiaceae、Bradyrhizobiaceae、Hyphomicrobiaceae、Methylobacteriaceae、Rhodobiaceae、Parvularculaceae、Burkholderiaceae、Oxalobacteraceae、Alcaligenaceae、Comamonadaceae、Incertae、sedis、Hydrogenophilaceae、Methylophilaceae、Neisseriaceae、Nitrosomonadaceae、Rhodocyclales、Acidithiobacillaceae、Piscirickettsiaceae、Thiotrichaceae、Francisellaceae、Chromatiaceae、Ectothiorhodospiraceae、Xanthomonadaceae、Cardiobacteriaceae、Legionellaceae、Coxiellaceae、Methylococcaceae、Oceanospirillaceae、Alcanivoraceae、Hahellaceae、Halomonadaceae、Saccharospirillaceae、Pseudomonadaceae、Moraxellaceae、Aeromonadaceae、Succinivibrionaceae、Alteromonadaceae、Vibrionaceae、Enterobacteriaceae、Pasteurellaceae、Desulfurellaceae、Desulfovibrionaceae、Desulfomicrobiaceae、Desulfohalobiaceae、Desulfobacteraceae、Desulfobulbaceae、Nitrospinaceae、Desulfuromonaceae、Geobacteraceae、Syntrophobacteraceae、Syntrophaceae、Cystobacteraceae、Myxococcaceae、Polyangiaceae、Nannocystaceae、Haliangiaceae、Campylobacteraceae、Helicobacteraceae、Clostridiaceae、Lachnospiraceae、Peptostreptococcaceae、Eubacteriaceae、Peptococcaceae、Heliobacteriaceae、Acidaminococcaceae、Syntrophomonadaceae、Halanaerobiaceae、Halobacteroidaceae、Thermoanaerobacteriaceae、Mycoplasmataceae、Entomoplasmataceae、Spiroplasmataceae、Acholeplasmataceae、Erysipelotrichaceae、Bacillaceae、Alicyclobacillaceae、Caryophanaceae、Listeriaceae、Paenibacillaceae、Planococcaceae、Sporolactobacillaceae、Staphylococcaceae、Thermoactinomycetaceae、Lactobacillaceae、Aerococcaceae、Carnobacteriaceae、Enterococcaceae、Leuconostocaceae、Streptococcaceae、Caldithraceae、Acidimicrobiaceae、Rubrobacteraceae、Coriobacteriaceaefamily、Actinomycetaceae、Micrococcaceae、Bogoriellaceae、Rarobacteraceae、Sanguibacteraceae、Brevibacteriaceae、Cellulomonadaceae、Dermabacteraceae、Dermatophilaceae、Dermacoccaceae、Intrasporangiaceae、Jonesiaceae、Microbacteriaceae、Beutenbergiaceae、Promicromonosporaceae、Corynebacteriaceae、Dietziaceae、Gordoniaceae、Mycobacteriaceae、Nocardiaceae、Tsukamurellaceae、Williamsiaceae、Micromonosporaceae、Propionibacteriaceae、Nocardioidaceae、Pseudonocardiaceae、Actinosynnemataceae、Streptomycetaceae、Streptosporangiaceae、Nocardiopsaceae、Thermomonosporaceae、Frankiaceae、Geodermatophilaceae、Microsphaeraceae、Sporichthyaceae、Acidothermaceae、Kineosporiaceae、Glycomycetaceae、Bifidobacteriaceae、Planctomycetaceae、Chlamydiaceae、Parachlamydiaceae、Simkaniaceae、Waddliaceae、Spirochaetaceae、Serpulinaceae、Leptospiraceae、Fibrobacteraceae、Acidobacteriaceae、Bacteroidaceae、Rikenellaceae、Porphyromonadaceae、Prevotellaceae、Flavobacteriaceae、Blattabacteriaceae、Sphingobacteriaceae、Saprospiraceae、Flexibacteraceae、Flammeovirgaceae、Crenotrichaceae、Fusobacteriaceae、Verrucomicrobiaceae、Xiphinematobacteraceae、Verrucomicrobiaceae、Xiphinematobacteraceae、Dictyoglomaceae、Gemmatimonadales。
【００２７】
細菌を含む試料からＤＮＡを抽出する方法としては、Ｍａｒｍｕｒ法（J. Marmur, J. Mol. Biol. (1961) 3:208-218）、酵素法などのその改良法（G. Voordouw et al., Appln. Environ. Microbiol. (1991) 57:3070-3078）、ベンジルクロライド法（Nucleic Acids Res. (1993) 21:5279-5280）等の他、抽出する試料に応じて最適化された抽出キット（例えばＩＳＯＰＬＡＮＴ（商標、ニッポンジーン社））を用いてもよい。また、試料の懸濁液をそのままＰＣＲチューブに入れ、反応に供することもできる。その場合、試料中にＰＣＲ反応を阻害する物質があれば、あらかじめ適切な方法で除去しておくことが望ましい。
【００２８】
ＰＣＲ反応において、本発明のプライマーを組み合わせ、増幅反応を行うことでＰＣＲ産物を得ることができる。本発明で使用するプライマーは、配列番号１〜７に示される塩基配列において１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、さらに好ましくは１５〜３０塩基、最も好ましくは１５〜２５塩基、特に１５〜２０塩基の配列、又はそれらの相補的配列を含む。より具体的には、配列番号８〜１９に示される塩基配列からなるＰＣＲプライマーを使用することができる。これらのプライマー配列は、公知のすべての属の細菌の１６ＳｒＲＮＡ配列において９９％〜１００％の同一性を有する共通配列を調べ今回見出した配列に基づいている。本発明におけるＰＣＲ反応には、例えば配列番号１２と１５のプライマーというように、２種類のプライマーを１組として用いることが望ましい。例えばそのような組み合わせの例は、配列番号８と１１、配列番号９と１１、配列番号１０と１３、配列番号１２と１５、配列番号１４と１７、配列番号１６と１８、及び配列番号１６と１９である。すなわち、プライマーを組み合わせて用いることで、試料中の全ての細菌の遺伝子において、両プライマー間で増幅反応がおき、これを検出、定量することができる。
【００２９】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供し、ＰＣＲ産物の蛍光強度をイメージアナライザ等を用いて数値化し、定量することも可能であるが、精度に限界があるため、リアルタイムＰＣＲ法を用いることが望ましい。
【００３０】
リアルタイムＰＣＲ法は、サーマルサイクラーと蛍光光度計を一体化した機器、例えばＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製のＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ Ｏｐｔｉｃｏｎ（商標）を用いて行うことができる。リアルタイムＰＣＲにより、ＰＣＲ産物の生成量をリアルタイムで検出可能となる。ＰＣＲ産物はＳＹＢＥＲ（商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉ等の蛍光色素で標識されるため、正確な定量が可能になり、本発明に適する。
【００３１】
ＰＣＲ反応条件の例は、９５℃１５分を１サイクルの後、９４℃１５秒、６０℃１５秒及び７２℃３０秒を３０サイクル行い、最後に５０〜９５℃で１℃刻みに蛍光測定を１サイクル行うことを含む手順からなる。
【００３２】
以下にＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ Ｏｐｔｉｃｏｎと、本装置に最適化されたＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社製ＤｙＮＡｍｏ（商標）ＨＳ ＳＹＢＥＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ ｋｉｔ（ＰＣＲ反応溶液キット）を用いたリアルタイムＰＣＲの手順を説明する。
【００３３】
まず鋳型となる試料由来のＤＮＡを、ＰＣＲ反応用９６ウエルプレートに１μｌ入れる。このときのＤＮＡ濃度は１ｎｇ／μｌ〜１０ｎｇ／μｌとなるようにする。次に、本発明で用いるプライマー（例えば、配列番号４および６）をそれぞれ１μｌ入れる。プライマーの濃度は１〜５０μＭが望ましい。次に、滅菌した超純水を７μｌ加える。次に、本キットの酵素溶液を１０μｌ加え、ＰＣＲ反応用９６ウエルプレートに蓋をする。これを２０００ｒｐｍで１０〜２０秒遠心後、ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ Ｏｐｔｉｃｏｎにセットし、リアルタイムＰＣＲを行う。ＤＮＡのコピー数を算出するための検量線には、あらかじめＣＦＵを測定した任意の菌体（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）培養液から抽出したＤＮＡ溶液を検量線として用いることができる他、任意の菌体（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）培養液からＤＮＡを抽出し、そのＤＮＡを鋳型として、本発明で用いるプライマー（例えば、配列番号５および８）を用いてＰＣＲ反応を行ったＰＣＲ産物を精製し、そのＤＮＡ濃度からコピー数を算出した物を検量線として用いてもよい。ＰＣＲ産物の定量、解析は、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製Ｏｐｔｉｃｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒを用いて行うことができる。
【００３４】
次に、総菌数測定キットの例を以下に説明する。
キットに用いるＰＣＲチューブは、一度に多検体の解析が可能なように、９６ウエルプレートや３８４ウエルプレートなどを用いることが望ましい。また、使用頻度に応じて列毎にチューブを切り離して使うことができるように、ストリップウェルを用いることがより望ましい。キットに付属する試薬としては、ＤＮＡポリメラーゼ、ＳＹＢＥＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ、本発明で用いるプライマー（例えば、配列番号５および８）、検量線ＤＮＡがあり、このうちＤＮＡポリメラーゼ、ＳＹＢＥＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ、プライマーは、あらかじめＰＣＲ反応に最適な濃度に調製したものが望ましい。このキットにより、試料から抽出したＤＮＡを反応プレートのウエルに入れ、キットに付属の試薬を所定量添加し、ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ Ｏｐｔｉｃｏｎ等の装置を用いて定量ＰＣＲを行うことで、総菌数の測定を行うことができる。
【００３５】
このように、本発明方法による細菌叢の解析として、試料中の細菌叢における総菌数の決定が挙げられる。従来、総菌数の測定には直接検鏡法やＤＡＰＩ染色法が用いられているが、多くの時間を要する、操作が煩雑であるなどの欠点があったが、本発明方法によってこのような欠点が克服できる。具体的には、総菌数は、増幅産物ＤＮＡを精製し、所定濃度の精製ＤＮＡについて２６０ｎｍの吸光度を測定し、所定量の増幅産物ＤＮＡあたりのコピー数を決定することを含む手段によって決定されうる。測定に先立ち予め、ＰＣＲ反応のサイクル数とＤＮＡ濃度の対数値とをプロットし検量線を作成しておく。
【００３６】
或いは、本発明方法による細菌叢の解析として、試料中の個々の属もしくは種の細菌の占有率を決定することを挙げることができる。本発明により総菌数が容易に決定できるため、個々の属もしくは種の細菌数が全細菌数に占めるパーセンテージを決定することができる。占有率は、例えば、試料中の特定の属もしくは種の細菌に特異的な１６ＳｒＲＮＡ配列由来のＰＣＲプライマーを用いて得られた所定量の増幅産物ＤＮＡあたりのコピー数を決定し、試料中の全細菌の増幅産物ＤＮＡあたりのコピー数に対する該特定の属の細菌のコピー数のパーセンテージを算出することを含む手段によって決定されうる。特定の属もしくは種の細菌に特異的な１６ＳｒＲＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋなどのデータバンクに登録された配列情報から入手してもよいし、或いは文献等から入手してもよい。
【００３７】
本発明はさらに、配列番号１〜７に示される塩基配列の１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、さらに好ましくは１５〜３０塩基、最も好ましくは１５〜２５塩基の配列又はそれらの相補的配列を含むＰＣＲプライマーの少なくとも１つを含むことを特徴とする、細菌叢を解析するためのキットを提供する。
【００３８】
ＰＣＲプライマーの具体例は、非限定的に、配列番号８〜１９に示される塩基配列又はその相補的配列からなるプライマーである。これらのプライマーの少なくとも１つ、望ましくは少なくとも２つをキット中に含む。プライマーの組み合わせは、センス鎖配列とアンチセンス鎖配列との組み合わせであり、例えば配列番号８と１１、配列番号９と１１、配列番号１０と１３、配列番号１２と１５、配列番号１４と１７、配列番号１６と１８、又は配列番号１６と１９であるが、これらに限定されない。プライマーを配置する、センス鎖とアンチセンス鎖との間の距離は、一般に、短い方が好ましく、またＧＣ含量などの影響を受けにくいことが望ましい。
【００３９】
本発明のキットは、上記プライマーを用いるリアルタイムＰＣＲによってＰＣＲ産物を定量し、細菌叢を解析するためのものであり、具体的には、試料中の細菌叢における総菌数を決定する、及び／又は試料中の個々の属もしくは種の細菌の占有率を決定するためのものである。
【００４０】
本発明のキットにはさらに、ＰＣＲ反応を行うための試薬、例えば耐熱性ポリメラーゼ、緩衝液などを含むことができる。さらにまた、本発明のキットは、試料からＤＮＡを抽出するための試薬（例えばＩＳＯＰＬＡＮＴ（ニッポンジーン社））をさらに含むことができる。
【００４１】
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれにより限定されるものではない。
【実施例】
【００４２】
＜菌種間における増幅効率の比較方法＞
まず、種々の細菌のＤＮＡを鋳型とし、配列番号８〜１９のプライマーを用いて定量ＰＣＲを行い、菌種間における増幅効率を比較する方法を示す。
【００４３】
測定に用いる細菌は、ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）やＪＣＭ（Japan Collection of Microorganisms）から入手し、所定の培養法に従って培養した。
【００４４】
培養した菌体からのＤＮＡの抽出には、ベンジルクロライド法を応用したキット（ＩＳＯＰＬＡＮＴ、ニッポンジーン社製）を用いた。抽出したＤＮＡは、２６０ｎｍの吸光度から濃度を測定後、ＴＥ ｂｕｆｆｅｒ（10mM Tris-HCl (pH 8.0), 1mM EDTA）を用いて適宜希釈し、希釈系列を作製した。
【００４５】
リアルタイムＰＣＲの反応は、ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社製ＤｙＮＡｍｏ ＨＳ ＳＹＢＥＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ ｋｉｔを用いた。ＰＣＲ反応液の組成は、菌体から抽出したＤＮＡ希釈液１μｌ、５μＭに調製したプライマーをそれぞれ１μｌ、超純水７μｌ、キットに付属のＰＣＲ反応バッファー１０μｌを加え、２０μｌとした。ＰＣＲ反応条件は、ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ Ｏｐｔｉｃｏｎ で９５℃、１５分を１サイクル、９４℃で１５秒、６０℃で１５秒、７２℃で３０秒、７５℃で蛍光測定を３０サイクル、５０℃〜９５℃で１℃刻みに蛍光測定を１サイクル行った。データ解析はＯｐｔｉｃｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒを使用した。
【００４６】
菌種間での増幅効率は、次のようにして求める。すなわち、増幅が指数関数的に起こる領域で一定の増幅産物量になるときのＰＣＲ反応のサイクル数（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ：Ｃｔ値）をｘ軸に、ＤＮＡ濃度の対数値をｙ軸にプロットし、検量線を作成する。検量線の傾きをａ、ＰＣＲ効率をＥとするとき、Ｅは次式で表すことができる。
Ｅ＝１０−ａ
代表的な細菌のＤＮＡを用いたときのＰＣＲ効率を表１に示す。
【００４７】
【表１】
【００４８】
表１に示したプライマーの組み合わせにおいて、菌種間における増幅効率に大きな差は認められなかった。
【００４９】
次に、本発明の有効性を確認するため、以下の実験を行った。
＜実施例１＞
本発明の細菌叢の解析方法を用いて、健常成人における腸内細菌叢における、総菌数に対するBifidobacterium属の占有率を解析した。
【００５０】
＜糞便からのＤＮＡ調製＞
糞便からのＤＮＡ調製には、Ｑｕａｇｅｎ社製 ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｓｔｏｏｌ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを用いた。健常成人３名の糞便約２００ｍｇから、約１５μｇのＤＮＡを得た。
【００５１】
＜総菌数測定用検量線ＤＮＡの調製＞
総菌数測定用の検量線ＤＮＡは、Escherichia coli菌体より抽出したＤＮＡを用いて調製した。菌体からのＤＮＡの抽出は、先に述べた方法と同様、ＩＳＯＰＬＡＮＴ（ニッポンジーン社製）を用いた。抽出したＤＮＡをテンプレートとして用い、配列番号５および８のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲの反応は、ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社製ＤｙＮＡｍｏ ＨＳ ＳＹＢＥＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ ｋｉｔを用いた。ＰＣＲ反応液の組成は、菌体から抽出したＤＮＡ希釈液１μｌ、５μＭに調製したプライマーをそれぞれ１μｌ、超純水７μｌ、キットに付属のＰＣＲ反応バッファー１０μｌを加え、２０μｌとした。ＰＣＲ反応条件は、ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ Ｏｐｔｉｃｏｎ で９５℃、１５分を１サイクル、９４℃で１５秒、６０℃で１５秒、７２℃で３０秒、７５℃で蛍光測定を３０サイクル、７２℃で７分を１サイクル行い、終了後は４℃で維持した。
【００５２】
得られた増幅産物は１％アガロースゲルを用いて電気泳動に供し、ＳＹＢＥＲ ＧＲＥＥＮ Ｉで染色後、増幅産物のバンドを確認した。このバンドをカッターナイフで切り出し、Ｍｏｎｔａｇｅ ＤＮＡ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いてＰＣＲ増幅産物ＤＮＡを精製した。精製したＤＮＡは、２６０ｎｍの吸光度を測定し、次式によって増幅産物ＤＮＡ１μｌあたりのコピー数を算出した。２６０ｎｍの吸光度をＡ、増幅産物の分子量をＷ、アボガドロ定数を６．０３×１０２３ ｍｏｌ -１とすると、検量線ＤＮＡのコピー数Ｃ（ｃｏｐｉｅｓ／μｌ）は、下式で表すことができる。
Ｃ＝Ａ×５０÷Ｗ×６．０３×１０１４
尚、大腸菌における増幅産物の分子量は１７８３５２ｇ／ｍｏｌである。
【００５３】
＜Bifidobacterium属菌数測定用検量線ＤＮＡの調製＞
Bifidobacterium属測定用の検量線ＤＮＡは、Bifidobacterium adolescentis菌体より抽出したＤＮＡを用いて調製した。菌体からのＤＮＡの抽出は、先に述べた方法と同様、ＩＳＯＰＬＡＮＴ（ニッポンジーン社製）を用いた。抽出したＤＮＡをテンプレートとして用い、配列番号２０および２１のプライマー（非特許文献７参照）を用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲの反応は、ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社製ＤｙＮＡｍｏ ＨＳ ＳＹＢＥＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ ｋｉｔを用いた。ＰＣＲ反応液の組成は、菌体から抽出したＤＮＡ希釈液１μｌ、５μＭに調製したプライマーをそれぞれ１μｌ、超純水７μｌ、キットに付属のＰＣＲ反応バッファー１０μｌを加え、２０μｌとした。ＰＣＲ反応条件は、ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ Ｏｐｔｉｃｏｎ で９５℃、１５分を１サイクル、９４℃で１５秒、５０℃で１５秒、７２℃で６０秒、７５℃で蛍光測定を３０サイクル、７２℃で７分を１サイクル行い、終了後は４℃で維持した。
【００５４】
得られた増幅産物は１％アガロースゲルを用いて電気泳動に供し、ＳＹＢＥＲ ＧＲＥＥＮ Ｉで染色後、増幅産物のバンドを確認した。このバンドをカッターナイフで切り出し、Ｍｏｎｔａｇｅ ＤＮＡ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いてＰＣＲ増幅産物ＤＮＡを精製した。精製したＤＮＡは、２６０ｎｍの吸光度を測定し、次式によって増幅産物ＤＮＡ１μｌあたりのコピー数を算出した。２６０ｎｍの吸光度をＡ、増幅産物の塩基数をＷ、アボガドロ定数を６．０×１０２３ ｍｏｌ -１とすると、検量線ＤＮＡのコピー数Ｃ（ｃｏｐｉｅｓ／μｌ）は、下式で表すことができる。
Ｃ＝Ａ×５０÷Ｗ×６．０３×１０１４
尚、Bifidobacterium adolescentisにおける増幅産物の分子量は３４０７９２ｇ／ｍｏｌである。
【００５５】
＜定量ＰＣＲによる総菌数におけるBifidobacterium属の占有率の測定＞
定量ＰＣＲは、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製のＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ Ｏｐｔｉｃｏｎと、本装置に最適化されたＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社製ＤｙＮＡｍｏ ＨＳ ＳＹＢＥＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ ｋｉｔを使用した。ＰＣＲ産物の定量、解析はＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製Ｏｐｔｉｃｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒを用いた。
【００５６】
総菌数の測定には配列番号５および８のプライマーを用い、Bifidobacterium属の測定には配列番号２０および２１のプライマーを用いた。ＰＣＲ反応液の組成は、糞便から抽出したＤＮＡ溶液１μｌ、５μＭに調製したプライマーをそれぞれ１μｌ、超純水７μｌ、キットに付属のＰＣＲ反応バッファー１０μｌを加え、２０μｌとした。ＰＣＲ反応条件は、総菌数の測定においては、９５℃、１５分を１サイクル、９４℃で１５秒、６０℃で１５秒、７２℃で３０秒、７５℃で蛍光測定を３０サイクル、５０℃〜９５℃で１℃刻みに蛍光測定を１サイクル行った。Bifidobacterium属の測定においては、９５℃、１５分を１サイクル、９４℃で１５秒、５０℃で１５秒、７２℃で６０秒、７５℃で蛍光測定を３０サイクル、５０℃〜９５℃で１℃刻みに蛍光測定を１サイクル行った。
【００５７】
尚、配列番号５および８のプライマーを用いた時の増幅領域を領域Ａ、配列番号２０および２１のプライマーを用いたときの増幅領域を領域Ｂとする。それぞれのＰＣＲ反応において、先に作成した検量線用ＤＮＡのコピー数とＣｔ値から検量線を作成し、糞便から抽出したＤＮＡ１μｌあたりに含まれる、領域ＡおよびＢのコピー数を算出した。総菌数におけるBifidobacterium属の占有率は、次式によって表すことができる。
Bifidobacterium属の占有率＝領域Ｂのコピー数／領域Ａのコピー数×１００（％）
【００５８】
上式によって算出した被検者３名の糞便中細菌におけるBifidobacterium属の占有率は以下のようになった。
（結果）
被検者１ ４％
被検者２ ６％
被検者３ １２％
尚、本方法による解析に要した時間は、約４時間であった。この時間は、従来公知の方法より短い。
【００５９】
＜比較例１＞
培養法を用いて、健常成人における腸内細菌叢における、総菌数に対するBifidobacterium属の占有率を解析した。
【００６０】
＜非選択培地による総菌数の測定＞
全ての細菌を培養しうる培地は未だ存在しないが、糞便中の優勢菌群の菌数測定によく用いられるＭ１０培地を使用した。糞便の希釈には光岡の希釈液を用いた。糞便の希釈、培地への塗沫、３７℃での培養はすべて嫌気グローブボックス（フォーマ社製）内で行った。測定に用いた献体は、実施例１でＤＮＡを抽出した同じ被検者の、同じ検体を用いた。本方法による、各被検者の糞便１ｇあたりの菌数（ＣＦＵ）は以下のようになった。
（測定結果）
被検者１ １．９２×１０１２
被検者２ ８．２６×１０１１
被検者３ ５．５６×１０１２
【００６１】
＜選択培地によるBifidobacterium属の測定＞
Bifidobacterium属細菌の培養は、ＢＳ寒天培地（日水製薬社製）を用いた。総菌数と同様、糞便の希釈には光岡の希釈液を用いた。糞便の希釈、培地への塗沫、３７℃での培養はすべて嫌気グローブボックス（フォーマ社製）内で行った。測定に用いた献体は、実施例１でＤＮＡを抽出した同じ被検者の、同じ検体を用いた。本方法による、各被検者の糞便１ｇあたりの菌数（ＣＦＵ）は以下のようになった。
（測定結果）
被検者１ １．５２×１０１１
被検者２ １．１８×１０１１
被検者３ ７．７６×１０１１
以上の結果より、培養法によって算出した被検者３名の糞便中細菌におけるBifidobacterium属の占有率は以下のようになった。
（測定結果）
被検者１ ７．９％
被検者２ １４．２％
被検者３ １２％
尚、本方法による解析に要した時間は、３日間であった。
【００６２】
以上の結果より、実施例１の方法による分析は、比較例１の方法と比較して短時間で行うことができた。また、実施例１によるBifidobacterium属の占有率は比較例１と比較して低くなる傾向が見られた。これは、実施例１の方法において、比較例１では検出し得ない細菌を検出しているため、総菌数としての分母が大きくなっていると考えられ、より正確な腸内細菌叢の解析を行うことが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明により、定量ＰＣＲ法を利用する試料中の細菌叢の総菌数を、細菌種や細菌属の菌数と同様に、簡便に測定することが可能になるため、細菌叢の解析のために産業上有用である。例えば、土壌の栄養改善、腸内細菌と疾患との関係、発酵食品の乳酸菌の割合などの調査に使用可能である。
【配列表フリーテキスト】
【００６４】
配列番号１: 細菌16SrRNA由来の共通配列
配列番号２: 細菌16SrRNA由来の共通配列
配列番号３: 細菌16SrRNA由来の共通配列
配列番号４: 細菌16SrRNA由来の共通配列
配列番号５: 細菌16SrRNA由来の共通配列
配列番号６: 細菌16SrRNA由来の共通配列
配列番号７: 細菌16SrRNA由来の共通配列
配列番号８: プライマー
配列番号９: プライマー
配列番号10: プライマー
配列番号11: プライマー
配列番号12: プライマー
配列番号13: プライマー
配列番号14: プライマー
配列番号15: プライマー
配列番号16: プライマー
配列番号17: プライマー
配列番号18: プライマー
配列番号19: プライマー
【技術分野】
【０００１】
本発明はＰＣＲプライマーを用いて試料中の細菌叢を解析するための方法及びキットに関し、具体的には、試料中の細菌叢における総菌数、或いは特定の細菌種又は細菌属の占有率を正確に測定し得ることを特徴とする、医療、食品および環境などの分野で有用な、細菌叢を解析するための方法およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医療、食品および環境などの分野において、細菌叢を解析し、制御することが重要視されてきている。細菌叢を構成する細菌は多種多様であり、複雑な生態系を形成している。特に医療、食品分野では、ヒトの消化管における細菌叢、例えば大腸内細菌叢は古くから解析が行われており、生理学上有用な細菌群は、必須ビタミンの合成、病原性細菌の腸管上皮細胞への定着阻止、腸管上皮細胞の増殖因子である酪酸などの単鎖脂肪酸の合成、および免疫賦活などの機能を持ついわゆる善玉菌と、食物成分や生体成分を代謝し、ニトロソアミン、インドール、二次胆汁酸等の発癌性物質を生産する悪玉菌とに二分される。乳酸菌やビフィズス菌などのプロバイオティクスや、オリゴ糖などのプロバイオティクスを含む食品によって善玉菌と悪玉菌のバランスをコントロールし、便秘の改善や様々な生活習慣病を予防する試みが数多くなされており、これらの食品による腸内細菌叢の変化を解析することが重要視されている（非特許文献１参照）。腸内細菌叢の制御はヒトのみならず愛玩動物、家畜などの動物の健康維持（非特許文献２参照）や、養殖漁業における感染防御（非特許文献３参照）においても重要な因子として認識されつつある。
【０００３】
食品産業分野では、発酵食品の製造過程における発酵槽内の細菌叢のモニタリングや、食品の品質や腐敗を防ぐ微生物制御においても、細菌叢の解析が重要視されている（非特許文献４参照）。
【０００４】
また、環境分野においては、汚染土壌の浄化に微生物を用いるバイオレメディエーション法、バイオスティミュレーション法、バイオオーギュメンテーション法などが用いられているが、土壌細菌叢をモニタリングすることで、土壌への栄養素や空気の注入のタイミングを最適化し、処理時間を短縮し、コストを低減する試みがなされている（非特許文献５参照）。
【０００５】
細菌叢の解析手法としては、これまで細菌を単離・同定する培養法が用いられてきた（非特許文献１参照）。しかし、培養法は、人工の栄養培地を用いる為、実際の細菌叢の生態系と比較して微生物の成育に選択がかかることや、腸内細菌や土壌細菌は一般的に高度な嫌気的環境が必要であること、更に操作が煩雑で多大な時間を費やすこと等、精度、定量性、簡便性の面で多くの問題を残している（非特許文献６参照）。
【０００６】
近年、分子生物学の発展に伴い、微生物の１６ＳｒＲＮＡの塩基配列が微生物の系統解析に用いられ、多くの情報が蓄積されてきている。この塩基配列を比較することによって、菌属、菌種特異的なプローブやプライマーが設計され、これらを応用した培養法に代わる細菌叢の解析方法が提案されている。特に、ＦＩＳＨ法、クローンライブラリー法、ＤＧＧＥ法、Ｔ−ＲＦＬＰ法、定量ＰＣＲ法は、煩雑な培養操作無しで細菌叢を解析できる方法として多くの研究に用いられている（非特許文献６参照）。
【０００７】
このうち定量ＰＣＲ法は、現在培養可能な細菌を菌種、および菌属特異的に、更に定量的に検出するための手法として有効であり、培養法の代替として用いられている。しかし、定量ＰＣＲ法では、定量した細菌属や細菌種の、細菌叢における占有率を算出する上での分母となる総菌数の定量方法が確立されておらず、総菌数を測定するために、直接検鏡法やＤＡＰＩ染色法が用いられているのが現状である（非特許文献６参照）。直接検鏡法やＤＡＰＩ染色法は操作に時間を要し、特にＤＡＰＩ法では煩雑な操作も必要である為、多検体の分析には不向きである。そのため、定量ＰＣＲ法によって、細菌属や細菌種と同様に総菌数を測定する方法の確立、およびキットの開発が望まれていた。
【０００８】
【非特許文献１】「ビフィズス菌の研究」、光岡知足編著、日本ビフィズス菌センター出版
【非特許文献２】Journal of Applied Microbiology誌、2002年、10月号、640〜646頁
【非特許文献３】「魚類腸内細菌の生産する抗病因子に関する研究」、文部省科学研究費補助金研究成果報告書、1997〜1999年
【非特許文献４】日本食品微生物学会誌、2004年、第21巻、第3号、187〜192頁
【非特許文献５】「バイオレメディエーションの基礎と実際」、児玉徹監修、シーエムシー出版
【非特許文献６】「腸内フローラシンポジウム10 21世紀腸内フローラ研究の新しい動向」、光岡知足編、学会出版センター
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、定量ＰＣＲ法によって、試料中の細菌叢の解析、より具体的には総菌数の測定或いは試料中の特定の細菌属又は細菌種の全細菌に占める占有率の測定、のための方法、並びに該方法に使用するためのキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意研究した結果、特定のＰＣＲプライマーを用いる定量ＰＣＲ法によって、細菌属又は細菌種と同様に全細菌の総菌数を測定する方法を見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１１】
したがって、本発明は以下の特徴を有する。
本発明は、第１の態様において、試料から抽出した細菌のＤＮＡ又はその一部を、配列番号１〜７に示される塩基配列（ここで、y, m, r, s, d, n, h, v, kまたはbで表される塩基は、特許庁編「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（平成14年7月）に規定される塩基の他に、イノシン(i)でもよい）の１０塩基以上の配列又はそれらの相補的配列を含むＰＣＲプライマーの少なくとも１つを用いて増幅する工程、増幅したＤＮＡ断片を定量する工程、および定量結果に基づいて細菌叢を分析する工程を含むことを特徴とする細菌叢の解析方法を提供する。
【００１２】
その一の実施形態において、本発明の方法は、試料中の細菌叢における総菌数を決定する。より具体的には、総菌数は、増幅産物ＤＮＡを精製し、所定濃度の精製ＤＮＡについて２６０ｎｍの吸光度を測定し、所定量の増幅産物ＤＮＡあたりのコピー数を決定することを含む手段によって決定される。
【００１３】
或いは、本発明の方法は、試料中の個々の属もしくは種の細菌の占有率を決定することを特徴とする。より具体的には、占有率は、試料中の特定の属もしくは種の細菌に特異的な１６ＳｒＲＮＡ配列由来のＰＣＲプライマーを用いて得られた所定量の増幅産物ＤＮＡあたりのコピー数を決定し、試料中の全細菌の増幅産物ＤＮＡあたりのコピー数に対する該特定の属の細菌のコピー数のパーセンテージを算出することを含む手段によって決定される。
【００１４】
別の実施形態により、本発明の方法で使用可能なＰＣＲプライマーは、例えば配列番号８〜１９に示される塩基配列又はその相補的配列からなる。これらのＰＣＲプライマーの組み合わせの例は、配列番号８と１１、配列番号９と１１、配列番号１０と１３、配列番号１２と１５、配列番号１４と１７、配列番号１６と１８、及び配列番号１６と１９からなる群から選択される配列の組み合わせである。
【００１５】
別の実施形態により、ＰＣＲ増幅産物は、リアルタイムＰＣＲによって定量される。
別の実施形態により、試料は、例えば食品、生体試料、環境試料、及び工業プロセスからの試料を含む。より具体的には、試料は、例えば活性汚泥、土壌、河川水、海水、温泉水、飲料水、加工食品、発酵槽培養物、並びに、ヒトを含む哺乳類や他の真核生物の組織、細胞または体液からなる群から選択される。
【００１６】
本発明はまた、第２の態様において、配列番号１〜７に示される塩基配列（ここで、y, m, r, s, d, n, h, v, kまたはbで表される塩基は、特許庁編「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（平成14年7月）に規定される塩基の他に、イノシン(i)でもよい）の１０塩基以上の配列又はそれらの相補的配列を含むＰＣＲプライマーの少なくとも１つを含むことを特徴とする、細菌叢を解析するためのキットを提供する。
【００１７】
その一の実施形態により、本発明のキットは、前記プライマーを用いるリアルタイムＰＣＲによってＰＣＲ産物を定量し、細菌叢を解析するためのものである。
【００１８】
或いは、本発明のキットは、試料中の細菌叢における総菌数を決定する、及び／又は試料中の個々の属もしくは種の細菌の占有率を決定するためのものである。
【００１９】
別の実施形態により、ＰＣＲプライマーが、配列番号８〜１９に示される塩基配列又はその相補的配列からなることを特徴とする。これらのＰＣＲプライマーの組み合わせの例は、配列番号８と１１、配列番号９と１１、配列番号１０と１３、配列番号１２と１５、配列番号１４と１７、配列番号１６と１８、及び配列番号１６と１９からなる群から選択される配列の組み合わせである。
【００２０】
別の実施形態により、本発明のキットは、ＰＣＲ反応を行うための試薬をさらに含むことができる。
【００２１】
別の実施形態により、本発明のキットは、試料からＤＮＡを調製または抽出するための試薬をさらに含むことができる。
【発明の効果】
【００２２】
本発明により、操作に多くの時間を要する、煩雑であるなどの従来の測定法に代わる、細菌叢中の総菌数の新規定量法が提供される。この方法は、例えば９６ウエルプレートなどの複数ウエルからなる固相を利用した測定を可能とするため、一度に多数の試料を測定することができるし、また従来よりも短い時間での測定を可能にするし、測定における細菌属や細菌種間の増幅効率のバラツキが非常に少ない、という利点がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明について詳述する。
本発明は、試料から抽出した細菌のＤＮＡ又はその一部を、配列番号１〜７に示される塩基配列の１０塩基以上の配列又はそれらの相補的配列を含むＰＣＲプライマーの少なくとも１つを用いて増幅する工程、増幅したＤＮＡ断片を定量する工程、および定量結果に基づいて細菌叢を分析する工程を含むことを特徴とする細菌叢の解析方法を提供する。
【００２４】
本発明の方法で使用される試料は、液体、固体、半固体、気体などのいずれでもよいが、水を溶媒もしくは分散媒として含む任意の水性試料が望ましい。水分を含まない試料においては、ＴＥ緩衝液のような緩衝液に懸濁し、完全に溶解、もしくは均一に分散させて試料として供することもできる。また、気相における細菌叢の解析に本発明の方法を用いる場合は、一定体積の気相をエアフィルターに通し、フィルターに付着した細菌を緩衝液で洗浄し、その洗浄液を試料として供することも可能である。
【００２５】
試料は、細菌が含有すると推定されるいずれのものでもよく特に制限されない。試料には、例えば食品、生体試料、環境試料、及び工業プロセスからの試料を含むことができる。具体的には、試料の例は、活性汚泥、土壌、井戸水、地下水、下水、河川水、海水、温泉水、飲料水、加工食品、発酵食品、野菜、肉、鶏卵などの食品、発酵槽培養物、並びに、ヒトを含む動物（哺乳類、鳥類、魚類など）や植物からの組織、細胞または体液、例えば動物の消化管内物質、皮膚、粘膜、糞便、尿、血液、血漿、血清、乳、唾液、汗、粘液など、を含む。これらを適宜、水またはＴＥ 緩衝液のような緩衝液に懸濁し、均一とした物を試料として供する。
【００２６】
検出・定量対象となる細菌の例としては、以下の分類のいずれかに属する細菌が挙げられる。
Aquificaceae、Thermotogaceae、Thermodesulfobacteriaceae、Deinococcaceae、Thermaceae、Chrysiogenaceae、Chloroflexaceae、Herpetosiphonaceae、Thermomicrobiaceae、Nitrospiraceae、Deferribacteraceae、Cyanobacteria、Chlorobiaceae、Rhodospirillaceae、Acetobacteraceae、Rickettsiaceae、Anaplasmataceae、Rhodobacteraceae、Sphingomonadaceae、Caulobacteraceae、Rhizobiaceae、Bartonellaceae、Brucellaceae、Phyllobacteriaceae、Methylocystaceae、Beijerinckiaceae、Bradyrhizobiaceae、Hyphomicrobiaceae、Methylobacteriaceae、Rhodobiaceae、Parvularculaceae、Burkholderiaceae、Oxalobacteraceae、Alcaligenaceae、Comamonadaceae、Incertae、sedis、Hydrogenophilaceae、Methylophilaceae、Neisseriaceae、Nitrosomonadaceae、Rhodocyclales、Acidithiobacillaceae、Piscirickettsiaceae、Thiotrichaceae、Francisellaceae、Chromatiaceae、Ectothiorhodospiraceae、Xanthomonadaceae、Cardiobacteriaceae、Legionellaceae、Coxiellaceae、Methylococcaceae、Oceanospirillaceae、Alcanivoraceae、Hahellaceae、Halomonadaceae、Saccharospirillaceae、Pseudomonadaceae、Moraxellaceae、Aeromonadaceae、Succinivibrionaceae、Alteromonadaceae、Vibrionaceae、Enterobacteriaceae、Pasteurellaceae、Desulfurellaceae、Desulfovibrionaceae、Desulfomicrobiaceae、Desulfohalobiaceae、Desulfobacteraceae、Desulfobulbaceae、Nitrospinaceae、Desulfuromonaceae、Geobacteraceae、Syntrophobacteraceae、Syntrophaceae、Cystobacteraceae、Myxococcaceae、Polyangiaceae、Nannocystaceae、Haliangiaceae、Campylobacteraceae、Helicobacteraceae、Clostridiaceae、Lachnospiraceae、Peptostreptococcaceae、Eubacteriaceae、Peptococcaceae、Heliobacteriaceae、Acidaminococcaceae、Syntrophomonadaceae、Halanaerobiaceae、Halobacteroidaceae、Thermoanaerobacteriaceae、Mycoplasmataceae、Entomoplasmataceae、Spiroplasmataceae、Acholeplasmataceae、Erysipelotrichaceae、Bacillaceae、Alicyclobacillaceae、Caryophanaceae、Listeriaceae、Paenibacillaceae、Planococcaceae、Sporolactobacillaceae、Staphylococcaceae、Thermoactinomycetaceae、Lactobacillaceae、Aerococcaceae、Carnobacteriaceae、Enterococcaceae、Leuconostocaceae、Streptococcaceae、Caldithraceae、Acidimicrobiaceae、Rubrobacteraceae、Coriobacteriaceaefamily、Actinomycetaceae、Micrococcaceae、Bogoriellaceae、Rarobacteraceae、Sanguibacteraceae、Brevibacteriaceae、Cellulomonadaceae、Dermabacteraceae、Dermatophilaceae、Dermacoccaceae、Intrasporangiaceae、Jonesiaceae、Microbacteriaceae、Beutenbergiaceae、Promicromonosporaceae、Corynebacteriaceae、Dietziaceae、Gordoniaceae、Mycobacteriaceae、Nocardiaceae、Tsukamurellaceae、Williamsiaceae、Micromonosporaceae、Propionibacteriaceae、Nocardioidaceae、Pseudonocardiaceae、Actinosynnemataceae、Streptomycetaceae、Streptosporangiaceae、Nocardiopsaceae、Thermomonosporaceae、Frankiaceae、Geodermatophilaceae、Microsphaeraceae、Sporichthyaceae、Acidothermaceae、Kineosporiaceae、Glycomycetaceae、Bifidobacteriaceae、Planctomycetaceae、Chlamydiaceae、Parachlamydiaceae、Simkaniaceae、Waddliaceae、Spirochaetaceae、Serpulinaceae、Leptospiraceae、Fibrobacteraceae、Acidobacteriaceae、Bacteroidaceae、Rikenellaceae、Porphyromonadaceae、Prevotellaceae、Flavobacteriaceae、Blattabacteriaceae、Sphingobacteriaceae、Saprospiraceae、Flexibacteraceae、Flammeovirgaceae、Crenotrichaceae、Fusobacteriaceae、Verrucomicrobiaceae、Xiphinematobacteraceae、Verrucomicrobiaceae、Xiphinematobacteraceae、Dictyoglomaceae、Gemmatimonadales。
【００２７】
細菌を含む試料からＤＮＡを抽出する方法としては、Ｍａｒｍｕｒ法（J. Marmur, J. Mol. Biol. (1961) 3:208-218）、酵素法などのその改良法（G. Voordouw et al., Appln. Environ. Microbiol. (1991) 57:3070-3078）、ベンジルクロライド法（Nucleic Acids Res. (1993) 21:5279-5280）等の他、抽出する試料に応じて最適化された抽出キット（例えばＩＳＯＰＬＡＮＴ（商標、ニッポンジーン社））を用いてもよい。また、試料の懸濁液をそのままＰＣＲチューブに入れ、反応に供することもできる。その場合、試料中にＰＣＲ反応を阻害する物質があれば、あらかじめ適切な方法で除去しておくことが望ましい。
【００２８】
ＰＣＲ反応において、本発明のプライマーを組み合わせ、増幅反応を行うことでＰＣＲ産物を得ることができる。本発明で使用するプライマーは、配列番号１〜７に示される塩基配列において１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、さらに好ましくは１５〜３０塩基、最も好ましくは１５〜２５塩基、特に１５〜２０塩基の配列、又はそれらの相補的配列を含む。より具体的には、配列番号８〜１９に示される塩基配列からなるＰＣＲプライマーを使用することができる。これらのプライマー配列は、公知のすべての属の細菌の１６ＳｒＲＮＡ配列において９９％〜１００％の同一性を有する共通配列を調べ今回見出した配列に基づいている。本発明におけるＰＣＲ反応には、例えば配列番号１２と１５のプライマーというように、２種類のプライマーを１組として用いることが望ましい。例えばそのような組み合わせの例は、配列番号８と１１、配列番号９と１１、配列番号１０と１３、配列番号１２と１５、配列番号１４と１７、配列番号１６と１８、及び配列番号１６と１９である。すなわち、プライマーを組み合わせて用いることで、試料中の全ての細菌の遺伝子において、両プライマー間で増幅反応がおき、これを検出、定量することができる。
【００２９】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供し、ＰＣＲ産物の蛍光強度をイメージアナライザ等を用いて数値化し、定量することも可能であるが、精度に限界があるため、リアルタイムＰＣＲ法を用いることが望ましい。
【００３０】
リアルタイムＰＣＲ法は、サーマルサイクラーと蛍光光度計を一体化した機器、例えばＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製のＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ Ｏｐｔｉｃｏｎ（商標）を用いて行うことができる。リアルタイムＰＣＲにより、ＰＣＲ産物の生成量をリアルタイムで検出可能となる。ＰＣＲ産物はＳＹＢＥＲ（商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉ等の蛍光色素で標識されるため、正確な定量が可能になり、本発明に適する。
【００３１】
ＰＣＲ反応条件の例は、９５℃１５分を１サイクルの後、９４℃１５秒、６０℃１５秒及び７２℃３０秒を３０サイクル行い、最後に５０〜９５℃で１℃刻みに蛍光測定を１サイクル行うことを含む手順からなる。
【００３２】
以下にＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ Ｏｐｔｉｃｏｎと、本装置に最適化されたＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社製ＤｙＮＡｍｏ（商標）ＨＳ ＳＹＢＥＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ ｋｉｔ（ＰＣＲ反応溶液キット）を用いたリアルタイムＰＣＲの手順を説明する。
【００３３】
まず鋳型となる試料由来のＤＮＡを、ＰＣＲ反応用９６ウエルプレートに１μｌ入れる。このときのＤＮＡ濃度は１ｎｇ／μｌ〜１０ｎｇ／μｌとなるようにする。次に、本発明で用いるプライマー（例えば、配列番号４および６）をそれぞれ１μｌ入れる。プライマーの濃度は１〜５０μＭが望ましい。次に、滅菌した超純水を７μｌ加える。次に、本キットの酵素溶液を１０μｌ加え、ＰＣＲ反応用９６ウエルプレートに蓋をする。これを２０００ｒｐｍで１０〜２０秒遠心後、ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ Ｏｐｔｉｃｏｎにセットし、リアルタイムＰＣＲを行う。ＤＮＡのコピー数を算出するための検量線には、あらかじめＣＦＵを測定した任意の菌体（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）培養液から抽出したＤＮＡ溶液を検量線として用いることができる他、任意の菌体（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）培養液からＤＮＡを抽出し、そのＤＮＡを鋳型として、本発明で用いるプライマー（例えば、配列番号５および８）を用いてＰＣＲ反応を行ったＰＣＲ産物を精製し、そのＤＮＡ濃度からコピー数を算出した物を検量線として用いてもよい。ＰＣＲ産物の定量、解析は、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製Ｏｐｔｉｃｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒを用いて行うことができる。
【００３４】
次に、総菌数測定キットの例を以下に説明する。
キットに用いるＰＣＲチューブは、一度に多検体の解析が可能なように、９６ウエルプレートや３８４ウエルプレートなどを用いることが望ましい。また、使用頻度に応じて列毎にチューブを切り離して使うことができるように、ストリップウェルを用いることがより望ましい。キットに付属する試薬としては、ＤＮＡポリメラーゼ、ＳＹＢＥＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ、本発明で用いるプライマー（例えば、配列番号５および８）、検量線ＤＮＡがあり、このうちＤＮＡポリメラーゼ、ＳＹＢＥＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ、プライマーは、あらかじめＰＣＲ反応に最適な濃度に調製したものが望ましい。このキットにより、試料から抽出したＤＮＡを反応プレートのウエルに入れ、キットに付属の試薬を所定量添加し、ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ Ｏｐｔｉｃｏｎ等の装置を用いて定量ＰＣＲを行うことで、総菌数の測定を行うことができる。
【００３５】
このように、本発明方法による細菌叢の解析として、試料中の細菌叢における総菌数の決定が挙げられる。従来、総菌数の測定には直接検鏡法やＤＡＰＩ染色法が用いられているが、多くの時間を要する、操作が煩雑であるなどの欠点があったが、本発明方法によってこのような欠点が克服できる。具体的には、総菌数は、増幅産物ＤＮＡを精製し、所定濃度の精製ＤＮＡについて２６０ｎｍの吸光度を測定し、所定量の増幅産物ＤＮＡあたりのコピー数を決定することを含む手段によって決定されうる。測定に先立ち予め、ＰＣＲ反応のサイクル数とＤＮＡ濃度の対数値とをプロットし検量線を作成しておく。
【００３６】
或いは、本発明方法による細菌叢の解析として、試料中の個々の属もしくは種の細菌の占有率を決定することを挙げることができる。本発明により総菌数が容易に決定できるため、個々の属もしくは種の細菌数が全細菌数に占めるパーセンテージを決定することができる。占有率は、例えば、試料中の特定の属もしくは種の細菌に特異的な１６ＳｒＲＮＡ配列由来のＰＣＲプライマーを用いて得られた所定量の増幅産物ＤＮＡあたりのコピー数を決定し、試料中の全細菌の増幅産物ＤＮＡあたりのコピー数に対する該特定の属の細菌のコピー数のパーセンテージを算出することを含む手段によって決定されうる。特定の属もしくは種の細菌に特異的な１６ＳｒＲＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋなどのデータバンクに登録された配列情報から入手してもよいし、或いは文献等から入手してもよい。
【００３７】
本発明はさらに、配列番号１〜７に示される塩基配列の１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、さらに好ましくは１５〜３０塩基、最も好ましくは１５〜２５塩基の配列又はそれらの相補的配列を含むＰＣＲプライマーの少なくとも１つを含むことを特徴とする、細菌叢を解析するためのキットを提供する。
【００３８】
ＰＣＲプライマーの具体例は、非限定的に、配列番号８〜１９に示される塩基配列又はその相補的配列からなるプライマーである。これらのプライマーの少なくとも１つ、望ましくは少なくとも２つをキット中に含む。プライマーの組み合わせは、センス鎖配列とアンチセンス鎖配列との組み合わせであり、例えば配列番号８と１１、配列番号９と１１、配列番号１０と１３、配列番号１２と１５、配列番号１４と１７、配列番号１６と１８、又は配列番号１６と１９であるが、これらに限定されない。プライマーを配置する、センス鎖とアンチセンス鎖との間の距離は、一般に、短い方が好ましく、またＧＣ含量などの影響を受けにくいことが望ましい。
【００３９】
本発明のキットは、上記プライマーを用いるリアルタイムＰＣＲによってＰＣＲ産物を定量し、細菌叢を解析するためのものであり、具体的には、試料中の細菌叢における総菌数を決定する、及び／又は試料中の個々の属もしくは種の細菌の占有率を決定するためのものである。
【００４０】
本発明のキットにはさらに、ＰＣＲ反応を行うための試薬、例えば耐熱性ポリメラーゼ、緩衝液などを含むことができる。さらにまた、本発明のキットは、試料からＤＮＡを抽出するための試薬（例えばＩＳＯＰＬＡＮＴ（ニッポンジーン社））をさらに含むことができる。
【００４１】
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれにより限定されるものではない。
【実施例】
【００４２】
＜菌種間における増幅効率の比較方法＞
まず、種々の細菌のＤＮＡを鋳型とし、配列番号８〜１９のプライマーを用いて定量ＰＣＲを行い、菌種間における増幅効率を比較する方法を示す。
【００４３】
測定に用いる細菌は、ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）やＪＣＭ（Japan Collection of Microorganisms）から入手し、所定の培養法に従って培養した。
【００４４】
培養した菌体からのＤＮＡの抽出には、ベンジルクロライド法を応用したキット（ＩＳＯＰＬＡＮＴ、ニッポンジーン社製）を用いた。抽出したＤＮＡは、２６０ｎｍの吸光度から濃度を測定後、ＴＥ ｂｕｆｆｅｒ（10mM Tris-HCl (pH 8.0), 1mM EDTA）を用いて適宜希釈し、希釈系列を作製した。
【００４５】
リアルタイムＰＣＲの反応は、ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社製ＤｙＮＡｍｏ ＨＳ ＳＹＢＥＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ ｋｉｔを用いた。ＰＣＲ反応液の組成は、菌体から抽出したＤＮＡ希釈液１μｌ、５μＭに調製したプライマーをそれぞれ１μｌ、超純水７μｌ、キットに付属のＰＣＲ反応バッファー１０μｌを加え、２０μｌとした。ＰＣＲ反応条件は、ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ Ｏｐｔｉｃｏｎ で９５℃、１５分を１サイクル、９４℃で１５秒、６０℃で１５秒、７２℃で３０秒、７５℃で蛍光測定を３０サイクル、５０℃〜９５℃で１℃刻みに蛍光測定を１サイクル行った。データ解析はＯｐｔｉｃｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒを使用した。
【００４６】
菌種間での増幅効率は、次のようにして求める。すなわち、増幅が指数関数的に起こる領域で一定の増幅産物量になるときのＰＣＲ反応のサイクル数（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ：Ｃｔ値）をｘ軸に、ＤＮＡ濃度の対数値をｙ軸にプロットし、検量線を作成する。検量線の傾きをａ、ＰＣＲ効率をＥとするとき、Ｅは次式で表すことができる。
Ｅ＝１０−ａ
代表的な細菌のＤＮＡを用いたときのＰＣＲ効率を表１に示す。
【００４７】
【表１】
【００４８】
表１に示したプライマーの組み合わせにおいて、菌種間における増幅効率に大きな差は認められなかった。
【００４９】
次に、本発明の有効性を確認するため、以下の実験を行った。
＜実施例１＞
本発明の細菌叢の解析方法を用いて、健常成人における腸内細菌叢における、総菌数に対するBifidobacterium属の占有率を解析した。
【００５０】
＜糞便からのＤＮＡ調製＞
糞便からのＤＮＡ調製には、Ｑｕａｇｅｎ社製 ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｓｔｏｏｌ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを用いた。健常成人３名の糞便約２００ｍｇから、約１５μｇのＤＮＡを得た。
【００５１】
＜総菌数測定用検量線ＤＮＡの調製＞
総菌数測定用の検量線ＤＮＡは、Escherichia coli菌体より抽出したＤＮＡを用いて調製した。菌体からのＤＮＡの抽出は、先に述べた方法と同様、ＩＳＯＰＬＡＮＴ（ニッポンジーン社製）を用いた。抽出したＤＮＡをテンプレートとして用い、配列番号５および８のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲの反応は、ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社製ＤｙＮＡｍｏ ＨＳ ＳＹＢＥＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ ｋｉｔを用いた。ＰＣＲ反応液の組成は、菌体から抽出したＤＮＡ希釈液１μｌ、５μＭに調製したプライマーをそれぞれ１μｌ、超純水７μｌ、キットに付属のＰＣＲ反応バッファー１０μｌを加え、２０μｌとした。ＰＣＲ反応条件は、ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ Ｏｐｔｉｃｏｎ で９５℃、１５分を１サイクル、９４℃で１５秒、６０℃で１５秒、７２℃で３０秒、７５℃で蛍光測定を３０サイクル、７２℃で７分を１サイクル行い、終了後は４℃で維持した。
【００５２】
得られた増幅産物は１％アガロースゲルを用いて電気泳動に供し、ＳＹＢＥＲ ＧＲＥＥＮ Ｉで染色後、増幅産物のバンドを確認した。このバンドをカッターナイフで切り出し、Ｍｏｎｔａｇｅ ＤＮＡ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いてＰＣＲ増幅産物ＤＮＡを精製した。精製したＤＮＡは、２６０ｎｍの吸光度を測定し、次式によって増幅産物ＤＮＡ１μｌあたりのコピー数を算出した。２６０ｎｍの吸光度をＡ、増幅産物の分子量をＷ、アボガドロ定数を６．０３×１０２３ ｍｏｌ -１とすると、検量線ＤＮＡのコピー数Ｃ（ｃｏｐｉｅｓ／μｌ）は、下式で表すことができる。
Ｃ＝Ａ×５０÷Ｗ×６．０３×１０１４
尚、大腸菌における増幅産物の分子量は１７８３５２ｇ／ｍｏｌである。
【００５３】
＜Bifidobacterium属菌数測定用検量線ＤＮＡの調製＞
Bifidobacterium属測定用の検量線ＤＮＡは、Bifidobacterium adolescentis菌体より抽出したＤＮＡを用いて調製した。菌体からのＤＮＡの抽出は、先に述べた方法と同様、ＩＳＯＰＬＡＮＴ（ニッポンジーン社製）を用いた。抽出したＤＮＡをテンプレートとして用い、配列番号２０および２１のプライマー（非特許文献７参照）を用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲの反応は、ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社製ＤｙＮＡｍｏ ＨＳ ＳＹＢＥＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ ｋｉｔを用いた。ＰＣＲ反応液の組成は、菌体から抽出したＤＮＡ希釈液１μｌ、５μＭに調製したプライマーをそれぞれ１μｌ、超純水７μｌ、キットに付属のＰＣＲ反応バッファー１０μｌを加え、２０μｌとした。ＰＣＲ反応条件は、ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ Ｏｐｔｉｃｏｎ で９５℃、１５分を１サイクル、９４℃で１５秒、５０℃で１５秒、７２℃で６０秒、７５℃で蛍光測定を３０サイクル、７２℃で７分を１サイクル行い、終了後は４℃で維持した。
【００５４】
得られた増幅産物は１％アガロースゲルを用いて電気泳動に供し、ＳＹＢＥＲ ＧＲＥＥＮ Ｉで染色後、増幅産物のバンドを確認した。このバンドをカッターナイフで切り出し、Ｍｏｎｔａｇｅ ＤＮＡ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いてＰＣＲ増幅産物ＤＮＡを精製した。精製したＤＮＡは、２６０ｎｍの吸光度を測定し、次式によって増幅産物ＤＮＡ１μｌあたりのコピー数を算出した。２６０ｎｍの吸光度をＡ、増幅産物の塩基数をＷ、アボガドロ定数を６．０×１０２３ ｍｏｌ -１とすると、検量線ＤＮＡのコピー数Ｃ（ｃｏｐｉｅｓ／μｌ）は、下式で表すことができる。
Ｃ＝Ａ×５０÷Ｗ×６．０３×１０１４
尚、Bifidobacterium adolescentisにおける増幅産物の分子量は３４０７９２ｇ／ｍｏｌである。
【００５５】
＜定量ＰＣＲによる総菌数におけるBifidobacterium属の占有率の測定＞
定量ＰＣＲは、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製のＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ Ｏｐｔｉｃｏｎと、本装置に最適化されたＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社製ＤｙＮＡｍｏ ＨＳ ＳＹＢＥＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ ｋｉｔを使用した。ＰＣＲ産物の定量、解析はＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製Ｏｐｔｉｃｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒを用いた。
【００５６】
総菌数の測定には配列番号５および８のプライマーを用い、Bifidobacterium属の測定には配列番号２０および２１のプライマーを用いた。ＰＣＲ反応液の組成は、糞便から抽出したＤＮＡ溶液１μｌ、５μＭに調製したプライマーをそれぞれ１μｌ、超純水７μｌ、キットに付属のＰＣＲ反応バッファー１０μｌを加え、２０μｌとした。ＰＣＲ反応条件は、総菌数の測定においては、９５℃、１５分を１サイクル、９４℃で１５秒、６０℃で１５秒、７２℃で３０秒、７５℃で蛍光測定を３０サイクル、５０℃〜９５℃で１℃刻みに蛍光測定を１サイクル行った。Bifidobacterium属の測定においては、９５℃、１５分を１サイクル、９４℃で１５秒、５０℃で１５秒、７２℃で６０秒、７５℃で蛍光測定を３０サイクル、５０℃〜９５℃で１℃刻みに蛍光測定を１サイクル行った。
【００５７】
尚、配列番号５および８のプライマーを用いた時の増幅領域を領域Ａ、配列番号２０および２１のプライマーを用いたときの増幅領域を領域Ｂとする。それぞれのＰＣＲ反応において、先に作成した検量線用ＤＮＡのコピー数とＣｔ値から検量線を作成し、糞便から抽出したＤＮＡ１μｌあたりに含まれる、領域ＡおよびＢのコピー数を算出した。総菌数におけるBifidobacterium属の占有率は、次式によって表すことができる。
Bifidobacterium属の占有率＝領域Ｂのコピー数／領域Ａのコピー数×１００（％）
【００５８】
上式によって算出した被検者３名の糞便中細菌におけるBifidobacterium属の占有率は以下のようになった。
（結果）
被検者１ ４％
被検者２ ６％
被検者３ １２％
尚、本方法による解析に要した時間は、約４時間であった。この時間は、従来公知の方法より短い。
【００５９】
＜比較例１＞
培養法を用いて、健常成人における腸内細菌叢における、総菌数に対するBifidobacterium属の占有率を解析した。
【００６０】
＜非選択培地による総菌数の測定＞
全ての細菌を培養しうる培地は未だ存在しないが、糞便中の優勢菌群の菌数測定によく用いられるＭ１０培地を使用した。糞便の希釈には光岡の希釈液を用いた。糞便の希釈、培地への塗沫、３７℃での培養はすべて嫌気グローブボックス（フォーマ社製）内で行った。測定に用いた献体は、実施例１でＤＮＡを抽出した同じ被検者の、同じ検体を用いた。本方法による、各被検者の糞便１ｇあたりの菌数（ＣＦＵ）は以下のようになった。
（測定結果）
被検者１ １．９２×１０１２
被検者２ ８．２６×１０１１
被検者３ ５．５６×１０１２
【００６１】
＜選択培地によるBifidobacterium属の測定＞
Bifidobacterium属細菌の培養は、ＢＳ寒天培地（日水製薬社製）を用いた。総菌数と同様、糞便の希釈には光岡の希釈液を用いた。糞便の希釈、培地への塗沫、３７℃での培養はすべて嫌気グローブボックス（フォーマ社製）内で行った。測定に用いた献体は、実施例１でＤＮＡを抽出した同じ被検者の、同じ検体を用いた。本方法による、各被検者の糞便１ｇあたりの菌数（ＣＦＵ）は以下のようになった。
（測定結果）
被検者１ １．５２×１０１１
被検者２ １．１８×１０１１
被検者３ ７．７６×１０１１
以上の結果より、培養法によって算出した被検者３名の糞便中細菌におけるBifidobacterium属の占有率は以下のようになった。
（測定結果）
被検者１ ７．９％
被検者２ １４．２％
被検者３ １２％
尚、本方法による解析に要した時間は、３日間であった。
【００６２】
以上の結果より、実施例１の方法による分析は、比較例１の方法と比較して短時間で行うことができた。また、実施例１によるBifidobacterium属の占有率は比較例１と比較して低くなる傾向が見られた。これは、実施例１の方法において、比較例１では検出し得ない細菌を検出しているため、総菌数としての分母が大きくなっていると考えられ、より正確な腸内細菌叢の解析を行うことが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明により、定量ＰＣＲ法を利用する試料中の細菌叢の総菌数を、細菌種や細菌属の菌数と同様に、簡便に測定することが可能になるため、細菌叢の解析のために産業上有用である。例えば、土壌の栄養改善、腸内細菌と疾患との関係、発酵食品の乳酸菌の割合などの調査に使用可能である。
【配列表フリーテキスト】
【００６４】
配列番号１: 細菌16SrRNA由来の共通配列
配列番号２: 細菌16SrRNA由来の共通配列
配列番号３: 細菌16SrRNA由来の共通配列
配列番号４: 細菌16SrRNA由来の共通配列
配列番号５: 細菌16SrRNA由来の共通配列
配列番号６: 細菌16SrRNA由来の共通配列
配列番号７: 細菌16SrRNA由来の共通配列
配列番号８: プライマー
配列番号９: プライマー
配列番号10: プライマー
配列番号11: プライマー
配列番号12: プライマー
配列番号13: プライマー
配列番号14: プライマー
配列番号15: プライマー
配列番号16: プライマー
配列番号17: プライマー
配列番号18: プライマー
配列番号19: プライマー
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料から抽出した細菌のＤＮＡ又はその一部を、配列番号１〜７に示される塩基配列の１０塩基以上の配列又はそれらの相補的配列を含むＰＣＲプライマーの少なくとも１つを用いて増幅する工程、増幅したＤＮＡ断片を定量する工程、および定量結果に基づいて細菌叢を分析する工程を含むことを特徴とする細菌叢の解析方法。
【請求項２】
試料中の細菌叢における総菌数を決定することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
総菌数が、増幅産物ＤＮＡを精製し、所定濃度の精製ＤＮＡについて２６０ｎｍの吸光度を測定し、所定量の増幅産物ＤＮＡあたりのコピー数を決定することを含む手段によって決定されることを特徴とする、請求項２記載の方法。
【請求項４】
試料中の個々の属もしくは種の細菌の占有率を決定することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項５】
占有率が、試料中の特定の属もしくは種の細菌に特異的な１６ＳｒＲＮＡ配列由来のＰＣＲプライマーを用いて得られた所定量の増幅産物ＤＮＡあたりのコピー数を決定し、試料中の全細菌の増幅産物ＤＮＡあたりのコピー数に対する該特定の属の細菌のコピー数のパーセンテージを算出することを含む手段によって決定されることを特徴とする、請求項４記載の方法。
【請求項６】
ＰＣＲプライマーが、配列番号８〜１９に示される塩基配列又はその相補的配列からなることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
ＰＣＲプライマーが、配列番号８と１１、配列番号９と１１、配列番号１０と１３、配列番号１２と１５、配列番号１４と１７、配列番号１６と１８、及び配列番号１６と１９からなる群から選択される配列の組み合わせであることを特徴とする、請求項６記載の方法。
【請求項８】
リアルタイムＰＣＲによってＰＣＲ産物を定量することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
試料が、食品、生体試料、環境試料、及び工業プロセスからの試料を含むことを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
試料が、活性汚泥、土壌、河川水、海水、温泉水、飲料水、加工食品、発酵槽培養物、並びに、ヒトを含む哺乳類や他の真核生物の組織、細胞または体液からなる群から選択されることを特徴とする、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
配列番号１〜７に示される塩基配列の１０塩基以上の配列又はそれらの相補的配列を含むＰＣＲプライマーの少なくとも１つを含むことを特徴とする、細菌叢を解析するためのキット。
【請求項１２】
前記プライマーを用いるリアルタイムＰＣＲによってＰＣＲ産物を定量し、細菌叢を解析するためのものであることを特徴とする、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
試料中の細菌叢における総菌数を決定する、及び／又は試料中の個々の属もしくは種の細菌の占有率を決定するためのものであることを特徴とする、請求項１１又は１２記載のキット。
【請求項１４】
ＰＣＲプライマーが、配列番号８〜１９に示される塩基配列又はその相補的配列からなることを特徴とする、請求項１１〜１３のいずれか１項記載のキット。
【請求項１５】
ＰＣＲプライマーが、配列番号８と１１、配列番号９と１１、配列番号１０と１３、配列番号１２と１５、配列番号１４と１７、配列番号１６と１８、及び配列番号１６と１９からなる群から選択される配列の組み合わせであることを特徴とする、請求項１４記載のキット。
【請求項１６】
ＰＣＲ反応を行うための試薬をさらに含むことを特徴とする、請求項１１〜１５のいずれか１項記載のキット。
【請求項１７】
試料からＤＮＡを調製または抽出するための試薬をさらに含むことを特徴とする、請求項１１〜１６のいずれか１項記載のキット。
【請求項１】
試料から抽出した細菌のＤＮＡ又はその一部を、配列番号１〜７に示される塩基配列の１０塩基以上の配列又はそれらの相補的配列を含むＰＣＲプライマーの少なくとも１つを用いて増幅する工程、増幅したＤＮＡ断片を定量する工程、および定量結果に基づいて細菌叢を分析する工程を含むことを特徴とする細菌叢の解析方法。
【請求項２】
試料中の細菌叢における総菌数を決定することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
総菌数が、増幅産物ＤＮＡを精製し、所定濃度の精製ＤＮＡについて２６０ｎｍの吸光度を測定し、所定量の増幅産物ＤＮＡあたりのコピー数を決定することを含む手段によって決定されることを特徴とする、請求項２記載の方法。
【請求項４】
試料中の個々の属もしくは種の細菌の占有率を決定することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項５】
占有率が、試料中の特定の属もしくは種の細菌に特異的な１６ＳｒＲＮＡ配列由来のＰＣＲプライマーを用いて得られた所定量の増幅産物ＤＮＡあたりのコピー数を決定し、試料中の全細菌の増幅産物ＤＮＡあたりのコピー数に対する該特定の属の細菌のコピー数のパーセンテージを算出することを含む手段によって決定されることを特徴とする、請求項４記載の方法。
【請求項６】
ＰＣＲプライマーが、配列番号８〜１９に示される塩基配列又はその相補的配列からなることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
ＰＣＲプライマーが、配列番号８と１１、配列番号９と１１、配列番号１０と１３、配列番号１２と１５、配列番号１４と１７、配列番号１６と１８、及び配列番号１６と１９からなる群から選択される配列の組み合わせであることを特徴とする、請求項６記載の方法。
【請求項８】
リアルタイムＰＣＲによってＰＣＲ産物を定量することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
試料が、食品、生体試料、環境試料、及び工業プロセスからの試料を含むことを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
試料が、活性汚泥、土壌、河川水、海水、温泉水、飲料水、加工食品、発酵槽培養物、並びに、ヒトを含む哺乳類や他の真核生物の組織、細胞または体液からなる群から選択されることを特徴とする、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
配列番号１〜７に示される塩基配列の１０塩基以上の配列又はそれらの相補的配列を含むＰＣＲプライマーの少なくとも１つを含むことを特徴とする、細菌叢を解析するためのキット。
【請求項１２】
前記プライマーを用いるリアルタイムＰＣＲによってＰＣＲ産物を定量し、細菌叢を解析するためのものであることを特徴とする、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
試料中の細菌叢における総菌数を決定する、及び／又は試料中の個々の属もしくは種の細菌の占有率を決定するためのものであることを特徴とする、請求項１１又は１２記載のキット。
【請求項１４】
ＰＣＲプライマーが、配列番号８〜１９に示される塩基配列又はその相補的配列からなることを特徴とする、請求項１１〜１３のいずれか１項記載のキット。
【請求項１５】
ＰＣＲプライマーが、配列番号８と１１、配列番号９と１１、配列番号１０と１３、配列番号１２と１５、配列番号１４と１７、配列番号１６と１８、及び配列番号１６と１９からなる群から選択される配列の組み合わせであることを特徴とする、請求項１４記載のキット。
【請求項１６】
ＰＣＲ反応を行うための試薬をさらに含むことを特徴とする、請求項１１〜１５のいずれか１項記載のキット。
【請求項１７】
試料からＤＮＡを調製または抽出するための試薬をさらに含むことを特徴とする、請求項１１〜１６のいずれか１項記載のキット。
【公開番号】特開２００７−６８４３１（Ｐ２００７−６８４３１Ａ）
【公開日】平成１９年３月２２日（２００７．３．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２５６７９０（Ｐ２００５−２５６７９０）
【出願日】平成１７年９月５日（２００５．９．５）
【出願人】（０００１２２２９８）王子製紙株式会社 (2,055)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年３月２２日（２００７．３．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年９月５日（２００５．９．５）
【出願人】（０００１２２２９８）王子製紙株式会社 (2,055)
【Ｆターム（参考）】
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