組み込まれたケイ素および細胞培養技術を用いて組み立てられたハイスループット細胞ベースアッセイ
本発明は、生体分子、細胞などの種と相互作用が可能で、それによって多孔質材料の表面または多孔質表面をコーティングする接着層に対して種を接着または固定化することができる多孔質材料（例えば、膜）を伴う物品および方法に関する。多孔質材料は、種の配置および空間的分布を材料の表面にわたって制御して種を付着することができ得る。そのような物品および方法は、例えば、バイオアッセイ、バイオセンサー、または生体細胞の培養に有用であり得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、生体分子および／または生体細胞の研究に使用するための物品および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
細胞ベースの器具は、細胞増殖と、細胞遊走と、トキシン、病原体、薬物、または他の細胞などの作用物質に対する細胞応答とを含む細胞の挙動を研究するための、ハイスループット医薬品試験システムに多数使用されてきた。膜などの材料が細胞培養環境の中で使用されることにより、種々の応用例に用途を見出し得る細胞ベースの器具の開発が加速している。多数のシステムで高分子膜の使用が採用されており、そこでは細胞が膜の表面にまたは膜の細孔内に接着することができ、細胞の挙動が研究できる。多数の公知である高分子膜では、細孔サイズおよび細孔分布の両方を制御するのが困難である恐れがあり、細胞の挙動を正確にモニタする能力に制約がある。細孔サイズおよび細孔分布の制御をより厳密に達成する１つの方法は、複数層の高分子膜を用いることでもよいが、複合膜の厚さが増大し（例えば、少なくとも４０ミクロン）、柔軟性が減少するという結果をもたらす。これは、例えば、複合膜の反対面上の細胞間の相互作用を伴う研究に弊害をもたらす恐れがある。逆に、厚さが減少した高分子膜は、望ましくなく低い機械的強度によって特徴付けられることが多い。そのうえ、多数の従来型高分子膜に対する細胞の接着を、制御およびモニタするのが困難である恐れがある。細胞は細孔に接着し得るが、細孔間の箇所に接着する可能性もあり、それは規則正しく並んだ組織の増殖を妨害し得るか、または、そうでなければ、ある種の応用例にとって望ましくない恐れがある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、改良された方法および材料が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（発明の要旨）
本発明は、ある種の実施形態においては、膜を備えた細胞培養および／または細胞アッセイ用に構成された装置に関する。膜は、主に無機材料を含んでいてもよく、第１の面および対向する第２の面、ならびに膜の第１の面から第２の面までを貫通する複数の細孔を備える。
【０００５】
本発明はまた、細胞培養および／または細胞アッセイ用の物品であって、第１の面および対向する第２の面を有する膜；膜の第１の面から第２の面までを貫通する複数の細孔、および細孔を介して対向する第２の面と接触している環境に暴露され、複数の細孔の少なくとも一部を閉塞するように、膜の第１の面上に配置された細胞接着性材料層を備えた物品に関する。
【０００６】
別の態様では、本発明は、第１の面、対向する第２の面、および膜の第１の面と第２の面との間を貫通する複数の細孔を備えた膜を用意すること；細胞が実質的に細孔を密封し、流体が膜を通して膜の第１の面と第２の面との間を流れるのを実質的に妨げるように細孔のサイズを決定した膜上に細胞を配置すること；膜の第１の面を第１の流体に、膜の第２の面を第２の流体に暴露することを含み、流体の交換が、膜を通して第１の面と第２の面との間で起こらず、または膜表面積１ｃｍ２、１時間当たり流体１ｃｍ３未満の割合で起こる方法を提供する。
【０００７】
本発明はまた、第１の面および対向する第２の面、ならびに膜の第１の面と第２の面との間を貫通する複数の細孔を備えた膜を用意すること；少なくとも膜の第１の面に細胞を提示すること；およびこうした細胞の少なくとも１つの、細孔を介した第１の面から第２の面への遊走を決定することを含む方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
添付図面は模式的であり、スケールに合わせて描かれることを意図していない。図中、種々の図に例示された同一のまたは実質的に類似した各構成要素は、典型的には、単一の番号または記号により表される。明確さを期すために、当業者に本発明を理解させるために例示が必ずしも必要ではない場合には、全ての構成要素が全ての図で標識されているわけではなく、本発明の各実施形態の全ての構成要素が示されているわけでもない。
【０００９】
（詳細な説明）
本発明は、多孔質であり得る材料、特に膜を伴う物品と方法に関し、種々の応用例、特に、細胞の培養および／または細胞を伴うアッセイを伴う応用例に有用であり得る。本発明のある種の材料（例えば、膜または膜（複数可）を含む多構成要素材料）は、生体分子（細胞の表面に存在してもよい）などの種と相互作用が可能で、それによって種は、材料の表面に接着し、または材料と結合することができる。幾つかの実施例では、本発明の材料は、種の配置および空間的分布を材料の表面にわたって制御し得る可能性がある。そのような材料および方法は、例えば、バイオアッセイ、バイオセンサー、または生体細胞の培養に有用であり得る。
【００１０】
本発明の物品および装置は、生体分子および／または生体細胞の研究に有用な膜を備えていてもよい。既に公知である典型的な細胞研究用のシステムは、平均細孔サイズの制御が不良なだけでなく、細孔の空間的分布が無作為である膜を採用することが多い。この研究で、そのような材料を使用し、かつ膜の表面に付着した細胞などの種を使用すると、一貫性のないおよび／または解釈が困難な結果が生じる恐れがある。対照的に、本発明は、ある種の実施形態では、細孔サイズおよび細孔の空間的分布の両方を制御して製作することができる膜を提供する。その結果、膜に対する細胞などの種の固定化を、ある場合には細孔の空間的分布に基づいて制御することもできる。例えば、膜の細孔は、実質的に大多数の種が細孔間の区域ではなく、細孔内の、細孔と同一の広がりを有する、または細孔と重複した領域内にのみ接着するように、表面への種の接着を導くことができる。接着した種の空間的制御は、数多くの応用例で有利であり得る。例えば、表面上の細胞の接着を制御することは、以下でより詳細に記載するように、組織工学で有用であり得る。さらに、本発明の膜は、他の従来型の膜と比較して、薄く（例えば、厚さが４０ミクロン未満）、柔軟性を有し、膜の対向する面上の種間の接触を促進することができる。
【００１１】
本発明は、ある種の実施形態において、細胞培養および／または細胞アッセイに使用するための膜を備えた物品を提供し、そのような物品は、第１の面および対向する第２の面、ならびに膜の第１の面から第２の面までを貫通する複数の細孔を有する膜を備え、膜は主に無機材料を含む。
【００１２】
本明細書で使用する場合、「無機材料」という用語には、その通常の意味が付与され、有機材料ではない任意のものを意味する。「有機材料」もまた、この文脈におけるその通常の意味に従って使用され、すなわち、１つまたは複数の炭素−水素結合を含有する分子で構成される材料である。例えば、無機材料は、少なくとも１つの金属原子（例えば、１〜１７族から選択される金属原子）を含む材料および／またはその化合物を含んでもよいが、それらに限定されず、そのような化合物は水素に結合した炭素原子を含む官能基を典型的には含有しない。無機材料の幾つかの例には、セラミックス、ガラス、および金属が含まれていてもよい。ある場合には、無機材料は、金属酸化物または金属窒化物を含む。特定の実施形態では、無機材料は、窒化ケイ素（ＳｉＮ）であってもよい。無機材料は、不透明、半不透明性半透明、または透明であってもよく、ガス透過性、半透過性、またはガス不透過性であってもよい。ある場合には、無機材料は、約４００ｎｍより長い波長で光学的に透過性であるように選択してもよい。無機材料はまた、細胞および／または生体分子と適合するように選択してもよい。本発明に従って使用可能である多種多様で好適な無機材料は、本明細書で提供される手引きおよび教示が与えられれば、当業者にとって直ちに明白になり、または当業者ならば過度の実験をせずに選択することができる。
【００１３】
幾つかの実施形態では、本発明の膜は、単一層の材料（例えば、無機材料）を含んでいてもよい。ある種の実施形態では、膜は、第１の面と第２の面との間で測定された約３０ミクロン未満の厚さを有する少なくとも１つの部分を含んでいてもよい。幾つかの実施形態では、厚さは、約２０ミクロン未満、約１０ミクロン未満、または約５ミクロン未満であり得る。
【００１４】
幾つかの実施形態では、膜は、例えば、平均細孔サイズからのサイズの逸脱が約１０％（ある場合にはわずか約５％）を超える細孔が全細孔の約５％以下であるように、比較的均等な細孔サイズの分布を有するように構築される。本明細書で使用する場合、「細孔サイズ」は、顕微鏡的に、例えば、可視光顕微鏡法または走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）のいずれか一方または両方を使用して決定することが可能で、細孔の円周上の２点を結びかつ細孔開口部の幾何学的中心を通った、膜の表面に平行な最短線の長さを指す。
【００１５】
当業者に公知である微細加工技術を使用して、細孔の断面形状（円形状、楕円形状、三角形状、不規則形状、正方形状または長方形状など）、数、および寸法は、特定の応用例に適するように変化させることができる。好適なまたは潜在的に好適である種々の微細加工技術は、例えば、Ｓｉｌｉｃｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｆｏｒ ｔｈｅ ＶＬＳＩ Ｅｒａ、第２版、第１巻、Ｓ． ＷｏｌｆおよびＲ． Ｎ． Ｔａｕｂｅｒ、Ｌａｔｔｉｃｅ Ｐｒｅｓｓ、Ｓｕｎｓｅｔ Ｂｅａｃｈ、ＣＡ（２０００年）；Ｍ． Ｊ． Ｂｏｗｄｅｎ、「Ａ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｎ ｒｅｓｉｓｔ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ ｆｉｎｅ ｌｉｎｅ ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ」、Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｌｉｔｈｏｇｒａｎｈｙ， Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｅｒｉｅｓ， ＃ ２６６、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、第３章、３９〜１１７頁（１９８４年）に収録；Ｄ． Ｎｙｙｓｓｏｎｅｎ、「Ｏｐｔｉｃａｌ Ｌｉｎｅｗｉｄｔｈ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｎ Ｐａｔｔｅｒｎｅｄ Ｗａｆｅｒｓ」、ＳＰＩＥ ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ、第４８０巻、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｃｉｒｃｕｉｔ Ｍｅｔｒｏｌｏｇｙ、６５頁（１９８４年）；およびＪ．Ｄ． Ｃｕｔｈｂｅｒｔ、「Ｏｐｔｉｃａｌ Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ」、Ｓｏｌｉｄ Ｓｔａｔｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、５９頁、１９７７年８月；において考察され、これらの各々は参照により組み込まれる。例えば、細孔は本質的に円形状の断面形状を有していてもよい。ある場合には、細孔は、膜が暴露され得る種の最小断面寸法より小さい最小直径を有していてもよい。ある場合では、細孔サイズは、膜が暴露され得る種よりずっと大きく選択してもよい。さらに、細孔の空間的分布は、少なくとも約５０％の細孔が直近の隣接した細孔から約２５ミクロン未満に配置されるように、公知の技術を使用して制御することができる。幾つかの実施形態では、細孔は、約２〜３％以下のサイズ偏差で約０．２ミクロンから約１００ミクロンの平均細孔サイズを有することができる。ある種の実施形態では、最小細孔サイズは、少なくとも約１ミクロンである。典型的には、細孔の空間的分布は、直近の隣接した細孔間の距離が約１〜５０ミクロンであり得るものであってよい。各々の場合には、上記で参照した、隣接している細孔を隔てる距離は、特定の細孔の円周周辺とその直近の隣接した細孔の円周周辺を結ぶ最短距離を指す。
【００１６】
フォトリソグラフィーが発明の膜を加工する技術として使用される実施形態では、細孔サイズは、使用する特定のリソグラフィーマスクの設計上／描画上の特徴的サイズによって決定され得る。細孔の間隔は使用する材料と採用するリソグラフィー用具との組合せによって決定され得る。優位的な機械的安定性を有する膜を加工するには、細孔の間隔は、直近の隣接した細孔間の距離が約２ミクロン以上であり得るものであってよい。膜の厚さは、基質材料上に堆積する薄膜の厚さに依存し、例えば、約２００ｎｍから約２ミクロンまで幅広く変化し得る。
【００１７】
幾つかの実施形態では、膜は、ある種の実施形態では細胞接着層および細胞でコーティングされているが、少なくとも約１ｍｍ２の面積を有し、約４００ｎｍから約８００ｎｍまでの波長の範囲内の少なくとも１つの波長で少なくとも３０％の光透過率を示す少なくとも１つの部分を含んでいてもよく；他の実施形態では、そのような部分（複数可）中で、約４００ｎｍから約８００ｎｍまでの波長の範囲内の少なくとも１つの波長で少なくとも４０％または少なくとも５０％の光透過率を示し得る。１つの実施形態では、ＳｉＮ膜は、ＵＶ光の透過を遮蔽することができ、ＵＶ光は細胞膜の変性および細胞死を引き起こす恐れがあるため、例えば環境検出システムに有利であり得る。ＵＶ光が膜によってシステムから本質的に濾波され得るため、このことによって、そのようなデバイスの構成を単純化することができる。
【００１８】
本発明の膜はまた、膜の表面にまたは膜の表面をコーティングする材料に、様々な種の接着を可能にすることができ、またはそのように改変してもよい。例えば、細胞および／またはタンパク質などの生体分子を、例えば細孔の側壁に沿った区域または膜の表面上の細孔間の区域を含む膜の種々の部分に対して固定化することができる。幾つかの実施例では、そのような種は、他の区域ではなく膜のある区域に優先的に接着することができる。例えば、そのような種の実質的に全てが、細孔間の区域にではなく、膜の細孔と同一の広がりを有する領域内に、細孔内に、または細孔と重複して接着することができる。種が細孔と同一の広がりを有する領域内に、細孔内にまたは細孔と重複して接着したとき、種の少なくとも一部分が、膜の側面と平行な平面で細孔の断面区域に渡って膜と結合または付着した材料に付着するように、細孔のサイズを決定することができる。ある場合には、種は、そのような細孔の断面区域と同一の広がりを有する領域内のみに接着することができる。ある場合には、さらに以下に記載し図２Ｂに例示するように、種は、例えば細胞などの種が実質的に細孔を密封するように、そのような細孔の断面区域の実質的な大部分と同一の広がりを有する領域内に接着することができる。
【００１９】
本発明の幾つかの物品は、膜の少なくとも１つの面に対して付着、固定化、またはそうでなければ結合した細胞または他の生物学的種などの特定の種を、優先的に誘引および／または結合させるように選択された接着性材料を含んでいてもよい。例えば、膜の他方の面が細胞を含有する培地に暴露しているとき、膜の少なくとも１つの細孔に渡る、ある場合には膜の少なくとも１つの細孔を閉塞する層内に含有および／または存在することにより細胞に暴露された細胞接着性材料を含む領域内に細胞が接着できるように、膜の面の一方の表面上に配置された細胞接着性材料を含んでいてもよい（例えば、図１を参照）。ある種の実施形態では、接着性材料は細胞接着性材料である。本明細書で使用する場合、「細胞接着性材料」という用語は、細胞が接着する可能性のある任意の化学的または生物学的材料を指してもよい。ある種の実施形態では、そのような細胞接着性材料は、膜の少なくとも１つ面の表面に付着した連続層として構成される。そのような細胞接着性材料層は、例えばコラーゲンもしくは多糖類とコラーゲンの混合物、抗体、細胞表面受容体に対するリガンド、抗原、レクチン、インテグリン、セレクチン、プロテインＡもしくはプロテインＧなどの細菌由来親和性分子、その誘導体、その混合物、またはコラーゲン、ゼラチン、アガロース、アクリルアミド、キトサン、セルロース、デキストラン、アルギン酸塩、カラゲナンなどのゲルもしくは他の層形成材料と結合した上記任意ものなど、生体細胞の膜またはその構成要素に特異的または非特異的に結合することができると当技術分野において公知の様々な種の任意のものを含んでいてもよい。
【００２０】
１つの実施形態では、細胞接着性材料層は、細孔を介して膜の対向する第２の面に（すなわち、膜の第２の面に接触している環境に）暴露されるように、膜の第１の面上に配置してもよい。図１は、本発明のそのような実施形態の一例を示す。図１ａは、複数の細孔２０を備えた膜１０を示す。接着性材料層３０は、膜の対向する第２の面への細孔と同一の広がりを有する領域に暴露されるように、膜の第１の面上に形成および配置することができる（図１ｂ）。膜の第２の面を細胞４０に暴露すると、細胞４０が、暴露した接着性材料３０に接着し、複合物品４６を形成することができる。接着性材料は、細胞または細胞表面に結合している種（例えば、受容体、イムノグロブリンなど）などの特定の標的種に優先的に結合するように選択してもよい。図１ｃに例示されているような本発明のシステムは、細胞を表面に接着したままで検査することができ、多数の細胞型の生存率は細胞接着に依存する可能性があるため、細胞挙動の研究に有用であり得る。例えばコラーゲンに接着した細胞は、例えば、長時間にわたるインキュベーションにおいてそれら細胞の分化状態を維持することができる。
【００２１】
他の実施形態では、細胞接着性材料は、膜の任意の部分上にまたは膜の任意の部分に沿って配置されてもよい。例えば、細胞接着性材料層は、細孔内で細胞の接着を達成するために、細孔の側壁に沿って配置してもよい。細胞接着性材料層はまた、細孔開口部の表面にのみ配置してもよい。あるいは、細胞接着性材料層は、膜の細孔間の表面上にのみ配置してもよい。この層は、膜上の単一の箇所にまたは膜上の箇所の組合せに配置してもよい。当業者は、特定の応用例に適合するように細胞接着性材料層の配置を選択できよう。
【００２２】
ある場合には、単一の細孔に、単一の細孔内に、または単一の細孔と同じ広がりを有する領域内に単一細胞のみを接着させるように、細孔のサイズを決定することができ、それによって、物理的に単離された複数の単一細胞が膜の表面上に配列されることを可能にし、そこでは、表面上の細胞の空間的分布が細孔の空間的分布に相関する。これは、細胞が膜表面上の種々の箇所に無差別に接着する可能性がある多数の従来型システムと比べて有利であり得る。ある場合には、使用中に、細孔の少なくとも５０％が単一細胞を各細孔に付着させることができる。ある場合には、少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも８０％である。
【００２３】
本発明の物品は、細胞および／または他の生物学的実体の研究用に構成されたデバイスに組み込まれていてもよい。例えば、ある種の実施形態では、本明細書に記載された膜はマルチチャンバ装置内で使用してもよく、その装置は、第１および第２のコンパートメントが膜によって分離され、例えば流体を含有するように構築および配置された、第１のコンパートメントおよび第２のコンパートメントを少なくとも備える。すなわち、このデバイスは、少なくとも１つのコンパートメントを含有してもよく、コンパートメントは壁によって囲まれ、少なくとも１つの壁は膜を備える。このコンパートメントには、流体環境などの、膜が暴露され得る環境を含有することが可能であってもよい。この装置はさらに、膜に隣接して配置された流体の、各コンパートメント内での含有を容易にするように構築および配置された構成要素を備えていてもよい。例えば、この装置は、流体を膜に接触させて配置することを可能にする、種々のインレット、アウトレット、ポンプなどを備えていてもよい。図２Ａは、本発明のそのような実施形態の例示的な例を示す。既に記載のように、膜１０および細胞接着性材料３０ならびに接着した細胞４０を備えた複合層４６は、この層がチャンバ６０とチャンバ９０を分離するように、デバイス５０内に配置されている。流路７０、８０、および１００は、デバイス内へ流体および／または他の構成要素を導入し、またはデバイスから流体および／または他の構成要素を除去するために使用してもよい。細胞４０は、細胞４０の頂部分４２および底部分４４がそれぞれ、膜の対向する面上に存在する異なる環境に暴露し得るように、細孔２０上または細孔２０内に接着できる。細胞の頂部分４２は、膜の上部表面２２と接触している一方の環境に暴露され得るが、細胞の底部分４４は、膜および／または細胞接着性材料の底部表面２４と接触している別の環境に暴露され得る。
【００２４】
幾つかの実施形態では、膜を備えた本発明のデバイスは、組織増殖のモニタおよび制御を可能にするように構成することができる。マトリックス表面への細胞接着の重要な局面を制御できず、規則性が不良な組織形成を生じさせるある種の従来型の組織増殖および工学用のプラットフォームとは異なり、本発明のある種の実施形態により提供されるある種のプラットフォームは、細胞増殖を導くための確定した構造を有し、高度に規則的で、かつ生理学的に正しい組織の産生を促進させ得る。また、そのような発明の材料は、組織の増殖および発生に影響する要因および条件の研究に役立ち得る。幾つかの実施形態では、本発明の膜を備えた物品は、表面上に接着した細胞の規則的配列を形成する能力を有することができ、それは細胞および組織の定方向増殖を促進することができる。
【００２５】
表面上に接着した細胞の間隔を制御する能力は、生物学的作用物質および／または生体分子に対する細胞の応答、および／または個別の細胞応答、または細胞間シグナル伝達、または他の細胞間相互作用を研究するための、種々の応用例に特に有用であり得る。幾つかの実施形態では、膜は、接着した細胞の規則的配列を含むことができ、すなわち単一細胞が膜の表面にわたって単一細孔と同一の広がりを有する領域に付着することができ、ある場合では、膜の少なくとも１つの面が生体分子および／または生物学的作用物質に暴露された際に、生体分子および／または生物学的作用物質への細胞の暴露の影響を迅速にスクリーニングすることができる。幾つかの実施形態では、細胞の第１のセットは膜表面に接着することができ、膜の少なくとも１つの面上で、癌細胞など細胞の第２のセットを含む環境に暴露され得る。細胞の第１のセット（例えば、接着した細胞）と細胞の第２のセットとの間の細胞間相互作用は、ある場合では、接着した細胞の特定の部分でモニタすることができる。本発明のある種の膜は、膜が十分に薄く（例えば、４０ミクロン未満の厚さ）、膜の対向する面上の細胞が細孔を介して互いに接触できるため、細胞間相互作用の研究に特に有用であり得る。
【００２６】
本発明の膜を備えた物品に接着した細胞はまた、例えば、細胞上の抗体、抗原、増殖および制御因子などの有効性および／または細胞毒性、またはそれらのある種の機能を、例えばスクリーニングするために、他の生体分子および／または生物学的作用物質（例えば、タンパク質、抗体など）に暴露されてもよい。さらに、細胞の挙動、機序、およびプロセスも研究が可能である。例えば、膜を備えた物品の底部表面２４の、生物学的作用物質を含む環境への暴露は、ある場合には、特に細胞の底部分４４（図２Ｂ）での、生物学的作用物質に対する細胞応答の研究を可能にし得る。
【００２７】
上述したように、ある場合には、本発明の物品は、例えば細胞培養用の、マルチチャンバ灌流システム中に組み込まれてもよい。図２Ａは、そのような応用例のために構成された本発明の例示的実施形態を示す。本明細書に記載のように細胞接着性材料層でコーティングされた膜を備えた物品４６は、この物品がチャンバ６０とチャンバ９０を分離するように、デバイス５０中に配置されている。流路７０は、流体および／または他の構成要素が物品の上部表面２２に接触するように、チャンバ６０に流体および／または他の構成要素を導入するために使用してもよい。流路１００は、流体および／または他の構成要素が物品の底部表面２４に接触するように、チャンバ９０にまたはチャンバ９０から流体および／または他の構成要素を導入および／または除去するために使用してもよい。
【００２８】
幾つかの実施形態では、膜を介した流体の交換は、細胞接着層３０および／または細胞４０の存在により実質的に妨げることができる。例えば、流体の交換は、膜を介して膜の第１の面と第２の面との間で起こらず、または膜表面積１ｃｍ２、１時間当たり流体１ｃｍ３未満の割合で起こってもよい。図２Ａに示された例示的実施形態では、膜／細胞接着層／付着細胞の複合体は、チャンバ６０とチャンバ９０の間の実質的な流体の交換を妨げることができる。
【００２９】
幾つかの実施形態は、膜上に配置された細胞を含むことができ、細胞が細孔と同一の広がりを有する領域に、細孔内の領域に、または細孔と重複した領域に固定化されたとき、細胞がそのような細孔を実質的に密封できるように、細孔のサイズを決定する。例えば、細孔は、接着した細胞によって覆われる、かつ／または密封されるほど十分に小さくあり得るサイズを有することが可能で、細胞の少なくとも一部分が、膜の表面（例えば表面２２）に平行な平面にとられた細孔の断面区域と同一の広がりを有する領域の実質的な大部分に接着することができる。
【００３０】
図２Ｂに示すように、細孔２０が実質的に密封されて、例えば膜の両面間の流体の交換または拡散が、細胞４０自体を介して起こる場合を除き、妨げられるように、細胞４０は、細孔２０の領域内で細胞接着層３０に接着することができる。ある場合には、細胞は、細胞との相互作用による膜を通したある種の交換（例えば、細胞を通した／介する拡散および／または能動輸送）しか可能にしない場合がある。例えば、膜の１つの面は、細胞が細胞膜を介して吸収し、細胞生存および増殖を促進し得る種を含む環境に暴露していてもよい。同様に、細胞はまた、細胞膜を介して他方のチャンバ中に種々の種を排出することができる。１つの例示的な実施形態では、細胞４０は、細孔２０の領域内で細胞接着層３０に接着したとき、頂部分４２および底部分４４が、（図２Ａに例示したような）２チャンバシステム中の異なる液状環境に暴露され得るように、頂部分４２（例えば、頂端膜）および底部分４４（例えば、基底膜）を備えていてもよい。そのような１つの実施形態では、流路７０は、酸素、窒素、二酸化炭素、栄養素、培地などをチャンバ６０中に運搬するために使用してもよく、それらの１つまたは複数が細胞の細胞部分４２（例えば、頂端膜）を介して細胞中に輸送され得る。次いで、老廃物は、細胞部分４４（例えば、基底膜）によって細胞からチャンバ９０中に分泌され得る。流路１００は、老廃物をデバイス５０の外部に輸送するために使用されてもよい。したがって、長期の細胞培養の期間を通じて、高い細胞生存率が維持され得る。
【００３１】
本発明の別の態様は、細胞遊走を研究するための方法を提供する。細胞遊走は、例えば細胞が、特異的な部位に向かって特定の方向に運動することが必要であり得る、創傷治癒、組織形成（例えば修復、胚発生などの発生など）、疾患進行（例えば、癌の進行）、および／または免疫応答の研究に重要であり得る。例えば、創傷治癒（例えば、皮膚性または血管性創傷治癒）の初期段階は、損失または損傷細胞を置換する細胞分裂ではなく、創傷区域中への細胞遊走を伴う可能性がある。本発明の方法は、本明細書に記載したように膜の第１の面に細胞を提示すること、および細胞の、細孔を介した膜の第１の面から膜の第２の面への遊走を決定することを含んでいてもよい。幾つかの実施形態では、この方法は、膜の表面に細胞を接着させること、および例えば、少なくとも２つの細孔間で表面を横切る細胞の遊走を決定することを含んでいてもよい。細胞の遊走は、当業者に公知の方法により決定することができる。ある例では、細胞は、膜の第１の面から細孔に進入可能であり、細胞遊走は、膜の第２の面から細孔を出る細胞数を測定することによりモニタすることができる。
【００３２】
ある場合には、本発明の膜は、細胞遊走誘導または阻害作用物質を含んでいてもよく、「細胞遊走作用物質」は、ある区域を横切る、例えば創傷区域中への細胞の遊走を促進または阻害する可能性のある、任意の化学的または生物学的種であってよい。細胞遊走作用物質は、１つまたは複数のポリヌクレオチド、タンパク質、糖質、脂質、有機分子、合成または天然の薬剤、および／または当業者に公知である他の細胞遊走作用物質を含んでいてもよい。細胞遊走研究のために使用される本発明の膜は、細孔の側壁、細孔の入り口、膜の１つまたは複数の面の表面、または膜の他の任意の部分もしくは部分群に沿って配置され、場合によって付着している細胞遊走作用物質を含んでいてもよい。ある場合には、細孔のサイズは、細孔内への細胞の進入および／または細孔を介した細胞の遊走を促進するように、十分に大きくてもよい。
【００３３】
本発明の膜は、ある種の実施形態では無機材料を主に含んでいてもよく、またはある種の実施形態では無機材料から本質的になっていてもよく、または他の実施形態では無機材料からなっていてもよい。無機材料は、例えば、任意の好適な金属酸化物（複数可）および／または金属窒化物（複数可）であってもよい。ある場合には、無機材料は、ＳｉＮ、ＳｉＯ２、Ａｌ２Ｏ３、ＴｉＯ２、および／またはＴｉＮを含んでいてもよい。特定の実施形態では、無機材料はＳｉＮを含む。前述したように、無機材料は、特定の応用例に適合するように選択することができる。例えば、無機材料は、細胞との生体適合性に基づいて選択することができ、すなわち無機材料は、実質的に無毒であり得る。ある場合には、無機材料は、約４００ｎｍから約８００ｎｍまでの波長の範囲内の少なくとも１つの波長で少なくとも３０％の光透過率を示すことができる。
【００３４】
膜は、前述したように、当技術分野で公知の、任意の各種好適な微細加工技術を使用して形成され得る。例えば、微細打抜き、フォトリソグラフィー、エッチング、ステンシル印刷、または他のシリコン微細加工技術などである。ある種の実施形態では、例えば、膜が細胞培養および／または細胞アッセイ用に構成された装置内で使用されるある種の実施形態では、フォトリソグラフィー技術を使用すれば、有利には膜を形成することができる。幾つかの実施形態では、膜または膜の前駆体は、金属窒化物層を形成するために、当技術分野で公知の方法により窒化され得る。例えば、窒化皮膜は、窒素環境（例えば、アンモニアなど）への暴露に際し、または、化学気相堆積法、パルスレーザー堆積法、真空プラズマスプレー法、湿式スプレー法、スパッタ法、蒸発法、分子ビームエピキタシ法などの任意の化学的および／または物理的堆積プロセスにより、シリコンウェハ上に形成され得る。
【００３５】
幾つかの実施形態では、生物学的種は、膜、および／または膜に付着した、またはそうでなければ膜に対して固定された、または膜と結合した接着層に接着することができる。生物学的種は、細胞、またはタンパク質およびペプチドなどの生体分子、抗体などを含んでいてもよい。幾つかの実施形態では、生物学的種は、哺乳類細胞または細菌細胞などの細胞であってもよい。ある場合には、肝細胞または足場依存性の細胞もしくは細胞株を研究することができる。
【００３６】
本発明の、これらの、および他の実施形態の機能および利点は、下記の実施例からより詳しく理解し得る。以下の実施例は、本発明のある種の実施形態を例示するが、本発明の全範囲を例証しない。
【実施例】
【００３７】
（実施例１）
サイズが約３ミクロンから約３０ミクロン（ＳＥＭ経由で測定）までの範囲にある細孔と、約３ミクロンから約１８ミクロンまでの範囲にある細孔間隔とを有する窒化ケイ素膜を、以下に記載のように、公知の技術を使用して微細加工した。まず、Ｒａｄｉｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ（ＲＣＡ）社洗浄技術を使用して４インチシリコン＜１００＞ウェハを洗浄し、窒素中で回転乾燥して、シリコンウェハの表面上に存在し得る任意の汚染物質を取り除いた。次に、ジクロロシランおよびアンモニア（それぞれ９５ｓｃｃｍ、１６ｓｃｃｍで）の雰囲気ガス流動中で、低応力窒化物の層（１μｍ）を、８００℃、２００ｍｔｏｒｒで成長させた。堆積した窒化ケイ素皮膜の測定された応力は、伸張性を有した（１８０ＭＰａ）。窒化ケイ素皮膜の厚さはＦｉｌｍｅｔｒｉｃｓ社製干渉計で測定し、皮膜の平均の厚さは、全ウェハについて２％未満で変化した。窒化物膜上の細孔は、まずＡＺ７２２０フォトレジストをウェハ上で回転させることにより、ウェハの前面上にパターン形成した。次に、クロムマスクを介してフォトレジストをＥＶＧ６２０接触式アライナで露光し、露光したウェハをＳｈｉｐｅｌｅｙ社製ＭＩＦ−３００現像機で現像した。ウェハをハードベークした後、窒化ケイ素皮膜を、５０ｍＴｏｒｒの圧力で、１０ｓｃｃｍのＯ２および１００ｓｃｃｍのＣＨＦ３で、Ａｌｃａｔｅｌ社製誘導結合型プラズマエッチャを使ってエッチングした。同一のリソグラフィーおよびエッチングプロセスを使用して、背面エッチング窓をパターン形成した。８０℃のＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）の超音波漕中で、フォトレジストを剥ぎ取った。最後に、ウェハを脱イオン水ですすぎ、回転乾燥した。ウェットエッチング用の片面エッチング保持器中にウェハを位置させることにより、窒化ケイ素膜上の細孔を暴露した。この膜を、９０℃の２５％テトラメチルアンモニウムヒドロキシド（ＴＭＡＨ）中でエッチングした。最後に、ウェハを脱イオン水およびメタノールですすぎ、空気乾燥した。細胞パターン形成のために以下の実施例４で使用された膜は、比較的均等な細孔サイズ分布を有し、細孔は約１８ミクロンの細孔サイズおよび約８ミクロンの細孔間隔を有した。
【００３８】
（実施例２）
コラーゲン溶液（０．０１２ＮのＨＣｌ中の１．５重量％のペプシン可溶化１型ウシ皮膚コラーゲンの滅菌溶液（Ｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）コラーゲンインソルーション（Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｉｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、Ｎｕｔａｃｏｎ ＢＶ、オランダ））を、実施例１に記載されたように加工された微細加工化多孔質窒化ケイ素膜の一方の面に接触させることにより、コラーゲンの細胞接着層を形成した。加工された窒化ケイ素表面上での、水およびコラーゲン溶液の接触角度は、それぞれ４９．２°および４８．４°であった。親水性表面は、コラーゲン溶液が窒化膜上で均一に拡散して、膜表面上の均一な層としてゲル化するのを可能にした。
【００３９】
（実施例３）
パターン形成されていない窒化ケイ素膜を介した光透過率を、Ａｇｉｌｅｎｔ社製８４５３型ＵＶ−可視分光光度計を使用して測定した。図３は、（ａ）ガラス（曲線Ａ）、（ｂ）コラーゲンをコーティングしたガラス（曲線Ｂ）、（ｃ）窒化ケイ素膜（曲線Ｃ）、（ｄ）コラーゲンのゲル層がコーティングされた窒化ケイ素膜に接着した細胞（曲線Ｄ）を介した光透過率を示す。光透過率は、窒化ケイ素薄膜内の光干渉のため、波長の変化と共に変動した。細胞／コラーゲン／パターン形成されていない窒化ケイ素膜を含有する堆積物を介した光透過率は、パターン形成されていない窒化ケイ素膜を介した光透過率よりほんの少し低いだけであった。したがって、細胞およびコラーゲンの存在による光吸収は、有意ではなかった。しかしながら、堆積物の厚さが増大するため、変動に位相変位が観察された。細胞層／コラーゲン／窒化ケイ素膜を介した光透過率は、５００〜１０００ｎｍの波長では５０％より高いことが見出され、このプラットフォームは、標準的な蛍光技術で非侵襲的に細胞を評価およびモニタするために使用され得ることが実証された。
【００４０】
（実施例４）
実施例１に記載されたように加工された窒化ケイ素膜を、一方の面上にコラーゲンでコーティングし、細胞を、図１に模式的に示したように、コーティングされた膜に接着した。パターン形成された窒化ケイ素膜を、最初にこの膜を１２０℃で１時間オートクレーブすることによって、細胞培養用に準備した。次に、４０μｌの１．５ｍｇ／ｍｌコラーゲン溶液を、４℃で膜の背面上にピペットで注下した。コラーゲンは、Ｏ２恒温器中で１時間、３７℃でゲル化させた。続いて、膜を裏返し、５０μｌの初代肝細胞懸濁液（１０５細胞／ｍｌ）で被覆した。この細胞を、ヘパトザイムＳＦＭ培地（Ｈｅｐａｔｏｚｙｍｅ ＳＦＭ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ）（Ｇｉｂｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア）中で４５分間、暴露されたコラーゲン上に接種した。次いで、膜を培地中で洗い、２ｍｌの培地で満たされた１２ウェルプレート中に位置させた。
【００４１】
膜の表面は微細パターン化されているため、数多くの細胞を一段階で窒化ケイ素膜上に配置することができた。本技術を実証するため、膜の裏面上にコーティングされたコラーゲンを持つ細孔配列（約１８ミクロンの平均細孔サイズを持つ、１ｍｍ×１ｍｍの細孔配列）を、膜の前面上の細胞懸濁液に暴露した。暴露されたコラーゲン上に細胞を接着させ、４時間置いた。細胞が多孔質窒化ケイ素膜上に接種された膜の前面の光学顕微鏡写真は、細胞がそれら自身を細孔の上方に配置したことを示す（図４）。約８０％の細孔が、細孔当たり１つの単一細胞で被覆されたことを観察した。近隣細胞と接触していたより大きな細胞は、互いに接着して細胞連鎖を形成した。培養５日後、肝細胞は、窒化ケイ素膜をコーティングしたコラーゲン層に固定化されたままであった。これらの結果は、本技術が、多数の単一細胞型バイオセンサーを生み出すハイスループットプロセスを開発するために使用できることを示す。
【００４２】
（実施例５）
次いで、実施例４に記載されたプロセスに従って調製した、接着した細胞を有する膜を、走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）を使用して研究した。最初に、２％のグルタルアルデヒド中で一晩細胞を固定する（膜に対して固定される）ことにより、ＳＥＭ試料を調製した。次に、濃度が増加する（１０％段階で３０％〜１００％）一連のエタノール溶液中に引き続いて浸漬させることにより、細胞を脱水した。次いで、Ｔｏｕｓｉｍｉｓ社製臨界点乾燥機を使用して細胞を持つ膜を乾燥させ、プラチナを試料表面にスパッタした。図５のＳＥＭ顕微鏡写真は、窒化ケイ素膜の裏面上にコラーゲンゲルがコーティングされた微細加工化細孔の上部に配置された単一細胞を示す。コラーゲンゲルは、細孔を介して窒化ケイ素膜の前面に浸透せず、細孔上方／内に単一細胞を正確に配置するのを可能にした。
【００４３】
本発明の幾つかの実施形態が本明細書に記載および例示されているが、当業者は、機能を実施するためのおよび／または本明細書に記載の結果または利点を得るための、様々な他の手段および構造を直ちに想定であろう。そうした変異、改変、および改良の各々は、本発明の範囲内であると見なされる。より一般的には、本明細書に記載された全てのパラメータ、材料、反応条件、および構成は例示的であることが意図され、実際のパラメータ、材料、反応条件、および構成は、本発明の教示内容が使用される具体的な用途に依存すると、当業者は直ちに理解しよう。当業者は、本明細書に記載された本発明の具体的な実施形態に相当するものを数多く認識し、または定常を越えないほどの実験を使用して確定することができよう。それゆえ、前述の実施形態は例示のためのみに提示され、添付の特許請求の範囲およびそれに相当するものの範囲内において、本発明は具体的な記載とは異なって実行され得ると理解されるべきである。本発明は、本明細書に記載の各個別の特性、システム、材料、および／または方法を対象とする。加えて、２つ以上のそのような特性、システム、材料、および／または方法の任意の組合せは、そうした特性、システム、材料、および／または方法が相互に矛盾しない限り、本発明の範囲内に含まれる。本請求項において（上記明細書においても同様に）、「備える」、「含む」、「運搬する」、「有する」、「含有する」、「で構成される」、「で作られている」、「で形成される」、「伴う」などの、全ての移行句または内包語句は、開放的に、すなわち、「含むが限定されない」という意味に解釈されるべきであり、それゆえ、追加項目と同様にその後に列挙する項目およびそれに相当するものを包含する。「からなる」および「から本質的になる」という移行句または内包語句のみが、それぞれ閉鎖的または半閉鎖的語句として解釈されるべきである。本明細書および本請求項において使用される場合、不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、それに反すると明記されていない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。
【００４４】
本明細書および特許請求の範囲において使用される「および／または」という語句は、結合される要素、すなわち、ある場合には接続的に存在し、別の場合には非接続的に存在する要素の「いずれか一方または両方」を意味すると理解されるべきである。他の要素は、「および／または」節によって具体的に特定された要素以外に、具体的に特定されたそれらの要素に関連している、または関連していないにかかわらず、任意選択で存在してもよい。したがって、非限定的な例として、「Ａおよび／またはＢ」への言及は、１つの実施形態では、Ａのみを（Ｂ以外の要素を任意選択で含む）；別の実施形態では、Ｂのみを（Ａ以外の要素を任意選択で含む）；さらに別の実施形態では、ＡおよびＢの両方（他の要素を任意選択で含む）；等を指し得る。本明細書および本請求項において使用される場合、「または」は、上記で定義されたような「および／または」と同一の意味を有すると理解されるべきである。例えば、リストにある項目を分割する際に、「または」または「および／または」は、包括的であるとして、すなわち、数多くのまたは列挙された要素の少なくとも１つ（１つより多くのものも含むが）と、任意選択で列挙されていない追加項目とを包括するとして、解釈されるべきである。「〜の１つのみ」または「〜の正確に１つ」など、それに反すると明記された用語のみが、数多くのまたは列挙された要素の正確に１つの要素を包括することを指す。一般的に、本明細書で使用する場合、「または」という用語は、「いずれか一方」、「〜の１つ」、「〜の１つのみ」または「〜の正確に１つ」などの、排他性の用語が先行する場合のみ、排他的代替性（すなわち「一方または他方であるが両方ではない」）を示すと解釈されるべきである。
【００４５】
１つまたは複数の要素リストに関して、本明細書および本請求項において使用される場合、「少なくとも１つ」という語句は、他に指示がない限り、要素リストの１つまたは複数の任意の要素から選択される少なくとも１つの要素を意味するが、要素リスト内に具体的に列挙された１つ１つ全ての要素の少なくとも１つを必ずしも含まず、要素リスト中の要素の任意の組合せを除外しないと理解されるべきである。この定義はまた、具体的に特定されたそれらの要素に関連する、または関連しないにかかわらず、「少なくとも１つ」という語句が指す要素リスト内で具体的に特定された要素以外に、要素が任意選択で存在してもよいことも許容する。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または、同等に、「ＡまたはＢの少なくとも１つ」、または、同等に「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）は、１つの実施形態では、Ｂが存在せずに、複数を任意選択で含む、少なくとも１つのＡ（かつＢ以外の要素を任意選択で含む）；別の実施形態では、Ａが存在せずに、複数を任意選択で含む、少なくとも１つのＢ（かつＡ以外の要素を任意選択で含む）；さらに別の実施形態では、複数を任意選択で含む、少なくとも１つのＡ、および複数を任意選択で含む、少なくとも１つのＢ（かつ他の要素を任意選択で含む）等を指し得よう。
【００４６】
特許および公開出願を含む、本明細書で引用された全ての参照文献は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書と、参照により組み込まれた、かつ／または本明細書に参照された文書とが、矛盾する開示内容および／または技術用語の不統一な使用を含み、かつ／または、それらが本明細書での使用または定義と異なって、組み込まれた／参照された文書が用語を使用または定義する場合、本明細書が優先する。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は、本発明の１つの実施形態に従った細胞ベースの器具を模式的に例示する。
【図２Ａ】図２Ａは、本発明の１つの実施形態に従った２チャンバシステムを模式的に例示する。
【図２Ｂ】図２Ｂは、本発明の１つの実施形態に従った、膜内の細孔に接着した細胞を例示する。
【図３】図３は、（ａ）ガラス基材、（ｂ）コラーゲン付きのガラス基材、（ｃ）窒化ケイ素膜、および（ｄ）コラーゲンおよびコラーゲンに接着した細胞付きの窒化ケイ素膜、を介した光透過スペクトラムを示す。
【図４】図４は、コラーゲンでコーティングされた多孔質窒化ケイ素膜上に接種された細胞の光学顕微鏡写真を示す。
【図５】図５は、窒化ケイ素膜の裏面からコラーゲンゲルでコーティングされた微細加工化細孔の上部に配置された単一の細胞のＳＥＭ顕微鏡写真を示す。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、生体分子および／または生体細胞の研究に使用するための物品および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
細胞ベースの器具は、細胞増殖と、細胞遊走と、トキシン、病原体、薬物、または他の細胞などの作用物質に対する細胞応答とを含む細胞の挙動を研究するための、ハイスループット医薬品試験システムに多数使用されてきた。膜などの材料が細胞培養環境の中で使用されることにより、種々の応用例に用途を見出し得る細胞ベースの器具の開発が加速している。多数のシステムで高分子膜の使用が採用されており、そこでは細胞が膜の表面にまたは膜の細孔内に接着することができ、細胞の挙動が研究できる。多数の公知である高分子膜では、細孔サイズおよび細孔分布の両方を制御するのが困難である恐れがあり、細胞の挙動を正確にモニタする能力に制約がある。細孔サイズおよび細孔分布の制御をより厳密に達成する１つの方法は、複数層の高分子膜を用いることでもよいが、複合膜の厚さが増大し（例えば、少なくとも４０ミクロン）、柔軟性が減少するという結果をもたらす。これは、例えば、複合膜の反対面上の細胞間の相互作用を伴う研究に弊害をもたらす恐れがある。逆に、厚さが減少した高分子膜は、望ましくなく低い機械的強度によって特徴付けられることが多い。そのうえ、多数の従来型高分子膜に対する細胞の接着を、制御およびモニタするのが困難である恐れがある。細胞は細孔に接着し得るが、細孔間の箇所に接着する可能性もあり、それは規則正しく並んだ組織の増殖を妨害し得るか、または、そうでなければ、ある種の応用例にとって望ましくない恐れがある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、改良された方法および材料が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（発明の要旨）
本発明は、ある種の実施形態においては、膜を備えた細胞培養および／または細胞アッセイ用に構成された装置に関する。膜は、主に無機材料を含んでいてもよく、第１の面および対向する第２の面、ならびに膜の第１の面から第２の面までを貫通する複数の細孔を備える。
【０００５】
本発明はまた、細胞培養および／または細胞アッセイ用の物品であって、第１の面および対向する第２の面を有する膜；膜の第１の面から第２の面までを貫通する複数の細孔、および細孔を介して対向する第２の面と接触している環境に暴露され、複数の細孔の少なくとも一部を閉塞するように、膜の第１の面上に配置された細胞接着性材料層を備えた物品に関する。
【０００６】
別の態様では、本発明は、第１の面、対向する第２の面、および膜の第１の面と第２の面との間を貫通する複数の細孔を備えた膜を用意すること；細胞が実質的に細孔を密封し、流体が膜を通して膜の第１の面と第２の面との間を流れるのを実質的に妨げるように細孔のサイズを決定した膜上に細胞を配置すること；膜の第１の面を第１の流体に、膜の第２の面を第２の流体に暴露することを含み、流体の交換が、膜を通して第１の面と第２の面との間で起こらず、または膜表面積１ｃｍ２、１時間当たり流体１ｃｍ３未満の割合で起こる方法を提供する。
【０００７】
本発明はまた、第１の面および対向する第２の面、ならびに膜の第１の面と第２の面との間を貫通する複数の細孔を備えた膜を用意すること；少なくとも膜の第１の面に細胞を提示すること；およびこうした細胞の少なくとも１つの、細孔を介した第１の面から第２の面への遊走を決定することを含む方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
添付図面は模式的であり、スケールに合わせて描かれることを意図していない。図中、種々の図に例示された同一のまたは実質的に類似した各構成要素は、典型的には、単一の番号または記号により表される。明確さを期すために、当業者に本発明を理解させるために例示が必ずしも必要ではない場合には、全ての構成要素が全ての図で標識されているわけではなく、本発明の各実施形態の全ての構成要素が示されているわけでもない。
【０００９】
（詳細な説明）
本発明は、多孔質であり得る材料、特に膜を伴う物品と方法に関し、種々の応用例、特に、細胞の培養および／または細胞を伴うアッセイを伴う応用例に有用であり得る。本発明のある種の材料（例えば、膜または膜（複数可）を含む多構成要素材料）は、生体分子（細胞の表面に存在してもよい）などの種と相互作用が可能で、それによって種は、材料の表面に接着し、または材料と結合することができる。幾つかの実施例では、本発明の材料は、種の配置および空間的分布を材料の表面にわたって制御し得る可能性がある。そのような材料および方法は、例えば、バイオアッセイ、バイオセンサー、または生体細胞の培養に有用であり得る。
【００１０】
本発明の物品および装置は、生体分子および／または生体細胞の研究に有用な膜を備えていてもよい。既に公知である典型的な細胞研究用のシステムは、平均細孔サイズの制御が不良なだけでなく、細孔の空間的分布が無作為である膜を採用することが多い。この研究で、そのような材料を使用し、かつ膜の表面に付着した細胞などの種を使用すると、一貫性のないおよび／または解釈が困難な結果が生じる恐れがある。対照的に、本発明は、ある種の実施形態では、細孔サイズおよび細孔の空間的分布の両方を制御して製作することができる膜を提供する。その結果、膜に対する細胞などの種の固定化を、ある場合には細孔の空間的分布に基づいて制御することもできる。例えば、膜の細孔は、実質的に大多数の種が細孔間の区域ではなく、細孔内の、細孔と同一の広がりを有する、または細孔と重複した領域内にのみ接着するように、表面への種の接着を導くことができる。接着した種の空間的制御は、数多くの応用例で有利であり得る。例えば、表面上の細胞の接着を制御することは、以下でより詳細に記載するように、組織工学で有用であり得る。さらに、本発明の膜は、他の従来型の膜と比較して、薄く（例えば、厚さが４０ミクロン未満）、柔軟性を有し、膜の対向する面上の種間の接触を促進することができる。
【００１１】
本発明は、ある種の実施形態において、細胞培養および／または細胞アッセイに使用するための膜を備えた物品を提供し、そのような物品は、第１の面および対向する第２の面、ならびに膜の第１の面から第２の面までを貫通する複数の細孔を有する膜を備え、膜は主に無機材料を含む。
【００１２】
本明細書で使用する場合、「無機材料」という用語には、その通常の意味が付与され、有機材料ではない任意のものを意味する。「有機材料」もまた、この文脈におけるその通常の意味に従って使用され、すなわち、１つまたは複数の炭素−水素結合を含有する分子で構成される材料である。例えば、無機材料は、少なくとも１つの金属原子（例えば、１〜１７族から選択される金属原子）を含む材料および／またはその化合物を含んでもよいが、それらに限定されず、そのような化合物は水素に結合した炭素原子を含む官能基を典型的には含有しない。無機材料の幾つかの例には、セラミックス、ガラス、および金属が含まれていてもよい。ある場合には、無機材料は、金属酸化物または金属窒化物を含む。特定の実施形態では、無機材料は、窒化ケイ素（ＳｉＮ）であってもよい。無機材料は、不透明、半不透明性半透明、または透明であってもよく、ガス透過性、半透過性、またはガス不透過性であってもよい。ある場合には、無機材料は、約４００ｎｍより長い波長で光学的に透過性であるように選択してもよい。無機材料はまた、細胞および／または生体分子と適合するように選択してもよい。本発明に従って使用可能である多種多様で好適な無機材料は、本明細書で提供される手引きおよび教示が与えられれば、当業者にとって直ちに明白になり、または当業者ならば過度の実験をせずに選択することができる。
【００１３】
幾つかの実施形態では、本発明の膜は、単一層の材料（例えば、無機材料）を含んでいてもよい。ある種の実施形態では、膜は、第１の面と第２の面との間で測定された約３０ミクロン未満の厚さを有する少なくとも１つの部分を含んでいてもよい。幾つかの実施形態では、厚さは、約２０ミクロン未満、約１０ミクロン未満、または約５ミクロン未満であり得る。
【００１４】
幾つかの実施形態では、膜は、例えば、平均細孔サイズからのサイズの逸脱が約１０％（ある場合にはわずか約５％）を超える細孔が全細孔の約５％以下であるように、比較的均等な細孔サイズの分布を有するように構築される。本明細書で使用する場合、「細孔サイズ」は、顕微鏡的に、例えば、可視光顕微鏡法または走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）のいずれか一方または両方を使用して決定することが可能で、細孔の円周上の２点を結びかつ細孔開口部の幾何学的中心を通った、膜の表面に平行な最短線の長さを指す。
【００１５】
当業者に公知である微細加工技術を使用して、細孔の断面形状（円形状、楕円形状、三角形状、不規則形状、正方形状または長方形状など）、数、および寸法は、特定の応用例に適するように変化させることができる。好適なまたは潜在的に好適である種々の微細加工技術は、例えば、Ｓｉｌｉｃｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｆｏｒ ｔｈｅ ＶＬＳＩ Ｅｒａ、第２版、第１巻、Ｓ． ＷｏｌｆおよびＲ． Ｎ． Ｔａｕｂｅｒ、Ｌａｔｔｉｃｅ Ｐｒｅｓｓ、Ｓｕｎｓｅｔ Ｂｅａｃｈ、ＣＡ（２０００年）；Ｍ． Ｊ． Ｂｏｗｄｅｎ、「Ａ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｎ ｒｅｓｉｓｔ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ ｆｉｎｅ ｌｉｎｅ ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ」、Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｌｉｔｈｏｇｒａｎｈｙ， Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｅｒｉｅｓ， ＃ ２６６、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、第３章、３９〜１１７頁（１９８４年）に収録；Ｄ． Ｎｙｙｓｓｏｎｅｎ、「Ｏｐｔｉｃａｌ Ｌｉｎｅｗｉｄｔｈ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｎ Ｐａｔｔｅｒｎｅｄ Ｗａｆｅｒｓ」、ＳＰＩＥ ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ、第４８０巻、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｃｉｒｃｕｉｔ Ｍｅｔｒｏｌｏｇｙ、６５頁（１９８４年）；およびＪ．Ｄ． Ｃｕｔｈｂｅｒｔ、「Ｏｐｔｉｃａｌ Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ」、Ｓｏｌｉｄ Ｓｔａｔｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、５９頁、１９７７年８月；において考察され、これらの各々は参照により組み込まれる。例えば、細孔は本質的に円形状の断面形状を有していてもよい。ある場合には、細孔は、膜が暴露され得る種の最小断面寸法より小さい最小直径を有していてもよい。ある場合では、細孔サイズは、膜が暴露され得る種よりずっと大きく選択してもよい。さらに、細孔の空間的分布は、少なくとも約５０％の細孔が直近の隣接した細孔から約２５ミクロン未満に配置されるように、公知の技術を使用して制御することができる。幾つかの実施形態では、細孔は、約２〜３％以下のサイズ偏差で約０．２ミクロンから約１００ミクロンの平均細孔サイズを有することができる。ある種の実施形態では、最小細孔サイズは、少なくとも約１ミクロンである。典型的には、細孔の空間的分布は、直近の隣接した細孔間の距離が約１〜５０ミクロンであり得るものであってよい。各々の場合には、上記で参照した、隣接している細孔を隔てる距離は、特定の細孔の円周周辺とその直近の隣接した細孔の円周周辺を結ぶ最短距離を指す。
【００１６】
フォトリソグラフィーが発明の膜を加工する技術として使用される実施形態では、細孔サイズは、使用する特定のリソグラフィーマスクの設計上／描画上の特徴的サイズによって決定され得る。細孔の間隔は使用する材料と採用するリソグラフィー用具との組合せによって決定され得る。優位的な機械的安定性を有する膜を加工するには、細孔の間隔は、直近の隣接した細孔間の距離が約２ミクロン以上であり得るものであってよい。膜の厚さは、基質材料上に堆積する薄膜の厚さに依存し、例えば、約２００ｎｍから約２ミクロンまで幅広く変化し得る。
【００１７】
幾つかの実施形態では、膜は、ある種の実施形態では細胞接着層および細胞でコーティングされているが、少なくとも約１ｍｍ２の面積を有し、約４００ｎｍから約８００ｎｍまでの波長の範囲内の少なくとも１つの波長で少なくとも３０％の光透過率を示す少なくとも１つの部分を含んでいてもよく；他の実施形態では、そのような部分（複数可）中で、約４００ｎｍから約８００ｎｍまでの波長の範囲内の少なくとも１つの波長で少なくとも４０％または少なくとも５０％の光透過率を示し得る。１つの実施形態では、ＳｉＮ膜は、ＵＶ光の透過を遮蔽することができ、ＵＶ光は細胞膜の変性および細胞死を引き起こす恐れがあるため、例えば環境検出システムに有利であり得る。ＵＶ光が膜によってシステムから本質的に濾波され得るため、このことによって、そのようなデバイスの構成を単純化することができる。
【００１８】
本発明の膜はまた、膜の表面にまたは膜の表面をコーティングする材料に、様々な種の接着を可能にすることができ、またはそのように改変してもよい。例えば、細胞および／またはタンパク質などの生体分子を、例えば細孔の側壁に沿った区域または膜の表面上の細孔間の区域を含む膜の種々の部分に対して固定化することができる。幾つかの実施例では、そのような種は、他の区域ではなく膜のある区域に優先的に接着することができる。例えば、そのような種の実質的に全てが、細孔間の区域にではなく、膜の細孔と同一の広がりを有する領域内に、細孔内に、または細孔と重複して接着することができる。種が細孔と同一の広がりを有する領域内に、細孔内にまたは細孔と重複して接着したとき、種の少なくとも一部分が、膜の側面と平行な平面で細孔の断面区域に渡って膜と結合または付着した材料に付着するように、細孔のサイズを決定することができる。ある場合には、種は、そのような細孔の断面区域と同一の広がりを有する領域内のみに接着することができる。ある場合には、さらに以下に記載し図２Ｂに例示するように、種は、例えば細胞などの種が実質的に細孔を密封するように、そのような細孔の断面区域の実質的な大部分と同一の広がりを有する領域内に接着することができる。
【００１９】
本発明の幾つかの物品は、膜の少なくとも１つの面に対して付着、固定化、またはそうでなければ結合した細胞または他の生物学的種などの特定の種を、優先的に誘引および／または結合させるように選択された接着性材料を含んでいてもよい。例えば、膜の他方の面が細胞を含有する培地に暴露しているとき、膜の少なくとも１つの細孔に渡る、ある場合には膜の少なくとも１つの細孔を閉塞する層内に含有および／または存在することにより細胞に暴露された細胞接着性材料を含む領域内に細胞が接着できるように、膜の面の一方の表面上に配置された細胞接着性材料を含んでいてもよい（例えば、図１を参照）。ある種の実施形態では、接着性材料は細胞接着性材料である。本明細書で使用する場合、「細胞接着性材料」という用語は、細胞が接着する可能性のある任意の化学的または生物学的材料を指してもよい。ある種の実施形態では、そのような細胞接着性材料は、膜の少なくとも１つ面の表面に付着した連続層として構成される。そのような細胞接着性材料層は、例えばコラーゲンもしくは多糖類とコラーゲンの混合物、抗体、細胞表面受容体に対するリガンド、抗原、レクチン、インテグリン、セレクチン、プロテインＡもしくはプロテインＧなどの細菌由来親和性分子、その誘導体、その混合物、またはコラーゲン、ゼラチン、アガロース、アクリルアミド、キトサン、セルロース、デキストラン、アルギン酸塩、カラゲナンなどのゲルもしくは他の層形成材料と結合した上記任意ものなど、生体細胞の膜またはその構成要素に特異的または非特異的に結合することができると当技術分野において公知の様々な種の任意のものを含んでいてもよい。
【００２０】
１つの実施形態では、細胞接着性材料層は、細孔を介して膜の対向する第２の面に（すなわち、膜の第２の面に接触している環境に）暴露されるように、膜の第１の面上に配置してもよい。図１は、本発明のそのような実施形態の一例を示す。図１ａは、複数の細孔２０を備えた膜１０を示す。接着性材料層３０は、膜の対向する第２の面への細孔と同一の広がりを有する領域に暴露されるように、膜の第１の面上に形成および配置することができる（図１ｂ）。膜の第２の面を細胞４０に暴露すると、細胞４０が、暴露した接着性材料３０に接着し、複合物品４６を形成することができる。接着性材料は、細胞または細胞表面に結合している種（例えば、受容体、イムノグロブリンなど）などの特定の標的種に優先的に結合するように選択してもよい。図１ｃに例示されているような本発明のシステムは、細胞を表面に接着したままで検査することができ、多数の細胞型の生存率は細胞接着に依存する可能性があるため、細胞挙動の研究に有用であり得る。例えばコラーゲンに接着した細胞は、例えば、長時間にわたるインキュベーションにおいてそれら細胞の分化状態を維持することができる。
【００２１】
他の実施形態では、細胞接着性材料は、膜の任意の部分上にまたは膜の任意の部分に沿って配置されてもよい。例えば、細胞接着性材料層は、細孔内で細胞の接着を達成するために、細孔の側壁に沿って配置してもよい。細胞接着性材料層はまた、細孔開口部の表面にのみ配置してもよい。あるいは、細胞接着性材料層は、膜の細孔間の表面上にのみ配置してもよい。この層は、膜上の単一の箇所にまたは膜上の箇所の組合せに配置してもよい。当業者は、特定の応用例に適合するように細胞接着性材料層の配置を選択できよう。
【００２２】
ある場合には、単一の細孔に、単一の細孔内に、または単一の細孔と同じ広がりを有する領域内に単一細胞のみを接着させるように、細孔のサイズを決定することができ、それによって、物理的に単離された複数の単一細胞が膜の表面上に配列されることを可能にし、そこでは、表面上の細胞の空間的分布が細孔の空間的分布に相関する。これは、細胞が膜表面上の種々の箇所に無差別に接着する可能性がある多数の従来型システムと比べて有利であり得る。ある場合には、使用中に、細孔の少なくとも５０％が単一細胞を各細孔に付着させることができる。ある場合には、少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも８０％である。
【００２３】
本発明の物品は、細胞および／または他の生物学的実体の研究用に構成されたデバイスに組み込まれていてもよい。例えば、ある種の実施形態では、本明細書に記載された膜はマルチチャンバ装置内で使用してもよく、その装置は、第１および第２のコンパートメントが膜によって分離され、例えば流体を含有するように構築および配置された、第１のコンパートメントおよび第２のコンパートメントを少なくとも備える。すなわち、このデバイスは、少なくとも１つのコンパートメントを含有してもよく、コンパートメントは壁によって囲まれ、少なくとも１つの壁は膜を備える。このコンパートメントには、流体環境などの、膜が暴露され得る環境を含有することが可能であってもよい。この装置はさらに、膜に隣接して配置された流体の、各コンパートメント内での含有を容易にするように構築および配置された構成要素を備えていてもよい。例えば、この装置は、流体を膜に接触させて配置することを可能にする、種々のインレット、アウトレット、ポンプなどを備えていてもよい。図２Ａは、本発明のそのような実施形態の例示的な例を示す。既に記載のように、膜１０および細胞接着性材料３０ならびに接着した細胞４０を備えた複合層４６は、この層がチャンバ６０とチャンバ９０を分離するように、デバイス５０内に配置されている。流路７０、８０、および１００は、デバイス内へ流体および／または他の構成要素を導入し、またはデバイスから流体および／または他の構成要素を除去するために使用してもよい。細胞４０は、細胞４０の頂部分４２および底部分４４がそれぞれ、膜の対向する面上に存在する異なる環境に暴露し得るように、細孔２０上または細孔２０内に接着できる。細胞の頂部分４２は、膜の上部表面２２と接触している一方の環境に暴露され得るが、細胞の底部分４４は、膜および／または細胞接着性材料の底部表面２４と接触している別の環境に暴露され得る。
【００２４】
幾つかの実施形態では、膜を備えた本発明のデバイスは、組織増殖のモニタおよび制御を可能にするように構成することができる。マトリックス表面への細胞接着の重要な局面を制御できず、規則性が不良な組織形成を生じさせるある種の従来型の組織増殖および工学用のプラットフォームとは異なり、本発明のある種の実施形態により提供されるある種のプラットフォームは、細胞増殖を導くための確定した構造を有し、高度に規則的で、かつ生理学的に正しい組織の産生を促進させ得る。また、そのような発明の材料は、組織の増殖および発生に影響する要因および条件の研究に役立ち得る。幾つかの実施形態では、本発明の膜を備えた物品は、表面上に接着した細胞の規則的配列を形成する能力を有することができ、それは細胞および組織の定方向増殖を促進することができる。
【００２５】
表面上に接着した細胞の間隔を制御する能力は、生物学的作用物質および／または生体分子に対する細胞の応答、および／または個別の細胞応答、または細胞間シグナル伝達、または他の細胞間相互作用を研究するための、種々の応用例に特に有用であり得る。幾つかの実施形態では、膜は、接着した細胞の規則的配列を含むことができ、すなわち単一細胞が膜の表面にわたって単一細孔と同一の広がりを有する領域に付着することができ、ある場合では、膜の少なくとも１つの面が生体分子および／または生物学的作用物質に暴露された際に、生体分子および／または生物学的作用物質への細胞の暴露の影響を迅速にスクリーニングすることができる。幾つかの実施形態では、細胞の第１のセットは膜表面に接着することができ、膜の少なくとも１つの面上で、癌細胞など細胞の第２のセットを含む環境に暴露され得る。細胞の第１のセット（例えば、接着した細胞）と細胞の第２のセットとの間の細胞間相互作用は、ある場合では、接着した細胞の特定の部分でモニタすることができる。本発明のある種の膜は、膜が十分に薄く（例えば、４０ミクロン未満の厚さ）、膜の対向する面上の細胞が細孔を介して互いに接触できるため、細胞間相互作用の研究に特に有用であり得る。
【００２６】
本発明の膜を備えた物品に接着した細胞はまた、例えば、細胞上の抗体、抗原、増殖および制御因子などの有効性および／または細胞毒性、またはそれらのある種の機能を、例えばスクリーニングするために、他の生体分子および／または生物学的作用物質（例えば、タンパク質、抗体など）に暴露されてもよい。さらに、細胞の挙動、機序、およびプロセスも研究が可能である。例えば、膜を備えた物品の底部表面２４の、生物学的作用物質を含む環境への暴露は、ある場合には、特に細胞の底部分４４（図２Ｂ）での、生物学的作用物質に対する細胞応答の研究を可能にし得る。
【００２７】
上述したように、ある場合には、本発明の物品は、例えば細胞培養用の、マルチチャンバ灌流システム中に組み込まれてもよい。図２Ａは、そのような応用例のために構成された本発明の例示的実施形態を示す。本明細書に記載のように細胞接着性材料層でコーティングされた膜を備えた物品４６は、この物品がチャンバ６０とチャンバ９０を分離するように、デバイス５０中に配置されている。流路７０は、流体および／または他の構成要素が物品の上部表面２２に接触するように、チャンバ６０に流体および／または他の構成要素を導入するために使用してもよい。流路１００は、流体および／または他の構成要素が物品の底部表面２４に接触するように、チャンバ９０にまたはチャンバ９０から流体および／または他の構成要素を導入および／または除去するために使用してもよい。
【００２８】
幾つかの実施形態では、膜を介した流体の交換は、細胞接着層３０および／または細胞４０の存在により実質的に妨げることができる。例えば、流体の交換は、膜を介して膜の第１の面と第２の面との間で起こらず、または膜表面積１ｃｍ２、１時間当たり流体１ｃｍ３未満の割合で起こってもよい。図２Ａに示された例示的実施形態では、膜／細胞接着層／付着細胞の複合体は、チャンバ６０とチャンバ９０の間の実質的な流体の交換を妨げることができる。
【００２９】
幾つかの実施形態は、膜上に配置された細胞を含むことができ、細胞が細孔と同一の広がりを有する領域に、細孔内の領域に、または細孔と重複した領域に固定化されたとき、細胞がそのような細孔を実質的に密封できるように、細孔のサイズを決定する。例えば、細孔は、接着した細胞によって覆われる、かつ／または密封されるほど十分に小さくあり得るサイズを有することが可能で、細胞の少なくとも一部分が、膜の表面（例えば表面２２）に平行な平面にとられた細孔の断面区域と同一の広がりを有する領域の実質的な大部分に接着することができる。
【００３０】
図２Ｂに示すように、細孔２０が実質的に密封されて、例えば膜の両面間の流体の交換または拡散が、細胞４０自体を介して起こる場合を除き、妨げられるように、細胞４０は、細孔２０の領域内で細胞接着層３０に接着することができる。ある場合には、細胞は、細胞との相互作用による膜を通したある種の交換（例えば、細胞を通した／介する拡散および／または能動輸送）しか可能にしない場合がある。例えば、膜の１つの面は、細胞が細胞膜を介して吸収し、細胞生存および増殖を促進し得る種を含む環境に暴露していてもよい。同様に、細胞はまた、細胞膜を介して他方のチャンバ中に種々の種を排出することができる。１つの例示的な実施形態では、細胞４０は、細孔２０の領域内で細胞接着層３０に接着したとき、頂部分４２および底部分４４が、（図２Ａに例示したような）２チャンバシステム中の異なる液状環境に暴露され得るように、頂部分４２（例えば、頂端膜）および底部分４４（例えば、基底膜）を備えていてもよい。そのような１つの実施形態では、流路７０は、酸素、窒素、二酸化炭素、栄養素、培地などをチャンバ６０中に運搬するために使用してもよく、それらの１つまたは複数が細胞の細胞部分４２（例えば、頂端膜）を介して細胞中に輸送され得る。次いで、老廃物は、細胞部分４４（例えば、基底膜）によって細胞からチャンバ９０中に分泌され得る。流路１００は、老廃物をデバイス５０の外部に輸送するために使用されてもよい。したがって、長期の細胞培養の期間を通じて、高い細胞生存率が維持され得る。
【００３１】
本発明の別の態様は、細胞遊走を研究するための方法を提供する。細胞遊走は、例えば細胞が、特異的な部位に向かって特定の方向に運動することが必要であり得る、創傷治癒、組織形成（例えば修復、胚発生などの発生など）、疾患進行（例えば、癌の進行）、および／または免疫応答の研究に重要であり得る。例えば、創傷治癒（例えば、皮膚性または血管性創傷治癒）の初期段階は、損失または損傷細胞を置換する細胞分裂ではなく、創傷区域中への細胞遊走を伴う可能性がある。本発明の方法は、本明細書に記載したように膜の第１の面に細胞を提示すること、および細胞の、細孔を介した膜の第１の面から膜の第２の面への遊走を決定することを含んでいてもよい。幾つかの実施形態では、この方法は、膜の表面に細胞を接着させること、および例えば、少なくとも２つの細孔間で表面を横切る細胞の遊走を決定することを含んでいてもよい。細胞の遊走は、当業者に公知の方法により決定することができる。ある例では、細胞は、膜の第１の面から細孔に進入可能であり、細胞遊走は、膜の第２の面から細孔を出る細胞数を測定することによりモニタすることができる。
【００３２】
ある場合には、本発明の膜は、細胞遊走誘導または阻害作用物質を含んでいてもよく、「細胞遊走作用物質」は、ある区域を横切る、例えば創傷区域中への細胞の遊走を促進または阻害する可能性のある、任意の化学的または生物学的種であってよい。細胞遊走作用物質は、１つまたは複数のポリヌクレオチド、タンパク質、糖質、脂質、有機分子、合成または天然の薬剤、および／または当業者に公知である他の細胞遊走作用物質を含んでいてもよい。細胞遊走研究のために使用される本発明の膜は、細孔の側壁、細孔の入り口、膜の１つまたは複数の面の表面、または膜の他の任意の部分もしくは部分群に沿って配置され、場合によって付着している細胞遊走作用物質を含んでいてもよい。ある場合には、細孔のサイズは、細孔内への細胞の進入および／または細孔を介した細胞の遊走を促進するように、十分に大きくてもよい。
【００３３】
本発明の膜は、ある種の実施形態では無機材料を主に含んでいてもよく、またはある種の実施形態では無機材料から本質的になっていてもよく、または他の実施形態では無機材料からなっていてもよい。無機材料は、例えば、任意の好適な金属酸化物（複数可）および／または金属窒化物（複数可）であってもよい。ある場合には、無機材料は、ＳｉＮ、ＳｉＯ２、Ａｌ２Ｏ３、ＴｉＯ２、および／またはＴｉＮを含んでいてもよい。特定の実施形態では、無機材料はＳｉＮを含む。前述したように、無機材料は、特定の応用例に適合するように選択することができる。例えば、無機材料は、細胞との生体適合性に基づいて選択することができ、すなわち無機材料は、実質的に無毒であり得る。ある場合には、無機材料は、約４００ｎｍから約８００ｎｍまでの波長の範囲内の少なくとも１つの波長で少なくとも３０％の光透過率を示すことができる。
【００３４】
膜は、前述したように、当技術分野で公知の、任意の各種好適な微細加工技術を使用して形成され得る。例えば、微細打抜き、フォトリソグラフィー、エッチング、ステンシル印刷、または他のシリコン微細加工技術などである。ある種の実施形態では、例えば、膜が細胞培養および／または細胞アッセイ用に構成された装置内で使用されるある種の実施形態では、フォトリソグラフィー技術を使用すれば、有利には膜を形成することができる。幾つかの実施形態では、膜または膜の前駆体は、金属窒化物層を形成するために、当技術分野で公知の方法により窒化され得る。例えば、窒化皮膜は、窒素環境（例えば、アンモニアなど）への暴露に際し、または、化学気相堆積法、パルスレーザー堆積法、真空プラズマスプレー法、湿式スプレー法、スパッタ法、蒸発法、分子ビームエピキタシ法などの任意の化学的および／または物理的堆積プロセスにより、シリコンウェハ上に形成され得る。
【００３５】
幾つかの実施形態では、生物学的種は、膜、および／または膜に付着した、またはそうでなければ膜に対して固定された、または膜と結合した接着層に接着することができる。生物学的種は、細胞、またはタンパク質およびペプチドなどの生体分子、抗体などを含んでいてもよい。幾つかの実施形態では、生物学的種は、哺乳類細胞または細菌細胞などの細胞であってもよい。ある場合には、肝細胞または足場依存性の細胞もしくは細胞株を研究することができる。
【００３６】
本発明の、これらの、および他の実施形態の機能および利点は、下記の実施例からより詳しく理解し得る。以下の実施例は、本発明のある種の実施形態を例示するが、本発明の全範囲を例証しない。
【実施例】
【００３７】
（実施例１）
サイズが約３ミクロンから約３０ミクロン（ＳＥＭ経由で測定）までの範囲にある細孔と、約３ミクロンから約１８ミクロンまでの範囲にある細孔間隔とを有する窒化ケイ素膜を、以下に記載のように、公知の技術を使用して微細加工した。まず、Ｒａｄｉｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ（ＲＣＡ）社洗浄技術を使用して４インチシリコン＜１００＞ウェハを洗浄し、窒素中で回転乾燥して、シリコンウェハの表面上に存在し得る任意の汚染物質を取り除いた。次に、ジクロロシランおよびアンモニア（それぞれ９５ｓｃｃｍ、１６ｓｃｃｍで）の雰囲気ガス流動中で、低応力窒化物の層（１μｍ）を、８００℃、２００ｍｔｏｒｒで成長させた。堆積した窒化ケイ素皮膜の測定された応力は、伸張性を有した（１８０ＭＰａ）。窒化ケイ素皮膜の厚さはＦｉｌｍｅｔｒｉｃｓ社製干渉計で測定し、皮膜の平均の厚さは、全ウェハについて２％未満で変化した。窒化物膜上の細孔は、まずＡＺ７２２０フォトレジストをウェハ上で回転させることにより、ウェハの前面上にパターン形成した。次に、クロムマスクを介してフォトレジストをＥＶＧ６２０接触式アライナで露光し、露光したウェハをＳｈｉｐｅｌｅｙ社製ＭＩＦ−３００現像機で現像した。ウェハをハードベークした後、窒化ケイ素皮膜を、５０ｍＴｏｒｒの圧力で、１０ｓｃｃｍのＯ２および１００ｓｃｃｍのＣＨＦ３で、Ａｌｃａｔｅｌ社製誘導結合型プラズマエッチャを使ってエッチングした。同一のリソグラフィーおよびエッチングプロセスを使用して、背面エッチング窓をパターン形成した。８０℃のＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）の超音波漕中で、フォトレジストを剥ぎ取った。最後に、ウェハを脱イオン水ですすぎ、回転乾燥した。ウェットエッチング用の片面エッチング保持器中にウェハを位置させることにより、窒化ケイ素膜上の細孔を暴露した。この膜を、９０℃の２５％テトラメチルアンモニウムヒドロキシド（ＴＭＡＨ）中でエッチングした。最後に、ウェハを脱イオン水およびメタノールですすぎ、空気乾燥した。細胞パターン形成のために以下の実施例４で使用された膜は、比較的均等な細孔サイズ分布を有し、細孔は約１８ミクロンの細孔サイズおよび約８ミクロンの細孔間隔を有した。
【００３８】
（実施例２）
コラーゲン溶液（０．０１２ＮのＨＣｌ中の１．５重量％のペプシン可溶化１型ウシ皮膚コラーゲンの滅菌溶液（Ｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）コラーゲンインソルーション（Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｉｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、Ｎｕｔａｃｏｎ ＢＶ、オランダ））を、実施例１に記載されたように加工された微細加工化多孔質窒化ケイ素膜の一方の面に接触させることにより、コラーゲンの細胞接着層を形成した。加工された窒化ケイ素表面上での、水およびコラーゲン溶液の接触角度は、それぞれ４９．２°および４８．４°であった。親水性表面は、コラーゲン溶液が窒化膜上で均一に拡散して、膜表面上の均一な層としてゲル化するのを可能にした。
【００３９】
（実施例３）
パターン形成されていない窒化ケイ素膜を介した光透過率を、Ａｇｉｌｅｎｔ社製８４５３型ＵＶ−可視分光光度計を使用して測定した。図３は、（ａ）ガラス（曲線Ａ）、（ｂ）コラーゲンをコーティングしたガラス（曲線Ｂ）、（ｃ）窒化ケイ素膜（曲線Ｃ）、（ｄ）コラーゲンのゲル層がコーティングされた窒化ケイ素膜に接着した細胞（曲線Ｄ）を介した光透過率を示す。光透過率は、窒化ケイ素薄膜内の光干渉のため、波長の変化と共に変動した。細胞／コラーゲン／パターン形成されていない窒化ケイ素膜を含有する堆積物を介した光透過率は、パターン形成されていない窒化ケイ素膜を介した光透過率よりほんの少し低いだけであった。したがって、細胞およびコラーゲンの存在による光吸収は、有意ではなかった。しかしながら、堆積物の厚さが増大するため、変動に位相変位が観察された。細胞層／コラーゲン／窒化ケイ素膜を介した光透過率は、５００〜１０００ｎｍの波長では５０％より高いことが見出され、このプラットフォームは、標準的な蛍光技術で非侵襲的に細胞を評価およびモニタするために使用され得ることが実証された。
【００４０】
（実施例４）
実施例１に記載されたように加工された窒化ケイ素膜を、一方の面上にコラーゲンでコーティングし、細胞を、図１に模式的に示したように、コーティングされた膜に接着した。パターン形成された窒化ケイ素膜を、最初にこの膜を１２０℃で１時間オートクレーブすることによって、細胞培養用に準備した。次に、４０μｌの１．５ｍｇ／ｍｌコラーゲン溶液を、４℃で膜の背面上にピペットで注下した。コラーゲンは、Ｏ２恒温器中で１時間、３７℃でゲル化させた。続いて、膜を裏返し、５０μｌの初代肝細胞懸濁液（１０５細胞／ｍｌ）で被覆した。この細胞を、ヘパトザイムＳＦＭ培地（Ｈｅｐａｔｏｚｙｍｅ ＳＦＭ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ）（Ｇｉｂｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア）中で４５分間、暴露されたコラーゲン上に接種した。次いで、膜を培地中で洗い、２ｍｌの培地で満たされた１２ウェルプレート中に位置させた。
【００４１】
膜の表面は微細パターン化されているため、数多くの細胞を一段階で窒化ケイ素膜上に配置することができた。本技術を実証するため、膜の裏面上にコーティングされたコラーゲンを持つ細孔配列（約１８ミクロンの平均細孔サイズを持つ、１ｍｍ×１ｍｍの細孔配列）を、膜の前面上の細胞懸濁液に暴露した。暴露されたコラーゲン上に細胞を接着させ、４時間置いた。細胞が多孔質窒化ケイ素膜上に接種された膜の前面の光学顕微鏡写真は、細胞がそれら自身を細孔の上方に配置したことを示す（図４）。約８０％の細孔が、細孔当たり１つの単一細胞で被覆されたことを観察した。近隣細胞と接触していたより大きな細胞は、互いに接着して細胞連鎖を形成した。培養５日後、肝細胞は、窒化ケイ素膜をコーティングしたコラーゲン層に固定化されたままであった。これらの結果は、本技術が、多数の単一細胞型バイオセンサーを生み出すハイスループットプロセスを開発するために使用できることを示す。
【００４２】
（実施例５）
次いで、実施例４に記載されたプロセスに従って調製した、接着した細胞を有する膜を、走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）を使用して研究した。最初に、２％のグルタルアルデヒド中で一晩細胞を固定する（膜に対して固定される）ことにより、ＳＥＭ試料を調製した。次に、濃度が増加する（１０％段階で３０％〜１００％）一連のエタノール溶液中に引き続いて浸漬させることにより、細胞を脱水した。次いで、Ｔｏｕｓｉｍｉｓ社製臨界点乾燥機を使用して細胞を持つ膜を乾燥させ、プラチナを試料表面にスパッタした。図５のＳＥＭ顕微鏡写真は、窒化ケイ素膜の裏面上にコラーゲンゲルがコーティングされた微細加工化細孔の上部に配置された単一細胞を示す。コラーゲンゲルは、細孔を介して窒化ケイ素膜の前面に浸透せず、細孔上方／内に単一細胞を正確に配置するのを可能にした。
【００４３】
本発明の幾つかの実施形態が本明細書に記載および例示されているが、当業者は、機能を実施するためのおよび／または本明細書に記載の結果または利点を得るための、様々な他の手段および構造を直ちに想定であろう。そうした変異、改変、および改良の各々は、本発明の範囲内であると見なされる。より一般的には、本明細書に記載された全てのパラメータ、材料、反応条件、および構成は例示的であることが意図され、実際のパラメータ、材料、反応条件、および構成は、本発明の教示内容が使用される具体的な用途に依存すると、当業者は直ちに理解しよう。当業者は、本明細書に記載された本発明の具体的な実施形態に相当するものを数多く認識し、または定常を越えないほどの実験を使用して確定することができよう。それゆえ、前述の実施形態は例示のためのみに提示され、添付の特許請求の範囲およびそれに相当するものの範囲内において、本発明は具体的な記載とは異なって実行され得ると理解されるべきである。本発明は、本明細書に記載の各個別の特性、システム、材料、および／または方法を対象とする。加えて、２つ以上のそのような特性、システム、材料、および／または方法の任意の組合せは、そうした特性、システム、材料、および／または方法が相互に矛盾しない限り、本発明の範囲内に含まれる。本請求項において（上記明細書においても同様に）、「備える」、「含む」、「運搬する」、「有する」、「含有する」、「で構成される」、「で作られている」、「で形成される」、「伴う」などの、全ての移行句または内包語句は、開放的に、すなわち、「含むが限定されない」という意味に解釈されるべきであり、それゆえ、追加項目と同様にその後に列挙する項目およびそれに相当するものを包含する。「からなる」および「から本質的になる」という移行句または内包語句のみが、それぞれ閉鎖的または半閉鎖的語句として解釈されるべきである。本明細書および本請求項において使用される場合、不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、それに反すると明記されていない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。
【００４４】
本明細書および特許請求の範囲において使用される「および／または」という語句は、結合される要素、すなわち、ある場合には接続的に存在し、別の場合には非接続的に存在する要素の「いずれか一方または両方」を意味すると理解されるべきである。他の要素は、「および／または」節によって具体的に特定された要素以外に、具体的に特定されたそれらの要素に関連している、または関連していないにかかわらず、任意選択で存在してもよい。したがって、非限定的な例として、「Ａおよび／またはＢ」への言及は、１つの実施形態では、Ａのみを（Ｂ以外の要素を任意選択で含む）；別の実施形態では、Ｂのみを（Ａ以外の要素を任意選択で含む）；さらに別の実施形態では、ＡおよびＢの両方（他の要素を任意選択で含む）；等を指し得る。本明細書および本請求項において使用される場合、「または」は、上記で定義されたような「および／または」と同一の意味を有すると理解されるべきである。例えば、リストにある項目を分割する際に、「または」または「および／または」は、包括的であるとして、すなわち、数多くのまたは列挙された要素の少なくとも１つ（１つより多くのものも含むが）と、任意選択で列挙されていない追加項目とを包括するとして、解釈されるべきである。「〜の１つのみ」または「〜の正確に１つ」など、それに反すると明記された用語のみが、数多くのまたは列挙された要素の正確に１つの要素を包括することを指す。一般的に、本明細書で使用する場合、「または」という用語は、「いずれか一方」、「〜の１つ」、「〜の１つのみ」または「〜の正確に１つ」などの、排他性の用語が先行する場合のみ、排他的代替性（すなわち「一方または他方であるが両方ではない」）を示すと解釈されるべきである。
【００４５】
１つまたは複数の要素リストに関して、本明細書および本請求項において使用される場合、「少なくとも１つ」という語句は、他に指示がない限り、要素リストの１つまたは複数の任意の要素から選択される少なくとも１つの要素を意味するが、要素リスト内に具体的に列挙された１つ１つ全ての要素の少なくとも１つを必ずしも含まず、要素リスト中の要素の任意の組合せを除外しないと理解されるべきである。この定義はまた、具体的に特定されたそれらの要素に関連する、または関連しないにかかわらず、「少なくとも１つ」という語句が指す要素リスト内で具体的に特定された要素以外に、要素が任意選択で存在してもよいことも許容する。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または、同等に、「ＡまたはＢの少なくとも１つ」、または、同等に「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）は、１つの実施形態では、Ｂが存在せずに、複数を任意選択で含む、少なくとも１つのＡ（かつＢ以外の要素を任意選択で含む）；別の実施形態では、Ａが存在せずに、複数を任意選択で含む、少なくとも１つのＢ（かつＡ以外の要素を任意選択で含む）；さらに別の実施形態では、複数を任意選択で含む、少なくとも１つのＡ、および複数を任意選択で含む、少なくとも１つのＢ（かつ他の要素を任意選択で含む）等を指し得よう。
【００４６】
特許および公開出願を含む、本明細書で引用された全ての参照文献は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書と、参照により組み込まれた、かつ／または本明細書に参照された文書とが、矛盾する開示内容および／または技術用語の不統一な使用を含み、かつ／または、それらが本明細書での使用または定義と異なって、組み込まれた／参照された文書が用語を使用または定義する場合、本明細書が優先する。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は、本発明の１つの実施形態に従った細胞ベースの器具を模式的に例示する。
【図２Ａ】図２Ａは、本発明の１つの実施形態に従った２チャンバシステムを模式的に例示する。
【図２Ｂ】図２Ｂは、本発明の１つの実施形態に従った、膜内の細孔に接着した細胞を例示する。
【図３】図３は、（ａ）ガラス基材、（ｂ）コラーゲン付きのガラス基材、（ｃ）窒化ケイ素膜、および（ｄ）コラーゲンおよびコラーゲンに接着した細胞付きの窒化ケイ素膜、を介した光透過スペクトラムを示す。
【図４】図４は、コラーゲンでコーティングされた多孔質窒化ケイ素膜上に接種された細胞の光学顕微鏡写真を示す。
【図５】図５は、窒化ケイ素膜の裏面からコラーゲンゲルでコーティングされた微細加工化細孔の上部に配置された単一の細胞のＳＥＭ顕微鏡写真を示す。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜を備えた装置であって、該膜は、
第１の面；
対向する第２の面；および
該膜の第１の面から第２の面までを貫通する複数の細孔を備え、
該膜は主に無機材料を含み、
該装置は細胞培養用および／または細胞アッセイ実施用に構成された、装置。
【請求項２】
流体を含有するように構築および配置され、前記膜によって分離されている、第１および第２のコンパートメント；および
前記膜に隣接して配置された流体の、各コンパートメント内での含有を容易にするように構築および配置された構成要素
をさらに備えた、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記細孔を介して前記対向する第２の面から暴露されるように前記膜の第１の面上に配置された細胞接着性材料層
をさらに備えた、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記細胞接着性材料層が前記複数の細孔の少なくとも一部を閉塞する、請求項３に記載の装置。
【請求項５】
前記細胞接着性材料層が前記複数の細孔の本質的に全てにおいてを閉塞する、請求項４に記載の装置。
【請求項６】
前記細胞接着性材料層がコラーゲンを含む、請求項３に記載の装置。
【請求項７】
前記無機材料が金属酸化物および／または金属窒化物である、請求項１に記載の装置。
【請求項８】
前記無機材料が窒化ケイ素である、請求項７に記載の装置。
【請求項９】
前記膜が、前記第１の面と第２の面との間で測定された約３０ミクロン未満の厚さを有する少なくとも１つの部分を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項１０】
前記膜が、前記第１の面と第２の面との間で測定された約２０ミクロン未満の厚さを有する少なくとも１つの部分を含む、請求項９に記載の装置。
【請求項１１】
前記膜が、前記第１の面と第２の面との間で測定された約１０ミクロン未満の厚さを有する少なくとも１つの部分を含む、請求項１０に記載の装置。
【請求項１２】
前記膜が、前記第１の面と第２の面との間で測定された約５ミクロン未満の厚さを有する少なくとも１つの部分を含む、請求項１１に記載の装置。
【請求項１３】
前記複数の細孔の平均細孔サイズからのサイズの逸脱が約１０％を超える細孔が、全細孔の約５％以下である、請求項１に記載の装置。
【請求項１４】
前記複数の細孔の平均細孔サイズからのサイズの逸脱が約５％を超える細孔が、全細孔の約５％以下である、請求項１に記載の装置。
【請求項１５】
前記細孔の少なくとも約５０％が、直近の隣接する細孔から約２５ミクロン未満に配置されている、請求項１に記載の装置。
【請求項１６】
前記膜が、少なくとも１つの部分を含み、該部分は、少なくとも約１ｍｍ２の面積を有し、約４００ｎｍから約８００ｎｍまでの波長の範囲内の少なくとも１つの波長で少なくとも３０％の光透過率を示す、請求項１に記載の装置。
【請求項１７】
前記膜が、少なくとも１つの部分を含み、該部分は、少なくとも約１ｍｍ２の面積を有し、約４００ｎｍから約８００ｎｍまでの波長の範囲内の少なくとも１つの波長で少なくとも４０％の光透過率を示す、請求項１６に記載の装置。
【請求項１８】
前記膜が、少なくとも１つの部分を含み、該部分は、少なくとも約１ｍｍ２の面積を有し、約４００ｎｍから約８００ｎｍまでの波長の範囲内の少なくとも１つの波長で少なくとも５０％の光透過率を示す、請求項１７に記載の装置。
【請求項１９】
前記膜の第２の面上に配置され、前記細胞接着性材料層に付着した細胞をさらに含み、前記膜上での前記細胞の空間的分布が前記細孔の空間的分布によって導かれるように、各付着細胞が単一細孔と結合している、請求項３に記載の装置。
【請求項２０】
細胞培養および／または細胞アッセイ用の物品であって、
第１の面および対向する第２の面を有する膜；
該膜の第１の面から第２の面までを貫通する複数の細孔、および
該細孔を介して対向する第２の面と接触する環境に暴露され、該複数の細孔の少なくとも一部を閉塞するように、該膜の第１の面上に配置された該細胞接着性材料層
を備えた物品。
【請求項２１】
前記細胞接着性材料層が前記複数の細孔の本質的に全てにおいてを閉塞する、請求項２０に記載の物品。
【請求項２２】
前記膜が、前記第１の面と第２の面との間で測定された約３０ミクロン未満の厚さを有する少なくとも１つの部分を含む、請求項２０に記載の物品。
【請求項２３】
前記複数の細孔の平均細孔サイズからのサイズの逸脱が約１０％を超える細孔が、全細孔の約５％以下である、請求項２０に記載の物品。
【請求項２４】
前記細孔の少なくとも約５０％が、直近の隣接する細孔から約２５ミクロン未満に配置されている、請求項２０に記載の物品。
【請求項２５】
少なくとも約１ｍｍ２の面積を有し、約４００ｎｍから約８００ｎｍまでの波長の範囲内の少なくとも１つの波長で少なくとも３０％の光透過率を示す前記膜の少なくとも一部を備えた少なくとも１つの部分を含む、請求項２０に記載の物品。
【請求項２６】
第１の面、対向する第２の面、および膜の第１の面と第２の面との間を貫通する複数の細孔を含む膜を用意すること；
該膜上に該細胞を配置することであって、ここで、細胞が実質的に該細孔を密封し、流体が該膜を通して該膜の第１の面と第２の面との間を流れるのを実質的に妨げるように該細孔がサイズ決定される、こと；
該膜の第１の面を第１の流体に、該膜の第２の面を第２の流体に暴露することを含み、流体の交換が、該膜を通して第１の面と第２の面との間で起こらないか、または膜表面積１ｃｍ２あたり１時間当たり流体１ｃｍ３未満の割合で起こる方法。
【請求項２７】
前記膜が主に無機材料を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記膜が、前記細孔を介して対向する第２の面から前記細胞に暴露されるように前記第１の面上に配置された細胞接着性材料層をさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞接着性材料層が前記複数の細孔の少なくとも一部を閉塞する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞接着性材料層が前記複数の細孔の本質的に全てにおいてを閉塞する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞接着性材料層がコラーゲンを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記膜が主に無機材料を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
前記無機材料が金属酸化物および／または金属窒化物である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記無機材料が窒化ケイ素である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記膜が、前記第１の面と第２の面との間で測定された約３０ミクロン未満の厚さを有する少なくとも１つの部分を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３６】
前記膜が、前記第１の面と第２の面との間で測定された約２０ミクロン未満の厚さを有する少なくとも１つの部分を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記膜が、前記第１の面と第２の面との間で測定された約１０ミクロン未満の厚さを有する少なくとも１つの部分を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記膜が、前記第１の面と第２の面との間で測定された約５ミクロン未満の厚さを有する少なくとも１つの部分を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記複数の細孔の平均細孔サイズからのサイズの逸脱が約１０％を超える細孔が、全細孔の約５％以下である、請求項２６に記載の方法。
【請求項４０】
前記複数の細孔の平均細孔サイズからのサイズの逸脱が約５％を超える細孔が、全細孔の約５％以下である、請求項２６に記載の方法。
【請求項４１】
前記細孔の少なくとも約５０％が、直近の隣接する細孔から約２５ミクロン未満に配置されている、請求項２６に記載の方法。
【請求項４２】
前記膜が、少なくとも１つの部分を含み、該部分は、少なくとも約１ｍｍ２の面積を有し、約４００ｎｍから約８００ｎｍまでの波長の範囲内の少なくとも１つの波長で少なくとも３０％の光透過率を示す、請求項２６に記載の方法。
【請求項４３】
前記膜が、少なくとも１つの部分を含み、該部分は、少なくとも約１ｍｍ２の面積を有し、約４００ｎｍから約８００ｎｍまでの波長の範囲内の少なくとも１つの波長で少なくとも４０％の光透過率を示す、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記膜が、少なくとも１つの部分を含み、該部分は、少なくとも約１ｍｍ２の面積を有し、約４００ｎｍから約８００ｎｍまでの波長の範囲内の少なくとも１つの波長で少なくとも５０％の光透過率を示す、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記膜に前記細胞を付着させることをさらに含み、前記膜上での前記細胞の空間的分布が前記細孔の空間的分布によって導かれるように、各細胞を単一細孔上に付着させる、請求項２６に記載の方法。
【請求項４６】
第１の種が前記細胞の第１の部分を介して前記細胞に入ることができ、第２の種が前記細胞の第２の部分を介して前記細胞から出ることができるように、前記細胞の第１の部分が第１の流体に暴露され、前記細胞の第２の部分が第２の流体に暴露される、請求項２６に記載の方法。
【請求項４７】
第１の面および対向する第２の面、ならびに前記膜の第１の面と第２の面との間を貫通する複数の細孔を有する膜を用意すること；
該膜の少なくとも第１の面に細胞を提示すること；および
こうした細胞の少なくとも１つの、前記細孔を介した第１の面から第２の面への遊走を決定することを含む方法。
【請求項４８】
前記膜が主に無機材料を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記膜が細胞接着性材料層と接触している、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記細胞接着性材料層が前記複数の細孔の少なくとも一部を閉塞する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記細胞接着性材料層が前記複数の細孔の本質的に全てにおいてを閉塞する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記細胞接着性材料層がコラーゲンを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
前記膜が主に無機材料を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５４】
前記無機材料が金属酸化物および／または金属窒化物である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記無機材料が窒化ケイ素である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記膜が、前記第１の面と第２の面との間で測定された約３０ミクロン未満の厚さを有する少なくとも１つの部分を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５７】
前記膜が、前記第１の面と第２の面との間で測定された約２０ミクロン未満の厚さを有する少なくとも１つの部分を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５８】
前記膜が、前記第１の面と第２の面との間で測定された約１０ミクロン未満の厚さを有する少なくとも１つの部分を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５９】
前記膜が、前記第１の面と第２の面との間で測定された約５ミクロン未満の厚さを有する少なくとも１つの部分を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項６０】
前記複数の細孔の平均細孔サイズからのサイズの逸脱が約１０％を超える細孔が、全細孔の約５％以下である、請求項４７に記載の方法。
【請求項６１】
前記複数の細孔の平均細孔サイズからのサイズの逸脱が約５％を超える細孔が、全細孔の約５％以下である、請求項４７に記載の方法。
【請求項６２】
前記細孔の少なくとも約５０％が、直近の隣接する細孔から約２５ミクロン未満に配置されている、請求項４７に記載の方法。
【請求項６３】
前記膜が、少なくとも１つの部分を含み、該部分は、少なくとも約１ｍｍ２の面積を有し、約４００ｎｍから約８００ｎｍまでの波長の範囲内の少なくとも１つの波長で少なくとも３０％の光透過率を示す、請求項４７に記載の方法。
【請求項６４】
前記膜が、少なくとも１つの部分を含み、該部分は、少なくとも約１ｍｍ２の面積を有し、約４００ｎｍから約８００ｎｍまでの波長の範囲内の少なくとも１つの波長で少なくとも４０％の光透過率を示す、請求項４７に記載の方法。
【請求項６５】
前記膜が、少なくとも１つの部分を含み、該部分は、少なくとも約１ｍｍ２の面積を有し、約４００ｎｍから約８００ｎｍまでの波長の範囲内の少なくとも１つの波長で、少なくとも５０％の光透過率を示す、請求項４７に記載の方法。
【請求項６６】
前記膜に前記細胞を付着させることをさらに含み、前記膜上での前記細胞の空間的分布が前記細孔の空間的分布によって導かれるように、各細胞を単一細孔上に付着させる、請求項４７に記載の方法。
【請求項１】
膜を備えた装置であって、該膜は、
第１の面；
対向する第２の面；および
該膜の第１の面から第２の面までを貫通する複数の細孔を備え、
該膜は主に無機材料を含み、
該装置は細胞培養用および／または細胞アッセイ実施用に構成された、装置。
【請求項２】
流体を含有するように構築および配置され、前記膜によって分離されている、第１および第２のコンパートメント；および
前記膜に隣接して配置された流体の、各コンパートメント内での含有を容易にするように構築および配置された構成要素
をさらに備えた、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記細孔を介して前記対向する第２の面から暴露されるように前記膜の第１の面上に配置された細胞接着性材料層
をさらに備えた、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記細胞接着性材料層が前記複数の細孔の少なくとも一部を閉塞する、請求項３に記載の装置。
【請求項５】
前記細胞接着性材料層が前記複数の細孔の本質的に全てにおいてを閉塞する、請求項４に記載の装置。
【請求項６】
前記細胞接着性材料層がコラーゲンを含む、請求項３に記載の装置。
【請求項７】
前記無機材料が金属酸化物および／または金属窒化物である、請求項１に記載の装置。
【請求項８】
前記無機材料が窒化ケイ素である、請求項７に記載の装置。
【請求項９】
前記膜が、前記第１の面と第２の面との間で測定された約３０ミクロン未満の厚さを有する少なくとも１つの部分を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項１０】
前記膜が、前記第１の面と第２の面との間で測定された約２０ミクロン未満の厚さを有する少なくとも１つの部分を含む、請求項９に記載の装置。
【請求項１１】
前記膜が、前記第１の面と第２の面との間で測定された約１０ミクロン未満の厚さを有する少なくとも１つの部分を含む、請求項１０に記載の装置。
【請求項１２】
前記膜が、前記第１の面と第２の面との間で測定された約５ミクロン未満の厚さを有する少なくとも１つの部分を含む、請求項１１に記載の装置。
【請求項１３】
前記複数の細孔の平均細孔サイズからのサイズの逸脱が約１０％を超える細孔が、全細孔の約５％以下である、請求項１に記載の装置。
【請求項１４】
前記複数の細孔の平均細孔サイズからのサイズの逸脱が約５％を超える細孔が、全細孔の約５％以下である、請求項１に記載の装置。
【請求項１５】
前記細孔の少なくとも約５０％が、直近の隣接する細孔から約２５ミクロン未満に配置されている、請求項１に記載の装置。
【請求項１６】
前記膜が、少なくとも１つの部分を含み、該部分は、少なくとも約１ｍｍ２の面積を有し、約４００ｎｍから約８００ｎｍまでの波長の範囲内の少なくとも１つの波長で少なくとも３０％の光透過率を示す、請求項１に記載の装置。
【請求項１７】
前記膜が、少なくとも１つの部分を含み、該部分は、少なくとも約１ｍｍ２の面積を有し、約４００ｎｍから約８００ｎｍまでの波長の範囲内の少なくとも１つの波長で少なくとも４０％の光透過率を示す、請求項１６に記載の装置。
【請求項１８】
前記膜が、少なくとも１つの部分を含み、該部分は、少なくとも約１ｍｍ２の面積を有し、約４００ｎｍから約８００ｎｍまでの波長の範囲内の少なくとも１つの波長で少なくとも５０％の光透過率を示す、請求項１７に記載の装置。
【請求項１９】
前記膜の第２の面上に配置され、前記細胞接着性材料層に付着した細胞をさらに含み、前記膜上での前記細胞の空間的分布が前記細孔の空間的分布によって導かれるように、各付着細胞が単一細孔と結合している、請求項３に記載の装置。
【請求項２０】
細胞培養および／または細胞アッセイ用の物品であって、
第１の面および対向する第２の面を有する膜；
該膜の第１の面から第２の面までを貫通する複数の細孔、および
該細孔を介して対向する第２の面と接触する環境に暴露され、該複数の細孔の少なくとも一部を閉塞するように、該膜の第１の面上に配置された該細胞接着性材料層
を備えた物品。
【請求項２１】
前記細胞接着性材料層が前記複数の細孔の本質的に全てにおいてを閉塞する、請求項２０に記載の物品。
【請求項２２】
前記膜が、前記第１の面と第２の面との間で測定された約３０ミクロン未満の厚さを有する少なくとも１つの部分を含む、請求項２０に記載の物品。
【請求項２３】
前記複数の細孔の平均細孔サイズからのサイズの逸脱が約１０％を超える細孔が、全細孔の約５％以下である、請求項２０に記載の物品。
【請求項２４】
前記細孔の少なくとも約５０％が、直近の隣接する細孔から約２５ミクロン未満に配置されている、請求項２０に記載の物品。
【請求項２５】
少なくとも約１ｍｍ２の面積を有し、約４００ｎｍから約８００ｎｍまでの波長の範囲内の少なくとも１つの波長で少なくとも３０％の光透過率を示す前記膜の少なくとも一部を備えた少なくとも１つの部分を含む、請求項２０に記載の物品。
【請求項２６】
第１の面、対向する第２の面、および膜の第１の面と第２の面との間を貫通する複数の細孔を含む膜を用意すること；
該膜上に該細胞を配置することであって、ここで、細胞が実質的に該細孔を密封し、流体が該膜を通して該膜の第１の面と第２の面との間を流れるのを実質的に妨げるように該細孔がサイズ決定される、こと；
該膜の第１の面を第１の流体に、該膜の第２の面を第２の流体に暴露することを含み、流体の交換が、該膜を通して第１の面と第２の面との間で起こらないか、または膜表面積１ｃｍ２あたり１時間当たり流体１ｃｍ３未満の割合で起こる方法。
【請求項２７】
前記膜が主に無機材料を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記膜が、前記細孔を介して対向する第２の面から前記細胞に暴露されるように前記第１の面上に配置された細胞接着性材料層をさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞接着性材料層が前記複数の細孔の少なくとも一部を閉塞する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞接着性材料層が前記複数の細孔の本質的に全てにおいてを閉塞する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞接着性材料層がコラーゲンを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記膜が主に無機材料を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
前記無機材料が金属酸化物および／または金属窒化物である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記無機材料が窒化ケイ素である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記膜が、前記第１の面と第２の面との間で測定された約３０ミクロン未満の厚さを有する少なくとも１つの部分を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３６】
前記膜が、前記第１の面と第２の面との間で測定された約２０ミクロン未満の厚さを有する少なくとも１つの部分を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記膜が、前記第１の面と第２の面との間で測定された約１０ミクロン未満の厚さを有する少なくとも１つの部分を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記膜が、前記第１の面と第２の面との間で測定された約５ミクロン未満の厚さを有する少なくとも１つの部分を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記複数の細孔の平均細孔サイズからのサイズの逸脱が約１０％を超える細孔が、全細孔の約５％以下である、請求項２６に記載の方法。
【請求項４０】
前記複数の細孔の平均細孔サイズからのサイズの逸脱が約５％を超える細孔が、全細孔の約５％以下である、請求項２６に記載の方法。
【請求項４１】
前記細孔の少なくとも約５０％が、直近の隣接する細孔から約２５ミクロン未満に配置されている、請求項２６に記載の方法。
【請求項４２】
前記膜が、少なくとも１つの部分を含み、該部分は、少なくとも約１ｍｍ２の面積を有し、約４００ｎｍから約８００ｎｍまでの波長の範囲内の少なくとも１つの波長で少なくとも３０％の光透過率を示す、請求項２６に記載の方法。
【請求項４３】
前記膜が、少なくとも１つの部分を含み、該部分は、少なくとも約１ｍｍ２の面積を有し、約４００ｎｍから約８００ｎｍまでの波長の範囲内の少なくとも１つの波長で少なくとも４０％の光透過率を示す、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記膜が、少なくとも１つの部分を含み、該部分は、少なくとも約１ｍｍ２の面積を有し、約４００ｎｍから約８００ｎｍまでの波長の範囲内の少なくとも１つの波長で少なくとも５０％の光透過率を示す、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記膜に前記細胞を付着させることをさらに含み、前記膜上での前記細胞の空間的分布が前記細孔の空間的分布によって導かれるように、各細胞を単一細孔上に付着させる、請求項２６に記載の方法。
【請求項４６】
第１の種が前記細胞の第１の部分を介して前記細胞に入ることができ、第２の種が前記細胞の第２の部分を介して前記細胞から出ることができるように、前記細胞の第１の部分が第１の流体に暴露され、前記細胞の第２の部分が第２の流体に暴露される、請求項２６に記載の方法。
【請求項４７】
第１の面および対向する第２の面、ならびに前記膜の第１の面と第２の面との間を貫通する複数の細孔を有する膜を用意すること；
該膜の少なくとも第１の面に細胞を提示すること；および
こうした細胞の少なくとも１つの、前記細孔を介した第１の面から第２の面への遊走を決定することを含む方法。
【請求項４８】
前記膜が主に無機材料を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記膜が細胞接着性材料層と接触している、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記細胞接着性材料層が前記複数の細孔の少なくとも一部を閉塞する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記細胞接着性材料層が前記複数の細孔の本質的に全てにおいてを閉塞する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記細胞接着性材料層がコラーゲンを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
前記膜が主に無機材料を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５４】
前記無機材料が金属酸化物および／または金属窒化物である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記無機材料が窒化ケイ素である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記膜が、前記第１の面と第２の面との間で測定された約３０ミクロン未満の厚さを有する少なくとも１つの部分を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５７】
前記膜が、前記第１の面と第２の面との間で測定された約２０ミクロン未満の厚さを有する少なくとも１つの部分を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５８】
前記膜が、前記第１の面と第２の面との間で測定された約１０ミクロン未満の厚さを有する少なくとも１つの部分を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５９】
前記膜が、前記第１の面と第２の面との間で測定された約５ミクロン未満の厚さを有する少なくとも１つの部分を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項６０】
前記複数の細孔の平均細孔サイズからのサイズの逸脱が約１０％を超える細孔が、全細孔の約５％以下である、請求項４７に記載の方法。
【請求項６１】
前記複数の細孔の平均細孔サイズからのサイズの逸脱が約５％を超える細孔が、全細孔の約５％以下である、請求項４７に記載の方法。
【請求項６２】
前記細孔の少なくとも約５０％が、直近の隣接する細孔から約２５ミクロン未満に配置されている、請求項４７に記載の方法。
【請求項６３】
前記膜が、少なくとも１つの部分を含み、該部分は、少なくとも約１ｍｍ２の面積を有し、約４００ｎｍから約８００ｎｍまでの波長の範囲内の少なくとも１つの波長で少なくとも３０％の光透過率を示す、請求項４７に記載の方法。
【請求項６４】
前記膜が、少なくとも１つの部分を含み、該部分は、少なくとも約１ｍｍ２の面積を有し、約４００ｎｍから約８００ｎｍまでの波長の範囲内の少なくとも１つの波長で少なくとも４０％の光透過率を示す、請求項４７に記載の方法。
【請求項６５】
前記膜が、少なくとも１つの部分を含み、該部分は、少なくとも約１ｍｍ２の面積を有し、約４００ｎｍから約８００ｎｍまでの波長の範囲内の少なくとも１つの波長で、少なくとも５０％の光透過率を示す、請求項４７に記載の方法。
【請求項６６】
前記膜に前記細胞を付着させることをさらに含み、前記膜上での前記細胞の空間的分布が前記細孔の空間的分布によって導かれるように、各細胞を単一細孔上に付着させる、請求項４７に記載の方法。
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２００９−５２１９５１（Ｐ２００９−５２１９５１Ａ）
【公表日】平成２１年６月１１日（２００９．６．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４９４９９（Ｐ２００８−５４９４９９）
【出願日】平成１８年１２月２０日（２００６．１２．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４９０８２
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０８１５４３
【国際公開日】平成１９年７月１９日（２００７．７．１９）
【出願人】（５０８２０１４６６）エージェンシー フォー サイエンス， テクノロジー アンド リサーチ (13)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年６月１１日（２００９．６．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月２０日（２００６．１２．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４９０８２
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０８１５４３
【国際公開日】平成１９年７月１９日（２００７．７．１９）
【出願人】（５０８２０１４６６）エージェンシー フォー サイエンス， テクノロジー アンド リサーチ (13)
【Ｆターム（参考）】
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