組成物
【課題】 眼の硝子体液代替物として有用な組成物を提供する。
【解決手段】 ヒドロゲルポリマーを含む組成物を開示する。該ヒドロゲルポリマーは、酸化ヒアルロン酸と、酸化ヒアルロン酸を架橋するジヒドラジドとを含む。また、該ヒドロゲルポリマーは、ａ）無色透明であり、ｂ）３７℃で液体状態からゲルマトリックスに変化する、という特性を有する。これらの特性により、該ヒドロゲルポリマーは、硝子体液代替物として有用である。
【解決手段】 ヒドロゲルポリマーを含む組成物を開示する。該ヒドロゲルポリマーは、酸化ヒアルロン酸と、酸化ヒアルロン酸を架橋するジヒドラジドとを含む。また、該ヒドロゲルポリマーは、ａ）無色透明であり、ｂ）３７℃で液体状態からゲルマトリックスに変化する、という特性を有する。これらの特性により、該ヒドロゲルポリマーは、硝子体液代替物として有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、眼球の硝子体代用物として使用される組成物に関し、具体的には、硝子体液代替物として使用される組成物、および、その調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
硝子体は、水晶体の後部で、網膜の前部にある眼の硝子体腔中の澄んで透明な膠様質である。硝子体は、眼の容積の３分の２を占め、およそ４ｇの重量および約４ｍｌの容積である。硝子体の主成分には、水（９８％）、膠原細繊維、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸（ＨＡ）、および他の残余溶質が含まれる。特異的疾患、年齢に関連する変性または外傷は、硝子体で、ＨＡ変性およびコラーゲン沈殿を含む病理変化をもたらし、基質（matrix）の液化が生じる。変性または液化した硝子体は、浮遊物の形成をもたらし、最終的には、後部硝子体剥離および網膜剥離の可能性が生じる。
【０００３】
臨床治療時において、経扁平部硝子体切除（ＰＰＶ）は、糖尿病性網膜症、難治性網膜剥離(complex retinal detachment)（例えば、外傷によるもの）、および黄斑円孔を含む、眼に関連する多くの疾病を治療するための最も重要な手術のうちの一つである。
ＰＰＶ時に、硝子体を切断し吸引し、次いで、ガス（空気、パーフルオロプロパン(perfluropropane)、もしくは六フッ化硫黄）、またはシリコーン油等の硝子体代替物と一般に交換する。硝子体代替物を使用して、硝子体腔を充填し、硝子体切除手術後に網膜が再付着するのを支援する。手術後に、硝子体代替物は、網膜と網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の間の付着を形成する、位置に網膜を保持することができる。水より軽いガスは、剥離した網膜を平坦にし、治療における網膜の付着を保持するのに有用である。
【０００４】
しかしながら、ガスを使用する場合、手術後１週間以上、腹臥位を維持する必要があることが多い。１９６０年代以来、シリコーン油を、難治性網膜剥離(complicated retinal detachment)において、または手術後に姿勢を維持することができない患者（例えば、子供）において、手術後に付着した網膜を保持するガスの代わりに使用することもある。しかし、シリコーン油を後で除去しない場合、長期的合併症が生じる場合がある。その上、シリコーン油は、角膜内皮細胞等の眼組織に対して細胞毒性でもあり得る。
【０００５】
近年、天然、半合成、または合成高分子を使用する多数の硝子体代替材料が調査されており、これらには、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(１−ビニル−２−ピロリドン）、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（グリセリルメタクリラート）、ポリ（メチル−２−アクリルアミド−２−メトキシアセタート）、およびポリ（２−ヒドロキシエチルアクリラート）が含まれる。理想的な硝子体代替物としての基準には、清澄度、透明度、屈折率、タンポナーデ代替物として作用するのに十分な剛性、代謝物質移動の許容能、非吸収性、親水性組成、および小ゲージ針による注入能が含まれる。これらの基準は、硝子体代替物の適切な材料を見つけることが容易な課題ではないことを示唆する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００８−５２６９６５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、特に硝子体代替物に関して、当技術分野で、前述した不備および不適切な点を検討するための、これまで検討されていないニーズがある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一態様において、本発明は、ヒドロゲルポリマーを含む組成物に関する。
この組成物は、ａ）酸化ヒアルロン酸と、ｂ）酸化ヒアルロン酸を架橋するジヒドラジドと、を含むヒドロゲルポリマーを含む。ヒドロゲルポリマーは、ａ）無色透明であり、ｂ）３７℃で液体状態からゲルマトリックスに変化する、という特性を有する。
【０００９】
別の態様において、本発明は、前述した組成物の調製方法に関する。この調製方法は、酸化ヒアルロン酸を含む第１の溶液と、ジヒドラジドを含む第２の溶液とを混合して、ヒドロゲルポリマーを含んだ組成物を形成する工程を含む。
ヒドロゲルポリマーは、ａ）酸化ヒアルロン酸と、ｂ）酸化ヒアルロン酸を架橋するジヒドラジドと、を含む。また、該ヒドロゲルポリマーは、ａ）無色透明であり、ｂ）３７℃で液体状態からゲルマトリックスに変化する、という特性を有する。
【００１０】
さらに、別の態様において、本発明は、次に示すものを含むキットに関する。
a）酸化ヒアルロン酸、ｂ）ジヒドラジド、ｃ）緩衝液、および、ｄ）前述した組成物の調製方法を記載した説明書。
【００１１】
さらに、別の態様において、本発明は、次に示す段階を含む眼球の硝子体の置換方法に関する。
眼球の硝子体腔から硝子体を除去する段階、
硝子体を空気と置換する段階、
硝子体腔に、空気と置換するのに十分な量の組成物を注入する段階。
【００１２】
さらにまた、別の態様において、本発明は、次に示す化学式（Ｉ）のヒドロゲルポリマーを含む組成物に関する。
【化１】
【００１３】
式中、ｍ、ｎは整数であり、ｍ≦５、１００≦ｎ≦２５００である。
また、該ヒドロゲルポリマーは、ａ）無色透明であり、ｂ）３７℃で液体状態からゲルマトリックスに５分以内に変化する、という特性を有する。
【００１４】
本明細書の種々の変形例および改良は、本開示の新規概念の趣旨および範囲から逸脱することなく、影響を及ぼし得るが、これらの態様および別の態様は、次に示す図面と共に把握される、次に示す好ましい実施態様の記載から明らかになる。
【００１５】
添付の図面は、説明と共に、本発明の１以上の実施態様を例示し、本発明の原理について説明するのに有用である。可能な限り、同様の実施態様の要素に言及するために、同じ参照符号を図面全体で使用する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】ヒアルロン酸（ＨＡ）が過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ4）によって酸化することを示す化学反応式である。
【図１Ｂ】種々の酸化度（ＤＯ）による酸化ヒアルロン酸（オキシ−ＨＡ）のＦＴ−ＩＲスペクトルである。（ｉ）ＨＡ粉末（ＤＯ：０％）、(ii)低酸化度オキシ−ＨＡ（ＤＯ：27.3％）、（ｉｉｉ）中酸化度オキシ−ＨＡ（ＤＯ：44.3％）、および(iv)高酸化度オキシ−ＨＡ（ＤＯ：60.4％）。矢印は、1725cm-1および836cm-1のオキシ−ＨＡのアルデヒド官能基、並びに、1147cm-1および895cm-1のＣ−Ｏ−ＣおよびＣ−Ｈバンドのピークの変化を示す。
【図２Ａ】アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）と共有結合により架橋したオキシ−ＨＡを示す概略図である。
【図２Ｂ】２７ゲージ針（左の写真）によってオキシ−ＨＡ／ＡＤＨ溶液を注入して、無色で透明なヒドロゲル（右の写真）を形成できたことを示す。
【図２Ｃ】種々の濃度のＡＤＨ（２ｗ／ｖ％〜８ｗ／ｖ％）で架橋した６ｗ／ｖ％オキシ−ＨＡ（酸化度：４４．３％）の屈折率を示す。
【図３Ａ】４℃でのオキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルの弾性率（Ｇ',○）および粘性率（Ｇ'',●）の時間変化を示すグラフである。 オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルは、６％（重量／ｖ）のオキシ−ＨＡ（ＤＯ：44.3％）を、（ｉ）２％、（ｉｉ）４％、（ｉｉｉ）８％（重量／ｖ）の架橋剤ＡＤＨとそれぞれ反応させることによって調製した。オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルの弾性率（Ｇ',○）および粘性率（Ｇ'',●）を、時間に対して０．１Ｈｚの一定周波数で測定した。 ここで、ゲル化点を、Ｇ'およびＧ''の交点と定義する。ゲル化点を生じるのに必要な時間をゲル化時間と称する。
【図３Ｂ】３７℃でのオキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルの弾性率（Ｇ',○）および粘性率（Ｇ'',●）の時間変化を示すグラフである。 オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルは、図３Ａに記載のとおりに、オキシ−ＨＡを架橋剤ＡＤＨと反応させることによって調製した。
【図４Ａ】リゾチーム(lysozme)消化後のヒドロゲルの質量残存率の時間変化を示すグラフである。オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルは、６％（重量／ｖ）のオキシ−ＨＡ（ＤＯ：44.3％）を、２％（◇）、４％（△）および８％（重量／ｖ）（□）の架橋剤ＡＤＨとそれぞれ反応させることによって調製した。円柱状ヒドロゲル（３００μｌ）は、10,000ユニット／ｍｌのリゾチームを含む３ｍｌのＰＢＳ中に浸漬した。
【図４Ｂ】リゾチーム(lysozme)消化後のヒドロゲルの膨潤指数の時間変化を示すグラフである。オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルは、６％（重量／ｖ）のオキシ−ＨＡ（ＤＯ：44.3％）を、２％（◇）、４％（△）および８％（重量／ｖ）（□）の架橋剤ＡＤＨとそれぞれ反応させることによって調製した。
【図５Ａ】オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルが細胞増殖に対して効果がなかったことを示すグラフである。ＷＳＴ−８アッセイで得られた吸光度の読取りは、細胞増殖に関連していた（ｎ＝６）。
【図５Ｂ】オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルが細胞毒性効果を有しなかったことを示すグラフである。細胞は、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ２、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ４、およびオキシ−ＨＡ／ＡＤＨ８ヒドロゲルの抽出培地で培養した（ｎ＝６）。
【図６】蛍光顕微鏡による、細胞培養での生存細胞および死細胞の同時検出のために色素で染色した細胞の顕微鏡写真の集合である。倍率：４０Ｘ、スケールバー200μｍ。
【図７Ａ】観察期間中に眼内圧の有意な増加が観察されず、手術した眼と対照の眼との間で有意差がみられなかったことを示す。
【図７Ｂ】観察期間中に角膜厚さの有意な変化が観察されず、手術した眼と対照の眼との間で有意差がみられなかったことを示す（ｎ＝３）。
【図８Ａ】オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ８を注入した眼（左）の手術の３週間後、および対照の眼（右）のスリットランプ写真を示す。
【図８Ｂ】手術後２１日目の網膜組織部分の光学顕微鏡観察を示す（ＨＥ染色、２００ｘ）。左：手術した眼、右：対照の眼。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本明細書中の多くの改良および変形例が当業者に明らかであるので、以下、例示として、本発明の実施例を説明する。本発明の種々の実施態様をこれから詳細に説明する。
さらに、読み手の便宜上、表題または副題を明細書で使用してもよく、これらは、本発明の範囲に影響がないものとする。さらにまた、本明細書で使用する一部の用語は、具体的に以下のように定義される。
【００１８】
（定義）
本明細書で一般に使用する用語は、本発明の文脈内およびそれぞれの用語を使用する特定の文脈で、当技術分野において通常の意味を有する。本発明を説明するのに使用する特定の用語は、明細書中で定義され、本発明の技術分野の当業者に付加的に教示される。
便宜上、特定の用語を、例えば、「 」等を用いて強調してもよい。強調表示の使用は、用語の範囲および意味に影響がない。強調されても強調されてなくても、同じ文脈での用語の範囲および意味は同じである。
同じものを２つ以上の用語で表す場合がある。したがって、本明細書の用語に代えて、代替用語または同義語を使用してもよく、また、その用語が本明細書で用いられているか否かに特別の意味は無い。特定の用語に対し同義語が使用される。ある同義語の使用は、他の同義語の使用を排除しない。
本明細書で論じられる用語の一例を含む、本明細書のいかなる箇所における一例の使用は、例示のみであり、本発明の用語または例示した用語の範囲および意味を全く限定するものではない。同様に、本発明は、本明細書における種々の実施態様に限定されない。
【００１９】
別段の定義がない限り、本明細書で使用する専門用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味である。例外的に一般の解釈と矛盾する場合は、本明細書の定義に基づいて解釈する。
【００２０】
本明細書で使用する「約」は、一般に、所定の値または範囲の２０パーセント以内、好ましくは１０パーセント以内、より好ましくは５パーセント以内を意味するものとする。本明細書で提供される数的な量は、およその量を示し、明示がなければ、「約」を暗示する意味である。
本明細書の説明において、具体的な数または範囲が示される場合、当業者は、この数または範囲が、本発明に関係する特定の分野において適切で妥当な範囲を包含することを意図すると理解する。
【００２１】
本明細書で使用するように、用語「ヒドロゲル」とは、親水性ポリマーの架橋ネットワークをいう。
ジヒドラジドは、下記の活性基によって表される。
【化２】
【００２２】
式中、Ｒは、好ましくはカルボン酸由来の、多価有機ラジカルであり得る。
触媒および水抽出手段を用いて、カルボン酸エステルを、アルコール溶液中でヒドラジン水化物と反応させる。最も一般的なジヒドラジドには、アジピン酸由来のアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）、セバシン酸ジヒドラジド（ＳＤＨ）、アミノ酸バリン由来のバリンジヒドラジド（ＶＤＨ）、および，イソフタル酸ジヒドラジド(isophthalic dihydrazide)（ＩＤＨ）が含まれる。脂肪族のＲ基は、任意の長さであり得る。例えば、Ｒ基が炭素のみである場合、生じる化合物は、最も短いジヒドラジドである、カルボジヒドラジド（ＣＤＨ）である。また、イコサン二酸ジヒドラジド（ＬＤＨ）で、Ｃ−１８の長さのＲが報告されている。ＡＤＨの安全性は十分に確立されている。
【００２３】
本発明は、硝子体代替物として酸化ＨＡ（オキシ−ＨＡ）とアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）からなり、インサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）で形成される、注入可能なヒドロゲルに関する。前述したように、ヒアルロン酸（ＨＡ）は、硝子体液の主成分のうちの一つである。ヒアルロン酸は、バイオマテリアル、組織工学、および他の関連する分野の領域において広く使用されている。これらのグルコース系ポリマーは、ポリマーを高い親水性にさせ、さらには、化学的に機能化させる高密度のヒドロキシル基を含む。
ヒアルロン酸は、１９６０年代に硝子体代替物として最初に使用された。しかしながら、ヒアルロン酸は、部分的にその低い表面張力およびその比重のために、手術時に、または手術後において、網膜に対する適切なタンポナーデ効果を提供しない。その上、ＨＡ溶液は、眼から比較的速く除去されるために、長期的な硝子体代替物として有用でないことが示されている。ＨＡ系の硝子体代替物の保持時間を改善するために、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ4）をオキシデートＨＡに使用して、アルデヒド官能基を作製した。次いで、ＡＤＨによってオキシ−ＨＡを架橋して、澄んで、無色透明なオキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルを形成した。
【００２４】
オキシ−ＨＡのアルデヒド官能基を、フーリエ変換赤外分光（ＦＴ−ＩＲ）分析によって特性評価した。また、オキシ−ＨＡの酸化度を、トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）アッセイによって決定した。屈折率（ＲＩ）は、硝子体代替物の実質的特性であるので、種々の組成物によるオキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルの屈折率を、屈折計によって測定した。オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルのゲル化性を、４℃および３７℃でレオロジー分析によって評価した。弾性率（Ｇ'）および粘性率（Ｇ''）を記録して、ゲル化時間を決定した。さらに、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨのインビトロの分解時間、膨潤特性および細胞毒性を調査した。
【００２５】
（第一態様）
一態様において、本発明は、ヒドロゲルポリマーを含む組成物に関する。
この組成物は、ａ）酸化ヒアルロン酸と、ｂ）酸化ヒアルロン酸を架橋するジヒドラジドと、を含むヒドロゲルポリマーを含む。ヒドロゲルポリマーは、ａ）無色透明であり、ｂ）３７℃で液体状態からゲルマトリックスに変化する、という特性を有する。
【００２６】
本発明の一実施態様において、ヒドロゲルは、３７℃で５分以内に、液体状態からゲルに変化する。
【００２７】
本発明の一実施態様において、ジヒドラジドは、アジピン酸ジヒドラジド、オキサリルジヒドラジド、コハク酸ジヒドラジド(succinic dihydrazide)、マロン酸ジヒドラジド(malonic dihydrazide)、エチルマロン酸ジヒドラジド、セバシン酸ジヒドラジド(sebasic acid dihydrazide)、イソフタル酸ジヒドラジド、アミキュアＬＤＨ、アミキュアＶＤＨ、マレイン酸ジヒドラジド、およびピメリン酸ジヒドラジドからなる群より選択される。例えば、ヒドロゲルポリマーは、アジピン酸ジヒドラジドによって架橋した酸化ヒアルロン酸を含んでもよい。
【００２８】
本発明の別の実施態様において、ヒドロゲルポリマーの架橋した酸化ヒアルロン酸は、Ｃ２もしくはＣ３、またはこれらのアルデヒド基を有するグルクロン酸を含む。
【００２９】
本発明の別の実施態様において、ジヒドラジドは、酸化ヒアルロン酸のグルクロン酸のＣ２およびＣ３によって、２つの鎖の酸化ヒアルロン酸を架橋する。
【００３０】
本発明の別の実施態様において、ヒドロゲルポリマーの架橋した酸化ヒアルロン酸は、Ｃ２もしくはＣ３、または酸化したＣ２もしくはＣ３を有するグルクロン酸が含む。
【００３１】
本発明の別の実施態様において、酸化ヒアルロン酸とヒドラジドとの重量比は、１２：１から３：１まで変動する。本発明の範囲を限定する意図なしに、酸化ヒアルロン酸とアジピン酸ジヒドラジドとの重量比の一例は、３：１である。
【００３２】
本発明の別の実施態様において、組成物は、１．３４１〜１．３４５の範囲の屈折率を有する。
【００３３】
本発明の別の実施態様において、組成物は、１．３４２０〜１．３４４２の範囲の屈折率を有する。
【００３４】
（第二態様）
別の態様において、本発明は、前述した組成物の調製方法に関する。この調製方法は、酸化ヒアルロン酸を含む第１の溶液と、ジヒドラジドを含む第２の溶液とを混合して、ヒドロゲルポリマーを含んだ組成物を形成する工程を含む。
ヒドロゲルポリマーは、ａ）酸化ヒアルロン酸と、ｂ）酸化ヒアルロン酸を架橋するジヒドラジドと、を含む。また、該ヒドロゲルポリマーは、ａ）無色透明であり、ｂ）３７℃で液体状態からゲルマトリックスに変化する、という特性を有する。
【００３５】
本発明の一実施態様において、第１の溶液中の酸化ヒアルロン酸の濃度（ｗ／ｖ）は、４％を超え８％未満であり、第２の溶液中のジヒドラジドの濃度（ｗ／ｖ）は、２％から８％まで変動する。
【００３６】
本発明の別の実施態様において、組成物中の酸化ヒアルロン酸とジヒドラジドとの重量比または濃度比は、３：１である。
【００３７】
本発明の別の実施態様において、組成物中の酸化ヒアルロン酸とアジピン酸ジヒドラジドとの重量比または濃度比は、３：１から１２：１である。
【００３８】
本発明の別の実施態様において、混合工程は、ゲル化時間が５分以上のヒドロゲルポリマーを形成する温度で行なわれる。少なくとも５分間、溶液状態を維持するヒドロゲルを形成するために、混合工程は４℃で行ってもよい。
【００３９】
（第三態様）
さらに、別の態様において、本発明は、次に示すものを含むキットに関する。
a）酸化ヒアルロン酸、ｂ）ジヒドラジド、ｃ）緩衝液、および、ｄ）前述した組成物の調製方法を記載した説明書。
【００４０】
本発明の一実施態様において、前述したキットにおけるジヒドラジドは、アジピン酸ジヒドラジドである。
【００４１】
（第四態様）
さらに、別の態様において、本発明は、次に示す段階を含む眼球の硝子体の置換方法に関する。
ａ）眼球の硝子体腔から硝子体を除去する段階、
ｂ）硝子体を空気と置換する段階、
ｃ）硝子体腔に、空気と置換するのに十分な量の組成物を注入する段階。
【００４２】
（第五態様）
さらにまた、別の態様において、本発明は、次に示す化学式（Ｉ）のヒドロゲルポリマーを含む組成物に関する。
【化３】
【００４３】
式中、ｍ、ｎは整数であり、ｍ≦５、１００≦ｎ≦２５００である。
また、該ヒドロゲルポリマーは、ａ）無色透明であり、ｂ）３７℃で液体状態からゲルマトリックスに変化する、という特性を有する。
【００４４】
本発明の一実施態様において、ｍ＝４である。
【００４５】
本発明の別の実施態様において、ｎは、≦２４００、≦２３００、≦２２００、≦２１００、≦２０００、≦１９００、≦１８００、≦１７００、≦１６００、≦１５００、≦１４００、≦１３００、≦１２００、≦１１００または≦１０００である。
【００４６】
本発明の別の実施態様において、ｎは、≧２００、≧３００、≧４００、≧５００、≧６００、≧７００、≧８００または≧９００である。
【００４７】
本発明の別の実施態様において、組成物中のポリマーにおける酸化ＨＡは、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の理論的酸化度を有する。
【００４８】
本発明の別の実施態様において、組成物中の酸化ＨＡは、少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の試験的酸化度を有する。
【００４９】
本発明の別の実施態様において、酸化ＨＡは、１００％の理論的酸化度、および／または２０％から８０％に及ぶ試験的酸化度を有する。
【００５０】
本発明の別の実施態様において、組成物中のポリマーにおける酸化ＨＡは、少なくとも４０％、４５％または５０％の酸化度を有する。
【実施例】
【００５１】
本発明の範囲を限定する意図なしに、本発明の実施態様による例示的な機器、装置、方法およびこれらに関連する結果を以下に示す。読み手の便宜上、表題または副題を実施例で使用してもよく、これらは、本発明の範囲に影響がないものとする。
さらに、本明細書で特定の理論を提案し開示する。しかしながら、本発明が、特定の理論または実施方式に関なく実施される限り、その特定の理論が正しいか間違っているかにかかわらず、本発明の範囲を全く限定するものではない。
【００５２】
＜２．材料、および、調製、試験、評価等の方法＞
２．１．材料
ヒアルロン酸（平均分子量Ｄａ＝３．２×１０5）は、Ｑ．Ｐ．社（日本、東京）から購入した。
四ホウ酸ナトリウム（ホウ砂）、tert-ブチルカルバジン酸 (tert-butyl carbazae)、およびアジピン酸ジヒドラジドは、Sigma-Aldrich社（米国、ミズーリ州、セントルイス）から購入した。
ジエチレングリコール、臭化カリウム（ＫＢｒ）、および過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ4）は、ＲＤＨ Chemical社（米国、カリフォルニア州、スプリングバレー）から購入した。
トリクロロ酢酸は、ＪＴＢ社（日本、東京）から購入した。
【００５３】
透析チューブ（ＭＷＣＯ 6,000−8,000）は、Membrane Filtration Products社（米国、テキサス州）から入手した。
ヒト網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ細胞、ＢＣＲＣ６０３８３）は、台湾国立細胞科学センター（National Centre for Cell Sciences)から提供された。
細胞培養培地ＤＭＤＭ／Ｆ−１２、トリプシン−ＥＤＴＡ、ウシ胎仔血清、およびペニシリン‐ストレプトマイシンは、Gibco社（米国、ニューヨーク州、グランド・アイランド）から購入した。
高速セル増殖アッセイキットＩＩは、BioVision社（米国、カリフォルニア州）から入手した。
ＣＹＴＯＴＯＸ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイは、Promega社（米国、ウィスコンシン州）から入手した。
哺乳類細胞の生／死、生存率／細胞毒性キット(Live/Dead Viability/Cytotoxicity kit)は、Molecular Probes社（米国、オレゴン州、ユージーン）から入手した。
【００５４】
２．２．酸化ヒアルロン酸（オキシ−ＨＡ）の調製
ヒアルロン酸（ＨＡ）を、室温で２４時間、水溶液中で過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ4）によって酸化した。アルミホイルでくるんだ３００ｍｌのビーカーにおいて、ヒアルロン酸（２．００ｇ）を再蒸留水（２００ｍｌ）中で溶解した。次いで、種々の濃度の過ヨウ素酸ナトリウム溶液を撹拌しながら徐々に加えた。ＨＡに対するＮａＩＯ4のモル比は、低酸化度、中酸化度、高酸化度のオキシ−ＨＡを得るために、それぞれ１：０．５、１：１、１：２とした。
２４時間の撹拌後、さらにエチレングリコールを添加して３０分撹拌し、反応を停止した。得られた溶液を、再蒸留水で３日間、ＭＷＣＯ6,000−8,000の透析チューブ（CelluSep Ｔ２チューブ、Uptima社製）によって透析した。透析処理中に水を少なくとも３回交換した。そして、透析した溶液を、３日間、凍結乾燥器（ＦＤＵ−１１００、東京理化器械社製（日本、東京））によって凍結乾燥して、白色の綿毛状の生成物である酸化ヒアルロン酸（オキシ−ＨＡ）を得た。ＦＴ−ＩＲ分析（ＪＡＳＣＯ ＦＴＩＲ−４２００及びＡＴＲ ＰＲＯ４５０−Ｓ）のために、得られたオキシ−ＨＡを人の手で小さなペレットに圧搾した。
【００５５】
２．３．酸化度の決定
ｔ−ブチルカルバジン酸（ｔ−ＢＣ）を使用し、オキシ−ＨＡ中のアルデヒド官能基の数を測定することによって、オキシ−ＨＡの酸化度を定量化した。カルバジン酸塩は、ヒドラゾン形成と類似する方法で、アルデヒドと反応して安定したカルバジン酸塩を形成することで周知である。したがって、過剰のｔ−ＢＣ（２５μｌ、１％水性トリクロロ酢酸中３０．０ｍＭ）を、２４時間、オキシ−ＨＡ（２５μｌ、０．６ｗ／ｖ％）のアルデヒド官能基と反応させた後、残余のｔ−ＢＣを測定することによって、オキシ−ＨＡの酸化度を決定した。過剰の水性トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）水溶液（５００μｌ、６．０ｍＭ）を加え、錯体（トリニトロフェニル誘導体）の３４０ｎｍの吸光度を測定することによって、残余のｔ−ＢＣを決定した。基準として種々の濃度のｔ−ＢＣ溶液を使用し、較正曲線を得て、試験試料中の未反応のカルバジン酸塩を確認した。
【００５６】
２．４．オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルの調製
各酸化度のオキシ−ＨＡ試料を、室温で一晩、６ｗ／ｖ％の最終濃度となるまでリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で個別に溶解した。２、４および８ｗ／ｖ％のアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）溶液を、リン酸緩衝液で調製した。水と氷の入ったバス（約０℃）に入れたエッペンドルフにおいて、オキシ−ＨＡ溶液（４００μｌ）を２、４および８ｗ／ｖ％のＡＤＨ溶液（１００μｌ）と混合し、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ２、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ４、およびオキシ−ＨＡ／ＡＤＨ８のヒドロゲルをそれぞれ形成した。
【００５７】
２．５．オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルの屈折率
屈折計（ＤＲ−Ａ１ アタゴ社、日本）を使用して、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ２、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ４、およびオキシ−ＨＡ／ＡＤＨ８ヒドロゲルの屈折率（ＲＩ）を測定した。簡潔に説明すれば、液体状態のオキシ−ＨＡ／ＡＤＨ溶液の一部を、ピペット先端で屈折計プリズムに移した。屈折計プリズムを、等温の循環水浴によって３７℃でインキュベートした。ゲル化のため１０分間待機した後、ヒドロゲルの屈折率（ＲＩ）をディジタル画面から読み取った。
【００５８】
２．６．オキシ-ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルのレオロジー評価
円錐状およびプレート状（１−Ｃ３５／２ Ｔｉ）のレオメータ（HAAKE Rheostress 600、Thermo Fisher Scientific社製）を使用して、保存温度４℃および本体温度３７℃で、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルのレオロジー特性を評価した。温度４℃は、混合オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ溶液に対する外科医の手術時間の評価に用い、温度３７℃は、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルのゲル化時間の評価に用いた。
振動時間掃引(oscillation time sweep)モードでは、０．１Ｈｚ、１０Ｐａで運転し、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルのゲル化時間を決定するために１５分後に終了した。弾性率Ｇ'および粘性率Ｇ''を、RheoWin 3ソフトウェアによって記録して分析した。
【００５９】
２．７．オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルのインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）分解試験
オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ２、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ４、およびオキシ−ＨＡ／ＡＤＨ８ヒドロゲルの分解特性を、１００００ユニット／ｍｌのリゾチームを含むＰＢＳ中に、予め形成したヒドロゲルを浸漬することによって評価した。リゾチームは、多糖部分に作用する眼の酵素であることが知られていることから、分解モデル系にリゾチームを選択した。
簡潔に説明すれば、溶液中のオキシ−ＨＡおよびＡＤＨをエッペンドルフで混合し、混合物（オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ溶液）３００μｌをすぐに円柱状の型に移し、１０分間ゲル化させて、径０．７ｍｍおよび高さ０．８ｍｍの円柱状ヒドロゲルを形成した。この円柱状オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルを、２４ウエルの培養皿に入れ、リゾチームを含む３ｍｌのＰＢＳをそれぞれのウエルに加えた。ヒドロゲル形成直後に、ヒドロゲルの初期乾燥重量（Ｗid）を決定した。規則的な間隔で、ヒドロゲルを取り除き、凍結乾燥器によって、これを７２時間、凍結乾燥した。種々の時点のオキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルの乾燥重量（Ｗd）を秤量し、分解割合を、［（Ｗid−Ｗd）／Ｗid］によって算出した。
【００６０】
２．８．オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルの膨潤試験
オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ２、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ４、およびオキシ−ＨＡ／ＡＤＨ８ヒドロゲルの膨潤指数を、インビトロの分解試験と同じ条件下で評価した。ヒドロゲル形成直後にヒドロゲルの初期重量（Ｗi）を決定し、次いで、これを２４ウエル培養皿に入れた。規則的な間隔で、リゾチームを含むＰＢＳからヒドロゲルを取り除き、ろ紙で表層水を拭き取ってヒドロゲルを取り除き、これを秤量（Ｗt）し、同じ容器（各測定で緩衝液を交換した）に戻した。ＷtとＷiの比率から膨潤指数を算出した。
【００６１】
２．９．オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルの細胞毒性評価
オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルの細胞毒性評価を、ＩＳＯ規格に従ってヒト網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ細胞、ＢＣＲＣ６０３８３、台湾国立細胞科学センター）の単層による抽出培地を試験することによって行った。オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ２、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ４、およびオキシ−ＨＡ／ＡＤＨ８ヒドロゲルを、標準培地（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２）と共に、３７℃で７２時間、抽出率０．７５ｃｍ2／ｍｌでインキュベートすることによって抽出培地を調製した。
２００μｌの抽出培地を単層のＲＰＥ細胞で試験した。ＲＰＥ細胞を、５ｘ１０3細胞／ウエルの細胞密度で９６ウエルの培養皿に接種し、３７℃で一晩、標準培地に供した。その後、標準培地を抽出培地と交換した。対照（標準培地）、負の対照（Ａｌ2Ｏ3抽出培地）、正の対照（０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００含有培地）、ならびに試験群（オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ２、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ４、およびオキシ−ＨＡ／ＡＤＨ８抽出培地）を含む群を、６回反復して試験した（ｎ＝６）。
３７℃で１日間および３日間インキュベーション後、高速セル増殖アッセイキットＩＩ（BioVision社製）、およびＣＹＴＯＴＯＸ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Promega社製）をそれぞれ使用して、細胞生存率および細胞毒性を定量的に評価した。また、抽出培地で処理したＲＰＥ細胞を、生／死 染色キット（Molecular Probes # L3224）で染色した。
【００６２】
高速セル増殖アッセイキットＩＩを使用して細胞生存率を評価した。細胞を１日間および３日間培養し、その後、培地を廃棄し、それぞれのウエルにおいて０．２ｍｌ水溶性テトラゾリウム−８（ＷＳＴ−８）標準溶液と交換した。ＷＳＴ−８を生存細胞における脱水素酵素によって低減して、黄色の有色生成物（ホルマザン）を生成することができる。２時間インキュベーション後、１００μｌ標準溶液を、４５０ｎｍでの分光測光器による読み取りによって定量的に評価した。標準波長は６５０ｎｍであった。
【００６３】
ＣＹＴＯＴＯＸ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイキットを使用して、細胞毒性を評価した。このアッセイキットは、細胞溶解で放出した安定性のあるサイトゾル酵素である乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を定量的に測定した。１日間および３日間の培養後、培地および全細胞溶解を共に、アッセイマニュアルに従って４９０ｎｍの吸光度で測定した。また、抽出培地（ＲＰＥ細胞によりインキュベーションしていない）も、バックグラウンドとして使用するため評価した。細胞毒性を次に示す数式によって算出した。
【数１】
【００６４】
２．１０．予備動物試験
３羽のニュージーランド産シロウサギ（２．８〜３．２ｋｇ）の６つの眼を使用した。ケタラール／チャナジン(Chanazine)２％の筋肉注射による全身麻酔下で手術を行った。手術用顕微鏡下で、手術用メスによって、左眼におよそ３ｍｍの強膜切開を形成した。
１８ゲージ(gague)針によって硝子体をできるだけ多く吸引し、空気と置換した後、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ溶液を硝子体腔に注入した。手術後、眼を、１週間、１日に３回、抗生物質点眼薬および塩酸テトラサイクリン(tetracyclin hydrochloride)眼軟膏として、ゲンタマイシン（genticin、Roche社製）で処理した。また、手術していない対照として右眼を使用した。
眼科用テーブルスリットランプ（Topcon Medical Systems社製）を使用して、前部および透光体を観察し記録した。手術後第１、５、８、１２、１５および２１日目に、ｓｃｈｉｏｔｚ眼圧計によって眼内圧（ＩＯＰ）を測定した。超音波パキメトリー（DGH Technology社製）を使用して、中心角膜厚さを測定した。手術３週間後、３羽のウサギを屠殺した。右眼（対照）および左眼（手術したもの）を、これらの動物から採取した。この眼を１０％ホルムアルデヒド溶液で定着し、これらをパラフィンに埋め込み、光学顕微鏡観察のためにヘマトキシロンおよびエオシン（ＨＥ染色）で染色した。
【００６５】
２．１１．統計分析
すべてのデータを「平均±標準偏差」として示す。群間の統計的相違を、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して試験した。統計的有意性は、予めｐ＝０．０５の確率水準に設定した。
【００６６】
＜３．結果＞
３．１．酸化ヒアルロン酸（オキシ-HA）の特性評価
ヒアルロン酸（ＨＡ）を、室温で、種々の濃度の過ヨウ素酸ナトリウムによって酸化した。図１Ａは、ＮａＩＯ4によってＨＡを酸化して、２つのアルデヒド官能基を形成する、化学反応を示す。
図１Ｂに、（ｉ）ＨＡ粉末、および、（ｉｉ）低酸化度、（ｉｉｉ）中酸化度、（ｉｖ）高酸化度の酸化ＨＡ（オキシ−ＨＡ）オキシ−ＨＡのＦＴ−ＩＲスペクトルを示した。
（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）ののＦＴ−ＩＲスペクトルにおいて、1725ｃｍ-1および836ｃｍ-1にアルデヒド官能基の顕著なピークを観察することができ、その強度は、酸化度の増加（（ｉｉ）＜（ｉｉｉ）＜（ｉｖ））に伴って増加した。
（ｉ）ＨＡ粉末のスペクトルの1147ｃｍ-1および895ｃｍ-1のピークは、Ｃ−Ｏ−Ｃ（エーテル結合）、およびＣ−Ｈと関係があった。これらの２つのピークは、アルデヒド官能基の形成により、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）のスペクトルにおいて、1112ｃｍ-1および875ｃｍ-1へそれぞれシフトした。
【００６７】
オキシ−ＨＡの酸化度を、前述したｔ−ＢＣ滴定（ＴＮＢＳアッセイ）によってさらに測定した。
表１は、ＨＡ対のＮａＩＯ4のモル比から算出した理論的酸化度、およびＴＮＢＳアッセイによって測定して得た酸化度を示す。予想どおりに、ＮａＩＯ4量の増加に伴って、オキシ−ＨＡの酸化度は、27.3±2.3％から60.4±2.66％まで増加した。中酸化度（44.3±4.25％）を有するオキシ−ＨＡについて、次に示す試験において、種々の濃度のＡＤＨ（２、４および８ｗ／ｖ％）によって架橋した。
【００６８】
【表１】
【００６９】
３．２．オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルの屈折率（ＲＩ）
オキシ−ＨＡが、二官能性架橋剤であるＡＤＨにより架橋して、化学開始剤を使用することなく、ヒドロゲルを形成できることがわかった。図２Ａは、他の化学試薬を添加することなく、架橋反応が自然に発生し、反応が開始されたことを示す。
オキシ−ＨＡのアルデヒド官能基は、ＡＤＨのＮＨ2官能基と急速に反応して、無色透明なオキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルを形成した（図２Ｂ、左右の写真）。
ＡＤＨの濃度が２％から８％に増加するに伴って、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルの屈折率は１．３４２０から１．３４４２まで変化した（図２Ｃ）。この値は、ヒト硝子体液の屈折率（１．３３４５〜１．３３４８）に近い。
【００７０】
３．３．オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルのレオロジー特性
振動時間掃引（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｙ ｔｉｍｅ ｓｗｅｅｐｓ）を行い、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルのゲル化挙動を評価した。図３は、４℃および３７℃のオキシ−ＨＡ／ＡＤＨ２、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ４、およびオキシ−ＨＡ／ＡＤＨ８ヒドロゲルの弾性率（Ｇ'）および粘性率（Ｇ''）を示す。Ｇ'およびＧ''の交点を、ゲル生成を示すゲル化点と定義する。ゲル化点を生じるのに必要な時間を試料のゲル化時間と称する。
【００７１】
図３Ａは、４℃のオキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲル（オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ２、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ４、およびオキシ−ＨＡ／ＡＤＨ８）のレオロジーの結果を示す。これらの結果は、すべての型のオキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルが、ヒドロゲル中のＡＤＨ濃度によって、４℃で３〜８分間、液体状態に維持できることを示す。
図３Ｂは、３７℃のオキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルのレオロジーの結果を示す。すべてのヒドロゲルのゲル化時間は、１４３〜１７５秒と考えられ、これは、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルが、３７℃、３分以内で、ゲルマトリックスに変化し始めることを示している。オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルのレオロジー評価の結果を、表２に示す。
【００７２】
【表２】
【００７３】
３．４．オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルのインビトロ分解および膨潤指数
図４Ａは、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルの質量残存率の時間変化を示す。オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ２（◇）、およびオキシ−ＨＡ／ＡＤＨ４（△）ヒドロゲルをそれぞれ、第３日目および第１４日目で完全に溶解した。オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ８ヒドロゲル（□）の質量残存率は、第３日目において86.67±3.54％であり、第３５日で徐々に61.02±3.13％まで減少した。
図４Ｂは、種々の濃度のＡＤＨで架橋したオキシ−ＨＡの膨潤指数を示す。ヒドロゲルが完全に溶解するまで（３日以内）、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ２ヒドロゲルの膨潤指数は、時間の経過に伴って増加した。オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ４およびオキシ−ＨＡ／ＡＤＨ８の膨潤指数は、最初の３日間でわずかに減少し、その後、ヒドロゲルが分解し始めるまで、一定の値を維持した。
【００７４】
３．５．オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルの細胞毒性
細胞生存率をＷＳＴ−８アッセイによって評価した（図５Ａ）。第１日目では、試験群（オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ２、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ４、およびオキシ−ＨＡ／ＡＤＨ８）の有意差はなかった（ｐ＞０．５）。培養第３日目の対照、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ２、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ４、およびオキシ−ＨＡ／ＡＤＨ８群のＷＳＴ−８ ＯＤ450値は、それぞれ、1.27±0.03、1.20±0.05、1.14±0.04、および0.99±0.06だった。オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ２およびオキシ−ＨＡ／ＡＤＨ４の抽出培地（ｐ＞０．５）は、対照および負の対照群と比較して、ＲＰＥ細胞の細胞生存率に顕著な影響を及ぼさなかった。しかしながら、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ８の抽出培地は、対照群（ｐ＜０．００１）と比較して、細胞生存率のわずかな減少が生じた。
【００７５】
さらに、ＬＤＨアッセイによって細胞毒性を評価した（図５Ｂ）。オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ２、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ４、およびオキシ−ＨＡ／ＡＤＨ８の細胞毒性割合は、それぞれ、6.1640±0.5805％、6.0720±0.3872％、および5.3166±0.9590％であった。この結果は、対照群(6.9811±0.6663％、p＞0.5)と比較して、オキシ-HA/ADH抽出培地群では有意差がないことを示している。
【００７６】
図６は、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ２、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ４、およびオキシ−ＨＡ／ＡＤＨ８ヒドロゲルの抽出培地で培養したＲＰＥ細胞の蛍光顕微鏡写真をそれぞれ示す。ポリアニオン色素カルセイン−ＡＭは、生存細胞内で保持され、生存細胞において強くて均一な緑色蛍光を生成することができる。一方、ＥｔｈＤ−１は、損傷を受けた細胞膜を有する細胞に入り、死細胞において明るい赤色蛍光を生成することができる。生／死細胞の染色の結果は、種々の抽出培地で培養したほとんどの細胞が生存できることを示した。
【００７７】
３．６．予備動物試験
図７Ａは、手術後の眼内圧（ＩＯＰ）の変化を示す。手術した眼におけるＩＯＰは、手術後第１日目でわずかに減少した。オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲル注入後第５日目および第８日目で、ＩＯＰに上昇傾向があった。手術後第１２日目、１５日目および２１日目で、ＩＯＰがプラトーレベルに達した。観察期間中に手術した眼と対照の眼の間のＩＯＰに有意差はなかった。
図７Ｂは、手術した眼および対照の眼の角膜厚さを示す。群間の角膜厚さに有意差はなかった。
【００７８】
図８Ａは、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ８注入後第２１日目の眼のスリットランプ検査の写真を示す。手術した眼の角膜および水晶体は、欠陥を示さなかった。結果は、手術３週間後に検査した眼の前部において、顕著な炎症または他の疾病を示さなかった。
図８Ｂは、手術後第２１日目の手術した眼および対照の眼の網膜部分を示す。手術した眼の網膜層は容易に検出された。また、炎症反応もしくは浸潤、または、対照の眼とのいかなる相違もなかった。
【００７９】
＜４．考察＞
患者が硝子体切除手術を受ける場合、硝子体腔から多くの硝子体液を除去する。生来の硝子体は再生することができないので、硝子体腔を硝子体代替物で充填して、網膜の位置を保持し、網膜が再び剥離するのを防ぐことが必要である。過去数十年間で、硝子体代替物の開発は、研究者にとって挑戦であった。多くの生体高分子および合成化合物が研究室で検討された。しかしながら、恒久的な硝子体代替物となりうる理想的な材料は、現在開発されていない。
【００８０】
本研究では、２７ゲージ針によって硝子体腔に注入することができ、その後、ゲル様物質に変化することができる無色透明なオキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルを得ることができた。オキシ−ＨＡにおけるアルデヒド官能基をＮａＩＯ4によって形成した。すなわち、ＦＴ−ＩＲによって特性評価されるように（図１Ｂの1725ｃｍ-1および836ｃｍ-1のピーク）、グルクロン酸のＣ２−Ｃ３ヒドロキシル基を開裂してジアルデヒドを形成した。オキシ−ＨＡのジアルデヒドは、ＡＤＨのヒドラジド基と反応して、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルにおいて分子間ネットワークを形成することができた。
【００８１】
屈折率は、硝子体代替物の適用において重要な光学特性のうちの一つである。硝子体代替物の不適切な屈折率は、硝子体切除手術後に患者の視力に影響を及ぼす。ガスタンポナーデは、眼底検査および患者の視力を共に、一時的に制限するのに十分厳格な光学的変化を誘導する。現在の硝子体代替物（例えば、シリコーン油、ｎＤ＝1.40516、ヘビーシリコーン油、ｎＤ＝1.3008）の屈折率は、天然の硝子体の屈折率（ｎＤ＝1.336)と異なるため、タンポナーデ眼における屈折の変化の誘導を招くこととなる。
それに対し、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ８の屈折率は約1.3342であり、これはヒト硝子体と非常に類似している。硝子体代替物としてのオキシ−ＨＡ／ＡＤＨ８ヒドロゲルの利用は、硝子体切除手術後に好ましくない屈折の変化を回避することができる。
【００８２】
小ゲージ針による注入は、硝子体代替物の送入のための臨床的な一般的な手法である。図２Ｂ（左の写真）に示すように、２７ゲージ針によって、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ８ヒドロゲルを容易に注入することができた。注入能は、眼科医および患者への重要な要因である。
手術時間は、眼科医が硝子体腔に液体状態のヒドロゲルを注入するのに十分である必要がある。また、溶液‐ゲル変化時間は、ヒドロゲルの押出しを防ぐように、できるだけ短いことが必要である。レオロジー評価は、オキシ−ＨＡ溶液とＡＤＨ溶液の混合物が、約８分間、溶液形態で維持できることを示した。したがって、眼科医は、４℃でオキシ−ＨＡとＡＤＨ溶液を混合した後、注射器に混合オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ溶液を移すのに十分な時間（８分）が与えられる。また、液体形態で注入することができるので、ゲル形態で代替物を導入する際の困難性を克服する。このため、眼への硝子体代替物の送入方法において、侵襲性を最小とすることができる。
【００８３】
低架橋ヒドロゲル（例えば、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ２）において、膨潤指数はすぐに増加し、３日以内に完全に溶解した。この間、ヒドロゲルは加水分解を受け、ヒドラゾン結合は時間の経過に伴ってほぼ直線的に分解した。高架橋ヒドロゲル（例えば、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ４およびオキシ−ＨＡ／ＡＤＨ８）において、膨潤指数は、最初の３日間で減少した後、一定した値であり、その後、ネットワークが完全に溶解するまで、増加した。経時的な膨潤指数の増加は、ヒドロゲルネットワーク中のヒドラゾン結合の加水分解の結果であった。ヒドロゲル中のヒドラゾン結合が加水分解する場合、該ネットワークは、膨脹し、多くの水を含み、その後、完全に溶解する。
【００８４】
質量損失試験によれば、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ４およびオキシ−ＨＡ／ＡＤＨ８ヒドロゲルでみられた分解挙動は、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ２ヒドロゲルでみられたものと異なっていた。高いＡＤＨ含量の、したがってヒドラゾン結合の多い、ヒドロゲルは、低いＡＤＨ含量のヒドロゲルよりも遅く加水分解する傾向がある。高架橋ヒドロゲルでは、おそらく、低架橋密度または未架橋ヒアルロン酸を有するヒドロゲル領域の加水分解により、最初の３日間の質量損失（５〜１５％）において初期の減少があった。この段階の後に、おそらく、高架橋領域の分解により、次の数日または数週で質量のわずかな減少があった。そして、ヒドロゲル中のヒドラゾン結合が加水分解し、これは、溶解段階で生じた。
【００８５】
オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ４ヒドロゲルは、第８−１２日目で膨潤の進行を示した。これは、ヒドラゾン結合がこのときに加水分解し、その後、第１４日目で溶解段階があることを意味した。これによって、ヒドロゲル質量の減少が生じ、最終的にヒドロゲルの完全溶解が生じた。一方、高度の架橋により、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ８は、３日間一定の膨潤指数に達し、ヒドロゲルは、第３０−３５日目で膨潤の進行を示した。
【００８６】
インビトロ分解試験は、酵素（10,000ユニット／ｍｌのリゾチームを含むＰＢＳ）の存在下で、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ８ヒドロゲルの３０−４０％のみが分解するにすぎず、ヒドロゲルが５週間安定することを示した。シリコーン油およびガスは、臨床的に、眼内容積を回復し網膜剥離を操作する網膜再付着手術における一般的な硝子体代替物である。これらは、網膜破損による液体の通過を防ぎ、正常な網膜−網膜色素上皮（ＲＰＥ）の付着を維持し、網膜の再付着を維持する。ガスの寿命は、ガスの種類、気泡容積、初期濃度、および眼内圧によって、通常数日から２週間以内である。数週以内に再吸収する眼内のガスとは対照的に、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ８ヒドロゲルは、インビトロ分解試験で少なくとも５週間ゲルマトリックスを維持することができる。臨床的考慮において、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ８ヒドロゲルの寿命は、網膜付着に有益である。さらに、患者がガスタンポナーデにより硝子体切除手術を受ける場合、ヒドロゲルは、腹臥位の不便性を克服する。
【００８７】
網膜色素上皮（ＲＥＰ）細胞は、網膜剥離または局所的な網膜切除後に、眼球を充填する硝子体代替物に直接暴露することが多いので、ＲＥＰ細胞を細胞毒性評価のための標的細胞として選択した。また、ＲＰＥ細胞も、網膜の再付着の失敗および増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）に関係することが分かった。細胞生存率アッセイ（ＷＳＴ−８）、および細胞毒性（ＬＤＨアッセイ）は、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルが、インビトロ評価で、生体適合性であり、ＲＰＥ細胞による毒性がなかったことを示す。
【００８８】
ヒドロゲルの分解産物は、臨床応用についての別の懸念である。分解評価の結果によれば、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ２ヒドロゲルは、水性環境中で３日以内に分解した。これは、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ２ヒドロゲルが、抽出処理（３７℃、７２時間）時に、抽出培地ですべて分解し、分解産物が、細胞毒性評価でＲＰＥ細胞と培養されたことを示す。細胞毒性分析データ（図５Ａ、５Ｂ）によれば、この群では、顕著な細胞毒性はなかった。これらの結果は、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルからの分解産物が、ＷＳＴ−８および細胞毒性アッセイに基づき、ＲＰＥ細胞に対して細胞毒性がないことを示した。さらに、生／死細胞染色も、種々の抽出培地からほとんどの培養細胞が生存できたことを示す。
【００８９】
オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ８を注入した眼のスリットランプ検査は、観察期間中、前眼部で炎症または混濁が発生しないことを示した。眼内圧の増加は、硝子体切除手術後に生じることが多い。しかしながら、手術した眼の眼内圧は、観察期間中に正常なレベルにとどまった。これは、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルの膨潤指数のわずかな減少によるものであると考えられた。また、網膜組織の組織学的検査も、構造変化または分解がないことを示し、対照の眼との有意差も示さなかった。
【００９０】
＜５．結論＞
現在、臨床応用のための理想的な硝子体代替物は、まだ開発されていない。多くの研究は、硝子体代替物のための適切なバイオマテリアルを開発することを試みた。
本発明は、注入可能な新規ヒアルロン酸系ヒドロゲルであるオキシ−ＨＡ／ＡＤＨの合成および特性に関する。このヒドロゲルは、適切な屈折率を有し、注入可能であり、インサイチュのゲル化性を有し、また、ＲＥＰ細胞に対して細胞毒性を示さない等の、硝子体代替物としての利用において幾つかの有益な特性を示す。さらに、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ８ヒドロゲルは、眼の酵素（リゾチーム）によって、５週間、インビトロで分解しなかった。予備動物試験では、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルは、観察期間に重篤な合併症を誘発しなかった。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、眼球の硝子体代用物として使用される組成物に関し、具体的には、硝子体液代替物として使用される組成物、および、その調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
硝子体は、水晶体の後部で、網膜の前部にある眼の硝子体腔中の澄んで透明な膠様質である。硝子体は、眼の容積の３分の２を占め、およそ４ｇの重量および約４ｍｌの容積である。硝子体の主成分には、水（９８％）、膠原細繊維、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸（ＨＡ）、および他の残余溶質が含まれる。特異的疾患、年齢に関連する変性または外傷は、硝子体で、ＨＡ変性およびコラーゲン沈殿を含む病理変化をもたらし、基質（matrix）の液化が生じる。変性または液化した硝子体は、浮遊物の形成をもたらし、最終的には、後部硝子体剥離および網膜剥離の可能性が生じる。
【０００３】
臨床治療時において、経扁平部硝子体切除（ＰＰＶ）は、糖尿病性網膜症、難治性網膜剥離(complex retinal detachment)（例えば、外傷によるもの）、および黄斑円孔を含む、眼に関連する多くの疾病を治療するための最も重要な手術のうちの一つである。
ＰＰＶ時に、硝子体を切断し吸引し、次いで、ガス（空気、パーフルオロプロパン(perfluropropane)、もしくは六フッ化硫黄）、またはシリコーン油等の硝子体代替物と一般に交換する。硝子体代替物を使用して、硝子体腔を充填し、硝子体切除手術後に網膜が再付着するのを支援する。手術後に、硝子体代替物は、網膜と網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の間の付着を形成する、位置に網膜を保持することができる。水より軽いガスは、剥離した網膜を平坦にし、治療における網膜の付着を保持するのに有用である。
【０００４】
しかしながら、ガスを使用する場合、手術後１週間以上、腹臥位を維持する必要があることが多い。１９６０年代以来、シリコーン油を、難治性網膜剥離(complicated retinal detachment)において、または手術後に姿勢を維持することができない患者（例えば、子供）において、手術後に付着した網膜を保持するガスの代わりに使用することもある。しかし、シリコーン油を後で除去しない場合、長期的合併症が生じる場合がある。その上、シリコーン油は、角膜内皮細胞等の眼組織に対して細胞毒性でもあり得る。
【０００５】
近年、天然、半合成、または合成高分子を使用する多数の硝子体代替材料が調査されており、これらには、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(１−ビニル−２−ピロリドン）、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（グリセリルメタクリラート）、ポリ（メチル−２−アクリルアミド−２−メトキシアセタート）、およびポリ（２−ヒドロキシエチルアクリラート）が含まれる。理想的な硝子体代替物としての基準には、清澄度、透明度、屈折率、タンポナーデ代替物として作用するのに十分な剛性、代謝物質移動の許容能、非吸収性、親水性組成、および小ゲージ針による注入能が含まれる。これらの基準は、硝子体代替物の適切な材料を見つけることが容易な課題ではないことを示唆する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００８−５２６９６５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、特に硝子体代替物に関して、当技術分野で、前述した不備および不適切な点を検討するための、これまで検討されていないニーズがある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一態様において、本発明は、ヒドロゲルポリマーを含む組成物に関する。
この組成物は、ａ）酸化ヒアルロン酸と、ｂ）酸化ヒアルロン酸を架橋するジヒドラジドと、を含むヒドロゲルポリマーを含む。ヒドロゲルポリマーは、ａ）無色透明であり、ｂ）３７℃で液体状態からゲルマトリックスに変化する、という特性を有する。
【０００９】
別の態様において、本発明は、前述した組成物の調製方法に関する。この調製方法は、酸化ヒアルロン酸を含む第１の溶液と、ジヒドラジドを含む第２の溶液とを混合して、ヒドロゲルポリマーを含んだ組成物を形成する工程を含む。
ヒドロゲルポリマーは、ａ）酸化ヒアルロン酸と、ｂ）酸化ヒアルロン酸を架橋するジヒドラジドと、を含む。また、該ヒドロゲルポリマーは、ａ）無色透明であり、ｂ）３７℃で液体状態からゲルマトリックスに変化する、という特性を有する。
【００１０】
さらに、別の態様において、本発明は、次に示すものを含むキットに関する。
a）酸化ヒアルロン酸、ｂ）ジヒドラジド、ｃ）緩衝液、および、ｄ）前述した組成物の調製方法を記載した説明書。
【００１１】
さらに、別の態様において、本発明は、次に示す段階を含む眼球の硝子体の置換方法に関する。
眼球の硝子体腔から硝子体を除去する段階、
硝子体を空気と置換する段階、
硝子体腔に、空気と置換するのに十分な量の組成物を注入する段階。
【００１２】
さらにまた、別の態様において、本発明は、次に示す化学式（Ｉ）のヒドロゲルポリマーを含む組成物に関する。
【化１】
【００１３】
式中、ｍ、ｎは整数であり、ｍ≦５、１００≦ｎ≦２５００である。
また、該ヒドロゲルポリマーは、ａ）無色透明であり、ｂ）３７℃で液体状態からゲルマトリックスに５分以内に変化する、という特性を有する。
【００１４】
本明細書の種々の変形例および改良は、本開示の新規概念の趣旨および範囲から逸脱することなく、影響を及ぼし得るが、これらの態様および別の態様は、次に示す図面と共に把握される、次に示す好ましい実施態様の記載から明らかになる。
【００１５】
添付の図面は、説明と共に、本発明の１以上の実施態様を例示し、本発明の原理について説明するのに有用である。可能な限り、同様の実施態様の要素に言及するために、同じ参照符号を図面全体で使用する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】ヒアルロン酸（ＨＡ）が過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ4）によって酸化することを示す化学反応式である。
【図１Ｂ】種々の酸化度（ＤＯ）による酸化ヒアルロン酸（オキシ−ＨＡ）のＦＴ−ＩＲスペクトルである。（ｉ）ＨＡ粉末（ＤＯ：０％）、(ii)低酸化度オキシ−ＨＡ（ＤＯ：27.3％）、（ｉｉｉ）中酸化度オキシ−ＨＡ（ＤＯ：44.3％）、および(iv)高酸化度オキシ−ＨＡ（ＤＯ：60.4％）。矢印は、1725cm-1および836cm-1のオキシ−ＨＡのアルデヒド官能基、並びに、1147cm-1および895cm-1のＣ−Ｏ−ＣおよびＣ−Ｈバンドのピークの変化を示す。
【図２Ａ】アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）と共有結合により架橋したオキシ−ＨＡを示す概略図である。
【図２Ｂ】２７ゲージ針（左の写真）によってオキシ−ＨＡ／ＡＤＨ溶液を注入して、無色で透明なヒドロゲル（右の写真）を形成できたことを示す。
【図２Ｃ】種々の濃度のＡＤＨ（２ｗ／ｖ％〜８ｗ／ｖ％）で架橋した６ｗ／ｖ％オキシ−ＨＡ（酸化度：４４．３％）の屈折率を示す。
【図３Ａ】４℃でのオキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルの弾性率（Ｇ',○）および粘性率（Ｇ'',●）の時間変化を示すグラフである。 オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルは、６％（重量／ｖ）のオキシ−ＨＡ（ＤＯ：44.3％）を、（ｉ）２％、（ｉｉ）４％、（ｉｉｉ）８％（重量／ｖ）の架橋剤ＡＤＨとそれぞれ反応させることによって調製した。オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルの弾性率（Ｇ',○）および粘性率（Ｇ'',●）を、時間に対して０．１Ｈｚの一定周波数で測定した。 ここで、ゲル化点を、Ｇ'およびＧ''の交点と定義する。ゲル化点を生じるのに必要な時間をゲル化時間と称する。
【図３Ｂ】３７℃でのオキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルの弾性率（Ｇ',○）および粘性率（Ｇ'',●）の時間変化を示すグラフである。 オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルは、図３Ａに記載のとおりに、オキシ−ＨＡを架橋剤ＡＤＨと反応させることによって調製した。
【図４Ａ】リゾチーム(lysozme)消化後のヒドロゲルの質量残存率の時間変化を示すグラフである。オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルは、６％（重量／ｖ）のオキシ−ＨＡ（ＤＯ：44.3％）を、２％（◇）、４％（△）および８％（重量／ｖ）（□）の架橋剤ＡＤＨとそれぞれ反応させることによって調製した。円柱状ヒドロゲル（３００μｌ）は、10,000ユニット／ｍｌのリゾチームを含む３ｍｌのＰＢＳ中に浸漬した。
【図４Ｂ】リゾチーム(lysozme)消化後のヒドロゲルの膨潤指数の時間変化を示すグラフである。オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルは、６％（重量／ｖ）のオキシ−ＨＡ（ＤＯ：44.3％）を、２％（◇）、４％（△）および８％（重量／ｖ）（□）の架橋剤ＡＤＨとそれぞれ反応させることによって調製した。
【図５Ａ】オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルが細胞増殖に対して効果がなかったことを示すグラフである。ＷＳＴ−８アッセイで得られた吸光度の読取りは、細胞増殖に関連していた（ｎ＝６）。
【図５Ｂ】オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルが細胞毒性効果を有しなかったことを示すグラフである。細胞は、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ２、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ４、およびオキシ−ＨＡ／ＡＤＨ８ヒドロゲルの抽出培地で培養した（ｎ＝６）。
【図６】蛍光顕微鏡による、細胞培養での生存細胞および死細胞の同時検出のために色素で染色した細胞の顕微鏡写真の集合である。倍率：４０Ｘ、スケールバー200μｍ。
【図７Ａ】観察期間中に眼内圧の有意な増加が観察されず、手術した眼と対照の眼との間で有意差がみられなかったことを示す。
【図７Ｂ】観察期間中に角膜厚さの有意な変化が観察されず、手術した眼と対照の眼との間で有意差がみられなかったことを示す（ｎ＝３）。
【図８Ａ】オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ８を注入した眼（左）の手術の３週間後、および対照の眼（右）のスリットランプ写真を示す。
【図８Ｂ】手術後２１日目の網膜組織部分の光学顕微鏡観察を示す（ＨＥ染色、２００ｘ）。左：手術した眼、右：対照の眼。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本明細書中の多くの改良および変形例が当業者に明らかであるので、以下、例示として、本発明の実施例を説明する。本発明の種々の実施態様をこれから詳細に説明する。
さらに、読み手の便宜上、表題または副題を明細書で使用してもよく、これらは、本発明の範囲に影響がないものとする。さらにまた、本明細書で使用する一部の用語は、具体的に以下のように定義される。
【００１８】
（定義）
本明細書で一般に使用する用語は、本発明の文脈内およびそれぞれの用語を使用する特定の文脈で、当技術分野において通常の意味を有する。本発明を説明するのに使用する特定の用語は、明細書中で定義され、本発明の技術分野の当業者に付加的に教示される。
便宜上、特定の用語を、例えば、「 」等を用いて強調してもよい。強調表示の使用は、用語の範囲および意味に影響がない。強調されても強調されてなくても、同じ文脈での用語の範囲および意味は同じである。
同じものを２つ以上の用語で表す場合がある。したがって、本明細書の用語に代えて、代替用語または同義語を使用してもよく、また、その用語が本明細書で用いられているか否かに特別の意味は無い。特定の用語に対し同義語が使用される。ある同義語の使用は、他の同義語の使用を排除しない。
本明細書で論じられる用語の一例を含む、本明細書のいかなる箇所における一例の使用は、例示のみであり、本発明の用語または例示した用語の範囲および意味を全く限定するものではない。同様に、本発明は、本明細書における種々の実施態様に限定されない。
【００１９】
別段の定義がない限り、本明細書で使用する専門用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味である。例外的に一般の解釈と矛盾する場合は、本明細書の定義に基づいて解釈する。
【００２０】
本明細書で使用する「約」は、一般に、所定の値または範囲の２０パーセント以内、好ましくは１０パーセント以内、より好ましくは５パーセント以内を意味するものとする。本明細書で提供される数的な量は、およその量を示し、明示がなければ、「約」を暗示する意味である。
本明細書の説明において、具体的な数または範囲が示される場合、当業者は、この数または範囲が、本発明に関係する特定の分野において適切で妥当な範囲を包含することを意図すると理解する。
【００２１】
本明細書で使用するように、用語「ヒドロゲル」とは、親水性ポリマーの架橋ネットワークをいう。
ジヒドラジドは、下記の活性基によって表される。
【化２】
【００２２】
式中、Ｒは、好ましくはカルボン酸由来の、多価有機ラジカルであり得る。
触媒および水抽出手段を用いて、カルボン酸エステルを、アルコール溶液中でヒドラジン水化物と反応させる。最も一般的なジヒドラジドには、アジピン酸由来のアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）、セバシン酸ジヒドラジド（ＳＤＨ）、アミノ酸バリン由来のバリンジヒドラジド（ＶＤＨ）、および，イソフタル酸ジヒドラジド(isophthalic dihydrazide)（ＩＤＨ）が含まれる。脂肪族のＲ基は、任意の長さであり得る。例えば、Ｒ基が炭素のみである場合、生じる化合物は、最も短いジヒドラジドである、カルボジヒドラジド（ＣＤＨ）である。また、イコサン二酸ジヒドラジド（ＬＤＨ）で、Ｃ−１８の長さのＲが報告されている。ＡＤＨの安全性は十分に確立されている。
【００２３】
本発明は、硝子体代替物として酸化ＨＡ（オキシ−ＨＡ）とアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）からなり、インサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）で形成される、注入可能なヒドロゲルに関する。前述したように、ヒアルロン酸（ＨＡ）は、硝子体液の主成分のうちの一つである。ヒアルロン酸は、バイオマテリアル、組織工学、および他の関連する分野の領域において広く使用されている。これらのグルコース系ポリマーは、ポリマーを高い親水性にさせ、さらには、化学的に機能化させる高密度のヒドロキシル基を含む。
ヒアルロン酸は、１９６０年代に硝子体代替物として最初に使用された。しかしながら、ヒアルロン酸は、部分的にその低い表面張力およびその比重のために、手術時に、または手術後において、網膜に対する適切なタンポナーデ効果を提供しない。その上、ＨＡ溶液は、眼から比較的速く除去されるために、長期的な硝子体代替物として有用でないことが示されている。ＨＡ系の硝子体代替物の保持時間を改善するために、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ4）をオキシデートＨＡに使用して、アルデヒド官能基を作製した。次いで、ＡＤＨによってオキシ−ＨＡを架橋して、澄んで、無色透明なオキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルを形成した。
【００２４】
オキシ−ＨＡのアルデヒド官能基を、フーリエ変換赤外分光（ＦＴ−ＩＲ）分析によって特性評価した。また、オキシ−ＨＡの酸化度を、トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）アッセイによって決定した。屈折率（ＲＩ）は、硝子体代替物の実質的特性であるので、種々の組成物によるオキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルの屈折率を、屈折計によって測定した。オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルのゲル化性を、４℃および３７℃でレオロジー分析によって評価した。弾性率（Ｇ'）および粘性率（Ｇ''）を記録して、ゲル化時間を決定した。さらに、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨのインビトロの分解時間、膨潤特性および細胞毒性を調査した。
【００２５】
（第一態様）
一態様において、本発明は、ヒドロゲルポリマーを含む組成物に関する。
この組成物は、ａ）酸化ヒアルロン酸と、ｂ）酸化ヒアルロン酸を架橋するジヒドラジドと、を含むヒドロゲルポリマーを含む。ヒドロゲルポリマーは、ａ）無色透明であり、ｂ）３７℃で液体状態からゲルマトリックスに変化する、という特性を有する。
【００２６】
本発明の一実施態様において、ヒドロゲルは、３７℃で５分以内に、液体状態からゲルに変化する。
【００２７】
本発明の一実施態様において、ジヒドラジドは、アジピン酸ジヒドラジド、オキサリルジヒドラジド、コハク酸ジヒドラジド(succinic dihydrazide)、マロン酸ジヒドラジド(malonic dihydrazide)、エチルマロン酸ジヒドラジド、セバシン酸ジヒドラジド(sebasic acid dihydrazide)、イソフタル酸ジヒドラジド、アミキュアＬＤＨ、アミキュアＶＤＨ、マレイン酸ジヒドラジド、およびピメリン酸ジヒドラジドからなる群より選択される。例えば、ヒドロゲルポリマーは、アジピン酸ジヒドラジドによって架橋した酸化ヒアルロン酸を含んでもよい。
【００２８】
本発明の別の実施態様において、ヒドロゲルポリマーの架橋した酸化ヒアルロン酸は、Ｃ２もしくはＣ３、またはこれらのアルデヒド基を有するグルクロン酸を含む。
【００２９】
本発明の別の実施態様において、ジヒドラジドは、酸化ヒアルロン酸のグルクロン酸のＣ２およびＣ３によって、２つの鎖の酸化ヒアルロン酸を架橋する。
【００３０】
本発明の別の実施態様において、ヒドロゲルポリマーの架橋した酸化ヒアルロン酸は、Ｃ２もしくはＣ３、または酸化したＣ２もしくはＣ３を有するグルクロン酸が含む。
【００３１】
本発明の別の実施態様において、酸化ヒアルロン酸とヒドラジドとの重量比は、１２：１から３：１まで変動する。本発明の範囲を限定する意図なしに、酸化ヒアルロン酸とアジピン酸ジヒドラジドとの重量比の一例は、３：１である。
【００３２】
本発明の別の実施態様において、組成物は、１．３４１〜１．３４５の範囲の屈折率を有する。
【００３３】
本発明の別の実施態様において、組成物は、１．３４２０〜１．３４４２の範囲の屈折率を有する。
【００３４】
（第二態様）
別の態様において、本発明は、前述した組成物の調製方法に関する。この調製方法は、酸化ヒアルロン酸を含む第１の溶液と、ジヒドラジドを含む第２の溶液とを混合して、ヒドロゲルポリマーを含んだ組成物を形成する工程を含む。
ヒドロゲルポリマーは、ａ）酸化ヒアルロン酸と、ｂ）酸化ヒアルロン酸を架橋するジヒドラジドと、を含む。また、該ヒドロゲルポリマーは、ａ）無色透明であり、ｂ）３７℃で液体状態からゲルマトリックスに変化する、という特性を有する。
【００３５】
本発明の一実施態様において、第１の溶液中の酸化ヒアルロン酸の濃度（ｗ／ｖ）は、４％を超え８％未満であり、第２の溶液中のジヒドラジドの濃度（ｗ／ｖ）は、２％から８％まで変動する。
【００３６】
本発明の別の実施態様において、組成物中の酸化ヒアルロン酸とジヒドラジドとの重量比または濃度比は、３：１である。
【００３７】
本発明の別の実施態様において、組成物中の酸化ヒアルロン酸とアジピン酸ジヒドラジドとの重量比または濃度比は、３：１から１２：１である。
【００３８】
本発明の別の実施態様において、混合工程は、ゲル化時間が５分以上のヒドロゲルポリマーを形成する温度で行なわれる。少なくとも５分間、溶液状態を維持するヒドロゲルを形成するために、混合工程は４℃で行ってもよい。
【００３９】
（第三態様）
さらに、別の態様において、本発明は、次に示すものを含むキットに関する。
a）酸化ヒアルロン酸、ｂ）ジヒドラジド、ｃ）緩衝液、および、ｄ）前述した組成物の調製方法を記載した説明書。
【００４０】
本発明の一実施態様において、前述したキットにおけるジヒドラジドは、アジピン酸ジヒドラジドである。
【００４１】
（第四態様）
さらに、別の態様において、本発明は、次に示す段階を含む眼球の硝子体の置換方法に関する。
ａ）眼球の硝子体腔から硝子体を除去する段階、
ｂ）硝子体を空気と置換する段階、
ｃ）硝子体腔に、空気と置換するのに十分な量の組成物を注入する段階。
【００４２】
（第五態様）
さらにまた、別の態様において、本発明は、次に示す化学式（Ｉ）のヒドロゲルポリマーを含む組成物に関する。
【化３】
【００４３】
式中、ｍ、ｎは整数であり、ｍ≦５、１００≦ｎ≦２５００である。
また、該ヒドロゲルポリマーは、ａ）無色透明であり、ｂ）３７℃で液体状態からゲルマトリックスに変化する、という特性を有する。
【００４４】
本発明の一実施態様において、ｍ＝４である。
【００４５】
本発明の別の実施態様において、ｎは、≦２４００、≦２３００、≦２２００、≦２１００、≦２０００、≦１９００、≦１８００、≦１７００、≦１６００、≦１５００、≦１４００、≦１３００、≦１２００、≦１１００または≦１０００である。
【００４６】
本発明の別の実施態様において、ｎは、≧２００、≧３００、≧４００、≧５００、≧６００、≧７００、≧８００または≧９００である。
【００４７】
本発明の別の実施態様において、組成物中のポリマーにおける酸化ＨＡは、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の理論的酸化度を有する。
【００４８】
本発明の別の実施態様において、組成物中の酸化ＨＡは、少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の試験的酸化度を有する。
【００４９】
本発明の別の実施態様において、酸化ＨＡは、１００％の理論的酸化度、および／または２０％から８０％に及ぶ試験的酸化度を有する。
【００５０】
本発明の別の実施態様において、組成物中のポリマーにおける酸化ＨＡは、少なくとも４０％、４５％または５０％の酸化度を有する。
【実施例】
【００５１】
本発明の範囲を限定する意図なしに、本発明の実施態様による例示的な機器、装置、方法およびこれらに関連する結果を以下に示す。読み手の便宜上、表題または副題を実施例で使用してもよく、これらは、本発明の範囲に影響がないものとする。
さらに、本明細書で特定の理論を提案し開示する。しかしながら、本発明が、特定の理論または実施方式に関なく実施される限り、その特定の理論が正しいか間違っているかにかかわらず、本発明の範囲を全く限定するものではない。
【００５２】
＜２．材料、および、調製、試験、評価等の方法＞
２．１．材料
ヒアルロン酸（平均分子量Ｄａ＝３．２×１０5）は、Ｑ．Ｐ．社（日本、東京）から購入した。
四ホウ酸ナトリウム（ホウ砂）、tert-ブチルカルバジン酸 (tert-butyl carbazae)、およびアジピン酸ジヒドラジドは、Sigma-Aldrich社（米国、ミズーリ州、セントルイス）から購入した。
ジエチレングリコール、臭化カリウム（ＫＢｒ）、および過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ4）は、ＲＤＨ Chemical社（米国、カリフォルニア州、スプリングバレー）から購入した。
トリクロロ酢酸は、ＪＴＢ社（日本、東京）から購入した。
【００５３】
透析チューブ（ＭＷＣＯ 6,000−8,000）は、Membrane Filtration Products社（米国、テキサス州）から入手した。
ヒト網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ細胞、ＢＣＲＣ６０３８３）は、台湾国立細胞科学センター（National Centre for Cell Sciences)から提供された。
細胞培養培地ＤＭＤＭ／Ｆ−１２、トリプシン−ＥＤＴＡ、ウシ胎仔血清、およびペニシリン‐ストレプトマイシンは、Gibco社（米国、ニューヨーク州、グランド・アイランド）から購入した。
高速セル増殖アッセイキットＩＩは、BioVision社（米国、カリフォルニア州）から入手した。
ＣＹＴＯＴＯＸ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイは、Promega社（米国、ウィスコンシン州）から入手した。
哺乳類細胞の生／死、生存率／細胞毒性キット(Live/Dead Viability/Cytotoxicity kit)は、Molecular Probes社（米国、オレゴン州、ユージーン）から入手した。
【００５４】
２．２．酸化ヒアルロン酸（オキシ−ＨＡ）の調製
ヒアルロン酸（ＨＡ）を、室温で２４時間、水溶液中で過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ4）によって酸化した。アルミホイルでくるんだ３００ｍｌのビーカーにおいて、ヒアルロン酸（２．００ｇ）を再蒸留水（２００ｍｌ）中で溶解した。次いで、種々の濃度の過ヨウ素酸ナトリウム溶液を撹拌しながら徐々に加えた。ＨＡに対するＮａＩＯ4のモル比は、低酸化度、中酸化度、高酸化度のオキシ−ＨＡを得るために、それぞれ１：０．５、１：１、１：２とした。
２４時間の撹拌後、さらにエチレングリコールを添加して３０分撹拌し、反応を停止した。得られた溶液を、再蒸留水で３日間、ＭＷＣＯ6,000−8,000の透析チューブ（CelluSep Ｔ２チューブ、Uptima社製）によって透析した。透析処理中に水を少なくとも３回交換した。そして、透析した溶液を、３日間、凍結乾燥器（ＦＤＵ−１１００、東京理化器械社製（日本、東京））によって凍結乾燥して、白色の綿毛状の生成物である酸化ヒアルロン酸（オキシ−ＨＡ）を得た。ＦＴ−ＩＲ分析（ＪＡＳＣＯ ＦＴＩＲ−４２００及びＡＴＲ ＰＲＯ４５０−Ｓ）のために、得られたオキシ−ＨＡを人の手で小さなペレットに圧搾した。
【００５５】
２．３．酸化度の決定
ｔ−ブチルカルバジン酸（ｔ−ＢＣ）を使用し、オキシ−ＨＡ中のアルデヒド官能基の数を測定することによって、オキシ−ＨＡの酸化度を定量化した。カルバジン酸塩は、ヒドラゾン形成と類似する方法で、アルデヒドと反応して安定したカルバジン酸塩を形成することで周知である。したがって、過剰のｔ−ＢＣ（２５μｌ、１％水性トリクロロ酢酸中３０．０ｍＭ）を、２４時間、オキシ−ＨＡ（２５μｌ、０．６ｗ／ｖ％）のアルデヒド官能基と反応させた後、残余のｔ−ＢＣを測定することによって、オキシ−ＨＡの酸化度を決定した。過剰の水性トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）水溶液（５００μｌ、６．０ｍＭ）を加え、錯体（トリニトロフェニル誘導体）の３４０ｎｍの吸光度を測定することによって、残余のｔ−ＢＣを決定した。基準として種々の濃度のｔ−ＢＣ溶液を使用し、較正曲線を得て、試験試料中の未反応のカルバジン酸塩を確認した。
【００５６】
２．４．オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルの調製
各酸化度のオキシ−ＨＡ試料を、室温で一晩、６ｗ／ｖ％の最終濃度となるまでリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で個別に溶解した。２、４および８ｗ／ｖ％のアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）溶液を、リン酸緩衝液で調製した。水と氷の入ったバス（約０℃）に入れたエッペンドルフにおいて、オキシ−ＨＡ溶液（４００μｌ）を２、４および８ｗ／ｖ％のＡＤＨ溶液（１００μｌ）と混合し、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ２、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ４、およびオキシ−ＨＡ／ＡＤＨ８のヒドロゲルをそれぞれ形成した。
【００５７】
２．５．オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルの屈折率
屈折計（ＤＲ−Ａ１ アタゴ社、日本）を使用して、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ２、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ４、およびオキシ−ＨＡ／ＡＤＨ８ヒドロゲルの屈折率（ＲＩ）を測定した。簡潔に説明すれば、液体状態のオキシ−ＨＡ／ＡＤＨ溶液の一部を、ピペット先端で屈折計プリズムに移した。屈折計プリズムを、等温の循環水浴によって３７℃でインキュベートした。ゲル化のため１０分間待機した後、ヒドロゲルの屈折率（ＲＩ）をディジタル画面から読み取った。
【００５８】
２．６．オキシ-ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルのレオロジー評価
円錐状およびプレート状（１−Ｃ３５／２ Ｔｉ）のレオメータ（HAAKE Rheostress 600、Thermo Fisher Scientific社製）を使用して、保存温度４℃および本体温度３７℃で、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルのレオロジー特性を評価した。温度４℃は、混合オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ溶液に対する外科医の手術時間の評価に用い、温度３７℃は、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルのゲル化時間の評価に用いた。
振動時間掃引(oscillation time sweep)モードでは、０．１Ｈｚ、１０Ｐａで運転し、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルのゲル化時間を決定するために１５分後に終了した。弾性率Ｇ'および粘性率Ｇ''を、RheoWin 3ソフトウェアによって記録して分析した。
【００５９】
２．７．オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルのインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）分解試験
オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ２、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ４、およびオキシ−ＨＡ／ＡＤＨ８ヒドロゲルの分解特性を、１００００ユニット／ｍｌのリゾチームを含むＰＢＳ中に、予め形成したヒドロゲルを浸漬することによって評価した。リゾチームは、多糖部分に作用する眼の酵素であることが知られていることから、分解モデル系にリゾチームを選択した。
簡潔に説明すれば、溶液中のオキシ−ＨＡおよびＡＤＨをエッペンドルフで混合し、混合物（オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ溶液）３００μｌをすぐに円柱状の型に移し、１０分間ゲル化させて、径０．７ｍｍおよび高さ０．８ｍｍの円柱状ヒドロゲルを形成した。この円柱状オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルを、２４ウエルの培養皿に入れ、リゾチームを含む３ｍｌのＰＢＳをそれぞれのウエルに加えた。ヒドロゲル形成直後に、ヒドロゲルの初期乾燥重量（Ｗid）を決定した。規則的な間隔で、ヒドロゲルを取り除き、凍結乾燥器によって、これを７２時間、凍結乾燥した。種々の時点のオキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルの乾燥重量（Ｗd）を秤量し、分解割合を、［（Ｗid−Ｗd）／Ｗid］によって算出した。
【００６０】
２．８．オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルの膨潤試験
オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ２、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ４、およびオキシ−ＨＡ／ＡＤＨ８ヒドロゲルの膨潤指数を、インビトロの分解試験と同じ条件下で評価した。ヒドロゲル形成直後にヒドロゲルの初期重量（Ｗi）を決定し、次いで、これを２４ウエル培養皿に入れた。規則的な間隔で、リゾチームを含むＰＢＳからヒドロゲルを取り除き、ろ紙で表層水を拭き取ってヒドロゲルを取り除き、これを秤量（Ｗt）し、同じ容器（各測定で緩衝液を交換した）に戻した。ＷtとＷiの比率から膨潤指数を算出した。
【００６１】
２．９．オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルの細胞毒性評価
オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルの細胞毒性評価を、ＩＳＯ規格に従ってヒト網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ細胞、ＢＣＲＣ６０３８３、台湾国立細胞科学センター）の単層による抽出培地を試験することによって行った。オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ２、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ４、およびオキシ−ＨＡ／ＡＤＨ８ヒドロゲルを、標準培地（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２）と共に、３７℃で７２時間、抽出率０．７５ｃｍ2／ｍｌでインキュベートすることによって抽出培地を調製した。
２００μｌの抽出培地を単層のＲＰＥ細胞で試験した。ＲＰＥ細胞を、５ｘ１０3細胞／ウエルの細胞密度で９６ウエルの培養皿に接種し、３７℃で一晩、標準培地に供した。その後、標準培地を抽出培地と交換した。対照（標準培地）、負の対照（Ａｌ2Ｏ3抽出培地）、正の対照（０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００含有培地）、ならびに試験群（オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ２、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ４、およびオキシ−ＨＡ／ＡＤＨ８抽出培地）を含む群を、６回反復して試験した（ｎ＝６）。
３７℃で１日間および３日間インキュベーション後、高速セル増殖アッセイキットＩＩ（BioVision社製）、およびＣＹＴＯＴＯＸ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Promega社製）をそれぞれ使用して、細胞生存率および細胞毒性を定量的に評価した。また、抽出培地で処理したＲＰＥ細胞を、生／死 染色キット（Molecular Probes # L3224）で染色した。
【００６２】
高速セル増殖アッセイキットＩＩを使用して細胞生存率を評価した。細胞を１日間および３日間培養し、その後、培地を廃棄し、それぞれのウエルにおいて０．２ｍｌ水溶性テトラゾリウム−８（ＷＳＴ−８）標準溶液と交換した。ＷＳＴ−８を生存細胞における脱水素酵素によって低減して、黄色の有色生成物（ホルマザン）を生成することができる。２時間インキュベーション後、１００μｌ標準溶液を、４５０ｎｍでの分光測光器による読み取りによって定量的に評価した。標準波長は６５０ｎｍであった。
【００６３】
ＣＹＴＯＴＯＸ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイキットを使用して、細胞毒性を評価した。このアッセイキットは、細胞溶解で放出した安定性のあるサイトゾル酵素である乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を定量的に測定した。１日間および３日間の培養後、培地および全細胞溶解を共に、アッセイマニュアルに従って４９０ｎｍの吸光度で測定した。また、抽出培地（ＲＰＥ細胞によりインキュベーションしていない）も、バックグラウンドとして使用するため評価した。細胞毒性を次に示す数式によって算出した。
【数１】
【００６４】
２．１０．予備動物試験
３羽のニュージーランド産シロウサギ（２．８〜３．２ｋｇ）の６つの眼を使用した。ケタラール／チャナジン(Chanazine)２％の筋肉注射による全身麻酔下で手術を行った。手術用顕微鏡下で、手術用メスによって、左眼におよそ３ｍｍの強膜切開を形成した。
１８ゲージ(gague)針によって硝子体をできるだけ多く吸引し、空気と置換した後、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ溶液を硝子体腔に注入した。手術後、眼を、１週間、１日に３回、抗生物質点眼薬および塩酸テトラサイクリン(tetracyclin hydrochloride)眼軟膏として、ゲンタマイシン（genticin、Roche社製）で処理した。また、手術していない対照として右眼を使用した。
眼科用テーブルスリットランプ（Topcon Medical Systems社製）を使用して、前部および透光体を観察し記録した。手術後第１、５、８、１２、１５および２１日目に、ｓｃｈｉｏｔｚ眼圧計によって眼内圧（ＩＯＰ）を測定した。超音波パキメトリー（DGH Technology社製）を使用して、中心角膜厚さを測定した。手術３週間後、３羽のウサギを屠殺した。右眼（対照）および左眼（手術したもの）を、これらの動物から採取した。この眼を１０％ホルムアルデヒド溶液で定着し、これらをパラフィンに埋め込み、光学顕微鏡観察のためにヘマトキシロンおよびエオシン（ＨＥ染色）で染色した。
【００６５】
２．１１．統計分析
すべてのデータを「平均±標準偏差」として示す。群間の統計的相違を、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して試験した。統計的有意性は、予めｐ＝０．０５の確率水準に設定した。
【００６６】
＜３．結果＞
３．１．酸化ヒアルロン酸（オキシ-HA）の特性評価
ヒアルロン酸（ＨＡ）を、室温で、種々の濃度の過ヨウ素酸ナトリウムによって酸化した。図１Ａは、ＮａＩＯ4によってＨＡを酸化して、２つのアルデヒド官能基を形成する、化学反応を示す。
図１Ｂに、（ｉ）ＨＡ粉末、および、（ｉｉ）低酸化度、（ｉｉｉ）中酸化度、（ｉｖ）高酸化度の酸化ＨＡ（オキシ−ＨＡ）オキシ−ＨＡのＦＴ−ＩＲスペクトルを示した。
（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）ののＦＴ−ＩＲスペクトルにおいて、1725ｃｍ-1および836ｃｍ-1にアルデヒド官能基の顕著なピークを観察することができ、その強度は、酸化度の増加（（ｉｉ）＜（ｉｉｉ）＜（ｉｖ））に伴って増加した。
（ｉ）ＨＡ粉末のスペクトルの1147ｃｍ-1および895ｃｍ-1のピークは、Ｃ−Ｏ−Ｃ（エーテル結合）、およびＣ−Ｈと関係があった。これらの２つのピークは、アルデヒド官能基の形成により、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）のスペクトルにおいて、1112ｃｍ-1および875ｃｍ-1へそれぞれシフトした。
【００６７】
オキシ−ＨＡの酸化度を、前述したｔ−ＢＣ滴定（ＴＮＢＳアッセイ）によってさらに測定した。
表１は、ＨＡ対のＮａＩＯ4のモル比から算出した理論的酸化度、およびＴＮＢＳアッセイによって測定して得た酸化度を示す。予想どおりに、ＮａＩＯ4量の増加に伴って、オキシ−ＨＡの酸化度は、27.3±2.3％から60.4±2.66％まで増加した。中酸化度（44.3±4.25％）を有するオキシ−ＨＡについて、次に示す試験において、種々の濃度のＡＤＨ（２、４および８ｗ／ｖ％）によって架橋した。
【００６８】
【表１】
【００６９】
３．２．オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルの屈折率（ＲＩ）
オキシ−ＨＡが、二官能性架橋剤であるＡＤＨにより架橋して、化学開始剤を使用することなく、ヒドロゲルを形成できることがわかった。図２Ａは、他の化学試薬を添加することなく、架橋反応が自然に発生し、反応が開始されたことを示す。
オキシ−ＨＡのアルデヒド官能基は、ＡＤＨのＮＨ2官能基と急速に反応して、無色透明なオキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルを形成した（図２Ｂ、左右の写真）。
ＡＤＨの濃度が２％から８％に増加するに伴って、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルの屈折率は１．３４２０から１．３４４２まで変化した（図２Ｃ）。この値は、ヒト硝子体液の屈折率（１．３３４５〜１．３３４８）に近い。
【００７０】
３．３．オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルのレオロジー特性
振動時間掃引（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｙ ｔｉｍｅ ｓｗｅｅｐｓ）を行い、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルのゲル化挙動を評価した。図３は、４℃および３７℃のオキシ−ＨＡ／ＡＤＨ２、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ４、およびオキシ−ＨＡ／ＡＤＨ８ヒドロゲルの弾性率（Ｇ'）および粘性率（Ｇ''）を示す。Ｇ'およびＧ''の交点を、ゲル生成を示すゲル化点と定義する。ゲル化点を生じるのに必要な時間を試料のゲル化時間と称する。
【００７１】
図３Ａは、４℃のオキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲル（オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ２、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ４、およびオキシ−ＨＡ／ＡＤＨ８）のレオロジーの結果を示す。これらの結果は、すべての型のオキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルが、ヒドロゲル中のＡＤＨ濃度によって、４℃で３〜８分間、液体状態に維持できることを示す。
図３Ｂは、３７℃のオキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルのレオロジーの結果を示す。すべてのヒドロゲルのゲル化時間は、１４３〜１７５秒と考えられ、これは、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルが、３７℃、３分以内で、ゲルマトリックスに変化し始めることを示している。オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルのレオロジー評価の結果を、表２に示す。
【００７２】
【表２】
【００７３】
３．４．オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルのインビトロ分解および膨潤指数
図４Ａは、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルの質量残存率の時間変化を示す。オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ２（◇）、およびオキシ−ＨＡ／ＡＤＨ４（△）ヒドロゲルをそれぞれ、第３日目および第１４日目で完全に溶解した。オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ８ヒドロゲル（□）の質量残存率は、第３日目において86.67±3.54％であり、第３５日で徐々に61.02±3.13％まで減少した。
図４Ｂは、種々の濃度のＡＤＨで架橋したオキシ−ＨＡの膨潤指数を示す。ヒドロゲルが完全に溶解するまで（３日以内）、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ２ヒドロゲルの膨潤指数は、時間の経過に伴って増加した。オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ４およびオキシ−ＨＡ／ＡＤＨ８の膨潤指数は、最初の３日間でわずかに減少し、その後、ヒドロゲルが分解し始めるまで、一定の値を維持した。
【００７４】
３．５．オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルの細胞毒性
細胞生存率をＷＳＴ−８アッセイによって評価した（図５Ａ）。第１日目では、試験群（オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ２、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ４、およびオキシ−ＨＡ／ＡＤＨ８）の有意差はなかった（ｐ＞０．５）。培養第３日目の対照、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ２、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ４、およびオキシ−ＨＡ／ＡＤＨ８群のＷＳＴ−８ ＯＤ450値は、それぞれ、1.27±0.03、1.20±0.05、1.14±0.04、および0.99±0.06だった。オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ２およびオキシ−ＨＡ／ＡＤＨ４の抽出培地（ｐ＞０．５）は、対照および負の対照群と比較して、ＲＰＥ細胞の細胞生存率に顕著な影響を及ぼさなかった。しかしながら、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ８の抽出培地は、対照群（ｐ＜０．００１）と比較して、細胞生存率のわずかな減少が生じた。
【００７５】
さらに、ＬＤＨアッセイによって細胞毒性を評価した（図５Ｂ）。オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ２、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ４、およびオキシ−ＨＡ／ＡＤＨ８の細胞毒性割合は、それぞれ、6.1640±0.5805％、6.0720±0.3872％、および5.3166±0.9590％であった。この結果は、対照群(6.9811±0.6663％、p＞0.5)と比較して、オキシ-HA/ADH抽出培地群では有意差がないことを示している。
【００７６】
図６は、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ２、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ４、およびオキシ−ＨＡ／ＡＤＨ８ヒドロゲルの抽出培地で培養したＲＰＥ細胞の蛍光顕微鏡写真をそれぞれ示す。ポリアニオン色素カルセイン−ＡＭは、生存細胞内で保持され、生存細胞において強くて均一な緑色蛍光を生成することができる。一方、ＥｔｈＤ−１は、損傷を受けた細胞膜を有する細胞に入り、死細胞において明るい赤色蛍光を生成することができる。生／死細胞の染色の結果は、種々の抽出培地で培養したほとんどの細胞が生存できることを示した。
【００７７】
３．６．予備動物試験
図７Ａは、手術後の眼内圧（ＩＯＰ）の変化を示す。手術した眼におけるＩＯＰは、手術後第１日目でわずかに減少した。オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲル注入後第５日目および第８日目で、ＩＯＰに上昇傾向があった。手術後第１２日目、１５日目および２１日目で、ＩＯＰがプラトーレベルに達した。観察期間中に手術した眼と対照の眼の間のＩＯＰに有意差はなかった。
図７Ｂは、手術した眼および対照の眼の角膜厚さを示す。群間の角膜厚さに有意差はなかった。
【００７８】
図８Ａは、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ８注入後第２１日目の眼のスリットランプ検査の写真を示す。手術した眼の角膜および水晶体は、欠陥を示さなかった。結果は、手術３週間後に検査した眼の前部において、顕著な炎症または他の疾病を示さなかった。
図８Ｂは、手術後第２１日目の手術した眼および対照の眼の網膜部分を示す。手術した眼の網膜層は容易に検出された。また、炎症反応もしくは浸潤、または、対照の眼とのいかなる相違もなかった。
【００７９】
＜４．考察＞
患者が硝子体切除手術を受ける場合、硝子体腔から多くの硝子体液を除去する。生来の硝子体は再生することができないので、硝子体腔を硝子体代替物で充填して、網膜の位置を保持し、網膜が再び剥離するのを防ぐことが必要である。過去数十年間で、硝子体代替物の開発は、研究者にとって挑戦であった。多くの生体高分子および合成化合物が研究室で検討された。しかしながら、恒久的な硝子体代替物となりうる理想的な材料は、現在開発されていない。
【００８０】
本研究では、２７ゲージ針によって硝子体腔に注入することができ、その後、ゲル様物質に変化することができる無色透明なオキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルを得ることができた。オキシ−ＨＡにおけるアルデヒド官能基をＮａＩＯ4によって形成した。すなわち、ＦＴ−ＩＲによって特性評価されるように（図１Ｂの1725ｃｍ-1および836ｃｍ-1のピーク）、グルクロン酸のＣ２−Ｃ３ヒドロキシル基を開裂してジアルデヒドを形成した。オキシ−ＨＡのジアルデヒドは、ＡＤＨのヒドラジド基と反応して、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルにおいて分子間ネットワークを形成することができた。
【００８１】
屈折率は、硝子体代替物の適用において重要な光学特性のうちの一つである。硝子体代替物の不適切な屈折率は、硝子体切除手術後に患者の視力に影響を及ぼす。ガスタンポナーデは、眼底検査および患者の視力を共に、一時的に制限するのに十分厳格な光学的変化を誘導する。現在の硝子体代替物（例えば、シリコーン油、ｎＤ＝1.40516、ヘビーシリコーン油、ｎＤ＝1.3008）の屈折率は、天然の硝子体の屈折率（ｎＤ＝1.336)と異なるため、タンポナーデ眼における屈折の変化の誘導を招くこととなる。
それに対し、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ８の屈折率は約1.3342であり、これはヒト硝子体と非常に類似している。硝子体代替物としてのオキシ−ＨＡ／ＡＤＨ８ヒドロゲルの利用は、硝子体切除手術後に好ましくない屈折の変化を回避することができる。
【００８２】
小ゲージ針による注入は、硝子体代替物の送入のための臨床的な一般的な手法である。図２Ｂ（左の写真）に示すように、２７ゲージ針によって、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ８ヒドロゲルを容易に注入することができた。注入能は、眼科医および患者への重要な要因である。
手術時間は、眼科医が硝子体腔に液体状態のヒドロゲルを注入するのに十分である必要がある。また、溶液‐ゲル変化時間は、ヒドロゲルの押出しを防ぐように、できるだけ短いことが必要である。レオロジー評価は、オキシ−ＨＡ溶液とＡＤＨ溶液の混合物が、約８分間、溶液形態で維持できることを示した。したがって、眼科医は、４℃でオキシ−ＨＡとＡＤＨ溶液を混合した後、注射器に混合オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ溶液を移すのに十分な時間（８分）が与えられる。また、液体形態で注入することができるので、ゲル形態で代替物を導入する際の困難性を克服する。このため、眼への硝子体代替物の送入方法において、侵襲性を最小とすることができる。
【００８３】
低架橋ヒドロゲル（例えば、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ２）において、膨潤指数はすぐに増加し、３日以内に完全に溶解した。この間、ヒドロゲルは加水分解を受け、ヒドラゾン結合は時間の経過に伴ってほぼ直線的に分解した。高架橋ヒドロゲル（例えば、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ４およびオキシ−ＨＡ／ＡＤＨ８）において、膨潤指数は、最初の３日間で減少した後、一定した値であり、その後、ネットワークが完全に溶解するまで、増加した。経時的な膨潤指数の増加は、ヒドロゲルネットワーク中のヒドラゾン結合の加水分解の結果であった。ヒドロゲル中のヒドラゾン結合が加水分解する場合、該ネットワークは、膨脹し、多くの水を含み、その後、完全に溶解する。
【００８４】
質量損失試験によれば、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ４およびオキシ−ＨＡ／ＡＤＨ８ヒドロゲルでみられた分解挙動は、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ２ヒドロゲルでみられたものと異なっていた。高いＡＤＨ含量の、したがってヒドラゾン結合の多い、ヒドロゲルは、低いＡＤＨ含量のヒドロゲルよりも遅く加水分解する傾向がある。高架橋ヒドロゲルでは、おそらく、低架橋密度または未架橋ヒアルロン酸を有するヒドロゲル領域の加水分解により、最初の３日間の質量損失（５〜１５％）において初期の減少があった。この段階の後に、おそらく、高架橋領域の分解により、次の数日または数週で質量のわずかな減少があった。そして、ヒドロゲル中のヒドラゾン結合が加水分解し、これは、溶解段階で生じた。
【００８５】
オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ４ヒドロゲルは、第８−１２日目で膨潤の進行を示した。これは、ヒドラゾン結合がこのときに加水分解し、その後、第１４日目で溶解段階があることを意味した。これによって、ヒドロゲル質量の減少が生じ、最終的にヒドロゲルの完全溶解が生じた。一方、高度の架橋により、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ８は、３日間一定の膨潤指数に達し、ヒドロゲルは、第３０−３５日目で膨潤の進行を示した。
【００８６】
インビトロ分解試験は、酵素（10,000ユニット／ｍｌのリゾチームを含むＰＢＳ）の存在下で、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ８ヒドロゲルの３０−４０％のみが分解するにすぎず、ヒドロゲルが５週間安定することを示した。シリコーン油およびガスは、臨床的に、眼内容積を回復し網膜剥離を操作する網膜再付着手術における一般的な硝子体代替物である。これらは、網膜破損による液体の通過を防ぎ、正常な網膜−網膜色素上皮（ＲＰＥ）の付着を維持し、網膜の再付着を維持する。ガスの寿命は、ガスの種類、気泡容積、初期濃度、および眼内圧によって、通常数日から２週間以内である。数週以内に再吸収する眼内のガスとは対照的に、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ８ヒドロゲルは、インビトロ分解試験で少なくとも５週間ゲルマトリックスを維持することができる。臨床的考慮において、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ８ヒドロゲルの寿命は、網膜付着に有益である。さらに、患者がガスタンポナーデにより硝子体切除手術を受ける場合、ヒドロゲルは、腹臥位の不便性を克服する。
【００８７】
網膜色素上皮（ＲＥＰ）細胞は、網膜剥離または局所的な網膜切除後に、眼球を充填する硝子体代替物に直接暴露することが多いので、ＲＥＰ細胞を細胞毒性評価のための標的細胞として選択した。また、ＲＰＥ細胞も、網膜の再付着の失敗および増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）に関係することが分かった。細胞生存率アッセイ（ＷＳＴ−８）、および細胞毒性（ＬＤＨアッセイ）は、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルが、インビトロ評価で、生体適合性であり、ＲＰＥ細胞による毒性がなかったことを示す。
【００８８】
ヒドロゲルの分解産物は、臨床応用についての別の懸念である。分解評価の結果によれば、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ２ヒドロゲルは、水性環境中で３日以内に分解した。これは、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ２ヒドロゲルが、抽出処理（３７℃、７２時間）時に、抽出培地ですべて分解し、分解産物が、細胞毒性評価でＲＰＥ細胞と培養されたことを示す。細胞毒性分析データ（図５Ａ、５Ｂ）によれば、この群では、顕著な細胞毒性はなかった。これらの結果は、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルからの分解産物が、ＷＳＴ−８および細胞毒性アッセイに基づき、ＲＰＥ細胞に対して細胞毒性がないことを示した。さらに、生／死細胞染色も、種々の抽出培地からほとんどの培養細胞が生存できたことを示す。
【００８９】
オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ８を注入した眼のスリットランプ検査は、観察期間中、前眼部で炎症または混濁が発生しないことを示した。眼内圧の増加は、硝子体切除手術後に生じることが多い。しかしながら、手術した眼の眼内圧は、観察期間中に正常なレベルにとどまった。これは、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルの膨潤指数のわずかな減少によるものであると考えられた。また、網膜組織の組織学的検査も、構造変化または分解がないことを示し、対照の眼との有意差も示さなかった。
【００９０】
＜５．結論＞
現在、臨床応用のための理想的な硝子体代替物は、まだ開発されていない。多くの研究は、硝子体代替物のための適切なバイオマテリアルを開発することを試みた。
本発明は、注入可能な新規ヒアルロン酸系ヒドロゲルであるオキシ−ＨＡ／ＡＤＨの合成および特性に関する。このヒドロゲルは、適切な屈折率を有し、注入可能であり、インサイチュのゲル化性を有し、また、ＲＥＰ細胞に対して細胞毒性を示さない等の、硝子体代替物としての利用において幾つかの有益な特性を示す。さらに、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨ８ヒドロゲルは、眼の酵素（リゾチーム）によって、５週間、インビトロで分解しなかった。予備動物試験では、オキシ−ＨＡ／ＡＤＨヒドロゲルは、観察期間に重篤な合併症を誘発しなかった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）酸化ヒアルロン酸と、
（ｂ）酸化ヒアルロン酸を架橋するジヒドラジドと、を含むヒドロゲルポリマーを含む組成物であって、
該ヒドロゲルポリマーは、
（ｉ）無色透明であり、
（ｉｉ）３７℃で液体状態からゲルマトリックスに変化する特性を有する組成物。
【請求項２】
前記ジヒドラジドは、
アジピン酸ジヒドラジド、オキサリルジヒドラジド、コハク酸ジヒドラジド、マロン酸ジヒドラジド、エチルマロン酸ジヒドラジド、セバシン酸ジヒドラジド、イソフタル酸ジヒドラジド、アミキュアＬＤＨ、アミキュアＶＤＨ、マレイン酸ジヒドラジド、およびピメリン酸ジヒドラジドから選択される少なくとも１つである請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記ジヒドラジドは、アジピン酸ジヒドラジドである請求項２記載の組成物。
【請求項４】
前記ヒドロゲルポリマーは、架橋した酸化ヒアルロン酸を含み、
該架橋した酸化ヒアルロン酸は、Ｃ２もしくはＣ３、またはこれらのアルデヒド基を有したグルクロン酸を有する請求項１または２記載の組成物。
【請求項５】
前記ジヒドラジドは、前記酸化ヒアルロン酸のグルクロン酸のＣ２およびＣ３によって、２つの鎖の酸化ヒアルロン酸を架橋する請求項１または２記載の組成物。
【請求項６】
前記ヒドロゲルポリマー中の酸化ヒアルロン酸とヒドラジドとの重量比は、１２：１から３：１の範囲である請求項１または２記載の組成物。
【請求項７】
前記ヒドロゲルポリマーは、１．３４１〜１．３４５の範囲の屈折率を有する請求項１または２記載の組成物。
【請求項８】
請求項１記載の組成物の調製方法であって、
酸化ヒアルロン酸を含む第１の溶液と、ジヒドラジドを含む第２の溶液とを混合して、ヒドロゲルポリマーを含む組成物を形成する工程を含み、
該ヒドロゲルポリマーは、
（ａ）酸化ヒアルロン酸と、
（ｂ）酸化ヒアルロン酸を架橋するジヒドラジドと、を含み、
該ヒドロゲルポリマーは、
（ｉ）無色透明であり、
（ｉｉ）３７℃で液体状態からゲルマトリックスに変化する特性を有する組成物の調製方法。
【請求項９】
（ａ）酸化ヒアルロン酸と、
（ｂ）ジヒドラジドと、
（ｃ）緩衝液と、
（ｄ）請求項１記載の組成物の調製方法を記載した説明書と、
を含むキット。
【請求項１０】
前記ジヒドラジドは、
アジピン酸ジヒドラジド、オキサリルジヒドラジド、コハク酸ジヒドラジド、マロン酸ジヒドラジド、エチルマロン酸ジヒドラジド、セバシン酸ジヒドラジド、イソフタル酸ジヒドラジド、アミキュアＬＤＨ、アミキュアＶＤＨ、マレイン酸ジヒドラジド、およびピメリン酸ジヒドラジドから選択される少なくとも１つである請求項９記載のキット。
【請求項１１】
前記ジヒドラジドは、アジピン酸ジヒドラジドである請求項１０記載のキット。
【請求項１２】
ヒトを除く動物の眼球の硝子体の置換方法であって、
眼球の硝子体腔から硝子体を除去する段階と、
硝子体を空気と置換する段階と、
硝子体腔に、空気と置換するのに十分な量の請求項１記載の組成物を注入する段階と、
を含む眼球の硝子体の置換方法。
【請求項１３】
ヒトを除く動物の眼球の硝子体の置換方法であって、
眼球の硝子体腔から硝子体を除去する段階と、
硝子体を空気と置換する段階と、
硝子体腔に、空気と置換するのに十分な量の請求項７記載の組成物を注入する段階と、
を含む眼球の硝子体の置換方法。
【請求項１４】
化学式（Ｉ）のヒドロゲルポリマーを含み、
【化１】
式中、ｍ、ｎは整数であり、ｍ≦５、１００≦ｎ≦２５００であり、
該ヒドロゲルポリマーは、
（ｉ）無色透明であり、
（ｉｉ）３７℃で液体状態からゲルマトリックスに変化する特性を有する組成物。
【請求項１５】
前記ヒドロゲルポリマーは、１．３４１〜１．３４５の範囲の屈折率を有する請求項１４記載の組成物。
【請求項１】
（ａ）酸化ヒアルロン酸と、
（ｂ）酸化ヒアルロン酸を架橋するジヒドラジドと、を含むヒドロゲルポリマーを含む組成物であって、
該ヒドロゲルポリマーは、
（ｉ）無色透明であり、
（ｉｉ）３７℃で液体状態からゲルマトリックスに変化する特性を有する組成物。
【請求項２】
前記ジヒドラジドは、
アジピン酸ジヒドラジド、オキサリルジヒドラジド、コハク酸ジヒドラジド、マロン酸ジヒドラジド、エチルマロン酸ジヒドラジド、セバシン酸ジヒドラジド、イソフタル酸ジヒドラジド、アミキュアＬＤＨ、アミキュアＶＤＨ、マレイン酸ジヒドラジド、およびピメリン酸ジヒドラジドから選択される少なくとも１つである請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記ジヒドラジドは、アジピン酸ジヒドラジドである請求項２記載の組成物。
【請求項４】
前記ヒドロゲルポリマーは、架橋した酸化ヒアルロン酸を含み、
該架橋した酸化ヒアルロン酸は、Ｃ２もしくはＣ３、またはこれらのアルデヒド基を有したグルクロン酸を有する請求項１または２記載の組成物。
【請求項５】
前記ジヒドラジドは、前記酸化ヒアルロン酸のグルクロン酸のＣ２およびＣ３によって、２つの鎖の酸化ヒアルロン酸を架橋する請求項１または２記載の組成物。
【請求項６】
前記ヒドロゲルポリマー中の酸化ヒアルロン酸とヒドラジドとの重量比は、１２：１から３：１の範囲である請求項１または２記載の組成物。
【請求項７】
前記ヒドロゲルポリマーは、１．３４１〜１．３４５の範囲の屈折率を有する請求項１または２記載の組成物。
【請求項８】
請求項１記載の組成物の調製方法であって、
酸化ヒアルロン酸を含む第１の溶液と、ジヒドラジドを含む第２の溶液とを混合して、ヒドロゲルポリマーを含む組成物を形成する工程を含み、
該ヒドロゲルポリマーは、
（ａ）酸化ヒアルロン酸と、
（ｂ）酸化ヒアルロン酸を架橋するジヒドラジドと、を含み、
該ヒドロゲルポリマーは、
（ｉ）無色透明であり、
（ｉｉ）３７℃で液体状態からゲルマトリックスに変化する特性を有する組成物の調製方法。
【請求項９】
（ａ）酸化ヒアルロン酸と、
（ｂ）ジヒドラジドと、
（ｃ）緩衝液と、
（ｄ）請求項１記載の組成物の調製方法を記載した説明書と、
を含むキット。
【請求項１０】
前記ジヒドラジドは、
アジピン酸ジヒドラジド、オキサリルジヒドラジド、コハク酸ジヒドラジド、マロン酸ジヒドラジド、エチルマロン酸ジヒドラジド、セバシン酸ジヒドラジド、イソフタル酸ジヒドラジド、アミキュアＬＤＨ、アミキュアＶＤＨ、マレイン酸ジヒドラジド、およびピメリン酸ジヒドラジドから選択される少なくとも１つである請求項９記載のキット。
【請求項１１】
前記ジヒドラジドは、アジピン酸ジヒドラジドである請求項１０記載のキット。
【請求項１２】
ヒトを除く動物の眼球の硝子体の置換方法であって、
眼球の硝子体腔から硝子体を除去する段階と、
硝子体を空気と置換する段階と、
硝子体腔に、空気と置換するのに十分な量の請求項１記載の組成物を注入する段階と、
を含む眼球の硝子体の置換方法。
【請求項１３】
ヒトを除く動物の眼球の硝子体の置換方法であって、
眼球の硝子体腔から硝子体を除去する段階と、
硝子体を空気と置換する段階と、
硝子体腔に、空気と置換するのに十分な量の請求項７記載の組成物を注入する段階と、
を含む眼球の硝子体の置換方法。
【請求項１４】
化学式（Ｉ）のヒドロゲルポリマーを含み、
【化１】
式中、ｍ、ｎは整数であり、ｍ≦５、１００≦ｎ≦２５００であり、
該ヒドロゲルポリマーは、
（ｉ）無色透明であり、
（ｉｉ）３７℃で液体状態からゲルマトリックスに変化する特性を有する組成物。
【請求項１５】
前記ヒドロゲルポリマーは、１．３４１〜１．３４５の範囲の屈折率を有する請求項１４記載の組成物。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【公表番号】特表２０１３−５１９４４５（Ｐ２０１３−５１９４４５Ａ）
【公表日】平成２５年５月３０日（２０１３．５．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５５３００６（Ｐ２０１２−５５３００６）
【出願日】平成２３年２月１０日（２０１１．２．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２４３９８
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／１００４６９
【国際公開日】平成２３年８月１８日（２０１１．８．１８）
【出願人】（５１２１７５１３３）ナショナル ヘルス リサーチ インスティテューツ (2)
【氏名又は名称原語表記】Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年５月３０日（２０１３．５．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年２月１０日（２０１１．２．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２４３９８
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／１００４６９
【国際公開日】平成２３年８月１８日（２０１１．８．１８）
【出願人】（５１２１７５１３３）ナショナル ヘルス リサーチ インスティテューツ (2)
【氏名又は名称原語表記】Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ
【Ｆターム（参考）】
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