組織を操作するための増殖因子改変タンパク質マトリクス
【課題】組織修復、再生、および／またはリモデリング、ならびに／もしくは薬物送達における使用のための、薬学的に活性な分子を含むマトリクスの使用を課題とする。
【解決手段】上記課題は、タンパク質を、マトリクスの分解、酵素作用、および／または拡散により放出されるように組込むことで解決された。１つの方法は、共有結合または非共有結合方法のいずれかにより、ヘパリンをマトリクスに結合させ、ヘパリン−マトリクスを形成することである。次いで、ヘパリンは、このタンパク質マトリクスに対するヘパリン結合増殖因子に非共有結合する。あるいは、架橋領域（例えば、第ＸＩＩＩａ因子基質）およびネイティブのタンパク質配列を含む融合タンパク質が、構築され得る。マトリクスと生理活性因子との間の分解可能な連結の組込みは、特に、長期の薬物送達が所望される場合（例えば、神経再生の場合）に有用であり得る。
【解決手段】上記課題は、タンパク質を、マトリクスの分解、酵素作用、および／または拡散により放出されるように組込むことで解決された。１つの方法は、共有結合または非共有結合方法のいずれかにより、ヘパリンをマトリクスに結合させ、ヘパリン−マトリクスを形成することである。次いで、ヘパリンは、このタンパク質マトリクスに対するヘパリン結合増殖因子に非共有結合する。あるいは、架橋領域（例えば、第ＸＩＩＩａ因子基質）およびネイティブのタンパク質配列を含む融合タンパク質が、構築され得る。マトリクスと生理活性因子との間の分解可能な連結の組込みは、特に、長期の薬物送達が所望される場合（例えば、神経再生の場合）に有用であり得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、組織の修復または再生、および／あるいは薬学的に活性な分子の制御された放出における使用のための、親和性結合相互作用を使用した、薬学的に活性な分子（薬学的に活性な分子（特に増殖因子）の融合タンパク質を含む）を含むマトリクスの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
組織の修復または再生のために、細胞は創傷床（ｗｏｕｎｄ ｂｅｄ）に移動し、増殖し、マトリクス成分を発現するかまたは細胞外マトリクスを形成し、そして最終的な組織の形状を形成しなければならない。複数の細胞集団が、しばしばこの形態形成応答（これは頻繁に脈管細胞および神経細胞を含む）において関与するに違いない。マトリクスは、非常に増強されることが実証され、そしていくつかの場合、これを生じるために必須であることが見出された。天然の細胞は、細胞内部増殖マトリクスの影響による再構築に供され、これは全てタンパク質分解（例えば、プラスミン（フィブリンを分解する）およびマトリクスメタロプロテイナーゼ（コラーゲン、エラスチンなどを分解する）による）に基づく。このような分解は、高度に局在化され、そして移動細胞と直接的に接触する際にのみ生じる。さらに、特定の細胞シグナル伝達タンパク質（例えば、増殖因子）の送達は、きつく調節されている。天然のモデルにおいて、マクロ孔質（ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ）細胞内部増殖マトリクスは使用されず、むしろ、局所的に、および要求される場合は細胞がマトリクス中に移動したときに、細胞が分解し得る微孔質マトリクスが使用される。
【０００３】
増殖因子についての制御された送達デバイスは、いくつかの形態の増殖因子を隔離するために固定化されたヘパリンの使用に基づいて以前に設計された。例えば、Ｅｄｅｌｍａｎらは、アルギネート中のヘパリン結合ＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭビーズを使用した。このビーズは、塩基性線維芽細胞増殖因子（「ｂＦＧＦ」）のヘパリンとの結合および解離に基づいて、ｂＦＧＦをゆっくり放出する貯蔵庫として役立つ。
【０００４】
二ドメインペプチド（これは第ＸＩＩＩａ因子基質配列および生理活性ペプチド配列を含む）が、フィブリンゲルに架橋され得ること、およびこの生理活性ペプチドがインビトロでその細胞活性を保持していることが実証された（非特許文献１）。ペプチドは、そのペプチドが由来するタンパク質全体の生理活性を部分的に模倣し得るがこの生理活性は通常はタンパク質全体の生理活性よりも低く、ときどき、ほんの短いペプチドで特定のタンパク質を模倣することは不可能である。従って、タンパク質全体（例えば、増殖因子または他の薬学的に活性な分子）をマトリクス中に組み込み得ることが所望される。
【０００５】
タンパク質および増殖因子についての送達系が存在し、公知であるが、組織の移動細胞への増殖因子の提示および放出の制御ならびに細胞接着部位の制御を介したマトリクス中への細胞移動および組織内部増殖を促進する、修復において使用するためのマトリクスについての必要性が残る。この必要性は、天然において起こるように、マトリクスとの親和性相互作用を介して増殖因子を局所的に提示し得、そしてその影響および活性を局所的に保持し得るような内部増殖のマトリクスについて特に大きい。
【０００６】
従って、インタクトな増殖因子分子の活性を保持する増殖因子がその中に組み込まれた組織の修復、再生および再構築のための、天然の生分解性マトリクスを提供することが本発明の目的である。
【０００７】
増殖因子の制御および／または維持された放出のための、天然の生分解性マトリクスを提供することが、本発明のさらなる目的である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｓｃｈｅｎｓｅ，Ｊ．Ｃ．ら（１９９９）Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１０：７５〜８１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
組織の修復、再生および／もしくは再構築ならびに／または薬物送達において使用するために、タンパク質は、タンパク質または多糖ポリマーのマトリクスまたはゲル中に組み込まれる。このタンパク質は、このマトリクスの分解によって、酵素作用および／または拡散によって放出されるように組み込まれ得る。実施例によって実証されるように、１つの方法は、ヘパリンを共有結合的または非共有的結合方法のいずれかによってマトリクスに結合させてヘパリン−マトリクスを形成することである。次いで、このヘパリンは、ヘパリン結合増殖因子をタンパク質マトリクスに非共有結合させる。結合されるべきタンパク質がネイティブなヘパリン結合配列を含まない場合、ネイティブなタンパク質配列および合成ヘパリン結合ドメインを含む融合タンパク質が構築され得る。あるいは、架橋領域およびネイティブなタンパク質配列を含む融合タンパク質が構築され得、そしてこの融合タンパク質は架橋によって隔離されて、マトリクスを形成し得る。この融合タンパク質またはペプチドドメインは、加水分解部位または酵素的切断部位を含む分解可能な結合を含み得る。これは、マトリクス中の異なる位置で、その位置および／またはマトリクス中における細胞活性に依存して、送達速度を変更することを可能にする。このアプローチは、長期の薬物送達が所望される場合、例えば、神経再生の場合（再生の相関的要素として空間的に薬物放出速度を変更すること（例えば、生存組織境界の付近では速く、そして損傷域中ではさらによりゆっくりと）が所望される場合）、特に有用であり得る。さらなる利点としては、送達系中のより低い総薬物用量、および、最大細胞活性の時点で放出されるべき薬物のよりも高い割合を可能にする、放出の空間的な制御が挙げられる。実施例は、細胞内部増殖および組織再生を最適に誘導したマトリクス中へ隔離された増殖因子、ヘパリン結合ドメインおよびヘパリンまたはヘパリン結合ペプチドの、最適化される比またはレベルを実証する。
【００１０】
本発明は、例えば以下を提供する。
（項目１） ペプチドドメインまたはタンパク質を含む操作したタンパク質または多糖ポリマーであって、該ドメインまたはタンパク質が、ヘパリン結合タンパク質もしくはその部分または放出のための生理活性因子を結合する、操作したタンパク質または多糖ポリマー。
（項目２） 細胞増殖または内部増殖または生理活性因子の放出に適したマトリクスの形成のための共有結合またはイオン結合を含む、項目１に記載のポリマー。
（項目３） 酵素的にまたは加水分解により切断される切断部位をさらに含む、項目１に記載のポリマー。
（項目４） マトリクスを形成するタンパク質または多糖ポリマーとヘパリンまたはヘパリンペプチドの間の部位の切断により放出される、ヘパリンまたはヘパリンペプチドを含む、項目２に記載のポリマー。
（項目５） 架橋酵素の基質である少なくとも一つの領域を含む、項目１に記載のポリマー。
（項目６） 第ＸＩＩＩａ因子の基質である領域を含む、項目５に記載のポリマー。
（項目７） 前記ヘパリン結合タンパク質が増殖因子である、項目１に記載のポリマー。
（項目８） 前記増殖因子が、トランスフォーミング増殖因子β、骨形成タンパク質、線維芽細胞増殖因子、血管上皮増殖因子、インターロイキン−８、ニューロトロフィン−６、ヘパリン結合上皮増殖因子、肝細胞増殖因子、結合組織増殖因子、ミッドカイン、ヘパリン結合増殖関連分子、およびそれらの混合物からなる群より選択される、項目７に記載のポリマー。
（項目９） ヘパリンペプチドキメラを含む項目１に記載のポリマーであって、
トランスグルタミナーゼ基質および
ヘパリンまたはヘパリン様ペプチド、を含み
ここで該トランスグルタミナーゼ基質およびヘパリンまたはヘパリン様ペプチドがお互いに直接結合される、ポリマー。
（項目１０） 前記トランスグルタミナーゼ基質は、ヘパリンまたはヘパリン様ペプチドに共有結合される架橋可能なタンパク質である、項目９に記載のポリマー。
（項目１１） 前記架橋可能なタンパク質が、フィブリンである、項目１０に記載のポリマー。
（項目１２） 融合タンパク質を含む、項目９に記載のポリマー。
（項目１３） 前記トランスグルタミナーゼ基質が、第ＸＩＩＩａ因子により架橋される、項目９に記載のポリマー。
（項目１４） 前記基質が、ＮＱＥＱＶＳＰを含む、項目１３に記載のポリマー。
（項目１５） トランスグルタミナーゼ基質とヘパリンまたはヘパリンペプチドの間に酵素切断部位を含む、項目９に記載のポリマー。
（項目１６） 前記酵素切断部位が、プラスミンおよびマトリクスメタロプロテイナーゼの群から選択される酵素により切断される、項目４に記載のポリマー。
（項目１７） 操作したタンパク質または多糖ポリマーのマトリクスであって、該タンパク質または多糖が、共有結合またはイオン結合されて細胞増殖または内部増殖または生理活性因子の放出に適したマトリクスを形成し、該ポリマーが、ヘパリン結合タンパク質またはその部分、マトリクスからの放出のための生理活性因子、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるペプチドドメインまたはタンパク質を含む、操作したタンパク質または多糖ポリマーマトリクス。
（項目１８） 前記ポリマーが、酵素的にまたは加水分解により切断される切断部位を含む、項目１７に記載のマトリクス。
（項目１９） 前記切断部位が、エステルおよびアミドからなる群より選択される、項目１８に記載のマトリクス。
（項目２０） 前記マトリクスを形成するタンパク質または多糖ポリマーとヘパリンまたはヘパリンペプチドまたは生理活性因子の間の切断部位を含む項目１８に記載のマトリクス。
（項目２１） 前記生理活性因子が、増殖因子である、項目１７に記載のマトリクス。
（項目２２） 前記増殖因子が、トランスフォーミング増殖因子β、骨形成タンパク質、線維芽細胞増殖因子、血管上皮増殖因子、インターロイキン−８、ニューロトロフィン−６、ヘパリン結合上皮増殖因子、肝細胞増殖因子、結合組織増殖因子、ミッドカイン、ヘパリン結合増殖関連分子、およびそれらの混合物からなる群より選択される、項目２１に記載のマトリクス。
（項目２３） 前記マトリクス形成タンパク質ポリマーが、フィブリンを含む項目１７に記載のマトリクス。
（項目２４） ヘパリン結合ペプチドおよび骨形成因子を含む項目２２に記載のマトリクスであって、ＢＭＰに対するペプチドの比が、ほぼ等モルであるマトリクス。
（項目２５） 切断部位が切断される場合に放出されるヘパリンを含む、項目２０に記載のマトリクス。
（項目２６） 前記ヘパリン結合ドメインが、アンチトロンビンＩＩＩ、血小板第４因子、およびアミノ酸配列ＮＣＡＭを含むタンパク質からなる群より選択されるタンパク質由来である、項目１７に記載のマトリクス。
（項目２７） 前記タンパク質または多糖ポリマーが、融合タンパク質である、項目１７に記載のマトリクス。
（項目２８） 前記融合タンパク質が、一つのドメインとしてのトランスグルタミナーゼ基質またはヘパリンまたはヘパリン結合ペプチドおよび第二の生理活性ドメインを含む、項目２７に記載のマトリクス。
（項目２９） 前記生理活性ドメインが、増殖因子である、項目２８に記載のマトリクス。
（項目３０） 前記増殖因子が、ＮＧＦβ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＶＥＧＦ１２１、ＥＧＦ、およびＰＤＧＦからなる群より選択される、項目２９に記載のマトリクス。
（項目３１） 前記マトリクスを形成するポリマーが、プロテアーゼインヒビターを含む、項目１７に記載のマトリクス。
（項目３２） ペプチドドメインまたはタンパク質を含む操作したタンパク質または多糖ポリマーを架橋することを含むマトリクスを作製するための方法であって、該ドメインまたはタンパク質が、ヘパリン結合タンパク質もしくはその部分または放出のための生理活性因子を結合する、方法。
（項目３３） ヘパリンまたはヘパリンペプチドの放出のための項目３２に記載の方法であって、前記マトリクスを形成するタンパク質または多糖ポリマーとヘパリンまたはヘパリンペプチドの間の部位の切断により放出されるヘパリンまたはヘパリンペプチドを含むポリマーを架橋することを含む、方法。
（項目３４） 前記マトリクスが、該マトリクスから放出される生理活性因子を含む、項目３２に記載の方法。
（項目３５） 前記マトリクスが、ある一つの部位で移植され、そして内部増殖および／または該マトリクス中での細胞の増殖を促進するように配置される、項目３２に記載の方法。
（項目３６） 前記マトリクスが、第ＸＩＩＩ因子または第ＸＩＩＩａ因子に富む前駆体から、フィブリンマトリクス中に外因性物質を組み込む、項目３２に記載の方法。
（項目３７） ペプチドドメインまたはタンパク質を含む操作したタンパク質または多糖ポリマーを移植することを含む生理活性因子の制御された放出のための方法であって、該ドメインまたはタンパク質は、ヘパリン結合タンパク質もしくはその部分または放出のための生理活性因子を結合し、該ポリマーが、移植前または移植時に架橋される、方法。
（項目３８） 前記マトリクスが、放出される生理活性因子に結合するヘパリンまたはヘパリンペプチドを含むポリマーを含む、項目３７に記載の方法。
（項目３９） 放出される生理活性因子を提供することをさらに含む項目３８に記載の方法であって、該生理活性因子が、マトリクスの分解、ヘパリンもしくはヘパリンペプチドを放出するためのポリマーの切断、またはヘパリンもしくはヘパリン結合ペプチドが結合した生理活性因子の拡散により、放出される方法。
（項目４０） 前記生理活性因子が、細胞の修復、再生または再構築を促進する、項目３７に記載の方法。
（項目４１） 前記生理活性因子が、細胞の修復または再生を阻害する、項目３７に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、プラスミン分解されたペプチド含有フィブリンゲルおよび遊離ペプチドの蛍光検出クロマトグラムである。２ＰＩ１〜７−ＡＴＩＩＩ１２１〜１３４ペプチドが取り込まれた分解したフィブリンゲル（−）、取り込まれたペプチドを含む分解したフィブリンゲルに遊離状態で添加された同じペプチドを有する分解したフィブリンゲル（…）、および遊離ペプチド単独（−−）のサイズ排除クロマトグラフィーを示す。Ｎ末端ロイシン残基は、ダンシル化した（ｄＬと省略される）。遊離ペプチドは、より低い分子量に対応して、凝固の間にフィブリン中に取り込まれたペプチドが溶出する時間よりも長い時間で溶出された。これは、分解したフィブリンへの共有結合、従って第ＸＩＩＩａ因子活性の作用を介する共有結合的な取り込みを実証する。
【図２】図２は、４８時間でのＤＲＧ神経突起の伸長に対するマトリクス結合ｂＦＧＦの効果のグラフである。平均値および平均の標準偏差が示される。（＊は、改変されていないフィブリンと比較してｐ＜０．０５であることを示す）。
【図３】図３は、フィブリンマトリクス中のＤＲＧ神経突起の伸長に対する固定化された−ＮＧＦ融合タンパク質の効果のグラフである。平均値および平均の標準誤差が示される。 は、ネイティブなＮＧＦを示す。 は、ＴＧ−Ｐ−ＮＧＦを示す。 は、ＴＧ−Ｐｉ−ＮＧＦを示す。＊は、培養培地中のＮＧＦを有する改変されていないフィブリンに対してｐ＜０．０００１であることを示す。この結果は、マトリクスに結合した−ＮＧＦが、フィブリンマトリクスを介して、培地中の同じ濃度のＮＧＦと比較して、神経突起の伸長を増強することを実証する。
【図４】図４は、ビオチン標識−ＮＧＦを使用して直接的ＥＬＩＳＡで定量した、外因性第ＸＩＩＩａ因子基質を使用した−ＮＧＦ融合タンパク質のフィブリンマトリクス中への取り込みの量のグラフである。−ＮＧＦ融合タンパク質の取り込み効率は、試験された濃度の範囲にわたって比較的一定であった。
【図５】図５は、ｄＬＮＱＥＱＶＳＰＬＲＧＤ（配列番号１）の、外因性第ＸＩＩＩ因子が添加されたフィブリンゲル中への取り込みのグラフである。１Ｕ／ｍＬを添加した場合、取り込みのレベルは、２５ｍｏｌのペプチド／ｍｏｌのフィブリノーゲンよりも多くが達成され得るように増加した。
【図６】図６は、二ドメインペプチド（ｄＬＮＱＥＱＶＳＰＬＲＧＤ（配列番号１））の、希釈していないフィブリン接着剤（ｇｌｕｅ）中への取り込みのグラフである。３つの別々のキットを試験し、そしてそれぞれの場合において高レベルの取り込みが観察され得、これは２５ｍｏｌペプチド／ｍｏｌフィブリノーゲンに達した。最大取り込みのために必要とされる外因性ペプチドの濃度は、少なくとも５ｍＭであり、これは、作製される高度に濃いフィブリンマトリクス中への、拡散の限界におそらく起因する。取り込みのレベルは非常に一致しており、それぞれのキットは、同様の取り込みプロフィールを提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（発明の詳細な説明）
本明細書中に記載される場合、組織の修復、再生または再構築を、増殖因子が放出可能に取り込まれた天然のマトリクスを使用して増強するための方法が開発された。先行技術のマトリクスを越えるいくつかの利点が存在する：天然のマトリクスは生体適合性および生分解性であり、そして移植時に、インビトロまたはインビボで形成され得る；全長の増殖因子タンパク質が取り込まれ得、そして全部の生理活性を保持し得る；この増殖因子は、この増殖因子をどのように、およびいつ、およびどの程度放出するかについての制御を提供する技術を使用して放出可能に組み込まれ得、その結果このマトリクスは、直接的または間接的に組織修復のために、制御された放出ビヒクルとしてこのマトリクスを使用して、使用され得る。
【００１３】
（Ｉ．マトリクスおよび増殖因子）
（Ａ．マトリクス材料）
１つ以上のポリマー材料をマトリクス内での細胞内部増殖または細胞のマトリクス中への移動を可能にするのに十分なポリマー間間隙を有するポリマーマトリクスを形成する、イオン的、共有結合的、またはその組合わせによって架橋してマトリクスが形成される。
【００１４】
好ましい実施形態において、このマトリクスはタンパク質で形成され、最も好ましくは、マトリクスが移植されるべき患者において天然に存在するタンパク質で形成される。最も好ましいタンパク質はフィブリンであるが、他のタンパク質（例えば、コラーゲンおよびゼラチン）もまた使用され得る。多糖および糖タンパク質もまた使用され得る。いくつかの実施形態において、イオン結合または共有結合によって架橋され得る合成ポリマーを使用することもまた可能である。
【００１５】
このマトリクス材料は、好ましくは、天然に存在する酵素によって生分解可能である。分解の速度は、架橋の程度およびマトリクス中にプロテアーゼインヒビターを含むことによって操作され得る。
【００１６】
（Ｂ．分解可能な結合）
マトリクスを形成するタンパク質は、分解可能な結合を含むことを介して改変され得る。代表的に、これらは酵素切断部位（例えば、トロンビンによる切断のための部位）である。さらに、融合タンパク質またはペプチドキメラ（これはフィブリンゲルに架橋される）は、接着部位（すなわち、第ＸＩＩＩａ因子基質またはヘパリン結合ドメイン）と生理活性タンパク質（すなわち、増殖因子または酵素）との間に切断可能な部位を含むようにさらに改変され得る。これらの部位は、非特異的な加水分解（すなわち、エステル結合）によって切断され得るか、または特異的な酵素的分解（タンパク質分解性分解または多糖分解のいずれか）のための基質であり得るかのいずれかである。これらの分解可能な部位は、フィブリンゲルから生理活性因子のより特異的な放出の操作を可能にする。例えば、酵素活性に基づく分解は、ゲルを介したこの因子の拡散によるよりもむしろ、細胞プロセスによって制御されるべき生理活性因子の放出を可能にする。
【００１７】
この分解部位は、一次タンパク質配列に対してわずかな改変を伴うかまたは改変を伴わずに生理活性因子の放出を可能にし、これはこの因子のより高い活性を生じ得る。さらに、この分解部位は、は、因子の放出がいくつかの多孔性材料から拡散されるよりもむしろ、細胞特異的なプロセス（例えば、局在化したタンパク質分解）によって制御されることを可能にする。これは、材料中の細胞の位置に依存して因子が同じ材料中で異なる速度で放出されることを可能にする。細胞特異的タンパク質分解活性は、長期間にわたって生じる神経の再生などの適用にきわめて重要である。これはまた、必要な総増殖因子の量を減少させる。なぜなら、この増殖因子の放出は、細胞プロセスによって制御されるからである。増殖因子の保存およびその生理活性は、初期バースト放出における生理活性因子の有意な量の欠失を特徴的に生じる拡散制御放出デバイスの使用に対する、細胞特異的タンパク質分解活性の開発の明らかな利点である。
【００１８】
タンパク質分解性分解のために使用され得る酵素は、多数である。タンパク質分解的分解部位は、コラゲナーゼ、プラスチン、エラスターゼ、ストロメライシン、またはプラスミノーゲンアクチベーターのための基質を含み得る。例示的な基質を、以下に列挙する。Ｐ１〜Ｐ５は、タンパク質分解が生じる部位から、このタンパク質のアミノ末端に向かってアミノ酸の１〜５位を示す。Ｐ１’〜Ｐ４’は、タンパク質分解が生じる部位から、このタンパク質のカルボキシ末端に向かってアミノ酸の１〜４位を示す。
【００１９】
（表１：プロテアーゼのサンプル基質配列）
【００２０】
【表１】
（多糖基質）
酵素分解は、酵素（例えば、ヘパリナーゼ、ヘパリチナーゼ、およびコンドロイチン分解酵素ＡＢＣ）についての多糖基質を伴って生じ得る。これらのそれぞれの酵素は、多糖基質を有する。全てのヘパリン結合系におけるヘパリンの存在によって、ヘパリナーゼについての基質は、すでにこれらの系の中に構築されている。
【００２１】
（タンパク質分解基質）
タンパク質分解基質は、ペプチドキメラまたはヘパリンペプチドキメラのいずれかのペプチド合成の間に添加され得る。このヘパリン結合ペプチドキメラは、プロテアーゼ基質（例えば、上記のプラスミンについての基質のうちの１つ）を第ＸＩＩＩａ因子基質とヘパリン結合ドメインとの間に挿入することによってタンパク質分解性分解配列を含むように改変され得る。このヘパリン−ペプチドキメラは、プロテアーゼ基質（例えば、上記のプラスミンについての基質のうちの１つ）を第ＸＩＩＩａ因子基質とヘパリンドメインとの間に挿入することによってタンパク質分解性分解配列を含むように改変され得る。高いＫｍおよび低いＫｃａｔを有する基質を使用して、プロテアーゼの活性部位を占有しながらも切断をゆっくりにし得る。プラスミンについての基質以外の切断基質を使用して、マトリクス分解と独立した生理活性因子の放出を可能にし得る。
【００２２】
（オリゴエステル）
オリゴエステルドメインは、キメラの第ＸＩＩＩａ因子基質と、ヘパリン結合ドメインまたはヘパリンドメインのいずれかとの間に、ペプチド合成工程の間同様に挿入され得る。これは、乳酸のオリゴマーのようなオリゴエステルを使用して達成され得る。
【００２３】
非酵素的分解基質は、酸または塩基触媒機構によって加水分解を受ける任意の結合で構成され得る。これらの基質は、オリゴエステル（例えば、乳酸のオリゴマーまたはグリコール酸のオリゴマー）を含み得る。これらの材料の分解速度は、オリゴマーの選択を介して制御され得る。
【００２４】
（Ｃ．ヘパリン；ヘパリン結合ペプチド）
マトリクスは、ヘパリンおよび／またはヘパリン結合フラグメントを含むことを介して改変され得、これはヘパリンに結合するタンパク質に直接的または間接的に結合する。後者の場合、このペプチドはヘパリンに結合し得、次いでこれはヘパリン結合部位を含む因子に結合するために利用可能であるか、またはこのペプチドはそれ自体が特定のヘパリン結合増殖因子によって結合されるヘパリン部分を含み得る。これらは、以下においてより詳細に議論されるような標準的な技術を使用して、マトリクス材料に結合され得る。
【００２５】
好ましい実施形態において、ヘパリンは、ペプチドキメラおよびヘパリンそれ自体からなる２部の系（ｔｗｏ−ｐａｒｔ ｓｙｓｔｅｍ）を使用して、フィブリンゲルに非共有結合的に結合される。このペプチドキメラは、２つのドメイン（第ＸＩＩＩａ因子基質および多糖結合ドメイン）からなる。一旦、このペプチドキメラがフィブリンゲル中に架橋すると、このペプチドキメラは非共有結合的相互作用によってヘパリン（または他の多糖）に結合する。
【００２６】
多くのタンパク質が、ヘパリン結合親和性を有することが見出されている。これらのタンパク質およびそれらのヘパリン結合ドメインの配列のいくつかを、以下の表２に列挙する。これらはまた、ポリマーマトリクスによって送達され得る生理活性因子に関する節で議論される。
【００２７】
【表２】
（Ｄ．生理活性因子）
発育中の生物および成体の両方において形態発生に関与する多くの増殖因子は、細胞外マトリクス分子に結合する。この親和性は、形態形成物質の作用の局所モードを提供し、制御できない遠位の影響を妨げる。この影響の局所化に関与するこの主なマトリクス親和性相互作用は、へパリンとヘパリン−表面プロテオグリカンについてである。ヘパリンに結合する増殖因子としては、なかでも、トランスフォーミング増殖因子（「ＴＧＦ」）−βスーパーファミリー（骨形成タンパク質、「ＢＭＰ」を含む）、線維芽細胞増殖因子（「ＦＧＦ」）ファミリー、および血管上皮増殖因子（「ＶＥＧＦ」）が挙げられる。一般的に、ヘパリンを結合すると考えられる増殖因子は、生理的レベルより高いＮａＣｌ濃度（１４０ｍＭ以上）でヘパリン親和性カラムから溶出する。さらなる「ヘパリン結合」増殖因子としては、インターロイキン−８、ニューロトロフィン−６、ヘパリン結合上皮増殖因子、肝細胞増殖因子、結合組織増殖因子、ミッドカイン、およびヘパリン結合増殖関連分子が挙げられる。これらの増殖因子は、組織修復を調節することが示されている。
【００２８】
ヘパリン結合ドメインは、増殖因子の多くの異なるファミリーに天然に存在する。ヘパリンを結合する１つ以上のメンバーを有するこれらのファミリーの１つは、線維芽細胞増殖因子である（Ｐｒｅｓｔａ，Ｍ．ら、（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．１８５：１０９８〜１１０７）。ヘパリンを結合するさらなる増殖因子としては、トランスフォーミング増殖因子、骨形成因子、インターロイキン−８、ニューロトロフィン−６、血管内皮細胞増殖因子、ヘパリン結合上皮増殖因子、肝細胞増殖因子、結合組織増殖因子、ミッドカイン、およびヘパリン結合増殖関連分子が挙げられる（Ｇｏｅｔｚ，Ｒ．ら、（１９９４）．Ｎａｔｕｒｅ．３７２：２６６−２６９；Ｋａｎｅｄａ，Ｎ．ら、（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１９：１１５０〜１１５６；Ｋｉｇｕｃｈｉ，Ｋ．ら、（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｓｉｓ．２２：７３〜８３；Ｋｉｎｏｓａｋｉ，Ｍ．ら、（１９９８）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１３８４：９３〜１０２；ＭｃＣａｆｆｒｅｙ，Ｔ．ら、（１９９２）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１５２：４３０〜４４０；Ｎｏｌｏ，Ｒ．ら、（１９９６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．８：１６５８〜１６６５；Ｓｐｉｌｌｍａｎｎ，Ｄ．，ら、（１９９８）．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２７３：１５４８７−１５４９３；Ｓｔｅｆｆｅｎ，Ｃ．ら、（１９９８）Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ． １５：１９９〜２１３．Ｔｅｓｓｌｅｒ，Ｓ．ら、（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１２４５６〜１２４６１）。これらの因子は、血管系、皮膚、神経および肝臓を含む多くの異なる型の組織における治癒を促進する可能性を示している。従って、これらの物質は、使用されて、適切な増殖因子を選択することによって身体の多くの異なる部分において創傷治癒を促進し得る。
【００２９】
（ＩＩ．生理活性因子の取り込みおよび／または放出方法）
マトリクス中の増殖因子または他の生理活性タンパク質の取り込みに対する好ましい実施形態において、このマトリクスは、フィブリンおよび外因性分子から形成され、凝固の間にフィブリン中に取り込まれる基質を含む。外因性ペプチドは、２つのドメイン（そのうちの１つは、ＸＩＩＩａなどの架橋酵素に対する基質であるドメイン）を含むように設計され得る。第ＸＩＩＩａ因子は、凝固の間は活性なトランスグルタミナーゼである。この酵素（通常トロンビンによる切断によって第ＸＩＩＩ因子から形成される）は、グルタミン側鎖およびリジン側鎖の間に形成されるアミド結合を介してフィブリン鎖を互いに接着するように機能する。この酵素はまた、凝固の間に他のタンパク質をフィブリンに接着するように機能する（例えば、タンパク質α２プラスミンインヒビター）。このタンパク質のＮ末端ドメイン（特に、配列ＮＱＥＱＶＳＰ（配列番号２０））は、第ＸＩＩＩａ因子に対して有効な基質として機能するように示されている。次いで、このペプチドの第二のドメインは、生理活性因子（例えばペプチド、またはタンパク質、または多糖）であるように選択され得る（Ｓａｋｉｙａｍａ−Ｅｌｂｅｒｔら、（２０００）Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ６５：３８９−４０２および本明細書中）。このように、外因性生理活性因子は、凝固の間にフィブリン中に第ＸＩＩＩａ因子基質を介して組み込まれ得る。
【００３０】
（Ａ．タンパク質の放出におけるヘパリン親和性の使用）
治癒およびフィブリンへの再生において目的の多くの生理活性タンパク質を取り込む単純な方法は、本明細書に記載の方法の１つによってヘパリンをフィブリンゲルへ接着し、そしてヘパリンを使用してヘパリン結合タンパク質（例えば、ヘパリン結合増殖因子）を分離することである。これは、２つの方法のうち１つ（直接的にヘパリン結合ペプチドをフィブリンゲルへ架橋してヘパリンをこのペプチドに非共有結合的に結合する（ヘパリン結合ドメインおよび第ＸＩＩＩａ因子基質を含む二機能性ペプチドを使用する）ことによってか、またはヘパリン−ペプチドキメラを直接的にカップリングする（このヘパリンは第ＸＩＩＩａ因子基質を含むペプチドに化学的に接着される）ことによってのいずれか）で達成され得る。取り込みの方法によらず、取りこまれたヘパリンは、次いで、フィブリンゲルにおいてタンパク質（例えば、ヘパリン結合親和性を有する増殖因子）を、タンパク質が自然に細胞外マトリクスに分離される方法に類似の様式で分離し得る。ヘパリンはまた、タンパク質分解性分解からこれらの因子を保護し、そしてこれらの因子がマトリクスから放出されるまでその活性を延長し得る。
【００３１】
（ヘパリン結合ペプチドの取り込みを介するヘパリンの取り込み）
共有結合的または非共有結合的なフィブリンゲルへのヘパリンの接着は、これらの材料に新規な機能を追加する。ヘパリンの接着は、フィブリンマトリクスがヘパリン結合タンパク質（増殖因子を含む）をタンパク質を傷つけない様式で結合することを可能にし、そしてゲルからのタンパク質の遊離拡散を防ぐ。このことは、２つの機能のうちの１つ（ゲルの分解またはタンパク質のいくつかの他の高親和性タンパク質（例えば、細胞表面レセプター）への結合のいずれか）によってヘパリン結合タンパク質の徐放を可能にする。
【００３２】
ヘパリンは、ペプチドキメラおよびヘパリン自体からなる２部分系を使用して非共有結合的にフィブリンへ接着され得る。このペプチドキメラは、２つのドメイン（第ＸＩＩＩａ因子基質および多糖結合ドメイン）からなる。一旦、このペプチドキメラがフィブリンゲルに架橋されると、非共有結合相互作用によってヘパリン（または他の多糖）を接着する。
【００３３】
自発的にヘパリンを結合しない増殖因子を分離するために、フィブリンに接着し得る機能性の付加を介してこのタンパク質を改変することが必要である。このことは、いくつかの方法で達成し得る。例として、これは、第ＸＩＩＩａ因子基質の付加を介してまたはヘパリン結合ドメインを得られた融合タンパク質に付加することによって達成され得る。
【００３４】
合成された第ＸＩＩＩａ因子基質の付加は、ネイティブな増殖因子配列および融合タンパク質のアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかで第ＸＩＩＩａ因子基質を含む融合タンパク質を発現することによって達成され得る。この改変は、ＤＮＡレベルでなされる。タンパク質全体は、固相化学合成によって合成するという点で困難性を示す。増殖因子をコードするこのＤＮＡ配列は、細菌性発現のために最適なコドン使用を適合される。次いで、このＤＮＡ配列は、細菌性ＤＮＡに頻繁に生じるコドンを使用して所望の第ＸＩＩＩａ因子基質について決定される。
【００３５】
一連の遺伝子フラグメントは、ＤＮＡ合成の前に設計される。ほとんどのＤＮＡ合成のエラー頻度（約５０ｂｐ毎のエラーを含む）に起因して、遺伝子は、約１００ｂｐ長になるように構築される。これは、適切なＤＮＡ配列を含むコロニーを見出すためにスクリーニングされなければならないコロニーの数を減少する。１つの遺伝子が終了し、そして次に始まる位置は、この遺伝子中の天然に存在する独特の制限酵素切断部位に基づいて選択され、可変長のフラグメント（またはオリゴヌクレオチド）を生じる。このプロセスは、所定のＤＮＡ配列中の制限酵素部位の位置および頻度を同定するソフトウェアの使用によっておおいに援助される。
【００３６】
一旦、遺伝子フラグメントが首尾良く設計されると、共通の制限酵素部位は、各フラグメントの末端に含まれて、各フラグメントのクローニングプラスミドへのライゲーションを可能にする。例えば、各遺伝子フラグメントへのＥｃｏＲＩ部位およびＨｉｎｄＩＩＩ部位の付加により、ｐＵＣ１９のポリリンカークローニング領域への挿入が可能になる。次いで、各遺伝子フラグメントの３’１本鎖および５’１本鎖は、クローニングベクターへの挿入のために適切な粘着末端を用いる標準的な固相合成を使用して合成される。次いで、切断および脱塩に続いて、１本鎖フラグメントは、ＰＡＧＥによって精製され、そしてアニーリングされる。リン酸化の後、アニーリングされたフラグメントは、クローニングベクター（例えば、ｐＵＣ１９）へライゲーションされる。
【００３７】
ライゲーション後、このプラスミドを、ＤＨ５−Ｆ’コンピテントセルへ形質転換し、そしてイソプロピル−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）／５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）プレート上にプレートして、遺伝子フラグメントの挿入についてスクリーニングする。次いで、遺伝子フラグメントを含む得られたコロニーを、適切な長さの挿入についてスクリーニングする。これは、アルカリ溶解ミニプレッププロトコールによって形質転換された細胞のコロニーからプラスミドを精製すること、および遺伝子フラグメントのいずれかの末端に存在する制限酵素部位でこのプラスミドを消化することによって達成される。アガロースゲル電気泳動による適切な長さのフラグメントの決定の際に、このプラスミドを、配列決定する。
【００３８】
適切な配列を有する遺伝子フラグメントを含むプラスミドを同定する場合、次いでこのフラグメントを切断し、そして使用して、全遺伝子を構築する。各時点で、１つのプラスミドを、挿入点で酵素を用いて切断し、そしてプラスミドの脱リン酸化後にアガロースゲルから精製する。その間に、挿入されるべきフラグメントを含む第２のプラスミドをまた、切断して、そして挿入されるべきフラグメントを、アガロースゲルから精製する。次いで、この挿入ＤＮＡを、脱リン酸化プラスミドへライゲーションする。このプロセスは、全遺伝子が構築されるまで続く。次いで、この遺伝子を、発現ベクター（例えば、ｐＥＴ１４ｂ）へ移動し、そして発現のための細菌へ形質転換する。この最終ライゲーション後、全遺伝子を、配列決定されて、正しいことを確認する。
【００３９】
融合タンパク質の発現は、細菌がｍｉｄ−ｌｏｇ期増殖に達するまで細菌を増殖し、次いで、融合タンパク質の発現を誘導することで達成される。発現は、約３時間続き、次いで細胞を収穫する。細菌細胞ペレットを得た後、この細胞を、溶解する。この細胞膜および細胞屑を、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００を用いて細胞溶解ペレットを洗浄することで除去し、封入体を相対的に純粋な形式にする。この融合タンパク質を、高い尿素濃縮物を使用して可溶化し、そしてヒスチジン親和性クロマトグラフィーによって精製する。次いで、生じたタンパク質を、尿素の量をゆっくりと減少するように透析することで徐々に復元し、そして凍結乾燥する。
【００４０】
（ヘパリン−ペプチドキメラの取り込みを介するヘパリンの取り込み）
多糖片（ヘパリン−第ＸＩＩＩａ因子基質ペプチドキメラ）は、凝固の間にフィブリンに取り込まれて、固定化されたヘパリン部位を提供して、増殖因子を結合してその放出を遅くし得る。ヘパリン（または他の多糖（例えば、ヘパリン硫酸またはコンドロイチン硫酸））は、ヘパリン−ペプチドキメラを構築することで第ＸＩＩＩａ因子を使用して直接フィブリンに接着され得る。このキメラは、２つのドメイン（第ＸＩＩＩａ因子基質からなるペプチドドメインおよび多糖ドメイン（例えば、ヘパリン））を含む。これらのキメラは、改変されたヘパリン（または別の多糖）（例えば、ペプチドカップリングがヘパリン分子上で生じる部位を制御するように独特な反応基を１つの末端で含む）を使用して作製される。ペプチド上の独特な官能基（例えば、カップリングが所望されるペプチドの末端のみに存在する側鎖）の使用を介して、ペプチド上のカップリングの位置は、さらに制御され得る。ヘパリンの鎖（末端とは反対）に沿った第ＸＩＩＩａ因子基質ペプチドを取り込むこと、および１つのヘパリン鎖あたり１つより多いこのようなペプチドを取り込むことでさえ、可能でもあるが、好ましいアプローチは、単一の第ＸＩＩＩａ因子基質ペプチドをヘパリンの１つの末端で取り込むことである。次いで、これらのキメラは、第ＸＩＩＩａ因子の酵素的活性によって、凝固の間にフィブリンゲルに共有結合的に架橋され、ヘパリンのフィブリンゲルへの直接接着を可能にし得る。
【００４１】
（タンパク質の放出速度を決定する際のヘパリンの濃度の役割）
増殖因子：ヘパリン−ペプチドキメラの最適比、または増殖因子：ヘパリン：ヘパリン結合ペプチドの最適比ならびにヘパリン−ペプチドキメラまたはフィブリンへ取り込まれたヘパリン結合ペプチドの最適密度の決定は、重要である。ヘパリンに対する相対的に強い親和性にもかかわらず、ヘパリン結合増殖因子は、短い時間の尺度でマトリクスから解離する。従って、過剰な結合部位は、増殖因子が再びマトリクスに結合する前に拡散しないことを確実にする。この平衡はまた、解離部位に近く隣接する細胞表面レセプターへの遊離増殖因子の結合を可能にする。徐放のこの方法は、増殖因子の比較的長期な結合および増殖因子の局所細胞への速やかな放出の両方を提供する。本明細書中で記載されるように、高い比（従って放出の低い速度）が、最も所望される生物学的応答を提供する場合は、いつもではない。特に、いくつかの増殖因子の場合、放出のより速やかな速度が所望される場合があり得る。
【００４２】
どのような増殖因子に対する結合部位の比が、非常に緩やかな増殖因子放出によって決定される場合、細胞増殖用途に最適であるかを数学的に予測することが試みられている。マトリクスからの増殖因子の受動放出の速度は、ヘパリン結合性長因子に対するペプチドおよびヘパリンの比を介して調節され得、ヘパリン結合増殖因子と比較してより過剰なヘパリンおよびヘパリン結合ペプチドは、より緩やかな受動放出を導くことが示された。しかし、このような方法を使用して、最適の放出特性を予測することが常に可能なわけではない。例えば、この例は、ＢＭＰ−２が有利により速やかに物質（等モルにより近いＢＭＰ−２に対するヘパリンおよびヘパリン結合ペプチドの比を有する）から放出され得ることを示す。いくつかの場合において、より良い結果は、より低いヘパリン対増殖因子比で得られる。
【００４３】
活性形態においてヘパリン含有送達システムが増殖因子を送達する能力は、骨形成の異所性モデルにおいて試験され、ここで送達システムおよびＢＭＰ−２を含有するフィブリンマトリクスは、ラットにおいて皮下に移植された。このモデルにおいて、骨形成のために好ましい条件は、１：１の低いヘパリン対増殖因子比であった。より高い比（例えば、５：１またはそれより大きい）の付加は、骨形成に対して阻害性であった。これらの結果は、以前に公開されていた研究に基づいては予期されず、かつ低いヘパリン対増殖因子比はＢＭＰ−２の送達において予期されない用途を有することが示唆される（実施例５を参照のこと）。
【００４４】
外因性第ＸＩＩＩ因子のフィブリノーゲン調製物への添加を、使用して、フィブリンマトリクスと共に取り込まれたヘパリン結合ペプチドの数を増加し得、ヘパリン結合ペプチドがヘパリンに対する固定化部位および細胞接着部位の両方を利用することが可能になる。ペプチド濃度におけるこの増加は、このような物質が軸索伸長、および細胞移動の他の形式を、細胞接着部位としてのヘパリン結合ドメインの使用を介して促進する能力を高め得た。ヘパリン結合ペプチドが接着ペプチドとして作用し、従ってフィブリン中の細胞移動の速度を高め得ることが示されている（Ｓａｋｉｙａｍａ，Ｓ．Ｅ．ら、（１９９９）ＦＡＳＥＢ Ｊ．１３：２２１４−２２２４）。しかし、この応答は、クロット中の１モルのフィブリノーゲンあたり約８モルの取り込まれたペプチドを必要とした。従って、ヘパリン結合増殖因子の持続放出において親和性部位として使用するヘパリンに結合するためのこれらのヘパリン結合ペプチドの多数の使用は、ヘパリン結合ペプチドの有益な接着効果を取り除き得る。この制限は、より高いレベルの外因性ヘパリン結合ペプチドの取り込みによって克服され得る。この取り込みは、フィブリノーゲン調製物へのより高いレベルの第ＸＩＩＩａ因子の添加を介して達成され得、従って、ペプチドが同時に両方の効果を有することを可能にする。従って、１モルフィブリノーゲンあたり８モルのペプチドより大きい比（すなわち、１モルフィブリノーゲンあたり２５モルのペプチド）でのさらなるペプチドの取り込みは、薬剤送達のためにヘパリン結合ペプチドが細胞接着部位およびヘパリン固定化部位として両方を利用することを可能にするのに有用であり得た。例えば、５％のヘパリン結合部位を、使用して、薬物送達のためにヘパリンを固定化し得、そして他の９５％は、細胞接着ドメインとして利用するために占有されず、かつ遊離のままであり、従ってヘパリン結合ペプチドが、同じ物質中で細胞接着ドメインおよび増殖因子固定化部位の両方として使用されることを可能にする。ヘパリン結合ペプチドのこの二重使用は、外因性第ＸＩＩＩａ因子から利益を得る。これは、相対的に高い数のヘパリン結合部位は、フィブリン物質中における細胞接着および細胞移動を高めるためにフィブリンへ取り込まれなければならない（１モルのフィブリノーゲンあたり８モルのペプチド）ことが示されているからである。
【００４５】
（ヘパリン親和性部位の組み込みのための二ドメイン（ｂｉ−ｄｏｍａｉｎ）ペプチドの使用）
ペプチド−ペプチドキメラ（１方のドメイン上に第ＸＩＩＩａ基質を有し、他方のドメイン上にヘパリン結合ペプチドを有する）の多くの可能性のある組み合わせが存在する。これらの異なる組み合わせは、異なる利点および不利な点を有する。例えば、いくつかの第ＸＩＩＩａ基質は、他よりもさらに効率的に取り込まれる。さらに、異なるヘパリン結合ペプチドは、ヘパリンに対して異なる親和性を有する。このペプチドの可能性のある免疫原性が、１つのさらなる検討事項である。ヒトタンパク質の配列に基づいてペプチド配列を利用することが可能であるけれども、これらの２つのヒト配列の間の融合は、新しく、そして決して患者の免疫系によってはみられない。従って、このような融合が免疫原性であり、そしてどれか一方のタンパク質に対して、または融合部位自体に対して抗体を誘導する危険性がある程度存在する。一般に、ペプチド配列が短いほど、長いポリペプチド配列よりも抗原性応答を誘導する傾向が小さくなる。従って、α２プラスミンインヒビター第ＸＩＩＩａ因子基質およびアンチトロンビンＩＩＩヘパリン結合ドメインを有するキメラは、例えば、血小板第４因子由来のヘパリン結合ドメインと対応する二ドメインペプチドよりも抗原性応答を誘導する可能性が幾分か大きいようである。
【００４６】
フィブリンネットワーク内にヘパリンを固定するために用いた二ドメインキメラが免疫原性である可能性を低下させるさらなるアプローチは、１つのドメインにおいては、第ＸＩＩＩａ基質（例えば、タンパク質α２プラスミンインヒビターから）、および他方のドメインとしてヘパリン鎖を用いて、２つの間の共有結合により、直接、ペプチド−ヘパリンキメラを形成することである。この様式では、天然ではないペプチド配列が融合部位に存在し、そのため免疫学的相互作用の可能性は非常に低い。
【００４７】
（タンパク質の放出における融合タンパク質の使用）
当業者は、ヘパリンに対する親和性によるタンパク質の放出における融合タンパク質の使用をさらに考慮し得る。ここでは、ヘパリンに結合しない生理活性タンパク質の融合物がヘパリン結合ドメインを用いて構築されて、ヘパリンに結合する融合タンパク質を生じ得る。さらに、ヘパリンに対する親和性を介したフィブリン内の生理活性タンパク質の組み込みに対する代替として、このタンパク質は、第ＸＩＩＩａ因子を用いて直接組み込まれ得る。それらが第ＸＩＩＩａ因子について基質ドメインを保有する場合、天然にまたは組み換えタンパク質内への組み込みのいずれかによって、生物学的に活性なタンパク質および第ＸＩＩＩａ基質ドメインを有する融合タンパク質を形成することが可能である。
【００４８】
上記の融合タンパク質のいずれかの合成は、分子生物学的技術を利用することによって達成され得る。これを行うために、このタンパク質鎖内のアミノ末端もしくはカルボキシ末端、または可能性としては他のいずれかに融合した配列を架橋もしくは結合することで、目的のタンパク質配列全体を含む融合タンパク質が作製され得る。これはＤＮＡレベルで行われる。なぜなら、第ＸＩＩＩａ因子架橋基質またはヘパリン結合ドメインのいずれかをコードする配列は、例えば、もとのタンパク質のコドンの初めまたは終わりに挿入され得るからである。これらの改変されたタンパク質が発現される場合は、主なタンパク質ドメインのアミノ末端もしくはカルボキシ末端、または他のいずれかに目的のさらなるドメインを含む。タンパク質合成のために設計された自然の機構を使用することにより、高い忠実度を有する大きいタンパク質を合成および精製することが可能になる。
【００４９】
標準的な分子生物学的技術を用いて、タンパク質配列またはＤＮＡ配列が既知である任意の増殖因子の融合タンパク質を作製し得、ヘパリン結合ドメインまたは酵素基質のような新規のドメインの付加が可能になる。これらの融合タンパク質は、このタンパク質のＮ末端またはＣ末端のいずれかに対して、または例えば、このタンパク質鎖内に新規なドメインを付加するように構築され得る。この改変は、増殖因子をコードするＤＮＡ配列、および架橋または結合の配列（例えば、ヘパリン結合ドメイン）をコードするＤＮＡ配列の両方を含む遺伝子を構築することによってＤＮＡレベルで作製される。次いで、このＤＮＡを発現プラスミドに連結し、そして細菌に形質転換する。発現の誘導の際、細菌は大量の融合タンパク質を生成する。発現後、このタンパク質は細胞溶解物から精製され、そして再折り畳み（リフォールディング）されなければならない。精製はしばしば、高レベルで発現された哺乳動物タンパク質が細菌内で封入体を形成する傾向によって単純になる。
【００５０】
（組み込みのための融合タンパク質の設計）
組み換え融合タンパク質は、いくつかの異なるスキームを用いてフィブリンゲル中に組み込まれ得る。最初の設計において、第ＸＩＩＩａ基質は、このタンパク質に直接組み込まれた。この改変されたタンパク質が、フィブリンの重合化の間に存在する場合、このタンパク質は、二ドメインペプチドと同様の様式でフィブリンマトリクスに直接組み込まれる。別の方法は、ヘパリン結合ドメインを組み込むために合成された融合タンパク質を含む。この実施例において、二結合ペプチド、ヘパリン、およびヘパリン結合融合タンパク質が、フィブリン重合化混合物に含まれる。重合化の間、二ドメインペプチドは、フィブリンゲルに架橋される。この二ドメインペプチドは、ヘパリン結合配列に加えて、第ＸＩＩＩａ因子基質配列を含む。このヘパリンは、フィブリンゲルに組み込まれた二ドメインペプチドに結合し、そしてフィブリンマトリクスにトラップされる。このトラップされた（ｅｎｔｒａｐｐｅｄ）ヘパリンは、操作されたヘパリン結合ドメインに対する結合によってフィブリン内のヘパリン結合融合タンパク質を隔離するように働く。この組み込みは、架橋されたペプチドが細胞に制御されたタンパク質分解を通じてゲルから除去されるまで、この増殖因子を隔離するのに十分安定であることが示されている。
【００５１】
この技術は、第ＸＩＩＩａ基質配列と目的のタンパク質との間に酵素分解部位を組み込むことによってさらに改変され得る。この酵素分解部位のＫｍおよびｋｃａｔの注意深い選択により、分解がタンパク質マトリクスの前もしくは後のいずれかで生じるように、そして／または類似のもしくは類似していない酵素を利用することにより、マトリクスを、各タイプのタンパク質および適用について仕立てられている分解部位の位置で分解するように制御され得る。この新しいタンパク質は、上記のようなフィブリンマトリクスに直接架橋され得る。しかし、酵素分解部位を組み込むことは、タンパク質分解の間、タンパク質の遊離を変更する。細胞由来プロテアーゼが、隔離されたタンパク質に到達する場合、このプロテアーゼは、新しく形成された分解部位でこの操作されたタンパク質を切断する。得られた分解産物は、遊離したタンパク質を含む。この遊離したタンパク質は、いまやどのような操作された融合配列も、どのような分解フィブリンもほぼ含まない。従って、この遊離タンパク質は、ネイティブの増殖因子の一次配列にほぼ同一であり、そして潜在的にさらに生理活性である。類似の方法がヘパリン結合融合タンパク質で用いられ得る。次いでこれらの新しいタンパク質は、プロテアーゼ分解部位、および新しいヘパリン結合ドメインを含む。このヘパリン結合融合タンパク質は、ヘパリン結合ペプチドの共有結合（固定）を介したフィブリンへのヘパリンの組み込みによってこのマトリクス中に隔離される。ここでも、付加された新しいプロテアーゼ分解部位を考慮すれば、この放出されたタンパク質は、天然のタンパク質に対する一次配列と同一である。
【００５２】
（ＩＩＩ．使用方法）
本明細書に記載されたポリマーは、移植の前にまたは移植時に、架橋されて、組織の修復、再生、もしくは再構築、および／または生理活性因子の放出のためのマトリクスを形成し得る。ある場合には、移植部位で組織に対してマトリクスを一致させるために投与の部位で架橋を誘導することができる。他の場合には、移植の前にマトリクスを調製することが都合がよく、このマトリクスがヘパリンまたはヘパリン結合ペプチド（増殖因子のような他の生理活性分子に結合するために用いられる）を取り込む場合には、これらの因子は、移植の前にまたは移植の時点でこのマトリクスに添加され得る。もともと充填された因子が放出された場合には、これらの生理活性因子を有するマトリクスを、同様に「再充填（ｒｅ−ｆｉｌｌ）する」ことも、ある場合には都合よい。
【００５３】
架橋は、内因性の架橋剤の添加によって、またはポリマーが第ＸＩＩＩａ因子基質を含む場合には、手術手順の間、または移植の部位に局所的にトロンビンを付与することにより、達成され得る。
【００５４】
細胞はまた、移植の前にもしくは移植の時点で、または移植の後でさえ、ポリマーの架橋の時点もしくはその後のいずれかで添加されて、マトリクスを形成し得る。これは、細胞増殖または内殖を促進するように設計された間質性空間を生成するようにマトリクスを架橋することに対する追加であり得るか、またはその代わりであり得る。
【００５５】
ほとんどの場合、細胞成長または増殖を促進するようにマトリクスを移植することが所望され得るが、いくつかの場合には、細胞増殖の速度を阻害するために生理活性因子が用いられる。特定の適用は、手術後の接着の形成を阻害することである。
【００５６】
以下の例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。組成物および方法は、好ましい実施形態に関して記載されているが、本発明の、概念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の組成物、方法およびこの方法の工程のまたはこの工程の順序に対して、バリエーションが適用され得ることが当業者には明白である。
【００５７】
（実施例１：増殖因子に結合するヘパリン結合ペプチドを介したヘパリンの間接的カップリング）
標準的な固相合成によって、第ＸＩＩＩａ因子基質およびヘパリン結合ドメインの両方を含むペプチドキメラを合成した。サンプルペプチドは、以下の配列：ｄＬＮＱＥＱＶＳＰＫ（Ａ）ＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲＫＡ（配列番号２１）を含むペプチドであり、ここでこのペプチドのＮ末端は、第ＸＩＩＩａ因子基質を含み、そしてイタリック体の配列（ここで、後半に表記した（Ａ）ＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲＫＡはイタリック体である）は、ＡＴＩＩＩのヘパリン結合ドメイン由来の改変ペプチドを含む（ｄＬは、ダンシルロイシンを示し、これを用いて、蛍光によるこのペプチドの検出が可能になる）。
【００５８】
サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、以前に開発された組み込み方法を用いた、フィブリンゲルに架橋したペプチドの量を決定した。アンチトロンビンＩＩＩ由来のヘパリン結合ドメインおよび蛍光標識を含む二ドメインペプチドを、重合化の間、フィブリンゲルに組み込んだ。遊離のペプチドをゲルから洗浄し、そしてフィブリンネットワークをプラスミンで分解した。分解産物を高速液体クロマトグラフィー（サイズ排除クロマトグラフィー）によって分析して、１モルあたりのフィブリノーゲン（ＵＶ吸収）に存在するペプチドの量を（蛍光によって）決定した。ペプチド改変ゲルからの蛍光シグナルは、遊離のペプチドだけからのシグナルよりも早期の溶出時間で出現し、このことは改変ゲル中に存在した全てのペプチドがフィブリンに架橋されたことを示した（図１）。プラスミンで分解したペプチドネットワークおよびフィブリンネットワークの両方について既知の濃度標準に基づいた定量によって、１モルあたりのフィブリノーゲンに８．７±０．２モルのペプチドが組み込まれたことが示された（ｎ＝１０）。
【００５９】
共有結合した二ドメインペプチド（その１ドメインは、第ＸＩＩＩａ因子基質であり、そしてその１ドメインは、アンチトロンビンＩＩＩに基づくヘパリン結合ドメインである）をまた含むフィブリン細胞内殖マトリクス由来のヘパリン結合増殖因子の放出のためのこのアプローチを評価するために、後根神経節を以下に示すような、種々の条件下で、フィブリンゲル内で３次元的に培養した。
【００６０】
（ヘパリン結合ペプチドの使用のための架橋プロトコール）
１）４ＬのＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水（３３ｍＭ Ｔｒｉｓ）（ｐＨ７．４）に対して２４時間フィブリノーゲン（８ｍｇ／ｍｌ）を透析する
２）０．２μｍシリンジフィルターを用いてフィブリノーゲンを濾過滅菌する
３）以下のペプチド溶液を作製する：
【００６１】
【表３】
４）トロンビン溶液を作製する：５ｍｌ ＴＢＳに１００単位含有
５）各ペプチド溶液に１．４ｍｌのフィブリノーゲンを添加する
６）ゲルを作製する：２０μｌのＴＢＳ＋５０ｍＭ ＣａＣｌ２、４０μｌのトロンビン溶液（２０単位／ｍｌ）、および３４０μｌのペプチド溶液＋フィブリノーゲンを添加する（上記の溶液を６ゲル作製する）
７）３７℃で１時間インキュベートする
８）２４時間で５回洗浄する。最初の４回は１ｍｌのＴＢＳを用い、最後の１回はニューロン培地を用いる
９）８日目にニワトリ胚後根神経節を解剖する
１０）各ゲルに１つの神経節を置いて、３７℃で１時間置く
１１）各ゲルに１ｍｌの神経培地を添加する
１２）２４時間後培地を交換する。
【００６２】
後根神経節を用いたこれらの研究の結果を図２に示す。ペプチドおよびヘパリンなしで添加した場合、ｂＦＧＦは、神経突起成長を増強せず、このことは、用いた洗浄プロトコールが十分であることを示す。神経突起増強は、用量依存性の様式で結合したｂＦＧＦの１μｇ／ｍｌおよび５μｇ／ｍｌの両方の添加によって増大する。１．０μｇ／ｍｌの結合したＶＥＧＦの添加によって、神経突起伸長は増大せず、このことはｂＦＧＦの効果が、新脈管形成を促進する能力には因らないことを示唆した。
【００６３】
（実施例２：ヘパリン−ペプチドキメラの合成）
還元的アミノ化を介して、Ｎ末端上に第ＸＩＩＩａ因子基質を、およびＣ末端にポリリジンを含むペプチドを、一方の末端に特有のアルデヒド基を有するヘパリンオリゴサッカライドにカップリングすることによって、ヘパリン−ペプチドキメラを合成する。以下の配列ｄＬＮＱＥＱＶＳＰＬＫＫＫＧ（配列番号２２）を有するペプチドを、標準的な固相ペプチド化学で合成する。ヘパリンオリゴサッカライドを、ヘパリンの標準的亜硝酸分解によって作製し、切断されたオリゴサッカライドの還元末端上にアルデヒドの形成を生じる。カップリングの間、リジン側鎖のアミノ基は、ヘパリンオリゴサッカライドの還元末端上のアルデヒドを攻撃して、シッフ塩基を形成する。次いでこのシッフ塩基を還元して安定な生成物を形成する。サンプルカップリングプロトコールは以下に示す。当業者はまた、ヘパリンをさらに単純なα２プラスミンインヒビター基質部位ＮＱＥＱＶＳＰ（配列番号２０）にカップリングし得る。第一級アミンは、ペプチドのＮ末端にのみ存在する。ペプチドが、従来どおり固相樹脂上に合成されるとき、Ｎ末端はダングリングに曝露され、そしてＮ末端上のαアミンが脱保護され、第一級アミンが反応に利用可能である。ヘパリンの反応型は、Ｇｒａｉｎｇｅｒ，Ｄら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔ．Ｒｅｓ．２２：２３１〜２４９に記載のように、特定の酸での切断によって容易に形成され、末端アルデヒド基とヘパリンフラグメントを形成し得る。この反応性アルデヒドは、樹脂（その上に縮合された）に結合されたままのペプチドを通過し、シッフ塩基（水素化ホウ素シアンナトリウムで容易に還元されてさらに安定な型である二級アミンを形成し得る）に結合されるペプチド−ヘパリンキメラを形成し得る。
【００６４】
他のアプローチが使用され得る。例えば、アルデヒドヘパリンは、上記されたのと同様に、過剰のエチレンジアミンとの反応およびシッフ塩基の還元によって第一級アミノヘパリンに変換され得る。遊離残基エチレンジアミンからの精製は、透析によって達成され得る。このアミンヘパリンは、まだ保護されているＥ残基上のカルボキシル基を有する固相樹脂からペプチドを切断することによって、続いてペプチド合成からの標準的試薬を用いたＣ末端上のカルボキシル基の活性化によって、続いてこのＥ残基上のカルボキシル基の脱保護によって、このＣ末端カルボキシル基上に縮合され得る。
【００６５】
（カップリングプロトコール：）
１）５０ｍＭのホウ酸緩衝液（ｐＨ９）中に、１．８ｍＭのペプチドおよび１．８ｍＭの亜硝酸分解ヘパリンを溶解する。３０分間反応させる
２）１６０ｍＭ ＮａＣＮＢＨ３を添加し、１２時間反応させる
３）２４０ｍＭ ＮａＣＮＢＨ３を添加し、１２時間反応させる
４）希塩酸でｐＨ７に調整する
５）最終濃度１ＭにＮａＣｌを添加する
６）４Ｌの脱イオン水に対して２４時間透析する
７）凍結乾燥して反応生成物を得る
８）サイズ排除クロマトグラフィーによって反応収率を分析する
９）陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて、所望の生成物の精製を達成する
（ヘパリン−ペプチドキメラの使用のための架橋プロトコール：を使用する）
１）４ＬのＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水（３３ｍＭ Ｔｒｉｓ）（ｐＨ７．４）に対して２４時間フィブリノーゲン（８ｍｇ／ｍｌ）を透析する
２）０．２μｍシリンジフィルターを用いてフィブリノーゲンを濾過滅菌する
３）以下のキメラ溶液を作製する：
【００６６】
【表４】
４）トロンビン溶液を作製する：５ｍｌ ＴＢＳに１００単位含有
５）各キメラ溶液に１．４ｍｌのフィブリノーゲンを添加する
６）ゲルを作製する：２０μｌのＴＢＳ＋５０ｍＭ ＣａＣｌ２、４０μｌのトロンビン溶液（２０単位／ｍｌ）、および３４０μｌのキメラ溶液＋フィブリノーゲンを添加する（上記の溶液を６ゲル作製する）
７）３７℃で１時間インキュベートする
８）２４時間で５回洗浄する。最初の４回は１ｍｌのＴＢＳを用い、最後の１回はニューロン培地を用いる
９）８日目にニワトリ胚後根神経節を解剖する
１０）各ゲルに１つの神経節を置いて、３７℃で１時間置く
１１）各ゲルに１ｍｌの神経培地を添加する
１２）２４時間後培地を交換する。
【００６７】
（実施例３：融合タンパク質およびペプチドキメラにおける分解部位）
（第ＸＩＩＩａ因子基質を含む−ＮＧＦ融合タンパク質およびプラスミン分解部位）
−ＮＧＦ融合タンパク質を、−ＮＧＦ融合タンパク質がフィブリンマトリクスに酵素的に架橋することを可能にする内因性架橋基質を用いて発現し、これは薬物送達系のベース材料として役立つ。プラスミン基質は、この架橋基質と融合タンパク質の−ＮＧＦドメインとの間に位置し、これは分解リンカーとして働き、そして酵素切断によって−ＮＧＦがそのネイティブの配列とほとんど同一の形態でこのマトリクスから放出されることを可能にする。このＮＧＦ融合タンパク質を、第ＸＩＩＩａ因子のトランスグルタミナーゼ活性によってフィブリンに共有結合し、そしてこれを細胞関連酵素活性に応答して活性な増殖因子を放出するこの送達系の能力を決定するために、神経再生のインビトロモデルにおいて試験した。
【００６８】
（遺伝子合成）
２つの−ＮＧＦ融合タンパク質を、組換えタンパク質発現によって作製した。各タンパク質は、２−プラスミンインヒビター、ＮＱＥＱＶＳＰＬ（配列番号２３）由来のトランスグルタミナーゼ（ＴＧ）第ＸＩＩＩａ因子基質からなるタンパク質のＮ末端に、架橋基質を含んだ。各−ＮＧＦ融合タンパク質はまた、このタンパク質のＣ末端にネイティブの−ＮＧＦ配列を含んだ。２つのプラスミン基質（Ｐ）（機能的プラスミン基質（ＬＩＫ／ＭＫＰ、ここで／は切断部位を示す）または非機能的プラスミン基質（ＬＩＮＭＫＰ）のいずれか）のうちの１つを、架橋基質と融合タンパク質の−ＮＧＦドメインとの間に配置し、ここで、プラスミン基質における切断部位のリジン残基を、プラスミン基質を非機能的にするために、アスパラギン（ａｓｐａｒｉｇｉｎ）残基に変更した。機能的プラスミン基質を含む融合タンパク質を、ＴＧ−Ｐ−ＮＧＦと示し、そして、非機能的プラスミン基質を含む融合タンパク質を、ＴＧ−Ｐｉ−ＮＧＦと示す。
【００６９】
発現するタンパク質配列は、以下である：
【００７０】
【表５】
（配列番号２４）、ここで、斜体の領域は、この発現ベクター由来のヒスチジンタグであり、そして下線を引かれた領域は、トロンビン切断部位である。この残基は、第ＸＩＩＩａ因子についての架橋基質配列であり、そして二重下線が引かれている領域は、プラスミン基質を示す。
【００７１】
遺伝子構築のために使用したクローニングプラスミドは、ｐＵＣ １８であった。この遺伝子のＤＮＡ配列は、５’から３’で以下のようである：
【００７２】
【表６】
（配列番号２５）。
【００７３】
組換えタンパク質発現によって−ＮＧＦ融合タンパク質を合成するために、このタンパク質をコードする遺伝子をクローニングした。一旦、この遺伝子フラグメントを設計すると、Ｅｃｏ ＲＩ部位およびＨｉｎｄ ＩＩＩ部位を各フラグメントの末端に付加して、これらのフラグメントのｐＵＣ１８（Ｇｉｂｃｏ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）のポリクローニングリンカーへのクローニングを可能にした。各遺伝子フラグメントの３’および５’一本鎖オリゴヌクレオチドを、２つのクローニング制限部位に対する粘着性の末端を用いてＭｉｃｒｏｓｙｎｔｈ（Ｂａｌｇａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によって合成した。この一本鎖オリゴヌクレオチドを、変性ポリ−アクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を使用して精製し、各フラグメントについて最も高い分子量バンドをこのゲルから抽出し、そして対応する３’および５’リゴヌクレオチドフラグメントをアニールした。このアニールしたフラグメントを、Ｔ４ ＤＮＡキナーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｒｏｔｋｒｅｕｚ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）でリン酸化し、そしてｐＵＣ １８に連結した。連結後、このプラスミドをＤＨ５−Ｆ’コンピテント細胞へと形質転換し、そしてイソプロピル−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）／５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）／アンピシリン（Ａｍｐ）プレートへとプレートして、このプラスミドへのこの遺伝子フラグメントの挿入についてスクリーニングした。挿入した遺伝子フラグメントを含むコロニー由来のプラスミドを、正確な配列を有する遺伝子フラグメントを含むコロニーを同定するために配列決定した。各フラグメントについての正確な配列を得た後、このフラグメントを、この融合タンパク質についての完全な遺伝子を形成するために、構築した。手短に言うと、フラグメント２を含むプラスミドを、酵素ＥｃｏＲ ＶおよびＨｉｎｄ ＩＩＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で消化し、そしてこのフラグメントを、非変性ＰＡＧＥによって精製した。フラグメント１を含むプラスミドを、酵素Ｅｃｏ ＲＶおよびＨｉｎｄ ＩＩＩで消化し、アルカリホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で脱リン酸し、そしてこの消化したプラスミドを、アガロースゲル電気泳動で精製した。フラグメント２を、フラグメント１を含む消化したプラスミドに連結して、フラグメント１および２の両方を含むプラスミドを得た。このプラスミドをＤＨ５−Ｆ’コンピテント細胞へと形質転換し、そしてＡｍｐプレートにプレートした。得られたコロニーを、両方のフラグメントを含むプラスミドについてスクリーニングし、そしてこれらのプラスミドを配列決定した。このプロセスを、−ＮＧＦ融合タンパク質についての完全な遺伝子が構築されるまで繰り返した。
【００７４】
ＴＧ−Ｐｉ−ＮＧＦ融合タンパク質のための遺伝子を、部位特異的変異誘発によってＴＧ−Ｐ−ＮＧＦ遺伝子から作製した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、この遺伝子の所望の改変を含むプライマーを使用して、プラスミン基質をコードするこの融合タンパク質の遺伝子の領域を改変するために行った。テンプレートとしてＴＧ−Ｐ−ＮＧＦ遺伝子を使用して、２つの反応を行った（一方はプライマーＡおよびプライマーＢを用いて、そして他方はプライマーＣおよびプライマーＤを用いて）。
【００７５】
プライマーＡ ＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧ ＡＣＣＡＴＧ（Ｍ１３逆方向）
プライマーＢ ＧＴＴＴＣＡＴＧＴＴ ＧＡＴＣＡＧＣＧＧＣ ＡＧＴ
プライマーＣ ＴＧＡＴＣＡＡＣＡＴ ＧＡＡＡＣＣＣＧＴＧ ＧＡＡ
プライマーＤ ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧ ＧＣＣＡＧＴ（Ｍ１３）
（配列番号２６〜２９）。この２つの反応からの産物を、アガロースゲル電気泳動によって精製し、そして第３の反応のためのプライマーとして使用した。プライマーＡおよびＤもまた、所望の産物を増幅（ａｍｐｌｙ）するために第３の反応に添加した。この最終反応産物を、Ｅｃｏ ＲＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩで消化し、そしてアガロースゲル電気泳動によって精製した。このＰＣＲフラグメントをｐＵＣ １８にクローニングし、そして正確なＰＣＲ産物を同定するために配列決定した。
【００７６】
（タンパク質の発現）
この−ＮＧＦ融合タンパク質の各々についての完全な遺伝子を、ｐＵＣ１８から消化して切り出し、そして発現ベクターｐＥＴ１４ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）に連結した。この発現ベクターを、発現宿主ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳへと形質転換し、融合タンパク質発現の厳密な調節を可能にした。この融合タンパク質を、これらが中間対数（ｍｉｄ−ｌｏｇ ｐｈａｓｅ）増殖期（６００ｎｍでの光学密度０．４〜０．６）に達するまでＥ．ｃｏｌｉを増殖し、次いで培養培地への０．４ｍＭのＩＰＴＧの添加によってタンパク質発現を誘導することによって、発現した。この細菌を、２時間後に、５５００×ｇでの遠心分離によって収集した。収集後、この細胞を、１／１０培地容量の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ，２５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０に懸濁した。リゾチーム（０．４ｍｇ／ｍＬ）およびＤＮａｓｅ（５ｎｇ／ｍＬ）を、この収集した細胞に添加し、そしてこの溶液を３７℃で３０分間インキュベートした。この封入体を、１０，０００×ｇの遠心分離１５分によって細胞溶解物から収集した。この封入体を含むペレットを、６Ｍのグアニジン塩酸塩（ＧｕＨＣｌ）を含む４０ｍＬ／リットルの培地容量の結合緩衝液５ｍＭ イミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ，ｐＨ７．９）中、室温で９０分間再懸濁した。この溶液中の不溶性物質を、２０，０００×ｇでの遠心分離２０分によって収集し、そして溶解した融合タンパク質を含む上清を、さらなる精製のために保管した。
【００７７】
（タンパク質の精製）
この融合タンパク質は、このタンパク質のＮ末端に精製のためのトロンビン切断可能ヒスチジンタグを有した。なぜなら、−ＮＧＦ融合タンパク質のための遺伝子は、ｐＥＴ１４ｂのＮｄｅ Ｉ部位とＢａｍ ＨＩ部位との間に挿入さるためである。ニッケル親和性クロマトグラフィーを使用して、この−ＮＧＦ融合タンパク質を精製した。Ｈｉｓ ＢｉｎｄＴＭ樹脂（Ｎｏｖａｇｅｎ）をクロマトグラフィーカラムにパッキングし（１リットルの培地容量当り２．５ｍＬの吸着床容量）、Ｎｉ＋＋を充填し、そして６ＭのＧｕＨＣｌを含む結合緩衝液で平衡化した（製造者の指示に従って）。融合タンパク質を含む上清を、５μｍのシリンジフィルタで濾過し、そしてこのカラムにロードした。このカラムを、８Ｍの尿素を含む１０カラム容量の結合緩衝液、および８Ｍの尿素を含む６カラム容量の洗浄緩衝液（２０ｍＭ イミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ７．９）で洗浄した。この融合タンパク質を、８Ｍの尿素を含む４カラム容量の溶出緩衝液（１Ｍ イミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ７．９）で溶出した。この溶出画分中の−ＮＧＦ融合タンパク質の存在を、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ＰＡＧＥによって確認した。
【００７８】
（タンパク質の再折り畳み）
５倍過剰の氷冷折り畳み緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭの還元グルタチオンおよび０．２ｍＭの酸化グルタチオン、ｐＨ８．０）を、この精製−ＮＧＦ融合タンパク質に、１．３Ｍの最終尿素濃度が達成されるまでゆっくりと添加することによって、−ＮＧＦ融合タンパク質を折り畳みした。この融合タンパク質を、攪拌しながら４℃で４８時間再折り畳みした。この再折り畳み融合タンパク質を、１０％のグリセロールを含む５０倍過剰の貯蔵緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に対して、４℃で一晩透析した。この融合タンパク質を、ＶｉｖａｓｐｉｎＴＭコンセントレータ（５０００ＭＷのカットオフ、Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＵＫ）を使用する遠心分離によって、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイで測定する場合に約３００〜４００μｇ／ｍＬの濃度まで濃縮した。
【００７９】
（−ＮＧＦ融合タンパク質のフィブリンマトリクスへの取り込み）
フィブリンマトリクスへの−ＮＧＦ融合タンパク質の取り込みの効率を決定するために、ＴＧ−Ｐｉ−ＮＧＦ融合タンパク質をビオチンで標識して、直接酵素連結免疫吸収アッセイ（ＥＬＩＳＡ）による−ＮＧＦの定量化を可能にした。２０倍モル過剰のスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）ＬＣビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｌａｕｓａｎｎｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中の１０ｍｇ／ｍＬビオチンのストック溶液（３７℃で１０分間溶解した）からの１ｍｇ／ｍＬの濃度で、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ、０．０１Ｍ リン酸緩衝液、８ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、０．２ｇ／Ｌ ＫＣｌ、ｐＨ７．４）中の−ＮＧＦ融合タンパク質に添加した。この反応を、室温で２時間進めた。次いで、未反応のビオチンを、ＰＤ−１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｄｕｂｅｎｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用するゲル濾過クロマトグラフィーによって除去した。
【００８０】
既知量の標識された−ＮＧＦを、コーティング緩衝液（０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８）中、４℃で一晩９６ウェルプレートに吸着させた。このウェルを、ＰＢＳ中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で２時間、室温でブロックした。このウェルを、０．５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ緩衝液）中で３回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合体化したストレプトアビジンを、ＰＢＳ中で１μｇ／ｍＬまで希釈し、そして各ウェルに１時間添加した。このウェルを、ＰＢＳＴ緩衝液で３回洗浄し、次いでＡＢＴＳ（２，２’−アジノ（Ａｚｉｎｏ）−ビス（３−エチルベンズ−チアゾリン−６−スルホン酸））展開溶液（０．１Ｍ ＮａＣ２Ｈ３Ｏ２、０．０５Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４、０．１％ ＡＢＴＳ、０．０１％ Ｈ２Ｏ２、ｐＨ４．２）中でインキュベートした。１〜５分後、この反応を、等量の０．６％ ＳＤＳの添加によって停止し、そして各ウェルの吸光度を、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，Ｖｅｒｍｏｎｔ）のＥＬ３１１ＳＸプレートリーダーを使用して４０５ｎｍで測定した。４０５ｎｍの吸光度に対する−ＮＧＦ濃度の標準曲線を、直接ＥＬＩＳＡアッセイからのこれらの測定を使用して作成した。
【００８１】
プラスミノーゲンを含まないフィブリノーゲンを水に溶解し、そしてＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ，３３ｍＭ Ｔｒｉｓ、８ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、０．２ｇ／Ｌ ＫＣｌ）、ｐＨ７．４に対して２４時間透析した。−ＮＧＦ融合タンパク質を、５ｍＭ Ｃａ＋＋および４ ＮＩＨ単位／ｍＬのトロンビンと共に３７℃で１時間インキュベートして、精製に使用したヒスチジンタグを除去した。この−ＮＧＦ融合タンパク質溶液を、８ｍｇ／ｍＬの濃度のフィブリノーゲンと同じ比率で混合し、そして３７℃で６０分間重合した。フィブリンマトリクスを、２４時間にわたって５回洗浄し、そして各洗浄液を、このマトリクスから洗浄された−ＮＧＦの総量を決定するために保管した。２４時間後、−ＮＧＦを含むフィブリンマトリクスを、０．１Ｕのブタプラスミンで分解した。洗浄液中の−ＮＧＦおよびマトリクスに残っている−ＮＧＦの量を、直接ＥＬＩＳＡによって上記のように定量し、そして−ＮＧＦ標準曲線を、実施した各ＥＬＩＳＡについて作成した。
【００８２】
−ＮＧＦ融合タンパク質がフィブリンマトリクスに共有結合していることを直接示すために、ウエスタンブロットを行った。フィブリンマトリクスを作製し、そして取り込み定量アッセイにおいて記載したように洗浄した。このマトリクスを、上記のように、２４時間かけて５回洗浄し、次いでプラスミンで分解した。この分解産物を、１３．５％変性ゲルを使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。このゲルからのタンパク質を、活性化したＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−ＰＴＭポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｖｏｌｋｅｔｓｗｉｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に、４００ｍＡの電流を用いて１時間かけて移した。この膜を一晩乾燥した。膜に移したタンパク質（分子量マーカーを含む）を、０．２％のＰｏｎｃｅａｕ Ｓで染色することによって可視化した。この膜に結合した非特異的タンパク質を、ＴＢＳ中の３％ ＢＳＡで２時間ブロックした。この膜を、３％ＢＳＡ中０．２μｇ／ｍＬの濃度のヤギ抗ヒト−ＮＧＦ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）と共に１時間インキュベートした。この膜を、ＴＢＳで５分間かけて３回洗浄し、そして二次抗体、３％ ＢＳＡ中０．５μｇ／ｍＬの濃度のＨＲＰ結合体化ウサギ抗ヤギ免疫グロブリン（Ｄａｋｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｚｕｇ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）と共に３０分間インキュベートした。この膜をＴＢＳで３回洗浄し、次いでＴＢＳ中で１：５に希釈した増感した化学発光ＨＲＰ基質（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｌａｕｓａｎｎｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）と共に５分間インキュベートした。この膜から過剰の液体を除去し、そしてこれをプラスチックで覆い、そしてＸ線フィルムに５〜６０秒間曝露した。
【００８３】
フィブリンマトリクスの重合の間に存在する−ＮＧＦ融合タンパク質についての分子量の増加が実際に観察されたが、架橋基質を欠く−ＮＧＦの場合、洗浄後このマトリクスには−ＮＧＦは観察されなかった。この結果は、ＮＧＦ融合タンパク質が、第ＸＩＩＩａ因子のトランスグルタミナーゼ活性を介して、重合の間にフィブリンマトリクスに共有結合的に固定されたことを直接示した。
【００８４】
（固定化−ＮＧＦ融合タンパク質の生理活性）
共有結合的に固定された−ＮＧＦ融合タンパク質が制御された様式で誘導される能力を決定するために、−ＮＧＦ融合タンパク質を、重合の間にフィブリンマトリクスに組み込み、そしてこれらのマトリクスがインビトロで神経突起の伸長を増大する能力を、ニワトリＤＲＧを使用してアッセイした。ＴＧ−Ｐ−ＮＧＦは、この培養培地にＮＧＦが存在しない未改変フィブリンに対して３５０％を超えて神経突起伸長を増大すること、および培地にネイティブの１０ｎｇ／ｍＬのＮＧＦを含む未改変フィブリンよりも５０％増大することを見出した（図３）。ＴＧ−Ｐｉ−ＮＧＦ（これは、非機能的プラスミン基質を含む）は、プラスミンによってネイティブの形態ではフィブリンマトリクスから切断され得ず、そして試験した濃度のいずれかでフィブリンマトリクス内に共有結合的に固定される場合、培養培地中のネイティブのＮＧＦに対して有意な神経突起の伸長の増大を起こさなかった。しかし、ＴＧ−Ｐ−ＮＧＦ（これは、機能的プラスミン基質を含む）は、プラスミンによってネイティブのＮＧＦに非常に類似した形態でこのマトリクスから切断され得、そして培養培地に存在するネイティブのＮＧＦの同様の用量と比較した場合でさえも、神経突起の伸長の増大が観察された。ＴＧ−Ｐ−ＮＧＦ融合タンパク質についての用量応答効果を観察し、１〜５μｇ／ｍＬの−ＮＧＦ融合タンパク質が重合混合物に存在する場合に、最適な用量を達成した。これらの結果は、ＴＧ−Ｐ−ＮＧＦ融合タンパク質が、フィブリンマトリクス内に固定される場合に生理活性を有することを実証し、これは、このタンパク質が細胞関連マトリクス分解によって活性な形態で放出され得ることを示唆する。ＰＣ１２細胞活性アッセイにおける−ＮＧＦ融合タンパク質の低い活性にもかかわらず、プラスミン分解可能な−ＮＧＦ融合タンパク質がフィブリンに共有結合される場合、これは培養培地中のネイティブのＮＧＦの同じ用量よりも神経突起の伸長のより高いレベルを促進した。これらの結果はまた、−ＮＧＦ融合タンパク質が完全に活性化されていることを示唆し、これらはそのネイティブの構造に類似の形態でフィブリンマトリクスから放出されているに違いない。
【００８５】
（−ＮＧＦ融合タンパク質架橋の効率）
フィブリンマトリクスへの−ＮＧＦ融合タンパク質の取り込みの効率を決定するために、このタンパク質をビオチンで標識し、そして重合混合物中にビオチン標識された−ＮＧＦ融合タンパク質を含むフィブリンマトリクスについて直接ＥＬＩＳＡを行った。ビオチン標識された−ＮＧＦ融合タンパク質を、重合の間にフィブリンマトリクス中に取り込んだ。任意の未結合−ＮＧＦ融合タンパク質を除去するために洗浄した後、このマトリクスをプラスミンで分解し、そして分解したマトリクス中の−ＮＧＦおよび洗浄液中の−ＮＧＦの量を定量した。フィブリンマトリクス中に取り込まれた−ＮＧＦ融合タンパク質のパーセンテージは、重合混合物における−ＮＧＦの濃度の関数として図４に示される。試験した−ＮＧＦ融合タンパク質の濃度範囲にわたって、融合タンパク質のうち５０〜６０％が、フィブリンマトリクスの重合の間に取り込まれた。この結果は、ＮＧＦ融合タンパク質が、第ＸＩＩＩａ因子の作用を介してフィブリンマトリクスに効率的に取り込まれることを実証した。
【００８６】
（ヘパリン結合メインおよびプラスミン分解部位を有する−ＮＧＦ融合タンパク質）
ＮＧＦは、Ｅ．ｃｏｌｉ中で融合タンパク質として発現され得、これは、ヘパリン結合ドメインをＮ末端に、プラスミン基質を中央に、そしてＮＧＦ配列をこのタンパク質のＣ末端に含む。これは、所望の融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む合成遺伝子を構築することによって達成される。発現のためのこのタンパク質配列は、以下の通りである：
【００８７】
【表７】
（配列番号３０）、ここで、斜体の領域は、発現ベクター由来のヒスチジンタグであり、そして下線を引かれた領域は、トロンビン切断部位である。破線での下線は、ヘパリン結合配列を示し、そして二重下線は、プラスミン基質を示す。
【００８８】
遺伝子構築のために使用したクローニングプラスミドは、ｐＵＣ １８であった。この遺伝子のＤＮＡ配列は、５’から３’で以下の通りである：
【００８９】
【表８】
（配列番号３１）。
【００９０】
この遺伝子を、マップに示されるように、ｐＵＣ １８のポリリンカークローニング領域においてＥｃｏＲＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入する。
【００９１】
構築後、この遺伝子を発現ベクターに挿入する。次いで、発現および精製を、上記のように行う。
【００９２】
（実施例４：自発的にヘパリンに結合する増殖因子の融合タンパク質）
（Ａ．ＮＧＦとの第ＸＩＩＩａ基質融合タンパク質の生合成）
ＮＧＦは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて融合タンパク質として発現され得、タンパク質のＮ末端に第ＸＩＩＩａ因子基質およびタンパク質のＣ末端にヒト−ＮＧＦ配列を含む。これは、所望の融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む合成遺伝子を構築することにより達成される。この発現されるタンパク質配列は以下のようなものである。
【００９３】
【表９】
ここで、イタリック体の領域は、発現ベクター由来のヒスチジンタグであり、そして下線の領域は、トロンビン切断部位である。これらの残基は、第ＸＩＩＩａ因子に対する架橋基質配列である。
【００９４】
遺伝子構築に用いられたクローニングプラスミドは、ｐＵＣ１８（これは、ポリリンカークローニング領域の配列が逆であることを除いてｐＵＣ１９と同一である）であった。Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから入手したｐＵＣ１９のマップを以下に示す。この遺伝子のＤＮＡ配列は、５’から３’に向かって以下のような配列である。
【００９５】
【表１０】
この遺伝子は、マップに示されるように、ｐＵＣ１８のポリリンカークローニング領域中のＥｃｏＲＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されている。遺伝子構築後、この遺伝子を、発現ベクターｐＥＴ １４ｂのＮｄｅＩ部位とＢａｍＨＩ部位との間に挿入する。Ｎｏｖａｇｅｎから入手したｐＥＴ １４ｂベクターのマップを以下に示す。この遺伝子の発現ベクターへの挿入後、プラスミドをＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳコンピテント細胞中に形質転換する。この細胞を、約０．６のＯＤに達するまで増殖させ、次いでＩＰＴＧ（溶液中の最終濃度０．４ｍＭ）を用いて融合タンパク質の発現を誘導する。発現を２〜３時間継続する。この細胞を５分間氷上に静置し、次いで４℃にて５分間、５０００×ｇでの遠心分離により収集する。それらを、０．２５培養容量の冷５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に２５Ｃにて再懸濁する。これらの細胞を前回と同様に遠心分離し、ペレットを凍結する。細胞を解凍の際に溶解させる。
【００９６】
この細胞溶解物を遠心分離し、上清を廃棄する。ペレットをＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００に再懸濁する。次いで、この溶液を遠心分離し、上清を廃棄する。ペレットを６Ｍ尿素に再懸濁し、そして融合タンパク質をヒスチジンアフィニティークロマトグラフィーにより精製する。ヒスチジンタグを重合の間にトロンビンにより切断し得、そして標準的な洗浄手順の間にゲルから洗浄し得る。
【００９７】
（Ｂ．ＮＧＦのヘパリン結合ドメイン融合タンパク質の生合成）
ＮＧＦを、タンパク質のＮ末端にヘパリン結合ドメインおよびタンパク質のＣ末端にＮＧＦ配列を含む融合タンパク質としてＥ．ｃｏｌｉにおいて発現し得る。これを、所望の融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む合成遺伝子を構築することにより達成する。この発現されるタンパク質配列は、以下のようなものである。
【００９８】
【表１１】
ここで、イタリック体の領域は、発現ベクター由来のヒスチジンタグであり、そして下線の領域は、トロンビン切断部位である。点線で下線を引いた領域は、ヘパリン結合配列である。
【００９９】
遺伝子構築に用いられたクローニングプラスミドはｐＵＣ１８であった。この遺伝子のＤＮＡ配列は、５’から３’に向かって以下のような配列である。
【０１００】
【表１２】
この遺伝子は、マップに示されるように、ｐＵＣ１８のポリリンカークローニング領域中のＥｃｏＲＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されている。構築後、この遺伝子を、発現ベクターに挿入する。次いで、発現および精製を、上記のように実施する。
【０１０１】
（実施例５：ヘパリン親和性の二ドメインペプチドを有するフィブリンマトリクスからのＢＭＰ２の送達）
フィブリンマトリクスに結合した骨形成因子がこの因子の放出を制御し得ること、およびこのマトリクスが移植される場合、皮下での異所性の骨が形成されることが実証された。この手順は骨欠陥における骨形成と異なるが、生理活性増殖因子のインビボでの放出を制御する能力を試験するための適切な方法を提供する。
【０１０２】
フィブリンゲルを、配列ＬＮＱＥＱＶＳＰＫ（Ａ）ＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲＫＡ（配列番号３６）を有する異なる二ドメインペプチドを用いて合成した。このペプチドは、第１のドメインにおける２−プラスミンインヒビターについての第ＸＩＩＩａ因子基質配列および第２のドメインにおける抗トロンビンＩＩＩのヘパリン結合ドメインの模倣物に由来する。ＢＭＰ−２はヘパリン結合タンパク質であり、そして上記の配列に結合する。ゲルをペプチド（１ｍＭ）、ヘパリン、および組換えヒトＢＭＰ−２の存在下（ヘパリン：ＢＭＰ−２の比が１：１および４０：１）で重合した。
【０１０３】
等量の形態形成タンパク質、ＢＭＰ−２を有するが、ヘパリンおよび二ドメインペプチドを欠くコントロールゲルを作製した。次いで、これらのゲルを、ラットに皮下移植し、そして２週間維持した。マトリクスを取り出したとき、ペプチド−ヘパリン放出系を含まなかったゲルから骨はほとんどから全く観察されなかったが、この系を含んだゲルは有意な骨形成を示した。
【０１０４】
これは、取り出されたマトリクスの質量において最も見出された。これを表３に示す。
【０１０５】
【表１３】
この放出系は、マトリクス内での異所性の骨の形成を増強し、このことは、インビボでの放出系の可能性を実証する。
【０１０６】
（実施例６：外因性第ＸＩＩＩ因子を用いたペプチドの組込み）
標準的な沈殿方法を通じて獲得した精製フィブリノーゲンは、二ドメインペプチドの組込みにおける制限因子（ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ）として作用する少量の内因性第ＸＩＩＩａ因子を含む。これを、精製フィブリノーゲンを用いて実証した。内因性第ＸＩＩＩａ因子の濃度に基づき、８．２ｍｏｌペプチド／ｍｏｌフィブリノーゲンまでの濃度での二ドメインペプチドの組込みが可能であった。外因性第ＸＩＩＩａ因子の添加が、ペプチド組込みのレベルを増強することを実証した。これは特に、ゲル内の二ドメインペプチド濃度の制御に関係し、次に細胞接着にも影響をおよぼし、そしてヘパリンおよび増殖因子の組込みに対する上限も決定する。いくつかの場合、標準的な精製フィブリノーゲンを用いて可能な増加を超えて、細胞接着、ヘパリンの濃度、または増殖因子の濃度が増加することが利点であり得る。
【０１０７】
プールされた血漿から精製された外因性第ＸＩＩＩ因子を用いて、二ドメインペプチド（ｄＬＮＱＥＱＶＳＰＬＲＧＤ（配列番号１））をゲル中に組込んだ。１Ｕの外因性第ＸＩＩＩ因子をフィブリンゲル１ｍＬ当たりに添加し、そして共有結合的に組込まれた二ドメインペプチドのレベルを、クロマトグラフィー分析を通して分析した。この結果を表５に示す。１Ｕ／ｍＬの外因性第ＸＩＩＩ因子を添加した場合、組込みのレベルは２５ｍｏｌペプチド／ｍｏｌフィブリノーゲンに達した。この組込みのレベルは、可能な結合部位の数に基づく理論的な限界に近い。
【０１０８】
市販のフィブリン接着キットに組込まれる二ドメインペプチド（ｄＬＮＱＥＱＶＳＰＬＲＧＤ（配列番号１））の能力もまた、実証した。Ｔｉｓｓｕｃｏｌキットを入手し、次いで複数のサンプルに分画した。外因性の二ドメインペプチドを６ｍＭまで添加し、そして組込みのレベルをクロマトグラフィー分析を通して分析した（図６）。ペプチド組込みのレベルを、３つの別々のキットについて広範囲の二ドメインペプチドの初期濃度にわたって試験した。組込みのレベルを測定した場合、最大組込みが５ｍＭよりも大きい外因性ペプチドの濃度で生じたことが観察された。それは、これらの高密度マトリクスにおいて、拡散が組込みのプロセスにおいて役割を果たしはじめていることであり得る。しかし、非常に高レベルの組込みが、少なくとも２５ｍｏｌペプチド／ｍｏｌフィブリノーゲンに達するレベルで観察された。さらに、広範囲の存在する可能性のあるタンパク質濃度を有するフィブリン接着キットの組成物において有意な可能性が存在する。しかし、これは、明らかに、二ドメイペプチドの組込みに有意に影響を及ぼさず、組込みのプロフィールは、試験された３つのキット全てについて同様であった。
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、組織の修復または再生、および／あるいは薬学的に活性な分子の制御された放出における使用のための、親和性結合相互作用を使用した、薬学的に活性な分子（薬学的に活性な分子（特に増殖因子）の融合タンパク質を含む）を含むマトリクスの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
組織の修復または再生のために、細胞は創傷床（ｗｏｕｎｄ ｂｅｄ）に移動し、増殖し、マトリクス成分を発現するかまたは細胞外マトリクスを形成し、そして最終的な組織の形状を形成しなければならない。複数の細胞集団が、しばしばこの形態形成応答（これは頻繁に脈管細胞および神経細胞を含む）において関与するに違いない。マトリクスは、非常に増強されることが実証され、そしていくつかの場合、これを生じるために必須であることが見出された。天然の細胞は、細胞内部増殖マトリクスの影響による再構築に供され、これは全てタンパク質分解（例えば、プラスミン（フィブリンを分解する）およびマトリクスメタロプロテイナーゼ（コラーゲン、エラスチンなどを分解する）による）に基づく。このような分解は、高度に局在化され、そして移動細胞と直接的に接触する際にのみ生じる。さらに、特定の細胞シグナル伝達タンパク質（例えば、増殖因子）の送達は、きつく調節されている。天然のモデルにおいて、マクロ孔質（ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ）細胞内部増殖マトリクスは使用されず、むしろ、局所的に、および要求される場合は細胞がマトリクス中に移動したときに、細胞が分解し得る微孔質マトリクスが使用される。
【０００３】
増殖因子についての制御された送達デバイスは、いくつかの形態の増殖因子を隔離するために固定化されたヘパリンの使用に基づいて以前に設計された。例えば、Ｅｄｅｌｍａｎらは、アルギネート中のヘパリン結合ＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭビーズを使用した。このビーズは、塩基性線維芽細胞増殖因子（「ｂＦＧＦ」）のヘパリンとの結合および解離に基づいて、ｂＦＧＦをゆっくり放出する貯蔵庫として役立つ。
【０００４】
二ドメインペプチド（これは第ＸＩＩＩａ因子基質配列および生理活性ペプチド配列を含む）が、フィブリンゲルに架橋され得ること、およびこの生理活性ペプチドがインビトロでその細胞活性を保持していることが実証された（非特許文献１）。ペプチドは、そのペプチドが由来するタンパク質全体の生理活性を部分的に模倣し得るがこの生理活性は通常はタンパク質全体の生理活性よりも低く、ときどき、ほんの短いペプチドで特定のタンパク質を模倣することは不可能である。従って、タンパク質全体（例えば、増殖因子または他の薬学的に活性な分子）をマトリクス中に組み込み得ることが所望される。
【０００５】
タンパク質および増殖因子についての送達系が存在し、公知であるが、組織の移動細胞への増殖因子の提示および放出の制御ならびに細胞接着部位の制御を介したマトリクス中への細胞移動および組織内部増殖を促進する、修復において使用するためのマトリクスについての必要性が残る。この必要性は、天然において起こるように、マトリクスとの親和性相互作用を介して増殖因子を局所的に提示し得、そしてその影響および活性を局所的に保持し得るような内部増殖のマトリクスについて特に大きい。
【０００６】
従って、インタクトな増殖因子分子の活性を保持する増殖因子がその中に組み込まれた組織の修復、再生および再構築のための、天然の生分解性マトリクスを提供することが本発明の目的である。
【０００７】
増殖因子の制御および／または維持された放出のための、天然の生分解性マトリクスを提供することが、本発明のさらなる目的である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｓｃｈｅｎｓｅ，Ｊ．Ｃ．ら（１９９９）Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１０：７５〜８１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
組織の修復、再生および／もしくは再構築ならびに／または薬物送達において使用するために、タンパク質は、タンパク質または多糖ポリマーのマトリクスまたはゲル中に組み込まれる。このタンパク質は、このマトリクスの分解によって、酵素作用および／または拡散によって放出されるように組み込まれ得る。実施例によって実証されるように、１つの方法は、ヘパリンを共有結合的または非共有的結合方法のいずれかによってマトリクスに結合させてヘパリン−マトリクスを形成することである。次いで、このヘパリンは、ヘパリン結合増殖因子をタンパク質マトリクスに非共有結合させる。結合されるべきタンパク質がネイティブなヘパリン結合配列を含まない場合、ネイティブなタンパク質配列および合成ヘパリン結合ドメインを含む融合タンパク質が構築され得る。あるいは、架橋領域およびネイティブなタンパク質配列を含む融合タンパク質が構築され得、そしてこの融合タンパク質は架橋によって隔離されて、マトリクスを形成し得る。この融合タンパク質またはペプチドドメインは、加水分解部位または酵素的切断部位を含む分解可能な結合を含み得る。これは、マトリクス中の異なる位置で、その位置および／またはマトリクス中における細胞活性に依存して、送達速度を変更することを可能にする。このアプローチは、長期の薬物送達が所望される場合、例えば、神経再生の場合（再生の相関的要素として空間的に薬物放出速度を変更すること（例えば、生存組織境界の付近では速く、そして損傷域中ではさらによりゆっくりと）が所望される場合）、特に有用であり得る。さらなる利点としては、送達系中のより低い総薬物用量、および、最大細胞活性の時点で放出されるべき薬物のよりも高い割合を可能にする、放出の空間的な制御が挙げられる。実施例は、細胞内部増殖および組織再生を最適に誘導したマトリクス中へ隔離された増殖因子、ヘパリン結合ドメインおよびヘパリンまたはヘパリン結合ペプチドの、最適化される比またはレベルを実証する。
【００１０】
本発明は、例えば以下を提供する。
（項目１） ペプチドドメインまたはタンパク質を含む操作したタンパク質または多糖ポリマーであって、該ドメインまたはタンパク質が、ヘパリン結合タンパク質もしくはその部分または放出のための生理活性因子を結合する、操作したタンパク質または多糖ポリマー。
（項目２） 細胞増殖または内部増殖または生理活性因子の放出に適したマトリクスの形成のための共有結合またはイオン結合を含む、項目１に記載のポリマー。
（項目３） 酵素的にまたは加水分解により切断される切断部位をさらに含む、項目１に記載のポリマー。
（項目４） マトリクスを形成するタンパク質または多糖ポリマーとヘパリンまたはヘパリンペプチドの間の部位の切断により放出される、ヘパリンまたはヘパリンペプチドを含む、項目２に記載のポリマー。
（項目５） 架橋酵素の基質である少なくとも一つの領域を含む、項目１に記載のポリマー。
（項目６） 第ＸＩＩＩａ因子の基質である領域を含む、項目５に記載のポリマー。
（項目７） 前記ヘパリン結合タンパク質が増殖因子である、項目１に記載のポリマー。
（項目８） 前記増殖因子が、トランスフォーミング増殖因子β、骨形成タンパク質、線維芽細胞増殖因子、血管上皮増殖因子、インターロイキン−８、ニューロトロフィン−６、ヘパリン結合上皮増殖因子、肝細胞増殖因子、結合組織増殖因子、ミッドカイン、ヘパリン結合増殖関連分子、およびそれらの混合物からなる群より選択される、項目７に記載のポリマー。
（項目９） ヘパリンペプチドキメラを含む項目１に記載のポリマーであって、
トランスグルタミナーゼ基質および
ヘパリンまたはヘパリン様ペプチド、を含み
ここで該トランスグルタミナーゼ基質およびヘパリンまたはヘパリン様ペプチドがお互いに直接結合される、ポリマー。
（項目１０） 前記トランスグルタミナーゼ基質は、ヘパリンまたはヘパリン様ペプチドに共有結合される架橋可能なタンパク質である、項目９に記載のポリマー。
（項目１１） 前記架橋可能なタンパク質が、フィブリンである、項目１０に記載のポリマー。
（項目１２） 融合タンパク質を含む、項目９に記載のポリマー。
（項目１３） 前記トランスグルタミナーゼ基質が、第ＸＩＩＩａ因子により架橋される、項目９に記載のポリマー。
（項目１４） 前記基質が、ＮＱＥＱＶＳＰを含む、項目１３に記載のポリマー。
（項目１５） トランスグルタミナーゼ基質とヘパリンまたはヘパリンペプチドの間に酵素切断部位を含む、項目９に記載のポリマー。
（項目１６） 前記酵素切断部位が、プラスミンおよびマトリクスメタロプロテイナーゼの群から選択される酵素により切断される、項目４に記載のポリマー。
（項目１７） 操作したタンパク質または多糖ポリマーのマトリクスであって、該タンパク質または多糖が、共有結合またはイオン結合されて細胞増殖または内部増殖または生理活性因子の放出に適したマトリクスを形成し、該ポリマーが、ヘパリン結合タンパク質またはその部分、マトリクスからの放出のための生理活性因子、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるペプチドドメインまたはタンパク質を含む、操作したタンパク質または多糖ポリマーマトリクス。
（項目１８） 前記ポリマーが、酵素的にまたは加水分解により切断される切断部位を含む、項目１７に記載のマトリクス。
（項目１９） 前記切断部位が、エステルおよびアミドからなる群より選択される、項目１８に記載のマトリクス。
（項目２０） 前記マトリクスを形成するタンパク質または多糖ポリマーとヘパリンまたはヘパリンペプチドまたは生理活性因子の間の切断部位を含む項目１８に記載のマトリクス。
（項目２１） 前記生理活性因子が、増殖因子である、項目１７に記載のマトリクス。
（項目２２） 前記増殖因子が、トランスフォーミング増殖因子β、骨形成タンパク質、線維芽細胞増殖因子、血管上皮増殖因子、インターロイキン−８、ニューロトロフィン−６、ヘパリン結合上皮増殖因子、肝細胞増殖因子、結合組織増殖因子、ミッドカイン、ヘパリン結合増殖関連分子、およびそれらの混合物からなる群より選択される、項目２１に記載のマトリクス。
（項目２３） 前記マトリクス形成タンパク質ポリマーが、フィブリンを含む項目１７に記載のマトリクス。
（項目２４） ヘパリン結合ペプチドおよび骨形成因子を含む項目２２に記載のマトリクスであって、ＢＭＰに対するペプチドの比が、ほぼ等モルであるマトリクス。
（項目２５） 切断部位が切断される場合に放出されるヘパリンを含む、項目２０に記載のマトリクス。
（項目２６） 前記ヘパリン結合ドメインが、アンチトロンビンＩＩＩ、血小板第４因子、およびアミノ酸配列ＮＣＡＭを含むタンパク質からなる群より選択されるタンパク質由来である、項目１７に記載のマトリクス。
（項目２７） 前記タンパク質または多糖ポリマーが、融合タンパク質である、項目１７に記載のマトリクス。
（項目２８） 前記融合タンパク質が、一つのドメインとしてのトランスグルタミナーゼ基質またはヘパリンまたはヘパリン結合ペプチドおよび第二の生理活性ドメインを含む、項目２７に記載のマトリクス。
（項目２９） 前記生理活性ドメインが、増殖因子である、項目２８に記載のマトリクス。
（項目３０） 前記増殖因子が、ＮＧＦβ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＶＥＧＦ１２１、ＥＧＦ、およびＰＤＧＦからなる群より選択される、項目２９に記載のマトリクス。
（項目３１） 前記マトリクスを形成するポリマーが、プロテアーゼインヒビターを含む、項目１７に記載のマトリクス。
（項目３２） ペプチドドメインまたはタンパク質を含む操作したタンパク質または多糖ポリマーを架橋することを含むマトリクスを作製するための方法であって、該ドメインまたはタンパク質が、ヘパリン結合タンパク質もしくはその部分または放出のための生理活性因子を結合する、方法。
（項目３３） ヘパリンまたはヘパリンペプチドの放出のための項目３２に記載の方法であって、前記マトリクスを形成するタンパク質または多糖ポリマーとヘパリンまたはヘパリンペプチドの間の部位の切断により放出されるヘパリンまたはヘパリンペプチドを含むポリマーを架橋することを含む、方法。
（項目３４） 前記マトリクスが、該マトリクスから放出される生理活性因子を含む、項目３２に記載の方法。
（項目３５） 前記マトリクスが、ある一つの部位で移植され、そして内部増殖および／または該マトリクス中での細胞の増殖を促進するように配置される、項目３２に記載の方法。
（項目３６） 前記マトリクスが、第ＸＩＩＩ因子または第ＸＩＩＩａ因子に富む前駆体から、フィブリンマトリクス中に外因性物質を組み込む、項目３２に記載の方法。
（項目３７） ペプチドドメインまたはタンパク質を含む操作したタンパク質または多糖ポリマーを移植することを含む生理活性因子の制御された放出のための方法であって、該ドメインまたはタンパク質は、ヘパリン結合タンパク質もしくはその部分または放出のための生理活性因子を結合し、該ポリマーが、移植前または移植時に架橋される、方法。
（項目３８） 前記マトリクスが、放出される生理活性因子に結合するヘパリンまたはヘパリンペプチドを含むポリマーを含む、項目３７に記載の方法。
（項目３９） 放出される生理活性因子を提供することをさらに含む項目３８に記載の方法であって、該生理活性因子が、マトリクスの分解、ヘパリンもしくはヘパリンペプチドを放出するためのポリマーの切断、またはヘパリンもしくはヘパリン結合ペプチドが結合した生理活性因子の拡散により、放出される方法。
（項目４０） 前記生理活性因子が、細胞の修復、再生または再構築を促進する、項目３７に記載の方法。
（項目４１） 前記生理活性因子が、細胞の修復または再生を阻害する、項目３７に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、プラスミン分解されたペプチド含有フィブリンゲルおよび遊離ペプチドの蛍光検出クロマトグラムである。２ＰＩ１〜７−ＡＴＩＩＩ１２１〜１３４ペプチドが取り込まれた分解したフィブリンゲル（−）、取り込まれたペプチドを含む分解したフィブリンゲルに遊離状態で添加された同じペプチドを有する分解したフィブリンゲル（…）、および遊離ペプチド単独（−−）のサイズ排除クロマトグラフィーを示す。Ｎ末端ロイシン残基は、ダンシル化した（ｄＬと省略される）。遊離ペプチドは、より低い分子量に対応して、凝固の間にフィブリン中に取り込まれたペプチドが溶出する時間よりも長い時間で溶出された。これは、分解したフィブリンへの共有結合、従って第ＸＩＩＩａ因子活性の作用を介する共有結合的な取り込みを実証する。
【図２】図２は、４８時間でのＤＲＧ神経突起の伸長に対するマトリクス結合ｂＦＧＦの効果のグラフである。平均値および平均の標準偏差が示される。（＊は、改変されていないフィブリンと比較してｐ＜０．０５であることを示す）。
【図３】図３は、フィブリンマトリクス中のＤＲＧ神経突起の伸長に対する固定化された−ＮＧＦ融合タンパク質の効果のグラフである。平均値および平均の標準誤差が示される。 は、ネイティブなＮＧＦを示す。 は、ＴＧ−Ｐ−ＮＧＦを示す。 は、ＴＧ−Ｐｉ−ＮＧＦを示す。＊は、培養培地中のＮＧＦを有する改変されていないフィブリンに対してｐ＜０．０００１であることを示す。この結果は、マトリクスに結合した−ＮＧＦが、フィブリンマトリクスを介して、培地中の同じ濃度のＮＧＦと比較して、神経突起の伸長を増強することを実証する。
【図４】図４は、ビオチン標識−ＮＧＦを使用して直接的ＥＬＩＳＡで定量した、外因性第ＸＩＩＩａ因子基質を使用した−ＮＧＦ融合タンパク質のフィブリンマトリクス中への取り込みの量のグラフである。−ＮＧＦ融合タンパク質の取り込み効率は、試験された濃度の範囲にわたって比較的一定であった。
【図５】図５は、ｄＬＮＱＥＱＶＳＰＬＲＧＤ（配列番号１）の、外因性第ＸＩＩＩ因子が添加されたフィブリンゲル中への取り込みのグラフである。１Ｕ／ｍＬを添加した場合、取り込みのレベルは、２５ｍｏｌのペプチド／ｍｏｌのフィブリノーゲンよりも多くが達成され得るように増加した。
【図６】図６は、二ドメインペプチド（ｄＬＮＱＥＱＶＳＰＬＲＧＤ（配列番号１））の、希釈していないフィブリン接着剤（ｇｌｕｅ）中への取り込みのグラフである。３つの別々のキットを試験し、そしてそれぞれの場合において高レベルの取り込みが観察され得、これは２５ｍｏｌペプチド／ｍｏｌフィブリノーゲンに達した。最大取り込みのために必要とされる外因性ペプチドの濃度は、少なくとも５ｍＭであり、これは、作製される高度に濃いフィブリンマトリクス中への、拡散の限界におそらく起因する。取り込みのレベルは非常に一致しており、それぞれのキットは、同様の取り込みプロフィールを提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（発明の詳細な説明）
本明細書中に記載される場合、組織の修復、再生または再構築を、増殖因子が放出可能に取り込まれた天然のマトリクスを使用して増強するための方法が開発された。先行技術のマトリクスを越えるいくつかの利点が存在する：天然のマトリクスは生体適合性および生分解性であり、そして移植時に、インビトロまたはインビボで形成され得る；全長の増殖因子タンパク質が取り込まれ得、そして全部の生理活性を保持し得る；この増殖因子は、この増殖因子をどのように、およびいつ、およびどの程度放出するかについての制御を提供する技術を使用して放出可能に組み込まれ得、その結果このマトリクスは、直接的または間接的に組織修復のために、制御された放出ビヒクルとしてこのマトリクスを使用して、使用され得る。
【００１３】
（Ｉ．マトリクスおよび増殖因子）
（Ａ．マトリクス材料）
１つ以上のポリマー材料をマトリクス内での細胞内部増殖または細胞のマトリクス中への移動を可能にするのに十分なポリマー間間隙を有するポリマーマトリクスを形成する、イオン的、共有結合的、またはその組合わせによって架橋してマトリクスが形成される。
【００１４】
好ましい実施形態において、このマトリクスはタンパク質で形成され、最も好ましくは、マトリクスが移植されるべき患者において天然に存在するタンパク質で形成される。最も好ましいタンパク質はフィブリンであるが、他のタンパク質（例えば、コラーゲンおよびゼラチン）もまた使用され得る。多糖および糖タンパク質もまた使用され得る。いくつかの実施形態において、イオン結合または共有結合によって架橋され得る合成ポリマーを使用することもまた可能である。
【００１５】
このマトリクス材料は、好ましくは、天然に存在する酵素によって生分解可能である。分解の速度は、架橋の程度およびマトリクス中にプロテアーゼインヒビターを含むことによって操作され得る。
【００１６】
（Ｂ．分解可能な結合）
マトリクスを形成するタンパク質は、分解可能な結合を含むことを介して改変され得る。代表的に、これらは酵素切断部位（例えば、トロンビンによる切断のための部位）である。さらに、融合タンパク質またはペプチドキメラ（これはフィブリンゲルに架橋される）は、接着部位（すなわち、第ＸＩＩＩａ因子基質またはヘパリン結合ドメイン）と生理活性タンパク質（すなわち、増殖因子または酵素）との間に切断可能な部位を含むようにさらに改変され得る。これらの部位は、非特異的な加水分解（すなわち、エステル結合）によって切断され得るか、または特異的な酵素的分解（タンパク質分解性分解または多糖分解のいずれか）のための基質であり得るかのいずれかである。これらの分解可能な部位は、フィブリンゲルから生理活性因子のより特異的な放出の操作を可能にする。例えば、酵素活性に基づく分解は、ゲルを介したこの因子の拡散によるよりもむしろ、細胞プロセスによって制御されるべき生理活性因子の放出を可能にする。
【００１７】
この分解部位は、一次タンパク質配列に対してわずかな改変を伴うかまたは改変を伴わずに生理活性因子の放出を可能にし、これはこの因子のより高い活性を生じ得る。さらに、この分解部位は、は、因子の放出がいくつかの多孔性材料から拡散されるよりもむしろ、細胞特異的なプロセス（例えば、局在化したタンパク質分解）によって制御されることを可能にする。これは、材料中の細胞の位置に依存して因子が同じ材料中で異なる速度で放出されることを可能にする。細胞特異的タンパク質分解活性は、長期間にわたって生じる神経の再生などの適用にきわめて重要である。これはまた、必要な総増殖因子の量を減少させる。なぜなら、この増殖因子の放出は、細胞プロセスによって制御されるからである。増殖因子の保存およびその生理活性は、初期バースト放出における生理活性因子の有意な量の欠失を特徴的に生じる拡散制御放出デバイスの使用に対する、細胞特異的タンパク質分解活性の開発の明らかな利点である。
【００１８】
タンパク質分解性分解のために使用され得る酵素は、多数である。タンパク質分解的分解部位は、コラゲナーゼ、プラスチン、エラスターゼ、ストロメライシン、またはプラスミノーゲンアクチベーターのための基質を含み得る。例示的な基質を、以下に列挙する。Ｐ１〜Ｐ５は、タンパク質分解が生じる部位から、このタンパク質のアミノ末端に向かってアミノ酸の１〜５位を示す。Ｐ１’〜Ｐ４’は、タンパク質分解が生じる部位から、このタンパク質のカルボキシ末端に向かってアミノ酸の１〜４位を示す。
【００１９】
（表１：プロテアーゼのサンプル基質配列）
【００２０】
【表１】
（多糖基質）
酵素分解は、酵素（例えば、ヘパリナーゼ、ヘパリチナーゼ、およびコンドロイチン分解酵素ＡＢＣ）についての多糖基質を伴って生じ得る。これらのそれぞれの酵素は、多糖基質を有する。全てのヘパリン結合系におけるヘパリンの存在によって、ヘパリナーゼについての基質は、すでにこれらの系の中に構築されている。
【００２１】
（タンパク質分解基質）
タンパク質分解基質は、ペプチドキメラまたはヘパリンペプチドキメラのいずれかのペプチド合成の間に添加され得る。このヘパリン結合ペプチドキメラは、プロテアーゼ基質（例えば、上記のプラスミンについての基質のうちの１つ）を第ＸＩＩＩａ因子基質とヘパリン結合ドメインとの間に挿入することによってタンパク質分解性分解配列を含むように改変され得る。このヘパリン−ペプチドキメラは、プロテアーゼ基質（例えば、上記のプラスミンについての基質のうちの１つ）を第ＸＩＩＩａ因子基質とヘパリンドメインとの間に挿入することによってタンパク質分解性分解配列を含むように改変され得る。高いＫｍおよび低いＫｃａｔを有する基質を使用して、プロテアーゼの活性部位を占有しながらも切断をゆっくりにし得る。プラスミンについての基質以外の切断基質を使用して、マトリクス分解と独立した生理活性因子の放出を可能にし得る。
【００２２】
（オリゴエステル）
オリゴエステルドメインは、キメラの第ＸＩＩＩａ因子基質と、ヘパリン結合ドメインまたはヘパリンドメインのいずれかとの間に、ペプチド合成工程の間同様に挿入され得る。これは、乳酸のオリゴマーのようなオリゴエステルを使用して達成され得る。
【００２３】
非酵素的分解基質は、酸または塩基触媒機構によって加水分解を受ける任意の結合で構成され得る。これらの基質は、オリゴエステル（例えば、乳酸のオリゴマーまたはグリコール酸のオリゴマー）を含み得る。これらの材料の分解速度は、オリゴマーの選択を介して制御され得る。
【００２４】
（Ｃ．ヘパリン；ヘパリン結合ペプチド）
マトリクスは、ヘパリンおよび／またはヘパリン結合フラグメントを含むことを介して改変され得、これはヘパリンに結合するタンパク質に直接的または間接的に結合する。後者の場合、このペプチドはヘパリンに結合し得、次いでこれはヘパリン結合部位を含む因子に結合するために利用可能であるか、またはこのペプチドはそれ自体が特定のヘパリン結合増殖因子によって結合されるヘパリン部分を含み得る。これらは、以下においてより詳細に議論されるような標準的な技術を使用して、マトリクス材料に結合され得る。
【００２５】
好ましい実施形態において、ヘパリンは、ペプチドキメラおよびヘパリンそれ自体からなる２部の系（ｔｗｏ−ｐａｒｔ ｓｙｓｔｅｍ）を使用して、フィブリンゲルに非共有結合的に結合される。このペプチドキメラは、２つのドメイン（第ＸＩＩＩａ因子基質および多糖結合ドメイン）からなる。一旦、このペプチドキメラがフィブリンゲル中に架橋すると、このペプチドキメラは非共有結合的相互作用によってヘパリン（または他の多糖）に結合する。
【００２６】
多くのタンパク質が、ヘパリン結合親和性を有することが見出されている。これらのタンパク質およびそれらのヘパリン結合ドメインの配列のいくつかを、以下の表２に列挙する。これらはまた、ポリマーマトリクスによって送達され得る生理活性因子に関する節で議論される。
【００２７】
【表２】
（Ｄ．生理活性因子）
発育中の生物および成体の両方において形態発生に関与する多くの増殖因子は、細胞外マトリクス分子に結合する。この親和性は、形態形成物質の作用の局所モードを提供し、制御できない遠位の影響を妨げる。この影響の局所化に関与するこの主なマトリクス親和性相互作用は、へパリンとヘパリン−表面プロテオグリカンについてである。ヘパリンに結合する増殖因子としては、なかでも、トランスフォーミング増殖因子（「ＴＧＦ」）−βスーパーファミリー（骨形成タンパク質、「ＢＭＰ」を含む）、線維芽細胞増殖因子（「ＦＧＦ」）ファミリー、および血管上皮増殖因子（「ＶＥＧＦ」）が挙げられる。一般的に、ヘパリンを結合すると考えられる増殖因子は、生理的レベルより高いＮａＣｌ濃度（１４０ｍＭ以上）でヘパリン親和性カラムから溶出する。さらなる「ヘパリン結合」増殖因子としては、インターロイキン−８、ニューロトロフィン−６、ヘパリン結合上皮増殖因子、肝細胞増殖因子、結合組織増殖因子、ミッドカイン、およびヘパリン結合増殖関連分子が挙げられる。これらの増殖因子は、組織修復を調節することが示されている。
【００２８】
ヘパリン結合ドメインは、増殖因子の多くの異なるファミリーに天然に存在する。ヘパリンを結合する１つ以上のメンバーを有するこれらのファミリーの１つは、線維芽細胞増殖因子である（Ｐｒｅｓｔａ，Ｍ．ら、（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．１８５：１０９８〜１１０７）。ヘパリンを結合するさらなる増殖因子としては、トランスフォーミング増殖因子、骨形成因子、インターロイキン−８、ニューロトロフィン−６、血管内皮細胞増殖因子、ヘパリン結合上皮増殖因子、肝細胞増殖因子、結合組織増殖因子、ミッドカイン、およびヘパリン結合増殖関連分子が挙げられる（Ｇｏｅｔｚ，Ｒ．ら、（１９９４）．Ｎａｔｕｒｅ．３７２：２６６−２６９；Ｋａｎｅｄａ，Ｎ．ら、（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１９：１１５０〜１１５６；Ｋｉｇｕｃｈｉ，Ｋ．ら、（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｓｉｓ．２２：７３〜８３；Ｋｉｎｏｓａｋｉ，Ｍ．ら、（１９９８）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１３８４：９３〜１０２；ＭｃＣａｆｆｒｅｙ，Ｔ．ら、（１９９２）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１５２：４３０〜４４０；Ｎｏｌｏ，Ｒ．ら、（１９９６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．８：１６５８〜１６６５；Ｓｐｉｌｌｍａｎｎ，Ｄ．，ら、（１９９８）．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２７３：１５４８７−１５４９３；Ｓｔｅｆｆｅｎ，Ｃ．ら、（１９９８）Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ． １５：１９９〜２１３．Ｔｅｓｓｌｅｒ，Ｓ．ら、（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１２４５６〜１２４６１）。これらの因子は、血管系、皮膚、神経および肝臓を含む多くの異なる型の組織における治癒を促進する可能性を示している。従って、これらの物質は、使用されて、適切な増殖因子を選択することによって身体の多くの異なる部分において創傷治癒を促進し得る。
【００２９】
（ＩＩ．生理活性因子の取り込みおよび／または放出方法）
マトリクス中の増殖因子または他の生理活性タンパク質の取り込みに対する好ましい実施形態において、このマトリクスは、フィブリンおよび外因性分子から形成され、凝固の間にフィブリン中に取り込まれる基質を含む。外因性ペプチドは、２つのドメイン（そのうちの１つは、ＸＩＩＩａなどの架橋酵素に対する基質であるドメイン）を含むように設計され得る。第ＸＩＩＩａ因子は、凝固の間は活性なトランスグルタミナーゼである。この酵素（通常トロンビンによる切断によって第ＸＩＩＩ因子から形成される）は、グルタミン側鎖およびリジン側鎖の間に形成されるアミド結合を介してフィブリン鎖を互いに接着するように機能する。この酵素はまた、凝固の間に他のタンパク質をフィブリンに接着するように機能する（例えば、タンパク質α２プラスミンインヒビター）。このタンパク質のＮ末端ドメイン（特に、配列ＮＱＥＱＶＳＰ（配列番号２０））は、第ＸＩＩＩａ因子に対して有効な基質として機能するように示されている。次いで、このペプチドの第二のドメインは、生理活性因子（例えばペプチド、またはタンパク質、または多糖）であるように選択され得る（Ｓａｋｉｙａｍａ−Ｅｌｂｅｒｔら、（２０００）Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ６５：３８９−４０２および本明細書中）。このように、外因性生理活性因子は、凝固の間にフィブリン中に第ＸＩＩＩａ因子基質を介して組み込まれ得る。
【００３０】
（Ａ．タンパク質の放出におけるヘパリン親和性の使用）
治癒およびフィブリンへの再生において目的の多くの生理活性タンパク質を取り込む単純な方法は、本明細書に記載の方法の１つによってヘパリンをフィブリンゲルへ接着し、そしてヘパリンを使用してヘパリン結合タンパク質（例えば、ヘパリン結合増殖因子）を分離することである。これは、２つの方法のうち１つ（直接的にヘパリン結合ペプチドをフィブリンゲルへ架橋してヘパリンをこのペプチドに非共有結合的に結合する（ヘパリン結合ドメインおよび第ＸＩＩＩａ因子基質を含む二機能性ペプチドを使用する）ことによってか、またはヘパリン−ペプチドキメラを直接的にカップリングする（このヘパリンは第ＸＩＩＩａ因子基質を含むペプチドに化学的に接着される）ことによってのいずれか）で達成され得る。取り込みの方法によらず、取りこまれたヘパリンは、次いで、フィブリンゲルにおいてタンパク質（例えば、ヘパリン結合親和性を有する増殖因子）を、タンパク質が自然に細胞外マトリクスに分離される方法に類似の様式で分離し得る。ヘパリンはまた、タンパク質分解性分解からこれらの因子を保護し、そしてこれらの因子がマトリクスから放出されるまでその活性を延長し得る。
【００３１】
（ヘパリン結合ペプチドの取り込みを介するヘパリンの取り込み）
共有結合的または非共有結合的なフィブリンゲルへのヘパリンの接着は、これらの材料に新規な機能を追加する。ヘパリンの接着は、フィブリンマトリクスがヘパリン結合タンパク質（増殖因子を含む）をタンパク質を傷つけない様式で結合することを可能にし、そしてゲルからのタンパク質の遊離拡散を防ぐ。このことは、２つの機能のうちの１つ（ゲルの分解またはタンパク質のいくつかの他の高親和性タンパク質（例えば、細胞表面レセプター）への結合のいずれか）によってヘパリン結合タンパク質の徐放を可能にする。
【００３２】
ヘパリンは、ペプチドキメラおよびヘパリン自体からなる２部分系を使用して非共有結合的にフィブリンへ接着され得る。このペプチドキメラは、２つのドメイン（第ＸＩＩＩａ因子基質および多糖結合ドメイン）からなる。一旦、このペプチドキメラがフィブリンゲルに架橋されると、非共有結合相互作用によってヘパリン（または他の多糖）を接着する。
【００３３】
自発的にヘパリンを結合しない増殖因子を分離するために、フィブリンに接着し得る機能性の付加を介してこのタンパク質を改変することが必要である。このことは、いくつかの方法で達成し得る。例として、これは、第ＸＩＩＩａ因子基質の付加を介してまたはヘパリン結合ドメインを得られた融合タンパク質に付加することによって達成され得る。
【００３４】
合成された第ＸＩＩＩａ因子基質の付加は、ネイティブな増殖因子配列および融合タンパク質のアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかで第ＸＩＩＩａ因子基質を含む融合タンパク質を発現することによって達成され得る。この改変は、ＤＮＡレベルでなされる。タンパク質全体は、固相化学合成によって合成するという点で困難性を示す。増殖因子をコードするこのＤＮＡ配列は、細菌性発現のために最適なコドン使用を適合される。次いで、このＤＮＡ配列は、細菌性ＤＮＡに頻繁に生じるコドンを使用して所望の第ＸＩＩＩａ因子基質について決定される。
【００３５】
一連の遺伝子フラグメントは、ＤＮＡ合成の前に設計される。ほとんどのＤＮＡ合成のエラー頻度（約５０ｂｐ毎のエラーを含む）に起因して、遺伝子は、約１００ｂｐ長になるように構築される。これは、適切なＤＮＡ配列を含むコロニーを見出すためにスクリーニングされなければならないコロニーの数を減少する。１つの遺伝子が終了し、そして次に始まる位置は、この遺伝子中の天然に存在する独特の制限酵素切断部位に基づいて選択され、可変長のフラグメント（またはオリゴヌクレオチド）を生じる。このプロセスは、所定のＤＮＡ配列中の制限酵素部位の位置および頻度を同定するソフトウェアの使用によっておおいに援助される。
【００３６】
一旦、遺伝子フラグメントが首尾良く設計されると、共通の制限酵素部位は、各フラグメントの末端に含まれて、各フラグメントのクローニングプラスミドへのライゲーションを可能にする。例えば、各遺伝子フラグメントへのＥｃｏＲＩ部位およびＨｉｎｄＩＩＩ部位の付加により、ｐＵＣ１９のポリリンカークローニング領域への挿入が可能になる。次いで、各遺伝子フラグメントの３’１本鎖および５’１本鎖は、クローニングベクターへの挿入のために適切な粘着末端を用いる標準的な固相合成を使用して合成される。次いで、切断および脱塩に続いて、１本鎖フラグメントは、ＰＡＧＥによって精製され、そしてアニーリングされる。リン酸化の後、アニーリングされたフラグメントは、クローニングベクター（例えば、ｐＵＣ１９）へライゲーションされる。
【００３７】
ライゲーション後、このプラスミドを、ＤＨ５−Ｆ’コンピテントセルへ形質転換し、そしてイソプロピル−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）／５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）プレート上にプレートして、遺伝子フラグメントの挿入についてスクリーニングする。次いで、遺伝子フラグメントを含む得られたコロニーを、適切な長さの挿入についてスクリーニングする。これは、アルカリ溶解ミニプレッププロトコールによって形質転換された細胞のコロニーからプラスミドを精製すること、および遺伝子フラグメントのいずれかの末端に存在する制限酵素部位でこのプラスミドを消化することによって達成される。アガロースゲル電気泳動による適切な長さのフラグメントの決定の際に、このプラスミドを、配列決定する。
【００３８】
適切な配列を有する遺伝子フラグメントを含むプラスミドを同定する場合、次いでこのフラグメントを切断し、そして使用して、全遺伝子を構築する。各時点で、１つのプラスミドを、挿入点で酵素を用いて切断し、そしてプラスミドの脱リン酸化後にアガロースゲルから精製する。その間に、挿入されるべきフラグメントを含む第２のプラスミドをまた、切断して、そして挿入されるべきフラグメントを、アガロースゲルから精製する。次いで、この挿入ＤＮＡを、脱リン酸化プラスミドへライゲーションする。このプロセスは、全遺伝子が構築されるまで続く。次いで、この遺伝子を、発現ベクター（例えば、ｐＥＴ１４ｂ）へ移動し、そして発現のための細菌へ形質転換する。この最終ライゲーション後、全遺伝子を、配列決定されて、正しいことを確認する。
【００３９】
融合タンパク質の発現は、細菌がｍｉｄ−ｌｏｇ期増殖に達するまで細菌を増殖し、次いで、融合タンパク質の発現を誘導することで達成される。発現は、約３時間続き、次いで細胞を収穫する。細菌細胞ペレットを得た後、この細胞を、溶解する。この細胞膜および細胞屑を、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００を用いて細胞溶解ペレットを洗浄することで除去し、封入体を相対的に純粋な形式にする。この融合タンパク質を、高い尿素濃縮物を使用して可溶化し、そしてヒスチジン親和性クロマトグラフィーによって精製する。次いで、生じたタンパク質を、尿素の量をゆっくりと減少するように透析することで徐々に復元し、そして凍結乾燥する。
【００４０】
（ヘパリン−ペプチドキメラの取り込みを介するヘパリンの取り込み）
多糖片（ヘパリン−第ＸＩＩＩａ因子基質ペプチドキメラ）は、凝固の間にフィブリンに取り込まれて、固定化されたヘパリン部位を提供して、増殖因子を結合してその放出を遅くし得る。ヘパリン（または他の多糖（例えば、ヘパリン硫酸またはコンドロイチン硫酸））は、ヘパリン−ペプチドキメラを構築することで第ＸＩＩＩａ因子を使用して直接フィブリンに接着され得る。このキメラは、２つのドメイン（第ＸＩＩＩａ因子基質からなるペプチドドメインおよび多糖ドメイン（例えば、ヘパリン））を含む。これらのキメラは、改変されたヘパリン（または別の多糖）（例えば、ペプチドカップリングがヘパリン分子上で生じる部位を制御するように独特な反応基を１つの末端で含む）を使用して作製される。ペプチド上の独特な官能基（例えば、カップリングが所望されるペプチドの末端のみに存在する側鎖）の使用を介して、ペプチド上のカップリングの位置は、さらに制御され得る。ヘパリンの鎖（末端とは反対）に沿った第ＸＩＩＩａ因子基質ペプチドを取り込むこと、および１つのヘパリン鎖あたり１つより多いこのようなペプチドを取り込むことでさえ、可能でもあるが、好ましいアプローチは、単一の第ＸＩＩＩａ因子基質ペプチドをヘパリンの１つの末端で取り込むことである。次いで、これらのキメラは、第ＸＩＩＩａ因子の酵素的活性によって、凝固の間にフィブリンゲルに共有結合的に架橋され、ヘパリンのフィブリンゲルへの直接接着を可能にし得る。
【００４１】
（タンパク質の放出速度を決定する際のヘパリンの濃度の役割）
増殖因子：ヘパリン−ペプチドキメラの最適比、または増殖因子：ヘパリン：ヘパリン結合ペプチドの最適比ならびにヘパリン−ペプチドキメラまたはフィブリンへ取り込まれたヘパリン結合ペプチドの最適密度の決定は、重要である。ヘパリンに対する相対的に強い親和性にもかかわらず、ヘパリン結合増殖因子は、短い時間の尺度でマトリクスから解離する。従って、過剰な結合部位は、増殖因子が再びマトリクスに結合する前に拡散しないことを確実にする。この平衡はまた、解離部位に近く隣接する細胞表面レセプターへの遊離増殖因子の結合を可能にする。徐放のこの方法は、増殖因子の比較的長期な結合および増殖因子の局所細胞への速やかな放出の両方を提供する。本明細書中で記載されるように、高い比（従って放出の低い速度）が、最も所望される生物学的応答を提供する場合は、いつもではない。特に、いくつかの増殖因子の場合、放出のより速やかな速度が所望される場合があり得る。
【００４２】
どのような増殖因子に対する結合部位の比が、非常に緩やかな増殖因子放出によって決定される場合、細胞増殖用途に最適であるかを数学的に予測することが試みられている。マトリクスからの増殖因子の受動放出の速度は、ヘパリン結合性長因子に対するペプチドおよびヘパリンの比を介して調節され得、ヘパリン結合増殖因子と比較してより過剰なヘパリンおよびヘパリン結合ペプチドは、より緩やかな受動放出を導くことが示された。しかし、このような方法を使用して、最適の放出特性を予測することが常に可能なわけではない。例えば、この例は、ＢＭＰ−２が有利により速やかに物質（等モルにより近いＢＭＰ−２に対するヘパリンおよびヘパリン結合ペプチドの比を有する）から放出され得ることを示す。いくつかの場合において、より良い結果は、より低いヘパリン対増殖因子比で得られる。
【００４３】
活性形態においてヘパリン含有送達システムが増殖因子を送達する能力は、骨形成の異所性モデルにおいて試験され、ここで送達システムおよびＢＭＰ−２を含有するフィブリンマトリクスは、ラットにおいて皮下に移植された。このモデルにおいて、骨形成のために好ましい条件は、１：１の低いヘパリン対増殖因子比であった。より高い比（例えば、５：１またはそれより大きい）の付加は、骨形成に対して阻害性であった。これらの結果は、以前に公開されていた研究に基づいては予期されず、かつ低いヘパリン対増殖因子比はＢＭＰ−２の送達において予期されない用途を有することが示唆される（実施例５を参照のこと）。
【００４４】
外因性第ＸＩＩＩ因子のフィブリノーゲン調製物への添加を、使用して、フィブリンマトリクスと共に取り込まれたヘパリン結合ペプチドの数を増加し得、ヘパリン結合ペプチドがヘパリンに対する固定化部位および細胞接着部位の両方を利用することが可能になる。ペプチド濃度におけるこの増加は、このような物質が軸索伸長、および細胞移動の他の形式を、細胞接着部位としてのヘパリン結合ドメインの使用を介して促進する能力を高め得た。ヘパリン結合ペプチドが接着ペプチドとして作用し、従ってフィブリン中の細胞移動の速度を高め得ることが示されている（Ｓａｋｉｙａｍａ，Ｓ．Ｅ．ら、（１９９９）ＦＡＳＥＢ Ｊ．１３：２２１４−２２２４）。しかし、この応答は、クロット中の１モルのフィブリノーゲンあたり約８モルの取り込まれたペプチドを必要とした。従って、ヘパリン結合増殖因子の持続放出において親和性部位として使用するヘパリンに結合するためのこれらのヘパリン結合ペプチドの多数の使用は、ヘパリン結合ペプチドの有益な接着効果を取り除き得る。この制限は、より高いレベルの外因性ヘパリン結合ペプチドの取り込みによって克服され得る。この取り込みは、フィブリノーゲン調製物へのより高いレベルの第ＸＩＩＩａ因子の添加を介して達成され得、従って、ペプチドが同時に両方の効果を有することを可能にする。従って、１モルフィブリノーゲンあたり８モルのペプチドより大きい比（すなわち、１モルフィブリノーゲンあたり２５モルのペプチド）でのさらなるペプチドの取り込みは、薬剤送達のためにヘパリン結合ペプチドが細胞接着部位およびヘパリン固定化部位として両方を利用することを可能にするのに有用であり得た。例えば、５％のヘパリン結合部位を、使用して、薬物送達のためにヘパリンを固定化し得、そして他の９５％は、細胞接着ドメインとして利用するために占有されず、かつ遊離のままであり、従ってヘパリン結合ペプチドが、同じ物質中で細胞接着ドメインおよび増殖因子固定化部位の両方として使用されることを可能にする。ヘパリン結合ペプチドのこの二重使用は、外因性第ＸＩＩＩａ因子から利益を得る。これは、相対的に高い数のヘパリン結合部位は、フィブリン物質中における細胞接着および細胞移動を高めるためにフィブリンへ取り込まれなければならない（１モルのフィブリノーゲンあたり８モルのペプチド）ことが示されているからである。
【００４５】
（ヘパリン親和性部位の組み込みのための二ドメイン（ｂｉ−ｄｏｍａｉｎ）ペプチドの使用）
ペプチド−ペプチドキメラ（１方のドメイン上に第ＸＩＩＩａ基質を有し、他方のドメイン上にヘパリン結合ペプチドを有する）の多くの可能性のある組み合わせが存在する。これらの異なる組み合わせは、異なる利点および不利な点を有する。例えば、いくつかの第ＸＩＩＩａ基質は、他よりもさらに効率的に取り込まれる。さらに、異なるヘパリン結合ペプチドは、ヘパリンに対して異なる親和性を有する。このペプチドの可能性のある免疫原性が、１つのさらなる検討事項である。ヒトタンパク質の配列に基づいてペプチド配列を利用することが可能であるけれども、これらの２つのヒト配列の間の融合は、新しく、そして決して患者の免疫系によってはみられない。従って、このような融合が免疫原性であり、そしてどれか一方のタンパク質に対して、または融合部位自体に対して抗体を誘導する危険性がある程度存在する。一般に、ペプチド配列が短いほど、長いポリペプチド配列よりも抗原性応答を誘導する傾向が小さくなる。従って、α２プラスミンインヒビター第ＸＩＩＩａ因子基質およびアンチトロンビンＩＩＩヘパリン結合ドメインを有するキメラは、例えば、血小板第４因子由来のヘパリン結合ドメインと対応する二ドメインペプチドよりも抗原性応答を誘導する可能性が幾分か大きいようである。
【００４６】
フィブリンネットワーク内にヘパリンを固定するために用いた二ドメインキメラが免疫原性である可能性を低下させるさらなるアプローチは、１つのドメインにおいては、第ＸＩＩＩａ基質（例えば、タンパク質α２プラスミンインヒビターから）、および他方のドメインとしてヘパリン鎖を用いて、２つの間の共有結合により、直接、ペプチド−ヘパリンキメラを形成することである。この様式では、天然ではないペプチド配列が融合部位に存在し、そのため免疫学的相互作用の可能性は非常に低い。
【００４７】
（タンパク質の放出における融合タンパク質の使用）
当業者は、ヘパリンに対する親和性によるタンパク質の放出における融合タンパク質の使用をさらに考慮し得る。ここでは、ヘパリンに結合しない生理活性タンパク質の融合物がヘパリン結合ドメインを用いて構築されて、ヘパリンに結合する融合タンパク質を生じ得る。さらに、ヘパリンに対する親和性を介したフィブリン内の生理活性タンパク質の組み込みに対する代替として、このタンパク質は、第ＸＩＩＩａ因子を用いて直接組み込まれ得る。それらが第ＸＩＩＩａ因子について基質ドメインを保有する場合、天然にまたは組み換えタンパク質内への組み込みのいずれかによって、生物学的に活性なタンパク質および第ＸＩＩＩａ基質ドメインを有する融合タンパク質を形成することが可能である。
【００４８】
上記の融合タンパク質のいずれかの合成は、分子生物学的技術を利用することによって達成され得る。これを行うために、このタンパク質鎖内のアミノ末端もしくはカルボキシ末端、または可能性としては他のいずれかに融合した配列を架橋もしくは結合することで、目的のタンパク質配列全体を含む融合タンパク質が作製され得る。これはＤＮＡレベルで行われる。なぜなら、第ＸＩＩＩａ因子架橋基質またはヘパリン結合ドメインのいずれかをコードする配列は、例えば、もとのタンパク質のコドンの初めまたは終わりに挿入され得るからである。これらの改変されたタンパク質が発現される場合は、主なタンパク質ドメインのアミノ末端もしくはカルボキシ末端、または他のいずれかに目的のさらなるドメインを含む。タンパク質合成のために設計された自然の機構を使用することにより、高い忠実度を有する大きいタンパク質を合成および精製することが可能になる。
【００４９】
標準的な分子生物学的技術を用いて、タンパク質配列またはＤＮＡ配列が既知である任意の増殖因子の融合タンパク質を作製し得、ヘパリン結合ドメインまたは酵素基質のような新規のドメインの付加が可能になる。これらの融合タンパク質は、このタンパク質のＮ末端またはＣ末端のいずれかに対して、または例えば、このタンパク質鎖内に新規なドメインを付加するように構築され得る。この改変は、増殖因子をコードするＤＮＡ配列、および架橋または結合の配列（例えば、ヘパリン結合ドメイン）をコードするＤＮＡ配列の両方を含む遺伝子を構築することによってＤＮＡレベルで作製される。次いで、このＤＮＡを発現プラスミドに連結し、そして細菌に形質転換する。発現の誘導の際、細菌は大量の融合タンパク質を生成する。発現後、このタンパク質は細胞溶解物から精製され、そして再折り畳み（リフォールディング）されなければならない。精製はしばしば、高レベルで発現された哺乳動物タンパク質が細菌内で封入体を形成する傾向によって単純になる。
【００５０】
（組み込みのための融合タンパク質の設計）
組み換え融合タンパク質は、いくつかの異なるスキームを用いてフィブリンゲル中に組み込まれ得る。最初の設計において、第ＸＩＩＩａ基質は、このタンパク質に直接組み込まれた。この改変されたタンパク質が、フィブリンの重合化の間に存在する場合、このタンパク質は、二ドメインペプチドと同様の様式でフィブリンマトリクスに直接組み込まれる。別の方法は、ヘパリン結合ドメインを組み込むために合成された融合タンパク質を含む。この実施例において、二結合ペプチド、ヘパリン、およびヘパリン結合融合タンパク質が、フィブリン重合化混合物に含まれる。重合化の間、二ドメインペプチドは、フィブリンゲルに架橋される。この二ドメインペプチドは、ヘパリン結合配列に加えて、第ＸＩＩＩａ因子基質配列を含む。このヘパリンは、フィブリンゲルに組み込まれた二ドメインペプチドに結合し、そしてフィブリンマトリクスにトラップされる。このトラップされた（ｅｎｔｒａｐｐｅｄ）ヘパリンは、操作されたヘパリン結合ドメインに対する結合によってフィブリン内のヘパリン結合融合タンパク質を隔離するように働く。この組み込みは、架橋されたペプチドが細胞に制御されたタンパク質分解を通じてゲルから除去されるまで、この増殖因子を隔離するのに十分安定であることが示されている。
【００５１】
この技術は、第ＸＩＩＩａ基質配列と目的のタンパク質との間に酵素分解部位を組み込むことによってさらに改変され得る。この酵素分解部位のＫｍおよびｋｃａｔの注意深い選択により、分解がタンパク質マトリクスの前もしくは後のいずれかで生じるように、そして／または類似のもしくは類似していない酵素を利用することにより、マトリクスを、各タイプのタンパク質および適用について仕立てられている分解部位の位置で分解するように制御され得る。この新しいタンパク質は、上記のようなフィブリンマトリクスに直接架橋され得る。しかし、酵素分解部位を組み込むことは、タンパク質分解の間、タンパク質の遊離を変更する。細胞由来プロテアーゼが、隔離されたタンパク質に到達する場合、このプロテアーゼは、新しく形成された分解部位でこの操作されたタンパク質を切断する。得られた分解産物は、遊離したタンパク質を含む。この遊離したタンパク質は、いまやどのような操作された融合配列も、どのような分解フィブリンもほぼ含まない。従って、この遊離タンパク質は、ネイティブの増殖因子の一次配列にほぼ同一であり、そして潜在的にさらに生理活性である。類似の方法がヘパリン結合融合タンパク質で用いられ得る。次いでこれらの新しいタンパク質は、プロテアーゼ分解部位、および新しいヘパリン結合ドメインを含む。このヘパリン結合融合タンパク質は、ヘパリン結合ペプチドの共有結合（固定）を介したフィブリンへのヘパリンの組み込みによってこのマトリクス中に隔離される。ここでも、付加された新しいプロテアーゼ分解部位を考慮すれば、この放出されたタンパク質は、天然のタンパク質に対する一次配列と同一である。
【００５２】
（ＩＩＩ．使用方法）
本明細書に記載されたポリマーは、移植の前にまたは移植時に、架橋されて、組織の修復、再生、もしくは再構築、および／または生理活性因子の放出のためのマトリクスを形成し得る。ある場合には、移植部位で組織に対してマトリクスを一致させるために投与の部位で架橋を誘導することができる。他の場合には、移植の前にマトリクスを調製することが都合がよく、このマトリクスがヘパリンまたはヘパリン結合ペプチド（増殖因子のような他の生理活性分子に結合するために用いられる）を取り込む場合には、これらの因子は、移植の前にまたは移植の時点でこのマトリクスに添加され得る。もともと充填された因子が放出された場合には、これらの生理活性因子を有するマトリクスを、同様に「再充填（ｒｅ−ｆｉｌｌ）する」ことも、ある場合には都合よい。
【００５３】
架橋は、内因性の架橋剤の添加によって、またはポリマーが第ＸＩＩＩａ因子基質を含む場合には、手術手順の間、または移植の部位に局所的にトロンビンを付与することにより、達成され得る。
【００５４】
細胞はまた、移植の前にもしくは移植の時点で、または移植の後でさえ、ポリマーの架橋の時点もしくはその後のいずれかで添加されて、マトリクスを形成し得る。これは、細胞増殖または内殖を促進するように設計された間質性空間を生成するようにマトリクスを架橋することに対する追加であり得るか、またはその代わりであり得る。
【００５５】
ほとんどの場合、細胞成長または増殖を促進するようにマトリクスを移植することが所望され得るが、いくつかの場合には、細胞増殖の速度を阻害するために生理活性因子が用いられる。特定の適用は、手術後の接着の形成を阻害することである。
【００５６】
以下の例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。組成物および方法は、好ましい実施形態に関して記載されているが、本発明の、概念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の組成物、方法およびこの方法の工程のまたはこの工程の順序に対して、バリエーションが適用され得ることが当業者には明白である。
【００５７】
（実施例１：増殖因子に結合するヘパリン結合ペプチドを介したヘパリンの間接的カップリング）
標準的な固相合成によって、第ＸＩＩＩａ因子基質およびヘパリン結合ドメインの両方を含むペプチドキメラを合成した。サンプルペプチドは、以下の配列：ｄＬＮＱＥＱＶＳＰＫ（Ａ）ＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲＫＡ（配列番号２１）を含むペプチドであり、ここでこのペプチドのＮ末端は、第ＸＩＩＩａ因子基質を含み、そしてイタリック体の配列（ここで、後半に表記した（Ａ）ＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲＫＡはイタリック体である）は、ＡＴＩＩＩのヘパリン結合ドメイン由来の改変ペプチドを含む（ｄＬは、ダンシルロイシンを示し、これを用いて、蛍光によるこのペプチドの検出が可能になる）。
【００５８】
サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、以前に開発された組み込み方法を用いた、フィブリンゲルに架橋したペプチドの量を決定した。アンチトロンビンＩＩＩ由来のヘパリン結合ドメインおよび蛍光標識を含む二ドメインペプチドを、重合化の間、フィブリンゲルに組み込んだ。遊離のペプチドをゲルから洗浄し、そしてフィブリンネットワークをプラスミンで分解した。分解産物を高速液体クロマトグラフィー（サイズ排除クロマトグラフィー）によって分析して、１モルあたりのフィブリノーゲン（ＵＶ吸収）に存在するペプチドの量を（蛍光によって）決定した。ペプチド改変ゲルからの蛍光シグナルは、遊離のペプチドだけからのシグナルよりも早期の溶出時間で出現し、このことは改変ゲル中に存在した全てのペプチドがフィブリンに架橋されたことを示した（図１）。プラスミンで分解したペプチドネットワークおよびフィブリンネットワークの両方について既知の濃度標準に基づいた定量によって、１モルあたりのフィブリノーゲンに８．７±０．２モルのペプチドが組み込まれたことが示された（ｎ＝１０）。
【００５９】
共有結合した二ドメインペプチド（その１ドメインは、第ＸＩＩＩａ因子基質であり、そしてその１ドメインは、アンチトロンビンＩＩＩに基づくヘパリン結合ドメインである）をまた含むフィブリン細胞内殖マトリクス由来のヘパリン結合増殖因子の放出のためのこのアプローチを評価するために、後根神経節を以下に示すような、種々の条件下で、フィブリンゲル内で３次元的に培養した。
【００６０】
（ヘパリン結合ペプチドの使用のための架橋プロトコール）
１）４ＬのＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水（３３ｍＭ Ｔｒｉｓ）（ｐＨ７．４）に対して２４時間フィブリノーゲン（８ｍｇ／ｍｌ）を透析する
２）０．２μｍシリンジフィルターを用いてフィブリノーゲンを濾過滅菌する
３）以下のペプチド溶液を作製する：
【００６１】
【表３】
４）トロンビン溶液を作製する：５ｍｌ ＴＢＳに１００単位含有
５）各ペプチド溶液に１．４ｍｌのフィブリノーゲンを添加する
６）ゲルを作製する：２０μｌのＴＢＳ＋５０ｍＭ ＣａＣｌ２、４０μｌのトロンビン溶液（２０単位／ｍｌ）、および３４０μｌのペプチド溶液＋フィブリノーゲンを添加する（上記の溶液を６ゲル作製する）
７）３７℃で１時間インキュベートする
８）２４時間で５回洗浄する。最初の４回は１ｍｌのＴＢＳを用い、最後の１回はニューロン培地を用いる
９）８日目にニワトリ胚後根神経節を解剖する
１０）各ゲルに１つの神経節を置いて、３７℃で１時間置く
１１）各ゲルに１ｍｌの神経培地を添加する
１２）２４時間後培地を交換する。
【００６２】
後根神経節を用いたこれらの研究の結果を図２に示す。ペプチドおよびヘパリンなしで添加した場合、ｂＦＧＦは、神経突起成長を増強せず、このことは、用いた洗浄プロトコールが十分であることを示す。神経突起増強は、用量依存性の様式で結合したｂＦＧＦの１μｇ／ｍｌおよび５μｇ／ｍｌの両方の添加によって増大する。１．０μｇ／ｍｌの結合したＶＥＧＦの添加によって、神経突起伸長は増大せず、このことはｂＦＧＦの効果が、新脈管形成を促進する能力には因らないことを示唆した。
【００６３】
（実施例２：ヘパリン−ペプチドキメラの合成）
還元的アミノ化を介して、Ｎ末端上に第ＸＩＩＩａ因子基質を、およびＣ末端にポリリジンを含むペプチドを、一方の末端に特有のアルデヒド基を有するヘパリンオリゴサッカライドにカップリングすることによって、ヘパリン−ペプチドキメラを合成する。以下の配列ｄＬＮＱＥＱＶＳＰＬＫＫＫＧ（配列番号２２）を有するペプチドを、標準的な固相ペプチド化学で合成する。ヘパリンオリゴサッカライドを、ヘパリンの標準的亜硝酸分解によって作製し、切断されたオリゴサッカライドの還元末端上にアルデヒドの形成を生じる。カップリングの間、リジン側鎖のアミノ基は、ヘパリンオリゴサッカライドの還元末端上のアルデヒドを攻撃して、シッフ塩基を形成する。次いでこのシッフ塩基を還元して安定な生成物を形成する。サンプルカップリングプロトコールは以下に示す。当業者はまた、ヘパリンをさらに単純なα２プラスミンインヒビター基質部位ＮＱＥＱＶＳＰ（配列番号２０）にカップリングし得る。第一級アミンは、ペプチドのＮ末端にのみ存在する。ペプチドが、従来どおり固相樹脂上に合成されるとき、Ｎ末端はダングリングに曝露され、そしてＮ末端上のαアミンが脱保護され、第一級アミンが反応に利用可能である。ヘパリンの反応型は、Ｇｒａｉｎｇｅｒ，Ｄら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔ．Ｒｅｓ．２２：２３１〜２４９に記載のように、特定の酸での切断によって容易に形成され、末端アルデヒド基とヘパリンフラグメントを形成し得る。この反応性アルデヒドは、樹脂（その上に縮合された）に結合されたままのペプチドを通過し、シッフ塩基（水素化ホウ素シアンナトリウムで容易に還元されてさらに安定な型である二級アミンを形成し得る）に結合されるペプチド−ヘパリンキメラを形成し得る。
【００６４】
他のアプローチが使用され得る。例えば、アルデヒドヘパリンは、上記されたのと同様に、過剰のエチレンジアミンとの反応およびシッフ塩基の還元によって第一級アミノヘパリンに変換され得る。遊離残基エチレンジアミンからの精製は、透析によって達成され得る。このアミンヘパリンは、まだ保護されているＥ残基上のカルボキシル基を有する固相樹脂からペプチドを切断することによって、続いてペプチド合成からの標準的試薬を用いたＣ末端上のカルボキシル基の活性化によって、続いてこのＥ残基上のカルボキシル基の脱保護によって、このＣ末端カルボキシル基上に縮合され得る。
【００６５】
（カップリングプロトコール：）
１）５０ｍＭのホウ酸緩衝液（ｐＨ９）中に、１．８ｍＭのペプチドおよび１．８ｍＭの亜硝酸分解ヘパリンを溶解する。３０分間反応させる
２）１６０ｍＭ ＮａＣＮＢＨ３を添加し、１２時間反応させる
３）２４０ｍＭ ＮａＣＮＢＨ３を添加し、１２時間反応させる
４）希塩酸でｐＨ７に調整する
５）最終濃度１ＭにＮａＣｌを添加する
６）４Ｌの脱イオン水に対して２４時間透析する
７）凍結乾燥して反応生成物を得る
８）サイズ排除クロマトグラフィーによって反応収率を分析する
９）陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて、所望の生成物の精製を達成する
（ヘパリン−ペプチドキメラの使用のための架橋プロトコール：を使用する）
１）４ＬのＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水（３３ｍＭ Ｔｒｉｓ）（ｐＨ７．４）に対して２４時間フィブリノーゲン（８ｍｇ／ｍｌ）を透析する
２）０．２μｍシリンジフィルターを用いてフィブリノーゲンを濾過滅菌する
３）以下のキメラ溶液を作製する：
【００６６】
【表４】
４）トロンビン溶液を作製する：５ｍｌ ＴＢＳに１００単位含有
５）各キメラ溶液に１．４ｍｌのフィブリノーゲンを添加する
６）ゲルを作製する：２０μｌのＴＢＳ＋５０ｍＭ ＣａＣｌ２、４０μｌのトロンビン溶液（２０単位／ｍｌ）、および３４０μｌのキメラ溶液＋フィブリノーゲンを添加する（上記の溶液を６ゲル作製する）
７）３７℃で１時間インキュベートする
８）２４時間で５回洗浄する。最初の４回は１ｍｌのＴＢＳを用い、最後の１回はニューロン培地を用いる
９）８日目にニワトリ胚後根神経節を解剖する
１０）各ゲルに１つの神経節を置いて、３７℃で１時間置く
１１）各ゲルに１ｍｌの神経培地を添加する
１２）２４時間後培地を交換する。
【００６７】
（実施例３：融合タンパク質およびペプチドキメラにおける分解部位）
（第ＸＩＩＩａ因子基質を含む−ＮＧＦ融合タンパク質およびプラスミン分解部位）
−ＮＧＦ融合タンパク質を、−ＮＧＦ融合タンパク質がフィブリンマトリクスに酵素的に架橋することを可能にする内因性架橋基質を用いて発現し、これは薬物送達系のベース材料として役立つ。プラスミン基質は、この架橋基質と融合タンパク質の−ＮＧＦドメインとの間に位置し、これは分解リンカーとして働き、そして酵素切断によって−ＮＧＦがそのネイティブの配列とほとんど同一の形態でこのマトリクスから放出されることを可能にする。このＮＧＦ融合タンパク質を、第ＸＩＩＩａ因子のトランスグルタミナーゼ活性によってフィブリンに共有結合し、そしてこれを細胞関連酵素活性に応答して活性な増殖因子を放出するこの送達系の能力を決定するために、神経再生のインビトロモデルにおいて試験した。
【００６８】
（遺伝子合成）
２つの−ＮＧＦ融合タンパク質を、組換えタンパク質発現によって作製した。各タンパク質は、２−プラスミンインヒビター、ＮＱＥＱＶＳＰＬ（配列番号２３）由来のトランスグルタミナーゼ（ＴＧ）第ＸＩＩＩａ因子基質からなるタンパク質のＮ末端に、架橋基質を含んだ。各−ＮＧＦ融合タンパク質はまた、このタンパク質のＣ末端にネイティブの−ＮＧＦ配列を含んだ。２つのプラスミン基質（Ｐ）（機能的プラスミン基質（ＬＩＫ／ＭＫＰ、ここで／は切断部位を示す）または非機能的プラスミン基質（ＬＩＮＭＫＰ）のいずれか）のうちの１つを、架橋基質と融合タンパク質の−ＮＧＦドメインとの間に配置し、ここで、プラスミン基質における切断部位のリジン残基を、プラスミン基質を非機能的にするために、アスパラギン（ａｓｐａｒｉｇｉｎ）残基に変更した。機能的プラスミン基質を含む融合タンパク質を、ＴＧ−Ｐ−ＮＧＦと示し、そして、非機能的プラスミン基質を含む融合タンパク質を、ＴＧ−Ｐｉ−ＮＧＦと示す。
【００６９】
発現するタンパク質配列は、以下である：
【００７０】
【表５】
（配列番号２４）、ここで、斜体の領域は、この発現ベクター由来のヒスチジンタグであり、そして下線を引かれた領域は、トロンビン切断部位である。この残基は、第ＸＩＩＩａ因子についての架橋基質配列であり、そして二重下線が引かれている領域は、プラスミン基質を示す。
【００７１】
遺伝子構築のために使用したクローニングプラスミドは、ｐＵＣ １８であった。この遺伝子のＤＮＡ配列は、５’から３’で以下のようである：
【００７２】
【表６】
（配列番号２５）。
【００７３】
組換えタンパク質発現によって−ＮＧＦ融合タンパク質を合成するために、このタンパク質をコードする遺伝子をクローニングした。一旦、この遺伝子フラグメントを設計すると、Ｅｃｏ ＲＩ部位およびＨｉｎｄ ＩＩＩ部位を各フラグメントの末端に付加して、これらのフラグメントのｐＵＣ１８（Ｇｉｂｃｏ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）のポリクローニングリンカーへのクローニングを可能にした。各遺伝子フラグメントの３’および５’一本鎖オリゴヌクレオチドを、２つのクローニング制限部位に対する粘着性の末端を用いてＭｉｃｒｏｓｙｎｔｈ（Ｂａｌｇａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によって合成した。この一本鎖オリゴヌクレオチドを、変性ポリ−アクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を使用して精製し、各フラグメントについて最も高い分子量バンドをこのゲルから抽出し、そして対応する３’および５’リゴヌクレオチドフラグメントをアニールした。このアニールしたフラグメントを、Ｔ４ ＤＮＡキナーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｒｏｔｋｒｅｕｚ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）でリン酸化し、そしてｐＵＣ １８に連結した。連結後、このプラスミドをＤＨ５−Ｆ’コンピテント細胞へと形質転換し、そしてイソプロピル−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）／５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）／アンピシリン（Ａｍｐ）プレートへとプレートして、このプラスミドへのこの遺伝子フラグメントの挿入についてスクリーニングした。挿入した遺伝子フラグメントを含むコロニー由来のプラスミドを、正確な配列を有する遺伝子フラグメントを含むコロニーを同定するために配列決定した。各フラグメントについての正確な配列を得た後、このフラグメントを、この融合タンパク質についての完全な遺伝子を形成するために、構築した。手短に言うと、フラグメント２を含むプラスミドを、酵素ＥｃｏＲ ＶおよびＨｉｎｄ ＩＩＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で消化し、そしてこのフラグメントを、非変性ＰＡＧＥによって精製した。フラグメント１を含むプラスミドを、酵素Ｅｃｏ ＲＶおよびＨｉｎｄ ＩＩＩで消化し、アルカリホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で脱リン酸し、そしてこの消化したプラスミドを、アガロースゲル電気泳動で精製した。フラグメント２を、フラグメント１を含む消化したプラスミドに連結して、フラグメント１および２の両方を含むプラスミドを得た。このプラスミドをＤＨ５−Ｆ’コンピテント細胞へと形質転換し、そしてＡｍｐプレートにプレートした。得られたコロニーを、両方のフラグメントを含むプラスミドについてスクリーニングし、そしてこれらのプラスミドを配列決定した。このプロセスを、−ＮＧＦ融合タンパク質についての完全な遺伝子が構築されるまで繰り返した。
【００７４】
ＴＧ−Ｐｉ−ＮＧＦ融合タンパク質のための遺伝子を、部位特異的変異誘発によってＴＧ−Ｐ−ＮＧＦ遺伝子から作製した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、この遺伝子の所望の改変を含むプライマーを使用して、プラスミン基質をコードするこの融合タンパク質の遺伝子の領域を改変するために行った。テンプレートとしてＴＧ−Ｐ−ＮＧＦ遺伝子を使用して、２つの反応を行った（一方はプライマーＡおよびプライマーＢを用いて、そして他方はプライマーＣおよびプライマーＤを用いて）。
【００７５】
プライマーＡ ＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧ ＡＣＣＡＴＧ（Ｍ１３逆方向）
プライマーＢ ＧＴＴＴＣＡＴＧＴＴ ＧＡＴＣＡＧＣＧＧＣ ＡＧＴ
プライマーＣ ＴＧＡＴＣＡＡＣＡＴ ＧＡＡＡＣＣＣＧＴＧ ＧＡＡ
プライマーＤ ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧ ＧＣＣＡＧＴ（Ｍ１３）
（配列番号２６〜２９）。この２つの反応からの産物を、アガロースゲル電気泳動によって精製し、そして第３の反応のためのプライマーとして使用した。プライマーＡおよびＤもまた、所望の産物を増幅（ａｍｐｌｙ）するために第３の反応に添加した。この最終反応産物を、Ｅｃｏ ＲＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩで消化し、そしてアガロースゲル電気泳動によって精製した。このＰＣＲフラグメントをｐＵＣ １８にクローニングし、そして正確なＰＣＲ産物を同定するために配列決定した。
【００７６】
（タンパク質の発現）
この−ＮＧＦ融合タンパク質の各々についての完全な遺伝子を、ｐＵＣ１８から消化して切り出し、そして発現ベクターｐＥＴ１４ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）に連結した。この発現ベクターを、発現宿主ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳへと形質転換し、融合タンパク質発現の厳密な調節を可能にした。この融合タンパク質を、これらが中間対数（ｍｉｄ−ｌｏｇ ｐｈａｓｅ）増殖期（６００ｎｍでの光学密度０．４〜０．６）に達するまでＥ．ｃｏｌｉを増殖し、次いで培養培地への０．４ｍＭのＩＰＴＧの添加によってタンパク質発現を誘導することによって、発現した。この細菌を、２時間後に、５５００×ｇでの遠心分離によって収集した。収集後、この細胞を、１／１０培地容量の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ，２５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０に懸濁した。リゾチーム（０．４ｍｇ／ｍＬ）およびＤＮａｓｅ（５ｎｇ／ｍＬ）を、この収集した細胞に添加し、そしてこの溶液を３７℃で３０分間インキュベートした。この封入体を、１０，０００×ｇの遠心分離１５分によって細胞溶解物から収集した。この封入体を含むペレットを、６Ｍのグアニジン塩酸塩（ＧｕＨＣｌ）を含む４０ｍＬ／リットルの培地容量の結合緩衝液５ｍＭ イミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ，ｐＨ７．９）中、室温で９０分間再懸濁した。この溶液中の不溶性物質を、２０，０００×ｇでの遠心分離２０分によって収集し、そして溶解した融合タンパク質を含む上清を、さらなる精製のために保管した。
【００７７】
（タンパク質の精製）
この融合タンパク質は、このタンパク質のＮ末端に精製のためのトロンビン切断可能ヒスチジンタグを有した。なぜなら、−ＮＧＦ融合タンパク質のための遺伝子は、ｐＥＴ１４ｂのＮｄｅ Ｉ部位とＢａｍ ＨＩ部位との間に挿入さるためである。ニッケル親和性クロマトグラフィーを使用して、この−ＮＧＦ融合タンパク質を精製した。Ｈｉｓ ＢｉｎｄＴＭ樹脂（Ｎｏｖａｇｅｎ）をクロマトグラフィーカラムにパッキングし（１リットルの培地容量当り２．５ｍＬの吸着床容量）、Ｎｉ＋＋を充填し、そして６ＭのＧｕＨＣｌを含む結合緩衝液で平衡化した（製造者の指示に従って）。融合タンパク質を含む上清を、５μｍのシリンジフィルタで濾過し、そしてこのカラムにロードした。このカラムを、８Ｍの尿素を含む１０カラム容量の結合緩衝液、および８Ｍの尿素を含む６カラム容量の洗浄緩衝液（２０ｍＭ イミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ７．９）で洗浄した。この融合タンパク質を、８Ｍの尿素を含む４カラム容量の溶出緩衝液（１Ｍ イミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ７．９）で溶出した。この溶出画分中の−ＮＧＦ融合タンパク質の存在を、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ＰＡＧＥによって確認した。
【００７８】
（タンパク質の再折り畳み）
５倍過剰の氷冷折り畳み緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭの還元グルタチオンおよび０．２ｍＭの酸化グルタチオン、ｐＨ８．０）を、この精製−ＮＧＦ融合タンパク質に、１．３Ｍの最終尿素濃度が達成されるまでゆっくりと添加することによって、−ＮＧＦ融合タンパク質を折り畳みした。この融合タンパク質を、攪拌しながら４℃で４８時間再折り畳みした。この再折り畳み融合タンパク質を、１０％のグリセロールを含む５０倍過剰の貯蔵緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に対して、４℃で一晩透析した。この融合タンパク質を、ＶｉｖａｓｐｉｎＴＭコンセントレータ（５０００ＭＷのカットオフ、Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＵＫ）を使用する遠心分離によって、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイで測定する場合に約３００〜４００μｇ／ｍＬの濃度まで濃縮した。
【００７９】
（−ＮＧＦ融合タンパク質のフィブリンマトリクスへの取り込み）
フィブリンマトリクスへの−ＮＧＦ融合タンパク質の取り込みの効率を決定するために、ＴＧ−Ｐｉ−ＮＧＦ融合タンパク質をビオチンで標識して、直接酵素連結免疫吸収アッセイ（ＥＬＩＳＡ）による−ＮＧＦの定量化を可能にした。２０倍モル過剰のスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）ＬＣビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｌａｕｓａｎｎｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中の１０ｍｇ／ｍＬビオチンのストック溶液（３７℃で１０分間溶解した）からの１ｍｇ／ｍＬの濃度で、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ、０．０１Ｍ リン酸緩衝液、８ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、０．２ｇ／Ｌ ＫＣｌ、ｐＨ７．４）中の−ＮＧＦ融合タンパク質に添加した。この反応を、室温で２時間進めた。次いで、未反応のビオチンを、ＰＤ−１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｄｕｂｅｎｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用するゲル濾過クロマトグラフィーによって除去した。
【００８０】
既知量の標識された−ＮＧＦを、コーティング緩衝液（０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８）中、４℃で一晩９６ウェルプレートに吸着させた。このウェルを、ＰＢＳ中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で２時間、室温でブロックした。このウェルを、０．５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ緩衝液）中で３回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合体化したストレプトアビジンを、ＰＢＳ中で１μｇ／ｍＬまで希釈し、そして各ウェルに１時間添加した。このウェルを、ＰＢＳＴ緩衝液で３回洗浄し、次いでＡＢＴＳ（２，２’−アジノ（Ａｚｉｎｏ）−ビス（３−エチルベンズ−チアゾリン−６−スルホン酸））展開溶液（０．１Ｍ ＮａＣ２Ｈ３Ｏ２、０．０５Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４、０．１％ ＡＢＴＳ、０．０１％ Ｈ２Ｏ２、ｐＨ４．２）中でインキュベートした。１〜５分後、この反応を、等量の０．６％ ＳＤＳの添加によって停止し、そして各ウェルの吸光度を、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，Ｖｅｒｍｏｎｔ）のＥＬ３１１ＳＸプレートリーダーを使用して４０５ｎｍで測定した。４０５ｎｍの吸光度に対する−ＮＧＦ濃度の標準曲線を、直接ＥＬＩＳＡアッセイからのこれらの測定を使用して作成した。
【００８１】
プラスミノーゲンを含まないフィブリノーゲンを水に溶解し、そしてＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ，３３ｍＭ Ｔｒｉｓ、８ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、０．２ｇ／Ｌ ＫＣｌ）、ｐＨ７．４に対して２４時間透析した。−ＮＧＦ融合タンパク質を、５ｍＭ Ｃａ＋＋および４ ＮＩＨ単位／ｍＬのトロンビンと共に３７℃で１時間インキュベートして、精製に使用したヒスチジンタグを除去した。この−ＮＧＦ融合タンパク質溶液を、８ｍｇ／ｍＬの濃度のフィブリノーゲンと同じ比率で混合し、そして３７℃で６０分間重合した。フィブリンマトリクスを、２４時間にわたって５回洗浄し、そして各洗浄液を、このマトリクスから洗浄された−ＮＧＦの総量を決定するために保管した。２４時間後、−ＮＧＦを含むフィブリンマトリクスを、０．１Ｕのブタプラスミンで分解した。洗浄液中の−ＮＧＦおよびマトリクスに残っている−ＮＧＦの量を、直接ＥＬＩＳＡによって上記のように定量し、そして−ＮＧＦ標準曲線を、実施した各ＥＬＩＳＡについて作成した。
【００８２】
−ＮＧＦ融合タンパク質がフィブリンマトリクスに共有結合していることを直接示すために、ウエスタンブロットを行った。フィブリンマトリクスを作製し、そして取り込み定量アッセイにおいて記載したように洗浄した。このマトリクスを、上記のように、２４時間かけて５回洗浄し、次いでプラスミンで分解した。この分解産物を、１３．５％変性ゲルを使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。このゲルからのタンパク質を、活性化したＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−ＰＴＭポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｖｏｌｋｅｔｓｗｉｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に、４００ｍＡの電流を用いて１時間かけて移した。この膜を一晩乾燥した。膜に移したタンパク質（分子量マーカーを含む）を、０．２％のＰｏｎｃｅａｕ Ｓで染色することによって可視化した。この膜に結合した非特異的タンパク質を、ＴＢＳ中の３％ ＢＳＡで２時間ブロックした。この膜を、３％ＢＳＡ中０．２μｇ／ｍＬの濃度のヤギ抗ヒト−ＮＧＦ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）と共に１時間インキュベートした。この膜を、ＴＢＳで５分間かけて３回洗浄し、そして二次抗体、３％ ＢＳＡ中０．５μｇ／ｍＬの濃度のＨＲＰ結合体化ウサギ抗ヤギ免疫グロブリン（Ｄａｋｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｚｕｇ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）と共に３０分間インキュベートした。この膜をＴＢＳで３回洗浄し、次いでＴＢＳ中で１：５に希釈した増感した化学発光ＨＲＰ基質（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｌａｕｓａｎｎｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）と共に５分間インキュベートした。この膜から過剰の液体を除去し、そしてこれをプラスチックで覆い、そしてＸ線フィルムに５〜６０秒間曝露した。
【００８３】
フィブリンマトリクスの重合の間に存在する−ＮＧＦ融合タンパク質についての分子量の増加が実際に観察されたが、架橋基質を欠く−ＮＧＦの場合、洗浄後このマトリクスには−ＮＧＦは観察されなかった。この結果は、ＮＧＦ融合タンパク質が、第ＸＩＩＩａ因子のトランスグルタミナーゼ活性を介して、重合の間にフィブリンマトリクスに共有結合的に固定されたことを直接示した。
【００８４】
（固定化−ＮＧＦ融合タンパク質の生理活性）
共有結合的に固定された−ＮＧＦ融合タンパク質が制御された様式で誘導される能力を決定するために、−ＮＧＦ融合タンパク質を、重合の間にフィブリンマトリクスに組み込み、そしてこれらのマトリクスがインビトロで神経突起の伸長を増大する能力を、ニワトリＤＲＧを使用してアッセイした。ＴＧ−Ｐ−ＮＧＦは、この培養培地にＮＧＦが存在しない未改変フィブリンに対して３５０％を超えて神経突起伸長を増大すること、および培地にネイティブの１０ｎｇ／ｍＬのＮＧＦを含む未改変フィブリンよりも５０％増大することを見出した（図３）。ＴＧ−Ｐｉ−ＮＧＦ（これは、非機能的プラスミン基質を含む）は、プラスミンによってネイティブの形態ではフィブリンマトリクスから切断され得ず、そして試験した濃度のいずれかでフィブリンマトリクス内に共有結合的に固定される場合、培養培地中のネイティブのＮＧＦに対して有意な神経突起の伸長の増大を起こさなかった。しかし、ＴＧ−Ｐ−ＮＧＦ（これは、機能的プラスミン基質を含む）は、プラスミンによってネイティブのＮＧＦに非常に類似した形態でこのマトリクスから切断され得、そして培養培地に存在するネイティブのＮＧＦの同様の用量と比較した場合でさえも、神経突起の伸長の増大が観察された。ＴＧ−Ｐ−ＮＧＦ融合タンパク質についての用量応答効果を観察し、１〜５μｇ／ｍＬの−ＮＧＦ融合タンパク質が重合混合物に存在する場合に、最適な用量を達成した。これらの結果は、ＴＧ−Ｐ−ＮＧＦ融合タンパク質が、フィブリンマトリクス内に固定される場合に生理活性を有することを実証し、これは、このタンパク質が細胞関連マトリクス分解によって活性な形態で放出され得ることを示唆する。ＰＣ１２細胞活性アッセイにおける−ＮＧＦ融合タンパク質の低い活性にもかかわらず、プラスミン分解可能な−ＮＧＦ融合タンパク質がフィブリンに共有結合される場合、これは培養培地中のネイティブのＮＧＦの同じ用量よりも神経突起の伸長のより高いレベルを促進した。これらの結果はまた、−ＮＧＦ融合タンパク質が完全に活性化されていることを示唆し、これらはそのネイティブの構造に類似の形態でフィブリンマトリクスから放出されているに違いない。
【００８５】
（−ＮＧＦ融合タンパク質架橋の効率）
フィブリンマトリクスへの−ＮＧＦ融合タンパク質の取り込みの効率を決定するために、このタンパク質をビオチンで標識し、そして重合混合物中にビオチン標識された−ＮＧＦ融合タンパク質を含むフィブリンマトリクスについて直接ＥＬＩＳＡを行った。ビオチン標識された−ＮＧＦ融合タンパク質を、重合の間にフィブリンマトリクス中に取り込んだ。任意の未結合−ＮＧＦ融合タンパク質を除去するために洗浄した後、このマトリクスをプラスミンで分解し、そして分解したマトリクス中の−ＮＧＦおよび洗浄液中の−ＮＧＦの量を定量した。フィブリンマトリクス中に取り込まれた−ＮＧＦ融合タンパク質のパーセンテージは、重合混合物における−ＮＧＦの濃度の関数として図４に示される。試験した−ＮＧＦ融合タンパク質の濃度範囲にわたって、融合タンパク質のうち５０〜６０％が、フィブリンマトリクスの重合の間に取り込まれた。この結果は、ＮＧＦ融合タンパク質が、第ＸＩＩＩａ因子の作用を介してフィブリンマトリクスに効率的に取り込まれることを実証した。
【００８６】
（ヘパリン結合メインおよびプラスミン分解部位を有する−ＮＧＦ融合タンパク質）
ＮＧＦは、Ｅ．ｃｏｌｉ中で融合タンパク質として発現され得、これは、ヘパリン結合ドメインをＮ末端に、プラスミン基質を中央に、そしてＮＧＦ配列をこのタンパク質のＣ末端に含む。これは、所望の融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む合成遺伝子を構築することによって達成される。発現のためのこのタンパク質配列は、以下の通りである：
【００８７】
【表７】
（配列番号３０）、ここで、斜体の領域は、発現ベクター由来のヒスチジンタグであり、そして下線を引かれた領域は、トロンビン切断部位である。破線での下線は、ヘパリン結合配列を示し、そして二重下線は、プラスミン基質を示す。
【００８８】
遺伝子構築のために使用したクローニングプラスミドは、ｐＵＣ １８であった。この遺伝子のＤＮＡ配列は、５’から３’で以下の通りである：
【００８９】
【表８】
（配列番号３１）。
【００９０】
この遺伝子を、マップに示されるように、ｐＵＣ １８のポリリンカークローニング領域においてＥｃｏＲＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入する。
【００９１】
構築後、この遺伝子を発現ベクターに挿入する。次いで、発現および精製を、上記のように行う。
【００９２】
（実施例４：自発的にヘパリンに結合する増殖因子の融合タンパク質）
（Ａ．ＮＧＦとの第ＸＩＩＩａ基質融合タンパク質の生合成）
ＮＧＦは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて融合タンパク質として発現され得、タンパク質のＮ末端に第ＸＩＩＩａ因子基質およびタンパク質のＣ末端にヒト−ＮＧＦ配列を含む。これは、所望の融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む合成遺伝子を構築することにより達成される。この発現されるタンパク質配列は以下のようなものである。
【００９３】
【表９】
ここで、イタリック体の領域は、発現ベクター由来のヒスチジンタグであり、そして下線の領域は、トロンビン切断部位である。これらの残基は、第ＸＩＩＩａ因子に対する架橋基質配列である。
【００９４】
遺伝子構築に用いられたクローニングプラスミドは、ｐＵＣ１８（これは、ポリリンカークローニング領域の配列が逆であることを除いてｐＵＣ１９と同一である）であった。Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから入手したｐＵＣ１９のマップを以下に示す。この遺伝子のＤＮＡ配列は、５’から３’に向かって以下のような配列である。
【００９５】
【表１０】
この遺伝子は、マップに示されるように、ｐＵＣ１８のポリリンカークローニング領域中のＥｃｏＲＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されている。遺伝子構築後、この遺伝子を、発現ベクターｐＥＴ １４ｂのＮｄｅＩ部位とＢａｍＨＩ部位との間に挿入する。Ｎｏｖａｇｅｎから入手したｐＥＴ １４ｂベクターのマップを以下に示す。この遺伝子の発現ベクターへの挿入後、プラスミドをＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳコンピテント細胞中に形質転換する。この細胞を、約０．６のＯＤに達するまで増殖させ、次いでＩＰＴＧ（溶液中の最終濃度０．４ｍＭ）を用いて融合タンパク質の発現を誘導する。発現を２〜３時間継続する。この細胞を５分間氷上に静置し、次いで４℃にて５分間、５０００×ｇでの遠心分離により収集する。それらを、０．２５培養容量の冷５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に２５Ｃにて再懸濁する。これらの細胞を前回と同様に遠心分離し、ペレットを凍結する。細胞を解凍の際に溶解させる。
【００９６】
この細胞溶解物を遠心分離し、上清を廃棄する。ペレットをＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００に再懸濁する。次いで、この溶液を遠心分離し、上清を廃棄する。ペレットを６Ｍ尿素に再懸濁し、そして融合タンパク質をヒスチジンアフィニティークロマトグラフィーにより精製する。ヒスチジンタグを重合の間にトロンビンにより切断し得、そして標準的な洗浄手順の間にゲルから洗浄し得る。
【００９７】
（Ｂ．ＮＧＦのヘパリン結合ドメイン融合タンパク質の生合成）
ＮＧＦを、タンパク質のＮ末端にヘパリン結合ドメインおよびタンパク質のＣ末端にＮＧＦ配列を含む融合タンパク質としてＥ．ｃｏｌｉにおいて発現し得る。これを、所望の融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む合成遺伝子を構築することにより達成する。この発現されるタンパク質配列は、以下のようなものである。
【００９８】
【表１１】
ここで、イタリック体の領域は、発現ベクター由来のヒスチジンタグであり、そして下線の領域は、トロンビン切断部位である。点線で下線を引いた領域は、ヘパリン結合配列である。
【００９９】
遺伝子構築に用いられたクローニングプラスミドはｐＵＣ１８であった。この遺伝子のＤＮＡ配列は、５’から３’に向かって以下のような配列である。
【０１００】
【表１２】
この遺伝子は、マップに示されるように、ｐＵＣ１８のポリリンカークローニング領域中のＥｃｏＲＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されている。構築後、この遺伝子を、発現ベクターに挿入する。次いで、発現および精製を、上記のように実施する。
【０１０１】
（実施例５：ヘパリン親和性の二ドメインペプチドを有するフィブリンマトリクスからのＢＭＰ２の送達）
フィブリンマトリクスに結合した骨形成因子がこの因子の放出を制御し得ること、およびこのマトリクスが移植される場合、皮下での異所性の骨が形成されることが実証された。この手順は骨欠陥における骨形成と異なるが、生理活性増殖因子のインビボでの放出を制御する能力を試験するための適切な方法を提供する。
【０１０２】
フィブリンゲルを、配列ＬＮＱＥＱＶＳＰＫ（Ａ）ＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲＫＡ（配列番号３６）を有する異なる二ドメインペプチドを用いて合成した。このペプチドは、第１のドメインにおける２−プラスミンインヒビターについての第ＸＩＩＩａ因子基質配列および第２のドメインにおける抗トロンビンＩＩＩのヘパリン結合ドメインの模倣物に由来する。ＢＭＰ−２はヘパリン結合タンパク質であり、そして上記の配列に結合する。ゲルをペプチド（１ｍＭ）、ヘパリン、および組換えヒトＢＭＰ−２の存在下（ヘパリン：ＢＭＰ−２の比が１：１および４０：１）で重合した。
【０１０３】
等量の形態形成タンパク質、ＢＭＰ−２を有するが、ヘパリンおよび二ドメインペプチドを欠くコントロールゲルを作製した。次いで、これらのゲルを、ラットに皮下移植し、そして２週間維持した。マトリクスを取り出したとき、ペプチド−ヘパリン放出系を含まなかったゲルから骨はほとんどから全く観察されなかったが、この系を含んだゲルは有意な骨形成を示した。
【０１０４】
これは、取り出されたマトリクスの質量において最も見出された。これを表３に示す。
【０１０５】
【表１３】
この放出系は、マトリクス内での異所性の骨の形成を増強し、このことは、インビボでの放出系の可能性を実証する。
【０１０６】
（実施例６：外因性第ＸＩＩＩ因子を用いたペプチドの組込み）
標準的な沈殿方法を通じて獲得した精製フィブリノーゲンは、二ドメインペプチドの組込みにおける制限因子（ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ）として作用する少量の内因性第ＸＩＩＩａ因子を含む。これを、精製フィブリノーゲンを用いて実証した。内因性第ＸＩＩＩａ因子の濃度に基づき、８．２ｍｏｌペプチド／ｍｏｌフィブリノーゲンまでの濃度での二ドメインペプチドの組込みが可能であった。外因性第ＸＩＩＩａ因子の添加が、ペプチド組込みのレベルを増強することを実証した。これは特に、ゲル内の二ドメインペプチド濃度の制御に関係し、次に細胞接着にも影響をおよぼし、そしてヘパリンおよび増殖因子の組込みに対する上限も決定する。いくつかの場合、標準的な精製フィブリノーゲンを用いて可能な増加を超えて、細胞接着、ヘパリンの濃度、または増殖因子の濃度が増加することが利点であり得る。
【０１０７】
プールされた血漿から精製された外因性第ＸＩＩＩ因子を用いて、二ドメインペプチド（ｄＬＮＱＥＱＶＳＰＬＲＧＤ（配列番号１））をゲル中に組込んだ。１Ｕの外因性第ＸＩＩＩ因子をフィブリンゲル１ｍＬ当たりに添加し、そして共有結合的に組込まれた二ドメインペプチドのレベルを、クロマトグラフィー分析を通して分析した。この結果を表５に示す。１Ｕ／ｍＬの外因性第ＸＩＩＩ因子を添加した場合、組込みのレベルは２５ｍｏｌペプチド／ｍｏｌフィブリノーゲンに達した。この組込みのレベルは、可能な結合部位の数に基づく理論的な限界に近い。
【０１０８】
市販のフィブリン接着キットに組込まれる二ドメインペプチド（ｄＬＮＱＥＱＶＳＰＬＲＧＤ（配列番号１））の能力もまた、実証した。Ｔｉｓｓｕｃｏｌキットを入手し、次いで複数のサンプルに分画した。外因性の二ドメインペプチドを６ｍＭまで添加し、そして組込みのレベルをクロマトグラフィー分析を通して分析した（図６）。ペプチド組込みのレベルを、３つの別々のキットについて広範囲の二ドメインペプチドの初期濃度にわたって試験した。組込みのレベルを測定した場合、最大組込みが５ｍＭよりも大きい外因性ペプチドの濃度で生じたことが観察された。それは、これらの高密度マトリクスにおいて、拡散が組込みのプロセスにおいて役割を果たしはじめていることであり得る。しかし、非常に高レベルの組込みが、少なくとも２５ｍｏｌペプチド／ｍｏｌフィブリノーゲンに達するレベルで観察された。さらに、広範囲の存在する可能性のあるタンパク質濃度を有するフィブリン接着キットの組成物において有意な可能性が存在する。しかし、これは、明らかに、二ドメイペプチドの組込みに有意に影響を及ぼさず、組込みのプロフィールは、試験された３つのキット全てについて同様であった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
架橋したマトリクス。
【請求項１】
架橋したマトリクス。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１０−２３９９６４（Ｐ２０１０−２３９９６４Ａ）
【公開日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−６７０１０（Ｐ２０１０−６７０１０）
【出願日】平成２２年３月２３日（２０１０．３．２３）
【分割の表示】特願２００１−５８０９４６（Ｐ２００１−５８０９４６）の分割
【原出願日】平成１２年５月１日（２０００．５．１）
【出願人】（５０１０７９０２６）
【出願人】（５０１３９３９６６）ウニヴェルジテート・チューリッヒ (13)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＡＥＴ ＺＵＥＲＩＣＨ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月２３日（２０１０．３．２３）
【分割の表示】特願２００１−５８０９４６（Ｐ２００１−５８０９４６）の分割
【原出願日】平成１２年５月１日（２０００．５．１）
【出願人】（５０１０７９０２６）
【出願人】（５０１３９３９６６）ウニヴェルジテート・チューリッヒ (13)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＡＥＴ ＺＵＥＲＩＣＨ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]