結合分子結合酵素アッセイによる分析物の検出
分析物を検出および定量するための方法、キットおよび組成物が提供される。典型的には、本方法では、分析物特異的結合剤と分析物との間で複合体が形成される。分析物特異的結合剤は、結合分子および分析物の存在を示すＰＣＲ鋳型を生成する活性を有する酵素を含んでいる。ＰＣＲ鋳型の増幅および検出は、分析物濃度の感受性および定量的測定を生じさせる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジーの分野に関する。より詳細には、本発明は、分析物を検出および定量するための、例えばリガーゼ、トポイソメラーゼ、または逆転写酵素などの酵素へ結合した結合分子を有する分析物特異的結合剤を用いる、便宜的で高速かつ感受性の方法、組成物、およびキットに関する。分析物が結合分子に結合すると、酵素は、核酸増幅反応のための鋳型を生成するための手段を提供する。増幅産物の存在の検出は、サンプル中に分析物が存在することを表示する。
【背景技術】
【０００２】
イムノアッセイの開発および核酸検出における進歩は、生物学的サンプル中の分析物の検出を前進させてきた。酵素結合免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、サンプル中のタンパク質の存在についてのサンプルの高スループット・スクリーニングを許容する。分析物の存在は、アルカリ・ホスファターゼまたはホースラディッシュ・ペルオキシダーゼをベースとする酵素的比色アッセイの使用によって検出されることが多い。これは酵素基質の比色変化の検出範囲に依存してアッセイの感受性および範囲を制限する。これには、血清中の分析物のおおよその量を決定するための初期スクリーニング、またはサンプルが使用される特定方法および試薬の検出範囲内で試験されることを保証するために、広範囲の連続する希釈率の使用のいずれかを必要とする。この方法に関するその他の問題には、高いバックグラウンドレベルならびに低感受性が含まれる。例えば、ＥＬＩＳＡプレートへのホースラディッシュ・ペルオキシダーゼの直接結合は、非特異的バックグラウンドシグナルを生じさせる。非特異的結合を減少させるために、比較的に不活性のタンパク質（乳汁または血清アルブミン）を含有するブロッキング溶液がアッセイに加えられる。しかし、バックグラウンドシグナルを生じさせる非特異的結合は排除されないので、それによってアッセイは低感受性となる。
【０００３】
これらの制限に対応するために、酵素に基づくサンプル中の分析物の検出と結び付けて使用するための核酸に基づく検出方法が開発されてきた。このような方法は、時々はイムノ−ＰＣＲと呼ばれている。
【０００４】
例えば、特許文献１は、特異的タンパク質を検出する感受性を増加させるために、抗体の検出とポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）とを結び付けている。標準的イムノ−ＰＣＲプロトコールでは、核酸配列に結合した抗体は、抗原分子上のエピトープに結合する。抗体と核酸との結合は、核酸および抗体に対して二重特異性親和性を備えるリンカーを介して発生するので、このため特異的抗原−抗体−ＤＮＡコンジュゲートの形成を生じさせる。続いて、結合した核酸配列のセグメントはＰＣＲによって増幅させられ、ＰＣＲ産物はゲル電気泳動法によって検出される。しかし、ＤＮＡを抗体へ結合させる工程は、ＤＮＡが付着性であり、任意の未結合ＤＮＡは検出前にシステムから容易に洗浄されないために、アッセイにおける非特異的結合および高いバックグラウンドを生じさせるので、問題が多い。
【０００５】
その他のイムノ−ＰＣＲアッセイおよび方法は、例えば、非特許文献１、特許文献２および特許文献３；特許文献４；特許文献５および特許文献６に記載されている。特許文献２および特許文献３、特許文献４、および特許文献５は、それらの各々がオリゴヌクレオチドに連結している、少なくとも第１および第２分析物結合化合物（例えば、抗体など）を用いる方法を含んでいる。化合物が分析物に結合すると、オリゴヌクレオチドは近接近させられ、そこでこれらは相互作用して、増幅反応工程後に検出可能な核酸複合体を形成することができる。しかしこれらの方法はいずれも、結合化合物を酵素とは連結させない。むしろこれらの方法は全部が、相違するオリゴヌクレオチドに連結した２つ以上の結合化合物の使用を必要とする。さらに、オリゴヌクレオチドの小さな部分が、特別にはバックグラウンドシグナルに起因して、結合化合物の濃度が上昇するにつれて分析物の非存在下で相互作用する可能性がある。
【０００６】
特許文献５は、１）例えばオキシダーゼなどの開裂誘導成分を有し、複合体内で第１タンパク質に対して特異的である第１プローブと、２）複合体内で１つ以上の第２タンパク質に対して特異的な１つ以上の結合化合物とを用いるイムノ−ＰＣＲアッセイについて記載している。第１プローブおよび１つ以上の結合化合物が複合体と結合し、近接近させられると、開裂プローブは、結合化合物に結合した分子標識を開裂する、一重項酸素などの活性種を生成するように誘導される。放出された分子標識は、サンプル中の分子複合体のプロファイルを提供するために分離かつ検出される。極めて様々な分離技術を使用すると、物理的、化学的または光学的相違に基づいて当該の分子標識を識別することができる。しかし、このシステムで使用される分子標識は、開裂誘導成分による開裂に感受性でなければならない。
【０００７】
特許文献７は、核酸分子を修飾することのできるホスファターゼなどの酵素を検出するための方法について記載している。ホスファターゼがサンプル中に存在する場合は、ホスファターゼは標的核酸分子から５’末端リン酸塩を除去し、それによりエキソヌクレアーゼ消化から標的核酸を保護するであろう。エキソヌクレアーゼ処理および任意の増幅反応工程後の標的核酸の検出は、サンプル中のホスファターゼの存在を指示している。この方法は抗体もしくはその他の結合成分に結合したＤＮＡを含むプローブの使用を回避するが、その教示はホスファターゼ活性を有する酵素の検出に限定される。さらに、検出された酵素は、核酸分子を直接的に修飾することができなければならない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第５，６６５，５３９号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００２／００６４７７９号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００５／０００３３６１号明細書
【特許文献４】米国特許第６，５１１，８０９号明細書
【特許文献５】国際公開第２００５／０１９４７０号パンフレット
【特許文献６】国際公開第２００７／０４４９０３号パンフレット
【特許文献７】米国特許出願公開第２００６／０２５７８７９号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｎｉｅｍｅｙｅｒら、（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．３１：ｅ９０，２００３）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本開示は、分析物特異的結合剤を用いてサンプル中の分析物を検出および定量するための方法、キット、および組成物を提供する。分析物特異的結合剤は、例えば、リガーゼ、トポイソメラーゼ、または逆転写酵素などの酵素に結合した分析物特異的結合分子を含んでいる。分析物特異的結合剤は、使用される特異的結合分子に対応する分析物を検出するために分析物特異的結合剤を分析物に結合させるための条件下で、サンプルとともにインキュベートされる。結合した分析物特異的結合剤は、１つ以上のポリヌクレオチドと、分析物特異的結合剤中の酵素に依存して、酵素が核酸増幅反応のための鋳型を生成することを許容する条件下でインキュベートされる。鋳型は、好ましくは、増幅産物を形成するために使用できるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のための鋳型である。増幅産物の存在の検出は、サンプル中に分析物が存在することを表示する。定量的増幅反応は、サンプル中の分析物の量を定量するために実施できる。これらの方法、組成物、およびキットは、特異的結合対結合反応（例、免疫検出法）と触媒反応（例、酵素に基づく検出系）の感受性とを結び付ける。これらはさらに、市販の系において見られる様々なバックグラウンドの起源を減少または排除する２工程結合／検出プロセスを許容することによって、市販の系全体のバックグラウンドレベルの減少を許容する。
【００１１】
１つの態様においては、サンプル中の分析物を検出するための方法であって、分析物特異的結合剤を、結合を許容する条件下で分析物を含有する可能性があるサンプルと接触させる工程による方法が提供される。分析物特異的結合剤は、リガーゼ活性を有する酵素に結合した分析物特異的結合分子を含んでいる。リガーゼ活性は、トポイソメラーゼまたはリガーゼのいずれかから引き出すことができる。結合した分析物特異的結合剤は、さらにリガーゼ活性のために基質とインキュベートされる。基質は、少なくとも１つの二本鎖ＤＮＡ分子の第１および第２末端を含んでおり、末端は、増幅鋳型を形成するために（例、ライゲーション混合物中で）ライゲーションを許容する条件下で相互にアニーリングしてライゲートされることのできる適切な付着末端である。これらの末端は、少なくとも１つの二本鎖ＤＮＡ分子によって、少なくとも２つの別個の二本鎖ＤＮＡ分子によって、または少なくとも１つの二本鎖ＤＮＡ分子および１つの一本鎖核酸分子によって提供することができる。ライゲーション混合物の少なくとも一部分は、増幅産物を少なくとも１つのｄＮＴＰ、好ましくは全４つのｄＮＴＰ、およびポリメラーゼの存在下で生成することを許容する方向において鋳型の反対側の鎖へハイブリダイズする少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーを含む増幅反応混合物中においてインキュベートされる。増幅産物は、分析物がサンプル中に存在するかどうかを決定するための増幅反応中および／または後に検出される。増幅産物は、ｑＰＣＲまたは他の方法による増幅中に検出することができる。
【００１２】
また別の態様においては、サンプル中の分析物を検出するための方法であって、分析物特異的結合剤を、分析物の結合を許容する条件下でサンプルとともにインキュベートする工程による方法が提供されるが、このとき分析物特異的結合剤は、逆転写酵素に結合した分析物特異的結合分子を含んでいる。結合した分析物特異的結合剤は、さらに逆転写反応混合物中で基質として機能できるＲＮＡ分子とインキュベートされると、順に核酸増幅のための鋳型として機能できるｃＤＮＡを形成する。逆転写反応混合物の少なくとも一部分は、好ましくは少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーを含む増幅反応混合物中でインキュベートされる。プライマーは、１つは相補鎖の重合を許容するためにｃＤＮＡにハイブリダイズでき、１つはｃＤＮＡの相補鎖へハイブリダイズできるように設計される。プライマーは、少なくとも１つのｄＮＴＰ、好ましくは全４つのｄＮＴＰ、およびポリメラーゼの存在下で生成することを許容する方向において、ｃＤＮＡおよび相補鎖へハイブリダイズするように設計される。増幅産物は、分析物がサンプル中に存在するかどうかを決定するための増幅反応中および／または後に検出される。増幅産物は、ｑＰＣＲまたは他の方法によって増幅中に検出することができる。
【００１３】
さらに別の態様においては、本明細書に開示した方法を実践するためのキットおよび組成物が提供される。キットおよび組成物は、例えば、トポイソメラーゼ、リガーゼ、または逆転写酵素などの酵素に結合した分析物特異的結合分子を含む分析物特異的結合剤、酵素成分のための１つ以上のポリヌクレオチド基質、およびそれらのためのパッキング材料を含むことができる。本キットもしくは組成物は、例えば逆転写酵素、ＰＣＲ用試薬、特別にはｑＰＣＲなどの核酸増幅反応工程のための１つ以上の試薬、およびプライマーをさらに含むことができる。分析物特異的結合剤の代わりに、本キットもしくは組成物は、例えば抗体などの分析物特異的結合成分へ結合するための基を有する酵素を含むことができる。例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、またはプロテインＬに結合した酵素は、最終使用者が分析物特異的結合剤を形成するために抗体と混合することができる。または、酵素は、ストレプトアビジンもしくはアビジンに結合させ、他の起源（例、市販されているかまたは実験室で生成する）から入手したビオチン化抗体と混合することができる。以下では、分析物特異的結合分子および酵素を相互に結合させるためのその他の方法について考察する。
【００１４】
また別の態様においては、分析物特異的結合分子および酵素を含む分析物特異的結合剤が提供される。分析物特異的結合剤は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、レクチン、細胞表面受容体、受容体リガンド、ペプチド、炭水化物、アプタマー、ビオチン、ストレプトアビジン、アビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、およびプロテインＬ、ならびにそれらの任意の結合フラグメントからなる群から選択される分析物特異的結合分子を含むことができる。酵素は、トポイソメラーゼ、リガーゼ、逆転写酵素、アデニングアニン・アルキルトランスフェラーゼ、メチルトランスフェラーゼ、リコンビナーゼ類、例えばＣｒｅリコンビナーゼλ−インテグラーゼ、φＣ３１−リコンビナーゼまたはｆｌｐ−リコンビナーゼ、およびポリヌクレオチドキナーゼを含むことができる。
【００１５】
また別の態様においては、分析物を検出するための方法、キット、および組成物が提供されるが、このとき２つ以上の分析物特異的結合剤と分析物との間で複合体が形成される。この態様では、各分析物特異的結合剤は、分析物特異的結合分子およびそれに結合した酵素の一部分を含んでいる。酵素の部分は相互作用して、分析物特異的結合剤が分析物に結合すると、機能的酵素複合体を形成する。機能的酵素複合体は、次にサンプル中における分析物の存在および／または量の指標である検出可能なシグナルを生成する。所定の実施形態においては、酵素は、リガーゼ、トポイソメラーゼ、または逆転写酵素である。そこで、本出願に記載した方法、キット、および組成物では、酵素に結合した分析物特異的結合分子は、各々が分析物特異的結合分子および酵素の一部分を含む２つ以上の分析物特異的結合剤と、酵素の部分が相互作用して分析物特異的結合剤が分析物へ結合すると機能的酵素複合体を形成するように、置換することができる。
【００１６】
所定の態様においては、第１および第２結合分子は、抗体（またはその抗原結合フラグメント）を含んでいる。１つの実施形態においては、抗体は、例えば融合タンパク質として、酵素へ直接的に連結または結合している。他の実施形態においては、抗体は、例えばビオチン−ストレプトアビジンまたはビオチン−アビジン相互作用などのビオチン−結合相互作用を通して、酵素へ間接的に連結または結合している。
【００１７】
１つの態様においては、抗体などの分析物特異的結合分子は、スペーサ分子によって酵素から分離されている。同様に、酵素が抗体などの分析物特異的結合成分へ結合または連結するための基（例、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、ビオチン、ストレプトアビジン、またはアビジン）を有する１つの実施形態においては、酵素は、スペーサ分子によって基から分離することができる。複数の実施形態においては、スペーサ分子は、ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質、ポリヌクレオチド、またはその他の化学リンカーを含んでいる。スペーサ分子を用いることによって分析物特異的結合分子を酵素から分離することは、例えば融合タンパク質に対するより大きな柔軟性を提供し、結合および酵素成分の妨害されない機能を促進することに有用である。スペーサ分子は、さらにまた分割酵素成分（例、ＮおよびＣ末端部分）の相互作用および機能的酵素複合体の再構成を促進するためにも役立つ。
【００１８】
用語の定義
本明細書で使用する用語「増幅」または「合成」は、核酸配列に適用される場合は、それによって特定核酸配列の１つ以上のコピーが鋳型核酸から生成されるプロセスを意味する。本明細書で使用する「増幅」は、プライマー伸長反応によるように、核酸配列の単一複製（ｓｉｎｇｌｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ／ｃｏｐｙｉｎｇ）を含むことが意図されている。しかし一般的に、増幅は、当技術分野において周知の技術であるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）テクノロジー（Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ，Ｃ．Ｗ．ａｎｄ Ｇ．Ｓ．Ｄｖｅｋｓｌｅｒ（１９９５） ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．）を用いて実施される。さらに、本明細書に開示した方法は、鎖置換増幅法（ＳＤＡ）、回転環増幅法（ＲＣＡ）、転写媒介増幅法（ＴＭＡ）またはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）を用いて実施することができる。シグナルの増幅は、リアルタイム増幅法を用いて均質な閉管環境内で生成することができる。リアルタイム増幅法のために適切な機器類には、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製Ｍｘ３００５Ｐ、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ社製ＴａｑＭａｎシステム、Ｒｏｃｈｅ社製ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ、Ｉｄａｈｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製ＲａｐｉｄＣｙｃｌｅｒ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製ｉＣｙｃｌｅｒおよびＣｅｐｈｅｉｄ社製ＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒが含まれる。
【００１９】
本明細書で使用する「増幅産物」は、熱安定性または非熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いて重合反応によって生成されたポリヌクレオチドを意味する。好ましい実施形態においては、重合反応は、ポリメラーゼ連鎖反応である。増幅産物は、定性的または半定量的方法によって、例えばゲル電気泳動法および染色もしくはドットブロット法によって、増幅反応中および／または増幅反応後の１つ以上の時点に入手された増幅反応由来のサンプルを使用して検出することができる。増幅産物は、増幅反応を通して、例えば上述した試薬などの、多数の市販の試薬のいずれかを用いて蛍光監視により定量的ＰＣＲ法を使用して検出することができる。
【００２０】
１つの実施形態においては、指数関数的増幅は、一本鎖ポリヌクレオチド鋳型および単一プライマーを用いて達成できる。これは、一本鎖標的の一方の末端ではプライマー結合配列を、および標的鎖の反対側の末端ではプライマー結合部位の相補配列を含有するポリヌクレオチド鋳型配列を設計することによって達成される。プライマーのアニーリングおよび伸長は、同一のプライマー結合部位を含有する標的相補鎖の形成を生じさせる。この方法では、結果として生じる二本鎖標的の（＋）および（−）鎖はどちらも標的二重鎖の対向する末端で同一のプライマー部位を含有しており、ポリメラーゼおよび標的核酸と組み合わせて使用される同一プライマーは、＋および−標的鎖の両方の複製を促進する。そこで、所定の実施形態においては、本出願で考察する第１および第２プライマーは、同一プライマーであってよい。
【００２１】
本明細書で使用する用語「分析物」は、本明細書に開示した方法によって検出またはアッセイされる物質を意味する。典型的な分析物には、タンパク質、ペプチド、細胞表面受容体、受容体リガンド、核酸、炭水化物、分子、細胞、微生物およびそれらのフラグメント、またはそれに対して分析物特異的結合分子、例えば抗体を発生させることのできる任意の物質が含まれてよいが、これらに限定されない。
【００２２】
本明細書で使用する用語「分析物特異的結合剤」は、酵素の少なくとも活性部分に結合または連結した分析物特異的結合分子を有する分子を意味する。これらの部分は、例えば、単一融合タンパク質として２つの部分の発現によって、いずれのタンパク質にも自然ではない介在配列を用いて、または用いずに結合することができる。例えばプロテインＡ、Ｇ、またはＬなどの一般的抗体結合リガンドに対するコーディング配列は、酵素を分析物結合分子へ結合させるために、酵素のコーディング配列へ融合させ、抗体と混合することができる。ビオチンおよびストレプトアビジンなどの高親和性結合パートナーもまた使用できる。ビオチンは、分析物特異的結合剤のいずれかの部分に結合させることができ、アビジンまたはストレプトアビジンは相互に結合させることができる。分析物特異的結合分子、例えば抗分析物ｍＡｂ（モノクローナル抗体）は、分析物特異的結合剤を形成するために架橋剤によって酵素へ結合させることができる。タンパク質をコンジュゲート化するために当技術分野において公知の任意の架橋結合化学は、本発明と結び付けて使用できる。
【００２３】
結合部分は、結合分子が酵素の活性を実質的に妨害しない、およびその逆もまた同様であるように、酵素成分へ機能的に連結している。この連結は、酵素の活性を７０％、６０％、５０％、４０％もしくは３０％未満、好ましくは２５％、２０％、１５％、もしくは１０％未満、より好ましくは５％、３％、２％、もしくは１％未満減少させる。同様に、この連結は、結合成分の親和性を７０％、６０％、５０％、４０％もしくは３０％未満、好ましくは２５％、２０％、１５％、もしくは１０％未満、より好ましくは５％、３％、２％、もしくは１％未満減少させる。本発明は、分析物特異的結合剤の成分の特定構造または結合方法によって限定されない。典型的には、分析物特異的結合分子および酵素は、約１：１の比で存在している。しかし、様々な部分の機能が他の成分の存在によって実質的に阻害されないことを前提に、その他の比率も可能である。
【００２４】
分析物特異的結合剤の酵素成分に適用される本明細書で使用する用語「相互作用する」は、反応性成分が物理的に結び付くことができるように、２つ以上の反応性成分（例、酵素の第１および第２部分、例えばトポイソメラーゼ、リガーゼ、または逆転写酵素）を相互に近接近させることを意味する。酵素の第１および第２部分を有する１対の分析物特異的結合剤が分析物に結合すると、酵素の第１および第２部分は、相互作用して機能的酵素複合体を形成できるように近接近させられる。この機能的酵素複合体を次に使用すると、増幅鋳型を（例えば、リガーゼまたは逆転写酵素活性を通して）合成することができる。酵素の第１および第２部分が（相互作用せずに）分離される場合は、これらの部分には実質的に合成活性（すなわち、酵素活性、例えばリガーゼまたは逆転写酵素活性を通して増幅反応に使用できる鋳型を合成する能力）が欠けている。
【００２５】
本明細書で使用する用語「実質的に合成活性が欠けている」は、機能的酵素複合体の合成活性を５０％、４０％、３０％、２０％または１０％以上有していない、および好ましくは１％未満しか有していない酵素の第１または第２部分を意味する。
【００２６】
本明細書で使用する、第１酵素に関連する用語「部分」は、単離されると実質的に核酸合成活性が欠如するが、酵素の第２部分と相互作用すると核酸合成活性を有する、酵素のフラグメントを意味する。本明細書で使用する、第１酵素に関連する用語「部分」は、５０〜１０００アミノ酸のフラグメントであるが全長酵素より短いフラグメントを意味する。１つの実施形態においては、部分は、酵素の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、もしくは６００以上のアミノ酸を有するが、全長酵素よりは短い。また別の実施形態では、酵素の第１および第２部分は一緒に、野生型酵素の少なくとも９０％、または少なくとも９５％配列同一性を含んでおり、それらが相互作用すると機能的酵素複合体を形成する。
【００２７】
本明細書で使用する用語「機能的酵素複合体」は、本明細書に規定したように、いずれかの部分単独（例、複合体中ではない）の合成活性の少なくとも２倍である合成活性を有するポリペプチド複合体を形成するために相互作用する酵素の２つ以上の部分を意味している。
【００２８】
本明細書で使用する用語「アニーリング」は、オリゴヌクレオチドプライマーが相補的付着末端または鋳型核酸鎖へハイブリダイズすることを許容することを意味する。プライマーアニーリングのための条件は、プライマーの長さおよび配列に伴って変動し、そのプライマーについての計算Ｔｍ値に基づいている。本明細書で使用する用語「アニーリングを許容する条件下」は、反応において適切な塩、カチオン、緩衝液、および相補的核酸の濃度、ならびに二本鎖核酸分子の形成が可能であるような適切な温度を含むがこれらに限定されない適切な条件を有することであると理解されている。本明細書で使用する「二本鎖核酸分子」は、好ましくは２つの別個の核酸分子によって形成される。一般に、増幅レジメンにおけるアニーリング工程は、鎖分離工程後に温度をプライマー配列について計算されたＴｍに基づく温度へ、このようなアニーリングを許容するために十分な時間にわたり低下させることを含んでいる。
【００２９】
本明細書で使用する用語「抗体」は、抗原、例えば分析物に結合できる免疫グロブリンタンパク質を意味する。抗体は、一般には「エピトープ結合フラグメント」と呼ばれる、全長抗体によって認識されるエピトープへ結合する能力を保持している抗体の任意の部分を含んでいる。抗体フラグメントの実施例には、好ましくは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）ならびにＶＬもしくはＶＨドメインのいずれかを含むフラグメントが含まれるが、これらに限定されない。一本鎖抗体を含むエピトープ結合フラグメントは、可変領域を単独で、または次のヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインの全体もしくは一部分と組み合わせて含むことができる。
【００３０】
本明細書で使用する用語「分析物特異的結合分子」は、分析物に安定性で結合する分子または分子の一部分を意味する。結合分子には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、アプタマー、細胞表面受容体、受容体リガンド、ビオチン、ストレプトアビジン、アビジン、ならびにプロテインＡ、Ｇ、およびＬ、レクチン、核酸、ペプチド、分析物相互作用パートナーが含まれるが、これらに限定されない。結合分子は、さらにまた列挙した結合成分の結合フラグメント、例えば上記に列挙した抗体フラグメントであってよい。結合分子は、分析物特異的結合剤を形成するために酵素へ直接的または間接的に連結している。
【００３１】
本明細書で使用する用語「結合分析物特異的結合剤」は、その対応する分析物に結合した分析物特異的結合剤である。
【００３２】
本明細書で使用する用語「Ｃｔ」は、定量的増幅反応から生成されたシグナルが最初に「閾値」より上方に上昇する、すなわち標的核酸配列の増幅の最初の確実な検出が生じるサイクル数を意味する。「確実な」は、シグナルが増幅中の増幅産物の検出可能なレベルを反映することを意味する。Ｃｔは、一般に未知の量の標的核酸の出発量と相関しており、すなわちより低量の標的はより後期のＣｔを生じさせる。Ｃｔは、出発核酸の初期コピー数または濃度と結び付いている。
【００３３】
「捕捉分子」は、分析物へ結合するための固体支持体上の特異的または非特異的物質を意味する。捕捉分子は、分析物へ特異的に結合する抗体であってよい。捕捉分子は、さらにまた分析物によって結合されている一本鎖もしくは二本鎖の核酸配列、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。または、捕捉分子は、ポリ−リジン、シラン、コラーゲン、または固体支持体上に分析物を捕捉するための他の非特異的物質であってよい。
【００３４】
本明細書で使用する、リガーゼ、ポリメラーゼ、トポイソメラーゼ、または他の酵素の用語「触媒部分」は、本明細書に開示した方法に使用される酵素反応を促進するために必要とされる酵素の部分である。このような酵素の構造は公知であり、様々なアミノ酸とドメインおよび酵素活性との間の構造−機能関係は明確に理解されている（例えば、トポイソメラーゼについてはＣｈａｍｐｏｕｘら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３６９−４１３，１９９１；ならびにポリメラーゼについてはＢｒａｉｔｈｗａｉｔｅ ａｎｄ Ｉｔｏ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：４０４５，１９９１、およびＢｒａｔｈｗａｉｔｅ ａｎｄ Ｉｔｏ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：７８７，１９９３を参照されたい。それら全部は参照して本明細書に組み込まれる）。酵素の特異的触媒活性を実質的には変化させない短縮および突然変異を含有する酵素は、本明細書に開示した方法に使用できる。
【００３５】
本明細書で使用する用語「ｃＤＮＡ」は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例、逆転写酵素）の作用によってＲＮＡ鋳型から生成される相補的またはコピーポリヌクレオチドを意味する。「ｃＤＮＡクローン」は、クローニングベクターで運ばれる、当該のＲＮＡ分子に相補的な二重鎖ＤＮＡ配列を意味する。
【００３６】
本明細書で使用する用語「開裂」は、一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドの一方または両方の鎖の切断、典型的には酵素的切断を意味する。
【００３７】
本明細書で使用する用語「開裂産物」は、ポリヌクレオチドの一方または両方の鎖の切断後に溶液中へ放出されるポリヌクレオチドフラグメントである。一部の実施形態においては、開裂産物は、トポイソメラーゼによって開裂されたオリゴヌクレオチドである。また別の実施形態においては、開裂産物は、制限酵素によって開裂されたオリゴヌクレオチドである。開裂産物は、相補鎖へ事前にハイブリダイズした、短い一本鎖部分であってよい。または、開裂産物は、二本鎖であってよい。
【００３８】
本明細書で使用する用語「開裂部位」は、開裂剤によって開裂され得るポリヌクレオチド構造もしくは配列を意味する。開裂部位には、トポイソメラーゼ酵素認識部位、制限酵素部位、リボザイム部位、ニッカーゼ部位、ＤＮＡザイム部位、回転環レプリコンと結び付いているニッカーゼについての認識部位および移入の起源、ならびにヌクレアーゼ開裂部位が含まれるが、これらに限定されない。例えば、ワクシニアウイルス（ｖａｃｃｉｎｉａ−ｖｉｒｕｓ）に基づくトポイソメラーゼおよびＭＣＶトポイソメラーゼに対する特異的開裂認識部位は、ＣＣＣＴＴである。開裂は、最後のＴの後で起こる。制限酵素のための開裂部位は周知であり、分子生物学試薬のための多数のカタログのいずれかに見いだすことができる。
【００３９】
本明細書で使用する用語「適合性付着末端」は、核酸分子のライゲーションを許容する条件下でハイブリダイズすることのできる、典型的には核酸分子の短い（例えば、長さが約２０ヌクレオチド未満、約１５未満、または約１０未満）一本鎖末端である。付着末端のアニーリングする部分の長さを増加させることによって、鎖が安定性にアニーリングする温度が上昇し、より高温（例えば、３７℃）でのリガーゼの使用を許容する。このような基質は、ヌクレオチド主鎖内にギャップを含むことができるが、ヌクレオチド対合内にはギャップを含んでいない。トポイソメラーゼによるライゲーションは、アクセプター分子の５’末端で遊離５’−ＯＨの存在を必要とし、従来型リガーゼによるライゲーションは５’リン酸基を必要とする。
【００４０】
本明細書で使用する用語「相補的」は、１本の鎖の構造が他方の鎖の構造を決定するように、ＤＮＡ、および場合によってはＲＮＡの鎖間でプリンおよびピリミジン塩基が正確に対合する能力を意味する。第１ポリヌクレオチドは、第２ポリヌクレオチドに対して、第１ポリヌクレオチドのあらゆるヌクレオチドが第２ポリヌクレオチドの相補領域内のヌクレオチドと塩基対を形成する場合は、「十分に相補的」または「完全に相補的」であると言われる。第１ポリヌクレオチドは、第２ポリヌクレオチドに対して、第１ポリヌクレオチドのあらゆるヌクレオチドが第２ポリヌクレオチドの相補領域内でヌクレオチドと塩基対を形成しない場合は、相補的ではない（すなわち、部分的に相補的である）。例えば、２つのポリヌクレオチドは、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％相補的である可能性がある。相補性率は、例えば、相補性塩基の数を二本鎖部分の全長またはポリヌクレオチドの短い方の鎖の長さによって割ることによって決定できる。ポリヌクレオチド鎖間の相補性度は、ポリヌクレオチド鎖間のアニーリングまたはハイブリダイゼーションの効率および強度に有意な影響を及ぼす。これは、ポリヌクレオチド鎖間の結合に依存する、増幅反応において特に重要である。オリゴヌクレオチドは、増幅を許容するために鋳型に対して１００％相補性である必要はない。オリゴヌクレオチドと鋳型との間のミスマッチは、伸長反応においてオリゴヌクレオチドの３’末端よりオリゴヌクレオチドの５’末端に近い方でより多く許容される。典型的には、オリゴヌクレオチドの末端３’ヌクレオチドでのミスマッチは、ポリメラーゼによる伸長を阻害するであろう。
【００４１】
本明細書で使用する、結合、増幅または増幅産物の形成、ライゲーション、ハイブリダイゼーションなどを「許容する条件」は、例えば塩、緩衝液、ヌクレオチド、酵素、二価カチオン、ＡＴＰなどの必要な試薬の存在下での、適切な時間量にわたるｐＨおよび温度の適切な条件にあると理解されている。特定酵素の活性を許容する条件は、典型的には酵素製造業者によって提供される。抗体の結合を許容する条件は、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（Ｅｄｓ．），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，（著作権）１９８８（参照して本明細書に組み込まれる）の中に見いだすことができる。増幅、増幅産物の形成、およびオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを許容する条件は、例えば、Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｊａｎｅｓ（Ｅｄｓ．），ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ、（著作権）２００２（参照して本明細書に組み込まれる）の中に見いだすことができる。
【００４２】
本明細書で使用する「連結した」は、例えば水素、イオン性、またはファンデルワールス（Ｖａｎ−ｄｅｒ−Ｗａａｌｓ）結合によって共有的および非共有的相互作用を通した２つの分子の結び付きまたは結合を意味する。このような結合は、同一もしくは相違する原子もしくはイオンのうちの少なくとも２つの間で、これらの原子もしくはイオンの電子密度の再分布の結果として形成される可能性がある。例えば、酵素は抗体−酵素融合タンパク質としての抗体へ、ストレプトアビジン−ビオチン相互作用を通して、またはＦｃプロテインＡ／Ｇ／Ｌ相互作用（例えば、ポリメラーゼはプロテインＡ／Ｇへ連結され、これは順に抗体のＦｃ領域へ結合する）を介する結合を通して連結させることができる。
【００４３】
本明細書で使用する「検出する工程」、「検出」などは、サンプル中の特定分析のためにアッセイが実施されることであると理解されている。分析物は任意の特定濃度もしくは量でサンプル中に存在する必要はないが、本アッセイが分析物を検出する能力はサンプル中に存在する濃度／量に関連するであろうことに留意されたい。所定の場合には、本明細書に開示した方法は、分析物がサンプル中に存在しない、またはアッセイの検出レベルより低い量で存在することを決定するために使用できる。
【００４４】
本明細書で使用する「ｄＮＴＰ」は、デオキシヌクレオチド三リン酸塩であると理解されており、天然または「標準」ｄＮＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびＴＴＰを含んでいる。本明細書で使用する「ｄＮＴＰ」はさらに、例えば蛍光標識さもなければ化学標識されたヌクレオチドなどの天然および非天然ヌクレオチドアナログを含んでいる。
【００４５】
本明細書で使用する「二本鎖ＤＮＡ」は、ＤＮＡの相補鎖もしくはセグメントにアニーリングしている少なくとも一部分を有するＤＮＡを意味すると理解されている。二本鎖ＤＮＡは、２本の別個の鎖から構成されて、または自己相補的配列（例、ヘアピン構造）を備える単一ポリヌクレオチドであってよい。二本鎖ＤＮＡ分子もしくはポリヌクレオチドは、一本鎖部分を含むことができる。
【００４６】
本明細書で使用する「酵素」は、例えば、トポイソメラーゼ、リガーゼ、逆転写酵素、アデニングアニン・アルキルトランスフェラーゼ、メチルトランスフェラーゼなどの酵素、例えばＣｒｅリコンビナーゼλ−インテグラーゼ、φＣ３１−リコンビナーゼもしくはｆｌｐ−リコンビナーゼなどのリコンビナーゼ類、および分析物特異的結合分子へ結合させることのできるポリヌクレオチドキナーゼの少なくとも触媒部分を含んでいる。酵素部分は、分析物特異的結合分子から独立して存在することができる。
【００４７】
本明細書で使用する「融合ポリペプチド」は、フレーム内で相互に結合（連結）している２つ以上のポリペプチドを含むポリペプチドを意味する。本明細書で使用する用語「結合した」もしくは「融合した」は、フレーム内で相互に結合した２つ以上のポリペプチドをコードする融合分子を形成するためにポリペプチドまたは核酸の２つ以上のセグメントを一緒に結合することを意味する。２つ以上のポリペプチドは、直接的に、またはリンカー配列を介して結合させることができる。
【００４８】
本明細書で使用する「ハイブリダイゼーション」は、相補的ヌクレオシドもしくはヌクレオチド塩基間でのワトソン−クリック（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ）、フーグスティーン（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ）もしくは逆フーグスティーン水素結合であってよい、水素結合の工程を意味している。例えば、アデニンおよびチミンは、水素結合の形成を通して対合する相補的核酸塩基である。
【００４９】
本明細書で使用する「単離（した）」または「精製（した）」は、ポリヌクレオチドに関連して使用する場合は、天然型配列がその通常の細胞（例、染色体）環境から分配されている、または非自然環境において合成（例えば、人工的に合成）されていることを意味する。ここで、「単離（した）」または「精製（した）」配列は、無細胞溶液中にあってよい、または相違する細胞環境内に配置されていてよい。用語「精製（した）」は、その配列が存在する唯一のヌクレオチド配列であるが、それと自然に関連している非ヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドを実質的に含んでいない（約９０〜９５％、９９〜１００％まで純粋）ことを意味していないので、単離染色体とは識別される。
【００５０】
本明細書で使用する「リガーゼ」は、酵素である適切なリガーゼ基質中でＤＮＡ鎖の隣接端の結合を触媒することのできるリガーゼもしくはトポイソメラーゼ酵素の少なくとも一部分である。リガーゼの構造および機能は、当技術分野において周知である。例えば、全部がこれにより参照して本明細書に組み込まれるＴｉｍｓｏｎ ＤＪら、“ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｐａｉｒ ａｎｄ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ，” Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２０００ ４０：３０１−１８；Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ Ａら、“Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅｓ，” Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００１ ４０：１２４１−４８；Ｍａｒｔｉｎ ａｎｄ ＭａｃＮｅｉｌ，“ＡＴＰ−ｄｅｐｅｄｅｎｄｅｎｔ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅｓ，” Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００２ ３（４）：ｒｅｖｉｅｗｓ３００５．１−３００５．７を参照されたい。用語のリガーゼは、ＲＮＡリガーゼをさらに含んでいる。
【００５１】
本明細書で使用する「融点」もしくは「Ｔｍ」は、２つの相補的核酸分子の相互に対する親和性に関連する温度値であると理解されている。Ｔｍは、当業者であれば、多数の広汎に利用できる多数のアルゴリズム（例、ＯＬＩＧＯ（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ社、カリフォルニア州カスケード（Ｃａｓｃａｄｅ，ＣＡ））、Ｐｒｉｍｅｒ Ｄｅｓｉｇｎ、ならびにＰｒｉｍｅｒ３およびＯｌｉｇｏ Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒを含むインターネット上で入手できるプログラム）のいずれかを用いて容易に予測できる。大多数の増幅レジメンのためには、アニーリング温度は予測Ｔｍより約５℃低い温度へ選択されるが、Ｔｍにより近い、およびそれより高い（例、予想Ｔｍより１℃〜５℃低い、または予想Ｔｍの１℃〜５℃高い）温度を使用でき、同様に予想Ｔｍより５℃より低い、または高い（例、６℃低い、８℃低い、１０℃低い、および６℃高い、８℃高い、または１０℃高い）温度も使用できる。一般に、アニーリング温度がＴｍにより近いほど、アニーリングはより特異的である。プライマーのアニーリング時間は、反応量に高度に左右され、反応量が大きいほどより長い時間を必要とするが、さらにまたプライマーおよび鋳型の濃度に依存し、鋳型に対するプライマーの相対濃度が高いほど、低濃度より短い時間を必要とする。容量および相対プライマー／鋳型濃度に依存して、増幅レジメンにおけるプライマーアニーリング工程は、約１秒間〜５分間であってよいが、一般には１０秒間〜２分間であろう。
【００５２】
本明細書で使用する用語「成分」もしくは「部分」は、例えば分析物特異的検出剤などの何かがそれに分けられる活性ドメインの１つであると理解されている。成分もしくは部分は、分析物特異的検出剤から独立して存在することができる。
【００５３】
本明細書で使用する用語「オリゴヌクレオチド」もしくは「ポリヌクレオチド」は、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボース）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含有する）、およびプリンもしくはピリミジン塩基、または修飾プリンもしくはピリミジン塩基のＮ−グリコシドである、任意のポリヌクレオチドを意味する。オリゴヌクレオチドは、他のオリゴヌクレオチドへハイブリダイズすることができる、または自己ハイブリダイズする、例えばヘアピン構造を有することができる。オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドには、制限なく、一本鎖および二本鎖オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドが含まれる。本明細書で使用する用語「オリゴヌクレオチド」もしくは「ポリヌクレオチド」は、さらに２’−Ｏ−メチル修飾および２’もしくは３’ＮＨ２修飾を含むがこれらに限定されない、１つ以上の修飾された塩基もしくは糖を含有するＤＮＡもしくはＲＮＡを含んでいる。そこで、安定性またはその他の理由から修飾されたバックボーンを備えるＤＮＡもしくはＲＮＡは、「ポリヌクレオチド」である。本明細書で使用する用語「オリゴヌクレオチド」もしくは「ポリヌクレオチド」は、このような化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態のポリヌクレオチド、ならびに例えば単純型および複雑型細胞を含むウイルスおよび細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学形を含んでいる。本明細書に記載した方法のために有用なオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドは、単離もしくは精製されたポリヌクレオチドで、または増幅反応において増幅したポリヌクレオチドであってよい。
【００５４】
本明細書で使用する「複数」は１つより多い、典型的には少なくとも２つを意味すると理解されている。
【００５５】
本明細書で使用する「ポリメラーゼ」は、鋳型依存方法でヌクレオチドの重合を触媒する酵素である。ポリメラーゼは、鋳型としてＤＮＡもしくはＲＮＡを使用できる。ポリメラーゼは、熱安定性または非熱安定性であってよい。一般に、酵素は、核酸鋳型配列にアニーリングしたプライマーの３’末端で合成を開始し、鋳型鎖の５’末端に向かって進行するであろう。「ＤＮＡポリメラーゼ」は、デオキシリボヌクレオチドの重合を触媒する。公知のＤＮＡポリメラーゼには、例えば、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｕｎｄｂｅｒｇら、１９９１，Ｇｅｎｅ，１０８：１）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｌｅｃｏｍｔｅ ａｎｄ Ｄｏｕｂｌｅｄａｙ，１９８３，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１：７５０５）、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｒｄｓｔｒｏｍら、１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：３１１２）、サームス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｇｅｌｆａｎｄ １９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：７６６１）、バシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｅｎｅｓｈ ａｎｄ ＭｃＧｏｗａｎ，１９７７，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ４７５：３２）、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）（Ｔｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼとも呼ばれる、Ｃａｒｉｅｌｌｏら、１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１９：４１９３）、９°Ｎｍ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社からの製造中止になった製品）、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｄｉａｚ ａｎｄ Ｓａｂｉｎｏ，１９９８ Ｂｒａｚ Ｊ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ，３１：１２３９）、サーマス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｈｉｅｎら、１９７６，Ｊ．Ｂａｃｔｅｏｒｉｏｌ，１２７：１５５０）、パイロコッカス・コダカレンシス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）（ＫＯＤ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｇｉら、１９９７，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：４５０４）、ＪＤＦ−３ ＤＮＡポリメラーゼ（国際特許公開第０１３２８８７号パンフレット）、およびパイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ＧＢ−Ｄ（ＰＧＢ−Ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｊｕｎｃｏｓａ−Ｇｉｎｅｓｔａら、１９９４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１６：８２０）が含まれる。上記の酵素のポリメラーゼ活性は、当分野において周知の手段によって決定することができる。１単位のＤＮＡポリメラーゼ活性は、最適温度（例、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼのためには７２℃）で３０分間にわたり１０ｎＭ（ナノモル）の全ｄＮＴＰのポリマー形への組込みを触媒する酵素の量であると規定されている。非熱安定性ＤＮＡポリメラーゼには、Ｔ３ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、およびΦ２９ ＤＮＡポリメラーゼが含まれるが、これらに限定されない。
【００５６】
本明細書で使用する「酵素に対するポリヌクレオチド基質分子」は、中間体もしくは産物を形成するために酵素により触媒的に作用することができる１つ以上のＤＮＡもしくはＲＮＡ分子であると理解されている。「増幅もしくはＰＣＲのためのポリヌクレオチド基質」は、２つの特異的オリゴヌクレオチドプライマーの結合を許容するために十分な長さの一本鎖または二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドであると理解されている（一方は第１鎖、およびもう一方は第１鎖を鋳型として用いて合成された第２鎖または相補鎖）。例えば、ＲＮＡ分子は、逆転写酵素のための基質であってよい。リガーゼ活性を有する酵素のための基質は、ライゲーションを許容する条件下で相互にアニーリングおよびライゲーションできる適合する末端を備える第１二本鎖ＤＮＡ分子および第２核酸分子を含んでいる。第２核酸分子は、一本鎖または二本鎖であってよい。５’−ＣＣＣＴＴ−３’（配列番号１）配列を含む二本鎖ＤＮＡ分子は、ワクシニアウイルスＤＮＡトポイソメラーゼＩのための基質になることができる。２つのプライマーの特異的結合を可能にするために十分な長さかつ適切な配列の二本鎖ＤＮＡ分子は、ＰＣＲによる核酸増幅のための基質になることができる。
【００５７】
用語「プライマー」は、１つより多いプライマーを意味する場合があり、精製された制限消化物中におけるように自然に発生しようと、または核酸鎖に相補的であるプライマー伸長産物の合成が触媒される条件下に置かれると相補鎖に沿った合成の開始点として機能できる合成により生成されようと、オリゴヌクレオチドを意味する。そのような条件には、適切な緩衝液（「緩衝液」は、補因子である、またはｐＨ、イオン強度などに影響を及ぼす置換基を含んでいる）中、および適切な温度での、４つの相違するデオキシリボヌクレオシド三リン酸塩およびＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素などの重合誘導剤の存在が含まれる。プライマーは、好ましくは、増幅において最大効率を得るためには一本鎖である。
【００５８】
オリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型核酸配列にハイブリダイズすることができ、第２核酸鎖の酵素的合成をプライミングする一本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ分子である。プライマーは、標的分子の一部分に相補的である。オリゴヌクレオチドプライマーは、化学的または酵素的いずれかの合成方法によって調製できる、と考えられる。または、このような分子もしくはこのフラグメントは天然型であり、天然起源から単離される、または商業的供給業者から購入される。オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブは、長さが５〜２００ヌクレオチド、理想的には１７〜４０ヌクレオチドであるが、相違する長さのプライマーおよびプローブも有用である。増幅のためのプライマーは、好ましくは１７〜２５ヌクレオチドである。プライマーは、さらにまた融点推定法によって特定の融点（Ｔｍ）を有するように設計できる。ＯＬＩＧＯ（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ社、カリフォルニア州カスケード（Ｃａｓｃａｄｅ，ＣＡ））を含む市販のプログラム、Ｐｒｉｍｅｒ３ ａｎｄ Ｏｌｉｇｏ Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒを含むウェブ上で入手できるプライマー設計およびプログラムを使用すると、核酸配列のＴｍを計算することができる。プライマーの好ましい融点は、実践される特定実施形態に左右されるであろう。オリゴヌクレオチドは、（修飾もしくは非修飾）ポリヌクレオチド鋳型およびプライマーを含んでいる。ポリヌクレオチド鋳型は、長さが少なくとも１０塩基、典型的には長さが少なくとも２０塩基、例えば長さが少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００塩基からの範囲内の長さを備えて調製できる。オリゴヌクレオチドは大きな核酸フラグメントであってよいが、一般には、５００塩基以下の核酸に限定される。
【００５９】
オリゴヌクレオチドは、溶液中で遊離していて、または結合分子に共役していてよい。結合成分に共役しているオリゴヌクレオチドは、一般には、これらが共役されることを許容する、これらのヌクレオチド配列内の任意の地点で化学的活性基（例えば、第１級アミン基）を有しているであろう。
【００６０】
本明細書で使用する「反応混合物」は、典型的には、塩、緩衝液、核酸、および酵素を含むが、これらに限定されない試薬の組み合わせである。反応混合物は、典型的には所望の反応が発生できる条件に曝露させられる。反応が発生できる条件は、少なくとも一部の試薬、例えば酵素とともに提供される製造業者の取扱説明書に提供されることが多い。
【００６１】
本明細書で使用する用語「制限酵素」は、特異的ヌクレオチド配列、またはその近くで二本鎖ＤＮＡを切断する酵素を意味する。多数の制限酵素の特異性は、当技術分野において周知である。様々な制限酵素は市販されており、それらの反応条件、補因子、および酵素供給業者によって確立されるその他の要件は周知である。
【００６２】
本明細書で使用する「逆転写酵素」は、ＭＭＬＶおよびＡＭＶ逆転写酵素を含むＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである。逆転写酵素は、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、ＦｅＬＶ、ＦＩＶ、ＳＩＶ、ＡＭＶ、ＭＭＴＶ、およびＭｏＭｕＬＶを含む全てのレトロウイルスについてのウイルスＲＮＡからのｃＤＮＡの合成を仲介する。例えば、いずれもこれにより参照して組み込まれるＬｅｖｉｎ，１９９７，Ｃｅｌｌ，８８：５−８；Ｂｒｏｓｉｕｓら、１９９５，Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ １１ ：１６３−７９を参照されたい。逆転写酵素の構造および機能は、当技術分野において周知である。例えば、参照して組み込まれる米国特許出願第１１／１００１８３号明細書（米国特許出願公開第２００５／０２７２０７４号明細書）を参照されたい。１つの実施形態においては、逆転写酵素は、ウイルス逆転写酵素である。相違する温度で使用するための様々な逆転写酵素は、ＡＦＦＩＮＩＴＹＳＣＲＩＰＴ（商標）、ＡＣＣＵＳＣＲＩＰＴ（登録商標）およびＳＴＲＡＴＡＳＣＲＩＰＴ（登録商標）（全部がＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社、カリフォルニア州ラ・ホーヤ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）から）を含めて市販されている。
【００６３】
本明細書で使用する用語「サンプル」は、その自然環境から単離されており、分析物を含有すると疑われる、または分析物を含有する可能性がある生物学的物質を意味する。本明細書に開示した方法による「サンプル」は、精製もしくは単離された分析物を含有していてよい、または分析物を含有することが疑われる組織サンプル、生体液サンプル、もしくは細胞サンプルなどの生物学的サンプルを含むことができる。生体液には、血液、血漿、血清、痰、尿、脳脊髄液、洗浄液、および白血球泳動サンプルが含まれる。サンプルは、分析物を含有することが疑われる任意の植物、動物、細菌、もしくはウイルス物質を含むことができる。
【００６４】
本明細書で使用する「固体支持体」または「固体表面」は、捕捉分子のための支持体を提供する任意の構造を意味する。適切な固体支持体には、ポリスチレン、誘導体化ポリスチレン、例えばニトロセルロース、ＰＶＤＦもしくはナイロンなどの膜、ラテックスビーズ、ガラスビーズ、シリカビーズ、常磁性もしくはラテックスミクロスフェア、またはマイクロタイターウエルが含まれる。また別の例として、固体支持体は、例えば抗体などの捕捉分子のプレートへの共役結合を可能にするＴＯＰ ＹＩＥＬＤ（商標）プレート（Ｎｕｎｃ社、ニューヨーク州ロチェスター（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ））などの修飾されたマイクロタイタープレートであってよい。固体支持体がビーズ、常磁性ミクロスフェアもしくはラテックスミクロスフェアなどの物質である場合は、固体支持体は、どちらも実験室において一般に使用される、複数ウエル組織培養皿などの開放容器内に、またはネジ蓋付きチューブなどの密封容器内に収容することができる。
【００６５】
本明細書で使用する用語「特異的に結合する」および「特異的結合」は、抗体もしくはその他の結合分子が、抗原、リガンドもしくは分析物などの標的へ、本発明の特定の条件下で他の分子へ結合するよりはるかに大きな親和性で結合することを意味する。抗体もしくは抗体フラグメントは、当技術分野において公知であるように、抗原などの他の分子に結合できる領域を含有するポリペプチド分子である。様々な実施形態においては、「特異的に結合する工程」は、抗体もしくはその他の生物学的分子が少なくとも１０−６〜１０−１４／Ｍの親和性で標的分子に結合することを意味することができるが、より好ましくはそれらは少なくとも１０−８／Ｍの親和性を有し、最も好ましくは少なくとも１０−９／Ｍの親和性を有するであろう。
【００６６】
本明細書で使用する「リガーゼのための基質」は、本明細書では１対の核酸分子である（少なくともその一方は部分的に二本鎖である）、または相互に付着末端へのアニーリングがヌクレオチドを消失することなく、各鎖のバックボーン内での中断を伴う二本鎖核酸分子を生じさせるように適合する付着末端を有する１つの二本鎖核酸分子の２つの末端であると理解されている。核酸鎖は、少なくとも１本の鎖上の中断部位およびその周囲で、中断点およびその周囲で少なくとも３、５、７、もしくは１０連続相補的ヌクレオチドにわたり相補鎖へハイブリダイズさせられる。両方の鎖はＤＮＡ分子である、または鎖の１本はＤＮＡ分子であり、他方の鎖はＲＮＡ分子である。中断点での鎖の両端は、リガーゼもしくはトポイソメラーゼによるライゲーションを許容するために適切な末端官能基を有している。リガーゼは、アクセプター分子の５’末端では５’リン酸基を必要とするが、トポイソメラーゼは、アクセプター分子の５’末端で遊離５’−ＯＨを必要とする。リガーゼは、熱安定性または非熱安定性であってよい。非熱安定性リガーゼは、高温への曝露、またはポリメラーゼ連鎖反応の変性工程によって不活性化することができる。
【００６７】
本明細書で使用する「ポリメラーゼのための基質」は、本明細書では、二本鎖部分の第１鎖の３’末端が、それがアニーリングしている配列に完全に相補的であり、第２鎖は３’末端が伸長するであろう方向に第１鎖の３’末端を越えて伸長する、二本鎖配列の一部分を備える一本鎖核酸、いずれかのＤＮＡであると理解されている。３’末端は、さらに３’末端の伸長を可能にするために３’−ヒドロキシル基を含んでいる。このようなＤＮＡ鋳型は、「ＰＣＲ鋳型」でもある。または、核酸は、それからｃＤＮＡを生成することができ、順にＰＣＲ鋳型として機能できるＲＮＡ鎖であってよい。このようなＲＮＡ鎖は、「逆転写酵素のための基質」でもある。
【００６８】
本明細書で使用する「熱安定性ポリメラーゼ」は、熱に対して安定性である、耐熱性である、および各核酸鎖に相補的であるプライマー伸長産物を形成するために適正な方法でヌクレオチドの結合を触媒（促進）する酵素であると理解されている。熱安定性ポリメラーゼは、二本鎖核酸の変性を実行するために必要な時間にわたり高温に曝露させた場合に非可逆的に変性（不活性化）されない。本発明のための非可逆的変性は、酵素活性の永続的かつ完全な消失を意味する。核酸変性のために必要な加熱条件は、例えば、緩衝液の塩濃度および組成ならびに変性させられる核酸の長さおよびヌクレオチド組成に依存するであろうが、典型的には温度および核酸長に主として依存した時間、典型的には３０秒間〜４分間にわたり約９０〜約１０５℃である。緩衝塩の濃度および／または核酸のＧＣ組成が増加するにつれて、より高い温度が許容される場合がある。好ましくは、酵素は、約９０〜１００℃では非可逆的に変性されないであろう。「非熱安定性ポリメラーゼ」は、熱安定性ポリメラーゼによって忍容される条件下で非可逆的に変性されるようになるポリメラーゼを意味すると理解されている。熱安定性および非熱安定性ポリメラーゼはどちらも、多数の業者から広汎に入手できる。
【００６９】
本明細書で使用する「トポイソメラーゼ」は、ＤＮＡの開裂およびライゲーションを媒介できる酵素の少なくとも触媒部分を意味する。トポイソメラーゼの構造および機能は、当技術分野において周知である。その開示がこれにより参照して組み込まれる、Ｗａｎｇ，Ｊ．Ｃ．，“ＤＮＡ ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅｓ，” Ａｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６５：６３５−９２（１９９６）を参照されたい。一部のトポイソメラーゼはＤＮＡ分子の二本鎖部分の１本の鎖の開裂を触媒するが、その他は両方の鎖の開裂を触媒し、ＤＮＡの巻き付けおよび／または巻き戻しを触媒する。トポイソメラーゼは、配列特異的であってよく、特定配列もしくはその後で開裂する、または非配列特異的で、好ましい配列では開裂しない場合がある。２つの配列特異的トポイソメラーゼは公知であり、ワクシニアウイルスＤＮＡトポイソメラーゼＩおよびＭＣＶトポイソメラーゼである。どちらも、本明細書では「トポイソメラーゼ開裂認識部位」とよばれる、配列ＣＣＣＴＴ（配列番号１）のすぐ後で１本のＤＮＡ鎖を開裂する。
【００７０】
本明細書で使用する「トポイソメラーゼ−核酸結合中間体」は、ＤＮＡの二本鎖部分の鎖の一方の３’末端に近いトポイソメラーゼ開裂認識部位を備える２本鎖ＤＮＡ基質を提供することによって生成される。鎖の開裂は、他のＤＮＡ鎖へ安定性でハイブリダイズし続けるには短すぎる短鎖開裂産物の生成を生じさせる（Ｔｍは、トポイソメラーゼ反応の温度より１０℃以上高くなく、好ましくは５℃以上高くない）。トポイソメラーゼは、リガーゼ活性のための基質を完成させるための核酸がトポイソメラーゼのライゲーションおよび遊離を可能にするために適合性の付着末端へアニーリングするまでは、核酸に結合したままとなる。
【００７１】
本明細書に提供する範囲は、その範囲内の数値全部についての省略表現であると理解されている。例えば、長さが１〜５０ヌクレオチドの配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むと理解されている。
【００７２】
他に特に明記しない限り、または状況から明白にならない限り、本明細書で使用する用語「または」は、包含的であると理解されている。
【００７３】
他に特に明記しない限り、または状況から明白にならない限り、本明細書で使用する用語「１つの」および「その」は、単数形または複数形であると理解されている。
【００７４】
本明細書に組み込まれていてその一部を構成する添付の図面は、本発明の所定の実施形態を例示しており、文書による記載と一緒に、本発明の所定の原理を説明するために役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】酵素としてトポイソメラーゼを使用する方法の実施形態の略図を示す図である。
【図２】酵素としてリガーゼを使用する方法の実施形態の略図を示す図である。
【図３】酵素として逆転写酵素を使用する方法の実施形態の略図を示す図である。
【図４】トポイソメラーゼ・ライゲーションアッセイの略図を示す図である。
【図５】トポイソメラーゼ・ライゲーションアッセイの検出感受性を示している増幅プロットを示す図である。
【図６】様々な濃度のトポイソメラーゼを用いた閾値サイクル数（Ｃｔ）を示すグラフである。
【図７】７桁を超えるトポイソメラーゼ濃度についてのＣｔを示す標準曲線を示す図である。
【図８】６桁を超えるトポイソメラーゼ濃度についてのＣｔの標準曲線を示す図であり、プロテインＧのワクシニアウイルスＤＮＡトポイソメラーゼＩへの融合が実質的にこの酵素の機能を妨害しないこと、そして６桁を超える結果の直線性を妨害しないことを示している。
【図９】図９Ａおよび９Ｂは、レポーター酵素としてトポイソメラーゼを使用するＥＬＩＳＡによって決定された様々な量のＶＥＧＦのＣｔを示すグラフである。
【図１０】ＡＴＰの存在下または非存在下での様々な濃度のＨｉｓ標識Ｔ３リガーゼを用いたＣｔを示すグラフである。
【図１１】ＰＣＲマスターミックス中で反応を実施した、ＡＴＰの存在下または非存在下での様々な濃度のＨｉｓ標識Ｔ３またはＴ７リガーゼを用いたＣｔを示すグラフである。
【図１２】１０倍の連続希釈濃度の、野生型Ｔ４ ＤＮＡリガーゼまたはＴ４ ＤＮＡリガーゼに結合したストレプトアビジンを含む融合タンパク質のいずれかを用いたライゲーション反応後の増幅反応において得られたＣｔ値を比較したグラフである。
【図１３】１つはＮ末端トポイソメラーゼフラグメントに融合したストレプトアビジンを有し、もう１つはＣ末端トポイソメラーゼフラグメントに融合したストレプトアビジンを有する２つの分析物特異的結合剤を用いて、それらのフラグメントが、近接近して分析物に結合すると機能的トポイソメラーゼ酵素を形成するように、様々な濃度のビオチン化ＢＳＡの近接性に基づく検出を示すグラフである。
【図１４】図１４Ａおよび１４Ｂ１つはＮ末端トポイソメラーゼフラグメントに融合したストレプトアビジンを有し、もう１つはＣ末端トポイソメラーゼフラグメントに融合したストレプトアビジンを有する、４５０ｐｍ（図１４Ａ）または１１０ｐＭ（図１４Ｂ）の２つの分析物特異的結合剤を用いて、それらのフラグメントが、近接近して分析物に結合すると機能的トポイソメラーゼ酵素を形成するように、様々な濃度のビオチン化抗体の近接性に基づく検出を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００７６】
以下では、実施例が添付の図面に示されている、本発明の様々な代表的実施形を詳細に参照されたい。以下の詳細な説明は、読者に本発明の態様の所定の実施形態、特徴および詳細をより十分に理解してもらうために提供されており、本発明の範囲の制限であると解釈すべきではないことを理解されたい。
【００７７】
上記で考察したように、当該の物質を免疫検出するための試薬および方法は公知であり、市販されている。しかし、これらの試薬および方法は、最も顕著には相当に低感受性である、もしくはシグナル対ノイズ比が不良である（バックグラウンドシグナルが高い）、またはその両方が顕著であるという重大な欠点に悩まされる。さらに、一部は所定の方法でのみ機能するように特別設計されているので、そこで当該の物質を検出するために広汎に使用するためには適合しない。感受性を向上させるために免疫ＰＣＲ技術が考案されてきたが、商業的に利用できるテクノロジーは今もなおそれらの有用性を制限する高いシグナル対ノイズ比に悩まされる。本出願は、高度に感受性の酵素部分（例、リガーゼ、トポイソメラーゼ、または逆転写酵素）に連結した高度に特異的な結合部分（例、抗体部分）を含む分析物特異的結合剤を使用することによって、検出アッセイの特異性および／または感受性を同時に保持または改善しながら、シグナル対ノイズ比を向上させる方法、組成物、およびキットを開示するが、このとき物質は酵素とともに、その酵素が増幅反応（例、ＰＣＲ）のための鋳型を生成することを許容する条件下でインキュベートすることができる。この方法で、増幅のための鋳型を形成することに責任のある酵素は、感受性を維持または改良しながらバックグラウンドシグナルを減少させるために役立つように、分析物が存在する場所にのみ存在する。さらに、本検出反応は、結合反応から物理的に分離することができる。例えば、結合反応後、増幅反応のための鋳型は、増幅反応を実施するための別個の容器へ移すことができる。
【００７８】
本明細書では、分析物を検出するための方法、キットおよび組成物が提供される。これらの方法では、反応における分析物の存在は、反応における分析物の存在を指示する核酸増幅鋳型の形成を生じさせる。分析物特異的結合剤の酵素は、１つ以上のポリヌクレオチド分子と相互作用し、増幅鋳型分子、好ましくはＰＣＲ増幅鋳型を生じさせる。増幅産物の増幅および検出は、感受性であり、分析物の存在の潜在的な定量的指標である。１つの態様では、分析物は、タンパク質、オリゴヌクレオチド、細胞表面受容体、または受容体リガンドである。
【００７９】
１つの態様では、サンプル中の分析物を検出するための方法であって、分析物を、サンプル中の分析物へ特異的に結合し、かつさらにＰＣＲ増幅のための鋳型の形成を触媒することのできる酵素部分を含んでいる分析物特異的結合剤と接触させる工程を含んでいる。ＰＣＲ増幅のための鋳型は、直鎖状ＤＮＡポリヌクレオチドを形成するためにアニーリングした１対のＤＮＡ二重鎖の少なくとも１本の鎖と適合する付着末端とのライゲーションによって生成することができる。３つ以上のライゲートした二重鎖の鎖を作製するためには、２対以上のＤＮＡ二重鎖を直列でライゲートすることができる。適合する付着末端は、少なくとも一部には、鎖の１本を開裂して開裂産物を遊離し、付着末端を形成する配列特異的トポイソメラーゼによって生成することができる。ＰＣＲのための鋳型は、さらにまたＲＮＡ鋳型の存在下で逆転写酵素によって生成することもできる。生成されたｃＤＮＡは、ＰＣＲのための鋳型である。ＰＣＲのための鋳型は、増幅反応において第１および第２プライマーと接触させられる。第１プライマーは、ＰＣＲ増幅のための鋳型へ、鋳型に相補的な鎖を生成するための増幅を許容する条件下で結合する。この第２鎖は、ＰＣＲによる第２鎖の増幅のために第２プライマーへ結合する。プライマーは、サンプル中の分析物の存在を証明するために、鋳型からの特定産物の増幅を許容するように設計される。増幅産物の生成は、例えば、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社、オレゴン州ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ））、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、カリフォルニア州アラメダ（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ））、または分子ビーコンプローブを使用することによって監視できる。未知のサンプル中で検出されたシグナルの量は、元の未知のサンプル中に存在する分析物の量を決定するために、既知量の分析物を含有するコントロールサンプル中で検出されたシグナルと比較することができる。または、増幅産物は、例えば、ドットブロット法もしくはゲル電気泳動法および臭化エチジウム染色によって、半定量的または定性的に検出することができる。一連の希釈率の未知サンプルを分析し、それを一連の既知サンプルと比較することによって、未知サンプル中の分析物サンプルの量を推定することができる。
【００８０】
そこで、１つの実施形態においては、サンプル中の分析物を検出するための方法であって、
（ａ）分析物特異的結合剤を、結合を許容する条件下で分析物とともにインキュベートするステップであって、分析物特異的結合剤はリガーゼに結合した分析物特異的結合分子を含むステップと、
（ｂ）（ａ）の結合した分析物特異的結合剤を、第１二本鎖核酸分子および第２核酸分子とともに反応混合物中でインキュベートするステップであって、第１核酸分子はリガーゼの存在下で第２核酸分子にライゲートされるステップと、
（ｃ）核酸増幅を許容する条件下で（ｂ）の反応混合物の少なくとも一部分を、第１オリゴヌクレオチドプライマー、第２オリゴヌクレオチドプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および少なくとも１つのｄＮＴＰを含む増幅反応混合物とともにインキュベートするステップであって、第１オリゴヌクレオチドプライマーは第１核酸分子と特異的に結合し、第２オリゴヌクレオチドプライマーは増幅産物の形成を許容するために第２核酸分子と結合するステップと、および
（ｄ）増幅産物を検出する工程と、
を含む方法に向けられる。
【００８１】
また別の実施形態においては、溶液中の分析物を検出するための方法は、
（ａ）分析物特異的結合剤を、結合を許容する条件下で分析物とともにインキュベートするステップであって、分析物特異的結合剤はリガーゼ活性含有分子に結合した分析物特異的結合分子を含むステップと、
（ｂ）（ａ）の結合した分析物特異的結合剤を、各々が２つの末端を有する１つ以上のポリヌクレオチド基質分子を備えるリガーゼとともに反応混合物中でインキュベートするステップであって、リガーゼは核酸増幅のための鋳型を生成するために基質分子の２つの末端と結合するステップと、
（ｃ）反応混合物（ｂ）の少なくとも一部分を増幅反応液とともにインキュベートするステップと、および
（ｄ）増幅産物を検出するステップと、
を含む。
【００８２】
他の実施形態においては、本方法は、
トポイソメラーゼ核酸結合中間体の形成をさらに含み、
増幅産物は、特異的増幅産物であり、
特異的増幅産物は、サイズによって決定され、
第２核酸分子は二本鎖核酸であり、第１二本鎖核酸および第２二本鎖核酸は適合する付着末端を有し、または反応混合物中の末端は適合する付着末端を有し、
第１二本鎖核酸もしくは第２二本鎖核酸のいずれかは配列特異的トポイソメラーゼ開裂部位を有し、またはそれらの末端の少なくとも一方は配列特異的トポイソメラーゼ開裂部位を有し、
適合する付着末端の少なくとも１つは配列特異的トポイソメラーゼ開裂によって生成され、
二本鎖核酸の開裂は、ライゲーションを許容する条件下では安定性にハイブリダイズしない核酸の二本鎖部分の形成を生じさせ、または
非鋳型生成鎖の核酸は、修飾を含んでいる。
【００８３】
さらにまた別の実施形態においては、サンプル中の分析物を検出するための方法は、
（ａ）分析物特異的結合剤を、結合を許容する条件下で分析物とともにインキュベートするステップであって、分析物特異的結合剤は逆転写酵素に結合した分析物特異的結合分子を含むステップと、
（ｂ）（ａ）の結合した分析物特異的結合剤を、ｃＤＮＡ分子を生成するためにＲＮＡの逆転写を許容する条件下でＲＮＡ分子とともに反応混合物中でインキュベートするステップと、
（ｃ）核酸増幅を許容する条件下で（ｂ）の反応混合物の少なくとも一部分を、第１オリゴヌクレオチドプライマー、第２オリゴヌクレオチドプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および少なくとも１つのｄＮＴＰを含む増幅反応混合物とともにインキュベートするステップであって、第１オリゴヌクレオチドプライマーはｃＤＮＡ分子と特異的に結合し、第２オリゴヌクレオチドプライマーは増幅産物の形成を許容するために第ｃＤＮＡ分子の相補体と結合するステップと、および
（ｄ）増幅産物を検出する工程と、
を含む。
【００８４】
他の実施形態においては、
本方法は、増幅産物の一部分へハイブリダイズする第３オリゴヌクレオチドを提供するステップをさらに含み、
第３オリゴヌクレオチドは、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、カリフォルニア州アラメダ（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ））プローブもしくは分子ビーコンプローブであり、
増幅産物は、特異的増幅産物であり、
特異的増幅産物は、サイズによって決定され、
検出は、増幅産物の定量をさらに含み、
方法は、工程（ｂ）の前に未結合分析物特異的結合を除去する工程をさらに含む。
【００８５】
本明細書に開示した方法の、酵素として各々トポイソメラーゼ、リガーゼ、および逆転写酵素を使用する様々な実施形態の略図は、図１、２、および３に提供されている。
【００８６】
図１（１）では、結合した分析物特異的結合剤のトポイソメラーゼ部分は、トポイソメラーゼのための基質上のトポイソメラーゼ特異的開裂部位へ結合している。明確にするために、完全に結合した分析物特異的結合剤は１回しか示されていないが、トポイソメラーゼは、本方法を通して結合剤に結合したままとなっている。図１（２）では、トポイソメラーゼは、リガーゼ基質を生成するための適合する付着末端を生成するためにトポイソメラーゼ基質を開裂する。開裂産物は放出され、トポイソメラーゼ−核酸結合中間体が生成される。リガーゼ基質の付着末端はアニーリングし、アニーリングした基質の各々の上の鎖（ｔｏｐ ｓｔｒａｎｄ）のライゲーションおよびトポイソメラーゼの放出を可能にする。下の鎖（ｂｏｔｔｏｍ ｓｔｒａｎｄ）の３’末端は、上の鎖に対して完全に相補的である必要はない（例、図２（１）を参照されたい）。図１（３）は、増幅反応における鋳型として機能できるライゲーション産物を示している。
【００８７】
図２（１）では、結合した分析物特異的結合剤のリガーゼ部分はリガーゼのための基質の半分に結合しており、リガーゼ基質の付着末端はアニーリングされている。付着末端の少なくとも１つの５’末端は、リン酸化されている。図２（２）では、リガーゼは、増幅反応に使用するための鋳型を生成するためにリン酸化された５’末端を有する鎖を結合している。
【００８８】
図３では、結合した分析物特異的結合剤の逆転写酵素部分は、逆転写酵素のための基質であるＲＮＡへ結合している。逆転写酵素は、増幅反応に使用するための鋳型を生成するためにＲＮＡ鎖をＤＮＡ内に転写する。
【００８９】
好ましい実施形態においては、分析物特異的結合分子は、ビオチン−ストレプトアビジンまたはビオチン−アビジン相互作用を通して任意で酵素へ間接的に結合している抗体である。
【００９０】
本明細書に開示した実施形態は、さらにまた第１および第２分析物特異的結合剤が提供される、本明細書に記載した分割バージョンの酵素を用いて実施することもできる。これらの実施形態においては、各分析物特異的結合剤は、酵素の一部分に連結した分析物特異的結合分子を含んでいる。酵素部分は相互作用して、分析物特異的結合剤が分析物に結合すると、機能的酵素複合体を形成する。機能的酵素複合体は、次にサンプル中における分析物の存在および／または量の指標である検出可能なシグナルを生成する。１つの実施形態においては、分割バージョンのリガーゼ、トポイソメラーゼ、または逆転写酵素が提供される。また別の実施形態においては、第１および第２分析物特異的結合分子は抗体である。好ましい実施形態においては、第１および第２分析物特異的結合分子は、例えばビオチン−ストレプトアビジンまたはビオチン−アビジン相互作用などの、ビオチン結合相互作用を通して酵素部分へ間接的に結合している抗体である。例えば、酵素の第１および第２部分は、ストレプトアビジンまたはアビジンへ融合させられ、当該の分析物に対して特異的なビオチン化抗体と混合される。
【００９１】
１つの実施形態においては、分割された酵素は、配列番号１９のアミノ酸配列を有するワクシニアウイルス・トポイソメラーゼＩまたは、配列番号１９と少なくとも９０％および好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドなどの、ポリペプチドがトポイソメラーゼ活性を保持することを前提とするトポイソメラーゼに由来する。例えば、トポイソメラーゼ酵素の第１部分は、配列番号１７のアミノ酸残基１７９〜２７５を含む。または、トポイソメラーゼ酵素の第１部分は、第１部分が機能的酵素複合体を形成するためにトポイソメラーゼ酵素の第２部分と相互作用する能力を保持することを前提として、配列番号１７のアミノ酸残基１７９〜２７５に対して少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。例えば、トポイソメラーゼ酵素の第２部分は、配列番号１８のアミノ酸残基１〜２１６を含んでいる。または、トポイソメラーゼ酵素の第２部分は、第２部分が機能的酵素複合体を形成するためにトポイソメラーゼ酵素の第１部分と相互作用する能力を保持することを前提として、配列番号１８のアミノ酸残基１〜２１６に対して少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。酵素は、２つのドメインが相互作用すると酵素活性を回復できる他のサブドメインへ分離することができる。
【００９２】
ワクシニアウイルス・トポイソメラーゼＩのアミノ酸配列（配列番号１９）は、例えば、アクセッション番号ＹＰ＿２３２９８６で公表されているものを含めて、公的に入手できる。ワクシニアウイルス・トポイソメラーゼＩは、ウイルスＤＮＡトポイソメラーゼ・スーパーファミリーに属しており、鎖β２およびβ３の間に左巻き交差を備えるＮ末端β（２）−α−β−α−β（２）折り畳みを想定している。ＤＮＡ結合ドメインおよび触媒ドメイン内の保存残基は、当技術分野において公知である。例えば、ワクシニアウイルス・トポイソメラーゼＩＢ型は、触媒活性と相関する５つの保存残基（Ｒ１３０、Ｋ１６７、Ｋ２２０、Ｒ２２３、およびＨ２６４）ならびに触媒ドメイン内のＤＮＡ結合部位へマッピングされる１７の保存残基（Ｒ１３０、Ｆ１３１、Ｇ１３２、Ｋ１３３、Ｋ１３５、Ｔ１４２、Ｋ１６７、Ｄ１６８、Ｙ２０９、Ｋ２１３、Ｒ２１８、Ｉ２１９、Ｋ２２０、Ｒ２２３、Ｈ２６５、Ｔ２６６、およびＹ２７４）を含有する、アミノ酸残基約７５〜アミノ酸残基約２８５に及ぶＣ末端触媒ドメインを含有している。そこで当業者であれば、これらの保存残基での保存的突然変異は、トポイソメラーゼ活性を有するタンパク質を生じさせる可能性が高いが、他方保存ドメインの外側での突然変異は、触媒活性に大きく影響を及ぼさないと予想されるであろう。
【００９３】
本明細書に開示した実施形態は、分析物特異的結合分子と酵素または分割酵素系にある酵素の第１および第２部分との間に配置された任意のスペーサ分子を用いて実施することもできる。スペーサ分子は、任意の物質または物質の組み合わせから構成されてよい。しかし典型的には、スペーサ分子は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドから構成されるであろう。１つの実施形態においては、スペーサ分子は、例えばグリシン、セリン、アラニン、およびトレオニンなどの小さなアミノ酸を含んでいる。また別の実施形態においては、天然型柔軟性非構造領域を使用できる。このような領域は、豊富に発現したタンパク質から、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のｚｉｐＡタンパク質（Ｏｈａｓｈｉ Ｔ，Ｈａｌｅ ＣＡ，ｄｅ Ｂｏｅｒ ＰＡ，Ｅｒｉｃｋｓｏｎ ＨＰ．“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｔｈａｔ ｔｈｅ Ｐ／Ｑ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ＺｉｐＡ ｉｓ ａｎ ｕｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ，ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｔｅｔｈｅｒ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ＦｔｓＺ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ．” Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２００２；１８４（１５）：４３１３−４３１５）またはＬ７／Ｌ１２リボソームタンパク質（Ｂｏｃｈａｒｏｖら、“Ｆｒｏｍ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２ ｔｏ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ ｉｎ ｒｉｂｏｓｏｍｅ，” Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００４ ２７９（１７）：１７６９７−７０６）から選択することができる。多数の非構造領域は当業者には公知であり、例えばＥｎｔｒｅｚ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ＮＣＢＩデータベースからのＤｉｓｐｒｏｔデータベースからなどのデータベース内のタンパク質構造から入手できる。さらに、非構造領域は、例えばＳｃｏｏｂｙ−Ｄｏｍａｉｎ法（Ｐａｎｇ ＣＮら、“Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ｆｏｌｄａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｓｉｇｎａｌ，” Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２００８ ３６（２）：５７８−８８）を用いるバイオインフォーマティクス法によってタンパク質中で予測できる。
【００９４】
本出願に開示された方法は、サンプル中の分析物の特異的および感受性検出のため、ならびに任意の定量のために有用である。本法は、当該分析物を結合させるために特定分析物を調製できることを前提に、本質的にあらゆる分析物を検出するために使用できる。分析物は、例えば哺乳動物もしくはヒトなどの生物由来の組織もしくは体液などの生物学的サンプル由来であってよい。本方法は、例えば、疾患状態または臨床的介入の有効性を決定するために経時的にタンパク質の発現を監視するために使用できる。サンプルは、例えば、水もしくは土壌サンプル中の分析物の存在を検出するために、環境起源由来であってよい。サンプルは、汚染物質または感染性物質の存在について試験するために農業的もしくは食物起源由来であってよい。分析物を特異的分析物結合成分へ結合させるために抽出物を調製する方法は、当業者であれば周知である。
【００９５】
１つの態様においては、公知のＥＬＩＳＡタイプのアッセイと組み合わせて検出剤を使用するための組成物およびキットが提供される。一般に、本キットは、典型的には容器を貯蔵および／または輸送するための包装材料と組み合わせて、少なくとも１つの容器内に、分析物特異的結合剤を含んでいる。分析物特異的結合剤は、増幅反応のための鋳型を形成するための基質、および増幅反応、好ましくはＰＣＲ反応、より好ましくは定量的ＰＣＲ反応に使用するために必要とされる試薬と組み合わせて使用できる。
【００９６】
特定の分析物を検出するための多数のキットは、市販されている。このようなキットは、典型的にはＥＬＩＳＡプレート、および分析物へ結合するためにプレート上に事前にコーティングされた、または別個のいずれかでの捕捉分子を含んでいる。公知の濃度にあるコントロール分析物は、陽性コントロールとしてキットともに提供されてよい。分析物を検出するための分析物特異的抗体は、市販のＥＬＩＳＡの成分として提供され、分析物特異的抗体を検出するためには、検出可能なレベルに結合した第２抗体が提供される。１つの実施形態においては、本キットは、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて提供される、および／または典型的に使用される第２抗体の代りに使用するための組成物および試薬を含んでいる。
【００９７】
さらに、市販されているキットを含むＥＬＩＳＡアッセイとともに検出試薬として使用するためのプロテインＡ、Ｇ、またはＬなどの抗体結合ドメインに連結した、例えばリガーゼ、トポイソメラーゼ、または逆転写酵素などの酵素を含有するキットが提供される。酵素は、さらにまたキット内に含まれる、またはまた別の起源から入手されるビオチン化抗体へ結合させるためにストレプトアビジンまたはアビジンへ結合させることができる。抗体結合ドメインまたはストレプトアビジンに連結した酵素は、分析物特異的結合剤を生成するために、分析物特異的抗体または任意のビオチン化分子各々と接触させることができる。または、抗体結合ドメインへ連結した酵素は、分析物特異的抗体と結合する抗体と接触させることができる。例えば、分析物特異的抗体がマウスＩｇＧモノクローナル抗体である場合は、市販の抗マウスＩｇＧ抗体は、抗体結合ドメイン（例、プロテインＧ）と連結した酵素と接触させることができる。または、本キットには、検出剤として使用するための酵素成分と連結した抗免疫グロブリン抗体を含むキットを含むことができる。
【００９８】
本キットは、ＰＣＲ用の鋳型を生成するための酵素の基質である、核酸分子をさらに含んでいる。
【００９９】
トポイソメラーゼに基づくキットでは、核酸分子は、その一方の末端は開裂されると第２二本鎖核酸分子にアニーリングするために適合する付着末端を生成する、トポイソメラーゼ開裂部位を含有する１つまたは２つの二本鎖核酸分子、好ましくはＤＮＡ分子であってよい。アクセプター鎖は、トポイソメラーゼのための基質を形成するために５’−ＯＨを含んでいる。
【０１００】
リガーゼに基づくキットでは、核酸分子は、第２二本鎖核酸分子もしくは一本鎖核酸分子にアニーリングするために適合する付着末端を有する、２つの二本鎖核酸分子または１つの二本鎖核酸分子および１つの一本鎖核酸分子、好ましくはＤＮＡ分子であってよい。増幅のための鋳型となる鎖内の少なくともアクセプター鎖は、トポイソメラーゼのための基質を形成するために５’−リン酸塩を含んでいる。５’−リン酸塩を含んでいない鎖は、例えばＰｆｕなどの高レベルの識別を備えるポリメラーゼによる鎖の増幅を妨害する非天然ｄＮＴＰを含む可能性がある。
【０１０１】
逆転写酵素に基づくキットでは、核酸分子は、ＲＮＡ分子である。ＲＮＡ分子は、逆転写酵素を実質的に妨害することなくＲＮＡ鋳型の安定性を増加させるために化学修飾を含むことができる。このようなＲＮＡ分子は、当業者には公知である。
【０１０２】
本キットは、酵素成分によって生成された鋳型からの産物の定量的増幅のために、プライマー、プローブ（例、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、カリフォルニア州アラメダ（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ））もしくは分子ビーコンプローブ）、またはその他の物質（例、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社、オレゴン州ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ））のうちの少なくとも１つをさらに含むことができる。本キットは、ＰＣＲ産物を増幅させるためのポリメラーゼをさらに含むことができる。
【０１０３】
また別の態様では、本明細書に開示した方法およびキットに使用するための組成物が提供される。例えば、本組成物は、試薬と結び付けて使用するために適合する少なくとも１つの他の物質と結合できる、酵素もしくは酵素成分と連結した分析物特異的結合分子を有する分析物特異的検出剤（例、融合タンパク質）を含んでいてよい。適切な物質には、本発明による方法において所望であるように実施する能力に有害な影響を及ぼさずに試薬に接触することを引き起こせる物質が含まれる。または、追加して、組成物は分析物特異的検出剤およびそれに試薬が特異的に結合する１つ以上の物質（例、検出対象の分析物）または分析物特異的検出剤の酵素部分と相互作用する１つ以上の物質（例、例えば本明細書に開示した方法およびキットに使用するために本明細書において考察したような、酵素の核酸基質）を含むことができる。さらに、例えばプロテインＡ、Ｇ、もしくはＬなどの抗体結合ドメイン、または好ましくは結合剤として使用するためのビオチン、アビジン、もしくはストレプトアビジンへ連結した酵素もしくは酵素成分である。さらに、好ましくは結合剤として使用するための抗免疫グロブリン抗体にさらに連結した抗体結合ドメインに連結した酵素もしくは酵素成分である。組成物は、例えば、凍結乾燥粉末もしくは水性混合液中のような液体形もしくは固体形で見いだすことができる。したがって、結合および検出アッセイにおける組成物の使用が提供される。
【０１０４】
１つの態様においては、本方法は、サンプル中に存在する可能性がある特異的分析物の結合を許容するために分析物捕捉分子を備える固体表面を調製する工程を含んでいる。市販の抗体でコーティングされたプレート、または抗体および抗体を表面に結合させるための取扱説明書を含むＥＬＩＳＡキットもまた使用できる。分析物捕捉分子は、特異的もしくは非特異的結合剤であってよく、または特定物質を非特異的物質によってプレートに結合させることができる。捕捉分子は、例えばビオチン−アビジンまたはビオチン−ストレプトアビジンなどの、結合対の半分を含むことができる。固体表面はアビジンもしくはストレプトアビジンでコーティングできる、および捕捉分子はビオチンへ結合させることができる。捕捉分子を固体支持体へ結合させる正確な方法は、本発明の制限内にはない。プレートを捕捉分子でコーティングした後、表面を洗浄し、表面への物質の非特異的結合を防止するために非特異的物質を用いてブロッキングする。
【０１０５】
調製したプレートは、結合を可能にする時間および温度の適切な条件下で適切な緩衝液中で分析物と接触させられる。これらの条件は、使用される分析物および捕捉試薬に依存して変動する場合がある。このような検討材料は、当業者には明確に理解されている。未結合分析物は、洗浄する工程によって除去される。
【０１０６】
分析物特異的結合剤は、分析物の存在を検出するために調製される。分析物特異的結合剤は、酵素に連結した、融合した、または付着した分析物特異的結合分子を含む。分析物結合分子は、分析物に分析物捕捉分子とは別個のエピトープで結合するように、かつ分析物および酵素成分以外の反応の任意の他の成分へ結合しないように選択されなければならない。例えば、捕捉分子および分析物結合分子は、分析物上の２つの別個の、非妨害性エピトープで結合する、分析物を標的とするモノクローナル抗体であってよい。または、捕捉分子および分析物結合分子は、どちらも、２つの抗体が分析物へ同時に結合できるように分析物の少なくとも実質的部分に向けられたポリクローナル抗体であってよい。同一エピトープに結合する抗体は、繰り返し構造もしくはモチーフを有する分析物（例、コラーゲン）のために使用できる。
【０１０７】
分析物特異的結合剤の酵素部分は、リガーゼもしくはトポイソメラーゼのいずれかに由来するリガーゼ、または逆転写酵素成分であってよい。分析物特異的結合分子は抗体であることが多いので、分析物特異的結合分子は、便宜的には、例えばプロテインＡ、ＧもしくはＬなどの一般的抗体結合ペプチドとの融合タンパク質として酵素成分を発現させることによって、頻回に酵素に連結させることができる。しかし、酵素が固体支持体に結合した捕捉分子には結合しないことを保証するために注意を払わなければならない。例えば、ニワトリＩｇＹはプロテインＡ、Ｇ、もしくはＬのいずれによっても結合されず、ラット、ウシ、ヤギ、およびヒツジ由来の全ＩｇＧはプロテインＡによって弱くしか結合されないが、他方ヒト、マウス、およびウサギＩｇＧは、プロテインＡによって強力に結合される。このため、ニワトリＩｇＹ抗体またはラット、ウシ、ヤギ、もしくはヒツジ抗体は、分析物特異的結合分子としてのヒト、マウス、もしくはウサギＩｇＧに結合させるためのプロテインＡドメインに融合した酵素と結び付けて酵素捕捉分子として使用できる。このような許容できる組み合わせは、当業者であれば容易に決定できる。
【０１０８】
分析物特異的結合剤は、分析物の結合剤への結合を許容する条件下で、調製された固体表面に結合した分析物と接触させられる。これらの条件は、使用される分析物および結合剤に依存して変動する場合がある。そのような検討材料は、当業者には明確に理解されている。未結合結合剤は、洗浄する工程によって除去される。
【０１０９】
その後の工程および試薬は、酵素内に含まれる酵素成分に依存する。各トポイソメラーゼ、リガーゼ、および逆転写酵素のために適切な基質および反応条件は、本明細書で考察されている。結合した分析物特異的結合剤は、酵素によって触媒された反応が発生するのを許容する条件下で、適切な核酸基質とともにインキュベートされる。インキュベーション後、反応混合物の一部分は増幅反応混合物、好ましくはＰＣＲ反応混合物、より好ましくは定量的ＰＣＲ反応混合物へ移される。増幅産物の量は、増幅反応中および／または後に検出され、サンプル中の分析物の存在が決定される。
【０１１０】
上記の態様のいずれかでは、増幅鋳型および検出反応の合成は、単独の工程反応（例、同一反応混合物およびインキュベーション工程）として、または連続的（例、別個の反応混合物およびインキュベーション工程）に実施することができる。
【０１１１】
結合分子
本明細書に開示した方法は、利用された捕捉分子および検出分子が、本方法に使用した捕捉分子（例、固体支持体に結合した捕捉抗体）および／または分析物特異的検出剤をそのために本法が使用される分析物を特異的に認識して結合するように単純に変化させることによって、任意の分析物を検出するために適応する可能性がある。一部の実施形態においては、分析物は、捕捉抗体が必要ではないように固体支持体へ直接的に結合させることができる。他の実施形態においては、捕捉抗体は分析物に結合し、未標識中間体抗体は分析物に結合し、および検出抗体は中間体抗体に結合する。
【０１１２】
他の実施形態においては、本アッセイは、液相反応として実行される（例、捕捉抗体および固体支持体を使用せずに、図１Ｂ、２Ｂ、および３Ｂを参照されたい）。これらの実施形態においては、本方法は、一般に、第１はポリヌクレオチド鋳型へ機能的に連結しており、第２は酵素成分に結合している２つの分析物特異的結合分子（例、抗体）を利用する。抗体は、ポリヌクレオチドおよび酵素成分が増幅鋳型を形成できるように相互作用することを可能にできるように分析物上で相互に近接近して結合できるように設計される。このようなアッセイは、２００６年１０月１１日に出願された、その全体が参照して本明細書に組み込まれる米国特許出願第１１／５４６６９５号明細書に記載されている。
【０１１３】
捕捉分子および分析物特異的検出剤は、調査対象の分析物（例、多価分析物）の同一部分またはエピトープを認識して結合することができる。または、捕捉分子および分析物特異的検出剤は、分析物の相違する部分またはエピトープを認識して結合する。一部の実施形態においては、捕捉分子および分析物特異的検出剤は、同一分析物に結合することができないが、相互作用して複合体を形成する２つの相違する分析物に結合することができる。例えば、捕捉分子、受容体タンパク質、リガンドおよび検出抗体の全部が複合体を形成するように、捕捉抗体は、受容体タンパク質に特異的で結合することができ、検出抗体は受容体のリガンドに対して特異的で結合することができる。
【０１１４】
本明細書に開示した方法に使用される捕捉分子および検出分子として使用される特異的分子は、特別には限定されない。捕捉分子および分析物結合検出分子として有用な分子には、モノクローナル、ポリクローナル、もしくはファージ由来抗体、抗体フラグメント、ペプチド、リガンド、ハプテン、核酸、核酸アプタマー、プロテインＡ、プロテインＧ、葉酸塩、葉酸塩結合タンパク質、プラスミノーゲン、マレイミドおよびその他のスルフヒドリル反応性基、ならびに本明細書に開示した方法と一緒に使用するために生成できる分子が含まれる。
【０１１５】
好ましくは、捕捉分子および分析物結合検出分子は、モノクローナル、ポリクローナル、もしくはファージ由来抗体、または抗体フラグメントである。より好ましくは、捕捉分子および検出分子は、モノクローナル抗体である。
【０１１６】
抗体は、それらがポリクローナル、モノクローナル抗体であろうと、またはそれらの免疫反応性フラグメントであろうと、当業者であれば習熟している慣例的方法によって製造することができる。従来型のモノクローナルおよびポリクローナル抗体は有用であり、好ましいタイプの結合分子を表している。このため確立された抗体調製方法は、免疫タイプの結合分子を調整するために使用できる。免疫タイプの結合成分のための抗体を調製および精製するために適切な方法は、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８８）に記載されている。さらに、本明細書に記載したアッセイは、現在入手可能な市販の抗体とともに使用できる。
【０１１７】
「ポリクローナル抗体」は、抗原、もしくはその抗原性機能的誘導体を用いて免疫された動物の血清に由来する抗体分子の異種集団である。ポリクローナル抗体を製造するためには、ウサギ、マウス、およびヤギなどの宿主動物を、任意でアジュバントが補給された抗原もしくはハプテン−担体コンジュゲートの注射によって免疫することができる。
【０１１８】
モノクローナル抗体を生成するために当技術分野において公知の、例えばファージ提示テクノロジーを用いたインビトロ生成による、および例えばマウスなどの動物を免疫する工程による生体内生成による方法が企図されている。これらの方法には、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５−４９７（１９７５））およびＣａｍｐｂｅｌｌ（“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｏｄｅｎｔ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ” ｉｎ Ｂｕｒｄｏｎら、Ｅｄｓ．，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ １３，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９９５））によって記載された免疫学的方法、ならびにＨｕｓｅらによって記載された組み換えＤＮＡ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６，１２７５−１２８１（１９８９））が含まれる。標準的な組み換えＤＮＡ技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８７））およびＡｕｓｕｂｅｌ（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ／Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９０））の中に記載されている。これらの方法の各々は、参照して本明細書に組み込まれる。
【０１１９】
捕捉分子および検出分子は無傷抗体には限定されず、例えば抗体フラグメントなどの他の結合分子および抗体フラグメントを含む組み換え融合タンパク質を含んでいる。
【０１２０】
分析物結合検出分子と酵素との連結
分析物結合検出分子および酵素は、結合もしくは連結する工程が成分のいずれかの活性を実質的に妨害しない限り、任意の方法で結合もしくは連結することができる。２つの部分間の連結を提供する正確な方法もしくは構造は制限ではなく、選択される様々な成分および最終ユーザが入手できる試薬に依存する選択の問題である。１つの連結タイプは、分析物特異的結合分子に連結した酵素を含んでいる。これらは、当業者には周知の方法を使用して調製できる。Ｄ．Ｇ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，７９，２６１（１９８４）を参照されたい。または、分析物結合剤は、組み換えＤＮＡおよび遺伝子組み換え技術を使用して生成することができる。Ｉ．Ｐａｓｔａｎ ａｎｄ Ｄ．Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４，１１７３（１９９１）を参照されたい。
【０１２１】
文献の中には、タンパク質を例えば抗体などの結合化合物（他のタンパク質）へ共有結合させるための広汎な指針を見いだすことができる。例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９６）などを参照されたい。１つの態様においては、１つ以上の酵素が分析物特異的結合分子上の一般的反応性基へ直接的または間接的に結合させられる。一般的反応性基には、アミン、チオール、カルボキシレート、ヒドロキシル、アルデヒド、ケトンなどが含まれ、市販の架橋剤によってタンパク質に連結させることができる。例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ（上記）；Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｎｉｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，２００２）を参照されたい。１つの実施形態においては、分子標識のＮＨＳ−エステルが結合分子上の遊離アミンと反応させられる。
【０１２２】
また別のタイプの連結は、分析物が核酸である場合は、酵素に連結したポリヌクレオチド鋳型配列から構成される。これらは、タンパク質をアミノ−オリゴヌクレオチドへ結合させるために当業者に公知の方法の変形を用いると調製できる。例えば、これは、アミノ修飾ｄＮＴＰが核酸の３’末端へ追加される酵素的テーリング法を使用して遂行することができる。Ａ．Ｋｕｍａｒ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６９，３７６（１９８８）を参照されたい。または、アミノ修飾塩基を核酸塩基配列内に合成的に導入することができる。Ｐ．Ｌｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１５，５２７５（１９８７）を参照されたい。酵素は次に、Ｕｒｄｅａの方法（Ｍ．Ｓ．，Ｕｒｄｅａ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６，４９３７（１９８８））においてアミノ修飾核酸へ結合させることができる。
【０１２３】
一部の実施形態においては、核酸／抗体コンジュゲートは、米国特許第５３２４６５０号明細書の中でＴｓｅｎｇらによって記載された化学的方法を用いて、順に抗体へ連結させられるＤＮＡオリゴヌクレオチド標的へのヘテロ二官能架橋剤の連結を含んでいる。
【０１２４】
オリゴヌクレオチドの抗体への化学結合を促進するために、オリゴヌクレオチドは、シアノエチル−ホスホルアミダイト化学を用いる合成中に５’末端で第１級アミン基を導入することによってアミノ修飾することができる。アミノ修飾オリゴヌクレオチドは、スルフヒドリル基を導入するヘテロ二官能試薬を用いてさらに修飾することができる。試薬であるＮ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）は、アセチル保護スルフヒドリル基を導入するアミノ修飾オリゴヌクレオチドへ連結させるために第１級アミン反応性基であるＮ−ヒドロキシル−スクシンイミド（ＮＨＳ）を使用するヘテロ二官能架橋剤である。抗体は、また別のＮＨＳ架橋剤であるスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）を用いて修飾される。ＳＭＣＣは、抗体のペプチド内の第１級アミン基（例、リシン上のイプシロン基）と反応し、マレイミド基（遊離スルフヒドリル反応性基）を抗体へ導入する。マレイミド修飾抗体は、ＳＡＴＡ修飾抗体と混合される。ＳＡＴＡ修飾オリゴヌクレオチド上のアセチル保護スルフヒドリル基は、反応性遊離スルフヒドリル基を生成するためにヒドロキシルアミンの添加を用いて活性化される（米国特許第５３２４６５０号明細書）。遊離スルフヒドリル含有オリゴヌクレオチドは、マレイミド修飾抗体と直ちに反応して、ＤＮＡ−抗体コンジュゲートを形成する。
【０１２５】
または、酵素は酵素配列に融合した（例えば、下記の実施例を参照されたい）、または２つの別個のポリペプチドとして発現して化学的に結合されたプロテインＡ、プロテインＧ、またはプロテインＬコーディング配列によって、抗体分析物特異的結合剤の抗体分析物特異的結合部分に結合させられる。
【０１２６】
同様に、ストレプトアビジンまたはアビジン配列は、コーディング配列を酵素のコーディング配列へ融合させることによって酵素に結合させることができ、またはポリペプチドを個別に発現させて化学的に結合することができる。ストレプトアビジンまたはアビジン結合酵素は次に、当業者には周知の条件下で、例えばポリペプチドもしくは核酸分子などの任意のビオチン化分子と混合することができる。
【０１２７】
固体表面に結合した結合分子
１つの実施形態においては、捕捉抗体が固体支持体へ結合させられる。また別の実施形態においては、分析物は、固体支持体へ直接的に結合する。
【０１２８】
固体支持体は、捕捉分子の固体の表面上への結合を促進するために、例えばポリＬ−リシンを用いた表面のコーティング、またはアミノアルデヒドシランもしくはエポキシシランを用いたシリコン化などによって修飾することができる。当業者であれば、本明細書に開示した方法が実施される状況は、どの固体支持体が最も好ましいのか、および容器が使用されるかどうかを規定することを理解するであろう。市販の、プレコートされたＥＬＩＳＡプレートおよびＥＬＩＳＡキットは市販されており、本明細書に開示した検出方法と結び付けて使用できる。
【０１２９】
固体支持体に結合させるべき捕捉分子の量は、試験サンプル中の量を模倣すると予測されるであろう様々な量の分析物を用いた公差力価測定によって実験的に決定できよう。一般に、試験サンプル中の分析物の量は、アトグラムからミリグラムの範囲内にあると予想される。試験サンプル中の未知の濃度の分析物は規定容量で加えられ、これは試験の感受性に影響を及ぼすであろう。大容量の試験サンプル（例、２００〜４００μＬ）が使用される場合は、サンプルの大容量を可能にするために試験フォーマットの変更が必要になることがある。しかし一般には、捕捉分子の濃度は、１ｍＬあたり約１〜約１０μｇ（マイクログラム）であろう。
【０１３０】
捕捉分子は、分析物をプラスチックもしくはその他の固体支持体系（例、膜もしくはミクロスフェア）へ結合させるために記載されてきたルーチン方法によって固体支持体へ結合させることができる。このような方法の例は、どちらも参照して本明細書に組み込まれる米国特許第４０４５３８４号明細書および米国特許第４０４６７２３号明細書中に見いだすことができる。
【０１３１】
捕捉分子の、例えば膜、ミクロスフェア、もしくはマイクロタイターウエルなどの表面への結合は、ＰＢＳ、もしくは規定ｐＨを備える他の緩衝液中への直接添加、その後の対流式オーブン中での乾燥によって実施することができる。
【０１３２】
捕捉分子は、固体支持体へ、例えば吸着、共有結合、アビジン−ビオチン結合、ストレプトアビジン−ビオチン結合、ヘテロ二官能架橋剤、プロテインＡ結合またはプロテインＧ結合などの結合手段によって結合させることができる。結合手段は各々、固体支持体の表面からの捕捉分子の消失を最小限に抑えながら、ストリンジェントな洗浄条件の使用を許容しなければならない。このような条件については下記で考察するが、当業者には明確に理解されている。１つの例として、吸着は、親水性吸着であってよい。また別の例として、ヘテロ二官能架橋剤は、マレイン酸無水物、３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＳ）、Ｎ−５アジド、２−ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド（ＡＮＢ−ＮＯＳ）またはメルカプトシランであってよい。
【０１３３】
捕捉分子は、例えばアミノ酸残基、好ましくはリシンもしくはアルギニン残基、チオール基、または炭水化物残基などの捕捉分子の一部分を通して固体支持体に結合させることができる。捕捉分子が抗体である場合は、チオール基は抗体ヒンジ領域のチオール基であってよい。
【０１３４】
固体支持体は、アビジンもしくはストレプトアビジンを用いて誘導体化することができ、捕捉分子は、固体支持体への捕捉分子の結合に役立つように、少なくとも１つのビオチン成分を含有するように修飾することができる。または、固体支持体はビオチンを用いて誘導体化することでき、捕捉分子は少なくとも１つのアビジンまたは少なくとも１つのストレプトアビジン成分を含有するように修飾することができる。
【０１３５】
試験サンプルおよび分析物の結合
本明細書に開示した方法を実施する際には、調査対象の選択された分析物を含有すると疑われるサンプルが、固体支持体上に分析物を捕捉するために抗体もしくは他の物質をコーティングして調製された支持体へ適用される。または、溶液に基づくアッセイでは、試験サンプルは固体支持体を含んでいない液相反応混合物へ直接的に加えられる。支持体の同一性に依存して、支持体は何らかのタイプの培養デバイス内に含有されてよい。支持体が膜の場合は、例えば膜の長さおよび幅よりわずかに大きな浅いガラス皿を使用できる。支持体がミクロスフェアである場合は、ミクロスフェアは、例えばポリプロピレンもしくはポリスチレン製のネジ蓋式のチューブなどのチューブに含有されてよい。容器の同一性は決定的ではないが、容器は、本明細書に開示した方法に使用される試薬がそれに非特異的には付着しない材料から作製されなければならない。
【０１３６】
使用される試験サンプルの量は決定的ではないが、容易に取り扱える量でなければならない。試験サンプルはさらにまた、支持体を適正に被覆するために十分でなければならず、これに関連して必要であれば希釈することができる。例えば、試験サンプルの量は、０．５μＬ〜２ｍＬであってよい。好ましくは、試験サンプルの量は、０．５μＬ〜１ｍＬである。最も好ましくは、試験サンプルの量は、０．５μＬ〜２００ｍＬであってよい。より少ない容量のサンプルは、マイクロ流体デバイスと結び付けて使用できる。当業者であれば、濃度は試験サンプルの容量に依存して変動してよいこと、そこで分析物を検出できる濃度範囲を提供することは困難であることを理解するであろう。
【０１３７】
そこで本明細書で教示する方法およびキットは、低い数字でサンプル中に存在する分析物を検出するために使用できる。本明細書に開示した方法において分析される試験サンプルは、１０４分子以下の分析物、１０６分子以下の分析物、１０８分子以下の分析物、１０１０分子以下の分析物、１０１２分子以下の分析物、または１０１４分子以下の分析物を含有する可能性がある。サンプルの量が増加するにつれて、一層大量の分析物を検出することが可能である。
【０１３８】
捕捉分子は、固体支持体と、捕捉分子が固体支持体に結合することを可能にするために十分な時間にわたってインキュベートされる。または、分析物は、分析物が固体支持体に結合することを可能にするために十分な時間にわたって固体支持体とともにインキュベートされる。好ましくは、インキュベーションは約１０分間〜約６０分間にわたって進行するが、一晩を必要とする場合がある。
【０１３９】
本方法のインキュベーション工程の各々が実施される特定温度もまた臨界的ではない。温度は、例えば任意の特定工程で使用される酵素、または任意の特定工程でアニーリングされるべき核酸のＴｍに依存する。このような検討材料は、当業者には明確に理解されている。
【０１４０】
結合した分析物特異的結合剤の検出
検出反応は、結合／ライゲーションまたは逆転写酵素反応と同一もしくは別個の反応容器内で実施されてよい。例えば、増幅鋳型を有する反応混合物のアリコートを９６ウエルＰＣＲプレートの対応するウエルへ移す。このステップでは、増幅鋳型は、検出試薬（例、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、カリフォルニア州アラメダ（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ））、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社、オレゴン州ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ））、第１および第２プライマーならびにポリメラーゼと反応させられる。検出反応混合物は、プライマーのアニーリング、増幅鋳型の増幅および増幅鋳型の検出を可能にする反応条件にかけられる。好ましい実施形態においては、第１および第２オリゴヌクレオチドプライマーは相違する。また別の実施形態においては、第１および第２オリゴヌクレオチドプライマーは同一である。例えば、１つの実施形態においては、検出反応は、増幅および検出のために必要な適切な時間および温度を用いてプログラミングされているリアルタイムＰＣＲ装置内で実行される。例えば、ＭＸ３００５ＰリアルタイムＰＣＲ装置は、解離曲線ならびに９０℃で１０分間、次に４０サイクルにわたり９５℃で１５秒間、および６３℃で３４秒間が続く２工程サイクリングパラメータを備えるＳＹＢＲ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社、オレゴン州ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ））Ｇｒｅｅｎ検出アッセイに対応するプログラムを用いて利用できる。その他のリアルタイムＰＣＲ検出の手段は当技術分野において周知であり（例、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、カリフォルニア州アラメダ（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ））および分子ビーコン検出アッセイ）、本実施形に使用するために適応させることができる。検出されたシグナルを次に使用すると、サンプル中の分析物の濃度を決定できる。
【０１４１】
非特異的増幅産物の増幅の防止
ライゲーションに基づく方法では、ＰＣＲのための増幅産物を生成するためには１本の鎖だけがライゲートされる必要がある。トポイソメラーゼを使用すると、１本の鎖だけがライゲートされる。しかしライゲーションもしくはトポイソメラーゼ反応混合物の少なくとも一部分が増幅反応混合物へ移される場合は、ライゲーションもしくはトポイソメラーゼ反応へ加えられた二本鎖ＤＮＡ分子のライゲートしていない部分が非特異的増幅産物の産生を生じさせよう。このような産物の形成は、不対３’ヌクレオチドオーバーハングの組み込みまたは例えば非天然ヌクレオチドアナログ、例えば２’−Ｍｅ、もしくは類似の修飾、ＵＴＰもしくは他のＲＮＡヌクレオチド、特別にはライゲーション部位に近位のライゲートしていない鎖の３’末端などの鎖内への修飾の組み込みを、高レベルの識別を有し、修飾ＤＮＡ鎖の向かい側のヌクレオチドを組み込まないであろうＰｆｕなどのポリメラーゼの使用と結び付けて制限することができる。
【０１４２】
洗浄条件
本明細書に開示した方法における試薬の添加間には、本アッセイシステムは、好ましくは非特異的結合の発生率を低下させるために洗浄にかけられる。洗浄サイクルおよび浸漬時間の数は実験によって決定されるが、一般には、洗剤、典型的には例えばＴｗｅｅｎ ２０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、またはＮＰ−４０（約１．０％まで）などの非イオン性ポリマー系洗剤を備える水または低もしくは高モル塩溶液（約１Ｍまでの塩、典型的にはＮａＣｌ）のいずれかを洗浄溶液として使用することができる。各々が約５秒間〜５分間持続する１〜８回の洗浄を、本方法に使用される試薬各々のインキュベーション後に実施できる。極めて高い、または極めて低い塩濃度は生理的塩濃度よりはるかにストリンジェントであると理解されている。洗剤濃度が高いほど、低い洗剤濃度よりストリンジェントである。適切な洗浄用緩衝液の選択は明確に、当業者の能力の範囲内である。一般的に使用される洗浄用緩衝液には、０．０２％のＴｗｅｅｎ ２０もしくは０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を備えるリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）（１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２ｍＭのＫＨ２ＰＯ４）またはＴｒｉｓ緩衝食塩液（ＴＢＳ）（１００ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）；１５０ｍＭのＮａＣｌ）が含まれる。洗浄する工程は、各インキュベーション工程間に、例えば固体支持体への捕捉分子の添加後、試験サンプルの添加後、および検出分子の添加後に実施できる。典型的な洗浄条件については、実施例で記載する。
【０１４３】
診断法
本方法、キット、および組成物は、サンプル中の分析物を検出および／または定量するために使用できる。典型的な分析物には、タンパク質、ペプチド、細胞表面受容体、受容体リガンド、核酸、炭水化物、ハプテン、分子、細胞、微生物およびそれらのフラグメントが含まれてよいが、これらに限定されない。本明細書に開示した方法の感受性に起因して、本方法は、典型的には極めて低濃度で存在する治療用生物学的物質を検出するために使用できる。
【０１４４】
組み換えポリペプチドの発現
本発明の実践は、他に特に規定しない限り、分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来技術を使用するが、これらは明確に当業者の技量の範囲内に含まれる。このような技術は、例えば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９）；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ” （Ｇａｉｔ，１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ” （Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，１９８７）；“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ” （Ｗｅｉｒ，１９９６）；“Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ” （Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｃａｌｏｓ，１９８７）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ” （Ａｕｓｕｂｅｌ，１９８７）；“ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ”，（Ｍｕｌｌｉｓ，１９９４）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，（Ｃｏｌｉｇａｎ，１９９１）などの文献において十分に説明されている。これらの技術は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの生成に適用することができるので、したがって本発明を作製および実践する際に考察することができる。特定の実施形態に特に有用な技術については、以下の項で考察する。
【０１４５】
下記の実施例は、当業者に本アッセイ、スクリーニング、および治療方法を作成および使用する方法についての完全な開示および説明を提供できるように考えられており、本発明者らが本発明であると見なす範囲を限定することは意図されていない。
【０１４６】
トポイソメラーゼ／リガーゼ用の基質の例
トポイソメラーゼについては、第１二本鎖核酸は、以下の配列を含んでいる。リガーゼについては、上の鎖は３’末端でＡＴＧＧＧＴ配列を含んでおらず、配列番号４の５’末端はリン酸化されており、
５’−ＴＧＡＣＧＣＣＣＧＡＡＧＣＣＡＡＧＴＧＣＧＧＧＡＣＧＧＣＴＴＣＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＣＣＣＣＴＴＡＴＧＧＧＴ−３’（配列番号２）
３’−ＣＴＴＡＡＣＣＧＧＧＧＡＡＴＡＣＣＣＴＴＧＣＴ−５’（配列番号３）
および第２核酸分子は、
５’−ＡＴＧＧＧＡＡＣＧＡＧＣＡＧＡＣＣＧＡＣＣＧＣＴＡＧＡＣＡＧＣＴＣＣＧＴＧＧＡ−３’（配列番号４）
３’−ＣＧＴＣＴＧＧＣＴＧＧＣＧＡＴＣＴＧＴＣＧＡＧＧＣＡＣＣＴ−５’（配列番号５）
を含んでいる。
【０１４７】
上記に示したトポイソメラーゼ／リガーゼのための対の基質とともに使用できる増幅のための第１および第２オリゴヌクレオチドプライマーは、第１オリゴヌクレオチドプライマー
５’−ＴＣＣＡＣＧＧＡＧＣＴＧＴＣＴＡＧＣＧ−３’（配列番号１０）
および第２オリゴヌクレオチドプライマー
５’−ＴＧＡＣＧＣＣＣＧＡＡＧＣＣＡＡＧＴＧ−３’（配列番号１１）
を含む。
【０１４８】
逆転写酵素用の基質の例
逆転写酵素のための基質となるＲＮＡ分子の配列を提供する。この配列は、図示した逆相補的ＲＮＡ鎖であるＤＮＡ鋳型を用いた逆転写酵素反応の産物であってよい。
５’−ＧＡＡＵＵＧＧＡＧＣＵＣＣＡＣＣＧＣＧＧＵＧＧＣＧＧＣＣＧＣＵＣＵＡＧＡＡＣＵＡＧＵＧＧＡＵＣＣＣＣＣＧＧＧＣＵＧＣＡＧＧＡＡＵＣＧＡＵＡＵＣＡＡＧＣＵＡＵＣＧＡＵＡＣＣＧＵＣＧＡＣＣＵＣＧＡＧＧＧＧＧＧＧＣＣＣＧＧＵＡＣＣＣＡＧＣＵＵＵＵＧＵＵＣＣＣＵＵＵＡＧＴＧＡＧＧＧＵＵＡＡＵＵＧＣＧＣＧＣＵＵＧＧＣＧＵＡＡＵＣＡＵＧＧＵＣＡＵＡＧＣＵＧＵＵＵＣＣＵＧＵＧＵＧＡＡＡＵ−３’（配列番号９）
【実施例】
【０１４９】
実施例１：トポイソメラーゼ活性の定量的検出
トポイソメラーゼアッセイは、ワクシニアウイルスＤＮＡトポイソメラーゼＩの２工程反応に基づいている。この基質の上の鎖は、トポイソメラーゼ認識部位（ＣＣＣＴＴ）を含有している。トポイソメラーゼ反応は、１μＬのトポイソメラーゼと２μＬの基質を結合することによって実施した。トポイソメラーゼ基質およびライゲーション基質は、１ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６０ｍＭのＮａＣｌ、１ｎｇ／μＬのＢＳＡ中に各々１０ｎＭ／Ｌで存在した。反応は、室温で１０分間にわたりインキュベートさせた。
【０１５０】
トポイソメラーゼ酵素は、認識部位の後で上の鎖を開裂し、開裂部位の３’末端へ共有結合するようになる。開裂部位の配列３’（図４では、上の鎖の３’末端の６マー「ＡＴＧＧＧＴ」（配列番号１２））は、相補鎖へアニーリングしたままとなるには短すぎるので、開裂産物は基質分子から拡散するであろう。結果として、トポイソメラーゼ反応サイクル（１本の鎖の開裂およびその後の開裂部位のライゲーション）は完了することができず、トポイソメラーゼ酵素はトポイソメラーゼ−核酸結合中間体として捕捉されたままとなる。反応サイクルは、ライゲーション基質へのライゲーションによって完了され、結果としてフローチャートの底部で生成物を生じる。この産物は次に新しくライゲートされたＤＮＡ分子内でライゲート部位をフランキングするＰＣＲプライマーを用いて増幅される（図４では、このような配列はボールド体で指示されている。トポイソメラーゼ反応は上の鎖しか開裂せず、下の鎖には切れ目を残すことに注目されたい）。
【０１５１】
プローブに基づく検出のためには、それに対するプローブが確立されている産物内に２つの検出配列を統合した（したがって、名称ＨｏｘプローブおよびｅＮＯＳ）。Ｈｏｘプローブ配列はトポイソメラーゼ認識部位（ＣＣＣＴＴ）を含有していることを留意されたい。定量的ＰＣＲ反応は、Ｔａｑポリメラーゼおよび４００ｎＭの各ＰＣＲプライマー（最終濃度）を含有する２７μＬのｑＰＣＲマスターミックス（プローブに基づく検出のためには：ＢＲＩＬＬＩＡＮＴ（登録商標）ＱＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、製品番号６００５４９（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、カリフォルニア州ラ・ホーヤ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ））；染料に基づく検出のためには：ＢＲＩＬＬＩＡＮＴ（登録商標）ＱＰＣＲ Ｃｏｒｅ試薬キット、製品番号６００５３０（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、カリフォルニア州ラ・ホーヤ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ））を加えることによって実施した。ｑＰＣＲ反応サイクルは、９５℃で１０分間、次に９５℃で１５秒間、および６０℃で４５秒間を４０サイクルにわたり実施した。プローブに基づく検出のためには、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、カリフォルニア州アラメダ（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ））プローブを最終濃度１００ｎＭで加えた。
【０１５２】
Ｈｏｘプローブに基づくアッセイの増幅プロットは、図６に示した。ｑＰＣＲアッセイにおける二倍希釈シリーズのＶＶ−トポイソメラーゼ（注意：酵素コントロールを用いていない場合は検出可能なＣｔ値は得られない）。表１からのデータは、図３にグラフで示した。
【０１５３】
【表１】
【０１５４】
同一アッセイを、プローブ検出法ではなくＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社、オレゴン州ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ））を用いて実施かつ定量した。結果は、４桁を超えて線形であった。表２からのデータは、図７にグラフで示した。
【０１５５】
【表２】
【０１５６】
本アッセイの検出限界は、約１００分子のＶＶ−トポイソメラーゼであると決定された。
【０１５７】
実施例２：トポイソメラーゼ−プロテインＧ融合タンパク質の活性
プロテインＧ標識ワクシニア・トポイソメラーゼをＢＬ２１−（ＤＥ３）細胞内で生成し、ＣＢＰ標識を用いて親和性精製した。Ｗｔ−トポイソメラーゼを従来型カラム精製法によって精製した。本アッセイは、プロテインＧ融合が酵素の機能を妨害するかどうかを決定するために、上記の方法を用いてＨｏｘプローブを使用して実施した。ＣＢＰ−プロテインＧトポイソメラーゼは、ｗｔ−トポイソメラーゼより約１桁低い比活性を有することが見いだされた（図８を参照）。これは、融合タンパク質としてのトポイソメラーゼの発現が酵素成分の活性を実質的に妨害しないことを証明している。
【０１５８】
実施例３：分析物の定量的検出のためのトポイソメラーゼに基づくＥＬＩＳＡ
ポリ塩化ビニル製マイクロタイタープレートのウエルを分析物に対する等量の精製モノクローナル抗体でコーティングする。ウエルを洗浄し、例えばリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）などの適切な緩衝液中のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの非特異的タンパク質を用いてブロッキングする。分析物を含有する可能性があるサンプルは、適切な緩衝液中で連続的に希釈する。ブロッキング剤を除去するために、ウエルを洗浄する。元のサンプルの様々な希釈液を含有する等量のサンプルを調製したウエル内へ、好ましくは２つずつ、または３つずつ配置する。定量的アッセイのためには、一連の公知の分析物濃度を一連の別個のウエルに加える。プレートは、サンプル中に存在する分析物が抗体に結合するために適切な時間にわたり温度および湿度の適切な条件下でインキュベートする。インキュベーション後、ウエルを洗浄して未結合分析物を除去する。
【０１５９】
ウエルは、分析物特異的結合分子としての抗体成分、および酵素成分としてのトポイソメラーゼ成分を含む分析物特異的結合剤に曝露させる。抗体成分は、ウエルをコーティングするために使用した抗体とは別個である分析物上のエピトープに結合する。マイクロタイタープレートは、サンプル中に存在する分析物が分析物特異的結合剤中に存在する抗体に結合するために適切な時間にわたり温度および湿度の条件下でインキュベートする。分析物特異的結合剤の成分は、ウエルへの非特異的結合を生じさせるであろう結合基によっては相互に結合されない。ウエルは、未結合の分析物特異的結合剤を除去するために洗浄する。
【０１６０】
ウエル内の結合した分析物特異的結合剤は、ワクシニアウイルスＤＮＡトポイソメラーゼＩ反応混合物中の２つの少なくとも部分的に二本鎖であるＤＮＡ二重鎖と接触させる。ＤＮＡ二重鎖の１本は、配列ＣＣＣＴＴＮ６（配列番号１３）を備える３’末端を有しており、各Ｎは独立して任意のヌクレオチドである。もう１本の二本鎖のＤＮＡ二重鎖は、Ｎ６配列のトポイソメラーゼ開裂によって生成される５’オーバーハングに相補的である５’オーバーハングを有している。２つの二重鎖は、二本鎖の二重鎖の１本の鎖を結合できるワクシニアのトポイソメラーゼ活性のための基質を形成する。
【０１６１】
トポイソメラーゼ反応混合物の一部分をウエルから取り出して、トポイソメラーゼ産物からの産物の特異的増幅を可能にするように設計された２つのプライマーを含むｑＰＣＲのための反応混合物へ移す。この反応は、結合したＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社、オレゴン州ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ））によって閾値サイクル（Ｃｔ）を決定するために監視する。標準曲線は、既知量の分析物を含有するウエル由来のサンプルに基づいて作製する。未治療の分析物を含有するサンプルのＣｔを決定し、元のサンプル中に存在した分析物の量は、既知濃度の分析物を含むサンプルを用いて作製された標準曲線を用いて決定する。
【０１６２】
実施例４：読出しとしてトポイソメラーゼ活性を使用する異種ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡアッセイ
ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡは、分析物であるＶＥＧＦの存在についての読出しとしてトポイソメラーゼ活性を用いて実施した。ＶＥＧＦ検出のためのＥＬＩＳＡキットは、業者（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）から購入した。結合および洗浄工程は、検出試薬であるＨＲＰ結合抗体を加える時点まで反応容量を１００μＬから５μＬへ減少させることを除いて、製造業者の取扱説明書にしたがって実施した。検出試薬であるストレプトアビジン−トポイソメラーゼ融合タンパク質（ＳＡ−Ｔｏｐｏ）は、１：１０００および１：１０，０００の希釈率で加え、未結合の検出試薬はインキュベーション後に洗浄した。３μＬのトポイソメラーゼ基質とともに１０分間にわたりインキュベーションした後、２７μＬのＰＣＲ混合物を加え、ＰＣＲを実施例１に記載したように実施した。Ｃｔ値は、ＶＥＧＦの投入濃度に対してプロットした（図９Ａ）。破線は、アッセイのバックグラウンド（ＶＥＧＦの添加なし）を表している。黒色の太線は、製造業者による検出限界（３０ｐｇ（ピコグラム）／ｍＬ）を表す。図９Ｂでは、同一データを検出されたＶＥＧＦのｐｇ値として表した。同様に、黒色の太線は、標準ＥＬＩＳＡにおける検出限界（１００μＬに付き３ｐｇ）を表す。３０ｐｇ／ｍＬのＶＥＧＦ濃度は、本方法によって確実に検出することができる。検出された絶対量は約１５０ｆｇ（フェムトグラム）、または市販のＥＬＩＳＡアッセイより約２０分の１少ない量であった。これらのデータは、本方法の感受性が比色酵素検出剤に匹敵することを証明している。
【０１６３】
実施例５：様々な緩衝液中でのＨｉｓ融合タンパク質としてのＴ３およびＴ７ ＤＮＡリガーゼの活性
Ｔ３およびＴ７ ＤＮＡリガーゼは、精製を促進するために組み換えＨｉｓ標識タンパク質として発現させた。これらのリガーゼは、１ｍＭのＡＴＰの存在下または非存在下でリガーゼ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、７ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ）中において活性について試験した。リガーゼの１０倍の希釈率の範囲にわたるライゲーション産物の精製は、ＰＣＲ増幅によって決定した。ある範囲のリガーゼ分子についての増幅産物のＣｔは、表１０に提示した。このデータは、加えられたＡＴＰがリガーゼ反応を進行させるためには必ずしも必要とされないこと、およびＨｉｓ標識タンパク質が機能的であることの両方を証明している。
【０１６４】
Ｔ３およびＴ７リガーゼは、さらにＰＣＲマスターミックス（ＢＲＩＬＬＩＡＮＴ（登録商標）ＱＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、製品番号６００５４９）中で試験した。Ｈｉｓ標識タンパク質としての両方のリガーゼは、Ｃｔによって決定されたようにＰＣＲマスターミックス中で機能的であることが見いだされた（図１１を参照されたい）。
【０１６５】
Ｔ３ ＤＮＡリガーゼは、Ｔ７リガーゼより有効であること、およびＴ３リガーゼはリガーゼ緩衝液中でＰＣＲマスターミックスよりも活性であることに注目されたい。
【０１６６】
Ｔ３リガーゼは、各々ストレプトアビジンおよびプロテインＧを用いて融合タンパク質としても生成されている。融合パートナーは、どちらのリガーゼも融合タンパク質として機能的であることが見いだされたので、リガーゼの活性を実質的に妨害しなかった。
【０１６７】
実施例６：タンパク質−タンパク質相互作用についてスクリーニングするためのリガーゼに基づく検出法
ランダム突然変異導入法および高スループットスクリーニング法を使用すると、タンパク質−タンパク質相互作用を変化させる突然変異についてスクリーニングすることができる。その結合パートナーとの相互作用について試験対象のタンパク質をランダム突然変異導入法にかけ、エピトープ標識を含有する発現ベクター内にサブクローニングする。個別のコロニーを採取し、培養中で増殖させる。各培養の一部分を使用して、ランダムに突然変異ライブラリー由来のタンパク質を含有する溶解物を調製する。
【０１６８】
ポリ塩化ビニル製マイクロタイタープレートのウエルを、各ライブラリーメンバーによって発現させたエピトープ標識に対する等量の精製モノクローナル抗体でコーティングする。ウエルを洗浄し、ＰＢＳ中のＢＳＡでブロッキングする。個別のライブラリーメンバーから調製した抽出物を適切な緩衝液中で希釈する。ブロッキング剤を除去するために、ウエルを洗浄する。等量の希釈抽出物を調製したウエル内へ、好ましくは２つずつ、または３つずつ配置する。結合パートナーに結合することが公知である突然変異誘発のために使用されたバージョンのタンパク質を含有する陽性コントロールウエル、およびタンパク質を含有していない、または結合パートナーと相互作用しないことが公知であるバージョンのタンパク質を含有する陰性コントロールウエルもまた調製する。プレートは、抽出物中のライブラリーメンバーが抗体に結合するために適切な時間にわたり温度および湿度の適切な条件下でインキュベートする。インキュベーション後、ウエルを洗浄して未結合ライブラリーメンバーを除去する。
【０１６９】
結合パートナーを含む適切な分析物特異的結合剤をリガーゼドメインに結合させる。結合パートナーは、例えば上述した方法などの組み換えポリペプチド法を使用してリガーゼドメインを備える融合タンパク質として生成される。結合パートナーおよびリガーゼドメインは、１つのドメインが他方に及ぼす可能性がある作用を減少させるために、短い、柔軟性のタンパク質配列によって分離する。
【０１７０】
ウエルは、ライブラリーメンバーが結合パートナーに結合することを可能にする適切な時間にわたり温度および湿度の条件下で結合パートナー−リガーゼ融合タンパク質に曝露させる。ウエルは、未結合の分析物特異的結合剤を除去するために洗浄する。
【０１７１】
ウエル内の結合した分析物特異的結合剤は、少なくとも１本の鎖がライゲーションしてＰＣＲのための鋳型を形成することを可能にするために適合する末端および少なくとも１つの５’−リン酸を有する２本の二本鎖ＤＮＡ二重鎖と接触させる。２本の二重鎖は、ライゲーションを許容する条件下でリガーゼのための基質として機能する。ライゲーション混合物は、規定時間にわたって適切な温度でインキュベートする。
【０１７２】
ライゲーション反応混合物の一部分をウエルから取り出して、ライゲーション反応からの産物の特異的増幅を可能にするように設計された２つのプライマーを含むＰＣＲのための反応混合物へ移す。増幅反応の終了時に、反応混合物の一部分を取り出し、ライブラリーメンバーと結合パートナーとの相互作用を示す増幅産物の存在を検出するために、ゲル電気泳動法および臭化エチジウムを用いた染色法にかける。所望の特性を有するライブラリーメンバーについてさらに分析する。
【０１７３】
実施例７：Ｔ４リガーゼ−ストレプトアビジン融合タンパク質の活性
ストレプトアビジンに連結したＴ４ ＤＮＡリガーゼを含む融合タンパク質（「Ｔ４／ＳＡ融合タンパク質」）を調製し、リガーゼ活性について試験した。市販されているＴ４ ＤＮＡリガーゼをＴ４／ＳＡ融合タンパク質の２つの調製物と比較した。２μＬの１０倍希釈シリーズのＴ４ ＤＮＡリガーゼもしくはＴ４／ＳＡ融合タンパク質を、１ｍＭのＡＴＰ、２００ｎＭプライマー（配列番号１０および配列番号１１）を含む２３μＬの１Ｘ ＢＲＩＬＬＩＡＮＴ（登録商標）ＱＰＣＲ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、ラ・ホーヤ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ））および、ライゲートすることのできる５塩基対オーバーハングを有する最終濃度１３．３ｎＭの以下のライゲーション基質と結合した。
５’ＴＧＡＣＧＣＣＣＧＡＡＧＣＣＡＡＧＴＧＣＧＧＧＡＣＧＧＣＴＴＣＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＣＣＣＣＴＴ（配列番号６）
ＡＣＴＧＣＧＧＧＣＴＴＣＧＧＴＴＣＡＣＧＣＣＣＴＧＣＣＧＡＡＧＡＧＧＴＣＧＡＡＣＣＧＧＧＧＡＡＴＡＣＣＣＡ−ＰＯ４ ５’（配列番号１４）
５’ＰＯ４−ＴＧＧＧＴＡＣＧＡＧＣＡＧＡＣＣＧＡＣＣＧＣＴＡＧＡＣＡＧＣＴＣＣＧＴＧＧＡ（配列番号１５）
ＴＧＣＴＣＧＴＣＴＧＧＣＴＧＧＣＧＡＴＣＴＧＴＣＧＡＧＧＣＡＣＣＴ ５’（配列番号１６）
【０１７４】
この反応を周囲温度で３０分間維持し、その後でＭＸ ３００５Ｐ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、ラ・ホーヤ）上で４０サイクルを実行することによるＳＹＢＲ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社、オレゴン州ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ））Ｇｒｅｅｎに基づく産物形成の検出法によってライゲーション産物を検出した。
【０１７５】
図１２に示したように、Ｔ４／ＳＡ融合タンパク質の平均Ｃｔ値は５〜７閾値サイクル後であり、これは市販のＴ４ ＤＮＡリガーゼと比較して活性のほぼ１００分の１への減少に対応する。さらにデータは、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼが融合タンパク質として機能的であることを証明している。
【０１７６】
実施例８：トポイソメラーゼ活性の近接性に基づく相補性による分析物の検出
本実施例は、同種アッセイにおける分割したトポイソメラーゼ酵素を用いた分析物の検出を証明している（すなわち、ＥＬＩＳＡタイプのアッセイにおけるような酵素を使用せずに、および任意の洗浄工程を使用せずに溶液中で）。当然ながら、本出願で考察するように、近接性に基づく検出法は、固相アッセイとして実施することもできる。例えば、（本実施例のように）酵素がアビジンもしくはストレプトアビジンに結合させられる実施形態においては、検出アッセイは、当該の分析物に対して特異的なビオチン化抗体を用いて固相アッセイとして実施することができる。
【０１７７】
以下の実験では、分析物はビオチン化タンパク質（ビオチン化ＢＳＡまたはビオチン化ＩｇＧ（抗体）のいずれか）であり、分析物特異的結合分子はストレプトアビジンであり、酵素は融合タンパク質としてのストレプトアビジンに結合させたトポイソメラーゼである。ワクシニアウイルス・トポイソメラーゼは、各々がストレプトアビジンに融合したＮ末端およびＣ末端フラグメントに分割した。詳細には、以下のトポイソメラーゼＣ末端フラグメント−ストレプトアビジン融合タンパク質を合成した：
Ｈｉｓ−ＳＡ−Ｃ−Ｔｏｐｏ：
ＭＧＳＳＨＨＨＨＨΗＡＡＥＡＧＩＴＧＴＷＹＮＱＬＧＳＴＦＩＶＴＡＧＡＤＧＡＬＴＧＴＹＥＳＡＶＧＮＡＥＳＲＹＶＬＴＧＲＹＤＳＡＰＡＴＤＧＳＧＴＡＬＧＷＴＶＡＷＫＮＮＹＲＮＡＨＳＡＴＴＷＳＧＱＹＶＧＧＡＥＡＲＩＮＴＱＷＬＬＴＳＧＴＴＥＡＮＶＷＫＳＴＬＶＧＨＤＴＦＴＫＶＫＰＳＡＡＳＩＤＡＡＫＫＡＧＶＮＮＧＮＰＬＤＡＶＱＱＬＥＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＩＲＩＫＤＬＲＴＹＧＶＮＹＴＦＬＹＮＦＷＴＮＶＫＳＩＳＰＬＰＳＰＫＫＬＩＡＬＴＩＫＱＴＡＥＶＶＧＨＴＰＳＩＳＫＲＡＹＭＡＴＴＩＬＥＭＶＫＤＫＮＦＬＤＶＶＳＫＴＴＦＤＥＦＬＳＩＶＶＤＨＶＫＳＳＴＤ（配列番号１７）
【０１７８】
以下のトポイソメラーゼＮ末端フラグメント−ストレプトアビジン融合タンパク質を合成した：
Ｎ−Ｔｏｐｏ−ＳＡ−Ｈｉｓ：
ＭＲＡＬＦＹＫＤＧＫＬＦＴＤＮＮＦＬＮＰＶＳＤＤＮＰＡＹＥＶＬＱＨＶＫＩＰＴＨＬＴＤＶＶＶＹＥＱＴＷＥＥＡＬＴＲＬＩＦＶＧＳＤＳＫＧＲＲＱＹＦＹＧＫＭＨＶＱＮＲＮＡＫＲＤＲＩＦＶＲＶＹＮＶＭＫＲＩＮＣＦＩＮＫＮＩＫＫＳＳＴＤＳＮＹＱＬＡＶＦＭＬＭＥＴＭＦＦＩＲＦＧＫＭＫＹＬＫＥＮＥＴＶＧＬＬＴＬＫＮＫＨＩＥＩＳＰＤＥＩＶＩＫＦＶＧＫＤＫＶＳＨＥＦＶＶＨＫＳＮＲＬＹＫＰＬＬＫＬＴＤＤＳＳＰＥＥＦＬＦＮＫＬＳＥＲＫＶＹＥＣＩＫＱＦＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＲＲＩＬＶＳＡＡＥＡＧＩＴＧＴＷＹＮＱＬＧＳＴＦＩＶＴＡＧＡＤＧＡＬＴＧＴＹＥＳＡＶＧＮＡＥＳＲＹＶＬＴＧＲＹＤＳＡＰＡＴＤＧＳＧＴＡＬＧＷＴＶＡＷＫＮＮＹＲＮＡＨＳＡＴＴＷＳＧＱＹＶＧＧＡＥＡＲＩＮＴＱＷＬＬＴＳＧＴＴＥＡＮＶＷＫＳＴＬＶＧＨＤＴＦＴＫＶＫＰＳＡＡＳＩＤＡＡＫＫＡＧＶＮＮＧＮＰＬＤＡＶＱＱＨＨＨＨＨＨ（配列番号１８）
【０１７９】
これらの構築体の各々では、Ｎ末端およびＣ末端トポイソメラーゼフラグメント（下線付き）のアミノ酸配列をストレプトアビジン（ボールド体およびイタリック体）および６ｘ−Ｈｉｓ標識へ融合させる。トポイソメラーゼおよびストレプトアビジンドメインは、グリシンおよびセリンリッチリンカーによって分離する。
【０１８０】
トポイソメラーゼフラグメント自体には、有意な検出可能なトポイソメラーゼ活性を有していない。しかし一緒に結合すると、両方の半分は相互に対して測定可能な親和性を有しており（本発明者らの推定では、約２×１０−９Ｍ）、トポイソメラーゼ活性を再構成できる。推定ＫＤを超える濃度で両半分を使用した実験に基づくと、Ｎ末端およびＣ末端フラグメントから再構成されたトポイソメラーゼは、全長トポイソメラーゼとほぼ同一の酵素活性を提示する。これらの内因性親和性のＫＤ未満の濃度で使用した場合は、トポイソメラーゼフラグメントは、トポイソメラーゼ活性の近接性依存性再構成によって分析物を検出するために使用できる。
【０１８１】
分析物のシグナル対近接性依存性検出のプロットは、最終的に全部の分析物特異的結合剤は別個の分析物分子と結び付き、近接性増強シグナル生成に関わることがあり得ないように、典型的には分析物濃度が分析物特異的結合剤の濃度より高い場合に観察されるスケルチング作用に起因する二相曲線を生じさせる。分析物特異的結合剤の濃度の上限は、分析物特異的結合剤の相互に対する親和性のＫＤによって与えられる。ＫＤを超える濃度では、大多数の酵素の半分はすでに再構成される。分析物特異的結合剤の濃度を低下させると、シグナルがまだ検出限界の上方にあればアッセイ感受性を改善できる。分析物特異的結合剤の濃度の下限は、分析物特異的結合分子（例、ストレプトアビジン）の分析物（例、担体タンパク質に結合したビオチン、ＫＤ １０−１４Ｍ）への親和性およびシグナル検出のための検出限界によって決定する。
【０１８２】
近接性依存性検出実験は、ストレプトアビジンに融合した指示濃度のＮ末端およびＣ末端トポイソメラーゼフラグメントを用いて３μＬの反応容量で実施した（図１３および１４を参照されたい）。詳細には、１μＬのビオチン化ＢＳＡもしくはビオチン化ヤギ−抗ウサギ抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｑｕａｌｅｘ社、カリフォルニア州サンクレメンテ（Ｓａｎ Ｃｌｅｍｅｎｔｅ，ＣＡ））を指示（最終）濃度で１μＬのストレプトアビジン／Ｎ末端トポイソメラーゼフラグメント融合タンパク質および１μＬのストレプトアビジン／Ｃ末端トポイソメラーゼフラグメント融合タンパク質（４５０ｐｍ、１１０ｐＭ、または５５ｐＭいずれかの最終濃度で、各々はそのモノマー形にある）と混合した。この混合物を室温で４時間にわたりインキュベートした。１μＬのトポイソメラーゼ基質（１２ｎＭ）を加え、さらに１０分間にわたりインキュベートした。最終濃度が４００ｎＭの増幅プライマーを含む２６μＬのＢＲＩＬＬＩＡＮＴ（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、ラ・ホーヤ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ））ＰＣＲミックスを加え、トポイソメラーゼ由来鋳型の量は、ＭＸ ３００５Ｐ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、ラ・ホーヤ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ））上で４０サイクル実行することによるＳＹＢＲ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社、オレゴン州ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ））に基づく産物形成検出法によって検出した。提示のために、Ｃｔ値は、全長トポイソメラーゼ／ストレプトアビジンの標準曲線に基づいて全長トポイソメラーゼ等量へ変換させた。図１３ならびに図１４Ａおよび１４Ｂにおける黒塗り記号は、分析物を伴わないバックグラウンドシグナルを表している。ビオチン化タンパク質（ＢＳＡおよびＩｇＧ）についての推定検出限界は、約５００ｆＭまたは２×１０７分子であった。
【０１８３】
その他の実施形態
上記の説明から、様々な使用および状態に適合させるために、本明細書に記載した本発明に変更および修飾を加えられることは明白であろう。このような実施形態もまた、以下の特許請求項の範囲内に含まれる。
【０１８４】
本明細書の変量の任意の定義における要素の列挙は、任意の単一要素または列挙した要素の組み合わせ（もしくは小組み合わせ）としての変量の定義を含んでいる。本明細書での実施形態についての詳述は、任意の単一実施形態としての、または任意の他の実施形態もしくはそれらの部分と組み合わせた実施形態を含んでいる。
【０１８５】
本明細書で言及した全ての特許および刊行物は、各独立特許および刊行物が参照して組み込まれると特別かつ個別に言及されているのと同程度まで参照して本明細書に組み込まれる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジーの分野に関する。より詳細には、本発明は、分析物を検出および定量するための、例えばリガーゼ、トポイソメラーゼ、または逆転写酵素などの酵素へ結合した結合分子を有する分析物特異的結合剤を用いる、便宜的で高速かつ感受性の方法、組成物、およびキットに関する。分析物が結合分子に結合すると、酵素は、核酸増幅反応のための鋳型を生成するための手段を提供する。増幅産物の存在の検出は、サンプル中に分析物が存在することを表示する。
【背景技術】
【０００２】
イムノアッセイの開発および核酸検出における進歩は、生物学的サンプル中の分析物の検出を前進させてきた。酵素結合免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、サンプル中のタンパク質の存在についてのサンプルの高スループット・スクリーニングを許容する。分析物の存在は、アルカリ・ホスファターゼまたはホースラディッシュ・ペルオキシダーゼをベースとする酵素的比色アッセイの使用によって検出されることが多い。これは酵素基質の比色変化の検出範囲に依存してアッセイの感受性および範囲を制限する。これには、血清中の分析物のおおよその量を決定するための初期スクリーニング、またはサンプルが使用される特定方法および試薬の検出範囲内で試験されることを保証するために、広範囲の連続する希釈率の使用のいずれかを必要とする。この方法に関するその他の問題には、高いバックグラウンドレベルならびに低感受性が含まれる。例えば、ＥＬＩＳＡプレートへのホースラディッシュ・ペルオキシダーゼの直接結合は、非特異的バックグラウンドシグナルを生じさせる。非特異的結合を減少させるために、比較的に不活性のタンパク質（乳汁または血清アルブミン）を含有するブロッキング溶液がアッセイに加えられる。しかし、バックグラウンドシグナルを生じさせる非特異的結合は排除されないので、それによってアッセイは低感受性となる。
【０００３】
これらの制限に対応するために、酵素に基づくサンプル中の分析物の検出と結び付けて使用するための核酸に基づく検出方法が開発されてきた。このような方法は、時々はイムノ−ＰＣＲと呼ばれている。
【０００４】
例えば、特許文献１は、特異的タンパク質を検出する感受性を増加させるために、抗体の検出とポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）とを結び付けている。標準的イムノ−ＰＣＲプロトコールでは、核酸配列に結合した抗体は、抗原分子上のエピトープに結合する。抗体と核酸との結合は、核酸および抗体に対して二重特異性親和性を備えるリンカーを介して発生するので、このため特異的抗原−抗体−ＤＮＡコンジュゲートの形成を生じさせる。続いて、結合した核酸配列のセグメントはＰＣＲによって増幅させられ、ＰＣＲ産物はゲル電気泳動法によって検出される。しかし、ＤＮＡを抗体へ結合させる工程は、ＤＮＡが付着性であり、任意の未結合ＤＮＡは検出前にシステムから容易に洗浄されないために、アッセイにおける非特異的結合および高いバックグラウンドを生じさせるので、問題が多い。
【０００５】
その他のイムノ−ＰＣＲアッセイおよび方法は、例えば、非特許文献１、特許文献２および特許文献３；特許文献４；特許文献５および特許文献６に記載されている。特許文献２および特許文献３、特許文献４、および特許文献５は、それらの各々がオリゴヌクレオチドに連結している、少なくとも第１および第２分析物結合化合物（例えば、抗体など）を用いる方法を含んでいる。化合物が分析物に結合すると、オリゴヌクレオチドは近接近させられ、そこでこれらは相互作用して、増幅反応工程後に検出可能な核酸複合体を形成することができる。しかしこれらの方法はいずれも、結合化合物を酵素とは連結させない。むしろこれらの方法は全部が、相違するオリゴヌクレオチドに連結した２つ以上の結合化合物の使用を必要とする。さらに、オリゴヌクレオチドの小さな部分が、特別にはバックグラウンドシグナルに起因して、結合化合物の濃度が上昇するにつれて分析物の非存在下で相互作用する可能性がある。
【０００６】
特許文献５は、１）例えばオキシダーゼなどの開裂誘導成分を有し、複合体内で第１タンパク質に対して特異的である第１プローブと、２）複合体内で１つ以上の第２タンパク質に対して特異的な１つ以上の結合化合物とを用いるイムノ−ＰＣＲアッセイについて記載している。第１プローブおよび１つ以上の結合化合物が複合体と結合し、近接近させられると、開裂プローブは、結合化合物に結合した分子標識を開裂する、一重項酸素などの活性種を生成するように誘導される。放出された分子標識は、サンプル中の分子複合体のプロファイルを提供するために分離かつ検出される。極めて様々な分離技術を使用すると、物理的、化学的または光学的相違に基づいて当該の分子標識を識別することができる。しかし、このシステムで使用される分子標識は、開裂誘導成分による開裂に感受性でなければならない。
【０００７】
特許文献７は、核酸分子を修飾することのできるホスファターゼなどの酵素を検出するための方法について記載している。ホスファターゼがサンプル中に存在する場合は、ホスファターゼは標的核酸分子から５’末端リン酸塩を除去し、それによりエキソヌクレアーゼ消化から標的核酸を保護するであろう。エキソヌクレアーゼ処理および任意の増幅反応工程後の標的核酸の検出は、サンプル中のホスファターゼの存在を指示している。この方法は抗体もしくはその他の結合成分に結合したＤＮＡを含むプローブの使用を回避するが、その教示はホスファターゼ活性を有する酵素の検出に限定される。さらに、検出された酵素は、核酸分子を直接的に修飾することができなければならない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第５，６６５，５３９号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００２／００６４７７９号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００５／０００３３６１号明細書
【特許文献４】米国特許第６，５１１，８０９号明細書
【特許文献５】国際公開第２００５／０１９４７０号パンフレット
【特許文献６】国際公開第２００７／０４４９０３号パンフレット
【特許文献７】米国特許出願公開第２００６／０２５７８７９号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｎｉｅｍｅｙｅｒら、（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．３１：ｅ９０，２００３）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本開示は、分析物特異的結合剤を用いてサンプル中の分析物を検出および定量するための方法、キット、および組成物を提供する。分析物特異的結合剤は、例えば、リガーゼ、トポイソメラーゼ、または逆転写酵素などの酵素に結合した分析物特異的結合分子を含んでいる。分析物特異的結合剤は、使用される特異的結合分子に対応する分析物を検出するために分析物特異的結合剤を分析物に結合させるための条件下で、サンプルとともにインキュベートされる。結合した分析物特異的結合剤は、１つ以上のポリヌクレオチドと、分析物特異的結合剤中の酵素に依存して、酵素が核酸増幅反応のための鋳型を生成することを許容する条件下でインキュベートされる。鋳型は、好ましくは、増幅産物を形成するために使用できるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のための鋳型である。増幅産物の存在の検出は、サンプル中に分析物が存在することを表示する。定量的増幅反応は、サンプル中の分析物の量を定量するために実施できる。これらの方法、組成物、およびキットは、特異的結合対結合反応（例、免疫検出法）と触媒反応（例、酵素に基づく検出系）の感受性とを結び付ける。これらはさらに、市販の系において見られる様々なバックグラウンドの起源を減少または排除する２工程結合／検出プロセスを許容することによって、市販の系全体のバックグラウンドレベルの減少を許容する。
【００１１】
１つの態様においては、サンプル中の分析物を検出するための方法であって、分析物特異的結合剤を、結合を許容する条件下で分析物を含有する可能性があるサンプルと接触させる工程による方法が提供される。分析物特異的結合剤は、リガーゼ活性を有する酵素に結合した分析物特異的結合分子を含んでいる。リガーゼ活性は、トポイソメラーゼまたはリガーゼのいずれかから引き出すことができる。結合した分析物特異的結合剤は、さらにリガーゼ活性のために基質とインキュベートされる。基質は、少なくとも１つの二本鎖ＤＮＡ分子の第１および第２末端を含んでおり、末端は、増幅鋳型を形成するために（例、ライゲーション混合物中で）ライゲーションを許容する条件下で相互にアニーリングしてライゲートされることのできる適切な付着末端である。これらの末端は、少なくとも１つの二本鎖ＤＮＡ分子によって、少なくとも２つの別個の二本鎖ＤＮＡ分子によって、または少なくとも１つの二本鎖ＤＮＡ分子および１つの一本鎖核酸分子によって提供することができる。ライゲーション混合物の少なくとも一部分は、増幅産物を少なくとも１つのｄＮＴＰ、好ましくは全４つのｄＮＴＰ、およびポリメラーゼの存在下で生成することを許容する方向において鋳型の反対側の鎖へハイブリダイズする少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーを含む増幅反応混合物中においてインキュベートされる。増幅産物は、分析物がサンプル中に存在するかどうかを決定するための増幅反応中および／または後に検出される。増幅産物は、ｑＰＣＲまたは他の方法による増幅中に検出することができる。
【００１２】
また別の態様においては、サンプル中の分析物を検出するための方法であって、分析物特異的結合剤を、分析物の結合を許容する条件下でサンプルとともにインキュベートする工程による方法が提供されるが、このとき分析物特異的結合剤は、逆転写酵素に結合した分析物特異的結合分子を含んでいる。結合した分析物特異的結合剤は、さらに逆転写反応混合物中で基質として機能できるＲＮＡ分子とインキュベートされると、順に核酸増幅のための鋳型として機能できるｃＤＮＡを形成する。逆転写反応混合物の少なくとも一部分は、好ましくは少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーを含む増幅反応混合物中でインキュベートされる。プライマーは、１つは相補鎖の重合を許容するためにｃＤＮＡにハイブリダイズでき、１つはｃＤＮＡの相補鎖へハイブリダイズできるように設計される。プライマーは、少なくとも１つのｄＮＴＰ、好ましくは全４つのｄＮＴＰ、およびポリメラーゼの存在下で生成することを許容する方向において、ｃＤＮＡおよび相補鎖へハイブリダイズするように設計される。増幅産物は、分析物がサンプル中に存在するかどうかを決定するための増幅反応中および／または後に検出される。増幅産物は、ｑＰＣＲまたは他の方法によって増幅中に検出することができる。
【００１３】
さらに別の態様においては、本明細書に開示した方法を実践するためのキットおよび組成物が提供される。キットおよび組成物は、例えば、トポイソメラーゼ、リガーゼ、または逆転写酵素などの酵素に結合した分析物特異的結合分子を含む分析物特異的結合剤、酵素成分のための１つ以上のポリヌクレオチド基質、およびそれらのためのパッキング材料を含むことができる。本キットもしくは組成物は、例えば逆転写酵素、ＰＣＲ用試薬、特別にはｑＰＣＲなどの核酸増幅反応工程のための１つ以上の試薬、およびプライマーをさらに含むことができる。分析物特異的結合剤の代わりに、本キットもしくは組成物は、例えば抗体などの分析物特異的結合成分へ結合するための基を有する酵素を含むことができる。例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、またはプロテインＬに結合した酵素は、最終使用者が分析物特異的結合剤を形成するために抗体と混合することができる。または、酵素は、ストレプトアビジンもしくはアビジンに結合させ、他の起源（例、市販されているかまたは実験室で生成する）から入手したビオチン化抗体と混合することができる。以下では、分析物特異的結合分子および酵素を相互に結合させるためのその他の方法について考察する。
【００１４】
また別の態様においては、分析物特異的結合分子および酵素を含む分析物特異的結合剤が提供される。分析物特異的結合剤は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、レクチン、細胞表面受容体、受容体リガンド、ペプチド、炭水化物、アプタマー、ビオチン、ストレプトアビジン、アビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、およびプロテインＬ、ならびにそれらの任意の結合フラグメントからなる群から選択される分析物特異的結合分子を含むことができる。酵素は、トポイソメラーゼ、リガーゼ、逆転写酵素、アデニングアニン・アルキルトランスフェラーゼ、メチルトランスフェラーゼ、リコンビナーゼ類、例えばＣｒｅリコンビナーゼλ−インテグラーゼ、φＣ３１−リコンビナーゼまたはｆｌｐ−リコンビナーゼ、およびポリヌクレオチドキナーゼを含むことができる。
【００１５】
また別の態様においては、分析物を検出するための方法、キット、および組成物が提供されるが、このとき２つ以上の分析物特異的結合剤と分析物との間で複合体が形成される。この態様では、各分析物特異的結合剤は、分析物特異的結合分子およびそれに結合した酵素の一部分を含んでいる。酵素の部分は相互作用して、分析物特異的結合剤が分析物に結合すると、機能的酵素複合体を形成する。機能的酵素複合体は、次にサンプル中における分析物の存在および／または量の指標である検出可能なシグナルを生成する。所定の実施形態においては、酵素は、リガーゼ、トポイソメラーゼ、または逆転写酵素である。そこで、本出願に記載した方法、キット、および組成物では、酵素に結合した分析物特異的結合分子は、各々が分析物特異的結合分子および酵素の一部分を含む２つ以上の分析物特異的結合剤と、酵素の部分が相互作用して分析物特異的結合剤が分析物へ結合すると機能的酵素複合体を形成するように、置換することができる。
【００１６】
所定の態様においては、第１および第２結合分子は、抗体（またはその抗原結合フラグメント）を含んでいる。１つの実施形態においては、抗体は、例えば融合タンパク質として、酵素へ直接的に連結または結合している。他の実施形態においては、抗体は、例えばビオチン−ストレプトアビジンまたはビオチン−アビジン相互作用などのビオチン−結合相互作用を通して、酵素へ間接的に連結または結合している。
【００１７】
１つの態様においては、抗体などの分析物特異的結合分子は、スペーサ分子によって酵素から分離されている。同様に、酵素が抗体などの分析物特異的結合成分へ結合または連結するための基（例、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、ビオチン、ストレプトアビジン、またはアビジン）を有する１つの実施形態においては、酵素は、スペーサ分子によって基から分離することができる。複数の実施形態においては、スペーサ分子は、ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質、ポリヌクレオチド、またはその他の化学リンカーを含んでいる。スペーサ分子を用いることによって分析物特異的結合分子を酵素から分離することは、例えば融合タンパク質に対するより大きな柔軟性を提供し、結合および酵素成分の妨害されない機能を促進することに有用である。スペーサ分子は、さらにまた分割酵素成分（例、ＮおよびＣ末端部分）の相互作用および機能的酵素複合体の再構成を促進するためにも役立つ。
【００１８】
用語の定義
本明細書で使用する用語「増幅」または「合成」は、核酸配列に適用される場合は、それによって特定核酸配列の１つ以上のコピーが鋳型核酸から生成されるプロセスを意味する。本明細書で使用する「増幅」は、プライマー伸長反応によるように、核酸配列の単一複製（ｓｉｎｇｌｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ／ｃｏｐｙｉｎｇ）を含むことが意図されている。しかし一般的に、増幅は、当技術分野において周知の技術であるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）テクノロジー（Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ，Ｃ．Ｗ．ａｎｄ Ｇ．Ｓ．Ｄｖｅｋｓｌｅｒ（１９９５） ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．）を用いて実施される。さらに、本明細書に開示した方法は、鎖置換増幅法（ＳＤＡ）、回転環増幅法（ＲＣＡ）、転写媒介増幅法（ＴＭＡ）またはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）を用いて実施することができる。シグナルの増幅は、リアルタイム増幅法を用いて均質な閉管環境内で生成することができる。リアルタイム増幅法のために適切な機器類には、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製Ｍｘ３００５Ｐ、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ社製ＴａｑＭａｎシステム、Ｒｏｃｈｅ社製ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ、Ｉｄａｈｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製ＲａｐｉｄＣｙｃｌｅｒ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製ｉＣｙｃｌｅｒおよびＣｅｐｈｅｉｄ社製ＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒが含まれる。
【００１９】
本明細書で使用する「増幅産物」は、熱安定性または非熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いて重合反応によって生成されたポリヌクレオチドを意味する。好ましい実施形態においては、重合反応は、ポリメラーゼ連鎖反応である。増幅産物は、定性的または半定量的方法によって、例えばゲル電気泳動法および染色もしくはドットブロット法によって、増幅反応中および／または増幅反応後の１つ以上の時点に入手された増幅反応由来のサンプルを使用して検出することができる。増幅産物は、増幅反応を通して、例えば上述した試薬などの、多数の市販の試薬のいずれかを用いて蛍光監視により定量的ＰＣＲ法を使用して検出することができる。
【００２０】
１つの実施形態においては、指数関数的増幅は、一本鎖ポリヌクレオチド鋳型および単一プライマーを用いて達成できる。これは、一本鎖標的の一方の末端ではプライマー結合配列を、および標的鎖の反対側の末端ではプライマー結合部位の相補配列を含有するポリヌクレオチド鋳型配列を設計することによって達成される。プライマーのアニーリングおよび伸長は、同一のプライマー結合部位を含有する標的相補鎖の形成を生じさせる。この方法では、結果として生じる二本鎖標的の（＋）および（−）鎖はどちらも標的二重鎖の対向する末端で同一のプライマー部位を含有しており、ポリメラーゼおよび標的核酸と組み合わせて使用される同一プライマーは、＋および−標的鎖の両方の複製を促進する。そこで、所定の実施形態においては、本出願で考察する第１および第２プライマーは、同一プライマーであってよい。
【００２１】
本明細書で使用する用語「分析物」は、本明細書に開示した方法によって検出またはアッセイされる物質を意味する。典型的な分析物には、タンパク質、ペプチド、細胞表面受容体、受容体リガンド、核酸、炭水化物、分子、細胞、微生物およびそれらのフラグメント、またはそれに対して分析物特異的結合分子、例えば抗体を発生させることのできる任意の物質が含まれてよいが、これらに限定されない。
【００２２】
本明細書で使用する用語「分析物特異的結合剤」は、酵素の少なくとも活性部分に結合または連結した分析物特異的結合分子を有する分子を意味する。これらの部分は、例えば、単一融合タンパク質として２つの部分の発現によって、いずれのタンパク質にも自然ではない介在配列を用いて、または用いずに結合することができる。例えばプロテインＡ、Ｇ、またはＬなどの一般的抗体結合リガンドに対するコーディング配列は、酵素を分析物結合分子へ結合させるために、酵素のコーディング配列へ融合させ、抗体と混合することができる。ビオチンおよびストレプトアビジンなどの高親和性結合パートナーもまた使用できる。ビオチンは、分析物特異的結合剤のいずれかの部分に結合させることができ、アビジンまたはストレプトアビジンは相互に結合させることができる。分析物特異的結合分子、例えば抗分析物ｍＡｂ（モノクローナル抗体）は、分析物特異的結合剤を形成するために架橋剤によって酵素へ結合させることができる。タンパク質をコンジュゲート化するために当技術分野において公知の任意の架橋結合化学は、本発明と結び付けて使用できる。
【００２３】
結合部分は、結合分子が酵素の活性を実質的に妨害しない、およびその逆もまた同様であるように、酵素成分へ機能的に連結している。この連結は、酵素の活性を７０％、６０％、５０％、４０％もしくは３０％未満、好ましくは２５％、２０％、１５％、もしくは１０％未満、より好ましくは５％、３％、２％、もしくは１％未満減少させる。同様に、この連結は、結合成分の親和性を７０％、６０％、５０％、４０％もしくは３０％未満、好ましくは２５％、２０％、１５％、もしくは１０％未満、より好ましくは５％、３％、２％、もしくは１％未満減少させる。本発明は、分析物特異的結合剤の成分の特定構造または結合方法によって限定されない。典型的には、分析物特異的結合分子および酵素は、約１：１の比で存在している。しかし、様々な部分の機能が他の成分の存在によって実質的に阻害されないことを前提に、その他の比率も可能である。
【００２４】
分析物特異的結合剤の酵素成分に適用される本明細書で使用する用語「相互作用する」は、反応性成分が物理的に結び付くことができるように、２つ以上の反応性成分（例、酵素の第１および第２部分、例えばトポイソメラーゼ、リガーゼ、または逆転写酵素）を相互に近接近させることを意味する。酵素の第１および第２部分を有する１対の分析物特異的結合剤が分析物に結合すると、酵素の第１および第２部分は、相互作用して機能的酵素複合体を形成できるように近接近させられる。この機能的酵素複合体を次に使用すると、増幅鋳型を（例えば、リガーゼまたは逆転写酵素活性を通して）合成することができる。酵素の第１および第２部分が（相互作用せずに）分離される場合は、これらの部分には実質的に合成活性（すなわち、酵素活性、例えばリガーゼまたは逆転写酵素活性を通して増幅反応に使用できる鋳型を合成する能力）が欠けている。
【００２５】
本明細書で使用する用語「実質的に合成活性が欠けている」は、機能的酵素複合体の合成活性を５０％、４０％、３０％、２０％または１０％以上有していない、および好ましくは１％未満しか有していない酵素の第１または第２部分を意味する。
【００２６】
本明細書で使用する、第１酵素に関連する用語「部分」は、単離されると実質的に核酸合成活性が欠如するが、酵素の第２部分と相互作用すると核酸合成活性を有する、酵素のフラグメントを意味する。本明細書で使用する、第１酵素に関連する用語「部分」は、５０〜１０００アミノ酸のフラグメントであるが全長酵素より短いフラグメントを意味する。１つの実施形態においては、部分は、酵素の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、もしくは６００以上のアミノ酸を有するが、全長酵素よりは短い。また別の実施形態では、酵素の第１および第２部分は一緒に、野生型酵素の少なくとも９０％、または少なくとも９５％配列同一性を含んでおり、それらが相互作用すると機能的酵素複合体を形成する。
【００２７】
本明細書で使用する用語「機能的酵素複合体」は、本明細書に規定したように、いずれかの部分単独（例、複合体中ではない）の合成活性の少なくとも２倍である合成活性を有するポリペプチド複合体を形成するために相互作用する酵素の２つ以上の部分を意味している。
【００２８】
本明細書で使用する用語「アニーリング」は、オリゴヌクレオチドプライマーが相補的付着末端または鋳型核酸鎖へハイブリダイズすることを許容することを意味する。プライマーアニーリングのための条件は、プライマーの長さおよび配列に伴って変動し、そのプライマーについての計算Ｔｍ値に基づいている。本明細書で使用する用語「アニーリングを許容する条件下」は、反応において適切な塩、カチオン、緩衝液、および相補的核酸の濃度、ならびに二本鎖核酸分子の形成が可能であるような適切な温度を含むがこれらに限定されない適切な条件を有することであると理解されている。本明細書で使用する「二本鎖核酸分子」は、好ましくは２つの別個の核酸分子によって形成される。一般に、増幅レジメンにおけるアニーリング工程は、鎖分離工程後に温度をプライマー配列について計算されたＴｍに基づく温度へ、このようなアニーリングを許容するために十分な時間にわたり低下させることを含んでいる。
【００２９】
本明細書で使用する用語「抗体」は、抗原、例えば分析物に結合できる免疫グロブリンタンパク質を意味する。抗体は、一般には「エピトープ結合フラグメント」と呼ばれる、全長抗体によって認識されるエピトープへ結合する能力を保持している抗体の任意の部分を含んでいる。抗体フラグメントの実施例には、好ましくは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）ならびにＶＬもしくはＶＨドメインのいずれかを含むフラグメントが含まれるが、これらに限定されない。一本鎖抗体を含むエピトープ結合フラグメントは、可変領域を単独で、または次のヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインの全体もしくは一部分と組み合わせて含むことができる。
【００３０】
本明細書で使用する用語「分析物特異的結合分子」は、分析物に安定性で結合する分子または分子の一部分を意味する。結合分子には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、アプタマー、細胞表面受容体、受容体リガンド、ビオチン、ストレプトアビジン、アビジン、ならびにプロテインＡ、Ｇ、およびＬ、レクチン、核酸、ペプチド、分析物相互作用パートナーが含まれるが、これらに限定されない。結合分子は、さらにまた列挙した結合成分の結合フラグメント、例えば上記に列挙した抗体フラグメントであってよい。結合分子は、分析物特異的結合剤を形成するために酵素へ直接的または間接的に連結している。
【００３１】
本明細書で使用する用語「結合分析物特異的結合剤」は、その対応する分析物に結合した分析物特異的結合剤である。
【００３２】
本明細書で使用する用語「Ｃｔ」は、定量的増幅反応から生成されたシグナルが最初に「閾値」より上方に上昇する、すなわち標的核酸配列の増幅の最初の確実な検出が生じるサイクル数を意味する。「確実な」は、シグナルが増幅中の増幅産物の検出可能なレベルを反映することを意味する。Ｃｔは、一般に未知の量の標的核酸の出発量と相関しており、すなわちより低量の標的はより後期のＣｔを生じさせる。Ｃｔは、出発核酸の初期コピー数または濃度と結び付いている。
【００３３】
「捕捉分子」は、分析物へ結合するための固体支持体上の特異的または非特異的物質を意味する。捕捉分子は、分析物へ特異的に結合する抗体であってよい。捕捉分子は、さらにまた分析物によって結合されている一本鎖もしくは二本鎖の核酸配列、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。または、捕捉分子は、ポリ−リジン、シラン、コラーゲン、または固体支持体上に分析物を捕捉するための他の非特異的物質であってよい。
【００３４】
本明細書で使用する、リガーゼ、ポリメラーゼ、トポイソメラーゼ、または他の酵素の用語「触媒部分」は、本明細書に開示した方法に使用される酵素反応を促進するために必要とされる酵素の部分である。このような酵素の構造は公知であり、様々なアミノ酸とドメインおよび酵素活性との間の構造−機能関係は明確に理解されている（例えば、トポイソメラーゼについてはＣｈａｍｐｏｕｘら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３６９−４１３，１９９１；ならびにポリメラーゼについてはＢｒａｉｔｈｗａｉｔｅ ａｎｄ Ｉｔｏ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：４０４５，１９９１、およびＢｒａｔｈｗａｉｔｅ ａｎｄ Ｉｔｏ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：７８７，１９９３を参照されたい。それら全部は参照して本明細書に組み込まれる）。酵素の特異的触媒活性を実質的には変化させない短縮および突然変異を含有する酵素は、本明細書に開示した方法に使用できる。
【００３５】
本明細書で使用する用語「ｃＤＮＡ」は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例、逆転写酵素）の作用によってＲＮＡ鋳型から生成される相補的またはコピーポリヌクレオチドを意味する。「ｃＤＮＡクローン」は、クローニングベクターで運ばれる、当該のＲＮＡ分子に相補的な二重鎖ＤＮＡ配列を意味する。
【００３６】
本明細書で使用する用語「開裂」は、一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドの一方または両方の鎖の切断、典型的には酵素的切断を意味する。
【００３７】
本明細書で使用する用語「開裂産物」は、ポリヌクレオチドの一方または両方の鎖の切断後に溶液中へ放出されるポリヌクレオチドフラグメントである。一部の実施形態においては、開裂産物は、トポイソメラーゼによって開裂されたオリゴヌクレオチドである。また別の実施形態においては、開裂産物は、制限酵素によって開裂されたオリゴヌクレオチドである。開裂産物は、相補鎖へ事前にハイブリダイズした、短い一本鎖部分であってよい。または、開裂産物は、二本鎖であってよい。
【００３８】
本明細書で使用する用語「開裂部位」は、開裂剤によって開裂され得るポリヌクレオチド構造もしくは配列を意味する。開裂部位には、トポイソメラーゼ酵素認識部位、制限酵素部位、リボザイム部位、ニッカーゼ部位、ＤＮＡザイム部位、回転環レプリコンと結び付いているニッカーゼについての認識部位および移入の起源、ならびにヌクレアーゼ開裂部位が含まれるが、これらに限定されない。例えば、ワクシニアウイルス（ｖａｃｃｉｎｉａ−ｖｉｒｕｓ）に基づくトポイソメラーゼおよびＭＣＶトポイソメラーゼに対する特異的開裂認識部位は、ＣＣＣＴＴである。開裂は、最後のＴの後で起こる。制限酵素のための開裂部位は周知であり、分子生物学試薬のための多数のカタログのいずれかに見いだすことができる。
【００３９】
本明細書で使用する用語「適合性付着末端」は、核酸分子のライゲーションを許容する条件下でハイブリダイズすることのできる、典型的には核酸分子の短い（例えば、長さが約２０ヌクレオチド未満、約１５未満、または約１０未満）一本鎖末端である。付着末端のアニーリングする部分の長さを増加させることによって、鎖が安定性にアニーリングする温度が上昇し、より高温（例えば、３７℃）でのリガーゼの使用を許容する。このような基質は、ヌクレオチド主鎖内にギャップを含むことができるが、ヌクレオチド対合内にはギャップを含んでいない。トポイソメラーゼによるライゲーションは、アクセプター分子の５’末端で遊離５’−ＯＨの存在を必要とし、従来型リガーゼによるライゲーションは５’リン酸基を必要とする。
【００４０】
本明細書で使用する用語「相補的」は、１本の鎖の構造が他方の鎖の構造を決定するように、ＤＮＡ、および場合によってはＲＮＡの鎖間でプリンおよびピリミジン塩基が正確に対合する能力を意味する。第１ポリヌクレオチドは、第２ポリヌクレオチドに対して、第１ポリヌクレオチドのあらゆるヌクレオチドが第２ポリヌクレオチドの相補領域内のヌクレオチドと塩基対を形成する場合は、「十分に相補的」または「完全に相補的」であると言われる。第１ポリヌクレオチドは、第２ポリヌクレオチドに対して、第１ポリヌクレオチドのあらゆるヌクレオチドが第２ポリヌクレオチドの相補領域内でヌクレオチドと塩基対を形成しない場合は、相補的ではない（すなわち、部分的に相補的である）。例えば、２つのポリヌクレオチドは、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％相補的である可能性がある。相補性率は、例えば、相補性塩基の数を二本鎖部分の全長またはポリヌクレオチドの短い方の鎖の長さによって割ることによって決定できる。ポリヌクレオチド鎖間の相補性度は、ポリヌクレオチド鎖間のアニーリングまたはハイブリダイゼーションの効率および強度に有意な影響を及ぼす。これは、ポリヌクレオチド鎖間の結合に依存する、増幅反応において特に重要である。オリゴヌクレオチドは、増幅を許容するために鋳型に対して１００％相補性である必要はない。オリゴヌクレオチドと鋳型との間のミスマッチは、伸長反応においてオリゴヌクレオチドの３’末端よりオリゴヌクレオチドの５’末端に近い方でより多く許容される。典型的には、オリゴヌクレオチドの末端３’ヌクレオチドでのミスマッチは、ポリメラーゼによる伸長を阻害するであろう。
【００４１】
本明細書で使用する、結合、増幅または増幅産物の形成、ライゲーション、ハイブリダイゼーションなどを「許容する条件」は、例えば塩、緩衝液、ヌクレオチド、酵素、二価カチオン、ＡＴＰなどの必要な試薬の存在下での、適切な時間量にわたるｐＨおよび温度の適切な条件にあると理解されている。特定酵素の活性を許容する条件は、典型的には酵素製造業者によって提供される。抗体の結合を許容する条件は、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（Ｅｄｓ．），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，（著作権）１９８８（参照して本明細書に組み込まれる）の中に見いだすことができる。増幅、増幅産物の形成、およびオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを許容する条件は、例えば、Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｊａｎｅｓ（Ｅｄｓ．），ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ、（著作権）２００２（参照して本明細書に組み込まれる）の中に見いだすことができる。
【００４２】
本明細書で使用する「連結した」は、例えば水素、イオン性、またはファンデルワールス（Ｖａｎ−ｄｅｒ−Ｗａａｌｓ）結合によって共有的および非共有的相互作用を通した２つの分子の結び付きまたは結合を意味する。このような結合は、同一もしくは相違する原子もしくはイオンのうちの少なくとも２つの間で、これらの原子もしくはイオンの電子密度の再分布の結果として形成される可能性がある。例えば、酵素は抗体−酵素融合タンパク質としての抗体へ、ストレプトアビジン−ビオチン相互作用を通して、またはＦｃプロテインＡ／Ｇ／Ｌ相互作用（例えば、ポリメラーゼはプロテインＡ／Ｇへ連結され、これは順に抗体のＦｃ領域へ結合する）を介する結合を通して連結させることができる。
【００４３】
本明細書で使用する「検出する工程」、「検出」などは、サンプル中の特定分析のためにアッセイが実施されることであると理解されている。分析物は任意の特定濃度もしくは量でサンプル中に存在する必要はないが、本アッセイが分析物を検出する能力はサンプル中に存在する濃度／量に関連するであろうことに留意されたい。所定の場合には、本明細書に開示した方法は、分析物がサンプル中に存在しない、またはアッセイの検出レベルより低い量で存在することを決定するために使用できる。
【００４４】
本明細書で使用する「ｄＮＴＰ」は、デオキシヌクレオチド三リン酸塩であると理解されており、天然または「標準」ｄＮＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびＴＴＰを含んでいる。本明細書で使用する「ｄＮＴＰ」はさらに、例えば蛍光標識さもなければ化学標識されたヌクレオチドなどの天然および非天然ヌクレオチドアナログを含んでいる。
【００４５】
本明細書で使用する「二本鎖ＤＮＡ」は、ＤＮＡの相補鎖もしくはセグメントにアニーリングしている少なくとも一部分を有するＤＮＡを意味すると理解されている。二本鎖ＤＮＡは、２本の別個の鎖から構成されて、または自己相補的配列（例、ヘアピン構造）を備える単一ポリヌクレオチドであってよい。二本鎖ＤＮＡ分子もしくはポリヌクレオチドは、一本鎖部分を含むことができる。
【００４６】
本明細書で使用する「酵素」は、例えば、トポイソメラーゼ、リガーゼ、逆転写酵素、アデニングアニン・アルキルトランスフェラーゼ、メチルトランスフェラーゼなどの酵素、例えばＣｒｅリコンビナーゼλ−インテグラーゼ、φＣ３１−リコンビナーゼもしくはｆｌｐ−リコンビナーゼなどのリコンビナーゼ類、および分析物特異的結合分子へ結合させることのできるポリヌクレオチドキナーゼの少なくとも触媒部分を含んでいる。酵素部分は、分析物特異的結合分子から独立して存在することができる。
【００４７】
本明細書で使用する「融合ポリペプチド」は、フレーム内で相互に結合（連結）している２つ以上のポリペプチドを含むポリペプチドを意味する。本明細書で使用する用語「結合した」もしくは「融合した」は、フレーム内で相互に結合した２つ以上のポリペプチドをコードする融合分子を形成するためにポリペプチドまたは核酸の２つ以上のセグメントを一緒に結合することを意味する。２つ以上のポリペプチドは、直接的に、またはリンカー配列を介して結合させることができる。
【００４８】
本明細書で使用する「ハイブリダイゼーション」は、相補的ヌクレオシドもしくはヌクレオチド塩基間でのワトソン−クリック（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ）、フーグスティーン（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ）もしくは逆フーグスティーン水素結合であってよい、水素結合の工程を意味している。例えば、アデニンおよびチミンは、水素結合の形成を通して対合する相補的核酸塩基である。
【００４９】
本明細書で使用する「単離（した）」または「精製（した）」は、ポリヌクレオチドに関連して使用する場合は、天然型配列がその通常の細胞（例、染色体）環境から分配されている、または非自然環境において合成（例えば、人工的に合成）されていることを意味する。ここで、「単離（した）」または「精製（した）」配列は、無細胞溶液中にあってよい、または相違する細胞環境内に配置されていてよい。用語「精製（した）」は、その配列が存在する唯一のヌクレオチド配列であるが、それと自然に関連している非ヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドを実質的に含んでいない（約９０〜９５％、９９〜１００％まで純粋）ことを意味していないので、単離染色体とは識別される。
【００５０】
本明細書で使用する「リガーゼ」は、酵素である適切なリガーゼ基質中でＤＮＡ鎖の隣接端の結合を触媒することのできるリガーゼもしくはトポイソメラーゼ酵素の少なくとも一部分である。リガーゼの構造および機能は、当技術分野において周知である。例えば、全部がこれにより参照して本明細書に組み込まれるＴｉｍｓｏｎ ＤＪら、“ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｐａｉｒ ａｎｄ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ，” Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２０００ ４０：３０１−１８；Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ Ａら、“Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅｓ，” Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００１ ４０：１２４１−４８；Ｍａｒｔｉｎ ａｎｄ ＭａｃＮｅｉｌ，“ＡＴＰ−ｄｅｐｅｄｅｎｄｅｎｔ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅｓ，” Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００２ ３（４）：ｒｅｖｉｅｗｓ３００５．１−３００５．７を参照されたい。用語のリガーゼは、ＲＮＡリガーゼをさらに含んでいる。
【００５１】
本明細書で使用する「融点」もしくは「Ｔｍ」は、２つの相補的核酸分子の相互に対する親和性に関連する温度値であると理解されている。Ｔｍは、当業者であれば、多数の広汎に利用できる多数のアルゴリズム（例、ＯＬＩＧＯ（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ社、カリフォルニア州カスケード（Ｃａｓｃａｄｅ，ＣＡ））、Ｐｒｉｍｅｒ Ｄｅｓｉｇｎ、ならびにＰｒｉｍｅｒ３およびＯｌｉｇｏ Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒを含むインターネット上で入手できるプログラム）のいずれかを用いて容易に予測できる。大多数の増幅レジメンのためには、アニーリング温度は予測Ｔｍより約５℃低い温度へ選択されるが、Ｔｍにより近い、およびそれより高い（例、予想Ｔｍより１℃〜５℃低い、または予想Ｔｍの１℃〜５℃高い）温度を使用でき、同様に予想Ｔｍより５℃より低い、または高い（例、６℃低い、８℃低い、１０℃低い、および６℃高い、８℃高い、または１０℃高い）温度も使用できる。一般に、アニーリング温度がＴｍにより近いほど、アニーリングはより特異的である。プライマーのアニーリング時間は、反応量に高度に左右され、反応量が大きいほどより長い時間を必要とするが、さらにまたプライマーおよび鋳型の濃度に依存し、鋳型に対するプライマーの相対濃度が高いほど、低濃度より短い時間を必要とする。容量および相対プライマー／鋳型濃度に依存して、増幅レジメンにおけるプライマーアニーリング工程は、約１秒間〜５分間であってよいが、一般には１０秒間〜２分間であろう。
【００５２】
本明細書で使用する用語「成分」もしくは「部分」は、例えば分析物特異的検出剤などの何かがそれに分けられる活性ドメインの１つであると理解されている。成分もしくは部分は、分析物特異的検出剤から独立して存在することができる。
【００５３】
本明細書で使用する用語「オリゴヌクレオチド」もしくは「ポリヌクレオチド」は、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボース）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含有する）、およびプリンもしくはピリミジン塩基、または修飾プリンもしくはピリミジン塩基のＮ−グリコシドである、任意のポリヌクレオチドを意味する。オリゴヌクレオチドは、他のオリゴヌクレオチドへハイブリダイズすることができる、または自己ハイブリダイズする、例えばヘアピン構造を有することができる。オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドには、制限なく、一本鎖および二本鎖オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドが含まれる。本明細書で使用する用語「オリゴヌクレオチド」もしくは「ポリヌクレオチド」は、さらに２’−Ｏ−メチル修飾および２’もしくは３’ＮＨ２修飾を含むがこれらに限定されない、１つ以上の修飾された塩基もしくは糖を含有するＤＮＡもしくはＲＮＡを含んでいる。そこで、安定性またはその他の理由から修飾されたバックボーンを備えるＤＮＡもしくはＲＮＡは、「ポリヌクレオチド」である。本明細書で使用する用語「オリゴヌクレオチド」もしくは「ポリヌクレオチド」は、このような化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態のポリヌクレオチド、ならびに例えば単純型および複雑型細胞を含むウイルスおよび細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学形を含んでいる。本明細書に記載した方法のために有用なオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドは、単離もしくは精製されたポリヌクレオチドで、または増幅反応において増幅したポリヌクレオチドであってよい。
【００５４】
本明細書で使用する「複数」は１つより多い、典型的には少なくとも２つを意味すると理解されている。
【００５５】
本明細書で使用する「ポリメラーゼ」は、鋳型依存方法でヌクレオチドの重合を触媒する酵素である。ポリメラーゼは、鋳型としてＤＮＡもしくはＲＮＡを使用できる。ポリメラーゼは、熱安定性または非熱安定性であってよい。一般に、酵素は、核酸鋳型配列にアニーリングしたプライマーの３’末端で合成を開始し、鋳型鎖の５’末端に向かって進行するであろう。「ＤＮＡポリメラーゼ」は、デオキシリボヌクレオチドの重合を触媒する。公知のＤＮＡポリメラーゼには、例えば、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｕｎｄｂｅｒｇら、１９９１，Ｇｅｎｅ，１０８：１）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｌｅｃｏｍｔｅ ａｎｄ Ｄｏｕｂｌｅｄａｙ，１９８３，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１：７５０５）、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｒｄｓｔｒｏｍら、１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：３１１２）、サームス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｇｅｌｆａｎｄ １９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：７６６１）、バシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｅｎｅｓｈ ａｎｄ ＭｃＧｏｗａｎ，１９７７，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ４７５：３２）、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）（Ｔｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼとも呼ばれる、Ｃａｒｉｅｌｌｏら、１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１９：４１９３）、９°Ｎｍ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社からの製造中止になった製品）、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｄｉａｚ ａｎｄ Ｓａｂｉｎｏ，１９９８ Ｂｒａｚ Ｊ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ，３１：１２３９）、サーマス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｈｉｅｎら、１９７６，Ｊ．Ｂａｃｔｅｏｒｉｏｌ，１２７：１５５０）、パイロコッカス・コダカレンシス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）（ＫＯＤ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｇｉら、１９９７，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：４５０４）、ＪＤＦ−３ ＤＮＡポリメラーゼ（国際特許公開第０１３２８８７号パンフレット）、およびパイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ＧＢ−Ｄ（ＰＧＢ−Ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｊｕｎｃｏｓａ−Ｇｉｎｅｓｔａら、１９９４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１６：８２０）が含まれる。上記の酵素のポリメラーゼ活性は、当分野において周知の手段によって決定することができる。１単位のＤＮＡポリメラーゼ活性は、最適温度（例、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼのためには７２℃）で３０分間にわたり１０ｎＭ（ナノモル）の全ｄＮＴＰのポリマー形への組込みを触媒する酵素の量であると規定されている。非熱安定性ＤＮＡポリメラーゼには、Ｔ３ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、およびΦ２９ ＤＮＡポリメラーゼが含まれるが、これらに限定されない。
【００５６】
本明細書で使用する「酵素に対するポリヌクレオチド基質分子」は、中間体もしくは産物を形成するために酵素により触媒的に作用することができる１つ以上のＤＮＡもしくはＲＮＡ分子であると理解されている。「増幅もしくはＰＣＲのためのポリヌクレオチド基質」は、２つの特異的オリゴヌクレオチドプライマーの結合を許容するために十分な長さの一本鎖または二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドであると理解されている（一方は第１鎖、およびもう一方は第１鎖を鋳型として用いて合成された第２鎖または相補鎖）。例えば、ＲＮＡ分子は、逆転写酵素のための基質であってよい。リガーゼ活性を有する酵素のための基質は、ライゲーションを許容する条件下で相互にアニーリングおよびライゲーションできる適合する末端を備える第１二本鎖ＤＮＡ分子および第２核酸分子を含んでいる。第２核酸分子は、一本鎖または二本鎖であってよい。５’−ＣＣＣＴＴ−３’（配列番号１）配列を含む二本鎖ＤＮＡ分子は、ワクシニアウイルスＤＮＡトポイソメラーゼＩのための基質になることができる。２つのプライマーの特異的結合を可能にするために十分な長さかつ適切な配列の二本鎖ＤＮＡ分子は、ＰＣＲによる核酸増幅のための基質になることができる。
【００５７】
用語「プライマー」は、１つより多いプライマーを意味する場合があり、精製された制限消化物中におけるように自然に発生しようと、または核酸鎖に相補的であるプライマー伸長産物の合成が触媒される条件下に置かれると相補鎖に沿った合成の開始点として機能できる合成により生成されようと、オリゴヌクレオチドを意味する。そのような条件には、適切な緩衝液（「緩衝液」は、補因子である、またはｐＨ、イオン強度などに影響を及ぼす置換基を含んでいる）中、および適切な温度での、４つの相違するデオキシリボヌクレオシド三リン酸塩およびＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素などの重合誘導剤の存在が含まれる。プライマーは、好ましくは、増幅において最大効率を得るためには一本鎖である。
【００５８】
オリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型核酸配列にハイブリダイズすることができ、第２核酸鎖の酵素的合成をプライミングする一本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ分子である。プライマーは、標的分子の一部分に相補的である。オリゴヌクレオチドプライマーは、化学的または酵素的いずれかの合成方法によって調製できる、と考えられる。または、このような分子もしくはこのフラグメントは天然型であり、天然起源から単離される、または商業的供給業者から購入される。オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブは、長さが５〜２００ヌクレオチド、理想的には１７〜４０ヌクレオチドであるが、相違する長さのプライマーおよびプローブも有用である。増幅のためのプライマーは、好ましくは１７〜２５ヌクレオチドである。プライマーは、さらにまた融点推定法によって特定の融点（Ｔｍ）を有するように設計できる。ＯＬＩＧＯ（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ社、カリフォルニア州カスケード（Ｃａｓｃａｄｅ，ＣＡ））を含む市販のプログラム、Ｐｒｉｍｅｒ３ ａｎｄ Ｏｌｉｇｏ Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒを含むウェブ上で入手できるプライマー設計およびプログラムを使用すると、核酸配列のＴｍを計算することができる。プライマーの好ましい融点は、実践される特定実施形態に左右されるであろう。オリゴヌクレオチドは、（修飾もしくは非修飾）ポリヌクレオチド鋳型およびプライマーを含んでいる。ポリヌクレオチド鋳型は、長さが少なくとも１０塩基、典型的には長さが少なくとも２０塩基、例えば長さが少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００塩基からの範囲内の長さを備えて調製できる。オリゴヌクレオチドは大きな核酸フラグメントであってよいが、一般には、５００塩基以下の核酸に限定される。
【００５９】
オリゴヌクレオチドは、溶液中で遊離していて、または結合分子に共役していてよい。結合成分に共役しているオリゴヌクレオチドは、一般には、これらが共役されることを許容する、これらのヌクレオチド配列内の任意の地点で化学的活性基（例えば、第１級アミン基）を有しているであろう。
【００６０】
本明細書で使用する「反応混合物」は、典型的には、塩、緩衝液、核酸、および酵素を含むが、これらに限定されない試薬の組み合わせである。反応混合物は、典型的には所望の反応が発生できる条件に曝露させられる。反応が発生できる条件は、少なくとも一部の試薬、例えば酵素とともに提供される製造業者の取扱説明書に提供されることが多い。
【００６１】
本明細書で使用する用語「制限酵素」は、特異的ヌクレオチド配列、またはその近くで二本鎖ＤＮＡを切断する酵素を意味する。多数の制限酵素の特異性は、当技術分野において周知である。様々な制限酵素は市販されており、それらの反応条件、補因子、および酵素供給業者によって確立されるその他の要件は周知である。
【００６２】
本明細書で使用する「逆転写酵素」は、ＭＭＬＶおよびＡＭＶ逆転写酵素を含むＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである。逆転写酵素は、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、ＦｅＬＶ、ＦＩＶ、ＳＩＶ、ＡＭＶ、ＭＭＴＶ、およびＭｏＭｕＬＶを含む全てのレトロウイルスについてのウイルスＲＮＡからのｃＤＮＡの合成を仲介する。例えば、いずれもこれにより参照して組み込まれるＬｅｖｉｎ，１９９７，Ｃｅｌｌ，８８：５−８；Ｂｒｏｓｉｕｓら、１９９５，Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ １１ ：１６３−７９を参照されたい。逆転写酵素の構造および機能は、当技術分野において周知である。例えば、参照して組み込まれる米国特許出願第１１／１００１８３号明細書（米国特許出願公開第２００５／０２７２０７４号明細書）を参照されたい。１つの実施形態においては、逆転写酵素は、ウイルス逆転写酵素である。相違する温度で使用するための様々な逆転写酵素は、ＡＦＦＩＮＩＴＹＳＣＲＩＰＴ（商標）、ＡＣＣＵＳＣＲＩＰＴ（登録商標）およびＳＴＲＡＴＡＳＣＲＩＰＴ（登録商標）（全部がＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社、カリフォルニア州ラ・ホーヤ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）から）を含めて市販されている。
【００６３】
本明細書で使用する用語「サンプル」は、その自然環境から単離されており、分析物を含有すると疑われる、または分析物を含有する可能性がある生物学的物質を意味する。本明細書に開示した方法による「サンプル」は、精製もしくは単離された分析物を含有していてよい、または分析物を含有することが疑われる組織サンプル、生体液サンプル、もしくは細胞サンプルなどの生物学的サンプルを含むことができる。生体液には、血液、血漿、血清、痰、尿、脳脊髄液、洗浄液、および白血球泳動サンプルが含まれる。サンプルは、分析物を含有することが疑われる任意の植物、動物、細菌、もしくはウイルス物質を含むことができる。
【００６４】
本明細書で使用する「固体支持体」または「固体表面」は、捕捉分子のための支持体を提供する任意の構造を意味する。適切な固体支持体には、ポリスチレン、誘導体化ポリスチレン、例えばニトロセルロース、ＰＶＤＦもしくはナイロンなどの膜、ラテックスビーズ、ガラスビーズ、シリカビーズ、常磁性もしくはラテックスミクロスフェア、またはマイクロタイターウエルが含まれる。また別の例として、固体支持体は、例えば抗体などの捕捉分子のプレートへの共役結合を可能にするＴＯＰ ＹＩＥＬＤ（商標）プレート（Ｎｕｎｃ社、ニューヨーク州ロチェスター（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ））などの修飾されたマイクロタイタープレートであってよい。固体支持体がビーズ、常磁性ミクロスフェアもしくはラテックスミクロスフェアなどの物質である場合は、固体支持体は、どちらも実験室において一般に使用される、複数ウエル組織培養皿などの開放容器内に、またはネジ蓋付きチューブなどの密封容器内に収容することができる。
【００６５】
本明細書で使用する用語「特異的に結合する」および「特異的結合」は、抗体もしくはその他の結合分子が、抗原、リガンドもしくは分析物などの標的へ、本発明の特定の条件下で他の分子へ結合するよりはるかに大きな親和性で結合することを意味する。抗体もしくは抗体フラグメントは、当技術分野において公知であるように、抗原などの他の分子に結合できる領域を含有するポリペプチド分子である。様々な実施形態においては、「特異的に結合する工程」は、抗体もしくはその他の生物学的分子が少なくとも１０−６〜１０−１４／Ｍの親和性で標的分子に結合することを意味することができるが、より好ましくはそれらは少なくとも１０−８／Ｍの親和性を有し、最も好ましくは少なくとも１０−９／Ｍの親和性を有するであろう。
【００６６】
本明細書で使用する「リガーゼのための基質」は、本明細書では１対の核酸分子である（少なくともその一方は部分的に二本鎖である）、または相互に付着末端へのアニーリングがヌクレオチドを消失することなく、各鎖のバックボーン内での中断を伴う二本鎖核酸分子を生じさせるように適合する付着末端を有する１つの二本鎖核酸分子の２つの末端であると理解されている。核酸鎖は、少なくとも１本の鎖上の中断部位およびその周囲で、中断点およびその周囲で少なくとも３、５、７、もしくは１０連続相補的ヌクレオチドにわたり相補鎖へハイブリダイズさせられる。両方の鎖はＤＮＡ分子である、または鎖の１本はＤＮＡ分子であり、他方の鎖はＲＮＡ分子である。中断点での鎖の両端は、リガーゼもしくはトポイソメラーゼによるライゲーションを許容するために適切な末端官能基を有している。リガーゼは、アクセプター分子の５’末端では５’リン酸基を必要とするが、トポイソメラーゼは、アクセプター分子の５’末端で遊離５’−ＯＨを必要とする。リガーゼは、熱安定性または非熱安定性であってよい。非熱安定性リガーゼは、高温への曝露、またはポリメラーゼ連鎖反応の変性工程によって不活性化することができる。
【００６７】
本明細書で使用する「ポリメラーゼのための基質」は、本明細書では、二本鎖部分の第１鎖の３’末端が、それがアニーリングしている配列に完全に相補的であり、第２鎖は３’末端が伸長するであろう方向に第１鎖の３’末端を越えて伸長する、二本鎖配列の一部分を備える一本鎖核酸、いずれかのＤＮＡであると理解されている。３’末端は、さらに３’末端の伸長を可能にするために３’−ヒドロキシル基を含んでいる。このようなＤＮＡ鋳型は、「ＰＣＲ鋳型」でもある。または、核酸は、それからｃＤＮＡを生成することができ、順にＰＣＲ鋳型として機能できるＲＮＡ鎖であってよい。このようなＲＮＡ鎖は、「逆転写酵素のための基質」でもある。
【００６８】
本明細書で使用する「熱安定性ポリメラーゼ」は、熱に対して安定性である、耐熱性である、および各核酸鎖に相補的であるプライマー伸長産物を形成するために適正な方法でヌクレオチドの結合を触媒（促進）する酵素であると理解されている。熱安定性ポリメラーゼは、二本鎖核酸の変性を実行するために必要な時間にわたり高温に曝露させた場合に非可逆的に変性（不活性化）されない。本発明のための非可逆的変性は、酵素活性の永続的かつ完全な消失を意味する。核酸変性のために必要な加熱条件は、例えば、緩衝液の塩濃度および組成ならびに変性させられる核酸の長さおよびヌクレオチド組成に依存するであろうが、典型的には温度および核酸長に主として依存した時間、典型的には３０秒間〜４分間にわたり約９０〜約１０５℃である。緩衝塩の濃度および／または核酸のＧＣ組成が増加するにつれて、より高い温度が許容される場合がある。好ましくは、酵素は、約９０〜１００℃では非可逆的に変性されないであろう。「非熱安定性ポリメラーゼ」は、熱安定性ポリメラーゼによって忍容される条件下で非可逆的に変性されるようになるポリメラーゼを意味すると理解されている。熱安定性および非熱安定性ポリメラーゼはどちらも、多数の業者から広汎に入手できる。
【００６９】
本明細書で使用する「トポイソメラーゼ」は、ＤＮＡの開裂およびライゲーションを媒介できる酵素の少なくとも触媒部分を意味する。トポイソメラーゼの構造および機能は、当技術分野において周知である。その開示がこれにより参照して組み込まれる、Ｗａｎｇ，Ｊ．Ｃ．，“ＤＮＡ ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅｓ，” Ａｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６５：６３５−９２（１９９６）を参照されたい。一部のトポイソメラーゼはＤＮＡ分子の二本鎖部分の１本の鎖の開裂を触媒するが、その他は両方の鎖の開裂を触媒し、ＤＮＡの巻き付けおよび／または巻き戻しを触媒する。トポイソメラーゼは、配列特異的であってよく、特定配列もしくはその後で開裂する、または非配列特異的で、好ましい配列では開裂しない場合がある。２つの配列特異的トポイソメラーゼは公知であり、ワクシニアウイルスＤＮＡトポイソメラーゼＩおよびＭＣＶトポイソメラーゼである。どちらも、本明細書では「トポイソメラーゼ開裂認識部位」とよばれる、配列ＣＣＣＴＴ（配列番号１）のすぐ後で１本のＤＮＡ鎖を開裂する。
【００７０】
本明細書で使用する「トポイソメラーゼ−核酸結合中間体」は、ＤＮＡの二本鎖部分の鎖の一方の３’末端に近いトポイソメラーゼ開裂認識部位を備える２本鎖ＤＮＡ基質を提供することによって生成される。鎖の開裂は、他のＤＮＡ鎖へ安定性でハイブリダイズし続けるには短すぎる短鎖開裂産物の生成を生じさせる（Ｔｍは、トポイソメラーゼ反応の温度より１０℃以上高くなく、好ましくは５℃以上高くない）。トポイソメラーゼは、リガーゼ活性のための基質を完成させるための核酸がトポイソメラーゼのライゲーションおよび遊離を可能にするために適合性の付着末端へアニーリングするまでは、核酸に結合したままとなる。
【００７１】
本明細書に提供する範囲は、その範囲内の数値全部についての省略表現であると理解されている。例えば、長さが１〜５０ヌクレオチドの配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むと理解されている。
【００７２】
他に特に明記しない限り、または状況から明白にならない限り、本明細書で使用する用語「または」は、包含的であると理解されている。
【００７３】
他に特に明記しない限り、または状況から明白にならない限り、本明細書で使用する用語「１つの」および「その」は、単数形または複数形であると理解されている。
【００７４】
本明細書に組み込まれていてその一部を構成する添付の図面は、本発明の所定の実施形態を例示しており、文書による記載と一緒に、本発明の所定の原理を説明するために役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】酵素としてトポイソメラーゼを使用する方法の実施形態の略図を示す図である。
【図２】酵素としてリガーゼを使用する方法の実施形態の略図を示す図である。
【図３】酵素として逆転写酵素を使用する方法の実施形態の略図を示す図である。
【図４】トポイソメラーゼ・ライゲーションアッセイの略図を示す図である。
【図５】トポイソメラーゼ・ライゲーションアッセイの検出感受性を示している増幅プロットを示す図である。
【図６】様々な濃度のトポイソメラーゼを用いた閾値サイクル数（Ｃｔ）を示すグラフである。
【図７】７桁を超えるトポイソメラーゼ濃度についてのＣｔを示す標準曲線を示す図である。
【図８】６桁を超えるトポイソメラーゼ濃度についてのＣｔの標準曲線を示す図であり、プロテインＧのワクシニアウイルスＤＮＡトポイソメラーゼＩへの融合が実質的にこの酵素の機能を妨害しないこと、そして６桁を超える結果の直線性を妨害しないことを示している。
【図９】図９Ａおよび９Ｂは、レポーター酵素としてトポイソメラーゼを使用するＥＬＩＳＡによって決定された様々な量のＶＥＧＦのＣｔを示すグラフである。
【図１０】ＡＴＰの存在下または非存在下での様々な濃度のＨｉｓ標識Ｔ３リガーゼを用いたＣｔを示すグラフである。
【図１１】ＰＣＲマスターミックス中で反応を実施した、ＡＴＰの存在下または非存在下での様々な濃度のＨｉｓ標識Ｔ３またはＴ７リガーゼを用いたＣｔを示すグラフである。
【図１２】１０倍の連続希釈濃度の、野生型Ｔ４ ＤＮＡリガーゼまたはＴ４ ＤＮＡリガーゼに結合したストレプトアビジンを含む融合タンパク質のいずれかを用いたライゲーション反応後の増幅反応において得られたＣｔ値を比較したグラフである。
【図１３】１つはＮ末端トポイソメラーゼフラグメントに融合したストレプトアビジンを有し、もう１つはＣ末端トポイソメラーゼフラグメントに融合したストレプトアビジンを有する２つの分析物特異的結合剤を用いて、それらのフラグメントが、近接近して分析物に結合すると機能的トポイソメラーゼ酵素を形成するように、様々な濃度のビオチン化ＢＳＡの近接性に基づく検出を示すグラフである。
【図１４】図１４Ａおよび１４Ｂ１つはＮ末端トポイソメラーゼフラグメントに融合したストレプトアビジンを有し、もう１つはＣ末端トポイソメラーゼフラグメントに融合したストレプトアビジンを有する、４５０ｐｍ（図１４Ａ）または１１０ｐＭ（図１４Ｂ）の２つの分析物特異的結合剤を用いて、それらのフラグメントが、近接近して分析物に結合すると機能的トポイソメラーゼ酵素を形成するように、様々な濃度のビオチン化抗体の近接性に基づく検出を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００７６】
以下では、実施例が添付の図面に示されている、本発明の様々な代表的実施形を詳細に参照されたい。以下の詳細な説明は、読者に本発明の態様の所定の実施形態、特徴および詳細をより十分に理解してもらうために提供されており、本発明の範囲の制限であると解釈すべきではないことを理解されたい。
【００７７】
上記で考察したように、当該の物質を免疫検出するための試薬および方法は公知であり、市販されている。しかし、これらの試薬および方法は、最も顕著には相当に低感受性である、もしくはシグナル対ノイズ比が不良である（バックグラウンドシグナルが高い）、またはその両方が顕著であるという重大な欠点に悩まされる。さらに、一部は所定の方法でのみ機能するように特別設計されているので、そこで当該の物質を検出するために広汎に使用するためには適合しない。感受性を向上させるために免疫ＰＣＲ技術が考案されてきたが、商業的に利用できるテクノロジーは今もなおそれらの有用性を制限する高いシグナル対ノイズ比に悩まされる。本出願は、高度に感受性の酵素部分（例、リガーゼ、トポイソメラーゼ、または逆転写酵素）に連結した高度に特異的な結合部分（例、抗体部分）を含む分析物特異的結合剤を使用することによって、検出アッセイの特異性および／または感受性を同時に保持または改善しながら、シグナル対ノイズ比を向上させる方法、組成物、およびキットを開示するが、このとき物質は酵素とともに、その酵素が増幅反応（例、ＰＣＲ）のための鋳型を生成することを許容する条件下でインキュベートすることができる。この方法で、増幅のための鋳型を形成することに責任のある酵素は、感受性を維持または改良しながらバックグラウンドシグナルを減少させるために役立つように、分析物が存在する場所にのみ存在する。さらに、本検出反応は、結合反応から物理的に分離することができる。例えば、結合反応後、増幅反応のための鋳型は、増幅反応を実施するための別個の容器へ移すことができる。
【００７８】
本明細書では、分析物を検出するための方法、キットおよび組成物が提供される。これらの方法では、反応における分析物の存在は、反応における分析物の存在を指示する核酸増幅鋳型の形成を生じさせる。分析物特異的結合剤の酵素は、１つ以上のポリヌクレオチド分子と相互作用し、増幅鋳型分子、好ましくはＰＣＲ増幅鋳型を生じさせる。増幅産物の増幅および検出は、感受性であり、分析物の存在の潜在的な定量的指標である。１つの態様では、分析物は、タンパク質、オリゴヌクレオチド、細胞表面受容体、または受容体リガンドである。
【００７９】
１つの態様では、サンプル中の分析物を検出するための方法であって、分析物を、サンプル中の分析物へ特異的に結合し、かつさらにＰＣＲ増幅のための鋳型の形成を触媒することのできる酵素部分を含んでいる分析物特異的結合剤と接触させる工程を含んでいる。ＰＣＲ増幅のための鋳型は、直鎖状ＤＮＡポリヌクレオチドを形成するためにアニーリングした１対のＤＮＡ二重鎖の少なくとも１本の鎖と適合する付着末端とのライゲーションによって生成することができる。３つ以上のライゲートした二重鎖の鎖を作製するためには、２対以上のＤＮＡ二重鎖を直列でライゲートすることができる。適合する付着末端は、少なくとも一部には、鎖の１本を開裂して開裂産物を遊離し、付着末端を形成する配列特異的トポイソメラーゼによって生成することができる。ＰＣＲのための鋳型は、さらにまたＲＮＡ鋳型の存在下で逆転写酵素によって生成することもできる。生成されたｃＤＮＡは、ＰＣＲのための鋳型である。ＰＣＲのための鋳型は、増幅反応において第１および第２プライマーと接触させられる。第１プライマーは、ＰＣＲ増幅のための鋳型へ、鋳型に相補的な鎖を生成するための増幅を許容する条件下で結合する。この第２鎖は、ＰＣＲによる第２鎖の増幅のために第２プライマーへ結合する。プライマーは、サンプル中の分析物の存在を証明するために、鋳型からの特定産物の増幅を許容するように設計される。増幅産物の生成は、例えば、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社、オレゴン州ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ））、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、カリフォルニア州アラメダ（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ））、または分子ビーコンプローブを使用することによって監視できる。未知のサンプル中で検出されたシグナルの量は、元の未知のサンプル中に存在する分析物の量を決定するために、既知量の分析物を含有するコントロールサンプル中で検出されたシグナルと比較することができる。または、増幅産物は、例えば、ドットブロット法もしくはゲル電気泳動法および臭化エチジウム染色によって、半定量的または定性的に検出することができる。一連の希釈率の未知サンプルを分析し、それを一連の既知サンプルと比較することによって、未知サンプル中の分析物サンプルの量を推定することができる。
【００８０】
そこで、１つの実施形態においては、サンプル中の分析物を検出するための方法であって、
（ａ）分析物特異的結合剤を、結合を許容する条件下で分析物とともにインキュベートするステップであって、分析物特異的結合剤はリガーゼに結合した分析物特異的結合分子を含むステップと、
（ｂ）（ａ）の結合した分析物特異的結合剤を、第１二本鎖核酸分子および第２核酸分子とともに反応混合物中でインキュベートするステップであって、第１核酸分子はリガーゼの存在下で第２核酸分子にライゲートされるステップと、
（ｃ）核酸増幅を許容する条件下で（ｂ）の反応混合物の少なくとも一部分を、第１オリゴヌクレオチドプライマー、第２オリゴヌクレオチドプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および少なくとも１つのｄＮＴＰを含む増幅反応混合物とともにインキュベートするステップであって、第１オリゴヌクレオチドプライマーは第１核酸分子と特異的に結合し、第２オリゴヌクレオチドプライマーは増幅産物の形成を許容するために第２核酸分子と結合するステップと、および
（ｄ）増幅産物を検出する工程と、
を含む方法に向けられる。
【００８１】
また別の実施形態においては、溶液中の分析物を検出するための方法は、
（ａ）分析物特異的結合剤を、結合を許容する条件下で分析物とともにインキュベートするステップであって、分析物特異的結合剤はリガーゼ活性含有分子に結合した分析物特異的結合分子を含むステップと、
（ｂ）（ａ）の結合した分析物特異的結合剤を、各々が２つの末端を有する１つ以上のポリヌクレオチド基質分子を備えるリガーゼとともに反応混合物中でインキュベートするステップであって、リガーゼは核酸増幅のための鋳型を生成するために基質分子の２つの末端と結合するステップと、
（ｃ）反応混合物（ｂ）の少なくとも一部分を増幅反応液とともにインキュベートするステップと、および
（ｄ）増幅産物を検出するステップと、
を含む。
【００８２】
他の実施形態においては、本方法は、
トポイソメラーゼ核酸結合中間体の形成をさらに含み、
増幅産物は、特異的増幅産物であり、
特異的増幅産物は、サイズによって決定され、
第２核酸分子は二本鎖核酸であり、第１二本鎖核酸および第２二本鎖核酸は適合する付着末端を有し、または反応混合物中の末端は適合する付着末端を有し、
第１二本鎖核酸もしくは第２二本鎖核酸のいずれかは配列特異的トポイソメラーゼ開裂部位を有し、またはそれらの末端の少なくとも一方は配列特異的トポイソメラーゼ開裂部位を有し、
適合する付着末端の少なくとも１つは配列特異的トポイソメラーゼ開裂によって生成され、
二本鎖核酸の開裂は、ライゲーションを許容する条件下では安定性にハイブリダイズしない核酸の二本鎖部分の形成を生じさせ、または
非鋳型生成鎖の核酸は、修飾を含んでいる。
【００８３】
さらにまた別の実施形態においては、サンプル中の分析物を検出するための方法は、
（ａ）分析物特異的結合剤を、結合を許容する条件下で分析物とともにインキュベートするステップであって、分析物特異的結合剤は逆転写酵素に結合した分析物特異的結合分子を含むステップと、
（ｂ）（ａ）の結合した分析物特異的結合剤を、ｃＤＮＡ分子を生成するためにＲＮＡの逆転写を許容する条件下でＲＮＡ分子とともに反応混合物中でインキュベートするステップと、
（ｃ）核酸増幅を許容する条件下で（ｂ）の反応混合物の少なくとも一部分を、第１オリゴヌクレオチドプライマー、第２オリゴヌクレオチドプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および少なくとも１つのｄＮＴＰを含む増幅反応混合物とともにインキュベートするステップであって、第１オリゴヌクレオチドプライマーはｃＤＮＡ分子と特異的に結合し、第２オリゴヌクレオチドプライマーは増幅産物の形成を許容するために第ｃＤＮＡ分子の相補体と結合するステップと、および
（ｄ）増幅産物を検出する工程と、
を含む。
【００８４】
他の実施形態においては、
本方法は、増幅産物の一部分へハイブリダイズする第３オリゴヌクレオチドを提供するステップをさらに含み、
第３オリゴヌクレオチドは、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、カリフォルニア州アラメダ（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ））プローブもしくは分子ビーコンプローブであり、
増幅産物は、特異的増幅産物であり、
特異的増幅産物は、サイズによって決定され、
検出は、増幅産物の定量をさらに含み、
方法は、工程（ｂ）の前に未結合分析物特異的結合を除去する工程をさらに含む。
【００８５】
本明細書に開示した方法の、酵素として各々トポイソメラーゼ、リガーゼ、および逆転写酵素を使用する様々な実施形態の略図は、図１、２、および３に提供されている。
【００８６】
図１（１）では、結合した分析物特異的結合剤のトポイソメラーゼ部分は、トポイソメラーゼのための基質上のトポイソメラーゼ特異的開裂部位へ結合している。明確にするために、完全に結合した分析物特異的結合剤は１回しか示されていないが、トポイソメラーゼは、本方法を通して結合剤に結合したままとなっている。図１（２）では、トポイソメラーゼは、リガーゼ基質を生成するための適合する付着末端を生成するためにトポイソメラーゼ基質を開裂する。開裂産物は放出され、トポイソメラーゼ−核酸結合中間体が生成される。リガーゼ基質の付着末端はアニーリングし、アニーリングした基質の各々の上の鎖（ｔｏｐ ｓｔｒａｎｄ）のライゲーションおよびトポイソメラーゼの放出を可能にする。下の鎖（ｂｏｔｔｏｍ ｓｔｒａｎｄ）の３’末端は、上の鎖に対して完全に相補的である必要はない（例、図２（１）を参照されたい）。図１（３）は、増幅反応における鋳型として機能できるライゲーション産物を示している。
【００８７】
図２（１）では、結合した分析物特異的結合剤のリガーゼ部分はリガーゼのための基質の半分に結合しており、リガーゼ基質の付着末端はアニーリングされている。付着末端の少なくとも１つの５’末端は、リン酸化されている。図２（２）では、リガーゼは、増幅反応に使用するための鋳型を生成するためにリン酸化された５’末端を有する鎖を結合している。
【００８８】
図３では、結合した分析物特異的結合剤の逆転写酵素部分は、逆転写酵素のための基質であるＲＮＡへ結合している。逆転写酵素は、増幅反応に使用するための鋳型を生成するためにＲＮＡ鎖をＤＮＡ内に転写する。
【００８９】
好ましい実施形態においては、分析物特異的結合分子は、ビオチン−ストレプトアビジンまたはビオチン−アビジン相互作用を通して任意で酵素へ間接的に結合している抗体である。
【００９０】
本明細書に開示した実施形態は、さらにまた第１および第２分析物特異的結合剤が提供される、本明細書に記載した分割バージョンの酵素を用いて実施することもできる。これらの実施形態においては、各分析物特異的結合剤は、酵素の一部分に連結した分析物特異的結合分子を含んでいる。酵素部分は相互作用して、分析物特異的結合剤が分析物に結合すると、機能的酵素複合体を形成する。機能的酵素複合体は、次にサンプル中における分析物の存在および／または量の指標である検出可能なシグナルを生成する。１つの実施形態においては、分割バージョンのリガーゼ、トポイソメラーゼ、または逆転写酵素が提供される。また別の実施形態においては、第１および第２分析物特異的結合分子は抗体である。好ましい実施形態においては、第１および第２分析物特異的結合分子は、例えばビオチン−ストレプトアビジンまたはビオチン−アビジン相互作用などの、ビオチン結合相互作用を通して酵素部分へ間接的に結合している抗体である。例えば、酵素の第１および第２部分は、ストレプトアビジンまたはアビジンへ融合させられ、当該の分析物に対して特異的なビオチン化抗体と混合される。
【００９１】
１つの実施形態においては、分割された酵素は、配列番号１９のアミノ酸配列を有するワクシニアウイルス・トポイソメラーゼＩまたは、配列番号１９と少なくとも９０％および好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドなどの、ポリペプチドがトポイソメラーゼ活性を保持することを前提とするトポイソメラーゼに由来する。例えば、トポイソメラーゼ酵素の第１部分は、配列番号１７のアミノ酸残基１７９〜２７５を含む。または、トポイソメラーゼ酵素の第１部分は、第１部分が機能的酵素複合体を形成するためにトポイソメラーゼ酵素の第２部分と相互作用する能力を保持することを前提として、配列番号１７のアミノ酸残基１７９〜２７５に対して少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。例えば、トポイソメラーゼ酵素の第２部分は、配列番号１８のアミノ酸残基１〜２１６を含んでいる。または、トポイソメラーゼ酵素の第２部分は、第２部分が機能的酵素複合体を形成するためにトポイソメラーゼ酵素の第１部分と相互作用する能力を保持することを前提として、配列番号１８のアミノ酸残基１〜２１６に対して少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。酵素は、２つのドメインが相互作用すると酵素活性を回復できる他のサブドメインへ分離することができる。
【００９２】
ワクシニアウイルス・トポイソメラーゼＩのアミノ酸配列（配列番号１９）は、例えば、アクセッション番号ＹＰ＿２３２９８６で公表されているものを含めて、公的に入手できる。ワクシニアウイルス・トポイソメラーゼＩは、ウイルスＤＮＡトポイソメラーゼ・スーパーファミリーに属しており、鎖β２およびβ３の間に左巻き交差を備えるＮ末端β（２）−α−β−α−β（２）折り畳みを想定している。ＤＮＡ結合ドメインおよび触媒ドメイン内の保存残基は、当技術分野において公知である。例えば、ワクシニアウイルス・トポイソメラーゼＩＢ型は、触媒活性と相関する５つの保存残基（Ｒ１３０、Ｋ１６７、Ｋ２２０、Ｒ２２３、およびＨ２６４）ならびに触媒ドメイン内のＤＮＡ結合部位へマッピングされる１７の保存残基（Ｒ１３０、Ｆ１３１、Ｇ１３２、Ｋ１３３、Ｋ１３５、Ｔ１４２、Ｋ１６７、Ｄ１６８、Ｙ２０９、Ｋ２１３、Ｒ２１８、Ｉ２１９、Ｋ２２０、Ｒ２２３、Ｈ２６５、Ｔ２６６、およびＹ２７４）を含有する、アミノ酸残基約７５〜アミノ酸残基約２８５に及ぶＣ末端触媒ドメインを含有している。そこで当業者であれば、これらの保存残基での保存的突然変異は、トポイソメラーゼ活性を有するタンパク質を生じさせる可能性が高いが、他方保存ドメインの外側での突然変異は、触媒活性に大きく影響を及ぼさないと予想されるであろう。
【００９３】
本明細書に開示した実施形態は、分析物特異的結合分子と酵素または分割酵素系にある酵素の第１および第２部分との間に配置された任意のスペーサ分子を用いて実施することもできる。スペーサ分子は、任意の物質または物質の組み合わせから構成されてよい。しかし典型的には、スペーサ分子は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドから構成されるであろう。１つの実施形態においては、スペーサ分子は、例えばグリシン、セリン、アラニン、およびトレオニンなどの小さなアミノ酸を含んでいる。また別の実施形態においては、天然型柔軟性非構造領域を使用できる。このような領域は、豊富に発現したタンパク質から、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のｚｉｐＡタンパク質（Ｏｈａｓｈｉ Ｔ，Ｈａｌｅ ＣＡ，ｄｅ Ｂｏｅｒ ＰＡ，Ｅｒｉｃｋｓｏｎ ＨＰ．“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｔｈａｔ ｔｈｅ Ｐ／Ｑ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ＺｉｐＡ ｉｓ ａｎ ｕｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ，ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｔｅｔｈｅｒ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ＦｔｓＺ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ．” Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２００２；１８４（１５）：４３１３−４３１５）またはＬ７／Ｌ１２リボソームタンパク質（Ｂｏｃｈａｒｏｖら、“Ｆｒｏｍ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２ ｔｏ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ ｉｎ ｒｉｂｏｓｏｍｅ，” Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００４ ２７９（１７）：１７６９７−７０６）から選択することができる。多数の非構造領域は当業者には公知であり、例えばＥｎｔｒｅｚ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ＮＣＢＩデータベースからのＤｉｓｐｒｏｔデータベースからなどのデータベース内のタンパク質構造から入手できる。さらに、非構造領域は、例えばＳｃｏｏｂｙ−Ｄｏｍａｉｎ法（Ｐａｎｇ ＣＮら、“Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ｆｏｌｄａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｓｉｇｎａｌ，” Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２００８ ３６（２）：５７８−８８）を用いるバイオインフォーマティクス法によってタンパク質中で予測できる。
【００９４】
本出願に開示された方法は、サンプル中の分析物の特異的および感受性検出のため、ならびに任意の定量のために有用である。本法は、当該分析物を結合させるために特定分析物を調製できることを前提に、本質的にあらゆる分析物を検出するために使用できる。分析物は、例えば哺乳動物もしくはヒトなどの生物由来の組織もしくは体液などの生物学的サンプル由来であってよい。本方法は、例えば、疾患状態または臨床的介入の有効性を決定するために経時的にタンパク質の発現を監視するために使用できる。サンプルは、例えば、水もしくは土壌サンプル中の分析物の存在を検出するために、環境起源由来であってよい。サンプルは、汚染物質または感染性物質の存在について試験するために農業的もしくは食物起源由来であってよい。分析物を特異的分析物結合成分へ結合させるために抽出物を調製する方法は、当業者であれば周知である。
【００９５】
１つの態様においては、公知のＥＬＩＳＡタイプのアッセイと組み合わせて検出剤を使用するための組成物およびキットが提供される。一般に、本キットは、典型的には容器を貯蔵および／または輸送するための包装材料と組み合わせて、少なくとも１つの容器内に、分析物特異的結合剤を含んでいる。分析物特異的結合剤は、増幅反応のための鋳型を形成するための基質、および増幅反応、好ましくはＰＣＲ反応、より好ましくは定量的ＰＣＲ反応に使用するために必要とされる試薬と組み合わせて使用できる。
【００９６】
特定の分析物を検出するための多数のキットは、市販されている。このようなキットは、典型的にはＥＬＩＳＡプレート、および分析物へ結合するためにプレート上に事前にコーティングされた、または別個のいずれかでの捕捉分子を含んでいる。公知の濃度にあるコントロール分析物は、陽性コントロールとしてキットともに提供されてよい。分析物を検出するための分析物特異的抗体は、市販のＥＬＩＳＡの成分として提供され、分析物特異的抗体を検出するためには、検出可能なレベルに結合した第２抗体が提供される。１つの実施形態においては、本キットは、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて提供される、および／または典型的に使用される第２抗体の代りに使用するための組成物および試薬を含んでいる。
【００９７】
さらに、市販されているキットを含むＥＬＩＳＡアッセイとともに検出試薬として使用するためのプロテインＡ、Ｇ、またはＬなどの抗体結合ドメインに連結した、例えばリガーゼ、トポイソメラーゼ、または逆転写酵素などの酵素を含有するキットが提供される。酵素は、さらにまたキット内に含まれる、またはまた別の起源から入手されるビオチン化抗体へ結合させるためにストレプトアビジンまたはアビジンへ結合させることができる。抗体結合ドメインまたはストレプトアビジンに連結した酵素は、分析物特異的結合剤を生成するために、分析物特異的抗体または任意のビオチン化分子各々と接触させることができる。または、抗体結合ドメインへ連結した酵素は、分析物特異的抗体と結合する抗体と接触させることができる。例えば、分析物特異的抗体がマウスＩｇＧモノクローナル抗体である場合は、市販の抗マウスＩｇＧ抗体は、抗体結合ドメイン（例、プロテインＧ）と連結した酵素と接触させることができる。または、本キットには、検出剤として使用するための酵素成分と連結した抗免疫グロブリン抗体を含むキットを含むことができる。
【００９８】
本キットは、ＰＣＲ用の鋳型を生成するための酵素の基質である、核酸分子をさらに含んでいる。
【００９９】
トポイソメラーゼに基づくキットでは、核酸分子は、その一方の末端は開裂されると第２二本鎖核酸分子にアニーリングするために適合する付着末端を生成する、トポイソメラーゼ開裂部位を含有する１つまたは２つの二本鎖核酸分子、好ましくはＤＮＡ分子であってよい。アクセプター鎖は、トポイソメラーゼのための基質を形成するために５’−ＯＨを含んでいる。
【０１００】
リガーゼに基づくキットでは、核酸分子は、第２二本鎖核酸分子もしくは一本鎖核酸分子にアニーリングするために適合する付着末端を有する、２つの二本鎖核酸分子または１つの二本鎖核酸分子および１つの一本鎖核酸分子、好ましくはＤＮＡ分子であってよい。増幅のための鋳型となる鎖内の少なくともアクセプター鎖は、トポイソメラーゼのための基質を形成するために５’−リン酸塩を含んでいる。５’−リン酸塩を含んでいない鎖は、例えばＰｆｕなどの高レベルの識別を備えるポリメラーゼによる鎖の増幅を妨害する非天然ｄＮＴＰを含む可能性がある。
【０１０１】
逆転写酵素に基づくキットでは、核酸分子は、ＲＮＡ分子である。ＲＮＡ分子は、逆転写酵素を実質的に妨害することなくＲＮＡ鋳型の安定性を増加させるために化学修飾を含むことができる。このようなＲＮＡ分子は、当業者には公知である。
【０１０２】
本キットは、酵素成分によって生成された鋳型からの産物の定量的増幅のために、プライマー、プローブ（例、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、カリフォルニア州アラメダ（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ））もしくは分子ビーコンプローブ）、またはその他の物質（例、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社、オレゴン州ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ））のうちの少なくとも１つをさらに含むことができる。本キットは、ＰＣＲ産物を増幅させるためのポリメラーゼをさらに含むことができる。
【０１０３】
また別の態様では、本明細書に開示した方法およびキットに使用するための組成物が提供される。例えば、本組成物は、試薬と結び付けて使用するために適合する少なくとも１つの他の物質と結合できる、酵素もしくは酵素成分と連結した分析物特異的結合分子を有する分析物特異的検出剤（例、融合タンパク質）を含んでいてよい。適切な物質には、本発明による方法において所望であるように実施する能力に有害な影響を及ぼさずに試薬に接触することを引き起こせる物質が含まれる。または、追加して、組成物は分析物特異的検出剤およびそれに試薬が特異的に結合する１つ以上の物質（例、検出対象の分析物）または分析物特異的検出剤の酵素部分と相互作用する１つ以上の物質（例、例えば本明細書に開示した方法およびキットに使用するために本明細書において考察したような、酵素の核酸基質）を含むことができる。さらに、例えばプロテインＡ、Ｇ、もしくはＬなどの抗体結合ドメイン、または好ましくは結合剤として使用するためのビオチン、アビジン、もしくはストレプトアビジンへ連結した酵素もしくは酵素成分である。さらに、好ましくは結合剤として使用するための抗免疫グロブリン抗体にさらに連結した抗体結合ドメインに連結した酵素もしくは酵素成分である。組成物は、例えば、凍結乾燥粉末もしくは水性混合液中のような液体形もしくは固体形で見いだすことができる。したがって、結合および検出アッセイにおける組成物の使用が提供される。
【０１０４】
１つの態様においては、本方法は、サンプル中に存在する可能性がある特異的分析物の結合を許容するために分析物捕捉分子を備える固体表面を調製する工程を含んでいる。市販の抗体でコーティングされたプレート、または抗体および抗体を表面に結合させるための取扱説明書を含むＥＬＩＳＡキットもまた使用できる。分析物捕捉分子は、特異的もしくは非特異的結合剤であってよく、または特定物質を非特異的物質によってプレートに結合させることができる。捕捉分子は、例えばビオチン−アビジンまたはビオチン−ストレプトアビジンなどの、結合対の半分を含むことができる。固体表面はアビジンもしくはストレプトアビジンでコーティングできる、および捕捉分子はビオチンへ結合させることができる。捕捉分子を固体支持体へ結合させる正確な方法は、本発明の制限内にはない。プレートを捕捉分子でコーティングした後、表面を洗浄し、表面への物質の非特異的結合を防止するために非特異的物質を用いてブロッキングする。
【０１０５】
調製したプレートは、結合を可能にする時間および温度の適切な条件下で適切な緩衝液中で分析物と接触させられる。これらの条件は、使用される分析物および捕捉試薬に依存して変動する場合がある。このような検討材料は、当業者には明確に理解されている。未結合分析物は、洗浄する工程によって除去される。
【０１０６】
分析物特異的結合剤は、分析物の存在を検出するために調製される。分析物特異的結合剤は、酵素に連結した、融合した、または付着した分析物特異的結合分子を含む。分析物結合分子は、分析物に分析物捕捉分子とは別個のエピトープで結合するように、かつ分析物および酵素成分以外の反応の任意の他の成分へ結合しないように選択されなければならない。例えば、捕捉分子および分析物結合分子は、分析物上の２つの別個の、非妨害性エピトープで結合する、分析物を標的とするモノクローナル抗体であってよい。または、捕捉分子および分析物結合分子は、どちらも、２つの抗体が分析物へ同時に結合できるように分析物の少なくとも実質的部分に向けられたポリクローナル抗体であってよい。同一エピトープに結合する抗体は、繰り返し構造もしくはモチーフを有する分析物（例、コラーゲン）のために使用できる。
【０１０７】
分析物特異的結合剤の酵素部分は、リガーゼもしくはトポイソメラーゼのいずれかに由来するリガーゼ、または逆転写酵素成分であってよい。分析物特異的結合分子は抗体であることが多いので、分析物特異的結合分子は、便宜的には、例えばプロテインＡ、ＧもしくはＬなどの一般的抗体結合ペプチドとの融合タンパク質として酵素成分を発現させることによって、頻回に酵素に連結させることができる。しかし、酵素が固体支持体に結合した捕捉分子には結合しないことを保証するために注意を払わなければならない。例えば、ニワトリＩｇＹはプロテインＡ、Ｇ、もしくはＬのいずれによっても結合されず、ラット、ウシ、ヤギ、およびヒツジ由来の全ＩｇＧはプロテインＡによって弱くしか結合されないが、他方ヒト、マウス、およびウサギＩｇＧは、プロテインＡによって強力に結合される。このため、ニワトリＩｇＹ抗体またはラット、ウシ、ヤギ、もしくはヒツジ抗体は、分析物特異的結合分子としてのヒト、マウス、もしくはウサギＩｇＧに結合させるためのプロテインＡドメインに融合した酵素と結び付けて酵素捕捉分子として使用できる。このような許容できる組み合わせは、当業者であれば容易に決定できる。
【０１０８】
分析物特異的結合剤は、分析物の結合剤への結合を許容する条件下で、調製された固体表面に結合した分析物と接触させられる。これらの条件は、使用される分析物および結合剤に依存して変動する場合がある。そのような検討材料は、当業者には明確に理解されている。未結合結合剤は、洗浄する工程によって除去される。
【０１０９】
その後の工程および試薬は、酵素内に含まれる酵素成分に依存する。各トポイソメラーゼ、リガーゼ、および逆転写酵素のために適切な基質および反応条件は、本明細書で考察されている。結合した分析物特異的結合剤は、酵素によって触媒された反応が発生するのを許容する条件下で、適切な核酸基質とともにインキュベートされる。インキュベーション後、反応混合物の一部分は増幅反応混合物、好ましくはＰＣＲ反応混合物、より好ましくは定量的ＰＣＲ反応混合物へ移される。増幅産物の量は、増幅反応中および／または後に検出され、サンプル中の分析物の存在が決定される。
【０１１０】
上記の態様のいずれかでは、増幅鋳型および検出反応の合成は、単独の工程反応（例、同一反応混合物およびインキュベーション工程）として、または連続的（例、別個の反応混合物およびインキュベーション工程）に実施することができる。
【０１１１】
結合分子
本明細書に開示した方法は、利用された捕捉分子および検出分子が、本方法に使用した捕捉分子（例、固体支持体に結合した捕捉抗体）および／または分析物特異的検出剤をそのために本法が使用される分析物を特異的に認識して結合するように単純に変化させることによって、任意の分析物を検出するために適応する可能性がある。一部の実施形態においては、分析物は、捕捉抗体が必要ではないように固体支持体へ直接的に結合させることができる。他の実施形態においては、捕捉抗体は分析物に結合し、未標識中間体抗体は分析物に結合し、および検出抗体は中間体抗体に結合する。
【０１１２】
他の実施形態においては、本アッセイは、液相反応として実行される（例、捕捉抗体および固体支持体を使用せずに、図１Ｂ、２Ｂ、および３Ｂを参照されたい）。これらの実施形態においては、本方法は、一般に、第１はポリヌクレオチド鋳型へ機能的に連結しており、第２は酵素成分に結合している２つの分析物特異的結合分子（例、抗体）を利用する。抗体は、ポリヌクレオチドおよび酵素成分が増幅鋳型を形成できるように相互作用することを可能にできるように分析物上で相互に近接近して結合できるように設計される。このようなアッセイは、２００６年１０月１１日に出願された、その全体が参照して本明細書に組み込まれる米国特許出願第１１／５４６６９５号明細書に記載されている。
【０１１３】
捕捉分子および分析物特異的検出剤は、調査対象の分析物（例、多価分析物）の同一部分またはエピトープを認識して結合することができる。または、捕捉分子および分析物特異的検出剤は、分析物の相違する部分またはエピトープを認識して結合する。一部の実施形態においては、捕捉分子および分析物特異的検出剤は、同一分析物に結合することができないが、相互作用して複合体を形成する２つの相違する分析物に結合することができる。例えば、捕捉分子、受容体タンパク質、リガンドおよび検出抗体の全部が複合体を形成するように、捕捉抗体は、受容体タンパク質に特異的で結合することができ、検出抗体は受容体のリガンドに対して特異的で結合することができる。
【０１１４】
本明細書に開示した方法に使用される捕捉分子および検出分子として使用される特異的分子は、特別には限定されない。捕捉分子および分析物結合検出分子として有用な分子には、モノクローナル、ポリクローナル、もしくはファージ由来抗体、抗体フラグメント、ペプチド、リガンド、ハプテン、核酸、核酸アプタマー、プロテインＡ、プロテインＧ、葉酸塩、葉酸塩結合タンパク質、プラスミノーゲン、マレイミドおよびその他のスルフヒドリル反応性基、ならびに本明細書に開示した方法と一緒に使用するために生成できる分子が含まれる。
【０１１５】
好ましくは、捕捉分子および分析物結合検出分子は、モノクローナル、ポリクローナル、もしくはファージ由来抗体、または抗体フラグメントである。より好ましくは、捕捉分子および検出分子は、モノクローナル抗体である。
【０１１６】
抗体は、それらがポリクローナル、モノクローナル抗体であろうと、またはそれらの免疫反応性フラグメントであろうと、当業者であれば習熟している慣例的方法によって製造することができる。従来型のモノクローナルおよびポリクローナル抗体は有用であり、好ましいタイプの結合分子を表している。このため確立された抗体調製方法は、免疫タイプの結合分子を調整するために使用できる。免疫タイプの結合成分のための抗体を調製および精製するために適切な方法は、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８８）に記載されている。さらに、本明細書に記載したアッセイは、現在入手可能な市販の抗体とともに使用できる。
【０１１７】
「ポリクローナル抗体」は、抗原、もしくはその抗原性機能的誘導体を用いて免疫された動物の血清に由来する抗体分子の異種集団である。ポリクローナル抗体を製造するためには、ウサギ、マウス、およびヤギなどの宿主動物を、任意でアジュバントが補給された抗原もしくはハプテン−担体コンジュゲートの注射によって免疫することができる。
【０１１８】
モノクローナル抗体を生成するために当技術分野において公知の、例えばファージ提示テクノロジーを用いたインビトロ生成による、および例えばマウスなどの動物を免疫する工程による生体内生成による方法が企図されている。これらの方法には、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５−４９７（１９７５））およびＣａｍｐｂｅｌｌ（“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｏｄｅｎｔ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ” ｉｎ Ｂｕｒｄｏｎら、Ｅｄｓ．，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ １３，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９９５））によって記載された免疫学的方法、ならびにＨｕｓｅらによって記載された組み換えＤＮＡ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６，１２７５−１２８１（１９８９））が含まれる。標準的な組み換えＤＮＡ技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８７））およびＡｕｓｕｂｅｌ（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ／Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９０））の中に記載されている。これらの方法の各々は、参照して本明細書に組み込まれる。
【０１１９】
捕捉分子および検出分子は無傷抗体には限定されず、例えば抗体フラグメントなどの他の結合分子および抗体フラグメントを含む組み換え融合タンパク質を含んでいる。
【０１２０】
分析物結合検出分子と酵素との連結
分析物結合検出分子および酵素は、結合もしくは連結する工程が成分のいずれかの活性を実質的に妨害しない限り、任意の方法で結合もしくは連結することができる。２つの部分間の連結を提供する正確な方法もしくは構造は制限ではなく、選択される様々な成分および最終ユーザが入手できる試薬に依存する選択の問題である。１つの連結タイプは、分析物特異的結合分子に連結した酵素を含んでいる。これらは、当業者には周知の方法を使用して調製できる。Ｄ．Ｇ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，７９，２６１（１９８４）を参照されたい。または、分析物結合剤は、組み換えＤＮＡおよび遺伝子組み換え技術を使用して生成することができる。Ｉ．Ｐａｓｔａｎ ａｎｄ Ｄ．Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４，１１７３（１９９１）を参照されたい。
【０１２１】
文献の中には、タンパク質を例えば抗体などの結合化合物（他のタンパク質）へ共有結合させるための広汎な指針を見いだすことができる。例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９６）などを参照されたい。１つの態様においては、１つ以上の酵素が分析物特異的結合分子上の一般的反応性基へ直接的または間接的に結合させられる。一般的反応性基には、アミン、チオール、カルボキシレート、ヒドロキシル、アルデヒド、ケトンなどが含まれ、市販の架橋剤によってタンパク質に連結させることができる。例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ（上記）；Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｎｉｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，２００２）を参照されたい。１つの実施形態においては、分子標識のＮＨＳ−エステルが結合分子上の遊離アミンと反応させられる。
【０１２２】
また別のタイプの連結は、分析物が核酸である場合は、酵素に連結したポリヌクレオチド鋳型配列から構成される。これらは、タンパク質をアミノ−オリゴヌクレオチドへ結合させるために当業者に公知の方法の変形を用いると調製できる。例えば、これは、アミノ修飾ｄＮＴＰが核酸の３’末端へ追加される酵素的テーリング法を使用して遂行することができる。Ａ．Ｋｕｍａｒ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６９，３７６（１９８８）を参照されたい。または、アミノ修飾塩基を核酸塩基配列内に合成的に導入することができる。Ｐ．Ｌｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１５，５２７５（１９８７）を参照されたい。酵素は次に、Ｕｒｄｅａの方法（Ｍ．Ｓ．，Ｕｒｄｅａ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６，４９３７（１９８８））においてアミノ修飾核酸へ結合させることができる。
【０１２３】
一部の実施形態においては、核酸／抗体コンジュゲートは、米国特許第５３２４６５０号明細書の中でＴｓｅｎｇらによって記載された化学的方法を用いて、順に抗体へ連結させられるＤＮＡオリゴヌクレオチド標的へのヘテロ二官能架橋剤の連結を含んでいる。
【０１２４】
オリゴヌクレオチドの抗体への化学結合を促進するために、オリゴヌクレオチドは、シアノエチル−ホスホルアミダイト化学を用いる合成中に５’末端で第１級アミン基を導入することによってアミノ修飾することができる。アミノ修飾オリゴヌクレオチドは、スルフヒドリル基を導入するヘテロ二官能試薬を用いてさらに修飾することができる。試薬であるＮ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）は、アセチル保護スルフヒドリル基を導入するアミノ修飾オリゴヌクレオチドへ連結させるために第１級アミン反応性基であるＮ−ヒドロキシル−スクシンイミド（ＮＨＳ）を使用するヘテロ二官能架橋剤である。抗体は、また別のＮＨＳ架橋剤であるスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）を用いて修飾される。ＳＭＣＣは、抗体のペプチド内の第１級アミン基（例、リシン上のイプシロン基）と反応し、マレイミド基（遊離スルフヒドリル反応性基）を抗体へ導入する。マレイミド修飾抗体は、ＳＡＴＡ修飾抗体と混合される。ＳＡＴＡ修飾オリゴヌクレオチド上のアセチル保護スルフヒドリル基は、反応性遊離スルフヒドリル基を生成するためにヒドロキシルアミンの添加を用いて活性化される（米国特許第５３２４６５０号明細書）。遊離スルフヒドリル含有オリゴヌクレオチドは、マレイミド修飾抗体と直ちに反応して、ＤＮＡ−抗体コンジュゲートを形成する。
【０１２５】
または、酵素は酵素配列に融合した（例えば、下記の実施例を参照されたい）、または２つの別個のポリペプチドとして発現して化学的に結合されたプロテインＡ、プロテインＧ、またはプロテインＬコーディング配列によって、抗体分析物特異的結合剤の抗体分析物特異的結合部分に結合させられる。
【０１２６】
同様に、ストレプトアビジンまたはアビジン配列は、コーディング配列を酵素のコーディング配列へ融合させることによって酵素に結合させることができ、またはポリペプチドを個別に発現させて化学的に結合することができる。ストレプトアビジンまたはアビジン結合酵素は次に、当業者には周知の条件下で、例えばポリペプチドもしくは核酸分子などの任意のビオチン化分子と混合することができる。
【０１２７】
固体表面に結合した結合分子
１つの実施形態においては、捕捉抗体が固体支持体へ結合させられる。また別の実施形態においては、分析物は、固体支持体へ直接的に結合する。
【０１２８】
固体支持体は、捕捉分子の固体の表面上への結合を促進するために、例えばポリＬ−リシンを用いた表面のコーティング、またはアミノアルデヒドシランもしくはエポキシシランを用いたシリコン化などによって修飾することができる。当業者であれば、本明細書に開示した方法が実施される状況は、どの固体支持体が最も好ましいのか、および容器が使用されるかどうかを規定することを理解するであろう。市販の、プレコートされたＥＬＩＳＡプレートおよびＥＬＩＳＡキットは市販されており、本明細書に開示した検出方法と結び付けて使用できる。
【０１２９】
固体支持体に結合させるべき捕捉分子の量は、試験サンプル中の量を模倣すると予測されるであろう様々な量の分析物を用いた公差力価測定によって実験的に決定できよう。一般に、試験サンプル中の分析物の量は、アトグラムからミリグラムの範囲内にあると予想される。試験サンプル中の未知の濃度の分析物は規定容量で加えられ、これは試験の感受性に影響を及ぼすであろう。大容量の試験サンプル（例、２００〜４００μＬ）が使用される場合は、サンプルの大容量を可能にするために試験フォーマットの変更が必要になることがある。しかし一般には、捕捉分子の濃度は、１ｍＬあたり約１〜約１０μｇ（マイクログラム）であろう。
【０１３０】
捕捉分子は、分析物をプラスチックもしくはその他の固体支持体系（例、膜もしくはミクロスフェア）へ結合させるために記載されてきたルーチン方法によって固体支持体へ結合させることができる。このような方法の例は、どちらも参照して本明細書に組み込まれる米国特許第４０４５３８４号明細書および米国特許第４０４６７２３号明細書中に見いだすことができる。
【０１３１】
捕捉分子の、例えば膜、ミクロスフェア、もしくはマイクロタイターウエルなどの表面への結合は、ＰＢＳ、もしくは規定ｐＨを備える他の緩衝液中への直接添加、その後の対流式オーブン中での乾燥によって実施することができる。
【０１３２】
捕捉分子は、固体支持体へ、例えば吸着、共有結合、アビジン−ビオチン結合、ストレプトアビジン−ビオチン結合、ヘテロ二官能架橋剤、プロテインＡ結合またはプロテインＧ結合などの結合手段によって結合させることができる。結合手段は各々、固体支持体の表面からの捕捉分子の消失を最小限に抑えながら、ストリンジェントな洗浄条件の使用を許容しなければならない。このような条件については下記で考察するが、当業者には明確に理解されている。１つの例として、吸着は、親水性吸着であってよい。また別の例として、ヘテロ二官能架橋剤は、マレイン酸無水物、３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＳ）、Ｎ−５アジド、２−ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド（ＡＮＢ−ＮＯＳ）またはメルカプトシランであってよい。
【０１３３】
捕捉分子は、例えばアミノ酸残基、好ましくはリシンもしくはアルギニン残基、チオール基、または炭水化物残基などの捕捉分子の一部分を通して固体支持体に結合させることができる。捕捉分子が抗体である場合は、チオール基は抗体ヒンジ領域のチオール基であってよい。
【０１３４】
固体支持体は、アビジンもしくはストレプトアビジンを用いて誘導体化することができ、捕捉分子は、固体支持体への捕捉分子の結合に役立つように、少なくとも１つのビオチン成分を含有するように修飾することができる。または、固体支持体はビオチンを用いて誘導体化することでき、捕捉分子は少なくとも１つのアビジンまたは少なくとも１つのストレプトアビジン成分を含有するように修飾することができる。
【０１３５】
試験サンプルおよび分析物の結合
本明細書に開示した方法を実施する際には、調査対象の選択された分析物を含有すると疑われるサンプルが、固体支持体上に分析物を捕捉するために抗体もしくは他の物質をコーティングして調製された支持体へ適用される。または、溶液に基づくアッセイでは、試験サンプルは固体支持体を含んでいない液相反応混合物へ直接的に加えられる。支持体の同一性に依存して、支持体は何らかのタイプの培養デバイス内に含有されてよい。支持体が膜の場合は、例えば膜の長さおよび幅よりわずかに大きな浅いガラス皿を使用できる。支持体がミクロスフェアである場合は、ミクロスフェアは、例えばポリプロピレンもしくはポリスチレン製のネジ蓋式のチューブなどのチューブに含有されてよい。容器の同一性は決定的ではないが、容器は、本明細書に開示した方法に使用される試薬がそれに非特異的には付着しない材料から作製されなければならない。
【０１３６】
使用される試験サンプルの量は決定的ではないが、容易に取り扱える量でなければならない。試験サンプルはさらにまた、支持体を適正に被覆するために十分でなければならず、これに関連して必要であれば希釈することができる。例えば、試験サンプルの量は、０．５μＬ〜２ｍＬであってよい。好ましくは、試験サンプルの量は、０．５μＬ〜１ｍＬである。最も好ましくは、試験サンプルの量は、０．５μＬ〜２００ｍＬであってよい。より少ない容量のサンプルは、マイクロ流体デバイスと結び付けて使用できる。当業者であれば、濃度は試験サンプルの容量に依存して変動してよいこと、そこで分析物を検出できる濃度範囲を提供することは困難であることを理解するであろう。
【０１３７】
そこで本明細書で教示する方法およびキットは、低い数字でサンプル中に存在する分析物を検出するために使用できる。本明細書に開示した方法において分析される試験サンプルは、１０４分子以下の分析物、１０６分子以下の分析物、１０８分子以下の分析物、１０１０分子以下の分析物、１０１２分子以下の分析物、または１０１４分子以下の分析物を含有する可能性がある。サンプルの量が増加するにつれて、一層大量の分析物を検出することが可能である。
【０１３８】
捕捉分子は、固体支持体と、捕捉分子が固体支持体に結合することを可能にするために十分な時間にわたってインキュベートされる。または、分析物は、分析物が固体支持体に結合することを可能にするために十分な時間にわたって固体支持体とともにインキュベートされる。好ましくは、インキュベーションは約１０分間〜約６０分間にわたって進行するが、一晩を必要とする場合がある。
【０１３９】
本方法のインキュベーション工程の各々が実施される特定温度もまた臨界的ではない。温度は、例えば任意の特定工程で使用される酵素、または任意の特定工程でアニーリングされるべき核酸のＴｍに依存する。このような検討材料は、当業者には明確に理解されている。
【０１４０】
結合した分析物特異的結合剤の検出
検出反応は、結合／ライゲーションまたは逆転写酵素反応と同一もしくは別個の反応容器内で実施されてよい。例えば、増幅鋳型を有する反応混合物のアリコートを９６ウエルＰＣＲプレートの対応するウエルへ移す。このステップでは、増幅鋳型は、検出試薬（例、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、カリフォルニア州アラメダ（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ））、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社、オレゴン州ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ））、第１および第２プライマーならびにポリメラーゼと反応させられる。検出反応混合物は、プライマーのアニーリング、増幅鋳型の増幅および増幅鋳型の検出を可能にする反応条件にかけられる。好ましい実施形態においては、第１および第２オリゴヌクレオチドプライマーは相違する。また別の実施形態においては、第１および第２オリゴヌクレオチドプライマーは同一である。例えば、１つの実施形態においては、検出反応は、増幅および検出のために必要な適切な時間および温度を用いてプログラミングされているリアルタイムＰＣＲ装置内で実行される。例えば、ＭＸ３００５ＰリアルタイムＰＣＲ装置は、解離曲線ならびに９０℃で１０分間、次に４０サイクルにわたり９５℃で１５秒間、および６３℃で３４秒間が続く２工程サイクリングパラメータを備えるＳＹＢＲ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社、オレゴン州ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ））Ｇｒｅｅｎ検出アッセイに対応するプログラムを用いて利用できる。その他のリアルタイムＰＣＲ検出の手段は当技術分野において周知であり（例、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、カリフォルニア州アラメダ（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ））および分子ビーコン検出アッセイ）、本実施形に使用するために適応させることができる。検出されたシグナルを次に使用すると、サンプル中の分析物の濃度を決定できる。
【０１４１】
非特異的増幅産物の増幅の防止
ライゲーションに基づく方法では、ＰＣＲのための増幅産物を生成するためには１本の鎖だけがライゲートされる必要がある。トポイソメラーゼを使用すると、１本の鎖だけがライゲートされる。しかしライゲーションもしくはトポイソメラーゼ反応混合物の少なくとも一部分が増幅反応混合物へ移される場合は、ライゲーションもしくはトポイソメラーゼ反応へ加えられた二本鎖ＤＮＡ分子のライゲートしていない部分が非特異的増幅産物の産生を生じさせよう。このような産物の形成は、不対３’ヌクレオチドオーバーハングの組み込みまたは例えば非天然ヌクレオチドアナログ、例えば２’−Ｍｅ、もしくは類似の修飾、ＵＴＰもしくは他のＲＮＡヌクレオチド、特別にはライゲーション部位に近位のライゲートしていない鎖の３’末端などの鎖内への修飾の組み込みを、高レベルの識別を有し、修飾ＤＮＡ鎖の向かい側のヌクレオチドを組み込まないであろうＰｆｕなどのポリメラーゼの使用と結び付けて制限することができる。
【０１４２】
洗浄条件
本明細書に開示した方法における試薬の添加間には、本アッセイシステムは、好ましくは非特異的結合の発生率を低下させるために洗浄にかけられる。洗浄サイクルおよび浸漬時間の数は実験によって決定されるが、一般には、洗剤、典型的には例えばＴｗｅｅｎ ２０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、またはＮＰ−４０（約１．０％まで）などの非イオン性ポリマー系洗剤を備える水または低もしくは高モル塩溶液（約１Ｍまでの塩、典型的にはＮａＣｌ）のいずれかを洗浄溶液として使用することができる。各々が約５秒間〜５分間持続する１〜８回の洗浄を、本方法に使用される試薬各々のインキュベーション後に実施できる。極めて高い、または極めて低い塩濃度は生理的塩濃度よりはるかにストリンジェントであると理解されている。洗剤濃度が高いほど、低い洗剤濃度よりストリンジェントである。適切な洗浄用緩衝液の選択は明確に、当業者の能力の範囲内である。一般的に使用される洗浄用緩衝液には、０．０２％のＴｗｅｅｎ ２０もしくは０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を備えるリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）（１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２ｍＭのＫＨ２ＰＯ４）またはＴｒｉｓ緩衝食塩液（ＴＢＳ）（１００ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）；１５０ｍＭのＮａＣｌ）が含まれる。洗浄する工程は、各インキュベーション工程間に、例えば固体支持体への捕捉分子の添加後、試験サンプルの添加後、および検出分子の添加後に実施できる。典型的な洗浄条件については、実施例で記載する。
【０１４３】
診断法
本方法、キット、および組成物は、サンプル中の分析物を検出および／または定量するために使用できる。典型的な分析物には、タンパク質、ペプチド、細胞表面受容体、受容体リガンド、核酸、炭水化物、ハプテン、分子、細胞、微生物およびそれらのフラグメントが含まれてよいが、これらに限定されない。本明細書に開示した方法の感受性に起因して、本方法は、典型的には極めて低濃度で存在する治療用生物学的物質を検出するために使用できる。
【０１４４】
組み換えポリペプチドの発現
本発明の実践は、他に特に規定しない限り、分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来技術を使用するが、これらは明確に当業者の技量の範囲内に含まれる。このような技術は、例えば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９）；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ” （Ｇａｉｔ，１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ” （Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，１９８７）；“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ” （Ｗｅｉｒ，１９９６）；“Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ” （Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｃａｌｏｓ，１９８７）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ” （Ａｕｓｕｂｅｌ，１９８７）；“ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ”，（Ｍｕｌｌｉｓ，１９９４）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，（Ｃｏｌｉｇａｎ，１９９１）などの文献において十分に説明されている。これらの技術は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの生成に適用することができるので、したがって本発明を作製および実践する際に考察することができる。特定の実施形態に特に有用な技術については、以下の項で考察する。
【０１４５】
下記の実施例は、当業者に本アッセイ、スクリーニング、および治療方法を作成および使用する方法についての完全な開示および説明を提供できるように考えられており、本発明者らが本発明であると見なす範囲を限定することは意図されていない。
【０１４６】
トポイソメラーゼ／リガーゼ用の基質の例
トポイソメラーゼについては、第１二本鎖核酸は、以下の配列を含んでいる。リガーゼについては、上の鎖は３’末端でＡＴＧＧＧＴ配列を含んでおらず、配列番号４の５’末端はリン酸化されており、
５’−ＴＧＡＣＧＣＣＣＧＡＡＧＣＣＡＡＧＴＧＣＧＧＧＡＣＧＧＣＴＴＣＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＣＣＣＣＴＴＡＴＧＧＧＴ−３’（配列番号２）
３’−ＣＴＴＡＡＣＣＧＧＧＧＡＡＴＡＣＣＣＴＴＧＣＴ−５’（配列番号３）
および第２核酸分子は、
５’−ＡＴＧＧＧＡＡＣＧＡＧＣＡＧＡＣＣＧＡＣＣＧＣＴＡＧＡＣＡＧＣＴＣＣＧＴＧＧＡ−３’（配列番号４）
３’−ＣＧＴＣＴＧＧＣＴＧＧＣＧＡＴＣＴＧＴＣＧＡＧＧＣＡＣＣＴ−５’（配列番号５）
を含んでいる。
【０１４７】
上記に示したトポイソメラーゼ／リガーゼのための対の基質とともに使用できる増幅のための第１および第２オリゴヌクレオチドプライマーは、第１オリゴヌクレオチドプライマー
５’−ＴＣＣＡＣＧＧＡＧＣＴＧＴＣＴＡＧＣＧ−３’（配列番号１０）
および第２オリゴヌクレオチドプライマー
５’−ＴＧＡＣＧＣＣＣＧＡＡＧＣＣＡＡＧＴＧ−３’（配列番号１１）
を含む。
【０１４８】
逆転写酵素用の基質の例
逆転写酵素のための基質となるＲＮＡ分子の配列を提供する。この配列は、図示した逆相補的ＲＮＡ鎖であるＤＮＡ鋳型を用いた逆転写酵素反応の産物であってよい。
５’−ＧＡＡＵＵＧＧＡＧＣＵＣＣＡＣＣＧＣＧＧＵＧＧＣＧＧＣＣＧＣＵＣＵＡＧＡＡＣＵＡＧＵＧＧＡＵＣＣＣＣＣＧＧＧＣＵＧＣＡＧＧＡＡＵＣＧＡＵＡＵＣＡＡＧＣＵＡＵＣＧＡＵＡＣＣＧＵＣＧＡＣＣＵＣＧＡＧＧＧＧＧＧＧＣＣＣＧＧＵＡＣＣＣＡＧＣＵＵＵＵＧＵＵＣＣＣＵＵＵＡＧＴＧＡＧＧＧＵＵＡＡＵＵＧＣＧＣＧＣＵＵＧＧＣＧＵＡＡＵＣＡＵＧＧＵＣＡＵＡＧＣＵＧＵＵＵＣＣＵＧＵＧＵＧＡＡＡＵ−３’（配列番号９）
【実施例】
【０１４９】
実施例１：トポイソメラーゼ活性の定量的検出
トポイソメラーゼアッセイは、ワクシニアウイルスＤＮＡトポイソメラーゼＩの２工程反応に基づいている。この基質の上の鎖は、トポイソメラーゼ認識部位（ＣＣＣＴＴ）を含有している。トポイソメラーゼ反応は、１μＬのトポイソメラーゼと２μＬの基質を結合することによって実施した。トポイソメラーゼ基質およびライゲーション基質は、１ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６０ｍＭのＮａＣｌ、１ｎｇ／μＬのＢＳＡ中に各々１０ｎＭ／Ｌで存在した。反応は、室温で１０分間にわたりインキュベートさせた。
【０１５０】
トポイソメラーゼ酵素は、認識部位の後で上の鎖を開裂し、開裂部位の３’末端へ共有結合するようになる。開裂部位の配列３’（図４では、上の鎖の３’末端の６マー「ＡＴＧＧＧＴ」（配列番号１２））は、相補鎖へアニーリングしたままとなるには短すぎるので、開裂産物は基質分子から拡散するであろう。結果として、トポイソメラーゼ反応サイクル（１本の鎖の開裂およびその後の開裂部位のライゲーション）は完了することができず、トポイソメラーゼ酵素はトポイソメラーゼ−核酸結合中間体として捕捉されたままとなる。反応サイクルは、ライゲーション基質へのライゲーションによって完了され、結果としてフローチャートの底部で生成物を生じる。この産物は次に新しくライゲートされたＤＮＡ分子内でライゲート部位をフランキングするＰＣＲプライマーを用いて増幅される（図４では、このような配列はボールド体で指示されている。トポイソメラーゼ反応は上の鎖しか開裂せず、下の鎖には切れ目を残すことに注目されたい）。
【０１５１】
プローブに基づく検出のためには、それに対するプローブが確立されている産物内に２つの検出配列を統合した（したがって、名称ＨｏｘプローブおよびｅＮＯＳ）。Ｈｏｘプローブ配列はトポイソメラーゼ認識部位（ＣＣＣＴＴ）を含有していることを留意されたい。定量的ＰＣＲ反応は、Ｔａｑポリメラーゼおよび４００ｎＭの各ＰＣＲプライマー（最終濃度）を含有する２７μＬのｑＰＣＲマスターミックス（プローブに基づく検出のためには：ＢＲＩＬＬＩＡＮＴ（登録商標）ＱＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、製品番号６００５４９（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、カリフォルニア州ラ・ホーヤ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ））；染料に基づく検出のためには：ＢＲＩＬＬＩＡＮＴ（登録商標）ＱＰＣＲ Ｃｏｒｅ試薬キット、製品番号６００５３０（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、カリフォルニア州ラ・ホーヤ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ））を加えることによって実施した。ｑＰＣＲ反応サイクルは、９５℃で１０分間、次に９５℃で１５秒間、および６０℃で４５秒間を４０サイクルにわたり実施した。プローブに基づく検出のためには、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、カリフォルニア州アラメダ（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ））プローブを最終濃度１００ｎＭで加えた。
【０１５２】
Ｈｏｘプローブに基づくアッセイの増幅プロットは、図６に示した。ｑＰＣＲアッセイにおける二倍希釈シリーズのＶＶ−トポイソメラーゼ（注意：酵素コントロールを用いていない場合は検出可能なＣｔ値は得られない）。表１からのデータは、図３にグラフで示した。
【０１５３】
【表１】
【０１５４】
同一アッセイを、プローブ検出法ではなくＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社、オレゴン州ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ））を用いて実施かつ定量した。結果は、４桁を超えて線形であった。表２からのデータは、図７にグラフで示した。
【０１５５】
【表２】
【０１５６】
本アッセイの検出限界は、約１００分子のＶＶ−トポイソメラーゼであると決定された。
【０１５７】
実施例２：トポイソメラーゼ−プロテインＧ融合タンパク質の活性
プロテインＧ標識ワクシニア・トポイソメラーゼをＢＬ２１−（ＤＥ３）細胞内で生成し、ＣＢＰ標識を用いて親和性精製した。Ｗｔ−トポイソメラーゼを従来型カラム精製法によって精製した。本アッセイは、プロテインＧ融合が酵素の機能を妨害するかどうかを決定するために、上記の方法を用いてＨｏｘプローブを使用して実施した。ＣＢＰ−プロテインＧトポイソメラーゼは、ｗｔ−トポイソメラーゼより約１桁低い比活性を有することが見いだされた（図８を参照）。これは、融合タンパク質としてのトポイソメラーゼの発現が酵素成分の活性を実質的に妨害しないことを証明している。
【０１５８】
実施例３：分析物の定量的検出のためのトポイソメラーゼに基づくＥＬＩＳＡ
ポリ塩化ビニル製マイクロタイタープレートのウエルを分析物に対する等量の精製モノクローナル抗体でコーティングする。ウエルを洗浄し、例えばリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）などの適切な緩衝液中のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの非特異的タンパク質を用いてブロッキングする。分析物を含有する可能性があるサンプルは、適切な緩衝液中で連続的に希釈する。ブロッキング剤を除去するために、ウエルを洗浄する。元のサンプルの様々な希釈液を含有する等量のサンプルを調製したウエル内へ、好ましくは２つずつ、または３つずつ配置する。定量的アッセイのためには、一連の公知の分析物濃度を一連の別個のウエルに加える。プレートは、サンプル中に存在する分析物が抗体に結合するために適切な時間にわたり温度および湿度の適切な条件下でインキュベートする。インキュベーション後、ウエルを洗浄して未結合分析物を除去する。
【０１５９】
ウエルは、分析物特異的結合分子としての抗体成分、および酵素成分としてのトポイソメラーゼ成分を含む分析物特異的結合剤に曝露させる。抗体成分は、ウエルをコーティングするために使用した抗体とは別個である分析物上のエピトープに結合する。マイクロタイタープレートは、サンプル中に存在する分析物が分析物特異的結合剤中に存在する抗体に結合するために適切な時間にわたり温度および湿度の条件下でインキュベートする。分析物特異的結合剤の成分は、ウエルへの非特異的結合を生じさせるであろう結合基によっては相互に結合されない。ウエルは、未結合の分析物特異的結合剤を除去するために洗浄する。
【０１６０】
ウエル内の結合した分析物特異的結合剤は、ワクシニアウイルスＤＮＡトポイソメラーゼＩ反応混合物中の２つの少なくとも部分的に二本鎖であるＤＮＡ二重鎖と接触させる。ＤＮＡ二重鎖の１本は、配列ＣＣＣＴＴＮ６（配列番号１３）を備える３’末端を有しており、各Ｎは独立して任意のヌクレオチドである。もう１本の二本鎖のＤＮＡ二重鎖は、Ｎ６配列のトポイソメラーゼ開裂によって生成される５’オーバーハングに相補的である５’オーバーハングを有している。２つの二重鎖は、二本鎖の二重鎖の１本の鎖を結合できるワクシニアのトポイソメラーゼ活性のための基質を形成する。
【０１６１】
トポイソメラーゼ反応混合物の一部分をウエルから取り出して、トポイソメラーゼ産物からの産物の特異的増幅を可能にするように設計された２つのプライマーを含むｑＰＣＲのための反応混合物へ移す。この反応は、結合したＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社、オレゴン州ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ））によって閾値サイクル（Ｃｔ）を決定するために監視する。標準曲線は、既知量の分析物を含有するウエル由来のサンプルに基づいて作製する。未治療の分析物を含有するサンプルのＣｔを決定し、元のサンプル中に存在した分析物の量は、既知濃度の分析物を含むサンプルを用いて作製された標準曲線を用いて決定する。
【０１６２】
実施例４：読出しとしてトポイソメラーゼ活性を使用する異種ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡアッセイ
ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡは、分析物であるＶＥＧＦの存在についての読出しとしてトポイソメラーゼ活性を用いて実施した。ＶＥＧＦ検出のためのＥＬＩＳＡキットは、業者（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）から購入した。結合および洗浄工程は、検出試薬であるＨＲＰ結合抗体を加える時点まで反応容量を１００μＬから５μＬへ減少させることを除いて、製造業者の取扱説明書にしたがって実施した。検出試薬であるストレプトアビジン−トポイソメラーゼ融合タンパク質（ＳＡ−Ｔｏｐｏ）は、１：１０００および１：１０，０００の希釈率で加え、未結合の検出試薬はインキュベーション後に洗浄した。３μＬのトポイソメラーゼ基質とともに１０分間にわたりインキュベーションした後、２７μＬのＰＣＲ混合物を加え、ＰＣＲを実施例１に記載したように実施した。Ｃｔ値は、ＶＥＧＦの投入濃度に対してプロットした（図９Ａ）。破線は、アッセイのバックグラウンド（ＶＥＧＦの添加なし）を表している。黒色の太線は、製造業者による検出限界（３０ｐｇ（ピコグラム）／ｍＬ）を表す。図９Ｂでは、同一データを検出されたＶＥＧＦのｐｇ値として表した。同様に、黒色の太線は、標準ＥＬＩＳＡにおける検出限界（１００μＬに付き３ｐｇ）を表す。３０ｐｇ／ｍＬのＶＥＧＦ濃度は、本方法によって確実に検出することができる。検出された絶対量は約１５０ｆｇ（フェムトグラム）、または市販のＥＬＩＳＡアッセイより約２０分の１少ない量であった。これらのデータは、本方法の感受性が比色酵素検出剤に匹敵することを証明している。
【０１６３】
実施例５：様々な緩衝液中でのＨｉｓ融合タンパク質としてのＴ３およびＴ７ ＤＮＡリガーゼの活性
Ｔ３およびＴ７ ＤＮＡリガーゼは、精製を促進するために組み換えＨｉｓ標識タンパク質として発現させた。これらのリガーゼは、１ｍＭのＡＴＰの存在下または非存在下でリガーゼ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、７ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ）中において活性について試験した。リガーゼの１０倍の希釈率の範囲にわたるライゲーション産物の精製は、ＰＣＲ増幅によって決定した。ある範囲のリガーゼ分子についての増幅産物のＣｔは、表１０に提示した。このデータは、加えられたＡＴＰがリガーゼ反応を進行させるためには必ずしも必要とされないこと、およびＨｉｓ標識タンパク質が機能的であることの両方を証明している。
【０１６４】
Ｔ３およびＴ７リガーゼは、さらにＰＣＲマスターミックス（ＢＲＩＬＬＩＡＮＴ（登録商標）ＱＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、製品番号６００５４９）中で試験した。Ｈｉｓ標識タンパク質としての両方のリガーゼは、Ｃｔによって決定されたようにＰＣＲマスターミックス中で機能的であることが見いだされた（図１１を参照されたい）。
【０１６５】
Ｔ３ ＤＮＡリガーゼは、Ｔ７リガーゼより有効であること、およびＴ３リガーゼはリガーゼ緩衝液中でＰＣＲマスターミックスよりも活性であることに注目されたい。
【０１６６】
Ｔ３リガーゼは、各々ストレプトアビジンおよびプロテインＧを用いて融合タンパク質としても生成されている。融合パートナーは、どちらのリガーゼも融合タンパク質として機能的であることが見いだされたので、リガーゼの活性を実質的に妨害しなかった。
【０１６７】
実施例６：タンパク質−タンパク質相互作用についてスクリーニングするためのリガーゼに基づく検出法
ランダム突然変異導入法および高スループットスクリーニング法を使用すると、タンパク質−タンパク質相互作用を変化させる突然変異についてスクリーニングすることができる。その結合パートナーとの相互作用について試験対象のタンパク質をランダム突然変異導入法にかけ、エピトープ標識を含有する発現ベクター内にサブクローニングする。個別のコロニーを採取し、培養中で増殖させる。各培養の一部分を使用して、ランダムに突然変異ライブラリー由来のタンパク質を含有する溶解物を調製する。
【０１６８】
ポリ塩化ビニル製マイクロタイタープレートのウエルを、各ライブラリーメンバーによって発現させたエピトープ標識に対する等量の精製モノクローナル抗体でコーティングする。ウエルを洗浄し、ＰＢＳ中のＢＳＡでブロッキングする。個別のライブラリーメンバーから調製した抽出物を適切な緩衝液中で希釈する。ブロッキング剤を除去するために、ウエルを洗浄する。等量の希釈抽出物を調製したウエル内へ、好ましくは２つずつ、または３つずつ配置する。結合パートナーに結合することが公知である突然変異誘発のために使用されたバージョンのタンパク質を含有する陽性コントロールウエル、およびタンパク質を含有していない、または結合パートナーと相互作用しないことが公知であるバージョンのタンパク質を含有する陰性コントロールウエルもまた調製する。プレートは、抽出物中のライブラリーメンバーが抗体に結合するために適切な時間にわたり温度および湿度の適切な条件下でインキュベートする。インキュベーション後、ウエルを洗浄して未結合ライブラリーメンバーを除去する。
【０１６９】
結合パートナーを含む適切な分析物特異的結合剤をリガーゼドメインに結合させる。結合パートナーは、例えば上述した方法などの組み換えポリペプチド法を使用してリガーゼドメインを備える融合タンパク質として生成される。結合パートナーおよびリガーゼドメインは、１つのドメインが他方に及ぼす可能性がある作用を減少させるために、短い、柔軟性のタンパク質配列によって分離する。
【０１７０】
ウエルは、ライブラリーメンバーが結合パートナーに結合することを可能にする適切な時間にわたり温度および湿度の条件下で結合パートナー−リガーゼ融合タンパク質に曝露させる。ウエルは、未結合の分析物特異的結合剤を除去するために洗浄する。
【０１７１】
ウエル内の結合した分析物特異的結合剤は、少なくとも１本の鎖がライゲーションしてＰＣＲのための鋳型を形成することを可能にするために適合する末端および少なくとも１つの５’−リン酸を有する２本の二本鎖ＤＮＡ二重鎖と接触させる。２本の二重鎖は、ライゲーションを許容する条件下でリガーゼのための基質として機能する。ライゲーション混合物は、規定時間にわたって適切な温度でインキュベートする。
【０１７２】
ライゲーション反応混合物の一部分をウエルから取り出して、ライゲーション反応からの産物の特異的増幅を可能にするように設計された２つのプライマーを含むＰＣＲのための反応混合物へ移す。増幅反応の終了時に、反応混合物の一部分を取り出し、ライブラリーメンバーと結合パートナーとの相互作用を示す増幅産物の存在を検出するために、ゲル電気泳動法および臭化エチジウムを用いた染色法にかける。所望の特性を有するライブラリーメンバーについてさらに分析する。
【０１７３】
実施例７：Ｔ４リガーゼ−ストレプトアビジン融合タンパク質の活性
ストレプトアビジンに連結したＴ４ ＤＮＡリガーゼを含む融合タンパク質（「Ｔ４／ＳＡ融合タンパク質」）を調製し、リガーゼ活性について試験した。市販されているＴ４ ＤＮＡリガーゼをＴ４／ＳＡ融合タンパク質の２つの調製物と比較した。２μＬの１０倍希釈シリーズのＴ４ ＤＮＡリガーゼもしくはＴ４／ＳＡ融合タンパク質を、１ｍＭのＡＴＰ、２００ｎＭプライマー（配列番号１０および配列番号１１）を含む２３μＬの１Ｘ ＢＲＩＬＬＩＡＮＴ（登録商標）ＱＰＣＲ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、ラ・ホーヤ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ））および、ライゲートすることのできる５塩基対オーバーハングを有する最終濃度１３．３ｎＭの以下のライゲーション基質と結合した。
５’ＴＧＡＣＧＣＣＣＧＡＡＧＣＣＡＡＧＴＧＣＧＧＧＡＣＧＧＣＴＴＣＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＣＣＣＣＴＴ（配列番号６）
ＡＣＴＧＣＧＧＧＣＴＴＣＧＧＴＴＣＡＣＧＣＣＣＴＧＣＣＧＡＡＧＡＧＧＴＣＧＡＡＣＣＧＧＧＧＡＡＴＡＣＣＣＡ−ＰＯ４ ５’（配列番号１４）
５’ＰＯ４−ＴＧＧＧＴＡＣＧＡＧＣＡＧＡＣＣＧＡＣＣＧＣＴＡＧＡＣＡＧＣＴＣＣＧＴＧＧＡ（配列番号１５）
ＴＧＣＴＣＧＴＣＴＧＧＣＴＧＧＣＧＡＴＣＴＧＴＣＧＡＧＧＣＡＣＣＴ ５’（配列番号１６）
【０１７４】
この反応を周囲温度で３０分間維持し、その後でＭＸ ３００５Ｐ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、ラ・ホーヤ）上で４０サイクルを実行することによるＳＹＢＲ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社、オレゴン州ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ））Ｇｒｅｅｎに基づく産物形成の検出法によってライゲーション産物を検出した。
【０１７５】
図１２に示したように、Ｔ４／ＳＡ融合タンパク質の平均Ｃｔ値は５〜７閾値サイクル後であり、これは市販のＴ４ ＤＮＡリガーゼと比較して活性のほぼ１００分の１への減少に対応する。さらにデータは、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼが融合タンパク質として機能的であることを証明している。
【０１７６】
実施例８：トポイソメラーゼ活性の近接性に基づく相補性による分析物の検出
本実施例は、同種アッセイにおける分割したトポイソメラーゼ酵素を用いた分析物の検出を証明している（すなわち、ＥＬＩＳＡタイプのアッセイにおけるような酵素を使用せずに、および任意の洗浄工程を使用せずに溶液中で）。当然ながら、本出願で考察するように、近接性に基づく検出法は、固相アッセイとして実施することもできる。例えば、（本実施例のように）酵素がアビジンもしくはストレプトアビジンに結合させられる実施形態においては、検出アッセイは、当該の分析物に対して特異的なビオチン化抗体を用いて固相アッセイとして実施することができる。
【０１７７】
以下の実験では、分析物はビオチン化タンパク質（ビオチン化ＢＳＡまたはビオチン化ＩｇＧ（抗体）のいずれか）であり、分析物特異的結合分子はストレプトアビジンであり、酵素は融合タンパク質としてのストレプトアビジンに結合させたトポイソメラーゼである。ワクシニアウイルス・トポイソメラーゼは、各々がストレプトアビジンに融合したＮ末端およびＣ末端フラグメントに分割した。詳細には、以下のトポイソメラーゼＣ末端フラグメント−ストレプトアビジン融合タンパク質を合成した：
Ｈｉｓ−ＳＡ−Ｃ−Ｔｏｐｏ：
ＭＧＳＳＨＨＨＨＨΗＡＡＥＡＧＩＴＧＴＷＹＮＱＬＧＳＴＦＩＶＴＡＧＡＤＧＡＬＴＧＴＹＥＳＡＶＧＮＡＥＳＲＹＶＬＴＧＲＹＤＳＡＰＡＴＤＧＳＧＴＡＬＧＷＴＶＡＷＫＮＮＹＲＮＡＨＳＡＴＴＷＳＧＱＹＶＧＧＡＥＡＲＩＮＴＱＷＬＬＴＳＧＴＴＥＡＮＶＷＫＳＴＬＶＧＨＤＴＦＴＫＶＫＰＳＡＡＳＩＤＡＡＫＫＡＧＶＮＮＧＮＰＬＤＡＶＱＱＬＥＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＩＲＩＫＤＬＲＴＹＧＶＮＹＴＦＬＹＮＦＷＴＮＶＫＳＩＳＰＬＰＳＰＫＫＬＩＡＬＴＩＫＱＴＡＥＶＶＧＨＴＰＳＩＳＫＲＡＹＭＡＴＴＩＬＥＭＶＫＤＫＮＦＬＤＶＶＳＫＴＴＦＤＥＦＬＳＩＶＶＤＨＶＫＳＳＴＤ（配列番号１７）
【０１７８】
以下のトポイソメラーゼＮ末端フラグメント−ストレプトアビジン融合タンパク質を合成した：
Ｎ−Ｔｏｐｏ−ＳＡ−Ｈｉｓ：
ＭＲＡＬＦＹＫＤＧＫＬＦＴＤＮＮＦＬＮＰＶＳＤＤＮＰＡＹＥＶＬＱＨＶＫＩＰＴＨＬＴＤＶＶＶＹＥＱＴＷＥＥＡＬＴＲＬＩＦＶＧＳＤＳＫＧＲＲＱＹＦＹＧＫＭＨＶＱＮＲＮＡＫＲＤＲＩＦＶＲＶＹＮＶＭＫＲＩＮＣＦＩＮＫＮＩＫＫＳＳＴＤＳＮＹＱＬＡＶＦＭＬＭＥＴＭＦＦＩＲＦＧＫＭＫＹＬＫＥＮＥＴＶＧＬＬＴＬＫＮＫＨＩＥＩＳＰＤＥＩＶＩＫＦＶＧＫＤＫＶＳＨＥＦＶＶＨＫＳＮＲＬＹＫＰＬＬＫＬＴＤＤＳＳＰＥＥＦＬＦＮＫＬＳＥＲＫＶＹＥＣＩＫＱＦＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＲＲＩＬＶＳＡＡＥＡＧＩＴＧＴＷＹＮＱＬＧＳＴＦＩＶＴＡＧＡＤＧＡＬＴＧＴＹＥＳＡＶＧＮＡＥＳＲＹＶＬＴＧＲＹＤＳＡＰＡＴＤＧＳＧＴＡＬＧＷＴＶＡＷＫＮＮＹＲＮＡＨＳＡＴＴＷＳＧＱＹＶＧＧＡＥＡＲＩＮＴＱＷＬＬＴＳＧＴＴＥＡＮＶＷＫＳＴＬＶＧＨＤＴＦＴＫＶＫＰＳＡＡＳＩＤＡＡＫＫＡＧＶＮＮＧＮＰＬＤＡＶＱＱＨＨＨＨＨＨ（配列番号１８）
【０１７９】
これらの構築体の各々では、Ｎ末端およびＣ末端トポイソメラーゼフラグメント（下線付き）のアミノ酸配列をストレプトアビジン（ボールド体およびイタリック体）および６ｘ−Ｈｉｓ標識へ融合させる。トポイソメラーゼおよびストレプトアビジンドメインは、グリシンおよびセリンリッチリンカーによって分離する。
【０１８０】
トポイソメラーゼフラグメント自体には、有意な検出可能なトポイソメラーゼ活性を有していない。しかし一緒に結合すると、両方の半分は相互に対して測定可能な親和性を有しており（本発明者らの推定では、約２×１０−９Ｍ）、トポイソメラーゼ活性を再構成できる。推定ＫＤを超える濃度で両半分を使用した実験に基づくと、Ｎ末端およびＣ末端フラグメントから再構成されたトポイソメラーゼは、全長トポイソメラーゼとほぼ同一の酵素活性を提示する。これらの内因性親和性のＫＤ未満の濃度で使用した場合は、トポイソメラーゼフラグメントは、トポイソメラーゼ活性の近接性依存性再構成によって分析物を検出するために使用できる。
【０１８１】
分析物のシグナル対近接性依存性検出のプロットは、最終的に全部の分析物特異的結合剤は別個の分析物分子と結び付き、近接性増強シグナル生成に関わることがあり得ないように、典型的には分析物濃度が分析物特異的結合剤の濃度より高い場合に観察されるスケルチング作用に起因する二相曲線を生じさせる。分析物特異的結合剤の濃度の上限は、分析物特異的結合剤の相互に対する親和性のＫＤによって与えられる。ＫＤを超える濃度では、大多数の酵素の半分はすでに再構成される。分析物特異的結合剤の濃度を低下させると、シグナルがまだ検出限界の上方にあればアッセイ感受性を改善できる。分析物特異的結合剤の濃度の下限は、分析物特異的結合分子（例、ストレプトアビジン）の分析物（例、担体タンパク質に結合したビオチン、ＫＤ １０−１４Ｍ）への親和性およびシグナル検出のための検出限界によって決定する。
【０１８２】
近接性依存性検出実験は、ストレプトアビジンに融合した指示濃度のＮ末端およびＣ末端トポイソメラーゼフラグメントを用いて３μＬの反応容量で実施した（図１３および１４を参照されたい）。詳細には、１μＬのビオチン化ＢＳＡもしくはビオチン化ヤギ−抗ウサギ抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｑｕａｌｅｘ社、カリフォルニア州サンクレメンテ（Ｓａｎ Ｃｌｅｍｅｎｔｅ，ＣＡ））を指示（最終）濃度で１μＬのストレプトアビジン／Ｎ末端トポイソメラーゼフラグメント融合タンパク質および１μＬのストレプトアビジン／Ｃ末端トポイソメラーゼフラグメント融合タンパク質（４５０ｐｍ、１１０ｐＭ、または５５ｐＭいずれかの最終濃度で、各々はそのモノマー形にある）と混合した。この混合物を室温で４時間にわたりインキュベートした。１μＬのトポイソメラーゼ基質（１２ｎＭ）を加え、さらに１０分間にわたりインキュベートした。最終濃度が４００ｎＭの増幅プライマーを含む２６μＬのＢＲＩＬＬＩＡＮＴ（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、ラ・ホーヤ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ））ＰＣＲミックスを加え、トポイソメラーゼ由来鋳型の量は、ＭＸ ３００５Ｐ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、ラ・ホーヤ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ））上で４０サイクル実行することによるＳＹＢＲ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社、オレゴン州ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ））に基づく産物形成検出法によって検出した。提示のために、Ｃｔ値は、全長トポイソメラーゼ／ストレプトアビジンの標準曲線に基づいて全長トポイソメラーゼ等量へ変換させた。図１３ならびに図１４Ａおよび１４Ｂにおける黒塗り記号は、分析物を伴わないバックグラウンドシグナルを表している。ビオチン化タンパク質（ＢＳＡおよびＩｇＧ）についての推定検出限界は、約５００ｆＭまたは２×１０７分子であった。
【０１８３】
その他の実施形態
上記の説明から、様々な使用および状態に適合させるために、本明細書に記載した本発明に変更および修飾を加えられることは明白であろう。このような実施形態もまた、以下の特許請求項の範囲内に含まれる。
【０１８４】
本明細書の変量の任意の定義における要素の列挙は、任意の単一要素または列挙した要素の組み合わせ（もしくは小組み合わせ）としての変量の定義を含んでいる。本明細書での実施形態についての詳述は、任意の単一実施形態としての、または任意の他の実施形態もしくはそれらの部分と組み合わせた実施形態を含んでいる。
【０１８５】
本明細書で言及した全ての特許および刊行物は、各独立特許および刊行物が参照して組み込まれると特別かつ個別に言及されているのと同程度まで参照して本明細書に組み込まれる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の分析物を検出するための方法であって、
（ａ）分析物特異的結合剤を、結合を許容する条件下で前記分析物とともにインキュベートするステップであって、前記分析物特異的結合剤はリガーゼ活性を有する酵素に結合した分析物特異的結合分子を含むステップと、
（ｂ）（ａ）の前記結合した分析物特異的結合剤を、第１二本鎖核酸分子および第２核酸分子とともに反応混合物中でインキュベートするステップであって、前記第１核酸分子は前記リガーゼの存在下で前記第２核酸分子にライゲートされるステップと、
（ｃ）（ｂ）の前記反応混合物の少なくとも一部分の核酸増幅を許容する条件下で第１オリゴヌクレオチドプライマー、第２オリゴヌクレオチドプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および少なくとも１つのｄＮＴＰを含む増幅反応混合物とともにインキュベートするステップであって、前記第１オリゴヌクレオチドプライマーは前記第１核酸分子と特異的に結合し、前記第２オリゴヌクレオチドプライマーは増幅産物の形成を許容するために前記第２核酸分子と結合するステップと、
（ｄ）前記増幅産物を検出する工程、
とを含む、方法。
【請求項２】
サンプル中の分析物を検出するための方法であって、
（ａ）第１分析物特異的結合剤および第２分析物特異的結合剤を、前記分析物が前記第１および第２分析物特異的結合剤と結合することを許容する条件下で前記分析物とともにインキュベートするステップであって、前記第１分析物特異的結合剤はリガーゼ活性を有する酵素の第１部分に結合した第１分析物特異的結合分子を含み、前記第２分析物特異的結合剤はリガーゼ活性を有する前記酵素の第２部分に結合した第２分析物特異的結合分子を含み、リガーゼ活性を有する前記酵素の第１および第２部分は相互作用して、前記第１および第２分析物特異的結合剤が前記分析物に結合するとリガーゼ活性を有する機能的酵素複合体を形成するステップと、
（ｂ）（ａ）の前記結合した第１および第２分析物特異的結合剤を、第１二本鎖核酸分子および第２核酸分子とともに反応混合物中でインキュベートするステップであって、前記第１核酸分子はリガーゼ活性を有する前記機能的酵素の存在下で前記第２核酸分子にライゲートされるステップと、
（ｃ）（ｂ）の前記反応混合物の少なくとも一部分の核酸増幅を許容する条件下で第１オリゴヌクレオチドプライマー、第２オリゴヌクレオチドプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および少なくとも１つのｄＮＴＰを含む増幅反応混合物とともにインキュベートするステップであって、前記第１オリゴヌクレオチドプライマーは前記第１核酸分子と特異的に結合し、前記第２オリゴヌクレオチドプライマーは増幅産物の形成を許容するために前記第２核酸分子と結合するステップと、
（ｄ）前記増幅産物を検出する工程
とを含む、方法。
【請求項３】
リガーゼ活性を有する前記酵素は、トポイソメラーゼまたはＤＮＡリガーゼである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記分析物特異的結合分子は、抗体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
リガーゼ活性を有する前記酵素は、ワクシニアウイルス・トポイソメラーゼＩもしくは伝染性軟属種（ｍｏｌｌｕｓｃｕｍ ｃｏｎｔａｇｉｏｓｕｍ）ウイルス（ＭＣＶ）トポイソメラーゼまたはそれらの触媒部分である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
リガーゼ活性を有する前記酵素は、Ｔ３ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ５ ＤＮＡリガーゼもしくはＴ７ ＤＮＡリガーゼまたはそれらの触媒部分である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記分析物は、固体支持体に結合させられる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体は、リガーゼ活性を有する前記酵素またはリガーゼ活性を有する前記酵素の第１および第２部分へビオチン−ストレプトアビジンまたはビオチン−アビジン相互作用によって間接的に結合させられる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔ３ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、Φ２９ ＤＮＡポリメラーゼまたは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩから選択される非熱安定性ポリメラーゼである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＤＮＡポリメラーゼは、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、バシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）（Ｔｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、９°Ｎｍ ＤＮＡポリメラーゼ、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、パイロコッカス・コダカレンシス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）（ＫＯＤ）ＤＮＡポリメラーゼ、ＪＤＦ−３ ＤＮＡポリメラーゼ、またはパイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）ＧＢ−Ｄ（ＰＧＢ−Ｄ）ＤＮＡポリメラーゼから選択される熱安定性ポリメラーゼである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｂ）の前に未結合分析物特異的結合剤を除去するステップをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
サンプル中の分析物を検出するための方法であって、
（ａ）分析物特異的結合剤を、結合を許容する条件下で前記分析物とともにインキュベートするステップであって、前記分析物特異的結合剤は逆転写酵素に結合した分析物特異的結合分子を含むステップと、
（ｂ）（ａ）の前記結合した分析物特異的結合剤を、ｃＤＮＡ分子を生成するために前記ＲＮＡの逆転写を許容する条件下でＲＮＡ分子とともに反応混合物中でインキュベートするステップと、
（ｃ）（ｂ）の前記反応混合物の少なくとも一部分の核酸増幅を許容する条件下で第１オリゴヌクレオチドプライマー、第２オリゴヌクレオチドプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および少なくとも１つのｄＮＴＰを含む増幅反応混合物とともにインキュベートするステップであって、前記第１オリゴヌクレオチドプライマーは前記ｃＤＮＡ分子と特異的に結合し、前記第２オリゴヌクレオチドプライマーは増幅産物の形成を許容するために前記第ｃＤＮＡ分子の相補体と結合するステップと、 （ｄ）前記増幅産物を検出するステップ
とを含む方法。
【請求項１３】
前記逆転写酵素は、ＭＭＬＶ逆転写酵素もしくはＡＭＶ逆転写酵素、またはこれらの触媒部分である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記分析物特異的結合分子は、逆転写酵素に直接的または間接的に連結した抗体である、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔ３ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Φ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、または大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩから選択される非熱安定性ポリメラーゼである、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＤＮＡポリメラーゼは、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス・サーモフィラス（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、バシラス・ステアロサーモフィラスＤＮＡポリメラーゼ、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、９°Ｎｍ ＤＮＡポリメラーゼ、サーモトガ・マリティマ（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス・アクアチクス（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、パイロコッカス・コダカレンシス（ＫＯＤ）ＤＮＡポリメラーゼ、ＪＤＦ−３ ＤＮＡポリメラーゼ、またはパイロコッカスＧＢ−Ｄ（ＰＧＢ−Ｄ）ＤＮＡポリメラーゼから選択される熱安定性ポリメラーゼである、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
分析物特異的結合剤を含む組成物であって、前記分析物特異的結合剤は酵素に連結した分析物特異的結合分子を含み、前記酵素はリガーゼ、トポイソメラーゼ、または逆転写酵素である組成物。
【請求項１８】
前記分析物特異的結合分子は、前記酵素へ直接的または間接的に連結した抗体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
分析物を検出するためのキットであって、
酵素に結合した分析物特異的結合分子を含む分析物特異的結合剤であって、前記酵素はリガーゼ、トポイソメラーゼ、または逆転写酵素である分析物特異的結合剤と、
前記酵素のための１つ以上のポリヌクレオチド基質であって、前記１つ以上のポリヌクレオチド上の前記酵素の活性は前記分析物の存在を示すＰＣＲ鋳型を生成する１つ以上のポリヌクレオチド基質と、
これらのための包装材料
とを含むキット。
【請求項２０】
前記分析物特異的結合分子は、前記酵素に直接的または間接的に連結した抗体である、請求項１９に記載のキット。
【請求項１】
サンプル中の分析物を検出するための方法であって、
（ａ）分析物特異的結合剤を、結合を許容する条件下で前記分析物とともにインキュベートするステップであって、前記分析物特異的結合剤はリガーゼ活性を有する酵素に結合した分析物特異的結合分子を含むステップと、
（ｂ）（ａ）の前記結合した分析物特異的結合剤を、第１二本鎖核酸分子および第２核酸分子とともに反応混合物中でインキュベートするステップであって、前記第１核酸分子は前記リガーゼの存在下で前記第２核酸分子にライゲートされるステップと、
（ｃ）（ｂ）の前記反応混合物の少なくとも一部分の核酸増幅を許容する条件下で第１オリゴヌクレオチドプライマー、第２オリゴヌクレオチドプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および少なくとも１つのｄＮＴＰを含む増幅反応混合物とともにインキュベートするステップであって、前記第１オリゴヌクレオチドプライマーは前記第１核酸分子と特異的に結合し、前記第２オリゴヌクレオチドプライマーは増幅産物の形成を許容するために前記第２核酸分子と結合するステップと、
（ｄ）前記増幅産物を検出する工程、
とを含む、方法。
【請求項２】
サンプル中の分析物を検出するための方法であって、
（ａ）第１分析物特異的結合剤および第２分析物特異的結合剤を、前記分析物が前記第１および第２分析物特異的結合剤と結合することを許容する条件下で前記分析物とともにインキュベートするステップであって、前記第１分析物特異的結合剤はリガーゼ活性を有する酵素の第１部分に結合した第１分析物特異的結合分子を含み、前記第２分析物特異的結合剤はリガーゼ活性を有する前記酵素の第２部分に結合した第２分析物特異的結合分子を含み、リガーゼ活性を有する前記酵素の第１および第２部分は相互作用して、前記第１および第２分析物特異的結合剤が前記分析物に結合するとリガーゼ活性を有する機能的酵素複合体を形成するステップと、
（ｂ）（ａ）の前記結合した第１および第２分析物特異的結合剤を、第１二本鎖核酸分子および第２核酸分子とともに反応混合物中でインキュベートするステップであって、前記第１核酸分子はリガーゼ活性を有する前記機能的酵素の存在下で前記第２核酸分子にライゲートされるステップと、
（ｃ）（ｂ）の前記反応混合物の少なくとも一部分の核酸増幅を許容する条件下で第１オリゴヌクレオチドプライマー、第２オリゴヌクレオチドプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および少なくとも１つのｄＮＴＰを含む増幅反応混合物とともにインキュベートするステップであって、前記第１オリゴヌクレオチドプライマーは前記第１核酸分子と特異的に結合し、前記第２オリゴヌクレオチドプライマーは増幅産物の形成を許容するために前記第２核酸分子と結合するステップと、
（ｄ）前記増幅産物を検出する工程
とを含む、方法。
【請求項３】
リガーゼ活性を有する前記酵素は、トポイソメラーゼまたはＤＮＡリガーゼである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記分析物特異的結合分子は、抗体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
リガーゼ活性を有する前記酵素は、ワクシニアウイルス・トポイソメラーゼＩもしくは伝染性軟属種（ｍｏｌｌｕｓｃｕｍ ｃｏｎｔａｇｉｏｓｕｍ）ウイルス（ＭＣＶ）トポイソメラーゼまたはそれらの触媒部分である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
リガーゼ活性を有する前記酵素は、Ｔ３ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ５ ＤＮＡリガーゼもしくはＴ７ ＤＮＡリガーゼまたはそれらの触媒部分である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記分析物は、固体支持体に結合させられる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体は、リガーゼ活性を有する前記酵素またはリガーゼ活性を有する前記酵素の第１および第２部分へビオチン−ストレプトアビジンまたはビオチン−アビジン相互作用によって間接的に結合させられる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔ３ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、Φ２９ ＤＮＡポリメラーゼまたは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩから選択される非熱安定性ポリメラーゼである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＤＮＡポリメラーゼは、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、バシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）（Ｔｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、９°Ｎｍ ＤＮＡポリメラーゼ、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、パイロコッカス・コダカレンシス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）（ＫＯＤ）ＤＮＡポリメラーゼ、ＪＤＦ−３ ＤＮＡポリメラーゼ、またはパイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）ＧＢ−Ｄ（ＰＧＢ−Ｄ）ＤＮＡポリメラーゼから選択される熱安定性ポリメラーゼである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｂ）の前に未結合分析物特異的結合剤を除去するステップをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
サンプル中の分析物を検出するための方法であって、
（ａ）分析物特異的結合剤を、結合を許容する条件下で前記分析物とともにインキュベートするステップであって、前記分析物特異的結合剤は逆転写酵素に結合した分析物特異的結合分子を含むステップと、
（ｂ）（ａ）の前記結合した分析物特異的結合剤を、ｃＤＮＡ分子を生成するために前記ＲＮＡの逆転写を許容する条件下でＲＮＡ分子とともに反応混合物中でインキュベートするステップと、
（ｃ）（ｂ）の前記反応混合物の少なくとも一部分の核酸増幅を許容する条件下で第１オリゴヌクレオチドプライマー、第２オリゴヌクレオチドプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および少なくとも１つのｄＮＴＰを含む増幅反応混合物とともにインキュベートするステップであって、前記第１オリゴヌクレオチドプライマーは前記ｃＤＮＡ分子と特異的に結合し、前記第２オリゴヌクレオチドプライマーは増幅産物の形成を許容するために前記第ｃＤＮＡ分子の相補体と結合するステップと、 （ｄ）前記増幅産物を検出するステップ
とを含む方法。
【請求項１３】
前記逆転写酵素は、ＭＭＬＶ逆転写酵素もしくはＡＭＶ逆転写酵素、またはこれらの触媒部分である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記分析物特異的結合分子は、逆転写酵素に直接的または間接的に連結した抗体である、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔ３ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Φ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、または大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩから選択される非熱安定性ポリメラーゼである、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＤＮＡポリメラーゼは、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス・サーモフィラス（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、バシラス・ステアロサーモフィラスＤＮＡポリメラーゼ、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、９°Ｎｍ ＤＮＡポリメラーゼ、サーモトガ・マリティマ（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス・アクアチクス（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、パイロコッカス・コダカレンシス（ＫＯＤ）ＤＮＡポリメラーゼ、ＪＤＦ−３ ＤＮＡポリメラーゼ、またはパイロコッカスＧＢ−Ｄ（ＰＧＢ−Ｄ）ＤＮＡポリメラーゼから選択される熱安定性ポリメラーゼである、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
分析物特異的結合剤を含む組成物であって、前記分析物特異的結合剤は酵素に連結した分析物特異的結合分子を含み、前記酵素はリガーゼ、トポイソメラーゼ、または逆転写酵素である組成物。
【請求項１８】
前記分析物特異的結合分子は、前記酵素へ直接的または間接的に連結した抗体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
分析物を検出するためのキットであって、
酵素に結合した分析物特異的結合分子を含む分析物特異的結合剤であって、前記酵素はリガーゼ、トポイソメラーゼ、または逆転写酵素である分析物特異的結合剤と、
前記酵素のための１つ以上のポリヌクレオチド基質であって、前記１つ以上のポリヌクレオチド上の前記酵素の活性は前記分析物の存在を示すＰＣＲ鋳型を生成する１つ以上のポリヌクレオチド基質と、
これらのための包装材料
とを含むキット。
【請求項２０】
前記分析物特異的結合分子は、前記酵素に直接的または間接的に連結した抗体である、請求項１９に記載のキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【公表番号】特表２０１０−５３７６３５（Ｐ２０１０−５３７６３５Ａ）
【公表日】平成２２年１２月９日（２０１０．１２．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２２９９４（Ｐ２０１０−５２２９９４）
【出願日】平成２０年７月１４日（２００８．７．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６９９５３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０３２４０１
【国際公開日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【出願人】（５０９３３１２８３）アジレント テクノロジーズ インコーポレイテッド (4)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１２月９日（２０１０．１２．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年７月１４日（２００８．７．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６９９５３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０３２４０１
【国際公開日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【出願人】（５０９３３１２８３）アジレント テクノロジーズ インコーポレイテッド (4)
【Ｆターム（参考）】
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