統合型マイクロ流体デバイスおよび方法
対象試料を解析するためのマイクロ流体デバイスが提供される。該マイクロ流体デバイスは、マイクロ流体デバイスの本体を含むことができ、該マイクロ流体デバイス本体は、試料調製領域（１０１）と、核酸増幅領域（１０２）と、核酸解析領域（１０３）と、流体チャネルネットワークとを含む。試料調製領域（１０１）、核酸増幅領域（１０２）、および核酸解析領域（１０３）の各々は、少なくとも１つの流体チャネルにより、他の２つの領域の少なくとも１つと流体的に相互連結される。該マイクロ流体デバイスを用いると、試料調製を生物学的に活性な分子の増幅と組み合わせることができ、対象分子の解析および／または検出に適する生物学的試料を提供することができる。提供される小規模装置および方法は、生物学的試料の調製および解析のためのより大規模な設備と比較して、より簡便であり、より迅速であり、より廉価であり、同等に有効である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．技術分野
本発明は、マイクロ流体工学の分野ならびに生化学および分子生物学の分野におけるマイクロ流体工学の応用に関する。本発明はさらに、統合型マイクロ流体プラットフォーム装置および関連の方法に関する。本発明はまた、核酸など、対象の生物学的分子を調製、増幅、および検出するためのマイクロ流体デバイスにも関する。本発明はまた、マイクロ流体デバイスを用いて、核酸など、対象の生物学的分子を調製、増幅、および検出する方法にも関する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体において本明細書に組込まれる、２００７年１０月１２日出願の同時係属米国特許仮出願第６０／９７９，５１５号の優先権およびその利益を主張する。
【０００３】
連邦政府による後援を受ける研究または開発に関する言明
該当なし。
【０００４】
付録の参照
該当なし。
【背景技術】
【０００５】
２．発明の背景
分子生物学は、核酸およびタンパク質などの高分子の形成、構造、および機能、ならびに細胞による遺伝情報の複製および伝達におけるそれらの役割のほか、生物のゲノム内で核酸を配列決定し、突然変異させ、さらに操作して、突然変異の生物学的効果を研究しうるような核酸の操作も取り扱う生物学の分野として広く定義することができる。
【０００６】
生化学および分子生物学の従来の実践では、しばしば研究される被験体のサイズに反比例するスケールにおける物理的工程の供給源を必要とすることがある。例えば、予測解析のための核酸フラグメントなどの生物学的試料の調製および精製と関連する装置およびプロセス化学では、往々にして無菌施設を伴う完全規模のバイオ実験室を必要とすることがある。さらに、核酸フラグメントを増幅する周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）工程を実行するには、同様の規模の環境から孤絶した施設を必要とすることが典型的でありうる。
【０００７】
２．１ マイクロ流体システム
「マイクロ流体工学」とは、一般に、小容量流体を処理する系、デバイス、および方法を指す。マイクロ流体システムは、流体を操作する多種多様の作業を統合しうる。このような流体は、化学的または生物学的な試料を含みうる。これらのシステムはまた、生物学的アッセイ（例えば、医学的診断、薬剤の発見、および薬剤送達のためのアッセイ）、生化学的センサー、または生命科学研究一般のほか、環境解析、工業工程のモニタリング、および食品安全試験など、多くの適用領域も有する。
【０００８】
マイクロ流体デバイスの１つの種類は、マイクロ流体チップである。マイクロ流体チップは、流体を保持し、チップ上における様々な位置から、また、様々な位置へと流体を移送し、かつ／または流体試薬を反応させる、チャネル、弁、ポンプ、リアクター、および／またはリザーバーなど、マイクロスケールの形状特徴（または「マイクロフィーチャ」）を含みうる。
【０００９】
しかし、既存のマイクロ流体システムは、あらかじめ規定された流動パターンによる以外、複数種の流体の制御された操作を可能とするのに十分な機構を欠いており、このため、システムを各種の化学的アッセイまたは生物学的アッセイで用いうる実用性が制約されている。これは、現場のアッセイが、各種の解析目的に応じて、異なる試薬の反復的な操作を必要とすることが多いためである。
【００１０】
さらに、多くの既存のマイクロ流体デバイスは、１つの特定の使用に制約されており、完全に再設計しない限り、他の適用に適応させるかまたはカスタマイズすることが容易に可能ではない。これらのデバイスはモジュール性を欠いており、したがって、１つの設計で複数の機能の実行が可能となる共通のデバイス部材を共有することが可能ではない。この柔軟性の欠如により、各使用に異なるシステムの作製が必要となるので、生産費用が増大する。
【００１１】
さらにまた、多くの既存のマイクロ流体システムは、アッセイの結果として得られる解析物の相互作用または存在を容易に検出することか可能な、直接的な評価項目アッセイのための手段を欠いている。例として述べると、アッセイ後における試料の色変化の視覚的な検出を用いてアッセイの結果を評価することが多い。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
こうして、生物学的試料または化学的試料の解析のために、また特に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アミノ酸、およびタンパク質などの試料に由来する生物学的に活性な高分子の検出および解析において流体を処理する、改善されたマイクロ流体システムが必要である。システムは、大量生産性であり、廉価であり、好ましくはディスポーザブルであることが望ましい。システムは、操作が単純で、流体処理ステップの多くまたは実質的にすべてが自動化されることが望ましい。システムはカスタマイズ可能であり、高分子の検出が所望される各種の適用に適する形で容易かつ迅速に再構成されるよう、モジュラー性であることが望ましい。また、システムは、直接的で有意味なアッセイ結果を提供可能であることも望ましい。
【００１３】
第２節または本出願の他の任意の節における任意の参考文献の引用および同定は、このような参考文献が本発明に対する先行技術として用いられることの容認としては考えないものとする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
３．発明の概要
対象試料を解析するためのマイクロ流体デバイスであって、
ａ）マイクロ流体デバイスの本体
を含み、該マイクロ流体デバイス本体が、
ｉ）試料調製領域と、
ｉｉ）核酸増幅領域と、
ｉｉｉ）核酸解析領域と、
ｉｖ）ネットワーク内において相互連結された複数の流体チャネルと
を含み、
試料調製領域、核酸増幅領域、および核酸解析領域の各々が、該ネットワーク内における少なくとも１つの流体チャネルにより、他の２つの領域の少なくとも１つと流体的に相互連結されるマイクロ流体デバイスが提供される。
【００１５】
また、対象試料を解析するためのマイクロ流体デバイスであって、
ａ）マイクロ流体デバイスの本体
を含み、該マイクロ流体デバイス本体が、
ｉ）試料調製領域と、
ｉｉ）核酸増幅領域と、
ｉｖ）ネットワーク内において相互連結された複数の流体チャネルと
を含み、
試料調製領域および核酸増幅領域の各々が、少なくとも１つの流体チャネルにより、他の領域と流体的に相互連結されるマイクロ流体デバイスも提供される。
【００１６】
一実施形態において、マイクロ流体デバイスは、マイクロ流体デバイス本体の選択される領域に、周囲圧力に対して陽圧または陰圧を加えることが可能な差圧供給源を含みうる。
【００１７】
別の実施形態において、マイクロ流体デバイスは、差圧供給源およびマイクロ流体デバイス本体に作動的に連結される差圧送達システムを含みうる。
【００１８】
別の実施形態において、マイクロ流体デバイスは、差圧供給源からダイアフラムの所望の開位置または閉位置への圧力を変換するための、特定であるかまたは選択の流体チャネル内であるかまたはその間に配置される、少なくとも１つのダイアフラムを含みうる。
【００１９】
別の実施形態において、試料調製領域は、
試料取込みリザーバーと、
試料調製試薬リザーバーと、
試料精製媒体と
を含み、試料取込みリザーバー、試料調製試薬リザーバー、および試料精製媒体は、流体的に相互連結される。
【００２０】
別の実施形態において、マイクロ流体デバイスは、試料精製媒体が配置される試料精製媒体リザーバーを含みうる。
【００２１】
別の実施形態において、試料精製媒体は、複数の流体チャネルの１つに配置される。
【００２２】
別の実施形態において、試料精製媒体は、試料精製リザーバーの底部に配置される。
【００２３】
別の実施形態において、核酸増幅領域は、
核酸増幅リアクターと、
核酸増幅試薬リザーバーと、
核酸増幅産物リザーバーと、
を含み、核酸増幅リアクター、核酸増幅試薬リザーバー、および核酸増幅産物リザーバーは、流体的に相互連結される。
【００２４】
別の実施形態において、対象試料は、流体材料、気体材料、液体材料中に実質的に溶解した固体材料、エマルジョン材料、スラリー材料、またはその中に粒子が懸濁する流体材料である。
【００２５】
別の実施形態において、対象試料は、生物学的材料を含む。
【００２６】
別の実施形態において、対象試料は、流体中における細胞の懸濁液を含む。
【００２７】
別の実施形態において、マイクロ流体デバイス本体は、複数層の弱溶剤接着ポリスチレンを含む。
【００２８】
別の実施形態において、試料調製領域は、試料取込みリザーバーと流体的に連結された試料混合ダイアフラムを含む。
【００２９】
別の実施形態において、核酸抽出媒体は、シリカ膜である。
【００３０】
別の実施形態において、マイクロ流体デバイス本体は、試料精製媒体を通気乾燥させる手段を含む。
【００３１】
別の実施形態において、試料調製領域は、洗浄リザーバーを含む。
【００３２】
別の実施形態において、試料調製領域は、廃棄物リザーバーを含む。
【００３３】
別の実施形態において、試料調製領域は、溶出リザーバーを含む。
【００３４】
別の実施形態において、試料調製試薬は、磁気ビーズを含む。
【００３５】
別の実施形態において、試料調製試薬は、試料調製リザーバーに配置される。
【００３６】
別の実施形態において、試料調製試薬は、磁気ビーズである。
【００３７】
別の実施形態において、試料調製試薬は、溶解試薬である。
【００３８】
別の実施形態において、核酸増幅リアクターは、熱サイクルリアクターである。
【００３９】
別の実施形態において、熱サイクルリアクターの底部は、ポリスチレンの薄層である。
【００４０】
別の実施形態において、熱サイクルリアクターの底部は、熱サイクリング間に、マイクロ流体デバイス本体上または本体内には配置されないヒーターにより加熱される。
【００４１】
別の実施形態において、核酸増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素（ＲＴ−）ＰＣＲ、ｃＤＮＡ末端迅速増幅（ＲＡＣＥ）、ローリングサイクル増幅、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写物媒介増幅（ＴＭＡ）、およびリガーゼ連鎖反応からなる群から選択される。
【００４２】
別の実施形態において、核酸解析領域は、対象核酸と対象核酸のプローブとの間の相互作用を検出するための領域を含む。
【００４３】
また、対象核酸を検出する方法であって、対象核酸を含有することが疑われる試料を得るステップと、マイクロ流体デバイスを用意するステップと、試料調製領域に試料を導入するステップと、核酸増幅用に試料を調製するステップと、調製された試料を核酸増幅領域に導入するステップと、核酸増幅領域において核酸増幅反応を実行して対象核酸を増幅するステップと、増幅された対象核酸を核酸解析領域に導入するステップと、増幅された対象核酸を検出するステップとを含む方法も提供される。
【００４４】
一実施形態において、対象核酸は、対象の疾患または障害と関連する。
【００４５】
別の実施形態において、検出するステップは、増幅された対象核酸と対象核酸のプローブとの間の相互作用を検出するステップを含む。
【００４６】
別の実施形態において、検出するステップは、色強度、蛍光強度、電気信号強度、または化学発光強度を可視化するステップを含む。
【００４７】
別の実施形態において、検出するステップは、試料中における少なくとも１種の対象分子に対応する強度値を発生させるステップを含む。
【００４８】
別の実施形態において、強度値は、色強度値、蛍光強度値および化学発光強度値、電流または電圧からなる群から選択される。
【００４９】
別の実施形態において、色強度値を発生させるステップは、
試料に対応する画像を解析して複数の画素を発生させるステップと、
複数の画素の各々に対して複数の数値を与えるステップと、
数値を生じさせて色強度値を提供するステップと
を含む。
【００５０】
別の実施形態において、該方法は、閾値を計算するステップと、色強度値を閾値と比較して対象分子を検出するステップとをさらに含む。
【００５１】
別の実施形態において、該方法は、少なくとも１つの色強度値と閾値とをデータベースに保存するステップをさらに含む。
【００５２】
別の実施形態において、閾値は、少なくとも１種の陰性対照試料を用いて計算される。
【００５３】
被験体における対象の疾患または障害の存在または素因を判定する方法もまた提供される。該方法は、対象の疾患または障害と関連する核酸を含有することが疑われる試料を被験体から得るステップと、試料中における対象の疾患または障害と関連する核酸を検出するステップとを含み、該検出するステップは、対象核酸を含有することが疑われる試料を得るステップと、マイクロ流体デバイスを用意するステップと、試料調製領域に試料を導入するステップと、核酸増幅用に試料を調製するステップと、調製された試料を核酸増幅領域に導入するステップと、核酸増幅領域において核酸増幅反応を実行して対象核酸を増幅するステップと、増幅された対象核酸を核酸解析領域に導入するステップと、増幅された対象核酸を検出するステップとを含み、増幅された対象核酸の検出が、対象の疾患または障害の存在または素因と関連する。
【００５４】
一実施形態において、検出するステップは、増幅された対象核酸の量（またはレベル）を決定するステップを含み、ここで、該方法は、該量（またはレベル）を対象核酸のあらかじめ選択された量（またはレベル）と比較するステップをさらに含む。
【００５５】
別の実施形態において、該量（またはレベル）とあらかじめ選択された量（またはレベル）との間の差は、対象の疾患または障害の存在または素因を示す。
【００５６】
４．図面の簡単な説明
ここで、添付の図面を参照して本発明を説明するが、これらにおいては、複数の図を通して同様の参照文字が同様のエレメントを示す。場合によって、本発明の理解を容易にするために、本発明の各種の態様が誇張されるかまたは拡大されて示されうることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】試料調製領域１０１、核酸増幅領域１０２、および評価項目検出アッセイを実施するための核酸解析領域１０３の３つの機能領域を有するマイクロ流体デバイス（「チップ」）の実施形態の３次元図である。試薬リザーバー１１１。解析領域リザーバー１１３。廃棄物リザーバー１１４。
【図２】図１に記載のマイクロ流体デバイスの等尺分解図であり、マイクロ流体デバイスの３層を示す（明確さを目的として、連続膜は示さない）。
【図３Ａ】図１に記載のマイクロ流体デバイスの実施形態についての上面図であり、試料調製領域（「核酸（ＮＡ）抽出領域」）、核酸増幅領域（この実施形態では、「ＰＣＲ領域」）、および核酸解析領域（「ＲＤＢ領域」）を示す。また、デバイス上における弁、マイクロ流体チャネル、貫通孔、および低密度ＤＮＡフィルターの配置も示される。この実施形態では、核酸解析領域において、リバースドットブロット（ＲＤＢ）評価項目検出アッセイを実施することができる。「廃棄物」：廃棄物リザーバー。
【図３Ｂ】図１に記載のマイクロ流体デバイスの実施形態についての上面図であり、試料調製領域１０１、核酸増幅領域１０２（核酸増幅リアクター１１２を含む）、および核酸解析領域１０３、ならびにデバイス上における弁、マイクロ流体チャネル、および貫通孔の配置を示す。解析領域リザーバー１１３。
【図４】図１に記載のマイクロ流体デバイスの実施形態についての上面図であり、デバイスの特定の層上におけるリザーバー、核酸増幅リアクター（またはチャンバー）、弁、マイクロ流体チャネル、および貫通孔を含む、デバイスの機能配置を示す。
【図５】図１に記載のマイクロ流体デバイスの実施形態についての上面図であり、デバイス上における弁の配置図を示す。
【図６】図１に記載のマイクロ流体デバイスの実施形態についての上面図であり、デバイス上におけるリザーバーの配置図を示す。
【図７】図１に記載のマイクロ流体デバイスの実施形態についての上面図であり、デバイスの機能領域の配置図を示し、リザーバー内における試薬の配置を示す。試料調製領域１０１。核酸増幅領域１０２（核酸増幅リアクター１１２を含む）。核酸解析領域１０３、ならびにデバイス上における弁、マイクロ流体チャネル、および貫通孔の配置。解析領域リザーバー１１３。
【図８】試料調製領域および核酸増幅領域の２つの機能領域を有するマイクロ流体デバイスの別の実施形態を示す。矢印で示す通り、試料調製領域は、試料の投入および調製、試料の精製、ならびに核酸の抽出のためのリザーバーを含む。核酸増幅領域は、核酸増幅リアクター（「増幅チャンバー」）を含む。デバイスのこの実施形態はまた、核酸増幅の完了後においてマイクロ流体デバイスから単位複製配列が抽出される領域である、核酸増幅産物抽出領域（「増幅産物抽出領域」）も含む。デバイスのこの具体的な実施形態は、５０×３８ｍｍの寸法を有する。
【図９】図８に記載のマイクロ流体デバイスの実施形態についての等尺分解図であり、マイクロ流体デバイスの３つの層（明確さを目的として、連続膜は示さない）を示す。
【図１０】図８に記載のマイクロ流体デバイスについての上面略図であり、デバイスの特定の層上におけるポンプ、弁、増幅リアクター、マイクロ流体チャネル、および貫通孔の配置図を示す。
【図１１】図８に記載のマイクロ流体デバイスについての上面略図であり、デバイスの機能領域の配置図を示し、複数の試薬リザーバー（例えば、「細胞」、「エタノール」、「ミキサー」、「廃棄物」、「溶出」、「ＮＡ１」、「ＮＡ２」、「ＡＷ１」、「ＡＷ２」）内における試薬の配置を示す。 図１２〜１６は、試料調製領域および核酸増幅領域の２つの機能領域を有するが、オンチップの核酸解析領域を有さない本発明のマイクロ流体デバイス（「チップ」）の別の実施形態を示す図である。
【図１２】リザーバーは示さずに、弁およびチャネルの配置を示す上面図である。
【図１３】二方向ポンプの３つの群：試料調製用ポンプ、核酸増幅試薬調製用ポンプ、および充填用ポンプを有する、図１２に示すマイクロ流体デバイスの実施形態の配置を示す図である。
【図１４】図１２に示すマイクロ流体デバイスの実施形態についての操作略図である。矢印は、デバイス上で処理される際の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）試料の進行を示す。
【図１５】図１２に示すマイクロ流体デバイスの実施形態についての操作略図である。矢印は、デバイス上で処理される際の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）試料の進行を示す。
【図１６】図１２に示すマイクロ流体デバイスの実施形態についての操作略図である。矢印は、デバイス上で処理される際の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）試料の進行を示す。
【図１７】チャンバーの開口部（「ノズル」）上に配置されるダイアフラムを用いてチャンバーの内容物を混合する混合ジェットを発生させうる、デバイスのチャンバー底部の実施形態を示す図である。
【図１８】本発明の実施形態によるマイクロ流体デバイスおよび対照（Ｑｕｉａｇｅｎ社製ＲＮＥａｓｙキット）により得られた比較の結果を示す図である。Ｑｕｉａｇｅｎ社製ＲＮｅａｓｙによる抽出／精製法（レーン１〜３、１０）およびマイクロ流体デバイス（レーン４〜９）を用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞から単離されたＲＮＡの１％アガロースゲルを示す図である。分子量マーカーを左側に示す。
【図１９】レーン１：ＤＮＡ標準物質；レーン２：オンチップで実行されたＲＴ−ＰＣＲからの単位複製配列産物；レーン３：投入ＲＮＡ（１μｌ）を示す図である。ＲＮＡは、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞から作製した。ベータ−アクチンを認識するプライマーを用いて、ｃＤＮＡ産物を作製し、ＰＣＲによりアクチンのｃＤＮＡを増幅した。
【図２０】示される通り、熱サイクルおよび試行時間を変化させる場合における、８回のＰＣＲ試行に対するオンチップでの再現性を示す図である。
【図２１】ＰＣＲの比較を示す図である。ＢｉｏＲａｄ ＭＪ Ｍｉｎｉ熱サイクラー（レーン２および３）またはマイクロ流体デバイス（レーン４）を用いる３０サイクルのＰＣＲにより、５×１０３コピーのプラスミド（ｐｒｌｐＧＬ３）を増幅した。分子量マーカーがレーン１に示されている。
【図２２】この実験において、マイクロ流体デバイスと連結して用いられたＰＣＲ熱サイクラーによる典型的なサイクルを示す図である。下図におけるグラフは、上図のグラフ内で示される最初の４サイクルの一部の拡大図である。
【図２３】マイクロ流体デバイス上で実行されるＲＴ−ＰＣＲプロトコールの結果を示す図である。ベンチトップ（ｂｔ）プロトコールおよびオンチッププロトコールを用いて、ＨＩＶ ＲＮＡを単離した。
【図２４】全血液中におけるβ−サラセミア遺伝子の検出を示す図である。３０サイクルのＰＣＲ後において、ベンチトップの熱サイクラー（レーン４〜５）またはマイクロ流体デバイス（レーン２〜３）を用いて並行的にＰＣＲ増幅された２つの同一試料を、アガロースゲル上で解析した。レーン１は、分子量標準物質を表す。
【図２５】ベンチトップＰＣＲ法またはマイクロ流体デバイスを用いるＨＰＶ増幅の結果を示す図である。
【図２６】リバースドットブロット（ＲＤＢ）によるＨＰＶ血清型検出用のオンチッププローブアレイを示す図である。ＨＰＶ−５２（上図）およびＨＰＶ−１１（下図）は、適正に検出された。
【図２７】ＲＤＢプロトコールの概略図である。
【図２８】アップルジュース中に添加された大腸菌１，０００個を処理する２つのチップ間における比較を示す図である。該添加されたジュースをオンチップで調製してＤＮＡを精製し、次いで、１μｌずつの２アリコートを取り出し、ベンチトップ上で増幅し、精製された残りのＤＮＡをオンチップで増幅した。示される通り、産物を取り出し、ゲル上で解析した。各チップの産物のレーン１およびレーン２はベンチトップ上で増幅されたアリコートを示し、各場合におけるレーン３はオンチップにおける増幅産物を表す。
【図２９】オンチップで抽出されたＤＮＡを用いる、ベンチトップのＰＣＲ結果とオンチップのＰＣＲ結果との比較を示す図である。大腸菌の添加量は、５×１０３個／μｌ〜１×１０４個／μｌの範囲であった。
【図３０Ａ】Ａ：「ベンチトップ」のＰＣＲ解析（レーン３）とマイクロ流体デバイスによる解析（レーン４）とを比較する、アップルサイダーに導入された大腸菌５００，０００個の解析を示す図である。レーン１および２は、それぞれ、陰性対照および陽性対照を表す。
【図３０Ｂ】Ｂ：「ベンチトップ」のＰＣＲ解析（レーン３）とマイクロ流体デバイスによる解析（レーン４）とを比較する、アップルサイダーに導入された大腸菌１００，０００個の解析を示す図である。レーン１および２は、それぞれ、陰性対照および陽性対照を表す。
【図３１】「ベンチトップ」のＰＣＲ解析（レーン２〜３）とマイクロ流体デバイスによる解析（レーン４〜５）とを比較する、アップルサイダーに導入された大腸菌５００，０００個の解析を示す図である。レーン１は、陰性対照を表す。
【図３２】「ベンチトップ」のＰＣＲ解析（レーン２〜３）とマイクロ流体デバイスによる解析（レーン４〜５）とを比較する、ＰＢＳに導入された大腸菌５００，０００個の解析を示す図である。レーン１は、陰性対照を表す。
【図３３】「ベンチトップ」のＰＣＲ解析（レーン２〜３）とマイクロ流体デバイスによる解析（レーン４〜５）とを比較する、アップルジュースに導入された大腸菌１０，０００個の解析を示す図である。レーン１は、陰性対照を表す。
【図３４】「ベンチトップ」のＰＣＲ解析（レーン２〜３）とマイクロ流体デバイスによる解析（レーン４〜５）とを比較する、アップルジュースに導入された大腸菌１，０００個の解析を示す図である。レーン１は、陰性対照を表す。
【図３５】２回の異なるマイクロ流体デバイスでの試行から得られた単位反復配列の比較を示す図である。各マイクロ流体デバイスの完全な試行から得られた結果（各マイクロ流体デバイスから生成された生成物に由来するゲル解析に対応するレーン３）は、同じマイクロ流体デバイスから得られて別個に増幅された、ＤＮＡに対する「ベンチトップ」のＰＣＲ増幅により得られた結果（レーン１および２）と識別できなかった。
【図３６】「ベンチトップ」のＰＣＲ解析（レーン２〜３）とマイクロ流体デバイスによる解析（レーン４〜５）とを比較する、脱脂粉乳に導入された大腸菌１，０００，０００個の解析を示す図である。レーン１は、陰性対照を表す。
【図３７】大腸菌からのＤＮＡ精製のための、ベンチトップおよびオンチップにおけるＷｈａｔｍａｎ社製ＦＴＡによる溶出の結果を示す図である。すべての試験は、１００万（すなわち、１，０００Ｋ）個の大腸菌添加を用いて実施した。
【図３８】例えば、ＰＣＲリアクターを有するマイクロ流体デバイスの核酸増幅領域内における密閉された核酸増幅リアクターと共に用いうる圧力除去デバイスの概略図である。
【図３９】核酸増幅リアクター、例えば、ＰＣＲリアクターの上部に接着することで、高温時における熱効果の結果としてリアクターがたわむことを防止しうる、剛性構造の概略図である。
【図４０】小領域内におけるスポットアレイのためのＲＤＢ流動設計を示す図である。図４０。ＲＤＢ流動設計の側面図。図４１Ａ〜Ｂ。オンチップのＲＤＢリザーバー（Ａ）およびＲＤＢリザーバー（Ｂ）用の面取空間の実施形態についての透視図。
【図４１】小領域内におけるスポットアレイのためのＲＤＢ流動設計を示す図である。図４０。ＲＤＢ流動設計の側面図。図４１Ａ〜Ｂ。オンチップのＲＤＢリザーバー（Ａ）およびＲＤＢリザーバー（Ｂ）用の面取空間の実施形態についての透視図。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
５．発明の詳細な説明
本発明は、試料調製、生物学的に活性な分子の増幅を組み合わせることが可能であり、調製された元の試料からの対象分子の解析および／または検出に適する生物学的試料を提供することが可能な、マイクロ流体デバイス（「チップ」）およびこれに基づく方法を提供する。本発明により提供される小規模装置および方法は、生物学的試料の調製および解析のためのより大規模な設備と比較して、より簡便であり、より迅速であり、より廉価であり、同等に有効である。
【００５９】
マイクロ流体デバイスは、生の核酸を含有する試料を自動的に処理し、該試料に由来する核酸鋳型を用いてヌクレオチド（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）の増幅を実行する、構造的でありかつ機能的な能力を提供する。該デバイスは、処理時における試薬、生成物、または試料の汚染を制御することの利点を有するほか、試薬消費が低度であることの利点も有する。
【００６０】
該デバイス上で実行されるアッセイは、完全に自動化されている。本発明により提供されるマイクロ流体デバイスシステムでは、試料または検体の導入以外の「手」作業をほとんど伴わずに所望の結果が得られ、これにより、解析者側の多大な時間および労力を節約する手段がもたらされる。さらに、生の試料または検体をマイクロ流体デバイスに単に適用するだけで、未熟練者でも洗練された分子診断を実施することができる。
【００６１】
マイクロ流体デバイスは、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）、タンパク質、酵素を含むがこれらに限定されない、対象の生物学的高分子の潜在的な供給源として用いうる、ウイルス、細菌、真菌、原核細胞、真核細胞、古細菌細胞など、任意の生物学的供給源に由来するか、または全血液、血清または血漿、尿、便、粘液、唾液、膣または頬のスワブ、細胞培養物、細胞懸濁液などの生物学的材料に由来する、対象試料の解析に適する。マイクロ流体デバイスは、生物学的であるかまたは生物に由来する物質または材料の検出を伴う多種多様の検出、診断、モニタリング、および解析の目的、例えば、医学的または獣医学的な診断、食品加工、工業加工、および環境モニタリングに用いることができる。デバイスは、個体に由来する生物学的試料中における、感染、疾患、または障害の存在を検出する診断デバイスとして用いることができる。βサラセミア、ＵＴＩ（尿路感染症）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、性器クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、梅毒の原因病原体である梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）、細菌性膣症と関連する細菌などのＳＴＩ（性感染症）、２型単純ヘルペスウイルスなどのＨＰＶ、パピローマウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびサイトメガロウイルス、ＨＩＶ、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）などの酵母、ならびに膣トリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）などの原虫を含むがこれらに限定されない多くの疾患または障害が検出に適する。
【００６２】
一実施形態において、対象試料を解析するためのマイクロ流体デバイスは、マイクロ流体デバイスの本体を含むことができ、該マイクロ流体デバイス本体は、
ｉ）試料調製領域と、
ｉｉ）核酸増幅領域と、
ｉｉｉ）核酸解析領域と、
ｉｖ）ネットワーク内において相互連結された複数の流体チャネルと
を含み、
試料調製領域、核酸増幅領域、および核酸解析領域の各々が、該ネットワーク内における複数の流体チャネルの少なくとも１つにより、他の２つの領域の少なくとも１つと流体的に相互連結される（図１〜１１）。
【００６３】
別の実施形態において、対象試料を解析するためのマイクロ流体デバイスは、マイクロ流体デバイスの本体を含むことができ、該マイクロ流体デバイス本体は、
ｉ）試料調製領域と、
ｉｉ）核酸増幅領域と、
ｉｖ）ネットワーク内において相互連結された複数の流体チャネルと
を含み、
試料調製領域および核酸増幅領域の各々が、該ネットワーク内における少なくとも１つの流体チャネルにより、他の領域と流体的に相互連結される（図１〜７）。
【００６４】
別の実施形態において、マイクロ流体デバイスは、試料調製領域および核酸増幅領域の２つの機能領域を有しうるが、オンチップの核酸解析領域を欠く場合がある（図８〜１６）。
【００６５】
限定を目的とはせずに開示の明確さを目的として、本発明の詳細な説明を以下に記載の小節に分割する。
【００６６】
５．１ マイクロ流体デバイス本体
該解析デバイスは、マイクロ流体デバイス本体を含む。本発明による使用に適するマイクロ流体デバイス本体は、参照によりそれらの全体において本明細書に組込まれる、米国特許公開第ＵＳ２００６／００７６０６８Ａ１号（Ｙｏｕｎｇら、２００６年４月１３日）、同第ＵＳ２００７／０１６６２００Ａ１号（Ｚｈｏｕら、２００８年７月１９日）、および同第ＵＳ２００７／０１６６１９９Ａ１号（Ｚｈｏｕら、２００８年７月１９日）において説明されている。
【００６７】
本体は、上面および下面を有する第１の硬質プラスチック基板と、第１の基板上面に接触してこれと接着し、第１の基板上面に対して実質的に横たわる弛緩状態と、第１の基板上面から移動する作動状態とを有する、実質的に硬質のプラスチック膜とを含みうる。第１の硬質プラスチック基板はその中に形成されたマイクロフィーチャを有することが可能であり、実質的に硬質のプラスチック膜は該マイクロフィーチャの上に配置されうる。膜は、適切な機械力の適用時における変形を許容するように選択された厚さを有する。異なる実施形態において、膜は、約１０μｍ〜約１５０μｍ、１５μｍ〜約７５μｍの厚さを有する。
【００６８】
機械力は、基板向きに膜を変形させるように陽圧により適用され、約５０ｐｓｉ未満を有しうる。一実施形態において、該大きさは３ｐｓｉ〜約２５ｐｓｉである。
【００６９】
基板から遠ざかる向きに膜を変形させるように陰圧により適用される機械力は、約１４ｐｓｉ未満の大きさを有しうる。一実施形態において、該大きさは約３ｐｓｉ〜約１４ｐｓｉである。
【００７０】
膜および第１の基板は、実質的に同じ材料から作製することもでき、異なる材料から作製することもできる。本体の作製で用いるのに適する材料の例は、熱可塑性材料または線状ポリマー材料を含む。特定の実施形態において、該材料は、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、ポリカルボネート、またはアクリルである。
【００７１】
実質的に硬質のプラスチック膜は、第１の基板に接着されない非接着領域を有しうる。膜の非接着領域は、両者共に第１の基板内に配置される、第１のチャネルと、該第１のチャネルとは分離した第２のチャネルとを少なくとも部分的に覆うことが可能であり、弛緩状態において、第１のチャネルと第２のチャネルとの間のシールを形成する。
【００７２】
膜の非接着領域はまた、第１の基板内において形成され、第１および第２のチャネルから、また実質的にこれらの間で断絶する弁座も少なくとも部分的に覆うことが可能である。
【００７３】
弁座は、第１および第２のチャネルの長手軸に対して実質的に垂直な堰を含みうる。
【００７４】
膜の非接着領域は、両者共に第１の基板内に配置される、第１のチャネルと、該第１のチャネルとは分離した第２のチャネルとを少なくとも部分的に覆うことが可能であり、作動状態において、第１の基板上面から分離し、第１のチャネルと第２のチャネルとの間における流体の流動に適する空洞を提供する。
【００７５】
第１の基板はまた、第１の基板の上面から第１の基板の下面へと延びる貫通孔も含みうる。
【００７６】
膜の非接着領域は、実質的に円形、楕円形、または角を丸くした矩形でありうる。
【００７７】
本体は、膜の上面に接触してこれと接着する、第２の硬質プラスチック基板をさらに含みうる。
【００７８】
第１の基板、第２の基板、および膜は、実質的に同じ材料で作製することができる。
【００７９】
第２の基板は、膜の非接着領域の実質的な上方に位置し、膜の非接着領域が第１の基板上面から移動してそれにより実質的に格納された状態を保ちうるサイズのチャンバーを含みうる。
【００８０】
本体は、各々が個別に作動可能な弁構造を形成し、マイクロチャネルにより連鎖状に連結される、複数の断絶した非接着領域を有するポンプをさらに含みうる。マイクロチャネルは、流体の流動に対して様々な抵抗力を有する。
【００８１】
本体は、膜が作動状態にあるとき、膜を構造的に支持するサイズ、形状であり、そうする位置にある、膜上方の支持構造をさらに含みうる。
【００８２】
膜が第１の基板から所望の距離を超えて移動することを防止するサイズ、形状であり、そうする位置にある膜止めを膜上方に配置することができる。
【００８３】
本体は、共用弁構造を有する複数のポンプを有しうる。共用弁構造は、共用弁と連結された複数の流体ポートをもたらす、３つ以上のマイクロチャネルの上方に配置される膜を含みうる。
【００８４】
本体は、流体材料、気体材料、流体材料中に実質的に溶解した固体材料、スラリー材料、エマルジョン材料、およびその中に粒子が懸濁する流体材料の１種または複数種を保持することが可能な、少なくとも１つのリザーバーを含む。特定の実施形態において、対象試料は、生物学的材料、例えば、流体中における細胞の懸濁液を含む。
【００８５】
リザーバーは、実質的に垂直となるように配置することができる。それは、規定の垂直レベルにあるかまたはこれに近いリザーバー内から液体を抽出するための液体抽出手段と連結することができる。リザーバーは、流体材料および粒子を含有することが可能であり、粒子がリザーバーの上部および底部のいずれに滞留することも防止する形で、流体にデバイス全体を循環させるよう、リザーバーにポンプを連結することができる。リザーバーは、個別に作動可能な第１の弁構造と第２の弁構造との間に連結することができる。
【００８６】
別の実施形態において、本体は、ポンプ機構により相互連結された複数のリザーバーを含みうる。ポンプ機構は、複数のリザーバーからの流体を流過させる共用弁構造を含みうる。
【００８７】
本体はまた、少なくとも１つのマイクロフィーチャも含みうる。マイクロフィーチャは、１方向の流動を優先する形状を有するチャネルを含みうる。
【００８８】
本体は、ポンプ内を流動する流体により作動可能な受動弁構造を形成する２つの非接着領域へとマイクロチャネルにより相互連結される、外部から作動可能なダイアフラム構造を形成する１つの非接着領域を有するポンプを含みうる。別の実施形態において、ポンプは、各々が個別に作動可能なダイアフラム構造を形成し、各ダイアフラム構造が少なくとも１つの他のダイアフラム構造に部分的に重なる、複数の断絶した非接着領域を有しうる。
【００８９】
一実施形態において、本体は、差圧供給源から所望の開位置または閉位置への圧力を変換するための、特定であるかまたは選択の流体チャネル間に配置される、少なくとも１つのダイアフラムを含みうる。
【００９０】
特定の実施形態において、本体は、上面および下面ならびにその中に形成されるマイクロフィーチャを有する第１のポリスチレン基板と、第１の基板上面に溶剤接着されたポリスチレン膜とを含みうる。本体は、ポリスチレン膜が第１の基板上面に対して実質的に横たわる弛緩状態と、ポリスチレン膜が第１の基板上面から移動する作動状態とを有しうる。
【００９１】
弱溶剤接着は、室温および周囲力の条件下ではほとんどまたは実質的にまったく接着効果を有さないが、適切な気温または力の条件下では２つの対合表面間において接着界面を形成することが可能な溶剤により形成することができる。
【００９２】
特定の実施形態において、本体は、複数層の弱溶剤接着ポリスチレン内において作製された機能的な流体ネットワークを含みうる。例えば、参照により本明細書に組込まれる、米国特許出願第２００６／００７８４７０Ａ１号で開示される、弱溶剤積層工程により作製されうる３層ポリスチレン体（「チップ」）。特定の実施形態において、該チップは、第１および第２の表面を有し、少なくとも１つの表面がマイクロ構造を含み、さらに、ポリマー材料である第１の部材と、第１および第２の表面を有し、第１および第２の表面の１つが、米国特許出願第２００６／００７８４７０Ａ１号で開示される通り、ポリマー部材に対して弱溶剤である接着剤により、第１の部材の第２および第１の表面の１つにそれぞれ固定的に接着される、第２のポリマー部材とを含む積層構造でありうる。
【００９３】
一実施形態において、本体は、対象アッセイ（例えば、核酸検出アッセイ）を実施するのに用いうる３つの領域：試料調製領域、核酸増幅領域、および核酸解析領域を含む。３つの領域のすべては、当技術分野で知られる方法を用いてポンプおよび弁（例えば、参照により本明細書に組込まれる、米国特許出願第２００６／００７６０６８Ａ１号を参照されたい）、ならびにリザーバーおよびチャネル（例えば、参照により本明細書に組込まれる、米国特許出願第２００７／０１６６２００Ａ１号を参照されたい）へと流体的に連結することができる。リザーバーおよびチャネルは、例えば、弱溶剤接着工程（米国特許出願第２００６／００７８４７０Ａ１号）により、チップ内に構築することができる。
【００９４】
別の実施形態において、デバイス本体は、参照により本明細書に組込まれる、米国特許出願第２００６／００７６０６８Ａ１号で開示される通り、ダイアフラムが基板表面に対して着座する弛緩状態と、ダイアフラムが該基板から移動する作動状態との間で作動可能な、実質的に硬質のダイアフラムを有しうる。このダイアフラムにより形成されるマイクロ流体構造は、製作が容易で頑健なシステムのほか、弁およびポンプなど作製の容易な部品も提供しうる。
【００９５】
具体的な一実施形態において、デバイス本体は、実質的に硬質のプラスチック膜が、接着剤として作用する弱溶剤により、基本的に平坦な硬質プラスチック基板に固定的に接着または積層する、ポリマーマイクロ流体構造である。特定の態様において、基板はマイクロフィーチャを含み、デバイス本体は、変形可能な膜と基本的に平坦な基板表面との間の接着領域により取り囲まれて画定される非接着セグメントを含み、この結果、弁構造がもたらされる。一部の実施形態において、第２の基板は膜の上面に接着され、膜の非接着領域に空気圧を加えるのに用いうるチャンバーを含む。本発明の使用と符合する方法によれば、空気圧または空気力を加えることで膜を変形させ、これにより弁を作動させる。一部の実施形態において、ポンプは、マイクロチャネルにより相互連結される複数の弁構造を含む。マイクロチャネルにより弁、ポンプ、リアクター、およびマイクロ流体リザーバーを相互連結して、マイクロ流体処理およびマイクロ流体解析に機能的に関与するサーキュレーター、ミキサー、または他の構造を形成することができる。
【００９６】
別の実施形態において、デバイス本体は、上面および下面を有する第１の硬質プラスチック基板と、第１の基板上面に接触してこれと接着し、第１の基板上面に対して実質的に横たわる弛緩状態と、第１の基板上面から移動する作動状態とを有する、実質的に硬質のプラスチック膜とを有しうる。第１の硬質プラスチック基板は基板内に形成されたマイクロフィーチャを有することが可能であり、実質的に硬質のプラスチック膜は、少なくとも１つのマイクロフィーチャの上に配置されることが多い。実質的に硬質のプラスチック膜は、約２Ｇｐａ〜約４Ｇｐａのヤング率を有し、適切な機械力の適用時における変形を許容するように選択された厚さまたは幅を有しうる。膜は、約１０μｍ〜約１５０μｍ、またより具体的に、約１５μｍ〜約７５μｍの厚さを有しうる。
【００９７】
それに対して膜が応答する機械圧は、基板向きに膜を変形するように適用される陽圧の場合があり、これは約５０ｐｓｉ未満でありえ、３ｐｓｉ〜約２５ｐｓｉでありうる。代替的に、および場合によって、機械圧は、基板から遠ざかる向きに膜を変形するように適用される陰圧の場合もあり、これは約１４ｐｓｉ未満でありえ、約３ｐｓｉ〜約１４ｐｓｉでありうる。
【００９８】
膜および第１の基板は、実質的に同じ材料から作製することができる。膜および第１の基板の材料は、熱可塑性材料または線状ポリマー材料でありえ、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、ポリカルボネート、またはアクリルから作製することができる。
【００９９】
実質的に硬質のプラスチック膜は、第１の基板に接着されない非接着領域を有しうる。膜の非接着領域は、両者共に第１の基板内に配置される、第１のチャネルと、第１のチャネルとは分離した第２のチャネルとを少なくとも部分的に覆うことが可能である。弛緩状態において、膜は、第１のチャネルと第２のチャネルとの間のシールを形成しうる。場合によって、膜の非接着領域は、第１の基板内において形成され、第１および第２のチャネルから、また実質的にこれらの間で断絶する弁座を少なくとも部分的に覆うことが可能である。弁座は、第１および第２のチャネルの長手軸に対して実質的に垂直な堰を含みうる。さらに、膜の非接着領域は、第１のチャネルと、第１のチャネルとは分離した第２のチャネルとを少なくとも部分的に覆うことが可能である。これらのチャネルは共に第１の基板内に配置することができ、作動状態において、膜は第１の基板上面から分離し、第１のチャネルと第２のチャネルとの間における流体の流動に適する空洞を提供する。場合によって、第１の基板の上面から第１の基板の下面へと延びる貫通孔もまた存在しうる。非接着領域は、任意の適切な形状を有することが可能であり、選択される形状は、当然ながら、目前の適用に依存する。特定の実施形態において、非接着領域は、円形でもありえ、実質的に楕円形でもありえ、実質的に角を丸くした矩形でもありえ、該適用に適切な任意の形状でもありうる。
【０１００】
特定の実施形態において、デバイス本体は、膜の上面に接触してこれと接着する、第２の硬質プラスチック基板を含むことができ、場合によって、第１の基板、第２の基板、および膜は、ポリスチレンなどの実質的に同じ材料で作製される。第２の基板は、膜の非接着領域の実質的な上方に位置し、膜の非接着領域が第１の基板上面から移動してそれにより実質的に格納された状態を保つサイズのチャンバーを含みうる。
【０１０１】
マイクロ流体デバイス本体は、各々が、マイクロチャネルまたはある種の流体流路により連鎖状に連結されることが典型的な、個別に作動可能な弁構造を形成する、断絶した非接着領域の対または群を含むポンプをさらに含みうる。マイクロチャネルは、流体の流動に対する可変抵抗を有することが可能であり、この目的のために、異なるサイズ、形状、および拘束部を有しうる。さらに場合によって、デバイスは、流動の特定の１方向における流体の流動を優先する形状を有するチャネルなどの形状特徴を含みうる。
【０１０２】
一実施形態において、複数のポンプは、共有弁構造を有することができ、特に、該ポンプは、共用弁と連結された複数の流体ポートをもたらす３つ以上のマイクロチャネルの上方に配置される膜を含む、共用弁構造を有することができる。こうして、一部の実施形態において、ポンプは、任意の３連弁構造を含みうる。液体、気体、流体材料中に実質的に溶解した固体でありうる流体材料、スラリー材料、エマルジョン材料、またはその中に粒子が懸濁する流体材料を保持することが可能なリザーバーを提供することができる。リザーバーは、実質的に垂直でありえ、規定の垂直レベルにあるかまたはこれに近いリザーバー内から液体を抽出するための液体抽出デバイスと連結することができる。リザーバーはまた、実質的に垂直となるように配置することができ、流体および粒子を含有しうる。粒子がリザーバーの上部または底部に滞留することを防止する形で、流体にデバイス全体を循環させるよう、リザーバーにポンプを連結することができる。リザーバーは、個別に作動可能な第１の弁構造と第２の弁構造との間に連結することができ、複数のリザーバーは、ポンプ機構により相互連結することができる。ポンプが共用弁構造を含むかまたはこれに連結されることで、ポンプによる複数のリザーバーからの流体の流過が可能となる。
【０１０３】
さらなる実施形態において、デバイスは、ポンプ内を流動する流体により作動可能な受動弁構造を形成する２つの非接着領域へとマイクロチャネルにより相互連結される、外因的に作動可能なダイアフラム構造を形成する１つの非接着領域を有するポンプを有しうる。また別の実施形態において、ポンプは、各々が個別に作動可能なダイアフラム構造を形成し、各ダイアフラム構造が少なくとも１つの他のダイアフラム構造に部分的に重なる、複数の断絶した非接着領域を有しうる。
【０１０４】
デバイスは、膜が第１の基板から所望の距離を超えて移動することを防止するサイズ、形状であり、そうする位置にある、膜上方に配置された機械的膜止めなどの膜止め機構を含みうる。
【０１０５】
別の実施形態において、本体は、上面および下面ならびにその中に形成されるマイクロフィーチャを有する第１のポリスチレン基板と、第１の基板上面に溶剤接着され、第１の基板上面に対して実質的に横たわる弛緩状態と、第１の基板上面から移動する作動状態とを有するポリスチレン膜とを有しうる。
【０１０６】
マイクロ流体デバイスはまた、差圧送達供給源、例えば、圧力または真空を供給する１つまたは複数の機械的通気ポンプを含む場合もあり、これに連結される場合もある。
【０１０７】
一実施形態において、差圧供給源は、マイクロ流体デバイス本体の選択される領域に、周囲圧力に対して陽圧または陰圧を加えることが可能である。
【０１０８】
マイクロ流体デバイスはまた、差圧送達システム、例えば、弁を連鎖的に作動させて基板上に形成された弁およびポンプを操作することが可能なコントローラを含む場合もあり、これに連結される場合もある（Ｚｈｏｕら、米国特許公開第ＵＳ２００７／０１６６１９９Ａ１号）。差圧送達システムは、差圧供給源（例えば、１つまたは複数の通気ポンプ）を含みうる。差圧送達システムは、差圧供給源およびマイクロ流体デバイス本体に作動的に連結することができる。
【０１０９】
差圧送達システムは、デバイス内における材料の混合を可能とする。例えば、コントローラにより、リザーバーのポンプチャンバーおよび他の２つのポンプチャンバーを操作することが可能であり、これにより、材料はリザーバーのポンプチャンバー内に引き込まれ、次いで、該２つのポンプチャンバーの各々の中に部分的に引き込まれ、該２つのポンプチャンバーの１つに部分的に引き込まれた材料は、その後、リザーバーのポンプチャンバーに戻る。
【０１１０】
マイクロ流体デバイスはまた、コントローラを制御するコンピュータおよび／またはコンピュータソフトウェアも含みうる。
【０１１１】
５．２ 試料調製領域および試料調製法
マイクロ流体デバイスは、試料調製領域を含みうる。一実施形態において、試料調製領域は、
試料取込みリザーバーと、
試料調製試薬リザーバーと、
試料精製媒体と
を含み、
試料取込みリザーバー、試料調製試薬リザーバー、および試料精製媒体は、流体的に相互連結される（図１〜７）。
【０１１２】
試料調製領域は、例えば、１つまたは複数の溶出リザーバーまたは廃棄物リザーバーを含みうる（図７）。試料調製領域はまた、細胞溶解および／または細胞溶解緩衝液、試料洗浄および／または洗浄緩衝液、試料精製および／または精製媒体のための１つまたは複数のリザーバーも含有しうる（図７）。
【０１１３】
試料精製媒体は、試料精製媒体リザーバー内に配置することができる。特定の実施形態において、試料精製媒体は、試料精製リザーバーの底部に配置することができる。
【０１１４】
代替的に、試料精製媒体は、複数の流体チャネルの１つに配置することもできる。
【０１１５】
試料調製領域は、試料取込み領域に流体的に連結される、試料取込みリザーバー内に対象試料を導入するための試料流入口を含みうる。
【０１１６】
試料調製領域はまた、試料取込みリザーバーに流体的に連結される、試料混合ダイアフラムも含みうる。
【０１１７】
試料調製領域は、デバイス本体上の少なくとも他の１つのリザーバーと流体的に相互連結される、試料混合リザーバーをさらに含みうる。
【０１１８】
一実施形態において、試料調製領域は、生物学的試料、例えば、細胞または生物の試料に熱ショックを与える熱供給源を含みうる。生検体を熱ショックに曝露することにより、例えば、既知の特定のＲＮＡ分子種を作製することができる。マイクロ流体デバイス内の検体から単離されたＲＮＡを後で核酸増幅する際、熱ショックにより既知の特定のＲＮＡ分子種が生成されたかどうかを解析することにより、元の検体がマイクロ流体デバイス内に導入されたときにそれが生検体であったかどうかを判定することができる。
【０１１９】
一実施形態において、試料中の生物学的材料、例えば、細胞または組織は、試料調製工程において溶解される。別の実施形態において、生物学的材料は、抽出を受ける。化学的、機械的、電気的、超音波的、熱的などを含むがこれらに限定されない、当技術分野で知られる任意の生物学的抽出プロトコールを、本発明のマイクロ流体デバイスと共に用いることができる。
【０１２０】
当技術分野で知られる任意の核酸抽出精製媒体を、対象核酸の単離に用いることができる。一実施形態において、核酸の単離のための流体流路にシリカ膜を配置することができる。多孔性シリカ膜は、直径１μｍ未満の極細ガラス糸から作製することができる。このような媒体による核酸回収の収率は、流体流路における該ガラス糸の配向性と関係する。流体流路が短縮されることを回避し、核酸の抽出および精製に十分な媒体を確保するために、膜のサイズを流体チャネルの断面積よりも実質的に大きくすることができる。
【０１２１】
別の実施形態では、Ｂｏｏｍら（米国特許第５，２３４，８０９号）の固相抽出法を用いることができる。Ｂｏｏｍらは、核酸含有出発材料から核酸を単離する工程であって、出発材料、カオトロピック物質、および核酸結合固相を混合するステップと、そこに核酸が結合した固相を液体から分離するステップと、固相核酸複合体を洗浄するステップとを含む工程を開示している。
【０１２２】
核酸洗浄用に当技術分野で知られる任意の有機溶剤を用いて、核酸精製媒体上に吸収された核酸を洗浄することができる。
【０１２３】
核酸調製試薬は、溶解試薬またはプロテアーゼ試薬でありうる。対象の細胞試料または組織試料の溶解は、マイクロ流体デバイスの１つまたは複数の試薬リザーバーチャネルまたはリアクターにおいて実施することができる。一実施形態において、細胞溶解液（１つの試薬リザーバー内に保持される）と、その粘稠性であるかまたは非粘稠性の各試薬（（１つまたは複数の）異なるリザーバー内に保持される）とのオンチップでの混合は、１つのリザーバーから他のリザーバーへと流体を持続的に送達することにより実行することができる。
【０１２４】
細胞溶解は、流体の操作、例えば、静かな機械的撹拌もしくは「フラッフィング」、循環、化学的溶解、または細胞溶解法の組合せなど、当技術分野で知られる方法により達成することができる。
【０１２５】
磁気ビーズもまた溶解に用いることができる（例えば、Ｌｅｅ ＪＧ、Ｃｈｅｏｎｇ ＫＥ、Ｈｕｈ Ｎ、Ｋｉｍ Ｓ、Ｃｈｏｉ ＪＷ、Ｋｏ Ｃ、「Ｍｉｃｒｏｃｈｉｐ−ｂａｓｅｄ ｏｎｅ ｓｔｅｐ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｉｎ ｏｎｅ ｃｈａｍｂｅｒ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、Ｌａｂ Ｃｈｉｐ、２００６年、第６巻、第７号、８８６〜８９５頁を参照されたい）。
【０１２６】
磁気ビーズを用いて、当技術分野で知られる標準的な方法による精製プロトコールまたは核酸抽出プロトコールを増強することができる。例えば、溶解前に、これらを試料調製試薬として、例えば、特定の生物学的材料、細胞、組織、もしくは生物、またはこれらの部分成分に対する事前の濃縮または選択に用いることができる。
【０１２７】
細胞溶解／ホモジナイゼーションは、これらの目的に必要とされることが典型的な実験室設備を用いずに、マイクロ流体デバイス上で達成することができる。
【０１２８】
例えば、オンチップのポンプを持続的に作動させることにより、試薬リザーバーの底部に位置する多孔性ディスクを介して、試薬リザーバー内に保持される粘稠性の溶液を吸引することによりホモジナイズすることができる。
【０１２９】
一実施形態において、細胞溶解は、細胞試料を含有する溶液を、マイクロ流体デバイス上の狭小なチャネル（例えば、０．９ｍｍ）内で前後に吸引することにより達成することができる。このような機械的溶解を用いて、組織培養細胞をホモジナイズすることができる。
【０１３０】
細胞溶解はまた、細胞をせん断することによっても達成することができる。
【０１３１】
細胞溶解を達成するのに当技術分野でよく知られる他の方法は、カオトロピック変性（Ｂｏｏｍら、米国特許第５，２３４，８０９号）、超音波処理、リザーバーまたはチャネルにわたり適用されるＤＣ電圧（Ｗａｎｇ ＨＹ、Ｂｈｕｎｉａ ＡＫ、Ｌｕ Ｃ、「Ａ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ ｄｅｖｉｃｅ ｆｏｒ ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｌｙｓｉｓ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｄｅ ｖｏｌｔａｇｅ」、Ｂｉｏｓｅｎｓ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ、２００６年、第２２巻、第５号、５８２〜５８８頁）、マイクロエレクトロメカニクスベースの圧電式マイクロ流体ミニ超音波処理（Ｍａｒｅｎｔｉｓ ＴＣ、Ｋｕｓｌｅｒ Ｂ、Ｙａｒａｌｉｏｇｌｕ ＧＧ、Ｌｉｕ Ｓ、Ｈａｅｇｇｓｔｒｏｍ ＥＯ、Ｋｈｕｒｉ−Ｙａｋｕｂ ＢＴ、「Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｓｏｎｉｃａｔｏｒ ｆｏｒ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｐｏｒｅｓ ｆｏｒ ＤＮＡ ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ、２００５年、第３１巻、第９号、１２６５〜１２７７頁）、浸透圧溶解、局所的水酸化物生成による溶解、ナノスケールバーブによる機械的切断（Ｄｉ Ｃａｒｌｏ Ｄ、Ｊｅｏｎｇ ＫＲ、Ｌｅｅ ＬＰ、「Ｒｅａｇｅｎｔｌｅｓｓ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ ｂｙ ｎａｎｏｓｅａｌｅ ｂａｒｂｓ ｉｎ ｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌｓ ｆｏｒ ｓａｍｐｌｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ」、Ｌａｂ Ｃｈｉｐ ２００３年、第３巻、第４号、２８７〜２９１頁）、凍結−融解、熱変性、リゾチーム後におけるＧｕＳＣＮ処理、ＬＩＭＢＳ（レーザー照射磁気ビーズシステム；Ｌｅｅ ＪＧ、Ｃｈｅｏｎｇ ＫＥ、Ｈｕｈ Ｎ、Ｋｉｍ Ｓ、Ｃｈｏｉ ＪＷ、Ｋｏ Ｃ、「Ｍｉｃｒｏｃｈｉｐ−ｂａｓｅｄ ｏｎｅ ｓｔｅｐ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｉｎ ｏｎｅ ｃｈａｍｂｅｒ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、Ｌａｂ Ｃｈｉｐ、２００６年、第６巻、第７号、８８６〜８９５頁）、ならびに同時に適用されるレーザーおよび機械的振動を含む。
【０１３２】
一実施形態において、溶解は、試料および溶解試薬を有するリザーバーの下方にあるオンチップのダイアフラムポンプを、それが作動するときに流体がダイアフラム内に引き込まれ、ダイアフラムが逆向きに作動するときにリザーバー内に再注入されるように持続的に作動させることにより実施することができる。
【０１３３】
生物学的試料に対する多くの調製工程は、試料の溶解を伴う。溶解用に当技術分野で用いられる溶液は、非粘稠性でもありうるが、一般に、粘稠性の溶液である。試料調製時において、処理された（溶解した）生物学的試料は、溶解した試料に由来する核酸が結合する膜を介して流動することが典型的である。その後、溶解した生物学的試料よりも粘稠度が通常はるかに低い複数種の洗浄緩衝液に同じ膜を流過させる。
【０１３４】
試料調製領域は、デバイス本体上における少なくとも１つの他のリザーバーと流体的に相互連結された洗浄リザーバーをさらに含みうる。
【０１３５】
試料調製領域は、デバイス本体上における少なくとも１つの他のリザーバーと流体的に相互連結された廃棄物リザーバーをさらに含みうる。
【０１３６】
試料調製領域は、デバイス本体上における少なくとも１つの他のリザーバーと流体的に相互連結された溶出リザーバーをさらに含みうる。
【０１３７】
核酸は、膜親和性によるなど、当技術分野で知られる方法を用いて、試料から抽出または精製することができる。一実施形態では、シリカ膜を用いることができる。試料の溶解物は、（例えば、膜の下流におけるダイアフラムポンプを用いて）膜を介して押出すこともでき、絞り出すこともでき、吸引することもできる。流体は、シリカ膜を通常の方向（垂直方向）に流動することが好ましい。一実施形態では、シリカ膜を介して溶出緩衝液を引き込むことにより、核酸を抽出することができる。別の実施形態では、当技術分野で知られる核酸抽出法、例えば、Ｂｏｏｍら、米国特許第５，２３４，８０９号に記載の方法を用いることができる。
【０１３８】
溶剤（例えば、エタノール）は通常、シリカ膜または他の種類の核酸精製媒体から核酸が溶出する前に、膜から除去しなければならない。マイクロ流体デバイス本体は、試料精製媒体を通気乾燥させる手段を含みうる。一実施形態において、試料調製領域は、試料精製媒体を通気乾燥させる手段を含む。例えば、デバイス本体は、コントローラ上における通気ポンプに取り付けられたポートを装備しうる。遮断弁は、該ポートと、シリカ膜が位置する流体ネットワークのリザーバーまたはチャンバーとの間に装備される。試料および試薬が流体ネットワーク内で操作されてシリカ膜上を流動するかまたはこれを介して流動するとき、チップ上における遮断弁を閉じて流体が通気ポンプへと漏出しないことを確認することができる。
【０１３９】
膜が適正に準備されたら、遮断弁を開き、真空ポンプを作動させる。これにより、膜を介して空気が流動し、これを効果的に乾燥させる。代替的に、膜は、加熱によるかまたは加熱された気流によっても乾燥させることができる。
【０１４０】
別の実施形態では、オンチップのポンプを用いて、膜上へまたはこれを介して空気を送出するかまたは吹送するだけで、乾燥を調節することができる。
【０１４１】
核酸などの対象分子は、膜から除去して核酸増幅領域へと移送することができる。
【０１４２】
試料調製領域は、デバイス内の他のリザーバーと流体的に相互連結された核酸抽出膜リザーバーをさらに含みうる。該リザーバー内に核酸抽出膜または核酸抽出フィルターを配置することができる。
【０１４３】
核酸抽出膜は、例えば、核酸抽出膜リザーバーの底部に配置することができる。
【０１４４】
マイクロ流体デバイスは、核酸抽出膜を乾燥させる（例えば、送風、加熱、または真空乾燥により）ための領域をさらに含みうる。
【０１４５】
マイクロ流体デバイスのすべての領域は、酵素、溶出緩衝液、洗浄緩衝液、廃棄物保持、核酸抽出精製媒体、ヌクレオチド、プライマー配列、洗浄剤、および酵素基質を含みうるがこれらに限定されない試料処理試薬を保持および分注するリザーバーを含みうる。これらの試薬を含有するリザーバーのほか、核酸増幅領域も、マイクロ流体デバイス本体の異なる区画内に空間的に配置することができ、流体ネットワークにより互いに対して流体的に相互連結することができる。
【０１４６】
５．３ 核酸増幅領域および核酸の増幅方法
マイクロ流体デバイス本体は、核酸増幅領域を含む。核酸増幅領域は、
核酸増幅リアクターと、
核酸増幅試薬リザーバーと、
核酸増幅産物リザーバーと、
を含み、
核酸増幅リアクター、核酸増幅試薬リザーバー、および核酸増幅産物リザーバーは、流体的に相互連結される。
【０１４７】
リザーバー内の核酸増幅試薬は、例えば、核酸プライマーまたは核酸鋳型、核酸増幅混合物、核酸増幅酵素、ヌクレオチド、緩衝液、または他の核酸増幅試薬でありうる。このような核酸増幅試薬は、当技術分野でよく知られている。
【０１４８】
該試薬リザーバーおよび産物リザーバーは、核酸増幅リアクターに連結され、核酸増幅リアクターへおよびここからの１つまたは複数の流入口を有しうる。該リザーバーは、例えば、熱サイクリングの間に核酸リアクターを効果的にシールする、（１つまたは複数の）流入口および（１つまたは複数の）流出口における弁を含有しうる。特定の実施形態において、オンチップのバルブは、送出サイクル時において気泡を生じうる。こうして、一連の弁を用いて核酸増幅試薬を核酸増幅リザーバー内に「押出す」と、核酸増幅リアクター内に除去が困難でありうる気泡が生じうる。流入口の弁を閉じ、流出口におけるポンプを用いて部分真空を発生させる（試薬を押出す代わりにこれらを吸引することにより）ことで核酸増幅チャンバーを満たすことにより、気泡なしに核酸増幅チャンバーを満たす機構がもたらされる。核酸増幅リアクターはまた、リアクター内にまず部分真空を発生させることで気泡なしにリアクターを満たすのでなく、ただ流入口の弁を開き、流出口側のポンプを用いることによっても満たすことができる。
【０１４９】
マイクロチャネルの作製法により、チャネルの角または縁に沿った毛細管流動が生じる場合がある。この毛細管流動は、核酸増幅リアクターの充填を妨げることがある。乾燥したマイクロ流体デバイスを用いることにより、充填の間に、流体にリアクター内面を優先的に湿潤させ、空気の捕捉を回避することができる。
【０１５０】
核酸増幅反応時における気泡形成は、マイクロリアクター内の問題でありうる。傾斜型核酸増幅チャンバーにより、形成された気泡をチャンバーの１つの側で回収させうる。ポリスチレンおよび核酸増幅試薬混合物の疎水特性により、核酸増幅チャンバーの１つの端部で気泡を回収する能力が損なわれる。試薬混合物は、気泡の移動または形成の補助となる各種の界面化製剤および添加剤を有しうる。界面活性剤は、ポリスチレンの疎水性表面と相互作用する。
【０１５１】
一実施形態において、改変リザーバーと組み合わせた傾斜型核酸増幅リアクターを用いることで、チャンバーおよび導管内のすべての気泡を追い出すことができる。この「循環」法は、混合（とりわけ、異なる密度の試薬）の増強、充填時における気泡の低減、充填後における気泡の除去能、試薬による弁の充填、および定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）のための明確な「定量域」の提供を含む複数の利点を提供しうる。
【０１５２】
ｑＰＣＲでは、高感度の光学検出器および光源を用いるので、入射光に干渉する気泡がない核酸増幅リアクターは有利である。一実施形態では、光学検出機器を核酸増幅リアクターの下端部に配置することで、気泡が検出に干渉しないことを確認することできる。また、弁を液体で満たすことにより、液体なしの（空気）弁と比較して、弁のシールを改善する一助となることも観察されている。液体の表面張力は温度に反比例するので、高温時には循環送出を行うことにより核酸増幅リアクター内に捕捉された気泡を除去することもできる。
【０１５３】
別の実施形態では、ワックスまたは油を用いて核酸増幅リアクターをシールすることもできる。チップ作製工程時におけるチャンバーのコーティングまたは反応混合物への油／ワックスの組込み（例えば、熱によりワックスを溶融させ、再固形化時に反応物上にコーティングを形成させる；代替的には、反応物上に油を配置する；例えば、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、ユニット１５．１、「Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｂｙ ＰＣＲ．Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ａｎｄ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ」；Ｑｕｉｎ Ｃｈｏｕ、Ｍａｒｉｏｎ Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｄａｖｉｄ Ｅ．Ｂｉｒｃｈ、Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｒａｙｍｏｎｄ、およびＷｉｌｌ Ｂｌｏｃｈ、「Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｅ−ＰＣＲ ｍｉｓ−ｐｒｉｍｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｉｍｅｒ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｌｏｗｃｏｐｙ−ｎｕｍｂｅｒ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９２年、第２０巻、第７号、１７１７〜１７２頁を参照されたい）。
【０１５４】
別の実施形態において、試料調製領域で抽出された核酸は、核酸増幅領域へと誘導される（すなわち、押出されるか、吸引されるか、絞り出されるか、または送出される）。核酸は、混合リザーバーにおいて１種または複数種の核酸増幅試薬と混合され、次いで、該混合物は、核酸増幅リアクターへと誘導され、そこで、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素（ＲＴ−）ＰＣＲ、ｃＤＮＡ末端迅速増幅（ＲＡＣＥ）、ローリングサイクル増幅、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写物媒介増幅（ＴＭＡ）、およびリガーゼ連鎖反応を含むがこれらに限定されない、当技術分野で知られる任意の熱媒介的な核酸増幅を実施することができる。
【０１５５】
一実施形態において、核酸増幅のための熱サイクリングは、その薄さを踏まえると著明な熱障壁を提示しない一方で、コントローラのマニホールド上に位置するヒーターと増幅リアクターとの間の良好な接触も提供する、弁およびポンプを作製するのに用いられる膜を介して実施される。
【０１５６】
特定の実施形態において、核酸増幅チャンバーは、熱サイクルリアクターまたは熱サイクルチャンバーである。熱サイクルチャンバーの底部は、例えば、ポリスチレンの薄層であり得る。熱サイクルチャンバーの底部は、熱サイクリング間に、マイクロ流体デバイスの本体上または本体内に配置されていない（例えば、本体外部の）ヒーターにより加熱することができる。
【０１５７】
別の実施形態において、核酸増幅（例えば、ＰＣＲ）リアクターは、マイクロ流体デバイス本体の基板内において、弱溶剤接着法または弱溶剤積層法（参照によりその全体において本明細書に組込まれる、ＵＳ２００６／００７８４７０）を用いることによるポリスチレン薄膜により提供される（３方を壁で囲まれた）チャネル構造を格納することにより作製される。弱溶剤接着の使用は、その中に配置されるマイクロフィーチャの完全性および信頼性を保つ一方で、このような適用におけるポリスチレンの使用を可能として有利である。
【０１５８】
薄膜は、非常に低い熱抵抗を提供し、このために、迅速な熱サイクルを可能とする。該膜はまた可撓性でもあり、ヒーターとの優れた接触を可能とする。チャンバーは、オンチップの弁およびポンプにより、単一または複数の試薬流入リザーバーおよび単一または複数の流出リザーバーに流体的に連結される。
【０１５９】
別の実施形態において、核酸増幅リアクターは、マイクロ流体デバイス本体において形成される円形、矩形、四角形、または他の開口部形状に弱溶剤積層法を用いてポリスチレン薄膜を積層させることにより作製される。壁で囲まれた基板開口部と該開口部の底部に隣接する膜との間に形成される増幅リアクターにより、周囲圧力条件下の高温における増幅反応の実行が可能となる。
【０１６０】
マイクロ流体デバイス上に接着された膜を用いて、核酸増幅、例えば、迅速ＰＣＲ熱サイクリング用リアクターを提供することができる。薄膜は、システムの断熱性を低減するため、核酸増幅リアクターの底部として与えることができる。
【０１６１】
核酸増幅は、熱サイクルを必要とする。このサイクルは、リアクター内の試薬へおよびここからの熱の伝導を必要とする。一部の実施形態において、マイクロ流体デバイス本体および核酸増幅は、熱伝導性が低いポリスチレン（ＰＳ）から作製される。リアクター内における流体の温度を迅速に変化させるためには、ＰＳ材料の薄層が好ましい。マイクロ流体デバイスの通常の製作時には、熱サイクルリアクターの底部をシールする２５μｍ厚の膜が装備される。
【０１６２】
マイクロ流体デバイスはまた、コントローラのマニホールド上に配置すると、電極に接触し、熱サイクリング用のヒーターに電力を供給しうる、抵抗ヒーターをデバイス上に組込むこともできる。
【０１６３】
核酸増幅の場合、コントローラのマニホールド上のヒーターがこの膜に対して配置され、リアクターを加熱および冷却する熱抵抗の低い経路を提供する。
【０１６４】
別の実施形態において、加熱エレメントは、分子増幅リアクターを格納するポリスチレン膜と直接に接触する増幅リアクターの下方に配置することができる。代替的に、ヒーターとリアクター底部膜との間に、熱伝導性材料を配置することもできる。核酸増幅リアクターの各態様に応じ、リアクターは、数分の一マイクロリットル〜数十マイクロリットルの範囲の容量を有して有利である。
【０１６５】
別の実施形態において、核酸増幅リアクターは、クランプによる支持を受けることで、チャンバーの底部と、チャンバーの底部を画定する膜に対して配置されるヒーターとの間の接触を確保することができる。クランプはまた、リアクターの上部壁面に対する支持体としても作用し、変形を最小化することが可能である。
【０１６６】
前述のヒーターは、従来の表面実装電子抵抗器、薄膜ヒーター、赤外線送出器、ラジオ周波数、または他の既知のマイクロヒーターなど各種のものでありうる。一実施形態において、ヒーターは、１つまたは複数の抵抗温度検出器（ＲＴＤ）を含みうる。ある態様では、２つのＲＴＤを加熱に用い、１つを温度感知に用いることができる。代替的に、単一のＲＴＤを加熱および温度感知に用いることで、より小さな形状因子をもたらすこともできる。１つまたは複数のＲＴＤは、チップに内に組込むことで、リアクターの基底部を形成することができる。ヒーターは、条件文制御または他の既知の制御法により制御することができる。ある有利な態様では、ＲＴＤと共にフィードバック制御を用いて、核酸増幅の設定点温度に達したことを確認する。
【０１６７】
一実施形態では、抵抗温度検出器（ＲＴＤ）を、核酸増幅リアクターを熱サイクリングさせる温度センサーおよび抵抗ヒーターとして用いることができる。ＲＴＤは当技術分野でよく知られており、市販されている（コネチカット州、スタンフォード、Ｏｍｅｇａ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ社製）。ＲＴＤは、抵抗−温度間における既知の一次微分関係による高精度の抵抗器である。したがって、抵抗の変化を測定することにより、温度の変化を測定することができる。これらのセンサーは、巻線または沈着薄膜としての白金から作製されることが典型的であり、１００オームの公称抵抗を有する。ＲＴＤの構築は基本的に抵抗器の構築なので、このように用いることができる。当技術分野でよく知られる適切な回路設計により、単一のＲＴＤを用い、加熱モードと感知モードとを切り替えることができる。代替的に、一部が専用ヒーターとして作動し、その他が専用センサーとして作動するＲＴＤの組合せを用いることもできる。これらの構築により、コンパクトな加熱および温度感知の解決策がもたらされる。
【０１６８】
本発明のマイクロ流体デバイスと共に、当技術分野で知られる任意の核酸増幅プロトコールを用いることができる。
【０１６９】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素（ＲＴ−）ＰＣＲ、ｃＤＮＡ末端迅速増幅（ＲＡＣＥ）、ローリングサイクル増幅、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写物媒介増幅（ＴＭＡ）、およびリガーゼ連鎖反応を含むがこれらに限定されない、当技術分野で知られる核酸増幅プロトコールを、本発明のマイクロ流体デバイス及び方法を伴う使用に適合させることができる。
【０１７０】
マイクロ流体デバイス上では、複数の異なる反応を含むプロトコールを組み合わせて実行することができる。
【０１７１】
例えば、試料調製領域および核酸増幅領域の２つの機能領域を有する、図８〜１１および１２〜１６に示すデバイス上において、オンチップのＤＮＡ抽出／ＰＣＲプロトコールを実行することができる。図１１は、図１０に示すマイクロ流体デバイス内における、「細胞」、「エタノール」、「ミキサー」、「廃棄物」、「溶出」、「ＮＡ１」、「ＮＡ２」、「ＡＷ１」、「ＡＷ２」と称する複数の試薬リザーバーの例示的な配置（配置図）を示す。この実施形態によれば、「細胞」は懸濁した細胞およびプロテイナーゼＫを保有し、「ミキサー」は緩衝液ＡＬを保有し、「エタノール」はエタノールを保有し、「ＡＷ１」は洗浄緩衝液ＡＷ１を保有し、「ＡＷ２」は洗浄緩衝液ＡＷ２を保有し、「溶出」は溶出緩衝液ＡＥを保有し、「ＮＡ１」は核酸リザーバー１であり、「ＮＡ２」は核酸リザーバー２であり、「増幅マスター混合物」は増幅マスター混合物リザーバーであり、「単位複製配列流出１」は増幅流出リザーバー１であり、「単位複製配列流出２」は増幅流出リザーバー２であり、「廃棄物」は廃棄物リザーバーである。オフチップ解析ゾーンへの「単位複製配列１流出口」および「単位複製配列２流出口」のほか、増幅リアクターもまた示される。一実施形態において、オンチップのＤＮＡ抽出／ＰＣＲプロトコールは、以下の通りに実行することができる：
１．すべての溶液をそれぞれのリザーバーに添加する；
２．「細胞」−「ミキサー」間で細胞を複数回（例えば、１０分間にわたり５回）循環させて細胞を溶解し、「ミキサー」内に残存する最終流過物と混合する；
３．「エタノール」から「ミキサー」へとエタノールを送出する；
４．「ミキサー」内でエタノール／細胞溶液を混合する；
５．溶解した細胞溶液を、精製媒体を介して「廃棄物」へと送出する（例示的な態様によれば、精製媒体はシリカ膜を含む）；
６．洗浄緩衝液ＡＷ１を、精製媒体を介して「廃棄物」へと送出する；
７．洗浄緩衝液ＡＷ２を、精製媒体を介して「廃棄物」へと送出する；
８．精製媒体上に吸収されたアルコールを除去する（これは、精製媒体を介して空気を引き込む、コントローラに装備されたポンプにより達成することができる）；
９．乾燥ポンプを停止させる；
１０．溶出緩衝液ＡＥを、「溶出」から精製媒体（膜）を介して「ＮＡ１」へと送出する；
１１．溶出緩衝液ＡＥを、「溶出」から精製媒体（膜）を介して「ＮＡ２」へと送出する；
１２．増幅試薬を、増幅マスター混合リザーバーから「ＮＡ２」へと送出する；
１３．増幅混合物を、「ＮＡ２」から核酸増幅リアクターを介して「単位複製配列流出１」へと送出する；
１４．核酸増幅リアクター内において、残りの増幅混合物を熱サイクリングする；
１５．増幅産物を、増幅リアクターから「単位複製配列流出２」へと送出する；
１６．増幅産物を、「単位複製配列流出２」から核酸解析領域へと送出して検出する。
【０１７２】
５．４ 核酸解析領域および解析法
マイクロ流体デバイスは、核酸解析領域を含みうる。核酸解析領域では、核酸増幅反応から結果として得られる単位複製配列を検出することができる。核酸解析領域には、当技術分野で知られる任意の単位複製配列検出アッセイを容易に適合させることができる。核酸精製領域、核酸増幅領域、および核酸解析領域の各々は、少なくとも１つの流体流路により、他の２つの領域の少なくとも１つと流体的に相互連結することができる。
【０１７３】
別の実施形態において、マイクロ流体デバイスは、試料調製領域および核酸増幅領域を含みうるが、本体上の核酸解析領域を欠く場合がある。代わりに、核酸の検出は、マイクロ流体デバイスとは別の領域において（または検出器により）実施することができる（図８〜１６）。
【０１７４】
核酸解析領域を含むマイクロ流体デバイスの実施形態において、核酸解析領域は、検出アッセイが実行されるリアクター（リザーバー）または反応領域と、以下：ハイブリダイゼーション緩衝液、高厳密性の洗浄緩衝液、低厳密性の洗浄緩衝液、またはコンジュゲーション基質のいずれかのための１つまたは複数のリザーバーを含みうる。
【０１７５】
一実施形態において、核酸解析領域は、対象核酸と対象核酸のプローブとの間の相互作用を検出するための領域を含む。
【０１７６】
本発明は、対象核酸の検出法を提供する。一実施形態では、対象核酸を含有することが疑われる試料を得る。マイクロ流体デバイスの試料調製領域に試料を導入し、核酸増幅用に調製する。調製された試料を核酸増幅リアクターに導入し、核酸増幅領域において核酸増幅反応を実行して対象核酸を増幅する。次いで、増幅された対象核酸を核酸解析領域に導入し、増幅された対象核酸を検出する。検出するステップは、増幅された対象核酸と対象核酸のプローブとの間の相互作用を検出するステップ、例えば、当技術分野で知られる標準的な方法を用いる核酸ハイブリダイゼーションを検出するステップなど、評価項目検出アッセイを実施するステップを含みうる。
【０１７７】
一実施形態において、検出するステップは、色強度、蛍光強度、電気信号強度、または化学発光強度を可視化するステップを含みうる。
【０１７８】
別の実施形態において、検出するステップは、試料中における少なくとも１種の対象分子に対応する強度値を発生させるステップを含みうる。
【０１７９】
別の実施形態において、強度値は、色強度値、蛍光強度値および化学発光強度値、電流または電圧からなる群から選択しうる。
【０１８０】
別の実施形態において、色強度値を発生させるステップは、試料に対応する画像を解析またはデジタル化して複数の画素を発生させるステップと、複数の画素の各々に対して複数の数値を与えるステップと、数値を生じさせて色強度値を提供するステップと
を含みうる。
【０１８１】
別の実施形態では、閾値を計算し、色強度値を閾値と比較して対象分子を検出することができる。
【０１８２】
別の実施形態では、少なくとも１つの色強度値と閾値とをデータベースに保存することができる。閾値は、少なくとも１種の陰性対照試料を用いて計算することができる。
【０１８３】
被験体における対象の疾患または障害の存在または素因を判定する方法もまた提供される。一実施形態において、該方法は、
ａ）対象の疾患または障害と関連する核酸を含有することが疑われる試料を被験体から得るステップと、
ｂ）試料中における対象の疾患または障害と関連する核酸を検出するステップと
を含むことができ、該検出するステップは、
対象核酸を含有することが疑われる試料を得るステップと、
本発明のマイクロ流体デバイスを用意するステップと、
試料調製領域に試料を導入するステップと、
核酸増幅用に試料を調製するステップと、
調製された試料を核酸増幅領域に導入するステップと、
核酸増幅領域において核酸増幅反応を実行して対象核酸を増幅するステップと、
増幅された対象核酸を核酸解析領域に導入するステップと、
増幅された対象核酸を検出するステップと
を含み、増幅された対象核酸の検出が、対象の疾患または障害の存在または素因と関連する。
【０１８４】
検出するステップは、増幅された対象核酸の量（またはレベル）を決定するステップを含み、ここで、該方法は、該量（またはレベル）を対象核酸のあらかじめ選択された量（またはレベル）と比較するステップをさらに含む。一実施形態において、該量（またはレベル）とあらかじめ選択された量（またはレベル）との間の差は、対象の疾患または障害の存在または素因を示す。
【０１８５】
核酸解析領域内で実施しうる核酸検出法は、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、ｉｎ ｓｉｔｕにおける結果の視覚化、電気化学的検出など、当技術分野でよく知られる方法を含みうるがこれらに限定されない。
【０１８６】
特定の実施形態において、核酸解析領域は、リバースドットブロットアッセイを実施して、単位複製配列を検出するための反応チャンバーまたは反応領域を含みうる。このようなアッセイは当技術分野でよく知られている。核酸解析領域はまた、リバースドットブロットアッセイにおける相互反応を検出する、例えば、リバースドットブロット基質またはリバースドットブロット挿入物上における相互反応を検出するための領域を含みうる。代替的に、該基質または挿入物は、マイクロ流体デバイスから取り外して、別のリーダーまたは検出器内に挿入することもできる。
【０１８７】
一実施形態において、核酸解析領域は、リザーバー内に取り付けられ、フィルター下部にフリットを有する、ＲＤＢフィルターを含みうる。リザーバーは、ヒーターを伴うかまたは伴わずに取り付けることができ、能動的な送出のためのより大型のダイアフラムを有しうる。ハイブリダイゼーション緩衝液と混合され、ＲＤＢフィルターを介してフィルターに垂直な方向に送出された単位複製配列が、核酸増幅リアクターから直接に送達されうる。
【０１８８】
フリットを用いて、混合物がＲＤＢフィルターを均一に流過するように保つことができる。ハイブリダイズした単位複製配列に後ほどコンジュゲートを結合させて活性化させ、市販の自動リーダーにより検出するかまたは読み取ることができる。
【０１８９】
大型のダイアフラムを用いて、混合物を「フラッフィング」（すなわち、静かな機械的撹拌による）し、核酸解析領域におけるより迅速な核酸ハイブリダイゼーションを促進することができる。
【０１９０】
標準的なベンチトップ手順では、スポットされた膜をプラスチックバッグおよびまたはチューブ内に配置し、次いで、これを温度制御された水浴中に入れて用いる。ベンチトップ手順を補完するためにいくつかのデバイスが作製されており、これらのデバイスでは、ゴム製ガスケット付きの金属、プラスチック、またはガラス製大型マニホールドを用いて、膜を介する流動を供給している。これらの設計では、シーリングクッションまたはガスケットを有する固体支持体を用いる。有孔の金属プレートもまた、構造を支持し、流体にブロット膜を自由に流過させるのに用いられている。
【０１９１】
Ｉｍｍｕｎｅｔｉｃｓ社製のＭｉｎｉＳｌｏｔ（登録商標）＆ Ｍｉｎｉｂｌｏｔｔｅｒ（登録商標）システムは、並行するマイクロチャネルと、これを支持する底部プレートとの間で膜を挟み込む「シーリングクッション」を用いる。特定の実施形態において、Ｉｍｍｕｎｅｔｉｃｓ社製システムなど、当技術分野で知られる２つのシステムを用いて、互いに垂直であり、このため、グリッド様パターンを創出する、２つの流動方向を創出することができる。
【０１９２】
ＲＤＢ流動の設計は、小領域内におけるスポットアレイ用に設計することができる（図４０〜４１）。膜の下方には、多孔性の固体支持体を用いることができる。膜は、リザーバーの周囲だけに接着され、これにより、膜を介する流体の流動に対する干渉が回避される一方、また、膜の周囲を介する流体の流動も防止される。ＲＤＢリザーバーへと／から流体を送出するのに用いられる弁は大型で、圧力の急激な変化を受ける。大量の流体の流動は、面取り層により均一に分配され、多孔性の固体支持体により媒介される。多孔性の固体支持体は、流体に膜をゆっくりと流過させるだけでなく、膜を介して流動を均一に分配するのにも用いられる（図４０）。膜はリザーバーの周囲に固定される（図４１）。面取り層を小孔で置き換えることもできるが、この代替法は、小孔のサイズおよび位置に基づく最適化を必要とする。面取り貫通孔により、圧力が膜全体に均一に分配され、ほとんど〜まったく最適化を必要としない。多孔性の固体支持体はまた、送出および「フラッフィング」時における膜の大きなたわみも防止する。膜を介する流体の流動により、固定化されたオリゴヌクレオチドと、溶液中の標的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションが増大する。流動は、ハイブリダイゼーション工程を通じて拡散に制約されず、このため、ハイブリダイゼーション反応は迅速に進行する。
【０１９３】
５．５ マイクロ流体デバイスのさらなる構成要素および配置
マイクロ流体デバイスは、マイクロ流体デバイスの内部または外部に位置し、マイクロ流体デバイスまたはマイクロ流体デバイス上の特定の領域に作動的に連結される差圧送達システム、例えば、コントローラをさらに含みうる。一実施形態では、ＵＳ２００７／０１６６１９９Ａ１（参照により本明細書に組込まれるＺｈｏｕら、２００８年７月１９日）において開示されるコントローラを用いることができる。該コントローラは、一方が陽圧であり、他方が陰圧である、２つの圧力供給源を装備しうる。弁をシールするのに陽圧を用いうる一方、ダイアフラムを開くのには陰圧を用いうる。該配置により、ポンプ内における流体圧が弁よりも高圧とならず、弁による漏れが防止される。一態様において、コントローラ上におけるソレノイドマニホールドは、３つの圧力容器を含有しうる。この配置により、ソレノイド間における「クロストーク」を防止し、弁に供給される圧力が、近接する制御ソレノイドの変化に関わらず不変を保つ状態がもたらされる。
【０１９４】
コントローラは、例えば、複数の開口部を有する空気圧マニホールドと、開口部の各々からマイクロ流体デバイス（「チップ」）内における複数の圧力作動膜（ダイアフラム）へと空気圧信号を送るためのチャネルがその中に配置された、チップマニホールドとを含みうる（米国特許公開第ＵＳ２００７／０１６６１９９Ａ１号（Ｚｈｏｕら、２００８年７月１９日）を参照されたい）。チップ駆動マニホールド内のチャネルは、マイクロ流体チップ内における複数の圧力作動膜の構成に符合する空気圧信号を送ることが可能である。空気圧信号をマイクロ流体チップ内における少なくとも１つの信号回路に送り、該信号回路に連結された少なくとも１つのセンサーを作動させることができる。チップ駆動マニホールドは、空気圧マニホールドの単一の開口部から、マイクロ流体チップ内における複数の圧力作動膜へと空気圧信号を送るための、少なくとも１つのチャネルまたは一連のチャネルを含みうる。（１つまたは複数の）チャネルにより、該開口部からの空気圧信号が、単一のチャネルから分枝するチャネルネットワークへと送られる。単一のチャネルから分枝するチャネルネットワークにより、空気圧信号が、複数の圧力作動膜の各々へと送られる。
【０１９５】
他の実施形態において、マイクロ流体デバイスは、コントローラのマニホールド上に配置される、真空、圧力、電気、および光の入力／出力のための連結手段を含みうる。このような連結手段は、当技術分野でよく知られている。
【０１９６】
一実施形態において、通気口を備えたカバープレートを、試薬リザーバーの上部に固定的に配置することで、環境からの潜在的な汚染を防止することができる。
【０１９７】
本明細書に記載の実施形態によれば、自動的な試料の調製／精製および増幅を可能とする構造および工程が、単一のマイクロ流体デバイスプラットフォーム上に統合される。手作業による投入は不要である。
【０１９８】
５．６ 差圧送達供給源およびマイクロ流体デバイス上における流体の送出
マイクロ流体デバイスは、機械通気ポンプまたは一連の通気ポンプなどの差圧送達供給源を含む場合もあり、これに連結される場合もある。
【０１９９】
広範に異なる溶液（すなわち、一実施形態における粘稠性または非粘稠性の溶液を送出する際の問題を克服するため、シリカ膜など、特定のマイクロ流体エレメントの「上流」または「下流」にポンプを配置し、いずれのポンプもこのようなマイクロ流体エレメントを介して最良の形で流体を送出するように作動させることができる。これらの各々をマイクロ流体デバイス上で一体に統合することで、同じ膜を介して粘稠性および非粘稠性の流体を送出する可変圧力を供給することができる。別個の通気ポンプもまた、核酸増幅領域への核酸の溶出前に膜を乾燥させるのに十分な気流を供給しうる。
【０２００】
オンチップのポンプは、二段式ポンプを創出しうる。一実施形態において、高粘稠度の流体には膜の下流にあるポンプを用い、膜を介してこれを吸引することができ、低粘稠度の流体には膜の上流にあるポンプを用い、膜を介してこれを押出すことができる一方、乾燥工程では、別個の通気ポンプを用い、開いた弁および膜を介して空気を持続的に吸引することができる。オンチップのポンプはまた、生物学的試料および洗浄緩衝液／試薬を別個の場所（例えば、マイクロ流体デバイス上の廃棄物リザーバー）に送出するのにも用いることができ、膜を通気乾燥する際、通気ポンプが試料または試薬を引き込まないように弁を閉じることができる。これは、生物学的に感受性の試料に対する重要な考慮点でありうる。
【０２０１】
５．７ オンチップにおける流体の混合
２種以上の個別の流体を迅速に混合する能力は、流体システムの共通の特徴である。一実施形態において、マイクロ流体デバイスは、試薬リザーバー下方のダイアフラムが流体を下方へと引き下ろし、次いで、ノズルを介して流体を上方へと押し上げることでこのようなリザーバーの底部からパルスジェットを発生させ、該リザーバー内で流体を混合するのに用いうる、リザーバーの下方に作製される小型のノズル構造を含むことができる。これは、反応混合物の「フラッフィング」に用いることができる。このようなフラッフィングを用いて、例えば、試薬リザーバー内において、より大きな容量および異なる粘稠度の溶液を混合することができる。
【０２０２】
一実施形態において、フラッフィングは、マイクロ流体デバイス上のリザーバー下方の大型ダイアフラムを用い、リザーバー底部のノズルを介して流体を反転送出することで固有の混合流動パターンを提供することにより達成することができる。一実施形態では、ノズルおよびリザーバーにより創出される流動方式をミキサーとして用いることができる（図１７）。デバイス上にはダイアフラムが装備される。このダイアフラムには、流動チャネルおよび貫通ポートが取り付けられる。貫通孔の上部には、リザーバーが装備される。ダイアフラムが作動し、リザーバーが十分に満たされているときは、流体のジェットがリザーバー内に含有される流体を上方へと貫通する。ダイアフラムが格納されているときは、流体が該ポートを介してリザーバーから下方へと吸引される。次いで、ダイアフラムが反転されるときは、流体ジェットがリザーバー内へと大量に流入するものの、その後の逆流により流体はリザーバー底部から引き戻される。これにより、混合の有効な手段が与えられる。
【０２０３】
５．８ 多重ヒーターの条件付き同期化
１つの測定器を用いるコンポーネントサブシステムを共有する多重マイクロ流体デバイスを作動させるために、多重ヒーターを用いることができる。そのすべてがコンポーネントサブシステムを共有する多重マイクロ流体デバイスを作動させる場合、すべてのデバイスが同時にサイクリングを終了することが望ましい。これを実行するためには、熱サイクリングを同期させなければならない。一実施形態において、これは、温度設定点をセンサーからの温度測定値と比較する制御ソフトウェアにおける条件付き論理文を用いて達成することができる。
【０２０４】
各ヒーターは、他のヒーターと同じである場合もあり、同じでない場合もある、特定の温度に設定することができる。次いで、使用者は、所望の条件が満たされるまでは制御ソフトウェアにループを実行させる条件文を容易に作成することができる。このループは、単純な時間の遅延、またはヒーター温度が設定点まで移動する間に実行すべき他のコマンドを含有しうる。該条件が満たされると、プログラムが続行され、次のコマンドが実行される。
【０２０５】
５．９ マイクロ流体デバイスへの対流熱伝導
本発明のマイクロ流体システムの特定の実施形態において、デバイスは、取り外し可能であり、ディスポーザブルである。これらの実施形態では、加熱エレメントがデバイスに直接には接触しない加熱システムを用いることができる。これにより、デバイス／マニホールド間の接触面が簡素化される。デバイスから加熱エレメントが除去される場合も、やはり、必要とされる領域に熱を伝導させなければならない。強制対流を用いることにより、加工されたチャネルまたはチューブを介して、オフチップのヒーターからデバイスの所与の領域へと熱を伝導させることができる。ヒーターおよび該接触面の両方に対する設計上の制約が簡素化される。
【０２０６】
抵抗エレメントをチューブ内に配置し、流体にこのチューブ内を流動させることにより、流体を加熱することができる。温度感知エレメントを流体蒸気中に配置することで、温度を測定し、この値を制御システムにフィードバックする。次いで、チャネルおよびポートを介して、加熱された流体を、加熱を要するデバイスの領域へと送ることができる。
【０２０７】
５．１０ 誘導加熱
本発明の別の実施形態では、デバイス上における加熱操作（例えば、ＰＣＲ熱サイクリングまたはＲＤＢ）に、誘導ヒーターを用いることができる。この適用における誘導ヒーターの大きな利点は、加熱の局在化、熱伝導の効率、およびマイクロ流体デバイスへの直接の接続の欠如（すなわち、マイクロ流体デバイスへの電気的接触が不要である）である。
【０２０８】
５．１１ 空気圧冷却
ＮＡ増幅反応時において、熱サイクリングに用いられるヒーターは迅速に冷却されなければならない。冷却は、当技術分野で知られる任意の対流冷却エレメントまたは空気圧冷却エレメントにより達成することができる。例えば、小型の通気ポンプ出力からのチューブを用いて、ヒーターを冷却することができる。ＰＣＲ操作温度は５０〜１００℃なので、空気圧冷却は、２５℃の室温で作用する。加熱エレメントと、ヒーターと接触する空気との間の温度差が大きいほど、該エレメントは迅速に冷却される。ヒートシンクまたは熱電式冷却器をシステムに接続することにより、その効果を増大させることができる。
【０２０９】
５．１２ 核酸
特定の実施形態において、本発明は、対象の核酸分子（本明細書ではまた、「対象核酸」、「標的核酸」、「標的ポリヌクレオチド」とも称する）を増幅および／または単離する方法を提供する。単離核酸分子（または「単離核酸」）とは、該核酸分子の天然の供給源に存在する他の核酸分子から分離された核酸分子（または「核酸」）である。「単離」核酸は、該核酸がそこに由来する生物のゲノムＤＮＡ内において、該核酸に天然の形で隣接する核酸配列（すなわち、該核酸の５’端および３’端に位置する配列）（例えば、タンパク質をコードする配列）を含有しない。他の実施形態において、単離核酸は、イントロン配列を含有しない。
【０２１０】
「対象核酸」、「標的核酸」、「標的ポリヌクレオチド」とは、特定の対象ポリヌクレオチド配列の分子を指す。本発明の方法により解析しうる対象核酸は、ゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、およびオリゴヌクレオチド、発現配列タグ（「ＥＳＴ」）、配列タグ部位（「ＳＴＳ」）などを含むこれらのフラグメントなどのＤＮＡ分子を含むがこれらに限定されない。本発明の方法により解析しうる対象核酸はまた、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）分子、ｃＲＮＡ（すなわち、ｉｎ ｖｉｖｏで転写される、ｃＤＮＡ分子から調製されるＲＮＡ分子）などであるがこれらに決して限定されないＲＮＡ分子も含む。各種の実施形態において、単離核酸分子は、該核酸がそこに由来する細胞のゲノムＤＮＡ内において、該核酸分子に天然の形で隣接する核酸配列の約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、または０．１ｋｂ未満を含有しうる。さらに、ｃＤＮＡ分子などの単離核酸分子は、他の細胞物質、組換え法により作製される場合の培地、または化学的に合成される場合の化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含有しないことが可能である。
【０２１１】
対象核酸は、ＤＮＡもしくはＲＮＡまたはそのキメラ混合物もしくは誘導体もしくは修飾形でありうる。核酸は、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格において修飾可能であり、他の付属の基または標識を含みうる。
【０２１２】
例えば、一部の実施形態において、核酸は、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルキュエオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルキュエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、キュエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンを含むがこれらに限定されない群から選択される、少なくとも１つの修飾塩基部分を含みうる。
【０２１３】
別の実施形態において、核酸は、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロース、およびヘキソースを含むがこれらに限定されない群から選択される、少なくとも１つの修飾糖部分を含みうる。
【０２１４】
さらに別の実施形態において、核酸は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミドチオエート、ホスホルアミデート、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、およびホルムアセタール、またはこれらの類似体を含むがこれらに限定されない群から選択される、少なくとも１つの修飾リン酸骨格を含みうる。
【０２１５】
プライマー、プローブ、または鋳型として用いられる核酸は、市販品を購入することもでき、当技術分野で知られる標準的な方法により、例えば、自動ＤＮＡ合成器（カリフォルニア州、ナバト、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社；カリフォルニア州、フォスターシティー、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から市販される合成器など）および標準的なホスホルアミド化学反応の使用によるか、または非特異的な核酸切断用の化学物質もしくは酵素または部位特異的な制限エンドヌクレアーゼを用いるより大型の核酸フラグメントの切断により誘導することもできる。
【０２１６】
１つの動物種に由来する対象核酸の配列が知られ、別の動物種に由来する対応の遺伝子が所望される場合、当技術分野では、既知の配列に基づいてプローブを設計することが日常的である。該プローブは、それに由来する配列が所望される動物種に由来する核酸にハイブリダイズし、これは、例えば、対象動物種に由来するゲノムライブラリーまたはＤＮＡライブラリーに由来する核酸に対するハイブリダイゼーションである。
【０２１７】
一実施形態では、増幅されて単離された対象核酸と相補的であるか、または中程度に厳密な条件下でこれとハイブリダイズ可能な核酸分子が、プローブとして用いられる。
【０２１８】
別の実施形態では、増幅された対象核酸と中程度に厳密な条件下でハイブリダイズするか、またはこれと少なくとも９５％相補的な核酸分子が、プローブとして用いられる。
【０２１９】
別の実施形態では、対象のヌクレオチド配列またはその相補体と少なくとも４５％（または５５％、６５％、７５％、８５％、９５％、９８％、もしくは９９％）同一な核酸分子が、プローブとして用いられる。
【０２２０】
別の実施形態では、対象核酸またはその相補体のうち、少なくとも２５（５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、８００、９００、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、２０００、２４００、２６００、２８００、３０００、３２００、３４００、３６００、３８００、または４０００）ヌクレオチドのフラグメントを含む核酸分子が、プローブとして用いられる。
【０２２１】
別の実施形態では、対象のヌクレオチド配列を有する増幅された核酸分子またはその相補体と中程度に厳密な条件下でハイブリダイズする核酸分子が、プローブとして用いられる。他の実施形態では、少なくとも２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、８００、９００、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、２０００、２２００、２４００、２６００、２８００、３０００、３２００、３４００、３６００、３８００、または４０００ヌクレオチドの長さでありえ、対象の増幅された核酸分子またはその相補体と中程度に厳密な条件下でハイブリダイズしうる核酸分子が、プローブとして用いられる。
【０２２２】
増幅された対象核酸を検出するためのプローブ（または鋳型）として用いうる核酸は、当技術分野で知られる任意の方法により、例えば、プラスミドから、対象ヌクレオチド配列の３’端および５’とハイブリダイズ可能な合成プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、かつ／または該ヌクレオチド配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いるｃＤＮＡライブラリーもしくはゲノムライブラリーからクローニングすることにより得ることができる。ゲノムクローンは、適切なハイブリダイゼーション条件下、例えば、プローブされるゲノムＤＮＡに対するプローブの類縁性に応じて、高度に厳密な条件下、低度に厳密な条件下、または中程度に厳密な条件下において、ゲノムＤＮＡライブラリーをプローブすることにより同定することができる。例えば、対象のヌクレオチド配列に対するプローブとゲノムＤＮＡとが同じ動物種に由来する場合は高度に厳密なハイブリダイゼーション条件を用いることができるが、該プローブとゲノムＤＮＡとが異なる動物種に由来する場合は低度に厳密なハイブリダイゼーション条件を用いることができる。高度、低度、および中程度に厳密な条件は、当技術分野でよく知られている。
【０２２３】
増幅された対象核酸は、当技術分野で知られる標準的な方法を用いて、検出可能な形で標識することができる。
【０２２４】
検出可能な標識は、例えば、ヌクレオチド類似体の組込みによる蛍光標識でありうる。本発明での使用に適する他の標識は、ビオチン、イミノビオチン、抗原、補因子、ジニトロフェノール、リポ酸、オレフィン化合物、検出可能なポリペプチド、電子に富む分子、基質上における作用により検出可能なシグナルを発生させることが可能な酵素、および放射性同位体を含むがこれらに限定されない。好ましい放射性同位体は、少数を挙げれば、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃ、１５Ｎ、および１２５Ｉを含む。本発明に適する蛍光分子は、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、テキサスレッド、５’−カルボキシ−フルオレセイン（「ＦＭＡ」）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシ−フルオレセイン（「ＪＯＥ」）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシ−ローダミン（「ＴＡＭＲＡ」）、６’−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（「ＲＯＸ」）、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＩＲＤ４０、およびＩＲＤ４１を含むがこれらに限定されない。本発明に適する蛍光分子は、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、およびＦｌｕｏｒＸを含むがこれらに限定されないシアミン色素；ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ−６３０／６５０、およびＢＯＤＩＰＹ−６５０／６７０を含むがこれらに限定されないＢＯＤＩＰＹ色素；ならびにＡＬＥＸＡ−４８８、ＡＬＥＸＡ−５３２、ＡＬＥＸＡ−５４６、ＡＬＥＸＡ−５６８、およびＡＬＥＸＡ−５９４を含むがこれらに限定されないＡＬＥＸＡ色素のほか；当業者に知られる他の蛍光色素をさらに含む。本発明に適する、電子に富む指示分子は、アフェリチン、ヘモシアニン、および金コロイドを含むがこれらに限定されない。代替的に、増幅された対象核酸（標的ポリヌクレオチド）は、第１の基をそれに対して特異的に複合体化させることに標識することができる。指示分子に共有結合し、第１の基に対する親和性を有する第二の基を用いて、標的ポリヌクレオチドを間接的に検出することができる。このような実施形態において、第１の基としての使用に適する化合物は、ビオチンおよびイミノビオチンを含むがこれらに限定されない。
【０２２５】
１種または複数種のプローブと相補的な配列を有するポリヌクレオチド分子が該プローブにハイブリダイズする条件下で、本発明の方法により増幅および解析される（例えば、検出される）対象核酸を、該プローブに接触させることができる。本明細書で用いられる「プローブ」とは、該プローブに対する標的ポリヌクレオチド分子のハイブリダイゼーションが検出されるように、特定の配列（一般には、プローブ配列に相補的な配列）を有する対象の核酸分子がそれに対してハイブリダイズすることが可能な、特定の配列のポリヌクレオチド分子を指す。プローブのポリヌクレオチド配列は、例えば、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、またはＤＮＡおよびＲＮＡのコポリマー配列でありうる。例えば、プローブのポリヌクレオチド配列は、細胞から抽出されたゲノムＤＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列、ｍＲＮＡ配列、またはｃＲＮＡ配列の完全であるかまたは部分的な配列でありうる。プローブのポリヌクレオチド配列はまた、例えば、当業者に知られるオリゴヌクレオチド合成法によっても合成することができる。プローブ配列はまた、ｉｎ ｖｉｖｏで酵素的に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで酵素的に（例えば、ＰＣＲにより）、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで非酵素的に合成することもできる。
【０２２６】
本発明の方法において用いられるプローブは、該１種または複数種のプローブおよびこれらに結合するかまたはハイブリダイズした任意のポリヌクレオチド配列を除去することなく、該１種または複数種のプローブにハイブリダイズしないかまたは結合しないポリヌクレオチド配列を洗浄して除去することができるよう、固体の支持体または表面に固定化されることが好ましい。プローブを固体の支持体または表面に固定化する方法は、当技術分野でよく知られている。具体的な一実施形態において、プローブは、ガラス表面、またはナイロン膜もしくはニトロセルロース膜など、固体（または半固体）の支持体または表面に結合した、異なるポリヌクレオチド配列のアレイを含む。該アレイは、該支持体または表面上におけるその位置から特定のプローブの実体を決定しうるように、異なる各プローブが該支持体または表面上における既知の特定の位置に配置される、アドレス可能なアレイである。特定の実施形態では、第６．１０節に記載の方法を用いて、固体の支持体または表面に核酸プローブを固定化することができる。
【０２２７】
本発明で用いられるプローブは任意の種類のポリヌクレオチドを含みうるが、好ましい実施形態において、プローブは、オリゴヌクレオチド配列（すなわち、約４〜約２００塩基の長さであり、より好ましくは、約１５〜約１５０塩基の長さであるポリヌクレオチド配列）を含む。一実施形態では、約４〜約４０塩基の長さであり、より好ましくは、約１５〜約３０塩基の長さの、より短いオリゴヌクレオチド配列が用いられる。しかし、本発明のより好ましい実施形態では、約４０〜約８０塩基の長さの、より長いオリゴヌクレオチドプローブが用いられ、約５０〜約７０塩基の長さのオリゴヌクレオチド配列（例えば、約６０塩基の長さのオリゴヌクレオチド配列）が特に好ましい。
【０２２８】
５．１３ キット
さらなる態様において、本発明は、以下：コントローラ、視覚化装置もしくは検出装置、１種もしくは複数種の核酸プライマー、試料調合液、核酸増幅試薬および／または核酸検出試薬もしくは核酸解析試薬、緩衝液、ならびに洗浄剤、あるいはデバイスの使用説明書の１つまたは複数を伴う、本発明のマイクロ流体デバイスを、１つまたは複数の容器内において含みうる。容器内の試薬は、任意の形態、例えば、乾燥凍結形態、または溶液形態（例えば、蒸留水または緩衝液）などでありうる。キットは、本発明の方法に従い、対象分子の検出または測定に用いることができる。キットはまた、対象分子の作製または合成にも用いることができる。
【０２２９】
キットの一部としてまたはキットの付属品として、コントローラもまた提供することができる。コントローラは、アッセイごとのベースで購入される１つまたは複数のキットと共に用いるために、使用者により既に（前もって）購入されていることが典型的である。
【０２３０】
以下の実施例は、例示を目的として示されるものであり、限定を目的とするものではない。
【実施例１】
【０２３１】
６．実施例
６．１ ３つの機能領域を有するマイクロ流体デバイスの実施形態
本実施例では、試料調製領域、核酸増幅領域、および増幅産物アッセイを実行するための領域である核酸解析領域の３つの機能領域を有するマイクロ流体デバイス（「チップ」）の実施形態（図１〜７）、ならびに該デバイスを用いる例示的な方法について説明する。
【０２３２】
図２は、図１に記載のマイクロ流体デバイスの実施形態についての等尺分解図であり、弁配置図を示す。
【０２３３】
図３Ａは、図１に記載のマイクロ流体デバイスの実施形態についての上面図であり、試料調製領域（「核酸（ＮＡ）抽出領域」）、核酸増幅領域（この実施形態では、「ＰＣＲ領域」）、および核酸解析領域（「ＲＤＢ領域」）を示す。また、デバイス上における弁、マイクロ流体チャネル、貫通孔、および低密度ＤＮＡフィルターも示される。この実施形態では、核酸解析領域において、リバースドットブロット（ＲＤＢ）評価項目検出アッセイを実施することができる。「廃棄物」：廃棄物リザーバー。
【０２３４】
図３Ｂは、図１に記載のマイクロ流体デバイスの実施形態についての上面図であり、試料調製領域１０１、核酸増幅領域１０２（核酸増幅リアクター１１２を含む）、および核酸解析領域１０３、ならびにデバイス上における弁、マイクロ流体チャネル、および貫通孔を示す。解析領域リザーバー１１３。
【０２３５】
図４は、図１に記載のマイクロ流体デバイスの実施形態についての機能配置図であり、各種のリザーバーと関連する機能およびリザーバー（例えば、試薬）を示す。Ｗ１：洗浄緩衝液１。Ｗ２：洗浄緩衝液２。ＨＢ：ハイブリダイゼーション緩衝液。ＣＢ：コンジュゲーション緩衝液。Ｓｕｂ：基質緩衝液。
【０２３６】
図５〜７は、図１に記載のマイクロ流体デバイスの操作の進行を示す略図である。点線は、試料がデバイスにより処理されるときの試料の流動を示す。図５では、室温で５〜１０分間にわたり、Ｒ１〜Ｒ２において複数回送入送出することにより、細胞を緩衝液ＡＬおよびプロテイナーゼＫと混合する。Ｒ２〜Ｒ３において複数回送入送出することにより、Ｒ２の内容物をエタノールと混合する。混合された試料は、送出によりＲ３から核酸抽出媒体を介して廃棄物リザーバーへと移送される。ＡＷ１およびＡＷ２は、送出により核酸抽出媒体を介して廃棄物リザーバーへと移送される。核酸抽出媒体は、５〜１０分間にわたり通気ポンプを作動させ、核酸抽出媒体を介して送気または吸気することにより乾燥させる。
【０２３７】
図６では、核酸抽出媒体を介して溶出緩衝液をリザーバーＮＡ１へと送出することにより、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）をリザーバーＮＡ１へと溶出させる。Ｒ８およびＲ７からＲ９へと交互に送出することにより、増幅混合物を溶出された核酸と混合する。増幅混合物を核酸と共に熱サイクルリアクターへと送出し、そこで、核酸増幅反応を実施する。
【０２３８】
図７では、１５０μｌのハイブリダイゼーション緩衝液を核酸解析（例えば、リバースドットブロットまたはＲＤＢ）リザーバーへと送出する。５分間にわたりインキュベーションを実施する。９５℃で５分間にわたり、約８〜１０μｌの増幅産物を熱変性させる。増幅産物を核酸解析（ＲＤＢ）リザーバーへと送出する。弁３２の反復的な開／閉操作である「フラッフィング」により溶液を混合する。５分間にわたり溶液をインキュベートし、その内容物を空けて廃棄する。１５０μｌの緩衝液Ｗ２をリザーバーへと送出し、１．５分間にわたりインキュベートし、これを除去して廃棄することにより、２回にわたって膜を洗浄する。１５０μｌのコンジュゲーション緩衝液を核酸解析（ＲＤＢ）リザーバーへと送出する。弁３２の反復的な開／閉操作により溶液を混合する。３分間にわたり溶液をインキュベートし、該リザーバー内容物を廃棄物リザーバーへと空ける。１５０μｌの緩衝液Ｗ１を該リザーバーへと送出し、１分間にわたりインキュベートし、該緩衝液を除去して廃棄することにより、４〜５回にわたって膜を洗浄する。１００μｌの基質を該リザーバーへと送出し、５〜１０分間にわたりインキュベートし、該リザーバー内容物を廃棄物リザーバーへと空ける。１５０μｌの緩衝液Ｗ２をリザーバーへと送出し、１．５分間にわたりインキュベートし、該緩衝液を廃棄物リザーバーへと除去することにより、２回にわたって膜を洗浄する。
【実施例２】
【０２３９】
６．２ ２つの機能領域を有するマイクロ流体デバイスの実施形態
本実施例では、２つの機能領域を有するマイクロ流体デバイス（「チップ」）の別の実施形態（図８〜１１）、およびそれを用いる方法について説明する。
【０２４０】
図８は、試料調製領域および核酸増幅領域の２つの機能領域を有するマイクロ流体デバイスの別の実施形態を示す。矢印で示す通り、試料調製領域は、試料の投入および調製、試料の精製、ならびに核酸の抽出のためのリザーバーを含む。核酸増幅領域は、核酸増幅リアクター（「増幅チャンバー」）を含む。デバイスのこの実施形態はまた、核酸増幅の完了後においてマイクロ流体デバイスから単位複製配列が抽出される領域である、核酸増幅産物抽出領域（「増幅産物抽出領域」）も含む。デバイスのこの具体的な実施形態は、５０×３８ｍｍの寸法を有する。
【０２４１】
図９は、図８に記載のマイクロ流体デバイスの等尺分解図であり、その３つの層（明確さを目的として、デバイスは、膜なしで示されている）を示す。
【０２４２】
図１０は、図８に記載のマイクロ流体デバイスの上面図であり、デバイスのリザーバー、チャネル、弁、およびポンプの配置図を示す。
【０２４３】
図１１は、図８に記載のマイクロ流体デバイスの別の上面図であり、デバイスのポンプ、弁、およびチャネルの配置図を示す。
【０２４４】
マイクロ流体デバイスのこの実施形態において、リザーバーは、以下（図１１）：
「細胞」：懸濁細胞およびプロテイナーゼＫ
「ミキサー」：緩衝液ＡＬ
「エタノール」：エタノール
「ＡＷ１」：洗浄緩衝液ＡＷ１
「ＡＷ２」：洗浄緩衝液ＡＷ２
「溶出」：溶出緩衝液ＡＥ
「ＮＡ１」：核酸リザーバー１
「ＮＡ２」：核酸リザーバー２
「増幅マスター混合物」：増幅試薬リザーバー
「単位複製配列流出１」：増幅流出リザーバー１
「単位複製配列流出２」：増幅流出リザーバー２
「増幅リアクター」
の通りである。
【０２４５】
図１１に記載のマイクロ流体デバイスの実施形態の操作時における試料調製の進行例は以下：
１．１０〜１５分間にわたる、循環による細胞溶解
２．エタノールとの混合
３．細胞溶解液をＳｉ膜へと移送する／廃棄する
４．ＡＷ１およびＡＷ２をＳｉ膜へと移送する／廃棄する
５．５〜１０分間にわたり真空ポンプを作動させ、乾燥させる
６．溶出１および２
７．ＰＣＲマスターとの混合
８．ＰＣＲリアクターの充填
９．ＰＣＲ反応
１０．ＰＣＲ産物の放出
の通りである。
【実施例３】
【０２４６】
６．３ ２つの機能領域を有するマイクロ流体デバイスの実施形態
本実施例では、試料調製領域および核酸増幅領域の２つの機能領域を有するが、オンチップの核酸解析領域は有さないマイクロ流体デバイス（「チップ」）の別の実施形態（図１２〜１６）について説明する。
【０２４７】
デバイスは、５０×３８ｍｍの本体寸法を有し、米国特許出願第２００６／００７８４７０Ａ１号に記載の弱溶剤接着法により接着された３つのサンドイッチ層を含む。デバイスは、デバイスの上面に配置され、各弁および流体チャネルネットワークと流体連結される、複数のリザーバーをさらに含む。デバイスはまた、機能的な流体ネットワークの一部を形成する核酸増幅リアクターも含む。
【０２４８】
図１３は、図１２に示すマイクロ流体デバイスの実施形態の配置を示し、二方向ポンプの３つの群：試料調製用ポンプ、ＰＣＲ試薬調製用ポンプ、および充填用ポンプを図示する。流体は、同じポンプダイアフラムを共有するリザーバー間で移送されうる。核酸増幅領域に隣接する、円で囲われた「２」および「３」のリザーバー群は、該増幅領域と流体的に相互連結されたリザーバー群である。円で囲われた「１」のリザーバー群は、試料調製領域内のリザーバーである。この実施形態によれば、３群のポンプが存在する。流体は、同じポンプダイアフラムを共有するリザーバー間で移送されうる。この実施形態では、第１群におけるポンプのうちの７つ、第２群におけるポンプのうちの３つ、および第３群におけるポンプのうちの２つが用いられる。この実施形態において、ポンプは二方向である。複数の供給源リザーバーを１つの目的リザーバーに組み合わせて、より良好な混合効果を同時にもたらすことができる。
【０２４９】
この実施形態に基づく方法の一例（図１４）では、リザーバーＲ１内において室温で５〜１０分間にわたり、細胞溶解緩衝液およびプロテイナーゼＫと共に細胞をインキュベートする。Ｒ１およびＲ２をＲ３へと交互に送出することにより、細胞溶解混合物を、リザーバーＲ２からのＥｔＯＨ／ＤＮＡ結合緩衝液と混合する。混合された試料を、リザーバーＲ３からフィルターリザーバーへと移送し、該溶液を、該リザーバーの底部に位置する精製膜（例えば、シリカ膜）を介して吸引する。
【０２５０】
フィルターと結合したＤＮＡを洗浄緩衝液１により洗浄し、廃棄物を廃棄物リザーバーへと移送する（図１５）。次いで、結合したＤＮＡを洗浄緩衝液２により洗浄し、廃棄物を廃棄物リザーバーへと移送する。数分間にわたり通気ポンプを作動させて、膜を乾燥させる。溶出緩衝液をフィルターリザーバーへと送出し、インキュベートし、核酸リザーバーＮＡ１へと溶出させる。この段階で、一部のＤＮＡをベンチトップでの実行用にアリコートすることができ、残りはオンチップでの実行用に用いる。
【０２５１】
ＤＮＡ鋳型を「ＮＡ１」から「核酸増幅混合物」へと移送し、混合する（図１６）。ＤＮＡ鋳型と共に核酸増幅マスター混合物をリアクターへと吸引し、そこで、熱サイクリングプロトコールを実施する。核酸増幅産物を該産物リザーバーへと送出する。この段階で、一部のＤＮＡをベンチトップでの実行用にアリコートすることができ、残りはオンチップでの実行用に用いる。
【実施例４】
【０２５２】
６．４ マイクロ流体デバイスを用いる全ＲＮＡの増幅
この実施例では、図８〜１１に示すマイクロ流体デバイスの実施形態を用いて、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞から生成される全ＲＮＡの増幅結果を説明する。全ＲＮＡは、以下のプロトコールを用いてオンチップで調製し、ゲル電気泳動により解析した：
【０２５３】
０．１Ｎ ＮａＯＨをチップの全チャンバー内に通し、複数回反復した。
【０２５４】
水を全チャンバー内に送出することにより、多量の水でチップをすすぎ、通気乾燥させ、カラムを組み立てた。
【０２５５】
日常的な方法を用いて試験管２本分のＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を融解させ、遠心分離し、上清を除去した。
【０２５６】
６００μｌのＲＬＴ／Ｂｍｅ（２０μｌ Ｂｍｅを伴う２．０ｍｌ ＲＬＴ調製液）を各ペレットに添加し、再懸濁させ、ペレットを混合した。
【０２５７】
標準的な方法を用いて、再懸濁したペレットをＱｕｉａｓｈｒｅｄｄｅｒカラム（２連による実行）内に通すことによりこれをホモジナイズした。
【０２５８】
ＲＬＴ−Ｂｍｅにより容量を１．５ｍｌまで上昇させ、５ｍｌの培養試験管に移した。
【０２５９】
該試験管に１．５ｍｌの７０％ＥｔＯＨを添加し、反転させることにより混合した。
【０２６０】
２００μｌずつの３アリコートを取り出し、個別の試験管に入れた。
【０２６１】
これらの試験管に、５００μｌの１：１ ＲＬＴ／Ｂｍｅ：７０％ＥｔＯＨを添加し、よく混合した。これらの試験管は、図１３の試料１〜３に対応する（Ｑｉａｇｅｎ対照）。
【０２６２】
試料１〜３および１０のための標準的なオフチップカラムプロトコール（Ｑｕｉａｇｅｎ社製ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット、型番７４１０７）に従った。ＲＮＡを３０μｌの水中に溶出させた（あらかじめの加熱なし）。
【０２６３】
試料１〜３で用いられなかった元の試料の残りの容量のうち２００μｌを、ピペッティングにより個別のオンチップ試料注入カラムに直接投入し、ポンプを用いてカラム中に吸引し廃棄した。残りの試料容量を試料１〜３と共にオフチップで処理し、試料１０（Ｑｉａｇｅｎ対照）と名付けた。
【０２６４】
２２μｌずつのＲＷ１により２回にわたり、オンチップのカラムを洗浄した。
【０２６５】
２２μｌずつのＲＰＥにより４回にわたり、オンチップのカラムを洗浄した。
【０２６６】
約２０分間にわたり、カラムを乾燥させた。
【０２６７】
カラムの乾燥後、３０μｌの室温水をチップ試料４〜６に添加（カラムに直接ピペッティングすることにより）し、１０分間にわたり試料をインキュベートした。オンチップの送出を用いて、純粋なＲＮＡを回収した。
【０２６８】
３０μｌの加熱水をチップ試料７〜９に添加（カラムに直接ピペッティングすることにより）し、１０分間にわたり試料をインキュベートした。オンチップの送出を用いて、純粋なＲＮＡを回収した。
【０２６９】
送出時において、別の１０μｌ室温水を各カラムに添加した。
【０２７０】
純粋なＲＮＡを１．５ｍｌの試験管に移し、これにチップからの喪失容量に当たる、別の２０μｌの水を添加した。
【０２７１】
２６０〜２８０ｎｍ；全２００μｌの水のうち５μｌ（４０倍の希釈率）における吸光度を読み取った。
【０２７２】
標準的なアガロースゲル電気泳動；１％アガロース／ＴＡＥゲル；１００ボルト、３０分間を用いることにより、５μｌの各試料を解析した。
【０２７３】
図１８で見られる通り、オンチップのＲＮＡ調製により、標準的なＱｕｉａｇｅｎ法（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット、型番７４１０７）と比較して同等の量／質のＲＮＡがもたらされた。また、この実験により、オンチップによる核酸調製時において高粘稠度の材料を扱う際、オンチップのダイアフラムポンプが円滑に作動することも確認された。
【０２７４】
図１９は、図８〜１１に示されるマイクロ流体デバイス（「チップ」）上で実行されたＲＴ−ＰＣＲ増幅の結果を示す。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲを、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑシステムと共に、核酸増幅領域内で実行されるＰＣＲに用いた。上記で説明される通り、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞から生成される全ＲＮＡをオンチップで調製し、鋳型ＲＮＡに用いた。β−アクチンを認識するプライマーを用いてｃＤＮＡを作製し、ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によりアクチンｃＤＮＡを増幅した。順方向プライマーは、ＡＣＧ ＴＴＧ ＣＴＡ ＴＣＣ ＡＧＧ ＣＴＧ ＴＧＣ ＴＡＴ［配列番号１］（エクソン３内に存在する）であった。逆方向プライマーは、ＡＣＴ ＣＣＴ ＧＣＴ ＴＧＣ ＴＧＡ ＴＣＣ ＡＣＡ ＴＣＴ［配列番号２］（エクソン５内に存在する）であった。予測された産物、すなわち６８７コピーのｃＤＮＡ単位複製配列が得られた。
【０２７５】
ＲＮＡは、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞から作製した。ベータ−アクチンを認識するプライマーを用いてｃＤＮＡ産物を作製し、ＰＣＲによりアクチンのｃＤＮＡを増幅した（図１９）。レーン１：ＤＮＡ標準物質；レーン２：オンチップで実行されたＲＴ−ＰＣＲからの単位複製配列産物；レーン３：投入ＲＮＡ（１μｌ）。
【０２７６】
図２０は、示される通り、熱サイクルおよび試行時間を変化させる場合における、８回のＰＣＲ試行に対するオンチップでの再現性を示す。
【０２７７】
図２１は、マイクロ流体デバイスと従来のベンチトップでのＰＣＲプラットフォームとの間における結果の比較を示す。３０回に及ぶ熱サイクルにおける５０００プラスミドコピーの場合、ベンチトップ試行の場合の１．７５時間と比較して、１時間でオンチップの結果が得られた。
【０２７８】
図２２は、この実験において、マイクロ流体デバイスと連結して用いられたＰＣＲ熱サイクラーによる典型的なサイクルを示す。下図のグラフは、上図のグラフ内で示される最初の４サイクルのうちの複数の拡大図である。
【０２７９】
図２３は、マイクロ流体デバイス上で実行されるＲＴ−ＰＣＲプロトコールの結果を示す。略述すると、以下のベンチトップ（ｂｔ）プロトコールおよびオンチッププロトコールを用いて、ＨＩＶ ＲＮＡを単離した。ベンチトップおよびオンチップのＲＮＡ単離には、２０，０００コピー（Ｂｔ１）および２，５００コピー（Ｂｔ２）のＡｒｍｏｒｅｄ ＲＮＡを用いた。ベンチトップでの溶出量は５０μｌであった；理論的な１００％収率はＲＮＡ４００コピー／μｌである。オンチップでの溶出量は２０μｌであった；理論的な１００％収率はＲＮＡ１２５コピー／μｌである。ＲＴ−ＰＣＲには、１ｍｌの溶出量を用いた。
【０２８０】
逆転写物を用いて、５０℃で３０分間の後、９５℃で１５分間にわたり、当技術分野で知られる標準的なＲＴ−ＰＣＲプロトコールを実行し、次いで、９５℃における４５秒間、次いで、５８℃で４５秒間、および７２℃で６０秒間を用いる４０サイクルにわたりＰＣＲプロトコールを実行した。単離収率は、ＲＴ−ＰＣＲ後におけるゲル画像から推測した。
【０２８１】
図２３に示す通り、オンチップでの試行から得られたＲＮＡにより、Ｑｕｉａｇｅｎ ＲＮＡＥａｓｙキットを用いる同一の実験条件下においてベンチトップで実施された同じプロトコールの場合と少なくとも同等量のＲＮＡがもたらされた。レーン１：分子量の標準物質。レーン２：Ｂｔ１−ＲＮＡ。レーン３：Ｂｔ２−ＲＮＡ。レーン４：チップ−ＲＮＡ。
【実施例５】
【０２８２】
６．５ マイクロ流体デバイスを用いてＰＣＲ産物を検出する方法
以下のデータは、使用者がマイクロ流体デバイスを用いて、実質的に介入することなく、迅速かつ容易にＰＣＲを実施しうることを示す。細胞の溶解、ＤＮＡまたはＲＮＡの抽出および精製、ならびに核酸に対するＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲを含むすべての必要なステップを、単一のマイクロ流体デバイスシステム上で達成することができる。さらに、ＰＣＲによる単位複製配列の変性、およびリバースドットブロット（ＲＤＢ）解析による、オリゴヌクレオチドプローブのアレイ上におけるハイブリダイゼーションを介するＰＣＲ産物の検出が可能なシステムもまた設計されている。
【０２８３】
本実施例で用いられるマイクロ流体デバイスの実施形態は、２つの機能領域を有した。実際には図８〜１１に示す実施形態を用いたが、図１２〜１６に示すマイクロ流体デバイスもまた用いることが可能であった。マイクロ流体デバイスは、特許権のある工程により組み立てられて積層されると、ポンプ、弁、マイクロ流体チャネル、試薬リザーバー、ＤＮＡ／ＲＮＡ抽出／精製部材、および熱サイクリング能力を創出する、廉価なポリスチレンベースの３層型積層システムを有した。加えて、該システムの設計は、細胞溶解など特定のアッセイステップに極めて有用な流体の二方向流動を可能とする。最後に、マイクロ流体デバイスとコントローラとの間において流体の接触は存在せず、したがって、汚染の可能性が低減される。
【０２８４】
各種のマイクロチャネル、ポンプ、および弁の構成は容易に変更可能であり、マイクロ流体デバイスのフォーマットは、広範囲の検体の解析を可能とするのに十分な多目的フォーマットである。図１２〜１６に示す実施形態（図８〜１１における実施形態もまた用いうるが）を参照して略述すると、試料は、マイクロ流体デバイスシステム上における核酸増幅解析を受けながら、以下のステップ全体を進行する（図１４〜１６）。
１．生の臨床試料を、細胞溶解緩衝液およびプロテイナーゼＫを含有するリザーバーＲ１に導入する。
２．Ｒ１およびＲ３をリザーバーＲ２へと交互に送出することにより、Ｒ１の内容物を、リザーバーＲ３内に含有されるエタノールおよび核酸結合緩衝液と混合させる。
３．混合された試料（ここではＲ２内）をフィルターリザーバー（「フィルターＲｅｓ」）へと移送し、該リザーバーの底部に位置するシリカ膜を介して吸引し、抽出された核酸をシリカへと結合させる。
４．シリカに結合した核酸を、「Ｗ１」内に含有される緩衝液により洗浄し、廃棄物を廃棄物リザーバーへと移送する。
５．シリカに結合した核酸を、「Ｗ２」内に含有される緩衝液により洗浄し、廃棄物を廃棄物リザーバーへと移送する。
６．通気ポンプを作動させて、シリカ膜を乾燥させる。
７．溶出緩衝液（リザーバーＥｌｕからの）をフィルターリザーバーへと送出し、インキュベート後、２５μＬの精製核酸を、リザーバーＮＡ１へと溶出させる。
８．「ＮＡ１」からの精製核酸を核酸増幅混合物リザーバーへと移送し、１：９の比で鋳型を核酸増幅試薬と混合する（すなわち、プライマー対および他のすべての核酸増幅反応成分）。
９．核酸増幅マスター混合物および核酸鋳型を核酸増幅リアクターへと吸引する。
１０．核酸増幅リアクター内において核酸増幅熱サイクリングを実行する。
１１．最終核酸増幅産物を該産物リザーバー（「ＰＣＲ Ｐｒｏｄ」）へと送出する。
【０２８５】
ＲＮＡの単離および精製
マイクロ流体デバイスにより、「ベンチトップ」法と同様の形で効率的にＲＮＡを抽出および精製しうるかどうかを判定するため、いずれもＱｕｉａｇｅｎ社によるＲＮｅａｓｙプロトコールを用いる、マイクロ流体デバイスおよびベンチトップ法を共に用いて、等量（５００，０００個）の細胞を抽出にかけることにより、ヒト胚腎細胞（ＨＥＫ ２９３−Ｔ細胞）からＲＮＡを単離した。２つのプロトコール各々の複数回の反復に対するアガロースゲル電気泳動により、マイクロ流体デバイスが、「ベンチトップ」法と同等に機能したことが示される（図１８）。
【０２８６】
ベンチトップの熱サイクラーおよびマイクロ流体デバイスシステムを用いるＰＣＲの比較
マイクロ流体デバイス上において有効な熱サイクリングを達成しうることを示すため、ＢｉｏＲａｄ ＭＪ Ｍｉｎｉ熱サイクラーまたはマイクロ流体デバイス内でコントローラ上に搭載されて用いられた熱サイクラーを用いる３０サイクルにより、５×１０３コピーのプラスミド（ｐｒｌｐＧＬ３）を増幅した。アガロースゲル電気泳動により見られる通り、いずれの場合においても適切な単位複製配列が得られたことは、マイクロ流体デバイスシステムにより、実質的に「手」作業を必要とすることなく、適正な単位複製配列を作製することが可能であったことを示す（図２１）。
【０２８７】
マイクロ流体デバイスシステムの使用によるβ−サラセミアおよびＨＰＶの検出
マイクロ流体デバイスによる熱サイクリングと並んで、核酸の抽出および精製の全般的条件が整備されると、生試料導入時における特定の遺伝子標的の検出が達成される。特定の原型的なマイクロ流体デバイスを構成して、どのくらい迅速に対象標的を検出しうるかを示すため、ＰＣＲ解析により特定の対象標的を検出するのに生物学実験室で既に開発された、ベンチトッププロトコールを実施するマイクロ流体デバイスを開発した。マイクロ流体デバイスの重大な最適化なしに、当技術分野で知られる標準的なアッセイ条件およびプロトコールを用いて、必要とされるすべての調製ステップおよび解析ステップ（すなわち、細胞溶解、核酸抽出／精製、およびＰＣＲ増幅）を実施するシステム。
【０２８８】
この手法を用いて、各種の異なる臨床検体を解析した。例として述べると、マイクロ流体デバイスにヒト全血液（５０μＬ）を導入し、試料リザーバーと溶解緩衝液リザーバーとの間における二方向流動により細胞を溶解させた。マイクロ流体デバイス上におけるシリカ膜部材を介して、核酸を流動させた。
【０２８９】
最後に、３０サイクルのＰＣＲ後において、ベンチトップの熱サイクラー（レーン４〜５）またはマイクロ流体デバイスシステム（レーン２〜３）を用いて並行的にＰＣＲ増幅された２つの同一の試料を、アガロースゲル上で解析した（図２４）。
【０２９０】
さらに、１つの検体からレーン２および４を得る 一方で、第２の検体からレーン３および５を得た。ベンチトップのＰＣＲ反応により得られたより強いシグナルの場合におけるシグナル強度の見かけの乖離は、マイクロ流体デバイスで用いられた異なる出発材料量による可能性が極めて高い。ベンチトップＰＣＲ解析の出発量が２００μＬであるのに対して、マイクロ流体デバイスで用いられた量は５０μＬに過ぎなかった。より重要なことだが、ＰＣＲ単位複製配列のいずれのセットも、実質的に同一であった。
【０２９１】
同様にして、Ｌ１遺伝子変性プライマーＭＹ０９／ＭＹ１１を用いるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の存在についてのＰＣＲ（Ｇｒａｖｉｔｔ ＰＥ、Ｐｅｙｔｏｎ ＣＬ、Ａｐｐｌｅ ＲＪ、Ｗｈｅｅｌｅｒ ＣＭ、「Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ２７ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ＬＩ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｂｙ ａ ｓｉｎｇｌｅ−ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ， ｒｅｖｅｒｓｅ ｌｉｎｅ ｂｌｏｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ」、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｏｒｏｂｉｏｌ、１９９８年、第３６巻、第１０号、３０２０〜３０２７頁）により、膣内スワブを解析した。
【０２９２】
膣内スワブをＰＢＳ緩衝液に入れて撹拌後、ベンチトップＰＣＲ法またはマイクロ流体デバイスシステムを用いて、ＨＰＶの存在について上清を解析した。図２５に示す通り、マイクロ流体デバイスシステムにより、ベンチトップ法を用いて得られる結果と基本的に同一の結果がもたらされた。
【０２９３】
３つの個別の膣内スワブをＰＢＳ中に懸濁させ、「ベンチトップ」（右図）による溶解、ＤＮＡの抽出／精製、およびＰＣＲにかけるか、またはマイクロ流体デバイス（右図）内に導入してすべての機能を自動的に実施するだけであった。試料１、２、および３は、上記で説明した通りに２つのアリコートに分けて解析された、３つの個別試料を表す。
【０２９４】
ベンチトップ法の場合、まずウイルスＤＮＡを単離および精製し、次いで、ベンチトップの熱サイクラーを用いてＰＣＲ増幅した。マイクロ流体デバイスシステムの場合、ＰＢＳ上清を試料ウェルに添加し、すべての機能を自動的に実施する（ウイルス溶解、核酸の抽出／精製、およびＰＣＲを含む）だけであった。
【０２９５】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）を検出するリバースドットブロット（ＲＤＢ）モジュール（すなわち、核酸解析領域）を組込むマイクロ流体デバイスを用いた。膣内スワブからＨＰＶを得、複数のＨＰＶ血清型を増幅しうるプライマー対を用いるＰＣＲ増幅にかけた。マイクロ流体デバイス上では、図２７で図式的に説明されるプロトコールに従い、ビオチン化された単位複製配列を変性させ、血清型ＨＰＶ−１１、ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−３１、およびＨＰＶ−５２に対する４×４アレイのプローブ上に流動させた。ＨＰＶ−５２（上図）およびＨＶＰ−１１（下図）は、統合型マイクロ流体デバイスシステム内で適正に検出された（図２６）。
【０２９６】
その有用性を調べるため、本発明者らは、各種の異なるＨＰＶ血清型（ＨＰＶ １１、１６、３１、および５２）を増幅しうるＭＹ０９／ＭＹ１１変性プライマー（Ｐｅｙｔｏｎ ＣＬ、Ｗｈｅｅｌｅｒ ＣＭ、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｉｖｅ ｎｏｖｅｌ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｍｅｘｉｃｏ ｔｒｉｅｔｈｎｉｃ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ」、Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ、１９９４年、第１７０巻、第５号、１０８９〜１０９２頁）により、膣内スワブ試料を増幅した。両プライマーをそれらの５’端でビオチン化し、二本鎖ビオチン化単位複製配列を作製した。ＲＤＢモジュールを構成してＰＣＲ単位複製配列を変性させ、該単位複製配列がそれらの各捕捉プローブとハイブリダイズしたドットブロットアレイ（ミシガン州、アンアーバー、Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製、Ｉｍｍｕｎｏｄｙｎｅ Ｃ）の表面上にそれらを流動させた。
【０２９７】
上記の試験に加え、本発明者らは、マイクロ流体デバイスシステムを用いて、血漿および唾液の両方におけるＨＩＶ−１を検出するのに成功し、「ベンチトップ」のＲＴ−ＰＣＲ法を用いて得られた結果と同等の結果を達成した。
【０２９８】
まとめると、これらの予備的データは、マイクロ流体デバイスを用いて、使いやすいフォーマットにおける臨床試料の完全自動化されたＰＣＲ解析またはＲＴ−ＰＣＲ解析を達成しうることを示す。
【実施例６】
【０２９９】
６．６ オンチップにおける大腸菌試料の処理
本実施例で用いられるマイクロ流体デバイスの実施形態は、２つの機能領域を有した（図１２〜１６）。大腸菌の非病原性菌株Ｋ１２の誘導体であるＤＨ５ａを、オンチップにおける処理のための試料供給源として用いた。ＤＨ１０ｂのゲノムに基づいて、プライマーを作製した。ｒｒｓ遺伝子によりコードされる１６ＳのリボソームＲＮＡ。「腸内細菌共通抗原」（ＥＣＡ）は、ｗｙｚＥ遺伝子によりコードされる。用いられたプライマーは、１６Ｓ＿３６７（７本／ゲノム）およびＥＣＡ＿１７８（１本／ゲノム）であった（Ｂａｙａｒｄｅｌｌｅ Ｐ．およびＺａｈｒｕｌｌａｈ Ｍ．（２００２年）、「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｆｒｅｑｕｅｎｔ Ｅｎｔｅｒｏｈａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ ｓｐｅｃｉｅｓ ＤＮＡ ｕｓｉｎｇ ｗｅｃ ｇｅｎｅ ｔｅｍｐｌａｔｅｓ」、Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｈｉｏｌ．、第４８巻、１１３〜１２２頁を参照されたい）。
【０３００】
図１４〜１６は、この実験で用いられるマイクロ流体デバイスの実施形態についての操作略図である。矢印は、デバイス上で処理された際の大腸菌試料の進行を示す。図１４において：１．リザーバーＲ１内において室温で５〜１０分間にわたり、細胞溶解緩衝液およびプロテイナーゼＫと共に大腸菌をインキュベートした。２．次いで、Ｒ１およびＲ２を「Ｒ３」へと交互に送出することにより、試料をＲ２からのＥｔＯＨ／ＤＮＡ結合緩衝液と混合した。３．混合された試料を、Ｒ３リザーバーからフィルターリザーバーへと移送し、該溶液を、該リザーバーの底部に位置するシリカ膜を介して吸引した。
【０３０１】
図１５において：４．結合したＤＮＡを洗浄緩衝液１により洗浄し、廃棄物を廃棄物リザーバーへと移送する。５．次いで、結合したＤＮＡを洗浄緩衝液２により洗浄し、廃棄物を廃棄物リザーバーへと移送する。６．次いで、数分間にわたり通気ポンプを作動させてシリカ膜を介して空気を引き込み、膜を乾燥させる。７．溶出緩衝液をフィルターリザーバーへと送出し、インキュベートし、「ＮＡ１」へと溶出させる。この段階で、一部のＤＮＡをベンチトップでの実行用にアリコートすることができ、残りはオンチップでの実行用に用いる。
【０３０２】
図１６において：８．ＤＮＡ鋳型を「ＮＡ１」から「ＰＣＲ混合物」へと移送し、混合する。９．ＤＮＡ鋳型と共にＰＣＲマスター混合物をＰＣＲリアクターへと吸引する。１０．ＰＣＲ熱サイクリングを実行する。１１．ＰＣＲ産物を該産物リザーバーへと送出する。この段階で、一部のＤＮＡをベンチトップでの実行用にアリコートすることができ、残りはオンチップでの実行用に用いる。
【０３０３】
ＰＣＲ感度解析および吸光度試験を用いて「妥当な」（１０３個レベルの）大腸菌添加により自動化試行を実行する場合の成功率を決定することにより、自動化の信頼性および自動化の有効性を評価した。両方の設計を用いて、８０〜９０％の成功率が得られた。多くの市販のＰＣＲ産物に対し、約９０％の成功率が典型的である。
【０３０４】
マイクロ流体デバイスから得られたＮＡ抽出およびＰＣＲ結果をベンチトップの結果と比較することにより、自動化の有効性を評価した。
【０３０５】
２つの連鎖的なオンチップ操作：核酸（ＮＡ）抽出およびＰＣＲ増幅が実行された。大腸菌１０００個／μｌの試料２０μｌからのＤＮＡでは、従来のＵＶ分光光度計で検出不可能なＵＶ吸光度が生じるため、低量の大腸菌添加時におけるＮＡ抽出の直接的な比較は困難であった。
【０３０６】
図２８は、アップルジュース中に添加された大腸菌１，０００個を処理する２つのチップ間における比較を示す。該菌添加されたジュースをオンチップで調製してＤＮＡを精製し、次いで、１μｌずつの２アリコートを取り出し、ベンチトップ上で増幅し、精製された残りのＤＮＡをオンチップで増幅した。示される通り、産物を取り出し、ゲル上で解析した。各チップによる産物のレーン１およびレーン２はベンチトップ上で増幅されたアリコートを表し、各場合におけるレーン３はオンチップにおける増幅産物を表す。
【０３０７】
ＰＣＲでは、ベンチトップＰＣＲおよびオンチップＰＣＲのいずれの試行に対してもオンチップで抽出されたＤＮＡを用い、オンチップＰＣＲの有効性を決定した。図２９は、オンチップで抽出されたＤＮＡを用いる、ベンチトップのＰＣＲ結果とオンチップのＰＣＲ結果との比較を示す。大腸菌の添加量は、５×１０３個／μｌ〜１×１０４個／μｌの範囲であった。
【０３０８】
添加量が十分である場合、オンチップの結果およびベンチトップの結果は、ほぼ同等であった。
【実施例７】
【０３０９】
６．７ マイクロ流体デバイスを用いる食品マトリックス中における大腸菌の検出
本試験の主目的は、マイクロ流体デバイスの実施形態により、ＰＣＲベースのアッセイを用いて、アップルジュース、アップルサイダー、およびミルクなどの食品マトリックス中における大腸菌を検出する、すべての調製ステップおよび解析ステップを有効に実施しうると示すことであった。
【０３１０】
大腸菌株ＤＨ５αを培地内で増殖させ、用いられる各種のマトリックスに導入した。本試験では、２つの異なる遺伝子標的を用いた。細菌ファミリーおよび細菌種を通じて観察される、高度に保存された遺伝子である１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（ｒｒｓ遺伝子によりコードされる）と、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａ）ファミリーに共通の腸内細菌共通抗原ＥＣＡ（ｗｙｚＥ遺伝子によりコードされる）とをＰＣＲ増幅した。該ｒＲＮＡ遺伝子およびＥＣＡ遺伝子を検出するのに用いられたＰＣＲプライマーは、それぞれ、３６７ｂｐおよび１７８ｂｐの単位複製配列を生成すると予測された。
【０３１１】
マイクロ流体デバイスの２つの個別の実施形態を評価し、細菌１０００〜５００，０００個の範囲の添加濃度において３種の個別の大腸菌導入試料（アップルジュース、アップルサイダー、およびミルク）を評価した。最後に、この予備試験では、合計約１００回のマイクロ流体デバイスの試行を実施した。
【０３１２】
結果
本試験では２つの異なる設計を評価したが、この実施例では、評価された設計の１つだけに焦点を絞る（図１８〜２１）。このマイクロ流体デバイスは、単一のマイクロ流体デバイス上における２つの機能領域を用いる。第１の領域は、すべての試料調製（すなわち、細胞溶解、ＤＮＡ抽出／精製）を組込み、第２の領域は、ＰＣＲ増幅用である。これらの領域内には、各種の機能を達成する３つのポンプ／弁群が配置されている。流体は、同じポンプダイアフラムを共有する各リザーバー間で移送されうる。加えて、複数の供給源リザーバーを単一の目的リザーバーに組み合わせて、有効な混合を達成することができ、これはまた、ポンプの二方向性によっても増強されうる。略述すると、以下のステップが実行された。
１．「Ｒ１」内において室温で５〜１０分間にわたり、細胞溶解緩衝液およびプロテイナーゼＫと共に２０μＬの大腸菌試料をインキュベートする。
２．Ｒ１およびＲ３を「Ｒ２」へと交互に送出することにより、Ｒ１を「Ｒ３」からのＥｔＯＨ／ＤＮＡ結合緩衝液と混合する。
３．混合された試料を、「Ｒ２」からフィルターリザーバーへと移送し、該溶液を、該リザーバーの底部に位置するシリカ膜を介して吸引し、抽出されたＤＮＡをシリカに結合させる。
４．シリカと結合したＤＮＡを「Ｗ１」内の洗浄緩衝液１により洗浄し、廃棄物を廃棄物リザーバーへと移送する。
５．シリカと結合したＤＮＡを「Ｗ２」内の洗浄緩衝液２により洗浄し、廃棄物を廃棄物リザーバーへと移送する。
６．シリカ膜を乾燥させるため、数分間にわたり通気ポンプを作動させ、シリカ膜を介して空気を吸引させる。
７．（リザーバーＥｌｕからの）溶出緩衝液をフィルターリザーバーへと送出し、インキュベートし、２５μｌの精製ＤＮＡをリザーバーＮＡ１へと溶出させる。
８．ＤＮＡ鋳型をＮＡ１リザーバーからＰＣＲ 混合物リザーバーへと移送し、１：９の比で鋳型をＰＣＲ試薬と混合する（すなわち、プライマー対および他のすべてのＰＣＲ反応成分）。
９．ＤＮＡ鋳型と共にＰＣＲマスター混合物をＰＣＲリアクターへと吸引する。
１０．ＰＣＲリアクター内においてＰＣＲ熱サイクリングを実行する。
１１．ＰＣＲ産物を該産物リザーバー（「ＰＣＲ Ｐｒｏｄ」）へと送出する。
【０３１３】
この予備試行では約１００回の個別アッセイを実施したが、本実施例では試行間で極めて再現性の高い代表的データを説明する。図２８〜３７に示すデータは、ＰＢＳ緩衝液、アップルサイダー、アップルジュース、およびミルク中への既知量の大腸菌の導入から得られた結果を表す。
【０３１４】
Ｑｕｉａｇｅｎ社製ＤＮＡＥａｓｙキットを用いてＤＮＡを抽出する場合、試料量が１０〜３０μｌで変化しうるが、注目すべき影響は生じないことが分かった。
【０３１５】
細胞溶解緩衝液ＡＴＬおよびプロテイナーゼＫと共に試料を「Ｒ１」に入れた後、次いで、上記で説明した通りにこれを自動的に処理したところ、シリカ膜から溶出した最終ＤＮＡ量は２５μＬであった。ＰＣＲを実行するため、１：９の比でＤＮＡ鋳型をＰＣＲマスターと混合した後、熱サイクリングチャンバーに導入した。したがって、起こりにくい事象ながら、ＤＮＡ回収率が１００％であると推定したとしても、最終的にＰＣＲ増幅されるＤＮＡ総量は、理論的に、総出発菌数から得られるＤＮＡの１／２５以下を表す（例えば、出発菌数が１０００個であった場合、最終的にＰＣＲチャンバーに導入されたＤＮＡは、細菌４０個以下となった）。
【０３１６】
ＰＢＳ中に懸濁した大腸菌
アッセイ条件を確立する一助とするため、初めの試行の焦点を、ＰＢＳ中に導入された既知量（または数）の大腸菌に絞った。ＰＢＳ中に大腸菌５００，０００個を導入し、マイクロ流体デバイス上でＤＮＡを単離／精製した。２５μＬの単離ＤＮＡ鋳型から１μＬのアリコートを取り出し、「ベンチトップ」のＰＣＲ増幅にかける一方、該２５μＬの単離ＤＮＡ鋳型の別の１μＬアリコートを、１：９の比でＰＣＲマスター混合物と混合し、マイクロ流体デバイス上でさらに増幅した。図３２において、同じマイクロ流体デバイス上において完全に統合されたＤＮＡ単離／精製およびＰＣＲから得られたゲルプロファイル（レーン４）との、「ベンチトップ」ＰＣＲ試料のゲルプロファイル（レーン３）の比較では、識別できない結果が示された。同じゲル上におけるレーン１および２は、それぞれ、陰性対照（水）および陽性対照（ＵＶ吸光度測定に基づく、細菌１０００個に由来するＤＮＡ）を表す。同じ種類の試料に対する反復的解析により基本的に再現可能な結果がもたらされることは、マイクロ流体デバイスを用いて、問題となる細菌を信頼できる形で検出し、「ベンチトップ」のＰＣＲ解析と事実上識別できない結果を得ることが可能であったことを示す。
【０３１７】
初めの２０μＬの試料中に細菌１０，０００個だけを導入し、次いで、３つの個別のマイクロ流体デバイスによりまさに上記で説明した通りに処理することで、基本的に同一の結果が得られた。
【０３１８】
マイクロ流体デバイス上におけるＤＮＡの単離および精製
上記と同様の複数のさらなる実験を実施することにより、以下のアッセイプロトコールが確立された。
【０３１９】
試薬は、Ｑｕｉａｇｅｎ社製ＤＮＥａｓｙキットおよびＰｒｏｍｅｇａ社製ＰＣＲキットに由来した。
【０３２０】
【表Ａ】
【０３２１】
ＰＣＲプロトコール
９５℃で２分間にわたる最初のインキュベーション。各サイクルを
９５℃で５〜１５秒間
６０℃で２０〜３０秒間
７２℃で２０〜２５秒間
として、２５〜３５サイクル。７２℃で３分間にわたる最後のインキュベーション。
【０３２２】
アップルサイダーに導入された大腸菌
ＰＢＳに導入された細菌について報告された方式と同様の方式で、各濃度の大腸菌を市販のアップルサイダーに導入し、マイクロ流体デバイスシステムにおいて解析した。アップルサイダーに導入された細菌５００，０００個の解析（図３０Ａ）により、「ベンチトップ」のＰＣＲ解析（レーン３）と完全統合型マイクロ流体デバイスによる解析（レーン４）との間で基本的に識別できない結果がもたらされた。レーン１および２は、それぞれ、陰性対照および陽性対照を表す。陰性対照レーン内において現れる微弱なバンドは、実験室内における二次汚染による可能性が高い。アップルサイダーに導入される菌数を１００，０００個に低下させることによってもまた、標的配列の良好な増幅が示された（図３０Ｂ）。レーン１〜２が完全統合型マイクロ流体デバイスでの試行により生成される単位複製配列を示す一方、レーン４〜５は、同じＤＮＡに対する「ベンチトップ」のＰＣＲ増幅により生成される単位複製配列を示す。レーン３は、陰性対照を表す。
【０３２３】
最後に、アップルサイダーに導入される菌数を２５００個に低下させる（図３１）ことによってもまた、「ベンチトップ」のＰＣＲ解析（レーン２〜３）と完全統合型マイクロ流体デバイスによる解析（レーン４〜５）との間における優れた相関が得られた。レーン１は、陰性対照を表す。
【０３２４】
上記で注意した通り、マイクロ流体デバイス（ならびにベンチトップシステム）上でＤＮＡが抽出、精製、および増幅される方式により、以下の表は、マイクロ流体デバイスに添加され、ＰＣＲチャンバー内において実際に増幅される細菌数を表す（マイクロ流体デバイスの精製領域からの１００％のＤＮＡ回収率を仮定する）。以下の表１は、試料中およびＰＣＲチャンバー内における細菌添加数を示す。
【０３２５】
【表Ｂ】
【０３２６】
アップルジュースに導入された大腸菌
同様の方式で、各濃度の大腸菌を市販のアップルジュースに導入した。細菌１０，０００個をアップルジュースに導入した（図３３）ところ、完全統合型マイクロ流体デバイスでの試行から得られた結果（レーン４〜５）は、同じマイクロ流体デバイス上で単離されたＤＮＡに対する「ベンチトップ」のＰＣＲ解析により得られた結果と識別できなった。レーン１は陰性対照を表す。
【０３２７】
アップルジュースに細菌１０００個だけを導入する（図３４）ことによってもまた、完全統合型マイクロ流体デバイスから結果として得られた単位複製配列（レーン４〜５）は、同じマイクロ流体デバイス（レーン２〜３）上で単離されたＤＮＡに対するベンチトップＰＣＲにより得られた単位複製配列と識別できなかった。上記の通り、レーン１は陰性対照を表す。最後に、２回の異なるマイクロ流体デバイスでの試行から得られた単位反復配列を比較したところ（図３５）、完全統合による結果（各マイクロ流体デバイスのレーン３）は、同じマイクロ流体デバイスから得られたＤＮＡに対する「ベンチトップ」のＰＣＲ増幅により得られた結果と識別できなかった。
【０３２８】
上記で説明した通り、マイクロ流体デバイス内を進行する際におけるＤＮＡの希釈により、単離／精製およびＰＣＲ増幅から結果として得られる単位複製配列は、マイクロ流体デバイスに初めに導入された細菌が、初めの添加濃度の１／２５以下を占めることを示す。したがって、細菌１０，０００個が導入された場合、実際に増幅されたＤＮＡは、細菌４００個以下に由来した。同様に、細菌１０００個だけが導入された場合、実際に増幅されたＤＮＡは、細菌４０個以下に由来した。
【０３２９】
ミルクに導入された大腸菌
ミルク中に１，０００，０００個の大腸菌を導入し、上述の確立されたプロトコールを用いて調べたところ、状況は、アップルジュースまたはアップルサイダーよりも複雑であった。脱脂粉乳の場合、試験に対するタンパク質の干渉は極めて限定されたものであり、予期した結果が得られた（図３６）。しかし、細胞溶解緩衝液に対して１：１の容量比で全乳を調べたところ、ＤＮＡが単離されなかったことから、全乳中に存在する脂肪により単離過程が抑制されることが示される可能性が高い。
【０３３０】
この特定のプロトコールでは、臨床診断を目的として、血液の保存および輸送用に開発されたＷｈａｔｍａｎ社製ＦＴＡフィルターを用いた。Ｗｈａｔｍａｎ社製ＦＴＡフィルターの最も注目すべき特徴は、それが、フィルター自体における細胞の溶解および精製に十分な試薬を含むことであった。この場合、マイクロ流体デバイス上における水以外の他の試薬を保存する必要が存在しなかった。しかし、Ｗｈａｔｍａｎ社製ＦＴＡフィルターは、加工に際してむしろ過酷な条件を伴う。ベンチトップおよびマイクロ流体デバイスのいずれにおいても、大腸菌からのＤＮＡ精製のためのＦＴＡ溶出を調べたが、その結果を表２および図３７に示す。すべての試験は、１００万個の大腸菌添加を用いて実施した。
【０３３１】
【表Ｃ】
【０３３２】
結論
本試験により、マイクロ流体システムを用いて、アップルジュース、アップルサイダー、およびミルクなどの食品マトリックス中における大腸菌を検出しうることが示された。これらの結果は、単一のマイクロ流体デバイス上においてすべての調製機能および解析機能を実施しうることを明確に示す。
【実施例８】
【０３３３】
６．８ 密閉された核酸増幅リアクターに対する圧力除去デバイス
本実施例では、例えば、ＰＣＲリアクターを有するマイクロ流体デバイスの核酸増幅領域内における密閉された核酸増幅リアクターと共に用いうる圧力除去デバイスについて説明する。圧力除去（緩和）デバイスは、シールされたマイクロ流体デバイスの内部に設置することができる。圧力除去デバイスは、弁に類似するが、直径を貫通する導管状の切除部を有し（図３８）、流体は通常、ダイアフラム上部の導管を介して流動可能であり、システム圧が増大すると、流体は、設計およびシステム圧に応じて空気圧により制御されるかまたは雰囲気に対して開放される、緩和デバイスのダイアフラムを押しやり、ダイアフラムのたわみにより、該密閉システム内における物質が維持される一方で、圧力除去のためのさらなる空間がもたらされる。
【０３３４】
圧力除去デバイスは、マイクロ流体デバイスなど、シールされた微細リアクターが、熱サイクリング間の著明な温度変化に由来する破断または漏えいを起こすことを防止しうる。液体の熱膨張の結果として生じる圧力は、固定体積内において極めて高い。温度が２５℃から９５℃に上昇すると、水の体積は４％上昇する。従来のリアクター設計では、リアクター壁面の変形、捕捉された気体の圧縮、流入／流出導管の膨張、漏えいなどにより圧力が解放されうる。
【０３３５】
システム内において緩和デバイスを直列に配することにより、リアクター領域内における温度が上昇すると、リアクター内における液体が膨張し、圧力が上昇し、緩和ダイアフラムをたわませる。結果として、システム圧が解放される。リアクター内における温度が低下すると、液体が収縮し、流体の逆流が生じ、ダイアフラムのたわみが低減される。加えて、圧力緩和設計はまた、それなしには高圧弁が必要となる、システムをシールする弁の使用も容易とする。
【実施例９】
【０３３６】
６．９ 高温時におけるＰＣＲリアクター変形の防止
本実施例では、特定の実施形態において、核酸増幅リアクター、例えば、ＰＣＲリアクターの上部に接着することで、高温時における熱効果の結果としてリアクターがたわむことを防止しうる、剛性構造について説明する（図３９）。マイクロ流体デバイス材料としてポリスチレンを用いる場合、リアクターの上部は、高温、例えば、９５℃時において「たわみ」変形を受ける場合がある。冷却時において、チャンバー内の圧力は、変形および／または液体の漏出により陰圧となる場合があり、これにより、底部膜がたわみ、ヒーターとの共形接触が失われる。結果として、再現可能で高品質の核酸増幅を達成することが困難となりうる。リアクター上部に剛性構造を用いることにより、このような熱膨張がリアクターの上部から離れ、ヒーターを圧迫する膜へと方向づけられる。
【実施例１０】
【０３３７】
６．１０ リバースドットブロット（ＲＤＢ）用の核酸プローブを固定化する方法
本実施例では、リバースドットブロット（ＲＤＢ）検出用の核酸プローブを固定化するのに用いうる方法について説明する。
【０３３８】
Ｂｉｏｄｙｎｅ Ｃ膜は以下のように調製した。フィルターを、１０ｃｍのペトリディッシュ内における浸漬に適するサイズに切断した。膜を、ペトリディッシュ内における０．１Ｎ ＨＣｌ中ですすいだ。水中に１０％のＮ−エチル−Ｎ’−（３−ヂメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）水溶液（使用直前にＥＤＣを作製する）約５ｍｌを用いて、撹拌しながら１５分間にわたり、膜をＥＤＣ中に浸漬させた。膜を滅菌水中ですすぎ、一晩にわたり通気乾燥させた。
【０３３９】
アミノ末端プローブの２０μＭ溶液は、以下の通りに作製した：
１．（０．５Ｍ重炭酸Ｎａ）原液に由来する２００μＭプローブ溶液のうち５０μｌを、
２．４４５μｌの０．５Ｍ重炭酸Ｎａ溶液に混合し、
３．次いで、これに、総容量が５００μｌとなるように、５μｌの食用色素（黄色１号；赤色〜青緑色）を添加し、
４．調製された溶液中にピンを浸し、該ピンを既に調製したＢｉｏｄｙｎｅ Ｃ膜に１秒間にわたり接触させることにより該Ｂｉｏｄｙｎｅ Ｃ膜上にピンからの液滴を滴下させ、これを２サイクルにわたり繰り返す。
【０３４０】
上記と同じプロトコールを用いるが、異なるプローブを用いる、別の溶液を調製する。プローブアレイが完成したら、次いで、
５．プローブアレイを有するＢｉｏｄｙｎｅ Ｃ膜を、０．１Ｎ ＮａＯＨ中で５秒間にわたり洗浄する。
６．次いで、２回目は滅菌水中で５秒間にわたり洗浄する。
７．次いで、対流熱乾燥により３５秒間にわたり乾燥させる。
８．完全に通気乾燥させる。
９．約１分間にわたり、０．１Ｎ ＮａＯＨ中ですすぐ。
１０．滅菌水中ですすぐ。
１１．完全に通気乾燥させる。
【０３４１】
本発明は、本明細書で説明される特定の実施形態により範囲が限定されないものとする。実際、本明細書で説明された実施形態に加えての、本発明に対する各種の改変は、上述の説明から当業者には明らかであろう。このような改変は、添付の特許請求の範囲内に入ることを意図する。
【０３４２】
本明細書で引用されるすべての参考文献は、各個別の刊行物、特許、または特許出願が、参照により、すべての目的に対してその全体において組込まれることが具体的かつ個別に示されたと仮定する場合と同程度に、参照により、すべての目的に対してその全体において本明細書に組込まれる。
【０３４３】
任意の刊行物の引用は、出願年月日以前におけるその開示についてのものであり、本発明が、先行発明のためにこのような刊行物に先行する権利がないことの容認として解釈されるべきではない。
【符合の説明】
【０３４４】
３２ 弁
１０１ 試料調製領域
１０２ 核酸増幅領域
１０３ 核酸解析領域
１１１ 試薬リザーバー
１１２ 核酸増幅リアクター
１１３ 解析領域リザーバー
１１４ 廃棄物リザーバー
【技術分野】
【０００１】
１．技術分野
本発明は、マイクロ流体工学の分野ならびに生化学および分子生物学の分野におけるマイクロ流体工学の応用に関する。本発明はさらに、統合型マイクロ流体プラットフォーム装置および関連の方法に関する。本発明はまた、核酸など、対象の生物学的分子を調製、増幅、および検出するためのマイクロ流体デバイスにも関する。本発明はまた、マイクロ流体デバイスを用いて、核酸など、対象の生物学的分子を調製、増幅、および検出する方法にも関する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体において本明細書に組込まれる、２００７年１０月１２日出願の同時係属米国特許仮出願第６０／９７９，５１５号の優先権およびその利益を主張する。
【０００３】
連邦政府による後援を受ける研究または開発に関する言明
該当なし。
【０００４】
付録の参照
該当なし。
【背景技術】
【０００５】
２．発明の背景
分子生物学は、核酸およびタンパク質などの高分子の形成、構造、および機能、ならびに細胞による遺伝情報の複製および伝達におけるそれらの役割のほか、生物のゲノム内で核酸を配列決定し、突然変異させ、さらに操作して、突然変異の生物学的効果を研究しうるような核酸の操作も取り扱う生物学の分野として広く定義することができる。
【０００６】
生化学および分子生物学の従来の実践では、しばしば研究される被験体のサイズに反比例するスケールにおける物理的工程の供給源を必要とすることがある。例えば、予測解析のための核酸フラグメントなどの生物学的試料の調製および精製と関連する装置およびプロセス化学では、往々にして無菌施設を伴う完全規模のバイオ実験室を必要とすることがある。さらに、核酸フラグメントを増幅する周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）工程を実行するには、同様の規模の環境から孤絶した施設を必要とすることが典型的でありうる。
【０００７】
２．１ マイクロ流体システム
「マイクロ流体工学」とは、一般に、小容量流体を処理する系、デバイス、および方法を指す。マイクロ流体システムは、流体を操作する多種多様の作業を統合しうる。このような流体は、化学的または生物学的な試料を含みうる。これらのシステムはまた、生物学的アッセイ（例えば、医学的診断、薬剤の発見、および薬剤送達のためのアッセイ）、生化学的センサー、または生命科学研究一般のほか、環境解析、工業工程のモニタリング、および食品安全試験など、多くの適用領域も有する。
【０００８】
マイクロ流体デバイスの１つの種類は、マイクロ流体チップである。マイクロ流体チップは、流体を保持し、チップ上における様々な位置から、また、様々な位置へと流体を移送し、かつ／または流体試薬を反応させる、チャネル、弁、ポンプ、リアクター、および／またはリザーバーなど、マイクロスケールの形状特徴（または「マイクロフィーチャ」）を含みうる。
【０００９】
しかし、既存のマイクロ流体システムは、あらかじめ規定された流動パターンによる以外、複数種の流体の制御された操作を可能とするのに十分な機構を欠いており、このため、システムを各種の化学的アッセイまたは生物学的アッセイで用いうる実用性が制約されている。これは、現場のアッセイが、各種の解析目的に応じて、異なる試薬の反復的な操作を必要とすることが多いためである。
【００１０】
さらに、多くの既存のマイクロ流体デバイスは、１つの特定の使用に制約されており、完全に再設計しない限り、他の適用に適応させるかまたはカスタマイズすることが容易に可能ではない。これらのデバイスはモジュール性を欠いており、したがって、１つの設計で複数の機能の実行が可能となる共通のデバイス部材を共有することが可能ではない。この柔軟性の欠如により、各使用に異なるシステムの作製が必要となるので、生産費用が増大する。
【００１１】
さらにまた、多くの既存のマイクロ流体システムは、アッセイの結果として得られる解析物の相互作用または存在を容易に検出することか可能な、直接的な評価項目アッセイのための手段を欠いている。例として述べると、アッセイ後における試料の色変化の視覚的な検出を用いてアッセイの結果を評価することが多い。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
こうして、生物学的試料または化学的試料の解析のために、また特に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アミノ酸、およびタンパク質などの試料に由来する生物学的に活性な高分子の検出および解析において流体を処理する、改善されたマイクロ流体システムが必要である。システムは、大量生産性であり、廉価であり、好ましくはディスポーザブルであることが望ましい。システムは、操作が単純で、流体処理ステップの多くまたは実質的にすべてが自動化されることが望ましい。システムはカスタマイズ可能であり、高分子の検出が所望される各種の適用に適する形で容易かつ迅速に再構成されるよう、モジュラー性であることが望ましい。また、システムは、直接的で有意味なアッセイ結果を提供可能であることも望ましい。
【００１３】
第２節または本出願の他の任意の節における任意の参考文献の引用および同定は、このような参考文献が本発明に対する先行技術として用いられることの容認としては考えないものとする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
３．発明の概要
対象試料を解析するためのマイクロ流体デバイスであって、
ａ）マイクロ流体デバイスの本体
を含み、該マイクロ流体デバイス本体が、
ｉ）試料調製領域と、
ｉｉ）核酸増幅領域と、
ｉｉｉ）核酸解析領域と、
ｉｖ）ネットワーク内において相互連結された複数の流体チャネルと
を含み、
試料調製領域、核酸増幅領域、および核酸解析領域の各々が、該ネットワーク内における少なくとも１つの流体チャネルにより、他の２つの領域の少なくとも１つと流体的に相互連結されるマイクロ流体デバイスが提供される。
【００１５】
また、対象試料を解析するためのマイクロ流体デバイスであって、
ａ）マイクロ流体デバイスの本体
を含み、該マイクロ流体デバイス本体が、
ｉ）試料調製領域と、
ｉｉ）核酸増幅領域と、
ｉｖ）ネットワーク内において相互連結された複数の流体チャネルと
を含み、
試料調製領域および核酸増幅領域の各々が、少なくとも１つの流体チャネルにより、他の領域と流体的に相互連結されるマイクロ流体デバイスも提供される。
【００１６】
一実施形態において、マイクロ流体デバイスは、マイクロ流体デバイス本体の選択される領域に、周囲圧力に対して陽圧または陰圧を加えることが可能な差圧供給源を含みうる。
【００１７】
別の実施形態において、マイクロ流体デバイスは、差圧供給源およびマイクロ流体デバイス本体に作動的に連結される差圧送達システムを含みうる。
【００１８】
別の実施形態において、マイクロ流体デバイスは、差圧供給源からダイアフラムの所望の開位置または閉位置への圧力を変換するための、特定であるかまたは選択の流体チャネル内であるかまたはその間に配置される、少なくとも１つのダイアフラムを含みうる。
【００１９】
別の実施形態において、試料調製領域は、
試料取込みリザーバーと、
試料調製試薬リザーバーと、
試料精製媒体と
を含み、試料取込みリザーバー、試料調製試薬リザーバー、および試料精製媒体は、流体的に相互連結される。
【００２０】
別の実施形態において、マイクロ流体デバイスは、試料精製媒体が配置される試料精製媒体リザーバーを含みうる。
【００２１】
別の実施形態において、試料精製媒体は、複数の流体チャネルの１つに配置される。
【００２２】
別の実施形態において、試料精製媒体は、試料精製リザーバーの底部に配置される。
【００２３】
別の実施形態において、核酸増幅領域は、
核酸増幅リアクターと、
核酸増幅試薬リザーバーと、
核酸増幅産物リザーバーと、
を含み、核酸増幅リアクター、核酸増幅試薬リザーバー、および核酸増幅産物リザーバーは、流体的に相互連結される。
【００２４】
別の実施形態において、対象試料は、流体材料、気体材料、液体材料中に実質的に溶解した固体材料、エマルジョン材料、スラリー材料、またはその中に粒子が懸濁する流体材料である。
【００２５】
別の実施形態において、対象試料は、生物学的材料を含む。
【００２６】
別の実施形態において、対象試料は、流体中における細胞の懸濁液を含む。
【００２７】
別の実施形態において、マイクロ流体デバイス本体は、複数層の弱溶剤接着ポリスチレンを含む。
【００２８】
別の実施形態において、試料調製領域は、試料取込みリザーバーと流体的に連結された試料混合ダイアフラムを含む。
【００２９】
別の実施形態において、核酸抽出媒体は、シリカ膜である。
【００３０】
別の実施形態において、マイクロ流体デバイス本体は、試料精製媒体を通気乾燥させる手段を含む。
【００３１】
別の実施形態において、試料調製領域は、洗浄リザーバーを含む。
【００３２】
別の実施形態において、試料調製領域は、廃棄物リザーバーを含む。
【００３３】
別の実施形態において、試料調製領域は、溶出リザーバーを含む。
【００３４】
別の実施形態において、試料調製試薬は、磁気ビーズを含む。
【００３５】
別の実施形態において、試料調製試薬は、試料調製リザーバーに配置される。
【００３６】
別の実施形態において、試料調製試薬は、磁気ビーズである。
【００３７】
別の実施形態において、試料調製試薬は、溶解試薬である。
【００３８】
別の実施形態において、核酸増幅リアクターは、熱サイクルリアクターである。
【００３９】
別の実施形態において、熱サイクルリアクターの底部は、ポリスチレンの薄層である。
【００４０】
別の実施形態において、熱サイクルリアクターの底部は、熱サイクリング間に、マイクロ流体デバイス本体上または本体内には配置されないヒーターにより加熱される。
【００４１】
別の実施形態において、核酸増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素（ＲＴ−）ＰＣＲ、ｃＤＮＡ末端迅速増幅（ＲＡＣＥ）、ローリングサイクル増幅、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写物媒介増幅（ＴＭＡ）、およびリガーゼ連鎖反応からなる群から選択される。
【００４２】
別の実施形態において、核酸解析領域は、対象核酸と対象核酸のプローブとの間の相互作用を検出するための領域を含む。
【００４３】
また、対象核酸を検出する方法であって、対象核酸を含有することが疑われる試料を得るステップと、マイクロ流体デバイスを用意するステップと、試料調製領域に試料を導入するステップと、核酸増幅用に試料を調製するステップと、調製された試料を核酸増幅領域に導入するステップと、核酸増幅領域において核酸増幅反応を実行して対象核酸を増幅するステップと、増幅された対象核酸を核酸解析領域に導入するステップと、増幅された対象核酸を検出するステップとを含む方法も提供される。
【００４４】
一実施形態において、対象核酸は、対象の疾患または障害と関連する。
【００４５】
別の実施形態において、検出するステップは、増幅された対象核酸と対象核酸のプローブとの間の相互作用を検出するステップを含む。
【００４６】
別の実施形態において、検出するステップは、色強度、蛍光強度、電気信号強度、または化学発光強度を可視化するステップを含む。
【００４７】
別の実施形態において、検出するステップは、試料中における少なくとも１種の対象分子に対応する強度値を発生させるステップを含む。
【００４８】
別の実施形態において、強度値は、色強度値、蛍光強度値および化学発光強度値、電流または電圧からなる群から選択される。
【００４９】
別の実施形態において、色強度値を発生させるステップは、
試料に対応する画像を解析して複数の画素を発生させるステップと、
複数の画素の各々に対して複数の数値を与えるステップと、
数値を生じさせて色強度値を提供するステップと
を含む。
【００５０】
別の実施形態において、該方法は、閾値を計算するステップと、色強度値を閾値と比較して対象分子を検出するステップとをさらに含む。
【００５１】
別の実施形態において、該方法は、少なくとも１つの色強度値と閾値とをデータベースに保存するステップをさらに含む。
【００５２】
別の実施形態において、閾値は、少なくとも１種の陰性対照試料を用いて計算される。
【００５３】
被験体における対象の疾患または障害の存在または素因を判定する方法もまた提供される。該方法は、対象の疾患または障害と関連する核酸を含有することが疑われる試料を被験体から得るステップと、試料中における対象の疾患または障害と関連する核酸を検出するステップとを含み、該検出するステップは、対象核酸を含有することが疑われる試料を得るステップと、マイクロ流体デバイスを用意するステップと、試料調製領域に試料を導入するステップと、核酸増幅用に試料を調製するステップと、調製された試料を核酸増幅領域に導入するステップと、核酸増幅領域において核酸増幅反応を実行して対象核酸を増幅するステップと、増幅された対象核酸を核酸解析領域に導入するステップと、増幅された対象核酸を検出するステップとを含み、増幅された対象核酸の検出が、対象の疾患または障害の存在または素因と関連する。
【００５４】
一実施形態において、検出するステップは、増幅された対象核酸の量（またはレベル）を決定するステップを含み、ここで、該方法は、該量（またはレベル）を対象核酸のあらかじめ選択された量（またはレベル）と比較するステップをさらに含む。
【００５５】
別の実施形態において、該量（またはレベル）とあらかじめ選択された量（またはレベル）との間の差は、対象の疾患または障害の存在または素因を示す。
【００５６】
４．図面の簡単な説明
ここで、添付の図面を参照して本発明を説明するが、これらにおいては、複数の図を通して同様の参照文字が同様のエレメントを示す。場合によって、本発明の理解を容易にするために、本発明の各種の態様が誇張されるかまたは拡大されて示されうることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】試料調製領域１０１、核酸増幅領域１０２、および評価項目検出アッセイを実施するための核酸解析領域１０３の３つの機能領域を有するマイクロ流体デバイス（「チップ」）の実施形態の３次元図である。試薬リザーバー１１１。解析領域リザーバー１１３。廃棄物リザーバー１１４。
【図２】図１に記載のマイクロ流体デバイスの等尺分解図であり、マイクロ流体デバイスの３層を示す（明確さを目的として、連続膜は示さない）。
【図３Ａ】図１に記載のマイクロ流体デバイスの実施形態についての上面図であり、試料調製領域（「核酸（ＮＡ）抽出領域」）、核酸増幅領域（この実施形態では、「ＰＣＲ領域」）、および核酸解析領域（「ＲＤＢ領域」）を示す。また、デバイス上における弁、マイクロ流体チャネル、貫通孔、および低密度ＤＮＡフィルターの配置も示される。この実施形態では、核酸解析領域において、リバースドットブロット（ＲＤＢ）評価項目検出アッセイを実施することができる。「廃棄物」：廃棄物リザーバー。
【図３Ｂ】図１に記載のマイクロ流体デバイスの実施形態についての上面図であり、試料調製領域１０１、核酸増幅領域１０２（核酸増幅リアクター１１２を含む）、および核酸解析領域１０３、ならびにデバイス上における弁、マイクロ流体チャネル、および貫通孔の配置を示す。解析領域リザーバー１１３。
【図４】図１に記載のマイクロ流体デバイスの実施形態についての上面図であり、デバイスの特定の層上におけるリザーバー、核酸増幅リアクター（またはチャンバー）、弁、マイクロ流体チャネル、および貫通孔を含む、デバイスの機能配置を示す。
【図５】図１に記載のマイクロ流体デバイスの実施形態についての上面図であり、デバイス上における弁の配置図を示す。
【図６】図１に記載のマイクロ流体デバイスの実施形態についての上面図であり、デバイス上におけるリザーバーの配置図を示す。
【図７】図１に記載のマイクロ流体デバイスの実施形態についての上面図であり、デバイスの機能領域の配置図を示し、リザーバー内における試薬の配置を示す。試料調製領域１０１。核酸増幅領域１０２（核酸増幅リアクター１１２を含む）。核酸解析領域１０３、ならびにデバイス上における弁、マイクロ流体チャネル、および貫通孔の配置。解析領域リザーバー１１３。
【図８】試料調製領域および核酸増幅領域の２つの機能領域を有するマイクロ流体デバイスの別の実施形態を示す。矢印で示す通り、試料調製領域は、試料の投入および調製、試料の精製、ならびに核酸の抽出のためのリザーバーを含む。核酸増幅領域は、核酸増幅リアクター（「増幅チャンバー」）を含む。デバイスのこの実施形態はまた、核酸増幅の完了後においてマイクロ流体デバイスから単位複製配列が抽出される領域である、核酸増幅産物抽出領域（「増幅産物抽出領域」）も含む。デバイスのこの具体的な実施形態は、５０×３８ｍｍの寸法を有する。
【図９】図８に記載のマイクロ流体デバイスの実施形態についての等尺分解図であり、マイクロ流体デバイスの３つの層（明確さを目的として、連続膜は示さない）を示す。
【図１０】図８に記載のマイクロ流体デバイスについての上面略図であり、デバイスの特定の層上におけるポンプ、弁、増幅リアクター、マイクロ流体チャネル、および貫通孔の配置図を示す。
【図１１】図８に記載のマイクロ流体デバイスについての上面略図であり、デバイスの機能領域の配置図を示し、複数の試薬リザーバー（例えば、「細胞」、「エタノール」、「ミキサー」、「廃棄物」、「溶出」、「ＮＡ１」、「ＮＡ２」、「ＡＷ１」、「ＡＷ２」）内における試薬の配置を示す。 図１２〜１６は、試料調製領域および核酸増幅領域の２つの機能領域を有するが、オンチップの核酸解析領域を有さない本発明のマイクロ流体デバイス（「チップ」）の別の実施形態を示す図である。
【図１２】リザーバーは示さずに、弁およびチャネルの配置を示す上面図である。
【図１３】二方向ポンプの３つの群：試料調製用ポンプ、核酸増幅試薬調製用ポンプ、および充填用ポンプを有する、図１２に示すマイクロ流体デバイスの実施形態の配置を示す図である。
【図１４】図１２に示すマイクロ流体デバイスの実施形態についての操作略図である。矢印は、デバイス上で処理される際の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）試料の進行を示す。
【図１５】図１２に示すマイクロ流体デバイスの実施形態についての操作略図である。矢印は、デバイス上で処理される際の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）試料の進行を示す。
【図１６】図１２に示すマイクロ流体デバイスの実施形態についての操作略図である。矢印は、デバイス上で処理される際の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）試料の進行を示す。
【図１７】チャンバーの開口部（「ノズル」）上に配置されるダイアフラムを用いてチャンバーの内容物を混合する混合ジェットを発生させうる、デバイスのチャンバー底部の実施形態を示す図である。
【図１８】本発明の実施形態によるマイクロ流体デバイスおよび対照（Ｑｕｉａｇｅｎ社製ＲＮＥａｓｙキット）により得られた比較の結果を示す図である。Ｑｕｉａｇｅｎ社製ＲＮｅａｓｙによる抽出／精製法（レーン１〜３、１０）およびマイクロ流体デバイス（レーン４〜９）を用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞から単離されたＲＮＡの１％アガロースゲルを示す図である。分子量マーカーを左側に示す。
【図１９】レーン１：ＤＮＡ標準物質；レーン２：オンチップで実行されたＲＴ−ＰＣＲからの単位複製配列産物；レーン３：投入ＲＮＡ（１μｌ）を示す図である。ＲＮＡは、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞から作製した。ベータ−アクチンを認識するプライマーを用いて、ｃＤＮＡ産物を作製し、ＰＣＲによりアクチンのｃＤＮＡを増幅した。
【図２０】示される通り、熱サイクルおよび試行時間を変化させる場合における、８回のＰＣＲ試行に対するオンチップでの再現性を示す図である。
【図２１】ＰＣＲの比較を示す図である。ＢｉｏＲａｄ ＭＪ Ｍｉｎｉ熱サイクラー（レーン２および３）またはマイクロ流体デバイス（レーン４）を用いる３０サイクルのＰＣＲにより、５×１０３コピーのプラスミド（ｐｒｌｐＧＬ３）を増幅した。分子量マーカーがレーン１に示されている。
【図２２】この実験において、マイクロ流体デバイスと連結して用いられたＰＣＲ熱サイクラーによる典型的なサイクルを示す図である。下図におけるグラフは、上図のグラフ内で示される最初の４サイクルの一部の拡大図である。
【図２３】マイクロ流体デバイス上で実行されるＲＴ−ＰＣＲプロトコールの結果を示す図である。ベンチトップ（ｂｔ）プロトコールおよびオンチッププロトコールを用いて、ＨＩＶ ＲＮＡを単離した。
【図２４】全血液中におけるβ−サラセミア遺伝子の検出を示す図である。３０サイクルのＰＣＲ後において、ベンチトップの熱サイクラー（レーン４〜５）またはマイクロ流体デバイス（レーン２〜３）を用いて並行的にＰＣＲ増幅された２つの同一試料を、アガロースゲル上で解析した。レーン１は、分子量標準物質を表す。
【図２５】ベンチトップＰＣＲ法またはマイクロ流体デバイスを用いるＨＰＶ増幅の結果を示す図である。
【図２６】リバースドットブロット（ＲＤＢ）によるＨＰＶ血清型検出用のオンチッププローブアレイを示す図である。ＨＰＶ−５２（上図）およびＨＰＶ−１１（下図）は、適正に検出された。
【図２７】ＲＤＢプロトコールの概略図である。
【図２８】アップルジュース中に添加された大腸菌１，０００個を処理する２つのチップ間における比較を示す図である。該添加されたジュースをオンチップで調製してＤＮＡを精製し、次いで、１μｌずつの２アリコートを取り出し、ベンチトップ上で増幅し、精製された残りのＤＮＡをオンチップで増幅した。示される通り、産物を取り出し、ゲル上で解析した。各チップの産物のレーン１およびレーン２はベンチトップ上で増幅されたアリコートを示し、各場合におけるレーン３はオンチップにおける増幅産物を表す。
【図２９】オンチップで抽出されたＤＮＡを用いる、ベンチトップのＰＣＲ結果とオンチップのＰＣＲ結果との比較を示す図である。大腸菌の添加量は、５×１０３個／μｌ〜１×１０４個／μｌの範囲であった。
【図３０Ａ】Ａ：「ベンチトップ」のＰＣＲ解析（レーン３）とマイクロ流体デバイスによる解析（レーン４）とを比較する、アップルサイダーに導入された大腸菌５００，０００個の解析を示す図である。レーン１および２は、それぞれ、陰性対照および陽性対照を表す。
【図３０Ｂ】Ｂ：「ベンチトップ」のＰＣＲ解析（レーン３）とマイクロ流体デバイスによる解析（レーン４）とを比較する、アップルサイダーに導入された大腸菌１００，０００個の解析を示す図である。レーン１および２は、それぞれ、陰性対照および陽性対照を表す。
【図３１】「ベンチトップ」のＰＣＲ解析（レーン２〜３）とマイクロ流体デバイスによる解析（レーン４〜５）とを比較する、アップルサイダーに導入された大腸菌５００，０００個の解析を示す図である。レーン１は、陰性対照を表す。
【図３２】「ベンチトップ」のＰＣＲ解析（レーン２〜３）とマイクロ流体デバイスによる解析（レーン４〜５）とを比較する、ＰＢＳに導入された大腸菌５００，０００個の解析を示す図である。レーン１は、陰性対照を表す。
【図３３】「ベンチトップ」のＰＣＲ解析（レーン２〜３）とマイクロ流体デバイスによる解析（レーン４〜５）とを比較する、アップルジュースに導入された大腸菌１０，０００個の解析を示す図である。レーン１は、陰性対照を表す。
【図３４】「ベンチトップ」のＰＣＲ解析（レーン２〜３）とマイクロ流体デバイスによる解析（レーン４〜５）とを比較する、アップルジュースに導入された大腸菌１，０００個の解析を示す図である。レーン１は、陰性対照を表す。
【図３５】２回の異なるマイクロ流体デバイスでの試行から得られた単位反復配列の比較を示す図である。各マイクロ流体デバイスの完全な試行から得られた結果（各マイクロ流体デバイスから生成された生成物に由来するゲル解析に対応するレーン３）は、同じマイクロ流体デバイスから得られて別個に増幅された、ＤＮＡに対する「ベンチトップ」のＰＣＲ増幅により得られた結果（レーン１および２）と識別できなかった。
【図３６】「ベンチトップ」のＰＣＲ解析（レーン２〜３）とマイクロ流体デバイスによる解析（レーン４〜５）とを比較する、脱脂粉乳に導入された大腸菌１，０００，０００個の解析を示す図である。レーン１は、陰性対照を表す。
【図３７】大腸菌からのＤＮＡ精製のための、ベンチトップおよびオンチップにおけるＷｈａｔｍａｎ社製ＦＴＡによる溶出の結果を示す図である。すべての試験は、１００万（すなわち、１，０００Ｋ）個の大腸菌添加を用いて実施した。
【図３８】例えば、ＰＣＲリアクターを有するマイクロ流体デバイスの核酸増幅領域内における密閉された核酸増幅リアクターと共に用いうる圧力除去デバイスの概略図である。
【図３９】核酸増幅リアクター、例えば、ＰＣＲリアクターの上部に接着することで、高温時における熱効果の結果としてリアクターがたわむことを防止しうる、剛性構造の概略図である。
【図４０】小領域内におけるスポットアレイのためのＲＤＢ流動設計を示す図である。図４０。ＲＤＢ流動設計の側面図。図４１Ａ〜Ｂ。オンチップのＲＤＢリザーバー（Ａ）およびＲＤＢリザーバー（Ｂ）用の面取空間の実施形態についての透視図。
【図４１】小領域内におけるスポットアレイのためのＲＤＢ流動設計を示す図である。図４０。ＲＤＢ流動設計の側面図。図４１Ａ〜Ｂ。オンチップのＲＤＢリザーバー（Ａ）およびＲＤＢリザーバー（Ｂ）用の面取空間の実施形態についての透視図。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
５．発明の詳細な説明
本発明は、試料調製、生物学的に活性な分子の増幅を組み合わせることが可能であり、調製された元の試料からの対象分子の解析および／または検出に適する生物学的試料を提供することが可能な、マイクロ流体デバイス（「チップ」）およびこれに基づく方法を提供する。本発明により提供される小規模装置および方法は、生物学的試料の調製および解析のためのより大規模な設備と比較して、より簡便であり、より迅速であり、より廉価であり、同等に有効である。
【００５９】
マイクロ流体デバイスは、生の核酸を含有する試料を自動的に処理し、該試料に由来する核酸鋳型を用いてヌクレオチド（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）の増幅を実行する、構造的でありかつ機能的な能力を提供する。該デバイスは、処理時における試薬、生成物、または試料の汚染を制御することの利点を有するほか、試薬消費が低度であることの利点も有する。
【００６０】
該デバイス上で実行されるアッセイは、完全に自動化されている。本発明により提供されるマイクロ流体デバイスシステムでは、試料または検体の導入以外の「手」作業をほとんど伴わずに所望の結果が得られ、これにより、解析者側の多大な時間および労力を節約する手段がもたらされる。さらに、生の試料または検体をマイクロ流体デバイスに単に適用するだけで、未熟練者でも洗練された分子診断を実施することができる。
【００６１】
マイクロ流体デバイスは、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）、タンパク質、酵素を含むがこれらに限定されない、対象の生物学的高分子の潜在的な供給源として用いうる、ウイルス、細菌、真菌、原核細胞、真核細胞、古細菌細胞など、任意の生物学的供給源に由来するか、または全血液、血清または血漿、尿、便、粘液、唾液、膣または頬のスワブ、細胞培養物、細胞懸濁液などの生物学的材料に由来する、対象試料の解析に適する。マイクロ流体デバイスは、生物学的であるかまたは生物に由来する物質または材料の検出を伴う多種多様の検出、診断、モニタリング、および解析の目的、例えば、医学的または獣医学的な診断、食品加工、工業加工、および環境モニタリングに用いることができる。デバイスは、個体に由来する生物学的試料中における、感染、疾患、または障害の存在を検出する診断デバイスとして用いることができる。βサラセミア、ＵＴＩ（尿路感染症）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、性器クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、梅毒の原因病原体である梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）、細菌性膣症と関連する細菌などのＳＴＩ（性感染症）、２型単純ヘルペスウイルスなどのＨＰＶ、パピローマウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびサイトメガロウイルス、ＨＩＶ、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）などの酵母、ならびに膣トリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）などの原虫を含むがこれらに限定されない多くの疾患または障害が検出に適する。
【００６２】
一実施形態において、対象試料を解析するためのマイクロ流体デバイスは、マイクロ流体デバイスの本体を含むことができ、該マイクロ流体デバイス本体は、
ｉ）試料調製領域と、
ｉｉ）核酸増幅領域と、
ｉｉｉ）核酸解析領域と、
ｉｖ）ネットワーク内において相互連結された複数の流体チャネルと
を含み、
試料調製領域、核酸増幅領域、および核酸解析領域の各々が、該ネットワーク内における複数の流体チャネルの少なくとも１つにより、他の２つの領域の少なくとも１つと流体的に相互連結される（図１〜１１）。
【００６３】
別の実施形態において、対象試料を解析するためのマイクロ流体デバイスは、マイクロ流体デバイスの本体を含むことができ、該マイクロ流体デバイス本体は、
ｉ）試料調製領域と、
ｉｉ）核酸増幅領域と、
ｉｖ）ネットワーク内において相互連結された複数の流体チャネルと
を含み、
試料調製領域および核酸増幅領域の各々が、該ネットワーク内における少なくとも１つの流体チャネルにより、他の領域と流体的に相互連結される（図１〜７）。
【００６４】
別の実施形態において、マイクロ流体デバイスは、試料調製領域および核酸増幅領域の２つの機能領域を有しうるが、オンチップの核酸解析領域を欠く場合がある（図８〜１６）。
【００６５】
限定を目的とはせずに開示の明確さを目的として、本発明の詳細な説明を以下に記載の小節に分割する。
【００６６】
５．１ マイクロ流体デバイス本体
該解析デバイスは、マイクロ流体デバイス本体を含む。本発明による使用に適するマイクロ流体デバイス本体は、参照によりそれらの全体において本明細書に組込まれる、米国特許公開第ＵＳ２００６／００７６０６８Ａ１号（Ｙｏｕｎｇら、２００６年４月１３日）、同第ＵＳ２００７／０１６６２００Ａ１号（Ｚｈｏｕら、２００８年７月１９日）、および同第ＵＳ２００７／０１６６１９９Ａ１号（Ｚｈｏｕら、２００８年７月１９日）において説明されている。
【００６７】
本体は、上面および下面を有する第１の硬質プラスチック基板と、第１の基板上面に接触してこれと接着し、第１の基板上面に対して実質的に横たわる弛緩状態と、第１の基板上面から移動する作動状態とを有する、実質的に硬質のプラスチック膜とを含みうる。第１の硬質プラスチック基板はその中に形成されたマイクロフィーチャを有することが可能であり、実質的に硬質のプラスチック膜は該マイクロフィーチャの上に配置されうる。膜は、適切な機械力の適用時における変形を許容するように選択された厚さを有する。異なる実施形態において、膜は、約１０μｍ〜約１５０μｍ、１５μｍ〜約７５μｍの厚さを有する。
【００６８】
機械力は、基板向きに膜を変形させるように陽圧により適用され、約５０ｐｓｉ未満を有しうる。一実施形態において、該大きさは３ｐｓｉ〜約２５ｐｓｉである。
【００６９】
基板から遠ざかる向きに膜を変形させるように陰圧により適用される機械力は、約１４ｐｓｉ未満の大きさを有しうる。一実施形態において、該大きさは約３ｐｓｉ〜約１４ｐｓｉである。
【００７０】
膜および第１の基板は、実質的に同じ材料から作製することもでき、異なる材料から作製することもできる。本体の作製で用いるのに適する材料の例は、熱可塑性材料または線状ポリマー材料を含む。特定の実施形態において、該材料は、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、ポリカルボネート、またはアクリルである。
【００７１】
実質的に硬質のプラスチック膜は、第１の基板に接着されない非接着領域を有しうる。膜の非接着領域は、両者共に第１の基板内に配置される、第１のチャネルと、該第１のチャネルとは分離した第２のチャネルとを少なくとも部分的に覆うことが可能であり、弛緩状態において、第１のチャネルと第２のチャネルとの間のシールを形成する。
【００７２】
膜の非接着領域はまた、第１の基板内において形成され、第１および第２のチャネルから、また実質的にこれらの間で断絶する弁座も少なくとも部分的に覆うことが可能である。
【００７３】
弁座は、第１および第２のチャネルの長手軸に対して実質的に垂直な堰を含みうる。
【００７４】
膜の非接着領域は、両者共に第１の基板内に配置される、第１のチャネルと、該第１のチャネルとは分離した第２のチャネルとを少なくとも部分的に覆うことが可能であり、作動状態において、第１の基板上面から分離し、第１のチャネルと第２のチャネルとの間における流体の流動に適する空洞を提供する。
【００７５】
第１の基板はまた、第１の基板の上面から第１の基板の下面へと延びる貫通孔も含みうる。
【００７６】
膜の非接着領域は、実質的に円形、楕円形、または角を丸くした矩形でありうる。
【００７７】
本体は、膜の上面に接触してこれと接着する、第２の硬質プラスチック基板をさらに含みうる。
【００７８】
第１の基板、第２の基板、および膜は、実質的に同じ材料で作製することができる。
【００７９】
第２の基板は、膜の非接着領域の実質的な上方に位置し、膜の非接着領域が第１の基板上面から移動してそれにより実質的に格納された状態を保ちうるサイズのチャンバーを含みうる。
【００８０】
本体は、各々が個別に作動可能な弁構造を形成し、マイクロチャネルにより連鎖状に連結される、複数の断絶した非接着領域を有するポンプをさらに含みうる。マイクロチャネルは、流体の流動に対して様々な抵抗力を有する。
【００８１】
本体は、膜が作動状態にあるとき、膜を構造的に支持するサイズ、形状であり、そうする位置にある、膜上方の支持構造をさらに含みうる。
【００８２】
膜が第１の基板から所望の距離を超えて移動することを防止するサイズ、形状であり、そうする位置にある膜止めを膜上方に配置することができる。
【００８３】
本体は、共用弁構造を有する複数のポンプを有しうる。共用弁構造は、共用弁と連結された複数の流体ポートをもたらす、３つ以上のマイクロチャネルの上方に配置される膜を含みうる。
【００８４】
本体は、流体材料、気体材料、流体材料中に実質的に溶解した固体材料、スラリー材料、エマルジョン材料、およびその中に粒子が懸濁する流体材料の１種または複数種を保持することが可能な、少なくとも１つのリザーバーを含む。特定の実施形態において、対象試料は、生物学的材料、例えば、流体中における細胞の懸濁液を含む。
【００８５】
リザーバーは、実質的に垂直となるように配置することができる。それは、規定の垂直レベルにあるかまたはこれに近いリザーバー内から液体を抽出するための液体抽出手段と連結することができる。リザーバーは、流体材料および粒子を含有することが可能であり、粒子がリザーバーの上部および底部のいずれに滞留することも防止する形で、流体にデバイス全体を循環させるよう、リザーバーにポンプを連結することができる。リザーバーは、個別に作動可能な第１の弁構造と第２の弁構造との間に連結することができる。
【００８６】
別の実施形態において、本体は、ポンプ機構により相互連結された複数のリザーバーを含みうる。ポンプ機構は、複数のリザーバーからの流体を流過させる共用弁構造を含みうる。
【００８７】
本体はまた、少なくとも１つのマイクロフィーチャも含みうる。マイクロフィーチャは、１方向の流動を優先する形状を有するチャネルを含みうる。
【００８８】
本体は、ポンプ内を流動する流体により作動可能な受動弁構造を形成する２つの非接着領域へとマイクロチャネルにより相互連結される、外部から作動可能なダイアフラム構造を形成する１つの非接着領域を有するポンプを含みうる。別の実施形態において、ポンプは、各々が個別に作動可能なダイアフラム構造を形成し、各ダイアフラム構造が少なくとも１つの他のダイアフラム構造に部分的に重なる、複数の断絶した非接着領域を有しうる。
【００８９】
一実施形態において、本体は、差圧供給源から所望の開位置または閉位置への圧力を変換するための、特定であるかまたは選択の流体チャネル間に配置される、少なくとも１つのダイアフラムを含みうる。
【００９０】
特定の実施形態において、本体は、上面および下面ならびにその中に形成されるマイクロフィーチャを有する第１のポリスチレン基板と、第１の基板上面に溶剤接着されたポリスチレン膜とを含みうる。本体は、ポリスチレン膜が第１の基板上面に対して実質的に横たわる弛緩状態と、ポリスチレン膜が第１の基板上面から移動する作動状態とを有しうる。
【００９１】
弱溶剤接着は、室温および周囲力の条件下ではほとんどまたは実質的にまったく接着効果を有さないが、適切な気温または力の条件下では２つの対合表面間において接着界面を形成することが可能な溶剤により形成することができる。
【００９２】
特定の実施形態において、本体は、複数層の弱溶剤接着ポリスチレン内において作製された機能的な流体ネットワークを含みうる。例えば、参照により本明細書に組込まれる、米国特許出願第２００６／００７８４７０Ａ１号で開示される、弱溶剤積層工程により作製されうる３層ポリスチレン体（「チップ」）。特定の実施形態において、該チップは、第１および第２の表面を有し、少なくとも１つの表面がマイクロ構造を含み、さらに、ポリマー材料である第１の部材と、第１および第２の表面を有し、第１および第２の表面の１つが、米国特許出願第２００６／００７８４７０Ａ１号で開示される通り、ポリマー部材に対して弱溶剤である接着剤により、第１の部材の第２および第１の表面の１つにそれぞれ固定的に接着される、第２のポリマー部材とを含む積層構造でありうる。
【００９３】
一実施形態において、本体は、対象アッセイ（例えば、核酸検出アッセイ）を実施するのに用いうる３つの領域：試料調製領域、核酸増幅領域、および核酸解析領域を含む。３つの領域のすべては、当技術分野で知られる方法を用いてポンプおよび弁（例えば、参照により本明細書に組込まれる、米国特許出願第２００６／００７６０６８Ａ１号を参照されたい）、ならびにリザーバーおよびチャネル（例えば、参照により本明細書に組込まれる、米国特許出願第２００７／０１６６２００Ａ１号を参照されたい）へと流体的に連結することができる。リザーバーおよびチャネルは、例えば、弱溶剤接着工程（米国特許出願第２００６／００７８４７０Ａ１号）により、チップ内に構築することができる。
【００９４】
別の実施形態において、デバイス本体は、参照により本明細書に組込まれる、米国特許出願第２００６／００７６０６８Ａ１号で開示される通り、ダイアフラムが基板表面に対して着座する弛緩状態と、ダイアフラムが該基板から移動する作動状態との間で作動可能な、実質的に硬質のダイアフラムを有しうる。このダイアフラムにより形成されるマイクロ流体構造は、製作が容易で頑健なシステムのほか、弁およびポンプなど作製の容易な部品も提供しうる。
【００９５】
具体的な一実施形態において、デバイス本体は、実質的に硬質のプラスチック膜が、接着剤として作用する弱溶剤により、基本的に平坦な硬質プラスチック基板に固定的に接着または積層する、ポリマーマイクロ流体構造である。特定の態様において、基板はマイクロフィーチャを含み、デバイス本体は、変形可能な膜と基本的に平坦な基板表面との間の接着領域により取り囲まれて画定される非接着セグメントを含み、この結果、弁構造がもたらされる。一部の実施形態において、第２の基板は膜の上面に接着され、膜の非接着領域に空気圧を加えるのに用いうるチャンバーを含む。本発明の使用と符合する方法によれば、空気圧または空気力を加えることで膜を変形させ、これにより弁を作動させる。一部の実施形態において、ポンプは、マイクロチャネルにより相互連結される複数の弁構造を含む。マイクロチャネルにより弁、ポンプ、リアクター、およびマイクロ流体リザーバーを相互連結して、マイクロ流体処理およびマイクロ流体解析に機能的に関与するサーキュレーター、ミキサー、または他の構造を形成することができる。
【００９６】
別の実施形態において、デバイス本体は、上面および下面を有する第１の硬質プラスチック基板と、第１の基板上面に接触してこれと接着し、第１の基板上面に対して実質的に横たわる弛緩状態と、第１の基板上面から移動する作動状態とを有する、実質的に硬質のプラスチック膜とを有しうる。第１の硬質プラスチック基板は基板内に形成されたマイクロフィーチャを有することが可能であり、実質的に硬質のプラスチック膜は、少なくとも１つのマイクロフィーチャの上に配置されることが多い。実質的に硬質のプラスチック膜は、約２Ｇｐａ〜約４Ｇｐａのヤング率を有し、適切な機械力の適用時における変形を許容するように選択された厚さまたは幅を有しうる。膜は、約１０μｍ〜約１５０μｍ、またより具体的に、約１５μｍ〜約７５μｍの厚さを有しうる。
【００９７】
それに対して膜が応答する機械圧は、基板向きに膜を変形するように適用される陽圧の場合があり、これは約５０ｐｓｉ未満でありえ、３ｐｓｉ〜約２５ｐｓｉでありうる。代替的に、および場合によって、機械圧は、基板から遠ざかる向きに膜を変形するように適用される陰圧の場合もあり、これは約１４ｐｓｉ未満でありえ、約３ｐｓｉ〜約１４ｐｓｉでありうる。
【００９８】
膜および第１の基板は、実質的に同じ材料から作製することができる。膜および第１の基板の材料は、熱可塑性材料または線状ポリマー材料でありえ、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、ポリカルボネート、またはアクリルから作製することができる。
【００９９】
実質的に硬質のプラスチック膜は、第１の基板に接着されない非接着領域を有しうる。膜の非接着領域は、両者共に第１の基板内に配置される、第１のチャネルと、第１のチャネルとは分離した第２のチャネルとを少なくとも部分的に覆うことが可能である。弛緩状態において、膜は、第１のチャネルと第２のチャネルとの間のシールを形成しうる。場合によって、膜の非接着領域は、第１の基板内において形成され、第１および第２のチャネルから、また実質的にこれらの間で断絶する弁座を少なくとも部分的に覆うことが可能である。弁座は、第１および第２のチャネルの長手軸に対して実質的に垂直な堰を含みうる。さらに、膜の非接着領域は、第１のチャネルと、第１のチャネルとは分離した第２のチャネルとを少なくとも部分的に覆うことが可能である。これらのチャネルは共に第１の基板内に配置することができ、作動状態において、膜は第１の基板上面から分離し、第１のチャネルと第２のチャネルとの間における流体の流動に適する空洞を提供する。場合によって、第１の基板の上面から第１の基板の下面へと延びる貫通孔もまた存在しうる。非接着領域は、任意の適切な形状を有することが可能であり、選択される形状は、当然ながら、目前の適用に依存する。特定の実施形態において、非接着領域は、円形でもありえ、実質的に楕円形でもありえ、実質的に角を丸くした矩形でもありえ、該適用に適切な任意の形状でもありうる。
【０１００】
特定の実施形態において、デバイス本体は、膜の上面に接触してこれと接着する、第２の硬質プラスチック基板を含むことができ、場合によって、第１の基板、第２の基板、および膜は、ポリスチレンなどの実質的に同じ材料で作製される。第２の基板は、膜の非接着領域の実質的な上方に位置し、膜の非接着領域が第１の基板上面から移動してそれにより実質的に格納された状態を保つサイズのチャンバーを含みうる。
【０１０１】
マイクロ流体デバイス本体は、各々が、マイクロチャネルまたはある種の流体流路により連鎖状に連結されることが典型的な、個別に作動可能な弁構造を形成する、断絶した非接着領域の対または群を含むポンプをさらに含みうる。マイクロチャネルは、流体の流動に対する可変抵抗を有することが可能であり、この目的のために、異なるサイズ、形状、および拘束部を有しうる。さらに場合によって、デバイスは、流動の特定の１方向における流体の流動を優先する形状を有するチャネルなどの形状特徴を含みうる。
【０１０２】
一実施形態において、複数のポンプは、共有弁構造を有することができ、特に、該ポンプは、共用弁と連結された複数の流体ポートをもたらす３つ以上のマイクロチャネルの上方に配置される膜を含む、共用弁構造を有することができる。こうして、一部の実施形態において、ポンプは、任意の３連弁構造を含みうる。液体、気体、流体材料中に実質的に溶解した固体でありうる流体材料、スラリー材料、エマルジョン材料、またはその中に粒子が懸濁する流体材料を保持することが可能なリザーバーを提供することができる。リザーバーは、実質的に垂直でありえ、規定の垂直レベルにあるかまたはこれに近いリザーバー内から液体を抽出するための液体抽出デバイスと連結することができる。リザーバーはまた、実質的に垂直となるように配置することができ、流体および粒子を含有しうる。粒子がリザーバーの上部または底部に滞留することを防止する形で、流体にデバイス全体を循環させるよう、リザーバーにポンプを連結することができる。リザーバーは、個別に作動可能な第１の弁構造と第２の弁構造との間に連結することができ、複数のリザーバーは、ポンプ機構により相互連結することができる。ポンプが共用弁構造を含むかまたはこれに連結されることで、ポンプによる複数のリザーバーからの流体の流過が可能となる。
【０１０３】
さらなる実施形態において、デバイスは、ポンプ内を流動する流体により作動可能な受動弁構造を形成する２つの非接着領域へとマイクロチャネルにより相互連結される、外因的に作動可能なダイアフラム構造を形成する１つの非接着領域を有するポンプを有しうる。また別の実施形態において、ポンプは、各々が個別に作動可能なダイアフラム構造を形成し、各ダイアフラム構造が少なくとも１つの他のダイアフラム構造に部分的に重なる、複数の断絶した非接着領域を有しうる。
【０１０４】
デバイスは、膜が第１の基板から所望の距離を超えて移動することを防止するサイズ、形状であり、そうする位置にある、膜上方に配置された機械的膜止めなどの膜止め機構を含みうる。
【０１０５】
別の実施形態において、本体は、上面および下面ならびにその中に形成されるマイクロフィーチャを有する第１のポリスチレン基板と、第１の基板上面に溶剤接着され、第１の基板上面に対して実質的に横たわる弛緩状態と、第１の基板上面から移動する作動状態とを有するポリスチレン膜とを有しうる。
【０１０６】
マイクロ流体デバイスはまた、差圧送達供給源、例えば、圧力または真空を供給する１つまたは複数の機械的通気ポンプを含む場合もあり、これに連結される場合もある。
【０１０７】
一実施形態において、差圧供給源は、マイクロ流体デバイス本体の選択される領域に、周囲圧力に対して陽圧または陰圧を加えることが可能である。
【０１０８】
マイクロ流体デバイスはまた、差圧送達システム、例えば、弁を連鎖的に作動させて基板上に形成された弁およびポンプを操作することが可能なコントローラを含む場合もあり、これに連結される場合もある（Ｚｈｏｕら、米国特許公開第ＵＳ２００７／０１６６１９９Ａ１号）。差圧送達システムは、差圧供給源（例えば、１つまたは複数の通気ポンプ）を含みうる。差圧送達システムは、差圧供給源およびマイクロ流体デバイス本体に作動的に連結することができる。
【０１０９】
差圧送達システムは、デバイス内における材料の混合を可能とする。例えば、コントローラにより、リザーバーのポンプチャンバーおよび他の２つのポンプチャンバーを操作することが可能であり、これにより、材料はリザーバーのポンプチャンバー内に引き込まれ、次いで、該２つのポンプチャンバーの各々の中に部分的に引き込まれ、該２つのポンプチャンバーの１つに部分的に引き込まれた材料は、その後、リザーバーのポンプチャンバーに戻る。
【０１１０】
マイクロ流体デバイスはまた、コントローラを制御するコンピュータおよび／またはコンピュータソフトウェアも含みうる。
【０１１１】
５．２ 試料調製領域および試料調製法
マイクロ流体デバイスは、試料調製領域を含みうる。一実施形態において、試料調製領域は、
試料取込みリザーバーと、
試料調製試薬リザーバーと、
試料精製媒体と
を含み、
試料取込みリザーバー、試料調製試薬リザーバー、および試料精製媒体は、流体的に相互連結される（図１〜７）。
【０１１２】
試料調製領域は、例えば、１つまたは複数の溶出リザーバーまたは廃棄物リザーバーを含みうる（図７）。試料調製領域はまた、細胞溶解および／または細胞溶解緩衝液、試料洗浄および／または洗浄緩衝液、試料精製および／または精製媒体のための１つまたは複数のリザーバーも含有しうる（図７）。
【０１１３】
試料精製媒体は、試料精製媒体リザーバー内に配置することができる。特定の実施形態において、試料精製媒体は、試料精製リザーバーの底部に配置することができる。
【０１１４】
代替的に、試料精製媒体は、複数の流体チャネルの１つに配置することもできる。
【０１１５】
試料調製領域は、試料取込み領域に流体的に連結される、試料取込みリザーバー内に対象試料を導入するための試料流入口を含みうる。
【０１１６】
試料調製領域はまた、試料取込みリザーバーに流体的に連結される、試料混合ダイアフラムも含みうる。
【０１１７】
試料調製領域は、デバイス本体上の少なくとも他の１つのリザーバーと流体的に相互連結される、試料混合リザーバーをさらに含みうる。
【０１１８】
一実施形態において、試料調製領域は、生物学的試料、例えば、細胞または生物の試料に熱ショックを与える熱供給源を含みうる。生検体を熱ショックに曝露することにより、例えば、既知の特定のＲＮＡ分子種を作製することができる。マイクロ流体デバイス内の検体から単離されたＲＮＡを後で核酸増幅する際、熱ショックにより既知の特定のＲＮＡ分子種が生成されたかどうかを解析することにより、元の検体がマイクロ流体デバイス内に導入されたときにそれが生検体であったかどうかを判定することができる。
【０１１９】
一実施形態において、試料中の生物学的材料、例えば、細胞または組織は、試料調製工程において溶解される。別の実施形態において、生物学的材料は、抽出を受ける。化学的、機械的、電気的、超音波的、熱的などを含むがこれらに限定されない、当技術分野で知られる任意の生物学的抽出プロトコールを、本発明のマイクロ流体デバイスと共に用いることができる。
【０１２０】
当技術分野で知られる任意の核酸抽出精製媒体を、対象核酸の単離に用いることができる。一実施形態において、核酸の単離のための流体流路にシリカ膜を配置することができる。多孔性シリカ膜は、直径１μｍ未満の極細ガラス糸から作製することができる。このような媒体による核酸回収の収率は、流体流路における該ガラス糸の配向性と関係する。流体流路が短縮されることを回避し、核酸の抽出および精製に十分な媒体を確保するために、膜のサイズを流体チャネルの断面積よりも実質的に大きくすることができる。
【０１２１】
別の実施形態では、Ｂｏｏｍら（米国特許第５，２３４，８０９号）の固相抽出法を用いることができる。Ｂｏｏｍらは、核酸含有出発材料から核酸を単離する工程であって、出発材料、カオトロピック物質、および核酸結合固相を混合するステップと、そこに核酸が結合した固相を液体から分離するステップと、固相核酸複合体を洗浄するステップとを含む工程を開示している。
【０１２２】
核酸洗浄用に当技術分野で知られる任意の有機溶剤を用いて、核酸精製媒体上に吸収された核酸を洗浄することができる。
【０１２３】
核酸調製試薬は、溶解試薬またはプロテアーゼ試薬でありうる。対象の細胞試料または組織試料の溶解は、マイクロ流体デバイスの１つまたは複数の試薬リザーバーチャネルまたはリアクターにおいて実施することができる。一実施形態において、細胞溶解液（１つの試薬リザーバー内に保持される）と、その粘稠性であるかまたは非粘稠性の各試薬（（１つまたは複数の）異なるリザーバー内に保持される）とのオンチップでの混合は、１つのリザーバーから他のリザーバーへと流体を持続的に送達することにより実行することができる。
【０１２４】
細胞溶解は、流体の操作、例えば、静かな機械的撹拌もしくは「フラッフィング」、循環、化学的溶解、または細胞溶解法の組合せなど、当技術分野で知られる方法により達成することができる。
【０１２５】
磁気ビーズもまた溶解に用いることができる（例えば、Ｌｅｅ ＪＧ、Ｃｈｅｏｎｇ ＫＥ、Ｈｕｈ Ｎ、Ｋｉｍ Ｓ、Ｃｈｏｉ ＪＷ、Ｋｏ Ｃ、「Ｍｉｃｒｏｃｈｉｐ−ｂａｓｅｄ ｏｎｅ ｓｔｅｐ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｉｎ ｏｎｅ ｃｈａｍｂｅｒ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、Ｌａｂ Ｃｈｉｐ、２００６年、第６巻、第７号、８８６〜８９５頁を参照されたい）。
【０１２６】
磁気ビーズを用いて、当技術分野で知られる標準的な方法による精製プロトコールまたは核酸抽出プロトコールを増強することができる。例えば、溶解前に、これらを試料調製試薬として、例えば、特定の生物学的材料、細胞、組織、もしくは生物、またはこれらの部分成分に対する事前の濃縮または選択に用いることができる。
【０１２７】
細胞溶解／ホモジナイゼーションは、これらの目的に必要とされることが典型的な実験室設備を用いずに、マイクロ流体デバイス上で達成することができる。
【０１２８】
例えば、オンチップのポンプを持続的に作動させることにより、試薬リザーバーの底部に位置する多孔性ディスクを介して、試薬リザーバー内に保持される粘稠性の溶液を吸引することによりホモジナイズすることができる。
【０１２９】
一実施形態において、細胞溶解は、細胞試料を含有する溶液を、マイクロ流体デバイス上の狭小なチャネル（例えば、０．９ｍｍ）内で前後に吸引することにより達成することができる。このような機械的溶解を用いて、組織培養細胞をホモジナイズすることができる。
【０１３０】
細胞溶解はまた、細胞をせん断することによっても達成することができる。
【０１３１】
細胞溶解を達成するのに当技術分野でよく知られる他の方法は、カオトロピック変性（Ｂｏｏｍら、米国特許第５，２３４，８０９号）、超音波処理、リザーバーまたはチャネルにわたり適用されるＤＣ電圧（Ｗａｎｇ ＨＹ、Ｂｈｕｎｉａ ＡＫ、Ｌｕ Ｃ、「Ａ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ ｄｅｖｉｃｅ ｆｏｒ ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｌｙｓｉｓ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｄｅ ｖｏｌｔａｇｅ」、Ｂｉｏｓｅｎｓ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ、２００６年、第２２巻、第５号、５８２〜５８８頁）、マイクロエレクトロメカニクスベースの圧電式マイクロ流体ミニ超音波処理（Ｍａｒｅｎｔｉｓ ＴＣ、Ｋｕｓｌｅｒ Ｂ、Ｙａｒａｌｉｏｇｌｕ ＧＧ、Ｌｉｕ Ｓ、Ｈａｅｇｇｓｔｒｏｍ ＥＯ、Ｋｈｕｒｉ−Ｙａｋｕｂ ＢＴ、「Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｓｏｎｉｃａｔｏｒ ｆｏｒ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｐｏｒｅｓ ｆｏｒ ＤＮＡ ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ、２００５年、第３１巻、第９号、１２６５〜１２７７頁）、浸透圧溶解、局所的水酸化物生成による溶解、ナノスケールバーブによる機械的切断（Ｄｉ Ｃａｒｌｏ Ｄ、Ｊｅｏｎｇ ＫＲ、Ｌｅｅ ＬＰ、「Ｒｅａｇｅｎｔｌｅｓｓ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ ｂｙ ｎａｎｏｓｅａｌｅ ｂａｒｂｓ ｉｎ ｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌｓ ｆｏｒ ｓａｍｐｌｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ」、Ｌａｂ Ｃｈｉｐ ２００３年、第３巻、第４号、２８７〜２９１頁）、凍結−融解、熱変性、リゾチーム後におけるＧｕＳＣＮ処理、ＬＩＭＢＳ（レーザー照射磁気ビーズシステム；Ｌｅｅ ＪＧ、Ｃｈｅｏｎｇ ＫＥ、Ｈｕｈ Ｎ、Ｋｉｍ Ｓ、Ｃｈｏｉ ＪＷ、Ｋｏ Ｃ、「Ｍｉｃｒｏｃｈｉｐ−ｂａｓｅｄ ｏｎｅ ｓｔｅｐ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｉｎ ｏｎｅ ｃｈａｍｂｅｒ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、Ｌａｂ Ｃｈｉｐ、２００６年、第６巻、第７号、８８６〜８９５頁）、ならびに同時に適用されるレーザーおよび機械的振動を含む。
【０１３２】
一実施形態において、溶解は、試料および溶解試薬を有するリザーバーの下方にあるオンチップのダイアフラムポンプを、それが作動するときに流体がダイアフラム内に引き込まれ、ダイアフラムが逆向きに作動するときにリザーバー内に再注入されるように持続的に作動させることにより実施することができる。
【０１３３】
生物学的試料に対する多くの調製工程は、試料の溶解を伴う。溶解用に当技術分野で用いられる溶液は、非粘稠性でもありうるが、一般に、粘稠性の溶液である。試料調製時において、処理された（溶解した）生物学的試料は、溶解した試料に由来する核酸が結合する膜を介して流動することが典型的である。その後、溶解した生物学的試料よりも粘稠度が通常はるかに低い複数種の洗浄緩衝液に同じ膜を流過させる。
【０１３４】
試料調製領域は、デバイス本体上における少なくとも１つの他のリザーバーと流体的に相互連結された洗浄リザーバーをさらに含みうる。
【０１３５】
試料調製領域は、デバイス本体上における少なくとも１つの他のリザーバーと流体的に相互連結された廃棄物リザーバーをさらに含みうる。
【０１３６】
試料調製領域は、デバイス本体上における少なくとも１つの他のリザーバーと流体的に相互連結された溶出リザーバーをさらに含みうる。
【０１３７】
核酸は、膜親和性によるなど、当技術分野で知られる方法を用いて、試料から抽出または精製することができる。一実施形態では、シリカ膜を用いることができる。試料の溶解物は、（例えば、膜の下流におけるダイアフラムポンプを用いて）膜を介して押出すこともでき、絞り出すこともでき、吸引することもできる。流体は、シリカ膜を通常の方向（垂直方向）に流動することが好ましい。一実施形態では、シリカ膜を介して溶出緩衝液を引き込むことにより、核酸を抽出することができる。別の実施形態では、当技術分野で知られる核酸抽出法、例えば、Ｂｏｏｍら、米国特許第５，２３４，８０９号に記載の方法を用いることができる。
【０１３８】
溶剤（例えば、エタノール）は通常、シリカ膜または他の種類の核酸精製媒体から核酸が溶出する前に、膜から除去しなければならない。マイクロ流体デバイス本体は、試料精製媒体を通気乾燥させる手段を含みうる。一実施形態において、試料調製領域は、試料精製媒体を通気乾燥させる手段を含む。例えば、デバイス本体は、コントローラ上における通気ポンプに取り付けられたポートを装備しうる。遮断弁は、該ポートと、シリカ膜が位置する流体ネットワークのリザーバーまたはチャンバーとの間に装備される。試料および試薬が流体ネットワーク内で操作されてシリカ膜上を流動するかまたはこれを介して流動するとき、チップ上における遮断弁を閉じて流体が通気ポンプへと漏出しないことを確認することができる。
【０１３９】
膜が適正に準備されたら、遮断弁を開き、真空ポンプを作動させる。これにより、膜を介して空気が流動し、これを効果的に乾燥させる。代替的に、膜は、加熱によるかまたは加熱された気流によっても乾燥させることができる。
【０１４０】
別の実施形態では、オンチップのポンプを用いて、膜上へまたはこれを介して空気を送出するかまたは吹送するだけで、乾燥を調節することができる。
【０１４１】
核酸などの対象分子は、膜から除去して核酸増幅領域へと移送することができる。
【０１４２】
試料調製領域は、デバイス内の他のリザーバーと流体的に相互連結された核酸抽出膜リザーバーをさらに含みうる。該リザーバー内に核酸抽出膜または核酸抽出フィルターを配置することができる。
【０１４３】
核酸抽出膜は、例えば、核酸抽出膜リザーバーの底部に配置することができる。
【０１４４】
マイクロ流体デバイスは、核酸抽出膜を乾燥させる（例えば、送風、加熱、または真空乾燥により）ための領域をさらに含みうる。
【０１４５】
マイクロ流体デバイスのすべての領域は、酵素、溶出緩衝液、洗浄緩衝液、廃棄物保持、核酸抽出精製媒体、ヌクレオチド、プライマー配列、洗浄剤、および酵素基質を含みうるがこれらに限定されない試料処理試薬を保持および分注するリザーバーを含みうる。これらの試薬を含有するリザーバーのほか、核酸増幅領域も、マイクロ流体デバイス本体の異なる区画内に空間的に配置することができ、流体ネットワークにより互いに対して流体的に相互連結することができる。
【０１４６】
５．３ 核酸増幅領域および核酸の増幅方法
マイクロ流体デバイス本体は、核酸増幅領域を含む。核酸増幅領域は、
核酸増幅リアクターと、
核酸増幅試薬リザーバーと、
核酸増幅産物リザーバーと、
を含み、
核酸増幅リアクター、核酸増幅試薬リザーバー、および核酸増幅産物リザーバーは、流体的に相互連結される。
【０１４７】
リザーバー内の核酸増幅試薬は、例えば、核酸プライマーまたは核酸鋳型、核酸増幅混合物、核酸増幅酵素、ヌクレオチド、緩衝液、または他の核酸増幅試薬でありうる。このような核酸増幅試薬は、当技術分野でよく知られている。
【０１４８】
該試薬リザーバーおよび産物リザーバーは、核酸増幅リアクターに連結され、核酸増幅リアクターへおよびここからの１つまたは複数の流入口を有しうる。該リザーバーは、例えば、熱サイクリングの間に核酸リアクターを効果的にシールする、（１つまたは複数の）流入口および（１つまたは複数の）流出口における弁を含有しうる。特定の実施形態において、オンチップのバルブは、送出サイクル時において気泡を生じうる。こうして、一連の弁を用いて核酸増幅試薬を核酸増幅リザーバー内に「押出す」と、核酸増幅リアクター内に除去が困難でありうる気泡が生じうる。流入口の弁を閉じ、流出口におけるポンプを用いて部分真空を発生させる（試薬を押出す代わりにこれらを吸引することにより）ことで核酸増幅チャンバーを満たすことにより、気泡なしに核酸増幅チャンバーを満たす機構がもたらされる。核酸増幅リアクターはまた、リアクター内にまず部分真空を発生させることで気泡なしにリアクターを満たすのでなく、ただ流入口の弁を開き、流出口側のポンプを用いることによっても満たすことができる。
【０１４９】
マイクロチャネルの作製法により、チャネルの角または縁に沿った毛細管流動が生じる場合がある。この毛細管流動は、核酸増幅リアクターの充填を妨げることがある。乾燥したマイクロ流体デバイスを用いることにより、充填の間に、流体にリアクター内面を優先的に湿潤させ、空気の捕捉を回避することができる。
【０１５０】
核酸増幅反応時における気泡形成は、マイクロリアクター内の問題でありうる。傾斜型核酸増幅チャンバーにより、形成された気泡をチャンバーの１つの側で回収させうる。ポリスチレンおよび核酸増幅試薬混合物の疎水特性により、核酸増幅チャンバーの１つの端部で気泡を回収する能力が損なわれる。試薬混合物は、気泡の移動または形成の補助となる各種の界面化製剤および添加剤を有しうる。界面活性剤は、ポリスチレンの疎水性表面と相互作用する。
【０１５１】
一実施形態において、改変リザーバーと組み合わせた傾斜型核酸増幅リアクターを用いることで、チャンバーおよび導管内のすべての気泡を追い出すことができる。この「循環」法は、混合（とりわけ、異なる密度の試薬）の増強、充填時における気泡の低減、充填後における気泡の除去能、試薬による弁の充填、および定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）のための明確な「定量域」の提供を含む複数の利点を提供しうる。
【０１５２】
ｑＰＣＲでは、高感度の光学検出器および光源を用いるので、入射光に干渉する気泡がない核酸増幅リアクターは有利である。一実施形態では、光学検出機器を核酸増幅リアクターの下端部に配置することで、気泡が検出に干渉しないことを確認することできる。また、弁を液体で満たすことにより、液体なしの（空気）弁と比較して、弁のシールを改善する一助となることも観察されている。液体の表面張力は温度に反比例するので、高温時には循環送出を行うことにより核酸増幅リアクター内に捕捉された気泡を除去することもできる。
【０１５３】
別の実施形態では、ワックスまたは油を用いて核酸増幅リアクターをシールすることもできる。チップ作製工程時におけるチャンバーのコーティングまたは反応混合物への油／ワックスの組込み（例えば、熱によりワックスを溶融させ、再固形化時に反応物上にコーティングを形成させる；代替的には、反応物上に油を配置する；例えば、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、ユニット１５．１、「Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｂｙ ＰＣＲ．Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ａｎｄ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ」；Ｑｕｉｎ Ｃｈｏｕ、Ｍａｒｉｏｎ Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｄａｖｉｄ Ｅ．Ｂｉｒｃｈ、Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｒａｙｍｏｎｄ、およびＷｉｌｌ Ｂｌｏｃｈ、「Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｅ−ＰＣＲ ｍｉｓ−ｐｒｉｍｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｉｍｅｒ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｌｏｗｃｏｐｙ−ｎｕｍｂｅｒ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９２年、第２０巻、第７号、１７１７〜１７２頁を参照されたい）。
【０１５４】
別の実施形態において、試料調製領域で抽出された核酸は、核酸増幅領域へと誘導される（すなわち、押出されるか、吸引されるか、絞り出されるか、または送出される）。核酸は、混合リザーバーにおいて１種または複数種の核酸増幅試薬と混合され、次いで、該混合物は、核酸増幅リアクターへと誘導され、そこで、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素（ＲＴ−）ＰＣＲ、ｃＤＮＡ末端迅速増幅（ＲＡＣＥ）、ローリングサイクル増幅、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写物媒介増幅（ＴＭＡ）、およびリガーゼ連鎖反応を含むがこれらに限定されない、当技術分野で知られる任意の熱媒介的な核酸増幅を実施することができる。
【０１５５】
一実施形態において、核酸増幅のための熱サイクリングは、その薄さを踏まえると著明な熱障壁を提示しない一方で、コントローラのマニホールド上に位置するヒーターと増幅リアクターとの間の良好な接触も提供する、弁およびポンプを作製するのに用いられる膜を介して実施される。
【０１５６】
特定の実施形態において、核酸増幅チャンバーは、熱サイクルリアクターまたは熱サイクルチャンバーである。熱サイクルチャンバーの底部は、例えば、ポリスチレンの薄層であり得る。熱サイクルチャンバーの底部は、熱サイクリング間に、マイクロ流体デバイスの本体上または本体内に配置されていない（例えば、本体外部の）ヒーターにより加熱することができる。
【０１５７】
別の実施形態において、核酸増幅（例えば、ＰＣＲ）リアクターは、マイクロ流体デバイス本体の基板内において、弱溶剤接着法または弱溶剤積層法（参照によりその全体において本明細書に組込まれる、ＵＳ２００６／００７８４７０）を用いることによるポリスチレン薄膜により提供される（３方を壁で囲まれた）チャネル構造を格納することにより作製される。弱溶剤接着の使用は、その中に配置されるマイクロフィーチャの完全性および信頼性を保つ一方で、このような適用におけるポリスチレンの使用を可能として有利である。
【０１５８】
薄膜は、非常に低い熱抵抗を提供し、このために、迅速な熱サイクルを可能とする。該膜はまた可撓性でもあり、ヒーターとの優れた接触を可能とする。チャンバーは、オンチップの弁およびポンプにより、単一または複数の試薬流入リザーバーおよび単一または複数の流出リザーバーに流体的に連結される。
【０１５９】
別の実施形態において、核酸増幅リアクターは、マイクロ流体デバイス本体において形成される円形、矩形、四角形、または他の開口部形状に弱溶剤積層法を用いてポリスチレン薄膜を積層させることにより作製される。壁で囲まれた基板開口部と該開口部の底部に隣接する膜との間に形成される増幅リアクターにより、周囲圧力条件下の高温における増幅反応の実行が可能となる。
【０１６０】
マイクロ流体デバイス上に接着された膜を用いて、核酸増幅、例えば、迅速ＰＣＲ熱サイクリング用リアクターを提供することができる。薄膜は、システムの断熱性を低減するため、核酸増幅リアクターの底部として与えることができる。
【０１６１】
核酸増幅は、熱サイクルを必要とする。このサイクルは、リアクター内の試薬へおよびここからの熱の伝導を必要とする。一部の実施形態において、マイクロ流体デバイス本体および核酸増幅は、熱伝導性が低いポリスチレン（ＰＳ）から作製される。リアクター内における流体の温度を迅速に変化させるためには、ＰＳ材料の薄層が好ましい。マイクロ流体デバイスの通常の製作時には、熱サイクルリアクターの底部をシールする２５μｍ厚の膜が装備される。
【０１６２】
マイクロ流体デバイスはまた、コントローラのマニホールド上に配置すると、電極に接触し、熱サイクリング用のヒーターに電力を供給しうる、抵抗ヒーターをデバイス上に組込むこともできる。
【０１６３】
核酸増幅の場合、コントローラのマニホールド上のヒーターがこの膜に対して配置され、リアクターを加熱および冷却する熱抵抗の低い経路を提供する。
【０１６４】
別の実施形態において、加熱エレメントは、分子増幅リアクターを格納するポリスチレン膜と直接に接触する増幅リアクターの下方に配置することができる。代替的に、ヒーターとリアクター底部膜との間に、熱伝導性材料を配置することもできる。核酸増幅リアクターの各態様に応じ、リアクターは、数分の一マイクロリットル〜数十マイクロリットルの範囲の容量を有して有利である。
【０１６５】
別の実施形態において、核酸増幅リアクターは、クランプによる支持を受けることで、チャンバーの底部と、チャンバーの底部を画定する膜に対して配置されるヒーターとの間の接触を確保することができる。クランプはまた、リアクターの上部壁面に対する支持体としても作用し、変形を最小化することが可能である。
【０１６６】
前述のヒーターは、従来の表面実装電子抵抗器、薄膜ヒーター、赤外線送出器、ラジオ周波数、または他の既知のマイクロヒーターなど各種のものでありうる。一実施形態において、ヒーターは、１つまたは複数の抵抗温度検出器（ＲＴＤ）を含みうる。ある態様では、２つのＲＴＤを加熱に用い、１つを温度感知に用いることができる。代替的に、単一のＲＴＤを加熱および温度感知に用いることで、より小さな形状因子をもたらすこともできる。１つまたは複数のＲＴＤは、チップに内に組込むことで、リアクターの基底部を形成することができる。ヒーターは、条件文制御または他の既知の制御法により制御することができる。ある有利な態様では、ＲＴＤと共にフィードバック制御を用いて、核酸増幅の設定点温度に達したことを確認する。
【０１６７】
一実施形態では、抵抗温度検出器（ＲＴＤ）を、核酸増幅リアクターを熱サイクリングさせる温度センサーおよび抵抗ヒーターとして用いることができる。ＲＴＤは当技術分野でよく知られており、市販されている（コネチカット州、スタンフォード、Ｏｍｅｇａ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ社製）。ＲＴＤは、抵抗−温度間における既知の一次微分関係による高精度の抵抗器である。したがって、抵抗の変化を測定することにより、温度の変化を測定することができる。これらのセンサーは、巻線または沈着薄膜としての白金から作製されることが典型的であり、１００オームの公称抵抗を有する。ＲＴＤの構築は基本的に抵抗器の構築なので、このように用いることができる。当技術分野でよく知られる適切な回路設計により、単一のＲＴＤを用い、加熱モードと感知モードとを切り替えることができる。代替的に、一部が専用ヒーターとして作動し、その他が専用センサーとして作動するＲＴＤの組合せを用いることもできる。これらの構築により、コンパクトな加熱および温度感知の解決策がもたらされる。
【０１６８】
本発明のマイクロ流体デバイスと共に、当技術分野で知られる任意の核酸増幅プロトコールを用いることができる。
【０１６９】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素（ＲＴ−）ＰＣＲ、ｃＤＮＡ末端迅速増幅（ＲＡＣＥ）、ローリングサイクル増幅、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写物媒介増幅（ＴＭＡ）、およびリガーゼ連鎖反応を含むがこれらに限定されない、当技術分野で知られる核酸増幅プロトコールを、本発明のマイクロ流体デバイス及び方法を伴う使用に適合させることができる。
【０１７０】
マイクロ流体デバイス上では、複数の異なる反応を含むプロトコールを組み合わせて実行することができる。
【０１７１】
例えば、試料調製領域および核酸増幅領域の２つの機能領域を有する、図８〜１１および１２〜１６に示すデバイス上において、オンチップのＤＮＡ抽出／ＰＣＲプロトコールを実行することができる。図１１は、図１０に示すマイクロ流体デバイス内における、「細胞」、「エタノール」、「ミキサー」、「廃棄物」、「溶出」、「ＮＡ１」、「ＮＡ２」、「ＡＷ１」、「ＡＷ２」と称する複数の試薬リザーバーの例示的な配置（配置図）を示す。この実施形態によれば、「細胞」は懸濁した細胞およびプロテイナーゼＫを保有し、「ミキサー」は緩衝液ＡＬを保有し、「エタノール」はエタノールを保有し、「ＡＷ１」は洗浄緩衝液ＡＷ１を保有し、「ＡＷ２」は洗浄緩衝液ＡＷ２を保有し、「溶出」は溶出緩衝液ＡＥを保有し、「ＮＡ１」は核酸リザーバー１であり、「ＮＡ２」は核酸リザーバー２であり、「増幅マスター混合物」は増幅マスター混合物リザーバーであり、「単位複製配列流出１」は増幅流出リザーバー１であり、「単位複製配列流出２」は増幅流出リザーバー２であり、「廃棄物」は廃棄物リザーバーである。オフチップ解析ゾーンへの「単位複製配列１流出口」および「単位複製配列２流出口」のほか、増幅リアクターもまた示される。一実施形態において、オンチップのＤＮＡ抽出／ＰＣＲプロトコールは、以下の通りに実行することができる：
１．すべての溶液をそれぞれのリザーバーに添加する；
２．「細胞」−「ミキサー」間で細胞を複数回（例えば、１０分間にわたり５回）循環させて細胞を溶解し、「ミキサー」内に残存する最終流過物と混合する；
３．「エタノール」から「ミキサー」へとエタノールを送出する；
４．「ミキサー」内でエタノール／細胞溶液を混合する；
５．溶解した細胞溶液を、精製媒体を介して「廃棄物」へと送出する（例示的な態様によれば、精製媒体はシリカ膜を含む）；
６．洗浄緩衝液ＡＷ１を、精製媒体を介して「廃棄物」へと送出する；
７．洗浄緩衝液ＡＷ２を、精製媒体を介して「廃棄物」へと送出する；
８．精製媒体上に吸収されたアルコールを除去する（これは、精製媒体を介して空気を引き込む、コントローラに装備されたポンプにより達成することができる）；
９．乾燥ポンプを停止させる；
１０．溶出緩衝液ＡＥを、「溶出」から精製媒体（膜）を介して「ＮＡ１」へと送出する；
１１．溶出緩衝液ＡＥを、「溶出」から精製媒体（膜）を介して「ＮＡ２」へと送出する；
１２．増幅試薬を、増幅マスター混合リザーバーから「ＮＡ２」へと送出する；
１３．増幅混合物を、「ＮＡ２」から核酸増幅リアクターを介して「単位複製配列流出１」へと送出する；
１４．核酸増幅リアクター内において、残りの増幅混合物を熱サイクリングする；
１５．増幅産物を、増幅リアクターから「単位複製配列流出２」へと送出する；
１６．増幅産物を、「単位複製配列流出２」から核酸解析領域へと送出して検出する。
【０１７２】
５．４ 核酸解析領域および解析法
マイクロ流体デバイスは、核酸解析領域を含みうる。核酸解析領域では、核酸増幅反応から結果として得られる単位複製配列を検出することができる。核酸解析領域には、当技術分野で知られる任意の単位複製配列検出アッセイを容易に適合させることができる。核酸精製領域、核酸増幅領域、および核酸解析領域の各々は、少なくとも１つの流体流路により、他の２つの領域の少なくとも１つと流体的に相互連結することができる。
【０１７３】
別の実施形態において、マイクロ流体デバイスは、試料調製領域および核酸増幅領域を含みうるが、本体上の核酸解析領域を欠く場合がある。代わりに、核酸の検出は、マイクロ流体デバイスとは別の領域において（または検出器により）実施することができる（図８〜１６）。
【０１７４】
核酸解析領域を含むマイクロ流体デバイスの実施形態において、核酸解析領域は、検出アッセイが実行されるリアクター（リザーバー）または反応領域と、以下：ハイブリダイゼーション緩衝液、高厳密性の洗浄緩衝液、低厳密性の洗浄緩衝液、またはコンジュゲーション基質のいずれかのための１つまたは複数のリザーバーを含みうる。
【０１７５】
一実施形態において、核酸解析領域は、対象核酸と対象核酸のプローブとの間の相互作用を検出するための領域を含む。
【０１７６】
本発明は、対象核酸の検出法を提供する。一実施形態では、対象核酸を含有することが疑われる試料を得る。マイクロ流体デバイスの試料調製領域に試料を導入し、核酸増幅用に調製する。調製された試料を核酸増幅リアクターに導入し、核酸増幅領域において核酸増幅反応を実行して対象核酸を増幅する。次いで、増幅された対象核酸を核酸解析領域に導入し、増幅された対象核酸を検出する。検出するステップは、増幅された対象核酸と対象核酸のプローブとの間の相互作用を検出するステップ、例えば、当技術分野で知られる標準的な方法を用いる核酸ハイブリダイゼーションを検出するステップなど、評価項目検出アッセイを実施するステップを含みうる。
【０１７７】
一実施形態において、検出するステップは、色強度、蛍光強度、電気信号強度、または化学発光強度を可視化するステップを含みうる。
【０１７８】
別の実施形態において、検出するステップは、試料中における少なくとも１種の対象分子に対応する強度値を発生させるステップを含みうる。
【０１７９】
別の実施形態において、強度値は、色強度値、蛍光強度値および化学発光強度値、電流または電圧からなる群から選択しうる。
【０１８０】
別の実施形態において、色強度値を発生させるステップは、試料に対応する画像を解析またはデジタル化して複数の画素を発生させるステップと、複数の画素の各々に対して複数の数値を与えるステップと、数値を生じさせて色強度値を提供するステップと
を含みうる。
【０１８１】
別の実施形態では、閾値を計算し、色強度値を閾値と比較して対象分子を検出することができる。
【０１８２】
別の実施形態では、少なくとも１つの色強度値と閾値とをデータベースに保存することができる。閾値は、少なくとも１種の陰性対照試料を用いて計算することができる。
【０１８３】
被験体における対象の疾患または障害の存在または素因を判定する方法もまた提供される。一実施形態において、該方法は、
ａ）対象の疾患または障害と関連する核酸を含有することが疑われる試料を被験体から得るステップと、
ｂ）試料中における対象の疾患または障害と関連する核酸を検出するステップと
を含むことができ、該検出するステップは、
対象核酸を含有することが疑われる試料を得るステップと、
本発明のマイクロ流体デバイスを用意するステップと、
試料調製領域に試料を導入するステップと、
核酸増幅用に試料を調製するステップと、
調製された試料を核酸増幅領域に導入するステップと、
核酸増幅領域において核酸増幅反応を実行して対象核酸を増幅するステップと、
増幅された対象核酸を核酸解析領域に導入するステップと、
増幅された対象核酸を検出するステップと
を含み、増幅された対象核酸の検出が、対象の疾患または障害の存在または素因と関連する。
【０１８４】
検出するステップは、増幅された対象核酸の量（またはレベル）を決定するステップを含み、ここで、該方法は、該量（またはレベル）を対象核酸のあらかじめ選択された量（またはレベル）と比較するステップをさらに含む。一実施形態において、該量（またはレベル）とあらかじめ選択された量（またはレベル）との間の差は、対象の疾患または障害の存在または素因を示す。
【０１８５】
核酸解析領域内で実施しうる核酸検出法は、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、ｉｎ ｓｉｔｕにおける結果の視覚化、電気化学的検出など、当技術分野でよく知られる方法を含みうるがこれらに限定されない。
【０１８６】
特定の実施形態において、核酸解析領域は、リバースドットブロットアッセイを実施して、単位複製配列を検出するための反応チャンバーまたは反応領域を含みうる。このようなアッセイは当技術分野でよく知られている。核酸解析領域はまた、リバースドットブロットアッセイにおける相互反応を検出する、例えば、リバースドットブロット基質またはリバースドットブロット挿入物上における相互反応を検出するための領域を含みうる。代替的に、該基質または挿入物は、マイクロ流体デバイスから取り外して、別のリーダーまたは検出器内に挿入することもできる。
【０１８７】
一実施形態において、核酸解析領域は、リザーバー内に取り付けられ、フィルター下部にフリットを有する、ＲＤＢフィルターを含みうる。リザーバーは、ヒーターを伴うかまたは伴わずに取り付けることができ、能動的な送出のためのより大型のダイアフラムを有しうる。ハイブリダイゼーション緩衝液と混合され、ＲＤＢフィルターを介してフィルターに垂直な方向に送出された単位複製配列が、核酸増幅リアクターから直接に送達されうる。
【０１８８】
フリットを用いて、混合物がＲＤＢフィルターを均一に流過するように保つことができる。ハイブリダイズした単位複製配列に後ほどコンジュゲートを結合させて活性化させ、市販の自動リーダーにより検出するかまたは読み取ることができる。
【０１８９】
大型のダイアフラムを用いて、混合物を「フラッフィング」（すなわち、静かな機械的撹拌による）し、核酸解析領域におけるより迅速な核酸ハイブリダイゼーションを促進することができる。
【０１９０】
標準的なベンチトップ手順では、スポットされた膜をプラスチックバッグおよびまたはチューブ内に配置し、次いで、これを温度制御された水浴中に入れて用いる。ベンチトップ手順を補完するためにいくつかのデバイスが作製されており、これらのデバイスでは、ゴム製ガスケット付きの金属、プラスチック、またはガラス製大型マニホールドを用いて、膜を介する流動を供給している。これらの設計では、シーリングクッションまたはガスケットを有する固体支持体を用いる。有孔の金属プレートもまた、構造を支持し、流体にブロット膜を自由に流過させるのに用いられている。
【０１９１】
Ｉｍｍｕｎｅｔｉｃｓ社製のＭｉｎｉＳｌｏｔ（登録商標）＆ Ｍｉｎｉｂｌｏｔｔｅｒ（登録商標）システムは、並行するマイクロチャネルと、これを支持する底部プレートとの間で膜を挟み込む「シーリングクッション」を用いる。特定の実施形態において、Ｉｍｍｕｎｅｔｉｃｓ社製システムなど、当技術分野で知られる２つのシステムを用いて、互いに垂直であり、このため、グリッド様パターンを創出する、２つの流動方向を創出することができる。
【０１９２】
ＲＤＢ流動の設計は、小領域内におけるスポットアレイ用に設計することができる（図４０〜４１）。膜の下方には、多孔性の固体支持体を用いることができる。膜は、リザーバーの周囲だけに接着され、これにより、膜を介する流体の流動に対する干渉が回避される一方、また、膜の周囲を介する流体の流動も防止される。ＲＤＢリザーバーへと／から流体を送出するのに用いられる弁は大型で、圧力の急激な変化を受ける。大量の流体の流動は、面取り層により均一に分配され、多孔性の固体支持体により媒介される。多孔性の固体支持体は、流体に膜をゆっくりと流過させるだけでなく、膜を介して流動を均一に分配するのにも用いられる（図４０）。膜はリザーバーの周囲に固定される（図４１）。面取り層を小孔で置き換えることもできるが、この代替法は、小孔のサイズおよび位置に基づく最適化を必要とする。面取り貫通孔により、圧力が膜全体に均一に分配され、ほとんど〜まったく最適化を必要としない。多孔性の固体支持体はまた、送出および「フラッフィング」時における膜の大きなたわみも防止する。膜を介する流体の流動により、固定化されたオリゴヌクレオチドと、溶液中の標的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションが増大する。流動は、ハイブリダイゼーション工程を通じて拡散に制約されず、このため、ハイブリダイゼーション反応は迅速に進行する。
【０１９３】
５．５ マイクロ流体デバイスのさらなる構成要素および配置
マイクロ流体デバイスは、マイクロ流体デバイスの内部または外部に位置し、マイクロ流体デバイスまたはマイクロ流体デバイス上の特定の領域に作動的に連結される差圧送達システム、例えば、コントローラをさらに含みうる。一実施形態では、ＵＳ２００７／０１６６１９９Ａ１（参照により本明細書に組込まれるＺｈｏｕら、２００８年７月１９日）において開示されるコントローラを用いることができる。該コントローラは、一方が陽圧であり、他方が陰圧である、２つの圧力供給源を装備しうる。弁をシールするのに陽圧を用いうる一方、ダイアフラムを開くのには陰圧を用いうる。該配置により、ポンプ内における流体圧が弁よりも高圧とならず、弁による漏れが防止される。一態様において、コントローラ上におけるソレノイドマニホールドは、３つの圧力容器を含有しうる。この配置により、ソレノイド間における「クロストーク」を防止し、弁に供給される圧力が、近接する制御ソレノイドの変化に関わらず不変を保つ状態がもたらされる。
【０１９４】
コントローラは、例えば、複数の開口部を有する空気圧マニホールドと、開口部の各々からマイクロ流体デバイス（「チップ」）内における複数の圧力作動膜（ダイアフラム）へと空気圧信号を送るためのチャネルがその中に配置された、チップマニホールドとを含みうる（米国特許公開第ＵＳ２００７／０１６６１９９Ａ１号（Ｚｈｏｕら、２００８年７月１９日）を参照されたい）。チップ駆動マニホールド内のチャネルは、マイクロ流体チップ内における複数の圧力作動膜の構成に符合する空気圧信号を送ることが可能である。空気圧信号をマイクロ流体チップ内における少なくとも１つの信号回路に送り、該信号回路に連結された少なくとも１つのセンサーを作動させることができる。チップ駆動マニホールドは、空気圧マニホールドの単一の開口部から、マイクロ流体チップ内における複数の圧力作動膜へと空気圧信号を送るための、少なくとも１つのチャネルまたは一連のチャネルを含みうる。（１つまたは複数の）チャネルにより、該開口部からの空気圧信号が、単一のチャネルから分枝するチャネルネットワークへと送られる。単一のチャネルから分枝するチャネルネットワークにより、空気圧信号が、複数の圧力作動膜の各々へと送られる。
【０１９５】
他の実施形態において、マイクロ流体デバイスは、コントローラのマニホールド上に配置される、真空、圧力、電気、および光の入力／出力のための連結手段を含みうる。このような連結手段は、当技術分野でよく知られている。
【０１９６】
一実施形態において、通気口を備えたカバープレートを、試薬リザーバーの上部に固定的に配置することで、環境からの潜在的な汚染を防止することができる。
【０１９７】
本明細書に記載の実施形態によれば、自動的な試料の調製／精製および増幅を可能とする構造および工程が、単一のマイクロ流体デバイスプラットフォーム上に統合される。手作業による投入は不要である。
【０１９８】
５．６ 差圧送達供給源およびマイクロ流体デバイス上における流体の送出
マイクロ流体デバイスは、機械通気ポンプまたは一連の通気ポンプなどの差圧送達供給源を含む場合もあり、これに連結される場合もある。
【０１９９】
広範に異なる溶液（すなわち、一実施形態における粘稠性または非粘稠性の溶液を送出する際の問題を克服するため、シリカ膜など、特定のマイクロ流体エレメントの「上流」または「下流」にポンプを配置し、いずれのポンプもこのようなマイクロ流体エレメントを介して最良の形で流体を送出するように作動させることができる。これらの各々をマイクロ流体デバイス上で一体に統合することで、同じ膜を介して粘稠性および非粘稠性の流体を送出する可変圧力を供給することができる。別個の通気ポンプもまた、核酸増幅領域への核酸の溶出前に膜を乾燥させるのに十分な気流を供給しうる。
【０２００】
オンチップのポンプは、二段式ポンプを創出しうる。一実施形態において、高粘稠度の流体には膜の下流にあるポンプを用い、膜を介してこれを吸引することができ、低粘稠度の流体には膜の上流にあるポンプを用い、膜を介してこれを押出すことができる一方、乾燥工程では、別個の通気ポンプを用い、開いた弁および膜を介して空気を持続的に吸引することができる。オンチップのポンプはまた、生物学的試料および洗浄緩衝液／試薬を別個の場所（例えば、マイクロ流体デバイス上の廃棄物リザーバー）に送出するのにも用いることができ、膜を通気乾燥する際、通気ポンプが試料または試薬を引き込まないように弁を閉じることができる。これは、生物学的に感受性の試料に対する重要な考慮点でありうる。
【０２０１】
５．７ オンチップにおける流体の混合
２種以上の個別の流体を迅速に混合する能力は、流体システムの共通の特徴である。一実施形態において、マイクロ流体デバイスは、試薬リザーバー下方のダイアフラムが流体を下方へと引き下ろし、次いで、ノズルを介して流体を上方へと押し上げることでこのようなリザーバーの底部からパルスジェットを発生させ、該リザーバー内で流体を混合するのに用いうる、リザーバーの下方に作製される小型のノズル構造を含むことができる。これは、反応混合物の「フラッフィング」に用いることができる。このようなフラッフィングを用いて、例えば、試薬リザーバー内において、より大きな容量および異なる粘稠度の溶液を混合することができる。
【０２０２】
一実施形態において、フラッフィングは、マイクロ流体デバイス上のリザーバー下方の大型ダイアフラムを用い、リザーバー底部のノズルを介して流体を反転送出することで固有の混合流動パターンを提供することにより達成することができる。一実施形態では、ノズルおよびリザーバーにより創出される流動方式をミキサーとして用いることができる（図１７）。デバイス上にはダイアフラムが装備される。このダイアフラムには、流動チャネルおよび貫通ポートが取り付けられる。貫通孔の上部には、リザーバーが装備される。ダイアフラムが作動し、リザーバーが十分に満たされているときは、流体のジェットがリザーバー内に含有される流体を上方へと貫通する。ダイアフラムが格納されているときは、流体が該ポートを介してリザーバーから下方へと吸引される。次いで、ダイアフラムが反転されるときは、流体ジェットがリザーバー内へと大量に流入するものの、その後の逆流により流体はリザーバー底部から引き戻される。これにより、混合の有効な手段が与えられる。
【０２０３】
５．８ 多重ヒーターの条件付き同期化
１つの測定器を用いるコンポーネントサブシステムを共有する多重マイクロ流体デバイスを作動させるために、多重ヒーターを用いることができる。そのすべてがコンポーネントサブシステムを共有する多重マイクロ流体デバイスを作動させる場合、すべてのデバイスが同時にサイクリングを終了することが望ましい。これを実行するためには、熱サイクリングを同期させなければならない。一実施形態において、これは、温度設定点をセンサーからの温度測定値と比較する制御ソフトウェアにおける条件付き論理文を用いて達成することができる。
【０２０４】
各ヒーターは、他のヒーターと同じである場合もあり、同じでない場合もある、特定の温度に設定することができる。次いで、使用者は、所望の条件が満たされるまでは制御ソフトウェアにループを実行させる条件文を容易に作成することができる。このループは、単純な時間の遅延、またはヒーター温度が設定点まで移動する間に実行すべき他のコマンドを含有しうる。該条件が満たされると、プログラムが続行され、次のコマンドが実行される。
【０２０５】
５．９ マイクロ流体デバイスへの対流熱伝導
本発明のマイクロ流体システムの特定の実施形態において、デバイスは、取り外し可能であり、ディスポーザブルである。これらの実施形態では、加熱エレメントがデバイスに直接には接触しない加熱システムを用いることができる。これにより、デバイス／マニホールド間の接触面が簡素化される。デバイスから加熱エレメントが除去される場合も、やはり、必要とされる領域に熱を伝導させなければならない。強制対流を用いることにより、加工されたチャネルまたはチューブを介して、オフチップのヒーターからデバイスの所与の領域へと熱を伝導させることができる。ヒーターおよび該接触面の両方に対する設計上の制約が簡素化される。
【０２０６】
抵抗エレメントをチューブ内に配置し、流体にこのチューブ内を流動させることにより、流体を加熱することができる。温度感知エレメントを流体蒸気中に配置することで、温度を測定し、この値を制御システムにフィードバックする。次いで、チャネルおよびポートを介して、加熱された流体を、加熱を要するデバイスの領域へと送ることができる。
【０２０７】
５．１０ 誘導加熱
本発明の別の実施形態では、デバイス上における加熱操作（例えば、ＰＣＲ熱サイクリングまたはＲＤＢ）に、誘導ヒーターを用いることができる。この適用における誘導ヒーターの大きな利点は、加熱の局在化、熱伝導の効率、およびマイクロ流体デバイスへの直接の接続の欠如（すなわち、マイクロ流体デバイスへの電気的接触が不要である）である。
【０２０８】
５．１１ 空気圧冷却
ＮＡ増幅反応時において、熱サイクリングに用いられるヒーターは迅速に冷却されなければならない。冷却は、当技術分野で知られる任意の対流冷却エレメントまたは空気圧冷却エレメントにより達成することができる。例えば、小型の通気ポンプ出力からのチューブを用いて、ヒーターを冷却することができる。ＰＣＲ操作温度は５０〜１００℃なので、空気圧冷却は、２５℃の室温で作用する。加熱エレメントと、ヒーターと接触する空気との間の温度差が大きいほど、該エレメントは迅速に冷却される。ヒートシンクまたは熱電式冷却器をシステムに接続することにより、その効果を増大させることができる。
【０２０９】
５．１２ 核酸
特定の実施形態において、本発明は、対象の核酸分子（本明細書ではまた、「対象核酸」、「標的核酸」、「標的ポリヌクレオチド」とも称する）を増幅および／または単離する方法を提供する。単離核酸分子（または「単離核酸」）とは、該核酸分子の天然の供給源に存在する他の核酸分子から分離された核酸分子（または「核酸」）である。「単離」核酸は、該核酸がそこに由来する生物のゲノムＤＮＡ内において、該核酸に天然の形で隣接する核酸配列（すなわち、該核酸の５’端および３’端に位置する配列）（例えば、タンパク質をコードする配列）を含有しない。他の実施形態において、単離核酸は、イントロン配列を含有しない。
【０２１０】
「対象核酸」、「標的核酸」、「標的ポリヌクレオチド」とは、特定の対象ポリヌクレオチド配列の分子を指す。本発明の方法により解析しうる対象核酸は、ゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、およびオリゴヌクレオチド、発現配列タグ（「ＥＳＴ」）、配列タグ部位（「ＳＴＳ」）などを含むこれらのフラグメントなどのＤＮＡ分子を含むがこれらに限定されない。本発明の方法により解析しうる対象核酸はまた、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）分子、ｃＲＮＡ（すなわち、ｉｎ ｖｉｖｏで転写される、ｃＤＮＡ分子から調製されるＲＮＡ分子）などであるがこれらに決して限定されないＲＮＡ分子も含む。各種の実施形態において、単離核酸分子は、該核酸がそこに由来する細胞のゲノムＤＮＡ内において、該核酸分子に天然の形で隣接する核酸配列の約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、または０．１ｋｂ未満を含有しうる。さらに、ｃＤＮＡ分子などの単離核酸分子は、他の細胞物質、組換え法により作製される場合の培地、または化学的に合成される場合の化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含有しないことが可能である。
【０２１１】
対象核酸は、ＤＮＡもしくはＲＮＡまたはそのキメラ混合物もしくは誘導体もしくは修飾形でありうる。核酸は、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格において修飾可能であり、他の付属の基または標識を含みうる。
【０２１２】
例えば、一部の実施形態において、核酸は、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルキュエオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルキュエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、キュエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンを含むがこれらに限定されない群から選択される、少なくとも１つの修飾塩基部分を含みうる。
【０２１３】
別の実施形態において、核酸は、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロース、およびヘキソースを含むがこれらに限定されない群から選択される、少なくとも１つの修飾糖部分を含みうる。
【０２１４】
さらに別の実施形態において、核酸は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミドチオエート、ホスホルアミデート、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、およびホルムアセタール、またはこれらの類似体を含むがこれらに限定されない群から選択される、少なくとも１つの修飾リン酸骨格を含みうる。
【０２１５】
プライマー、プローブ、または鋳型として用いられる核酸は、市販品を購入することもでき、当技術分野で知られる標準的な方法により、例えば、自動ＤＮＡ合成器（カリフォルニア州、ナバト、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社；カリフォルニア州、フォスターシティー、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から市販される合成器など）および標準的なホスホルアミド化学反応の使用によるか、または非特異的な核酸切断用の化学物質もしくは酵素または部位特異的な制限エンドヌクレアーゼを用いるより大型の核酸フラグメントの切断により誘導することもできる。
【０２１６】
１つの動物種に由来する対象核酸の配列が知られ、別の動物種に由来する対応の遺伝子が所望される場合、当技術分野では、既知の配列に基づいてプローブを設計することが日常的である。該プローブは、それに由来する配列が所望される動物種に由来する核酸にハイブリダイズし、これは、例えば、対象動物種に由来するゲノムライブラリーまたはＤＮＡライブラリーに由来する核酸に対するハイブリダイゼーションである。
【０２１７】
一実施形態では、増幅されて単離された対象核酸と相補的であるか、または中程度に厳密な条件下でこれとハイブリダイズ可能な核酸分子が、プローブとして用いられる。
【０２１８】
別の実施形態では、増幅された対象核酸と中程度に厳密な条件下でハイブリダイズするか、またはこれと少なくとも９５％相補的な核酸分子が、プローブとして用いられる。
【０２１９】
別の実施形態では、対象のヌクレオチド配列またはその相補体と少なくとも４５％（または５５％、６５％、７５％、８５％、９５％、９８％、もしくは９９％）同一な核酸分子が、プローブとして用いられる。
【０２２０】
別の実施形態では、対象核酸またはその相補体のうち、少なくとも２５（５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、８００、９００、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、２０００、２４００、２６００、２８００、３０００、３２００、３４００、３６００、３８００、または４０００）ヌクレオチドのフラグメントを含む核酸分子が、プローブとして用いられる。
【０２２１】
別の実施形態では、対象のヌクレオチド配列を有する増幅された核酸分子またはその相補体と中程度に厳密な条件下でハイブリダイズする核酸分子が、プローブとして用いられる。他の実施形態では、少なくとも２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、８００、９００、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、２０００、２２００、２４００、２６００、２８００、３０００、３２００、３４００、３６００、３８００、または４０００ヌクレオチドの長さでありえ、対象の増幅された核酸分子またはその相補体と中程度に厳密な条件下でハイブリダイズしうる核酸分子が、プローブとして用いられる。
【０２２２】
増幅された対象核酸を検出するためのプローブ（または鋳型）として用いうる核酸は、当技術分野で知られる任意の方法により、例えば、プラスミドから、対象ヌクレオチド配列の３’端および５’とハイブリダイズ可能な合成プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、かつ／または該ヌクレオチド配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いるｃＤＮＡライブラリーもしくはゲノムライブラリーからクローニングすることにより得ることができる。ゲノムクローンは、適切なハイブリダイゼーション条件下、例えば、プローブされるゲノムＤＮＡに対するプローブの類縁性に応じて、高度に厳密な条件下、低度に厳密な条件下、または中程度に厳密な条件下において、ゲノムＤＮＡライブラリーをプローブすることにより同定することができる。例えば、対象のヌクレオチド配列に対するプローブとゲノムＤＮＡとが同じ動物種に由来する場合は高度に厳密なハイブリダイゼーション条件を用いることができるが、該プローブとゲノムＤＮＡとが異なる動物種に由来する場合は低度に厳密なハイブリダイゼーション条件を用いることができる。高度、低度、および中程度に厳密な条件は、当技術分野でよく知られている。
【０２２３】
増幅された対象核酸は、当技術分野で知られる標準的な方法を用いて、検出可能な形で標識することができる。
【０２２４】
検出可能な標識は、例えば、ヌクレオチド類似体の組込みによる蛍光標識でありうる。本発明での使用に適する他の標識は、ビオチン、イミノビオチン、抗原、補因子、ジニトロフェノール、リポ酸、オレフィン化合物、検出可能なポリペプチド、電子に富む分子、基質上における作用により検出可能なシグナルを発生させることが可能な酵素、および放射性同位体を含むがこれらに限定されない。好ましい放射性同位体は、少数を挙げれば、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃ、１５Ｎ、および１２５Ｉを含む。本発明に適する蛍光分子は、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、テキサスレッド、５’−カルボキシ−フルオレセイン（「ＦＭＡ」）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシ−フルオレセイン（「ＪＯＥ」）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシ−ローダミン（「ＴＡＭＲＡ」）、６’−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（「ＲＯＸ」）、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＩＲＤ４０、およびＩＲＤ４１を含むがこれらに限定されない。本発明に適する蛍光分子は、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、およびＦｌｕｏｒＸを含むがこれらに限定されないシアミン色素；ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ−６３０／６５０、およびＢＯＤＩＰＹ−６５０／６７０を含むがこれらに限定されないＢＯＤＩＰＹ色素；ならびにＡＬＥＸＡ−４８８、ＡＬＥＸＡ−５３２、ＡＬＥＸＡ−５４６、ＡＬＥＸＡ−５６８、およびＡＬＥＸＡ−５９４を含むがこれらに限定されないＡＬＥＸＡ色素のほか；当業者に知られる他の蛍光色素をさらに含む。本発明に適する、電子に富む指示分子は、アフェリチン、ヘモシアニン、および金コロイドを含むがこれらに限定されない。代替的に、増幅された対象核酸（標的ポリヌクレオチド）は、第１の基をそれに対して特異的に複合体化させることに標識することができる。指示分子に共有結合し、第１の基に対する親和性を有する第二の基を用いて、標的ポリヌクレオチドを間接的に検出することができる。このような実施形態において、第１の基としての使用に適する化合物は、ビオチンおよびイミノビオチンを含むがこれらに限定されない。
【０２２５】
１種または複数種のプローブと相補的な配列を有するポリヌクレオチド分子が該プローブにハイブリダイズする条件下で、本発明の方法により増幅および解析される（例えば、検出される）対象核酸を、該プローブに接触させることができる。本明細書で用いられる「プローブ」とは、該プローブに対する標的ポリヌクレオチド分子のハイブリダイゼーションが検出されるように、特定の配列（一般には、プローブ配列に相補的な配列）を有する対象の核酸分子がそれに対してハイブリダイズすることが可能な、特定の配列のポリヌクレオチド分子を指す。プローブのポリヌクレオチド配列は、例えば、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、またはＤＮＡおよびＲＮＡのコポリマー配列でありうる。例えば、プローブのポリヌクレオチド配列は、細胞から抽出されたゲノムＤＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列、ｍＲＮＡ配列、またはｃＲＮＡ配列の完全であるかまたは部分的な配列でありうる。プローブのポリヌクレオチド配列はまた、例えば、当業者に知られるオリゴヌクレオチド合成法によっても合成することができる。プローブ配列はまた、ｉｎ ｖｉｖｏで酵素的に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで酵素的に（例えば、ＰＣＲにより）、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで非酵素的に合成することもできる。
【０２２６】
本発明の方法において用いられるプローブは、該１種または複数種のプローブおよびこれらに結合するかまたはハイブリダイズした任意のポリヌクレオチド配列を除去することなく、該１種または複数種のプローブにハイブリダイズしないかまたは結合しないポリヌクレオチド配列を洗浄して除去することができるよう、固体の支持体または表面に固定化されることが好ましい。プローブを固体の支持体または表面に固定化する方法は、当技術分野でよく知られている。具体的な一実施形態において、プローブは、ガラス表面、またはナイロン膜もしくはニトロセルロース膜など、固体（または半固体）の支持体または表面に結合した、異なるポリヌクレオチド配列のアレイを含む。該アレイは、該支持体または表面上におけるその位置から特定のプローブの実体を決定しうるように、異なる各プローブが該支持体または表面上における既知の特定の位置に配置される、アドレス可能なアレイである。特定の実施形態では、第６．１０節に記載の方法を用いて、固体の支持体または表面に核酸プローブを固定化することができる。
【０２２７】
本発明で用いられるプローブは任意の種類のポリヌクレオチドを含みうるが、好ましい実施形態において、プローブは、オリゴヌクレオチド配列（すなわち、約４〜約２００塩基の長さであり、より好ましくは、約１５〜約１５０塩基の長さであるポリヌクレオチド配列）を含む。一実施形態では、約４〜約４０塩基の長さであり、より好ましくは、約１５〜約３０塩基の長さの、より短いオリゴヌクレオチド配列が用いられる。しかし、本発明のより好ましい実施形態では、約４０〜約８０塩基の長さの、より長いオリゴヌクレオチドプローブが用いられ、約５０〜約７０塩基の長さのオリゴヌクレオチド配列（例えば、約６０塩基の長さのオリゴヌクレオチド配列）が特に好ましい。
【０２２８】
５．１３ キット
さらなる態様において、本発明は、以下：コントローラ、視覚化装置もしくは検出装置、１種もしくは複数種の核酸プライマー、試料調合液、核酸増幅試薬および／または核酸検出試薬もしくは核酸解析試薬、緩衝液、ならびに洗浄剤、あるいはデバイスの使用説明書の１つまたは複数を伴う、本発明のマイクロ流体デバイスを、１つまたは複数の容器内において含みうる。容器内の試薬は、任意の形態、例えば、乾燥凍結形態、または溶液形態（例えば、蒸留水または緩衝液）などでありうる。キットは、本発明の方法に従い、対象分子の検出または測定に用いることができる。キットはまた、対象分子の作製または合成にも用いることができる。
【０２２９】
キットの一部としてまたはキットの付属品として、コントローラもまた提供することができる。コントローラは、アッセイごとのベースで購入される１つまたは複数のキットと共に用いるために、使用者により既に（前もって）購入されていることが典型的である。
【０２３０】
以下の実施例は、例示を目的として示されるものであり、限定を目的とするものではない。
【実施例１】
【０２３１】
６．実施例
６．１ ３つの機能領域を有するマイクロ流体デバイスの実施形態
本実施例では、試料調製領域、核酸増幅領域、および増幅産物アッセイを実行するための領域である核酸解析領域の３つの機能領域を有するマイクロ流体デバイス（「チップ」）の実施形態（図１〜７）、ならびに該デバイスを用いる例示的な方法について説明する。
【０２３２】
図２は、図１に記載のマイクロ流体デバイスの実施形態についての等尺分解図であり、弁配置図を示す。
【０２３３】
図３Ａは、図１に記載のマイクロ流体デバイスの実施形態についての上面図であり、試料調製領域（「核酸（ＮＡ）抽出領域」）、核酸増幅領域（この実施形態では、「ＰＣＲ領域」）、および核酸解析領域（「ＲＤＢ領域」）を示す。また、デバイス上における弁、マイクロ流体チャネル、貫通孔、および低密度ＤＮＡフィルターも示される。この実施形態では、核酸解析領域において、リバースドットブロット（ＲＤＢ）評価項目検出アッセイを実施することができる。「廃棄物」：廃棄物リザーバー。
【０２３４】
図３Ｂは、図１に記載のマイクロ流体デバイスの実施形態についての上面図であり、試料調製領域１０１、核酸増幅領域１０２（核酸増幅リアクター１１２を含む）、および核酸解析領域１０３、ならびにデバイス上における弁、マイクロ流体チャネル、および貫通孔を示す。解析領域リザーバー１１３。
【０２３５】
図４は、図１に記載のマイクロ流体デバイスの実施形態についての機能配置図であり、各種のリザーバーと関連する機能およびリザーバー（例えば、試薬）を示す。Ｗ１：洗浄緩衝液１。Ｗ２：洗浄緩衝液２。ＨＢ：ハイブリダイゼーション緩衝液。ＣＢ：コンジュゲーション緩衝液。Ｓｕｂ：基質緩衝液。
【０２３６】
図５〜７は、図１に記載のマイクロ流体デバイスの操作の進行を示す略図である。点線は、試料がデバイスにより処理されるときの試料の流動を示す。図５では、室温で５〜１０分間にわたり、Ｒ１〜Ｒ２において複数回送入送出することにより、細胞を緩衝液ＡＬおよびプロテイナーゼＫと混合する。Ｒ２〜Ｒ３において複数回送入送出することにより、Ｒ２の内容物をエタノールと混合する。混合された試料は、送出によりＲ３から核酸抽出媒体を介して廃棄物リザーバーへと移送される。ＡＷ１およびＡＷ２は、送出により核酸抽出媒体を介して廃棄物リザーバーへと移送される。核酸抽出媒体は、５〜１０分間にわたり通気ポンプを作動させ、核酸抽出媒体を介して送気または吸気することにより乾燥させる。
【０２３７】
図６では、核酸抽出媒体を介して溶出緩衝液をリザーバーＮＡ１へと送出することにより、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）をリザーバーＮＡ１へと溶出させる。Ｒ８およびＲ７からＲ９へと交互に送出することにより、増幅混合物を溶出された核酸と混合する。増幅混合物を核酸と共に熱サイクルリアクターへと送出し、そこで、核酸増幅反応を実施する。
【０２３８】
図７では、１５０μｌのハイブリダイゼーション緩衝液を核酸解析（例えば、リバースドットブロットまたはＲＤＢ）リザーバーへと送出する。５分間にわたりインキュベーションを実施する。９５℃で５分間にわたり、約８〜１０μｌの増幅産物を熱変性させる。増幅産物を核酸解析（ＲＤＢ）リザーバーへと送出する。弁３２の反復的な開／閉操作である「フラッフィング」により溶液を混合する。５分間にわたり溶液をインキュベートし、その内容物を空けて廃棄する。１５０μｌの緩衝液Ｗ２をリザーバーへと送出し、１．５分間にわたりインキュベートし、これを除去して廃棄することにより、２回にわたって膜を洗浄する。１５０μｌのコンジュゲーション緩衝液を核酸解析（ＲＤＢ）リザーバーへと送出する。弁３２の反復的な開／閉操作により溶液を混合する。３分間にわたり溶液をインキュベートし、該リザーバー内容物を廃棄物リザーバーへと空ける。１５０μｌの緩衝液Ｗ１を該リザーバーへと送出し、１分間にわたりインキュベートし、該緩衝液を除去して廃棄することにより、４〜５回にわたって膜を洗浄する。１００μｌの基質を該リザーバーへと送出し、５〜１０分間にわたりインキュベートし、該リザーバー内容物を廃棄物リザーバーへと空ける。１５０μｌの緩衝液Ｗ２をリザーバーへと送出し、１．５分間にわたりインキュベートし、該緩衝液を廃棄物リザーバーへと除去することにより、２回にわたって膜を洗浄する。
【実施例２】
【０２３９】
６．２ ２つの機能領域を有するマイクロ流体デバイスの実施形態
本実施例では、２つの機能領域を有するマイクロ流体デバイス（「チップ」）の別の実施形態（図８〜１１）、およびそれを用いる方法について説明する。
【０２４０】
図８は、試料調製領域および核酸増幅領域の２つの機能領域を有するマイクロ流体デバイスの別の実施形態を示す。矢印で示す通り、試料調製領域は、試料の投入および調製、試料の精製、ならびに核酸の抽出のためのリザーバーを含む。核酸増幅領域は、核酸増幅リアクター（「増幅チャンバー」）を含む。デバイスのこの実施形態はまた、核酸増幅の完了後においてマイクロ流体デバイスから単位複製配列が抽出される領域である、核酸増幅産物抽出領域（「増幅産物抽出領域」）も含む。デバイスのこの具体的な実施形態は、５０×３８ｍｍの寸法を有する。
【０２４１】
図９は、図８に記載のマイクロ流体デバイスの等尺分解図であり、その３つの層（明確さを目的として、デバイスは、膜なしで示されている）を示す。
【０２４２】
図１０は、図８に記載のマイクロ流体デバイスの上面図であり、デバイスのリザーバー、チャネル、弁、およびポンプの配置図を示す。
【０２４３】
図１１は、図８に記載のマイクロ流体デバイスの別の上面図であり、デバイスのポンプ、弁、およびチャネルの配置図を示す。
【０２４４】
マイクロ流体デバイスのこの実施形態において、リザーバーは、以下（図１１）：
「細胞」：懸濁細胞およびプロテイナーゼＫ
「ミキサー」：緩衝液ＡＬ
「エタノール」：エタノール
「ＡＷ１」：洗浄緩衝液ＡＷ１
「ＡＷ２」：洗浄緩衝液ＡＷ２
「溶出」：溶出緩衝液ＡＥ
「ＮＡ１」：核酸リザーバー１
「ＮＡ２」：核酸リザーバー２
「増幅マスター混合物」：増幅試薬リザーバー
「単位複製配列流出１」：増幅流出リザーバー１
「単位複製配列流出２」：増幅流出リザーバー２
「増幅リアクター」
の通りである。
【０２４５】
図１１に記載のマイクロ流体デバイスの実施形態の操作時における試料調製の進行例は以下：
１．１０〜１５分間にわたる、循環による細胞溶解
２．エタノールとの混合
３．細胞溶解液をＳｉ膜へと移送する／廃棄する
４．ＡＷ１およびＡＷ２をＳｉ膜へと移送する／廃棄する
５．５〜１０分間にわたり真空ポンプを作動させ、乾燥させる
６．溶出１および２
７．ＰＣＲマスターとの混合
８．ＰＣＲリアクターの充填
９．ＰＣＲ反応
１０．ＰＣＲ産物の放出
の通りである。
【実施例３】
【０２４６】
６．３ ２つの機能領域を有するマイクロ流体デバイスの実施形態
本実施例では、試料調製領域および核酸増幅領域の２つの機能領域を有するが、オンチップの核酸解析領域は有さないマイクロ流体デバイス（「チップ」）の別の実施形態（図１２〜１６）について説明する。
【０２４７】
デバイスは、５０×３８ｍｍの本体寸法を有し、米国特許出願第２００６／００７８４７０Ａ１号に記載の弱溶剤接着法により接着された３つのサンドイッチ層を含む。デバイスは、デバイスの上面に配置され、各弁および流体チャネルネットワークと流体連結される、複数のリザーバーをさらに含む。デバイスはまた、機能的な流体ネットワークの一部を形成する核酸増幅リアクターも含む。
【０２４８】
図１３は、図１２に示すマイクロ流体デバイスの実施形態の配置を示し、二方向ポンプの３つの群：試料調製用ポンプ、ＰＣＲ試薬調製用ポンプ、および充填用ポンプを図示する。流体は、同じポンプダイアフラムを共有するリザーバー間で移送されうる。核酸増幅領域に隣接する、円で囲われた「２」および「３」のリザーバー群は、該増幅領域と流体的に相互連結されたリザーバー群である。円で囲われた「１」のリザーバー群は、試料調製領域内のリザーバーである。この実施形態によれば、３群のポンプが存在する。流体は、同じポンプダイアフラムを共有するリザーバー間で移送されうる。この実施形態では、第１群におけるポンプのうちの７つ、第２群におけるポンプのうちの３つ、および第３群におけるポンプのうちの２つが用いられる。この実施形態において、ポンプは二方向である。複数の供給源リザーバーを１つの目的リザーバーに組み合わせて、より良好な混合効果を同時にもたらすことができる。
【０２４９】
この実施形態に基づく方法の一例（図１４）では、リザーバーＲ１内において室温で５〜１０分間にわたり、細胞溶解緩衝液およびプロテイナーゼＫと共に細胞をインキュベートする。Ｒ１およびＲ２をＲ３へと交互に送出することにより、細胞溶解混合物を、リザーバーＲ２からのＥｔＯＨ／ＤＮＡ結合緩衝液と混合する。混合された試料を、リザーバーＲ３からフィルターリザーバーへと移送し、該溶液を、該リザーバーの底部に位置する精製膜（例えば、シリカ膜）を介して吸引する。
【０２５０】
フィルターと結合したＤＮＡを洗浄緩衝液１により洗浄し、廃棄物を廃棄物リザーバーへと移送する（図１５）。次いで、結合したＤＮＡを洗浄緩衝液２により洗浄し、廃棄物を廃棄物リザーバーへと移送する。数分間にわたり通気ポンプを作動させて、膜を乾燥させる。溶出緩衝液をフィルターリザーバーへと送出し、インキュベートし、核酸リザーバーＮＡ１へと溶出させる。この段階で、一部のＤＮＡをベンチトップでの実行用にアリコートすることができ、残りはオンチップでの実行用に用いる。
【０２５１】
ＤＮＡ鋳型を「ＮＡ１」から「核酸増幅混合物」へと移送し、混合する（図１６）。ＤＮＡ鋳型と共に核酸増幅マスター混合物をリアクターへと吸引し、そこで、熱サイクリングプロトコールを実施する。核酸増幅産物を該産物リザーバーへと送出する。この段階で、一部のＤＮＡをベンチトップでの実行用にアリコートすることができ、残りはオンチップでの実行用に用いる。
【実施例４】
【０２５２】
６．４ マイクロ流体デバイスを用いる全ＲＮＡの増幅
この実施例では、図８〜１１に示すマイクロ流体デバイスの実施形態を用いて、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞から生成される全ＲＮＡの増幅結果を説明する。全ＲＮＡは、以下のプロトコールを用いてオンチップで調製し、ゲル電気泳動により解析した：
【０２５３】
０．１Ｎ ＮａＯＨをチップの全チャンバー内に通し、複数回反復した。
【０２５４】
水を全チャンバー内に送出することにより、多量の水でチップをすすぎ、通気乾燥させ、カラムを組み立てた。
【０２５５】
日常的な方法を用いて試験管２本分のＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を融解させ、遠心分離し、上清を除去した。
【０２５６】
６００μｌのＲＬＴ／Ｂｍｅ（２０μｌ Ｂｍｅを伴う２．０ｍｌ ＲＬＴ調製液）を各ペレットに添加し、再懸濁させ、ペレットを混合した。
【０２５７】
標準的な方法を用いて、再懸濁したペレットをＱｕｉａｓｈｒｅｄｄｅｒカラム（２連による実行）内に通すことによりこれをホモジナイズした。
【０２５８】
ＲＬＴ−Ｂｍｅにより容量を１．５ｍｌまで上昇させ、５ｍｌの培養試験管に移した。
【０２５９】
該試験管に１．５ｍｌの７０％ＥｔＯＨを添加し、反転させることにより混合した。
【０２６０】
２００μｌずつの３アリコートを取り出し、個別の試験管に入れた。
【０２６１】
これらの試験管に、５００μｌの１：１ ＲＬＴ／Ｂｍｅ：７０％ＥｔＯＨを添加し、よく混合した。これらの試験管は、図１３の試料１〜３に対応する（Ｑｉａｇｅｎ対照）。
【０２６２】
試料１〜３および１０のための標準的なオフチップカラムプロトコール（Ｑｕｉａｇｅｎ社製ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット、型番７４１０７）に従った。ＲＮＡを３０μｌの水中に溶出させた（あらかじめの加熱なし）。
【０２６３】
試料１〜３で用いられなかった元の試料の残りの容量のうち２００μｌを、ピペッティングにより個別のオンチップ試料注入カラムに直接投入し、ポンプを用いてカラム中に吸引し廃棄した。残りの試料容量を試料１〜３と共にオフチップで処理し、試料１０（Ｑｉａｇｅｎ対照）と名付けた。
【０２６４】
２２μｌずつのＲＷ１により２回にわたり、オンチップのカラムを洗浄した。
【０２６５】
２２μｌずつのＲＰＥにより４回にわたり、オンチップのカラムを洗浄した。
【０２６６】
約２０分間にわたり、カラムを乾燥させた。
【０２６７】
カラムの乾燥後、３０μｌの室温水をチップ試料４〜６に添加（カラムに直接ピペッティングすることにより）し、１０分間にわたり試料をインキュベートした。オンチップの送出を用いて、純粋なＲＮＡを回収した。
【０２６８】
３０μｌの加熱水をチップ試料７〜９に添加（カラムに直接ピペッティングすることにより）し、１０分間にわたり試料をインキュベートした。オンチップの送出を用いて、純粋なＲＮＡを回収した。
【０２６９】
送出時において、別の１０μｌ室温水を各カラムに添加した。
【０２７０】
純粋なＲＮＡを１．５ｍｌの試験管に移し、これにチップからの喪失容量に当たる、別の２０μｌの水を添加した。
【０２７１】
２６０〜２８０ｎｍ；全２００μｌの水のうち５μｌ（４０倍の希釈率）における吸光度を読み取った。
【０２７２】
標準的なアガロースゲル電気泳動；１％アガロース／ＴＡＥゲル；１００ボルト、３０分間を用いることにより、５μｌの各試料を解析した。
【０２７３】
図１８で見られる通り、オンチップのＲＮＡ調製により、標準的なＱｕｉａｇｅｎ法（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット、型番７４１０７）と比較して同等の量／質のＲＮＡがもたらされた。また、この実験により、オンチップによる核酸調製時において高粘稠度の材料を扱う際、オンチップのダイアフラムポンプが円滑に作動することも確認された。
【０２７４】
図１９は、図８〜１１に示されるマイクロ流体デバイス（「チップ」）上で実行されたＲＴ−ＰＣＲ増幅の結果を示す。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲを、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑシステムと共に、核酸増幅領域内で実行されるＰＣＲに用いた。上記で説明される通り、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞から生成される全ＲＮＡをオンチップで調製し、鋳型ＲＮＡに用いた。β−アクチンを認識するプライマーを用いてｃＤＮＡを作製し、ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によりアクチンｃＤＮＡを増幅した。順方向プライマーは、ＡＣＧ ＴＴＧ ＣＴＡ ＴＣＣ ＡＧＧ ＣＴＧ ＴＧＣ ＴＡＴ［配列番号１］（エクソン３内に存在する）であった。逆方向プライマーは、ＡＣＴ ＣＣＴ ＧＣＴ ＴＧＣ ＴＧＡ ＴＣＣ ＡＣＡ ＴＣＴ［配列番号２］（エクソン５内に存在する）であった。予測された産物、すなわち６８７コピーのｃＤＮＡ単位複製配列が得られた。
【０２７５】
ＲＮＡは、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞から作製した。ベータ−アクチンを認識するプライマーを用いてｃＤＮＡ産物を作製し、ＰＣＲによりアクチンのｃＤＮＡを増幅した（図１９）。レーン１：ＤＮＡ標準物質；レーン２：オンチップで実行されたＲＴ−ＰＣＲからの単位複製配列産物；レーン３：投入ＲＮＡ（１μｌ）。
【０２７６】
図２０は、示される通り、熱サイクルおよび試行時間を変化させる場合における、８回のＰＣＲ試行に対するオンチップでの再現性を示す。
【０２７７】
図２１は、マイクロ流体デバイスと従来のベンチトップでのＰＣＲプラットフォームとの間における結果の比較を示す。３０回に及ぶ熱サイクルにおける５０００プラスミドコピーの場合、ベンチトップ試行の場合の１．７５時間と比較して、１時間でオンチップの結果が得られた。
【０２７８】
図２２は、この実験において、マイクロ流体デバイスと連結して用いられたＰＣＲ熱サイクラーによる典型的なサイクルを示す。下図のグラフは、上図のグラフ内で示される最初の４サイクルのうちの複数の拡大図である。
【０２７９】
図２３は、マイクロ流体デバイス上で実行されるＲＴ−ＰＣＲプロトコールの結果を示す。略述すると、以下のベンチトップ（ｂｔ）プロトコールおよびオンチッププロトコールを用いて、ＨＩＶ ＲＮＡを単離した。ベンチトップおよびオンチップのＲＮＡ単離には、２０，０００コピー（Ｂｔ１）および２，５００コピー（Ｂｔ２）のＡｒｍｏｒｅｄ ＲＮＡを用いた。ベンチトップでの溶出量は５０μｌであった；理論的な１００％収率はＲＮＡ４００コピー／μｌである。オンチップでの溶出量は２０μｌであった；理論的な１００％収率はＲＮＡ１２５コピー／μｌである。ＲＴ−ＰＣＲには、１ｍｌの溶出量を用いた。
【０２８０】
逆転写物を用いて、５０℃で３０分間の後、９５℃で１５分間にわたり、当技術分野で知られる標準的なＲＴ−ＰＣＲプロトコールを実行し、次いで、９５℃における４５秒間、次いで、５８℃で４５秒間、および７２℃で６０秒間を用いる４０サイクルにわたりＰＣＲプロトコールを実行した。単離収率は、ＲＴ−ＰＣＲ後におけるゲル画像から推測した。
【０２８１】
図２３に示す通り、オンチップでの試行から得られたＲＮＡにより、Ｑｕｉａｇｅｎ ＲＮＡＥａｓｙキットを用いる同一の実験条件下においてベンチトップで実施された同じプロトコールの場合と少なくとも同等量のＲＮＡがもたらされた。レーン１：分子量の標準物質。レーン２：Ｂｔ１−ＲＮＡ。レーン３：Ｂｔ２−ＲＮＡ。レーン４：チップ−ＲＮＡ。
【実施例５】
【０２８２】
６．５ マイクロ流体デバイスを用いてＰＣＲ産物を検出する方法
以下のデータは、使用者がマイクロ流体デバイスを用いて、実質的に介入することなく、迅速かつ容易にＰＣＲを実施しうることを示す。細胞の溶解、ＤＮＡまたはＲＮＡの抽出および精製、ならびに核酸に対するＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲを含むすべての必要なステップを、単一のマイクロ流体デバイスシステム上で達成することができる。さらに、ＰＣＲによる単位複製配列の変性、およびリバースドットブロット（ＲＤＢ）解析による、オリゴヌクレオチドプローブのアレイ上におけるハイブリダイゼーションを介するＰＣＲ産物の検出が可能なシステムもまた設計されている。
【０２８３】
本実施例で用いられるマイクロ流体デバイスの実施形態は、２つの機能領域を有した。実際には図８〜１１に示す実施形態を用いたが、図１２〜１６に示すマイクロ流体デバイスもまた用いることが可能であった。マイクロ流体デバイスは、特許権のある工程により組み立てられて積層されると、ポンプ、弁、マイクロ流体チャネル、試薬リザーバー、ＤＮＡ／ＲＮＡ抽出／精製部材、および熱サイクリング能力を創出する、廉価なポリスチレンベースの３層型積層システムを有した。加えて、該システムの設計は、細胞溶解など特定のアッセイステップに極めて有用な流体の二方向流動を可能とする。最後に、マイクロ流体デバイスとコントローラとの間において流体の接触は存在せず、したがって、汚染の可能性が低減される。
【０２８４】
各種のマイクロチャネル、ポンプ、および弁の構成は容易に変更可能であり、マイクロ流体デバイスのフォーマットは、広範囲の検体の解析を可能とするのに十分な多目的フォーマットである。図１２〜１６に示す実施形態（図８〜１１における実施形態もまた用いうるが）を参照して略述すると、試料は、マイクロ流体デバイスシステム上における核酸増幅解析を受けながら、以下のステップ全体を進行する（図１４〜１６）。
１．生の臨床試料を、細胞溶解緩衝液およびプロテイナーゼＫを含有するリザーバーＲ１に導入する。
２．Ｒ１およびＲ３をリザーバーＲ２へと交互に送出することにより、Ｒ１の内容物を、リザーバーＲ３内に含有されるエタノールおよび核酸結合緩衝液と混合させる。
３．混合された試料（ここではＲ２内）をフィルターリザーバー（「フィルターＲｅｓ」）へと移送し、該リザーバーの底部に位置するシリカ膜を介して吸引し、抽出された核酸をシリカへと結合させる。
４．シリカに結合した核酸を、「Ｗ１」内に含有される緩衝液により洗浄し、廃棄物を廃棄物リザーバーへと移送する。
５．シリカに結合した核酸を、「Ｗ２」内に含有される緩衝液により洗浄し、廃棄物を廃棄物リザーバーへと移送する。
６．通気ポンプを作動させて、シリカ膜を乾燥させる。
７．溶出緩衝液（リザーバーＥｌｕからの）をフィルターリザーバーへと送出し、インキュベート後、２５μＬの精製核酸を、リザーバーＮＡ１へと溶出させる。
８．「ＮＡ１」からの精製核酸を核酸増幅混合物リザーバーへと移送し、１：９の比で鋳型を核酸増幅試薬と混合する（すなわち、プライマー対および他のすべての核酸増幅反応成分）。
９．核酸増幅マスター混合物および核酸鋳型を核酸増幅リアクターへと吸引する。
１０．核酸増幅リアクター内において核酸増幅熱サイクリングを実行する。
１１．最終核酸増幅産物を該産物リザーバー（「ＰＣＲ Ｐｒｏｄ」）へと送出する。
【０２８５】
ＲＮＡの単離および精製
マイクロ流体デバイスにより、「ベンチトップ」法と同様の形で効率的にＲＮＡを抽出および精製しうるかどうかを判定するため、いずれもＱｕｉａｇｅｎ社によるＲＮｅａｓｙプロトコールを用いる、マイクロ流体デバイスおよびベンチトップ法を共に用いて、等量（５００，０００個）の細胞を抽出にかけることにより、ヒト胚腎細胞（ＨＥＫ ２９３−Ｔ細胞）からＲＮＡを単離した。２つのプロトコール各々の複数回の反復に対するアガロースゲル電気泳動により、マイクロ流体デバイスが、「ベンチトップ」法と同等に機能したことが示される（図１８）。
【０２８６】
ベンチトップの熱サイクラーおよびマイクロ流体デバイスシステムを用いるＰＣＲの比較
マイクロ流体デバイス上において有効な熱サイクリングを達成しうることを示すため、ＢｉｏＲａｄ ＭＪ Ｍｉｎｉ熱サイクラーまたはマイクロ流体デバイス内でコントローラ上に搭載されて用いられた熱サイクラーを用いる３０サイクルにより、５×１０３コピーのプラスミド（ｐｒｌｐＧＬ３）を増幅した。アガロースゲル電気泳動により見られる通り、いずれの場合においても適切な単位複製配列が得られたことは、マイクロ流体デバイスシステムにより、実質的に「手」作業を必要とすることなく、適正な単位複製配列を作製することが可能であったことを示す（図２１）。
【０２８７】
マイクロ流体デバイスシステムの使用によるβ−サラセミアおよびＨＰＶの検出
マイクロ流体デバイスによる熱サイクリングと並んで、核酸の抽出および精製の全般的条件が整備されると、生試料導入時における特定の遺伝子標的の検出が達成される。特定の原型的なマイクロ流体デバイスを構成して、どのくらい迅速に対象標的を検出しうるかを示すため、ＰＣＲ解析により特定の対象標的を検出するのに生物学実験室で既に開発された、ベンチトッププロトコールを実施するマイクロ流体デバイスを開発した。マイクロ流体デバイスの重大な最適化なしに、当技術分野で知られる標準的なアッセイ条件およびプロトコールを用いて、必要とされるすべての調製ステップおよび解析ステップ（すなわち、細胞溶解、核酸抽出／精製、およびＰＣＲ増幅）を実施するシステム。
【０２８８】
この手法を用いて、各種の異なる臨床検体を解析した。例として述べると、マイクロ流体デバイスにヒト全血液（５０μＬ）を導入し、試料リザーバーと溶解緩衝液リザーバーとの間における二方向流動により細胞を溶解させた。マイクロ流体デバイス上におけるシリカ膜部材を介して、核酸を流動させた。
【０２８９】
最後に、３０サイクルのＰＣＲ後において、ベンチトップの熱サイクラー（レーン４〜５）またはマイクロ流体デバイスシステム（レーン２〜３）を用いて並行的にＰＣＲ増幅された２つの同一の試料を、アガロースゲル上で解析した（図２４）。
【０２９０】
さらに、１つの検体からレーン２および４を得る 一方で、第２の検体からレーン３および５を得た。ベンチトップのＰＣＲ反応により得られたより強いシグナルの場合におけるシグナル強度の見かけの乖離は、マイクロ流体デバイスで用いられた異なる出発材料量による可能性が極めて高い。ベンチトップＰＣＲ解析の出発量が２００μＬであるのに対して、マイクロ流体デバイスで用いられた量は５０μＬに過ぎなかった。より重要なことだが、ＰＣＲ単位複製配列のいずれのセットも、実質的に同一であった。
【０２９１】
同様にして、Ｌ１遺伝子変性プライマーＭＹ０９／ＭＹ１１を用いるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の存在についてのＰＣＲ（Ｇｒａｖｉｔｔ ＰＥ、Ｐｅｙｔｏｎ ＣＬ、Ａｐｐｌｅ ＲＪ、Ｗｈｅｅｌｅｒ ＣＭ、「Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ２７ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ＬＩ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｂｙ ａ ｓｉｎｇｌｅ−ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ， ｒｅｖｅｒｓｅ ｌｉｎｅ ｂｌｏｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ」、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｏｒｏｂｉｏｌ、１９９８年、第３６巻、第１０号、３０２０〜３０２７頁）により、膣内スワブを解析した。
【０２９２】
膣内スワブをＰＢＳ緩衝液に入れて撹拌後、ベンチトップＰＣＲ法またはマイクロ流体デバイスシステムを用いて、ＨＰＶの存在について上清を解析した。図２５に示す通り、マイクロ流体デバイスシステムにより、ベンチトップ法を用いて得られる結果と基本的に同一の結果がもたらされた。
【０２９３】
３つの個別の膣内スワブをＰＢＳ中に懸濁させ、「ベンチトップ」（右図）による溶解、ＤＮＡの抽出／精製、およびＰＣＲにかけるか、またはマイクロ流体デバイス（右図）内に導入してすべての機能を自動的に実施するだけであった。試料１、２、および３は、上記で説明した通りに２つのアリコートに分けて解析された、３つの個別試料を表す。
【０２９４】
ベンチトップ法の場合、まずウイルスＤＮＡを単離および精製し、次いで、ベンチトップの熱サイクラーを用いてＰＣＲ増幅した。マイクロ流体デバイスシステムの場合、ＰＢＳ上清を試料ウェルに添加し、すべての機能を自動的に実施する（ウイルス溶解、核酸の抽出／精製、およびＰＣＲを含む）だけであった。
【０２９５】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）を検出するリバースドットブロット（ＲＤＢ）モジュール（すなわち、核酸解析領域）を組込むマイクロ流体デバイスを用いた。膣内スワブからＨＰＶを得、複数のＨＰＶ血清型を増幅しうるプライマー対を用いるＰＣＲ増幅にかけた。マイクロ流体デバイス上では、図２７で図式的に説明されるプロトコールに従い、ビオチン化された単位複製配列を変性させ、血清型ＨＰＶ−１１、ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−３１、およびＨＰＶ−５２に対する４×４アレイのプローブ上に流動させた。ＨＰＶ−５２（上図）およびＨＶＰ−１１（下図）は、統合型マイクロ流体デバイスシステム内で適正に検出された（図２６）。
【０２９６】
その有用性を調べるため、本発明者らは、各種の異なるＨＰＶ血清型（ＨＰＶ １１、１６、３１、および５２）を増幅しうるＭＹ０９／ＭＹ１１変性プライマー（Ｐｅｙｔｏｎ ＣＬ、Ｗｈｅｅｌｅｒ ＣＭ、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｉｖｅ ｎｏｖｅｌ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｍｅｘｉｃｏ ｔｒｉｅｔｈｎｉｃ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ」、Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ、１９９４年、第１７０巻、第５号、１０８９〜１０９２頁）により、膣内スワブ試料を増幅した。両プライマーをそれらの５’端でビオチン化し、二本鎖ビオチン化単位複製配列を作製した。ＲＤＢモジュールを構成してＰＣＲ単位複製配列を変性させ、該単位複製配列がそれらの各捕捉プローブとハイブリダイズしたドットブロットアレイ（ミシガン州、アンアーバー、Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製、Ｉｍｍｕｎｏｄｙｎｅ Ｃ）の表面上にそれらを流動させた。
【０２９７】
上記の試験に加え、本発明者らは、マイクロ流体デバイスシステムを用いて、血漿および唾液の両方におけるＨＩＶ−１を検出するのに成功し、「ベンチトップ」のＲＴ−ＰＣＲ法を用いて得られた結果と同等の結果を達成した。
【０２９８】
まとめると、これらの予備的データは、マイクロ流体デバイスを用いて、使いやすいフォーマットにおける臨床試料の完全自動化されたＰＣＲ解析またはＲＴ−ＰＣＲ解析を達成しうることを示す。
【実施例６】
【０２９９】
６．６ オンチップにおける大腸菌試料の処理
本実施例で用いられるマイクロ流体デバイスの実施形態は、２つの機能領域を有した（図１２〜１６）。大腸菌の非病原性菌株Ｋ１２の誘導体であるＤＨ５ａを、オンチップにおける処理のための試料供給源として用いた。ＤＨ１０ｂのゲノムに基づいて、プライマーを作製した。ｒｒｓ遺伝子によりコードされる１６ＳのリボソームＲＮＡ。「腸内細菌共通抗原」（ＥＣＡ）は、ｗｙｚＥ遺伝子によりコードされる。用いられたプライマーは、１６Ｓ＿３６７（７本／ゲノム）およびＥＣＡ＿１７８（１本／ゲノム）であった（Ｂａｙａｒｄｅｌｌｅ Ｐ．およびＺａｈｒｕｌｌａｈ Ｍ．（２００２年）、「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｆｒｅｑｕｅｎｔ Ｅｎｔｅｒｏｈａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ ｓｐｅｃｉｅｓ ＤＮＡ ｕｓｉｎｇ ｗｅｃ ｇｅｎｅ ｔｅｍｐｌａｔｅｓ」、Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｈｉｏｌ．、第４８巻、１１３〜１２２頁を参照されたい）。
【０３００】
図１４〜１６は、この実験で用いられるマイクロ流体デバイスの実施形態についての操作略図である。矢印は、デバイス上で処理された際の大腸菌試料の進行を示す。図１４において：１．リザーバーＲ１内において室温で５〜１０分間にわたり、細胞溶解緩衝液およびプロテイナーゼＫと共に大腸菌をインキュベートした。２．次いで、Ｒ１およびＲ２を「Ｒ３」へと交互に送出することにより、試料をＲ２からのＥｔＯＨ／ＤＮＡ結合緩衝液と混合した。３．混合された試料を、Ｒ３リザーバーからフィルターリザーバーへと移送し、該溶液を、該リザーバーの底部に位置するシリカ膜を介して吸引した。
【０３０１】
図１５において：４．結合したＤＮＡを洗浄緩衝液１により洗浄し、廃棄物を廃棄物リザーバーへと移送する。５．次いで、結合したＤＮＡを洗浄緩衝液２により洗浄し、廃棄物を廃棄物リザーバーへと移送する。６．次いで、数分間にわたり通気ポンプを作動させてシリカ膜を介して空気を引き込み、膜を乾燥させる。７．溶出緩衝液をフィルターリザーバーへと送出し、インキュベートし、「ＮＡ１」へと溶出させる。この段階で、一部のＤＮＡをベンチトップでの実行用にアリコートすることができ、残りはオンチップでの実行用に用いる。
【０３０２】
図１６において：８．ＤＮＡ鋳型を「ＮＡ１」から「ＰＣＲ混合物」へと移送し、混合する。９．ＤＮＡ鋳型と共にＰＣＲマスター混合物をＰＣＲリアクターへと吸引する。１０．ＰＣＲ熱サイクリングを実行する。１１．ＰＣＲ産物を該産物リザーバーへと送出する。この段階で、一部のＤＮＡをベンチトップでの実行用にアリコートすることができ、残りはオンチップでの実行用に用いる。
【０３０３】
ＰＣＲ感度解析および吸光度試験を用いて「妥当な」（１０３個レベルの）大腸菌添加により自動化試行を実行する場合の成功率を決定することにより、自動化の信頼性および自動化の有効性を評価した。両方の設計を用いて、８０〜９０％の成功率が得られた。多くの市販のＰＣＲ産物に対し、約９０％の成功率が典型的である。
【０３０４】
マイクロ流体デバイスから得られたＮＡ抽出およびＰＣＲ結果をベンチトップの結果と比較することにより、自動化の有効性を評価した。
【０３０５】
２つの連鎖的なオンチップ操作：核酸（ＮＡ）抽出およびＰＣＲ増幅が実行された。大腸菌１０００個／μｌの試料２０μｌからのＤＮＡでは、従来のＵＶ分光光度計で検出不可能なＵＶ吸光度が生じるため、低量の大腸菌添加時におけるＮＡ抽出の直接的な比較は困難であった。
【０３０６】
図２８は、アップルジュース中に添加された大腸菌１，０００個を処理する２つのチップ間における比較を示す。該菌添加されたジュースをオンチップで調製してＤＮＡを精製し、次いで、１μｌずつの２アリコートを取り出し、ベンチトップ上で増幅し、精製された残りのＤＮＡをオンチップで増幅した。示される通り、産物を取り出し、ゲル上で解析した。各チップによる産物のレーン１およびレーン２はベンチトップ上で増幅されたアリコートを表し、各場合におけるレーン３はオンチップにおける増幅産物を表す。
【０３０７】
ＰＣＲでは、ベンチトップＰＣＲおよびオンチップＰＣＲのいずれの試行に対してもオンチップで抽出されたＤＮＡを用い、オンチップＰＣＲの有効性を決定した。図２９は、オンチップで抽出されたＤＮＡを用いる、ベンチトップのＰＣＲ結果とオンチップのＰＣＲ結果との比較を示す。大腸菌の添加量は、５×１０３個／μｌ〜１×１０４個／μｌの範囲であった。
【０３０８】
添加量が十分である場合、オンチップの結果およびベンチトップの結果は、ほぼ同等であった。
【実施例７】
【０３０９】
６．７ マイクロ流体デバイスを用いる食品マトリックス中における大腸菌の検出
本試験の主目的は、マイクロ流体デバイスの実施形態により、ＰＣＲベースのアッセイを用いて、アップルジュース、アップルサイダー、およびミルクなどの食品マトリックス中における大腸菌を検出する、すべての調製ステップおよび解析ステップを有効に実施しうると示すことであった。
【０３１０】
大腸菌株ＤＨ５αを培地内で増殖させ、用いられる各種のマトリックスに導入した。本試験では、２つの異なる遺伝子標的を用いた。細菌ファミリーおよび細菌種を通じて観察される、高度に保存された遺伝子である１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（ｒｒｓ遺伝子によりコードされる）と、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａ）ファミリーに共通の腸内細菌共通抗原ＥＣＡ（ｗｙｚＥ遺伝子によりコードされる）とをＰＣＲ増幅した。該ｒＲＮＡ遺伝子およびＥＣＡ遺伝子を検出するのに用いられたＰＣＲプライマーは、それぞれ、３６７ｂｐおよび１７８ｂｐの単位複製配列を生成すると予測された。
【０３１１】
マイクロ流体デバイスの２つの個別の実施形態を評価し、細菌１０００〜５００，０００個の範囲の添加濃度において３種の個別の大腸菌導入試料（アップルジュース、アップルサイダー、およびミルク）を評価した。最後に、この予備試験では、合計約１００回のマイクロ流体デバイスの試行を実施した。
【０３１２】
結果
本試験では２つの異なる設計を評価したが、この実施例では、評価された設計の１つだけに焦点を絞る（図１８〜２１）。このマイクロ流体デバイスは、単一のマイクロ流体デバイス上における２つの機能領域を用いる。第１の領域は、すべての試料調製（すなわち、細胞溶解、ＤＮＡ抽出／精製）を組込み、第２の領域は、ＰＣＲ増幅用である。これらの領域内には、各種の機能を達成する３つのポンプ／弁群が配置されている。流体は、同じポンプダイアフラムを共有する各リザーバー間で移送されうる。加えて、複数の供給源リザーバーを単一の目的リザーバーに組み合わせて、有効な混合を達成することができ、これはまた、ポンプの二方向性によっても増強されうる。略述すると、以下のステップが実行された。
１．「Ｒ１」内において室温で５〜１０分間にわたり、細胞溶解緩衝液およびプロテイナーゼＫと共に２０μＬの大腸菌試料をインキュベートする。
２．Ｒ１およびＲ３を「Ｒ２」へと交互に送出することにより、Ｒ１を「Ｒ３」からのＥｔＯＨ／ＤＮＡ結合緩衝液と混合する。
３．混合された試料を、「Ｒ２」からフィルターリザーバーへと移送し、該溶液を、該リザーバーの底部に位置するシリカ膜を介して吸引し、抽出されたＤＮＡをシリカに結合させる。
４．シリカと結合したＤＮＡを「Ｗ１」内の洗浄緩衝液１により洗浄し、廃棄物を廃棄物リザーバーへと移送する。
５．シリカと結合したＤＮＡを「Ｗ２」内の洗浄緩衝液２により洗浄し、廃棄物を廃棄物リザーバーへと移送する。
６．シリカ膜を乾燥させるため、数分間にわたり通気ポンプを作動させ、シリカ膜を介して空気を吸引させる。
７．（リザーバーＥｌｕからの）溶出緩衝液をフィルターリザーバーへと送出し、インキュベートし、２５μｌの精製ＤＮＡをリザーバーＮＡ１へと溶出させる。
８．ＤＮＡ鋳型をＮＡ１リザーバーからＰＣＲ 混合物リザーバーへと移送し、１：９の比で鋳型をＰＣＲ試薬と混合する（すなわち、プライマー対および他のすべてのＰＣＲ反応成分）。
９．ＤＮＡ鋳型と共にＰＣＲマスター混合物をＰＣＲリアクターへと吸引する。
１０．ＰＣＲリアクター内においてＰＣＲ熱サイクリングを実行する。
１１．ＰＣＲ産物を該産物リザーバー（「ＰＣＲ Ｐｒｏｄ」）へと送出する。
【０３１３】
この予備試行では約１００回の個別アッセイを実施したが、本実施例では試行間で極めて再現性の高い代表的データを説明する。図２８〜３７に示すデータは、ＰＢＳ緩衝液、アップルサイダー、アップルジュース、およびミルク中への既知量の大腸菌の導入から得られた結果を表す。
【０３１４】
Ｑｕｉａｇｅｎ社製ＤＮＡＥａｓｙキットを用いてＤＮＡを抽出する場合、試料量が１０〜３０μｌで変化しうるが、注目すべき影響は生じないことが分かった。
【０３１５】
細胞溶解緩衝液ＡＴＬおよびプロテイナーゼＫと共に試料を「Ｒ１」に入れた後、次いで、上記で説明した通りにこれを自動的に処理したところ、シリカ膜から溶出した最終ＤＮＡ量は２５μＬであった。ＰＣＲを実行するため、１：９の比でＤＮＡ鋳型をＰＣＲマスターと混合した後、熱サイクリングチャンバーに導入した。したがって、起こりにくい事象ながら、ＤＮＡ回収率が１００％であると推定したとしても、最終的にＰＣＲ増幅されるＤＮＡ総量は、理論的に、総出発菌数から得られるＤＮＡの１／２５以下を表す（例えば、出発菌数が１０００個であった場合、最終的にＰＣＲチャンバーに導入されたＤＮＡは、細菌４０個以下となった）。
【０３１６】
ＰＢＳ中に懸濁した大腸菌
アッセイ条件を確立する一助とするため、初めの試行の焦点を、ＰＢＳ中に導入された既知量（または数）の大腸菌に絞った。ＰＢＳ中に大腸菌５００，０００個を導入し、マイクロ流体デバイス上でＤＮＡを単離／精製した。２５μＬの単離ＤＮＡ鋳型から１μＬのアリコートを取り出し、「ベンチトップ」のＰＣＲ増幅にかける一方、該２５μＬの単離ＤＮＡ鋳型の別の１μＬアリコートを、１：９の比でＰＣＲマスター混合物と混合し、マイクロ流体デバイス上でさらに増幅した。図３２において、同じマイクロ流体デバイス上において完全に統合されたＤＮＡ単離／精製およびＰＣＲから得られたゲルプロファイル（レーン４）との、「ベンチトップ」ＰＣＲ試料のゲルプロファイル（レーン３）の比較では、識別できない結果が示された。同じゲル上におけるレーン１および２は、それぞれ、陰性対照（水）および陽性対照（ＵＶ吸光度測定に基づく、細菌１０００個に由来するＤＮＡ）を表す。同じ種類の試料に対する反復的解析により基本的に再現可能な結果がもたらされることは、マイクロ流体デバイスを用いて、問題となる細菌を信頼できる形で検出し、「ベンチトップ」のＰＣＲ解析と事実上識別できない結果を得ることが可能であったことを示す。
【０３１７】
初めの２０μＬの試料中に細菌１０，０００個だけを導入し、次いで、３つの個別のマイクロ流体デバイスによりまさに上記で説明した通りに処理することで、基本的に同一の結果が得られた。
【０３１８】
マイクロ流体デバイス上におけるＤＮＡの単離および精製
上記と同様の複数のさらなる実験を実施することにより、以下のアッセイプロトコールが確立された。
【０３１９】
試薬は、Ｑｕｉａｇｅｎ社製ＤＮＥａｓｙキットおよびＰｒｏｍｅｇａ社製ＰＣＲキットに由来した。
【０３２０】
【表Ａ】
【０３２１】
ＰＣＲプロトコール
９５℃で２分間にわたる最初のインキュベーション。各サイクルを
９５℃で５〜１５秒間
６０℃で２０〜３０秒間
７２℃で２０〜２５秒間
として、２５〜３５サイクル。７２℃で３分間にわたる最後のインキュベーション。
【０３２２】
アップルサイダーに導入された大腸菌
ＰＢＳに導入された細菌について報告された方式と同様の方式で、各濃度の大腸菌を市販のアップルサイダーに導入し、マイクロ流体デバイスシステムにおいて解析した。アップルサイダーに導入された細菌５００，０００個の解析（図３０Ａ）により、「ベンチトップ」のＰＣＲ解析（レーン３）と完全統合型マイクロ流体デバイスによる解析（レーン４）との間で基本的に識別できない結果がもたらされた。レーン１および２は、それぞれ、陰性対照および陽性対照を表す。陰性対照レーン内において現れる微弱なバンドは、実験室内における二次汚染による可能性が高い。アップルサイダーに導入される菌数を１００，０００個に低下させることによってもまた、標的配列の良好な増幅が示された（図３０Ｂ）。レーン１〜２が完全統合型マイクロ流体デバイスでの試行により生成される単位複製配列を示す一方、レーン４〜５は、同じＤＮＡに対する「ベンチトップ」のＰＣＲ増幅により生成される単位複製配列を示す。レーン３は、陰性対照を表す。
【０３２３】
最後に、アップルサイダーに導入される菌数を２５００個に低下させる（図３１）ことによってもまた、「ベンチトップ」のＰＣＲ解析（レーン２〜３）と完全統合型マイクロ流体デバイスによる解析（レーン４〜５）との間における優れた相関が得られた。レーン１は、陰性対照を表す。
【０３２４】
上記で注意した通り、マイクロ流体デバイス（ならびにベンチトップシステム）上でＤＮＡが抽出、精製、および増幅される方式により、以下の表は、マイクロ流体デバイスに添加され、ＰＣＲチャンバー内において実際に増幅される細菌数を表す（マイクロ流体デバイスの精製領域からの１００％のＤＮＡ回収率を仮定する）。以下の表１は、試料中およびＰＣＲチャンバー内における細菌添加数を示す。
【０３２５】
【表Ｂ】
【０３２６】
アップルジュースに導入された大腸菌
同様の方式で、各濃度の大腸菌を市販のアップルジュースに導入した。細菌１０，０００個をアップルジュースに導入した（図３３）ところ、完全統合型マイクロ流体デバイスでの試行から得られた結果（レーン４〜５）は、同じマイクロ流体デバイス上で単離されたＤＮＡに対する「ベンチトップ」のＰＣＲ解析により得られた結果と識別できなった。レーン１は陰性対照を表す。
【０３２７】
アップルジュースに細菌１０００個だけを導入する（図３４）ことによってもまた、完全統合型マイクロ流体デバイスから結果として得られた単位複製配列（レーン４〜５）は、同じマイクロ流体デバイス（レーン２〜３）上で単離されたＤＮＡに対するベンチトップＰＣＲにより得られた単位複製配列と識別できなかった。上記の通り、レーン１は陰性対照を表す。最後に、２回の異なるマイクロ流体デバイスでの試行から得られた単位反復配列を比較したところ（図３５）、完全統合による結果（各マイクロ流体デバイスのレーン３）は、同じマイクロ流体デバイスから得られたＤＮＡに対する「ベンチトップ」のＰＣＲ増幅により得られた結果と識別できなかった。
【０３２８】
上記で説明した通り、マイクロ流体デバイス内を進行する際におけるＤＮＡの希釈により、単離／精製およびＰＣＲ増幅から結果として得られる単位複製配列は、マイクロ流体デバイスに初めに導入された細菌が、初めの添加濃度の１／２５以下を占めることを示す。したがって、細菌１０，０００個が導入された場合、実際に増幅されたＤＮＡは、細菌４００個以下に由来した。同様に、細菌１０００個だけが導入された場合、実際に増幅されたＤＮＡは、細菌４０個以下に由来した。
【０３２９】
ミルクに導入された大腸菌
ミルク中に１，０００，０００個の大腸菌を導入し、上述の確立されたプロトコールを用いて調べたところ、状況は、アップルジュースまたはアップルサイダーよりも複雑であった。脱脂粉乳の場合、試験に対するタンパク質の干渉は極めて限定されたものであり、予期した結果が得られた（図３６）。しかし、細胞溶解緩衝液に対して１：１の容量比で全乳を調べたところ、ＤＮＡが単離されなかったことから、全乳中に存在する脂肪により単離過程が抑制されることが示される可能性が高い。
【０３３０】
この特定のプロトコールでは、臨床診断を目的として、血液の保存および輸送用に開発されたＷｈａｔｍａｎ社製ＦＴＡフィルターを用いた。Ｗｈａｔｍａｎ社製ＦＴＡフィルターの最も注目すべき特徴は、それが、フィルター自体における細胞の溶解および精製に十分な試薬を含むことであった。この場合、マイクロ流体デバイス上における水以外の他の試薬を保存する必要が存在しなかった。しかし、Ｗｈａｔｍａｎ社製ＦＴＡフィルターは、加工に際してむしろ過酷な条件を伴う。ベンチトップおよびマイクロ流体デバイスのいずれにおいても、大腸菌からのＤＮＡ精製のためのＦＴＡ溶出を調べたが、その結果を表２および図３７に示す。すべての試験は、１００万個の大腸菌添加を用いて実施した。
【０３３１】
【表Ｃ】
【０３３２】
結論
本試験により、マイクロ流体システムを用いて、アップルジュース、アップルサイダー、およびミルクなどの食品マトリックス中における大腸菌を検出しうることが示された。これらの結果は、単一のマイクロ流体デバイス上においてすべての調製機能および解析機能を実施しうることを明確に示す。
【実施例８】
【０３３３】
６．８ 密閉された核酸増幅リアクターに対する圧力除去デバイス
本実施例では、例えば、ＰＣＲリアクターを有するマイクロ流体デバイスの核酸増幅領域内における密閉された核酸増幅リアクターと共に用いうる圧力除去デバイスについて説明する。圧力除去（緩和）デバイスは、シールされたマイクロ流体デバイスの内部に設置することができる。圧力除去デバイスは、弁に類似するが、直径を貫通する導管状の切除部を有し（図３８）、流体は通常、ダイアフラム上部の導管を介して流動可能であり、システム圧が増大すると、流体は、設計およびシステム圧に応じて空気圧により制御されるかまたは雰囲気に対して開放される、緩和デバイスのダイアフラムを押しやり、ダイアフラムのたわみにより、該密閉システム内における物質が維持される一方で、圧力除去のためのさらなる空間がもたらされる。
【０３３４】
圧力除去デバイスは、マイクロ流体デバイスなど、シールされた微細リアクターが、熱サイクリング間の著明な温度変化に由来する破断または漏えいを起こすことを防止しうる。液体の熱膨張の結果として生じる圧力は、固定体積内において極めて高い。温度が２５℃から９５℃に上昇すると、水の体積は４％上昇する。従来のリアクター設計では、リアクター壁面の変形、捕捉された気体の圧縮、流入／流出導管の膨張、漏えいなどにより圧力が解放されうる。
【０３３５】
システム内において緩和デバイスを直列に配することにより、リアクター領域内における温度が上昇すると、リアクター内における液体が膨張し、圧力が上昇し、緩和ダイアフラムをたわませる。結果として、システム圧が解放される。リアクター内における温度が低下すると、液体が収縮し、流体の逆流が生じ、ダイアフラムのたわみが低減される。加えて、圧力緩和設計はまた、それなしには高圧弁が必要となる、システムをシールする弁の使用も容易とする。
【実施例９】
【０３３６】
６．９ 高温時におけるＰＣＲリアクター変形の防止
本実施例では、特定の実施形態において、核酸増幅リアクター、例えば、ＰＣＲリアクターの上部に接着することで、高温時における熱効果の結果としてリアクターがたわむことを防止しうる、剛性構造について説明する（図３９）。マイクロ流体デバイス材料としてポリスチレンを用いる場合、リアクターの上部は、高温、例えば、９５℃時において「たわみ」変形を受ける場合がある。冷却時において、チャンバー内の圧力は、変形および／または液体の漏出により陰圧となる場合があり、これにより、底部膜がたわみ、ヒーターとの共形接触が失われる。結果として、再現可能で高品質の核酸増幅を達成することが困難となりうる。リアクター上部に剛性構造を用いることにより、このような熱膨張がリアクターの上部から離れ、ヒーターを圧迫する膜へと方向づけられる。
【実施例１０】
【０３３７】
６．１０ リバースドットブロット（ＲＤＢ）用の核酸プローブを固定化する方法
本実施例では、リバースドットブロット（ＲＤＢ）検出用の核酸プローブを固定化するのに用いうる方法について説明する。
【０３３８】
Ｂｉｏｄｙｎｅ Ｃ膜は以下のように調製した。フィルターを、１０ｃｍのペトリディッシュ内における浸漬に適するサイズに切断した。膜を、ペトリディッシュ内における０．１Ｎ ＨＣｌ中ですすいだ。水中に１０％のＮ−エチル−Ｎ’−（３−ヂメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）水溶液（使用直前にＥＤＣを作製する）約５ｍｌを用いて、撹拌しながら１５分間にわたり、膜をＥＤＣ中に浸漬させた。膜を滅菌水中ですすぎ、一晩にわたり通気乾燥させた。
【０３３９】
アミノ末端プローブの２０μＭ溶液は、以下の通りに作製した：
１．（０．５Ｍ重炭酸Ｎａ）原液に由来する２００μＭプローブ溶液のうち５０μｌを、
２．４４５μｌの０．５Ｍ重炭酸Ｎａ溶液に混合し、
３．次いで、これに、総容量が５００μｌとなるように、５μｌの食用色素（黄色１号；赤色〜青緑色）を添加し、
４．調製された溶液中にピンを浸し、該ピンを既に調製したＢｉｏｄｙｎｅ Ｃ膜に１秒間にわたり接触させることにより該Ｂｉｏｄｙｎｅ Ｃ膜上にピンからの液滴を滴下させ、これを２サイクルにわたり繰り返す。
【０３４０】
上記と同じプロトコールを用いるが、異なるプローブを用いる、別の溶液を調製する。プローブアレイが完成したら、次いで、
５．プローブアレイを有するＢｉｏｄｙｎｅ Ｃ膜を、０．１Ｎ ＮａＯＨ中で５秒間にわたり洗浄する。
６．次いで、２回目は滅菌水中で５秒間にわたり洗浄する。
７．次いで、対流熱乾燥により３５秒間にわたり乾燥させる。
８．完全に通気乾燥させる。
９．約１分間にわたり、０．１Ｎ ＮａＯＨ中ですすぐ。
１０．滅菌水中ですすぐ。
１１．完全に通気乾燥させる。
【０３４１】
本発明は、本明細書で説明される特定の実施形態により範囲が限定されないものとする。実際、本明細書で説明された実施形態に加えての、本発明に対する各種の改変は、上述の説明から当業者には明らかであろう。このような改変は、添付の特許請求の範囲内に入ることを意図する。
【０３４２】
本明細書で引用されるすべての参考文献は、各個別の刊行物、特許、または特許出願が、参照により、すべての目的に対してその全体において組込まれることが具体的かつ個別に示されたと仮定する場合と同程度に、参照により、すべての目的に対してその全体において本明細書に組込まれる。
【０３４３】
任意の刊行物の引用は、出願年月日以前におけるその開示についてのものであり、本発明が、先行発明のためにこのような刊行物に先行する権利がないことの容認として解釈されるべきではない。
【符合の説明】
【０３４４】
３２ 弁
１０１ 試料調製領域
１０２ 核酸増幅領域
１０３ 核酸解析領域
１１１ 試薬リザーバー
１１２ 核酸増幅リアクター
１１３ 解析領域リザーバー
１１４ 廃棄物リザーバー
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象試料を解析するためのマイクロ流体デバイスであって、
ａ）マイクロ流体デバイスの本体
を含み、前記マイクロ流体デバイス本体が、
ｉ）試料調製領域と、
ｉｉ）核酸増幅領域と、
ｉｉｉ）核酸解析領域と、
ｉｖ）ネットワーク内において相互連結された複数の流体チャネルと
を含み、
試料調製領域、核酸増幅領域、および核酸解析領域の各々が、前記ネットワーク内における複数の流体チャネルの少なくとも１つにより、他の２つの領域の少なくとも１つと流体的に相互連結されるマイクロ流体デバイス。
【請求項２】
対象試料を解析するためのマイクロ流体デバイスであって、
ａ）マイクロ流体デバイスの本体
を含み、前記マイクロ流体デバイス本体が、
ｉ）試料調製領域と、
ｉｉ）核酸増幅領域と、
ｉｖ）ネットワーク内において相互連結された複数の流体チャネルと
を含み、
試料調製領域および核酸増幅領域の各々が、前記ネットワーク内における複数の流体チャネルの少なくとも１つにより、他の領域と流体的に相互連結されるマイクロ流体デバイス。
【請求項３】
マイクロ流体デバイス本体の選択される領域に、周囲圧力に対して陽圧または陰圧を加えることが可能な差圧供給源を含む、請求項１または２に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項４】
差圧供給源およびマイクロ流体デバイス本体に作動的に連結される差圧送達システムを含む、請求項１または２に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項５】
差圧供給源から所望の開位置または閉位置への圧力を変換するための、複数の流体チャネルの少なくとも２つの中に配置される、少なくとも１つのダイアフラムを含む、請求項１または２に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項６】
試料調製領域が、
試料取込みリザーバーと、
試料調製試薬リザーバーと、
試料精製媒体と
を含み、
試料取込みリザーバー、試料調製試薬リザーバー、および試料精製媒体が、流体的に相互連結される、請求項１または２に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項７】
試料精製媒体が配置される試料精製媒体リザーバーを含む、請求項６に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項８】
試料精製媒体が試料精製リザーバーの底部に配置される、請求項７に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項９】
試料精製媒体が複数の流体チャネルの１つに配置される、請求項６に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１０】
核酸増幅領域が、
核酸増幅リアクターと、
核酸増幅試薬リザーバーと、
核酸増幅産物リザーバーと
を含み、
核酸増幅リアクター、核酸増幅試薬リザーバー、および核酸増幅産物リザーバーが、流体的に相互連結される、請求項１または２に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１１】
核酸増幅産物抽出領域を含む、請求項２に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１２】
核酸増幅産物抽出領域が核酸抽出リザーバーを含む、請求項１０に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１３】
試料精製媒体がシリカ膜である、請求項６に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１４】
対象試料が、流体材料、気体材料、液体材料中に実質的に溶解した固体材料、エマルジョン材料、スラリー材料、またはその中に粒子が懸濁する流体材料である、請求項１または２に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１５】
対象試料が生物学的材料を含む、請求項１または２に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１６】
対象試料が流体中における細胞の懸濁液を含む、請求項１または２に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１７】
マイクロ流体デバイス本体が、複数層の弱溶剤接着ポリスチレンを含む、請求項１または２に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１８】
試料取込みリザーバーを含む、請求項１または２に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１９】
試料調製領域が、試料取込みリザーバーと流体的に連結された試料混合ダイアフラムを含む、請求項１８に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２０】
マイクロ流体デバイス本体が、試料精製媒体を通気乾燥させる手段を含む、請求項１または２に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２１】
試料調製領域が廃棄物リザーバーを含む、請求項１または２に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２２】
試料調製領域が溶出試薬リザーバーを含む、請求項１または２に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２３】
試料調製試薬が磁気ビーズを含む、請求項６に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２４】
試料調製試薬が溶解試薬を含む、請求項６に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２５】
核酸増幅リアクターが熱サイクルリアクターである、請求項１または２に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２６】
熱サイクルリアクターの底部がポリスチレンの薄層である、請求項２５に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２７】
熱サイクルリアクターの底部が、熱サイクリングの間に、マイクロ流体デバイス本体上または本体内には配置されないヒーターにより加熱される、請求項２５に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２８】
核酸増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素（ＲＴ−）ＰＣＲ、ｃＤＮＡ末端迅速増幅（ＲＡＣＥ）、ローリングサイクル増幅、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写物媒介増幅（ＴＭＡ）、およびリガーゼ連鎖反応からなる群から選択される、請求項１または２に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２９】
核酸解析領域が、対象核酸と対象核酸のプローブとの間の相互作用を検出するための領域を含む、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項３０】
対象核酸を検出する方法であって、
対象核酸を含有することが疑われる試料を得るステップと、
請求項１に記載のマイクロ流体デバイスを用意するステップと、
試料調製領域に試料を導入するステップと、
核酸増幅用に試料を調製するステップと、
調製された試料を核酸増幅領域に導入するステップと、
核酸増幅領域において核酸増幅反応を実行して対象核酸を増幅するステップと、
増幅された対象核酸を核酸解析領域に導入するステップと、
増幅された対象核酸を検出するステップと
を含む方法。
【請求項３１】
対象核酸を検出する方法であって、
対象核酸を含有することが疑われる試料を得るステップと、
請求項２に記載のマイクロ流体デバイスを用意するステップと、
試料調製領域に試料を導入するステップと、
核酸増幅用に試料を調製するステップと、
調製された試料を核酸増幅領域に導入するステップと、
核酸増幅領域において核酸増幅反応を実行して対象核酸を増幅するステップと、
増幅された対象核酸を検出するステップと
を含む方法。
【請求項３２】
対象核酸が対象の疾患または障害と関連する、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
検出するステップが、増幅された対象核酸と対象核酸のプローブとの間の相互作用を検出するステップを含む、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３４】
検出するステップが、色強度、蛍光強度、電気信号強度、または化学発光強度を可視化するステップを含む、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３５】
検出するステップが、試料中における少なくとも１種の対象分子に対応する強度値を発生させるステップを含む、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３６】
強度値が、色強度値、蛍光強度値および化学発光強度値、電流または電圧からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
色強度値を発生させるステップが、
試料に対応する画像をデジタル化して複数の画素を発生させるステップと、
複数の画素の各々に対して複数の数値を与えるステップと、
数値を生じさせて色強度値を提供するステップと
を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
閾値を計算するステップと、色強度値を閾値と比較して対象分子を検出するステップとをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
少なくとも１つの色強度値と閾値とをデータベースに保存するステップをさらに含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
閾値が、少なくとも１種の陰性対照試料を用いて計算される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
被験体における対象の疾患または障害の存在または素因を判定する方法であって、
ａ）対象の疾患または障害と関連する核酸を含有することが疑われる試料を被験体から得るステップと、
ｂ）試料中における対象の疾患または障害と関連する核酸を検出するステップと
を含み、前記検出するステップが、
請求項１に記載のマイクロ流体デバイスを用意するステップと、
試料調製領域に試料を導入するステップと、
核酸増幅用に試料を調製するステップと、
調製された試料を核酸増幅領域に導入するステップと、
核酸増幅領域において核酸増幅反応を実行して対象核酸を増幅するステップと、
増幅された対象核酸を核酸解析領域に導入するステップと、
増幅された対象核酸を検出するステップと
を含み、
増幅された対象核酸の検出が、対象の疾患または障害の存在または素因と関連する方法。
【請求項４２】
被験体における対象の疾患または障害の存在または素因を判定する方法であって、
ａ）対象の疾患または障害と関連する核酸を含有することが疑われる被験体を対象から得るステップと、
ｂ）試料中における対象の疾患または障害と関連する核酸を検出するステップと
を含み、前記検出するステップが、
請求項２に記載のマイクロ流体デバイスを用意するステップと、
試料調製領域に試料を導入するステップと、
核酸増幅用に試料を調製するステップと、
調製された試料を核酸増幅領域に導入するステップと、
核酸増幅領域において核酸増幅反応を実行して対象核酸を増幅するステップと、
増幅された対象核酸を検出するステップと
を含み、
増幅された対象核酸の検出が、対象の疾患または障害の存在または素因と関連する方法。
【請求項４３】
前記検出するステップが、増幅された対象核酸の量（またはレベル）を決定するステップを含み、
前記量（またはレベル）を対象核酸のあらかじめ選択された量（またはレベル）と比較するステップをさらに含む、請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記量（またはレベル）とあらかじめ選択された量（またはレベル）との間の差が、対象の疾患または障害の存在または素因を示す、請求項４３に記載の方法。
【請求項１】
対象試料を解析するためのマイクロ流体デバイスであって、
ａ）マイクロ流体デバイスの本体
を含み、前記マイクロ流体デバイス本体が、
ｉ）試料調製領域と、
ｉｉ）核酸増幅領域と、
ｉｉｉ）核酸解析領域と、
ｉｖ）ネットワーク内において相互連結された複数の流体チャネルと
を含み、
試料調製領域、核酸増幅領域、および核酸解析領域の各々が、前記ネットワーク内における複数の流体チャネルの少なくとも１つにより、他の２つの領域の少なくとも１つと流体的に相互連結されるマイクロ流体デバイス。
【請求項２】
対象試料を解析するためのマイクロ流体デバイスであって、
ａ）マイクロ流体デバイスの本体
を含み、前記マイクロ流体デバイス本体が、
ｉ）試料調製領域と、
ｉｉ）核酸増幅領域と、
ｉｖ）ネットワーク内において相互連結された複数の流体チャネルと
を含み、
試料調製領域および核酸増幅領域の各々が、前記ネットワーク内における複数の流体チャネルの少なくとも１つにより、他の領域と流体的に相互連結されるマイクロ流体デバイス。
【請求項３】
マイクロ流体デバイス本体の選択される領域に、周囲圧力に対して陽圧または陰圧を加えることが可能な差圧供給源を含む、請求項１または２に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項４】
差圧供給源およびマイクロ流体デバイス本体に作動的に連結される差圧送達システムを含む、請求項１または２に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項５】
差圧供給源から所望の開位置または閉位置への圧力を変換するための、複数の流体チャネルの少なくとも２つの中に配置される、少なくとも１つのダイアフラムを含む、請求項１または２に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項６】
試料調製領域が、
試料取込みリザーバーと、
試料調製試薬リザーバーと、
試料精製媒体と
を含み、
試料取込みリザーバー、試料調製試薬リザーバー、および試料精製媒体が、流体的に相互連結される、請求項１または２に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項７】
試料精製媒体が配置される試料精製媒体リザーバーを含む、請求項６に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項８】
試料精製媒体が試料精製リザーバーの底部に配置される、請求項７に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項９】
試料精製媒体が複数の流体チャネルの１つに配置される、請求項６に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１０】
核酸増幅領域が、
核酸増幅リアクターと、
核酸増幅試薬リザーバーと、
核酸増幅産物リザーバーと
を含み、
核酸増幅リアクター、核酸増幅試薬リザーバー、および核酸増幅産物リザーバーが、流体的に相互連結される、請求項１または２に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１１】
核酸増幅産物抽出領域を含む、請求項２に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１２】
核酸増幅産物抽出領域が核酸抽出リザーバーを含む、請求項１０に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１３】
試料精製媒体がシリカ膜である、請求項６に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１４】
対象試料が、流体材料、気体材料、液体材料中に実質的に溶解した固体材料、エマルジョン材料、スラリー材料、またはその中に粒子が懸濁する流体材料である、請求項１または２に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１５】
対象試料が生物学的材料を含む、請求項１または２に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１６】
対象試料が流体中における細胞の懸濁液を含む、請求項１または２に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１７】
マイクロ流体デバイス本体が、複数層の弱溶剤接着ポリスチレンを含む、請求項１または２に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１８】
試料取込みリザーバーを含む、請求項１または２に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１９】
試料調製領域が、試料取込みリザーバーと流体的に連結された試料混合ダイアフラムを含む、請求項１８に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２０】
マイクロ流体デバイス本体が、試料精製媒体を通気乾燥させる手段を含む、請求項１または２に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２１】
試料調製領域が廃棄物リザーバーを含む、請求項１または２に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２２】
試料調製領域が溶出試薬リザーバーを含む、請求項１または２に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２３】
試料調製試薬が磁気ビーズを含む、請求項６に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２４】
試料調製試薬が溶解試薬を含む、請求項６に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２５】
核酸増幅リアクターが熱サイクルリアクターである、請求項１または２に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２６】
熱サイクルリアクターの底部がポリスチレンの薄層である、請求項２５に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２７】
熱サイクルリアクターの底部が、熱サイクリングの間に、マイクロ流体デバイス本体上または本体内には配置されないヒーターにより加熱される、請求項２５に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２８】
核酸増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素（ＲＴ−）ＰＣＲ、ｃＤＮＡ末端迅速増幅（ＲＡＣＥ）、ローリングサイクル増幅、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写物媒介増幅（ＴＭＡ）、およびリガーゼ連鎖反応からなる群から選択される、請求項１または２に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２９】
核酸解析領域が、対象核酸と対象核酸のプローブとの間の相互作用を検出するための領域を含む、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項３０】
対象核酸を検出する方法であって、
対象核酸を含有することが疑われる試料を得るステップと、
請求項１に記載のマイクロ流体デバイスを用意するステップと、
試料調製領域に試料を導入するステップと、
核酸増幅用に試料を調製するステップと、
調製された試料を核酸増幅領域に導入するステップと、
核酸増幅領域において核酸増幅反応を実行して対象核酸を増幅するステップと、
増幅された対象核酸を核酸解析領域に導入するステップと、
増幅された対象核酸を検出するステップと
を含む方法。
【請求項３１】
対象核酸を検出する方法であって、
対象核酸を含有することが疑われる試料を得るステップと、
請求項２に記載のマイクロ流体デバイスを用意するステップと、
試料調製領域に試料を導入するステップと、
核酸増幅用に試料を調製するステップと、
調製された試料を核酸増幅領域に導入するステップと、
核酸増幅領域において核酸増幅反応を実行して対象核酸を増幅するステップと、
増幅された対象核酸を検出するステップと
を含む方法。
【請求項３２】
対象核酸が対象の疾患または障害と関連する、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
検出するステップが、増幅された対象核酸と対象核酸のプローブとの間の相互作用を検出するステップを含む、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３４】
検出するステップが、色強度、蛍光強度、電気信号強度、または化学発光強度を可視化するステップを含む、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３５】
検出するステップが、試料中における少なくとも１種の対象分子に対応する強度値を発生させるステップを含む、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３６】
強度値が、色強度値、蛍光強度値および化学発光強度値、電流または電圧からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
色強度値を発生させるステップが、
試料に対応する画像をデジタル化して複数の画素を発生させるステップと、
複数の画素の各々に対して複数の数値を与えるステップと、
数値を生じさせて色強度値を提供するステップと
を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
閾値を計算するステップと、色強度値を閾値と比較して対象分子を検出するステップとをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
少なくとも１つの色強度値と閾値とをデータベースに保存するステップをさらに含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
閾値が、少なくとも１種の陰性対照試料を用いて計算される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
被験体における対象の疾患または障害の存在または素因を判定する方法であって、
ａ）対象の疾患または障害と関連する核酸を含有することが疑われる試料を被験体から得るステップと、
ｂ）試料中における対象の疾患または障害と関連する核酸を検出するステップと
を含み、前記検出するステップが、
請求項１に記載のマイクロ流体デバイスを用意するステップと、
試料調製領域に試料を導入するステップと、
核酸増幅用に試料を調製するステップと、
調製された試料を核酸増幅領域に導入するステップと、
核酸増幅領域において核酸増幅反応を実行して対象核酸を増幅するステップと、
増幅された対象核酸を核酸解析領域に導入するステップと、
増幅された対象核酸を検出するステップと
を含み、
増幅された対象核酸の検出が、対象の疾患または障害の存在または素因と関連する方法。
【請求項４２】
被験体における対象の疾患または障害の存在または素因を判定する方法であって、
ａ）対象の疾患または障害と関連する核酸を含有することが疑われる被験体を対象から得るステップと、
ｂ）試料中における対象の疾患または障害と関連する核酸を検出するステップと
を含み、前記検出するステップが、
請求項２に記載のマイクロ流体デバイスを用意するステップと、
試料調製領域に試料を導入するステップと、
核酸増幅用に試料を調製するステップと、
調製された試料を核酸増幅領域に導入するステップと、
核酸増幅領域において核酸増幅反応を実行して対象核酸を増幅するステップと、
増幅された対象核酸を検出するステップと
を含み、
増幅された対象核酸の検出が、対象の疾患または障害の存在または素因と関連する方法。
【請求項４３】
前記検出するステップが、増幅された対象核酸の量（またはレベル）を決定するステップを含み、
前記量（またはレベル）を対象核酸のあらかじめ選択された量（またはレベル）と比較するステップをさらに含む、請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記量（またはレベル）とあらかじめ選択された量（またはレベル）との間の差が、対象の疾患または障害の存在または素因を示す、請求項４３に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０Ａ】
【図３０Ｂ】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０Ａ】
【図３０Ｂ】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【公表番号】特表２０１１−５０１６６５（Ｐ２０１１−５０１６６５Ａ）
【公表日】平成２３年１月１３日（２０１１．１．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２９１３０（Ｐ２０１０−５２９１３０）
【出願日】平成２０年１０月１０日（２００８．１０．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７９６５９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０４９２６８
【国際公開日】平成２１年４月１６日（２００９．４．１６）
【出願人】（５１０１００４０５）レオニックス，インコーポレイテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１月１３日（２０１１．１．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月１０日（２００８．１０．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７９６５９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０４９２６８
【国際公開日】平成２１年４月１６日（２００９．４．１６）
【出願人】（５１０１００４０５）レオニックス，インコーポレイテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
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