耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラ−ゼおよびそれをコードする遺伝子
【課題】Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳを製造するため、高濃度の基質存在下で効率良く、長期間安定して使用できる酵素触媒として、耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラ−ゼをコードする遺伝子を単離、提供する。
【解決手段】ストレプトマイセス属細菌から、Ｌ−スレオニンアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離し、特定の１ないし数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつ耐熱性のＬ−スレオニンアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を得た。
【解決手段】ストレプトマイセス属細菌から、Ｌ−スレオニンアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離し、特定の１ないし数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつ耐熱性のＬ−スレオニンアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を得た。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、産業上有用なβ−ヒドロキシアミノ酸誘導体であるＬ−スレオ−３，４−ジヒドロキシフェニルセリン（以下、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳと略記する）を合成するのに有利な酵素遺伝子および従来知られていない耐熱性を有するＬ−スレオニンアルドラーゼを遺伝子工学的手法により提供するものであり、さらに、この遺伝子を導入した組換え微生物を利用した合成反応によって、産業上有用なＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの製造法を提供するものである。より具体的には、本発明は、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの合成に有用な耐熱性のＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子およびその組換えベクターと形質転換体を提供し、この遺伝子を導入した組換え微生物による合成反応により、産業上有用なβ−ヒドロキシアミノ酸誘導体であるＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの製造法を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
β−ヒドロキシアミノ酸誘導体の一種であるＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳは、体内で芳香族アミノ酸脱炭酸酵素により天然型のノルアドレナリンとなり、すくみ足や起立性低血圧に有効なノルアドレナリンの前駆物質として、年間６０億円以上の市場があるパ−キンソン病の治療薬である。これらは現在、化学合成法により合成されているが、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの化学合成については多段階の面倒な保護・脱保護を必要とし、また、化学合成物質は４種類の異性体の混合物からなり、目的のＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳを得るためには繁雑な分離工程や分割工程を必要とし、非常に高価な医薬品となる。即ち、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンを強アルカリ存在下で縮合させ、ラセミ−スレオ／エリスロ−フェニルセリン誘導体を得た後、スレオ／エリスロ体の相互分離処理を行い、エリスロ体を除く。次に、得られたラセミ−スレオ−フェニルセリン誘導体のアミノ酸部分に置換基を導入した後、キニン、ブルシン等の光学分割剤を用いて光学分割を行い、最後にアミノ基部分の置換基を除去しなければならないなど非常に複雑なプロセスである。
【０００３】
一方、酵素による一段階合成法は化学合成と比べ、面倒な保護・脱保護を必要としないなどメリットは大きく、さらに安価な基質を利用することにより安価に合成することができる。酵素による一段階合成法は最も簡単かつ効率的で、近年最も注目され、様々なβ−ヒドロキシアミノ酸の一段階合成に利用されている。酵素による一段階合成法でβ−ヒドロキシアミノ酸誘導体を合成できる酵素としてスレオニンアルドラ−ゼが知られている。スレオニンアルドラ−ゼ（ＥＣ ４．１．２．５）は、β−ヒドロキシアミノ酸を分解して、グリシンとアルデヒドを生成する反応を触媒することで知られている酵素である。この酵素は二つの不斉炭素原子を有するスレオニンを基質とした場合、α−位の立体特異性によって、Ｌ−タイプとＤ−タイプに区別される。さらに、β−位の立体特異性によりＬ−スレオニンにのみ作用するＬ−スレオニンアルドラ−ゼ、Ｌ−アロスレオニンにのみ作用するＬ−アロスレオニンアルドラ−ゼ、さらにＬ−スレオニンとＬ−アロスレオニンの両方に作用する低立体選択性Ｌ−スレオニンアルドラ−ゼに分類されている。Ｄ−タイプでも同様に分けられる。
【０００４】
スレオニンアルドラ−ゼ活性は、現在まで酵母、放線菌、細菌など種々の微生物に広く見出されている。これまでの研究から、スレオニンアルドラーゼは幅広い範囲のβ−ヒドロキシアミノ酸に対する分解能が高いことが明らかとなっている。また、スレオニンアルドラーゼは前記の逆反応も媒介し、様々なβ−ヒドロキシアミノ酸の一段階合成能力を有することも報告されている（非特許文献１〜３）。そして、産業上の利用に関する観点からは、長期間安定して合成反応に使用できる、より高い熱安定性をもつ酵素が求められている。
しかし、高熱菌［例えば、ピロコッカス・ホリコシＯＴ３（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ ＯＴ３）や、アエロパイラム・ペルニックスＫ１（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ Ｋ１）やスルフォロブス・トコダイイ・ストレイン７（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉ ｓｔｒａｉｎ７）など］の最近のゲノム解析の結果、そのような高熱菌にはＬ−スレオニンアルドラ−ゼは存在しないことが示唆されていることから、通常の手段では耐熱性のＬ−スレオニンアルドラ−ゼを入手することは極めて困難である。
【０００５】
酵素法による一段階合成法は最も簡単かつ効率的で、近年最も注目され、様々な物質の合成反応に利用されている。しかし、一段階合成法を用いた合成反応は、平衡の状態が正反応（Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの分解反応側）に偏っているため、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳ生成量が低くなる問題点や、酵素に対する高濃度の基質による阻害作用の問題、そして酵素自身の不安定性など一段階合成プロセスを用いた合成反応へ利用するには多くの技術解決課題が残されている。
【０００６】
酵素による一段階合成法は、エシェリヒア属等により得られるＬ−スレオニンアルドラ−ゼや、バチルス属より得られるフェニルセリンアルドラ−ゼに様々なアルデヒド誘導体とグリシンを作用させＬ−スレオ−フェニルセリン誘導体を得る方法が知られている（特許文献１〜５）。しかし、このような酵素による一段階合成反応に利用されている大体のＬ−スレオニンアルドラ−ゼは熱安定性が低く、例えば約４５〜６５℃の比較的高温下におけるＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの合成反応中に失活してしまい、繰り返し酵素反応を行う際、目的するＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの合成量が低下する問題点があった。
【特許文献１】特公昭５２−４６３１３号公報
【特許文献２】特公昭５１−６２３９号公報
【特許文献３】特公昭５４−３９５２号公報
【特許文献４】特公昭５４−１２５５４号公報
【特許文献５】特開平９−２３８６８０号公報
【非特許文献１】キムラ・ティー（Ｋｉｍｕｒａ，Ｔ．）他３名、ジヤーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエテイー（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）、１９９７年、第１１９巻、ｐ．１１７３４−１１７４２
【非特許文献２】リウ・ジェイ・キュー（Ｌｉｕ，Ｊ．Ｑ）他５名、アプライド・マイクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロジー（Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）、１９９８年、第４９巻、ｐ．７０２−７０８
【非特許文献３】日本農芸化学会誌、１９９８年、第７２（５）巻、ｐ．７４６−７４７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明はβ−ヒドロキシアミノ酸誘導体であるＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳを酵素的合成法により製造するため、高濃度の基質の存在下でも効率良く、しかも、長期間安定して使用できる酵素触媒のＬ−スレオニンアルドラ−ゼをコードする遺伝子を取得し、そのような遺伝子を導入・発現した組換え微生物の利用により、上記のＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳを合成する方法を提供しようとするものである。
より詳しくは、本発明はＬ−スレオニンアルドラ−ゼを熱安定化させることにより、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの合成反応に酵素の活性低下が防止され、本発明の耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子を含有する菌体を用いる長時間の繰り返し合成反応においても活性低下が少ない技術を提供することを課題とする。すなわち、安定した合成能を保っている耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラ−ゼを用いて長期間Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの合成を可能にすることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、放線菌であるストレプトマイセス属から、β−ヒドロキシアミノ酸誘導体であるＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの合成に関与する遺伝子を取得するべく鋭意検討を行った。その結果、ストレプトマイセス属細菌から取得したＬ−スレオニンアルドラ−ゼをコードする遺伝子がβ−ヒドロキシアミノ酸誘導体であるＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの合成に利用できることを見出した。さらに、このストレプトマイセス属細菌から取得したＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子に、例えばランダム変異導入法による変異遺伝子ライブラリーを作製し、該ライブラリーから耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼを産生する変異株を取得し、さらに研究を重ね、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、
［１］ 下記の（１）、（２）、（３）または（４）に示す遺伝子：
（１）配列番号４、５、６又は７に示す塩基配列からなる遺伝子：
（２）配列番号４、５、６又は７に示す塩基配列のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ耐熱性のＬ−スレオニンアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子：
（３）配列番号９、１０、１１又は１２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子：
（４）配列番号９に示すアミノ酸配列の１７７番目のチロシン、配列番号１０に示すアミノ酸配列の１６９番目のスレオニン、配列番号１１に示すアミノ酸配列の１０４番目のアスパラギン酸、または配列番号１２に示すアミノ酸配列の１９番目のイソロイシンが保持され、当核アミノ酸配列９、１０、１１又は１２で示されるアミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつ耐熱性のＬ−スレオニンアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
［２］ 下記の（１）又は（２）に示すタンパク質：
（１）配列番号９、１０、１１又は１２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質：
（２）配列番号９に示すアミノ酸配列の１７７番目のチロシン、配列番号１０に示すアミノ酸配列の１６９番目のスレオニン、配列番号１１に示すアミノ酸配列の１０４番目のアスパラギン酸、または配列番号１２に示すアミノ酸配列の１９番目のイソロイシンが保持され、当核アミノ酸配列９、１０、１１又は１２で示されるアミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつ耐熱性のＬ−スレオニンアルドラーゼ活性を有するタンパク質、
［３］ 前項１に記載の遺伝子を含有する組み換えベクター、
［４］ 前項３に記載の遺伝子を含有する組み換えベクターを含む微生物、
［５］ 宿主が大腸菌である前項４に記載の微生物、
［６］ ＮＩＴＥ Ｐ−１１６、ＮＩＴＥ Ｐ−１１７、ＮＩＴＥ Ｐ−１１８およびＮＩＴＥ Ｐ−１１９として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託された微生物、および
［７］ 前項４、５または６に記載の微生物またはその調製物を、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドおよびグリシンを含有する液と接触せしめ、前記液中にＬ−スレオ−３，４−ジヒドロキシフェニルセリンを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするＬ−スレオ−３，４−ジヒドロキシフェニルセリンの製造法、
に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンからＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの合成反応を触媒する耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子が提供される。
また、本発明の耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼは、該酵素自身が熱に対して安定であるので、これらの耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子を保有する菌体もしくはその調製物を用いて、安定的にＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳを合成することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
Ｌ−スレオニンアルドラーゼは主としてＬ−スレオニンをグリシンとアセトアルデヒドに分解する反応を触媒する酵素である。又、この酵素は分解反応以外に逆反応としてグリシンとアセトアルデヒドからＬ−スレオニンとＬ−アロスレオニンの合成反応も触媒する酵素である。この逆（合成）反応を利用して、グリシンと３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドからＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳを熱安定的に合成するのが本発明の目的である。従って、Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子に変異を導入して、耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子および該遺伝子を挿入した微生物を創製し、耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼが微生物内で著量蓄積できれば、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの生産に有効に使用できると考えられる。
本発明の耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼとは、例えば６５℃２０分の加熱後でも５０％以上の残存活性を示すなど、高い耐熱安定性を持つＬ−スレオニンアルドラーゼをいう。
本発明の耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼとしては、配列番号９〜１２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる。また、耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼには、前記配列番号９〜１２において、配列番号９に示すアミノ酸配列の１７７番目のチロシン、配列番号１０に示すアミノ酸配列の１６９番目のスレオニン、配列番号１１に示すアミノ酸配列の１０４番目のアスパラギン酸、または配列番号１２に示すアミノ酸配列の１９番目のイソロイシンが保持され、当該配列番号９、１０、１１又は１２で示されるアミノ酸配列において、１乃至数個（約２〜２０個、好ましくは約２〜１０個程度）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼ活性を有するタンパク質等も含まれる。
【００１２】
Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子に変異を導入するとは、基礎となるＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子の塩基配列中の塩基が１〜数個（約２〜１０個）他の塩基に置換、または塩基が付加あるいは削除され、基礎となるＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子から耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子へと変異させることをいう。
【００１３】
上記変異操作に供される基礎となるＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子（以下、変異を導入する基となる遺伝子ともいう。）としては、Ｌ−スレオニンアルドラーゼを有する動物、植物、又は微生物由来のいずれの遺伝子でも使用できるが、工業的な利用には微生物由来のものが好ましい。前記微生物としては、例えばストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）を好ましく挙げることができる。
変異を導入する基となる遺伝子は、好ましくは、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）に属す微生物由来のＤＮＡ、さらに好ましくは、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）由来のＤＮＡ、とりわけ好ましくはストレプトマイセス・セリカラーＡ３（２）株（以下、親株ということもある。）由来の遺伝子が挙げられる。ストレプトマイセス・セリカラーＡ３（２）株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部(日本、木更津市)にストレプトマイセス・バイオラセルーバー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｏｌａｃｅｒｕｂｅｒ）ＮＢＲＣ１５１４６株として保存されており、誰でも入手可能である。
【００１４】
変異を導入する基となる親株由来の遺伝子としては、例えば配列番号３で表される塩基配列のＤＮＡを含む遺伝子を挙げることができる。
ただし、変異を導入する基となる遺伝子は、上記当該の遺伝子に限定されず、例えば配列番号８で表されるアミノ酸配列を含むＬ−スレオニンアルドラーゼをコードするすべての遺伝子を含む。
変異を導入する基となる遺伝子に変異を導入された耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子としては、例えば配列番号４〜７で表される塩基配列のＤＮＡを含む遺伝子を挙げることができる。
また、前記配列番号４〜７で示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含む遺伝子も、本発明に用いられる遺伝子である。
【００１５】
なお、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、例えば配列番号４に示す塩基配列をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法またはプラーク・ハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるＤＮＡを意味する。なお、ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、例えば相同性が高いＤＮＡ同士、少なくとも配列番号４で示される塩基配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約８０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは、約０．１〜２倍程度の濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる。）、温度約６５℃程度でのハイブリダイズ条件をいう。なお、相同性は塩基配列解析ソフト、例えばＥＭＢＯＳＳなどにより計算され得る。
【００１６】
また、本発明において「遺伝子」または「ＤＮＡ」という用語には、ＤＮＡのみならずそのｍＲＮＡおよびｃＤＮＡも含むものとする。したがって、本発明の遺伝子には、これらのＤＮＡ、ｍＲＮＡおよびｃＤＮＡの全てが含まれる。
【００１７】
本発明において「相補的な配列」とは、Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする塩基配列に対して塩基対合則（アデニン／チミン、シトシン／グアニン）に従って形成される塩基配列をいう。
【００１８】
ストレプトマイセス・セリカラーＡ３（２）株からのＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子の取得および変異の導入は、例えば以下の方法により実施することができる。
【００１９】
まず、ストレプトマイセス・セリカラーＡ３（２）株を栄養培地で培養し菌体（微生物）を得る。栄養培地は、通常の微生物の培養に使用される培地であればいずれも好ましく用いることができる。
【００２０】
菌体（微生物）からのゲノムＤＮＡの抽出は公知の方法で行なうことができ、また市販のＤＮＡ抽出キットを用いて簡便に行なうことができる。市販のＤＮＡ抽出キットとしては、例えばＰｕｒｅｇｅｎｅ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｇｅｎｔｒａ社製）、ＧＦＸ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（アマシャムバイオサイエンス社製）、ＭａｇＰｒｅｐ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｋｉｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
次に、ストレプトマイセス・セリカラーＡ３（２）株の全塩基配列はデータベース上で公開されているので、Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子の配列も閲覧することができる（例えばＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＬ６４５８８２）。このＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＬ６４５８８２に示されるＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のＮ末端およびＣ末端配列の塩基配列をもとにオリゴヌクレオチドを設計する。設計したオリゴヌクレオチドをプライマーとして、上記で抽出したゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行い、Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードするＤＮＡを得る。このようなプライマーとして例えば配列番号１または２の塩基配列で示されるプライマーが挙げられる。配列番号１の塩基配列で示されるプライマーはＬ−スレオニンアルドラーゼのＮ末端配列の上流に制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列を、配列番号２の塩基配列で示されるプライマーはＬ−スレオニンアルドラーゼのＣ末端配列の下流に制限酵素ＢａｍＨＩの認識配列をそれぞれ追加したものである。なお、前記認識配列は前記に限定されず、後記するベクターが有する制限酵素部位に含まれる制限酵素の認識配列との関係から適宜選択するのが好ましい。ＰＣＲ反応は公知のＰＣＲ増幅装置、例えばサーマルサイクラー等を利用し得る。ＰＣＲのサイクルは、公知技術に従って行なわれてよく、例えばデナチュレーション→アニーリング→エクステンションを１サイクルとして、約１０〜１００サイクル、好ましくは約２０〜５０サイクル程度増幅するのが好ましい。
【００２２】
ＰＣＲによって得られたＤＮＡ断片を制限酵素、例えばＥｃｏＲＩと制限酵素ＢａｍＨＩなどで処理し、同じく両制限酵素で処理した発現ベクターと連結させることにより発現ベクターを得ることができる。該発現ベクターを公知の方法で例えば大腸菌などの微生物に挿入し上記遺伝子のクローニングを行ない得る。
【００２３】
大腸菌等の微生物への遺伝子の導入および該遺伝子の発現は遺伝子工学実験の常法に基づいて行うことができる。大腸菌や放線菌等の種々の微生物のベクターの情報や外来遺伝子の導入・発現法は、多くの実験書に記載されているので（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｒｕｓｓｅｌ，Ｄ．Ｗ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ， ２００１； Ｈｏｐｗｏｏｄ，Ｄ．Ａ．，Ｂｉｂｂ，Ｍ．Ｊ．，Ｃｈａｔｅｒ， Ｋ．Ｆ．，Ｂｒｕｔｏｎ，Ｃ．Ｊ．，Ｋｉｅｓｅｒ，Ｈ．Ｍ．，Ｌｙｄｉａｔｅ，Ｄ．Ｊ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｃ．Ｐ．，Ｗａｒｄ，Ｊ．Ｍ．，Ｓｃｈｒｅｍｐｆ，Ｈ．Ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｅ Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｎｏｒｗｉｃｈ，ＵＫ，１９８５）、それらに従ってベクターの選択、遺伝子の導入、発現を行うことができる。
【００２４】
クローニングされたストレプトマイセス・セリカラーＡ３（２）由来のＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子への変異の導入は、市販の変異導入用キットなどを用いることにより簡便に行なうことができる。すなわち、Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子が挿入されたベクターを用いて、変異導入用キットを該キットのプロトコールなどに従い実施することにより、Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子に非常に高い頻度でランダムに変異が導入され、同時に該変異した遺伝子（以下、変異遺伝子という。）がＰＣＲにより増幅され得る。このような変異導入用キットとしては、例えばＭｕｔａｚｙｍｅ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを含むＧｅｎｅＭｏｒｐｈ Ｒａｎｄｏｍ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒ（登録商標） Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）、Ｍｕｔａｎ（登録商標）−Ｓｕｐｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｍ（タカラバイオ株式会社製）またはＤｉｖｅｒｓｉｆｙ ＰＣＲランダム突然変異誘発キット（ＢＤバイオサイエンス社製）などが挙げられるがこれに限定されない。変異導入用キットによりＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子に変異が導入され増幅された、変異遺伝子のＰＣＲ産物を、ＤＮＡ精製用キットを用いて精製するのが好ましい。該精製用キットとしては、例えばＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎｅ社製）、ＳｐｉｎＣｌｅａｎ（登録商標） ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｂｉｏｔｅｃｈ社製）、ＡＭＰｕｒｅ（登録商標） ＰＣＲ産物クリーンアップキット（パーキンエルマー社製）、ＪＥＴＦＬＥＸ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｇｅｎｏｍｅｄ社製）、ＧＦＸ ９６ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、ＡｕｔｏＳｅｑ Ｇ−５０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）などが挙げられるがこれに限定されない。精製した変異遺伝子のＰＣＲ産物を前述した二種類の制限酵素、例えばＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩなどで切断した後、アガロースゲル電気泳動にかけて、約１ｋｂｐに相当するバンドをゲルから切り出して、更にアガロースゲルからＤＮＡの精製を行うのが好ましい。該精製は、市販キットを使用することができ、例えばＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎｅ社製）またはＳ．Ｎ．Ａ．Ｐ．ＵＶ−Ｆｒｅｅ Ｇｅｌ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）などを使用し得るが、これらに限定されない。精製された変異遺伝子のＰＣＲ産物は、適当な発現用ベクターに挿入され、次いで変異遺伝子が挿入された発現ベクターを、宿主（菌株）に挿入し、宿主を形質転換し、変異遺伝子ライブラリーを構築し得る。
【００２５】
発現用ベクターとしては、例えば細菌プラスミド（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ＋、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＥＴ １６ｂ、ｐＥＴ ３２ａ（＋）、ｐＣＩＴＥ ４ａ、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１、ｐＧＥＸ−５Ｘ−３、ｐＭＡＬ−ｐ２、ｐＭＡＬ−ｃ２、ｐＢｒｉｄｇｅ Ｖｅｃｔｏ、ｐＫＦ１８ｋ ＤＮＡ、ｐＫＦ１９ｋ ＤＮＡ、ｐＴｒｃ９９Ａ（アマシャムバイオサイエンス製）、ｐＳＰＯＲＴ １、Ｃｈａｒｍｏｍｉｄ ９−３６ ＤＮＡ、ｐＥＵ−ＤＦＲ、ｐＩＶＥＸ ２．３−ＭＣＳ、ｐＩＶＥＸ ２．４ｃ、ｐＩＶＥＸ ２．３、ｐＩＶＥＸ ２．４ｂ Ｎｄｅ、ｐＩＶＥＸ ２．４ａなど）、ファージＤＮＡ（ラムダファージなど）、酵母プラスミド（ｐＧ−１など）、哺乳類細胞用のベクターとしてのバキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなどのウイルスＤＮＡ、ＳＶ４０とその誘導体などが挙げられ、宿主において複製可能である限り他のいかなるベクターも用いることができる。
【００２６】
ベクターは例えば複製開始点、選択マーカー、プロモーターを含み、必要に応じてエンハンサー、転写終結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナルなどを含んでいてもよい。ベクターは、種々の制限酵素部位をその内部にもつポリリンカーを含んでいるか、または単一の制限酵素部位を含んでいることが望ましい。制限酵素部位としては、例えばＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩサイト、ＮｏｔＩサイト、ＳａｌＩサイト、ＫｐｎＩサイトまたはＨｉｎｄＩＩＩサイトなどが挙げられる。これら制限酵素サイトは、各々制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ、ＮｏｔＩ、ＳａｌＩ、ＫｐｎＩまたはＨｉｎｄＩＩＩなどで切断され得る。
ベクターへの遺伝子導入は、公知の手段で行なうことができる。具体的には、ベクター中の特定の制限酵素部位（例えばＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩなど）を特定の制限酵素（例えばＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩなど）によって切断し、その切断部位に本発明の遺伝子を挿入するのが好ましい。このようにして、本発明の遺伝子を含む組換えベクターを調製できる。
【００２７】
宿主としては、例えば細菌、例えば大腸菌（例えば、エシェリヒア・コリＪＭ１０９菌株など）、コリネバクテリウム属菌、バチルス属菌、ストレプトミセス、枯草菌など；真菌細胞、例えばアスペルギルス属菌株など；酵母細胞、例えばパン酵母、メタノール資化性酵母など；昆虫細胞、例えばドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９など；ヒト培養細胞を含む哺乳類細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、３Ｔ３、Ｃ１２７など；あるいはこれらのコンピテントセルなどが挙げられ、好ましくは大腸菌のコンピテントセルである。
形質転換は、例えば塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション、電気穿孔法などの公知の方法で行うことができる。
具体的には、例えば上述の変異遺伝子が挿入された発現ベクターとエシェリヒア・コリＪＭ１０９（以下、大腸菌ＪＭ１０９ともいう。）のコンピテントセルと混合することにより、形質転換された微生物を得ることができる。
【００２８】
上述の変異遺伝子が挿入された発現ベクターにて形質転換された微生物（以下、単に形質転換された微生物または形質転換微生物という。）は下記する微生物培養培地などで、培養温度約２０〜４０℃、培養時間約１〜７日間、培地のｐＨ約５．０〜８．０程度で培養されることが好ましい。
【００２９】
Ｌ−スレオニンアルドラーゼの活性の測定は、例えば以下の様にして行なうことができる。Ｌ−スレオニンアルドラーゼのＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの分解活性は、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳを含む反応液（以下、分解反応液ともいう。）に、形質転換微生物から調製した無細胞抽出液を添加し、約２０〜６０℃、好ましくは約４０〜５０℃、約１〜３０分間、好ましくは約１０〜１５分間反応を行い、生成したグリシンをＨＰＬＣにより定量することにより測定することができる。無細胞抽出液としては、形質転換微生物を例えば水媒体中で超音波やガラスビーズなどで破砕した後のＬ−スレオニンアルドラーゼを含む遠心分離上清などが挙げられる。
Ｌ−スレオニンアルドラーゼのＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳ合成活性は、形質転換微生物をグリシンと３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドを含む反応液（以下、合成反応液ともいう。）中で、約５〜５０℃、好ましくは約１０〜２０℃、約１〜２４時間、好ましくは約４〜６時間反応させ、生成したＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳを例えばＯＤＳカラムを用いたＨＰＬＣ法などにより定量することができる。
【００３０】
分解反応液および合成反応液の基礎となる溶液としては、形質転換された微生物の生育やＬ−スレオニンアルドラーゼの働きを阻害しない溶液であれば特に制限はなく、例えば微生物培養培地または緩衝液、あるいは水（例えば精製水、蒸留水、イオン交換水等）などが好ましく挙げられる。
【００３１】
微生物培養培地は、通常の微生物の培養に使用される培地であれば好ましく用いることができ、例えば炭素源、窒素源、無機塩類およびその他の栄養物質などを含有する天然培地または合成培地などが用いられる。
炭素源としては、例えばグルコース、フルクトース、シュークロース、マンノース、マルトース、マンニトール、キシロース、ガラクトース、澱粉、糖蜜、ソルビトールまたはグリセリンなどの糖質および糖アルコール、酢酸、クエン酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸またはグルコン酸などの有機酸、エタノールまたはプロパノールなどのアルコールなどが挙げられる。また、所望によりノルマルパラフィンなどの炭化水素なども用いることができる。炭素源は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を混合して使用してもよい。
これら炭素源の培地における濃度は通常約０．１〜１０％（ｗｔ）程度である。
窒素源としては、窒素化合物、例えば塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなどの無機もしくは有機アンモニウム化合物、尿素、アンモニア水、硝酸ナトリウムまたは硝酸カリウムなどが挙げられるが、これらに限定されない。また、コーンスティープリカー、肉エキス、ペプトン、ＮＺ−アミン、蛋白質加水分解物またはアミノ酸などの含窒素有機化合物なども使用可能である。窒素源は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を混合して使用してもよい。
窒素源の培地濃度は、使用する窒素化合物によっても異なるが、通常約０．１〜１０％（ｗｔ）程度である。
無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルトまたは炭酸カルシウムなどが挙げられる。これら無機塩は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を混合して使用してもよい。
無機塩類の培地濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常約０．０１〜１．０％（ｗｔ）程度である。
栄養物質としては、例えば肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、コーンスティープリカー、脱脂粉乳、脱脂大豆塩酸加水分解物または動植物若しくは微生物菌体のエキスやそれらの分解物などが挙げられる。
栄養物質の培地濃度は、使用する栄養物質によっても異なるが、通常約０．１〜１０％（ｗｔ）程度である。
培地のｐＨは約５．０〜８．０程度が好ましい。
【００３２】
好ましい微生物培養培地としては、ＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地；トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、食塩１０ｇ／Ｌ）、ＮＺＹＭ培地、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ、ＳＯＢ培地、２ｘＹＴ培地、ＡＨＣ培地、χ１７７６培地、Ｍ９培地、ＹＰＤ培地、ＳＤ培地、ＹＰＡＤ培地またはＳｕｐｅｒ ｂｒｏｔｈ培地などが挙げられる。
【００３３】
緩衝液としては、例えばリン酸バッファー、トリスバッファー、リン酸緩衝食塩水、酢酸緩衝液などが挙げられる。緩衝液のｐＨは、通常約５〜１０、さらに約６．５〜８．５が好ましい。
【００３４】
また、耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼを産生する変異株を上述の遺伝子ライブラリーから選択するためのスクリーニングは、例えば９６穴のディープウェルプレートなどを用いて、少量の培養で迅速に行なうことができる。即ち、前述変異遺伝子ライブラリーのコロニーを、例えばコロニーピッカーなどにより選抜し、該コロニーの菌体（微生物）を、例えば９６穴のプレートを用いて約０．１〜０．５ｍＬ、好ましくは約０．２５ｍＬの微生物培養培地などで培養を行ない、菌体を得る。この菌体とＬ−スレオニンを含む反応液を約３０〜５０℃、約１０〜１２０分、好ましくは約３０分間反応後、生成したアセトアルデヒドを発色剤（例えば、約１５Ｗ／Ｖ％酢酸アンモニウム、約０．５Ｖ／Ｖ％酢酸、約２０Ｖ／Ｖ％アセチルアセトンを含む溶液；以下、発色剤において同様である。）と反応させ黄色の発色により、Ｌ−スレオニンアルドラーゼ活性の確認を行なう。この一次スクリーニングで活性の確認されたコロニーの菌体（微生物）のみを次の二次スクリーニングに供する。
二次スクリーニングも同様に、例えば９６穴のディープウェルプレートなどを用いて、約０．１〜０．５ｍＬ、好ましくは約０．２５ｍＬの微生物培養培地などで培養を行なう。得られた菌体（微生物）を例えばガラスビーズと共に細胞破砕装置シェイクマスター（バイオメディカルサイエンス社製）などで微生物の細胞破砕後、遠心分離を行い、無細胞抽出液を得、更に約６０〜７０℃、好ましくは約６５℃、約１０〜３０分、好ましくは約２０分間の熱処理を行なう。耐熱性のない酵素はこの段階で失活してしまう。熱処理後の無細胞抽出液とＬ−スレオニンを含む反応液を約３０〜５０℃、約１０〜１２０分、好ましくは約６０分間反応後、生成したアセトアルデヒドを発色剤と反応させ黄色の発色により、Ｌ−スレオニンアルドラーゼ活性の確認を行なう。
【００３５】
前述のスクリーニングにより得られた耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子が導入され形質転換された変異微生物（以下、変異遺伝子導入微生物という。）を得ることができる。この形質転換された微生物の菌株を約５０〜２００μｇ／ｍＬ、好ましくは約１００μｇ／ｍＬのアンビシリンを含む微生物培養培地（例えばＬＢ培地など）で、約２０〜４０℃で約１時間〜４８時間、静置若しくは攪拌下に培養し、その培養液から遠心分離により菌体（微生物）を回収することにより取得できる。
【００３６】
回収された菌体からプラスミドＤＮＡを抽出する。プラスミドＤＮＡの抽出は、公知の方法で行なうことができ、また市販のＤＮＡ抽出キットを用いてプラスミドＤＮＡを簡便に抽出できる。市販のプラスミドＤＮＡ抽出キットとしては、例えば、例えばＱＩＡｑｕｉｃｋ ｐｌａｓｍｉｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）等が挙げられる。この抽出されたプラスミドＤＮＡの塩基配列を決定することにより、本発明の耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする全ＤＮＡを決定することができる。
【００３７】
得られたＤＮＡ断片の塩基配列は、例えばジデオキシヌクレオチド酵素法等、公知の方法により決定することができる。また、キャピラリー電気泳動システムを用い、検出には多色蛍光技術を使用して塩基配列を決定することもできる。また、ＤＮＡシークエンサー、例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７００ ＤＮＡ ＡＮＡＬＹＺＥＲ（アプライドバイオシステム社製）等を使用して自動的に分析して塩基配列を決定することもできる。
【００３８】
上記のようにして、耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を決定し、本発明に用いられる遺伝子として、例えば、配列番号４〜７に示す塩基配列を決定し得る。該配列番号４で示される塩基配列を含む遺伝子は、親株由来のＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子の塩基配列（配列番号３）の５２９番目のシトシンがチミンに変化した遺伝子である。該配列番号５で示される塩基配列を含む遺伝子は、親株由来のＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子の塩基配列（配列番号３）の５０５番目のグアニンがアデニンに変化した遺伝子である。該配列番号６で示される塩基配列を含む遺伝子は、親株由来のＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子の塩基配列（配列番号３）の３１０番目のグアニンがアデニンに変化した遺伝子である。該配列番号７で示される塩基配列を含む遺伝子は、親株由来のＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子の塩基配列（配列番号３）の５５番目のチミンがアデニンに変化した遺伝子である。
次いで該塩基配列をアミノ酸配列に翻訳して解析し、例えば、配列番号９〜１２に示す耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼの全アミノ酸配列を決定することができる。すなわち、配列番号９で示されるタンパク質のアミノ酸配列は、親株由来のＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子の塩基配列（配列番号３）の５２９番目のシトシンがチミンに変化することにより、翻訳されるアミノ酸の配列の１７７番目のアミノ酸残基がヒスチジン残基からチロシン残基に変化したものである。配列番号１０で示されるタンパク質のアミノ酸配列は、親株由来のＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子の塩基配列（配列番号３）の５０５番目のグアニンがアデニンに変化することにより、翻訳されるアミノ酸の配列の１６９番目のアミノ酸残基がアラニン残基からスレオニン残基に変化したものである。配列番号１１で示されるタンパク質のアミノ酸配列は、親株由来のＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子の塩基配列（配列番号３）の３１０番目のグアニンがアデニンに変化することにより、翻訳されるアミノ酸の配列の１０４番目のアミノ酸残基がアスパラギン酸残基からアスパラギン残基に変化したものである。配列番号１２で示されるタンパク質のアミノ酸配列は、親株由来のＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子の塩基配列（配列番号３）の５５番目のチミンがアデニンに変化することにより、翻訳されるアミノ酸の配列の１９番目のアミノ酸残基がフェニルアラニン残基からイソロイシン残基に変化したものである。
【００３９】
上述の耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子を含む発現ベクターにて形質転換された微生物（以下、変異遺伝子導入微生物という。）を培養し、得られる変異遺伝子導入微生物を下記する反応に用いるのが好ましい。培養は、上記形質転換微生物の培養条件と同様に行うことができる。例えば好気条件下で約１２〜２４時間程度実施するのが好ましい。また培養温度は例えばエシェリキア・コリＪＭ１０９株形質転換体の場合、ポリペプトンや酵母エキス等の炭素源や窒素源、食塩等の無機物を含む培地を用いて、好ましくは約２０〜４０℃、より好ましくは３０〜３７℃である。
【００４０】
得られた変異遺伝子導入微生物またはその調製物を、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンを含有する液（合成反応液）と接触させ、目的のＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳ一段階合成反応を行い生成蓄積せしめる。該合成反応液の基礎となる溶液は、上記した分解反応液および合成反応液の基礎となる溶液と同様のものを用いることができる。
すなわち、本発明のＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの製造方法において、変異遺伝子導入微生物またはその調製物を用いて、グリシンと３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドから一段階で収率よくＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳを得ることができる。
【００４１】
変異遺伝子導入微生物は、培養液中に存在する状態や培養液から該微生物を分離・濃縮などして使用することもできる。また、変異遺伝子導入微生物の調製物としては、例えばアクリルアミドやカラギーナンなどの担体上に変異遺伝子導入微生物を固定化した固定化微生物、あるいは、凍結乾燥やアセトン処理などによる乾燥微生物などの調製物などが挙げられる。また、前記調製物には変異遺伝子導入微生物に生成蓄積した酵素を抽出し、好ましくは精製などして樹脂担体などに固定化した固定化酵素も含まれる。酵素の精製法は、微生物を超音波やガラスビーズで破砕した後、硫安沈殿、イオン交換およびゲルろ過カラムクロマトといった通常酵素精製に用いられる精製法を組み合わせて行なうことができる。
【００４２】
又、変異遺伝子導入微生物は、紫外線、エックス線または薬品等を用いる人工的な変異手段でさらに変異しうるが、このように得られるどのような変異株であっても本発明の対象とする耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼ生産能を有するかぎり、本発明の変異遺伝子導入微生物として使用することができる。
【００４３】
合成反応液中に含まれる３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドは、Ｌ−スレオニンアルドラーゼの酵素活性を阻害しない程度の濃度で用いられ、通常、合成反応液の約０．１〜１０％（ｗｔ）程度である。またその供給方法としては分割添加や連続的に添加する方法などで行うことが出来る。
合成反応液中に含まれる他方の反応基質であるグリシンは、通常約０．１〜３０％（ｗｔ）程度を反応系に存在せしめて使用されるが、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドに対しては等モル以上で使用することが好ましい。グリシンは、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドと同様に合成反応液に添加できる。
【００４４】
合成反応液と変異遺伝子導入微生物またはその調製物との接触は、例えば培養した変異遺伝子導入微生物を遠心分離機やろ過などで集め、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンを含有する合成反応液に加えて接触せしめてもよく、また集めた変異遺伝子導入微生物を例えば水媒体中で超音波やガラスビーズなどで破砕した後のＬ−スレオニンアルドラーゼを含む遠心分離上清または該上清から精製したＬ−スレオニンアルドラーゼを合成反応液に加える方法であってもよい。また、固定化微生物や固定化酵素を合成反応液と接触させても良い。
合成反応液と変異遺伝子導入微生物またはその調製物との接触方法は、公知の方法、例えばバッチ方式または連続方式（例えば、カラム法、固定化微生物、固定化酵素法等）など、いずれの方法も用いることができる。
また、合成反応液と変異遺伝子導入微生物をフィルターなどにより分離し、変異遺伝子導入微生物を連続的に回収し、繰り返し再使用することもできる。
【００４５】
本発明の反応は、ｐＨ約５〜１０、特に好ましくは約６．５〜８．５において、温度約５〜６０℃、特に約１０〜５０℃で静置若しくは攪拌下に反応を進行せしめるのが好ましい。反応時間としては、通常１時間〜４８時間の範囲が好ましい。
また、本発明の反応は、好気、嫌気いずれの条件でも行なうことができる。また、合成反応液と変異遺伝子導入微生物の反応は、変異遺伝子導入微生物が生存できる条件、例えば上記微生物の培養における条件と同様の条件で実施することが好ましい。
【００４６】
本酵素系には補酵素としてビタミンＢ６が要求されるため、合成反応液には、例えばピリドキシン、ピリドキサールまたはピリドキサール−５’−リン酸などを添加することが好ましい。該補酵素を添加することにより反応が高められ得る。
また。合成反応液には、所望により例えば２−メルカプトエタノールのような還元剤を添加することもできる。
かくして反応せしめた反応混合物中には、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンから両化合物の反応生成物であるＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳが高選択的にかつ高収率（反応条件により一概にはいえないが、約１５％ｄ．ｅ．以上、好ましくは約２０％ｄ．ｅ．以上、より好ましくは約２０〜８０％ｄ．ｅ．程度である。）に生成し得る。
【００４７】
合成されたＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの精製は、公知の方法、例えばイオン交換樹脂、吸着樹脂やシリカゲルなどのクロマト分離、酢酸エチルやトルエンなどの有機溶媒を用いた溶媒抽出、溶解度の差を利用した分別結晶化などを組み合わせて行なうことができる。
【００４８】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
なお、本発明において配列中、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシン、Ｔはチミンを示す。本明細書において％は特に断らない限り質量％を意味する。
【実施例１】
【００４９】
Ｌ−スレオニンアルドラーゼ産生株ＤＮＡの取得
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）からのゲノムＤＮＡ抽出には、ＰＵＲＥＧＥＮＥ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｇｅｎｔｒａ社製）を用いた。まず、斜面培養したＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）のコロニーから白金耳を用いて採取した菌体を、ポリペプトン１．０％、酵母エキス０．２％および硫酸マグネシウム０．１％を含む液体培地１０ｍＬ（ｐＨ７．０）に植菌し、３０℃、２日間振騰培養した。この５ｍＬの培養液を１５ｍＬのファルコンチュ−ブへ移し、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心した。上清を捨て、得られたペレットをキットに添付のＣｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ３ｍＬに懸濁した。その後、キットの使用説明書に従い、ＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡは、ＤＮＡ Ｈｙｄｒａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ５００μＬに溶解し、１μＬをアガロ−ス電気泳動してＤＮＡの存在を確認後、４℃または−２０℃で保存した。
【実施例２】
【００５０】
Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子の増幅
実施例１で取得したＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）のゲノムＤＮＡよりＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子をＰＣＲ反応より増幅するためのプライマーを合成した。即ち、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）のゲノム解析の結果得られたＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子の塩基配列はすでに公開されている（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ． ＡＬ６４５８８２）。この遺伝子のオープンリーディングフレ−ム（ＯＲＦ）のＮ末端およびＣ末端部分の塩基配列を利用し制限酵素の認識配列として、Ｎ末端の前にＥｃｏＲＩ認識配列を追加したＤＮＡプライマー配列
５’プライマー：5’-ATATACCATGGAATTCAACCCTCCTAAGACCGACG-3’（配列番号１）
とＣ末端の後にＢａｍＨＩ認識配列を追加したＤＮＡプライマー配列；
３’プライマー：5’-ATCTAGAGGATCCTCAGCGCGCCATCTCTTCCTTG-3’（配列番号２）
を合成した。
【００５１】
これらのＤＮＡプライマー（配列番号１と配列番号２）を用いて実施例１で得たゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより増幅を行なう。ＰＣＲには、Ｔａｋａｒａ社のＬＡ−ＰＣＲキットを用い、２種類のＨｉｇｈ ＧＣバッファーで反応を行った。ＰＣＲの条件は以下の通りである。
ＰＣＲ条件：１μＬ鋳型ゲノムＤＮＡ （３８７．５ｎｇ／μＬ）、０．５μＬ（５ Ｕ／μＬ）ＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、 ２５μＬ ＬＡ−Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ添付のＨｉｇｈ ＧＣバッファー（Ｉ）（１Ｘ）、８μＬ ｄＮＴＰ （各２．５ｍＭ）、０．５μＬ ５’プライマー配列番号１）２５ｐｍｏｌ／ｍＬおよび０．５μＬ ３’プライマー（配列番号２）２５ｐｍｏｌ／ｍＬの混合物に水を加え、総量５０μＬの溶液を作製し、９４℃で２分間熱処理後、９４℃で４０秒、６０℃で３０秒、７２℃で２分の条件で３０サイクルのプログラムで増幅を行い、その後７２℃で５分間処理した。また、増幅の確認は１％のアガロ−ス電気泳動で行った。その結果、制限酵素部位を含む１種類のＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子が増幅された（１０９７ｂｐ）。
【実施例３】
【００５２】
組換えＬ−スレオニンアルドラーゼ発現ベクターの作製。
ＰＣＲにより増幅されたＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子を、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで切断して分離し、発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａ（アマシャムバイオサイエンス製）に挿入することにより発現させた。即ち、実施例２におけるＰＣＲにより増幅されたＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子断片を含むＰＣＲ溶液を精製（ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ社製）し、各々１０Ｕの制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩを用いて３７℃で３時間切断反応を行った。反応後の溶液を１％（Ｗ／Ｖ）濃度のアガロ−スゲル電気泳動により分離し、１０８１ｂｐに相当するバンドをゲルより切り出してＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）により精製した。
【００５３】
次に１μｇのｐＴｒｃ９９Ａ（アマシャムバイオサイエンス製）を各１０Ｕの制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩを用いて３７℃で一晩静置し、ｐＴｒｃ９９Ａの制限酵素部位の切断反応を行った。反応後の溶液を０．７％（Ｗ／Ｖ）濃度のアガロ−スゲル電気泳動により切断を確認し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）により精製し，３０μＬのトリス−塩酸緩衝液（１０ｍＭ，ｐＨ８．５）に溶解した。
【００５４】
制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで切断して得た１０８１ｂｐのＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子断片を含む溶液８μＬとＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで切断して得たｐＴｒｃ９９Ａの溶液８μＬをＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社製）と混合し、１６℃で５時間連結反応を行った。反応後の溶液５μＬを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。形質転換した大腸菌ＪＭ１０９を含む溶液を１００μｇ／ｍＬのアンピシリン、０．１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）および０．００４％のＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地上に塗布し、３７℃で一晩培養してコロニーを形成させた。それぞれについて白色の陽性コロニーを選択し、３ｍＬの１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含んだＬＢ液体培地に植菌し、３７℃で一晩培養した。培養液を遠心分離して集菌後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ｐｌａｓｍｉｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）により約２μｇのプラスミドＤＮＡを精製した。そのうち約０．５μｇのプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで切断し、１％（Ｗ／Ｖ）濃度のアガロ−スゲル電気泳動により１０８１ｂｐに相当する挿入断片の存在を確認した。さらに挿入断片の塩基配列をシークエンス反応により確認したところ、変異は認められなかった。この発現プラスミドをｐｌｔｈ−ＳＣＡ３（２）とした。
【実施例４】
【００５５】
組換えＬ−スレオニンアルドラーゼの大腸菌での発現および活性測定
挿入断片が確認されたｐｌｔｈ−ＳＣＡ３（２）ベクターを挿入した大腸菌ＪＭ１０９株（この形質転換体は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されている。寄託番号：受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１１１）を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む３ｍＬのＬＢ培地に植菌し、一晩３７℃で培養した。この培養液のうち、０．１ｍＬを１０ｍＬのＬＢ培地（１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む）に接種した。約３時間後、培養液のＯＤ６００が０．４〜０．７に上昇したことを確認後、最終濃度で２ｍＭになるように１ＭのＩＰＴＧを培地に添加し組換えＬ−スレオニンアルドラーゼの大腸菌での発現を誘導させた。その培養液をさらに、一晩３７℃で培養し、培養液を１００００×ｇ、５分間の遠心操作により細胞を沈殿させ、上清を除いた後、０．８５％のＮａＣｌで１回洗浄した。遠心操作により細胞を沈殿させた後、ビーズ衝撃法細胞破砕装置Ｂｅａｄｓ Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ Ｍｏｄｅｌ ＢＣ−２０（４℃，３分，セントラル科学貿易製）でその菌体を２回破壊した。２００００×ｇで１０分間遠心した後、その上清を粗酵素液としてＬ−スレオニンアルドラーゼの分解活性を調べた。反応液の組成は１００μＬのＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳ（１ｍｇ／ｍＬ），２５μＬのピリドキサール−５’−リン酸（０．６μｇ／ｍＬ）および１μＬのメルカプトエタノール（２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）を水で１５０μＬとし、この１５０μＬの反応液に５０μＬの粗酵素液（多段階希釈により許容範囲に合わせた）を加え５０℃で１０分間酵素反応を行い，３倍量のメタノールを加えることにより反応を停止させた。Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの分解産物であるグリシンの生成量は液体クロマトグラフ分析法（以下ＨＰＬＣと言う；、日立Ｌ２０００シリーズ、日立製作所製）でポストカラム分析法を用いて測定した。ＨＰＬＣ分析は、ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＭＳ（Φ４．６×１５０ｍｍ）カラム、カラムおよび反応コイル温度２０℃，移動相は０．１％ １−ヘプタンスルホン酸Ｎａ／メタノール［１０：１（Ｖ／Ｖ）］，ポスト反応液組成は、ミリ−Ｑ水１Ｌに対しホウ酸２１．６４ｇ、水酸化ナトリウム１２ｇ、２−メルカプトエタノール ２ｍＬ、ＯＰＡ（オルトフタルアルデヒド；８００ｍｇ／１５ｍＬエタノール）、Ｂｒｉｊｉ−３５（ポリオキシエチレンラウリルエーテル；０．２５ｇ／２ｍＬエタノール）を添加し行った。ＨＰＬＣの流速は移動相および反応液共に０．７５ｍＬ／分で、分離産物の検出はλｅｘ／ｅｍ＝３４０／４５０ｎｍの蛍光で分析した。このＨＰＬＣによるグリシンの分析範囲は０．１μｇ／ｍＬ以下である。酵素活性は５０℃における１分間あたり１μｍｏｌのグリシンの生成量を１単位とした。その結果、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）のゲノムＤＮＡよりクロ−ニングしたＬ−スレオニンアルドラーゼは、粗酵素１ｍｇあたり１５４単位のＬ−スレオニンアルドラーゼ分解活性を示すことがわかった。
【００５６】
また、分解活性が確認されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）由来の Ｌ−スレオニンアルドラーゼによる合成反応の目的物質であるＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの合成活性を調べた。即ち、ｐｌｔｈ−ＳＣＡ３（２）ベクターを含む大腸菌ＪＭ１０９株を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む３ｍＬのＬＢ液体培地に植菌し、一晩３７℃で培養した。この培養液のうち、０．５ｍＬを５０ｍＬのＬＢ培地（１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む）に接種した。約３時間後、培養液のＯＤ６００が０．４〜０．７に上昇したことを確認後、最終濃度で２ｍＭになるように１ＭのＩＰＴＧを添加しＬ−スレオニンアルドラーゼの大腸菌での発現を誘導させた。その培養液をさらに、一晩３７℃で培養し、培養液を１００００×ｇ，１０分間の遠心操作により細胞を沈殿させ、上清を除いた後、０．８５％のＮａＣｌ水溶液で１回洗浄した。遠心操作により細胞を沈殿させた後、その菌体を用い合成反応を行った。反応液の組成は１ｇのグリシン、１００ｍｇの３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド、１０μＬのメルカプトエタノール（２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）、２５０μＬのピリドキシサ−ル−５’−リン酸（ＰＬＰ；０．６ｍｇ／ｍＬ）、４．７４ｍＬ ０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、０．０１５８ｇの亜硫酸ナトリウム、０．０３７５ｇのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００に溶解し、１Ｎ塩酸で最終ｐＨを６．５にした。この反応液に−８０℃で凍結保存しておいた上記遠心分離操作により得た菌体を加え１５℃で５時間酵素反応を行い、３倍量のメタノールを加えることにより反応を停止させた。合成産物であるＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの合成量はＨＰＬＣ（日立Ｌ２０００シリ−ズ、日立製作所製）で測定した。ＨＰＬＣ分析は、ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＭＳ（Φ４．６×１５０ｍｍ）カラム、カラム温度３０℃，移動相は０．１％ １−ヘプタンスルホン酸（ｐＨ２．５）／メタノール／１，４−ジオキサン＝［５００：５０：１５（Ｖ／Ｖ／Ｖ）］で行った。ＨＰＬＣの移動相流速は０．７５ｍＬ／分で、分離産物の検出はＵＶ＝２２０ｎｍの吸光で分析した。その結果、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）のゲノムＤＮＡよりクロ−ニングしたＬ−スレオニンアルドラーゼは、菌体培養液１Ｌあたり０．４ｇのＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの合成活性能を有する酵素であることがわかった。なお反応液１Ｌあたりの合成量は４ｇであった。
【実施例５】
【００５７】
ランダム変異導入法による変異遺伝子ライブラリーの作製
作製したｐｌｔｈ−ＳＣＡ３（２）を用いてＧｅｎｅＭｏｒｐｈ Ｒａｎｄｏｍ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）のプロトコールに従いランダムに変異を導入することにより点変異遺伝子ライブラリーを構築した。このＫｉｔに含まれているＭｕｔａｚｙｍｅ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅは従来のＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅと比べ非常に高い頻度で変異を導入することができ、さらに初期のベクターの濃度を制御することにより導入される変異の頻度を制御できる。そこで実施例３で作製したｐｌｔｈ−ＳＣＡ３（２）を鋳型としてＰＣＲを行うことにより導入される変異を制御した。このときｐｌｔｈ−ＳＣＡ３（２）の濃度を５０ｎｇ／μＬ、２５０ｎｇ／μＬ、さらに５００ｎｇ／μＬの三つの濃度でＰＣＲを行うことにより導入される変異を制御した。このときプライマーはクロ−ニングの時と同様にＮ末端の前にＥｃｏＲＩ認識配列を追加した５’プライマー（配列番号１）とＣ末端の後にＢａｍＨＩ認識配列を追加した３’プライマー（配列番号２）を用いて行った。変異ＰＣＲの条件は以下の通りである。
変異ＰＣＲ条件：１μＬ鋳型ＤＮＡ ５０ｎｇ／μＬ（２５０ｎｇ／μＬ、５００ｎｇ／μＬ）、１μＬ（２．５Ｕ／μＬ）Ｍｕｔａｚｙｍｅ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、２５μＬ ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ Ｒａｎｄｏｍ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔに添付の反応バッファー（１Ｘ）、８μＬ ｄＮＴＰ ０．２ｍＭ、０．５μＬ ５’プライマー（配列番号１）２５ｐｍｏｌ／ｍＬおよび０．５μＬ ３’プライマー（配列番号２）２５ｐｍｏｌ／ｍＬの混合物に水を加え、総量５０μＬの溶液を作製し、９６℃で秒３０秒間熱処理後、９６℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で１分１５秒、３０サイクルのプログラムで増幅を行い、その後７２℃で１０分間処理した。増幅反応後の溶液１０μＬを１％濃度のアガロ−スゲル電気泳動を行った結果、目的とした約１ｋｂｐのＬ−スレオニンアルドラーゼをコードするＤＮＡ断片が増幅されていることを確認した。
【００５８】
次に、ランダム変異導入法により増幅した変異ＰＣＲ産物を大腸菌ＪＭ１０９に導入し、変異遺伝子ライブラリーを構築した。即ち、変異型Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子を含むＰＣＲ溶液をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔにより精製（Ｑｉａｇｅｎ社製）し、精製した変異ＰＣＲ産物全量を各々２０Ｕの制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩを用いて３７℃で一晩切断反応を行った後、１％（Ｗ／Ｖ）濃度のアガロ−スゲル電気泳動により分離し、約１ｋｂｐに相当するバンドをゲルより切り出してＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）により該バンド部分のＤＮＡを精製後、３０μＬのトリス−塩酸緩衝液（１０ｍＭ，ｐＨ８．５）に溶解した。次に１μｇのｐＴｒｃ９９Ａを各１０Ｕの制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩを用いて３７℃で一晩静置し、ｐＴｒｃ９９Ａの制限酵素部位の切断反応を行い、反応後の溶液をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔにより精製（Ｑｉａｇｅｎ社製）し、３０μＬのトリス−塩酸緩衝液（１０ｍＭ，ｐＨ８．５）に溶解した。精製したＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで切断した約１ｋｂｐに相当するＤＮＡ部分のＤＮＡ溶液８μＬと２μＬの ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで切断したベクターｐＴｒｃ９９Ａを５μＬのＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ製）と混合し、１６℃で一晩連結反応を行った。連結反応後の溶液５μＬを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換させ変異遺伝子ライブラリー作製した。
【実施例６】
【００５９】
耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼのハイスルプットスクリ−ニング
変異遺伝子ライブラリーのコロニーをコロニーピッカー（ＧＥＮＥＴＩＸ、ビ−エム機械社製）によりランダムに約１２５９２株を選抜し、一次スクリーニングへ供した。一次スクリーニングは２ｍＬ容量の９６穴の角型ディープウェルプレート（Ｗｈａｔｍａｎ製）を用い、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む２５０μＬのＬＢ液体培地に植菌し、９６穴の角型プレ−ト振動機（Ｔｉｔｒａｍａｘ １０００，ＨＥＩＤＯＬＰＨ社製）で一晩培養した（３０℃、６００ｒｐｍ）。９６穴の角型ディープウェルプレートを２５００ｒｐｍで１０分間遠心することにより菌体を分離し、−８０℃で１時間処理した。菌体を用いた酵素反応は菌体に２５０μＬのＬ−スレオニン（２ｍｇ／ｍＬ）を添加し５０℃で３０分間振動させながら反応を行った。この菌体反応によりＬ−スレオニンはグリシンとアセトアルデヒドに分解される。活性を有する変異酵素の選別は反応後の液と同量の発色剤（Ｎａｓｈ’ｓ試薬：１５％（Ｗ／Ｖ）酢酸アンモニウム、０．５％（Ｖ／Ｖ）酢酸および２０％（Ｖ／Ｖ）アセチルアセトン）を添加し５０℃で３０分間振動させながら行った。酵素活性を有するコロニーはアセトアルデヒドの発色試薬により黄色に発色する。その結果、２７６９のコロニーについて黄色（吸光度：３８８ｎｍ）の発色が観察された。
【００６０】
一次スクリ−ニングの結果、活性を示している２７６９株を対象に熱処理を加えた後に酵素基質と発色剤を加え、２次スクリ−ニングへ供し、残存活性により発色するコロニーを選択した。即ち、一次スクリ−ニングの結果、Ｌ−スレオニン分解活性を示している２７６９株を９６穴の角型ディープウェルプレート（Ｗｈａｔｍａｎ製）の１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む２５０μＬのＬＢ液体培地に植菌し、９６穴の角型プレ−ト振動機（Ｔｉｔｒａｍａｘ １０００，ＨＥＩＤＯＬＰＨ社製）で一晩培養した（３０℃、６００ｒｐｍ）。９６穴の角型ディープウェルプレートを２５００ｒｐｍで１０分間遠心することにより菌体を分離した。その菌体をプレートビーズ衝撃法多検体細胞破砕装置シェイクマスター Ｖｅｒ １．２（１５分，バイオディカルサイエンス製）で破壊した。遠心（２５００ｒｐｍ、１０分）により得られた上澄みを粗酵素液とし、９６穴の角型アッセイプレートに５０μＬずつ分注した後、６５℃で２０分間熱処理を行った。熱処理後の９６穴の角型アッセイプレートに５０μＬのＬ−スレオニン（２ｍｇ／ｍＬ）を添加し５０℃で６０分間振動させながら酵素反応を行った。活性を有する変異酵素の選別は反応後の液と同量（１００μＬ）の発色剤［Ｎａｓｈ’ｓ試薬：１５％（Ｗ／Ｖ）酢酸アンモニウム、０．５％（Ｖ／Ｖ）酢酸および２０％（Ｖ／Ｖ）アセチルアセトン］を添加し５０℃で３０分間振動させながら行った。その結果、１１のコロニーについて黄色（吸光度：３８８ｎｍ）の発色が観察された。
【実施例７】
【００６１】
耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子の単離および塩基配列の解析
２次スクリ−ニングの結果、強い発色を示した耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子をもつ大腸菌ＪＭ１０９をＬＢ液体培地３ｍＬで培養し、プラスミドをＱＩＡｐｒｅｐ ｐｌａｓｍｉｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン製）で抽出した。シ−クエンス反応は、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（アプライドバイオシステム社製）、 Ｄｙｅｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ （アプライドバイオシステム社製）を用い、９６℃ １０秒、５０℃ ５秒、６０℃ ４分、２５サイクルで行った。反応生成物のシ−クエンスは全自動シークエンサー ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１００ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステム社製）にて解析することにより決定した。
【００６２】
その結果強い発色を示した４種類の異なる耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子配列は親株のＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子に比べ、それぞれ、親株の塩基配列（配列番号３）の５２９番目のシトシンがチミンに（Ｈ４４：表１記載の変異株）、同塩基配列の５０５番目のグアニンがアデニンに（Ｉ１−９４：表１の変異株）、同塩基配列の３１０番目のグアニンがアデニンに（５Ａ２−８４：表１の変異株）および同塩基配列の５５番目のチミンがアデニンに（Ｆ８：表１の変異株）に変化していた。これらのことをアミノ酸配列に翻訳すれば、親株の塩基配列（配列番号３）の５２９番目のシトシンがチミンに変化することにより、翻訳されるタンパク質のアミノ酸の配列の１７７番目のアミノ酸残基がヒスチジン残基からチロシン残基に（Ｈ４４）、親株の塩基配列（配列番号３）の５０５番目のグアニンがアデニンに変化することにより、翻訳されるタンパク質のアミノ酸の配列の１６９番目のアミノ酸残基がアラニン残基からスレオニン残基に（Ｉ１−９４）、親株の塩基配列（配列番号３）の３１０番目のグアニンがアデニンに変化することにより、翻訳されるタンパク質のアミノ酸の配列の１０４番目のアミノ酸残基がアスパラギン酸残基からアスパラギン残基に（５Ａ２−８４）、親株の塩基配列（配列番号３）の５５番目のチミンがアデニンに変化することにより、翻訳されるタンパク質のアミノ酸の配列の１９番目のアミノ酸残基がフェニルアラニン残基からイソロイシン残基に（Ｆ８）に変化していた。この４種類の耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子の配列を（変異株名：Ｈ４４，Ｉ１−９４，５Ａ２−８４およびＦ８に対応して）配列番号４、５、６及び７に示す。
独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されている。寄託番号：受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１１６、ＮＩＴＥ Ｐ−１１７、ＮＩＴＥ Ｐ−１１８およびＮＩＴＥ Ｐ−１１９。
【実施例８】
【００６３】
耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼ変異酵素の各熱処理温度における安定性
実施例７記載の耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子を含む大腸菌ＪＭ１０９（寄託番号：受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１１６、ＮＩＴＥ Ｐ−１１７、ＮＩＴＥ Ｐ−１１８およびＮＩＴＥ Ｐ−１１９）を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ液体培地３ｍＬに植菌し、一晩３０℃で振とう培養を行った。その振とう培養液５００μＬを５０ｍＬのＬＢ液体培地（１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む）に植菌し、３０℃、約５時間後（ＯＤ６００＝０．６〜０．８）に最終濃度が２ｍＭになるように５００μＬの１Ｍ ＩＰＴＧを無菌添加しさらに３０℃で一晩振とう培養した。その培養液を１００００×ｇで５分間遠心分離し、培養上清を除いた後、０．８５％のＮａＣｌで１回洗浄した。同様に遠心操作により細胞を沈殿させた後、ビ−ズ衝撃法細胞破砕装置Ｂｅａｄｓ Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ Ｍｏｄｅｌ ＢＣ−２０（４℃，３分，セントラル科学貿易製）でその菌体を２回破壊した。２００００×ｇで１０分間遠心した後、その上清を粗酵素液として１００μＬを１５００μＬ容サンプリングチュ−ブに入れ４０℃、５０℃、６０℃、６５℃で２０分間熱処理した。低立体選択性Ｌ−スレオニンアルドラーゼの残存活性は、反応液１５０μＬ［１００μＬのＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳ（１ｍｇ／ｍＬ）、２５μＬのＰＬＰ（０．６μｇ／ｍＬ）、１μＬのメルカプトエタノール（２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）］に５０μＬの熱処理したそれぞれの粗酵素液（多段階希釈により許容範囲に合せた）を加え５０℃で１０分間酵素反応を行なった。１０分後、３倍量のメタノールを加えることにより反応を停止させた。Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの分解産物であるグリシンの生成量は液体クロマトグラフ分析法（以下ＨＰＬＣと言う、日立Ｌ２０００シリ−ズ、日立製作所製）でポストカラム分析法を用いて測定した。ＨＰＬＣ分析は、ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＭＳ（Φ４．６×１５０ｍｍ）カラム、カラムおよび反応コイル温度２０℃、移動相は０．１％ １−ヘプタンスルホン酸Ｎａ／メタノール［１０：１（Ｖ／Ｖ）］、ポスト反応液組成は、ミリ−Ｑ水１Ｌに対しホウ酸２１．６４ｇ、水酸化ナトリウム１２ｇ、２−メルカプトエタノール ２ｍＬ、ＯＰＡ（８００ｍｇ／１５ｍＬエタノール）、Ｂｒｉｊｉ−３５（０．２５ｇ／２ｍＬエタノール）を添加し行った。ＨＰＬＣの流速は移動相および反応液共に０．７５ｍＬ／分で、分離産物の検出はλｅｘ／ｅｍ＝３４０／４５０ｎｍの蛍光で分析した。このＨＰＬＣによるグリシンの分析範囲は０．１μｇ／ｍＬ以下である。熱安定性は、５０℃における１分間あたり１μｍｏｌのグリシンの生成量を１単位とした酵素活性を求め、熱処理前のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）（親株）のＬ−スレオニンアルドラーゼの活性値を１００％とし、各処理温度について熱処理後の相対活性（％）を算出し表１に示した。
【００６４】
【表１】
【００６５】
表１で明らかなように、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）のＬ−スレオニンアルドラーゼが、６５℃で２０分間処理することにより１０．６％しか残存活性を示さないことに対し、本発明の耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼであるＨ４４は８５．７％、Ｆ８は５８．６％、５Ａ２−８４は６２．１％、Ｉ１−９４は６７．６％の残存活性を示した。
【実施例９】
【００６６】
耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼの繰り返し利用によるＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの製造
Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの一段階合成において、耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子を導入された大腸菌の菌体反応によるＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳ合成反応後、この菌体を回収し再度Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳ合成反応に供する方法で行った。即ち、実施例７記載の耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼのうち、変異酵素Ｈ４４が最も高い熱安定性を示した事から、繰り返し合成反応は親株由来のＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子を含む大腸菌（寄託番号：受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１１１）と耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子であるＨ４４を含む大腸菌寄託番号：受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１１６）とのＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳ合成反応を比較した。反応液の組成は１ｇのグリシン、１００μｇの３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド、１０μＬのメルカプトエタノール（２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）、２５０μＬのピリドキシサ−ル−５’−リン酸（ＰＬＰ、０．６ｍｇ／ｍＬ）、４．７４ｍＬ ０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、０．０１５８ｇの亜硫酸ナトリウムおよび、０．０３７５ｇのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を混合溶解し、１Ｎ塩酸で最終ｐＨを６．５にした。この反応液に−８０℃で凍結保存しておいた菌体（培養液５０ｍＬ相当分）を加え１５℃で５時間酵素反応を行なわせ、反応後の反応液を遠心分離（１００００×ｇ、１０分）により菌体を回収し、この菌体を繰り返し新鮮な反応液に懸濁し、再度同様の条件でＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳ合成反応を行った。この操作を２０回繰り返し、合計１００時間合成反応を行った結果、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの合成量は図１に示すように１回目のＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの合成能は、親株と耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子導入微生物（Ｈ４４株）は、共に同様のＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳ合成能を示し、尚かつ１１回目の繰り返し反応までその合成能に変化は見られなかった。しかし、親株由来のＬ−スレオニンアルドラーゼの場合、１２回目の反応、即ち６０時間後からのＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの合成量が減少し、２０回目に Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの濃度は１回目の反応で得られたＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの濃度（４０００μｇ／ｍＬ）の半分である２０４２μｇ／ｍＬであるのに対して、耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子であるＨ４４の遺伝子を含む大腸菌では１回目の反応で得られたＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの濃度の９１％に相当する３５５０μｇ／ｍＬとなった。このことから、耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子であるＨ４４の遺伝子を含む大腸菌の繰り返し利用によりＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳを高い合成効率で製造することが可能であることが示された。なおこのような耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子であるＨ４４の遺伝子を含む大腸菌を用いた繰り返し合成反応により合成されたＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの総合成量は７１ｇ／Ｌであった。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明の遺伝子は、耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子として有用である。該遺伝子を挿入した微生物を用いる本発明のＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの製造法は、医薬品として有用なＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳを煩雑な分離精製工程を行うこともなく工業的に有利に製造できる。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】親株のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）株および耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子導入微生物（Ｈ４４）株を用いたＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの繰り返し合成反応を示す図である。図中−○−はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）株を、−◆−は耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子導入微生物（Ｈ４４）株を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、産業上有用なβ−ヒドロキシアミノ酸誘導体であるＬ−スレオ−３，４−ジヒドロキシフェニルセリン（以下、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳと略記する）を合成するのに有利な酵素遺伝子および従来知られていない耐熱性を有するＬ−スレオニンアルドラーゼを遺伝子工学的手法により提供するものであり、さらに、この遺伝子を導入した組換え微生物を利用した合成反応によって、産業上有用なＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの製造法を提供するものである。より具体的には、本発明は、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの合成に有用な耐熱性のＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子およびその組換えベクターと形質転換体を提供し、この遺伝子を導入した組換え微生物による合成反応により、産業上有用なβ−ヒドロキシアミノ酸誘導体であるＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの製造法を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
β−ヒドロキシアミノ酸誘導体の一種であるＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳは、体内で芳香族アミノ酸脱炭酸酵素により天然型のノルアドレナリンとなり、すくみ足や起立性低血圧に有効なノルアドレナリンの前駆物質として、年間６０億円以上の市場があるパ−キンソン病の治療薬である。これらは現在、化学合成法により合成されているが、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの化学合成については多段階の面倒な保護・脱保護を必要とし、また、化学合成物質は４種類の異性体の混合物からなり、目的のＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳを得るためには繁雑な分離工程や分割工程を必要とし、非常に高価な医薬品となる。即ち、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンを強アルカリ存在下で縮合させ、ラセミ−スレオ／エリスロ−フェニルセリン誘導体を得た後、スレオ／エリスロ体の相互分離処理を行い、エリスロ体を除く。次に、得られたラセミ−スレオ−フェニルセリン誘導体のアミノ酸部分に置換基を導入した後、キニン、ブルシン等の光学分割剤を用いて光学分割を行い、最後にアミノ基部分の置換基を除去しなければならないなど非常に複雑なプロセスである。
【０００３】
一方、酵素による一段階合成法は化学合成と比べ、面倒な保護・脱保護を必要としないなどメリットは大きく、さらに安価な基質を利用することにより安価に合成することができる。酵素による一段階合成法は最も簡単かつ効率的で、近年最も注目され、様々なβ−ヒドロキシアミノ酸の一段階合成に利用されている。酵素による一段階合成法でβ−ヒドロキシアミノ酸誘導体を合成できる酵素としてスレオニンアルドラ−ゼが知られている。スレオニンアルドラ−ゼ（ＥＣ ４．１．２．５）は、β−ヒドロキシアミノ酸を分解して、グリシンとアルデヒドを生成する反応を触媒することで知られている酵素である。この酵素は二つの不斉炭素原子を有するスレオニンを基質とした場合、α−位の立体特異性によって、Ｌ−タイプとＤ−タイプに区別される。さらに、β−位の立体特異性によりＬ−スレオニンにのみ作用するＬ−スレオニンアルドラ−ゼ、Ｌ−アロスレオニンにのみ作用するＬ−アロスレオニンアルドラ−ゼ、さらにＬ−スレオニンとＬ−アロスレオニンの両方に作用する低立体選択性Ｌ−スレオニンアルドラ−ゼに分類されている。Ｄ−タイプでも同様に分けられる。
【０００４】
スレオニンアルドラ−ゼ活性は、現在まで酵母、放線菌、細菌など種々の微生物に広く見出されている。これまでの研究から、スレオニンアルドラーゼは幅広い範囲のβ−ヒドロキシアミノ酸に対する分解能が高いことが明らかとなっている。また、スレオニンアルドラーゼは前記の逆反応も媒介し、様々なβ−ヒドロキシアミノ酸の一段階合成能力を有することも報告されている（非特許文献１〜３）。そして、産業上の利用に関する観点からは、長期間安定して合成反応に使用できる、より高い熱安定性をもつ酵素が求められている。
しかし、高熱菌［例えば、ピロコッカス・ホリコシＯＴ３（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ ＯＴ３）や、アエロパイラム・ペルニックスＫ１（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ Ｋ１）やスルフォロブス・トコダイイ・ストレイン７（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉ ｓｔｒａｉｎ７）など］の最近のゲノム解析の結果、そのような高熱菌にはＬ−スレオニンアルドラ−ゼは存在しないことが示唆されていることから、通常の手段では耐熱性のＬ−スレオニンアルドラ−ゼを入手することは極めて困難である。
【０００５】
酵素法による一段階合成法は最も簡単かつ効率的で、近年最も注目され、様々な物質の合成反応に利用されている。しかし、一段階合成法を用いた合成反応は、平衡の状態が正反応（Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの分解反応側）に偏っているため、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳ生成量が低くなる問題点や、酵素に対する高濃度の基質による阻害作用の問題、そして酵素自身の不安定性など一段階合成プロセスを用いた合成反応へ利用するには多くの技術解決課題が残されている。
【０００６】
酵素による一段階合成法は、エシェリヒア属等により得られるＬ−スレオニンアルドラ−ゼや、バチルス属より得られるフェニルセリンアルドラ−ゼに様々なアルデヒド誘導体とグリシンを作用させＬ−スレオ−フェニルセリン誘導体を得る方法が知られている（特許文献１〜５）。しかし、このような酵素による一段階合成反応に利用されている大体のＬ−スレオニンアルドラ−ゼは熱安定性が低く、例えば約４５〜６５℃の比較的高温下におけるＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの合成反応中に失活してしまい、繰り返し酵素反応を行う際、目的するＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの合成量が低下する問題点があった。
【特許文献１】特公昭５２−４６３１３号公報
【特許文献２】特公昭５１−６２３９号公報
【特許文献３】特公昭５４−３９５２号公報
【特許文献４】特公昭５４−１２５５４号公報
【特許文献５】特開平９−２３８６８０号公報
【非特許文献１】キムラ・ティー（Ｋｉｍｕｒａ，Ｔ．）他３名、ジヤーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエテイー（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）、１９９７年、第１１９巻、ｐ．１１７３４−１１７４２
【非特許文献２】リウ・ジェイ・キュー（Ｌｉｕ，Ｊ．Ｑ）他５名、アプライド・マイクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロジー（Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）、１９９８年、第４９巻、ｐ．７０２−７０８
【非特許文献３】日本農芸化学会誌、１９９８年、第７２（５）巻、ｐ．７４６−７４７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明はβ−ヒドロキシアミノ酸誘導体であるＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳを酵素的合成法により製造するため、高濃度の基質の存在下でも効率良く、しかも、長期間安定して使用できる酵素触媒のＬ−スレオニンアルドラ−ゼをコードする遺伝子を取得し、そのような遺伝子を導入・発現した組換え微生物の利用により、上記のＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳを合成する方法を提供しようとするものである。
より詳しくは、本発明はＬ−スレオニンアルドラ−ゼを熱安定化させることにより、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの合成反応に酵素の活性低下が防止され、本発明の耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子を含有する菌体を用いる長時間の繰り返し合成反応においても活性低下が少ない技術を提供することを課題とする。すなわち、安定した合成能を保っている耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラ−ゼを用いて長期間Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの合成を可能にすることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、放線菌であるストレプトマイセス属から、β−ヒドロキシアミノ酸誘導体であるＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの合成に関与する遺伝子を取得するべく鋭意検討を行った。その結果、ストレプトマイセス属細菌から取得したＬ−スレオニンアルドラ−ゼをコードする遺伝子がβ−ヒドロキシアミノ酸誘導体であるＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの合成に利用できることを見出した。さらに、このストレプトマイセス属細菌から取得したＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子に、例えばランダム変異導入法による変異遺伝子ライブラリーを作製し、該ライブラリーから耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼを産生する変異株を取得し、さらに研究を重ね、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、
［１］ 下記の（１）、（２）、（３）または（４）に示す遺伝子：
（１）配列番号４、５、６又は７に示す塩基配列からなる遺伝子：
（２）配列番号４、５、６又は７に示す塩基配列のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ耐熱性のＬ−スレオニンアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子：
（３）配列番号９、１０、１１又は１２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子：
（４）配列番号９に示すアミノ酸配列の１７７番目のチロシン、配列番号１０に示すアミノ酸配列の１６９番目のスレオニン、配列番号１１に示すアミノ酸配列の１０４番目のアスパラギン酸、または配列番号１２に示すアミノ酸配列の１９番目のイソロイシンが保持され、当核アミノ酸配列９、１０、１１又は１２で示されるアミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつ耐熱性のＬ−スレオニンアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
［２］ 下記の（１）又は（２）に示すタンパク質：
（１）配列番号９、１０、１１又は１２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質：
（２）配列番号９に示すアミノ酸配列の１７７番目のチロシン、配列番号１０に示すアミノ酸配列の１６９番目のスレオニン、配列番号１１に示すアミノ酸配列の１０４番目のアスパラギン酸、または配列番号１２に示すアミノ酸配列の１９番目のイソロイシンが保持され、当核アミノ酸配列９、１０、１１又は１２で示されるアミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつ耐熱性のＬ−スレオニンアルドラーゼ活性を有するタンパク質、
［３］ 前項１に記載の遺伝子を含有する組み換えベクター、
［４］ 前項３に記載の遺伝子を含有する組み換えベクターを含む微生物、
［５］ 宿主が大腸菌である前項４に記載の微生物、
［６］ ＮＩＴＥ Ｐ−１１６、ＮＩＴＥ Ｐ−１１７、ＮＩＴＥ Ｐ−１１８およびＮＩＴＥ Ｐ−１１９として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託された微生物、および
［７］ 前項４、５または６に記載の微生物またはその調製物を、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドおよびグリシンを含有する液と接触せしめ、前記液中にＬ−スレオ−３，４−ジヒドロキシフェニルセリンを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするＬ−スレオ−３，４−ジヒドロキシフェニルセリンの製造法、
に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンからＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの合成反応を触媒する耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子が提供される。
また、本発明の耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼは、該酵素自身が熱に対して安定であるので、これらの耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子を保有する菌体もしくはその調製物を用いて、安定的にＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳを合成することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
Ｌ−スレオニンアルドラーゼは主としてＬ−スレオニンをグリシンとアセトアルデヒドに分解する反応を触媒する酵素である。又、この酵素は分解反応以外に逆反応としてグリシンとアセトアルデヒドからＬ−スレオニンとＬ−アロスレオニンの合成反応も触媒する酵素である。この逆（合成）反応を利用して、グリシンと３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドからＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳを熱安定的に合成するのが本発明の目的である。従って、Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子に変異を導入して、耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子および該遺伝子を挿入した微生物を創製し、耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼが微生物内で著量蓄積できれば、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの生産に有効に使用できると考えられる。
本発明の耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼとは、例えば６５℃２０分の加熱後でも５０％以上の残存活性を示すなど、高い耐熱安定性を持つＬ−スレオニンアルドラーゼをいう。
本発明の耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼとしては、配列番号９〜１２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる。また、耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼには、前記配列番号９〜１２において、配列番号９に示すアミノ酸配列の１７７番目のチロシン、配列番号１０に示すアミノ酸配列の１６９番目のスレオニン、配列番号１１に示すアミノ酸配列の１０４番目のアスパラギン酸、または配列番号１２に示すアミノ酸配列の１９番目のイソロイシンが保持され、当該配列番号９、１０、１１又は１２で示されるアミノ酸配列において、１乃至数個（約２〜２０個、好ましくは約２〜１０個程度）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼ活性を有するタンパク質等も含まれる。
【００１２】
Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子に変異を導入するとは、基礎となるＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子の塩基配列中の塩基が１〜数個（約２〜１０個）他の塩基に置換、または塩基が付加あるいは削除され、基礎となるＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子から耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子へと変異させることをいう。
【００１３】
上記変異操作に供される基礎となるＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子（以下、変異を導入する基となる遺伝子ともいう。）としては、Ｌ−スレオニンアルドラーゼを有する動物、植物、又は微生物由来のいずれの遺伝子でも使用できるが、工業的な利用には微生物由来のものが好ましい。前記微生物としては、例えばストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）を好ましく挙げることができる。
変異を導入する基となる遺伝子は、好ましくは、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）に属す微生物由来のＤＮＡ、さらに好ましくは、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）由来のＤＮＡ、とりわけ好ましくはストレプトマイセス・セリカラーＡ３（２）株（以下、親株ということもある。）由来の遺伝子が挙げられる。ストレプトマイセス・セリカラーＡ３（２）株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部(日本、木更津市)にストレプトマイセス・バイオラセルーバー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｏｌａｃｅｒｕｂｅｒ）ＮＢＲＣ１５１４６株として保存されており、誰でも入手可能である。
【００１４】
変異を導入する基となる親株由来の遺伝子としては、例えば配列番号３で表される塩基配列のＤＮＡを含む遺伝子を挙げることができる。
ただし、変異を導入する基となる遺伝子は、上記当該の遺伝子に限定されず、例えば配列番号８で表されるアミノ酸配列を含むＬ−スレオニンアルドラーゼをコードするすべての遺伝子を含む。
変異を導入する基となる遺伝子に変異を導入された耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子としては、例えば配列番号４〜７で表される塩基配列のＤＮＡを含む遺伝子を挙げることができる。
また、前記配列番号４〜７で示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含む遺伝子も、本発明に用いられる遺伝子である。
【００１５】
なお、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、例えば配列番号４に示す塩基配列をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法またはプラーク・ハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるＤＮＡを意味する。なお、ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、例えば相同性が高いＤＮＡ同士、少なくとも配列番号４で示される塩基配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約８０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは、約０．１〜２倍程度の濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる。）、温度約６５℃程度でのハイブリダイズ条件をいう。なお、相同性は塩基配列解析ソフト、例えばＥＭＢＯＳＳなどにより計算され得る。
【００１６】
また、本発明において「遺伝子」または「ＤＮＡ」という用語には、ＤＮＡのみならずそのｍＲＮＡおよびｃＤＮＡも含むものとする。したがって、本発明の遺伝子には、これらのＤＮＡ、ｍＲＮＡおよびｃＤＮＡの全てが含まれる。
【００１７】
本発明において「相補的な配列」とは、Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする塩基配列に対して塩基対合則（アデニン／チミン、シトシン／グアニン）に従って形成される塩基配列をいう。
【００１８】
ストレプトマイセス・セリカラーＡ３（２）株からのＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子の取得および変異の導入は、例えば以下の方法により実施することができる。
【００１９】
まず、ストレプトマイセス・セリカラーＡ３（２）株を栄養培地で培養し菌体（微生物）を得る。栄養培地は、通常の微生物の培養に使用される培地であればいずれも好ましく用いることができる。
【００２０】
菌体（微生物）からのゲノムＤＮＡの抽出は公知の方法で行なうことができ、また市販のＤＮＡ抽出キットを用いて簡便に行なうことができる。市販のＤＮＡ抽出キットとしては、例えばＰｕｒｅｇｅｎｅ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｇｅｎｔｒａ社製）、ＧＦＸ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（アマシャムバイオサイエンス社製）、ＭａｇＰｒｅｐ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｋｉｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
次に、ストレプトマイセス・セリカラーＡ３（２）株の全塩基配列はデータベース上で公開されているので、Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子の配列も閲覧することができる（例えばＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＬ６４５８８２）。このＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＬ６４５８８２に示されるＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のＮ末端およびＣ末端配列の塩基配列をもとにオリゴヌクレオチドを設計する。設計したオリゴヌクレオチドをプライマーとして、上記で抽出したゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行い、Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードするＤＮＡを得る。このようなプライマーとして例えば配列番号１または２の塩基配列で示されるプライマーが挙げられる。配列番号１の塩基配列で示されるプライマーはＬ−スレオニンアルドラーゼのＮ末端配列の上流に制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列を、配列番号２の塩基配列で示されるプライマーはＬ−スレオニンアルドラーゼのＣ末端配列の下流に制限酵素ＢａｍＨＩの認識配列をそれぞれ追加したものである。なお、前記認識配列は前記に限定されず、後記するベクターが有する制限酵素部位に含まれる制限酵素の認識配列との関係から適宜選択するのが好ましい。ＰＣＲ反応は公知のＰＣＲ増幅装置、例えばサーマルサイクラー等を利用し得る。ＰＣＲのサイクルは、公知技術に従って行なわれてよく、例えばデナチュレーション→アニーリング→エクステンションを１サイクルとして、約１０〜１００サイクル、好ましくは約２０〜５０サイクル程度増幅するのが好ましい。
【００２２】
ＰＣＲによって得られたＤＮＡ断片を制限酵素、例えばＥｃｏＲＩと制限酵素ＢａｍＨＩなどで処理し、同じく両制限酵素で処理した発現ベクターと連結させることにより発現ベクターを得ることができる。該発現ベクターを公知の方法で例えば大腸菌などの微生物に挿入し上記遺伝子のクローニングを行ない得る。
【００２３】
大腸菌等の微生物への遺伝子の導入および該遺伝子の発現は遺伝子工学実験の常法に基づいて行うことができる。大腸菌や放線菌等の種々の微生物のベクターの情報や外来遺伝子の導入・発現法は、多くの実験書に記載されているので（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｒｕｓｓｅｌ，Ｄ．Ｗ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ， ２００１； Ｈｏｐｗｏｏｄ，Ｄ．Ａ．，Ｂｉｂｂ，Ｍ．Ｊ．，Ｃｈａｔｅｒ， Ｋ．Ｆ．，Ｂｒｕｔｏｎ，Ｃ．Ｊ．，Ｋｉｅｓｅｒ，Ｈ．Ｍ．，Ｌｙｄｉａｔｅ，Ｄ．Ｊ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｃ．Ｐ．，Ｗａｒｄ，Ｊ．Ｍ．，Ｓｃｈｒｅｍｐｆ，Ｈ．Ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｅ Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｎｏｒｗｉｃｈ，ＵＫ，１９８５）、それらに従ってベクターの選択、遺伝子の導入、発現を行うことができる。
【００２４】
クローニングされたストレプトマイセス・セリカラーＡ３（２）由来のＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子への変異の導入は、市販の変異導入用キットなどを用いることにより簡便に行なうことができる。すなわち、Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子が挿入されたベクターを用いて、変異導入用キットを該キットのプロトコールなどに従い実施することにより、Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子に非常に高い頻度でランダムに変異が導入され、同時に該変異した遺伝子（以下、変異遺伝子という。）がＰＣＲにより増幅され得る。このような変異導入用キットとしては、例えばＭｕｔａｚｙｍｅ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを含むＧｅｎｅＭｏｒｐｈ Ｒａｎｄｏｍ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒ（登録商標） Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）、Ｍｕｔａｎ（登録商標）−Ｓｕｐｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｍ（タカラバイオ株式会社製）またはＤｉｖｅｒｓｉｆｙ ＰＣＲランダム突然変異誘発キット（ＢＤバイオサイエンス社製）などが挙げられるがこれに限定されない。変異導入用キットによりＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子に変異が導入され増幅された、変異遺伝子のＰＣＲ産物を、ＤＮＡ精製用キットを用いて精製するのが好ましい。該精製用キットとしては、例えばＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎｅ社製）、ＳｐｉｎＣｌｅａｎ（登録商標） ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｂｉｏｔｅｃｈ社製）、ＡＭＰｕｒｅ（登録商標） ＰＣＲ産物クリーンアップキット（パーキンエルマー社製）、ＪＥＴＦＬＥＸ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｇｅｎｏｍｅｄ社製）、ＧＦＸ ９６ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、ＡｕｔｏＳｅｑ Ｇ−５０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）などが挙げられるがこれに限定されない。精製した変異遺伝子のＰＣＲ産物を前述した二種類の制限酵素、例えばＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩなどで切断した後、アガロースゲル電気泳動にかけて、約１ｋｂｐに相当するバンドをゲルから切り出して、更にアガロースゲルからＤＮＡの精製を行うのが好ましい。該精製は、市販キットを使用することができ、例えばＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎｅ社製）またはＳ．Ｎ．Ａ．Ｐ．ＵＶ−Ｆｒｅｅ Ｇｅｌ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）などを使用し得るが、これらに限定されない。精製された変異遺伝子のＰＣＲ産物は、適当な発現用ベクターに挿入され、次いで変異遺伝子が挿入された発現ベクターを、宿主（菌株）に挿入し、宿主を形質転換し、変異遺伝子ライブラリーを構築し得る。
【００２５】
発現用ベクターとしては、例えば細菌プラスミド（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ＋、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＥＴ １６ｂ、ｐＥＴ ３２ａ（＋）、ｐＣＩＴＥ ４ａ、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１、ｐＧＥＸ−５Ｘ−３、ｐＭＡＬ−ｐ２、ｐＭＡＬ−ｃ２、ｐＢｒｉｄｇｅ Ｖｅｃｔｏ、ｐＫＦ１８ｋ ＤＮＡ、ｐＫＦ１９ｋ ＤＮＡ、ｐＴｒｃ９９Ａ（アマシャムバイオサイエンス製）、ｐＳＰＯＲＴ １、Ｃｈａｒｍｏｍｉｄ ９−３６ ＤＮＡ、ｐＥＵ−ＤＦＲ、ｐＩＶＥＸ ２．３−ＭＣＳ、ｐＩＶＥＸ ２．４ｃ、ｐＩＶＥＸ ２．３、ｐＩＶＥＸ ２．４ｂ Ｎｄｅ、ｐＩＶＥＸ ２．４ａなど）、ファージＤＮＡ（ラムダファージなど）、酵母プラスミド（ｐＧ−１など）、哺乳類細胞用のベクターとしてのバキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなどのウイルスＤＮＡ、ＳＶ４０とその誘導体などが挙げられ、宿主において複製可能である限り他のいかなるベクターも用いることができる。
【００２６】
ベクターは例えば複製開始点、選択マーカー、プロモーターを含み、必要に応じてエンハンサー、転写終結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナルなどを含んでいてもよい。ベクターは、種々の制限酵素部位をその内部にもつポリリンカーを含んでいるか、または単一の制限酵素部位を含んでいることが望ましい。制限酵素部位としては、例えばＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩサイト、ＮｏｔＩサイト、ＳａｌＩサイト、ＫｐｎＩサイトまたはＨｉｎｄＩＩＩサイトなどが挙げられる。これら制限酵素サイトは、各々制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ、ＮｏｔＩ、ＳａｌＩ、ＫｐｎＩまたはＨｉｎｄＩＩＩなどで切断され得る。
ベクターへの遺伝子導入は、公知の手段で行なうことができる。具体的には、ベクター中の特定の制限酵素部位（例えばＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩなど）を特定の制限酵素（例えばＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩなど）によって切断し、その切断部位に本発明の遺伝子を挿入するのが好ましい。このようにして、本発明の遺伝子を含む組換えベクターを調製できる。
【００２７】
宿主としては、例えば細菌、例えば大腸菌（例えば、エシェリヒア・コリＪＭ１０９菌株など）、コリネバクテリウム属菌、バチルス属菌、ストレプトミセス、枯草菌など；真菌細胞、例えばアスペルギルス属菌株など；酵母細胞、例えばパン酵母、メタノール資化性酵母など；昆虫細胞、例えばドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９など；ヒト培養細胞を含む哺乳類細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、３Ｔ３、Ｃ１２７など；あるいはこれらのコンピテントセルなどが挙げられ、好ましくは大腸菌のコンピテントセルである。
形質転換は、例えば塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション、電気穿孔法などの公知の方法で行うことができる。
具体的には、例えば上述の変異遺伝子が挿入された発現ベクターとエシェリヒア・コリＪＭ１０９（以下、大腸菌ＪＭ１０９ともいう。）のコンピテントセルと混合することにより、形質転換された微生物を得ることができる。
【００２８】
上述の変異遺伝子が挿入された発現ベクターにて形質転換された微生物（以下、単に形質転換された微生物または形質転換微生物という。）は下記する微生物培養培地などで、培養温度約２０〜４０℃、培養時間約１〜７日間、培地のｐＨ約５．０〜８．０程度で培養されることが好ましい。
【００２９】
Ｌ−スレオニンアルドラーゼの活性の測定は、例えば以下の様にして行なうことができる。Ｌ−スレオニンアルドラーゼのＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの分解活性は、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳを含む反応液（以下、分解反応液ともいう。）に、形質転換微生物から調製した無細胞抽出液を添加し、約２０〜６０℃、好ましくは約４０〜５０℃、約１〜３０分間、好ましくは約１０〜１５分間反応を行い、生成したグリシンをＨＰＬＣにより定量することにより測定することができる。無細胞抽出液としては、形質転換微生物を例えば水媒体中で超音波やガラスビーズなどで破砕した後のＬ−スレオニンアルドラーゼを含む遠心分離上清などが挙げられる。
Ｌ−スレオニンアルドラーゼのＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳ合成活性は、形質転換微生物をグリシンと３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドを含む反応液（以下、合成反応液ともいう。）中で、約５〜５０℃、好ましくは約１０〜２０℃、約１〜２４時間、好ましくは約４〜６時間反応させ、生成したＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳを例えばＯＤＳカラムを用いたＨＰＬＣ法などにより定量することができる。
【００３０】
分解反応液および合成反応液の基礎となる溶液としては、形質転換された微生物の生育やＬ−スレオニンアルドラーゼの働きを阻害しない溶液であれば特に制限はなく、例えば微生物培養培地または緩衝液、あるいは水（例えば精製水、蒸留水、イオン交換水等）などが好ましく挙げられる。
【００３１】
微生物培養培地は、通常の微生物の培養に使用される培地であれば好ましく用いることができ、例えば炭素源、窒素源、無機塩類およびその他の栄養物質などを含有する天然培地または合成培地などが用いられる。
炭素源としては、例えばグルコース、フルクトース、シュークロース、マンノース、マルトース、マンニトール、キシロース、ガラクトース、澱粉、糖蜜、ソルビトールまたはグリセリンなどの糖質および糖アルコール、酢酸、クエン酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸またはグルコン酸などの有機酸、エタノールまたはプロパノールなどのアルコールなどが挙げられる。また、所望によりノルマルパラフィンなどの炭化水素なども用いることができる。炭素源は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を混合して使用してもよい。
これら炭素源の培地における濃度は通常約０．１〜１０％（ｗｔ）程度である。
窒素源としては、窒素化合物、例えば塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなどの無機もしくは有機アンモニウム化合物、尿素、アンモニア水、硝酸ナトリウムまたは硝酸カリウムなどが挙げられるが、これらに限定されない。また、コーンスティープリカー、肉エキス、ペプトン、ＮＺ−アミン、蛋白質加水分解物またはアミノ酸などの含窒素有機化合物なども使用可能である。窒素源は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を混合して使用してもよい。
窒素源の培地濃度は、使用する窒素化合物によっても異なるが、通常約０．１〜１０％（ｗｔ）程度である。
無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルトまたは炭酸カルシウムなどが挙げられる。これら無機塩は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を混合して使用してもよい。
無機塩類の培地濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常約０．０１〜１．０％（ｗｔ）程度である。
栄養物質としては、例えば肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、コーンスティープリカー、脱脂粉乳、脱脂大豆塩酸加水分解物または動植物若しくは微生物菌体のエキスやそれらの分解物などが挙げられる。
栄養物質の培地濃度は、使用する栄養物質によっても異なるが、通常約０．１〜１０％（ｗｔ）程度である。
培地のｐＨは約５．０〜８．０程度が好ましい。
【００３２】
好ましい微生物培養培地としては、ＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地；トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、食塩１０ｇ／Ｌ）、ＮＺＹＭ培地、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ、ＳＯＢ培地、２ｘＹＴ培地、ＡＨＣ培地、χ１７７６培地、Ｍ９培地、ＹＰＤ培地、ＳＤ培地、ＹＰＡＤ培地またはＳｕｐｅｒ ｂｒｏｔｈ培地などが挙げられる。
【００３３】
緩衝液としては、例えばリン酸バッファー、トリスバッファー、リン酸緩衝食塩水、酢酸緩衝液などが挙げられる。緩衝液のｐＨは、通常約５〜１０、さらに約６．５〜８．５が好ましい。
【００３４】
また、耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼを産生する変異株を上述の遺伝子ライブラリーから選択するためのスクリーニングは、例えば９６穴のディープウェルプレートなどを用いて、少量の培養で迅速に行なうことができる。即ち、前述変異遺伝子ライブラリーのコロニーを、例えばコロニーピッカーなどにより選抜し、該コロニーの菌体（微生物）を、例えば９６穴のプレートを用いて約０．１〜０．５ｍＬ、好ましくは約０．２５ｍＬの微生物培養培地などで培養を行ない、菌体を得る。この菌体とＬ−スレオニンを含む反応液を約３０〜５０℃、約１０〜１２０分、好ましくは約３０分間反応後、生成したアセトアルデヒドを発色剤（例えば、約１５Ｗ／Ｖ％酢酸アンモニウム、約０．５Ｖ／Ｖ％酢酸、約２０Ｖ／Ｖ％アセチルアセトンを含む溶液；以下、発色剤において同様である。）と反応させ黄色の発色により、Ｌ−スレオニンアルドラーゼ活性の確認を行なう。この一次スクリーニングで活性の確認されたコロニーの菌体（微生物）のみを次の二次スクリーニングに供する。
二次スクリーニングも同様に、例えば９６穴のディープウェルプレートなどを用いて、約０．１〜０．５ｍＬ、好ましくは約０．２５ｍＬの微生物培養培地などで培養を行なう。得られた菌体（微生物）を例えばガラスビーズと共に細胞破砕装置シェイクマスター（バイオメディカルサイエンス社製）などで微生物の細胞破砕後、遠心分離を行い、無細胞抽出液を得、更に約６０〜７０℃、好ましくは約６５℃、約１０〜３０分、好ましくは約２０分間の熱処理を行なう。耐熱性のない酵素はこの段階で失活してしまう。熱処理後の無細胞抽出液とＬ−スレオニンを含む反応液を約３０〜５０℃、約１０〜１２０分、好ましくは約６０分間反応後、生成したアセトアルデヒドを発色剤と反応させ黄色の発色により、Ｌ−スレオニンアルドラーゼ活性の確認を行なう。
【００３５】
前述のスクリーニングにより得られた耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子が導入され形質転換された変異微生物（以下、変異遺伝子導入微生物という。）を得ることができる。この形質転換された微生物の菌株を約５０〜２００μｇ／ｍＬ、好ましくは約１００μｇ／ｍＬのアンビシリンを含む微生物培養培地（例えばＬＢ培地など）で、約２０〜４０℃で約１時間〜４８時間、静置若しくは攪拌下に培養し、その培養液から遠心分離により菌体（微生物）を回収することにより取得できる。
【００３６】
回収された菌体からプラスミドＤＮＡを抽出する。プラスミドＤＮＡの抽出は、公知の方法で行なうことができ、また市販のＤＮＡ抽出キットを用いてプラスミドＤＮＡを簡便に抽出できる。市販のプラスミドＤＮＡ抽出キットとしては、例えば、例えばＱＩＡｑｕｉｃｋ ｐｌａｓｍｉｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）等が挙げられる。この抽出されたプラスミドＤＮＡの塩基配列を決定することにより、本発明の耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする全ＤＮＡを決定することができる。
【００３７】
得られたＤＮＡ断片の塩基配列は、例えばジデオキシヌクレオチド酵素法等、公知の方法により決定することができる。また、キャピラリー電気泳動システムを用い、検出には多色蛍光技術を使用して塩基配列を決定することもできる。また、ＤＮＡシークエンサー、例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７００ ＤＮＡ ＡＮＡＬＹＺＥＲ（アプライドバイオシステム社製）等を使用して自動的に分析して塩基配列を決定することもできる。
【００３８】
上記のようにして、耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を決定し、本発明に用いられる遺伝子として、例えば、配列番号４〜７に示す塩基配列を決定し得る。該配列番号４で示される塩基配列を含む遺伝子は、親株由来のＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子の塩基配列（配列番号３）の５２９番目のシトシンがチミンに変化した遺伝子である。該配列番号５で示される塩基配列を含む遺伝子は、親株由来のＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子の塩基配列（配列番号３）の５０５番目のグアニンがアデニンに変化した遺伝子である。該配列番号６で示される塩基配列を含む遺伝子は、親株由来のＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子の塩基配列（配列番号３）の３１０番目のグアニンがアデニンに変化した遺伝子である。該配列番号７で示される塩基配列を含む遺伝子は、親株由来のＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子の塩基配列（配列番号３）の５５番目のチミンがアデニンに変化した遺伝子である。
次いで該塩基配列をアミノ酸配列に翻訳して解析し、例えば、配列番号９〜１２に示す耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼの全アミノ酸配列を決定することができる。すなわち、配列番号９で示されるタンパク質のアミノ酸配列は、親株由来のＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子の塩基配列（配列番号３）の５２９番目のシトシンがチミンに変化することにより、翻訳されるアミノ酸の配列の１７７番目のアミノ酸残基がヒスチジン残基からチロシン残基に変化したものである。配列番号１０で示されるタンパク質のアミノ酸配列は、親株由来のＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子の塩基配列（配列番号３）の５０５番目のグアニンがアデニンに変化することにより、翻訳されるアミノ酸の配列の１６９番目のアミノ酸残基がアラニン残基からスレオニン残基に変化したものである。配列番号１１で示されるタンパク質のアミノ酸配列は、親株由来のＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子の塩基配列（配列番号３）の３１０番目のグアニンがアデニンに変化することにより、翻訳されるアミノ酸の配列の１０４番目のアミノ酸残基がアスパラギン酸残基からアスパラギン残基に変化したものである。配列番号１２で示されるタンパク質のアミノ酸配列は、親株由来のＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子の塩基配列（配列番号３）の５５番目のチミンがアデニンに変化することにより、翻訳されるアミノ酸の配列の１９番目のアミノ酸残基がフェニルアラニン残基からイソロイシン残基に変化したものである。
【００３９】
上述の耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子を含む発現ベクターにて形質転換された微生物（以下、変異遺伝子導入微生物という。）を培養し、得られる変異遺伝子導入微生物を下記する反応に用いるのが好ましい。培養は、上記形質転換微生物の培養条件と同様に行うことができる。例えば好気条件下で約１２〜２４時間程度実施するのが好ましい。また培養温度は例えばエシェリキア・コリＪＭ１０９株形質転換体の場合、ポリペプトンや酵母エキス等の炭素源や窒素源、食塩等の無機物を含む培地を用いて、好ましくは約２０〜４０℃、より好ましくは３０〜３７℃である。
【００４０】
得られた変異遺伝子導入微生物またはその調製物を、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンを含有する液（合成反応液）と接触させ、目的のＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳ一段階合成反応を行い生成蓄積せしめる。該合成反応液の基礎となる溶液は、上記した分解反応液および合成反応液の基礎となる溶液と同様のものを用いることができる。
すなわち、本発明のＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの製造方法において、変異遺伝子導入微生物またはその調製物を用いて、グリシンと３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドから一段階で収率よくＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳを得ることができる。
【００４１】
変異遺伝子導入微生物は、培養液中に存在する状態や培養液から該微生物を分離・濃縮などして使用することもできる。また、変異遺伝子導入微生物の調製物としては、例えばアクリルアミドやカラギーナンなどの担体上に変異遺伝子導入微生物を固定化した固定化微生物、あるいは、凍結乾燥やアセトン処理などによる乾燥微生物などの調製物などが挙げられる。また、前記調製物には変異遺伝子導入微生物に生成蓄積した酵素を抽出し、好ましくは精製などして樹脂担体などに固定化した固定化酵素も含まれる。酵素の精製法は、微生物を超音波やガラスビーズで破砕した後、硫安沈殿、イオン交換およびゲルろ過カラムクロマトといった通常酵素精製に用いられる精製法を組み合わせて行なうことができる。
【００４２】
又、変異遺伝子導入微生物は、紫外線、エックス線または薬品等を用いる人工的な変異手段でさらに変異しうるが、このように得られるどのような変異株であっても本発明の対象とする耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼ生産能を有するかぎり、本発明の変異遺伝子導入微生物として使用することができる。
【００４３】
合成反応液中に含まれる３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドは、Ｌ−スレオニンアルドラーゼの酵素活性を阻害しない程度の濃度で用いられ、通常、合成反応液の約０．１〜１０％（ｗｔ）程度である。またその供給方法としては分割添加や連続的に添加する方法などで行うことが出来る。
合成反応液中に含まれる他方の反応基質であるグリシンは、通常約０．１〜３０％（ｗｔ）程度を反応系に存在せしめて使用されるが、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドに対しては等モル以上で使用することが好ましい。グリシンは、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドと同様に合成反応液に添加できる。
【００４４】
合成反応液と変異遺伝子導入微生物またはその調製物との接触は、例えば培養した変異遺伝子導入微生物を遠心分離機やろ過などで集め、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンを含有する合成反応液に加えて接触せしめてもよく、また集めた変異遺伝子導入微生物を例えば水媒体中で超音波やガラスビーズなどで破砕した後のＬ−スレオニンアルドラーゼを含む遠心分離上清または該上清から精製したＬ−スレオニンアルドラーゼを合成反応液に加える方法であってもよい。また、固定化微生物や固定化酵素を合成反応液と接触させても良い。
合成反応液と変異遺伝子導入微生物またはその調製物との接触方法は、公知の方法、例えばバッチ方式または連続方式（例えば、カラム法、固定化微生物、固定化酵素法等）など、いずれの方法も用いることができる。
また、合成反応液と変異遺伝子導入微生物をフィルターなどにより分離し、変異遺伝子導入微生物を連続的に回収し、繰り返し再使用することもできる。
【００４５】
本発明の反応は、ｐＨ約５〜１０、特に好ましくは約６．５〜８．５において、温度約５〜６０℃、特に約１０〜５０℃で静置若しくは攪拌下に反応を進行せしめるのが好ましい。反応時間としては、通常１時間〜４８時間の範囲が好ましい。
また、本発明の反応は、好気、嫌気いずれの条件でも行なうことができる。また、合成反応液と変異遺伝子導入微生物の反応は、変異遺伝子導入微生物が生存できる条件、例えば上記微生物の培養における条件と同様の条件で実施することが好ましい。
【００４６】
本酵素系には補酵素としてビタミンＢ６が要求されるため、合成反応液には、例えばピリドキシン、ピリドキサールまたはピリドキサール−５’−リン酸などを添加することが好ましい。該補酵素を添加することにより反応が高められ得る。
また。合成反応液には、所望により例えば２−メルカプトエタノールのような還元剤を添加することもできる。
かくして反応せしめた反応混合物中には、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンから両化合物の反応生成物であるＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳが高選択的にかつ高収率（反応条件により一概にはいえないが、約１５％ｄ．ｅ．以上、好ましくは約２０％ｄ．ｅ．以上、より好ましくは約２０〜８０％ｄ．ｅ．程度である。）に生成し得る。
【００４７】
合成されたＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの精製は、公知の方法、例えばイオン交換樹脂、吸着樹脂やシリカゲルなどのクロマト分離、酢酸エチルやトルエンなどの有機溶媒を用いた溶媒抽出、溶解度の差を利用した分別結晶化などを組み合わせて行なうことができる。
【００４８】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
なお、本発明において配列中、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシン、Ｔはチミンを示す。本明細書において％は特に断らない限り質量％を意味する。
【実施例１】
【００４９】
Ｌ−スレオニンアルドラーゼ産生株ＤＮＡの取得
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）からのゲノムＤＮＡ抽出には、ＰＵＲＥＧＥＮＥ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｇｅｎｔｒａ社製）を用いた。まず、斜面培養したＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）のコロニーから白金耳を用いて採取した菌体を、ポリペプトン１．０％、酵母エキス０．２％および硫酸マグネシウム０．１％を含む液体培地１０ｍＬ（ｐＨ７．０）に植菌し、３０℃、２日間振騰培養した。この５ｍＬの培養液を１５ｍＬのファルコンチュ−ブへ移し、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心した。上清を捨て、得られたペレットをキットに添付のＣｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ３ｍＬに懸濁した。その後、キットの使用説明書に従い、ＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡは、ＤＮＡ Ｈｙｄｒａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ５００μＬに溶解し、１μＬをアガロ−ス電気泳動してＤＮＡの存在を確認後、４℃または−２０℃で保存した。
【実施例２】
【００５０】
Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子の増幅
実施例１で取得したＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）のゲノムＤＮＡよりＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子をＰＣＲ反応より増幅するためのプライマーを合成した。即ち、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）のゲノム解析の結果得られたＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子の塩基配列はすでに公開されている（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ． ＡＬ６４５８８２）。この遺伝子のオープンリーディングフレ−ム（ＯＲＦ）のＮ末端およびＣ末端部分の塩基配列を利用し制限酵素の認識配列として、Ｎ末端の前にＥｃｏＲＩ認識配列を追加したＤＮＡプライマー配列
５’プライマー：5’-ATATACCATGGAATTCAACCCTCCTAAGACCGACG-3’（配列番号１）
とＣ末端の後にＢａｍＨＩ認識配列を追加したＤＮＡプライマー配列；
３’プライマー：5’-ATCTAGAGGATCCTCAGCGCGCCATCTCTTCCTTG-3’（配列番号２）
を合成した。
【００５１】
これらのＤＮＡプライマー（配列番号１と配列番号２）を用いて実施例１で得たゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより増幅を行なう。ＰＣＲには、Ｔａｋａｒａ社のＬＡ−ＰＣＲキットを用い、２種類のＨｉｇｈ ＧＣバッファーで反応を行った。ＰＣＲの条件は以下の通りである。
ＰＣＲ条件：１μＬ鋳型ゲノムＤＮＡ （３８７．５ｎｇ／μＬ）、０．５μＬ（５ Ｕ／μＬ）ＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、 ２５μＬ ＬＡ−Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ添付のＨｉｇｈ ＧＣバッファー（Ｉ）（１Ｘ）、８μＬ ｄＮＴＰ （各２．５ｍＭ）、０．５μＬ ５’プライマー配列番号１）２５ｐｍｏｌ／ｍＬおよび０．５μＬ ３’プライマー（配列番号２）２５ｐｍｏｌ／ｍＬの混合物に水を加え、総量５０μＬの溶液を作製し、９４℃で２分間熱処理後、９４℃で４０秒、６０℃で３０秒、７２℃で２分の条件で３０サイクルのプログラムで増幅を行い、その後７２℃で５分間処理した。また、増幅の確認は１％のアガロ−ス電気泳動で行った。その結果、制限酵素部位を含む１種類のＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子が増幅された（１０９７ｂｐ）。
【実施例３】
【００５２】
組換えＬ−スレオニンアルドラーゼ発現ベクターの作製。
ＰＣＲにより増幅されたＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子を、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで切断して分離し、発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａ（アマシャムバイオサイエンス製）に挿入することにより発現させた。即ち、実施例２におけるＰＣＲにより増幅されたＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子断片を含むＰＣＲ溶液を精製（ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ社製）し、各々１０Ｕの制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩを用いて３７℃で３時間切断反応を行った。反応後の溶液を１％（Ｗ／Ｖ）濃度のアガロ−スゲル電気泳動により分離し、１０８１ｂｐに相当するバンドをゲルより切り出してＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）により精製した。
【００５３】
次に１μｇのｐＴｒｃ９９Ａ（アマシャムバイオサイエンス製）を各１０Ｕの制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩを用いて３７℃で一晩静置し、ｐＴｒｃ９９Ａの制限酵素部位の切断反応を行った。反応後の溶液を０．７％（Ｗ／Ｖ）濃度のアガロ−スゲル電気泳動により切断を確認し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）により精製し，３０μＬのトリス−塩酸緩衝液（１０ｍＭ，ｐＨ８．５）に溶解した。
【００５４】
制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで切断して得た１０８１ｂｐのＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子断片を含む溶液８μＬとＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで切断して得たｐＴｒｃ９９Ａの溶液８μＬをＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社製）と混合し、１６℃で５時間連結反応を行った。反応後の溶液５μＬを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。形質転換した大腸菌ＪＭ１０９を含む溶液を１００μｇ／ｍＬのアンピシリン、０．１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）および０．００４％のＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地上に塗布し、３７℃で一晩培養してコロニーを形成させた。それぞれについて白色の陽性コロニーを選択し、３ｍＬの１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含んだＬＢ液体培地に植菌し、３７℃で一晩培養した。培養液を遠心分離して集菌後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ｐｌａｓｍｉｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）により約２μｇのプラスミドＤＮＡを精製した。そのうち約０．５μｇのプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで切断し、１％（Ｗ／Ｖ）濃度のアガロ−スゲル電気泳動により１０８１ｂｐに相当する挿入断片の存在を確認した。さらに挿入断片の塩基配列をシークエンス反応により確認したところ、変異は認められなかった。この発現プラスミドをｐｌｔｈ−ＳＣＡ３（２）とした。
【実施例４】
【００５５】
組換えＬ−スレオニンアルドラーゼの大腸菌での発現および活性測定
挿入断片が確認されたｐｌｔｈ−ＳＣＡ３（２）ベクターを挿入した大腸菌ＪＭ１０９株（この形質転換体は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されている。寄託番号：受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１１１）を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む３ｍＬのＬＢ培地に植菌し、一晩３７℃で培養した。この培養液のうち、０．１ｍＬを１０ｍＬのＬＢ培地（１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む）に接種した。約３時間後、培養液のＯＤ６００が０．４〜０．７に上昇したことを確認後、最終濃度で２ｍＭになるように１ＭのＩＰＴＧを培地に添加し組換えＬ−スレオニンアルドラーゼの大腸菌での発現を誘導させた。その培養液をさらに、一晩３７℃で培養し、培養液を１００００×ｇ、５分間の遠心操作により細胞を沈殿させ、上清を除いた後、０．８５％のＮａＣｌで１回洗浄した。遠心操作により細胞を沈殿させた後、ビーズ衝撃法細胞破砕装置Ｂｅａｄｓ Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ Ｍｏｄｅｌ ＢＣ−２０（４℃，３分，セントラル科学貿易製）でその菌体を２回破壊した。２００００×ｇで１０分間遠心した後、その上清を粗酵素液としてＬ−スレオニンアルドラーゼの分解活性を調べた。反応液の組成は１００μＬのＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳ（１ｍｇ／ｍＬ），２５μＬのピリドキサール−５’−リン酸（０．６μｇ／ｍＬ）および１μＬのメルカプトエタノール（２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）を水で１５０μＬとし、この１５０μＬの反応液に５０μＬの粗酵素液（多段階希釈により許容範囲に合わせた）を加え５０℃で１０分間酵素反応を行い，３倍量のメタノールを加えることにより反応を停止させた。Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの分解産物であるグリシンの生成量は液体クロマトグラフ分析法（以下ＨＰＬＣと言う；、日立Ｌ２０００シリーズ、日立製作所製）でポストカラム分析法を用いて測定した。ＨＰＬＣ分析は、ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＭＳ（Φ４．６×１５０ｍｍ）カラム、カラムおよび反応コイル温度２０℃，移動相は０．１％ １−ヘプタンスルホン酸Ｎａ／メタノール［１０：１（Ｖ／Ｖ）］，ポスト反応液組成は、ミリ−Ｑ水１Ｌに対しホウ酸２１．６４ｇ、水酸化ナトリウム１２ｇ、２−メルカプトエタノール ２ｍＬ、ＯＰＡ（オルトフタルアルデヒド；８００ｍｇ／１５ｍＬエタノール）、Ｂｒｉｊｉ−３５（ポリオキシエチレンラウリルエーテル；０．２５ｇ／２ｍＬエタノール）を添加し行った。ＨＰＬＣの流速は移動相および反応液共に０．７５ｍＬ／分で、分離産物の検出はλｅｘ／ｅｍ＝３４０／４５０ｎｍの蛍光で分析した。このＨＰＬＣによるグリシンの分析範囲は０．１μｇ／ｍＬ以下である。酵素活性は５０℃における１分間あたり１μｍｏｌのグリシンの生成量を１単位とした。その結果、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）のゲノムＤＮＡよりクロ−ニングしたＬ−スレオニンアルドラーゼは、粗酵素１ｍｇあたり１５４単位のＬ−スレオニンアルドラーゼ分解活性を示すことがわかった。
【００５６】
また、分解活性が確認されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）由来の Ｌ−スレオニンアルドラーゼによる合成反応の目的物質であるＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの合成活性を調べた。即ち、ｐｌｔｈ−ＳＣＡ３（２）ベクターを含む大腸菌ＪＭ１０９株を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む３ｍＬのＬＢ液体培地に植菌し、一晩３７℃で培養した。この培養液のうち、０．５ｍＬを５０ｍＬのＬＢ培地（１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む）に接種した。約３時間後、培養液のＯＤ６００が０．４〜０．７に上昇したことを確認後、最終濃度で２ｍＭになるように１ＭのＩＰＴＧを添加しＬ−スレオニンアルドラーゼの大腸菌での発現を誘導させた。その培養液をさらに、一晩３７℃で培養し、培養液を１００００×ｇ，１０分間の遠心操作により細胞を沈殿させ、上清を除いた後、０．８５％のＮａＣｌ水溶液で１回洗浄した。遠心操作により細胞を沈殿させた後、その菌体を用い合成反応を行った。反応液の組成は１ｇのグリシン、１００ｍｇの３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド、１０μＬのメルカプトエタノール（２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）、２５０μＬのピリドキシサ−ル−５’−リン酸（ＰＬＰ；０．６ｍｇ／ｍＬ）、４．７４ｍＬ ０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、０．０１５８ｇの亜硫酸ナトリウム、０．０３７５ｇのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００に溶解し、１Ｎ塩酸で最終ｐＨを６．５にした。この反応液に−８０℃で凍結保存しておいた上記遠心分離操作により得た菌体を加え１５℃で５時間酵素反応を行い、３倍量のメタノールを加えることにより反応を停止させた。合成産物であるＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの合成量はＨＰＬＣ（日立Ｌ２０００シリ−ズ、日立製作所製）で測定した。ＨＰＬＣ分析は、ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＭＳ（Φ４．６×１５０ｍｍ）カラム、カラム温度３０℃，移動相は０．１％ １−ヘプタンスルホン酸（ｐＨ２．５）／メタノール／１，４−ジオキサン＝［５００：５０：１５（Ｖ／Ｖ／Ｖ）］で行った。ＨＰＬＣの移動相流速は０．７５ｍＬ／分で、分離産物の検出はＵＶ＝２２０ｎｍの吸光で分析した。その結果、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）のゲノムＤＮＡよりクロ−ニングしたＬ−スレオニンアルドラーゼは、菌体培養液１Ｌあたり０．４ｇのＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの合成活性能を有する酵素であることがわかった。なお反応液１Ｌあたりの合成量は４ｇであった。
【実施例５】
【００５７】
ランダム変異導入法による変異遺伝子ライブラリーの作製
作製したｐｌｔｈ−ＳＣＡ３（２）を用いてＧｅｎｅＭｏｒｐｈ Ｒａｎｄｏｍ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）のプロトコールに従いランダムに変異を導入することにより点変異遺伝子ライブラリーを構築した。このＫｉｔに含まれているＭｕｔａｚｙｍｅ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅは従来のＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅと比べ非常に高い頻度で変異を導入することができ、さらに初期のベクターの濃度を制御することにより導入される変異の頻度を制御できる。そこで実施例３で作製したｐｌｔｈ−ＳＣＡ３（２）を鋳型としてＰＣＲを行うことにより導入される変異を制御した。このときｐｌｔｈ−ＳＣＡ３（２）の濃度を５０ｎｇ／μＬ、２５０ｎｇ／μＬ、さらに５００ｎｇ／μＬの三つの濃度でＰＣＲを行うことにより導入される変異を制御した。このときプライマーはクロ−ニングの時と同様にＮ末端の前にＥｃｏＲＩ認識配列を追加した５’プライマー（配列番号１）とＣ末端の後にＢａｍＨＩ認識配列を追加した３’プライマー（配列番号２）を用いて行った。変異ＰＣＲの条件は以下の通りである。
変異ＰＣＲ条件：１μＬ鋳型ＤＮＡ ５０ｎｇ／μＬ（２５０ｎｇ／μＬ、５００ｎｇ／μＬ）、１μＬ（２．５Ｕ／μＬ）Ｍｕｔａｚｙｍｅ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、２５μＬ ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ Ｒａｎｄｏｍ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔに添付の反応バッファー（１Ｘ）、８μＬ ｄＮＴＰ ０．２ｍＭ、０．５μＬ ５’プライマー（配列番号１）２５ｐｍｏｌ／ｍＬおよび０．５μＬ ３’プライマー（配列番号２）２５ｐｍｏｌ／ｍＬの混合物に水を加え、総量５０μＬの溶液を作製し、９６℃で秒３０秒間熱処理後、９６℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で１分１５秒、３０サイクルのプログラムで増幅を行い、その後７２℃で１０分間処理した。増幅反応後の溶液１０μＬを１％濃度のアガロ−スゲル電気泳動を行った結果、目的とした約１ｋｂｐのＬ−スレオニンアルドラーゼをコードするＤＮＡ断片が増幅されていることを確認した。
【００５８】
次に、ランダム変異導入法により増幅した変異ＰＣＲ産物を大腸菌ＪＭ１０９に導入し、変異遺伝子ライブラリーを構築した。即ち、変異型Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子を含むＰＣＲ溶液をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔにより精製（Ｑｉａｇｅｎ社製）し、精製した変異ＰＣＲ産物全量を各々２０Ｕの制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩを用いて３７℃で一晩切断反応を行った後、１％（Ｗ／Ｖ）濃度のアガロ−スゲル電気泳動により分離し、約１ｋｂｐに相当するバンドをゲルより切り出してＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）により該バンド部分のＤＮＡを精製後、３０μＬのトリス−塩酸緩衝液（１０ｍＭ，ｐＨ８．５）に溶解した。次に１μｇのｐＴｒｃ９９Ａを各１０Ｕの制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩを用いて３７℃で一晩静置し、ｐＴｒｃ９９Ａの制限酵素部位の切断反応を行い、反応後の溶液をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔにより精製（Ｑｉａｇｅｎ社製）し、３０μＬのトリス−塩酸緩衝液（１０ｍＭ，ｐＨ８．５）に溶解した。精製したＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで切断した約１ｋｂｐに相当するＤＮＡ部分のＤＮＡ溶液８μＬと２μＬの ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで切断したベクターｐＴｒｃ９９Ａを５μＬのＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ製）と混合し、１６℃で一晩連結反応を行った。連結反応後の溶液５μＬを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換させ変異遺伝子ライブラリー作製した。
【実施例６】
【００５９】
耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼのハイスルプットスクリ−ニング
変異遺伝子ライブラリーのコロニーをコロニーピッカー（ＧＥＮＥＴＩＸ、ビ−エム機械社製）によりランダムに約１２５９２株を選抜し、一次スクリーニングへ供した。一次スクリーニングは２ｍＬ容量の９６穴の角型ディープウェルプレート（Ｗｈａｔｍａｎ製）を用い、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む２５０μＬのＬＢ液体培地に植菌し、９６穴の角型プレ−ト振動機（Ｔｉｔｒａｍａｘ １０００，ＨＥＩＤＯＬＰＨ社製）で一晩培養した（３０℃、６００ｒｐｍ）。９６穴の角型ディープウェルプレートを２５００ｒｐｍで１０分間遠心することにより菌体を分離し、−８０℃で１時間処理した。菌体を用いた酵素反応は菌体に２５０μＬのＬ−スレオニン（２ｍｇ／ｍＬ）を添加し５０℃で３０分間振動させながら反応を行った。この菌体反応によりＬ−スレオニンはグリシンとアセトアルデヒドに分解される。活性を有する変異酵素の選別は反応後の液と同量の発色剤（Ｎａｓｈ’ｓ試薬：１５％（Ｗ／Ｖ）酢酸アンモニウム、０．５％（Ｖ／Ｖ）酢酸および２０％（Ｖ／Ｖ）アセチルアセトン）を添加し５０℃で３０分間振動させながら行った。酵素活性を有するコロニーはアセトアルデヒドの発色試薬により黄色に発色する。その結果、２７６９のコロニーについて黄色（吸光度：３８８ｎｍ）の発色が観察された。
【００６０】
一次スクリ−ニングの結果、活性を示している２７６９株を対象に熱処理を加えた後に酵素基質と発色剤を加え、２次スクリ−ニングへ供し、残存活性により発色するコロニーを選択した。即ち、一次スクリ−ニングの結果、Ｌ−スレオニン分解活性を示している２７６９株を９６穴の角型ディープウェルプレート（Ｗｈａｔｍａｎ製）の１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む２５０μＬのＬＢ液体培地に植菌し、９６穴の角型プレ−ト振動機（Ｔｉｔｒａｍａｘ １０００，ＨＥＩＤＯＬＰＨ社製）で一晩培養した（３０℃、６００ｒｐｍ）。９６穴の角型ディープウェルプレートを２５００ｒｐｍで１０分間遠心することにより菌体を分離した。その菌体をプレートビーズ衝撃法多検体細胞破砕装置シェイクマスター Ｖｅｒ １．２（１５分，バイオディカルサイエンス製）で破壊した。遠心（２５００ｒｐｍ、１０分）により得られた上澄みを粗酵素液とし、９６穴の角型アッセイプレートに５０μＬずつ分注した後、６５℃で２０分間熱処理を行った。熱処理後の９６穴の角型アッセイプレートに５０μＬのＬ−スレオニン（２ｍｇ／ｍＬ）を添加し５０℃で６０分間振動させながら酵素反応を行った。活性を有する変異酵素の選別は反応後の液と同量（１００μＬ）の発色剤［Ｎａｓｈ’ｓ試薬：１５％（Ｗ／Ｖ）酢酸アンモニウム、０．５％（Ｖ／Ｖ）酢酸および２０％（Ｖ／Ｖ）アセチルアセトン］を添加し５０℃で３０分間振動させながら行った。その結果、１１のコロニーについて黄色（吸光度：３８８ｎｍ）の発色が観察された。
【実施例７】
【００６１】
耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子の単離および塩基配列の解析
２次スクリ−ニングの結果、強い発色を示した耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子をもつ大腸菌ＪＭ１０９をＬＢ液体培地３ｍＬで培養し、プラスミドをＱＩＡｐｒｅｐ ｐｌａｓｍｉｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン製）で抽出した。シ−クエンス反応は、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（アプライドバイオシステム社製）、 Ｄｙｅｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ （アプライドバイオシステム社製）を用い、９６℃ １０秒、５０℃ ５秒、６０℃ ４分、２５サイクルで行った。反応生成物のシ−クエンスは全自動シークエンサー ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１００ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステム社製）にて解析することにより決定した。
【００６２】
その結果強い発色を示した４種類の異なる耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子配列は親株のＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子に比べ、それぞれ、親株の塩基配列（配列番号３）の５２９番目のシトシンがチミンに（Ｈ４４：表１記載の変異株）、同塩基配列の５０５番目のグアニンがアデニンに（Ｉ１−９４：表１の変異株）、同塩基配列の３１０番目のグアニンがアデニンに（５Ａ２−８４：表１の変異株）および同塩基配列の５５番目のチミンがアデニンに（Ｆ８：表１の変異株）に変化していた。これらのことをアミノ酸配列に翻訳すれば、親株の塩基配列（配列番号３）の５２９番目のシトシンがチミンに変化することにより、翻訳されるタンパク質のアミノ酸の配列の１７７番目のアミノ酸残基がヒスチジン残基からチロシン残基に（Ｈ４４）、親株の塩基配列（配列番号３）の５０５番目のグアニンがアデニンに変化することにより、翻訳されるタンパク質のアミノ酸の配列の１６９番目のアミノ酸残基がアラニン残基からスレオニン残基に（Ｉ１−９４）、親株の塩基配列（配列番号３）の３１０番目のグアニンがアデニンに変化することにより、翻訳されるタンパク質のアミノ酸の配列の１０４番目のアミノ酸残基がアスパラギン酸残基からアスパラギン残基に（５Ａ２−８４）、親株の塩基配列（配列番号３）の５５番目のチミンがアデニンに変化することにより、翻訳されるタンパク質のアミノ酸の配列の１９番目のアミノ酸残基がフェニルアラニン残基からイソロイシン残基に（Ｆ８）に変化していた。この４種類の耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子の配列を（変異株名：Ｈ４４，Ｉ１−９４，５Ａ２−８４およびＦ８に対応して）配列番号４、５、６及び７に示す。
独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されている。寄託番号：受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１１６、ＮＩＴＥ Ｐ−１１７、ＮＩＴＥ Ｐ−１１８およびＮＩＴＥ Ｐ−１１９。
【実施例８】
【００６３】
耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼ変異酵素の各熱処理温度における安定性
実施例７記載の耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子を含む大腸菌ＪＭ１０９（寄託番号：受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１１６、ＮＩＴＥ Ｐ−１１７、ＮＩＴＥ Ｐ−１１８およびＮＩＴＥ Ｐ−１１９）を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ液体培地３ｍＬに植菌し、一晩３０℃で振とう培養を行った。その振とう培養液５００μＬを５０ｍＬのＬＢ液体培地（１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む）に植菌し、３０℃、約５時間後（ＯＤ６００＝０．６〜０．８）に最終濃度が２ｍＭになるように５００μＬの１Ｍ ＩＰＴＧを無菌添加しさらに３０℃で一晩振とう培養した。その培養液を１００００×ｇで５分間遠心分離し、培養上清を除いた後、０．８５％のＮａＣｌで１回洗浄した。同様に遠心操作により細胞を沈殿させた後、ビ−ズ衝撃法細胞破砕装置Ｂｅａｄｓ Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ Ｍｏｄｅｌ ＢＣ−２０（４℃，３分，セントラル科学貿易製）でその菌体を２回破壊した。２００００×ｇで１０分間遠心した後、その上清を粗酵素液として１００μＬを１５００μＬ容サンプリングチュ−ブに入れ４０℃、５０℃、６０℃、６５℃で２０分間熱処理した。低立体選択性Ｌ−スレオニンアルドラーゼの残存活性は、反応液１５０μＬ［１００μＬのＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳ（１ｍｇ／ｍＬ）、２５μＬのＰＬＰ（０．６μｇ／ｍＬ）、１μＬのメルカプトエタノール（２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）］に５０μＬの熱処理したそれぞれの粗酵素液（多段階希釈により許容範囲に合せた）を加え５０℃で１０分間酵素反応を行なった。１０分後、３倍量のメタノールを加えることにより反応を停止させた。Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの分解産物であるグリシンの生成量は液体クロマトグラフ分析法（以下ＨＰＬＣと言う、日立Ｌ２０００シリ−ズ、日立製作所製）でポストカラム分析法を用いて測定した。ＨＰＬＣ分析は、ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＭＳ（Φ４．６×１５０ｍｍ）カラム、カラムおよび反応コイル温度２０℃、移動相は０．１％ １−ヘプタンスルホン酸Ｎａ／メタノール［１０：１（Ｖ／Ｖ）］、ポスト反応液組成は、ミリ−Ｑ水１Ｌに対しホウ酸２１．６４ｇ、水酸化ナトリウム１２ｇ、２−メルカプトエタノール ２ｍＬ、ＯＰＡ（８００ｍｇ／１５ｍＬエタノール）、Ｂｒｉｊｉ−３５（０．２５ｇ／２ｍＬエタノール）を添加し行った。ＨＰＬＣの流速は移動相および反応液共に０．７５ｍＬ／分で、分離産物の検出はλｅｘ／ｅｍ＝３４０／４５０ｎｍの蛍光で分析した。このＨＰＬＣによるグリシンの分析範囲は０．１μｇ／ｍＬ以下である。熱安定性は、５０℃における１分間あたり１μｍｏｌのグリシンの生成量を１単位とした酵素活性を求め、熱処理前のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）（親株）のＬ−スレオニンアルドラーゼの活性値を１００％とし、各処理温度について熱処理後の相対活性（％）を算出し表１に示した。
【００６４】
【表１】
【００６５】
表１で明らかなように、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）のＬ−スレオニンアルドラーゼが、６５℃で２０分間処理することにより１０．６％しか残存活性を示さないことに対し、本発明の耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼであるＨ４４は８５．７％、Ｆ８は５８．６％、５Ａ２−８４は６２．１％、Ｉ１−９４は６７．６％の残存活性を示した。
【実施例９】
【００６６】
耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼの繰り返し利用によるＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの製造
Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの一段階合成において、耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子を導入された大腸菌の菌体反応によるＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳ合成反応後、この菌体を回収し再度Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳ合成反応に供する方法で行った。即ち、実施例７記載の耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼのうち、変異酵素Ｈ４４が最も高い熱安定性を示した事から、繰り返し合成反応は親株由来のＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子を含む大腸菌（寄託番号：受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１１１）と耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子であるＨ４４を含む大腸菌寄託番号：受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１１６）とのＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳ合成反応を比較した。反応液の組成は１ｇのグリシン、１００μｇの３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド、１０μＬのメルカプトエタノール（２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）、２５０μＬのピリドキシサ−ル−５’−リン酸（ＰＬＰ、０．６ｍｇ／ｍＬ）、４．７４ｍＬ ０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、０．０１５８ｇの亜硫酸ナトリウムおよび、０．０３７５ｇのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を混合溶解し、１Ｎ塩酸で最終ｐＨを６．５にした。この反応液に−８０℃で凍結保存しておいた菌体（培養液５０ｍＬ相当分）を加え１５℃で５時間酵素反応を行なわせ、反応後の反応液を遠心分離（１００００×ｇ、１０分）により菌体を回収し、この菌体を繰り返し新鮮な反応液に懸濁し、再度同様の条件でＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳ合成反応を行った。この操作を２０回繰り返し、合計１００時間合成反応を行った結果、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの合成量は図１に示すように１回目のＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの合成能は、親株と耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子導入微生物（Ｈ４４株）は、共に同様のＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳ合成能を示し、尚かつ１１回目の繰り返し反応までその合成能に変化は見られなかった。しかし、親株由来のＬ−スレオニンアルドラーゼの場合、１２回目の反応、即ち６０時間後からのＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの合成量が減少し、２０回目に Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの濃度は１回目の反応で得られたＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの濃度（４０００μｇ／ｍＬ）の半分である２０４２μｇ／ｍＬであるのに対して、耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子であるＨ４４の遺伝子を含む大腸菌では１回目の反応で得られたＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの濃度の９１％に相当する３５５０μｇ／ｍＬとなった。このことから、耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子であるＨ４４の遺伝子を含む大腸菌の繰り返し利用によりＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳを高い合成効率で製造することが可能であることが示された。なおこのような耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子であるＨ４４の遺伝子を含む大腸菌を用いた繰り返し合成反応により合成されたＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの総合成量は７１ｇ／Ｌであった。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明の遺伝子は、耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子として有用である。該遺伝子を挿入した微生物を用いる本発明のＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの製造法は、医薬品として有用なＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳを煩雑な分離精製工程を行うこともなく工業的に有利に製造できる。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】親株のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）株および耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子導入微生物（Ｈ４４）株を用いたＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの繰り返し合成反応を示す図である。図中−○−はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）株を、−◆−は耐熱性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子導入微生物（Ｈ４４）株を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（１）、（２）、（３）または（４）に示す遺伝子：
（１）配列番号４、５、６又は７に示す塩基配列からなる遺伝子：
（２）配列番号４、５、６又は７に示す塩基配列のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ耐熱性のＬ−スレオニンアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子：
（３）配列番号９、１０、１１又は１２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子：
（４）配列番号９に示すアミノ酸配列の１７７番目のチロシン、配列番号１０に示すアミノ酸配列の１６９番目のスレオニン、配列番号１１に示すアミノ酸配列の１０４番目のアスパラギン酸、または配列番号１２に示すアミノ酸配列の１９番目のイソロイシンが保持され、当核アミノ酸配列９、１０、１１又は１２で示されるアミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつ耐熱性のＬ−スレオニンアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項２】
下記の（１）又は（２）に示すタンパク質：
（１）配列番号９、１０、１１又は１２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質：
（２）配列番号９に示すアミノ酸配列の１７７番目のチロシン、配列番号１０に示すアミノ酸配列の１６９番目のスレオニン、配列番号１１に示すアミノ酸配列の１０４番目のアスパラギン酸、または配列番号１２に示すアミノ酸配列の１９番目のイソロイシンが保持され、当核アミノ酸配列９、１０、１１又は１２で示されるアミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつ耐熱性のＬ−スレオニンアルドラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項３】
請求項１に記載の遺伝子を含有する組み換えベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の遺伝子を含有する組み換えベクターを含む微生物。
【請求項５】
宿主が大腸菌である請求項４に記載の微生物。
【請求項６】
受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１１６、ＮＩＴＥ Ｐ−１１７、ＮＩＴＥ Ｐ−１１８およびＮＩＴＥ Ｐ−１１９として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託された微生物。
【請求項７】
請求項４、５または６に記載の微生物またはその調製物を、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド及びグリシンを含有する液と接触せしめ、前記液中にＬ−スレオ−３，４−ジヒドロキシフェニルセリンを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするＬ−スレオ−３，４−ジヒドロキシフェニルセリンの製造法。
【請求項１】
下記の（１）、（２）、（３）または（４）に示す遺伝子：
（１）配列番号４、５、６又は７に示す塩基配列からなる遺伝子：
（２）配列番号４、５、６又は７に示す塩基配列のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ耐熱性のＬ−スレオニンアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子：
（３）配列番号９、１０、１１又は１２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子：
（４）配列番号９に示すアミノ酸配列の１７７番目のチロシン、配列番号１０に示すアミノ酸配列の１６９番目のスレオニン、配列番号１１に示すアミノ酸配列の１０４番目のアスパラギン酸、または配列番号１２に示すアミノ酸配列の１９番目のイソロイシンが保持され、当核アミノ酸配列９、１０、１１又は１２で示されるアミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつ耐熱性のＬ−スレオニンアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項２】
下記の（１）又は（２）に示すタンパク質：
（１）配列番号９、１０、１１又は１２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質：
（２）配列番号９に示すアミノ酸配列の１７７番目のチロシン、配列番号１０に示すアミノ酸配列の１６９番目のスレオニン、配列番号１１に示すアミノ酸配列の１０４番目のアスパラギン酸、または配列番号１２に示すアミノ酸配列の１９番目のイソロイシンが保持され、当核アミノ酸配列９、１０、１１又は１２で示されるアミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつ耐熱性のＬ−スレオニンアルドラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項３】
請求項１に記載の遺伝子を含有する組み換えベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の遺伝子を含有する組み換えベクターを含む微生物。
【請求項５】
宿主が大腸菌である請求項４に記載の微生物。
【請求項６】
受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１１６、ＮＩＴＥ Ｐ−１１７、ＮＩＴＥ Ｐ−１１８およびＮＩＴＥ Ｐ−１１９として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託された微生物。
【請求項７】
請求項４、５または６に記載の微生物またはその調製物を、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド及びグリシンを含有する液と接触せしめ、前記液中にＬ−スレオ−３，４−ジヒドロキシフェニルセリンを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするＬ−スレオ−３，４−ジヒドロキシフェニルセリンの製造法。
【図１】
【公開番号】特開２００７−５４０１３（Ｐ２００７−５４０１３Ａ）
【公開日】平成１９年３月８日（２００７．３．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２４５８７３（Ｐ２００５−２４５８７３）
【出願日】平成１７年８月２６日（２００５．８．２６）
【出願人】（５９１１７８０１２）財団法人地球環境産業技術研究機構 (153)
【出願人】（３０１０３７２１３）独立行政法人製品評価技術基盤機構 (25)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年３月８日（２００７．３．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年８月２６日（２００５．８．２６）
【出願人】（５９１１７８０１２）財団法人地球環境産業技術研究機構 (153)
【出願人】（３０１０３７２１３）独立行政法人製品評価技術基盤機構 (25)
【Ｆターム（参考）】
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