肝細胞癌腫分類および予後判定のための方法
本発明は、ＨＣＣサンプルからの肝細胞癌腫（ＨＣＣ）のインビトロ分類および／または予後判定のための方法に関する。本方法は特定遺伝子組合せの発現プロファイルの決定に基づく。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本発明は、肝細胞癌腫（ＨＣＣ）のインビトロ分類および／または予後判定のための方法に関する。本方法は、特定遺伝子組合せの発現プロファイルの決定に基づく。
【０００２】
肝細胞癌腫（ＨＣＣ）は、世界中で最も頻出の高い固形腫瘍の一つであり、癌による死亡原因の中で三番目である（Bosch.F.X.,et al.Semin Liver Dis 19,271-85(1999)）。その頻度は、高頻度のウイルス性肝炎感染とアフラトキシンＢ１暴露（ＡＦＢ１）とにより、特にアジアおよびアフリカにおいて高い。ここ１０年間、ＨＣＣの発生率は、英国、フランス、および米国において著しく増加してきた（Taylor-Robinson,S.D.et al.Bmj 319,640(1999)、Deuffic,S.et al.Lancet 351,214-5(1998)、El-Serag,H.B.& Mason,A.C.N Engl J Med 340,745-50(1999)）。この増加は、ウイルス性Ｃ型肝炎感染症の増加と関連する。
【０００３】
原形および異形成再生結節の肝硬変が、それらとＨＣＣ発生との強い関連性により、確実性の高いＨＣＣの前駆体であると考えられていた（Edmondson,H.A.& Peters,R.L.Semin Roentgenol 18,75-83(1983)、Thorgeirsson,S.S.& Grisham,J.W.Nat Genet 31,339-46(2002)）。他の固形腫瘍の場合のように、多数の遺伝子の改変が発癌工程に際して蓄積する。これら遺伝子改変の一部は、ＨＣＣ病因的因子(etiological factor)、特に染色体不安定性（Aoki.H.,et al.Proc Natl Acad Sci USA 93,7300-4(1996)）または挿入性突然変異誘発（Brechot,C.Gastroenterology 127,S56-61(2004)）を誘導しうるＨＢＶ感染に特有である。危険因子と特に関連する他の遺伝子改変は、アフラトキシンＢ１暴露ＨＣＣにおけるＲ２４９Ｓ ＴＰ５３遺伝子突然変異（Bressac,B.et al.Proc Natl Acad Sci USA 87,1973-7(1990)）、塩化ビニル関連ＨＣＣにおいて観察されるＫＲＡＳ２突然変異（Weihrauch,M.et al.Br J Cancer 84,982-9(2001)）、および肝細胞腺腫と関連したＴＣＦ１突然変異（Bluteau,O.et al.Nat Genet 32,312-5(2002)）である。ＨＣＣの危険因子と無関係な遺伝子改変の中においては、マイクロサテライト対立形質(allelotype)および比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）研究により、再発性染色体異常が証明された。最も高頻度で欠損される染色体腕(chromosome arm)は、１７ｐ、８ｐ、１６ｑ、１６ｐ、４ｑ、９ｐ、１３ｑ、１ｐ、および６ｑであり、一方、最も高頻度な付加は染色体１ｑ、７ｑ、８ｑ、および１７ｑにおいて見られる（Boige,V.et al.Cancer Res 57,1986-90(1997)、Wong,N.et al.Clin Cancer Res 6,4000-9(2000)、Guan,X.Y.et al.Genes Chromosomes Cancer 29,110-6(2000)）。そのため、ＨＣＣは危険因子および遺伝子改変により異なる、腫瘍の非常に多様な群である。
【０００４】
これにより、ＨＣＣ腫瘍の分類を行なう上で、更なる正確性、信頼性、および容易性が必要となる。実際に、例えば、非常に多様な腫瘍に対して効率的療法を探すことは非常に困難である。一方、信頼性あるＨＣＣの分類ができれば、各サブグループを別々に研究することにより、各サブグループについて新たな標的療法を見出せるであろう。さらに、分類検定を行なう際の信頼性および容易性があれば、各患者に適合した治療を選択しうるであろう。
【０００５】
特に、ＨＣＣの予後も非常に多様である。現在、ＨＣＣの主な治療は、アジュバント化学療法によりフォローされるまたはされない、ＨＣＣ腫瘍の外科切除である。化学療法は、患者にとって非常に面倒かつ苦痛であるが、予後の悪いＨＣＣの場合には必要である。ＨＣＣ腫瘍の分類および予後判定法があれば、ＨＣＣ患者にアジュバント療法を施すか否かを決める上でも、非常に役立つであろう。
【０００６】
ＨＣＣ多様性は当業者に周知であり、相当な努力が先行技術においてＨＣＣ腫瘍をより良く分類および／または予知するために払われてきた。
【０００７】
例えば、最近、いくつかのグループが総合トランスクリプトーム解析によりＨＣＣ腫瘍を分類しようと試みていた。ＨＢＶおよびＨＣＶ由来ＨＣＣ間において、重要な発現プロファイル変化について各々記載しているものもある（Okabe et al.Cancer Res.2001 Mar 1,61(5):2129-37、Iizuka et al.Cancer Res.2002 Jul 15,62(14):3939-44）。
【０００８】
様々な組織学的特徴（Chung et al.Mol Cells.2002 Dec 31,14(3):382-7、Chen et al.Mol Biol Cell.2002 Jun,13(6):1929-39、ＷＯ２００４／０９０１６３）または生存確率（Lee et al.Hepatology.2004 Sep,40(3):667-76）に基づき、二つまたは三つサブグループへのＨＣＣ分類について記載しているものもある。
【０００９】
本発明者らは、特に、二つのグループのＨＣＣを規定するＨＣＣの臨床的特徴と遺伝子改変が実際上密接に関連していることをこれまでに示した（Legoix,P.et al.Oncogene 18,4044-6(1999)、Laurent-Puig,P.et al.Gastroenterology 120,1763-73(2001)）。第一の種類のＨＣＣは、高レベルの染色体不安定性、頻出ＴＰ５３、およびＡＸＩＮ１突然変異と関連しているのみならず、ＨＢＶ感染および悪い予後とも密接に関連していた。逆に、第二サブグループのＨＣＣ腫瘍は染色体安定性であり、高頻度でβ‐カテニン変化を活性化するが、ウイルス感染とは関係しない。
【００１０】
予後に関しては、いくつかのグループが、血管侵襲（Chen et al.Mol Biol Cell.2002 Jun,13(6):1929-39、Qin et al.J Cancer Res Clin Oncol.2004 Sep,130(9):497-513）または転移（Qin et al.J Cancer Res Clin Oncol.2004 Sep,130(9):497-513、Ye et al.Nat Med.2003 Apr,9(4):416-23）に関与する遺伝子について記載した。
【００１１】
再発（Kurokawa et al.J Hepatol.2004 Aug,41(2):284-91、Lizuka et al.Lancet.2003 Mar 15,361(9361):923-9、ＷＯ２００５／０１７１５０）および／または生存（Lee et al.Hepatology.2004 Sep,40(3):667-76、ＷＯ２００５／０１７１５０）予後判定に関与する遺伝子の群について特定していたものもある。
【００１２】
しかしながら、組織学的または遺伝的特徴のみに基づく、二つまたは更には三つのサブグループへのＨＣＣ腫瘍の分類においては、ＨＣＣ高多様性をおそらく正確には反映できない。加えて、予後検定を行なう上での、簡単さ、容易性の必要性がなお存する。
【００１３】
更にＨＣＣで遺伝子型‐表現型相互関係を調査し、このように多様な腫瘍において脱調節された経路およびまたは生物学的工程を特定し、新たな予後因子を見つけるために、本発明者らは大きなシリーズの１２３腫瘍の臨床、遺伝子、およびトランスクリプトームレベルで包括的に解析を行った。
【００１４】
ほとんどの先行研究は、ＨＣＣ腫瘍を二つサブグループに細分類できただけであったが、本発明者らは、意外にも、ＨＣＣ腫瘍が様々な臨床および遺伝子改変と密接に関連した六つの異なるサブグループに現実に集団化されることを見出した。彼らは、クラスメンバーシップの１６‐遺伝子診断プレディクターおよび２４‐遺伝子プレディクターと、ＨＣＣサブグループにかかわらず患者予後を予測し、一般の臨床予後マーカーより優れた５‐遺伝子特性(signature)も決定した。
【００１５】
更に正確には、本発明者らは、六つの異なるＨＣＣサブグループまたはクラス（以下、Ｇ１〜Ｇ６と称される）を規定した。これら六つのサブグループは、Affymetrix ＨＧ-Ｕ１３３Ａ GeneChipアレイを用いて、５７ＨＣＣ、３肝細胞腺腫、および５サンプルの蓄積された非腫瘍組織の総合トランスクリプトーム解析の非管理解析により規定された。六つのサブグループは、下記表１において示され、図１において要約されるように、臨床および遺伝子因子と高度に関連する。
【００１６】
【表１】
【００１７】
実施例２、項目２．２において更に詳細に記載されているように、下記表２において記載されているような主要な特徴を用いて六つのサブグループが規定される。
【００１８】
【表２】
【００１９】
本発明による分類の方法によれば、ＨＣＣ肝臓サンプルについて、それがこれら六つのＨＣＣサブグループのうちどれに属するかを容易に決定しうる。
【００２０】
このように本発明は、第一に：
ａ）ＲＡＢ１Ａ、ＲＥＧ３Ａ、ＮＲＡＳ、ＲＡＭＰ３、ＭＥＲＴＫ、ＰＩＲ、ＥＰＨＡ１、ＬＡＭＡ３、Ｇ０Ｓ２、ＨＮ１、ＰＡＫ２、ＡＦＰ、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＤＨ２、ＨＡＭＰ、ＳＡＥ１、ＡＤＨ６、ＤＣＮ、ＦＬＪ１０１５９、ＡＬＤＨ１Ｌ１、ＩＧＦ１、ＬＥＣＴ２、ＳＬＣ３８Ａ１、ＳＰＡＲＣＬ１、ＣＴＮＮＡ２、ＧＬＵＬ、ＬＥＦ１、ＭＡＴＮ２、ＭＭＥ、ＰＦＮ２、ＳＰＩＮＴ２、ＴＢＸ３、およびＦＧＦＲ２からなる群より選択される少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、または少なくとも１６の遺伝子の組合せを含んでなる、またはこれらからなる発現プロファイルを決定し、
ｂ）該発現プロファイルから六つのサブグループの距離を計算し、そして
ｃ）サブグループの距離が最短であるサブグループにＨＣＣ腫瘍を分類する
ことを含んでなり、ここで六つのサブグループＧ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５、およびＧ６が表２において記載された、それらの臨床的および遺伝的特徴により規定される、ＨＣＣに罹患した対象の肝臓ＨＣＣサンプルからの六つのサブグループ間におけるＨＣＣ腫瘍のインビトロ分類の方法に関する。
【００２１】
ＨＣＣ分類に関与する第一セットの遺伝子の主要な特徴が下記表３において記載される。
【００２２】
【表３】
【００２３】
本発明によると、ＨＣＣ腫瘍の“分類”とは、ＨＣＣ腫瘍について、それが属するＨＣＣ“サブグループ”または“クラス”（これら二つの用語“サブグループ”および“クラス”は本願を通して互いに無関係に用いられる）の決定を意味するものであり、サブグループは表２において記載された特徴により規定される。
【００２４】
本発明によるインビトロ分類の方法の好ましい態様において、発現プロファイルは、ＲＡＢ１Ａ、ＲＥＧ３Ａ、ＮＲＡＳ、ＲＡＭＰ３、ＭＥＲＴＫ、ＰＩＲ、ＥＰＨＡ１、ＬＡＭＡ３、Ｇ０Ｓ２、ＨＮ１、ＰＡＫ２、ＡＦＰ、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＤＨ２、ＨＡＭＰ、ＳＡＥ１、ＡＤＨ６、ＤＣＮ、ＦＬＪ１０１５９、ＡＬＤＨ１Ｌ１、ＩＧＦ１、ＬＥＣＴ２、ＳＬＣ３８Ａ１、ＳＰＡＲＣＬ１からなる群より選択される少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、または少なくとも１６の遺伝子を含んでなる、またはこれらからなる。
【００２５】
本発明によるインビトロ分類の方法の更に好ましい態様において、発現プロファイルは、ＲＡＢ１Ａ、ＲＥＧ３Ａ、ＮＲＡＳ、ＲＡＭＰ３、ＭＥＲＴＫ、ＰＩＲ、ＥＰＨＡ１、ＬＡＭＡ３、Ｇ０Ｓ２、ＨＮ１、ＰＡＫ２、ＡＦＰ、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＤＨ２、ＨＡＭＰ、およびＳＡＥ１からなる群より選択される少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、または少なくとも１６の遺伝子を含んでなる、またはこれらからなる。本発明によるインビトロ分類の方法の最も好ましい態様において、発現プロファイルは、下記１６の遺伝子組合せを含んでなる、またはこれらからなる：ＲＡＢ１Ａ、ＲＥＧ３Ａ、ＮＲＡＳ、ＲＡＭＰ３、ＭＥＲＴＫ、ＰＩＲ、ＥＰＨＡ１、ＬＡＭＡ３、Ｇ０Ｓ２、ＨＮ１、ＰＡＫ２、ＡＦＰ、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＤＨ２、ＨＡＭＰ、およびＳＡＥ１。
【００２６】
本発明は：
ａ）ＡＬＤＨ１Ｌ１、ＣＤ２４、ＣＤ７４、ＣＦＨＲ３、ＣＹＰ４Ｆ１２、ＤＮＡＪＡ３、ＤＳＣＲ１、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＢ４、ＦＡＡＨ、ＦＧＦＲ２、ＦＬＪ１０１５９、ＧＬＴ８Ｄ１、ＨＡＬ、ＭＡＴＮ２、ＭＲＰＳ７、ＰＡＫ２、ＰＬＸＮＢ１、ＲＡＢ１Ａ、ＲＨＯＱ、ＳＬＣ２７Ａ５、ＳＬＰＩ、ＳＭＡＲＣＥ１、ＳＴＲＡ１３からなる群より選択される少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２２、または２４の遺伝子の組合せを含んでなる、またはこれらからなる発現プロファイルを決定し、
ｂ）該発現プロファイルから六つのサブグループの距離を計算し、そして
ｃ）サブグループの距離が最短であるサブグループにＨＣＣ腫瘍を分類する、
ことを含んでなり、ここで六つのサブグループＧ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５、およびＧ６が、表２において記載されたそれらの臨床的および遺伝的特徴により規定される、ＨＣＣに罹患した対象の肝臓ＨＣＣサンプルからの六つのサブグループ間におけるＨＣＣ腫瘍のインビトロ分類の他の方法にも関する。
【００２７】
ＨＣＣ分類に関与する第二セットの遺伝子の主要な特徴が下記表４に記載される。
【００２８】
【表４】
【００２９】
第二セットの遺伝子を用いた本発明によるインビトロ分類の上記方法の好ましい態様において、発現プロファイルは、次の２４遺伝子組合せを含んでなる、またはこれらからなる：ＡＬＤＨ１Ｌ１、ＣＤ２４、ＣＤ７４、ＣＦＨＲ３、ＣＹＰ４Ｆ１２、ＤＮＡＪＡ３、ＤＳＣＲ１、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＢ４、ＦＡＡＨ、ＦＧＦＲ２、ＦＬＪ１０１５９、ＧＬＴ８Ｄ１、ＨＡＬ、ＭＡＴＮ２、ＭＲＰＳ７、ＰＡＫ２、ＰＬＸＮＢ１、ＲＡＢ１Ａ、ＲＨＯＱ、ＳＬＣ２７Ａ５、ＳＬＰＩ、ＳＭＡＲＣＥ１、ＳＴＲＡ１３。
【００３０】
本発明によると、“肝臓ＨＣＣサンプル”とは、ＨＣＣ腫瘍組織を含んでなる、あらゆる肝臓サンプルを意味する。本発明によるインビトロ分類の方法の好ましい態様において、肝臓ＨＣＣサンプルは、肝臓ＨＣＣバイオプシーまたはＨＣＣ腫瘍外科切除によるものである。
【００３１】
“発現プロファイルを決定する”とは、選択遺伝子群の発現レベルの測定を意味する。各遺伝子の発現レベルは、当業界において知られた何らかの技術を用いて、タンパク質または核酸レベルのいずれかにおいて、インビトロにおいて決定されてもよい。
【００３２】
例えば、タンパク質レベルにおいて、特定タンパク質の発現レベルのインビトロ測定は、ＥＬＩＳＡまたはマススペクトロメトリー分析に限定されないが、それらを含めた、当業者に知られた何らかの量的方法により行なわれてもよい。これらの技術は、どのＨＣＣサンプルへも容易に適用される。実際に、ＨＣＣサンプルのタンパク質は、溶液測定の場合、ＥＬＩＳＡまたはマススペクトロメトリーに関して当業者に周知の様々な技術を用いて抽出される。一方、ＨＣＣ腫瘍スライス中におけるタンパク質の発現レベルは、直接的に組織スライスでマススペクトロメトリーを用いて分析されてもよい。
【００３３】
本発明によるインビトロ分類方法の好ましい態様において、発現プロファイルは核酸レベルにおいてインビトロで決定される。核酸レベルにおいて、遺伝子の発現レベルのインビトロ測定は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはレトロ転写された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）により直接的に行なわれてもよい。マイクロアレイ解析、定量的ＰＣＲ、サザン解析に限定されないが、それらを含めて、発現レベルを測定するいかなる方法も用いてもよい。本発明によるインビトロ分類の方法の好ましい態様において、発現プロファイルはマイクロアレイを用いてインビトロで決定される。本発明によるインビトロ分類の方法の他の好ましい態様において、発現プロファイルは定量的ＰＣＲを用いてインビトロにおいて決定される。いずれの場合においても、遺伝子の発現レベルは、好ましくは、内部コントロール遺伝子、一般的には、リボソームＲＮＡ（例えば１８ＳリボソームＲＮＡ）に限定されないが、それを含めたハウスホールド遺伝子、またはアクチンもしくはＨＰＲＴのような遺伝子の発現レベルと比較して標準化される。これらの技術はどのＨＣＣサンプルへも容易に適用される。実際に、組織サンプルからｍＲＮＡを抽出してｍＲＮＡをｃＤＮＡにレトロ転写する上で、いくつか周知の技術が当業者に利用しうる。
【００３４】
好ましい態様において、第一セットの遺伝子（表３参照）を利用するインビトロ分類の方法を用いた場合、発現プロファイルは定量的ＰＣＲを用いて核酸レベルにおいてインビトロで決定される。他の好ましい態様において、第二セットの遺伝子（表４参照）を利用する分類の方法を用いた場合、発現プロファイルは核酸マイクロアレイを用いて核酸レベルにおいてインビトロで決定される。特に、AffimetrixマイクロアレイＵ１３３Ａが有利に用いられる。
【００３５】
本発明者らにより規定された六つのサブグループ間におけるＨＣＣ腫瘍のインビトロ分類の方法において、各サブグループについて、該ＨＣＣ腫瘍と六つのサブグループの各々との数学的な距離を表す“サブグループ距離”が計算される。サンプルとサブグループとの距離が最短であれば、該サンプルがこの特定サブグループに属する確率は最高である。
【００３６】
ｎ遺伝子（ｎ≧８）の選択組合せの場合、全腫瘍のセットは、各腫瘍サンプルが該腫瘍サンプル中における各選択遺伝子の発現レベルに相当するｎ座標で特徴づけられる、ｎ次元セットとして規定される。各サブグループまたはクラスは、中心点と、中心点の各座標付近における許容偏差％とにより規定される、ｎ次元セットのサブセットである。発現プロファイルの決定に用いられる技術に応じて、六つのサブグループまたはクラスの一つまでの腫瘍サンプルの距離を各々計算しうる適切な数学関数が選択されてもよい。
【００３７】
特に、定量的ＰＣＲを用いて発現プロファイルが決定される場合、所定のＨＣＣ腫瘍サンプルｉおよび特定サブグループまたはクラスｋについて、該クラスｋまでの該サンプルｉの距離は下記式（Ｉ）を用いて計算されてもよい：
【数１】
上記式中
-ｎは発現プロファイルにおける遺伝子の数を表し、
-各遺伝子ｔについて、μ（クラスｋ，遺伝子ｔ）およびσ（遺伝子ｔ）は遺伝子の選択組合せに依存するパラメーターであり、本願の実施例２において更に詳細に記載されているような、ＨＣＣ腫瘍のトレーニング群における最適化、次いでＨＣＣ腫瘍の検定群におけるバリデーションにより計算される。
【００３８】
一方、発現プロファイルが核酸マイクロアレイを用いて核酸レベルにおいて決定される場合、所定のＨＣＣ腫瘍サンプルｉおよび特定サブグループまたはクラスｋについて、該クラスｋまでの該サンプルｉの距離は当業者に周知の様々なアルゴリズムから演繹される様々な式を用いて計算される。例えば、該クラスｋまでの該サンプルｉの該距離は下記式（II）を用いて計算される：
【数２】
上記式中
-ｎは発現プロファイルにおける遺伝子の数を表し、
-各遺伝子ｔについて、y（サンプルｉ，遺伝子ｔ）はサンプルｉ中における遺伝子ｔの標準化強度値を表し、および
-各遺伝子ｔおよびクラスｋについて、c（遺伝子ｔ，クラスｋ）、μ（遺伝子ｔ）、およびσ（遺伝子ｔ）は、遺伝子の選択組合せに依存するパラメーターであり、本願の実施例２において更に詳細に記載されているような、ＨＣＣ腫瘍のトレーニング群における最適化、次いでＨＣＣ腫瘍の検定群におけるバリデーションにより計算されてもよい。
【００３９】
標準化はいずれか周知の方法を用いて、例えばＲＭＡ標準化を用いて行なってもよい。
【００４０】
所定のサンプルｉについて、全クラスまでの全距離が計算された場合、サンプルｉ予測クラスが下記式(III)に従い計算される：
【数３】
上記式は、所定サンプルｉの予測クラスが、クラスまでのサンプルｉの距離が最短であるクラスであることを意味する。
【００４１】
第一セットの遺伝子（表３参照）を用いて、本発明者らにより規定された六つのサブグループ間におけるＨＣＣ腫瘍の分類の方法の好ましい態様において、発現プロファイルは次の遺伝子組合せ：ＲＡＢ１Ａ、ＲＥＧ３Ａ、ＮＲＡＳ、ＲＡＭＰ３、ＭＥＲＴＫ、ＰＩＲ、ＥＰＨＡ１、ＬＡＭＡ３、Ｇ０Ｓ２、ＨＮ１、ＰＡＫ２、ＡＦＰ、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＤＨ２、ＨＡＭＰ、およびＳＡＥ１からなり、定量的ＰＣＲを用いて決定され、クラスｋまでのサンプルｉの各距離は、下記式（IV）を用いて計算される：
【数４】
上記式中、各遺伝子ｔおよびクラスｋについて、μ（クラスｋ，遺伝子ｔ）およびσ（遺伝子ｔ）値は、下記表５で示された値から１０％、好ましくは９％、８％、７％、６％、５％、または更には４％、３％、２％、または１％の区間内にある。
【００４２】
【表５】
【００４３】
第二セットの遺伝子（表４参照）を用いて本発明者らにより規定された六つのサブグループ間におけるＨＣＣ腫瘍の分類の方法の好ましい態様において、発現プロファイルは次の遺伝子組合せ：ＡＬＤＨ１Ｌ１、ＣＤ２４、ＣＤ７４、ＣＦＨＲ３、ＣＹＰ４Ｆ１２、ＤＮＡＪＡ３、ＤＳＣＲ１、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＢ４、ＦＡＡＨ、ＦＧＦＲ２、ＦＬＪ１０１５９、ＧＬＴ８Ｄ１、ＨＡＬ、ＭＡＴＮ２、ＭＲＰＳ７、ＰＡＫ２、ＰＬＸＮＢ１、ＲＡＢ１Ａ、ＲＨＯＱ、ＳＬＣ２７Ａ５、ＳＬＰＩ、ＳＭＡＲＣＥ１、ＳＴＲＡ１３からなり、定量的マイクロアレイを用いて核酸レベルにおいて決定され、クラスｋまでのサンプルｉの各距離は下記式（Ｖ）を用いて計算される：
【数５】
上記式中、各遺伝子ｔおよびクラスｋについて、c（遺伝子ｔ，クラスｋ）、μ（遺伝子ｔ）、およびσ（遺伝子ｔ）値は、下記表６において示された値から１０％、好ましくは９％、８％、７％、６％、５％、または更には４％、３％、２％、または１％の区間内にある。
【表６】
【００４４】
本発明は：
ａ）ＮＲＣＡＭ、ＰＩＲ、ＲＡＭＰ３、ＳＬＣ２１Ａ２、ＴＡＦ９、ＴＮＡ、ＨＮ１、ＰＳＭＤ１、ＭＲＰＳ７、ＣＤＣ２０、ＥＮＯ１、ＨＬＦ、ＳＴＲＡ１３、ＲＡＧＤ、ＮＲＡＳ、ＡＲＦＧＥＦ２、ＲＡＢ１Ａ、Ｇ０Ｓ２、ＳＭＡＤ３、ＤＮＡＪＡ３、ＨＥＬＯ１、ＲＨＯＱ、Ｃ１４ｏｒｆ１５６、ＮＰＥＰＰＳ、ＰＤＣＤ２、ＰＨＢ、ＫＩＡＡ００９０、ＩＭＰ-３、ＫＰＮＡ２、ＫＩＡＡ０２６８、ＵＮＱ６０７７、ＬＯＣ４４０７５１、Ｇ６ＰＤ、ＳＴＫ６、ＴＦＲＣ、ＧＬＡ、ＴＲＩＰ１３、ＳＰＰ１、ＡＫＲ１Ｃ１、ＡＫＲ１Ｃ２、ＧＩＭＡＰ５、ＡＤＭ、ＣＣＮＢ１、ＴＫＴ、ＡＧＰＳ、ＲＡＮ、ＮＵＤＴ９、ＨＲＡＳＬＳ３、ＨＬＡ-ＤＱＡ１、ＮＥＵ１、ＲＡＲＲＥＳ２、ＰＡＰＯＬＡ、ＡＢＣＢ６、ＢＩＲＣ５、ＦＬＪ２０２７３、Ｃ１４ｏｒｆ１０９、ＣＨＫＡ、ＴＵＢＢ２、ＨＭＧＢ３、ＴＸＮＲＤ１、ＩＦＩＴＭ１、ＫＩＡＡ０９９２、ＭＰＰＥ１、ＫＬＲＢ１、ＣＣＬ５、ＳＹＮＥ１、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３、ＣＹＰ２Ｃ１８、ＰＡＣＳＩＮ２、ＰＯＮ３、およびＰＰＰ２Ｒ１Ｂからなる群より選択される少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、または少なくとも５の遺伝子の組合せを含んでなる発現プロファイルを決定し、
ｂ）該発現プロファイルから総合生存(global survival)スコアおよび／または非再発生存(survival without relapse)スコアを計算し、そして
ｃ）得られた総合生存スコアおよび／または非再発生存スコアを閾値と各々比較することを含んでなり、ここで
-該閾値より厳密に劣る総合生存／非再発生存スコアは良い生存／非再発生存予後を示し、一方
-該閾値より優れたまたはそれに等しい総合生存／非再発生存スコアは悪い生存／非再発生存予後を示す、
ＨＣＣに罹患した対象の肝臓ＨＣＣサンプルからの総合生存および／または非再発生存のインビトロ予後判定の方法にも関する。
【００４５】
ＨＣＣ予後に関与する遺伝子の主要特徴が、下記表７において記載されている。
【００４６】
【表７】
【００４７】
本発明によるインビトロ予後判定の方法の好ましい態様において、発現プロファイルはＮＲＣＡＭ、ＰＩＲ、ＲＡＭＰ３、ＳＬＣ２１Ａ２、ＴＡＦ９、ＴＮＡ、ＨＮ１、ＰＳＭＤ１、ＭＲＰＳ７、ＣＤＣ２０、ＥＮＯ１、ＨＬＦ、ＳＴＲＡ１３、ＲＡＧＤ、ＮＲＡＳ、ＡＲＦＧＥＦ２、ＲＡＢ１Ａ、Ｇ０Ｓ２、ＳＭＡＤ３、ＤＮＡＪＡ３、ＨＥＬＯ１、およびＲＨＯＱからなる群より選択される少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、または少なくとも５の遺伝子の組合せを含んでなる、好ましくはこれらからなる。
【００４８】
本発明によると、ＨＣＣ進展の“予後”とは、特定ＨＣＣ腫瘍に罹患した患者に関する、特定ＨＣＣ腫瘍の将来の進展の予測を意味する。本発明の方法によれば、総合生存予後と非再発生存予後との双方を判定しうる。
【００４９】
“総合生存予後”とは、再発または非再発における、生存の予後を意味する。前記のように、ＨＣＣに対する主な現行治療は腫瘍外科切除である。結果として、“悪い総合生存予後”は肝臓切除後３年以内における死の発生として規定され、一方“良い総合生存予後”は術後５年間にわたる死の非存在として規定される。
【００５０】
“非再発生存予後”とは、再発の非存在下における生存の予後を意味する。“悪い非再発生存予後”は肝臓切除後２年以内に腫瘍が再発するとして規定され、一方“良い非再発生存予後”は術後４年間にわたり再発しないとして規定される。
【００５１】
本発明による総合生存のインビトロ予後判定の方法の好ましい態様において、発現プロファイルは：
-ＴＡＦ９、ＰＩＲ、ＮＲＣＡＭ、およびＲＡＭＰ３
-ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、ＳＬＣ２１Ａ２、およびＰＳＭＤ１
-ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、ＲＡＭＰ３、およびＰＳＭＤ１
-ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、ＮＲＡＳ、ＲＡＭＰ３、およびＰＳＭＤ１、または
-ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、ＲＡＭＰ３、ＰＳＭＤ１、およびＡＲＦＧＥＦ２
から選択される遺伝子の組合せを含んでなる、好ましくはこれらからなる。
【００５２】
本発明による総合生存のインビトロ予後判定の方法の更に好ましい態様において、発現プロファイルは下記の遺伝子組合せ：
-ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、ＲＡＭＰ３、ＰＳＭＤ１、およびＡＲＦＧＥＦ２
を含んでなる、好ましくはこれらからなる。
【００５３】
一方、本発明による非再発生存のインビトロ予後判定の方法の好ましい態様において、発現プロファイルは：
-ＴＡＦ９およびＧ０Ｓ２
-ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、およびＲＡＭＰ３
-ＴＡＦ９、Ｇ０Ｓ２、およびＲＡＭＰ３
-ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、ＤＮＡＪＡ３、およびＲＡＭＰ３、または
-ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、Ｇ０Ｓ２、ＤＮＡＪＡ３、およびＲＡＭＰ３
から選択される遺伝子の組合せを含んでなる、好ましくはこれらからなる。
【００５４】
本発明による非再発生存のインビトロ予後判定の方法の更に好ましい態様において、発現プロファイルは下記の遺伝子組合せ：
-ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、およびＲＡＭＰ３
を含んでなる、好ましくはこれらからなる。
【００５５】
遺伝子の具体的な組合せは、プレディクターと称されてもよい。
【００５６】
本発明による総合生存および／または非再発生存のインビトロ予後判定の方法において、“肝臓ＨＣＣサンプル”は、ＨＣＣ腫瘍組織を含んでなる、いかなる肝臓サンプルでもよい。本発明による総合生存および／または非再発生存のインビトロ予後判定の方法の好ましい態様において、肝臓ＨＣＣサンプルは肝臓ＨＣＣバイオプシーまたはＨＣＣ腫瘍外科切除によるものである。
【００５７】
インビトロ分類の方法に関し、総合生存および／または非再発生存のインビトロ予後判定の方法において、各遺伝子の発現レベルは、当業界で知られた何らかの技術、特に上記いずれかの技術を用いて、タンパク質または核酸レベルにおいてインビトロで決定されてもよい。
【００５８】
総合生存および／または非再発生存のインビトロ予後判定の方法の好ましい態様において、発現プロファイルは核酸レベルにおいてインビトロで決定される。好ましくは、発現プロファイルはマイクロアレイを用いて決定される。他の好ましい態様において、発現プロファイルは定量的ＰＣＲを用いて決定される。いずれの場合でも、遺伝子の発現レベルは、好ましくは、内部コントロール遺伝子、一般的には、リボソームＲＮＡ（例えば１８ＳリボソームＲＮＡ）に限定されないが、それを含めたハウスホールド遺伝子、またはアクチンもしくはＨＰＲＴのような遺伝子の発現レベルと比較して標準化される。
【００５９】
本発明による総合生存および／または非再発生存のインビトロ予後判定の方法では、総合生存および／または非再発生存“スコア”が計算される。ｎ遺伝子（ｎ≧２）の選択組合せの場合、“スコア”は、遺伝子の選択組合せに依存したパラメーターにより加重される、該腫瘍サンプルで各選択遺伝子のｎ発現レベルを考慮に入れたロジスティック関数であり、本願の実施例３において更に詳細に記載されているような、ＨＣＣ腫瘍のトレーニング群における最適化、次いでＨＣＣ腫瘍の検定群におけるバリデーションにより計算されてもよい。
【００６０】
発現プロファイルの決定に用いられる技術に応じて、適切なパラメーターを用いた適切なスコア関数が求められてもよい。
【００６１】
特に、定量的ＰＣＲを用いて発現プロファイルが決定される場合、所定サンプルｉについて、総合生存または非再発生存“スコア”は下記式を用いて計算されてもよい：
【数６】
上記式中
-ｎは、発現プロファイルにおける遺伝子の数を表し、
-各遺伝子ｔについて、β（遺伝子ｔ）およびμ（遺伝子ｔ）は、遺伝子の選択組合せに依存するパラメーターであり、本願の実施例３において更に詳細に記載されているような、ＨＣＣ腫瘍のトレーニング群における最適化、次いでＨＣＣ腫瘍の検定群におけるバリデーションにより計算されてもよい。
【００６２】
本発明による総合生存および／または非再発生存のインビトロ予後判定のいずれの方法においても、総合生存および／または非再発生存の得られたスコアは、予後が悪いかまたは良いかを定める少なくとも一つの閾値と比較される。
【００６３】
発現プロファイルにおける遺伝子の所定の組合せについて、このような閾値は、β（遺伝子ｔ）およびμ（遺伝子ｔ）パラメーターの場合と同様の方法を用いて、即ち本願の実施例３で更に詳細に記載されているような、ＨＣＣ腫瘍のトレーニング群における最適化、次いでＨＣＣ腫瘍の検定群におけるバリデーションにより決定されてもよい。
【００６４】
所定の閾値について、サンプルの予後は：
-そのスコアが該閾値より優れるまたはそれに等しいならば、悪い予後であり、または
-そのスコアが該閾値より厳密に劣るならば、良い予後
である。
【００６５】
本発明による総合生存のインビトロ予後判定の方法の好ましい態様において、発現プロファイルは下記表８の遺伝子の組合せからなり、定量的ＰＣＲおよび下記式を用いて決定される：
【数７】
上記式中
-ｎは組合せにおける遺伝子の数を表し、
-ｔは下記表８で示された組合せにおける各遺伝子の数を表し、並びに
-各β（遺伝子ｔ）およびμ（遺伝子ｔ）係数の値は、下記表８において示された値から１０％、好ましくは９％、８％、７％、６％、５％、または更には４％、３％、２％、または１％の区間内にある。
【００６６】
【表８】
【００６７】
最も好ましい態様において、総合生存予後判定に用いられる閾値は、下記表８で示された値から１０％、好ましくは９％、８％、７％、６％、５％、または更には４％、３％、２％、または１％の区間内にある。
【００６８】
本発明による非再発生存のインビトロ予後判定の方法の好ましい態様において、発現プロファイルは下記表９の遺伝子の組合せからなり、定量的ＰＣＲおよび下記式を用いて決定される：
【数８】
上記式中
-ｎは、組合せにおける遺伝子の数を表し、
-ｔは、下記表９において示された組合せにおける各遺伝子の数を表し、および
-各β（遺伝子ｔ）およびμ（遺伝子ｔ）係数の値は、下記表９において示された値から１０％、好ましくは９％、８％、７％、６％、５％、または更には４％、３％、２％、または１％の区間内にある。
【００６９】
【表９】
【００７０】
最も好ましい態様において、予後判定に用いられる閾値は、下記表９において示された値から１０％、好ましくは９％、８％、７％、６％、５％、または更には４％、３％、２％、または１％の区間内にある。
【００７１】
好ましくは、ΔＣｔ（サンプルｉ，遺伝子ｔ）値は、リボソーム１８Ｓ ＲＮＡ（Ｒ１８Ｓ）と比較して計算される。
【００７２】
本発明は、更に：
ａ）本発明によるいずれかの方法に従い、生存および／または非再発生存予後を判定し、そして
ｂ）該予後判定からアジュバント療法の妥当性を決める：
-悪い予後である場合には、アジュバント療法が勧められ、一方
-悪い予後でない場合には、アジュバント療法が勧められない、
ＨＣＣに罹患した対象の肝臓ＨＣＣサンプルからのアジュバント療法の妥当性のインビトロ診断決定の方法に関する。
【００７３】
“アジュバント療法”とは、ＨＣＣに罹患した対象へ外科ＨＣＣ腫瘍切除後に施される、追加的抗腫瘍療法を意味する。アジュバント療法には化学療法および放射線療法を含んでもよいが、それらに限定されない。
【００７４】
本発明は、ＲＡＢ１Ａ、ＲＥＧ３Ａ、ＮＲＡＳ、ＲＡＭＰ３、ＭＥＲＴＫ、ＰＩＲ、ＥＰＨＡ１、ＬＡＭＡ３、Ｇ０Ｓ２、ＨＮ１、ＰＡＫ２、ＡＦＰ、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＤＨ２、ＨＡＭＰ、ＳＡＥ１、ＡＤＨ６、ＤＣＮ、ＦＬＪ１０１５９、ＡＬＤＨ１Ｌ１、ＩＧＦ１、ＬＥＣＴ２、ＳＬＣ３８Ａ１、ＳＰＡＲＣＬ１、ＣＴＮＮＡ２、ＧＬＵＬ、ＬＥＦ１、ＭＡＴＮ２、ＭＭＥ、ＰＦＮ２、ＳＰＩＮＴ２、ＴＢＸ３、およびＦＧＦＲ２からなる群より選択される少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４または少なくとも１６の遺伝子の組合せを含んでなる、またはこれらからなる発現プロファイルのインビトロ決定のための試薬を含んでなる、ＨＣＣに罹患した対象の肝臓ＨＣＣサンプルからの六つのサブグループ間におけるＨＣＣ腫瘍のインビトロ分類のためのキットにも関する。これらの遺伝子は、表２の臨床的および遺伝的特徴で規定されるようなサブグループＧ１〜Ｇ６にＨＣＣ腫瘍を分類する際に有用として特定された、第一セットの遺伝子（表３参照）に相当する。
【００７５】
好ましい態様において、本発明によるＨＣＣ腫瘍のインビトロ分類のためのキットは、ＲＡＢ１Ａ、ＲＥＧ３Ａ、ＮＲＡＳ、ＲＡＭＰ３、ＭＥＲＴＫ、ＰＩＲ、ＥＰＨＡ１、ＬＡＭＡ３、Ｇ０Ｓ２、ＨＮ１、ＰＡＫ２、ＡＦＰ、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＤＨ２、ＨＡＭＰ、ＳＡＥ１、ＡＤＨ６、ＤＣＮ、ＦＬＪ１０１５９、ＡＬＤＨ１Ｌ１、ＩＧＦ１、ＬＥＣＴ２、ＳＬＣ３８Ａ１、ＳＰＡＲＣＬ１からなる群より選択される少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、または少なくとも１６の遺伝子の組合せを含んでなる、またはこれらからなる発現プロファイルのインビトロ決定のための試薬を含んでなる。
【００７６】
更に好ましい態様において、本発明によるＨＣＣ腫瘍のインビトロ分類のためのキットは、ＲＡＢ１Ａ、ＲＥＧ３Ａ、ＮＲＡＳ、ＲＡＭＰ３、ＭＥＲＴＫ、ＰＩＲ、ＥＰＨＡ１、ＬＡＭＡ３、Ｇ０Ｓ２、ＨＮ１、ＰＡＫ２、ＡＦＰ、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＤＨ２、ＨＡＭＰ、およびＳＡＥ１からなる群より選択される少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、または少なくとも１６の遺伝子の組合せを含んでなる、またはこれらからなる発現プロファイルのインビトロ決定のための試薬を含んでなる。
【００７７】
更に一層に好ましい態様において、本発明によるＨＣＣ腫瘍のインビトロ分類のためのキットは、次の１６遺伝子組合せ：ＲＡＢ１Ａ、ＲＥＧ３Ａ、ＮＲＡＳ、ＲＡＭＰ３、ＭＥＲＴＫ、ＰＩＲ、ＥＰＨＡ１、ＬＡＭＡ３、Ｇ０Ｓ２、ＨＮ１、ＰＡＫ２、ＡＦＰ、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＤＨ２、ＨＡＭＰ、およびＳＡＥ１を含んでなる、またはこれらからなる発現プロファイルのインビトロ決定のための試薬を含んでなる。
【００７８】
本発明は、更に、ＡＬＤＨ１Ｌ１、ＣＤ２４、ＣＤ７４、ＣＦＨＲ３、ＣＹＰ４Ｆ１２、ＤＮＡＪＡ３、ＤＳＣＲ１、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＢ４、ＦＡＡＨ、ＦＧＦＲ２、ＦＬＪ１０１５９、ＧＬＴ８Ｄ１、ＨＡＬ、ＭＡＴＮ２、ＭＲＰＳ７、ＰＡＫ２、ＰＬＸＮＢ１、ＲＡＢ１Ａ、ＲＨＯＱ、ＳＬＣ２７Ａ５、ＳＬＰＩ、ＳＭＡＲＣＥ１、ＳＴＲＡ１３からなる群より選択される少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２２または２４の遺伝子の組合せを含んでなる、またはこれらからなる発現プロファイルのインビトロ決定のための試薬を含んでなる、ＨＣＣに罹患した対象の肝臓ＨＣＣサンプルからの六つのサブグループ間におけるＨＣＣ腫瘍のインビトロ分類のためのキットに関する。これらの遺伝子は、表２の臨床的および遺伝的特徴で規定されるようなサブグループＧ１〜Ｇ６にＨＣＣ腫瘍を分類する際に有用として特定された、第二セットの遺伝子（表４参照）に相当する。
【００７９】
好ましくは、該キットは、次の２４遺伝子組合せ：ＡＬＤＨ１Ｌ１、ＣＤ２４、ＣＤ７４、ＣＦＨＲ３、ＣＹＰ４Ｆ１２、ＤＮＡＪＡ３、ＤＳＣＲ１、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＢ４、ＦＡＡＨ、ＦＧＦＲ２、ＦＬＪ１０１５９、ＧＬＴ８Ｄ１、ＨＡＬ、ＭＡＴＮ２、ＭＲＰＳ７、ＰＡＫ２、ＰＬＸＮＢ１、ＲＡＢ１Ａ、ＲＨＯＱ、ＳＬＣ２７Ａ５、ＳＬＰＩ、ＳＭＡＲＣＥ１、ＳＴＲＡ１３からなる発現プロファイルのインビトロ決定のための試薬を含んでなる。
【００８０】
本発明は、更に、ＮＲＣＡＭ、ＰＩＲ、ＲＡＭＰ３、ＳＬＣ２１Ａ２、ＴＡＦ９、ＴＮＡ、ＨＮ１、ＰＳＭＤ１、ＭＲＰＳ７、ＣＤＣ２０、ＥＮＯ１、ＨＬＦ、ＳＴＲＡ１３、ＲＡＧＤ、ＮＲＡＳ、ＡＲＦＧＥＦ２、ＲＡＢ１Ａ、Ｇ０Ｓ２、ＳＭＡＤ３、ＤＮＡＪＡ３、ＨＥＬＯ１、ＲＨＯＱ、Ｃ１４ｏｒｆ１５６、ＮＰＥＰＰＳ、ＰＤＣＤ２、ＰＨＢ、ＫＩＡＡ００９０、ＩＭＰ-３、ＫＰＮＡ２、ＫＩＡＡ０２６８、ＵＮＱ６０７７、ＬＯＣ４４０７５１、Ｇ６ＰＤ、ＳＴＫ６、ＴＦＲＣ、ＧＬＡ、ＴＲＩＰ１３、ＳＰＰ１、ＡＫＲ１Ｃ１、ＡＫＲ１Ｃ２、ＧＩＭＡＰ５、ＡＤＭ、ＣＣＮＢ１、ＴＫＴ、ＡＧＰＳ、ＲＡＮ、ＮＵＤＴ９、ＨＲＡＳＬＳ３、ＨＬＡ-ＤＱＡ１、ＮＥＵ１、ＲＡＲＲＥＳ２、ＰＡＰＯＬＡ、ＡＢＣＢ６、ＢＩＲＣ５、ＦＬＪ２０２７３、Ｃ１４ｏｒｆ１０９、ＣＨＫＡ、ＴＵＢＢ２、ＨＭＧＢ３、ＴＸＮＲＤ１、ＩＦＩＴＭ１、ＫＩＡＡ０９９２、ＭＰＰＥ１、ＫＬＲＢ１、ＣＣＬ５、ＳＹＮＥ１、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３、ＣＹＰ２Ｃ１８、ＰＡＣＳＩＮ２、ＰＯＮ３、およびＰＰＰ２Ｒ１Ｂからなる群より選択される少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、または少なくとも５の遺伝子の組合せを含んでなる、またはこれらからなる発現プロファイルのインビトロ決定のための試薬を含んでなる、ＨＣＣに罹患した対象の肝臓ＨＣＣサンプルからの総合生存および／または非再発生存のインビトロ予後判定のためのキットに関する。
【００８１】
好ましい態様において、ＨＣＣに罹患した対象の肝臓ＨＣＣサンプルからの総合生存および／または非再発生存のインビトロ予後判定のためのキットは、ＮＲＣＡＭ、ＰＩＲ、ＲＡＭＰ３、ＳＬＣ２１Ａ２、ＴＡＦ９、ＴＮＡ、ＨＮ１、ＰＳＭＤ１、ＭＲＰＳ７、ＣＤＣ２０、ＥＮＯ１、ＨＬＦ、ＳＴＲＡ１３、ＲＡＧＤ、ＮＲＡＳ、ＡＲＦＧＥＦ２、ＲＡＢ１Ａ、Ｇ０Ｓ２、ＳＭＡＤ３、ＤＮＡＪＡ３、ＨＥＬＯ１、およびＲＨＯＱからなる群より選択される少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、または少なくとも５の遺伝子の組合せを含んでなる、またはこれらからなる発現プロファイルのインビトロ決定のための試薬を含んでなる。
【００８２】
更に一層好ましい態様において、ＨＣＣに罹患した対象の肝臓ＨＣＣサンプルからの総合生存のインビトロ予後判定のためのキットは、下記の遺伝子組合せ：
-ＴＡＦ９、ＰＩＲ、ＮＲＣＡＭ、およびＲＡＭＰ３
-ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、ＳＬＣ２１Ａ２、およびＰＳＭＤ１
-ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、ＲＡＭＰ３、およびＰＳＭＤ１
-ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、ＮＲＡＳ、ＲＡＭＰ３、およびＰＳＭＤ１、または
-ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、ＲＡＭＰ３、ＰＳＭＤ１、およびＡＲＦＧＥＦ２
のうち一つを含んでなる、またはこれらからなる発現プロファイルのインビトロ決定のための試薬を含んでなる。
【００８３】
更に好ましい態様において、ＨＣＣに罹患した対象の肝臓ＨＣＣサンプルからの総合生存のインビトロ予後判定のためのキットは、下記の遺伝子組合せ：
-ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、ＲＡＭＰ３、ＰＳＭＤ１、およびＡＲＦＧＥＦ２
を含んでなる、またはこれら発現プロファイルのインビトロ決定のための試薬を含んでなる。
【００８４】
他の好ましい態様において、ＨＣＣに罹患した対象の肝臓ＨＣＣサンプルからの非再発生存のインビトロ予後判定のためのキットは、下記の遺伝子組合せ：
-ＴＡＦ９およびＧ０Ｓ２
-ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、およびＲＡＭＰ３
-ＴＡＦ９、Ｇ０Ｓ２、およびＲＡＭＰ３
-ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、ＤＮＡＪＡ３、およびＲＡＭＰ３、または
-ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、Ｇ０Ｓ２、ＤＮＡＪＡ３、およびＲＡＭＰ３
のうち一つを含んでなる、またはこれらからなる発現プロファイルのインビトロ決定のための試薬を含んでなる。
【００８５】
更に好ましい態様において、ＨＣＣに罹患した対象の肝臓ＨＣＣサンプルからの非再発生存のインビトロ予後判定のためのキットは、下記の遺伝子組合せ：
-ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、およびＲＡＭＰ３
を含んでなる、またはこれらからなる発現プロファイルのインビトロ決定のための試薬を含んでなる。
【００８６】
本発明による総合生存および／または非再発生存のインビトロ予後判定のためのキットにおいて、用意された試薬は総合生存または非再発生存のみの予後判定を行なえるか、または総合生存および非再発生存の双方の予後判定を行なってもよい。
【００８７】
本発明によるあらゆるキットにおいて、発現プロファイルの決定のための試薬には遺伝子発現レベルの測定に有用なあらゆる試薬を含んでもよい。発現レベルの該測定は、タンパク質または核酸レベルで行なってもよい。
【００８８】
タンパク質レベルにおける発現プロファイルの決定に適した試薬には、マススペクトロメトリー分析およびタンパク質マイクロアレイ用の試薬、抗体、および抗体断片があるが、それらに限定されない。
【００８９】
逆に、核酸レベルにおける発現プロファイルの決定に適した試薬には、増幅プライマー、核酸プローブ、および核酸マイクロアレイがあるが、それらに限定されない。
【００９０】
特に、ＨＣＣ分類に有用な遺伝子の第一セットの遺伝子（表３参照）を用いて発現プロファイルを決定するための試薬を含んでなるＨＣＣの分類のためのキットにおいて、該キットは、有利には、増幅プライマーと、場合により遺伝子発現の定量的ＰＣＲ解析に有用な核酸プローブとを含んでもよい。該キットは、場合により、他の有用な定量的ＰＣＲ試薬を含有してもよい。
【００９１】
一方、ＨＣＣ分類に有用な遺伝子の第二セットの遺伝子（表４参照）を用いて発現プロファイルを決定するための試薬を含んでなるＨＣＣの分類のためのキットにおいて、該キットは、有利には、核酸マイクロアレイと、場合により遺伝子発現のマイクロアレイ解析に有用な他の試薬とを含んでもよい。
【００９２】
加えて、本発明によるどのキットにおいても、該試薬には、本発明による総合生存および／または非再発生存のインビトロ分類または予後判定の方法を行なうための説明書を添付してよい。例えば、該説明書は：
１）例えば、必要な処方および様々なパラメーター値を付すことにより、ユーザー自身に分類または予後判定を行なわせてもよく、または
２）キットに装備された、または例えば、インターネットでアクセスしうる専用ソフトウェアへその発現データを入力するようユーザーに指示してもよい。
【００９３】
このケースにおいて、試薬および説明書は同一のパッケージとともにまたは二つの別々なパッケージに分けて入れてもよい。
【００９４】
本発明は、更に：
ａ）本発明の方法に従い該対象の肝臓ＨＣＣサンプルから総合生存および／または非再発生存を決定し、そして
ｂ）悪い予後である場合には該対象にアジュバント療法を施し、一方悪い予後でない場合にはこのようなアジュバント療法を施さない
ことを含むＨＣＣに罹患した対象の治療の方法に関する。
【００９５】
本発明は：
ａ）ＨＣＣ腫瘍サンプルを用意し、
ｂ）本発明の方法に従い該ＨＣＣ腫瘍サンプルを分類し、そして
ｃ）該ＨＣＣサブグループで分類されたＨＣＣ腫瘍サンプルのインビトロ成長を阻害しうる化合物の能力を検定する、
本発明による六つのＨＣＣサブグループの一つの治療に有用な化合物のインビトロスクリーニングの方法にも関する。
【００９６】
本発明は、更に：
ａ）ＨＣＣ腫瘍サンプルを本発明による六つのサブグループの一つに分類し、そして
ｂ）そのＨＣＣ腫瘍サンプルが属するＨＣＣサブグループを標的とした治療上の処置を対象に施す
ことを含むＨＣＣに罹患した対象の治療の方法に関する。
【００９７】
本発明を全般的に説明してきたが、本発明の特徴および利点の更なる理解は、説明のみの目的でここに示され、別記されない限り限定する意味ではない、ある具体例および図面を参照することで得られる。
【実施例】
【００９８】
実施例１：ＨＣＣ腫瘍の転写解析の戦力
腫瘍およびサンプル，臨床データ
一連の１２０肝細胞癌腫および３肝細胞腺腫を、それらの対応非腫瘍組織と共に、１９９２年〜１９９９年に３箇所のフランス外科部門において肝臓切除により治療された患者１２３例から集めた。この研究に含まれるすべての場合において、全臨床データおよび追跡調査が入手しえた。これらすべての腫瘍は、既に記載されたように、臨床的に特徴づけられた（Laurent-Puig,P.et al.Gastroenterology 120,1763-73(2001)）。性別比（Ｍ：Ｆ）は１：４であり、患者の平均年齢は６０歳（年齢中央値＝６３歳，１８〜８５歳の範囲）であった。患者は、フランス（９２例）、サハラ以南アフリカ（１１例）、地中海エリア（７例）、アンティル（４例）、およびアジア（４例）において生まれた。Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、アルコール乱飲、およびヘモクロマトーシスのＨＣＣの危険因子が、腫瘍の３６、３０、４０、および６％で各々生じた。２５例においてＨＣＣが公知の危険因子の非存在下で進行し、１６例において、少なくとも二つの危険因子がみられた。腫瘍分化の組織学的グレードは、EdmondsonおよびSteinerグレーディングシステムに従い、グレードＩ（７％）、II（４９％）、III（３９％）、およびIV（４％）と判定された。１０３例において、手術前α-フェトプロテイン血清レベルが入手でき、患者３７例について１００ＩＵ／ｍＬ以上であった。肉眼的および／または微視的血管侵襲がケースの３７％において記録された。主腫瘍から１ｃｍ以内でみられる結節で規定される衛星腫瘍がケースの４１％で記録された。肝臓移植で治療されたまたは術後３月間以内で死んだ患者を除外した後、Ｒ０完全切除の患者９９例で全および無疾患生存が評価された。肝硬変で第二非関連腫瘍の発生の影響を最少化するために、我々は５年後の生存データを考慮に入れなかった。全シリーズにおける平均追跡調査は３８月間（範囲３〜６０月間）であり、それはなお生存する患者の場合４９月間であった。二つの質的予後変数により構成される：（１）“早期再発”ｙｅｓまたはｎｏは肝臓切除後２年以内における腫瘍再発の存在および術後４年間にわたる再発の欠如により規定された、（２）“早期死亡”ｙｅｓまたはｎｏは肝臓切除後３年以内における死亡の発生および術後５年間にわたる死亡の欠如により規定された。Affymetrix解析においては、アルコール性肝硬変（プール１）、アルコール非硬変肝（プール２）、ＨＢＶ非硬変肝（プール３）、ＨＣＶ肝硬変（プール４）、およびＨＢＶ肝硬変（プール５）を含めて、解析腫瘍に対応する５プールの３非腫瘍肝臓組織が用いられた。ＱＲＴ-ＰＣＲ実験においては、これらの１５の非腫瘍ＲＮＡおよび六つの追加正常非腫瘍肝臓ＲＮＡが個別に解析された。妊娠の異なる段階（１１〜２９週の妊娠期間範囲）にある１９のヒト胎児肝臓サンプルも集められた。該研究は地元の倫理委員会（ＣＣＰＰＲＢ Paris Saint-Louis）により承認され、インフォームド・コンセントがフランス法に従い得られた。
【００９９】
基本トランスクリプトーム解析
出発物質として各サンプルの全ＲＮＡ５μｇおよびＨＧ-Ｕ１３３Ａ Affymetrix GeneChipアレイのハイブリダイゼーション（GeneChip Fluidics Station 400）当たりｃＲＮＡ２０μｇを用いて、マイクロアレイ解析を行った。各アレイからの像はＨＰ GeneArray 2500を用いて作成し、製造業者のプロトコールに従い解析した（http://www.affymetrix.com/support/technical/manual/expression manual.affx）。指示された場合を除き、すべてのトランスクリプトーム解析はBioconductor（ｖ１．１．１）のものを含めたＲシステムソフトウェア（ｖ１．９．０）パッケージの各種取合せまたはオリジナルＲコードを用いて行なった。Ｒパッケージおよびバージョンは適宜に表示されている。６５Affymetrix ＨＧ-Ｕ１３３Ａ GeneChipマイクロアレイからの未処理特徴データを標準化し、頑健性マルチアレイ平均（パッケージaffy Ｖ１．４．３２）を用いて各ブローブセットに関するｌｏｇ２強度発現サマリー値を計算した。コントロール遺伝子に対応するまたは“ ｘ ”アノテーションを有するブローブセットをマスクして、更なる解析に利用しうる全部で１９，７８７のブローブセットを得た。
【０１００】
実施例２：ＨＣＣ腫瘍の分類
２．１ 材料および方法
遺伝子突然変異、染色体不均衡、ＨＢＶゲノムの定量およびＤＮＡメチル化
全サンプルについて、腫瘍および非腫瘍ＤＮＡを取り出し、QiaquickおよびRneasy抽出キット（Qiagen）を各々用いるＤＮＡおよびＲＮＡ抽出まで−８０℃において貯蔵した。ＤＮＡはフルオロメトリー（Fluoroskan Thermo Lab-system）により定量し、ＲＮＡはスペクトロフォトメーター（Nanodrop）を用いて２６０ｎｍで定量した。ＤＮＡおよびＲＮＡの質は、ゲル電気泳動、次いで臭化エチジウム染色およびAgilent ２１００バイオアナライザーにより制御した。２８Ｓ／１８Ｓ比がAffymetrix実験で１．５より大きく、定量的ＲＴ-ＰＣＲ解析で１より大きければ、ＲＮＡが適格とされた。遺伝子突然変異は、３１００ Applied Biosystemsシークエンサーを用いて腫瘍ＤＮＡを直接配列決定することにより、ＴＰ５３エキソン２〜１１、β-カテニンエキソン２〜４についてコードするＣＴＮＮＢ１、ＡＸＩＮ１エキソン１〜１０、ＰＩＫ３ＣＡエキソン１〜２０で調べた。アレル損失および染色体不均衡は、既に記載されたように（Laurent-Puig,P.et al.Gastroenterology 120,1763-73(2001)）、ＬＭＳ２マイクロサテライトパネル（Applied Biosystems）からのゲノタイピング４００マーカーにより調べた。血清学的結果またはウイルスＤＮＡ増幅（Laurent-Puig,P.et al.Gastroenterology 120,1763-73(2001)）によりＨＢＶ感染と関連づけられた全サンプルについて、ＤＮＡのＨＢＳおよびＨＢＸコピーがSyberグリーン法（Applied Biosystems）を用いて腫瘍および非腫瘍ＤＮＡにより定量された。定量に用いられたプライマーがウイルス多型性または突然変異のない領域で選択されるよう保証するために、ＨＢＳおよびＨＢＸ ＤＮＡの配列は全腫瘍で決定した。ウイルスＤＮＡの定量は染色体２２ＰＣＲ増幅と関連していた。ＰＣＲ増幅の効力は、ＨＢＳ、ＨＢＸ、および染色体２２レファレンスについて各々９５、９７、および９４％で測定した。腫瘍および非腫瘍ＤＮＡサンプルは更にHoechstのフルオリメトリーを用いて慎重に定量し、濃度はアガロースゲル電気泳動により調べた。腫瘍において低数のウイルスＤＮＡコピーは、０．５より劣るＨＢＸ／レファレンスおよびＨＢＳ／レファレンス比（平均：０．０１，範囲：０．００２〜０．５，標準誤差：０．１４）で規定された。腫瘍において高数のウイルスＤＮＡコピーは、１．５より優れたＨＢＸ／レファレンスおよびＨＢＳ／レファレンス比（平均：２５，範囲：１．６〜２１２，標準誤差：４６）で規定された。ＣＤＨ１およびＣＤＫＮ２ＡプロモーターにおけるＤＮＡメチル化は、既に記載されたように（Lee,S.et al.Am J Pathol 163,1371-8(2003)、Zochbauer-Muller,S.et al.Cancer Res 61,249-55(2001)）、重亜硫酸ＤＮＡおよびメチル化特異的増幅を用いて調べた。
【０１０１】
定量的ＲＴ-ＰＣＲ解析
定量的ＲＴ-ＰＣＲ解析では、高性能Archiveキットおよびランダムヘキサマー（Applied Biosystems）を用いて３μｇの全ＲＮＡを逆転写した。各サンプルおよび検定遺伝子について、TaqMan Low Density ArrayおよびABI PRISM 7900HT Systems（Applied Biosystems）を用いて、２ｎｇの逆転写ＲＮＡに相当する１μＬのｃＤＮＡをTaqMan ＰＣＲ解析により二重に解析した。ｃＤＮＡの質はリアルタイムＰＣＲ（全シリーズで偏差７％の係数）によりＲ１８Ｓ定量を用いて評価した。サンプル中における検定ｍＲＮＡの相対量は２−ΔΔＣＴ法を用いて調べた：ΔΔＣＴ＝（ＣＴ検定−ＣＴＲ１８Ｓ）サンプル−（ＣＴ検定−ＣＴＲ１８Ｓ）カリブレーター（Livak,K.J.& Schmittgen,T.D.Methods 25,402-8(2001)）。簡単には、遺伝子の発現結果は、内部コントロールリボソーム１８Ｓ、相対的には、内部コントロールリボソーム１８Ｓに対して標準化された非腫瘍サンプルにおける対応遺伝子の平均発現レベルに相当するカリブレーターに対して標準化された。表およびグラフで示された値は、非腫瘍組織の平均と比較した、検定サンプルにおける遺伝子発現のｎ倍比率を表している。
【０１０２】
ウエスタンブロットおよび免疫組織化学
凍結させた組織を５００μＬ氷冷ＲＩＰＡ Lysis緩衝液（Santa Cruz）中でDounceとホモゲナイズし、タンパク質濃度をＢＣＡタンパク質アッセイキット（Pierce）により調べた。イムノブロット解析は、ＳＤＳ６％ポリアクリルアミドゲル上で移動するタンパク質５０μｇ、ポリクローナルＥ-カドヘリン抗体（ＳＣ-７８７０，１：５００，Santa Cruz）、ペルオキシダーゼ複合化二次抗体（１：２０００，Santa Cruz）、および増強化学発光剤（ＥＬＣ，Pierce）を用いて行なった。免疫染色は、モノクローナル抗β-カテニン（１：４００，ＢＤ Biosciences 610153）、ビオチニル化抗マウス（１：２００，Vector Laboratories ＢＡ-２０００）、Vectastain ＡＢＣ Elite標準キット（Vector Laboratories ＰＫ-６１００）、ＤａＢキット（Vector Laboratories ＳＫ-４１００）を用いて、ホルマリン固定パラフィン包埋肝臓サンプルの５μｍ断片で行なった。免疫染色前に、内在性ペルオキシダーゼを遮断し、抗原検索を圧力釜（Biogenex）中０．００１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ７で行なった。
【０１０３】
トランスクリプトーム解析に基づく分類
６５サンプルの分類は、距離メトリックとして１-Pearson相関（パッケージクラスＶ７．２-２）を用い、八つのデータサブセットおよび三つの異なるリンケージ法（平均，完全，およびWard’s）から得られた、一連の２４階層クラスタ解析に基づいていた。八つのデータサブセットは最も変化する発現プロファイルの８非管理選択に対応した。この選択に関する基準は、分散中央値（Ｐ＜０．０１）と比較した所定プローブセットに関する分散の有意差、並びに偏差閾値の異なる“頑健性”係数（ｒＣＶ，最低および最高値を除外したｎ-２サンプルに関するプローブセットｌｏｇ２強度値の平均で標準偏差を割り計算される）であった。９９〜６７１２プローブセットを選択した（第９９．５および第６０ｒＣＶ百分位数）。初期２４系統樹の安定性は、摂動／リサンプリング後に得られたクラスタ結果と互いに比較することにより評価した（各々１００反復，安定性スコアの詳細については補足情報参照）。異なる初期クラスタ数（ｋ＝７..１５）でｋ-meansクラスタリングアプローチを用いて、モデルも検定した。各ｋについて２００中のベストラン（即ち、ｋグループ間で最大距離のもの）を用いて、サンプルを六つのＨＣＣサブグループのサブセットに従いまたはとして一貫的にグループ分けした。
【０１０４】
ＨＣＣサブグループと臨床／遺伝子変数との関連性
異なる臨床および遺伝子変数と六つのＨＣＣ腫瘍サブグループ間の関連の有意性を調べるために、Fisher正確確率検定を行なった。リンケージ法および遺伝子リストの全組合せから得られたクラスタ結果を検定した。加えて、多数モダリティー（例えば、ＨＢＴ）の変数を二項値へ記録し、各組合せを検定した。ＱＲＴ-ＰＣＲ結果（表１参照）を用いた総合プレディクターでは、表中で０のＰがＰ＜０．００１に等しいことを意味するオリジナルＰ値を補正するために、クラスラベルの１０００ランダム順列を用いた。
【０１０５】
総合プレディクターの構築
Affymetrixデータプレディクター
マルチクラスプレディクターを確立するために、６５サンプルをトレーニングセット（ｎ＝３６，各クラスタ群について６，ランダムに選択）および検定セット（ｎ＝２４腫瘍＋５非腫瘍サンプル）に分けた。次いで、６工程ラーニング戦略：（１）Ｆ検定を用いてトレーニングサンプルに基づく遺伝子管理選択（ｎ＝３７６プローブセット）、（２）サブサンプリング、全強度レベルおよびリダンダントＨＵＧＯ遺伝子記号および偽発見率コントロールに基づく遺伝子プローブセットフィルタリング（ｎ＝２５８）、（３）遺伝子クラスタビンで区分された（またはされていない）、８〜２５遺伝子のランダムサブ選択、（４）五つの予測アルゴリズムを用いたルールラーニング、（５）検定セットを予測する成功率に基づくルール選択、（６）予測グループに対する臨床および遺伝子因子間の関連性を評価するためにＲＴ-ＰＣＲデータおよびFisher正確確率検定を用いたルールバリデーションを用いた。
【０１０６】
更に正確には、異なる工程を次のように行なった：
１．遺伝子選択および２．遺伝子プローブセットフィルタリング：Ｓ１を用いて、我々は、マルチ検定（ＢＲＢ ArrayToolsv3.0.beta2）について補正するために、サンプルラベルの１０００順列に基づく多変量順列検定を用いるＦ検定を行なった。この検定から、１０未満の偽発見を含む１０４１プローブセットを得た。我々はＳ１における１８サンプル（グループ当たり三つのランダム選択ケース）のサブ選択で同様の検定を行い、５１５の有意なプローブセットを見つけた（ここでは、順列検定を信頼できないものにする低数のサンプル／クラスのせいで、閾値基準としてｐ値＜０．００１を用いた）。これら２リストの対比と、合計６のＨＣＣクラスタ群で１００単位未満の最大強度を有するプローブセットの選別により、２５８プローブセットを得た。同一ＨＵＧＯ遺伝子記号に相当するプローブセットについて、低Ｆ統計値を有するプローブセットを除外してリストを２２５プローブセットに減らすことにより、我々は１プローブセット／記号を守った。
【０１０７】
３．遺伝子のランダムサブ選択：（ｉ）２２５プローブセットリストから出発して、我々はｋ数のプローブセット（ｋ＝８..２５）の１０００サブリスト（合計で１８，０００のサブリスト）をランダムに作成した。（ii）２２５プローブセットリストから、個別遺伝子クラスタビンから同割合の遺伝子を選択することにより、我々はｋ数のプローブセットの１０００サブリスト（ｋ＝１５、３０、合計で２０００のサブリスト）を作成した。遺伝子クラスタビンは、２２５プローブセットの完全リンケージクラスタリングに基づき（距離メトリックとして１-Pearson係数を用い、１５クラスタノード（クラスタビンによるｎ＝４〜４９プローブセット）を得るように系統樹を切ることにより）構築した、(iii)我々は、平均リンケージクラスタリング（１-Pearson係数）から得られる遺伝子クラスタビンを等しく表し、系統樹を２０ノードに切り、（１０プローブセット未満または最隣接ノードと０．３より高い相関で表される）小さなクラスタノードを合わせると、合計で八つの大きな遺伝子クラスタビン（クラスタビンによるｎ＝９〜８７プローブセット）を生じる、ｋプローブセットの１０００サブリスト（ｋ＝８、１６、２４、合計で３０００のサブリスト）も作成した。
【０１０８】
４．ルールラーニング：プローブセットの２３，０００サブリストに制限された、セットＳ１からの発現データは、五つの予測アルゴリズム（ＳＶＭ（ｅ１０７１，ｖ１．４-１）、ＰＡＭ（ｐａｍｒ，ｖ１．１４．２）、ｋ-ＮＮ（クラス，ｖ７．２-２）、ＤＱＤＡおよびＤＬＤＡ（ｓｍａ，ｖ０．５．１４））をトレーニングして、１１５，０００プレディクターを得る上で役立った。
【０１０９】
５．ルール選択：各アルゴリズムについて、ｋの各値（（ｉ）ｋ＝８..２５、（ii）ｋ＝１５、３０、(iii)ｋ＝８、１６、２４）と組み合わせて、我々は、バリデーションセットサンプルを分類するために（トレーニングセットでトレーニングされた）、対応プレディクターの成功率に基づき、１０００の中で最良のサブリストを選択した（同等の場合には、出会う最初のサブリストが保存された）、この選択は１１５プレディクターを与えた。これらの中で、別々な６サブリストに関連した七つのプレディクターが、バリデーションセットからサンプルを分類する９３％より高い成功率を示した。我々はこれら６サブリストの中で２プレディクター（アルゴリズムＳＶＭおよびＰＡＭ）に関連した２４遺伝子サブリストを選択した。このサブリストは、トレーニングセットで３６サンプルの真のクラスメンバーシップを予測する上でNearest Shrunken Centroids（ＰＡＭ）を用いると９７％、およびバリデーショングループで２９サンプルの９３．１％の成功率を有したことを、我々は観察した。
【０１１０】
６．ルールバリデーション：ＲＴ-ＰＣＲデータが、Affymetrix ＨＧ-Ｕ１３３Ａ GeneChipマイクロアレイで既に解析された４６サンプル（オリジナルトレーニングセット（Ｓ１ａ）で２８およびオリジナルバリデーションセット（Ｓ２ａ）で１８ＨＣＣ）を含めた、一連の１０９腫瘍について、既に選択されたサブリストで２４遺伝子のうち２３について得られた（プライマーがＣＤ２４について入手できなかった）。セットＳ１ａでΔＣｔデータ（コントロール遺伝子として１８Ｓ）を用いて、我々は五つの予測アルゴリズム（ＳＶＭ、ＰＡＭ、ｋ-ＮＮ、ＤＱＤＡ、およびＤＬＤＡ）をトレーニングした：セットＳ２ａに適用すると、ＳＶＭから得られたプレディクターは８１％成功率（Ｓ１ａでは１００％）を示した。
【０１１１】
ＰＣＴデータプレディクター
AffymetrixデータからＰＣＲデータへ移された２４遺伝子プレディクターの部分的成功に基づき、ＱＲＴ-ＰＣＲで解析された１４０遺伝子の中で１０３遺伝子の初期リストからの工程を出発して、新たなプレディクターを捜した。これらの１０３遺伝子は、Affymetrixデータセットで全６５のサンプルを用いる、異なるクラスタ群を比較する管理統計学的検定に対応した。次いで、Affymetrixデータ：遺伝子のランダムサブ選択、ルールラーニング、ルール選択、ルールバリデーションにおいて記載されたものと同様のラーニング戦略に従った。ランダムに、リスト当たりｋ数のプローブセット（ｋ＝５..１６）の５００サブリスト（合計で６０００のサブリスト）を作成した。ΔＣｔデータ（コントロール遺伝子１８Ｓ）を用いて、五つの予測アルゴリズム（ＳＶＭ、ＰＡＭ、ｋＮＮ、ＤＱＤＡ、およびＤＬＤＡ）をセットＳ１でトレーニングし、３０，０００プレディクターを得た。各アルゴリズムについて、ｋの各値と組み合わせて、検定セットＳ２を分類するために（セットＳ１でトレーニングされた）対応プレディクターの成功率に基づき、５００の中で最良のサブリストを選択した（同等の場合には、出会う最初のサブリストが保存された）、この選択は６０プレディクターを与えた。これらの中で、検定セットＳ２を分類する上で、三つのプレディクターが最高の成功率を示し、そのうち一つは三つの異なるアルゴリズムで８８％より高い（Ｓ２の）成功率を示し、したがって最良とみなされた。このプレディクターはＤＬＤＡアルゴリズムで得られ、セットＳ１を１００％成功率およびセットＳ２を９４％成功率で予測した。選択プレディクターのバリデーションとして、セットＳ３に関する予測クラスの関連性を、予測クラス（１，２，３ vs ４，５，６）とＦＡＬ（Ｐ＝８．５ １０−４）並びに予測クラス（４ vs ５，６）とＣＴＮＮＢ１突然変異（Ｐ＝５ １０−５）との関連のレベルを測るFisher正確確率検定のＰ値から評価した。
【０１１２】
具体的ＨＣＣサブグループ示差的発現遺伝子の決定、それに続くＧＯ解析
１９，７８７プローブセットに関するｌｏｇ２-変換強度値でＢＲＢ ArrayTools（ｖ３．２ｂ５）を用いて、すべての単変量ｔおよびＦ検定を行なった。１０偽発見未満のＰ＜０．００１および９０％信頼の各単変量検定の名目有意レベルを、１０００順列を用いた多変量検定に基づき表した。所定サブグループ（またはサブグループの組合せ）と残りサンプル（Ｇｘ vs Ｇnon-ｘ）との間で並びに五つのプールされた非腫瘍サンプル（Ｇｘ vs 非腫瘍）間で示差的に発現されることがわかった遺伝子を特定するために、すべてのグループ間ｔ検定を行なった。所定サブグループ（他のグループ間比較ではない）について両検定タイプにより見つけられた、ＡＮＯＶＡ解析（前記のＦ検定）で有意（Ｐ＜０．００１，記載されたように１０偽発見未満）であった遺伝子は、ＨＣＣサブグループ（またはサブグループの組合せ）特異的遺伝子であるとみなされた。
【０１１３】
分類の安定性評価
摂動のために、ランダムGaussianノイズ（μ＝０，σ＝１．５ｘデータセットから計算された分散中央値）を所定のデータセットに加えた。各系統樹をｋグループ（ｋ＝２..１８）に区分し、初期系統樹と比較して各グループに置かれたサンプル-ペアの割合を安定性スコアとして用いた（１のスコアが摂動（またはリサンプリング）を意味する０〜１のスコア範囲は、クラスタ群のメンバーシップに影響を有しなかった）。
【０１１４】
２．２ 結果
非管理トランスクリプトーム解析は臨床および遺伝子改変と密接に関連した腫瘍のクラスタを規定する
Affymetrix ＨＧ-Ｕ１３３Ａ GeneChipアレイを用いて、５７ＨＣＣ、３肝細胞腺腫および５サンプルのプールされた非腫瘍組織を解析した。非管理解析に基づき、各々がFisher正確確率検定に基づく臨床的および遺伝的因子（前記の表１および２参照）と高度に関連した六つのサブグループ（図２）にＨＣＣ腫瘍を区分する、ＨＣＣ分類の頑健性モデルを我々は開発した。実施された解析に基づき、各々がより小さな三つのサブグループに更に細分される２大グループ（ここではＧ１〜Ｇ６と称される）に６０腫瘍サンプルを細分する。この分類は摂動／リサンプリング検定と照合したときに極めて頑健性であり（各クラスタ解析の平均再現性スコアは、二つの大きなグループおよび六つのサブグループについて少なくとも０．９であるとわかった）、反復ｋ-meansクラスタ解析と一致することを見出した（材料および方法の欄参照）。更に、サンプル区分のトポロジーは異なる遺伝子リストとクラスタリンケージ法にまたがり保存された。Ｇ１〜Ｇ３はＧ４〜Ｇ６より有意に高い断片的アレル損失（ＦＡＬ）を示したことから（Ｐ<１０−３，表２）、２大グループは染色体不安定（Ｇ１、Ｇ２、およびＧ３）および安定（Ｇ４、Ｇ５、およびＧ６）サンプルに相当する。加えて、Ｇ１〜Ｇ３グループに属するＨＣＣはＧ４〜Ｇ６のＨＣＣと比較して早い再発および早い死亡とやや関連していた（Ｐ＝０．０５，表２）。異なるサブグループが、低数のＨＢＶ ＤＮＡコピー（Ｇ１）およびＣＴＮＮＢ１遺伝子突然変異（Ｇ５およびＧ６）と共に、ＴＰ５３突然変異（Ｇ２およびＧ３）、ＨＢＶ感染（Ｇ１およびＧ２）で特徴づけられた。一次腫瘍から１ｃｍ以内で離れてみられる遠位癌性結節の存在は、Ｇ６と関連し（Ｐ＝０．０４，表２）、これら腫瘍の局部侵襲の高い可能性を示した。非腫瘍肝臓組織の５サンプルプールはしっかりと一緒にクラスタ化し、２０腫瘍を含む大きな異種グループ（Ｇ４）内でみられ、そのうち四つは同一小クラスタにおいてＴＣＦ１突然変異を有した（３腺腫および１ＨＣＣ）。
【０１１５】
六つのグループ分類の二つのプレディクターの特定
この分類のサブグループと診断ポテンシャルとで臨床的関連性があるとすれば、本発明者らの目的は、より時間およびコスト効率的な技術の定量的逆転写酵素ＰＣＲ（ＱＲＴ-ＰＣＲ）を用いることにより、臨床環境により適合したクラス-プレディクターを特定することであった。六つのＨＣＣサブグループへのクラスメンバーシップを予測しうる遺伝子を求めるために、最初にAffymetrixデータを用いてプレディクターを構築した（材料および方法と下記表１０参照）。この解析から、Affymetrixデータを用いるとクラス予測の高い成功率（９３．１％）を示すが、ＱＲＴ-ＰＣＲデータを用いたのではさほど満足しえない（８１％）ことが判明した、第一の２４遺伝子プレディクター（ＡＬＤＨ１Ｌ１、ＣＤ２４、ＣＤ７４、ＣＦＨＲ３、ＣＹＰ４Ｆ１２、ＤＮＡＪＡ３、ＤＳＣＲ１、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＢ４、ＦＡＡＨ、ＦＧＦＲ２、ＦＬＪ１０１５９、ＧＬＴ８Ｄ１、ＨＡＬ、ＭＡＴＮ２、ＭＲＰＳ７、ＰＡＫ２、ＰＬＸＮＢ１、ＲＡＢ１Ａ、ＲＨＯＱ、ＳＬＣ２７Ａ５、ＳＬＰＩ、ＳＭＡＲＣＥ１、ＳＴＲＡ１３）を特定した。
【０１１６】
【表１０】
【０１１７】
こうして、Affymetrixデータと関連臨床および遺伝子アノテーション（即ち、ＴＰ５３、ＣＴＮＮＢ１、およびＡＸＩＮ１遺伝子の突然変異状態、ＨＢＶの存在および力価、早期再発および全生存）を用いた一連の管理検定を行なった。これら管理検定のうち一以上で有意であることが示された１４０遺伝子のリストを作成した。これら選択遺伝子のうち五つ以外はすべて、１０９ＨＣＣ腫瘍（Affymetrixマイクロアレイを用いて解析された５７ＨＣＣのうち４６と６３ＨＣＣのバリデーションセットを含む）および２１非腫瘍肝臓組織でＱＲＴ-ＰＣＲにより確証された。AffymetrixデータとＱＲＴ-ＰＣＲデータとの高い相関が１４０選択遺伝子のうち１３５において見られた（ΔＣｔ値を用いると０．８４のSpearmanのρメジアン相関係数）。ＱＲＴ-ＰＣＲデータを用いて、（検定された１３５のうち）１０３遺伝子のセブセットの多数サブリストについて、六つのＨＣＣサブグループの最良総合プレディクターを特定するために遺伝子検定した。この目的のため、Affymetrixマイクロアレイで解析された４６ＨＣＣをトレーニング（ｎ＝２８）および検定セット（ｎ＝１８）に分けた。既に記載された表３において掲載されたすべての遺伝子はこれら管理検定のうち１以上で有意であることが少なくとも示され、それらのほとんどが少なくとも１または２の良い分類プレディクターに存在していた。トレーニングセット（１００％）および検定セット（９４．４％）の真のクラスメンバーシップを予測する最良成功率が、ＤＬＤＡ予測アルゴリズムを用いて１６遺伝子（ＲＡＢ１Ａ、ＰＡＰ、ＮＲＡＳ、ＲＡＭＰ３、ＭＥＲＴＫ、ＰＩＲ、ＥＰＨＡ１、ＬＡＭＡ３、Ｇ０Ｓ２、ＨＮ１、ＰＡＫ２、ＡＦＰ、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＤＨ２、ＨＡＭＰ、ＳＡＥ１）のＣｔ値で得られた。
【０１１８】
最良プレディクターは下記式に従う：
【数９】
上記式中
【数１０】
上記式中、異なるμ（クラスｋ，遺伝子ｔ）およびσ（遺伝子ｔ）パラメーターは既に記載された表５において掲載されたものである。
【０１１９】
こうして、所定サンプルと各クラスのセントロイド表現との距離を計算した後、新たなサンプルが最も近いクラスにおかれる。
【０１２０】
次いで、バリデーション腫瘍セットの６３サンプルを六つのサブグループに区分するために、このシグネチャーを用いた。Affymetrix実験で解析された第一セットの腫瘍で観察されるように、有意な関連性が、Fisher正確確率検定を用いると、ＦＡＬ、ＴＰ５３、ＨＢＶ感染、およびＣＴＮＮＢ１遺伝子突然変異と異なる予測サブグループとの間で、並びに１０９ＨＣＣ腫瘍の完全シリーズを用いたもので見られた（表１）。
【０１２１】
各ＨＣＣサブグループに関与する遺伝子のキーシグナリング経路および機能性カテゴリーの特定
異なるＨＣＣサブグループに関与するキー経路を特定するために、一以上のＨＣＣサブグループで特に脱調節される１５６０遺伝子が、ＡＮＯＶＡと組み合わされた全グループ式ｔ検定解析からの結果に基づき特定された。ＨＣＣサブグループに特異的な遺伝子の全リストについて、既知経路における遺伝子の関連性も調べた。染色体不安定サンプルに相当する、サブグループＧ１〜Ｇ３で特に過剰発現される細胞周期／増殖／ＤＮＡ代謝遺伝子の豊富化が観察された（Ｐ＜０．０１）。特に過剰発現される高数の遺伝子がＧ１サブグループ（低数のウイルスＤＮＡにおけるＨＢＶ感染、ＡＸＩＮ１突然変異、若年齢、高血清レベルのＡＦＰおよび頻出アフリカ起源と関連，表１および２）で観察された。それらの中で、発生に際して発現されるタンパク質をコードする遺伝子が見出された：ミオシン重鎖IIｂ、ＭＹＨ４、転写因子ＳＯＸ９およびＳＯＸ４、ならびに親性刷込み遺伝子：インスリン様成長因子２（ＩＧＦ２）、父系発現１、３、および１０（ＰＥＧ１、ＰＥＧ３、およびＰＥＧ１０）、α-フェトプロテイン（ＡＦＰ）およびサルコグリカンε（ＳＧＣＥ）。これらすべての遺伝子の差異的発現が、１０９腫瘍においてＱＲＴ-ＰＣＲを用いて確証された（図３ａ）。検定された刷込み遺伝子は正常胎児肝臓で高度に過剰発現された（図３ａ）。Ｈ１９ ｍＲＮＡもＧ１サンプルのみならず胎児サンプルでも過剰発現され、これら２グループにおいてＩＧＦ２と相関していた（各々Ｒ２＝０．４および０．６）。
【０１２２】
サブグループＧ２腫瘍（高数のウイルスＤＮＡコピーにおけるＨＢＶ感染、頻出局部および血管侵襲およびＴＰ５３突然変異と関連）は、過剰発現される細胞周期／増殖／ＤＮＡ代謝遺伝子（Ｐ＜０．０１）、Ｇ３（ＴＰ５３突然変異およびＣＤＫＮ２Ａプロモーターメチル化と関連）、およびすべての染色体不安定サンプルにおいて等しく観察される豊富化（Ｐ＜０．００７）と有意に関連していた。タンパク質リン酸化に関与する過剰発現遺伝子の有意な過剰提示も確認された（Ｐ＜０．００９）。興味深いことに、ホスファチジルイノシトール３-キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）-ＡＫＴ経路の活性化につながると予測されたＰＩＫ３ＣＡ遺伝子における突然変異が、Ｇ２に属する二つの腫瘍において確認された。これら二つのサンプルは非管理クラスタリング解析で密接に関連していた（図２）。ＰＩＫ３ＣＡ突然変異サンプルにおいて、特に過剰発現される３８遺伝子が、グループＧ１〜Ｇ３において他の腫瘍と比較して特定された。これら遺伝子の中では、ＱＲＴ-ＰＣＲを用いてＰＩＫ３ＣＡ突然変異腫瘍で特に過剰発現される（Ｐ=０．００１，図３ｂ）、タンパク質延長因子ＥＥＦ１Ａ２およびエンテロキナーゼＰＲＳＳ７についてコードする二つの遺伝子の過剰発現が確証された。更に、ＰＩＫ３ＣＡ突然変異腫瘍における細胞間連絡遺伝子の豊富化をＧＯ解析により証明した（Ｐ＝０．０７）。
【０１２３】
Ｇ５（ＣＴＮＮＢ１突然変異、非遠位結節）において、ＩＦＩ１６、ＩＬ４Ｒ、ＩＦＩ４４、ＳＴＡＴ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＣＴＳＳ、およびＨＬＡ-ＤＰＡ１／Ｂ１のようなストレスおよび免疫応答に関与する過少発現遺伝子の豊富化（Ｐ＜０．００２）が観察された。ＨＣＣサブグループＧ５およびＧ６は、前記場合の７０および１００％でＣＴＮＮＢ１突然変異された２３および１１腫瘍を各々含む。可能なβ-カテニン標的遺伝子のサーチにおいて、Ｇ５およびＧ６で有意に過剰発現される２８０遺伝子のリストが見出された。ＧＰＲ４９およびＧＬＵＬに加えて、肝臓における二つの既知β-カテニン標的遺伝子、（Cadoret,A.et al.Oncogene 21,8293-301(2002)、Yamamoto,Y.et al.Hepatology 37,528-33(2003)）、７推定β-カテニン標的遺伝子の過剰発現がＱＲＴ-ＰＣＲを用いて確認された。これらの遺伝子には、ＥＰＨＢ２，チロシンキナーゼレセプター、ＭＭＥ，エンケファリナーゼ ＣＤ１０、ＭＥＲＴＫ，癌遺伝子チロシンキナーゼ、ＬＡＭＡ３，ラミニン５のα-３鎖、ＰＡＰ／ＨＩＰ，膵炎関連タンパク質をコードする、ＳＰＡＲＣＬ１，細胞外マトリックスと関連したヘビンをコードする、および転写因子ＴＢＸ３を含む（図４ａ）。これらすべての推定β-カテニン標的遺伝子の発現の有意に高いレベルが、ＣＴＮＮＢ１突然変異のないサンプルの除外後であっても、Ｇ５と比較してＧ６において観察された。形質膜におけるシグナルの消失と細胞質および核における強い局在化と共に、β-カテニンがＧ５腫瘍と比較してＧ６腫瘍で多く過剰発現されることも示された（図４ｂ）。この観察と一致して、β-カテニンと相互作用してＷｎｔ応答性標的遺伝子を活性化する転写因子、ＬＥＦ１の過剰発現が、Ｇ６において見出された。Ｇ５およびＧ６サブグループ双方は染色体８ｐ ＬＯＨと関連していたが、Ｇ６に特有な他の染色体欠損は確認されなかった。しかしながら、主腫瘍の周辺でみられる衛星結節の準常在(quasi-constant presence)により示されるようなこれらＨＣＣの局部侵襲の原因となりうる、ＣＤＨ１（Ｅ-カドヘリンをコードする）の過少発現が、（AffymetrixおよびＱＲＴ-ＰＣＲ実験において、図４ａ）Ｇ６サブグループにおいて見られた（図４ｃと表１および２）。ＣＤＨ１ ｍＲＮＡ下方調節のレベルは、これら腫瘍においてＣＤＨ１のプロモーターメチル化の高レベルと一致する、Ｇ６におけるＥ-カドヘリンタンパク質の下方調節発現と高度に関連していることが示された（データ示さず）。
【０１２４】
２．３結論
非管理ゲノムワイドアプローチを用いて、本発明者らは、これら腫瘍の大きな自然多様性を反映する、六つの主要サブグループにおけるＨＣＣの頑健性分類を得た（Bosch.F.X.,et al.Gastroenterology 127,S5-S16(2004)、El-Serag,H.B.Gastroenterology 127,S27-34(2004)）。加えて、この分類はＱＲＴ-ＰＣＲで解析された１６遺伝子のみを用いて再現でき、更に重要なことに、腫瘍の独立セットにおいて確認された。
【０１２５】
この分類は、染色体安定性に関連した腫瘍の二つの主なグループ（メタグループＧ１〜Ｇ３およびＧ４〜Ｇ６に相当する）について記載した、ＨＣＣの既公開解析と一致する（Lee,J.S.et al.Hepatology 40,667-76(2004)、Breuhahn,K.et al.Cancer Res 64,6058-64(2004)、Chen,X.et al.Mol Biol Cell 13, 1929-39(2002)）。しかしながら、本解析により、この分類を拡張および精密化した。
【０１２６】
要約すると、（１）フランスで外科治療された腫瘍の一連の研究が、ＨＣＣの異なる主な危険因子、即ちＨＢＶおよびＨＣＶ感染、アルコール乱飲およびヘモクロマトーシスを含んでいたこと、および（２）研究サンプル群で利用しうる多数の臨床、組織病理学的および遺伝子アノテーションにより、二つサブグループへの既公開分類と比較して、ＨＣＣの多面的分類の解明は本願のみで可能であった、と本発明者らは考える。実際に、クラスメンバーシップの主な臨床決定因子はＨＢＶ感染であり、一方他の主決定因子は染色体不安定性、ＴＰ５３およびＣＴＮＮＢ１突然変異、ＣＤＫＮ２ＡおよびＣＤＨ１メチル化と親の刷込み(parental imprinting)を含めた遺伝的および非遺伝的変化である（図１参照）。
【０１２７】
ＨＣＣの自然史に焦点を当てると、Ｇ１およびＧ２サブグループを規定するＨＢＶ関連腫瘍は他の病因から明らかに分子的に区別されるようである。ＨＣＶ感染およびアルコール乱飲に関連する腫瘍はサブグループＧ３〜Ｇ６内に配分される。本トランスクリプトーム分類は腫瘍の新実体の特定化を可能にした。サブグループＧ１は、等しい性別比、低数のウイルスＤＮＡコピー、頻出ＡＸＩＮ１突然変異、ＴＰ５３突然変異の非存在、および正常に親に刷込みされた遺伝子の過剰発現と共に、若年患者（他のＨＢＶ ＨＣＣと比較して）、多くはアフリカからのＨＢＶ関連腫瘍を含む。早い年齢におけるＨＢＶ感染が、おそらく胎児肝細胞の永続性または成人肝細胞の脱分化による異常親性遺伝子刷込みで未成熟特徴を示すＨＣＣの特別な型に至ることを、これらの結果は示唆している。腫瘍におけるこのような多様性は、疫学研究でみられる高リスク群と関連しているかもしれない（Brechot,C.Gastroenterology 127,S56-61(2004)、Yu,M.C. & Yuan,J.M.Gastroenterology 127,S72-8(2004)）。
【０１２８】
ＣＴＮＮＢ１突然変異の１００％発生率、高レベルの病理学的Ｗｎｔ経路活性化（Ｇ５の場合より高い）およびＥ-カドヘリンの不活性化（kozyraki,R.et al.Gastroenterology 110,1137-49(1996)）を有するサブグループＧ６は、Ｅ-カドヘリン不活性化が細胞侵襲工程に関与することが知られていることから（Behrens,J.,et al.J Cell Biol 108,2435-47(1989)）、これら腫瘍の高侵襲ポテンシャルと一致する。
【０１２９】
腫瘍のこれら大きなサブグループとは別に、本トランスクリプトーム解析は、ＴＣＦ１またはＰＩＫ３ＣＡ突然変異のような希少遺伝子改変と関連した、腫瘍の同種サブグループも示唆した（Bluteau,O.et al.Nat Genet 32,312-5(2002)、Lee,J.W.et al.Oncogene 24,1477-80(2005)）。腫瘍の他の小さな同種サブグループに特有の新たな構造遺伝子改変がなおも特定され続けており、逆にこれは新治療標的を見出す強力な手段となりうる。
【０１３０】
実施例３：ＨＣＣ腫瘍の予後
３．１ 材料および方法
定量的ＲＴ-ＰＣＲ解析
実施例２の材料および方法の項目において記載されているように、定量的ＲＴ-ＰＣＲ解析を行った。
【０１３１】
予後プレディクターの構築
Affymetrix GeneChipで解析された一連の４２サンプルから１３５遺伝子の２−ΔＣｔ値（ΔＣｔ＝Ｃｔ検定−ＣｔＲ１８Ｓ）に基づき、予後状態（６０ヶ月における総合生存）と関連するトップ１６遺伝子（最大ｌｏｇｒａｎｋ Ｐ≦１０−２）が単変量Ｃｏｘモデル（パッケージ生存Ｖ２．１５）を用いて特定された。同４２サンプルを用いて、これら１６遺伝子の中で５遺伝子以下の最良組合せ（最大ｌｏｇｒａｎｋ Ｐ＜１０−５）が全可能組合せから多変量Ｃｏｘモデルを用いて選択された。次いで、これらのモデルを確証するために第二シリーズの５３独立ＨＣＣを用い（最大ｌｏｇｒａｎｋ Ｐ＜１０−３）、それらのうち４２を留保した。各モデルの頑健性が更に下記リサンプリングアプローチにより評価された：我々は１０００回にわたりランダムに９５腫瘍の全シリーズを各４７および４８サンプルの二群へ分ける（両グループ間で死亡事象の数を均衡させる）ことにより１０００サンプリングを得て、次いで、遺伝子の４２リストの各々を用いて、各サンプリングの両群について、多変量Ｃｏｘモデルを構築し、両モデルから計算されたｌｏｇｒａｎｋ Ｐ値を留置した。（これら１０００サンプリングの中で）両グループで最低中央値ｌｏｇｒａｎｋ Ｐに至る遺伝子の組合せを保存し、次いでプレディクターをこの組合せから得た。
【０１３２】
３．２ 結果
予後を予測する遺伝子の特定およびバリデーション
診断には有用であるが、１６遺伝子分類シグネチャー（実施例２参照）は、腫瘍の二つの主なグループ（Ｇ１〜Ｇ３ vs Ｇ４〜Ｇ６）または個別的な六つのサブグループを各々検定した場合、ログランク検定が（Ｐ＝０．２および０．１）の高いｐ値を生じたことから、ＨＣＣ予後を予測する上で十分でなかった。結果として、予後の特定プレディクターが材料および方法の項目において記載されたように構築された。
【０１３３】
全体として、総合生存および／または非再発生存の予後判定に有用であると見出された遺伝子は前記表７に掲載されたものであった。
【０１３４】
更に正確には、総合生存の予後状態と関連するトップ１６遺伝子は：ＮＲＣＡＭ、ＰＩＲ、ＲＡＭＰ３、ＳＬＣ２１Ａ２、ＴＡＦ９、ＴＮＡ、ＨＮ１、ＰＳＭＤ１、ＭＲＰＳ７、ＣＤＣ２０、ＥＮＯ１、ＨＬＦ、ＳＴＲＡ１３、ＲＡＧＤ、ＮＲＡＳ、ＡＲＦＧＥＦ２である、と決定された。
【０１３５】
材料および方法で記載されたようなこれら１６遺伝子の中で５遺伝子以下の全可能組合せの検定後、五つのベストモデルがＰ＜１０−８で多変量Ｃｏｘ解析を用いて総合生存を予測した。最後に、悪い結果を予測する最も有用な組合せは、５遺伝子：高レベルのＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、ＰＳＭＤ１、およびＡＲＦＧＥＦ２と組み合わされた低レベルのＲＡＭＰ３の集合である。
【０１３６】
最良な総合生存プレディクターは下記式に従う：
【数１１】
上記式中、異なるβ（遺伝子ｔ）およびμ（遺伝子ｔ）パラメーターは下記表１１において掲載されたものである。
【０１３７】
【表１１】
【０１３８】
ＲＯＣ曲線、スコア曲線、および生存曲線における総合生存の最良プレディクターに関する結果が図５ａにおいて示され、一方、総合生存のこの最良プレディクターに関する統計値が下記表１２において掲載されている。
【０１３９】
【表１２】
【０１４０】
５３ＨＣＣバリデーションセットにおいて、遺伝子のこの組合せはケースの７９％において早期再発を正確に予測した（（＋）７０％，（−）８９％）、そして早期死亡はケースの８１％において正確に予測された（（＋）７３％，（−）９２％）。臨床および形態学的特徴の中では、Edmondsonグレードおよび血管侵襲が悪い予後と有意に関連していた（各々ｌｏｇｒａｎｋ Ｐ＜０．０４および０．０００２）。これら二つの変数、さらに最良総合生存プレディクターを含む多変量Ｃｏｘモデルを行なった（下記表１３参照）。このモデルは、我々の遺伝子組合せが独立予後変数であることを示す。
【０１４１】
【表１３】
【０１４２】
無疾患生存を予測する遺伝子の組合せを見つけるために同様の戦略を適用した。興味深いことに、トップ１６遺伝子（ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、ＥＮＯ１、ＲＡＢ１Ａ、ＡＲＦＧＥＦ２、Ｇ０Ｓ２、ＰＳＭＤ１、ＭＲＰＳ７、ＲＡＧＤ、ＨＮ１、ＰＩＲ、ＳＭＡＤ３、ＤＮＡＪＡ３、ＨＥＬＯ１、ＲＡＭＰ３、ＲＨＯＱ）の中で、１０は単変量Ｃｏｘモデルを用いた全生存の最良プレディクターとして既に特定されていた。最後に、無疾患生存の最良プレディクターに含まれる全部で三つの遺伝子も、全生存の最良プレディクターに含まれた。
【０１４３】
最良非再発生存（または無疾患）プレディクターは下記式に従う：
【数１２】
上記式中、異なるβ（遺伝子ｔ）およびμ（遺伝子ｔ）パラメーターは下記表１４において掲載されたものである。
【０１４４】
【表１４】
【０１４５】
ＲＯＣ曲線、スコア曲線、および生存曲線における総合生存の最良プレディクターに関する結果が図５ｂにおいて示され、一方総合生存のこの最良プレディクターに関する統計値が下記表１５において掲載される。
【０１４６】
【表１５】
【０１４７】
３．３ 結論
トランスクリプトーム分類の解明は臨床適用上、特に興味深い。特に、グループＧ１〜Ｇ３に属するＨＣＣはＧ４〜Ｇ６のＨＣＣと比較して早い再発および早い死亡とやや関連し、分類と予後がともかく関連することを示す可能性がある。
【０１４８】
しかしながら、本発明者らは、完全外科切除により治療された患者の予後を予測する上で、約５遺伝子の小さな特定サブセットを用いた場合が、総合分類１６-遺伝子シグネチャーを用いた場合よりも優れていることを見出した。既に公開されたトランスクリプトーム解析と対照的に、決定された生存プレディクターの性能が全病因の危険因子を含む第二セットの独立腫瘍において実証され、このようなバリデーションがハイブリダイゼーションデータの代わりにＱＲＴ-ＰＣＲを用いて行なわれた（Lee,J.S.et al.Hepatology 40,667-76(2004)、Ye,Q.H.et al.Nat Med 9,416-23(2003)、Iizuka,N.et al.Lancet 361,923-9(2003)、Kurokawa,Y.et al.J Hepatol 41,284-91(2004)）。
【０１４９】
生存を予測する上で有用であると本願において特定された遺伝子は患者予後と関連していることがこれまでに見出されておらず、それらはタンパク質のプロテアソーム分解（ＰＳＭＤ１，Yokota,K.et al.Mol Biol Cell 7,853-70(1996)参照）、ＲＮＡ転写の開始（ＴＡＦ９，Michel,B.,Komarnitsky,P.& Buratowski,S.Mol Cell 2,663-73(1998)参照）、および細胞増殖（ＮＲＣＡＭ，Sehgal,A.et al.Anticancer Res 19,4947-53(1999)参照）ならびにＡＲＦＧＥＦ２（Sheen,V.L.et al.Nat Genet 36,69-76(2004)参照）のような一般的な細胞工程に関与しているようである。
【０１５０】
興味深いことに、総合生存および無疾患生存（即ち、非再発生存）を予測する遺伝子の最良の組合せは、決定されたプレディクターが非腫瘍関連肝疾患とかかわりなく腫瘍進行を正確に反映することを証明するこの研究において、非常に類似していた。
【０１５１】
治療選択に際するこれらマーカーの潜在的有用性を評価するために、肝臓移植または高周波により治療された患者において、これらのプレディクターを評価することも、非常に興味深いであろう。
【０１５２】
結論として、本総合トランスクリプトーム解析は大シリーズの高度アノテーション腫瘍を用いて実施され、そして確証された。この解析は、腫瘍進行に際して蓄積されるヒトＨＣＣの自然多様性、構造遺伝子改変、および非遺伝的脱調節を反映する頑健性分類を確立した。ＨＣＣ腫瘍の高い多様性は臨床的含意を有し、本分類は、外科治療患者のためのみならず、標的療法に有利な患者を更に特定するためにも、予後判定手段をもたらしたのである。
【０１５３】
参考文献
【図面の簡単な説明】
【０１５４】
【図１】関連する臨床、遺伝子および経路においてトランスクリプトーム解析により規定された異なるＨＣＣサブグループの体系図。 Ｇ１〜Ｇ６は、トランスクリプトーム解析により規定された腫瘍のＨＣＣサブグループを示す。縦線は重要な関連特徴を示す（表１参照）。ＬＯＨ（ヘテロ接合性の喪失）、Hemochrom（ヘモクロマトーシス）、ＡＦＰ（α-フェトプロテイン）、ＨＢＶ（Ｂ型肝炎ウイルス）。実線および点線部分の用語は、主として、その特定機能カテゴリーにおける過剰および過少発現遺伝子を各々示す。
【図２】非管理階層クラスタリング 示された系統樹は、Wardのリンケージおよび１-Pearson相関係数を用いて、５７ＨＣＣ腫瘍、３腺腫、および５プールの非腫瘍組織からのAffymetrixデータの６７１２プローブセットの発現プロファイルに基づき得られた。臨床的および遺伝的特徴は、陽性および陰性の場合、各々黒ボックスおよび白ボックスにより示される。ＨＢＶ感染の場合、灰色ボックスは低数のウイルスＤＮＡコピーを示す。ＦＡＬはFractional Allelic Lossを示す（黒は５より多い染色体アームの欠損を含む腫瘍を示す（ＦＡＬ＞０．１２８））。他の略語は次の通りである：ＣＴＮＮＢ１（β-カテニン遺伝子）、Ｍｕｔ（突然変異）、ｍｅｔｈ（メチル化）、sat.nodule（主腫瘍から１ｃｍ以内の衛星結節）、ＡＦＰ（α-フェトプロテイン）、ＣＤＨ１（Ｅ-カドヘリン遺伝子）、portal.inv.（門脈侵襲）。
【図３ａ】ＱＲＴ-ＰＣＲを用いた選択数のＨＣＣサブグループＧ１特定遺伝子の特徴化 ａ．ＨＣＣ予測サブグループＧ１において特に過剰発現される遺伝子のバリデーション。ＩＧＦ２（インスリン成長因子２）、ＡＦＰ（αフェトプロテイン）、ＳＯＸ９（性決定領域Ｙ-ｂｏｘ９）、ＭＹＨ４（ミオシン重鎖IIｂ）、ＰＥＧ１およびＰＥＧ３（父系発現１および３）が１０９ＨＣＣにより解析された。ボックス-プロットは、六つの予測サブグループ（Ｇ１〜Ｇ６）の各々、２１非腫瘍サンプル（ＮＴ）、および１９胎児肝臓サンプル（ＦＬ）において、表示遺伝子について得られた相対（腫瘍 vs ２１非腫瘍の平均（Ｔ／ＮＴ））ｌｏｇ１０発現値の範囲を示す（中央値（第５０百分位数）の線を挟んで第２５百分位数から第７５百分位数まで伸びる）。最高値および最低値を示すために、ひげ線がボックスの上下に伸びている。異なるＨＣＣサブグループにおいて発現値を比較したＡＮＯＶＡ検定からのＰ値が遺伝子記号の下に示される。
【図３ｂ】ＱＲＴ-ＰＣＲを用いた選択数のＨＣＣサブグループＧ１特定遺伝子の特徴化 ｂ．ＥＥＦ１Ａ２（真核細胞翻訳延長因子１α）およびＰＲＳＳ７（エンテロキナーゼ前駆体）について、１０７非突然変異ＨＣＣ（ＰＩＫ３ＣＡ ＮＭ）と比較して、ＰＩＫ３ＣＡ突然変異腫瘍（ＰＩＫ３ＣＡ ｍｕｔ）において過剰発現される遺伝子のバリデーション。突然変異および非突然変異サンプルを比較するｔ検定から得られたＰ値が遺伝子記号の下に示される。
【図４ａ】Ｇ５およびＧ６サブグループへ至るＨＣＣ腫瘍の特徴化 ａ．ＱＲＴ-ＰＣＲを用いたＨＣＣ予測サブグループＧ５およびＧ６において、特に過剰発現される遺伝子のバリデーション。ボックス-プロットは、図３において示されたような１０９ＨＣＣサンプルで解析されたＧＬＵＬ（グルタミンシンターゼ）、ＴＢＸ３（転写因子ＴＢＸ３）、ＭＭＥ（膜メタロペプチダーゼ，ＣＤ１０）、ＬＡＭＡ３（ラミニン５のα-３鎖）、ＳＰＡＲＣＬ１（ヘビン）、ＭＥＲＴＫ（ｃ‐ｍｅｒプロト癌遺伝子チロシンキナーゼ）、ＰＡＰ（膵炎関連タンパク質）、ＥＰＨＢ２（エフリンレセプターＢ２）、ＬＥＦ１（リンパ系エンハンサー結合因子１）、およびＣＤＨ１（Ｅ-カドヘリン）について得られた相対（腫瘍 vs 非腫瘍の平均（Ｔ／ＮＴ））ｌｏｇ１０発現値の範囲を示す。
【図４ｂ】Ｇ５およびＧ６サブグループへ至るＨＣＣ腫瘍の特徴化 ｂ．β-カテニンについて突然変異されてＧ５およびＧ６へ至るＨＣＣの代表的ケースにおけるβ-カテニン免疫染色。ケースＨＣＣ３０３（Ｇ５）においては、少数の染色核と形質膜（白矢印）の濃い染色に注目。ケースＨＣＣ３０５（Ｇ６）においては、形質膜でシグナルなしに、肝細胞の細胞質および核が濃く染色される（黒矢印）。
【図４ｃ】Ｇ５およびＧ６サブグループへ至るＨＣＣ腫瘍の特徴化 ｃ．ＱＲＴ-ＰＣＲ（下側パネル）を用いた発現のｍＲＮＡレベル（グループＧ５およびＧ６）と比較した、ウエスタンブロット（上側パネル）を用いたＧ６のＨＣＣにおけるＥ-カドヘリンのタンパク質発現。
【図５ａ】生存のプレディクター ａ．全生存最良プレディクターに関する結果が示される。ＲＯＣ曲線は異なるスコア閾値における特異性および感受性を表す。丸印はトレーニングセット（ｎ＝４２）、×印はバリデーションセット（ｎ＝５３）に相当する。四角丸印および×印は、選択閾値（−０．３９３）で得られた感受性および特異性を示す。トレーニングセットサンプルの“予測クラス／真のクラス”分割表においてFisher正確確率検定に基づく最大成功率および最小Ｐ値を有するように、閾値が選択された。スコア曲線は表１１のパラメーターにより実施例３．２において記載された総合生存スコア式からトレーニングセット（上側曲線）およびバリデーションセット（下側曲線）で得られたスコアを示し、一方点線は選択された閾値スコアを示す。水平ストロークは生存患者を表し、一方垂直ストロークは死亡患者を表す。トレーニングセット（点線）およびバリデーションセット（実線）の生存曲線は、表示スコア閾値により階層化される。
【図５ｂ】生存のプレディクター ｂ．最良無疾患生存プレディクターに関する結果を示す。図５ａの場合と同様の表示コードが用いられる。スコア曲線は、表１４のパラメーターにより実施例３．２において記載された無疾患スコア式から得られたスコアを示す。水平ストロークは無疾患患者を表し、一方垂直ストロークは非無疾患患者を表す。
【発明の背景】
【０００１】
本発明は、肝細胞癌腫（ＨＣＣ）のインビトロ分類および／または予後判定のための方法に関する。本方法は、特定遺伝子組合せの発現プロファイルの決定に基づく。
【０００２】
肝細胞癌腫（ＨＣＣ）は、世界中で最も頻出の高い固形腫瘍の一つであり、癌による死亡原因の中で三番目である（Bosch.F.X.,et al.Semin Liver Dis 19,271-85(1999)）。その頻度は、高頻度のウイルス性肝炎感染とアフラトキシンＢ１暴露（ＡＦＢ１）とにより、特にアジアおよびアフリカにおいて高い。ここ１０年間、ＨＣＣの発生率は、英国、フランス、および米国において著しく増加してきた（Taylor-Robinson,S.D.et al.Bmj 319,640(1999)、Deuffic,S.et al.Lancet 351,214-5(1998)、El-Serag,H.B.& Mason,A.C.N Engl J Med 340,745-50(1999)）。この増加は、ウイルス性Ｃ型肝炎感染症の増加と関連する。
【０００３】
原形および異形成再生結節の肝硬変が、それらとＨＣＣ発生との強い関連性により、確実性の高いＨＣＣの前駆体であると考えられていた（Edmondson,H.A.& Peters,R.L.Semin Roentgenol 18,75-83(1983)、Thorgeirsson,S.S.& Grisham,J.W.Nat Genet 31,339-46(2002)）。他の固形腫瘍の場合のように、多数の遺伝子の改変が発癌工程に際して蓄積する。これら遺伝子改変の一部は、ＨＣＣ病因的因子(etiological factor)、特に染色体不安定性（Aoki.H.,et al.Proc Natl Acad Sci USA 93,7300-4(1996)）または挿入性突然変異誘発（Brechot,C.Gastroenterology 127,S56-61(2004)）を誘導しうるＨＢＶ感染に特有である。危険因子と特に関連する他の遺伝子改変は、アフラトキシンＢ１暴露ＨＣＣにおけるＲ２４９Ｓ ＴＰ５３遺伝子突然変異（Bressac,B.et al.Proc Natl Acad Sci USA 87,1973-7(1990)）、塩化ビニル関連ＨＣＣにおいて観察されるＫＲＡＳ２突然変異（Weihrauch,M.et al.Br J Cancer 84,982-9(2001)）、および肝細胞腺腫と関連したＴＣＦ１突然変異（Bluteau,O.et al.Nat Genet 32,312-5(2002)）である。ＨＣＣの危険因子と無関係な遺伝子改変の中においては、マイクロサテライト対立形質(allelotype)および比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）研究により、再発性染色体異常が証明された。最も高頻度で欠損される染色体腕(chromosome arm)は、１７ｐ、８ｐ、１６ｑ、１６ｐ、４ｑ、９ｐ、１３ｑ、１ｐ、および６ｑであり、一方、最も高頻度な付加は染色体１ｑ、７ｑ、８ｑ、および１７ｑにおいて見られる（Boige,V.et al.Cancer Res 57,1986-90(1997)、Wong,N.et al.Clin Cancer Res 6,4000-9(2000)、Guan,X.Y.et al.Genes Chromosomes Cancer 29,110-6(2000)）。そのため、ＨＣＣは危険因子および遺伝子改変により異なる、腫瘍の非常に多様な群である。
【０００４】
これにより、ＨＣＣ腫瘍の分類を行なう上で、更なる正確性、信頼性、および容易性が必要となる。実際に、例えば、非常に多様な腫瘍に対して効率的療法を探すことは非常に困難である。一方、信頼性あるＨＣＣの分類ができれば、各サブグループを別々に研究することにより、各サブグループについて新たな標的療法を見出せるであろう。さらに、分類検定を行なう際の信頼性および容易性があれば、各患者に適合した治療を選択しうるであろう。
【０００５】
特に、ＨＣＣの予後も非常に多様である。現在、ＨＣＣの主な治療は、アジュバント化学療法によりフォローされるまたはされない、ＨＣＣ腫瘍の外科切除である。化学療法は、患者にとって非常に面倒かつ苦痛であるが、予後の悪いＨＣＣの場合には必要である。ＨＣＣ腫瘍の分類および予後判定法があれば、ＨＣＣ患者にアジュバント療法を施すか否かを決める上でも、非常に役立つであろう。
【０００６】
ＨＣＣ多様性は当業者に周知であり、相当な努力が先行技術においてＨＣＣ腫瘍をより良く分類および／または予知するために払われてきた。
【０００７】
例えば、最近、いくつかのグループが総合トランスクリプトーム解析によりＨＣＣ腫瘍を分類しようと試みていた。ＨＢＶおよびＨＣＶ由来ＨＣＣ間において、重要な発現プロファイル変化について各々記載しているものもある（Okabe et al.Cancer Res.2001 Mar 1,61(5):2129-37、Iizuka et al.Cancer Res.2002 Jul 15,62(14):3939-44）。
【０００８】
様々な組織学的特徴（Chung et al.Mol Cells.2002 Dec 31,14(3):382-7、Chen et al.Mol Biol Cell.2002 Jun,13(6):1929-39、ＷＯ２００４／０９０１６３）または生存確率（Lee et al.Hepatology.2004 Sep,40(3):667-76）に基づき、二つまたは三つサブグループへのＨＣＣ分類について記載しているものもある。
【０００９】
本発明者らは、特に、二つのグループのＨＣＣを規定するＨＣＣの臨床的特徴と遺伝子改変が実際上密接に関連していることをこれまでに示した（Legoix,P.et al.Oncogene 18,4044-6(1999)、Laurent-Puig,P.et al.Gastroenterology 120,1763-73(2001)）。第一の種類のＨＣＣは、高レベルの染色体不安定性、頻出ＴＰ５３、およびＡＸＩＮ１突然変異と関連しているのみならず、ＨＢＶ感染および悪い予後とも密接に関連していた。逆に、第二サブグループのＨＣＣ腫瘍は染色体安定性であり、高頻度でβ‐カテニン変化を活性化するが、ウイルス感染とは関係しない。
【００１０】
予後に関しては、いくつかのグループが、血管侵襲（Chen et al.Mol Biol Cell.2002 Jun,13(6):1929-39、Qin et al.J Cancer Res Clin Oncol.2004 Sep,130(9):497-513）または転移（Qin et al.J Cancer Res Clin Oncol.2004 Sep,130(9):497-513、Ye et al.Nat Med.2003 Apr,9(4):416-23）に関与する遺伝子について記載した。
【００１１】
再発（Kurokawa et al.J Hepatol.2004 Aug,41(2):284-91、Lizuka et al.Lancet.2003 Mar 15,361(9361):923-9、ＷＯ２００５／０１７１５０）および／または生存（Lee et al.Hepatology.2004 Sep,40(3):667-76、ＷＯ２００５／０１７１５０）予後判定に関与する遺伝子の群について特定していたものもある。
【００１２】
しかしながら、組織学的または遺伝的特徴のみに基づく、二つまたは更には三つのサブグループへのＨＣＣ腫瘍の分類においては、ＨＣＣ高多様性をおそらく正確には反映できない。加えて、予後検定を行なう上での、簡単さ、容易性の必要性がなお存する。
【００１３】
更にＨＣＣで遺伝子型‐表現型相互関係を調査し、このように多様な腫瘍において脱調節された経路およびまたは生物学的工程を特定し、新たな予後因子を見つけるために、本発明者らは大きなシリーズの１２３腫瘍の臨床、遺伝子、およびトランスクリプトームレベルで包括的に解析を行った。
【００１４】
ほとんどの先行研究は、ＨＣＣ腫瘍を二つサブグループに細分類できただけであったが、本発明者らは、意外にも、ＨＣＣ腫瘍が様々な臨床および遺伝子改変と密接に関連した六つの異なるサブグループに現実に集団化されることを見出した。彼らは、クラスメンバーシップの１６‐遺伝子診断プレディクターおよび２４‐遺伝子プレディクターと、ＨＣＣサブグループにかかわらず患者予後を予測し、一般の臨床予後マーカーより優れた５‐遺伝子特性(signature)も決定した。
【００１５】
更に正確には、本発明者らは、六つの異なるＨＣＣサブグループまたはクラス（以下、Ｇ１〜Ｇ６と称される）を規定した。これら六つのサブグループは、Affymetrix ＨＧ-Ｕ１３３Ａ GeneChipアレイを用いて、５７ＨＣＣ、３肝細胞腺腫、および５サンプルの蓄積された非腫瘍組織の総合トランスクリプトーム解析の非管理解析により規定された。六つのサブグループは、下記表１において示され、図１において要約されるように、臨床および遺伝子因子と高度に関連する。
【００１６】
【表１】
【００１７】
実施例２、項目２．２において更に詳細に記載されているように、下記表２において記載されているような主要な特徴を用いて六つのサブグループが規定される。
【００１８】
【表２】
【００１９】
本発明による分類の方法によれば、ＨＣＣ肝臓サンプルについて、それがこれら六つのＨＣＣサブグループのうちどれに属するかを容易に決定しうる。
【００２０】
このように本発明は、第一に：
ａ）ＲＡＢ１Ａ、ＲＥＧ３Ａ、ＮＲＡＳ、ＲＡＭＰ３、ＭＥＲＴＫ、ＰＩＲ、ＥＰＨＡ１、ＬＡＭＡ３、Ｇ０Ｓ２、ＨＮ１、ＰＡＫ２、ＡＦＰ、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＤＨ２、ＨＡＭＰ、ＳＡＥ１、ＡＤＨ６、ＤＣＮ、ＦＬＪ１０１５９、ＡＬＤＨ１Ｌ１、ＩＧＦ１、ＬＥＣＴ２、ＳＬＣ３８Ａ１、ＳＰＡＲＣＬ１、ＣＴＮＮＡ２、ＧＬＵＬ、ＬＥＦ１、ＭＡＴＮ２、ＭＭＥ、ＰＦＮ２、ＳＰＩＮＴ２、ＴＢＸ３、およびＦＧＦＲ２からなる群より選択される少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、または少なくとも１６の遺伝子の組合せを含んでなる、またはこれらからなる発現プロファイルを決定し、
ｂ）該発現プロファイルから六つのサブグループの距離を計算し、そして
ｃ）サブグループの距離が最短であるサブグループにＨＣＣ腫瘍を分類する
ことを含んでなり、ここで六つのサブグループＧ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５、およびＧ６が表２において記載された、それらの臨床的および遺伝的特徴により規定される、ＨＣＣに罹患した対象の肝臓ＨＣＣサンプルからの六つのサブグループ間におけるＨＣＣ腫瘍のインビトロ分類の方法に関する。
【００２１】
ＨＣＣ分類に関与する第一セットの遺伝子の主要な特徴が下記表３において記載される。
【００２２】
【表３】
【００２３】
本発明によると、ＨＣＣ腫瘍の“分類”とは、ＨＣＣ腫瘍について、それが属するＨＣＣ“サブグループ”または“クラス”（これら二つの用語“サブグループ”および“クラス”は本願を通して互いに無関係に用いられる）の決定を意味するものであり、サブグループは表２において記載された特徴により規定される。
【００２４】
本発明によるインビトロ分類の方法の好ましい態様において、発現プロファイルは、ＲＡＢ１Ａ、ＲＥＧ３Ａ、ＮＲＡＳ、ＲＡＭＰ３、ＭＥＲＴＫ、ＰＩＲ、ＥＰＨＡ１、ＬＡＭＡ３、Ｇ０Ｓ２、ＨＮ１、ＰＡＫ２、ＡＦＰ、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＤＨ２、ＨＡＭＰ、ＳＡＥ１、ＡＤＨ６、ＤＣＮ、ＦＬＪ１０１５９、ＡＬＤＨ１Ｌ１、ＩＧＦ１、ＬＥＣＴ２、ＳＬＣ３８Ａ１、ＳＰＡＲＣＬ１からなる群より選択される少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、または少なくとも１６の遺伝子を含んでなる、またはこれらからなる。
【００２５】
本発明によるインビトロ分類の方法の更に好ましい態様において、発現プロファイルは、ＲＡＢ１Ａ、ＲＥＧ３Ａ、ＮＲＡＳ、ＲＡＭＰ３、ＭＥＲＴＫ、ＰＩＲ、ＥＰＨＡ１、ＬＡＭＡ３、Ｇ０Ｓ２、ＨＮ１、ＰＡＫ２、ＡＦＰ、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＤＨ２、ＨＡＭＰ、およびＳＡＥ１からなる群より選択される少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、または少なくとも１６の遺伝子を含んでなる、またはこれらからなる。本発明によるインビトロ分類の方法の最も好ましい態様において、発現プロファイルは、下記１６の遺伝子組合せを含んでなる、またはこれらからなる：ＲＡＢ１Ａ、ＲＥＧ３Ａ、ＮＲＡＳ、ＲＡＭＰ３、ＭＥＲＴＫ、ＰＩＲ、ＥＰＨＡ１、ＬＡＭＡ３、Ｇ０Ｓ２、ＨＮ１、ＰＡＫ２、ＡＦＰ、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＤＨ２、ＨＡＭＰ、およびＳＡＥ１。
【００２６】
本発明は：
ａ）ＡＬＤＨ１Ｌ１、ＣＤ２４、ＣＤ７４、ＣＦＨＲ３、ＣＹＰ４Ｆ１２、ＤＮＡＪＡ３、ＤＳＣＲ１、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＢ４、ＦＡＡＨ、ＦＧＦＲ２、ＦＬＪ１０１５９、ＧＬＴ８Ｄ１、ＨＡＬ、ＭＡＴＮ２、ＭＲＰＳ７、ＰＡＫ２、ＰＬＸＮＢ１、ＲＡＢ１Ａ、ＲＨＯＱ、ＳＬＣ２７Ａ５、ＳＬＰＩ、ＳＭＡＲＣＥ１、ＳＴＲＡ１３からなる群より選択される少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２２、または２４の遺伝子の組合せを含んでなる、またはこれらからなる発現プロファイルを決定し、
ｂ）該発現プロファイルから六つのサブグループの距離を計算し、そして
ｃ）サブグループの距離が最短であるサブグループにＨＣＣ腫瘍を分類する、
ことを含んでなり、ここで六つのサブグループＧ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５、およびＧ６が、表２において記載されたそれらの臨床的および遺伝的特徴により規定される、ＨＣＣに罹患した対象の肝臓ＨＣＣサンプルからの六つのサブグループ間におけるＨＣＣ腫瘍のインビトロ分類の他の方法にも関する。
【００２７】
ＨＣＣ分類に関与する第二セットの遺伝子の主要な特徴が下記表４に記載される。
【００２８】
【表４】
【００２９】
第二セットの遺伝子を用いた本発明によるインビトロ分類の上記方法の好ましい態様において、発現プロファイルは、次の２４遺伝子組合せを含んでなる、またはこれらからなる：ＡＬＤＨ１Ｌ１、ＣＤ２４、ＣＤ７４、ＣＦＨＲ３、ＣＹＰ４Ｆ１２、ＤＮＡＪＡ３、ＤＳＣＲ１、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＢ４、ＦＡＡＨ、ＦＧＦＲ２、ＦＬＪ１０１５９、ＧＬＴ８Ｄ１、ＨＡＬ、ＭＡＴＮ２、ＭＲＰＳ７、ＰＡＫ２、ＰＬＸＮＢ１、ＲＡＢ１Ａ、ＲＨＯＱ、ＳＬＣ２７Ａ５、ＳＬＰＩ、ＳＭＡＲＣＥ１、ＳＴＲＡ１３。
【００３０】
本発明によると、“肝臓ＨＣＣサンプル”とは、ＨＣＣ腫瘍組織を含んでなる、あらゆる肝臓サンプルを意味する。本発明によるインビトロ分類の方法の好ましい態様において、肝臓ＨＣＣサンプルは、肝臓ＨＣＣバイオプシーまたはＨＣＣ腫瘍外科切除によるものである。
【００３１】
“発現プロファイルを決定する”とは、選択遺伝子群の発現レベルの測定を意味する。各遺伝子の発現レベルは、当業界において知られた何らかの技術を用いて、タンパク質または核酸レベルのいずれかにおいて、インビトロにおいて決定されてもよい。
【００３２】
例えば、タンパク質レベルにおいて、特定タンパク質の発現レベルのインビトロ測定は、ＥＬＩＳＡまたはマススペクトロメトリー分析に限定されないが、それらを含めた、当業者に知られた何らかの量的方法により行なわれてもよい。これらの技術は、どのＨＣＣサンプルへも容易に適用される。実際に、ＨＣＣサンプルのタンパク質は、溶液測定の場合、ＥＬＩＳＡまたはマススペクトロメトリーに関して当業者に周知の様々な技術を用いて抽出される。一方、ＨＣＣ腫瘍スライス中におけるタンパク質の発現レベルは、直接的に組織スライスでマススペクトロメトリーを用いて分析されてもよい。
【００３３】
本発明によるインビトロ分類方法の好ましい態様において、発現プロファイルは核酸レベルにおいてインビトロで決定される。核酸レベルにおいて、遺伝子の発現レベルのインビトロ測定は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはレトロ転写された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）により直接的に行なわれてもよい。マイクロアレイ解析、定量的ＰＣＲ、サザン解析に限定されないが、それらを含めて、発現レベルを測定するいかなる方法も用いてもよい。本発明によるインビトロ分類の方法の好ましい態様において、発現プロファイルはマイクロアレイを用いてインビトロで決定される。本発明によるインビトロ分類の方法の他の好ましい態様において、発現プロファイルは定量的ＰＣＲを用いてインビトロにおいて決定される。いずれの場合においても、遺伝子の発現レベルは、好ましくは、内部コントロール遺伝子、一般的には、リボソームＲＮＡ（例えば１８ＳリボソームＲＮＡ）に限定されないが、それを含めたハウスホールド遺伝子、またはアクチンもしくはＨＰＲＴのような遺伝子の発現レベルと比較して標準化される。これらの技術はどのＨＣＣサンプルへも容易に適用される。実際に、組織サンプルからｍＲＮＡを抽出してｍＲＮＡをｃＤＮＡにレトロ転写する上で、いくつか周知の技術が当業者に利用しうる。
【００３４】
好ましい態様において、第一セットの遺伝子（表３参照）を利用するインビトロ分類の方法を用いた場合、発現プロファイルは定量的ＰＣＲを用いて核酸レベルにおいてインビトロで決定される。他の好ましい態様において、第二セットの遺伝子（表４参照）を利用する分類の方法を用いた場合、発現プロファイルは核酸マイクロアレイを用いて核酸レベルにおいてインビトロで決定される。特に、AffimetrixマイクロアレイＵ１３３Ａが有利に用いられる。
【００３５】
本発明者らにより規定された六つのサブグループ間におけるＨＣＣ腫瘍のインビトロ分類の方法において、各サブグループについて、該ＨＣＣ腫瘍と六つのサブグループの各々との数学的な距離を表す“サブグループ距離”が計算される。サンプルとサブグループとの距離が最短であれば、該サンプルがこの特定サブグループに属する確率は最高である。
【００３６】
ｎ遺伝子（ｎ≧８）の選択組合せの場合、全腫瘍のセットは、各腫瘍サンプルが該腫瘍サンプル中における各選択遺伝子の発現レベルに相当するｎ座標で特徴づけられる、ｎ次元セットとして規定される。各サブグループまたはクラスは、中心点と、中心点の各座標付近における許容偏差％とにより規定される、ｎ次元セットのサブセットである。発現プロファイルの決定に用いられる技術に応じて、六つのサブグループまたはクラスの一つまでの腫瘍サンプルの距離を各々計算しうる適切な数学関数が選択されてもよい。
【００３７】
特に、定量的ＰＣＲを用いて発現プロファイルが決定される場合、所定のＨＣＣ腫瘍サンプルｉおよび特定サブグループまたはクラスｋについて、該クラスｋまでの該サンプルｉの距離は下記式（Ｉ）を用いて計算されてもよい：
【数１】
上記式中
-ｎは発現プロファイルにおける遺伝子の数を表し、
-各遺伝子ｔについて、μ（クラスｋ，遺伝子ｔ）およびσ（遺伝子ｔ）は遺伝子の選択組合せに依存するパラメーターであり、本願の実施例２において更に詳細に記載されているような、ＨＣＣ腫瘍のトレーニング群における最適化、次いでＨＣＣ腫瘍の検定群におけるバリデーションにより計算される。
【００３８】
一方、発現プロファイルが核酸マイクロアレイを用いて核酸レベルにおいて決定される場合、所定のＨＣＣ腫瘍サンプルｉおよび特定サブグループまたはクラスｋについて、該クラスｋまでの該サンプルｉの距離は当業者に周知の様々なアルゴリズムから演繹される様々な式を用いて計算される。例えば、該クラスｋまでの該サンプルｉの該距離は下記式（II）を用いて計算される：
【数２】
上記式中
-ｎは発現プロファイルにおける遺伝子の数を表し、
-各遺伝子ｔについて、y（サンプルｉ，遺伝子ｔ）はサンプルｉ中における遺伝子ｔの標準化強度値を表し、および
-各遺伝子ｔおよびクラスｋについて、c（遺伝子ｔ，クラスｋ）、μ（遺伝子ｔ）、およびσ（遺伝子ｔ）は、遺伝子の選択組合せに依存するパラメーターであり、本願の実施例２において更に詳細に記載されているような、ＨＣＣ腫瘍のトレーニング群における最適化、次いでＨＣＣ腫瘍の検定群におけるバリデーションにより計算されてもよい。
【００３９】
標準化はいずれか周知の方法を用いて、例えばＲＭＡ標準化を用いて行なってもよい。
【００４０】
所定のサンプルｉについて、全クラスまでの全距離が計算された場合、サンプルｉ予測クラスが下記式(III)に従い計算される：
【数３】
上記式は、所定サンプルｉの予測クラスが、クラスまでのサンプルｉの距離が最短であるクラスであることを意味する。
【００４１】
第一セットの遺伝子（表３参照）を用いて、本発明者らにより規定された六つのサブグループ間におけるＨＣＣ腫瘍の分類の方法の好ましい態様において、発現プロファイルは次の遺伝子組合せ：ＲＡＢ１Ａ、ＲＥＧ３Ａ、ＮＲＡＳ、ＲＡＭＰ３、ＭＥＲＴＫ、ＰＩＲ、ＥＰＨＡ１、ＬＡＭＡ３、Ｇ０Ｓ２、ＨＮ１、ＰＡＫ２、ＡＦＰ、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＤＨ２、ＨＡＭＰ、およびＳＡＥ１からなり、定量的ＰＣＲを用いて決定され、クラスｋまでのサンプルｉの各距離は、下記式（IV）を用いて計算される：
【数４】
上記式中、各遺伝子ｔおよびクラスｋについて、μ（クラスｋ，遺伝子ｔ）およびσ（遺伝子ｔ）値は、下記表５で示された値から１０％、好ましくは９％、８％、７％、６％、５％、または更には４％、３％、２％、または１％の区間内にある。
【００４２】
【表５】
【００４３】
第二セットの遺伝子（表４参照）を用いて本発明者らにより規定された六つのサブグループ間におけるＨＣＣ腫瘍の分類の方法の好ましい態様において、発現プロファイルは次の遺伝子組合せ：ＡＬＤＨ１Ｌ１、ＣＤ２４、ＣＤ７４、ＣＦＨＲ３、ＣＹＰ４Ｆ１２、ＤＮＡＪＡ３、ＤＳＣＲ１、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＢ４、ＦＡＡＨ、ＦＧＦＲ２、ＦＬＪ１０１５９、ＧＬＴ８Ｄ１、ＨＡＬ、ＭＡＴＮ２、ＭＲＰＳ７、ＰＡＫ２、ＰＬＸＮＢ１、ＲＡＢ１Ａ、ＲＨＯＱ、ＳＬＣ２７Ａ５、ＳＬＰＩ、ＳＭＡＲＣＥ１、ＳＴＲＡ１３からなり、定量的マイクロアレイを用いて核酸レベルにおいて決定され、クラスｋまでのサンプルｉの各距離は下記式（Ｖ）を用いて計算される：
【数５】
上記式中、各遺伝子ｔおよびクラスｋについて、c（遺伝子ｔ，クラスｋ）、μ（遺伝子ｔ）、およびσ（遺伝子ｔ）値は、下記表６において示された値から１０％、好ましくは９％、８％、７％、６％、５％、または更には４％、３％、２％、または１％の区間内にある。
【表６】
【００４４】
本発明は：
ａ）ＮＲＣＡＭ、ＰＩＲ、ＲＡＭＰ３、ＳＬＣ２１Ａ２、ＴＡＦ９、ＴＮＡ、ＨＮ１、ＰＳＭＤ１、ＭＲＰＳ７、ＣＤＣ２０、ＥＮＯ１、ＨＬＦ、ＳＴＲＡ１３、ＲＡＧＤ、ＮＲＡＳ、ＡＲＦＧＥＦ２、ＲＡＢ１Ａ、Ｇ０Ｓ２、ＳＭＡＤ３、ＤＮＡＪＡ３、ＨＥＬＯ１、ＲＨＯＱ、Ｃ１４ｏｒｆ１５６、ＮＰＥＰＰＳ、ＰＤＣＤ２、ＰＨＢ、ＫＩＡＡ００９０、ＩＭＰ-３、ＫＰＮＡ２、ＫＩＡＡ０２６８、ＵＮＱ６０７７、ＬＯＣ４４０７５１、Ｇ６ＰＤ、ＳＴＫ６、ＴＦＲＣ、ＧＬＡ、ＴＲＩＰ１３、ＳＰＰ１、ＡＫＲ１Ｃ１、ＡＫＲ１Ｃ２、ＧＩＭＡＰ５、ＡＤＭ、ＣＣＮＢ１、ＴＫＴ、ＡＧＰＳ、ＲＡＮ、ＮＵＤＴ９、ＨＲＡＳＬＳ３、ＨＬＡ-ＤＱＡ１、ＮＥＵ１、ＲＡＲＲＥＳ２、ＰＡＰＯＬＡ、ＡＢＣＢ６、ＢＩＲＣ５、ＦＬＪ２０２７３、Ｃ１４ｏｒｆ１０９、ＣＨＫＡ、ＴＵＢＢ２、ＨＭＧＢ３、ＴＸＮＲＤ１、ＩＦＩＴＭ１、ＫＩＡＡ０９９２、ＭＰＰＥ１、ＫＬＲＢ１、ＣＣＬ５、ＳＹＮＥ１、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３、ＣＹＰ２Ｃ１８、ＰＡＣＳＩＮ２、ＰＯＮ３、およびＰＰＰ２Ｒ１Ｂからなる群より選択される少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、または少なくとも５の遺伝子の組合せを含んでなる発現プロファイルを決定し、
ｂ）該発現プロファイルから総合生存(global survival)スコアおよび／または非再発生存(survival without relapse)スコアを計算し、そして
ｃ）得られた総合生存スコアおよび／または非再発生存スコアを閾値と各々比較することを含んでなり、ここで
-該閾値より厳密に劣る総合生存／非再発生存スコアは良い生存／非再発生存予後を示し、一方
-該閾値より優れたまたはそれに等しい総合生存／非再発生存スコアは悪い生存／非再発生存予後を示す、
ＨＣＣに罹患した対象の肝臓ＨＣＣサンプルからの総合生存および／または非再発生存のインビトロ予後判定の方法にも関する。
【００４５】
ＨＣＣ予後に関与する遺伝子の主要特徴が、下記表７において記載されている。
【００４６】
【表７】
【００４７】
本発明によるインビトロ予後判定の方法の好ましい態様において、発現プロファイルはＮＲＣＡＭ、ＰＩＲ、ＲＡＭＰ３、ＳＬＣ２１Ａ２、ＴＡＦ９、ＴＮＡ、ＨＮ１、ＰＳＭＤ１、ＭＲＰＳ７、ＣＤＣ２０、ＥＮＯ１、ＨＬＦ、ＳＴＲＡ１３、ＲＡＧＤ、ＮＲＡＳ、ＡＲＦＧＥＦ２、ＲＡＢ１Ａ、Ｇ０Ｓ２、ＳＭＡＤ３、ＤＮＡＪＡ３、ＨＥＬＯ１、およびＲＨＯＱからなる群より選択される少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、または少なくとも５の遺伝子の組合せを含んでなる、好ましくはこれらからなる。
【００４８】
本発明によると、ＨＣＣ進展の“予後”とは、特定ＨＣＣ腫瘍に罹患した患者に関する、特定ＨＣＣ腫瘍の将来の進展の予測を意味する。本発明の方法によれば、総合生存予後と非再発生存予後との双方を判定しうる。
【００４９】
“総合生存予後”とは、再発または非再発における、生存の予後を意味する。前記のように、ＨＣＣに対する主な現行治療は腫瘍外科切除である。結果として、“悪い総合生存予後”は肝臓切除後３年以内における死の発生として規定され、一方“良い総合生存予後”は術後５年間にわたる死の非存在として規定される。
【００５０】
“非再発生存予後”とは、再発の非存在下における生存の予後を意味する。“悪い非再発生存予後”は肝臓切除後２年以内に腫瘍が再発するとして規定され、一方“良い非再発生存予後”は術後４年間にわたり再発しないとして規定される。
【００５１】
本発明による総合生存のインビトロ予後判定の方法の好ましい態様において、発現プロファイルは：
-ＴＡＦ９、ＰＩＲ、ＮＲＣＡＭ、およびＲＡＭＰ３
-ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、ＳＬＣ２１Ａ２、およびＰＳＭＤ１
-ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、ＲＡＭＰ３、およびＰＳＭＤ１
-ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、ＮＲＡＳ、ＲＡＭＰ３、およびＰＳＭＤ１、または
-ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、ＲＡＭＰ３、ＰＳＭＤ１、およびＡＲＦＧＥＦ２
から選択される遺伝子の組合せを含んでなる、好ましくはこれらからなる。
【００５２】
本発明による総合生存のインビトロ予後判定の方法の更に好ましい態様において、発現プロファイルは下記の遺伝子組合せ：
-ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、ＲＡＭＰ３、ＰＳＭＤ１、およびＡＲＦＧＥＦ２
を含んでなる、好ましくはこれらからなる。
【００５３】
一方、本発明による非再発生存のインビトロ予後判定の方法の好ましい態様において、発現プロファイルは：
-ＴＡＦ９およびＧ０Ｓ２
-ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、およびＲＡＭＰ３
-ＴＡＦ９、Ｇ０Ｓ２、およびＲＡＭＰ３
-ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、ＤＮＡＪＡ３、およびＲＡＭＰ３、または
-ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、Ｇ０Ｓ２、ＤＮＡＪＡ３、およびＲＡＭＰ３
から選択される遺伝子の組合せを含んでなる、好ましくはこれらからなる。
【００５４】
本発明による非再発生存のインビトロ予後判定の方法の更に好ましい態様において、発現プロファイルは下記の遺伝子組合せ：
-ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、およびＲＡＭＰ３
を含んでなる、好ましくはこれらからなる。
【００５５】
遺伝子の具体的な組合せは、プレディクターと称されてもよい。
【００５６】
本発明による総合生存および／または非再発生存のインビトロ予後判定の方法において、“肝臓ＨＣＣサンプル”は、ＨＣＣ腫瘍組織を含んでなる、いかなる肝臓サンプルでもよい。本発明による総合生存および／または非再発生存のインビトロ予後判定の方法の好ましい態様において、肝臓ＨＣＣサンプルは肝臓ＨＣＣバイオプシーまたはＨＣＣ腫瘍外科切除によるものである。
【００５７】
インビトロ分類の方法に関し、総合生存および／または非再発生存のインビトロ予後判定の方法において、各遺伝子の発現レベルは、当業界で知られた何らかの技術、特に上記いずれかの技術を用いて、タンパク質または核酸レベルにおいてインビトロで決定されてもよい。
【００５８】
総合生存および／または非再発生存のインビトロ予後判定の方法の好ましい態様において、発現プロファイルは核酸レベルにおいてインビトロで決定される。好ましくは、発現プロファイルはマイクロアレイを用いて決定される。他の好ましい態様において、発現プロファイルは定量的ＰＣＲを用いて決定される。いずれの場合でも、遺伝子の発現レベルは、好ましくは、内部コントロール遺伝子、一般的には、リボソームＲＮＡ（例えば１８ＳリボソームＲＮＡ）に限定されないが、それを含めたハウスホールド遺伝子、またはアクチンもしくはＨＰＲＴのような遺伝子の発現レベルと比較して標準化される。
【００５９】
本発明による総合生存および／または非再発生存のインビトロ予後判定の方法では、総合生存および／または非再発生存“スコア”が計算される。ｎ遺伝子（ｎ≧２）の選択組合せの場合、“スコア”は、遺伝子の選択組合せに依存したパラメーターにより加重される、該腫瘍サンプルで各選択遺伝子のｎ発現レベルを考慮に入れたロジスティック関数であり、本願の実施例３において更に詳細に記載されているような、ＨＣＣ腫瘍のトレーニング群における最適化、次いでＨＣＣ腫瘍の検定群におけるバリデーションにより計算されてもよい。
【００６０】
発現プロファイルの決定に用いられる技術に応じて、適切なパラメーターを用いた適切なスコア関数が求められてもよい。
【００６１】
特に、定量的ＰＣＲを用いて発現プロファイルが決定される場合、所定サンプルｉについて、総合生存または非再発生存“スコア”は下記式を用いて計算されてもよい：
【数６】
上記式中
-ｎは、発現プロファイルにおける遺伝子の数を表し、
-各遺伝子ｔについて、β（遺伝子ｔ）およびμ（遺伝子ｔ）は、遺伝子の選択組合せに依存するパラメーターであり、本願の実施例３において更に詳細に記載されているような、ＨＣＣ腫瘍のトレーニング群における最適化、次いでＨＣＣ腫瘍の検定群におけるバリデーションにより計算されてもよい。
【００６２】
本発明による総合生存および／または非再発生存のインビトロ予後判定のいずれの方法においても、総合生存および／または非再発生存の得られたスコアは、予後が悪いかまたは良いかを定める少なくとも一つの閾値と比較される。
【００６３】
発現プロファイルにおける遺伝子の所定の組合せについて、このような閾値は、β（遺伝子ｔ）およびμ（遺伝子ｔ）パラメーターの場合と同様の方法を用いて、即ち本願の実施例３で更に詳細に記載されているような、ＨＣＣ腫瘍のトレーニング群における最適化、次いでＨＣＣ腫瘍の検定群におけるバリデーションにより決定されてもよい。
【００６４】
所定の閾値について、サンプルの予後は：
-そのスコアが該閾値より優れるまたはそれに等しいならば、悪い予後であり、または
-そのスコアが該閾値より厳密に劣るならば、良い予後
である。
【００６５】
本発明による総合生存のインビトロ予後判定の方法の好ましい態様において、発現プロファイルは下記表８の遺伝子の組合せからなり、定量的ＰＣＲおよび下記式を用いて決定される：
【数７】
上記式中
-ｎは組合せにおける遺伝子の数を表し、
-ｔは下記表８で示された組合せにおける各遺伝子の数を表し、並びに
-各β（遺伝子ｔ）およびμ（遺伝子ｔ）係数の値は、下記表８において示された値から１０％、好ましくは９％、８％、７％、６％、５％、または更には４％、３％、２％、または１％の区間内にある。
【００６６】
【表８】
【００６７】
最も好ましい態様において、総合生存予後判定に用いられる閾値は、下記表８で示された値から１０％、好ましくは９％、８％、７％、６％、５％、または更には４％、３％、２％、または１％の区間内にある。
【００６８】
本発明による非再発生存のインビトロ予後判定の方法の好ましい態様において、発現プロファイルは下記表９の遺伝子の組合せからなり、定量的ＰＣＲおよび下記式を用いて決定される：
【数８】
上記式中
-ｎは、組合せにおける遺伝子の数を表し、
-ｔは、下記表９において示された組合せにおける各遺伝子の数を表し、および
-各β（遺伝子ｔ）およびμ（遺伝子ｔ）係数の値は、下記表９において示された値から１０％、好ましくは９％、８％、７％、６％、５％、または更には４％、３％、２％、または１％の区間内にある。
【００６９】
【表９】
【００７０】
最も好ましい態様において、予後判定に用いられる閾値は、下記表９において示された値から１０％、好ましくは９％、８％、７％、６％、５％、または更には４％、３％、２％、または１％の区間内にある。
【００７１】
好ましくは、ΔＣｔ（サンプルｉ，遺伝子ｔ）値は、リボソーム１８Ｓ ＲＮＡ（Ｒ１８Ｓ）と比較して計算される。
【００７２】
本発明は、更に：
ａ）本発明によるいずれかの方法に従い、生存および／または非再発生存予後を判定し、そして
ｂ）該予後判定からアジュバント療法の妥当性を決める：
-悪い予後である場合には、アジュバント療法が勧められ、一方
-悪い予後でない場合には、アジュバント療法が勧められない、
ＨＣＣに罹患した対象の肝臓ＨＣＣサンプルからのアジュバント療法の妥当性のインビトロ診断決定の方法に関する。
【００７３】
“アジュバント療法”とは、ＨＣＣに罹患した対象へ外科ＨＣＣ腫瘍切除後に施される、追加的抗腫瘍療法を意味する。アジュバント療法には化学療法および放射線療法を含んでもよいが、それらに限定されない。
【００７４】
本発明は、ＲＡＢ１Ａ、ＲＥＧ３Ａ、ＮＲＡＳ、ＲＡＭＰ３、ＭＥＲＴＫ、ＰＩＲ、ＥＰＨＡ１、ＬＡＭＡ３、Ｇ０Ｓ２、ＨＮ１、ＰＡＫ２、ＡＦＰ、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＤＨ２、ＨＡＭＰ、ＳＡＥ１、ＡＤＨ６、ＤＣＮ、ＦＬＪ１０１５９、ＡＬＤＨ１Ｌ１、ＩＧＦ１、ＬＥＣＴ２、ＳＬＣ３８Ａ１、ＳＰＡＲＣＬ１、ＣＴＮＮＡ２、ＧＬＵＬ、ＬＥＦ１、ＭＡＴＮ２、ＭＭＥ、ＰＦＮ２、ＳＰＩＮＴ２、ＴＢＸ３、およびＦＧＦＲ２からなる群より選択される少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４または少なくとも１６の遺伝子の組合せを含んでなる、またはこれらからなる発現プロファイルのインビトロ決定のための試薬を含んでなる、ＨＣＣに罹患した対象の肝臓ＨＣＣサンプルからの六つのサブグループ間におけるＨＣＣ腫瘍のインビトロ分類のためのキットにも関する。これらの遺伝子は、表２の臨床的および遺伝的特徴で規定されるようなサブグループＧ１〜Ｇ６にＨＣＣ腫瘍を分類する際に有用として特定された、第一セットの遺伝子（表３参照）に相当する。
【００７５】
好ましい態様において、本発明によるＨＣＣ腫瘍のインビトロ分類のためのキットは、ＲＡＢ１Ａ、ＲＥＧ３Ａ、ＮＲＡＳ、ＲＡＭＰ３、ＭＥＲＴＫ、ＰＩＲ、ＥＰＨＡ１、ＬＡＭＡ３、Ｇ０Ｓ２、ＨＮ１、ＰＡＫ２、ＡＦＰ、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＤＨ２、ＨＡＭＰ、ＳＡＥ１、ＡＤＨ６、ＤＣＮ、ＦＬＪ１０１５９、ＡＬＤＨ１Ｌ１、ＩＧＦ１、ＬＥＣＴ２、ＳＬＣ３８Ａ１、ＳＰＡＲＣＬ１からなる群より選択される少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、または少なくとも１６の遺伝子の組合せを含んでなる、またはこれらからなる発現プロファイルのインビトロ決定のための試薬を含んでなる。
【００７６】
更に好ましい態様において、本発明によるＨＣＣ腫瘍のインビトロ分類のためのキットは、ＲＡＢ１Ａ、ＲＥＧ３Ａ、ＮＲＡＳ、ＲＡＭＰ３、ＭＥＲＴＫ、ＰＩＲ、ＥＰＨＡ１、ＬＡＭＡ３、Ｇ０Ｓ２、ＨＮ１、ＰＡＫ２、ＡＦＰ、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＤＨ２、ＨＡＭＰ、およびＳＡＥ１からなる群より選択される少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、または少なくとも１６の遺伝子の組合せを含んでなる、またはこれらからなる発現プロファイルのインビトロ決定のための試薬を含んでなる。
【００７７】
更に一層に好ましい態様において、本発明によるＨＣＣ腫瘍のインビトロ分類のためのキットは、次の１６遺伝子組合せ：ＲＡＢ１Ａ、ＲＥＧ３Ａ、ＮＲＡＳ、ＲＡＭＰ３、ＭＥＲＴＫ、ＰＩＲ、ＥＰＨＡ１、ＬＡＭＡ３、Ｇ０Ｓ２、ＨＮ１、ＰＡＫ２、ＡＦＰ、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＤＨ２、ＨＡＭＰ、およびＳＡＥ１を含んでなる、またはこれらからなる発現プロファイルのインビトロ決定のための試薬を含んでなる。
【００７８】
本発明は、更に、ＡＬＤＨ１Ｌ１、ＣＤ２４、ＣＤ７４、ＣＦＨＲ３、ＣＹＰ４Ｆ１２、ＤＮＡＪＡ３、ＤＳＣＲ１、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＢ４、ＦＡＡＨ、ＦＧＦＲ２、ＦＬＪ１０１５９、ＧＬＴ８Ｄ１、ＨＡＬ、ＭＡＴＮ２、ＭＲＰＳ７、ＰＡＫ２、ＰＬＸＮＢ１、ＲＡＢ１Ａ、ＲＨＯＱ、ＳＬＣ２７Ａ５、ＳＬＰＩ、ＳＭＡＲＣＥ１、ＳＴＲＡ１３からなる群より選択される少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２２または２４の遺伝子の組合せを含んでなる、またはこれらからなる発現プロファイルのインビトロ決定のための試薬を含んでなる、ＨＣＣに罹患した対象の肝臓ＨＣＣサンプルからの六つのサブグループ間におけるＨＣＣ腫瘍のインビトロ分類のためのキットに関する。これらの遺伝子は、表２の臨床的および遺伝的特徴で規定されるようなサブグループＧ１〜Ｇ６にＨＣＣ腫瘍を分類する際に有用として特定された、第二セットの遺伝子（表４参照）に相当する。
【００７９】
好ましくは、該キットは、次の２４遺伝子組合せ：ＡＬＤＨ１Ｌ１、ＣＤ２４、ＣＤ７４、ＣＦＨＲ３、ＣＹＰ４Ｆ１２、ＤＮＡＪＡ３、ＤＳＣＲ１、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＢ４、ＦＡＡＨ、ＦＧＦＲ２、ＦＬＪ１０１５９、ＧＬＴ８Ｄ１、ＨＡＬ、ＭＡＴＮ２、ＭＲＰＳ７、ＰＡＫ２、ＰＬＸＮＢ１、ＲＡＢ１Ａ、ＲＨＯＱ、ＳＬＣ２７Ａ５、ＳＬＰＩ、ＳＭＡＲＣＥ１、ＳＴＲＡ１３からなる発現プロファイルのインビトロ決定のための試薬を含んでなる。
【００８０】
本発明は、更に、ＮＲＣＡＭ、ＰＩＲ、ＲＡＭＰ３、ＳＬＣ２１Ａ２、ＴＡＦ９、ＴＮＡ、ＨＮ１、ＰＳＭＤ１、ＭＲＰＳ７、ＣＤＣ２０、ＥＮＯ１、ＨＬＦ、ＳＴＲＡ１３、ＲＡＧＤ、ＮＲＡＳ、ＡＲＦＧＥＦ２、ＲＡＢ１Ａ、Ｇ０Ｓ２、ＳＭＡＤ３、ＤＮＡＪＡ３、ＨＥＬＯ１、ＲＨＯＱ、Ｃ１４ｏｒｆ１５６、ＮＰＥＰＰＳ、ＰＤＣＤ２、ＰＨＢ、ＫＩＡＡ００９０、ＩＭＰ-３、ＫＰＮＡ２、ＫＩＡＡ０２６８、ＵＮＱ６０７７、ＬＯＣ４４０７５１、Ｇ６ＰＤ、ＳＴＫ６、ＴＦＲＣ、ＧＬＡ、ＴＲＩＰ１３、ＳＰＰ１、ＡＫＲ１Ｃ１、ＡＫＲ１Ｃ２、ＧＩＭＡＰ５、ＡＤＭ、ＣＣＮＢ１、ＴＫＴ、ＡＧＰＳ、ＲＡＮ、ＮＵＤＴ９、ＨＲＡＳＬＳ３、ＨＬＡ-ＤＱＡ１、ＮＥＵ１、ＲＡＲＲＥＳ２、ＰＡＰＯＬＡ、ＡＢＣＢ６、ＢＩＲＣ５、ＦＬＪ２０２７３、Ｃ１４ｏｒｆ１０９、ＣＨＫＡ、ＴＵＢＢ２、ＨＭＧＢ３、ＴＸＮＲＤ１、ＩＦＩＴＭ１、ＫＩＡＡ０９９２、ＭＰＰＥ１、ＫＬＲＢ１、ＣＣＬ５、ＳＹＮＥ１、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３、ＣＹＰ２Ｃ１８、ＰＡＣＳＩＮ２、ＰＯＮ３、およびＰＰＰ２Ｒ１Ｂからなる群より選択される少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、または少なくとも５の遺伝子の組合せを含んでなる、またはこれらからなる発現プロファイルのインビトロ決定のための試薬を含んでなる、ＨＣＣに罹患した対象の肝臓ＨＣＣサンプルからの総合生存および／または非再発生存のインビトロ予後判定のためのキットに関する。
【００８１】
好ましい態様において、ＨＣＣに罹患した対象の肝臓ＨＣＣサンプルからの総合生存および／または非再発生存のインビトロ予後判定のためのキットは、ＮＲＣＡＭ、ＰＩＲ、ＲＡＭＰ３、ＳＬＣ２１Ａ２、ＴＡＦ９、ＴＮＡ、ＨＮ１、ＰＳＭＤ１、ＭＲＰＳ７、ＣＤＣ２０、ＥＮＯ１、ＨＬＦ、ＳＴＲＡ１３、ＲＡＧＤ、ＮＲＡＳ、ＡＲＦＧＥＦ２、ＲＡＢ１Ａ、Ｇ０Ｓ２、ＳＭＡＤ３、ＤＮＡＪＡ３、ＨＥＬＯ１、およびＲＨＯＱからなる群より選択される少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、または少なくとも５の遺伝子の組合せを含んでなる、またはこれらからなる発現プロファイルのインビトロ決定のための試薬を含んでなる。
【００８２】
更に一層好ましい態様において、ＨＣＣに罹患した対象の肝臓ＨＣＣサンプルからの総合生存のインビトロ予後判定のためのキットは、下記の遺伝子組合せ：
-ＴＡＦ９、ＰＩＲ、ＮＲＣＡＭ、およびＲＡＭＰ３
-ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、ＳＬＣ２１Ａ２、およびＰＳＭＤ１
-ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、ＲＡＭＰ３、およびＰＳＭＤ１
-ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、ＮＲＡＳ、ＲＡＭＰ３、およびＰＳＭＤ１、または
-ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、ＲＡＭＰ３、ＰＳＭＤ１、およびＡＲＦＧＥＦ２
のうち一つを含んでなる、またはこれらからなる発現プロファイルのインビトロ決定のための試薬を含んでなる。
【００８３】
更に好ましい態様において、ＨＣＣに罹患した対象の肝臓ＨＣＣサンプルからの総合生存のインビトロ予後判定のためのキットは、下記の遺伝子組合せ：
-ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、ＲＡＭＰ３、ＰＳＭＤ１、およびＡＲＦＧＥＦ２
を含んでなる、またはこれら発現プロファイルのインビトロ決定のための試薬を含んでなる。
【００８４】
他の好ましい態様において、ＨＣＣに罹患した対象の肝臓ＨＣＣサンプルからの非再発生存のインビトロ予後判定のためのキットは、下記の遺伝子組合せ：
-ＴＡＦ９およびＧ０Ｓ２
-ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、およびＲＡＭＰ３
-ＴＡＦ９、Ｇ０Ｓ２、およびＲＡＭＰ３
-ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、ＤＮＡＪＡ３、およびＲＡＭＰ３、または
-ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、Ｇ０Ｓ２、ＤＮＡＪＡ３、およびＲＡＭＰ３
のうち一つを含んでなる、またはこれらからなる発現プロファイルのインビトロ決定のための試薬を含んでなる。
【００８５】
更に好ましい態様において、ＨＣＣに罹患した対象の肝臓ＨＣＣサンプルからの非再発生存のインビトロ予後判定のためのキットは、下記の遺伝子組合せ：
-ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、およびＲＡＭＰ３
を含んでなる、またはこれらからなる発現プロファイルのインビトロ決定のための試薬を含んでなる。
【００８６】
本発明による総合生存および／または非再発生存のインビトロ予後判定のためのキットにおいて、用意された試薬は総合生存または非再発生存のみの予後判定を行なえるか、または総合生存および非再発生存の双方の予後判定を行なってもよい。
【００８７】
本発明によるあらゆるキットにおいて、発現プロファイルの決定のための試薬には遺伝子発現レベルの測定に有用なあらゆる試薬を含んでもよい。発現レベルの該測定は、タンパク質または核酸レベルで行なってもよい。
【００８８】
タンパク質レベルにおける発現プロファイルの決定に適した試薬には、マススペクトロメトリー分析およびタンパク質マイクロアレイ用の試薬、抗体、および抗体断片があるが、それらに限定されない。
【００８９】
逆に、核酸レベルにおける発現プロファイルの決定に適した試薬には、増幅プライマー、核酸プローブ、および核酸マイクロアレイがあるが、それらに限定されない。
【００９０】
特に、ＨＣＣ分類に有用な遺伝子の第一セットの遺伝子（表３参照）を用いて発現プロファイルを決定するための試薬を含んでなるＨＣＣの分類のためのキットにおいて、該キットは、有利には、増幅プライマーと、場合により遺伝子発現の定量的ＰＣＲ解析に有用な核酸プローブとを含んでもよい。該キットは、場合により、他の有用な定量的ＰＣＲ試薬を含有してもよい。
【００９１】
一方、ＨＣＣ分類に有用な遺伝子の第二セットの遺伝子（表４参照）を用いて発現プロファイルを決定するための試薬を含んでなるＨＣＣの分類のためのキットにおいて、該キットは、有利には、核酸マイクロアレイと、場合により遺伝子発現のマイクロアレイ解析に有用な他の試薬とを含んでもよい。
【００９２】
加えて、本発明によるどのキットにおいても、該試薬には、本発明による総合生存および／または非再発生存のインビトロ分類または予後判定の方法を行なうための説明書を添付してよい。例えば、該説明書は：
１）例えば、必要な処方および様々なパラメーター値を付すことにより、ユーザー自身に分類または予後判定を行なわせてもよく、または
２）キットに装備された、または例えば、インターネットでアクセスしうる専用ソフトウェアへその発現データを入力するようユーザーに指示してもよい。
【００９３】
このケースにおいて、試薬および説明書は同一のパッケージとともにまたは二つの別々なパッケージに分けて入れてもよい。
【００９４】
本発明は、更に：
ａ）本発明の方法に従い該対象の肝臓ＨＣＣサンプルから総合生存および／または非再発生存を決定し、そして
ｂ）悪い予後である場合には該対象にアジュバント療法を施し、一方悪い予後でない場合にはこのようなアジュバント療法を施さない
ことを含むＨＣＣに罹患した対象の治療の方法に関する。
【００９５】
本発明は：
ａ）ＨＣＣ腫瘍サンプルを用意し、
ｂ）本発明の方法に従い該ＨＣＣ腫瘍サンプルを分類し、そして
ｃ）該ＨＣＣサブグループで分類されたＨＣＣ腫瘍サンプルのインビトロ成長を阻害しうる化合物の能力を検定する、
本発明による六つのＨＣＣサブグループの一つの治療に有用な化合物のインビトロスクリーニングの方法にも関する。
【００９６】
本発明は、更に：
ａ）ＨＣＣ腫瘍サンプルを本発明による六つのサブグループの一つに分類し、そして
ｂ）そのＨＣＣ腫瘍サンプルが属するＨＣＣサブグループを標的とした治療上の処置を対象に施す
ことを含むＨＣＣに罹患した対象の治療の方法に関する。
【００９７】
本発明を全般的に説明してきたが、本発明の特徴および利点の更なる理解は、説明のみの目的でここに示され、別記されない限り限定する意味ではない、ある具体例および図面を参照することで得られる。
【実施例】
【００９８】
実施例１：ＨＣＣ腫瘍の転写解析の戦力
腫瘍およびサンプル，臨床データ
一連の１２０肝細胞癌腫および３肝細胞腺腫を、それらの対応非腫瘍組織と共に、１９９２年〜１９９９年に３箇所のフランス外科部門において肝臓切除により治療された患者１２３例から集めた。この研究に含まれるすべての場合において、全臨床データおよび追跡調査が入手しえた。これらすべての腫瘍は、既に記載されたように、臨床的に特徴づけられた（Laurent-Puig,P.et al.Gastroenterology 120,1763-73(2001)）。性別比（Ｍ：Ｆ）は１：４であり、患者の平均年齢は６０歳（年齢中央値＝６３歳，１８〜８５歳の範囲）であった。患者は、フランス（９２例）、サハラ以南アフリカ（１１例）、地中海エリア（７例）、アンティル（４例）、およびアジア（４例）において生まれた。Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、アルコール乱飲、およびヘモクロマトーシスのＨＣＣの危険因子が、腫瘍の３６、３０、４０、および６％で各々生じた。２５例においてＨＣＣが公知の危険因子の非存在下で進行し、１６例において、少なくとも二つの危険因子がみられた。腫瘍分化の組織学的グレードは、EdmondsonおよびSteinerグレーディングシステムに従い、グレードＩ（７％）、II（４９％）、III（３９％）、およびIV（４％）と判定された。１０３例において、手術前α-フェトプロテイン血清レベルが入手でき、患者３７例について１００ＩＵ／ｍＬ以上であった。肉眼的および／または微視的血管侵襲がケースの３７％において記録された。主腫瘍から１ｃｍ以内でみられる結節で規定される衛星腫瘍がケースの４１％で記録された。肝臓移植で治療されたまたは術後３月間以内で死んだ患者を除外した後、Ｒ０完全切除の患者９９例で全および無疾患生存が評価された。肝硬変で第二非関連腫瘍の発生の影響を最少化するために、我々は５年後の生存データを考慮に入れなかった。全シリーズにおける平均追跡調査は３８月間（範囲３〜６０月間）であり、それはなお生存する患者の場合４９月間であった。二つの質的予後変数により構成される：（１）“早期再発”ｙｅｓまたはｎｏは肝臓切除後２年以内における腫瘍再発の存在および術後４年間にわたる再発の欠如により規定された、（２）“早期死亡”ｙｅｓまたはｎｏは肝臓切除後３年以内における死亡の発生および術後５年間にわたる死亡の欠如により規定された。Affymetrix解析においては、アルコール性肝硬変（プール１）、アルコール非硬変肝（プール２）、ＨＢＶ非硬変肝（プール３）、ＨＣＶ肝硬変（プール４）、およびＨＢＶ肝硬変（プール５）を含めて、解析腫瘍に対応する５プールの３非腫瘍肝臓組織が用いられた。ＱＲＴ-ＰＣＲ実験においては、これらの１５の非腫瘍ＲＮＡおよび六つの追加正常非腫瘍肝臓ＲＮＡが個別に解析された。妊娠の異なる段階（１１〜２９週の妊娠期間範囲）にある１９のヒト胎児肝臓サンプルも集められた。該研究は地元の倫理委員会（ＣＣＰＰＲＢ Paris Saint-Louis）により承認され、インフォームド・コンセントがフランス法に従い得られた。
【００９９】
基本トランスクリプトーム解析
出発物質として各サンプルの全ＲＮＡ５μｇおよびＨＧ-Ｕ１３３Ａ Affymetrix GeneChipアレイのハイブリダイゼーション（GeneChip Fluidics Station 400）当たりｃＲＮＡ２０μｇを用いて、マイクロアレイ解析を行った。各アレイからの像はＨＰ GeneArray 2500を用いて作成し、製造業者のプロトコールに従い解析した（http://www.affymetrix.com/support/technical/manual/expression manual.affx）。指示された場合を除き、すべてのトランスクリプトーム解析はBioconductor（ｖ１．１．１）のものを含めたＲシステムソフトウェア（ｖ１．９．０）パッケージの各種取合せまたはオリジナルＲコードを用いて行なった。Ｒパッケージおよびバージョンは適宜に表示されている。６５Affymetrix ＨＧ-Ｕ１３３Ａ GeneChipマイクロアレイからの未処理特徴データを標準化し、頑健性マルチアレイ平均（パッケージaffy Ｖ１．４．３２）を用いて各ブローブセットに関するｌｏｇ２強度発現サマリー値を計算した。コントロール遺伝子に対応するまたは“ ｘ ”アノテーションを有するブローブセットをマスクして、更なる解析に利用しうる全部で１９，７８７のブローブセットを得た。
【０１００】
実施例２：ＨＣＣ腫瘍の分類
２．１ 材料および方法
遺伝子突然変異、染色体不均衡、ＨＢＶゲノムの定量およびＤＮＡメチル化
全サンプルについて、腫瘍および非腫瘍ＤＮＡを取り出し、QiaquickおよびRneasy抽出キット（Qiagen）を各々用いるＤＮＡおよびＲＮＡ抽出まで−８０℃において貯蔵した。ＤＮＡはフルオロメトリー（Fluoroskan Thermo Lab-system）により定量し、ＲＮＡはスペクトロフォトメーター（Nanodrop）を用いて２６０ｎｍで定量した。ＤＮＡおよびＲＮＡの質は、ゲル電気泳動、次いで臭化エチジウム染色およびAgilent ２１００バイオアナライザーにより制御した。２８Ｓ／１８Ｓ比がAffymetrix実験で１．５より大きく、定量的ＲＴ-ＰＣＲ解析で１より大きければ、ＲＮＡが適格とされた。遺伝子突然変異は、３１００ Applied Biosystemsシークエンサーを用いて腫瘍ＤＮＡを直接配列決定することにより、ＴＰ５３エキソン２〜１１、β-カテニンエキソン２〜４についてコードするＣＴＮＮＢ１、ＡＸＩＮ１エキソン１〜１０、ＰＩＫ３ＣＡエキソン１〜２０で調べた。アレル損失および染色体不均衡は、既に記載されたように（Laurent-Puig,P.et al.Gastroenterology 120,1763-73(2001)）、ＬＭＳ２マイクロサテライトパネル（Applied Biosystems）からのゲノタイピング４００マーカーにより調べた。血清学的結果またはウイルスＤＮＡ増幅（Laurent-Puig,P.et al.Gastroenterology 120,1763-73(2001)）によりＨＢＶ感染と関連づけられた全サンプルについて、ＤＮＡのＨＢＳおよびＨＢＸコピーがSyberグリーン法（Applied Biosystems）を用いて腫瘍および非腫瘍ＤＮＡにより定量された。定量に用いられたプライマーがウイルス多型性または突然変異のない領域で選択されるよう保証するために、ＨＢＳおよびＨＢＸ ＤＮＡの配列は全腫瘍で決定した。ウイルスＤＮＡの定量は染色体２２ＰＣＲ増幅と関連していた。ＰＣＲ増幅の効力は、ＨＢＳ、ＨＢＸ、および染色体２２レファレンスについて各々９５、９７、および９４％で測定した。腫瘍および非腫瘍ＤＮＡサンプルは更にHoechstのフルオリメトリーを用いて慎重に定量し、濃度はアガロースゲル電気泳動により調べた。腫瘍において低数のウイルスＤＮＡコピーは、０．５より劣るＨＢＸ／レファレンスおよびＨＢＳ／レファレンス比（平均：０．０１，範囲：０．００２〜０．５，標準誤差：０．１４）で規定された。腫瘍において高数のウイルスＤＮＡコピーは、１．５より優れたＨＢＸ／レファレンスおよびＨＢＳ／レファレンス比（平均：２５，範囲：１．６〜２１２，標準誤差：４６）で規定された。ＣＤＨ１およびＣＤＫＮ２ＡプロモーターにおけるＤＮＡメチル化は、既に記載されたように（Lee,S.et al.Am J Pathol 163,1371-8(2003)、Zochbauer-Muller,S.et al.Cancer Res 61,249-55(2001)）、重亜硫酸ＤＮＡおよびメチル化特異的増幅を用いて調べた。
【０１０１】
定量的ＲＴ-ＰＣＲ解析
定量的ＲＴ-ＰＣＲ解析では、高性能Archiveキットおよびランダムヘキサマー（Applied Biosystems）を用いて３μｇの全ＲＮＡを逆転写した。各サンプルおよび検定遺伝子について、TaqMan Low Density ArrayおよびABI PRISM 7900HT Systems（Applied Biosystems）を用いて、２ｎｇの逆転写ＲＮＡに相当する１μＬのｃＤＮＡをTaqMan ＰＣＲ解析により二重に解析した。ｃＤＮＡの質はリアルタイムＰＣＲ（全シリーズで偏差７％の係数）によりＲ１８Ｓ定量を用いて評価した。サンプル中における検定ｍＲＮＡの相対量は２−ΔΔＣＴ法を用いて調べた：ΔΔＣＴ＝（ＣＴ検定−ＣＴＲ１８Ｓ）サンプル−（ＣＴ検定−ＣＴＲ１８Ｓ）カリブレーター（Livak,K.J.& Schmittgen,T.D.Methods 25,402-8(2001)）。簡単には、遺伝子の発現結果は、内部コントロールリボソーム１８Ｓ、相対的には、内部コントロールリボソーム１８Ｓに対して標準化された非腫瘍サンプルにおける対応遺伝子の平均発現レベルに相当するカリブレーターに対して標準化された。表およびグラフで示された値は、非腫瘍組織の平均と比較した、検定サンプルにおける遺伝子発現のｎ倍比率を表している。
【０１０２】
ウエスタンブロットおよび免疫組織化学
凍結させた組織を５００μＬ氷冷ＲＩＰＡ Lysis緩衝液（Santa Cruz）中でDounceとホモゲナイズし、タンパク質濃度をＢＣＡタンパク質アッセイキット（Pierce）により調べた。イムノブロット解析は、ＳＤＳ６％ポリアクリルアミドゲル上で移動するタンパク質５０μｇ、ポリクローナルＥ-カドヘリン抗体（ＳＣ-７８７０，１：５００，Santa Cruz）、ペルオキシダーゼ複合化二次抗体（１：２０００，Santa Cruz）、および増強化学発光剤（ＥＬＣ，Pierce）を用いて行なった。免疫染色は、モノクローナル抗β-カテニン（１：４００，ＢＤ Biosciences 610153）、ビオチニル化抗マウス（１：２００，Vector Laboratories ＢＡ-２０００）、Vectastain ＡＢＣ Elite標準キット（Vector Laboratories ＰＫ-６１００）、ＤａＢキット（Vector Laboratories ＳＫ-４１００）を用いて、ホルマリン固定パラフィン包埋肝臓サンプルの５μｍ断片で行なった。免疫染色前に、内在性ペルオキシダーゼを遮断し、抗原検索を圧力釜（Biogenex）中０．００１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ７で行なった。
【０１０３】
トランスクリプトーム解析に基づく分類
６５サンプルの分類は、距離メトリックとして１-Pearson相関（パッケージクラスＶ７．２-２）を用い、八つのデータサブセットおよび三つの異なるリンケージ法（平均，完全，およびWard’s）から得られた、一連の２４階層クラスタ解析に基づいていた。八つのデータサブセットは最も変化する発現プロファイルの８非管理選択に対応した。この選択に関する基準は、分散中央値（Ｐ＜０．０１）と比較した所定プローブセットに関する分散の有意差、並びに偏差閾値の異なる“頑健性”係数（ｒＣＶ，最低および最高値を除外したｎ-２サンプルに関するプローブセットｌｏｇ２強度値の平均で標準偏差を割り計算される）であった。９９〜６７１２プローブセットを選択した（第９９．５および第６０ｒＣＶ百分位数）。初期２４系統樹の安定性は、摂動／リサンプリング後に得られたクラスタ結果と互いに比較することにより評価した（各々１００反復，安定性スコアの詳細については補足情報参照）。異なる初期クラスタ数（ｋ＝７..１５）でｋ-meansクラスタリングアプローチを用いて、モデルも検定した。各ｋについて２００中のベストラン（即ち、ｋグループ間で最大距離のもの）を用いて、サンプルを六つのＨＣＣサブグループのサブセットに従いまたはとして一貫的にグループ分けした。
【０１０４】
ＨＣＣサブグループと臨床／遺伝子変数との関連性
異なる臨床および遺伝子変数と六つのＨＣＣ腫瘍サブグループ間の関連の有意性を調べるために、Fisher正確確率検定を行なった。リンケージ法および遺伝子リストの全組合せから得られたクラスタ結果を検定した。加えて、多数モダリティー（例えば、ＨＢＴ）の変数を二項値へ記録し、各組合せを検定した。ＱＲＴ-ＰＣＲ結果（表１参照）を用いた総合プレディクターでは、表中で０のＰがＰ＜０．００１に等しいことを意味するオリジナルＰ値を補正するために、クラスラベルの１０００ランダム順列を用いた。
【０１０５】
総合プレディクターの構築
Affymetrixデータプレディクター
マルチクラスプレディクターを確立するために、６５サンプルをトレーニングセット（ｎ＝３６，各クラスタ群について６，ランダムに選択）および検定セット（ｎ＝２４腫瘍＋５非腫瘍サンプル）に分けた。次いで、６工程ラーニング戦略：（１）Ｆ検定を用いてトレーニングサンプルに基づく遺伝子管理選択（ｎ＝３７６プローブセット）、（２）サブサンプリング、全強度レベルおよびリダンダントＨＵＧＯ遺伝子記号および偽発見率コントロールに基づく遺伝子プローブセットフィルタリング（ｎ＝２５８）、（３）遺伝子クラスタビンで区分された（またはされていない）、８〜２５遺伝子のランダムサブ選択、（４）五つの予測アルゴリズムを用いたルールラーニング、（５）検定セットを予測する成功率に基づくルール選択、（６）予測グループに対する臨床および遺伝子因子間の関連性を評価するためにＲＴ-ＰＣＲデータおよびFisher正確確率検定を用いたルールバリデーションを用いた。
【０１０６】
更に正確には、異なる工程を次のように行なった：
１．遺伝子選択および２．遺伝子プローブセットフィルタリング：Ｓ１を用いて、我々は、マルチ検定（ＢＲＢ ArrayToolsv3.0.beta2）について補正するために、サンプルラベルの１０００順列に基づく多変量順列検定を用いるＦ検定を行なった。この検定から、１０未満の偽発見を含む１０４１プローブセットを得た。我々はＳ１における１８サンプル（グループ当たり三つのランダム選択ケース）のサブ選択で同様の検定を行い、５１５の有意なプローブセットを見つけた（ここでは、順列検定を信頼できないものにする低数のサンプル／クラスのせいで、閾値基準としてｐ値＜０．００１を用いた）。これら２リストの対比と、合計６のＨＣＣクラスタ群で１００単位未満の最大強度を有するプローブセットの選別により、２５８プローブセットを得た。同一ＨＵＧＯ遺伝子記号に相当するプローブセットについて、低Ｆ統計値を有するプローブセットを除外してリストを２２５プローブセットに減らすことにより、我々は１プローブセット／記号を守った。
【０１０７】
３．遺伝子のランダムサブ選択：（ｉ）２２５プローブセットリストから出発して、我々はｋ数のプローブセット（ｋ＝８..２５）の１０００サブリスト（合計で１８，０００のサブリスト）をランダムに作成した。（ii）２２５プローブセットリストから、個別遺伝子クラスタビンから同割合の遺伝子を選択することにより、我々はｋ数のプローブセットの１０００サブリスト（ｋ＝１５、３０、合計で２０００のサブリスト）を作成した。遺伝子クラスタビンは、２２５プローブセットの完全リンケージクラスタリングに基づき（距離メトリックとして１-Pearson係数を用い、１５クラスタノード（クラスタビンによるｎ＝４〜４９プローブセット）を得るように系統樹を切ることにより）構築した、(iii)我々は、平均リンケージクラスタリング（１-Pearson係数）から得られる遺伝子クラスタビンを等しく表し、系統樹を２０ノードに切り、（１０プローブセット未満または最隣接ノードと０．３より高い相関で表される）小さなクラスタノードを合わせると、合計で八つの大きな遺伝子クラスタビン（クラスタビンによるｎ＝９〜８７プローブセット）を生じる、ｋプローブセットの１０００サブリスト（ｋ＝８、１６、２４、合計で３０００のサブリスト）も作成した。
【０１０８】
４．ルールラーニング：プローブセットの２３，０００サブリストに制限された、セットＳ１からの発現データは、五つの予測アルゴリズム（ＳＶＭ（ｅ１０７１，ｖ１．４-１）、ＰＡＭ（ｐａｍｒ，ｖ１．１４．２）、ｋ-ＮＮ（クラス，ｖ７．２-２）、ＤＱＤＡおよびＤＬＤＡ（ｓｍａ，ｖ０．５．１４））をトレーニングして、１１５，０００プレディクターを得る上で役立った。
【０１０９】
５．ルール選択：各アルゴリズムについて、ｋの各値（（ｉ）ｋ＝８..２５、（ii）ｋ＝１５、３０、(iii)ｋ＝８、１６、２４）と組み合わせて、我々は、バリデーションセットサンプルを分類するために（トレーニングセットでトレーニングされた）、対応プレディクターの成功率に基づき、１０００の中で最良のサブリストを選択した（同等の場合には、出会う最初のサブリストが保存された）、この選択は１１５プレディクターを与えた。これらの中で、別々な６サブリストに関連した七つのプレディクターが、バリデーションセットからサンプルを分類する９３％より高い成功率を示した。我々はこれら６サブリストの中で２プレディクター（アルゴリズムＳＶＭおよびＰＡＭ）に関連した２４遺伝子サブリストを選択した。このサブリストは、トレーニングセットで３６サンプルの真のクラスメンバーシップを予測する上でNearest Shrunken Centroids（ＰＡＭ）を用いると９７％、およびバリデーショングループで２９サンプルの９３．１％の成功率を有したことを、我々は観察した。
【０１１０】
６．ルールバリデーション：ＲＴ-ＰＣＲデータが、Affymetrix ＨＧ-Ｕ１３３Ａ GeneChipマイクロアレイで既に解析された４６サンプル（オリジナルトレーニングセット（Ｓ１ａ）で２８およびオリジナルバリデーションセット（Ｓ２ａ）で１８ＨＣＣ）を含めた、一連の１０９腫瘍について、既に選択されたサブリストで２４遺伝子のうち２３について得られた（プライマーがＣＤ２４について入手できなかった）。セットＳ１ａでΔＣｔデータ（コントロール遺伝子として１８Ｓ）を用いて、我々は五つの予測アルゴリズム（ＳＶＭ、ＰＡＭ、ｋ-ＮＮ、ＤＱＤＡ、およびＤＬＤＡ）をトレーニングした：セットＳ２ａに適用すると、ＳＶＭから得られたプレディクターは８１％成功率（Ｓ１ａでは１００％）を示した。
【０１１１】
ＰＣＴデータプレディクター
AffymetrixデータからＰＣＲデータへ移された２４遺伝子プレディクターの部分的成功に基づき、ＱＲＴ-ＰＣＲで解析された１４０遺伝子の中で１０３遺伝子の初期リストからの工程を出発して、新たなプレディクターを捜した。これらの１０３遺伝子は、Affymetrixデータセットで全６５のサンプルを用いる、異なるクラスタ群を比較する管理統計学的検定に対応した。次いで、Affymetrixデータ：遺伝子のランダムサブ選択、ルールラーニング、ルール選択、ルールバリデーションにおいて記載されたものと同様のラーニング戦略に従った。ランダムに、リスト当たりｋ数のプローブセット（ｋ＝５..１６）の５００サブリスト（合計で６０００のサブリスト）を作成した。ΔＣｔデータ（コントロール遺伝子１８Ｓ）を用いて、五つの予測アルゴリズム（ＳＶＭ、ＰＡＭ、ｋＮＮ、ＤＱＤＡ、およびＤＬＤＡ）をセットＳ１でトレーニングし、３０，０００プレディクターを得た。各アルゴリズムについて、ｋの各値と組み合わせて、検定セットＳ２を分類するために（セットＳ１でトレーニングされた）対応プレディクターの成功率に基づき、５００の中で最良のサブリストを選択した（同等の場合には、出会う最初のサブリストが保存された）、この選択は６０プレディクターを与えた。これらの中で、検定セットＳ２を分類する上で、三つのプレディクターが最高の成功率を示し、そのうち一つは三つの異なるアルゴリズムで８８％より高い（Ｓ２の）成功率を示し、したがって最良とみなされた。このプレディクターはＤＬＤＡアルゴリズムで得られ、セットＳ１を１００％成功率およびセットＳ２を９４％成功率で予測した。選択プレディクターのバリデーションとして、セットＳ３に関する予測クラスの関連性を、予測クラス（１，２，３ vs ４，５，６）とＦＡＬ（Ｐ＝８．５ １０−４）並びに予測クラス（４ vs ５，６）とＣＴＮＮＢ１突然変異（Ｐ＝５ １０−５）との関連のレベルを測るFisher正確確率検定のＰ値から評価した。
【０１１２】
具体的ＨＣＣサブグループ示差的発現遺伝子の決定、それに続くＧＯ解析
１９，７８７プローブセットに関するｌｏｇ２-変換強度値でＢＲＢ ArrayTools（ｖ３．２ｂ５）を用いて、すべての単変量ｔおよびＦ検定を行なった。１０偽発見未満のＰ＜０．００１および９０％信頼の各単変量検定の名目有意レベルを、１０００順列を用いた多変量検定に基づき表した。所定サブグループ（またはサブグループの組合せ）と残りサンプル（Ｇｘ vs Ｇnon-ｘ）との間で並びに五つのプールされた非腫瘍サンプル（Ｇｘ vs 非腫瘍）間で示差的に発現されることがわかった遺伝子を特定するために、すべてのグループ間ｔ検定を行なった。所定サブグループ（他のグループ間比較ではない）について両検定タイプにより見つけられた、ＡＮＯＶＡ解析（前記のＦ検定）で有意（Ｐ＜０．００１，記載されたように１０偽発見未満）であった遺伝子は、ＨＣＣサブグループ（またはサブグループの組合せ）特異的遺伝子であるとみなされた。
【０１１３】
分類の安定性評価
摂動のために、ランダムGaussianノイズ（μ＝０，σ＝１．５ｘデータセットから計算された分散中央値）を所定のデータセットに加えた。各系統樹をｋグループ（ｋ＝２..１８）に区分し、初期系統樹と比較して各グループに置かれたサンプル-ペアの割合を安定性スコアとして用いた（１のスコアが摂動（またはリサンプリング）を意味する０〜１のスコア範囲は、クラスタ群のメンバーシップに影響を有しなかった）。
【０１１４】
２．２ 結果
非管理トランスクリプトーム解析は臨床および遺伝子改変と密接に関連した腫瘍のクラスタを規定する
Affymetrix ＨＧ-Ｕ１３３Ａ GeneChipアレイを用いて、５７ＨＣＣ、３肝細胞腺腫および５サンプルのプールされた非腫瘍組織を解析した。非管理解析に基づき、各々がFisher正確確率検定に基づく臨床的および遺伝的因子（前記の表１および２参照）と高度に関連した六つのサブグループ（図２）にＨＣＣ腫瘍を区分する、ＨＣＣ分類の頑健性モデルを我々は開発した。実施された解析に基づき、各々がより小さな三つのサブグループに更に細分される２大グループ（ここではＧ１〜Ｇ６と称される）に６０腫瘍サンプルを細分する。この分類は摂動／リサンプリング検定と照合したときに極めて頑健性であり（各クラスタ解析の平均再現性スコアは、二つの大きなグループおよび六つのサブグループについて少なくとも０．９であるとわかった）、反復ｋ-meansクラスタ解析と一致することを見出した（材料および方法の欄参照）。更に、サンプル区分のトポロジーは異なる遺伝子リストとクラスタリンケージ法にまたがり保存された。Ｇ１〜Ｇ３はＧ４〜Ｇ６より有意に高い断片的アレル損失（ＦＡＬ）を示したことから（Ｐ<１０−３，表２）、２大グループは染色体不安定（Ｇ１、Ｇ２、およびＧ３）および安定（Ｇ４、Ｇ５、およびＧ６）サンプルに相当する。加えて、Ｇ１〜Ｇ３グループに属するＨＣＣはＧ４〜Ｇ６のＨＣＣと比較して早い再発および早い死亡とやや関連していた（Ｐ＝０．０５，表２）。異なるサブグループが、低数のＨＢＶ ＤＮＡコピー（Ｇ１）およびＣＴＮＮＢ１遺伝子突然変異（Ｇ５およびＧ６）と共に、ＴＰ５３突然変異（Ｇ２およびＧ３）、ＨＢＶ感染（Ｇ１およびＧ２）で特徴づけられた。一次腫瘍から１ｃｍ以内で離れてみられる遠位癌性結節の存在は、Ｇ６と関連し（Ｐ＝０．０４，表２）、これら腫瘍の局部侵襲の高い可能性を示した。非腫瘍肝臓組織の５サンプルプールはしっかりと一緒にクラスタ化し、２０腫瘍を含む大きな異種グループ（Ｇ４）内でみられ、そのうち四つは同一小クラスタにおいてＴＣＦ１突然変異を有した（３腺腫および１ＨＣＣ）。
【０１１５】
六つのグループ分類の二つのプレディクターの特定
この分類のサブグループと診断ポテンシャルとで臨床的関連性があるとすれば、本発明者らの目的は、より時間およびコスト効率的な技術の定量的逆転写酵素ＰＣＲ（ＱＲＴ-ＰＣＲ）を用いることにより、臨床環境により適合したクラス-プレディクターを特定することであった。六つのＨＣＣサブグループへのクラスメンバーシップを予測しうる遺伝子を求めるために、最初にAffymetrixデータを用いてプレディクターを構築した（材料および方法と下記表１０参照）。この解析から、Affymetrixデータを用いるとクラス予測の高い成功率（９３．１％）を示すが、ＱＲＴ-ＰＣＲデータを用いたのではさほど満足しえない（８１％）ことが判明した、第一の２４遺伝子プレディクター（ＡＬＤＨ１Ｌ１、ＣＤ２４、ＣＤ７４、ＣＦＨＲ３、ＣＹＰ４Ｆ１２、ＤＮＡＪＡ３、ＤＳＣＲ１、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＢ４、ＦＡＡＨ、ＦＧＦＲ２、ＦＬＪ１０１５９、ＧＬＴ８Ｄ１、ＨＡＬ、ＭＡＴＮ２、ＭＲＰＳ７、ＰＡＫ２、ＰＬＸＮＢ１、ＲＡＢ１Ａ、ＲＨＯＱ、ＳＬＣ２７Ａ５、ＳＬＰＩ、ＳＭＡＲＣＥ１、ＳＴＲＡ１３）を特定した。
【０１１６】
【表１０】
【０１１７】
こうして、Affymetrixデータと関連臨床および遺伝子アノテーション（即ち、ＴＰ５３、ＣＴＮＮＢ１、およびＡＸＩＮ１遺伝子の突然変異状態、ＨＢＶの存在および力価、早期再発および全生存）を用いた一連の管理検定を行なった。これら管理検定のうち一以上で有意であることが示された１４０遺伝子のリストを作成した。これら選択遺伝子のうち五つ以外はすべて、１０９ＨＣＣ腫瘍（Affymetrixマイクロアレイを用いて解析された５７ＨＣＣのうち４６と６３ＨＣＣのバリデーションセットを含む）および２１非腫瘍肝臓組織でＱＲＴ-ＰＣＲにより確証された。AffymetrixデータとＱＲＴ-ＰＣＲデータとの高い相関が１４０選択遺伝子のうち１３５において見られた（ΔＣｔ値を用いると０．８４のSpearmanのρメジアン相関係数）。ＱＲＴ-ＰＣＲデータを用いて、（検定された１３５のうち）１０３遺伝子のセブセットの多数サブリストについて、六つのＨＣＣサブグループの最良総合プレディクターを特定するために遺伝子検定した。この目的のため、Affymetrixマイクロアレイで解析された４６ＨＣＣをトレーニング（ｎ＝２８）および検定セット（ｎ＝１８）に分けた。既に記載された表３において掲載されたすべての遺伝子はこれら管理検定のうち１以上で有意であることが少なくとも示され、それらのほとんどが少なくとも１または２の良い分類プレディクターに存在していた。トレーニングセット（１００％）および検定セット（９４．４％）の真のクラスメンバーシップを予測する最良成功率が、ＤＬＤＡ予測アルゴリズムを用いて１６遺伝子（ＲＡＢ１Ａ、ＰＡＰ、ＮＲＡＳ、ＲＡＭＰ３、ＭＥＲＴＫ、ＰＩＲ、ＥＰＨＡ１、ＬＡＭＡ３、Ｇ０Ｓ２、ＨＮ１、ＰＡＫ２、ＡＦＰ、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＤＨ２、ＨＡＭＰ、ＳＡＥ１）のＣｔ値で得られた。
【０１１８】
最良プレディクターは下記式に従う：
【数９】
上記式中
【数１０】
上記式中、異なるμ（クラスｋ，遺伝子ｔ）およびσ（遺伝子ｔ）パラメーターは既に記載された表５において掲載されたものである。
【０１１９】
こうして、所定サンプルと各クラスのセントロイド表現との距離を計算した後、新たなサンプルが最も近いクラスにおかれる。
【０１２０】
次いで、バリデーション腫瘍セットの６３サンプルを六つのサブグループに区分するために、このシグネチャーを用いた。Affymetrix実験で解析された第一セットの腫瘍で観察されるように、有意な関連性が、Fisher正確確率検定を用いると、ＦＡＬ、ＴＰ５３、ＨＢＶ感染、およびＣＴＮＮＢ１遺伝子突然変異と異なる予測サブグループとの間で、並びに１０９ＨＣＣ腫瘍の完全シリーズを用いたもので見られた（表１）。
【０１２１】
各ＨＣＣサブグループに関与する遺伝子のキーシグナリング経路および機能性カテゴリーの特定
異なるＨＣＣサブグループに関与するキー経路を特定するために、一以上のＨＣＣサブグループで特に脱調節される１５６０遺伝子が、ＡＮＯＶＡと組み合わされた全グループ式ｔ検定解析からの結果に基づき特定された。ＨＣＣサブグループに特異的な遺伝子の全リストについて、既知経路における遺伝子の関連性も調べた。染色体不安定サンプルに相当する、サブグループＧ１〜Ｇ３で特に過剰発現される細胞周期／増殖／ＤＮＡ代謝遺伝子の豊富化が観察された（Ｐ＜０．０１）。特に過剰発現される高数の遺伝子がＧ１サブグループ（低数のウイルスＤＮＡにおけるＨＢＶ感染、ＡＸＩＮ１突然変異、若年齢、高血清レベルのＡＦＰおよび頻出アフリカ起源と関連，表１および２）で観察された。それらの中で、発生に際して発現されるタンパク質をコードする遺伝子が見出された：ミオシン重鎖IIｂ、ＭＹＨ４、転写因子ＳＯＸ９およびＳＯＸ４、ならびに親性刷込み遺伝子：インスリン様成長因子２（ＩＧＦ２）、父系発現１、３、および１０（ＰＥＧ１、ＰＥＧ３、およびＰＥＧ１０）、α-フェトプロテイン（ＡＦＰ）およびサルコグリカンε（ＳＧＣＥ）。これらすべての遺伝子の差異的発現が、１０９腫瘍においてＱＲＴ-ＰＣＲを用いて確証された（図３ａ）。検定された刷込み遺伝子は正常胎児肝臓で高度に過剰発現された（図３ａ）。Ｈ１９ ｍＲＮＡもＧ１サンプルのみならず胎児サンプルでも過剰発現され、これら２グループにおいてＩＧＦ２と相関していた（各々Ｒ２＝０．４および０．６）。
【０１２２】
サブグループＧ２腫瘍（高数のウイルスＤＮＡコピーにおけるＨＢＶ感染、頻出局部および血管侵襲およびＴＰ５３突然変異と関連）は、過剰発現される細胞周期／増殖／ＤＮＡ代謝遺伝子（Ｐ＜０．０１）、Ｇ３（ＴＰ５３突然変異およびＣＤＫＮ２Ａプロモーターメチル化と関連）、およびすべての染色体不安定サンプルにおいて等しく観察される豊富化（Ｐ＜０．００７）と有意に関連していた。タンパク質リン酸化に関与する過剰発現遺伝子の有意な過剰提示も確認された（Ｐ＜０．００９）。興味深いことに、ホスファチジルイノシトール３-キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）-ＡＫＴ経路の活性化につながると予測されたＰＩＫ３ＣＡ遺伝子における突然変異が、Ｇ２に属する二つの腫瘍において確認された。これら二つのサンプルは非管理クラスタリング解析で密接に関連していた（図２）。ＰＩＫ３ＣＡ突然変異サンプルにおいて、特に過剰発現される３８遺伝子が、グループＧ１〜Ｇ３において他の腫瘍と比較して特定された。これら遺伝子の中では、ＱＲＴ-ＰＣＲを用いてＰＩＫ３ＣＡ突然変異腫瘍で特に過剰発現される（Ｐ=０．００１，図３ｂ）、タンパク質延長因子ＥＥＦ１Ａ２およびエンテロキナーゼＰＲＳＳ７についてコードする二つの遺伝子の過剰発現が確証された。更に、ＰＩＫ３ＣＡ突然変異腫瘍における細胞間連絡遺伝子の豊富化をＧＯ解析により証明した（Ｐ＝０．０７）。
【０１２３】
Ｇ５（ＣＴＮＮＢ１突然変異、非遠位結節）において、ＩＦＩ１６、ＩＬ４Ｒ、ＩＦＩ４４、ＳＴＡＴ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＣＴＳＳ、およびＨＬＡ-ＤＰＡ１／Ｂ１のようなストレスおよび免疫応答に関与する過少発現遺伝子の豊富化（Ｐ＜０．００２）が観察された。ＨＣＣサブグループＧ５およびＧ６は、前記場合の７０および１００％でＣＴＮＮＢ１突然変異された２３および１１腫瘍を各々含む。可能なβ-カテニン標的遺伝子のサーチにおいて、Ｇ５およびＧ６で有意に過剰発現される２８０遺伝子のリストが見出された。ＧＰＲ４９およびＧＬＵＬに加えて、肝臓における二つの既知β-カテニン標的遺伝子、（Cadoret,A.et al.Oncogene 21,8293-301(2002)、Yamamoto,Y.et al.Hepatology 37,528-33(2003)）、７推定β-カテニン標的遺伝子の過剰発現がＱＲＴ-ＰＣＲを用いて確認された。これらの遺伝子には、ＥＰＨＢ２，チロシンキナーゼレセプター、ＭＭＥ，エンケファリナーゼ ＣＤ１０、ＭＥＲＴＫ，癌遺伝子チロシンキナーゼ、ＬＡＭＡ３，ラミニン５のα-３鎖、ＰＡＰ／ＨＩＰ，膵炎関連タンパク質をコードする、ＳＰＡＲＣＬ１，細胞外マトリックスと関連したヘビンをコードする、および転写因子ＴＢＸ３を含む（図４ａ）。これらすべての推定β-カテニン標的遺伝子の発現の有意に高いレベルが、ＣＴＮＮＢ１突然変異のないサンプルの除外後であっても、Ｇ５と比較してＧ６において観察された。形質膜におけるシグナルの消失と細胞質および核における強い局在化と共に、β-カテニンがＧ５腫瘍と比較してＧ６腫瘍で多く過剰発現されることも示された（図４ｂ）。この観察と一致して、β-カテニンと相互作用してＷｎｔ応答性標的遺伝子を活性化する転写因子、ＬＥＦ１の過剰発現が、Ｇ６において見出された。Ｇ５およびＧ６サブグループ双方は染色体８ｐ ＬＯＨと関連していたが、Ｇ６に特有な他の染色体欠損は確認されなかった。しかしながら、主腫瘍の周辺でみられる衛星結節の準常在(quasi-constant presence)により示されるようなこれらＨＣＣの局部侵襲の原因となりうる、ＣＤＨ１（Ｅ-カドヘリンをコードする）の過少発現が、（AffymetrixおよびＱＲＴ-ＰＣＲ実験において、図４ａ）Ｇ６サブグループにおいて見られた（図４ｃと表１および２）。ＣＤＨ１ ｍＲＮＡ下方調節のレベルは、これら腫瘍においてＣＤＨ１のプロモーターメチル化の高レベルと一致する、Ｇ６におけるＥ-カドヘリンタンパク質の下方調節発現と高度に関連していることが示された（データ示さず）。
【０１２４】
２．３結論
非管理ゲノムワイドアプローチを用いて、本発明者らは、これら腫瘍の大きな自然多様性を反映する、六つの主要サブグループにおけるＨＣＣの頑健性分類を得た（Bosch.F.X.,et al.Gastroenterology 127,S5-S16(2004)、El-Serag,H.B.Gastroenterology 127,S27-34(2004)）。加えて、この分類はＱＲＴ-ＰＣＲで解析された１６遺伝子のみを用いて再現でき、更に重要なことに、腫瘍の独立セットにおいて確認された。
【０１２５】
この分類は、染色体安定性に関連した腫瘍の二つの主なグループ（メタグループＧ１〜Ｇ３およびＧ４〜Ｇ６に相当する）について記載した、ＨＣＣの既公開解析と一致する（Lee,J.S.et al.Hepatology 40,667-76(2004)、Breuhahn,K.et al.Cancer Res 64,6058-64(2004)、Chen,X.et al.Mol Biol Cell 13, 1929-39(2002)）。しかしながら、本解析により、この分類を拡張および精密化した。
【０１２６】
要約すると、（１）フランスで外科治療された腫瘍の一連の研究が、ＨＣＣの異なる主な危険因子、即ちＨＢＶおよびＨＣＶ感染、アルコール乱飲およびヘモクロマトーシスを含んでいたこと、および（２）研究サンプル群で利用しうる多数の臨床、組織病理学的および遺伝子アノテーションにより、二つサブグループへの既公開分類と比較して、ＨＣＣの多面的分類の解明は本願のみで可能であった、と本発明者らは考える。実際に、クラスメンバーシップの主な臨床決定因子はＨＢＶ感染であり、一方他の主決定因子は染色体不安定性、ＴＰ５３およびＣＴＮＮＢ１突然変異、ＣＤＫＮ２ＡおよびＣＤＨ１メチル化と親の刷込み(parental imprinting)を含めた遺伝的および非遺伝的変化である（図１参照）。
【０１２７】
ＨＣＣの自然史に焦点を当てると、Ｇ１およびＧ２サブグループを規定するＨＢＶ関連腫瘍は他の病因から明らかに分子的に区別されるようである。ＨＣＶ感染およびアルコール乱飲に関連する腫瘍はサブグループＧ３〜Ｇ６内に配分される。本トランスクリプトーム分類は腫瘍の新実体の特定化を可能にした。サブグループＧ１は、等しい性別比、低数のウイルスＤＮＡコピー、頻出ＡＸＩＮ１突然変異、ＴＰ５３突然変異の非存在、および正常に親に刷込みされた遺伝子の過剰発現と共に、若年患者（他のＨＢＶ ＨＣＣと比較して）、多くはアフリカからのＨＢＶ関連腫瘍を含む。早い年齢におけるＨＢＶ感染が、おそらく胎児肝細胞の永続性または成人肝細胞の脱分化による異常親性遺伝子刷込みで未成熟特徴を示すＨＣＣの特別な型に至ることを、これらの結果は示唆している。腫瘍におけるこのような多様性は、疫学研究でみられる高リスク群と関連しているかもしれない（Brechot,C.Gastroenterology 127,S56-61(2004)、Yu,M.C. & Yuan,J.M.Gastroenterology 127,S72-8(2004)）。
【０１２８】
ＣＴＮＮＢ１突然変異の１００％発生率、高レベルの病理学的Ｗｎｔ経路活性化（Ｇ５の場合より高い）およびＥ-カドヘリンの不活性化（kozyraki,R.et al.Gastroenterology 110,1137-49(1996)）を有するサブグループＧ６は、Ｅ-カドヘリン不活性化が細胞侵襲工程に関与することが知られていることから（Behrens,J.,et al.J Cell Biol 108,2435-47(1989)）、これら腫瘍の高侵襲ポテンシャルと一致する。
【０１２９】
腫瘍のこれら大きなサブグループとは別に、本トランスクリプトーム解析は、ＴＣＦ１またはＰＩＫ３ＣＡ突然変異のような希少遺伝子改変と関連した、腫瘍の同種サブグループも示唆した（Bluteau,O.et al.Nat Genet 32,312-5(2002)、Lee,J.W.et al.Oncogene 24,1477-80(2005)）。腫瘍の他の小さな同種サブグループに特有の新たな構造遺伝子改変がなおも特定され続けており、逆にこれは新治療標的を見出す強力な手段となりうる。
【０１３０】
実施例３：ＨＣＣ腫瘍の予後
３．１ 材料および方法
定量的ＲＴ-ＰＣＲ解析
実施例２の材料および方法の項目において記載されているように、定量的ＲＴ-ＰＣＲ解析を行った。
【０１３１】
予後プレディクターの構築
Affymetrix GeneChipで解析された一連の４２サンプルから１３５遺伝子の２−ΔＣｔ値（ΔＣｔ＝Ｃｔ検定−ＣｔＲ１８Ｓ）に基づき、予後状態（６０ヶ月における総合生存）と関連するトップ１６遺伝子（最大ｌｏｇｒａｎｋ Ｐ≦１０−２）が単変量Ｃｏｘモデル（パッケージ生存Ｖ２．１５）を用いて特定された。同４２サンプルを用いて、これら１６遺伝子の中で５遺伝子以下の最良組合せ（最大ｌｏｇｒａｎｋ Ｐ＜１０−５）が全可能組合せから多変量Ｃｏｘモデルを用いて選択された。次いで、これらのモデルを確証するために第二シリーズの５３独立ＨＣＣを用い（最大ｌｏｇｒａｎｋ Ｐ＜１０−３）、それらのうち４２を留保した。各モデルの頑健性が更に下記リサンプリングアプローチにより評価された：我々は１０００回にわたりランダムに９５腫瘍の全シリーズを各４７および４８サンプルの二群へ分ける（両グループ間で死亡事象の数を均衡させる）ことにより１０００サンプリングを得て、次いで、遺伝子の４２リストの各々を用いて、各サンプリングの両群について、多変量Ｃｏｘモデルを構築し、両モデルから計算されたｌｏｇｒａｎｋ Ｐ値を留置した。（これら１０００サンプリングの中で）両グループで最低中央値ｌｏｇｒａｎｋ Ｐに至る遺伝子の組合せを保存し、次いでプレディクターをこの組合せから得た。
【０１３２】
３．２ 結果
予後を予測する遺伝子の特定およびバリデーション
診断には有用であるが、１６遺伝子分類シグネチャー（実施例２参照）は、腫瘍の二つの主なグループ（Ｇ１〜Ｇ３ vs Ｇ４〜Ｇ６）または個別的な六つのサブグループを各々検定した場合、ログランク検定が（Ｐ＝０．２および０．１）の高いｐ値を生じたことから、ＨＣＣ予後を予測する上で十分でなかった。結果として、予後の特定プレディクターが材料および方法の項目において記載されたように構築された。
【０１３３】
全体として、総合生存および／または非再発生存の予後判定に有用であると見出された遺伝子は前記表７に掲載されたものであった。
【０１３４】
更に正確には、総合生存の予後状態と関連するトップ１６遺伝子は：ＮＲＣＡＭ、ＰＩＲ、ＲＡＭＰ３、ＳＬＣ２１Ａ２、ＴＡＦ９、ＴＮＡ、ＨＮ１、ＰＳＭＤ１、ＭＲＰＳ７、ＣＤＣ２０、ＥＮＯ１、ＨＬＦ、ＳＴＲＡ１３、ＲＡＧＤ、ＮＲＡＳ、ＡＲＦＧＥＦ２である、と決定された。
【０１３５】
材料および方法で記載されたようなこれら１６遺伝子の中で５遺伝子以下の全可能組合せの検定後、五つのベストモデルがＰ＜１０−８で多変量Ｃｏｘ解析を用いて総合生存を予測した。最後に、悪い結果を予測する最も有用な組合せは、５遺伝子：高レベルのＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、ＰＳＭＤ１、およびＡＲＦＧＥＦ２と組み合わされた低レベルのＲＡＭＰ３の集合である。
【０１３６】
最良な総合生存プレディクターは下記式に従う：
【数１１】
上記式中、異なるβ（遺伝子ｔ）およびμ（遺伝子ｔ）パラメーターは下記表１１において掲載されたものである。
【０１３７】
【表１１】
【０１３８】
ＲＯＣ曲線、スコア曲線、および生存曲線における総合生存の最良プレディクターに関する結果が図５ａにおいて示され、一方、総合生存のこの最良プレディクターに関する統計値が下記表１２において掲載されている。
【０１３９】
【表１２】
【０１４０】
５３ＨＣＣバリデーションセットにおいて、遺伝子のこの組合せはケースの７９％において早期再発を正確に予測した（（＋）７０％，（−）８９％）、そして早期死亡はケースの８１％において正確に予測された（（＋）７３％，（−）９２％）。臨床および形態学的特徴の中では、Edmondsonグレードおよび血管侵襲が悪い予後と有意に関連していた（各々ｌｏｇｒａｎｋ Ｐ＜０．０４および０．０００２）。これら二つの変数、さらに最良総合生存プレディクターを含む多変量Ｃｏｘモデルを行なった（下記表１３参照）。このモデルは、我々の遺伝子組合せが独立予後変数であることを示す。
【０１４１】
【表１３】
【０１４２】
無疾患生存を予測する遺伝子の組合せを見つけるために同様の戦略を適用した。興味深いことに、トップ１６遺伝子（ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、ＥＮＯ１、ＲＡＢ１Ａ、ＡＲＦＧＥＦ２、Ｇ０Ｓ２、ＰＳＭＤ１、ＭＲＰＳ７、ＲＡＧＤ、ＨＮ１、ＰＩＲ、ＳＭＡＤ３、ＤＮＡＪＡ３、ＨＥＬＯ１、ＲＡＭＰ３、ＲＨＯＱ）の中で、１０は単変量Ｃｏｘモデルを用いた全生存の最良プレディクターとして既に特定されていた。最後に、無疾患生存の最良プレディクターに含まれる全部で三つの遺伝子も、全生存の最良プレディクターに含まれた。
【０１４３】
最良非再発生存（または無疾患）プレディクターは下記式に従う：
【数１２】
上記式中、異なるβ（遺伝子ｔ）およびμ（遺伝子ｔ）パラメーターは下記表１４において掲載されたものである。
【０１４４】
【表１４】
【０１４５】
ＲＯＣ曲線、スコア曲線、および生存曲線における総合生存の最良プレディクターに関する結果が図５ｂにおいて示され、一方総合生存のこの最良プレディクターに関する統計値が下記表１５において掲載される。
【０１４６】
【表１５】
【０１４７】
３．３ 結論
トランスクリプトーム分類の解明は臨床適用上、特に興味深い。特に、グループＧ１〜Ｇ３に属するＨＣＣはＧ４〜Ｇ６のＨＣＣと比較して早い再発および早い死亡とやや関連し、分類と予後がともかく関連することを示す可能性がある。
【０１４８】
しかしながら、本発明者らは、完全外科切除により治療された患者の予後を予測する上で、約５遺伝子の小さな特定サブセットを用いた場合が、総合分類１６-遺伝子シグネチャーを用いた場合よりも優れていることを見出した。既に公開されたトランスクリプトーム解析と対照的に、決定された生存プレディクターの性能が全病因の危険因子を含む第二セットの独立腫瘍において実証され、このようなバリデーションがハイブリダイゼーションデータの代わりにＱＲＴ-ＰＣＲを用いて行なわれた（Lee,J.S.et al.Hepatology 40,667-76(2004)、Ye,Q.H.et al.Nat Med 9,416-23(2003)、Iizuka,N.et al.Lancet 361,923-9(2003)、Kurokawa,Y.et al.J Hepatol 41,284-91(2004)）。
【０１４９】
生存を予測する上で有用であると本願において特定された遺伝子は患者予後と関連していることがこれまでに見出されておらず、それらはタンパク質のプロテアソーム分解（ＰＳＭＤ１，Yokota,K.et al.Mol Biol Cell 7,853-70(1996)参照）、ＲＮＡ転写の開始（ＴＡＦ９，Michel,B.,Komarnitsky,P.& Buratowski,S.Mol Cell 2,663-73(1998)参照）、および細胞増殖（ＮＲＣＡＭ，Sehgal,A.et al.Anticancer Res 19,4947-53(1999)参照）ならびにＡＲＦＧＥＦ２（Sheen,V.L.et al.Nat Genet 36,69-76(2004)参照）のような一般的な細胞工程に関与しているようである。
【０１５０】
興味深いことに、総合生存および無疾患生存（即ち、非再発生存）を予測する遺伝子の最良の組合せは、決定されたプレディクターが非腫瘍関連肝疾患とかかわりなく腫瘍進行を正確に反映することを証明するこの研究において、非常に類似していた。
【０１５１】
治療選択に際するこれらマーカーの潜在的有用性を評価するために、肝臓移植または高周波により治療された患者において、これらのプレディクターを評価することも、非常に興味深いであろう。
【０１５２】
結論として、本総合トランスクリプトーム解析は大シリーズの高度アノテーション腫瘍を用いて実施され、そして確証された。この解析は、腫瘍進行に際して蓄積されるヒトＨＣＣの自然多様性、構造遺伝子改変、および非遺伝的脱調節を反映する頑健性分類を確立した。ＨＣＣ腫瘍の高い多様性は臨床的含意を有し、本分類は、外科治療患者のためのみならず、標的療法に有利な患者を更に特定するためにも、予後判定手段をもたらしたのである。
【０１５３】
参考文献
【図面の簡単な説明】
【０１５４】
【図１】関連する臨床、遺伝子および経路においてトランスクリプトーム解析により規定された異なるＨＣＣサブグループの体系図。 Ｇ１〜Ｇ６は、トランスクリプトーム解析により規定された腫瘍のＨＣＣサブグループを示す。縦線は重要な関連特徴を示す（表１参照）。ＬＯＨ（ヘテロ接合性の喪失）、Hemochrom（ヘモクロマトーシス）、ＡＦＰ（α-フェトプロテイン）、ＨＢＶ（Ｂ型肝炎ウイルス）。実線および点線部分の用語は、主として、その特定機能カテゴリーにおける過剰および過少発現遺伝子を各々示す。
【図２】非管理階層クラスタリング 示された系統樹は、Wardのリンケージおよび１-Pearson相関係数を用いて、５７ＨＣＣ腫瘍、３腺腫、および５プールの非腫瘍組織からのAffymetrixデータの６７１２プローブセットの発現プロファイルに基づき得られた。臨床的および遺伝的特徴は、陽性および陰性の場合、各々黒ボックスおよび白ボックスにより示される。ＨＢＶ感染の場合、灰色ボックスは低数のウイルスＤＮＡコピーを示す。ＦＡＬはFractional Allelic Lossを示す（黒は５より多い染色体アームの欠損を含む腫瘍を示す（ＦＡＬ＞０．１２８））。他の略語は次の通りである：ＣＴＮＮＢ１（β-カテニン遺伝子）、Ｍｕｔ（突然変異）、ｍｅｔｈ（メチル化）、sat.nodule（主腫瘍から１ｃｍ以内の衛星結節）、ＡＦＰ（α-フェトプロテイン）、ＣＤＨ１（Ｅ-カドヘリン遺伝子）、portal.inv.（門脈侵襲）。
【図３ａ】ＱＲＴ-ＰＣＲを用いた選択数のＨＣＣサブグループＧ１特定遺伝子の特徴化 ａ．ＨＣＣ予測サブグループＧ１において特に過剰発現される遺伝子のバリデーション。ＩＧＦ２（インスリン成長因子２）、ＡＦＰ（αフェトプロテイン）、ＳＯＸ９（性決定領域Ｙ-ｂｏｘ９）、ＭＹＨ４（ミオシン重鎖IIｂ）、ＰＥＧ１およびＰＥＧ３（父系発現１および３）が１０９ＨＣＣにより解析された。ボックス-プロットは、六つの予測サブグループ（Ｇ１〜Ｇ６）の各々、２１非腫瘍サンプル（ＮＴ）、および１９胎児肝臓サンプル（ＦＬ）において、表示遺伝子について得られた相対（腫瘍 vs ２１非腫瘍の平均（Ｔ／ＮＴ））ｌｏｇ１０発現値の範囲を示す（中央値（第５０百分位数）の線を挟んで第２５百分位数から第７５百分位数まで伸びる）。最高値および最低値を示すために、ひげ線がボックスの上下に伸びている。異なるＨＣＣサブグループにおいて発現値を比較したＡＮＯＶＡ検定からのＰ値が遺伝子記号の下に示される。
【図３ｂ】ＱＲＴ-ＰＣＲを用いた選択数のＨＣＣサブグループＧ１特定遺伝子の特徴化 ｂ．ＥＥＦ１Ａ２（真核細胞翻訳延長因子１α）およびＰＲＳＳ７（エンテロキナーゼ前駆体）について、１０７非突然変異ＨＣＣ（ＰＩＫ３ＣＡ ＮＭ）と比較して、ＰＩＫ３ＣＡ突然変異腫瘍（ＰＩＫ３ＣＡ ｍｕｔ）において過剰発現される遺伝子のバリデーション。突然変異および非突然変異サンプルを比較するｔ検定から得られたＰ値が遺伝子記号の下に示される。
【図４ａ】Ｇ５およびＧ６サブグループへ至るＨＣＣ腫瘍の特徴化 ａ．ＱＲＴ-ＰＣＲを用いたＨＣＣ予測サブグループＧ５およびＧ６において、特に過剰発現される遺伝子のバリデーション。ボックス-プロットは、図３において示されたような１０９ＨＣＣサンプルで解析されたＧＬＵＬ（グルタミンシンターゼ）、ＴＢＸ３（転写因子ＴＢＸ３）、ＭＭＥ（膜メタロペプチダーゼ，ＣＤ１０）、ＬＡＭＡ３（ラミニン５のα-３鎖）、ＳＰＡＲＣＬ１（ヘビン）、ＭＥＲＴＫ（ｃ‐ｍｅｒプロト癌遺伝子チロシンキナーゼ）、ＰＡＰ（膵炎関連タンパク質）、ＥＰＨＢ２（エフリンレセプターＢ２）、ＬＥＦ１（リンパ系エンハンサー結合因子１）、およびＣＤＨ１（Ｅ-カドヘリン）について得られた相対（腫瘍 vs 非腫瘍の平均（Ｔ／ＮＴ））ｌｏｇ１０発現値の範囲を示す。
【図４ｂ】Ｇ５およびＧ６サブグループへ至るＨＣＣ腫瘍の特徴化 ｂ．β-カテニンについて突然変異されてＧ５およびＧ６へ至るＨＣＣの代表的ケースにおけるβ-カテニン免疫染色。ケースＨＣＣ３０３（Ｇ５）においては、少数の染色核と形質膜（白矢印）の濃い染色に注目。ケースＨＣＣ３０５（Ｇ６）においては、形質膜でシグナルなしに、肝細胞の細胞質および核が濃く染色される（黒矢印）。
【図４ｃ】Ｇ５およびＧ６サブグループへ至るＨＣＣ腫瘍の特徴化 ｃ．ＱＲＴ-ＰＣＲ（下側パネル）を用いた発現のｍＲＮＡレベル（グループＧ５およびＧ６）と比較した、ウエスタンブロット（上側パネル）を用いたＧ６のＨＣＣにおけるＥ-カドヘリンのタンパク質発現。
【図５ａ】生存のプレディクター ａ．全生存最良プレディクターに関する結果が示される。ＲＯＣ曲線は異なるスコア閾値における特異性および感受性を表す。丸印はトレーニングセット（ｎ＝４２）、×印はバリデーションセット（ｎ＝５３）に相当する。四角丸印および×印は、選択閾値（−０．３９３）で得られた感受性および特異性を示す。トレーニングセットサンプルの“予測クラス／真のクラス”分割表においてFisher正確確率検定に基づく最大成功率および最小Ｐ値を有するように、閾値が選択された。スコア曲線は表１１のパラメーターにより実施例３．２において記載された総合生存スコア式からトレーニングセット（上側曲線）およびバリデーションセット（下側曲線）で得られたスコアを示し、一方点線は選択された閾値スコアを示す。水平ストロークは生存患者を表し、一方垂直ストロークは死亡患者を表す。トレーニングセット（点線）およびバリデーションセット（実線）の生存曲線は、表示スコア閾値により階層化される。
【図５ｂ】生存のプレディクター ｂ．最良無疾患生存プレディクターに関する結果を示す。図５ａの場合と同様の表示コードが用いられる。スコア曲線は、表１４のパラメーターにより実施例３．２において記載された無疾患スコア式から得られたスコアを示す。水平ストロークは無疾患患者を表し、一方垂直ストロークは非無疾患患者を表す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ＲＡＢ１Ａ、ＲＥＧ３Ａ、ＮＲＡＳ、ＲＡＭＰ３、ＭＥＲＴＫ、ＰＩＲ、ＥＰＨＡ１、ＬＡＭＡ３、Ｇ０Ｓ２、ＨＮ１、ＰＡＫ２、ＡＦＰ、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＤＨ２、ＨＡＭＰ、ＳＡＥ１、ＡＤＨ６、ＤＣＮ、ＦＬＪ１０１５９、ＡＬＤＨ１Ｌ１、ＩＧＦ１、ＬＥＣＴ２、ＳＬＣ３８Ａ１、ＳＰＡＲＣＬ１、ＣＴＮＮＡ２、ＧＬＵＬ、ＬＥＦ１、ＭＡＴＮ２、ＭＭＥ、ＰＦＮ２、ＳＰＩＮＴ２、ＴＢＸ３、およびＦＧＦＲ２からなる群より選択される少なくとも８遺伝子の組合せを含んでなる、またはこれらからなる発現プロファイルを決定し、
ｂ）該発現プロファイルから六つのサブグループの距離を計算し、そして
ｃ）サブグループの距離が最短であるサブグループにＨＣＣ腫瘍を分類する
ことを含んでなり、
ここで六つのサブグループＧ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５、およびＧ６が、表２において記載されたそれらの臨床的および遺伝的特徴により規定される、ＨＣＣに罹患した対象の肝臓ＨＣＣサンプルからの六つのサブグループ間における、ＨＣＣ腫瘍のインビトロ分類の方法。
【請求項２】
前記発現プロファイルが、次の１６遺伝子組合せ：ＲＡＢ１Ａ、ＲＥＧ３Ａ、ＮＲＡＳ、ＲＡＭＰ３、ＭＥＲＴＫ、ＰＩＲ、ＥＰＨＡ１、ＬＡＭＡ３、Ｇ０Ｓ２、ＨＮ１、ＰＡＫ２、ＡＦＰ、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＤＨ２、ＨＡＭＰ、およびＳＡＥ１を含んでなる、またはこれらからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記発現プロファイルが定量的ＰＣＲを用いて核酸レベルにおいて決定される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記発現プロファイルが次の１６遺伝子組合せ：ＲＡＢ１Ａ、ＲＥＧ３Ａ、ＮＲＡＳ、ＲＡＭＰ３、ＭＥＲＴＫ、ＰＩＲ、ＥＰＨＡ１、ＬＡＭＡ３、Ｇ０Ｓ２、ＨＮ１、ＰＡＫ２、ＡＦＰ、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＤＨ２、ＨＡＭＰ、およびＳＡＥ１からなり、クラスｋまでのサンプルｉの各距離が下記式を用いて計算される、請求項３に記載の方法：
【数１】
（上記式中、各遺伝子ｔおよびクラスｋについて、μ（クラスｋ，遺伝子ｔ）およびσ（遺伝子ｔ）値は表５において示された値から１０％の区間内にある）。
【請求項５】
ｄ）ＡＬＤＨ１Ｌ１、ＣＤ２４、ＣＤ７４、ＣＦＨＲ３、ＣＹＰ４Ｆ１２、ＤＮＡＪＡ３、ＤＳＣＲ１、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＢ４、ＦＡＡＨ、ＦＧＦＲ２、ＦＬＪ１０１５９、ＧＬＴ８Ｄ１、ＨＡＬ、ＭＡＴＮ２、ＭＲＰＳ７、ＰＡＫ２、ＰＬＸＮＢ１、ＲＡＢ１Ａ、ＲＨＯＱ、ＳＬＣ２７Ａ５、ＳＬＰＩ、ＳＭＡＲＣＥ１、ＳＴＲＡ１３からなる群より選択される少なくとも８遺伝子の組合せを含んでなる、またはこれらからなる発現プロファイルを決定し、
ｅ）該発現プロファイルから六つのサブグループの距離を計算し、そして
ｆ）サブグループの距離が最短であるサブグループに前記ＨＣＣ腫瘍を分類する
ことを含んでなり、
ここで六つのサブグループＧ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５、およびＧ６が、表２において記載されたそれらの臨床的および遺伝的特徴により規定される、ＨＣＣに罹患した対象の肝臓ＨＣＣサンプルからの六つのサブグループ間における、ＨＣＣ腫瘍のインビトロ分類の方法。
【請求項６】
前記発現プロファイルが、次の２４遺伝子組合せ：ＡＬＤＨ１Ｌ１、ＣＤ２４、ＣＤ７４、ＣＦＨＲ３、ＣＹＰ４Ｆ１２、ＤＮＡＪＡ３、ＤＳＣＲ１、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＢ４、ＦＡＡＨ、ＦＧＦＲ２、ＦＬＪ１０１５９、ＧＬＴ８Ｄ１、ＨＡＬ、ＭＡＴＮ２、ＭＲＰＳ７、ＰＡＫ２、ＰＬＸＮＢ１、ＲＡＢ１Ａ、ＲＨＯＱ、ＳＬＣ２７Ａ５、ＳＬＰＩ、ＳＭＡＲＣＥ１、ＳＴＲＡ１３を含んでなる、またはそれらからなる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記発現プロファイルが核酸マイクロアレイを用いて核酸レベルにおいて決定される、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
前記発現プロファイルが次の２４遺伝子の組合せ：ＡＬＤＨ１Ｌ１、ＣＤ２４、ＣＤ７４、ＣＦＨＲ３、ＣＹＰ４Ｆ１２、ＤＮＡＪＡ３、ＤＳＣＲ１、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＢ４、ＦＡＡＨ、ＦＧＦＲ２、ＦＬＪ１０１５９、ＧＬＴ８Ｄ１、ＨＡＬ、ＭＡＴＮ２、ＭＲＰＳ７、ＰＡＫ２、ＰＬＸＮＢ１、ＲＡＢ１Ａ、ＲＨＯＱ、ＳＬＣ２７Ａ５、ＳＬＰＩ、ＳＭＡＲＣＥ１、ＳＴＲＡ１３からなり、クラスｋまでのサンプルｉの各距離が下記式を用いて計算される、請求項７に記載の方法：
【数２】
（上記式中、各遺伝子ｔおよびクラスｋについて、c（遺伝子ｔ，クラスｋ）、μ（遺伝子ｔ）、およびσ（遺伝子ｔ）値は表６において示された値から１０％の区間内にある）。
【請求項９】
前記肝臓ＨＣＣサンプルが肝臓ＨＣＣバイオプシーまたはＨＣＣ腫瘍外科切除によるものである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ａ）ＮＲＣＡＭ、ＰＩＲ、ＲＡＭＰ３、ＳＬＣ２１Ａ２、ＴＡＦ９、ＴＮＡ、ＨＮ１、ＰＳＭＤ１、ＭＲＰＳ７、ＣＤＣ２０、ＥＮＯ１、ＨＬＦ、ＳＴＲＡ１３、ＲＡＧＤ、ＮＲＡＳ、ＡＲＦＧＥＦ２、ＲＡＢ１Ａ、Ｇ０Ｓ２、ＳＭＡＤ３、ＤＮＡＪＡ３、ＨＥＬＯ１、ＲＨＯＱ、Ｃ１４ｏｒｆ１５６、ＮＰＥＰＰＳ、ＰＤＣＤ２、ＰＨＢ、ＫＩＡＡ００９０、ＩＭＰ-３、ＫＰＮＡ２、ＫＩＡＡ０２６８、ＵＮＱ６０７７、ＬＯＣ４４０７５１、Ｇ６ＰＤ、ＳＴＫ６、ＴＦＲＣ、ＧＬＡ、ＴＲＩＰ１３、ＳＰＰ１、ＡＫＲ１Ｃ１、ＡＫＲ１Ｃ２、ＧＩＭＡＰ５、ＡＤＭ、ＣＣＮＢ１、ＴＫＴ、ＡＧＰＳ、ＲＡＮ、ＮＵＤＴ９、ＨＲＡＳＬＳ３、ＨＬＡ-ＤＱＡ１、ＮＥＵ１、ＲＡＲＲＥＳ２、ＰＡＰＯＬＡ、ＡＢＣＢ６、ＢＩＲＣ５、ＦＬＪ２０２７３、Ｃ１４ｏｒｆ１０９、ＣＨＫＡ、ＴＵＢＢ２、ＨＭＧＢ３、ＴＸＮＲＤ１、ＩＦＩＴＭ１、ＫＩＡＡ０９９２、ＭＰＰＥ１、ＫＬＲＢ１、ＣＣＬ５、ＳＹＮＥ１、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３、ＣＹＰ２Ｃ１８、ＰＡＣＳＩＮ２、ＰＯＮ３、およびＰＰＰ２Ｒ１Ｂからなる群より選択される少なくとも２遺伝子の組合せを含んでなる、またはこれらからなる発現プロファイルを決定し、
ｂ）該発現プロファイルから総合生存スコアおよび／または非再発生存スコアを計算し、そして
ｃ）得られた総合生存スコアおよび／または非再発生存スコアを閾値と各々比較する
ことを含んでなり、ここで
-該閾値より厳密に劣る総合生存／非再発生存スコアは良い生存／非再発生存予後を示し、一方
-該閾値より優れたまたはそれに等しい総合生存／非再発生存スコアは悪い生存／非再発生存予後を示す、
ＨＣＣに罹患した対象の肝臓ＨＣＣサンプルからの総合生存および／または非再発生存のインビトロ予後判定の方法。
【請求項１１】
前記発現プロファイルが、ＮＲＣＡＭ、ＰＩＲ、ＲＡＭＰ３、ＳＬＣ２１Ａ２、ＴＡＦ９、ＴＮＡ、ＨＮ１、ＰＳＭＤ１、ＭＲＰＳ７、ＣＤＣ２０、ＥＮＯ１、ＨＬＦ、ＳＴＲＡ１３、ＲＡＧＤ、ＮＲＡＳ、ＡＲＦＧＥＦ２、ＲＡＢ１Ａ、Ｇ０Ｓ２、ＳＭＡＤ３、ＤＮＡＪＡ３、ＨＥＬＯ１、およびＲＨＯＱからなる群より選択される少なくとも２遺伝子の組合せを含んでなる、またはこれらからなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
総合生存が予知され、発現プロファイルが下記から選択される遺伝子組合せを含んでなる、またはこれらからなる、請求項１１に記載の方法：
-ＴＡＦ９、ＰＩＲ、ＮＲＣＡＭ、およびＲＡＭＰ３
-ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、ＳＬＣ２１Ａ２、およびＰＳＭＤ１
-ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、ＲＡＭＰ３、およびＰＳＭＤ１
-ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、ＮＲＡＳ、ＲＡＭＰ３、およびＰＳＭＤ１、または
-ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、ＲＡＭＰ３、ＰＳＭＤ１、およびＡＲＦＧＥＦ２。
【請求項１３】
前記発現プロファイルが、次の遺伝子組合せ：ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、ＲＡＭＰ３、ＰＳＭＤ１、およびＡＲＦＧＥＦ２を含んでなる、またはこれらからなる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
非再発生存が予知され、前記発現プロファイルが下記から選択される遺伝子の組合せを含んでなる、またはこれらからなる、請求項１１に記載の方法：
-ＴＡＦ９およびＧ０Ｓ２
-ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、およびＲＡＭＰ３
-ＴＡＦ９、Ｇ０Ｓ２、およびＲＡＭＰ３
-ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、ＤＮＡＪＡ３、およびＲＡＭＰ３、または
-ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、Ｇ０Ｓ２、ＤＮＡＪＡ３、およびＲＡＭＰ３。
【請求項１５】
前記発現プロファイルが、次の遺伝子の組合せ：ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、およびＲＡＭＰ３を含んでなる、またはこれらからなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記発現プロファイルが定量的ＰＣＲを用いて核酸レベルにおいて決定される、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記発現プロファイルが次の遺伝子組合せ：ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、ＲＡＭＰ３、ＰＳＭＤ１、およびＡＲＦＧＥＦ２からなり、下記式が用いられる、請求項１６に記載の方法：
【数３】
（上記式中
-ｎは、組合せにおける遺伝子の数を表し、
-ｔは、表８において示された組合せにおける各遺伝子の数を表し、並びに
-各β（遺伝子ｔ）およびμ（遺伝子ｔ）係数の値は表８において示された値から１０％の区間内にある）。
【請求項１８】
前記予後判定に用いられる前記閾値が、表８において示された値から１０％の区間内にある、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記発現プロファイルが次の遺伝子組合せ：ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、およびＲＡＭＰ３からなり、下記式が用いられる、請求項１６に記載の方法：
【数４】
（上記式中
-ｎは、組合せにおける遺伝子の数を表し、
-ｔは、表９において示された組合せにおける各遺伝子の数を表し、ならびに
-各β（遺伝子ｔ）およびμ（遺伝子ｔ）係数の値は表９において示された値から１０％の区間内にある）。
【請求項２０】
前記予後判定に用いられる閾値が、表９において示された値から１０％の区間内にある、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記肝臓ＨＣＣサンプルが肝臓ＨＣＣバイオプシーまたはＨＣＣ腫瘍外科切除によるものである、請求項１０〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ａ）請求項１０〜２１のいずれか一項に記載の方法に従い総合生存および／または非再発生存予後を判定し、そして
ｂ）該予後判定からアジュバント療法の妥当性を決める：
ことを含んでなり、ここで
-悪い予後である場合には、アジュバント療法が勧められ、一方
-良い予後でない場合には、アジュバント療法が勧められない、
ＨＣＣに罹患した対象の肝臓ＨＣＣサンプルからのアジュバント療法の妥当性のインビトロ決定の方法。
【請求項２３】
ＲＡＢ１Ａ、ＲＥＧ３Ａ、ＮＲＡＳ、ＲＡＭＰ３、ＭＥＲＴＫ、ＰＩＲ、ＥＰＨＡ１、ＬＡＭＡ３、Ｇ０Ｓ２、ＨＮ１、ＰＡＫ２、ＡＦＰ、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＤＨ２、ＨＡＭＰ、ＳＡＥ１、ＡＤＨ６、ＤＣＮ、ＦＬＪ１０１５９、ＡＬＤＨ１Ｌ１、ＩＧＦ１、ＬＥＣＴ２、ＳＬＣ３８Ａ１、ＳＰＡＲＣＬ１、ＣＴＮＮＡ２、ＧＬＵＬ、ＬＥＦ１、ＭＡＴＮ２、ＭＭＥ、ＰＦＮ２、ＳＰＩＮＴ２、ＴＢＸ３、およびＦＧＦＲ２からなる群より選択される少なくとも８遺伝子の組合せを含んでなる、またはこれらからなる発現プロファイルの決定のための試薬を含んでなる、ＨＣＣに罹患した対象の肝臓ＨＣＣサンプルからの六つのサブグループ間におけるＨＣＣ腫瘍のインビトロ分類のためのキット。
【請求項２４】
ＡＬＤＨ１Ｌ１、ＣＤ２４、ＣＤ７４、ＣＦＨＲ３、ＣＹＰ４Ｆ１２、ＤＮＡＪＡ３、ＤＳＣＲ１、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＢ４、ＦＡＡＨ、ＦＧＦＲ２、ＦＬＪ１０１５９、ＧＬＴ８Ｄ１、ＨＡＬ、ＭＡＴＮ２、ＭＲＰＳ７、ＰＡＫ２、ＰＬＸＮＢ１、ＲＡＢ１Ａ、ＲＨＯＱ、ＳＬＣ２７Ａ５、ＳＬＰＩ、ＳＭＡＲＣＥ１、ＳＴＲＡ１３からなる群より選択される少なくとも８遺伝子の組合せを含んでなる、またはこれらからなる発現プロファイルの決定のための試薬を含んでなる、ＨＣＣに罹患した対象の肝臓ＨＣＣサンプルからの六つのサブグループ間におけるＨＣＣ腫瘍のインビトロ分類のためのキット。
【請求項２５】
ＮＲＣＡＭ、ＰＩＲ、ＲＡＭＰ３、ＳＬＣ２１Ａ２、ＴＡＦ９、ＴＮＡ、ＨＮ１、ＰＳＭＤ１、ＭＲＰＳ７、ＣＤＣ２０、ＥＮＯ１、ＨＬＦ、ＳＴＲＡ１３、ＲＡＧＤ、ＮＲＡＳ、ＡＲＦＧＥＦ２、ＲＡＢ１Ａ、Ｇ０Ｓ２、ＳＭＡＤ３、ＤＮＡＪＡ３、ＨＥＬＯ１、ＲＨＯＱ、Ｃ１４ｏｒｆ１５６、ＮＰＥＰＰＳ、ＰＤＣＤ２、ＰＨＢ、ＫＩＡＡ００９０、ＩＭＰ-３、ＫＰＮＡ２、ＫＩＡＡ０２６８、ＵＮＱ６０７７、ＬＯＣ４４０７５１、Ｇ６ＰＤ、ＳＴＫ６、ＴＦＲＣ、ＧＬＡ、ＴＲＩＰ１３、ＳＰＰ１、ＡＫＲ１Ｃ１、ＡＫＲ１Ｃ２、ＧＩＭＡＰ５、ＡＤＭ、ＣＣＮＢ１、ＴＫＴ、ＡＧＰＳ、ＲＡＮ、ＮＵＤＴ９、ＨＲＡＳＬＳ３、ＨＬＡ-ＤＱＡ１、ＮＥＵ１、ＲＡＲＲＥＳ２、ＰＡＰＯＬＡ、ＡＢＣＢ６、ＢＩＲＣ５、ＦＬＪ２０２７３、Ｃ１４ｏｒｆ１０９、ＣＨＫＡ、ＴＵＢＢ２、ＨＭＧＢ３、ＴＸＮＲＤ１、ＩＦＩＴＭ１、ＫＩＡＡ０９９２、ＭＰＰＥ１、ＫＬＲＢ１、ＣＣＬ５、ＳＹＮＥ１、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３、ＣＹＰ２Ｃ１８、ＰＡＣＳＩＮ２、ＰＯＮ３、およびＰＰＰ２Ｒ１Ｂからなる群より選択される少なくとも２遺伝子の組合せを含んでなる、またはこれらからなる発現プロファイルの決定のための試薬を含んでなる、ＨＣＣに罹患した対象の肝臓ＨＣＣサンプルからの総合生存および／または非再発生存のインビトロ予後判定のためのキット。
【請求項１】
ａ）ＲＡＢ１Ａ、ＲＥＧ３Ａ、ＮＲＡＳ、ＲＡＭＰ３、ＭＥＲＴＫ、ＰＩＲ、ＥＰＨＡ１、ＬＡＭＡ３、Ｇ０Ｓ２、ＨＮ１、ＰＡＫ２、ＡＦＰ、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＤＨ２、ＨＡＭＰ、ＳＡＥ１、ＡＤＨ６、ＤＣＮ、ＦＬＪ１０１５９、ＡＬＤＨ１Ｌ１、ＩＧＦ１、ＬＥＣＴ２、ＳＬＣ３８Ａ１、ＳＰＡＲＣＬ１、ＣＴＮＮＡ２、ＧＬＵＬ、ＬＥＦ１、ＭＡＴＮ２、ＭＭＥ、ＰＦＮ２、ＳＰＩＮＴ２、ＴＢＸ３、およびＦＧＦＲ２からなる群より選択される少なくとも８遺伝子の組合せを含んでなる、またはこれらからなる発現プロファイルを決定し、
ｂ）該発現プロファイルから六つのサブグループの距離を計算し、そして
ｃ）サブグループの距離が最短であるサブグループにＨＣＣ腫瘍を分類する
ことを含んでなり、
ここで六つのサブグループＧ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５、およびＧ６が、表２において記載されたそれらの臨床的および遺伝的特徴により規定される、ＨＣＣに罹患した対象の肝臓ＨＣＣサンプルからの六つのサブグループ間における、ＨＣＣ腫瘍のインビトロ分類の方法。
【請求項２】
前記発現プロファイルが、次の１６遺伝子組合せ：ＲＡＢ１Ａ、ＲＥＧ３Ａ、ＮＲＡＳ、ＲＡＭＰ３、ＭＥＲＴＫ、ＰＩＲ、ＥＰＨＡ１、ＬＡＭＡ３、Ｇ０Ｓ２、ＨＮ１、ＰＡＫ２、ＡＦＰ、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＤＨ２、ＨＡＭＰ、およびＳＡＥ１を含んでなる、またはこれらからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記発現プロファイルが定量的ＰＣＲを用いて核酸レベルにおいて決定される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記発現プロファイルが次の１６遺伝子組合せ：ＲＡＢ１Ａ、ＲＥＧ３Ａ、ＮＲＡＳ、ＲＡＭＰ３、ＭＥＲＴＫ、ＰＩＲ、ＥＰＨＡ１、ＬＡＭＡ３、Ｇ０Ｓ２、ＨＮ１、ＰＡＫ２、ＡＦＰ、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＤＨ２、ＨＡＭＰ、およびＳＡＥ１からなり、クラスｋまでのサンプルｉの各距離が下記式を用いて計算される、請求項３に記載の方法：
【数１】
（上記式中、各遺伝子ｔおよびクラスｋについて、μ（クラスｋ，遺伝子ｔ）およびσ（遺伝子ｔ）値は表５において示された値から１０％の区間内にある）。
【請求項５】
ｄ）ＡＬＤＨ１Ｌ１、ＣＤ２４、ＣＤ７４、ＣＦＨＲ３、ＣＹＰ４Ｆ１２、ＤＮＡＪＡ３、ＤＳＣＲ１、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＢ４、ＦＡＡＨ、ＦＧＦＲ２、ＦＬＪ１０１５９、ＧＬＴ８Ｄ１、ＨＡＬ、ＭＡＴＮ２、ＭＲＰＳ７、ＰＡＫ２、ＰＬＸＮＢ１、ＲＡＢ１Ａ、ＲＨＯＱ、ＳＬＣ２７Ａ５、ＳＬＰＩ、ＳＭＡＲＣＥ１、ＳＴＲＡ１３からなる群より選択される少なくとも８遺伝子の組合せを含んでなる、またはこれらからなる発現プロファイルを決定し、
ｅ）該発現プロファイルから六つのサブグループの距離を計算し、そして
ｆ）サブグループの距離が最短であるサブグループに前記ＨＣＣ腫瘍を分類する
ことを含んでなり、
ここで六つのサブグループＧ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５、およびＧ６が、表２において記載されたそれらの臨床的および遺伝的特徴により規定される、ＨＣＣに罹患した対象の肝臓ＨＣＣサンプルからの六つのサブグループ間における、ＨＣＣ腫瘍のインビトロ分類の方法。
【請求項６】
前記発現プロファイルが、次の２４遺伝子組合せ：ＡＬＤＨ１Ｌ１、ＣＤ２４、ＣＤ７４、ＣＦＨＲ３、ＣＹＰ４Ｆ１２、ＤＮＡＪＡ３、ＤＳＣＲ１、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＢ４、ＦＡＡＨ、ＦＧＦＲ２、ＦＬＪ１０１５９、ＧＬＴ８Ｄ１、ＨＡＬ、ＭＡＴＮ２、ＭＲＰＳ７、ＰＡＫ２、ＰＬＸＮＢ１、ＲＡＢ１Ａ、ＲＨＯＱ、ＳＬＣ２７Ａ５、ＳＬＰＩ、ＳＭＡＲＣＥ１、ＳＴＲＡ１３を含んでなる、またはそれらからなる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記発現プロファイルが核酸マイクロアレイを用いて核酸レベルにおいて決定される、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
前記発現プロファイルが次の２４遺伝子の組合せ：ＡＬＤＨ１Ｌ１、ＣＤ２４、ＣＤ７４、ＣＦＨＲ３、ＣＹＰ４Ｆ１２、ＤＮＡＪＡ３、ＤＳＣＲ１、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＢ４、ＦＡＡＨ、ＦＧＦＲ２、ＦＬＪ１０１５９、ＧＬＴ８Ｄ１、ＨＡＬ、ＭＡＴＮ２、ＭＲＰＳ７、ＰＡＫ２、ＰＬＸＮＢ１、ＲＡＢ１Ａ、ＲＨＯＱ、ＳＬＣ２７Ａ５、ＳＬＰＩ、ＳＭＡＲＣＥ１、ＳＴＲＡ１３からなり、クラスｋまでのサンプルｉの各距離が下記式を用いて計算される、請求項７に記載の方法：
【数２】
（上記式中、各遺伝子ｔおよびクラスｋについて、c（遺伝子ｔ，クラスｋ）、μ（遺伝子ｔ）、およびσ（遺伝子ｔ）値は表６において示された値から１０％の区間内にある）。
【請求項９】
前記肝臓ＨＣＣサンプルが肝臓ＨＣＣバイオプシーまたはＨＣＣ腫瘍外科切除によるものである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ａ）ＮＲＣＡＭ、ＰＩＲ、ＲＡＭＰ３、ＳＬＣ２１Ａ２、ＴＡＦ９、ＴＮＡ、ＨＮ１、ＰＳＭＤ１、ＭＲＰＳ７、ＣＤＣ２０、ＥＮＯ１、ＨＬＦ、ＳＴＲＡ１３、ＲＡＧＤ、ＮＲＡＳ、ＡＲＦＧＥＦ２、ＲＡＢ１Ａ、Ｇ０Ｓ２、ＳＭＡＤ３、ＤＮＡＪＡ３、ＨＥＬＯ１、ＲＨＯＱ、Ｃ１４ｏｒｆ１５６、ＮＰＥＰＰＳ、ＰＤＣＤ２、ＰＨＢ、ＫＩＡＡ００９０、ＩＭＰ-３、ＫＰＮＡ２、ＫＩＡＡ０２６８、ＵＮＱ６０７７、ＬＯＣ４４０７５１、Ｇ６ＰＤ、ＳＴＫ６、ＴＦＲＣ、ＧＬＡ、ＴＲＩＰ１３、ＳＰＰ１、ＡＫＲ１Ｃ１、ＡＫＲ１Ｃ２、ＧＩＭＡＰ５、ＡＤＭ、ＣＣＮＢ１、ＴＫＴ、ＡＧＰＳ、ＲＡＮ、ＮＵＤＴ９、ＨＲＡＳＬＳ３、ＨＬＡ-ＤＱＡ１、ＮＥＵ１、ＲＡＲＲＥＳ２、ＰＡＰＯＬＡ、ＡＢＣＢ６、ＢＩＲＣ５、ＦＬＪ２０２７３、Ｃ１４ｏｒｆ１０９、ＣＨＫＡ、ＴＵＢＢ２、ＨＭＧＢ３、ＴＸＮＲＤ１、ＩＦＩＴＭ１、ＫＩＡＡ０９９２、ＭＰＰＥ１、ＫＬＲＢ１、ＣＣＬ５、ＳＹＮＥ１、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３、ＣＹＰ２Ｃ１８、ＰＡＣＳＩＮ２、ＰＯＮ３、およびＰＰＰ２Ｒ１Ｂからなる群より選択される少なくとも２遺伝子の組合せを含んでなる、またはこれらからなる発現プロファイルを決定し、
ｂ）該発現プロファイルから総合生存スコアおよび／または非再発生存スコアを計算し、そして
ｃ）得られた総合生存スコアおよび／または非再発生存スコアを閾値と各々比較する
ことを含んでなり、ここで
-該閾値より厳密に劣る総合生存／非再発生存スコアは良い生存／非再発生存予後を示し、一方
-該閾値より優れたまたはそれに等しい総合生存／非再発生存スコアは悪い生存／非再発生存予後を示す、
ＨＣＣに罹患した対象の肝臓ＨＣＣサンプルからの総合生存および／または非再発生存のインビトロ予後判定の方法。
【請求項１１】
前記発現プロファイルが、ＮＲＣＡＭ、ＰＩＲ、ＲＡＭＰ３、ＳＬＣ２１Ａ２、ＴＡＦ９、ＴＮＡ、ＨＮ１、ＰＳＭＤ１、ＭＲＰＳ７、ＣＤＣ２０、ＥＮＯ１、ＨＬＦ、ＳＴＲＡ１３、ＲＡＧＤ、ＮＲＡＳ、ＡＲＦＧＥＦ２、ＲＡＢ１Ａ、Ｇ０Ｓ２、ＳＭＡＤ３、ＤＮＡＪＡ３、ＨＥＬＯ１、およびＲＨＯＱからなる群より選択される少なくとも２遺伝子の組合せを含んでなる、またはこれらからなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
総合生存が予知され、発現プロファイルが下記から選択される遺伝子組合せを含んでなる、またはこれらからなる、請求項１１に記載の方法：
-ＴＡＦ９、ＰＩＲ、ＮＲＣＡＭ、およびＲＡＭＰ３
-ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、ＳＬＣ２１Ａ２、およびＰＳＭＤ１
-ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、ＲＡＭＰ３、およびＰＳＭＤ１
-ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、ＮＲＡＳ、ＲＡＭＰ３、およびＰＳＭＤ１、または
-ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、ＲＡＭＰ３、ＰＳＭＤ１、およびＡＲＦＧＥＦ２。
【請求項１３】
前記発現プロファイルが、次の遺伝子組合せ：ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、ＲＡＭＰ３、ＰＳＭＤ１、およびＡＲＦＧＥＦ２を含んでなる、またはこれらからなる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
非再発生存が予知され、前記発現プロファイルが下記から選択される遺伝子の組合せを含んでなる、またはこれらからなる、請求項１１に記載の方法：
-ＴＡＦ９およびＧ０Ｓ２
-ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、およびＲＡＭＰ３
-ＴＡＦ９、Ｇ０Ｓ２、およびＲＡＭＰ３
-ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、ＤＮＡＪＡ３、およびＲＡＭＰ３、または
-ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、Ｇ０Ｓ２、ＤＮＡＪＡ３、およびＲＡＭＰ３。
【請求項１５】
前記発現プロファイルが、次の遺伝子の組合せ：ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、およびＲＡＭＰ３を含んでなる、またはこれらからなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記発現プロファイルが定量的ＰＣＲを用いて核酸レベルにおいて決定される、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記発現プロファイルが次の遺伝子組合せ：ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、ＲＡＭＰ３、ＰＳＭＤ１、およびＡＲＦＧＥＦ２からなり、下記式が用いられる、請求項１６に記載の方法：
【数３】
（上記式中
-ｎは、組合せにおける遺伝子の数を表し、
-ｔは、表８において示された組合せにおける各遺伝子の数を表し、並びに
-各β（遺伝子ｔ）およびμ（遺伝子ｔ）係数の値は表８において示された値から１０％の区間内にある）。
【請求項１８】
前記予後判定に用いられる前記閾値が、表８において示された値から１０％の区間内にある、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記発現プロファイルが次の遺伝子組合せ：ＴＡＦ９、ＮＲＣＡＭ、およびＲＡＭＰ３からなり、下記式が用いられる、請求項１６に記載の方法：
【数４】
（上記式中
-ｎは、組合せにおける遺伝子の数を表し、
-ｔは、表９において示された組合せにおける各遺伝子の数を表し、ならびに
-各β（遺伝子ｔ）およびμ（遺伝子ｔ）係数の値は表９において示された値から１０％の区間内にある）。
【請求項２０】
前記予後判定に用いられる閾値が、表９において示された値から１０％の区間内にある、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記肝臓ＨＣＣサンプルが肝臓ＨＣＣバイオプシーまたはＨＣＣ腫瘍外科切除によるものである、請求項１０〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ａ）請求項１０〜２１のいずれか一項に記載の方法に従い総合生存および／または非再発生存予後を判定し、そして
ｂ）該予後判定からアジュバント療法の妥当性を決める：
ことを含んでなり、ここで
-悪い予後である場合には、アジュバント療法が勧められ、一方
-良い予後でない場合には、アジュバント療法が勧められない、
ＨＣＣに罹患した対象の肝臓ＨＣＣサンプルからのアジュバント療法の妥当性のインビトロ決定の方法。
【請求項２３】
ＲＡＢ１Ａ、ＲＥＧ３Ａ、ＮＲＡＳ、ＲＡＭＰ３、ＭＥＲＴＫ、ＰＩＲ、ＥＰＨＡ１、ＬＡＭＡ３、Ｇ０Ｓ２、ＨＮ１、ＰＡＫ２、ＡＦＰ、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＤＨ２、ＨＡＭＰ、ＳＡＥ１、ＡＤＨ６、ＤＣＮ、ＦＬＪ１０１５９、ＡＬＤＨ１Ｌ１、ＩＧＦ１、ＬＥＣＴ２、ＳＬＣ３８Ａ１、ＳＰＡＲＣＬ１、ＣＴＮＮＡ２、ＧＬＵＬ、ＬＥＦ１、ＭＡＴＮ２、ＭＭＥ、ＰＦＮ２、ＳＰＩＮＴ２、ＴＢＸ３、およびＦＧＦＲ２からなる群より選択される少なくとも８遺伝子の組合せを含んでなる、またはこれらからなる発現プロファイルの決定のための試薬を含んでなる、ＨＣＣに罹患した対象の肝臓ＨＣＣサンプルからの六つのサブグループ間におけるＨＣＣ腫瘍のインビトロ分類のためのキット。
【請求項２４】
ＡＬＤＨ１Ｌ１、ＣＤ２４、ＣＤ７４、ＣＦＨＲ３、ＣＹＰ４Ｆ１２、ＤＮＡＪＡ３、ＤＳＣＲ１、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＢ４、ＦＡＡＨ、ＦＧＦＲ２、ＦＬＪ１０１５９、ＧＬＴ８Ｄ１、ＨＡＬ、ＭＡＴＮ２、ＭＲＰＳ７、ＰＡＫ２、ＰＬＸＮＢ１、ＲＡＢ１Ａ、ＲＨＯＱ、ＳＬＣ２７Ａ５、ＳＬＰＩ、ＳＭＡＲＣＥ１、ＳＴＲＡ１３からなる群より選択される少なくとも８遺伝子の組合せを含んでなる、またはこれらからなる発現プロファイルの決定のための試薬を含んでなる、ＨＣＣに罹患した対象の肝臓ＨＣＣサンプルからの六つのサブグループ間におけるＨＣＣ腫瘍のインビトロ分類のためのキット。
【請求項２５】
ＮＲＣＡＭ、ＰＩＲ、ＲＡＭＰ３、ＳＬＣ２１Ａ２、ＴＡＦ９、ＴＮＡ、ＨＮ１、ＰＳＭＤ１、ＭＲＰＳ７、ＣＤＣ２０、ＥＮＯ１、ＨＬＦ、ＳＴＲＡ１３、ＲＡＧＤ、ＮＲＡＳ、ＡＲＦＧＥＦ２、ＲＡＢ１Ａ、Ｇ０Ｓ２、ＳＭＡＤ３、ＤＮＡＪＡ３、ＨＥＬＯ１、ＲＨＯＱ、Ｃ１４ｏｒｆ１５６、ＮＰＥＰＰＳ、ＰＤＣＤ２、ＰＨＢ、ＫＩＡＡ００９０、ＩＭＰ-３、ＫＰＮＡ２、ＫＩＡＡ０２６８、ＵＮＱ６０７７、ＬＯＣ４４０７５１、Ｇ６ＰＤ、ＳＴＫ６、ＴＦＲＣ、ＧＬＡ、ＴＲＩＰ１３、ＳＰＰ１、ＡＫＲ１Ｃ１、ＡＫＲ１Ｃ２、ＧＩＭＡＰ５、ＡＤＭ、ＣＣＮＢ１、ＴＫＴ、ＡＧＰＳ、ＲＡＮ、ＮＵＤＴ９、ＨＲＡＳＬＳ３、ＨＬＡ-ＤＱＡ１、ＮＥＵ１、ＲＡＲＲＥＳ２、ＰＡＰＯＬＡ、ＡＢＣＢ６、ＢＩＲＣ５、ＦＬＪ２０２７３、Ｃ１４ｏｒｆ１０９、ＣＨＫＡ、ＴＵＢＢ２、ＨＭＧＢ３、ＴＸＮＲＤ１、ＩＦＩＴＭ１、ＫＩＡＡ０９９２、ＭＰＰＥ１、ＫＬＲＢ１、ＣＣＬ５、ＳＹＮＥ１、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３、ＣＹＰ２Ｃ１８、ＰＡＣＳＩＮ２、ＰＯＮ３、およびＰＰＰ２Ｒ１Ｂからなる群より選択される少なくとも２遺伝子の組合せを含んでなる、またはこれらからなる発現プロファイルの決定のための試薬を含んでなる、ＨＣＣに罹患した対象の肝臓ＨＣＣサンプルからの総合生存および／または非再発生存のインビトロ予後判定のためのキット。
【図１】
【図２】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図４ｃ】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【図２】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図４ｃ】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【公表番号】特表２００９−５１７０６４（Ｐ２００９−５１７０６４Ａ）
【公表日】平成２１年４月３０日（２００９．４．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４２７７２（Ｐ２００８−５４２７７２）
【出願日】平成１８年１１月３０日（２００６．１１．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６９１７５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０６３１１８
【国際公開日】平成１９年６月７日（２００７．６．７）
【出願人】（５０００２５４７７）アンスティテュ、ナショナル、ド、ラ、サント、エ、ド、ラ、ルシェルシュ、メディカル（アンセルム） (19)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＳＡＮＴＥ ＥＴ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＭＥＤＩＣＡＬ （ＩＮＳＥＲＭ）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年４月３０日（２００９．４．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１１月３０日（２００６．１１．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６９１７５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０６３１１８
【国際公開日】平成１９年６月７日（２００７．６．７）
【出願人】（５０００２５４７７）アンスティテュ、ナショナル、ド、ラ、サント、エ、ド、ラ、ルシェルシュ、メディカル（アンセルム） (19)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＳＡＮＴＥ ＥＴ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＭＥＤＩＣＡＬ （ＩＮＳＥＲＭ）
【Ｆターム（参考）】
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