肝線維化抑制剤
【課題】 慢性肝炎から肝硬変への病態進展を抑制できる肝線維化抑制剤であって、優れた薬理活性を示し、副作用が少なく長期使用が可能な、肝線維化抑制剤を提供すること。
【解決手段】 プロアントシアニジン組成物を有効成分とする肝線維化抑制剤。
【解決手段】 プロアントシアニジン組成物を有効成分とする肝線維化抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロアントシアニジン（以下、「ＰＡＣ」という）を有効成分として含む肝線維化抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝線維化は肝臓の炎症や毒物による肝細胞の損傷、肝血流の変化、あるいはウイルス、細菌、真菌又は寄生虫の感染症など、非常に多くの因子によって生じる病態である。また、先天性代謝異常が線維化に関わることも多く、脂質代謝異常（ゴーシェ病）、糖原病、α抗トリプシン欠損症、鉄過剰蓄積症候群（ヘモクロマトーシス）、銅蓄積症（ウィルソン病）、毒性代謝産物の蓄積（チロシン血症，果糖血症，ガラクトース血症）、ペルオキシソームの異常（ゼルウェガー症候群）などが知られている。さらに、アルコール、メトトレキサートなどの化学物質や薬物、あるいは肝臓の循環障害（慢性心不全、バッド−キアリ症候群、静脈閉塞症、門脈血栓症など）や慢性的な胆汁流出路の閉塞も肝線維化の原因となる。
【０００３】
ウイルス性肝炎などの慢性肝炎から肝硬変への進行過程において肝線維化は主要な病態であり、肝線維化を抑えることは肝硬変を予防する上で極めて重要である。特にＣ型肝炎治療でのインターフェロン無効例においては、肝線維化抑制療法の開発が急務である。肝線維化の主たる原因は肝非実質細胞の一つである肝星細胞からの細胞外マトリックス（コラーゲン、ラミニン、プロテオグリカンなど）の異常産生である。肝星細胞の機能は肝マクロファージであるクッパー細胞の産生するサイトカイン及び増殖因子により調節されている。血小板由来増殖因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ； ＰＤＧＦ）は、肝星細胞の活性化促進因子の一つであり、肝星細胞の増殖を促進することにより肝線維化をもたらす。従って、肝星細胞の増殖あるいはＰＤＧＦによる活性化を抑制する薬剤が開発されれば、これにより肝線維化を抑制し、ウイルス性肝炎などの慢性肝障害から肝硬変への進展を抑制することが可能である。
【０００４】
肝星細胞の活性化を抑制する天然物化合物としては、緑茶由来のカテキン、エピカテキン等が知られている。緑茶カテキン療法は胆道閉鎖症術後患者の酸化ストレスを軽減し肝線維化を抑制することが報告されている。
【０００５】
非特許文献１、２及び３にはエピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（以下「ＥＧＣＧ」という）が、組み替えヒト血小板由来増殖因子（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｐｌａｔｅｌｅｔ-ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ-ＢＢ；以下「ＰＤＧＦ−ＢＢ」という）処理による肝星細胞のＤＮＡ合成量を抑制することが報告されている。
【０００６】
特許文献１では、ウーロン茶や紅茶などの発酵茶から抽出されたＰＡＣを含む高分子ポリフェノール類が脂肪肝の予防や治療に有効であることが述べられている。また、特許文献２ではプロシアニジンおよびその誘導体を含むポリフェノール類を含有する組成物が、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、膵癌、肝細胞癌または大腸癌等の腫瘍の治療に有効であることが示唆されている。
【０００７】
【特許文献１】特開２００７−３２０９５８号公報
【特許文献２】特表２００７−５１９７５２号公報
【非特許文献１】Ｓａｋａｔａ Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｈｅｐａｔｏｌ， ４０， ５２−５９ （２００４）
【非特許文献２】Ｃｈｅｎ Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７８， ２３３８１−２３３８９ （２００３）
【非特許文献３】Ｈｉｇａｓｈｉ Ｎ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｌａｂ． Ｃｌｉｎ． Ｍｅｄ．， １４５， ３１６−３２２ （２００５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、慢性肝炎から肝硬変への病態進展を抑制できる肝線維化抑制剤であって、優れた薬理活性を示し、副作用が少なく長期使用が可能な、肝線維化抑制剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記目的を達成するため、培養ヒト肝星細胞ＬＩ９０のＰＤＧＦ−ＢＢによる活性化の抑制効果を指標に、天然物由来の成分について種々検討した結果、フラバン−３−オールの重合体に、ＥＧＣＧと同等の肝線維化抑制効果があることを見出し、本発明に至った。
【００１０】
すなわち本発明は、プロアントシアニジン組成物を有効成分とする肝線維化抑制剤に関する。
【００１１】
本発明の肝線維化抑制剤は、上記のような構成を備えることにより、優れた薬理活性を示し、副作用が少なく長期使用が可能なものとなる。このような肝線維化抑制剤によれば、ウイルス性肝炎やアルコール性肝障害などの慢性肝障害における肝線維化を効果的に抑制することができる。また、肝線維化を病因とする、肝硬変や肝細胞癌などの病の発症又は進展を、効果的に予防又は抑制することができる。
【００１２】
本発明の肝線維化抑制剤は、上記プロアントシアニジン組成物が、下記一般式（１）で表されるフラバン−３−オール骨格が、下記（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の結合様式で２以上互いに結合した構造を有するものであることが好ましい。
（ｉ）４位炭素及び８位炭素の結合
（ｉｉ）４位炭素及び６位炭素の結合
（ｉｉｉ）４位炭素及び８位炭素の結合並びに２位炭素及び７位酸素の結合
【００１３】
【化１】
【００１４】
式（１）中、Ｒ１及びＲ３はそれぞれ独立に水素原子又は水酸基、Ｒ２は水酸基、Ｒ４は水素原子又は一価の有機基を、それぞれ示す。
【００１５】
上記のような肝線維化抑制剤は、薬理活性に一層優れ、副作用が少なく長期に亘って使用することができる。
【００１６】
本発明の肝線維化抑制剤は、上記プロアントシアニジンが天然物由来であるものであることが好ましい。このような肝線維化抑制剤は、優れた薬理活性を示し、副作用が少なく長期使用が可能で、且つ天然物から容易に加工することができる。
【００１７】
また、本発明は、プロアントシアニジン組成物を有効成分とする肝星細胞増殖抑制剤に関する。
【００１８】
本発明の肝星細胞増殖抑制剤は、肝星細胞の増殖又は活性化を抑制できる肝星細胞増殖抑制剤であって、上記のような構成を備えることにより、優れた薬理活性を示し、副作用が少なく長期使用が可能なものである。
【００１９】
本発明の肝星細胞増殖抑制剤は、上記プロアントシアニジン組成物が、下記一般式（１）で表されるフラバン−３−オール骨格が、下記（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の結合様式で２以上互いに結合した構造を有するものであることが好ましい。
（ｉ）４位炭素及び８位炭素の結合
（ｉｉ）４位炭素及び６位炭素の結合
（ｉｉｉ）４位炭素及び８位炭素の結合並びに２位炭素及び７位酸素の結合
【００２０】
【化２】
【００２１】
式（１）中、Ｒ１及びＲ３はそれぞれ独立に水素原子又は水酸基、Ｒ２は水酸基、Ｒ４は水素原子又は一価の有機基を、それぞれ示す。
【００２２】
上記のような肝星細胞増殖抑制剤は、薬理活性に一層優れ、副作用が少なく長期に亘って使用することができる。
【００２３】
本発明の肝星細胞増殖抑制剤は、上記プロアントシアニジンが天然物由来であるものであることが好ましい。このような肝線維化抑制剤は、優れた薬理活性を示し、副作用が少なく長期使用が可能で、且つ天然物から容易に加工することができる。
【００２４】
本発明の肝星細胞増殖抑制剤は、ある側面において、肝星細胞アポトーシスに基づいて、肝星細胞の増殖又は活性化を抑制するものである。
【００２５】
また、本発明は、上記肝線維化抑制剤又は上記肝星細胞増殖抑制剤を含む、肝線維化を病因とする肝疾病の発症・進展抑制剤に関する。
【００２６】
また、本発明は、上記肝線維化抑制剤又は上記肝星細胞増殖抑制剤を含む、肝線維化抑制、肝星細胞増殖抑制、肝星細胞アポトーシス誘導、肝線維化を病因とする肝疾病の発症抑制、又は、肝線維化を病因とする肝疾病の進展抑制用の、機能性補助飲食物に関する。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によれば、慢性肝炎から肝硬変への病態進展を抑制できる肝線維化抑制剤であって、優れた薬理活性を示し、副作用が少なく長期使用が可能な、肝線維化抑制剤を提供することができる。また本発明によれば、肝星細胞の増殖又は活性化を抑制できる肝星細胞増殖抑制剤であって、優れた薬理活性を示し、副作用が少なく長期使用が可能な、肝星細胞増殖抑制剤を提供することができる。さらに本発明によれば、上記肝線維化抑制剤又は上記肝星細胞増殖抑制剤を含むことを特徴とする、肝疾病の発症・進展抑制剤及び機能性補助飲食物を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下、必要に応じて図面を参照しつつ、本発明を実施するための最良の形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００２９】
本実施形態に係る肝線維化抑制剤及び肝星細胞増殖抑制剤は、プロアントシアニジン組成物（以下、「ＰＡＣ組成物」と表す。）を有効成分とする。ここで、ＰＡＣ組成物は、１種又は複数のプロアントシアニジン（以下、「ＰＡＣ」と表す。）からなる組成物であり、実施形態に係る肝線維化抑制剤及び肝星細胞増殖抑制剤は、多くの場合、複数のＰＡＣからなる組成物を有効成分としている。またＰＡＣ組成物は、ＰＡＣの誘導体、その生理学的に許容される塩、その水和物、その溶媒和物等を含んでも良い。
【００３０】
ＰＡＣは、フラバン骨格を基本として、種々の部位に水酸基を有する単量体が重合してなる重合体化合物群の総称である。このような重合体の構成単位のうち、基端部をターミナルユニット、その他をエクステンションユニットと呼ぶ。また、重合体の重合度は、二量体、三量体のものから１００量体以上の高分子にまで及ぶ。
【００３１】
本実施形態において、薬理活性の観点からＰＡＣの重合度は３以上であることが好ましく、５以上であることがより好ましく、５〜２０であることがさらに好ましい。ただし、ＰＡＣ組成物は、主たる成分が重合度３以上の重合体であれば、モノマー、その他の断片を含んでもよい。また、ＰＡＣ組成物に含まれるＰＡＣの平均重合度は、３以上であることが好ましく、５以上であることがより好ましく、５〜２０であることがさらに好ましい。なお、本発明において平均重合度とは、上記単量体が結合している平均個数を示し、例えば、後述する実施例に示す方法などにより、測定することができる。
【００３２】
ＰＡＣとしては、例えば、図１の化学式で示されるような、主としてカテキン類、すなわちフラバン−３−オールを構成単位とする重合度が２以上の重合体からなるポリフェノール成分が挙げられる。なお、図１の化学式中Ｒは、上記一般式（１）におけるＯＲ４に相当する。また、フラバン環３位水酸基にしばしば没食子酸がエステル結合する。
【００３３】
ある特定の単量体（骨格）が重合したＰＡＣには慣用名が与えられ、代表的なＰＡＣとしては、Ｂ環（図１参照）の水酸基の数に応じて定義・分類された、プロペラルゴニジン（４’−ＯＨ）、プロシアニジン（３’−ＯＨ、４’−ＯＨ）及びプロデルフィニジン（３’−ＯＨ、４’−ＯＨ、５’−ＯＨ）が挙げられる。例えば、Ａ環５位の水酸基を欠く成分を構成単位とした重合体には、プロガイボールチニジン、プロフィセチニジン、及びプロロビネチニジンがあり、さらにその他の特定部位の水酸基の有無に応じて、プロテラカシジン、プロメラカシジン、プロアピゲニニジン、プロルテオリニジンなどの慣用名がある。
【００３４】
本発明においてＰＡＣは、好ましくは、プロシアニジン、プロペラルゴニジン又はプロデルフィニジンである。「プロシアニジン」の構成単位（骨格）は、同一又は異なっていてもよく、カテキン、エピカテキン、カテキンガレート及びエピカテキンガレートから選択できる。「プロデルフィニジン」の構成単位（骨格）は、同一または異なっていてもよく、ガロカテキン、エピガロカテキン、ガロカテキンガレート及びエピガロカテキンガレートから選択できる。
【００３５】
また、ＰＡＣとしては、例えば、さまざまな植物に広く含まれている縮合型タンニンが挙げられる。このようなＰＡＣは、酸処理によって、シアニジン、デルフィニジン、ペラルゴニジン、オーランチニジン、ルテオリニジン、ペオニジン、マルビジン、ペチュニジン、ヨーロピニジン、ロシニジン、ヒルスチジン、アピゲニニジンなどを得ることができる。
【００３６】
さらに、ＰＡＣには、各環上の結合位置の違いや、構成単位内の置換基の立体配座、異なる構成単位の重合体内での結合順序などによる多様な化合物が知られている。本発明に含まれるＰＡＣの一部について、化学名（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｎａｍｅ）を以下に例示する。なお、括弧内は分子式（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｏｒｍｕｌａ）である。なお、本発明においては、下記のＰＡＣにのみならず、これらのＰＡＣが更にカテキン、エピカテキンなどの構成単位あるいは他のＰＡＣと縮合した、より高重合度のＰＡＣをも包含する。
【００３７】
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ ＰＺ５ （Ｃ７５ Ｈ６２ Ｏ３１），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ ＢＰ １ （Ｕｎｓｐｅｃｉｆｉｅｄ），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ ＲＰ ４ （Ｃ１２９ Ｈ１０６ Ｏ６７），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ ＲＰ ３ （Ｃ１３６ Ｈ１２０ Ｏ７０），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ ＣＳ ４ （Ｃ１３６ Ｈ１２０ Ｏ７０），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ ＣＳ ３ （Ｃ１２７ Ｈ１２８ Ｏ６９），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ ＣＳ ２ （Ｃ１１３ Ｈ１１０ Ｏ６２），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ ＣＳ１ （Ｃ１２１ Ｈ１１８ Ｏ６５），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ ＲＰ ２ （Ｃ１２０ Ｈ１１４ Ｏ６４），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ ＲＰ １ （Ｃ１２５ Ｈ１３０ Ｏ６９），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ｔ４ （Ｃ１２８ Ｈ１２２ Ｏ６５），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ｔ３ （Ｃ１０５ Ｈ１０２ Ｏ５９），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ｔ２ （Ｃ６７ Ｈ５４ Ｏ２９），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ｔ１ （Ｃ８７ Ｈ７２ Ｏ４３），
４−（Ｂｅｎｚｙｌｔｈｉｏ）ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ａ２ （Ｃ３７ Ｈ３０ Ｏ１２ Ｓ），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ａ７（Ｃ３０ Ｈ２４ Ｏ１２），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ （Ｃ３０ Ｈ２４ Ｏ１２），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ａ５’（Ｃ３０ Ｈ２４ Ｏ１２），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ａ４ （Ｃ３０ Ｈ２４ Ｏ１２），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ｂ６ （Ｃ３７ Ｈ３０ Ｏ１６），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ｂ２ ３，３’−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ （Ｃ４４ Ｈ３４ Ｏ２０），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ｂ４ （Ｃ３０ Ｈ２６ Ｏ１２），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ａ２ ４α−ｂｅｚｙｌｔｈｉｏｅｔｈｅｒ （Ｃ３７ Ｈ３０ Ｏ１２ Ｓ），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ａ２ （Ｃ３０ Ｈ２４ Ｏ１２），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ｃ１ （Ｃ４５ Ｈ３８ Ｏ１８），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ｂ２ （Ｃ３０ Ｈ２６ Ｏ１２），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ｂ （Ｃ３１ Ｈ２８ Ｏ１２），
Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ ｛（Ｃ２９ Ｈ３２ Ｏ１０）ｘ｝，
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ｂ１ （Ｃ３０ Ｈ２６ Ｏ１２），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ａ （Ｃ３１ Ｈ２８ Ｏ１２），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ｃ（Ｃ３０ Ｈ２６ Ｏ１２），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ｂ５（Ｃ３０ Ｈ２６ Ｏ１２），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ｐ−１ （Ｕｎｓｐｅｃｉｆｉｅｄ）．
【００３８】
本実施形態において、ＰＡＣ組成物は、下記一般式（１）で表されるフラバン−３−オール骨格が、（ｉ）４位炭素及び８位炭素の結合、（ｉｉ）４位炭素及び６位炭素の結合、（ｉｉｉ）４位炭素及び８位炭素の結合並びに２位炭素及び７位酸素の結合、のいずれかの結合様式で２以上互いに結合した構造を有するものを含むことが好ましい。
【００３９】
【化３】
【００４０】
式（１）中、Ｒ１及びＲ３はそれぞれ独立に水素原子又は水酸基、Ｒ２は水酸基、Ｒ４は水素原子又は一価の有機基を、それぞれ示す。
【００４１】
上記一般式（１）中のＲ４が示す一価の有機基としては、ガレート基、有機酸残基、糖残基等が挙げられる（ここで、残基とは、分子中の原子又は基が除かれて生じる一価の基を意味する）。有機酸残基のもとになる有機酸としては、ｐ−クマル酸、カフェ酸、フェルラ酸、シナピン酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、没食子酸、酢酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸等が挙げられる。糖残基を形成する糖は必要に応じて、例えばフェノール水酸基とエステル結合を介して任意の位置で修飾される。その配糖体形成残基の例としては、ピラノース型のヘキース残基、フラノース型のペントース残基を挙げることができる。具体的には、糖の形態として、グルコース、ガラクトース、ラムノース、キシロース、アラビノース等の単糖類の他に、２糖類や３糖類を挙げることができる。
【００４２】
また、Ｒ４は、ガレート基や有機酸基に糖が結合した配糖体形成残基であってもよい。その場合、例えば、糖は、ガレート基や有機酸基のフェノール水酸基とエステル結合を介して任意の位置で結合する。その配糖体形成残基の例としては、ピラノース型のヘキース残基、フラノース型のペントース残基等を挙げることができる。糖の形態としては、グルコース、ガラクトース、ラムノース、キシロース、アラビノース等の単糖類の他に、２糖類や３糖類を挙げることができる。
【００４３】
なかでも、Ｒ４は、置換基を有していてもよいガレート基を示すことが好ましい。「置換基を有していてもよいガレート基」には、「ガレート基」及び「置換基を有するガレート基」が含まれ、「置換基を有するガレート基」には、「糖が結合したガレート基」等が含まれる。
【００４４】
なお、式（１）中、Ａ環の５位及び／又は７位の水酸基は、ガレート基、糖、有機酸などが結合した修飾基であってもよい。
【００４５】
上記（ｉ）の結合様式によりフラバン−３−オール骨格が互いに結合した構造を有するプロアントシアニジンとしては、例えば、下記一般式（２）で表されるものがある。
【００４６】
【化４】
【００４７】
上記（ｉｉｉ）の結合様式によりフラバン−３−オール骨格が互いに結合した構造を有するプロアントシアニジンとしては、例えば、下記一般式（３）で表されるものがある。
【化５】
【００４８】
ＰＡＣの構成単位同士の主たる結合部位としては、上記のように（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の結合様式があるが、具体例としては、例えば、Ａ−タイプ結合；４位と８位および２位と７位酸素の２箇所、また例えば、Ｂ−タイプ結合；４位と６位または４位と８位のいずれか１箇所、が挙げられる。またこれら結合からなる種々の立体配置を有するＰＡＣが存在する。
【００４９】
ＰＡＣは、天然物由来、あるいは合成品を使用することができるが、天然物由来のＰＡＣが好ましく、植物由来のＰＡＣがより好ましい。このようなＰＡＣを得るための出発素材としては、野菜、ナッツ、樹皮、及びポリフェノール化合物を含む他の植物材料のような、植物から誘導される植物材料からの原料を用いることができる。例えば、殆どの色のついた果実、イチゴ類、及び野菜は、ポリフェノール化合物を含むことが知られている。ポリフェノール化合物を含む植物、果実、イチゴ類、及び野菜の例には、例えば、ブルーベリー葉、ブドウ種子、サトイモ、ビルベリー、エルダーベリー、プラム、ブラックベリー、ストロベリー、レッドカーラント、ブラックカーラント、クランベリー、チェリー、ラズベリー、グレープ実、カーラント、ハイビスカスの花、シシトウガラシ、豆、エンドウ豆、大豆皮、赤キャベツ、パープルコーン、紫サツマイモが含まれるが、それらに限定されるものではない。これらのうち、例えばブルーベリー葉、ブドウ種子、クロトン種樹液由来のようなＰＡＣ組成物の使用が実際的である。
【００５０】
本実施形態にかかるＰＡＣ組成物の具体例として、ブルーベリー葉、ブドウ種子及びクロトン種樹液から得られるプロアントシアニジン組成を表１に示す。
【００５１】
【表１】
【００５２】
本発明の出発素材において、使用する植物の部分は、葉、花弁、萼片、花、葉柄、新芽、根、茎、種子、鞘、塊茎、樹皮、形成層、材木、菌こぶ、果実、野菜、ハーブ、シダ、樹液、樹脂、ブドウ、リンゴ、タマネギやアボカドなどの皮、柑橘類の皮、果物の外皮を含む皮、リンゴ、ワインの絞りかす、穀粒の外皮、藁、干し草、オリーブ、アブラナ或いはカノラ由来の油製種子の塊、及びその他油料作物抽出物等を任意に用いることができる。
【００５３】
本発明で好ましい出発素材として、ブルーベリーが挙げられる。ブルーベリーは、ツツジ科（Ｅｒｉｃａｃｅａｅ）スノキ属（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ）サイアノコカス節（Ｃｙａｎｏｃｏｃｃｕｓ）に属するアメリカ原産の落葉性もしくは常緑性の低木または半高木果樹である。ブルーベリーはおよそ６種類からなるが、果樹園芸上重要なのは下記の三種である。本発明では、使用するブルーベリーについて、種類、由来、原産地を特に制限するものではない。
【００５４】
（１）ハイブッシュブルーベリー（Ｈｉｇｈｂｕｓｈ ｂｌｕｅｂｅｒｒｙ， Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ｃｏｒｙｍｂｏｓｕｍ Ｌ．）：オニール、シャープブルー、ジョージアジェム、フローダブルー、レベレイ、スパルタン、ダロウ、デューク、バークレイ、ハリソン等。
【００５５】
（２）ラビットアイブルーベリー（Ｒａｂｂｉｔｅｙｅ ｂｌｕｅｂｅｒｒｙ， Ｖ． ａｓｈｅｉ Ｒｅａｄｅ， Ｖ． ｖｉｒｇａｔｕｍ Ａｉｔｏｎ）：ウッダード、ガーデンブルー、ティフブルー、ホームベル、マイヤー等。
【００５６】
（３）ローブッシュブルーベリー（Ｌｏｗｂｕｓｈ ｂｌｕｅｂｅｒｒｙ， Ｖ． ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍ Ａｉｔｏｎ； Ｖ． ｍｙｒｔｉｌｌｏｉｄｅｓ Ｍｉｃｈａｕｘ）：チグネクト、ブロンズウィック、ブロミドン等。
【００５７】
本発明の有効成分である天然物由来のＰＡＣ組成物は、目的に応じて以下の工程を適宜組み合わせることにより得ることができる。
【００５８】
（１）前処理加工：
葉、皮、果実、茎、根等の全草部位に応じて、あらかじめ水洗、濾別などにより物理的に不純物を除く。あるいは、葉緑素、繊維素等、本発明のＰＡＣ以外の成分を溶媒で留去することもできる。この溶媒には、留去する対象により異なるが、クロロホルム、ヘキサン、アセトン等を用いることができる。生の素材は、そのまま粉砕しても乾燥後粉砕して、粉末状で次工程に供してもよいし、生素材からの搾汁液、抽出液を次工程に供してもよい。搾汁又は抽出液は、濃縮又は乾燥して粉末状で次工程に供してもよい。
【００５９】
乾燥手段は、本発明の薬理効果を損なわなければ特に制限はなく、真空凍結乾燥、熱風乾燥、遠赤外線乾燥、減圧乾燥、マイクロ波減圧乾燥、及び過熱蒸気乾燥等を広く用いることができる。なかでも、成分変化の少ない真空凍結乾燥が好適に使用できる。真空凍結乾燥条件は、原料素材の種類、部位の状態によって適宜選択できるが、例えば生葉をそのまま乾燥する際の凍結温度は−３０〜−２０℃、乾燥温度は−３０〜３０℃、乾燥時間は１５〜２４時間の範囲が好ましい。
【００６０】
（２）抽出工程：
前工程で得られた加工処理物は、次に溶媒抽出することができる。溶媒抽出には、下記の溶媒を適宜組み合わせて、必要に応じ多段抽出する。使用する抽出溶媒は特に制限されないが、水又は水と相溶性のある極性溶媒の使用が好適である。水と相溶性のある極性溶媒としては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどの炭素数１〜４の低級アルキルアルコール；エチレングリコール、ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリンなどの多価アルコールなどを挙げることができる。アルコールとしては、安全性の観点から低級アルコール、特にメタノールやエタノールの使用が実際的である。他の有機溶媒としては、例えばアセトン、ジエチルエーテル、ジオキサン、アセトニトリル、酢酸エチルエステル、キシレン、クロロホルム、トルエン、ヘキサンなどを挙げることができる。水と極性溶媒の組み合わせを含め、これらの溶媒は、単独あるいは２種以上を組み合わせて使用してもよい。例えば、アセトンとエチルエーテルの混合溶媒、好ましくはアセトンとエチルエーテルの１ ： １（ｖ／ｖ）混合液の使用が可能である。一般的には、極性溶媒と水との混合溶媒の使用が望ましい。これらの含水溶媒としては、含水アルキルアルコール、より好ましくは含水メタノール、含水エタノールである。含水アルコール中のアルコール濃度は、５〜９０容量％、好ましくは８０〜９０容量％、より好ましくは５０〜９０容量％である。アルコール以外の好ましい混合溶媒としては、水とアセトンの混液を挙げることができる。
【００６１】
抽出操作としては、加工処理物を溶媒に冷浸、温浸などの浸漬処理が挙げられる。通常は、加温下で撹拌しながら抽出し、ろ過して抽出液を得る。例えば、８０容量％エタノール水溶液による撹拌抽出では、溶液温度は、望ましくは室温、浸漬時間は温度により異なるが３０秒〜１時間の範囲内が好適である。また、パーコレーション法によることもできる。
【００６２】
得られた抽出物は、必要に応じてろ過又は遠心分離により固形物を除去する。ろ液は、次工程の要求に応じてそのまま用いるか、又は溶媒を留去して一部濃縮もしくは乾燥して用いてもよい。必要に応じて、これらの抽出、濃縮物は精製する。精製方法は、特に限定されないが、例えばカラム法や溶媒による分割法などを挙げることができる（ＷＯ００／６４８８３号公報参照）。
【００６３】
ＰＡＣ組成物は、抽出液、濃縮エキス、ペースト、乾燥、半乾燥物など、最終利用形態としてはさまざまな形で利用できる。精製されたＰＡＣ組成物は、濃縮されているので、一般に単純な抽出物に比べより高い薬理活性（肝線維化抑制活性）を有する。
【００６４】
得られたＰＡＣ組成物は、そのまま、又は、プロドラッグ若しくは薬剤として、利用できる。本実施形態に係る肝線維化抑制剤又は肝星細胞増殖抑制剤は、ＰＡＣ組成物、その生理学的に許容される塩、それらの水和物及び／又はそれらの溶媒和物からなる薬剤であっても良いが、一般には上記の物質と薬理学的及び製剤学的に許容される添加物を含む医薬組成物に調製することが望ましい。
【００６５】
薬理学的及び製剤学的に許容しうる添加物としては、例えば賦形剤、崩壊剤、崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤、溶解補助剤、張化剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、噴射剤、及び粘着剤などを用いることができる。
【００６６】
本実施形態に係る肝線維化抑制剤又は肝星細胞増殖抑制剤を医薬品とする場合は、投与単位形態で投与することが好ましく、経口投与、組織内投与（皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与など）、局所投与（経皮投与など）、又は経直腸的に投与をすることもできる。
【００６７】
経口投与剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、細粒剤、顆粒剤などから適宜選択すればよい。また経口投与用液状医薬製剤としては、乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤などを挙げることができる。製剤にあたっては、各種製剤に応じた賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色料、矯味矯臭剤、ｐＨ調整剤などを適宜配合することができる。例えば、錠剤の場合は、必要に応じて、通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶錠、フィルムコーティング錠、二重錠、又は多層錠とすることができる。錠剤の形態に調製するに際しては、担体として、例えば乳糖、白糖、塩化ナトリウム、グルコース、尿素、澱粉、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸などの賦形剤；水、エタノール、プロパノール、単シロップ、グルコース液、澱粉液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドンなどの結合剤；乾燥澱粉、アルギン酸ナトリウム、寒天末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、澱粉、乳糖などの崩壊剤；白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油などの崩壊抑制剤；第４級アンモニウム塩類、ラウリル硫酸ナトリウムなどの吸収促進剤；グリセリン、澱粉などの保湿剤；澱粉、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸などの吸着剤；精製タルク、ステアリン酸塩、硼酸末、ポリエチレングリコールなどの潤沢剤などを例示できる。
【００６８】
組織内投与剤形としては、注射剤を挙げることができる。注射剤として調製するには、非毒性の溶液、乳剤及び懸濁剤などの形態とするのが望ましい。これらは、殺菌され、かつ血液と等張であるのが好ましい。これら液剤、乳剤及び懸濁剤の形態に調製するに際しては、希釈剤として、例えば水、エタノール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類などを用いることができる。また等張性の溶液を調製するに十分な量の食塩、グルコース、又はグリセリン、及び通常の溶解補助剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤なども配合することができる。これらの注射剤は、皮下、筋肉内又は静脈内に投与することができる。
【００６９】
局所投与剤形としては、例えば、局所用液剤、クリーム剤、粉剤、ペースト剤、ゲル剤、軟膏剤などの外用製剤を挙げることができる。これらは、本実施形態に係るＰＡＣ組成物、そのプロドラッグ、製薬上許容されうるそれらの塩等の一定量を、外用製剤の目的に適合する香料、着色料、充填剤、界面活性剤、保湿剤、皮膚軟化剤、ゲル化剤、担体、保存剤、安定剤などのうちの一種以上と組み合わせることにより調製することができる。
【００７０】
経直腸的投与剤形としては、坐剤を挙げることができる。坐剤の形態に調製するに際しては、基材として、例えばパルミチン酸ミリスチルエステルなどの高級エステル類、高級アルコール類、ポリエチレングリコール、カカオ脂、ゼラチン、半合成グリセリド、これらの混合物などの低融点基材を挙げることができる。座剤は、本実施形態に係るＰＡＣ組成物、そのプロドラッグ、製薬上許容され得るそれらの塩等を、上記のような基材に混入し、成型することにより調製することができる。
【００７１】
本実施形態に係る肝線維化抑制剤又は肝星細胞増殖抑制剤などを医薬品として投与する場合、ＰＡＣ組成物（若しくはそのプロドラック、又は製薬上許容され得るそれらの塩）の有効投与量は、患者の年齢、体重、疾病の性質、進展状態、投与経路などにより異なるので特定はできないが、通常は成人一人、体重６０ｋｇ換算で、一日当たり１〜２０００ｍｇの範囲である。患者の状態などに応じて、上記範囲未満又は上記範囲を超える用量を投与することもできる。多量に投与するときは、一日数回に分割して投与することが望ましい。医薬品の場合、ＰＡＣの有効含量は、投与量又は服用量との関係で一概に特定できないが、０．１〜９９．５重量％、好ましくは０．５〜９０重量％の範囲で選択すればよい。
【００７２】
本実施形態に係るＰＡＣ組成物を用いた医薬品の用途としては、肝線維化抑制剤、肝星細胞増殖抑制剤、肝星細胞ＤＮＡ合成活性化抑制剤、肝星細胞アポトーシス誘導剤、又は、肝繊維化を病因とする肝疾病（例えば肝硬変や肝癌）の発症若しくは進展抑制剤、等を挙げることができる。
【００７３】
本実施形態に係るＰＡＣ組成物は、肝線維化抑制を含め、上記疾病の発症及び進展の予防のための機能性補助飲食物としても利用できる。機能性飲食物製剤としては、固体状、液体状、エマルジョンなどが可能であるが、必要に応じて薬学的もしくは食品上許容される担体又は添加剤を配合することもできる。添加剤には、一般的な剤形補助剤などの外、他の薬剤、機能性成分、例えばビタミン類、その他の微量成分などの有効成分を含むことができる。剤形は、特に問わないが、経口に適した形態であることが好ましい。また、その形態は特に制限されないが、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、トローチ剤、又は溶液剤（ドリンク）などの形態に調製することができる。
【実施例】
【００７４】
以下、実施例を挙げて本発明についてより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。以下の実施例において、「％」は、特に言及しない限り、「ｗ／ｗ％（質量％）」を意味する。
【００７５】
１．各素材からのＰＡＣの調製
ＰＡＣは、上述のとおり、広く植物界から見いだされている。ＰＡＣを含有することが報告されている下記に挙げる素材（試料１〜３）を入手し、ＰＡＣ画分を調製した。
【００７６】
試料１：ブルーベリー葉
試料２：ブドウ種子抽出物（グラヴィノールＴＭ：キッコーマン株式会社）
試料３：クロトン樹液（Ｓａｎｇｒｅ ｄｅ Ｄｒａｇｏ； Ｒａｉｎｔｒｅｅ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ， Ｉｎｃ．）
【００７７】
（試料１：ブルーベリー葉由来ＰＡＣ画分の調製）
ラビットアイブルーベリー種（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ Ａｉｔｏｎ）の生葉を、凍結乾燥（ＦＴＳ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｄｕｒａ−Ｔｏｐ ＭＰ＆Ｄｕｒａ−Ｄｒｙ ＭＰ）し、超遠心粉砕機（ＭＲＫ＆ＲＥＴＳＣＨ、ＥＭ−１）で粉砕することで、ブルーベリー葉の凍結乾燥粉末を得た。この凍結乾燥粉末１０ｇに１００ｍｌのヘキサンを加え、室温で３０分間振盪抽出し、デカンテーションにより残渣を回収した。この抽出操作を３回繰り返し、ブルーベリー葉ヘキサン洗浄物を得た。
【００７８】
さらに、得られたブルーベリー葉ヘキサン洗浄物に、１００ｍｌの酢酸エチルを加え、同様に３０分間振盪抽出し、デカンテーションにて残渣を回収した。これも同様に３回繰り返し、ヘキサン−酢酸エチル洗浄物を得た。
【００７９】
次に、ヘキサン−酢酸エチル洗浄物に１００ｍｌのメタノールを加え、３０分間振盪抽出し、ろ過にて抽出液を回収し、残渣に再度メタノール１００ｍｌを加え、同様に３回繰り返し抽出液を合わせた。
【００８０】
抽出液をエバポレーターで減圧濃縮後、凍結乾燥し、ブルーベリー葉メタノール抽出物約３．５ｇを得た。さらに、この抽出物約５００ｍｇを６０％メタノールに溶解し、６０％メタノールで平衡化したセファデックスＴＭＬＨ−２０（容量１００ｍｌ；ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）カラムにアプライし、６０％メタノール４００ｍｌで洗浄し、次に１００％メタノール４００ｍｌで洗浄した。その後７０％アセトン４００ｍｌで溶出させ、減圧濃縮後、凍結乾燥し、ブルーベリー葉由来ＰＡＣ画分（試料１）を約１００ｍｇ得た。同様に以下の試料を調製した。
【００８１】
（試料２〜３由来のＰＡＣ画分の調製）
試料２〜３は、素材を直接入手して、１００％メタノールで抽出を行い、減圧濃縮後、凍結乾燥した。その後、上記調製と同じように、セファデックスＬＨ−２０でＰＡＣ画分を調製した。
【００８２】
ＰＡＣ調製物の組成解析
各起源から抽出された上記試料１〜３につき、ＰＡＣ純度、組成及び平均重合度を調べた。以下に用いた解析方法と結果を示す。
【００８３】
２．ブタノール−塩酸加水分解法（ポーター法）
下記文献の方法に従い、ポーター法を用いてＰＡＣの分析を行った。
・Ｐｏｒｔｅｒ Ｌ． Ｊ． ｅｔ ａｌ．、“Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”、１９８６年、第２５巻、ｐ．２２３−２３０
・Ｓｈｏｊｉ Ｔ． ｅｔ ａｌ．、“Ｊ． Ａｇｒｉｃ． Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．”、２００６年、第５４巻、ｐ．８８４−８９２
【００８４】
ＰＡＣは酸性条件下における加熱により、フラバン間の結合が切断され、カルベニウムイオンとカテキン類を与える。前者はさらに酸化されて赤色のアントシアニジンとなる。この原理を利用した呈色法がポーター法であり、５４０ｎｍの吸光度の上昇により、試料中のＰＡＣを鋭敏に検出できる。
【００８５】
（１）ポーター法によるＰＡＣの定性及び定量
精製画分をメタノールに溶解し、その２００μｌに５％（ｖ／ｖ）塩酸を含む１−ブタノール７５０μｌと１％（ｗ／ｖ）硫酸鉄アンモニウムを含む２ｍｏｌ／Ｌ塩酸５０μｌを添加し、１０５℃で４０分間反応させた。反応液を室温に戻し、５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。コントロールとしてプロシアニジンＢ２（Ｓｉｇｍａ社製）を用いた。
【００８６】
（２）組成分析；ＬＣ／ＭＳ法
ＬＣ／ＭＳを用いて上記ポーター法反応分解物の分析を実施した。もしブルーベリー葉から精製したＰＡＣであれば、アントシアニジンを検出するはずである。ＬＣ／ＭＳに用いた装置及び条件は下記の通りである。
・装置：Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ／ＭＳ−ＩＴ−ＴＯＦ
・カラム：Ａｔｌａｎｔｉｓ Ｔ３、２．１ｍｍ Ｉ．Ｄ．×１００ｍｍ、３μｍ（Ｗａｔｅｒｓ製）、４０℃
・移動相（溶出液）：（Ａ）５ｍＭギ酸アンモニウムを含む０．５％（ｖ／ｖ）ギ酸
（Ｂ）アセトニトリル
・グラジエント：溶出液Ｂ １０％（０分）→４０％（１５分）→１００％（１５分）→１００％（２２．５分）
・移動相流速：０．２５ｍｌ／分
・検出器１：フォトダイオードアレイ５４０ｎｍ
・検出器２：ＥＳＩ−ＭＳ
（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ−Ｉｏｎ Ｍｏｄｅ、インターフェイス電圧：４．５ｋＶ、
ＣＤＬ温度２００℃、ネブライズガス流量：１．５Ｌ／分、
ドライガス圧力：２００ｋＰａ、ヒートブロック温度：２００℃）
【００８７】
上記で調製した各植物由来ＰＡＣ調製物のサンプルは本法によって赤色を呈したことから、ＰＡＣの存在が明らかとなった。また、ＬＣ／ＭＳ分析の結果、分解物のメインピークの溶出時間はシアニジン標品と同じであり、ＭＳ／ＭＳスペクトルも一致したことからＰＡＣと同定された（図２）。さらにプロシアニジンＢ２を標品として定量した結果、ＰＡＣの純度は５５．９１〜８８．１２％となった（表１）。
【００８８】
また、ＬＣ／ＭＳによってアントシアニジン組成を解析した結果、ブルーベリー葉とブドウ種子由来の調製物はプロシアニジンが１００％であったが、クロトン種樹液由来のものはプロデルフィニジンが約４割含まれていることが分かった（表１）。
【００８９】
３．チオール開裂によるＰＡＣの平均重合度と構成ユニット組成の解析
上記結果より、各植物由来調製物の主成分がＰＡＣであることが示された。次いでここでは、ＰＡＣの構成単位、結合様式及び重合度を調べるために、Ｇｕｙｏｔらの方法（Ｇｕｙｏｔ Ｓ． ｅｔ ａｌ．、“Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．”、２００１年、第４９巻、ｐ．１４−２０参照）に基づきチオール開裂分析を行った。
【００９０】
図３に、チオール開裂の基本反応を示す。チオール開列の基本反応においては、ＰＡＣを酸性条件下でトルエン−α−チオールと反応させることにより、エクステンションユニットはベンジルチオエーテル付加物となり、ターミナルユニットは遊離のフラバン−３−オールとなる。それらチオール開裂反応産物を逆相ＨＰＬＣで分析することにより、ターミナルユニットとエクステンションユニットの各組成や平均重合度（ｍＤＰ）の情報を得ることができる。平均重合度（ｍＤＰ）は、以下の式により求めることができる。
平均重合度（ｍＤＰ）＝［ターミナルユニット＋エクステンションユニット］／［ターミナルユニット］
【００９１】
標品としてカテキンとエピカテキンを用い、チオール開裂の反応中に生じる遊離のフラバン−３−オールの異性化も考慮に入れて補正を行った（Ｇｕ Ｌ． ｅｔ ａｌ．、“Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．”、２００２年、第５０巻、ｐ．４８５２−４８６０参照）。
【００９２】
（１）チオール開裂、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）条件
ブルーベリー葉由来活性化合物ＰＡＣを、メタノールで１ｍｇ／ｍｌに調製し、５０μｌを取り、３．３％（ｖ／ｖ）塩酸メタノール５０μｌを加え、５％（ｖ／ｖ）トルエン−α−チオール１００μｌを加え、５０℃で３０分間反応させた後、反応液を５倍にメタノールで希釈し、ＨＰＬＣに供した。ＨＰＬＣ条件を以下に示す。
・装置：Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ ＬＣ−２０Ａ
・カラム：Ａｔｌａｎｔｉｓ Ｔ３，４．６ｍｍ Ｉ．Ｄ．×１５０ｍｍ，３μｍ（Ｗａｔｅｒｓ製）、４０℃
・移動相（溶出液）：（Ａ）０．０５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸
（Ｂ）アセトニトリル
・グラジエント：溶出液Ｂ １５％（０分）→２５％（１０分）→６０％（４０分）→１００％（４０分）→１００％（５０分）
・移動相流速：０．７０ｍｌ／分
・検出器：ＵＶ２８０ｎｍ
【００９３】
（２）反応物の同定；液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣ／ＭＳ）
上記反応物を同様にＬＣ／ＭＳに供し各検出ピークの同定を行った。分析条件は下記に示す。
・装置：Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ／ＭＳ−ＩＴ−ＴＯＦ
・カラム：Ａｔｌａｎｔｉｓ Ｔ３，２．１ｍｍ Ｉ．Ｄ．×１００ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ製）
・移動相（溶出液）：（Ａ）０．０５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸
（Ｂ）アセトニトリル
・グラジエント：溶出液Ｂ １５％（０分）→２５％（１０分）→６０％（４０分）→１００％（４０分）
・移動相流速：０．２５ｍｌ／分
・検出器１：フォトダイオードアレイ２８０ｎｍ
・検出器２：ＥＳＩ−ＭＳ
（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ−Ｉｏｎ Ｍｏｄｅ、インターフェイス電圧：４．５ｋＶ、ＣＤＬ温度２００℃、ネブライズガス流量：１．５Ｌ／分、ドライガス圧力：２００ｋＰａ、ヒートブロック温度：２００℃）
【００９４】
ブルーベリー葉から調製したＰＡＣをチオール開裂し、ＨＰＬＣで分離したところ、主に８本のメインピークが確認できた。ＨＰＬＣのクロマトグラムを図４に示す。カテキン、エピカテキンとトルエン−α−チオールは、標品の溶出時間より確認を行い、ピークＡはカテキン、ピークＣはエピカテキン、そしてピークＨはトルエン−α−チオールと判明した。他のピークはＬＣ／ＭＳで再度分析を行い、各ピークのＭＳスペクトルを確認した。
【００９５】
ピークＥはｍ／ｚ＝４１１．０８９２を検出し、この組成を組成推定によりＣ２２Ｈ２０Ｏ６Ｓ（Ｅｒｒｏｒ＝−３．８ｐｐｍ）と推定した。また、ＭＳ／ＭＳスペクトルにｍ／ｚ＝２８７．０５１０を検出し、親ＭＳとＭＳ／ＭＳの差が１２４．０３８２であったことから、ピークＥはベンジルチオエーテル付加物であることが推定された。加えて、親イオンから推定した組成式Ｃ２２Ｈ２０Ｏ６Ｓからトルエン−α−チオールの組成式Ｃ７Ｈ８Ｓの部分を差し引くとＣ１５Ｈ１４Ｏ６となり、これらのことからピークＥはカテキンもしくはエピカテキンのベンジルチオエーテル付加物であることが確認できた。さらに、プロシアニジンＢ２標品をチオール開裂した場合、エピカテキンとエピカテキンベンジルチオエーテルが生成する。この分解物を分析したとき、エピカテキンベンジルチオエーテルとピークＥの溶出時間が同じであったことから、ピークＥはエピカテキンベンジルチオエーテルとした。
【００９６】
ピークＧは、親イオンとしてｍ／ｚ＝６９７．１３８５を、ＭＳ／ＭＳにｍ／ｚ＝５７３．０９８７を検出し、その差が１２４．０３９８になることからこのピークもベンジルチオエーテル付加物であることが分かった。この精密質量からＣ３７Ｈ３０Ｏ１２Ｓと推定した。この組成からベンジルチオエーテル付加物を除くと、Ｃ３０Ｈ２４Ｏ１２となることから、ピークＧはカテキンやエピカテキンからなるＡ−タイプ２量体のベンジルチオエーテル付加物であると推定された。
【００９７】
Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｒ． Ｓ． ｅｔ ａｌ．、“Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．Ｉ”、１９７２年、ｐ．１３８７−１３９９参照）によると、Ａ−タイプのフラバン間結合はチオール開裂に対して抵抗性があるとされている。チオール開裂反応後、ターミナルユニットにＡ−タイプが存在すれば、それに対応するＡ−タイプ２量体として遊離し、エクステンションユニットにあればそれに相当するベンジルチオエーテル付加物が検出される（Ｆｏｏ Ｌ． Ｙ． ｅｔ ａｌ．、 “Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．”、２０００年、第６３巻、ｐ．１２２５−１２２８参照）。
【００９８】
ピークＢの親イオンはｍ／ｚ＝８６３．１８２２で、この精密質量から組成を推定するとＣ４５Ｈ３６Ｏ１８（Ｅｒｒｏｒ＝−０．８６ｐｐｍ）となった。Ｂ−タイプ３量体の分子式はＣ４５Ｈ３８Ｏ１８であり、Ａ−タイプはＣ４５Ｈ３４Ｏ１８であることから、このピークＢはＡ−タイプとＢ−タイプが混在した３量体と推測した。
【００９９】
また、ピークＤはｍ／ｚ＝９８５．２００９であり、ベンジルチオエーテル付加物を除くとＣ４５Ｈ３６Ｏ１８となり、この化合物はＡ−Ｂ−タイプ混在型の３量体ベンジルチオエーテルであることが推測できた。
【０１００】
ピークＦはｍ／ｚ＝６０５．１４４９を検出し、ＭＳ／ＭＳでｍ／ｚ＝４８１．１１０９を検出したことから、このピークはベンジルチオエーテル付加物と考えられたが、付加物を除くとＣ２５Ｈ２４Ｏ１０となりそれ以上の情報は得られなかったため、表２ではＵｎｋｎｏｗｎと表示している。
【０１０１】
上記より調製したＰＡＣをチオール開裂した結果、その分解物にフラバン−３−オールモノマーとフラバン−３−オールモノマーのベンジルチオエーテル付加物以外に遊離の３量体とＡ−タイプ２量体と３量体ベンジルチオエーテル付加物が検出され、その組成比が比較的多いことから、ｍＤＰの計算方法を改めた。
【０１０２】
すなわち、検出されたフラバン−３−オールの重合度をｎとすると（ベンジルチオエーテル付加物も含めて）ｍＤＰは、以下の式により求める値とした。
ｍＤＰ＝［（ベンジルチオエーテル付加物×ｎ）の総和＋（遊離フラバン−３−オール×ｎ）の総和］／［遊離フラバン−３−オールの総和］
【０１０３】
加えて、検出されたフラバン−３−オールとそのベンジルチオエーテル付加物の面積比は、既知のプロシアニジンＢ２標品のチオール開裂反応物から算出し、それぞれ補正を行った。その結果、表２に示すとおり、ブルーベリー葉から調製したＰＡＣのｍＤＰは１１．２であった。加えて、その組成は全体的にエピカテキンの比率が高く、ターミナルユニットでは４２．６％、エクステンションユニットでは６９．６％であったが、検出されたＡ−タイプ２量体やＡ−Ｂ−タイプ混在３量体の組成が不明なので、検出されたモノマーのみで全体の組成を見ると、９５％以上がエピカテキンで構成されていることが分かった。
【０１０４】
本発明に用いたＰＡＣの平均重合度（ｍＤＰ）と組成を表２、３に示す。
【０１０５】
【表２】
【０１０６】
【表３】
【０１０７】
表２の結果から、各起源のＰＡＣ調製物は以下のように特徴づけられた。
（１）ブルーベリー葉由来のＰＡＣは平均重合度が１１．２であり、エピカテキン組成比が高く、すべてプロシアニジンで構成されていた。加えて、Ａタイプの結合を有しており、さらに未同定な側鎖も確認できた。
（２）ブドウ種子由来のものは平均重合度が１４．４とブルーベリーより長く、ターミナルユニットはカテキンの組成比が高く、エクステンションはエピカテキンとエピカテキンガレートがおよそ１：１であった。Ａタイプの結合様式やガレート以外の側鎖は確認されなかった。
（３）クロトン種樹液由来のものは平均重合度が８．３で、ガロカテキンとエピガロカテキンを確認した。そのプロデルフィニジン含量は約４０％であった。
【０１０８】
４．ＰＡＣ調製物の機能解析
肝星細胞として、ヒト培養肝星細胞継代培養株（ＬＩ９０；財団法人ヒューマンサイエンス振興財団より購入，カタログＮｏ．，ＪＣＲＢ０１６０）を用い、肝線維化抑制機能を評価した。
【０１０９】
被検試料としては、調製例１の方法で精製したＢＢ−ＰＡＣ、調製例２の方法で精製したＧＳ−ＰＡＣ、及び調製例３の方法で精製したＣＬ−ＰＡＣを用いた。ＰＡＣあるいはＥＧＣＧ［（-）−エピガロカテキン−Ｏ−ガレート；クリタ高純度試薬、クリタ分析センター（株）、Ｌｏｔ Ｎｏ．０４８３１１］、カテキン［（±）−カテキン；クリタ高純度試薬、クリタ分析センター（株）、Ｌｏｔ Ｎｏ．Ｃ０１２００２Ｊ１５］、エピカテキン（ＳＩＧＭＡ、Ｅ１７５３−１Ｇ、Ｌｏｔ Ｎｏ．０２６Ｋ２６１１）及びプロシアニジンＢ２（Ｂｉｏ Ｃｈｅｍｉｋａ、４２１５７、１ｍｇ）は、いずれも最終濃度が０．１から１０μｇ／ｍｌになるように、無血清ＤＭＥＭ培地で希釈し添加した。上記試薬の溶媒であるＤＭＳＯの最終濃度は、全群で０．１％に統一した。１時間の前培養の後、ＰＤＧＦ−ＢＢ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ、Ｎｏ．２２０−ＢＢ）を最終濃度１０ｎｇ／ｍｌになるようにＬＩ９０に添加し、さらに培養した。培養終了後、ＬＩ９０の増殖をＭＴＴ法にて、ＤＮＡ合成量をＢｒｄＵ ｌａｂｅｌｉｎｇ＆ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏ．，ＵＳＡ）を用いて評価した。また、アポトーシスにより生じるＤＮＡ断片化の相対量は、Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡＰＬＵＳ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏ．，ＵＳＡ）により測定した。ＥＲＫ（ｐ４２とｐ４４）及びＡｋｔ（Ｓｅｒ４７３）のリン酸化は、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法により検出し、得られたバンドの濃さを定量し、数値化した。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法に用いた抗体は、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２）（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）（Ｄ１３．１４．４Ｅ）ウサギモノクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ、＃９９１０）、ｐ４４／４２（Ｅｒｋ１／２）（１３７Ｆ５）ウサギモノクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ、＃９９２６）、Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）（Ｄ９Ｅ）ウサギモノクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ、＃９９１６）及びＡｋｔ（ｐａｎ）（Ｃ６７Ｅ７）ウサギモノクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ、＃９９１６）である。
【０１１０】
各実験結果における統計学的な有意差の検定は、多重比較検定（Ｔｕｋｅｙ法及びＤｕｎｎｅｔ法）によった。
【０１１１】
図５は、ＢＢ−ＰＡＣによるＬＩ９０細胞数の増殖抑制効果を示す。同図に示すように、ＢＢ−ＰＡＣは、１〜１０μｇ／ｍｌの濃度範囲で、ＬＩ９０細胞数の増殖を抑制するとともに、ＰＤＧＦ−ＢＢ処理したＬＩ９０細胞数の増加も抑制した。
【０１１２】
図６は、ＢＢ−ＰＡＣによるＰＤＧＦ−ＢＢ処理したＬＩ９０細胞のＤＮＡ合成活性化抑制効果を示す。同図に示すように、ＢＢ−ＰＡＣは、１μｇ／ｍｌにおいてＤＮＡ合成量の増加をほぼコントロールレベルまで抑制した。
【０１１３】
図７は、ＢＢ−ＰＡＣによるＰＤＧＦ−ＢＢ処理したＬＩ９０細胞のＥＲＫ及びＡｋｔリン酸化抑制効果を示す。同図に示すように、ＢＢ−ＰＡＣは、１μｇ／ｍｌにおいてＰＤＧＦ−ＢＢ処理によるＥＲＫのリン酸化を完全に抑制した。またＰＤＧＦ−ＢＢ処理によるＡｋｔ（Ｓｅｒ４７３）のリン酸化を部分的に抑制した。
【０１１４】
図８は、ＢＢ−ＰＡＣ以外のＰＡＣによるＰＤＧＦ−ＢＢ処理したＬＩ９０細胞のＤＮＡ合成活性化抑制効果を示す。同図に示すように、ブドウ種子由来のＧＳ−ＰＡＣ及びクロトン種樹液由来ＣＬ−ＰＡＣは、ＧＳ−ＰＡＣと同一の濃度で、ＢＢ−ＰＡＣ同様にＰＤＧＦ−ＢＢによるＬＩ９０細胞のＤＮＡ合成量の増加を強く抑制した。
【０１１５】
図９は、ＰＡＣの重合度によるＰＤＧＦ−ＢＢ処理したＬＩ９０細胞のＤＮＡ合成活性化抑制効果を示す。同図に示すように、ＰＡＣ単量体からなるカテキン、エピカテキン及びＥＧＣＧ、及びエピカテキン二量体からなるプロシアニジンＢ２は、ポジティーブコントロールのＢＢ−ＰＡＣ（平均重合度１１．２）と同一濃度範囲（３及び１０μｇ／ｍｌ）では、ＢＢ−ＰＡＣ及びＥＧＣＧ（コントロール）に匹敵するようなＤＮＡ合成量増加抑制効果は認められなかった。
【０１１６】
図１０は、ＢＢ−ＰＡＣによるＰＤＧＦ−ＢＢ処理したＬＩ９０細胞の増殖抑制及びアポトーシス誘導効果を示す。同図に示すように、ＢＢ−ＰＡＣは、３−１０μｇ／ｍｌの濃度範囲で、濃度依存的にＰＤＧＦ−ＢＢ処理したＬＩ９０細胞の増殖を抑制するとともに、ＤＮＡの断片化を有意に促進した。後者は、ＢＢ−ＰＡＣがＰＤＧＦ−ＢＢ処理したＬＩ９０細胞のアポトーシスを誘導する活性があることを示唆している。
【０１１７】
これらのことから、結論として次のことが言える。
（１）ブルーベリー葉由来ＢＢ−ＰＡＣは、ＬＩ９０細胞の増殖、及びＰＤＧＦ−ＢＢ処理によるＬＩ９０細胞のＤＮＡ合成活性化をＥＧＣＧ同様に強く抑制する。
（２）ブドウ種子由来のＧＬ−ＰＡＣ及びクロトン樹液由来のＣＬ−ＰＡＣにもブルーベリー葉由来のＢＢ−ＰＡＣと同等の抑制効果が認められる。
（３）カテキン、エピカテキン及びプロシアニジンＢ２のような単量体や二量体には、同様の抑制効果が殆ど認められない。
（４）ブルーベリー葉由来のＢＢ−ＰＡＣは、ＰＤＧＦ−ＢＢ処理によるＥＲＫ及びＡｋｔのリン酸化を抑制する。
（５）ＢＢ−ＰＡＣは、ＰＤＧＦ−ＢＢ処理したＬＩ９０細胞のアポトーシスを誘導する。
【産業上の利用可能性】
【０１１８】
ＰＡＣ組成物を有効成分とする、肝線維化の抑制剤、肝星細胞増殖抑制、肝星細胞ＤＮＡ合成活性化抑制剤、肝星細胞アポトーシス誘導剤、また肝線維化を病因とする肝疾患、例えば肝硬変や肝癌の発症もしくは進展抑制剤は、肝疾患の予防又は治療に優れた効果を示す。加えて、長期間にわたり服用できるところから、これらの改善のための機能性補助飲食物としても利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】ＰＡＣを構成するフラバン化合物の代表成分であるエピカテキン及びカテキン並びにフラバン環３位水酸基にしばしばエステル結合する没食子酸の構造式図である。
【図２】（Ａ）はシアニジン標品のＭＳ／ＭＳスペクトルで、（Ｂ）はブルーベリー葉由来ＰＡＣのポーター法分解物ＭＳ／ＭＳスペクトルを示すグラフである。
【図３】ＰＡＣを酸性条件下、ベンジルメルカプタンと共に加熱する反応であるチオール開裂を示した模式的図である。
【図４】ブルーベリー葉由来のＰＡＣのチオール開裂反応生成物の逆相クロマトグラムを示すグラフである。
【図５】ＰＤＧＦ−ＢＢ処理又は未処理によるＬＩ９０細胞の細胞増殖に対するＢＢ−ＰＡＣの作用を示すグラフである。
【図６】ＰＤＧＦ−ＢＢ処理又は未処理によるＬＩ９０細胞のＤＮＡ合成に対するＢＢ−ＰＡＣの作用を示すグラフである。
【図７】ＰＤＧＦ−ＢＢ又は未処理によるＬＩ９０細胞のＥＲＫ及びＡｋｔリン酸化に対するＢＢ−ＰＡＣの作用を示す写真及びグラフで、（Ａ）及び（Ｃ）は写真、（Ｂ）及び（Ｄ）はグラフである。
【図８】ＰＤＧＦ−ＢＢ処理又は未処理によるＬＩ９０細胞のＤＮＡ合成に対するＢＢ−ＰＡＣ、ＧＳ−ＰＡＣ、ＣＬ−ＰＡＣの作用を示すグラフである。
【図９】ＰＤＧＦ−ＢＢ処理又は未処理によるＬＩ９０細胞のＤＮＡ合成に対するＢＢ−ＰＡＣの作用と、ＥＧＣＧ、カテキン、エピカテキン及びプロシアニジンＢ２の作用を示すグラフである。
【図１０】ＰＤＧＦ−ＢＢ処理によるＬＩ９０細胞の細胞増殖とＤＮＡ断片化に対するＢＢ−ＰＡＣの作用を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロアントシアニジン（以下、「ＰＡＣ」という）を有効成分として含む肝線維化抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝線維化は肝臓の炎症や毒物による肝細胞の損傷、肝血流の変化、あるいはウイルス、細菌、真菌又は寄生虫の感染症など、非常に多くの因子によって生じる病態である。また、先天性代謝異常が線維化に関わることも多く、脂質代謝異常（ゴーシェ病）、糖原病、α抗トリプシン欠損症、鉄過剰蓄積症候群（ヘモクロマトーシス）、銅蓄積症（ウィルソン病）、毒性代謝産物の蓄積（チロシン血症，果糖血症，ガラクトース血症）、ペルオキシソームの異常（ゼルウェガー症候群）などが知られている。さらに、アルコール、メトトレキサートなどの化学物質や薬物、あるいは肝臓の循環障害（慢性心不全、バッド−キアリ症候群、静脈閉塞症、門脈血栓症など）や慢性的な胆汁流出路の閉塞も肝線維化の原因となる。
【０００３】
ウイルス性肝炎などの慢性肝炎から肝硬変への進行過程において肝線維化は主要な病態であり、肝線維化を抑えることは肝硬変を予防する上で極めて重要である。特にＣ型肝炎治療でのインターフェロン無効例においては、肝線維化抑制療法の開発が急務である。肝線維化の主たる原因は肝非実質細胞の一つである肝星細胞からの細胞外マトリックス（コラーゲン、ラミニン、プロテオグリカンなど）の異常産生である。肝星細胞の機能は肝マクロファージであるクッパー細胞の産生するサイトカイン及び増殖因子により調節されている。血小板由来増殖因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ； ＰＤＧＦ）は、肝星細胞の活性化促進因子の一つであり、肝星細胞の増殖を促進することにより肝線維化をもたらす。従って、肝星細胞の増殖あるいはＰＤＧＦによる活性化を抑制する薬剤が開発されれば、これにより肝線維化を抑制し、ウイルス性肝炎などの慢性肝障害から肝硬変への進展を抑制することが可能である。
【０００４】
肝星細胞の活性化を抑制する天然物化合物としては、緑茶由来のカテキン、エピカテキン等が知られている。緑茶カテキン療法は胆道閉鎖症術後患者の酸化ストレスを軽減し肝線維化を抑制することが報告されている。
【０００５】
非特許文献１、２及び３にはエピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（以下「ＥＧＣＧ」という）が、組み替えヒト血小板由来増殖因子（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｐｌａｔｅｌｅｔ-ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ-ＢＢ；以下「ＰＤＧＦ−ＢＢ」という）処理による肝星細胞のＤＮＡ合成量を抑制することが報告されている。
【０００６】
特許文献１では、ウーロン茶や紅茶などの発酵茶から抽出されたＰＡＣを含む高分子ポリフェノール類が脂肪肝の予防や治療に有効であることが述べられている。また、特許文献２ではプロシアニジンおよびその誘導体を含むポリフェノール類を含有する組成物が、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、膵癌、肝細胞癌または大腸癌等の腫瘍の治療に有効であることが示唆されている。
【０００７】
【特許文献１】特開２００７−３２０９５８号公報
【特許文献２】特表２００７−５１９７５２号公報
【非特許文献１】Ｓａｋａｔａ Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｈｅｐａｔｏｌ， ４０， ５２−５９ （２００４）
【非特許文献２】Ｃｈｅｎ Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７８， ２３３８１−２３３８９ （２００３）
【非特許文献３】Ｈｉｇａｓｈｉ Ｎ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｌａｂ． Ｃｌｉｎ． Ｍｅｄ．， １４５， ３１６−３２２ （２００５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、慢性肝炎から肝硬変への病態進展を抑制できる肝線維化抑制剤であって、優れた薬理活性を示し、副作用が少なく長期使用が可能な、肝線維化抑制剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記目的を達成するため、培養ヒト肝星細胞ＬＩ９０のＰＤＧＦ−ＢＢによる活性化の抑制効果を指標に、天然物由来の成分について種々検討した結果、フラバン−３−オールの重合体に、ＥＧＣＧと同等の肝線維化抑制効果があることを見出し、本発明に至った。
【００１０】
すなわち本発明は、プロアントシアニジン組成物を有効成分とする肝線維化抑制剤に関する。
【００１１】
本発明の肝線維化抑制剤は、上記のような構成を備えることにより、優れた薬理活性を示し、副作用が少なく長期使用が可能なものとなる。このような肝線維化抑制剤によれば、ウイルス性肝炎やアルコール性肝障害などの慢性肝障害における肝線維化を効果的に抑制することができる。また、肝線維化を病因とする、肝硬変や肝細胞癌などの病の発症又は進展を、効果的に予防又は抑制することができる。
【００１２】
本発明の肝線維化抑制剤は、上記プロアントシアニジン組成物が、下記一般式（１）で表されるフラバン−３−オール骨格が、下記（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の結合様式で２以上互いに結合した構造を有するものであることが好ましい。
（ｉ）４位炭素及び８位炭素の結合
（ｉｉ）４位炭素及び６位炭素の結合
（ｉｉｉ）４位炭素及び８位炭素の結合並びに２位炭素及び７位酸素の結合
【００１３】
【化１】
【００１４】
式（１）中、Ｒ１及びＲ３はそれぞれ独立に水素原子又は水酸基、Ｒ２は水酸基、Ｒ４は水素原子又は一価の有機基を、それぞれ示す。
【００１５】
上記のような肝線維化抑制剤は、薬理活性に一層優れ、副作用が少なく長期に亘って使用することができる。
【００１６】
本発明の肝線維化抑制剤は、上記プロアントシアニジンが天然物由来であるものであることが好ましい。このような肝線維化抑制剤は、優れた薬理活性を示し、副作用が少なく長期使用が可能で、且つ天然物から容易に加工することができる。
【００１７】
また、本発明は、プロアントシアニジン組成物を有効成分とする肝星細胞増殖抑制剤に関する。
【００１８】
本発明の肝星細胞増殖抑制剤は、肝星細胞の増殖又は活性化を抑制できる肝星細胞増殖抑制剤であって、上記のような構成を備えることにより、優れた薬理活性を示し、副作用が少なく長期使用が可能なものである。
【００１９】
本発明の肝星細胞増殖抑制剤は、上記プロアントシアニジン組成物が、下記一般式（１）で表されるフラバン−３−オール骨格が、下記（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の結合様式で２以上互いに結合した構造を有するものであることが好ましい。
（ｉ）４位炭素及び８位炭素の結合
（ｉｉ）４位炭素及び６位炭素の結合
（ｉｉｉ）４位炭素及び８位炭素の結合並びに２位炭素及び７位酸素の結合
【００２０】
【化２】
【００２１】
式（１）中、Ｒ１及びＲ３はそれぞれ独立に水素原子又は水酸基、Ｒ２は水酸基、Ｒ４は水素原子又は一価の有機基を、それぞれ示す。
【００２２】
上記のような肝星細胞増殖抑制剤は、薬理活性に一層優れ、副作用が少なく長期に亘って使用することができる。
【００２３】
本発明の肝星細胞増殖抑制剤は、上記プロアントシアニジンが天然物由来であるものであることが好ましい。このような肝線維化抑制剤は、優れた薬理活性を示し、副作用が少なく長期使用が可能で、且つ天然物から容易に加工することができる。
【００２４】
本発明の肝星細胞増殖抑制剤は、ある側面において、肝星細胞アポトーシスに基づいて、肝星細胞の増殖又は活性化を抑制するものである。
【００２５】
また、本発明は、上記肝線維化抑制剤又は上記肝星細胞増殖抑制剤を含む、肝線維化を病因とする肝疾病の発症・進展抑制剤に関する。
【００２６】
また、本発明は、上記肝線維化抑制剤又は上記肝星細胞増殖抑制剤を含む、肝線維化抑制、肝星細胞増殖抑制、肝星細胞アポトーシス誘導、肝線維化を病因とする肝疾病の発症抑制、又は、肝線維化を病因とする肝疾病の進展抑制用の、機能性補助飲食物に関する。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によれば、慢性肝炎から肝硬変への病態進展を抑制できる肝線維化抑制剤であって、優れた薬理活性を示し、副作用が少なく長期使用が可能な、肝線維化抑制剤を提供することができる。また本発明によれば、肝星細胞の増殖又は活性化を抑制できる肝星細胞増殖抑制剤であって、優れた薬理活性を示し、副作用が少なく長期使用が可能な、肝星細胞増殖抑制剤を提供することができる。さらに本発明によれば、上記肝線維化抑制剤又は上記肝星細胞増殖抑制剤を含むことを特徴とする、肝疾病の発症・進展抑制剤及び機能性補助飲食物を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下、必要に応じて図面を参照しつつ、本発明を実施するための最良の形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００２９】
本実施形態に係る肝線維化抑制剤及び肝星細胞増殖抑制剤は、プロアントシアニジン組成物（以下、「ＰＡＣ組成物」と表す。）を有効成分とする。ここで、ＰＡＣ組成物は、１種又は複数のプロアントシアニジン（以下、「ＰＡＣ」と表す。）からなる組成物であり、実施形態に係る肝線維化抑制剤及び肝星細胞増殖抑制剤は、多くの場合、複数のＰＡＣからなる組成物を有効成分としている。またＰＡＣ組成物は、ＰＡＣの誘導体、その生理学的に許容される塩、その水和物、その溶媒和物等を含んでも良い。
【００３０】
ＰＡＣは、フラバン骨格を基本として、種々の部位に水酸基を有する単量体が重合してなる重合体化合物群の総称である。このような重合体の構成単位のうち、基端部をターミナルユニット、その他をエクステンションユニットと呼ぶ。また、重合体の重合度は、二量体、三量体のものから１００量体以上の高分子にまで及ぶ。
【００３１】
本実施形態において、薬理活性の観点からＰＡＣの重合度は３以上であることが好ましく、５以上であることがより好ましく、５〜２０であることがさらに好ましい。ただし、ＰＡＣ組成物は、主たる成分が重合度３以上の重合体であれば、モノマー、その他の断片を含んでもよい。また、ＰＡＣ組成物に含まれるＰＡＣの平均重合度は、３以上であることが好ましく、５以上であることがより好ましく、５〜２０であることがさらに好ましい。なお、本発明において平均重合度とは、上記単量体が結合している平均個数を示し、例えば、後述する実施例に示す方法などにより、測定することができる。
【００３２】
ＰＡＣとしては、例えば、図１の化学式で示されるような、主としてカテキン類、すなわちフラバン−３−オールを構成単位とする重合度が２以上の重合体からなるポリフェノール成分が挙げられる。なお、図１の化学式中Ｒは、上記一般式（１）におけるＯＲ４に相当する。また、フラバン環３位水酸基にしばしば没食子酸がエステル結合する。
【００３３】
ある特定の単量体（骨格）が重合したＰＡＣには慣用名が与えられ、代表的なＰＡＣとしては、Ｂ環（図１参照）の水酸基の数に応じて定義・分類された、プロペラルゴニジン（４’−ＯＨ）、プロシアニジン（３’−ＯＨ、４’−ＯＨ）及びプロデルフィニジン（３’−ＯＨ、４’−ＯＨ、５’−ＯＨ）が挙げられる。例えば、Ａ環５位の水酸基を欠く成分を構成単位とした重合体には、プロガイボールチニジン、プロフィセチニジン、及びプロロビネチニジンがあり、さらにその他の特定部位の水酸基の有無に応じて、プロテラカシジン、プロメラカシジン、プロアピゲニニジン、プロルテオリニジンなどの慣用名がある。
【００３４】
本発明においてＰＡＣは、好ましくは、プロシアニジン、プロペラルゴニジン又はプロデルフィニジンである。「プロシアニジン」の構成単位（骨格）は、同一又は異なっていてもよく、カテキン、エピカテキン、カテキンガレート及びエピカテキンガレートから選択できる。「プロデルフィニジン」の構成単位（骨格）は、同一または異なっていてもよく、ガロカテキン、エピガロカテキン、ガロカテキンガレート及びエピガロカテキンガレートから選択できる。
【００３５】
また、ＰＡＣとしては、例えば、さまざまな植物に広く含まれている縮合型タンニンが挙げられる。このようなＰＡＣは、酸処理によって、シアニジン、デルフィニジン、ペラルゴニジン、オーランチニジン、ルテオリニジン、ペオニジン、マルビジン、ペチュニジン、ヨーロピニジン、ロシニジン、ヒルスチジン、アピゲニニジンなどを得ることができる。
【００３６】
さらに、ＰＡＣには、各環上の結合位置の違いや、構成単位内の置換基の立体配座、異なる構成単位の重合体内での結合順序などによる多様な化合物が知られている。本発明に含まれるＰＡＣの一部について、化学名（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｎａｍｅ）を以下に例示する。なお、括弧内は分子式（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｏｒｍｕｌａ）である。なお、本発明においては、下記のＰＡＣにのみならず、これらのＰＡＣが更にカテキン、エピカテキンなどの構成単位あるいは他のＰＡＣと縮合した、より高重合度のＰＡＣをも包含する。
【００３７】
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ ＰＺ５ （Ｃ７５ Ｈ６２ Ｏ３１），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ ＢＰ １ （Ｕｎｓｐｅｃｉｆｉｅｄ），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ ＲＰ ４ （Ｃ１２９ Ｈ１０６ Ｏ６７），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ ＲＰ ３ （Ｃ１３６ Ｈ１２０ Ｏ７０），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ ＣＳ ４ （Ｃ１３６ Ｈ１２０ Ｏ７０），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ ＣＳ ３ （Ｃ１２７ Ｈ１２８ Ｏ６９），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ ＣＳ ２ （Ｃ１１３ Ｈ１１０ Ｏ６２），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ ＣＳ１ （Ｃ１２１ Ｈ１１８ Ｏ６５），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ ＲＰ ２ （Ｃ１２０ Ｈ１１４ Ｏ６４），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ ＲＰ １ （Ｃ１２５ Ｈ１３０ Ｏ６９），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ｔ４ （Ｃ１２８ Ｈ１２２ Ｏ６５），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ｔ３ （Ｃ１０５ Ｈ１０２ Ｏ５９），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ｔ２ （Ｃ６７ Ｈ５４ Ｏ２９），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ｔ１ （Ｃ８７ Ｈ７２ Ｏ４３），
４−（Ｂｅｎｚｙｌｔｈｉｏ）ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ａ２ （Ｃ３７ Ｈ３０ Ｏ１２ Ｓ），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ａ７（Ｃ３０ Ｈ２４ Ｏ１２），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ （Ｃ３０ Ｈ２４ Ｏ１２），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ａ５’（Ｃ３０ Ｈ２４ Ｏ１２），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ａ４ （Ｃ３０ Ｈ２４ Ｏ１２），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ｂ６ （Ｃ３７ Ｈ３０ Ｏ１６），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ｂ２ ３，３’−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ （Ｃ４４ Ｈ３４ Ｏ２０），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ｂ４ （Ｃ３０ Ｈ２６ Ｏ１２），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ａ２ ４α−ｂｅｚｙｌｔｈｉｏｅｔｈｅｒ （Ｃ３７ Ｈ３０ Ｏ１２ Ｓ），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ａ２ （Ｃ３０ Ｈ２４ Ｏ１２），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ｃ１ （Ｃ４５ Ｈ３８ Ｏ１８），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ｂ２ （Ｃ３０ Ｈ２６ Ｏ１２），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ｂ （Ｃ３１ Ｈ２８ Ｏ１２），
Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ ｛（Ｃ２９ Ｈ３２ Ｏ１０）ｘ｝，
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ｂ１ （Ｃ３０ Ｈ２６ Ｏ１２），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ａ （Ｃ３１ Ｈ２８ Ｏ１２），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ｃ（Ｃ３０ Ｈ２６ Ｏ１２），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ｂ５（Ｃ３０ Ｈ２６ Ｏ１２），
Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ｐ−１ （Ｕｎｓｐｅｃｉｆｉｅｄ）．
【００３８】
本実施形態において、ＰＡＣ組成物は、下記一般式（１）で表されるフラバン−３−オール骨格が、（ｉ）４位炭素及び８位炭素の結合、（ｉｉ）４位炭素及び６位炭素の結合、（ｉｉｉ）４位炭素及び８位炭素の結合並びに２位炭素及び７位酸素の結合、のいずれかの結合様式で２以上互いに結合した構造を有するものを含むことが好ましい。
【００３９】
【化３】
【００４０】
式（１）中、Ｒ１及びＲ３はそれぞれ独立に水素原子又は水酸基、Ｒ２は水酸基、Ｒ４は水素原子又は一価の有機基を、それぞれ示す。
【００４１】
上記一般式（１）中のＲ４が示す一価の有機基としては、ガレート基、有機酸残基、糖残基等が挙げられる（ここで、残基とは、分子中の原子又は基が除かれて生じる一価の基を意味する）。有機酸残基のもとになる有機酸としては、ｐ−クマル酸、カフェ酸、フェルラ酸、シナピン酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、没食子酸、酢酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸等が挙げられる。糖残基を形成する糖は必要に応じて、例えばフェノール水酸基とエステル結合を介して任意の位置で修飾される。その配糖体形成残基の例としては、ピラノース型のヘキース残基、フラノース型のペントース残基を挙げることができる。具体的には、糖の形態として、グルコース、ガラクトース、ラムノース、キシロース、アラビノース等の単糖類の他に、２糖類や３糖類を挙げることができる。
【００４２】
また、Ｒ４は、ガレート基や有機酸基に糖が結合した配糖体形成残基であってもよい。その場合、例えば、糖は、ガレート基や有機酸基のフェノール水酸基とエステル結合を介して任意の位置で結合する。その配糖体形成残基の例としては、ピラノース型のヘキース残基、フラノース型のペントース残基等を挙げることができる。糖の形態としては、グルコース、ガラクトース、ラムノース、キシロース、アラビノース等の単糖類の他に、２糖類や３糖類を挙げることができる。
【００４３】
なかでも、Ｒ４は、置換基を有していてもよいガレート基を示すことが好ましい。「置換基を有していてもよいガレート基」には、「ガレート基」及び「置換基を有するガレート基」が含まれ、「置換基を有するガレート基」には、「糖が結合したガレート基」等が含まれる。
【００４４】
なお、式（１）中、Ａ環の５位及び／又は７位の水酸基は、ガレート基、糖、有機酸などが結合した修飾基であってもよい。
【００４５】
上記（ｉ）の結合様式によりフラバン−３−オール骨格が互いに結合した構造を有するプロアントシアニジンとしては、例えば、下記一般式（２）で表されるものがある。
【００４６】
【化４】
【００４７】
上記（ｉｉｉ）の結合様式によりフラバン−３−オール骨格が互いに結合した構造を有するプロアントシアニジンとしては、例えば、下記一般式（３）で表されるものがある。
【化５】
【００４８】
ＰＡＣの構成単位同士の主たる結合部位としては、上記のように（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の結合様式があるが、具体例としては、例えば、Ａ−タイプ結合；４位と８位および２位と７位酸素の２箇所、また例えば、Ｂ−タイプ結合；４位と６位または４位と８位のいずれか１箇所、が挙げられる。またこれら結合からなる種々の立体配置を有するＰＡＣが存在する。
【００４９】
ＰＡＣは、天然物由来、あるいは合成品を使用することができるが、天然物由来のＰＡＣが好ましく、植物由来のＰＡＣがより好ましい。このようなＰＡＣを得るための出発素材としては、野菜、ナッツ、樹皮、及びポリフェノール化合物を含む他の植物材料のような、植物から誘導される植物材料からの原料を用いることができる。例えば、殆どの色のついた果実、イチゴ類、及び野菜は、ポリフェノール化合物を含むことが知られている。ポリフェノール化合物を含む植物、果実、イチゴ類、及び野菜の例には、例えば、ブルーベリー葉、ブドウ種子、サトイモ、ビルベリー、エルダーベリー、プラム、ブラックベリー、ストロベリー、レッドカーラント、ブラックカーラント、クランベリー、チェリー、ラズベリー、グレープ実、カーラント、ハイビスカスの花、シシトウガラシ、豆、エンドウ豆、大豆皮、赤キャベツ、パープルコーン、紫サツマイモが含まれるが、それらに限定されるものではない。これらのうち、例えばブルーベリー葉、ブドウ種子、クロトン種樹液由来のようなＰＡＣ組成物の使用が実際的である。
【００５０】
本実施形態にかかるＰＡＣ組成物の具体例として、ブルーベリー葉、ブドウ種子及びクロトン種樹液から得られるプロアントシアニジン組成を表１に示す。
【００５１】
【表１】
【００５２】
本発明の出発素材において、使用する植物の部分は、葉、花弁、萼片、花、葉柄、新芽、根、茎、種子、鞘、塊茎、樹皮、形成層、材木、菌こぶ、果実、野菜、ハーブ、シダ、樹液、樹脂、ブドウ、リンゴ、タマネギやアボカドなどの皮、柑橘類の皮、果物の外皮を含む皮、リンゴ、ワインの絞りかす、穀粒の外皮、藁、干し草、オリーブ、アブラナ或いはカノラ由来の油製種子の塊、及びその他油料作物抽出物等を任意に用いることができる。
【００５３】
本発明で好ましい出発素材として、ブルーベリーが挙げられる。ブルーベリーは、ツツジ科（Ｅｒｉｃａｃｅａｅ）スノキ属（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ）サイアノコカス節（Ｃｙａｎｏｃｏｃｃｕｓ）に属するアメリカ原産の落葉性もしくは常緑性の低木または半高木果樹である。ブルーベリーはおよそ６種類からなるが、果樹園芸上重要なのは下記の三種である。本発明では、使用するブルーベリーについて、種類、由来、原産地を特に制限するものではない。
【００５４】
（１）ハイブッシュブルーベリー（Ｈｉｇｈｂｕｓｈ ｂｌｕｅｂｅｒｒｙ， Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ｃｏｒｙｍｂｏｓｕｍ Ｌ．）：オニール、シャープブルー、ジョージアジェム、フローダブルー、レベレイ、スパルタン、ダロウ、デューク、バークレイ、ハリソン等。
【００５５】
（２）ラビットアイブルーベリー（Ｒａｂｂｉｔｅｙｅ ｂｌｕｅｂｅｒｒｙ， Ｖ． ａｓｈｅｉ Ｒｅａｄｅ， Ｖ． ｖｉｒｇａｔｕｍ Ａｉｔｏｎ）：ウッダード、ガーデンブルー、ティフブルー、ホームベル、マイヤー等。
【００５６】
（３）ローブッシュブルーベリー（Ｌｏｗｂｕｓｈ ｂｌｕｅｂｅｒｒｙ， Ｖ． ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍ Ａｉｔｏｎ； Ｖ． ｍｙｒｔｉｌｌｏｉｄｅｓ Ｍｉｃｈａｕｘ）：チグネクト、ブロンズウィック、ブロミドン等。
【００５７】
本発明の有効成分である天然物由来のＰＡＣ組成物は、目的に応じて以下の工程を適宜組み合わせることにより得ることができる。
【００５８】
（１）前処理加工：
葉、皮、果実、茎、根等の全草部位に応じて、あらかじめ水洗、濾別などにより物理的に不純物を除く。あるいは、葉緑素、繊維素等、本発明のＰＡＣ以外の成分を溶媒で留去することもできる。この溶媒には、留去する対象により異なるが、クロロホルム、ヘキサン、アセトン等を用いることができる。生の素材は、そのまま粉砕しても乾燥後粉砕して、粉末状で次工程に供してもよいし、生素材からの搾汁液、抽出液を次工程に供してもよい。搾汁又は抽出液は、濃縮又は乾燥して粉末状で次工程に供してもよい。
【００５９】
乾燥手段は、本発明の薬理効果を損なわなければ特に制限はなく、真空凍結乾燥、熱風乾燥、遠赤外線乾燥、減圧乾燥、マイクロ波減圧乾燥、及び過熱蒸気乾燥等を広く用いることができる。なかでも、成分変化の少ない真空凍結乾燥が好適に使用できる。真空凍結乾燥条件は、原料素材の種類、部位の状態によって適宜選択できるが、例えば生葉をそのまま乾燥する際の凍結温度は−３０〜−２０℃、乾燥温度は−３０〜３０℃、乾燥時間は１５〜２４時間の範囲が好ましい。
【００６０】
（２）抽出工程：
前工程で得られた加工処理物は、次に溶媒抽出することができる。溶媒抽出には、下記の溶媒を適宜組み合わせて、必要に応じ多段抽出する。使用する抽出溶媒は特に制限されないが、水又は水と相溶性のある極性溶媒の使用が好適である。水と相溶性のある極性溶媒としては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどの炭素数１〜４の低級アルキルアルコール；エチレングリコール、ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリンなどの多価アルコールなどを挙げることができる。アルコールとしては、安全性の観点から低級アルコール、特にメタノールやエタノールの使用が実際的である。他の有機溶媒としては、例えばアセトン、ジエチルエーテル、ジオキサン、アセトニトリル、酢酸エチルエステル、キシレン、クロロホルム、トルエン、ヘキサンなどを挙げることができる。水と極性溶媒の組み合わせを含め、これらの溶媒は、単独あるいは２種以上を組み合わせて使用してもよい。例えば、アセトンとエチルエーテルの混合溶媒、好ましくはアセトンとエチルエーテルの１ ： １（ｖ／ｖ）混合液の使用が可能である。一般的には、極性溶媒と水との混合溶媒の使用が望ましい。これらの含水溶媒としては、含水アルキルアルコール、より好ましくは含水メタノール、含水エタノールである。含水アルコール中のアルコール濃度は、５〜９０容量％、好ましくは８０〜９０容量％、より好ましくは５０〜９０容量％である。アルコール以外の好ましい混合溶媒としては、水とアセトンの混液を挙げることができる。
【００６１】
抽出操作としては、加工処理物を溶媒に冷浸、温浸などの浸漬処理が挙げられる。通常は、加温下で撹拌しながら抽出し、ろ過して抽出液を得る。例えば、８０容量％エタノール水溶液による撹拌抽出では、溶液温度は、望ましくは室温、浸漬時間は温度により異なるが３０秒〜１時間の範囲内が好適である。また、パーコレーション法によることもできる。
【００６２】
得られた抽出物は、必要に応じてろ過又は遠心分離により固形物を除去する。ろ液は、次工程の要求に応じてそのまま用いるか、又は溶媒を留去して一部濃縮もしくは乾燥して用いてもよい。必要に応じて、これらの抽出、濃縮物は精製する。精製方法は、特に限定されないが、例えばカラム法や溶媒による分割法などを挙げることができる（ＷＯ００／６４８８３号公報参照）。
【００６３】
ＰＡＣ組成物は、抽出液、濃縮エキス、ペースト、乾燥、半乾燥物など、最終利用形態としてはさまざまな形で利用できる。精製されたＰＡＣ組成物は、濃縮されているので、一般に単純な抽出物に比べより高い薬理活性（肝線維化抑制活性）を有する。
【００６４】
得られたＰＡＣ組成物は、そのまま、又は、プロドラッグ若しくは薬剤として、利用できる。本実施形態に係る肝線維化抑制剤又は肝星細胞増殖抑制剤は、ＰＡＣ組成物、その生理学的に許容される塩、それらの水和物及び／又はそれらの溶媒和物からなる薬剤であっても良いが、一般には上記の物質と薬理学的及び製剤学的に許容される添加物を含む医薬組成物に調製することが望ましい。
【００６５】
薬理学的及び製剤学的に許容しうる添加物としては、例えば賦形剤、崩壊剤、崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤、溶解補助剤、張化剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、噴射剤、及び粘着剤などを用いることができる。
【００６６】
本実施形態に係る肝線維化抑制剤又は肝星細胞増殖抑制剤を医薬品とする場合は、投与単位形態で投与することが好ましく、経口投与、組織内投与（皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与など）、局所投与（経皮投与など）、又は経直腸的に投与をすることもできる。
【００６７】
経口投与剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、細粒剤、顆粒剤などから適宜選択すればよい。また経口投与用液状医薬製剤としては、乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤などを挙げることができる。製剤にあたっては、各種製剤に応じた賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色料、矯味矯臭剤、ｐＨ調整剤などを適宜配合することができる。例えば、錠剤の場合は、必要に応じて、通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶錠、フィルムコーティング錠、二重錠、又は多層錠とすることができる。錠剤の形態に調製するに際しては、担体として、例えば乳糖、白糖、塩化ナトリウム、グルコース、尿素、澱粉、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸などの賦形剤；水、エタノール、プロパノール、単シロップ、グルコース液、澱粉液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドンなどの結合剤；乾燥澱粉、アルギン酸ナトリウム、寒天末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、澱粉、乳糖などの崩壊剤；白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油などの崩壊抑制剤；第４級アンモニウム塩類、ラウリル硫酸ナトリウムなどの吸収促進剤；グリセリン、澱粉などの保湿剤；澱粉、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸などの吸着剤；精製タルク、ステアリン酸塩、硼酸末、ポリエチレングリコールなどの潤沢剤などを例示できる。
【００６８】
組織内投与剤形としては、注射剤を挙げることができる。注射剤として調製するには、非毒性の溶液、乳剤及び懸濁剤などの形態とするのが望ましい。これらは、殺菌され、かつ血液と等張であるのが好ましい。これら液剤、乳剤及び懸濁剤の形態に調製するに際しては、希釈剤として、例えば水、エタノール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類などを用いることができる。また等張性の溶液を調製するに十分な量の食塩、グルコース、又はグリセリン、及び通常の溶解補助剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤なども配合することができる。これらの注射剤は、皮下、筋肉内又は静脈内に投与することができる。
【００６９】
局所投与剤形としては、例えば、局所用液剤、クリーム剤、粉剤、ペースト剤、ゲル剤、軟膏剤などの外用製剤を挙げることができる。これらは、本実施形態に係るＰＡＣ組成物、そのプロドラッグ、製薬上許容されうるそれらの塩等の一定量を、外用製剤の目的に適合する香料、着色料、充填剤、界面活性剤、保湿剤、皮膚軟化剤、ゲル化剤、担体、保存剤、安定剤などのうちの一種以上と組み合わせることにより調製することができる。
【００７０】
経直腸的投与剤形としては、坐剤を挙げることができる。坐剤の形態に調製するに際しては、基材として、例えばパルミチン酸ミリスチルエステルなどの高級エステル類、高級アルコール類、ポリエチレングリコール、カカオ脂、ゼラチン、半合成グリセリド、これらの混合物などの低融点基材を挙げることができる。座剤は、本実施形態に係るＰＡＣ組成物、そのプロドラッグ、製薬上許容され得るそれらの塩等を、上記のような基材に混入し、成型することにより調製することができる。
【００７１】
本実施形態に係る肝線維化抑制剤又は肝星細胞増殖抑制剤などを医薬品として投与する場合、ＰＡＣ組成物（若しくはそのプロドラック、又は製薬上許容され得るそれらの塩）の有効投与量は、患者の年齢、体重、疾病の性質、進展状態、投与経路などにより異なるので特定はできないが、通常は成人一人、体重６０ｋｇ換算で、一日当たり１〜２０００ｍｇの範囲である。患者の状態などに応じて、上記範囲未満又は上記範囲を超える用量を投与することもできる。多量に投与するときは、一日数回に分割して投与することが望ましい。医薬品の場合、ＰＡＣの有効含量は、投与量又は服用量との関係で一概に特定できないが、０．１〜９９．５重量％、好ましくは０．５〜９０重量％の範囲で選択すればよい。
【００７２】
本実施形態に係るＰＡＣ組成物を用いた医薬品の用途としては、肝線維化抑制剤、肝星細胞増殖抑制剤、肝星細胞ＤＮＡ合成活性化抑制剤、肝星細胞アポトーシス誘導剤、又は、肝繊維化を病因とする肝疾病（例えば肝硬変や肝癌）の発症若しくは進展抑制剤、等を挙げることができる。
【００７３】
本実施形態に係るＰＡＣ組成物は、肝線維化抑制を含め、上記疾病の発症及び進展の予防のための機能性補助飲食物としても利用できる。機能性飲食物製剤としては、固体状、液体状、エマルジョンなどが可能であるが、必要に応じて薬学的もしくは食品上許容される担体又は添加剤を配合することもできる。添加剤には、一般的な剤形補助剤などの外、他の薬剤、機能性成分、例えばビタミン類、その他の微量成分などの有効成分を含むことができる。剤形は、特に問わないが、経口に適した形態であることが好ましい。また、その形態は特に制限されないが、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、トローチ剤、又は溶液剤（ドリンク）などの形態に調製することができる。
【実施例】
【００７４】
以下、実施例を挙げて本発明についてより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。以下の実施例において、「％」は、特に言及しない限り、「ｗ／ｗ％（質量％）」を意味する。
【００７５】
１．各素材からのＰＡＣの調製
ＰＡＣは、上述のとおり、広く植物界から見いだされている。ＰＡＣを含有することが報告されている下記に挙げる素材（試料１〜３）を入手し、ＰＡＣ画分を調製した。
【００７６】
試料１：ブルーベリー葉
試料２：ブドウ種子抽出物（グラヴィノールＴＭ：キッコーマン株式会社）
試料３：クロトン樹液（Ｓａｎｇｒｅ ｄｅ Ｄｒａｇｏ； Ｒａｉｎｔｒｅｅ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ， Ｉｎｃ．）
【００７７】
（試料１：ブルーベリー葉由来ＰＡＣ画分の調製）
ラビットアイブルーベリー種（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ Ａｉｔｏｎ）の生葉を、凍結乾燥（ＦＴＳ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｄｕｒａ−Ｔｏｐ ＭＰ＆Ｄｕｒａ−Ｄｒｙ ＭＰ）し、超遠心粉砕機（ＭＲＫ＆ＲＥＴＳＣＨ、ＥＭ−１）で粉砕することで、ブルーベリー葉の凍結乾燥粉末を得た。この凍結乾燥粉末１０ｇに１００ｍｌのヘキサンを加え、室温で３０分間振盪抽出し、デカンテーションにより残渣を回収した。この抽出操作を３回繰り返し、ブルーベリー葉ヘキサン洗浄物を得た。
【００７８】
さらに、得られたブルーベリー葉ヘキサン洗浄物に、１００ｍｌの酢酸エチルを加え、同様に３０分間振盪抽出し、デカンテーションにて残渣を回収した。これも同様に３回繰り返し、ヘキサン−酢酸エチル洗浄物を得た。
【００７９】
次に、ヘキサン−酢酸エチル洗浄物に１００ｍｌのメタノールを加え、３０分間振盪抽出し、ろ過にて抽出液を回収し、残渣に再度メタノール１００ｍｌを加え、同様に３回繰り返し抽出液を合わせた。
【００８０】
抽出液をエバポレーターで減圧濃縮後、凍結乾燥し、ブルーベリー葉メタノール抽出物約３．５ｇを得た。さらに、この抽出物約５００ｍｇを６０％メタノールに溶解し、６０％メタノールで平衡化したセファデックスＴＭＬＨ−２０（容量１００ｍｌ；ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）カラムにアプライし、６０％メタノール４００ｍｌで洗浄し、次に１００％メタノール４００ｍｌで洗浄した。その後７０％アセトン４００ｍｌで溶出させ、減圧濃縮後、凍結乾燥し、ブルーベリー葉由来ＰＡＣ画分（試料１）を約１００ｍｇ得た。同様に以下の試料を調製した。
【００８１】
（試料２〜３由来のＰＡＣ画分の調製）
試料２〜３は、素材を直接入手して、１００％メタノールで抽出を行い、減圧濃縮後、凍結乾燥した。その後、上記調製と同じように、セファデックスＬＨ−２０でＰＡＣ画分を調製した。
【００８２】
ＰＡＣ調製物の組成解析
各起源から抽出された上記試料１〜３につき、ＰＡＣ純度、組成及び平均重合度を調べた。以下に用いた解析方法と結果を示す。
【００８３】
２．ブタノール−塩酸加水分解法（ポーター法）
下記文献の方法に従い、ポーター法を用いてＰＡＣの分析を行った。
・Ｐｏｒｔｅｒ Ｌ． Ｊ． ｅｔ ａｌ．、“Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”、１９８６年、第２５巻、ｐ．２２３−２３０
・Ｓｈｏｊｉ Ｔ． ｅｔ ａｌ．、“Ｊ． Ａｇｒｉｃ． Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．”、２００６年、第５４巻、ｐ．８８４−８９２
【００８４】
ＰＡＣは酸性条件下における加熱により、フラバン間の結合が切断され、カルベニウムイオンとカテキン類を与える。前者はさらに酸化されて赤色のアントシアニジンとなる。この原理を利用した呈色法がポーター法であり、５４０ｎｍの吸光度の上昇により、試料中のＰＡＣを鋭敏に検出できる。
【００８５】
（１）ポーター法によるＰＡＣの定性及び定量
精製画分をメタノールに溶解し、その２００μｌに５％（ｖ／ｖ）塩酸を含む１−ブタノール７５０μｌと１％（ｗ／ｖ）硫酸鉄アンモニウムを含む２ｍｏｌ／Ｌ塩酸５０μｌを添加し、１０５℃で４０分間反応させた。反応液を室温に戻し、５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。コントロールとしてプロシアニジンＢ２（Ｓｉｇｍａ社製）を用いた。
【００８６】
（２）組成分析；ＬＣ／ＭＳ法
ＬＣ／ＭＳを用いて上記ポーター法反応分解物の分析を実施した。もしブルーベリー葉から精製したＰＡＣであれば、アントシアニジンを検出するはずである。ＬＣ／ＭＳに用いた装置及び条件は下記の通りである。
・装置：Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ／ＭＳ−ＩＴ−ＴＯＦ
・カラム：Ａｔｌａｎｔｉｓ Ｔ３、２．１ｍｍ Ｉ．Ｄ．×１００ｍｍ、３μｍ（Ｗａｔｅｒｓ製）、４０℃
・移動相（溶出液）：（Ａ）５ｍＭギ酸アンモニウムを含む０．５％（ｖ／ｖ）ギ酸
（Ｂ）アセトニトリル
・グラジエント：溶出液Ｂ １０％（０分）→４０％（１５分）→１００％（１５分）→１００％（２２．５分）
・移動相流速：０．２５ｍｌ／分
・検出器１：フォトダイオードアレイ５４０ｎｍ
・検出器２：ＥＳＩ−ＭＳ
（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ−Ｉｏｎ Ｍｏｄｅ、インターフェイス電圧：４．５ｋＶ、
ＣＤＬ温度２００℃、ネブライズガス流量：１．５Ｌ／分、
ドライガス圧力：２００ｋＰａ、ヒートブロック温度：２００℃）
【００８７】
上記で調製した各植物由来ＰＡＣ調製物のサンプルは本法によって赤色を呈したことから、ＰＡＣの存在が明らかとなった。また、ＬＣ／ＭＳ分析の結果、分解物のメインピークの溶出時間はシアニジン標品と同じであり、ＭＳ／ＭＳスペクトルも一致したことからＰＡＣと同定された（図２）。さらにプロシアニジンＢ２を標品として定量した結果、ＰＡＣの純度は５５．９１〜８８．１２％となった（表１）。
【００８８】
また、ＬＣ／ＭＳによってアントシアニジン組成を解析した結果、ブルーベリー葉とブドウ種子由来の調製物はプロシアニジンが１００％であったが、クロトン種樹液由来のものはプロデルフィニジンが約４割含まれていることが分かった（表１）。
【００８９】
３．チオール開裂によるＰＡＣの平均重合度と構成ユニット組成の解析
上記結果より、各植物由来調製物の主成分がＰＡＣであることが示された。次いでここでは、ＰＡＣの構成単位、結合様式及び重合度を調べるために、Ｇｕｙｏｔらの方法（Ｇｕｙｏｔ Ｓ． ｅｔ ａｌ．、“Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．”、２００１年、第４９巻、ｐ．１４−２０参照）に基づきチオール開裂分析を行った。
【００９０】
図３に、チオール開裂の基本反応を示す。チオール開列の基本反応においては、ＰＡＣを酸性条件下でトルエン−α−チオールと反応させることにより、エクステンションユニットはベンジルチオエーテル付加物となり、ターミナルユニットは遊離のフラバン−３−オールとなる。それらチオール開裂反応産物を逆相ＨＰＬＣで分析することにより、ターミナルユニットとエクステンションユニットの各組成や平均重合度（ｍＤＰ）の情報を得ることができる。平均重合度（ｍＤＰ）は、以下の式により求めることができる。
平均重合度（ｍＤＰ）＝［ターミナルユニット＋エクステンションユニット］／［ターミナルユニット］
【００９１】
標品としてカテキンとエピカテキンを用い、チオール開裂の反応中に生じる遊離のフラバン−３−オールの異性化も考慮に入れて補正を行った（Ｇｕ Ｌ． ｅｔ ａｌ．、“Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．”、２００２年、第５０巻、ｐ．４８５２−４８６０参照）。
【００９２】
（１）チオール開裂、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）条件
ブルーベリー葉由来活性化合物ＰＡＣを、メタノールで１ｍｇ／ｍｌに調製し、５０μｌを取り、３．３％（ｖ／ｖ）塩酸メタノール５０μｌを加え、５％（ｖ／ｖ）トルエン−α−チオール１００μｌを加え、５０℃で３０分間反応させた後、反応液を５倍にメタノールで希釈し、ＨＰＬＣに供した。ＨＰＬＣ条件を以下に示す。
・装置：Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ ＬＣ−２０Ａ
・カラム：Ａｔｌａｎｔｉｓ Ｔ３，４．６ｍｍ Ｉ．Ｄ．×１５０ｍｍ，３μｍ（Ｗａｔｅｒｓ製）、４０℃
・移動相（溶出液）：（Ａ）０．０５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸
（Ｂ）アセトニトリル
・グラジエント：溶出液Ｂ １５％（０分）→２５％（１０分）→６０％（４０分）→１００％（４０分）→１００％（５０分）
・移動相流速：０．７０ｍｌ／分
・検出器：ＵＶ２８０ｎｍ
【００９３】
（２）反応物の同定；液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣ／ＭＳ）
上記反応物を同様にＬＣ／ＭＳに供し各検出ピークの同定を行った。分析条件は下記に示す。
・装置：Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ／ＭＳ−ＩＴ−ＴＯＦ
・カラム：Ａｔｌａｎｔｉｓ Ｔ３，２．１ｍｍ Ｉ．Ｄ．×１００ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ製）
・移動相（溶出液）：（Ａ）０．０５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸
（Ｂ）アセトニトリル
・グラジエント：溶出液Ｂ １５％（０分）→２５％（１０分）→６０％（４０分）→１００％（４０分）
・移動相流速：０．２５ｍｌ／分
・検出器１：フォトダイオードアレイ２８０ｎｍ
・検出器２：ＥＳＩ−ＭＳ
（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ−Ｉｏｎ Ｍｏｄｅ、インターフェイス電圧：４．５ｋＶ、ＣＤＬ温度２００℃、ネブライズガス流量：１．５Ｌ／分、ドライガス圧力：２００ｋＰａ、ヒートブロック温度：２００℃）
【００９４】
ブルーベリー葉から調製したＰＡＣをチオール開裂し、ＨＰＬＣで分離したところ、主に８本のメインピークが確認できた。ＨＰＬＣのクロマトグラムを図４に示す。カテキン、エピカテキンとトルエン−α−チオールは、標品の溶出時間より確認を行い、ピークＡはカテキン、ピークＣはエピカテキン、そしてピークＨはトルエン−α−チオールと判明した。他のピークはＬＣ／ＭＳで再度分析を行い、各ピークのＭＳスペクトルを確認した。
【００９５】
ピークＥはｍ／ｚ＝４１１．０８９２を検出し、この組成を組成推定によりＣ２２Ｈ２０Ｏ６Ｓ（Ｅｒｒｏｒ＝−３．８ｐｐｍ）と推定した。また、ＭＳ／ＭＳスペクトルにｍ／ｚ＝２８７．０５１０を検出し、親ＭＳとＭＳ／ＭＳの差が１２４．０３８２であったことから、ピークＥはベンジルチオエーテル付加物であることが推定された。加えて、親イオンから推定した組成式Ｃ２２Ｈ２０Ｏ６Ｓからトルエン−α−チオールの組成式Ｃ７Ｈ８Ｓの部分を差し引くとＣ１５Ｈ１４Ｏ６となり、これらのことからピークＥはカテキンもしくはエピカテキンのベンジルチオエーテル付加物であることが確認できた。さらに、プロシアニジンＢ２標品をチオール開裂した場合、エピカテキンとエピカテキンベンジルチオエーテルが生成する。この分解物を分析したとき、エピカテキンベンジルチオエーテルとピークＥの溶出時間が同じであったことから、ピークＥはエピカテキンベンジルチオエーテルとした。
【００９６】
ピークＧは、親イオンとしてｍ／ｚ＝６９７．１３８５を、ＭＳ／ＭＳにｍ／ｚ＝５７３．０９８７を検出し、その差が１２４．０３９８になることからこのピークもベンジルチオエーテル付加物であることが分かった。この精密質量からＣ３７Ｈ３０Ｏ１２Ｓと推定した。この組成からベンジルチオエーテル付加物を除くと、Ｃ３０Ｈ２４Ｏ１２となることから、ピークＧはカテキンやエピカテキンからなるＡ−タイプ２量体のベンジルチオエーテル付加物であると推定された。
【００９７】
Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｒ． Ｓ． ｅｔ ａｌ．、“Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．Ｉ”、１９７２年、ｐ．１３８７−１３９９参照）によると、Ａ−タイプのフラバン間結合はチオール開裂に対して抵抗性があるとされている。チオール開裂反応後、ターミナルユニットにＡ−タイプが存在すれば、それに対応するＡ−タイプ２量体として遊離し、エクステンションユニットにあればそれに相当するベンジルチオエーテル付加物が検出される（Ｆｏｏ Ｌ． Ｙ． ｅｔ ａｌ．、 “Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．”、２０００年、第６３巻、ｐ．１２２５−１２２８参照）。
【００９８】
ピークＢの親イオンはｍ／ｚ＝８６３．１８２２で、この精密質量から組成を推定するとＣ４５Ｈ３６Ｏ１８（Ｅｒｒｏｒ＝−０．８６ｐｐｍ）となった。Ｂ−タイプ３量体の分子式はＣ４５Ｈ３８Ｏ１８であり、Ａ−タイプはＣ４５Ｈ３４Ｏ１８であることから、このピークＢはＡ−タイプとＢ−タイプが混在した３量体と推測した。
【００９９】
また、ピークＤはｍ／ｚ＝９８５．２００９であり、ベンジルチオエーテル付加物を除くとＣ４５Ｈ３６Ｏ１８となり、この化合物はＡ−Ｂ−タイプ混在型の３量体ベンジルチオエーテルであることが推測できた。
【０１００】
ピークＦはｍ／ｚ＝６０５．１４４９を検出し、ＭＳ／ＭＳでｍ／ｚ＝４８１．１１０９を検出したことから、このピークはベンジルチオエーテル付加物と考えられたが、付加物を除くとＣ２５Ｈ２４Ｏ１０となりそれ以上の情報は得られなかったため、表２ではＵｎｋｎｏｗｎと表示している。
【０１０１】
上記より調製したＰＡＣをチオール開裂した結果、その分解物にフラバン−３−オールモノマーとフラバン−３−オールモノマーのベンジルチオエーテル付加物以外に遊離の３量体とＡ−タイプ２量体と３量体ベンジルチオエーテル付加物が検出され、その組成比が比較的多いことから、ｍＤＰの計算方法を改めた。
【０１０２】
すなわち、検出されたフラバン−３−オールの重合度をｎとすると（ベンジルチオエーテル付加物も含めて）ｍＤＰは、以下の式により求める値とした。
ｍＤＰ＝［（ベンジルチオエーテル付加物×ｎ）の総和＋（遊離フラバン−３−オール×ｎ）の総和］／［遊離フラバン−３−オールの総和］
【０１０３】
加えて、検出されたフラバン−３−オールとそのベンジルチオエーテル付加物の面積比は、既知のプロシアニジンＢ２標品のチオール開裂反応物から算出し、それぞれ補正を行った。その結果、表２に示すとおり、ブルーベリー葉から調製したＰＡＣのｍＤＰは１１．２であった。加えて、その組成は全体的にエピカテキンの比率が高く、ターミナルユニットでは４２．６％、エクステンションユニットでは６９．６％であったが、検出されたＡ−タイプ２量体やＡ−Ｂ−タイプ混在３量体の組成が不明なので、検出されたモノマーのみで全体の組成を見ると、９５％以上がエピカテキンで構成されていることが分かった。
【０１０４】
本発明に用いたＰＡＣの平均重合度（ｍＤＰ）と組成を表２、３に示す。
【０１０５】
【表２】
【０１０６】
【表３】
【０１０７】
表２の結果から、各起源のＰＡＣ調製物は以下のように特徴づけられた。
（１）ブルーベリー葉由来のＰＡＣは平均重合度が１１．２であり、エピカテキン組成比が高く、すべてプロシアニジンで構成されていた。加えて、Ａタイプの結合を有しており、さらに未同定な側鎖も確認できた。
（２）ブドウ種子由来のものは平均重合度が１４．４とブルーベリーより長く、ターミナルユニットはカテキンの組成比が高く、エクステンションはエピカテキンとエピカテキンガレートがおよそ１：１であった。Ａタイプの結合様式やガレート以外の側鎖は確認されなかった。
（３）クロトン種樹液由来のものは平均重合度が８．３で、ガロカテキンとエピガロカテキンを確認した。そのプロデルフィニジン含量は約４０％であった。
【０１０８】
４．ＰＡＣ調製物の機能解析
肝星細胞として、ヒト培養肝星細胞継代培養株（ＬＩ９０；財団法人ヒューマンサイエンス振興財団より購入，カタログＮｏ．，ＪＣＲＢ０１６０）を用い、肝線維化抑制機能を評価した。
【０１０９】
被検試料としては、調製例１の方法で精製したＢＢ−ＰＡＣ、調製例２の方法で精製したＧＳ−ＰＡＣ、及び調製例３の方法で精製したＣＬ−ＰＡＣを用いた。ＰＡＣあるいはＥＧＣＧ［（-）−エピガロカテキン−Ｏ−ガレート；クリタ高純度試薬、クリタ分析センター（株）、Ｌｏｔ Ｎｏ．０４８３１１］、カテキン［（±）−カテキン；クリタ高純度試薬、クリタ分析センター（株）、Ｌｏｔ Ｎｏ．Ｃ０１２００２Ｊ１５］、エピカテキン（ＳＩＧＭＡ、Ｅ１７５３−１Ｇ、Ｌｏｔ Ｎｏ．０２６Ｋ２６１１）及びプロシアニジンＢ２（Ｂｉｏ Ｃｈｅｍｉｋａ、４２１５７、１ｍｇ）は、いずれも最終濃度が０．１から１０μｇ／ｍｌになるように、無血清ＤＭＥＭ培地で希釈し添加した。上記試薬の溶媒であるＤＭＳＯの最終濃度は、全群で０．１％に統一した。１時間の前培養の後、ＰＤＧＦ−ＢＢ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ、Ｎｏ．２２０−ＢＢ）を最終濃度１０ｎｇ／ｍｌになるようにＬＩ９０に添加し、さらに培養した。培養終了後、ＬＩ９０の増殖をＭＴＴ法にて、ＤＮＡ合成量をＢｒｄＵ ｌａｂｅｌｉｎｇ＆ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏ．，ＵＳＡ）を用いて評価した。また、アポトーシスにより生じるＤＮＡ断片化の相対量は、Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡＰＬＵＳ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏ．，ＵＳＡ）により測定した。ＥＲＫ（ｐ４２とｐ４４）及びＡｋｔ（Ｓｅｒ４７３）のリン酸化は、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法により検出し、得られたバンドの濃さを定量し、数値化した。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法に用いた抗体は、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２）（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）（Ｄ１３．１４．４Ｅ）ウサギモノクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ、＃９９１０）、ｐ４４／４２（Ｅｒｋ１／２）（１３７Ｆ５）ウサギモノクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ、＃９９２６）、Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）（Ｄ９Ｅ）ウサギモノクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ、＃９９１６）及びＡｋｔ（ｐａｎ）（Ｃ６７Ｅ７）ウサギモノクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ、＃９９１６）である。
【０１１０】
各実験結果における統計学的な有意差の検定は、多重比較検定（Ｔｕｋｅｙ法及びＤｕｎｎｅｔ法）によった。
【０１１１】
図５は、ＢＢ−ＰＡＣによるＬＩ９０細胞数の増殖抑制効果を示す。同図に示すように、ＢＢ−ＰＡＣは、１〜１０μｇ／ｍｌの濃度範囲で、ＬＩ９０細胞数の増殖を抑制するとともに、ＰＤＧＦ−ＢＢ処理したＬＩ９０細胞数の増加も抑制した。
【０１１２】
図６は、ＢＢ−ＰＡＣによるＰＤＧＦ−ＢＢ処理したＬＩ９０細胞のＤＮＡ合成活性化抑制効果を示す。同図に示すように、ＢＢ−ＰＡＣは、１μｇ／ｍｌにおいてＤＮＡ合成量の増加をほぼコントロールレベルまで抑制した。
【０１１３】
図７は、ＢＢ−ＰＡＣによるＰＤＧＦ−ＢＢ処理したＬＩ９０細胞のＥＲＫ及びＡｋｔリン酸化抑制効果を示す。同図に示すように、ＢＢ−ＰＡＣは、１μｇ／ｍｌにおいてＰＤＧＦ−ＢＢ処理によるＥＲＫのリン酸化を完全に抑制した。またＰＤＧＦ−ＢＢ処理によるＡｋｔ（Ｓｅｒ４７３）のリン酸化を部分的に抑制した。
【０１１４】
図８は、ＢＢ−ＰＡＣ以外のＰＡＣによるＰＤＧＦ−ＢＢ処理したＬＩ９０細胞のＤＮＡ合成活性化抑制効果を示す。同図に示すように、ブドウ種子由来のＧＳ−ＰＡＣ及びクロトン種樹液由来ＣＬ−ＰＡＣは、ＧＳ−ＰＡＣと同一の濃度で、ＢＢ−ＰＡＣ同様にＰＤＧＦ−ＢＢによるＬＩ９０細胞のＤＮＡ合成量の増加を強く抑制した。
【０１１５】
図９は、ＰＡＣの重合度によるＰＤＧＦ−ＢＢ処理したＬＩ９０細胞のＤＮＡ合成活性化抑制効果を示す。同図に示すように、ＰＡＣ単量体からなるカテキン、エピカテキン及びＥＧＣＧ、及びエピカテキン二量体からなるプロシアニジンＢ２は、ポジティーブコントロールのＢＢ−ＰＡＣ（平均重合度１１．２）と同一濃度範囲（３及び１０μｇ／ｍｌ）では、ＢＢ−ＰＡＣ及びＥＧＣＧ（コントロール）に匹敵するようなＤＮＡ合成量増加抑制効果は認められなかった。
【０１１６】
図１０は、ＢＢ−ＰＡＣによるＰＤＧＦ−ＢＢ処理したＬＩ９０細胞の増殖抑制及びアポトーシス誘導効果を示す。同図に示すように、ＢＢ−ＰＡＣは、３−１０μｇ／ｍｌの濃度範囲で、濃度依存的にＰＤＧＦ−ＢＢ処理したＬＩ９０細胞の増殖を抑制するとともに、ＤＮＡの断片化を有意に促進した。後者は、ＢＢ−ＰＡＣがＰＤＧＦ−ＢＢ処理したＬＩ９０細胞のアポトーシスを誘導する活性があることを示唆している。
【０１１７】
これらのことから、結論として次のことが言える。
（１）ブルーベリー葉由来ＢＢ−ＰＡＣは、ＬＩ９０細胞の増殖、及びＰＤＧＦ−ＢＢ処理によるＬＩ９０細胞のＤＮＡ合成活性化をＥＧＣＧ同様に強く抑制する。
（２）ブドウ種子由来のＧＬ−ＰＡＣ及びクロトン樹液由来のＣＬ−ＰＡＣにもブルーベリー葉由来のＢＢ−ＰＡＣと同等の抑制効果が認められる。
（３）カテキン、エピカテキン及びプロシアニジンＢ２のような単量体や二量体には、同様の抑制効果が殆ど認められない。
（４）ブルーベリー葉由来のＢＢ−ＰＡＣは、ＰＤＧＦ−ＢＢ処理によるＥＲＫ及びＡｋｔのリン酸化を抑制する。
（５）ＢＢ−ＰＡＣは、ＰＤＧＦ−ＢＢ処理したＬＩ９０細胞のアポトーシスを誘導する。
【産業上の利用可能性】
【０１１８】
ＰＡＣ組成物を有効成分とする、肝線維化の抑制剤、肝星細胞増殖抑制、肝星細胞ＤＮＡ合成活性化抑制剤、肝星細胞アポトーシス誘導剤、また肝線維化を病因とする肝疾患、例えば肝硬変や肝癌の発症もしくは進展抑制剤は、肝疾患の予防又は治療に優れた効果を示す。加えて、長期間にわたり服用できるところから、これらの改善のための機能性補助飲食物としても利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】ＰＡＣを構成するフラバン化合物の代表成分であるエピカテキン及びカテキン並びにフラバン環３位水酸基にしばしばエステル結合する没食子酸の構造式図である。
【図２】（Ａ）はシアニジン標品のＭＳ／ＭＳスペクトルで、（Ｂ）はブルーベリー葉由来ＰＡＣのポーター法分解物ＭＳ／ＭＳスペクトルを示すグラフである。
【図３】ＰＡＣを酸性条件下、ベンジルメルカプタンと共に加熱する反応であるチオール開裂を示した模式的図である。
【図４】ブルーベリー葉由来のＰＡＣのチオール開裂反応生成物の逆相クロマトグラムを示すグラフである。
【図５】ＰＤＧＦ−ＢＢ処理又は未処理によるＬＩ９０細胞の細胞増殖に対するＢＢ−ＰＡＣの作用を示すグラフである。
【図６】ＰＤＧＦ−ＢＢ処理又は未処理によるＬＩ９０細胞のＤＮＡ合成に対するＢＢ−ＰＡＣの作用を示すグラフである。
【図７】ＰＤＧＦ−ＢＢ又は未処理によるＬＩ９０細胞のＥＲＫ及びＡｋｔリン酸化に対するＢＢ−ＰＡＣの作用を示す写真及びグラフで、（Ａ）及び（Ｃ）は写真、（Ｂ）及び（Ｄ）はグラフである。
【図８】ＰＤＧＦ−ＢＢ処理又は未処理によるＬＩ９０細胞のＤＮＡ合成に対するＢＢ−ＰＡＣ、ＧＳ−ＰＡＣ、ＣＬ−ＰＡＣの作用を示すグラフである。
【図９】ＰＤＧＦ−ＢＢ処理又は未処理によるＬＩ９０細胞のＤＮＡ合成に対するＢＢ−ＰＡＣの作用と、ＥＧＣＧ、カテキン、エピカテキン及びプロシアニジンＢ２の作用を示すグラフである。
【図１０】ＰＤＧＦ−ＢＢ処理によるＬＩ９０細胞の細胞増殖とＤＮＡ断片化に対するＢＢ−ＰＡＣの作用を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロアントシアニジン組成物を有効成分とする肝線維化抑制剤。
【請求項２】
前記プロアントシアニジン組成物は、
下記一般式（１）
【化１】
［式（１）中、Ｒ１及びＲ３はそれぞれ独立に水素原子又は水酸基、Ｒ２は水酸基、Ｒ４は水素原子又は一価の有機基を、それぞれ示す。］
で表されるフラバン−３−オール骨格が、下記（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の結合様式で２以上互いに結合した構造を有する、請求項１記載の肝線維化抑制剤。
（ｉ）４位炭素及び８位炭素の結合
（ｉｉ）４位炭素及び６位炭素の結合
（ｉｉｉ）４位炭素及び８位炭素の結合並びに２位炭素及び７位酸素の結合
【請求項３】
前記プロアントシアニジンは天然物由来である、請求項１又は２記載の肝線維化抑制剤。
【請求項４】
プロアントシアニジン組成物を有効成分とする肝星細胞増殖抑制剤。
【請求項５】
前記プロアントシアニジン組成物は、
下記一般式（１）
【化２】
［式（１）中、Ｒ１及びＲ３はそれぞれ独立に水素原子又は水酸基、Ｒ２は水酸基、Ｒ４は水素原子又は一価の有機基を、それぞれ示す。］
で表されるフラバン−３−オール骨格が、下記（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の結合様式で２以上互いに結合した構造を有している、請求項４記載の肝星細胞増殖抑制剤。
（ｉ）４位炭素及び８位炭素の結合
（ｉｉ）４位炭素及び６位炭素の結合
（ｉｉｉ）４位炭素及び８位炭素の結合並びに２位炭素及び７位酸素の結合
【請求項６】
前記プロアントシアニジンは天然物由来である、請求項４又は５記載の肝星細胞増殖抑制剤。
【請求項７】
肝星細胞アポトーシスに基づく、請求項４〜６のいずれか一項に記載の肝星細胞増殖抑制剤。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の肝線維化抑制剤又は請求項４〜６のいずれか一項に記載の肝星細胞増殖抑制剤を含む、肝線維化を病因とする肝疾病の発症・進展抑制剤。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の肝線維化抑制剤又は請求項４〜６のいずれか一項に記載の肝星細胞増殖抑制剤を含む、肝線維化抑制、肝星細胞増殖抑制、肝星細胞アポトーシス誘導、肝線維化を病因とする肝疾病の発症抑制、又は、肝線維化を病因とする肝疾病の進展抑制用の、機能性補助飲食物。
【請求項１】
プロアントシアニジン組成物を有効成分とする肝線維化抑制剤。
【請求項２】
前記プロアントシアニジン組成物は、
下記一般式（１）
【化１】
［式（１）中、Ｒ１及びＲ３はそれぞれ独立に水素原子又は水酸基、Ｒ２は水酸基、Ｒ４は水素原子又は一価の有機基を、それぞれ示す。］
で表されるフラバン−３−オール骨格が、下記（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の結合様式で２以上互いに結合した構造を有する、請求項１記載の肝線維化抑制剤。
（ｉ）４位炭素及び８位炭素の結合
（ｉｉ）４位炭素及び６位炭素の結合
（ｉｉｉ）４位炭素及び８位炭素の結合並びに２位炭素及び７位酸素の結合
【請求項３】
前記プロアントシアニジンは天然物由来である、請求項１又は２記載の肝線維化抑制剤。
【請求項４】
プロアントシアニジン組成物を有効成分とする肝星細胞増殖抑制剤。
【請求項５】
前記プロアントシアニジン組成物は、
下記一般式（１）
【化２】
［式（１）中、Ｒ１及びＲ３はそれぞれ独立に水素原子又は水酸基、Ｒ２は水酸基、Ｒ４は水素原子又は一価の有機基を、それぞれ示す。］
で表されるフラバン−３−オール骨格が、下記（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の結合様式で２以上互いに結合した構造を有している、請求項４記載の肝星細胞増殖抑制剤。
（ｉ）４位炭素及び８位炭素の結合
（ｉｉ）４位炭素及び６位炭素の結合
（ｉｉｉ）４位炭素及び８位炭素の結合並びに２位炭素及び７位酸素の結合
【請求項６】
前記プロアントシアニジンは天然物由来である、請求項４又は５記載の肝星細胞増殖抑制剤。
【請求項７】
肝星細胞アポトーシスに基づく、請求項４〜６のいずれか一項に記載の肝星細胞増殖抑制剤。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の肝線維化抑制剤又は請求項４〜６のいずれか一項に記載の肝星細胞増殖抑制剤を含む、肝線維化を病因とする肝疾病の発症・進展抑制剤。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の肝線維化抑制剤又は請求項４〜６のいずれか一項に記載の肝星細胞増殖抑制剤を含む、肝線維化抑制、肝星細胞増殖抑制、肝星細胞アポトーシス誘導、肝線維化を病因とする肝疾病の発症抑制、又は、肝線維化を病因とする肝疾病の進展抑制用の、機能性補助飲食物。
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１】
【図７】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１】
【図７】
【公開番号】特開２００９−２４２３７４（Ｐ２００９−２４２３７４Ａ）
【公開日】平成２１年１０月２２日（２００９．１０．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３１８５９３（Ｐ２００８−３１８５９３）
【出願日】平成２０年１２月１５日（２００８．１２．１５）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２０年、独立行政法人科学技術辰興機構、地域結集型共同研究事業の委託研究、産業技術強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（３０６０２４６０９）財団法人宮崎県産業支援財団 (23)
【出願人】（５０４２５８５２７）国立大学法人 鹿児島大学 (284)
【出願人】（５０４２２４１５３）国立大学法人 宮崎大学 (239)
【出願人】（５９３０５０１１６）南日本酪農協同株式会社 (5)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１０月２２日（２００９．１０．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月１５日（２００８．１２．１５）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２０年、独立行政法人科学技術辰興機構、地域結集型共同研究事業の委託研究、産業技術強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（３０６０２４６０９）財団法人宮崎県産業支援財団 (23)
【出願人】（５０４２５８５２７）国立大学法人 鹿児島大学 (284)
【出願人】（５０４２２４１５３）国立大学法人 宮崎大学 (239)
【出願人】（５９３０５０１１６）南日本酪農協同株式会社 (5)
【Ｆターム（参考）】
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