肝障害保護剤及びその分取法
【課題】 P. acnes-LPSにより誘発される肝臓障害に対し保護する効果を安定良好に有し、大量生産を可能にする霊芝由来の肝障害保護剤を提供する。
【解決手段】 霊芝由来の下記の特徴構成を有する酸性多糖GLAaを有効成分とする肝障害保護剤。
記
グルコース、ガラクトース、マンノース及びフコースを1:0.013:0.009:0.024の割合で含有し、且つβ-D-(1→6)-G1c,β-D-(1→3)-G1c及びβ-D-(1→4)-G1c結合を全体結合の34.9%,33.9%及び28.7%を含む構造特性を有し、平均分子量は12.5×105ドルトン、施光度は[α]Dは-9.1°(c=0.55,H2O)を有し、更に、分子量の14.8%はウロン酸、0.14%は蛋白質、0.75%は窒素である特徴構成を有する。
【解決手段】 霊芝由来の下記の特徴構成を有する酸性多糖GLAaを有効成分とする肝障害保護剤。
記
グルコース、ガラクトース、マンノース及びフコースを1:0.013:0.009:0.024の割合で含有し、且つβ-D-(1→6)-G1c,β-D-(1→3)-G1c及びβ-D-(1→4)-G1c結合を全体結合の34.9%,33.9%及び28.7%を含む構造特性を有し、平均分子量は12.5×105ドルトン、施光度は[α]Dは-9.1°(c=0.55,H2O)を有し、更に、分子量の14.8%はウロン酸、0.14%は蛋白質、0.75%は窒素である特徴構成を有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、P. acnesとリポ多糖で誘発される肝臓障害に対する保護剤及びその分取法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、多くの文献により下記のことが知られている。即ち、霊芝(Ganoderma lucidum Karst)は、中国、日本及びその他の東アジア諸国において、天然の強壮剤及び鎮静剤として使用された長年の使用実績のある生薬であり、また、長寿を促進し、且つ活力を維持すると考えられる。最近の薬理学的研究により、この生薬は、肝炎、高血糖症、慢性気管支炎、癌、筋ジストロフィー、動脈硬化症、高血圧症、高コレステロール血症及び白血球減少症に対し有益な効果があることが確認されている。霊芝の子実体、その菌糸体及び胞子が家庭用医薬としてばかりでなく、新しい医薬源として最近注目されている。
過去20年間に、130種以上の高度に酸化されたトリテルペンとこれに関連した化合物が霊芝(G. lucidum)の子実体、菌糸体及び胞子から分離されている。これらのうちのあるものは、抗HIV-1(ガノデリオールF及びガノデルマノントリオール)、抗コレステロール(ガノデリン酸B及びC)、抗侵害受容(ガノデリン酸A,B,G及び化合物C6)、抗ヒスタミン(ガノデリン酸C1及びC2)、抗補体剤(ガノデリオールF、ガノデルマノンジオール及びガノデルマノントリオール)、及び抗HIV-1プロテアーゼ(ルシダモールB及びガノデルマノントリオール)の諸活性を有する。その他のものは、Meth-A(ザルコーマ)(ガノデルマノンジオール及びルシダモールA及びB)、ルイスラットの肺癌(LLC)、(ルシダモールA及びB及びガノデリン酸)及びT-47D(ヒトの肺癌)(ガノデルマノンジオール)に対する細胞障害効果を有することを確認した。ガノデリン酸S1及びCは、う食性細菌ストレプトコッカスミュータンス由来のグルコシルトランスフェラーゼを阻害する。
また、霊芝(G. lucidum)由来の多糖(GLP)は、特異的或いは非特異的免疫反応により誘発される損傷に対し阻害作用を有し、また、腹腔内マクロファージによる食作用を促進し、移植肉腫180及びHL=60腫瘍細胞の成長を阻止するので、該霊芝の子実体から抽出した重要な薬理学的成分であることも公知である。
また、座瘡プロピオンバクテリウム(Propionibacterium acnes)とリポ多糖(LPS)により誘発される劇症肝炎に対し保護効果を有するFK506(tacrolimus hydrate)について、Dig. Dis. Sci. 45:(2000)に報告されている。
上記に関連し、最近、我々は、Chem. Pharm. Bull. 55:(2006)において、座瘡プロピオンバクテリウム(以下P. acnesと略称)とリポ多糖(LPS)で誘発されたマウスの肝臓障害に対するアントロディア シンナモメア(Antrodia cinnamomea)の菌糸体から分離した中性多糖(ACN2a)による保護活性について報告した。
【非特許文献１】Uchida K., Sakaida i., Hironaka K., Kayano K., Okita K., Dig. Dis. Sci. 45:(2000)
【非特許文献２】Han H. F., Nakamura N., Yokozawa T., Hattori M., Chem. Pharm. Bull 55:(2006)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかし乍ら、上記の非特許文献1に報告されているFK506は、現在、臓器移植時、移植後の免疫抑制剤として臨床的に使用されているが、その取り扱いは厳重な医薬品であり、また、強い免疫抑制作用を持つことから、感染症、癌などにかかり易くなり、肝障害予防などの目的で使用できないなどの課題がある。
また、上記の非特許文献2に記載の発明は、肝障害保護剤である中性多糖を抽出する原材料である樟芝は入手困難であり、また、その菌糸体の安全性は未だ確定されていないばかりでなく、培養条件によりその菌糸体の成分組成が変動し、所定の中性多糖が安定して得られないなどの課題がある。
本願の発明は、上記の非特許文献1及び2の課題を解決し、従来から入手が容易で、安全性も確定されている霊芝の子実体や菌糸体を原材料とし、これから抽出、精製して安定な状態で得られる新規なP. acnesと多糖(LPS)により誘発される肝障害保護剤とその分取法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、請求項1に記載の通り、霊芝由来の下記の特徴構成を有し、GLAaと命名した酸性多糖を有効成分とする肝障害保護剤。
記
グルコース、ガラクトース、マンノース及びフコースを1:0.013:0.009:0.024の割合で含有し、且つβ-D-(1→6)-G1c,β-D-(1→3)-G1c及びβ-D-(1→4)-G1c結合を全体結合の夫々34.9%,33.9%及び28.7%を含有し、平均分子量は12.5×105ドルトン、施光度は[α]D25℃は-9.1°;c=0.55,H2Oを有し、更に、分子量の14.8%はウロン酸、0.14%は蛋白質、0.75%は窒素である構成から成ることを特徴とする。
更に本発明は、請求項2に記載の通り、霊芝をクロロホルムで抽出すること、得られた抽出物を真空乾固して得られた残留物を熱水で抽出すること、その水抽出物をエタノールと混ぜ放置し、沈殿物を得ること、その乾燥物をトリクロル酢酸(TCA)水溶液に懸濁せしめ、遠心分離により得たTCA可溶分を蒸留水に対し透析を行い、透析不能分を乾燥し茶色がかった残渣(GL)を得ること、該残渣(GL)の水溶液をアニオン交換クロマトグラフィーにかけ、0.5M NaClでの溶離画分(GLA)を分取すること、該GLA画分をアニオン交換クロマトグラフィーにかけ、0〜0.1M NaClで溶出し、GLA1,GLA2,GLA3の化合物画分を分取すること、該GLA1をゲル濾過クロマトグラフィーにかけ、0.2M NaClで溶出し、GLA1-1とGLA1-2の化合物画分を分取すること、GLA1-2をゲル濾過クロマトブラフィーにかけ、0.2M NaClで更に精製し、GLAaと命名した酸性多糖を取得することを特徴とする霊芝からの酸性多糖GLAaの分取法に存する。
更に本発明は、請求項3に記載の通り、該酸性多糖GLAaを含有する医薬又は飲食品に存する。
【発明の効果】
【０００５】
請求項1記載の発明に係る霊芝由来の酸性多糖GLAaは、P. acnesとリポ多糖(LPS)で肝障害を誘発されたマウスの血清中のASTとALTの増大を抑止することができる肝障害保護活性を有する。該酸性多糖GLAaは、請求項2に記載のように、霊芝から分離精製したものであるから、常に安定した生産が可能であると共に、衛生上安全で且つ安定した肝障害保護剤であり、請求項3に記載の通り、該酸性多糖GLAaを含有する注射薬、カプセル、錠剤などの医薬や健康食品として利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明の実施例として使用される霊芝マンネンタケ(Ganoderma lucidum)は、サルノコシカケ科に属する。該霊芝から下記詳述するように、本発明の酸性多糖を精製分取する。
また、本発明の実施例において、霊芝から分取した肝障害保護物質の分別工程やその特徴構成を特定するために使用した各種分析機器につき以下概説する。
標準分子量マーカーとして役立つPullulan(昭和電工社製 Shodex standard P-82)を用意した。また、旋光度は、JASCO DIP-360 自動旋光計を使用して水溶液を測定した。紫外線(UV)吸収は、株式会社島津製作所のUV-2200 UV-VIS 記録分光計を使用して測定した。赤外線スペクトル(IR)は、JASCO FT/IR-230 赤外線分光計を使用して、KBrディスク又は液体フィルムに記録した。また、核磁気共鳴(NMR)スペクトルは、Varian Unity Plus 500(1H,500MHz; 13C,125MHz)及びVarian GEMINI 300(1H,300MHz; 13C,75MHz)を使用して記録した。D2O中の多糖の分析は外部標準として、1,4-ジオキサン(1,4-dioxane)を用いた。該化合物は、JEOL質量分析計を連結した株式会社島津製GC-17Aガスクロマトグラフを使用したGC-MSにより分析した。夫々の試料(sample)は、ドイツ国、ダルムスシュタットMerck社製のシリカゲル60F254(層厚0.25mm)を塗布されたプレート上及びMerck社製のセルロースFプレート(層厚0.1mm)上の薄層クロマトグラフィー(TLC)により分離した。夫々のスポットは、100℃で10% H2SO4又はアニリン水素フタレートを吹き付けて可視化した。炭水化物の濃度は、フェノール-硫酸法を使用して決定した。(Dubois M.等により報告されたAnal. Chem. 28:350-356(1956)参照)。更にその詳細は以下に説明する。
【実施例】
【０００７】
次に、本発明の実施例につき以下に詳述する。
先ず、該霊芝から目的とする酸性多糖を分取する精製工程の1例を添付図面に基づいて詳述する。
乾燥した霊芝G. lucidumの子実体500gを4LのCHCl3で、室温で24時間抽出することを3回行い、次いで、これら抽出液を一緒にした混合溶液を濾過し、更に真空下で蒸発乾固させ、クロロホルム(CHCl3)抽出物を得た。その蒸発残留物を乾燥し、次いで、該残留物の20倍の容量の水を加え、室温で1時間放置し、次いで、100℃で2時間熱水抽出することを3回行った。3回分の該水抽出物を一緒にし、次いで、減圧下800mlに濃縮した。次いで、3.2Lのエタノールを該濃縮した抽出物に添加した。その混合物を撹拌し、冷蔵庫に一晩保存した。その後、該混合液中の沈殿物を濾過し、冷エタノールで洗浄、乾燥し、次いで、その乾燥物を10%のトリクロル酢酸(TCA)に懸濁させた。これを2,500xgで10分間遠心分離して得られたTCA可溶分を、3日間徹底的に蒸留水に対し透析した。透析不能分を真空凍結乾燥して茶色がかった残渣(GL)4.08gを得た。
【０００８】
次に、図6のチャートに示すように、得られた残渣(GL)につき、分画を行った。
該残渣GLのイオン交換クロマトグラフィー処理:
即ち、かくして得た残渣(GL)を3g H2Oに溶解せしめたものを、英国、メイドストーン(Maidstone)のWhatman International Ltd.製のアニオン交換クロマトグラフィーDE-52(カラム 2.0×20cm)に通し、H2O 60ml, 0.5M NaCl 60ml, 1M NaCl 60ml及び2M NaCl 60mlの溶媒で溶出し、夫々の画分2mlずつを分取した。図1は、該イオン交換クロマトグラフィーDE-52セルロースによるGLの分離を示す。これらの画分のうち、0.5M NaCl画分(GLA)を濃縮し、3日間徹底的に蒸留水に対し透析し、次いで凍結乾燥し、その乾燥物1.02gを得た。該GLA 1.02gをアニオン交換クロマトグラフィーDE-52セルロースを通し、0〜0.1Mの直線濃度勾配のNaClで溶出することにより更に精製した。該溶離液を、フェノール-硫酸法を使用し、480nmで監視した溶出プロフィールに従って、GLA1, GLA2及びGLA3の3画分に分離した(図2参照)。これらの化合物GLA1, GLA2及びGLA3の収量は夫々254mg, 423mg及び69mgであった。
【０００９】
このようにして得たGLA1, GLA２及びGLA３につき、夫々P. acnesとリポ多糖(LPS)により肝障害を誘発されたマウス群に夫々投与し、肝障害保護活性を調べたところ、GLA1のみに上記の効果があることが確認されたが、更に、下記のように精製することにより、著効があり且つ均一性の高い、目的とするGLAaと命名した酸性多糖が得られた。そのGLA1の精製を次のように行った。
GLA1のゲル濾過クロマトグラフィー処理:
即ち、該GLA1 254mgを0.2M NaCl溶液に溶解し、次いでこれを、Tosho社製のトヨパールHW-65(Toyopearl HW-65)カラム(2.0×90cm)に通し、同じ水溶液で溶出した。5mlの各溶出画分を、フェノール-硫酸法を使用し、480nmで監視した溶出プロフィールに従って、2つの部分(GLA1-1 12mgとGLA1-2 55mg)にプールした(図3参照)。
次いで、該GLA1-2画分55mgをカラムクロマトグラフィー Toyopearl HW-65により、上記と同じ条件で、更なる精製を行い、茶色がかった酸性多糖51mgを得た。これをGLAaと命名した。
【００１０】
上記のようにして分取した該酸性多糖GLAaの分子量の推定:
該酸性多糖GLAaの平均分子量を、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を使用して推定した。該試料を、TSK-GMPWXLゲルのカラム7.8×300mm i. d.を通し、0.2M NaClを1ml/分の流量で、ゲル濾過し、標準分子量マーカーとしてのPullulan(昭和電工社製Shodex standard P-82)と比較した。その結果、該GLAaの平均分子量は、12.5×105ドルトン(Daltons)であることが判った。
【００１１】
ウロン酸残渣の還元:
Taylor R. L., Conrad H. E., Biochem. 11:1383-1388(1992)に記載の方法に倣い、固体EDC1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド〔(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide〕1mMをGLAaの水溶液(1mg/ml)の10mlに添加した。反応中、pHは0.1N HClを用いて4.75を維持した。その全ての反応を少なくとも2時間行った。2M水素化ホウ素ナトリウム(NaBH4)を室温で該反応混合物に添加した。該NaBH4が消費されるにつれ、該pHは上昇するが、4NHClでpH7.0に維持した。この反応は、通常、60分以内で15〜25mlのNaBH4を消費した。1-オクタノール(1-Octanol)の1滴を、消泡剤として必要時に、添加した。得られた還元型GLAaは、下記に示す方法で加水分解後、構成糖類の分析を行った。(表1参照)。
【００１２】
構成糖類の同定:
該酸性多糖GLAa 2mgを2mlの2Nトリフルオル酢酸(TFA)に溶解し、密封した。次いで、これをスチームオートクレープ内で、125℃で1時間加水分解後、〔Anal. Biochem. 142:58-67(1984)参照〕、該TFAを蒸発させた。該加水分解物を6mgのNaBH4で還元し、更に、ガスクロマトグラフィー質量分析(GC-MS)〔J&W Scientific社のカラムDB-1(内径0.25mm×30m)、カラム温度条件:5℃/分の増分で50から190℃に上昇させ、次いで、190℃で12分間〕のために、シルブレンダー-HTP(silblendwe-HTP)(ヘキサメチルジシラザン(hexamethyldisilazane):トリメチルクロロシラン(trimethylchrolosilane):ピリジン(pyridine)=2:1:10)を使用して、トリミチルシリル化した。
構成糖類の分析により、GLAaはグルコース、ガラクトース、マンノース及びフコース(1:0.013:0.009:0.024の比率)から成ること及びグルコースが糖類含有量の95.5%を占めていることが判明した。
【００１３】
構成糖類の絶対配置の決定:
構成糖類の絶対配置を、Hara等により報告されたChem. Pharm. Bull. 35:501-506(1987)に従い決定した。即ち、該酸性多糖GLAa 1mgを3mlの2Nトリフルオル酢酸(TFA)で、125℃で、1時間加水分解し、次いで、該TFAを蒸発させ糖残渣を得た。該糖残渣2mgのピリジン溶液0.5mlとL-システインメチルエステル塩酸塩(L-cysteine methyl ester hydrochloride)3mgを混合し、60℃で1.5時間加温し、次いで、N2ガスで瞬間蒸発乾燥した。該乾燥試料を0.4mlのシルブレンダーHTPで、60℃、1時間、トリミチルシリル化した。CHCl3 3mlとH2O 3mlを分画後、該CHCl3抽出物をGC-MS(J&W Scientific社のカラムDB-wax, 30m×0.25mm及びカラム温度:10℃/分の増分で50℃から230℃まで昇温させ、次いで、230℃に12分間)により分析した。これにより、構成糖類の絶対配置はL-fucose, D-galactose, D-glucose, D-mannoseであることが判った。
【００１４】
酸性多糖GLAaの構造分析
上記の種々の分析により、該酸性多糖GLAaは綿の外観を有しており、旋光度[α]D25℃=-9.1°(c=0.55、H2O)、蛋白質0.14%〔Anal. Biochem. 72:248-254(1976)に記載のブラッドフォード法(Bradford method)で測定〕、窒素0.75%、(元素分析により測定)、マンヌロン酸14.8%(Nelly b.及びGustav A., H.等により報告されたAnaL. Biochem. 54:484-489(1973)に記載の方法)から成っていた。硫酸塩は酸性多糖GLAaには存在しなかった〔Terho T. T.及びHartiala K.により報告されたAnal. Biochem. 41:471-476(1971)に記載のバリウムロジゾン酸塩法(Barium rhodizonate method)及びIRで測定〕。
尚、該酸性多糖GLAa中のウロン酸残渣をNaBH4で還元し、次いで、構成糖類を再び分析した。マンノースの量はかなり増大し、マンヌロン酸のカルボン酸基はヒドロキシメチル基に変わり、マンノースを得ることを示していた。
下記表1は、酸性多糖GLAa及び還元酸性多糖GLAaの単糖組成の割合をモル比で示したものである。
【００１５】
【表１】
【００１６】
メチル化糖分析:
該酸性多糖GLAa 5mgを、Anumura及びTaylorにより報告されたAnal. Biochem. 203:101-108(1992)の記載に従って、ヨウ化メチルを使用してメチル化した。次いでオートクレーブ内で、4Nトリフルオル酢酸(TFA)8mlで125℃で90分間加水分解した。該TFAを蒸発させ、次いで、該加水分解物を、NaBH4 3mg/mlを含む1M NH4OHでアルジトールに変換させ、次いでアセチル化した。部分的にメチル化したアルジトールアセテート (Alditol acetates)を、キャリアーガスとしてヘリウムを使用し、GC及びGC-MS 米国、ペンシルベニア州、ベレホンテ(Bellefonte)サプレコ(Supelco)社製のカラムSP-2330(60m×0.25mm、フィルム厚0.20μm)により分析した。該カラム温度条件は、2℃/分の増分で160℃から120℃まで、次いで、5℃/分の増分で210℃から240℃まで、次いで、240℃で14分間であった。ピーク面積は、Sweet D. P., Shapiro R. H., Albersheim P., Carbohydr. Res. 40:217-255(1995)の出版物に記載のモル応答ファクターを使用して補正した。その誘導化合物は、それらのGC-EI-MS断片パターン及びそれらの相対保持時間を1,5-ジ-O-アセチル-2,3,4,6-テトラ-O-メチルグルシトール(1,5-di-O-acetyl-2,3,4,6-tetra-O-methylglucitol)の対応する断片パターン及び相対保持時間と比較することにより同定された。
該メチル化分析により、下記表2に記載するように、該GLAaは、末端1,3-、1,4-、1,6-、1,4,6-及び1,3,6-結合のグルコース残渣からなっていることが判った。また、該メチル化分析により、該GLAaはβ-D-(1→6)-G1c(1,6-、1,3,6-及び1,4,6-G1c)、β-D-(1→3)-G1c(1,3-及び1,3,6-G1c)及びβ-D-(1→4)-G1c(1,4-、1,6-及び1,4,6-G1c)結合を含むこと及び全結合の34.9%、33.9%と28.7%を夫々占めることが判明した。
【００１７】
【表２】
【００１８】
酸性多糖GLAaの旋光度は[α]D=-9.1°(c=0.55、H2O)であった。このことは、構成糖類は、Hadson C. S.により提示されたJ. Am Chem. Soc 31:66-86(1909), 52:1680-1700(1930)及び52:1707-1718(1930)に記載のハドソンの等旋光度則(isorotation rule)により、α-L配置或いはβ-D-配置を有することを示唆した。前記のHara等により提示されたChem. Pharm. Bull. 35:501-506(1987)に記載された方法で決定された夫々の糖の絶対配置は、L-フコース、D-ガラクトース、D-グルコース及びD-マンノースであった。フーリエ変換赤外分光器(FT-IR)スペクトルは、1157、1068及び1041cm-1に特徴のある吸収帯により、該酸性多糖中の糖類のピラノイド型の存在を示唆した。〔Zhao G. H.等により報告されたActa Pharm. Sinica. 38:37-41(2003)の記載によれば、フラノース型はこの領域では2つの吸収帯しか持たない〕899cm-1での吸収帯はD-グルコピラノースユニットを示唆した。更に、Zhang w. J., 2ND Ed. Hangzhou: Zhejiang University Press. P.193-198(1999)の記載によれば、864cm-1での吸収帯はマンノピラノイド及びガラクトピラノイドの特徴であることを示唆した。
【００１９】
1H NMRスペクトルによりδ4.80以下の領域、即ち、δ4.71、δ4.70とδ4.58の夫々の領域にアノマープロトンシグナルが現れた。このことは、該構成糖類はβ-D-配置を持つことを示唆した。これらの知見は、該旋光度の値からの推定と一致した。アノマープロトンシグナルは、δ4.80(δ5.01)以下の領域にあることも明らかになったので、Agrawal P. K.によるPhytochemistry 31:3309-3312(1991)及び32:3307-3330(1992)の記載に徴し、これらの構成糖類のうちのあるものはα-L-配置を持つ可能性がある。δ1.21でのシグナルは、フコース残基のメチルプロトンに当たると考えられた。該フコース残基からのアノマープロトンシグナルは、δ5.0以下の領域に、一重線として検出された。これらの知見は、β-Lフコースのアノマープロトンシグナルがδ5.0以上の領域に現れたので、Agrawal P. K.によるPhytochemistry 32:3307-3330(1992)及びHoshino T.等によるBiol. Pharm. Bull. 21:730-734(1998)の記載に徴し、フコース残渣はα-L配置を持つことを示唆した。
13C NMRスペクトルにより、δ80以上の領域に、C-4シグナル及びC-5シグナルが現れた。この知見は、C-4とC-5のフラノイド構造への化学シフトはδ80〜85に見出されることを記載した前記のAgrawal P. K.によるPhytochemistry 31:3309-3312(1991)及び32:3307-3330(1992)及びPawan. K., Agrawal, Phytochemistry31:3313-3315(1992)の文献の記載に徴し、構成糖類はピラノイド構造であることを示唆した。これらの知見はIRスペクトルデータからの推定と一致した。
【００２０】
次に、上記の酸性多糖GLAaのP. acnes-LPSによって誘発される肝臓障害に対する保護効果試験につき説明する。
加熱失活されたP. acnes細胞の調製:
P. acnes (ATCC6919)を、和光純薬化学工業社製のL-システイン(L-cysteine)0.03%とトゥイーン80(Tween80)0.03%で補添されたブレインハートインフュージョン培地(Brain heart infusion medium)を使用して、37℃で、48時間、嫌気性条件下で培養した。該培地液を4℃で、15分間、5500xgで遠心分離し、次いで、燐酸緩衝化生理食塩水(PBS)で洗浄した。該ペレットを300mlのPBSに懸濁させ、80℃で、30分間加熱し、次いで、加熱失活されたP. acnes細胞を凍結乾燥し、粉末にした。
大腸菌055:B5からのリポ多糖(LPS)を、ドイツ国、スタインハイムのシグマ-アルドリッヒ(Sigma-Aldrich)から購入し用意した。
試験用の動物として、1週間順応飼育した体重18-20gを有する4週齢のオスICRマウスの多数匹を用意した。
【００２１】
肝障害保護活性の比較試験:
GLAaの肝臓保護活性を、上記の順応飼育マウスの多数を用い次のような試験群を作り、検査した。
即ち、10匹のマウスを一群とし、(1)未処理のままのマウス群、(2)P. acnesとLPS(リポ多糖)で処理したマウス群、(3)該GLAa 0.2g/kg/day投与プラスP. acnes-LPSで処理したマウス群、(4) 該GLAa 0.4g/kg/day投与プラスP. acnes-LPSで処理したマウス群及び(5)該GLAa 0.8g/kg/day投与プラスP. acnes-LPSで処理したマウス群を下記のように調製した。
更に詳細には、上記の試験群(2)〜(5)において、生理食塩水に懸濁した加熱失活されたP. acnes細胞を0.15mg/マウスに尾静脈を介して注射し、7日後、マウス当たり0.05μgの量(LPS)を静脈注射することによって急性肝障害が誘発された。そして、該試験群(3),(4),(5)においては、該GLAaを夫々の上記の投与量を毎日一回、胃チューブを通して連続7日間投与し、8日目に、上記の量のLPSを尾静脈注射した。LPS注射後6時間目に肝臓障害を分析するために、夫々の試験群から血液サンプルを採取した。
これらの血液サンプルを3500xgで、15分間遠心分離し、これら血液サンプルから夫々の血清を採取し、-20℃で保管した。
肝細胞障害のマーカーである血清のALT及びASTの活性を市販のキット(和光純薬工業社製のキットTransaminase CII-Test)を使用して測定した。
【００２２】
その結果を図4及び図5に示す。図4及び図5において、“Nor”は上記(1)に対応する無処理マウス群、“Con”は上記(2)に対応するP. acnes-LPS処理マウス群、“Ga0.2”は上記(3)に対応するGLAa 0.2g/kg/day投与+P. acnes-LPS処理のマウス群、“Ga0.4”は上記(4)に対応するGLAa 0.4g/kg/day投与+P. acnes-LPS処理のマウス群、“Ga0.8”は上記(5)に対応するGLAa 0.8g/kg/day投与+P. acnes-LPS処理のマウス群の血清中のALT及びASTの活性レベル(IU/L)を示す。一群当たり10匹のマウスから得た平均±S.D.値を示す。図4,図5において、*はP. acnes-LPS処理群“Con”と比較したp<0.05、**はp<0.001を夫々示す。図4及び図5から明らかなように、特に、GLAa 0.4g/kg/day及びGLAa 0.8g/kg/dayを与えられたマウス群“Ga0.4”及び“Ga0.8”の平均ALT値及び平均AST値は、GLAaを与えられない、比較対照であるP. acnes-LPSにより肝障害を誘発されたマウス群“Con”の平均ALT値及び平均AST値に比し著しく低く、著しい抑制を示し、GLAaがP. acnes-LPSに誘発される肝障害保護に著しく有効であることが判る。この効果の機序について現在検討中である。
【００２３】
以上から明らかなように、霊芝から図6に示す分別法により分取したGLAaと命名した酸性多糖は、グルコース、ガラクトース、マンノース及びフコースを1:0.013:0.009:0.024の割合で含有し、且つβ-D-(1→6)-G1c,β-D-(1→3)-G1c及びβ-D-(1→4)-G1c結合を全体結合の34.9%,33.9%及び28.7%を示す構造特性を有し、平均分子量は12.5×105ドルトン(Doltoons)、施光度は[α]D-9.1°(c=0.55,H2O)を有し、更に、分子量の14.8%のウロン酸と蛋白質0.14%と窒素0.75%を有する特徴構成を有し、P. acnes-LPSで誘発される肝障害に対し、ALT及びASTレベルを有意に減少せしめることができ、肝障害保護剤として有用である。而も、該酸性多糖GLAaは、霊芝から分取できるため、衛生上安全であり、且つ大量生産が可能であり、また、精製品であるため、肝障害保護効果が顕著であり且つ安定している。而して、該GLAaを含む錠剤、カプセル型などの医薬として、また、種々の飲食品の製造に添加して液状又は固体状の健康食品として用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】イオン交換クロマトグラフィーDE-52セルロースによる霊芝(Ganoderma lucidum)の子実体から粗多糖の溶出プロフィール。
【図２】イオン交換クロマトグラフィーDE-52セルロースによるGLAの溶出プロフィール。
【図３】ゲル濾過クロマトグラフィー、トヨパールHW-65(Toyopearl HW-65)によるGLA1の溶出プロフィール。
【図４】座瘡プロピオンバクテリウム(P. acnes)-LPSにより肝障害を誘発されたICRマウスの群の血清のALTレベルについてのGLAaの活性効果を示すグラフ。
【図５】座瘡プロピオンバクテリウム(P. acnes)-LPSにより肝障害を誘発された夫々のICRマウス試験群の血清ASTレベルについてのGLAaの活性効果を示すグラフ。
【図６】霊芝(G. lucidum)からGLAaを分取する工程を示すチャート。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、P. acnesとリポ多糖で誘発される肝臓障害に対する保護剤及びその分取法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、多くの文献により下記のことが知られている。即ち、霊芝(Ganoderma lucidum Karst)は、中国、日本及びその他の東アジア諸国において、天然の強壮剤及び鎮静剤として使用された長年の使用実績のある生薬であり、また、長寿を促進し、且つ活力を維持すると考えられる。最近の薬理学的研究により、この生薬は、肝炎、高血糖症、慢性気管支炎、癌、筋ジストロフィー、動脈硬化症、高血圧症、高コレステロール血症及び白血球減少症に対し有益な効果があることが確認されている。霊芝の子実体、その菌糸体及び胞子が家庭用医薬としてばかりでなく、新しい医薬源として最近注目されている。
過去20年間に、130種以上の高度に酸化されたトリテルペンとこれに関連した化合物が霊芝(G. lucidum)の子実体、菌糸体及び胞子から分離されている。これらのうちのあるものは、抗HIV-1(ガノデリオールF及びガノデルマノントリオール)、抗コレステロール(ガノデリン酸B及びC)、抗侵害受容(ガノデリン酸A,B,G及び化合物C6)、抗ヒスタミン(ガノデリン酸C1及びC2)、抗補体剤(ガノデリオールF、ガノデルマノンジオール及びガノデルマノントリオール)、及び抗HIV-1プロテアーゼ(ルシダモールB及びガノデルマノントリオール)の諸活性を有する。その他のものは、Meth-A(ザルコーマ)(ガノデルマノンジオール及びルシダモールA及びB)、ルイスラットの肺癌(LLC)、(ルシダモールA及びB及びガノデリン酸)及びT-47D(ヒトの肺癌)(ガノデルマノンジオール)に対する細胞障害効果を有することを確認した。ガノデリン酸S1及びCは、う食性細菌ストレプトコッカスミュータンス由来のグルコシルトランスフェラーゼを阻害する。
また、霊芝(G. lucidum)由来の多糖(GLP)は、特異的或いは非特異的免疫反応により誘発される損傷に対し阻害作用を有し、また、腹腔内マクロファージによる食作用を促進し、移植肉腫180及びHL=60腫瘍細胞の成長を阻止するので、該霊芝の子実体から抽出した重要な薬理学的成分であることも公知である。
また、座瘡プロピオンバクテリウム(Propionibacterium acnes)とリポ多糖(LPS)により誘発される劇症肝炎に対し保護効果を有するFK506(tacrolimus hydrate)について、Dig. Dis. Sci. 45:(2000)に報告されている。
上記に関連し、最近、我々は、Chem. Pharm. Bull. 55:(2006)において、座瘡プロピオンバクテリウム(以下P. acnesと略称)とリポ多糖(LPS)で誘発されたマウスの肝臓障害に対するアントロディア シンナモメア(Antrodia cinnamomea)の菌糸体から分離した中性多糖(ACN2a)による保護活性について報告した。
【非特許文献１】Uchida K., Sakaida i., Hironaka K., Kayano K., Okita K., Dig. Dis. Sci. 45:(2000)
【非特許文献２】Han H. F., Nakamura N., Yokozawa T., Hattori M., Chem. Pharm. Bull 55:(2006)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかし乍ら、上記の非特許文献1に報告されているFK506は、現在、臓器移植時、移植後の免疫抑制剤として臨床的に使用されているが、その取り扱いは厳重な医薬品であり、また、強い免疫抑制作用を持つことから、感染症、癌などにかかり易くなり、肝障害予防などの目的で使用できないなどの課題がある。
また、上記の非特許文献2に記載の発明は、肝障害保護剤である中性多糖を抽出する原材料である樟芝は入手困難であり、また、その菌糸体の安全性は未だ確定されていないばかりでなく、培養条件によりその菌糸体の成分組成が変動し、所定の中性多糖が安定して得られないなどの課題がある。
本願の発明は、上記の非特許文献1及び2の課題を解決し、従来から入手が容易で、安全性も確定されている霊芝の子実体や菌糸体を原材料とし、これから抽出、精製して安定な状態で得られる新規なP. acnesと多糖(LPS)により誘発される肝障害保護剤とその分取法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、請求項1に記載の通り、霊芝由来の下記の特徴構成を有し、GLAaと命名した酸性多糖を有効成分とする肝障害保護剤。
記
グルコース、ガラクトース、マンノース及びフコースを1:0.013:0.009:0.024の割合で含有し、且つβ-D-(1→6)-G1c,β-D-(1→3)-G1c及びβ-D-(1→4)-G1c結合を全体結合の夫々34.9%,33.9%及び28.7%を含有し、平均分子量は12.5×105ドルトン、施光度は[α]D25℃は-9.1°;c=0.55,H2Oを有し、更に、分子量の14.8%はウロン酸、0.14%は蛋白質、0.75%は窒素である構成から成ることを特徴とする。
更に本発明は、請求項2に記載の通り、霊芝をクロロホルムで抽出すること、得られた抽出物を真空乾固して得られた残留物を熱水で抽出すること、その水抽出物をエタノールと混ぜ放置し、沈殿物を得ること、その乾燥物をトリクロル酢酸(TCA)水溶液に懸濁せしめ、遠心分離により得たTCA可溶分を蒸留水に対し透析を行い、透析不能分を乾燥し茶色がかった残渣(GL)を得ること、該残渣(GL)の水溶液をアニオン交換クロマトグラフィーにかけ、0.5M NaClでの溶離画分(GLA)を分取すること、該GLA画分をアニオン交換クロマトグラフィーにかけ、0〜0.1M NaClで溶出し、GLA1,GLA2,GLA3の化合物画分を分取すること、該GLA1をゲル濾過クロマトグラフィーにかけ、0.2M NaClで溶出し、GLA1-1とGLA1-2の化合物画分を分取すること、GLA1-2をゲル濾過クロマトブラフィーにかけ、0.2M NaClで更に精製し、GLAaと命名した酸性多糖を取得することを特徴とする霊芝からの酸性多糖GLAaの分取法に存する。
更に本発明は、請求項3に記載の通り、該酸性多糖GLAaを含有する医薬又は飲食品に存する。
【発明の効果】
【０００５】
請求項1記載の発明に係る霊芝由来の酸性多糖GLAaは、P. acnesとリポ多糖(LPS)で肝障害を誘発されたマウスの血清中のASTとALTの増大を抑止することができる肝障害保護活性を有する。該酸性多糖GLAaは、請求項2に記載のように、霊芝から分離精製したものであるから、常に安定した生産が可能であると共に、衛生上安全で且つ安定した肝障害保護剤であり、請求項3に記載の通り、該酸性多糖GLAaを含有する注射薬、カプセル、錠剤などの医薬や健康食品として利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明の実施例として使用される霊芝マンネンタケ(Ganoderma lucidum)は、サルノコシカケ科に属する。該霊芝から下記詳述するように、本発明の酸性多糖を精製分取する。
また、本発明の実施例において、霊芝から分取した肝障害保護物質の分別工程やその特徴構成を特定するために使用した各種分析機器につき以下概説する。
標準分子量マーカーとして役立つPullulan(昭和電工社製 Shodex standard P-82)を用意した。また、旋光度は、JASCO DIP-360 自動旋光計を使用して水溶液を測定した。紫外線(UV)吸収は、株式会社島津製作所のUV-2200 UV-VIS 記録分光計を使用して測定した。赤外線スペクトル(IR)は、JASCO FT/IR-230 赤外線分光計を使用して、KBrディスク又は液体フィルムに記録した。また、核磁気共鳴(NMR)スペクトルは、Varian Unity Plus 500(1H,500MHz; 13C,125MHz)及びVarian GEMINI 300(1H,300MHz; 13C,75MHz)を使用して記録した。D2O中の多糖の分析は外部標準として、1,4-ジオキサン(1,4-dioxane)を用いた。該化合物は、JEOL質量分析計を連結した株式会社島津製GC-17Aガスクロマトグラフを使用したGC-MSにより分析した。夫々の試料(sample)は、ドイツ国、ダルムスシュタットMerck社製のシリカゲル60F254(層厚0.25mm)を塗布されたプレート上及びMerck社製のセルロースFプレート(層厚0.1mm)上の薄層クロマトグラフィー(TLC)により分離した。夫々のスポットは、100℃で10% H2SO4又はアニリン水素フタレートを吹き付けて可視化した。炭水化物の濃度は、フェノール-硫酸法を使用して決定した。(Dubois M.等により報告されたAnal. Chem. 28:350-356(1956)参照)。更にその詳細は以下に説明する。
【実施例】
【０００７】
次に、本発明の実施例につき以下に詳述する。
先ず、該霊芝から目的とする酸性多糖を分取する精製工程の1例を添付図面に基づいて詳述する。
乾燥した霊芝G. lucidumの子実体500gを4LのCHCl3で、室温で24時間抽出することを3回行い、次いで、これら抽出液を一緒にした混合溶液を濾過し、更に真空下で蒸発乾固させ、クロロホルム(CHCl3)抽出物を得た。その蒸発残留物を乾燥し、次いで、該残留物の20倍の容量の水を加え、室温で1時間放置し、次いで、100℃で2時間熱水抽出することを3回行った。3回分の該水抽出物を一緒にし、次いで、減圧下800mlに濃縮した。次いで、3.2Lのエタノールを該濃縮した抽出物に添加した。その混合物を撹拌し、冷蔵庫に一晩保存した。その後、該混合液中の沈殿物を濾過し、冷エタノールで洗浄、乾燥し、次いで、その乾燥物を10%のトリクロル酢酸(TCA)に懸濁させた。これを2,500xgで10分間遠心分離して得られたTCA可溶分を、3日間徹底的に蒸留水に対し透析した。透析不能分を真空凍結乾燥して茶色がかった残渣(GL)4.08gを得た。
【０００８】
次に、図6のチャートに示すように、得られた残渣(GL)につき、分画を行った。
該残渣GLのイオン交換クロマトグラフィー処理:
即ち、かくして得た残渣(GL)を3g H2Oに溶解せしめたものを、英国、メイドストーン(Maidstone)のWhatman International Ltd.製のアニオン交換クロマトグラフィーDE-52(カラム 2.0×20cm)に通し、H2O 60ml, 0.5M NaCl 60ml, 1M NaCl 60ml及び2M NaCl 60mlの溶媒で溶出し、夫々の画分2mlずつを分取した。図1は、該イオン交換クロマトグラフィーDE-52セルロースによるGLの分離を示す。これらの画分のうち、0.5M NaCl画分(GLA)を濃縮し、3日間徹底的に蒸留水に対し透析し、次いで凍結乾燥し、その乾燥物1.02gを得た。該GLA 1.02gをアニオン交換クロマトグラフィーDE-52セルロースを通し、0〜0.1Mの直線濃度勾配のNaClで溶出することにより更に精製した。該溶離液を、フェノール-硫酸法を使用し、480nmで監視した溶出プロフィールに従って、GLA1, GLA2及びGLA3の3画分に分離した(図2参照)。これらの化合物GLA1, GLA2及びGLA3の収量は夫々254mg, 423mg及び69mgであった。
【０００９】
このようにして得たGLA1, GLA２及びGLA３につき、夫々P. acnesとリポ多糖(LPS)により肝障害を誘発されたマウス群に夫々投与し、肝障害保護活性を調べたところ、GLA1のみに上記の効果があることが確認されたが、更に、下記のように精製することにより、著効があり且つ均一性の高い、目的とするGLAaと命名した酸性多糖が得られた。そのGLA1の精製を次のように行った。
GLA1のゲル濾過クロマトグラフィー処理:
即ち、該GLA1 254mgを0.2M NaCl溶液に溶解し、次いでこれを、Tosho社製のトヨパールHW-65(Toyopearl HW-65)カラム(2.0×90cm)に通し、同じ水溶液で溶出した。5mlの各溶出画分を、フェノール-硫酸法を使用し、480nmで監視した溶出プロフィールに従って、2つの部分(GLA1-1 12mgとGLA1-2 55mg)にプールした(図3参照)。
次いで、該GLA1-2画分55mgをカラムクロマトグラフィー Toyopearl HW-65により、上記と同じ条件で、更なる精製を行い、茶色がかった酸性多糖51mgを得た。これをGLAaと命名した。
【００１０】
上記のようにして分取した該酸性多糖GLAaの分子量の推定:
該酸性多糖GLAaの平均分子量を、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を使用して推定した。該試料を、TSK-GMPWXLゲルのカラム7.8×300mm i. d.を通し、0.2M NaClを1ml/分の流量で、ゲル濾過し、標準分子量マーカーとしてのPullulan(昭和電工社製Shodex standard P-82)と比較した。その結果、該GLAaの平均分子量は、12.5×105ドルトン(Daltons)であることが判った。
【００１１】
ウロン酸残渣の還元:
Taylor R. L., Conrad H. E., Biochem. 11:1383-1388(1992)に記載の方法に倣い、固体EDC1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド〔(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide〕1mMをGLAaの水溶液(1mg/ml)の10mlに添加した。反応中、pHは0.1N HClを用いて4.75を維持した。その全ての反応を少なくとも2時間行った。2M水素化ホウ素ナトリウム(NaBH4)を室温で該反応混合物に添加した。該NaBH4が消費されるにつれ、該pHは上昇するが、4NHClでpH7.0に維持した。この反応は、通常、60分以内で15〜25mlのNaBH4を消費した。1-オクタノール(1-Octanol)の1滴を、消泡剤として必要時に、添加した。得られた還元型GLAaは、下記に示す方法で加水分解後、構成糖類の分析を行った。(表1参照)。
【００１２】
構成糖類の同定:
該酸性多糖GLAa 2mgを2mlの2Nトリフルオル酢酸(TFA)に溶解し、密封した。次いで、これをスチームオートクレープ内で、125℃で1時間加水分解後、〔Anal. Biochem. 142:58-67(1984)参照〕、該TFAを蒸発させた。該加水分解物を6mgのNaBH4で還元し、更に、ガスクロマトグラフィー質量分析(GC-MS)〔J&W Scientific社のカラムDB-1(内径0.25mm×30m)、カラム温度条件:5℃/分の増分で50から190℃に上昇させ、次いで、190℃で12分間〕のために、シルブレンダー-HTP(silblendwe-HTP)(ヘキサメチルジシラザン(hexamethyldisilazane):トリメチルクロロシラン(trimethylchrolosilane):ピリジン(pyridine)=2:1:10)を使用して、トリミチルシリル化した。
構成糖類の分析により、GLAaはグルコース、ガラクトース、マンノース及びフコース(1:0.013:0.009:0.024の比率)から成ること及びグルコースが糖類含有量の95.5%を占めていることが判明した。
【００１３】
構成糖類の絶対配置の決定:
構成糖類の絶対配置を、Hara等により報告されたChem. Pharm. Bull. 35:501-506(1987)に従い決定した。即ち、該酸性多糖GLAa 1mgを3mlの2Nトリフルオル酢酸(TFA)で、125℃で、1時間加水分解し、次いで、該TFAを蒸発させ糖残渣を得た。該糖残渣2mgのピリジン溶液0.5mlとL-システインメチルエステル塩酸塩(L-cysteine methyl ester hydrochloride)3mgを混合し、60℃で1.5時間加温し、次いで、N2ガスで瞬間蒸発乾燥した。該乾燥試料を0.4mlのシルブレンダーHTPで、60℃、1時間、トリミチルシリル化した。CHCl3 3mlとH2O 3mlを分画後、該CHCl3抽出物をGC-MS(J&W Scientific社のカラムDB-wax, 30m×0.25mm及びカラム温度:10℃/分の増分で50℃から230℃まで昇温させ、次いで、230℃に12分間)により分析した。これにより、構成糖類の絶対配置はL-fucose, D-galactose, D-glucose, D-mannoseであることが判った。
【００１４】
酸性多糖GLAaの構造分析
上記の種々の分析により、該酸性多糖GLAaは綿の外観を有しており、旋光度[α]D25℃=-9.1°(c=0.55、H2O)、蛋白質0.14%〔Anal. Biochem. 72:248-254(1976)に記載のブラッドフォード法(Bradford method)で測定〕、窒素0.75%、(元素分析により測定)、マンヌロン酸14.8%(Nelly b.及びGustav A., H.等により報告されたAnaL. Biochem. 54:484-489(1973)に記載の方法)から成っていた。硫酸塩は酸性多糖GLAaには存在しなかった〔Terho T. T.及びHartiala K.により報告されたAnal. Biochem. 41:471-476(1971)に記載のバリウムロジゾン酸塩法(Barium rhodizonate method)及びIRで測定〕。
尚、該酸性多糖GLAa中のウロン酸残渣をNaBH4で還元し、次いで、構成糖類を再び分析した。マンノースの量はかなり増大し、マンヌロン酸のカルボン酸基はヒドロキシメチル基に変わり、マンノースを得ることを示していた。
下記表1は、酸性多糖GLAa及び還元酸性多糖GLAaの単糖組成の割合をモル比で示したものである。
【００１５】
【表１】
【００１６】
メチル化糖分析:
該酸性多糖GLAa 5mgを、Anumura及びTaylorにより報告されたAnal. Biochem. 203:101-108(1992)の記載に従って、ヨウ化メチルを使用してメチル化した。次いでオートクレーブ内で、4Nトリフルオル酢酸(TFA)8mlで125℃で90分間加水分解した。該TFAを蒸発させ、次いで、該加水分解物を、NaBH4 3mg/mlを含む1M NH4OHでアルジトールに変換させ、次いでアセチル化した。部分的にメチル化したアルジトールアセテート (Alditol acetates)を、キャリアーガスとしてヘリウムを使用し、GC及びGC-MS 米国、ペンシルベニア州、ベレホンテ(Bellefonte)サプレコ(Supelco)社製のカラムSP-2330(60m×0.25mm、フィルム厚0.20μm)により分析した。該カラム温度条件は、2℃/分の増分で160℃から120℃まで、次いで、5℃/分の増分で210℃から240℃まで、次いで、240℃で14分間であった。ピーク面積は、Sweet D. P., Shapiro R. H., Albersheim P., Carbohydr. Res. 40:217-255(1995)の出版物に記載のモル応答ファクターを使用して補正した。その誘導化合物は、それらのGC-EI-MS断片パターン及びそれらの相対保持時間を1,5-ジ-O-アセチル-2,3,4,6-テトラ-O-メチルグルシトール(1,5-di-O-acetyl-2,3,4,6-tetra-O-methylglucitol)の対応する断片パターン及び相対保持時間と比較することにより同定された。
該メチル化分析により、下記表2に記載するように、該GLAaは、末端1,3-、1,4-、1,6-、1,4,6-及び1,3,6-結合のグルコース残渣からなっていることが判った。また、該メチル化分析により、該GLAaはβ-D-(1→6)-G1c(1,6-、1,3,6-及び1,4,6-G1c)、β-D-(1→3)-G1c(1,3-及び1,3,6-G1c)及びβ-D-(1→4)-G1c(1,4-、1,6-及び1,4,6-G1c)結合を含むこと及び全結合の34.9%、33.9%と28.7%を夫々占めることが判明した。
【００１７】
【表２】
【００１８】
酸性多糖GLAaの旋光度は[α]D=-9.1°(c=0.55、H2O)であった。このことは、構成糖類は、Hadson C. S.により提示されたJ. Am Chem. Soc 31:66-86(1909), 52:1680-1700(1930)及び52:1707-1718(1930)に記載のハドソンの等旋光度則(isorotation rule)により、α-L配置或いはβ-D-配置を有することを示唆した。前記のHara等により提示されたChem. Pharm. Bull. 35:501-506(1987)に記載された方法で決定された夫々の糖の絶対配置は、L-フコース、D-ガラクトース、D-グルコース及びD-マンノースであった。フーリエ変換赤外分光器(FT-IR)スペクトルは、1157、1068及び1041cm-1に特徴のある吸収帯により、該酸性多糖中の糖類のピラノイド型の存在を示唆した。〔Zhao G. H.等により報告されたActa Pharm. Sinica. 38:37-41(2003)の記載によれば、フラノース型はこの領域では2つの吸収帯しか持たない〕899cm-1での吸収帯はD-グルコピラノースユニットを示唆した。更に、Zhang w. J., 2ND Ed. Hangzhou: Zhejiang University Press. P.193-198(1999)の記載によれば、864cm-1での吸収帯はマンノピラノイド及びガラクトピラノイドの特徴であることを示唆した。
【００１９】
1H NMRスペクトルによりδ4.80以下の領域、即ち、δ4.71、δ4.70とδ4.58の夫々の領域にアノマープロトンシグナルが現れた。このことは、該構成糖類はβ-D-配置を持つことを示唆した。これらの知見は、該旋光度の値からの推定と一致した。アノマープロトンシグナルは、δ4.80(δ5.01)以下の領域にあることも明らかになったので、Agrawal P. K.によるPhytochemistry 31:3309-3312(1991)及び32:3307-3330(1992)の記載に徴し、これらの構成糖類のうちのあるものはα-L-配置を持つ可能性がある。δ1.21でのシグナルは、フコース残基のメチルプロトンに当たると考えられた。該フコース残基からのアノマープロトンシグナルは、δ5.0以下の領域に、一重線として検出された。これらの知見は、β-Lフコースのアノマープロトンシグナルがδ5.0以上の領域に現れたので、Agrawal P. K.によるPhytochemistry 32:3307-3330(1992)及びHoshino T.等によるBiol. Pharm. Bull. 21:730-734(1998)の記載に徴し、フコース残渣はα-L配置を持つことを示唆した。
13C NMRスペクトルにより、δ80以上の領域に、C-4シグナル及びC-5シグナルが現れた。この知見は、C-4とC-5のフラノイド構造への化学シフトはδ80〜85に見出されることを記載した前記のAgrawal P. K.によるPhytochemistry 31:3309-3312(1991)及び32:3307-3330(1992)及びPawan. K., Agrawal, Phytochemistry31:3313-3315(1992)の文献の記載に徴し、構成糖類はピラノイド構造であることを示唆した。これらの知見はIRスペクトルデータからの推定と一致した。
【００２０】
次に、上記の酸性多糖GLAaのP. acnes-LPSによって誘発される肝臓障害に対する保護効果試験につき説明する。
加熱失活されたP. acnes細胞の調製:
P. acnes (ATCC6919)を、和光純薬化学工業社製のL-システイン(L-cysteine)0.03%とトゥイーン80(Tween80)0.03%で補添されたブレインハートインフュージョン培地(Brain heart infusion medium)を使用して、37℃で、48時間、嫌気性条件下で培養した。該培地液を4℃で、15分間、5500xgで遠心分離し、次いで、燐酸緩衝化生理食塩水(PBS)で洗浄した。該ペレットを300mlのPBSに懸濁させ、80℃で、30分間加熱し、次いで、加熱失活されたP. acnes細胞を凍結乾燥し、粉末にした。
大腸菌055:B5からのリポ多糖(LPS)を、ドイツ国、スタインハイムのシグマ-アルドリッヒ(Sigma-Aldrich)から購入し用意した。
試験用の動物として、1週間順応飼育した体重18-20gを有する4週齢のオスICRマウスの多数匹を用意した。
【００２１】
肝障害保護活性の比較試験:
GLAaの肝臓保護活性を、上記の順応飼育マウスの多数を用い次のような試験群を作り、検査した。
即ち、10匹のマウスを一群とし、(1)未処理のままのマウス群、(2)P. acnesとLPS(リポ多糖)で処理したマウス群、(3)該GLAa 0.2g/kg/day投与プラスP. acnes-LPSで処理したマウス群、(4) 該GLAa 0.4g/kg/day投与プラスP. acnes-LPSで処理したマウス群及び(5)該GLAa 0.8g/kg/day投与プラスP. acnes-LPSで処理したマウス群を下記のように調製した。
更に詳細には、上記の試験群(2)〜(5)において、生理食塩水に懸濁した加熱失活されたP. acnes細胞を0.15mg/マウスに尾静脈を介して注射し、7日後、マウス当たり0.05μgの量(LPS)を静脈注射することによって急性肝障害が誘発された。そして、該試験群(3),(4),(5)においては、該GLAaを夫々の上記の投与量を毎日一回、胃チューブを通して連続7日間投与し、8日目に、上記の量のLPSを尾静脈注射した。LPS注射後6時間目に肝臓障害を分析するために、夫々の試験群から血液サンプルを採取した。
これらの血液サンプルを3500xgで、15分間遠心分離し、これら血液サンプルから夫々の血清を採取し、-20℃で保管した。
肝細胞障害のマーカーである血清のALT及びASTの活性を市販のキット(和光純薬工業社製のキットTransaminase CII-Test)を使用して測定した。
【００２２】
その結果を図4及び図5に示す。図4及び図5において、“Nor”は上記(1)に対応する無処理マウス群、“Con”は上記(2)に対応するP. acnes-LPS処理マウス群、“Ga0.2”は上記(3)に対応するGLAa 0.2g/kg/day投与+P. acnes-LPS処理のマウス群、“Ga0.4”は上記(4)に対応するGLAa 0.4g/kg/day投与+P. acnes-LPS処理のマウス群、“Ga0.8”は上記(5)に対応するGLAa 0.8g/kg/day投与+P. acnes-LPS処理のマウス群の血清中のALT及びASTの活性レベル(IU/L)を示す。一群当たり10匹のマウスから得た平均±S.D.値を示す。図4,図5において、*はP. acnes-LPS処理群“Con”と比較したp<0.05、**はp<0.001を夫々示す。図4及び図5から明らかなように、特に、GLAa 0.4g/kg/day及びGLAa 0.8g/kg/dayを与えられたマウス群“Ga0.4”及び“Ga0.8”の平均ALT値及び平均AST値は、GLAaを与えられない、比較対照であるP. acnes-LPSにより肝障害を誘発されたマウス群“Con”の平均ALT値及び平均AST値に比し著しく低く、著しい抑制を示し、GLAaがP. acnes-LPSに誘発される肝障害保護に著しく有効であることが判る。この効果の機序について現在検討中である。
【００２３】
以上から明らかなように、霊芝から図6に示す分別法により分取したGLAaと命名した酸性多糖は、グルコース、ガラクトース、マンノース及びフコースを1:0.013:0.009:0.024の割合で含有し、且つβ-D-(1→6)-G1c,β-D-(1→3)-G1c及びβ-D-(1→4)-G1c結合を全体結合の34.9%,33.9%及び28.7%を示す構造特性を有し、平均分子量は12.5×105ドルトン(Doltoons)、施光度は[α]D-9.1°(c=0.55,H2O)を有し、更に、分子量の14.8%のウロン酸と蛋白質0.14%と窒素0.75%を有する特徴構成を有し、P. acnes-LPSで誘発される肝障害に対し、ALT及びASTレベルを有意に減少せしめることができ、肝障害保護剤として有用である。而も、該酸性多糖GLAaは、霊芝から分取できるため、衛生上安全であり、且つ大量生産が可能であり、また、精製品であるため、肝障害保護効果が顕著であり且つ安定している。而して、該GLAaを含む錠剤、カプセル型などの医薬として、また、種々の飲食品の製造に添加して液状又は固体状の健康食品として用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】イオン交換クロマトグラフィーDE-52セルロースによる霊芝(Ganoderma lucidum)の子実体から粗多糖の溶出プロフィール。
【図２】イオン交換クロマトグラフィーDE-52セルロースによるGLAの溶出プロフィール。
【図３】ゲル濾過クロマトグラフィー、トヨパールHW-65(Toyopearl HW-65)によるGLA1の溶出プロフィール。
【図４】座瘡プロピオンバクテリウム(P. acnes)-LPSにより肝障害を誘発されたICRマウスの群の血清のALTレベルについてのGLAaの活性効果を示すグラフ。
【図５】座瘡プロピオンバクテリウム(P. acnes)-LPSにより肝障害を誘発された夫々のICRマウス試験群の血清ASTレベルについてのGLAaの活性効果を示すグラフ。
【図６】霊芝(G. lucidum)からGLAaを分取する工程を示すチャート。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
霊芝由来の下記の特徴構成を有し、GLAaと命名した酸性多糖を有効成分とする肝障害保護剤。
記
グルコース、ガラクトース、マンノース及びフコースを1:0.013:0.009:0.024の割合で含有し、且つβ-D-(1→6)-G1c,β-D-(1→3)-G1c及びβ-D-(1→4)-G1c結合を全体結合の夫々34.9%,33.9%及び28.7%を含有し、平均分子量は12.5×105ドルトン、施光度は[α]D25℃は-9.1°;c=0.55,H2Oを有し、更に、分子量の14.8%はウロン酸、0.14%は蛋白質、0.75%は窒素である構成から成ることを特徴とする。
【請求項２】
霊芝をクロロホルムで抽出すること、得られた抽出物を真空乾固して得られた残留物を熱水で抽出すること、その水抽出物をエタノールと混ぜ放置し、沈殿物を得ること、その乾燥物をトリクロル酢酸(TCA)水溶液に懸濁せしめ、延伸分離により得たTCA可溶分を蒸留水に対し透析を行い、透析不能分を乾燥し茶色がかった残渣(GL)を得ること、該残渣(GL)の水溶液をアニオン交換クロマトグラフィーにかけ、0.5M NaClでの溶離画分(GLA)を分取すること、該GLA画分をアニオン交換クロマトグラフィーにかけ、0〜0.1M NaClで溶出し、GLA1,GLA2,GLA3の化合物画分を分取すること、該GLA1をゲル濾過クロマトグラフィーにかけ、0.2M NaClで溶出し、GLA1-1とGLA1-2の化合物画分を分取すること、GLA1-2をゲル濾過クロマトブラフィーにかけ、0.2M NaClで更に精製し、GLAaと命名した酸性多糖を取得することを特徴とする霊芝からの酸性多糖GLAaの分取法。
【請求項３】
請求項1に記載の酸性多糖GLAaを含有する医薬又は飲食品。
【請求項１】
霊芝由来の下記の特徴構成を有し、GLAaと命名した酸性多糖を有効成分とする肝障害保護剤。
記
グルコース、ガラクトース、マンノース及びフコースを1:0.013:0.009:0.024の割合で含有し、且つβ-D-(1→6)-G1c,β-D-(1→3)-G1c及びβ-D-(1→4)-G1c結合を全体結合の夫々34.9%,33.9%及び28.7%を含有し、平均分子量は12.5×105ドルトン、施光度は[α]D25℃は-9.1°;c=0.55,H2Oを有し、更に、分子量の14.8%はウロン酸、0.14%は蛋白質、0.75%は窒素である構成から成ることを特徴とする。
【請求項２】
霊芝をクロロホルムで抽出すること、得られた抽出物を真空乾固して得られた残留物を熱水で抽出すること、その水抽出物をエタノールと混ぜ放置し、沈殿物を得ること、その乾燥物をトリクロル酢酸(TCA)水溶液に懸濁せしめ、延伸分離により得たTCA可溶分を蒸留水に対し透析を行い、透析不能分を乾燥し茶色がかった残渣(GL)を得ること、該残渣(GL)の水溶液をアニオン交換クロマトグラフィーにかけ、0.5M NaClでの溶離画分(GLA)を分取すること、該GLA画分をアニオン交換クロマトグラフィーにかけ、0〜0.1M NaClで溶出し、GLA1,GLA2,GLA3の化合物画分を分取すること、該GLA1をゲル濾過クロマトグラフィーにかけ、0.2M NaClで溶出し、GLA1-1とGLA1-2の化合物画分を分取すること、GLA1-2をゲル濾過クロマトブラフィーにかけ、0.2M NaClで更に精製し、GLAaと命名した酸性多糖を取得することを特徴とする霊芝からの酸性多糖GLAaの分取法。
【請求項３】
請求項1に記載の酸性多糖GLAaを含有する医薬又は飲食品。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００８−５０３１３（Ｐ２００８−５０３１３Ａ）
【公開日】平成２０年３月６日（２００８．３．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２２８９２０（Ｐ２００６−２２８９２０）
【出願日】平成１８年８月２５日（２００６．８．２５）
【出願人】（５９６１０３７６５）株式会社霊芝総合研究所 (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年３月６日（２００８．３．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年８月２５日（２００６．８．２５）
【出願人】（５９６１０３７６５）株式会社霊芝総合研究所 (2)
【Ｆターム（参考）】
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