肥満又は痩せの検査方法
肥満又は痩せの検査において、ＭＣＰ−１遺伝子又はタンパク質の被検組織又は被検細胞における発現レベルや、当該遺伝子における多型等に基づいた検査をする。また、肥満又は痩せの治療薬のスクリーニング等をはじめとする化合物の評価において、ＭＣＰ−１遺伝子又はタンパク質の性質を利用して当該評価をする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＭＣＰ−１（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｈｅｍｏａｔｒａｃｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ−１：単球走化性因子）遺伝子又はタンパク質を用いた肥満又は痩せの検査方法、及び、当該遺伝子又はタンパク質を含む検査薬等に関する。また、本発明は、当該遺伝子又はタンパク質を用いた、肥満又は痩せの治療又は予防に有効な化合物の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満は、高血圧症、糖尿病、高脂血症、虚血性心疾患等に代表される種々の成人病の危険因子である。また、これらの多くは慢性疾患であることから、将来的には医療費の高騰の原因になると考えられ、社会的にも大きな問題となっている。
【０００３】
このような肥満状態を適切に検査し、認定することは、その後の適切な治療にとって必要不可欠であるため、簡便で精度の高い肥満マーカーの出現が常に望まれている。また、近年、投与した薬剤の効果が被投与者の遺伝子多型等の遺伝子型に影響を受けることが見出されつつあり、薬剤の開発段階における臨床試験やいわゆるオーダーメイド医療において、分子レベルでの検査や診断のマーカーが待望されている。
【０００４】
このような状況にあって、肥満においては、主にＢＭＩ（Ｂｏｄｙ ｍａｓｓ ｉｎｄｅｘ：体重（ｋｇ）／身長（ｍ）／身長（ｍ））がそのマーカーとして使用されており、遺伝子やタンパク質のような分子レベルで診断可能なマーカーはほとんど知られていないのが現状であった。
【０００５】
一方、ＭＣＰ−１は、オープンリーディングフレームがアミノ酸９９個（ヒトの場合）からなり、ＣＣケモカインサブファミリーに属するタンパク質である（アクセッションナンバー：ヒト ＮＭ００２９８２（配列番号９及び１０）、マウス ＮＭ０１１３３３（配列番号１１及び１２））。ＭＣＰ−１は、１９８９年にクローニングされ（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ Ｔ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２４４，４８７−４９３（１９８９）；Ｆｕｒｕｔａｎｉ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１５９，２４９−２５５（１９８９）等）、その後、動脈硬化、慢性関節リウマチ、腎炎との関連が示唆されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，５１３４−５１３８（１９９０）；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０，７７２−７７９（１９９２）；Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．４４，１０３６−１０４７（１９９３））。
【０００６】
ところで、ケモカインは、白血球に対して遊走活性を有する一群のタンパク質であり、炎症の急性期及び慢性期においてその病態の発症、進展、憎悪に関与していることが明らかになっている。中でも、ＭＣＰ−１は、単球に対して強力な走化性及び活性化作用を有することが知られており、免疫活性化作用や抗腫瘍作用等の用途に使用できるものと考えられている。
【０００７】
このように、ＭＣＰ−１についての知見は数多く報告されており、生体内の多種多様な生命現象に関与していることが知られている。しかしながら、ＭＣＰ−１と肥満との関係については、特定の細胞に飽食因子として知られるレプチンを投与したところ、ＭＣＰ−１の発現レベルが上昇したという報告（ＦＡＳＥＢ Ｊ．，１３，１２３１−１２３８（１９９９）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，２５０９６−２５１００（２００１））や、ケモカインによる刺激が間接的に脂肪の蓄積に関与していることを示唆する報告（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．，１７５，８１−９２（２００１））があるに過ぎず、ＭＣＰ−１と肥満との直接的な関係や、ＭＣＰ−１の発現レベルと肥満又は体重変化との相関関係については全く知られていなかった。
【発明の開示】
【０００８】
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、分子レベルで判断可能な肥満又は痩せの検査方法及び当該分子を用いた肥満及び痩せの検査薬を提供することを目的とする。また、肥満又は痩せの治療薬のスクリーニング等、化合物の評価方法、及び当該評価方法により肥満又は痩せの治療薬として有効であると評価された化合物を提供することを目的とする。
【０００９】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、体重変化とＭＣＰ−１の発現量又は血中濃度に一定の相関関係があることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明の肥満又は痩せの検査方法は、ＭＣＰ−１遺伝子の被検組織又は被検細胞における発現レベルを測定することを特徴とする。すなわち、ＭＣＰ−１遺伝子発現レベルに基いて肥満度の検査が可能になる。ここで、前記発現レベルの測定をＤＮＡマイクロアレイにより行うことが好ましい。
【００１１】
また、本発明の肥満又は痩せの検査方法は、ＭＣＰ−１タンパク質の被検組織又は被検細胞における発現レベルを測定することを特徴とする。すなわち、ＭＣＰ−１タンパク質の発現レベルに基いて肥満度の検査が可能になる。
【００１２】
さらに、本発明の肥満又は痩せの検査方法は、ＭＣＰ−１遺伝子の被検組織又は被検細胞における発現レベルの変化を検出することを特徴とする。すなわち、ＭＣＰ−１遺伝子の発現レベルの初期値と所定期間後の発現レベルの測定値とを比較する（例えば、初期値と測定値の差又は比）、肥満度の検査又は予測方法が提供される。ここで、前記発現レベルの測定をＤＮＡマイクロアレイにより行うことが好ましい。
【００１３】
また、本発明の肥満又は痩せの検査方法は、ＭＣＰ−１タンパク質の被検組織又は被検細胞における発現レベルの変化を検出することを特徴とする。すなわち、ＭＣＰ−１タンパク質の発現レベルの初期値と所定期間後の発現レベルの測定値とを比較する（例えば、初期値と測定値の差又は比）、肥満度の検査又は予測方法が提供される。
【００１４】
また、本発明の肥満又は痩せの検査方法は、被検組織又は被検細胞におけるＭＣＰ−１遺伝子に存在する多型を検出することを特徴とする。すなわち、ＭＣＰ−１遺伝子多型に基づいて肥満度の検査又は予測をすることが可能となる。
【００１５】
さらに、本発明の肥満又は痩せの検査方法は、ＭＣＰ−１タンパク質と相互作用することによりＭＣＰ−１遺伝子の発現量に影響を及ぼすタンパク質の発現量又は活性を検出することを特徴とする。すなわち、ＭＣＰ−１遺伝子の発現量に影響を及ぼすタンパク質の発現量又は活性に基づいて肥満度の検査又は予測をすることが可能となる。
【００１６】
また、本発明の肥満又は痩せの検査薬は、ＭＣＰ−１タンパク質に対する抗体を有効成分として含むことを特徴とする。
【００１７】
さらに、本発明の肥満又は痩せの検査キットは、ＭＣＰ−１タンパク質に対する抗体を含むことを特徴とする。前記キットは、好ましくは、前記抗体（１次抗体）を検出するための蛍光物質又はラジオアイソトープで標識された２次抗体、抗原抗体反応を行う際に使用する緩衝液を含む。
【００１８】
また、本発明の肥満又は痩せの治療又は予防に有効な化合物の評価方法は、被検化合物を、被検動物又は被検細胞に、投与又は接触させる工程と、被検化合物が、被検動物又は被検細胞中でＭＣＰ−１遺伝子あるいは当該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現レベルを調節するか否かを確認する工程と、を含むことを特徴とする。
【００１９】
さらに、本発明の肥満又は痩せの治療又は予防に有効な化合物の評価方法は、被検化合物を、被検動物又は被検細胞に、投与又は接触させる工程と、被検化合物が、被検動物又は被検細胞中でＭＣＰ−１タンパク質あるいは当該タンパク質と機能的に等価なタンパク質の発現レベルを調節するか否かを確認する工程、を含むことを特徴とする。
【００２０】
さらに、本発明の肥満又は痩せの治療又は予防に有効な化合物の評価方法は、被検化合物を、ＭＣＰ−１タンパク質に接触させる工程と、被検化合物が、前記タンパク質の活性に影響を与えるか否かを確認する工程と、を含むことを特徴とする。
【００２１】
また、本発明の化合物は、本発明の化合物の評価方法により、肥満又は痩せの治療又は予防に有効であると評価されたことを特徴とする。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
図１は、ＤＩＯマウスと対照群とのＭＣＰ−１の血中濃度を比較したグラフである。
【００２３】
図２は、ＤＩＯマウスと対照群との体重を比較したグラフである。
【００２４】
図３は、ＤＩＯマウスにおける体重とＭＣＰ−１の血中濃度との関係を示すグラフである。
【００２５】
図４は、食事制限の前後におけるモデルマウスの体重を比較したグラフである。
【００２６】
図５は、食事制限の前後におけるモデルマウスの白色脂肪細胞中のＭＣＰ−１の発現量を比較したグラフである。
【００２７】
図６は、食事制限の前後におけるモデルマウスのＭＣＰ−１の血中濃度を比較したグラフである。
【００２８】
図７は、ＤＩＯマウスにおける肥満抑制化合物の投与とＭＣＰ−１の発現量との関係を示すグラフである。
【００２９】
図８は、ＤＩＯマウスにおける肥満抑制化合物の投与とＭＣＰ−１の血中濃度との関係を示すグラフである。
【００３０】
図９は、食事制限の前後における肥満抑制化合物の投与とＭＣＰ−１の血中濃度との関係を示すグラフである。
【００３１】
図１０（Ａ）（Ｂ）（Ｄ）及び（Ｅ）は、いずれも各種細胞におけるＣＤ１１ｂの蛍光強度と細胞数との関係を示すグラフである。また、（Ｃ）及び（Ｆ）は、各種細胞におけるＣＤ１１ｂ陽性細胞数を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
【００３３】
本発明における「発現レベル」とは、ＭＣＰ−１遺伝子の転写産物の絶対量又は相対量をいう。この場合、当該遺伝子は、ＤＮＡ又はｍＲＮＡのいずれをも含む。また、発現の検出対象がタンパク質の場合、その「発現レベル」とは、ＭＣＰ−１遺伝子の翻訳産物の絶対量又は相対量をいう。
【００３４】
本発明における「ＭＣＰ−１タンパク質」は、シグナルペプチドを有する前駆体タンパク質及びシグナルペプチドを有さない成熟タンパク質のいずれも含むが、好適には成熟タンパク質をさす。例えば、ヒトＭＣＰ−１タンパク質は、２３アミノ酸（配列番号１０の１〜２３番目のアミノ酸）からなるシグナルペプチドを有する９９アミノ酸（配列番号１０）からなる前駆体タンパク質及び当該シグナルペプチドを有さない７６アミノ酸（配列番号１０の２４〜９９番目のアミノ酸）からなる成熟タンパク質のいずれであってもよい。また、マウスＭＣＰ−１タンパク質は、２３アミノ酸（配列番号１２の１〜２３番目のアミノ酸）からなるシグナルペプチドを有する１４８アミノ酸（配列番号１２）からなる前駆体タンパク質及び当該シグナルペプチドを有さない１２５アミノ酸（配列番号１２の２４〜１４８番目のアミノ酸）からなる成熟タンパク質のいずれであってもよい。
【００３５】
また、本発明における「被検組織」とは、肥満又は痩せの検査を行う際に生体から抽出可能な組織であれば、その種類は特に限定されないが、肥満又は痩せの影響が反映されやすいとの観点から、例えば、肝臓組織、脂肪組織、筋肉組織、血液組織であることが好ましい。また、組織の単離が容易であるとの観点から、前記組織の中でも血液組織であることが好ましい。ここで、これらの組織の由来となる動物種については特に制限されないが、本発明の主たる用途がヒトの臨床的使用であることから、ヒトであることが好ましい。
【００３６】
また、本発明における「被検細胞」についても、肥満又は痩せの検査を行う際に生体から抽出可能な細胞であれば、その種類は特に限定されないが、肥満又は痩せの影響が反映されやすいとの観点から、例えば、肝細胞、脂肪細胞（白色脂肪細胞、褐色脂肪細胞等）、筋肉細胞（筋芽細胞、骨格筋細胞平滑筋細胞等）、膵細胞（膵島細胞等）、血球細胞であることが好ましい。ここで、かかる組織の由来となる動物種については特に限定されないが、本発明の主たる用途がヒトの臨床的使用であることから、ヒトであることが好ましい。
【００３７】
さらに、本発明における「肥満」とは、脂肪組織が過剰に蓄積した状態と定義される一般的な肥満に加え、これに糖尿病や高血圧等の合併症又は内臓脂肪が伴う、いわゆる「肥満症」も含む。また、本発明における「肥満」は、薬物投与等による体重のコントロールを受けた場合に、もとの体重と比較して相対的に体重が増加した状態をも意味する。
【００３８】
一方、本発明における「痩せ」とは、前記の肥満とは対立する概念を意味するとともに、薬物投与又はダイエット等による体重のコントロールを受けた場合に、もとの体重と比較して相対的に体重が減少した状態をも意味する。
【００３９】
また、本発明における「検査」とは、肥満又は痩せであることを単に判断するのみならず、将来的な肥満又は痩せを「予測」する場合をも含む。
【００４０】
（１）本発明の肥満又は痩せの検査方法
【００４１】
（Ａ）ＭＣＰ−１遺伝子の発現レベルを測定することによる肥満又は痩せの検査方法
【００４２】
前述した被検組織又は被検細胞におけるＭＣＰ−１遺伝子の発現レベルの変化を検出することにより、又は、発現レベルを測定することにより、当該被検組織又は被検細胞を抽出した生体（例えばヒト）が肥満であるか又は痩せであるかを検査・診断することが可能である。また、単に検査時の肥満又は痩せの状態を検査するのみならず、将来的に肥満又は痩せになるか否かを予測することも可能である。
【００４３】
以下に、このような検査の具体的な方法について説明する。
【００４４】
先ず、検査対象となる生体より被検組織又は被検細胞を抽出する。このような抽出の方法としては特に制限はなく、公知の方法により抽出することができる。
【００４５】
次に、抽出された被検組織又は被検細胞から発現レベルの測定の対象となる遺伝子を調製する。
【００４６】
ＭＣＰ−１遺伝子の発現レベルを測定するには、先ず、被検組織又は被検細胞からＭＣＰ−１のＲＮＡ（ｔｏｔａｌ ＲＮＡ又はｍＲＮＡ）を調製する必要がある。このようなＲＮＡの調製は、公知の方法によって行うことができるが、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ２ｎｄ ＥＤＩＴＩＯＮ（１９８９）（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）７．３−７．３６を参照して行うことができる。こうして調製したＲＮＡを用いて、例えば、ＲＴ−ＰＣＲのような遺伝子増幅法、ＤＮＡマイクロアレイ（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製ＤＮＡチップ）を用いる方法、ノーザンハイブリダイゼーション法により、その発現量を測定することができる。また、被検組織又は被検細胞を用いたイン サイチュ ハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）等により、その発現量を測定することもできる。
【００４７】
また、ＭＣＰ−１遺伝子の発現レベルの変化を検出するには、前記の発現量の測定を当該発現量が変化すると予測される期間の前後（例えば、肥満治療薬の投与の前後）について行い、発現量の差を測定すればよい。
【００４８】
具体的には、被検組織又は被検細胞において、前述したＭＣＰ−１遺伝子の発現量が変化すると予測される期間の前後で、その発現レベルが有意に上昇した場合に、体重の増加があった又は将来的に増加する可能性があると診断できる。一方、当該発現レベルが有意に減少した場合に、体重の減少があった又は将来的に減少する可能性があると診断することができる。
【００４９】
（Ｂ）ＭＣＰ−１タンパク質の発現レベルを測定することによる肥満又は痩せの検査方法
【００５０】
被検組織又は被検細胞におけるＭＣＰ−１タンパク質の発現レベルの変化を検出することにより、又は、発現レベルを測定することにより、当該被検組織又は被検細胞を抽出した生体（例えばヒト）が肥満であるか又は痩せであるかを検査・診断することが可能である。また、単に検査時の肥満又は痩せの状態を検査するのみならず、将来的に肥満又は痩せになりうるかを予測することも可能である。
【００５１】
以下、このような検査の具体的な方法について説明する。
【００５２】
タンパク質の発現レベルを測定する方法としては、生体から単離したタンパク質を定量する方法やタンパク質の血中濃度を測定する方法があり、具体的な方法としては特に限定されない。
【００５３】
生体から単離したタンパク質を定量する方法の具体例としては、以下のとおりである。先ず、被検組織又は被検細胞からＭＣＰ−１タンパク質を調製する。このようなタンパク質の調製は、公知の方法によって行うことができるが、例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，１８５０−１８５４（１９８９）に記載の方法により、行うことができる。こうして調製したタンパク質から、例えば、プロテインチップ（例えば、ＣＩＰＨＥＲＧＥＮ社製プロテインチップシステム）を用いる方法、免疫学的方法（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ法、ウエスタンブロッティング法）により、その発現量を測定することができる。また、被検組織又は被検細胞を用いた免疫染色等によって、その発現量を測定することもでできる。一方、タンパク質の血中濃度を測定する方法の具体例としては、生体から採取した血液を用いて、上記免疫学的方法等により、ＭＣＰ−１タンパク質を定量する方法が挙げられる。
【００５４】
以上のようにして、ＭＣＰ−１の遺伝子又はタンパク質の発現レベルを測定した後、その結果を解析することにより、被検体の肥満又は痩せを検査できる。すなわち、本発明より、ＭＣＰ−１タンパク質の発現レベルと体重は一定の相関関係を有することが明らかになったため、上記検査結果と対照群（健常人等）におけるＭＣＰ−１タンパク質の発現量とを比較することにより、肥満又は痩せの程度を判断することが可能となる。また、本発明の検査方法によれば、単に検査時の肥満又は痩せの状態を検査するのみならず、将来的な肥満又は痩せの可能性の予測も可能となる。これは、ＭＣＰ−１タンパク質の血中濃度が体重の増減に先だって増減する傾向が見られることによるものであり、特にＭＣＰ−１タンパク質の血中濃度の減少と体重の減少との関係において、この傾向が強いことが本発明者らによって見出されている。
【００５５】
また、ＭＣＰ−１タンパク質の発現レベルの変化を検出するには、前記の発現量の測定を当該発現量が変化すると予測される期間の前後（例えば、肥満治療薬の投与の前後）について行い、発現量の差を測定すればよい。
【００５６】
具体的には、被検組織又は被検細胞において、前述したＭＣＰ−１タンパク質の発現量が変化すると予測される期間の前後で、その発現レベルが有意に上昇した場合に体重の増加があった又は将来的に増加する可能性があると診断できる。一方、当該発現レベルが有意に減少した場合に体重の減少があった又は将来的に減少する可能性があると診断することができる。
【００５７】
（Ｃ）ＭＣＰ−１遺伝子の遺伝的多型を検出する肥満又は痩せの検査方法
【００５８】
ＭＣＰ−１遺伝子に遺伝的多型が存在する場合、その多型の有無や種類によりＭＣＰ−１遺伝子又はタンパク質の発現レベルが変化したり、当該タンパク質の活性に異常が生じる場合がある。従って、このような遺伝的多型を検出することによりＭＣＰ−１の発現や活性に関する知見を得、さらに、被検組織や被検細胞の由来となった被検体の肥満又は痩せの検査を行うことができる。このような遺伝的多型としては、具体的には、例えば、ミニサテライト、マイクロサテライト、ＳＮＰ（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：一塩基多型）が挙げられる。
【００５９】
ＭＣＰ−１遺伝子における多型の検出は以下のようにして行うことができる。すなわち、ＭＣＰ−１遺伝子において、その発現量を制御する領域を検査対象となる肥満又は痩せの被検体を対象として塩基配列を決定し、多型部位を検出する。検出された多型部位の対立遺伝子頻度を算出し、被検体集団において有意に増加又は減少している対立遺伝子を見出すことにより肥満又は痩せと相関する多型を同定する。このようにして検出された遺伝的多型は、例えば、被検体由来のゲノムＤＮＡについて、多型部位の塩基配列の解析、多型部位に存在する塩基の種類に依存して変化するＤＮＡの物理化学的性質の差や制限酵素部位の相違を利用する方法、当該多型部位の検出に適当な検出用プローブを利用する方法及び質量分析法を利用した方法等によって臨床的に検出可能である。
【００６０】
（Ｄ）ＭＣＰ−１タンパク質と相互作用することによりＭＣＰ−１遺伝子の発現量に影響を及ぼすタンパク質の発現量又は活性を検出することによる肥満又は痩せの検査方法
【００６１】
生体内において、多くのタンパク質は他のタンパク質と相互作用することにより、所定の生理機能を発揮する。例えば、ＭＣＰ−１タンパク質は、血管内皮細胞や平滑筋細胞等で産生され、その受容体であるＣＣＲ２を介して単球、リンパ球、好塩基球等の走化を促すことが知られている。従って、ＭＣＰ−１タンパク質と、当該ＭＣＰ−１タンパク質と相互作用することによりＭＣＰ−１遺伝子の発現量に影響を及ぼすタンパク質の発現量やその活性とは一定の相関関係を有し、いずれか一方の挙動を検出することにより、他方の挙動を推測できる関係にある。
【００６２】
ここで、「相互作用」とは、ＭＣＰ−１タンパク質と別のタンパク質が直接的又は間接的に作用することをいい、例えば、ＭＣＰ−１タンパク質が別のタンパク質と物理的に接触することによりアミノ酸の修飾等を生じるような作用や、第３のタンパク質を介して相互作用し、間接的にＭＣＰ−１タンパク質の発現に影響を及ぼすような作用が挙げられる。このようなタンパク質としては、例えば、ＭＣＰ−１タンパク質を介するシグナル伝達において、ＭＣＰ−１タンパク質の上流又は下流で生理的機能を発揮するタンパク質が挙げられ、より具体的には、例えば、ＭＣＰ−１タンパク質の受容体であるＣＣＲ２や、ＣＣＲ２の下流に位置するシグナル伝達分子が挙げられる。また、ＭＣＰ−１タンパク質の上流又は下流に位置するタンパク質の発現量又は活性を検出する方法としては、対象となるタンパク質の種類に応じて好適な手段を適宜選択すればよく、具体的な手段としては特に限定されない。
【００６３】
以上の（Ａ）〜（Ｄ）で説明したような本発明の肥満又は痩せの検査方法によって、分子レベルで肥満又は痩せの診断が可能となるばかりか、将来的に肥満又は痩せになる可能性についても予測できることとなり、従来の診断方法と比較して、より的確な診断が可能となる。
【００６４】
（２）肥満又は痩せの検査薬、検査キット
【００６５】
ＭＣＰ−１タンパク質の発現量は、肥満又は痩せに基づく体重変化と相関関係を有する。従って、当該タンパク質に対する抗体を使用して被検細胞や被検組織中のタンパク質量を検出、測定することにより、肥満又は痩せの検査を簡便に行うことができる。ここで、「抗体」とは、抗原であるＭＣＰ−１遺伝子産物に結合しうる抗体分子全体又はその断片をいう。このような抗体は、公知の方法によって製造することができ、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のいずれであってもよい。また、当該抗体を用いた免疫学的測定法としては、公知の方法を使用すればよく、具体的には、例えば、蛍光抗体法、酵素抗体法が挙げられる。
【００６６】
また、このような抗体を含んだキットを製造し、本発明を実施することも可能である。キットの構成としては、当該抗体に加え、例えば、抗体を検出するために蛍光標識やラジオアイソトープで標識された２次抗体や抗原抗体反応を行う際に使用する緩衝液を備えていてもよい。
【００６７】
このような肥満又は痩せの検査薬を使用することにより、分子レベルで肥満又は痩せの診断が可能となるばかりか、将来的に肥満又は痩せになる可能性についても予測できることとなり、従来の診断方法と比較して、より的確な診断が可能となる。また、本発明の肥満又は痩せの検査キットを使用することにより、前述したような的確な診断を非常に簡便に実施することが可能となる。
【００６８】
（３）本発明の肥満又は痩せの治療又は予防に有効な化合物の評価方法
【００６９】
被検化合物を被検動物や被検細胞に投与、接触させることにより変動するＭＣＰ−１遺伝子又はＭＣＰ−１タンパク質の発現量を測定したり、被検化合物をＭＣＰ−１タンパク質に接触させて当該タンパク質の活性に及ぼす影響を検討することにより、当該被検化合物の評価を行うことが可能となる。
【００７０】
すなわち、このような被検化合物の中には、細胞や組織に作用することにより、ＭＣＰ−１遺伝子又はＭＣＰ−１タンパク質の発現レベルやＭＣＰ−１タンパク質の活性を正常化あるいはコントロールし、脂肪の蓄積や食欲のコントロール等、肥満や痩せの原因となるメカニズムの正常化を図ることができるものがあると考えられる。従って、以下に説明するような評価方法により、肥満又は痩せの治療薬又は予防に有効な化合物を評価することが可能となる。ここで、「評価」とは、化合物のスクリーニングのみならず、バリデーションをも含む概念を指す。
【００７１】
また、本発明者らは、ＭＣＰ−１を投与してその血中濃度を高めることにより単球の活性化、すなわちＣＤ１１ｂ ｐｏｓｉｔｉｖｅ単球の増加が促進されることを見出している。従来は、血管の炎症部分等からＭＣＰ−１が血管内に分泌され、その結果、単球の活性化が促進されていると考えられていた。しかし、これに加え、血管外部からのＭＣＰ−１によっても単球の活性化が認められる。単球の走化は単球の活性化によって促進され、また、単球の走化に続くマクロファージの産生により動脈硬化が生じることから、肥満によるＭＣＰ−１の増加が動脈硬化の一因となる。
【００７２】
本発明の化合物の評価方法により、ＭＣＰ−１遺伝子又はＭＣＰ−１タンパク質の発現レベル又はＭＣＰ−１タンパク質の活性を指標として肥満又は痩せの治療又は予防に有効な化合物を評価することが可能になるとともに、肥満を介した動脈硬化についても、その治療又は予防に有効な化合物の評価を行うことが可能となる。
【００７３】
（Ａ）ＭＣＰ−１遺伝子の発現レベル調節能を指標とする評価方法
【００７４】
被検化合物を被検動物又は被検細胞に投与又は接触させ、当該被検化合物が被検動物又は被検細胞中でＭＣＰ−１遺伝子あるいは当該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現レベルを調節するか否かを確認することにより、肥満又は痩せの治療又は予防に有効な化合物を評価することが可能となる。
【００７５】
具体的には、以下の手順で被検化合物の評価を行う。
【００７６】
先ず、被検化合物を被検動物又は被検細胞に投与又は接触させる。ここで、被検化合物としては、肥満又は痩せの治療又は予防薬の候補化合物であれば、その構造や性質は問わず、化合物種も限定されない。また、被検動物としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、サルが挙げられる。
【００７７】
被検化合物を被検動物に投与する方法としては特に制限はなく、具体的には、例えば、経口投与、非経口投与（例えば、経皮投与、筋肉内注射、静脈内注射、皮下注射）が挙げられる。また、被検化合物を被検細胞に接触させる方法としても特に制限はなく、具体的には、例えば、緩衝液（リン酸緩衝液等）等の溶液中で混合し接触する方法が挙げられる。
【００７８】
次に、被検化合物が被検動物又は被検細胞中でＭＣＰ−１遺伝子あるいは当該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現レベルを調節するか否かを確認する。
【００７９】
前記遺伝子の発現レベルの調節の有無の確認法としては、特に制限はなく、前述の投与又は接触の前を対照とし、当該遺伝子の発現量の変化をＲＴ−ＰＣＲのような遺伝子増幅法、ＤＮＡマイクロアレイを用いる方法又はノーザンハイブリダイゼーション法等によって検出することにより実施することができる。また、前記遺伝子の発現調節領域とレポーター遺伝子との融合遺伝子を人為的に導入した動物又は細胞を用いてもよい。この場合、レポーター遺伝子としては、具体的には、例えば、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子又はグリーンフルオレッセンスプロテイン遺伝子が挙げられる。
【００８０】
ここで、「ＭＣＰ−１遺伝子と機能的に等価な遺伝子」とは、ＭＣＰ−１遺伝子と塩基配列は異なるものの、比較的高い相同性を示し、ＭＣＰ−１と同じ又は類似の活性を有する遺伝子を示す。ここで、前記相同性は、機能的に等価であれば特に制限はないが、塩基配列の相同性が７０〜１００％であることが好ましく、８０〜１００％であることがより好ましく、９０〜１００％であることが特に好ましい。相同性が前記下限より低い場合には、ＭＣＰ−１と同じ又は類似の機能を示さない可能性が高い傾向にある。しかしながら、塩基配列の相同性が前記下限未満であっても、ＭＣＰ−１に特有の機能を有するドメインと、当該ドメインに対応する塩基配列との相同性が高い場合にはＭＣＰ−１遺伝子と同様又は類似の機能を有する場合がある。このような遺伝子は、塩基配列の相同性が前記範囲外であっても好適に使用可能である。また、比較的相同性の高い遺伝子とは、ＭＣＰ−１遺伝子における１又は２以上の塩基が自然若しくは人工的に置換、欠失、付加及び／又は挿入した遺伝子であってもよい。
【００８１】
被検化合物を投与又は接触させない場合に比べて、被検化合物を投与又は接触させた場合のＭＣＰ−１遺伝子又はＭＣＰ−１遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現レベルが５％以上、好ましくは１０％以上、より好ましくは２０％以上低下した場合、当該被検化合物は肥満の治療又は予防に有効な化合物と評価できる。他方、被検化合物を投与又は接触させない場合に比べて、被検化合物を投与又は接触させた場合のＭＣＰ−１遺伝子又はＭＣＰ−１遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現レベルが５％以上、好ましくは１０％以上、より好ましくは２０％以上上昇した場合、当該被検化合物は痩せの治療又は予防に有効な化合物と評価できる。
【００８２】
（Ｂ）ＭＣＰ−１タンパク質の発現レベル調節能を指標とする評価方法
【００８３】
被検化合物を被検動物又は被検細胞に投与又は接触させ、当該被検化合物が被検動物又は被検細胞中でＭＣＰ−１タンパク質あるいは当該タンパク質と機能的に等価なタンパク質の発現レベルを調節するか否かを確認することにより、肥満又は痩せの治療又は予防に有効な化合物を評価することが可能となる。
【００８４】
被検化合物を被検動物又は被検細胞に投与又は接触させる方法等については、上記の（Ａ）ＭＣＰ−１遺伝子の発現レベル調節能を指標とする評価方法に記載の方法等と同様である。
【００８５】
前記タンパク質の発現レベルの調節の有無の確認法としては、特に制限はなく、前述の投与又は接触の前を対照とし、当該タンパク質の発現量の変化を、例えば、プロテインチップ（例えば、ＣＩＰＨＥＲＧＥＮ社製プロテインチップシステム）を用いる方法、免疫学的方法（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ法、ウエスタンブロッティング法）等によって検出することにより実施することができる。前記タンパク質の発現レベル調節の有無の確認は、ＭＣＰ−１タンパク質の血中濃度の測定により行うことが好ましい。
【００８６】
ここで、「ＭＣＰ−１タンパク質と機能的に等価なタンパク質」とは、ＭＣＰ−１タンパク質とアミノ酸配列は異なるものの、比較的高い相同性を示し、ＭＣＰ−１タンパク質と同じ又は類似の活性を有するタンパク質を示す。ここで、前記相同性は、機能的に等価であれば特に制限はないが、アミノ酸配列の相同性が５０〜１００％であることが好ましく、６０〜１００％であることがより好ましく、７０〜１００％であることが特に好ましい。相同性が前記下限より低い場合には、ＭＣＰ−１タンパク質と同じ又は類似の機能を示さない可能性が高い傾向にある。しかしながら、タンパク質のアミノ酸配列の相同性が前記下限未満であっても、ＭＣＰ−１タンパク質に特有の機能を有するドメインのアミノ酸配列と、前記タンパク質の当該ドメインに対応するアミノ酸配列との相同性が高い場合には、前記タンパク質はＭＣＰ−１タンパク質と同様又は類似の機能を有する場合がある。このようなタンパク質は、アミノ酸配列の相同性が前記範囲外であっても好適に使用可能である。また、比較的相同性の高いタンパク質とは、ＭＣＰ−１タンパク質における１又は２以上のアミノ酸残基が自然若しくは人工的に置換、欠失、付加及び／又は挿入したタンパク質であってもよい。
【００８７】
被検化合物を投与又は接触させない場合に比べて、被検化合物を投与又は接触させた場合のＭＣＰ−１タンパク質又はＭＣＰ−１タンパク質と機能的に等価なタンパク質の発現レベルが５％以上、好ましくは１０％以上、より好ましくは２０％以上低下した場合、当該被検化合物は肥満の治療又は予防に有効な化合物と評価できる。他方、被検化合物を投与又は接触させない場合に比べて、被検化合物を投与又は接触させた場合のＭＣＰ−１タンパク質又はＭＣＰ−１タンパク質と機能的に等価なタンパク質の発現レベルが５％以上、好ましくは１０％以上、より好ましくは２０％以上上昇した場合、当該被検化合物は痩せの治療又は予防に有効な化合物と評価できる。
【００８８】
（Ｃ）ＭＣＰ−１タンパク質の活性を指標とする評価方法
【００８９】
被検化合物をＭＣＰ−１タンパク質に接触させ、被検化合物が当該タンパク質の活性に影響を与えるか否かを確認することにより、肥満又は痩せの治療又は予防に有効な化合物を評価することが可能となる。
【００９０】
具体的には、以下の手順で被検化合物の評価を行う。
【００９１】
先ず、被検化合物をＭＣＰ−１タンパク質に接触させる。
【００９２】
このようなタンパク質と被検化合物を接触させる方法は、特に制限はなく、具体的には、例えば、緩衝液（リン酸緩衝液等）等の溶液中で混合し接触させる方法が挙げられる。
【００９３】
次に、被検化合物が当該タンパク質の活性に影響を与えるか否かを確認する。タンパク質の活性測定における条件は、使用するタンパク質の性質により適宜設定すればよい。このような条件としては、具体的には、例えば、ＭＣＰ−１タンパク質の場合には、単球走化性を指標とすることができ、例えば、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０，７７２−７７９（１９９２）；Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．４４，１０３６−１０４７（１９９３）（非特許文献４）を参照して行うことができる。
【００９４】
被検化合物をＭＣＰ−１タンパク質に接触させない場合に比べて、被検化合物をＭＣＰ−１タンパク質に接触させた場合のＭＣＰ−１タンパク質の活性が５％以上、好ましくは１０％以上、より好ましくは２０％以上低下した場合、当該被検化合物は肥満の治療又は予防に有効な化合物と評価できる。他方、被検化合物をＭＣＰ−１タンパク質に接触させない場合に比べて、被検化合物をＭＣＰ−１タンパク質に接触させた場合のＭＣＰ−１タンパク質の活性が５％以上、好ましくは１０％以上、より好ましくは２０％以上上昇した場合、当該被検化合物は痩せの治療又は予防に有効な化合物と評価できる。
【００９５】
以上説明したような本発明の肥満又は痩せの治療又は予防に有効な化合物の評価方法により、肥満又は痩せの治療薬や診断薬のスクリーニングや、これらの薬剤の有効性又は安全性の評価、さらには、オーダーメイド治療における適切な薬剤の選択が可能となる。
【００９６】
（４）本発明の肥満又は痩せの治療又は予防に有効な化合物
【００９７】
ＭＣＰ−１が肥満及び体重変化に関与していることが解明されたので、上記の評価方法により有効であると評価された化合物は、肥満又は痩せの治療又は予防剤として極めて有用である。
【実施例】
【００９８】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００９９】
（肥満モデル動物の作製）
【０１００】
製造例１
（ニューロペプチドＹ（Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｙ：ＮＰＹ）Ｙ５アゴニストｉ．ｃ．ｖ．投与マウス）
【０１０１】
ＮＰＹ Ｙ５アゴニストを投与することにより肥満を呈するモデルマウスを以下の要領で作製した。
【０１０２】
９〜１２週齢の雄マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ：クレア社製）は、室温２３±２℃、湿度５５±１５％の条件下、１プラスチックゲージに１匹ずつ飼育した。また、飼育時の明暗のサイクルは１２時間とし、午前７時に点灯し、午後７時に消灯した。また、マウスは、飼料（ＣＥ−２（タンパク質：２５．４重量％、炭水化物：５０．３重量％、脂質：４．４重量％）：クレア社製）と水は自由に摂取させた。
【０１０３】
マウスは、８０ｍｇ／ｋｇペントバルビタールナトリウム（ダイナボット社製）で麻酔をかけ、滅菌された２８ゲージの脳注入カニューレ（アルゼ（Ａｌｚｅｔ）社製）を右側脳質へ定位的に移植した。カニューレはブレグマより後方へ０．４ｍｍ、側方へ０．８ｍｍ、深さ２ｍｍの位置に、頭蓋骨に対し垂直に固定した。カニューレは歯科用セメントで頭蓋骨に固定した。カニューレは、０．０５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む１０ｍＭのリン酸緩衝液で満たした浸透圧ポンプ（モデルナンバー２００２：アルゼ社製）にポリビニルクロライドチューブで接続した。１０ｍＭ ＰＢＳ（０．０５％ＢＳＡ含む）にＤ−Ｔｒｙ３４ＮＰＹ（５マイクログラム／日になるように調製）を溶解した溶液をポンプに満たした後、マウスの背中の皮下に埋め込み、抗生物質（５０ｍｇ／ｋｇのセファメジン（Ｃｅｆａｍｅｄｉｎｅ）：藤沢薬品社製）を皮下注射した。
【０１０４】
これらのマウスを平均体重を一致させた３つのグループ（溶媒のみを注入したグループ（ｖｅｈｉｃｌｅ ｇｒｏｕｐ）、Ｄ−Ｔｒｙ３４ＮＰＹ（ＮＰＹ Ｙ５アゴニスト）を注入したグループ（ａｄ ｌｉｂ ｆｅｄ ｇｒｏｕｐ）、Ｄ−Ｔｒｙ３４ＮＰＹを注入しペアフィードとしたグループ（ｐａｉｒ−ｆｅｄ ｇｒｏｕｐ））に分けた。
【０１０５】
製造例２
（ＤＩＯ（Ｄｉｅｔ ｉｎｄｕｃｅｄ ｏｂｅｓｉｔｙ）マウス）
【０１０６】
１８週齢のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ：クレア社製）は、室温２３±２℃、湿度５５±１５％の条件下、１プラスチックゲージに１匹ずつ飼育した。このマウスに高カロリー食であるＭＨＦ（タンパク質：１８．２重量％、炭水化物：５５．６重量％、脂質：１５．５重量％）を６ヶ月間に渡って与え、肥満を呈するモデルマウス（ＤＩＯマウス）を作製した。なお、実施例中、「ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ＭＦＤ」は、これ以上体重が増えないようになるまでＭＨＦを与えて飼育したマウスを指す。
【０１０７】
また、前記のマウスにＭＨＦよりさらに高い脂肪を含有する高カロリー食であるＨＦＤ（タンパク質：２０．８重量％、炭水化物：３８．５９重量％、脂質：３２．８８重量％）を与えたＤＩＯマウス（ＨＦＤ）も作製した。
【０１０８】
製造例３
（食事制限をしたマウス）
【０１０９】
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ、１７週齢）は１ケージに１匹ずつ個別に飼育した。また、エサは普通食（ＣＡ−１、ＣＬＥＡ）を与えた。
【０１１０】
摂食制限は、以下のようなスケジュールで行った。すなわち、エサ（ＣＡ−１）を１日につき３時間（１０：００〜１３：００）だけ与え、水は自由に摂取できるようにした。摂食時間の前後で餌の重量を測定し、その差を摂食量とした。また、摂食制限をしている期間は、体重、外見の観察等をモニターした。なお、条件付けに失敗したと思われるマウス（短期間に極度な体重減少（例えば２０％程度の減少）が見られるマウス）は実験には使用しなかった。かかる条件下でマウスを７日間飼育した後、白色脂肪細胞を摘出した。
【０１１１】
実施例１〜３及び比較例１
（白色脂肪細胞におけるＭＣＰ−１の発現）
【０１１２】
ＭＣＰ−１の発現量の定量的な解析は、マウス白色脂肪細胞からＲＴ−ＰＣＲによって得たｃＤＮＡを用い、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法により行った。標準曲線はマウスＭＣＰ−１ ｃＤＮＡ（アクセッションナンバー：ＮＭ０１１３３３）断片を用いて作成し、β−ａｃｔｉｎの発現量に基づいて標準化した。以下に、使用したプライマーの塩基配列を示す。
マウスＭＣＰ−１ｃＤＮＡ断片作製用プライマー
【０１１３】
非処理のＣ５７ＢＬ／６Ｎの白色脂肪細胞におけるＭＣＰ−１及びレプチンの発現量を１とした場合の、ＤＩＯマウス（ＤＩＯ）、Ｄ−Ｔｒｙ３４ＮＰＹ投与マウス（Ｙ５ ａｇｏｎｉｓｔ ＦＦ）、Ｄ−Ｔｒｙ３４ＮＰＹ ｐａｉｒ ｆｅｅｄｉｎｇ投与群マウス（Ｙ５ ａｇｏｎｉｓｔ ＰＦ）及び食事制限をしたマウス（Ｆａｓｔｉｎｇ）におけるこれらの遺伝子の発現量を表１に示す。表１より明らかなように、肥満モデルマウスではＭＣＰ−１の発現量が増加し、食事制限をしたマウスでは、その発現量が低下していた。従って、ＭＣＰ−１の発現量と体重とが相関関係を有していることが明らかとなった。
【０１１４】
【実施例４】
【０１１５】
（肥満モデルマウスにおけるＭＣＰ−１の血中濃度）
【０１１６】
ＤＩＯマウスにおけるＭＣＰ−１の血中濃度の測定を行い、肥満とＭＣＰ−１濃度との関係を検討した。各マウスにおけるＭＣＰ−１の血中濃度の測定は、以下のようにして行った。
【０１１７】
８週齢からＭＨＦを与えて飼育したＤＩＯマウス５５匹について、１５週齢のときに尾静脈より採血を行った。この血漿成分を用いて、ＭＣＰ−１の血中濃度を測定した。具体的には、先ず、マウス尾静脈よりヘパリン採血を行い、遠心操作により血漿成分を採取した。次に、５０マイクロリットルの血漿を抗体固相化プレート中、室温で２時間静置して反応させた。このプレートを緩衝液で洗浄後、酵素標識された抗マウスＭＣＰ−１抗体を加え、室温でさらに２時間静置して反応させた。再びこのプレートを緩衝液で洗浄した後、酵素基質溶液を加え、遮光下、室温で３０分間静置して反応させた。この反応を塩酸で停止させた後、吸光度を測定した。標準曲線用のＭＣＰ−１溶液の吸光度より標準曲線を作製し、血漿中のＭＣＰ−１の濃度を求めた（ＥＩＡサンドイッチ法（Ｒ＆Ｄシステム社製））。
【０１１８】
図１に示すとおり、ＤＩＯマウスでは対照群（Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ）と比較してＭＣＰ−１の血中濃度が著しく上昇していることが分かった。なお、ここで使用したＤＩＯマウスと対照群との体重差を図２に示す。
【０１１９】
また、ＤＩＯマウスにおける体重とＭＣＰ−１の血中濃度との関係を図３に示す。図３から明らかなように、肥満モデルマウスにおいて、ＭＣＰ−１の血中濃度と体重とは一定の相関関係を有することが見出された。
【実施例５】
【０１２０】
（食事制限モデルマウスの白色脂肪細胞におけるＭＣＰ−１の発現）
【０１２１】
製造例３で作製した食事制限モデルマウスを用い、ＭＣＰ−１の発現量を測定した。ここで、ＭＣＰ−１の発現量の測定は、実施例１と同様に実施した。
【０１２２】
図４にモデルマウスの食事制限の前後における体重変化を示す。なお、図４中、縦軸は、食事制限前の体重に対する食事制限後の体重を％で示す。
【０１２３】
また、図５にモデルマウスの食事制限の前後におけるＭＣＰ−１の発現量を示す。図５から明らかなように、食事制限によりＭＣＰ−１の発現量が著しく低下した。なお、図５中、縦軸は食事制限前のＭＣＰ−１の発現量を１とした場合のＭＣＰ−１の発現量を示す。
【０１２４】
以上より、体重の減少とＭＣＰ−１の発現量との間には密接な相関関係があることが明らかとなった。
【実施例６】
【０１２５】
（食事制限モデルマウスにおけるＭＣＰ−１の血中濃度）
【０１２６】
製造例３で作製した食事制限モデルマウスを用い、ＭＣＰ−１の血中濃度の測定を行った。また、ＭＣＰ−１の血中濃度は実施例４と同様にして測定した。
【０１２７】
図６から明らかなように、食事制限の前後でＭＣＰ−１の血中濃度は著しく減少した。このことから、体重の減少と血中のＭＣＰ−１濃度との間には密接な相関関係があることが明らかとなった。
【実施例７〜９】
【０１２８】
（肥満抑制作用を有する化合物投与によるＭＣＰ−１の発現量及び血中濃度の変動）
【０１２９】
ＤＩＯマウス（ＨＦＤ）にＷＯ０１／１４３７６号公報記載の肥満抑制作用を有する化合物（化合物１）を投与した後、当該マウスの白色脂肪細胞におけるＭＣＰ−１の発現量を測定した。図７に示すとおり、ＤＩＯ（ＨＦＤ）マウスではＭＣＰ−１の発現は著しく上昇したが、肥満抑制作用を有する化合物を投与した場合には、その発現は有意に減少した（実施例７）。なお、図７中、ＲＤは普通食を与えたマウス（Ｒｅｇｕｌａｒ ｄｉｅｔ）を示し、縦軸はｍＲＮＡの発現量をβ−ａｃｔｉｎの発現量で補正した値を示す。
【０１３０】
また、ＤＩＯマウスにＷＯ０１／１４３７６号公報記載の肥満抑制作用を有する化合物（化合物１）を投与した後、ＭＣＰ−１の血中濃度を測定した。図８に示すとおり、ＤＩＯ（ＭＨＦ）マウスではＭＣＰ−１の血中濃度は著しく上昇したが、肥満抑制作用を有する化合物を投与した場合には、その血中濃度は有意に減少した（実施例８）。
【０１３１】
さらに、ＤＩＯマウスに前記化合物を投与後、４日目に採血してＭＣＰ−１の血中濃度を測定し、この血中濃度を体重で標準化した。図９より明らかなように、４日目では体重は減少していないにもかかわらず、ＭＣＰ−１の血中濃度は低下した。これは、体重が減少するのに先だってＭＣＰ−１の血中濃度の低下が生じていることを示す（実施例９）。なお、前記化合物投与４日目においては、ＭＣＰ−１遺伝子の発現は減少したが、レプチン遺伝子の発現には変化はなかった。このことより、ＭＣＰ−１は、レプチンよりも先に体重変化に反応することが明らかとなった。
【実施例１０】
【０１３２】
（フローサイトメトリーによるＣＤ１１ｂの発現解析）
【０１３３】
マクロファージの表面抗原であるＣＤ１１ｂの数、すなわち、血中単球がＭＣＰ−１の投与によりどのように変動するかを調べるため、フローサイトメトリーによる解析を行った。
【０１３４】
先ず、ＭＣＰ−１をマウスの皮下に１０ｎｇ／０．５マイクロリットル／時間の割合でオスモティックポンプを用いて２週間に渡って注入した。次に、コントロールマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）、ＤＩＯマウス及びＭＣＰ−１処理したマウスそれぞれの尾静脈から、ヘパリン処理したキャピラリーを用いて血液を採取した。血球細胞は３００×ｇで５分間遠心分離して採取した後、室温で１５分間、ＦＩＴＣラベルした抗マウスＣＤ１１ｂ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）とインキュベートした。また、非特異的結合のコントロールとして、前記の試料はＩｇＧ２ｂアイソタイプともインキュベートした。これらの細胞をＰＢＳで洗浄した後、赤血球を、溶解バッファーを用いて、室温で５分間、溶解した。細胞をＰＢＳで洗浄した後、０．５％ホルムアルデヒド入りのＰＢＳに懸濁した。この懸濁液から単球を同定するため、ＥＰＩＣＳ Ｅｌｉｔｅ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を用いてフローサイトメトリーを行った。ここで、フローサイトメトリーによる解析は、全血球細胞中の単球／マクロファージの集合を決定することにより行った。また、フローサイトメトリーは、蛍光と散乱光を指標にし、各試料につき４０，０００個の細胞を解析した。
【０１３５】
フローサイトメトリーの結果を図１０（ａ）〜（ｆ）に示す。ここで、図１０（ａ）はコントロールマウス由来の血球細胞の結果を示し、図１０（ｂ）はＤＩＯマウス由来の血球細胞の結果を示す。また、図１０（ｃ）はコントロールマウス及びＤＩＯマウスにおけるＣＤ１１ｂ陽性の単球数を示す。一方、図１０（ｄ）はｓａｌｉｎｅ投与したコントロールマウス由来の血球細胞の結果を示し、図１０（ｅ）はＭＣＰ−１投与したマウス由来の血球細胞の結果を示す。また、図１０（ｆ）はｓａｌｉｎｅ投与コントロールマウス及びＭＣＰ−１投与マウスにおけるＣＤ１１ｂ陽性の血球数を示す。図１０（ａ）〜（ｆ）より、ＤＩＯマウス及び体外からＭＣＰ−１を投与したマウスにおいてＣＤ１１ｂ陽性の血球数すなわちマクロファージ数の増加が確認できた。ここで、ＣＤ１１ｂ ｐｏｓｉｔｉｖｅ単球の増加は、単球の動脈硬化巣への走化を促進していると考えられる。すなわち、血管内皮から分泌されたＭＣＰ−１のみならず、体外から投与したＭＣＰ−１によっても単球の走化が起きることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【０１３６】
本発明の検査方法によれば、分子レベルで肥満又は痩せの検査・予測が可能となり、従来の診断方法と比較してより的確な診断が可能となる。また、本発明の化合物の評価方法によれば、肥満又は痩せの治療薬や診断薬のスクリーニング等、各種評価が可能となる。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＭＣＰ−１（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｈｅｍｏａｔｒａｃｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ−１：単球走化性因子）遺伝子又はタンパク質を用いた肥満又は痩せの検査方法、及び、当該遺伝子又はタンパク質を含む検査薬等に関する。また、本発明は、当該遺伝子又はタンパク質を用いた、肥満又は痩せの治療又は予防に有効な化合物の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満は、高血圧症、糖尿病、高脂血症、虚血性心疾患等に代表される種々の成人病の危険因子である。また、これらの多くは慢性疾患であることから、将来的には医療費の高騰の原因になると考えられ、社会的にも大きな問題となっている。
【０００３】
このような肥満状態を適切に検査し、認定することは、その後の適切な治療にとって必要不可欠であるため、簡便で精度の高い肥満マーカーの出現が常に望まれている。また、近年、投与した薬剤の効果が被投与者の遺伝子多型等の遺伝子型に影響を受けることが見出されつつあり、薬剤の開発段階における臨床試験やいわゆるオーダーメイド医療において、分子レベルでの検査や診断のマーカーが待望されている。
【０００４】
このような状況にあって、肥満においては、主にＢＭＩ（Ｂｏｄｙ ｍａｓｓ ｉｎｄｅｘ：体重（ｋｇ）／身長（ｍ）／身長（ｍ））がそのマーカーとして使用されており、遺伝子やタンパク質のような分子レベルで診断可能なマーカーはほとんど知られていないのが現状であった。
【０００５】
一方、ＭＣＰ−１は、オープンリーディングフレームがアミノ酸９９個（ヒトの場合）からなり、ＣＣケモカインサブファミリーに属するタンパク質である（アクセッションナンバー：ヒト ＮＭ００２９８２（配列番号９及び１０）、マウス ＮＭ０１１３３３（配列番号１１及び１２））。ＭＣＰ−１は、１９８９年にクローニングされ（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ Ｔ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２４４，４８７−４９３（１９８９）；Ｆｕｒｕｔａｎｉ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１５９，２４９−２５５（１９８９）等）、その後、動脈硬化、慢性関節リウマチ、腎炎との関連が示唆されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，５１３４−５１３８（１９９０）；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０，７７２−７７９（１９９２）；Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．４４，１０３６−１０４７（１９９３））。
【０００６】
ところで、ケモカインは、白血球に対して遊走活性を有する一群のタンパク質であり、炎症の急性期及び慢性期においてその病態の発症、進展、憎悪に関与していることが明らかになっている。中でも、ＭＣＰ−１は、単球に対して強力な走化性及び活性化作用を有することが知られており、免疫活性化作用や抗腫瘍作用等の用途に使用できるものと考えられている。
【０００７】
このように、ＭＣＰ−１についての知見は数多く報告されており、生体内の多種多様な生命現象に関与していることが知られている。しかしながら、ＭＣＰ−１と肥満との関係については、特定の細胞に飽食因子として知られるレプチンを投与したところ、ＭＣＰ−１の発現レベルが上昇したという報告（ＦＡＳＥＢ Ｊ．，１３，１２３１−１２３８（１９９９）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，２５０９６−２５１００（２００１））や、ケモカインによる刺激が間接的に脂肪の蓄積に関与していることを示唆する報告（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．，１７５，８１−９２（２００１））があるに過ぎず、ＭＣＰ−１と肥満との直接的な関係や、ＭＣＰ−１の発現レベルと肥満又は体重変化との相関関係については全く知られていなかった。
【発明の開示】
【０００８】
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、分子レベルで判断可能な肥満又は痩せの検査方法及び当該分子を用いた肥満及び痩せの検査薬を提供することを目的とする。また、肥満又は痩せの治療薬のスクリーニング等、化合物の評価方法、及び当該評価方法により肥満又は痩せの治療薬として有効であると評価された化合物を提供することを目的とする。
【０００９】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、体重変化とＭＣＰ−１の発現量又は血中濃度に一定の相関関係があることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明の肥満又は痩せの検査方法は、ＭＣＰ−１遺伝子の被検組織又は被検細胞における発現レベルを測定することを特徴とする。すなわち、ＭＣＰ−１遺伝子発現レベルに基いて肥満度の検査が可能になる。ここで、前記発現レベルの測定をＤＮＡマイクロアレイにより行うことが好ましい。
【００１１】
また、本発明の肥満又は痩せの検査方法は、ＭＣＰ−１タンパク質の被検組織又は被検細胞における発現レベルを測定することを特徴とする。すなわち、ＭＣＰ−１タンパク質の発現レベルに基いて肥満度の検査が可能になる。
【００１２】
さらに、本発明の肥満又は痩せの検査方法は、ＭＣＰ−１遺伝子の被検組織又は被検細胞における発現レベルの変化を検出することを特徴とする。すなわち、ＭＣＰ−１遺伝子の発現レベルの初期値と所定期間後の発現レベルの測定値とを比較する（例えば、初期値と測定値の差又は比）、肥満度の検査又は予測方法が提供される。ここで、前記発現レベルの測定をＤＮＡマイクロアレイにより行うことが好ましい。
【００１３】
また、本発明の肥満又は痩せの検査方法は、ＭＣＰ−１タンパク質の被検組織又は被検細胞における発現レベルの変化を検出することを特徴とする。すなわち、ＭＣＰ−１タンパク質の発現レベルの初期値と所定期間後の発現レベルの測定値とを比較する（例えば、初期値と測定値の差又は比）、肥満度の検査又は予測方法が提供される。
【００１４】
また、本発明の肥満又は痩せの検査方法は、被検組織又は被検細胞におけるＭＣＰ−１遺伝子に存在する多型を検出することを特徴とする。すなわち、ＭＣＰ−１遺伝子多型に基づいて肥満度の検査又は予測をすることが可能となる。
【００１５】
さらに、本発明の肥満又は痩せの検査方法は、ＭＣＰ−１タンパク質と相互作用することによりＭＣＰ−１遺伝子の発現量に影響を及ぼすタンパク質の発現量又は活性を検出することを特徴とする。すなわち、ＭＣＰ−１遺伝子の発現量に影響を及ぼすタンパク質の発現量又は活性に基づいて肥満度の検査又は予測をすることが可能となる。
【００１６】
また、本発明の肥満又は痩せの検査薬は、ＭＣＰ−１タンパク質に対する抗体を有効成分として含むことを特徴とする。
【００１７】
さらに、本発明の肥満又は痩せの検査キットは、ＭＣＰ−１タンパク質に対する抗体を含むことを特徴とする。前記キットは、好ましくは、前記抗体（１次抗体）を検出するための蛍光物質又はラジオアイソトープで標識された２次抗体、抗原抗体反応を行う際に使用する緩衝液を含む。
【００１８】
また、本発明の肥満又は痩せの治療又は予防に有効な化合物の評価方法は、被検化合物を、被検動物又は被検細胞に、投与又は接触させる工程と、被検化合物が、被検動物又は被検細胞中でＭＣＰ−１遺伝子あるいは当該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現レベルを調節するか否かを確認する工程と、を含むことを特徴とする。
【００１９】
さらに、本発明の肥満又は痩せの治療又は予防に有効な化合物の評価方法は、被検化合物を、被検動物又は被検細胞に、投与又は接触させる工程と、被検化合物が、被検動物又は被検細胞中でＭＣＰ−１タンパク質あるいは当該タンパク質と機能的に等価なタンパク質の発現レベルを調節するか否かを確認する工程、を含むことを特徴とする。
【００２０】
さらに、本発明の肥満又は痩せの治療又は予防に有効な化合物の評価方法は、被検化合物を、ＭＣＰ−１タンパク質に接触させる工程と、被検化合物が、前記タンパク質の活性に影響を与えるか否かを確認する工程と、を含むことを特徴とする。
【００２１】
また、本発明の化合物は、本発明の化合物の評価方法により、肥満又は痩せの治療又は予防に有効であると評価されたことを特徴とする。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
図１は、ＤＩＯマウスと対照群とのＭＣＰ−１の血中濃度を比較したグラフである。
【００２３】
図２は、ＤＩＯマウスと対照群との体重を比較したグラフである。
【００２４】
図３は、ＤＩＯマウスにおける体重とＭＣＰ−１の血中濃度との関係を示すグラフである。
【００２５】
図４は、食事制限の前後におけるモデルマウスの体重を比較したグラフである。
【００２６】
図５は、食事制限の前後におけるモデルマウスの白色脂肪細胞中のＭＣＰ−１の発現量を比較したグラフである。
【００２７】
図６は、食事制限の前後におけるモデルマウスのＭＣＰ−１の血中濃度を比較したグラフである。
【００２８】
図７は、ＤＩＯマウスにおける肥満抑制化合物の投与とＭＣＰ−１の発現量との関係を示すグラフである。
【００２９】
図８は、ＤＩＯマウスにおける肥満抑制化合物の投与とＭＣＰ−１の血中濃度との関係を示すグラフである。
【００３０】
図９は、食事制限の前後における肥満抑制化合物の投与とＭＣＰ−１の血中濃度との関係を示すグラフである。
【００３１】
図１０（Ａ）（Ｂ）（Ｄ）及び（Ｅ）は、いずれも各種細胞におけるＣＤ１１ｂの蛍光強度と細胞数との関係を示すグラフである。また、（Ｃ）及び（Ｆ）は、各種細胞におけるＣＤ１１ｂ陽性細胞数を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
【００３３】
本発明における「発現レベル」とは、ＭＣＰ−１遺伝子の転写産物の絶対量又は相対量をいう。この場合、当該遺伝子は、ＤＮＡ又はｍＲＮＡのいずれをも含む。また、発現の検出対象がタンパク質の場合、その「発現レベル」とは、ＭＣＰ−１遺伝子の翻訳産物の絶対量又は相対量をいう。
【００３４】
本発明における「ＭＣＰ−１タンパク質」は、シグナルペプチドを有する前駆体タンパク質及びシグナルペプチドを有さない成熟タンパク質のいずれも含むが、好適には成熟タンパク質をさす。例えば、ヒトＭＣＰ−１タンパク質は、２３アミノ酸（配列番号１０の１〜２３番目のアミノ酸）からなるシグナルペプチドを有する９９アミノ酸（配列番号１０）からなる前駆体タンパク質及び当該シグナルペプチドを有さない７６アミノ酸（配列番号１０の２４〜９９番目のアミノ酸）からなる成熟タンパク質のいずれであってもよい。また、マウスＭＣＰ−１タンパク質は、２３アミノ酸（配列番号１２の１〜２３番目のアミノ酸）からなるシグナルペプチドを有する１４８アミノ酸（配列番号１２）からなる前駆体タンパク質及び当該シグナルペプチドを有さない１２５アミノ酸（配列番号１２の２４〜１４８番目のアミノ酸）からなる成熟タンパク質のいずれであってもよい。
【００３５】
また、本発明における「被検組織」とは、肥満又は痩せの検査を行う際に生体から抽出可能な組織であれば、その種類は特に限定されないが、肥満又は痩せの影響が反映されやすいとの観点から、例えば、肝臓組織、脂肪組織、筋肉組織、血液組織であることが好ましい。また、組織の単離が容易であるとの観点から、前記組織の中でも血液組織であることが好ましい。ここで、これらの組織の由来となる動物種については特に制限されないが、本発明の主たる用途がヒトの臨床的使用であることから、ヒトであることが好ましい。
【００３６】
また、本発明における「被検細胞」についても、肥満又は痩せの検査を行う際に生体から抽出可能な細胞であれば、その種類は特に限定されないが、肥満又は痩せの影響が反映されやすいとの観点から、例えば、肝細胞、脂肪細胞（白色脂肪細胞、褐色脂肪細胞等）、筋肉細胞（筋芽細胞、骨格筋細胞平滑筋細胞等）、膵細胞（膵島細胞等）、血球細胞であることが好ましい。ここで、かかる組織の由来となる動物種については特に限定されないが、本発明の主たる用途がヒトの臨床的使用であることから、ヒトであることが好ましい。
【００３７】
さらに、本発明における「肥満」とは、脂肪組織が過剰に蓄積した状態と定義される一般的な肥満に加え、これに糖尿病や高血圧等の合併症又は内臓脂肪が伴う、いわゆる「肥満症」も含む。また、本発明における「肥満」は、薬物投与等による体重のコントロールを受けた場合に、もとの体重と比較して相対的に体重が増加した状態をも意味する。
【００３８】
一方、本発明における「痩せ」とは、前記の肥満とは対立する概念を意味するとともに、薬物投与又はダイエット等による体重のコントロールを受けた場合に、もとの体重と比較して相対的に体重が減少した状態をも意味する。
【００３９】
また、本発明における「検査」とは、肥満又は痩せであることを単に判断するのみならず、将来的な肥満又は痩せを「予測」する場合をも含む。
【００４０】
（１）本発明の肥満又は痩せの検査方法
【００４１】
（Ａ）ＭＣＰ−１遺伝子の発現レベルを測定することによる肥満又は痩せの検査方法
【００４２】
前述した被検組織又は被検細胞におけるＭＣＰ−１遺伝子の発現レベルの変化を検出することにより、又は、発現レベルを測定することにより、当該被検組織又は被検細胞を抽出した生体（例えばヒト）が肥満であるか又は痩せであるかを検査・診断することが可能である。また、単に検査時の肥満又は痩せの状態を検査するのみならず、将来的に肥満又は痩せになるか否かを予測することも可能である。
【００４３】
以下に、このような検査の具体的な方法について説明する。
【００４４】
先ず、検査対象となる生体より被検組織又は被検細胞を抽出する。このような抽出の方法としては特に制限はなく、公知の方法により抽出することができる。
【００４５】
次に、抽出された被検組織又は被検細胞から発現レベルの測定の対象となる遺伝子を調製する。
【００４６】
ＭＣＰ−１遺伝子の発現レベルを測定するには、先ず、被検組織又は被検細胞からＭＣＰ−１のＲＮＡ（ｔｏｔａｌ ＲＮＡ又はｍＲＮＡ）を調製する必要がある。このようなＲＮＡの調製は、公知の方法によって行うことができるが、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ２ｎｄ ＥＤＩＴＩＯＮ（１９８９）（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）７．３−７．３６を参照して行うことができる。こうして調製したＲＮＡを用いて、例えば、ＲＴ−ＰＣＲのような遺伝子増幅法、ＤＮＡマイクロアレイ（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製ＤＮＡチップ）を用いる方法、ノーザンハイブリダイゼーション法により、その発現量を測定することができる。また、被検組織又は被検細胞を用いたイン サイチュ ハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）等により、その発現量を測定することもできる。
【００４７】
また、ＭＣＰ−１遺伝子の発現レベルの変化を検出するには、前記の発現量の測定を当該発現量が変化すると予測される期間の前後（例えば、肥満治療薬の投与の前後）について行い、発現量の差を測定すればよい。
【００４８】
具体的には、被検組織又は被検細胞において、前述したＭＣＰ−１遺伝子の発現量が変化すると予測される期間の前後で、その発現レベルが有意に上昇した場合に、体重の増加があった又は将来的に増加する可能性があると診断できる。一方、当該発現レベルが有意に減少した場合に、体重の減少があった又は将来的に減少する可能性があると診断することができる。
【００４９】
（Ｂ）ＭＣＰ−１タンパク質の発現レベルを測定することによる肥満又は痩せの検査方法
【００５０】
被検組織又は被検細胞におけるＭＣＰ−１タンパク質の発現レベルの変化を検出することにより、又は、発現レベルを測定することにより、当該被検組織又は被検細胞を抽出した生体（例えばヒト）が肥満であるか又は痩せであるかを検査・診断することが可能である。また、単に検査時の肥満又は痩せの状態を検査するのみならず、将来的に肥満又は痩せになりうるかを予測することも可能である。
【００５１】
以下、このような検査の具体的な方法について説明する。
【００５２】
タンパク質の発現レベルを測定する方法としては、生体から単離したタンパク質を定量する方法やタンパク質の血中濃度を測定する方法があり、具体的な方法としては特に限定されない。
【００５３】
生体から単離したタンパク質を定量する方法の具体例としては、以下のとおりである。先ず、被検組織又は被検細胞からＭＣＰ−１タンパク質を調製する。このようなタンパク質の調製は、公知の方法によって行うことができるが、例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，１８５０−１８５４（１９８９）に記載の方法により、行うことができる。こうして調製したタンパク質から、例えば、プロテインチップ（例えば、ＣＩＰＨＥＲＧＥＮ社製プロテインチップシステム）を用いる方法、免疫学的方法（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ法、ウエスタンブロッティング法）により、その発現量を測定することができる。また、被検組織又は被検細胞を用いた免疫染色等によって、その発現量を測定することもでできる。一方、タンパク質の血中濃度を測定する方法の具体例としては、生体から採取した血液を用いて、上記免疫学的方法等により、ＭＣＰ−１タンパク質を定量する方法が挙げられる。
【００５４】
以上のようにして、ＭＣＰ−１の遺伝子又はタンパク質の発現レベルを測定した後、その結果を解析することにより、被検体の肥満又は痩せを検査できる。すなわち、本発明より、ＭＣＰ−１タンパク質の発現レベルと体重は一定の相関関係を有することが明らかになったため、上記検査結果と対照群（健常人等）におけるＭＣＰ−１タンパク質の発現量とを比較することにより、肥満又は痩せの程度を判断することが可能となる。また、本発明の検査方法によれば、単に検査時の肥満又は痩せの状態を検査するのみならず、将来的な肥満又は痩せの可能性の予測も可能となる。これは、ＭＣＰ−１タンパク質の血中濃度が体重の増減に先だって増減する傾向が見られることによるものであり、特にＭＣＰ−１タンパク質の血中濃度の減少と体重の減少との関係において、この傾向が強いことが本発明者らによって見出されている。
【００５５】
また、ＭＣＰ−１タンパク質の発現レベルの変化を検出するには、前記の発現量の測定を当該発現量が変化すると予測される期間の前後（例えば、肥満治療薬の投与の前後）について行い、発現量の差を測定すればよい。
【００５６】
具体的には、被検組織又は被検細胞において、前述したＭＣＰ−１タンパク質の発現量が変化すると予測される期間の前後で、その発現レベルが有意に上昇した場合に体重の増加があった又は将来的に増加する可能性があると診断できる。一方、当該発現レベルが有意に減少した場合に体重の減少があった又は将来的に減少する可能性があると診断することができる。
【００５７】
（Ｃ）ＭＣＰ−１遺伝子の遺伝的多型を検出する肥満又は痩せの検査方法
【００５８】
ＭＣＰ−１遺伝子に遺伝的多型が存在する場合、その多型の有無や種類によりＭＣＰ−１遺伝子又はタンパク質の発現レベルが変化したり、当該タンパク質の活性に異常が生じる場合がある。従って、このような遺伝的多型を検出することによりＭＣＰ−１の発現や活性に関する知見を得、さらに、被検組織や被検細胞の由来となった被検体の肥満又は痩せの検査を行うことができる。このような遺伝的多型としては、具体的には、例えば、ミニサテライト、マイクロサテライト、ＳＮＰ（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：一塩基多型）が挙げられる。
【００５９】
ＭＣＰ−１遺伝子における多型の検出は以下のようにして行うことができる。すなわち、ＭＣＰ−１遺伝子において、その発現量を制御する領域を検査対象となる肥満又は痩せの被検体を対象として塩基配列を決定し、多型部位を検出する。検出された多型部位の対立遺伝子頻度を算出し、被検体集団において有意に増加又は減少している対立遺伝子を見出すことにより肥満又は痩せと相関する多型を同定する。このようにして検出された遺伝的多型は、例えば、被検体由来のゲノムＤＮＡについて、多型部位の塩基配列の解析、多型部位に存在する塩基の種類に依存して変化するＤＮＡの物理化学的性質の差や制限酵素部位の相違を利用する方法、当該多型部位の検出に適当な検出用プローブを利用する方法及び質量分析法を利用した方法等によって臨床的に検出可能である。
【００６０】
（Ｄ）ＭＣＰ−１タンパク質と相互作用することによりＭＣＰ−１遺伝子の発現量に影響を及ぼすタンパク質の発現量又は活性を検出することによる肥満又は痩せの検査方法
【００６１】
生体内において、多くのタンパク質は他のタンパク質と相互作用することにより、所定の生理機能を発揮する。例えば、ＭＣＰ−１タンパク質は、血管内皮細胞や平滑筋細胞等で産生され、その受容体であるＣＣＲ２を介して単球、リンパ球、好塩基球等の走化を促すことが知られている。従って、ＭＣＰ−１タンパク質と、当該ＭＣＰ−１タンパク質と相互作用することによりＭＣＰ−１遺伝子の発現量に影響を及ぼすタンパク質の発現量やその活性とは一定の相関関係を有し、いずれか一方の挙動を検出することにより、他方の挙動を推測できる関係にある。
【００６２】
ここで、「相互作用」とは、ＭＣＰ−１タンパク質と別のタンパク質が直接的又は間接的に作用することをいい、例えば、ＭＣＰ−１タンパク質が別のタンパク質と物理的に接触することによりアミノ酸の修飾等を生じるような作用や、第３のタンパク質を介して相互作用し、間接的にＭＣＰ−１タンパク質の発現に影響を及ぼすような作用が挙げられる。このようなタンパク質としては、例えば、ＭＣＰ−１タンパク質を介するシグナル伝達において、ＭＣＰ−１タンパク質の上流又は下流で生理的機能を発揮するタンパク質が挙げられ、より具体的には、例えば、ＭＣＰ−１タンパク質の受容体であるＣＣＲ２や、ＣＣＲ２の下流に位置するシグナル伝達分子が挙げられる。また、ＭＣＰ−１タンパク質の上流又は下流に位置するタンパク質の発現量又は活性を検出する方法としては、対象となるタンパク質の種類に応じて好適な手段を適宜選択すればよく、具体的な手段としては特に限定されない。
【００６３】
以上の（Ａ）〜（Ｄ）で説明したような本発明の肥満又は痩せの検査方法によって、分子レベルで肥満又は痩せの診断が可能となるばかりか、将来的に肥満又は痩せになる可能性についても予測できることとなり、従来の診断方法と比較して、より的確な診断が可能となる。
【００６４】
（２）肥満又は痩せの検査薬、検査キット
【００６５】
ＭＣＰ−１タンパク質の発現量は、肥満又は痩せに基づく体重変化と相関関係を有する。従って、当該タンパク質に対する抗体を使用して被検細胞や被検組織中のタンパク質量を検出、測定することにより、肥満又は痩せの検査を簡便に行うことができる。ここで、「抗体」とは、抗原であるＭＣＰ−１遺伝子産物に結合しうる抗体分子全体又はその断片をいう。このような抗体は、公知の方法によって製造することができ、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のいずれであってもよい。また、当該抗体を用いた免疫学的測定法としては、公知の方法を使用すればよく、具体的には、例えば、蛍光抗体法、酵素抗体法が挙げられる。
【００６６】
また、このような抗体を含んだキットを製造し、本発明を実施することも可能である。キットの構成としては、当該抗体に加え、例えば、抗体を検出するために蛍光標識やラジオアイソトープで標識された２次抗体や抗原抗体反応を行う際に使用する緩衝液を備えていてもよい。
【００６７】
このような肥満又は痩せの検査薬を使用することにより、分子レベルで肥満又は痩せの診断が可能となるばかりか、将来的に肥満又は痩せになる可能性についても予測できることとなり、従来の診断方法と比較して、より的確な診断が可能となる。また、本発明の肥満又は痩せの検査キットを使用することにより、前述したような的確な診断を非常に簡便に実施することが可能となる。
【００６８】
（３）本発明の肥満又は痩せの治療又は予防に有効な化合物の評価方法
【００６９】
被検化合物を被検動物や被検細胞に投与、接触させることにより変動するＭＣＰ−１遺伝子又はＭＣＰ−１タンパク質の発現量を測定したり、被検化合物をＭＣＰ−１タンパク質に接触させて当該タンパク質の活性に及ぼす影響を検討することにより、当該被検化合物の評価を行うことが可能となる。
【００７０】
すなわち、このような被検化合物の中には、細胞や組織に作用することにより、ＭＣＰ−１遺伝子又はＭＣＰ−１タンパク質の発現レベルやＭＣＰ−１タンパク質の活性を正常化あるいはコントロールし、脂肪の蓄積や食欲のコントロール等、肥満や痩せの原因となるメカニズムの正常化を図ることができるものがあると考えられる。従って、以下に説明するような評価方法により、肥満又は痩せの治療薬又は予防に有効な化合物を評価することが可能となる。ここで、「評価」とは、化合物のスクリーニングのみならず、バリデーションをも含む概念を指す。
【００７１】
また、本発明者らは、ＭＣＰ−１を投与してその血中濃度を高めることにより単球の活性化、すなわちＣＤ１１ｂ ｐｏｓｉｔｉｖｅ単球の増加が促進されることを見出している。従来は、血管の炎症部分等からＭＣＰ−１が血管内に分泌され、その結果、単球の活性化が促進されていると考えられていた。しかし、これに加え、血管外部からのＭＣＰ−１によっても単球の活性化が認められる。単球の走化は単球の活性化によって促進され、また、単球の走化に続くマクロファージの産生により動脈硬化が生じることから、肥満によるＭＣＰ−１の増加が動脈硬化の一因となる。
【００７２】
本発明の化合物の評価方法により、ＭＣＰ−１遺伝子又はＭＣＰ−１タンパク質の発現レベル又はＭＣＰ−１タンパク質の活性を指標として肥満又は痩せの治療又は予防に有効な化合物を評価することが可能になるとともに、肥満を介した動脈硬化についても、その治療又は予防に有効な化合物の評価を行うことが可能となる。
【００７３】
（Ａ）ＭＣＰ−１遺伝子の発現レベル調節能を指標とする評価方法
【００７４】
被検化合物を被検動物又は被検細胞に投与又は接触させ、当該被検化合物が被検動物又は被検細胞中でＭＣＰ−１遺伝子あるいは当該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現レベルを調節するか否かを確認することにより、肥満又は痩せの治療又は予防に有効な化合物を評価することが可能となる。
【００７５】
具体的には、以下の手順で被検化合物の評価を行う。
【００７６】
先ず、被検化合物を被検動物又は被検細胞に投与又は接触させる。ここで、被検化合物としては、肥満又は痩せの治療又は予防薬の候補化合物であれば、その構造や性質は問わず、化合物種も限定されない。また、被検動物としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、サルが挙げられる。
【００７７】
被検化合物を被検動物に投与する方法としては特に制限はなく、具体的には、例えば、経口投与、非経口投与（例えば、経皮投与、筋肉内注射、静脈内注射、皮下注射）が挙げられる。また、被検化合物を被検細胞に接触させる方法としても特に制限はなく、具体的には、例えば、緩衝液（リン酸緩衝液等）等の溶液中で混合し接触する方法が挙げられる。
【００７８】
次に、被検化合物が被検動物又は被検細胞中でＭＣＰ−１遺伝子あるいは当該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現レベルを調節するか否かを確認する。
【００７９】
前記遺伝子の発現レベルの調節の有無の確認法としては、特に制限はなく、前述の投与又は接触の前を対照とし、当該遺伝子の発現量の変化をＲＴ−ＰＣＲのような遺伝子増幅法、ＤＮＡマイクロアレイを用いる方法又はノーザンハイブリダイゼーション法等によって検出することにより実施することができる。また、前記遺伝子の発現調節領域とレポーター遺伝子との融合遺伝子を人為的に導入した動物又は細胞を用いてもよい。この場合、レポーター遺伝子としては、具体的には、例えば、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子又はグリーンフルオレッセンスプロテイン遺伝子が挙げられる。
【００８０】
ここで、「ＭＣＰ−１遺伝子と機能的に等価な遺伝子」とは、ＭＣＰ−１遺伝子と塩基配列は異なるものの、比較的高い相同性を示し、ＭＣＰ−１と同じ又は類似の活性を有する遺伝子を示す。ここで、前記相同性は、機能的に等価であれば特に制限はないが、塩基配列の相同性が７０〜１００％であることが好ましく、８０〜１００％であることがより好ましく、９０〜１００％であることが特に好ましい。相同性が前記下限より低い場合には、ＭＣＰ−１と同じ又は類似の機能を示さない可能性が高い傾向にある。しかしながら、塩基配列の相同性が前記下限未満であっても、ＭＣＰ−１に特有の機能を有するドメインと、当該ドメインに対応する塩基配列との相同性が高い場合にはＭＣＰ−１遺伝子と同様又は類似の機能を有する場合がある。このような遺伝子は、塩基配列の相同性が前記範囲外であっても好適に使用可能である。また、比較的相同性の高い遺伝子とは、ＭＣＰ−１遺伝子における１又は２以上の塩基が自然若しくは人工的に置換、欠失、付加及び／又は挿入した遺伝子であってもよい。
【００８１】
被検化合物を投与又は接触させない場合に比べて、被検化合物を投与又は接触させた場合のＭＣＰ−１遺伝子又はＭＣＰ−１遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現レベルが５％以上、好ましくは１０％以上、より好ましくは２０％以上低下した場合、当該被検化合物は肥満の治療又は予防に有効な化合物と評価できる。他方、被検化合物を投与又は接触させない場合に比べて、被検化合物を投与又は接触させた場合のＭＣＰ−１遺伝子又はＭＣＰ−１遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現レベルが５％以上、好ましくは１０％以上、より好ましくは２０％以上上昇した場合、当該被検化合物は痩せの治療又は予防に有効な化合物と評価できる。
【００８２】
（Ｂ）ＭＣＰ−１タンパク質の発現レベル調節能を指標とする評価方法
【００８３】
被検化合物を被検動物又は被検細胞に投与又は接触させ、当該被検化合物が被検動物又は被検細胞中でＭＣＰ−１タンパク質あるいは当該タンパク質と機能的に等価なタンパク質の発現レベルを調節するか否かを確認することにより、肥満又は痩せの治療又は予防に有効な化合物を評価することが可能となる。
【００８４】
被検化合物を被検動物又は被検細胞に投与又は接触させる方法等については、上記の（Ａ）ＭＣＰ−１遺伝子の発現レベル調節能を指標とする評価方法に記載の方法等と同様である。
【００８５】
前記タンパク質の発現レベルの調節の有無の確認法としては、特に制限はなく、前述の投与又は接触の前を対照とし、当該タンパク質の発現量の変化を、例えば、プロテインチップ（例えば、ＣＩＰＨＥＲＧＥＮ社製プロテインチップシステム）を用いる方法、免疫学的方法（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ法、ウエスタンブロッティング法）等によって検出することにより実施することができる。前記タンパク質の発現レベル調節の有無の確認は、ＭＣＰ−１タンパク質の血中濃度の測定により行うことが好ましい。
【００８６】
ここで、「ＭＣＰ−１タンパク質と機能的に等価なタンパク質」とは、ＭＣＰ−１タンパク質とアミノ酸配列は異なるものの、比較的高い相同性を示し、ＭＣＰ−１タンパク質と同じ又は類似の活性を有するタンパク質を示す。ここで、前記相同性は、機能的に等価であれば特に制限はないが、アミノ酸配列の相同性が５０〜１００％であることが好ましく、６０〜１００％であることがより好ましく、７０〜１００％であることが特に好ましい。相同性が前記下限より低い場合には、ＭＣＰ−１タンパク質と同じ又は類似の機能を示さない可能性が高い傾向にある。しかしながら、タンパク質のアミノ酸配列の相同性が前記下限未満であっても、ＭＣＰ−１タンパク質に特有の機能を有するドメインのアミノ酸配列と、前記タンパク質の当該ドメインに対応するアミノ酸配列との相同性が高い場合には、前記タンパク質はＭＣＰ−１タンパク質と同様又は類似の機能を有する場合がある。このようなタンパク質は、アミノ酸配列の相同性が前記範囲外であっても好適に使用可能である。また、比較的相同性の高いタンパク質とは、ＭＣＰ−１タンパク質における１又は２以上のアミノ酸残基が自然若しくは人工的に置換、欠失、付加及び／又は挿入したタンパク質であってもよい。
【００８７】
被検化合物を投与又は接触させない場合に比べて、被検化合物を投与又は接触させた場合のＭＣＰ−１タンパク質又はＭＣＰ−１タンパク質と機能的に等価なタンパク質の発現レベルが５％以上、好ましくは１０％以上、より好ましくは２０％以上低下した場合、当該被検化合物は肥満の治療又は予防に有効な化合物と評価できる。他方、被検化合物を投与又は接触させない場合に比べて、被検化合物を投与又は接触させた場合のＭＣＰ−１タンパク質又はＭＣＰ−１タンパク質と機能的に等価なタンパク質の発現レベルが５％以上、好ましくは１０％以上、より好ましくは２０％以上上昇した場合、当該被検化合物は痩せの治療又は予防に有効な化合物と評価できる。
【００８８】
（Ｃ）ＭＣＰ−１タンパク質の活性を指標とする評価方法
【００８９】
被検化合物をＭＣＰ−１タンパク質に接触させ、被検化合物が当該タンパク質の活性に影響を与えるか否かを確認することにより、肥満又は痩せの治療又は予防に有効な化合物を評価することが可能となる。
【００９０】
具体的には、以下の手順で被検化合物の評価を行う。
【００９１】
先ず、被検化合物をＭＣＰ−１タンパク質に接触させる。
【００９２】
このようなタンパク質と被検化合物を接触させる方法は、特に制限はなく、具体的には、例えば、緩衝液（リン酸緩衝液等）等の溶液中で混合し接触させる方法が挙げられる。
【００９３】
次に、被検化合物が当該タンパク質の活性に影響を与えるか否かを確認する。タンパク質の活性測定における条件は、使用するタンパク質の性質により適宜設定すればよい。このような条件としては、具体的には、例えば、ＭＣＰ−１タンパク質の場合には、単球走化性を指標とすることができ、例えば、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０，７７２−７７９（１９９２）；Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．４４，１０３６−１０４７（１９９３）（非特許文献４）を参照して行うことができる。
【００９４】
被検化合物をＭＣＰ−１タンパク質に接触させない場合に比べて、被検化合物をＭＣＰ−１タンパク質に接触させた場合のＭＣＰ−１タンパク質の活性が５％以上、好ましくは１０％以上、より好ましくは２０％以上低下した場合、当該被検化合物は肥満の治療又は予防に有効な化合物と評価できる。他方、被検化合物をＭＣＰ−１タンパク質に接触させない場合に比べて、被検化合物をＭＣＰ−１タンパク質に接触させた場合のＭＣＰ−１タンパク質の活性が５％以上、好ましくは１０％以上、より好ましくは２０％以上上昇した場合、当該被検化合物は痩せの治療又は予防に有効な化合物と評価できる。
【００９５】
以上説明したような本発明の肥満又は痩せの治療又は予防に有効な化合物の評価方法により、肥満又は痩せの治療薬や診断薬のスクリーニングや、これらの薬剤の有効性又は安全性の評価、さらには、オーダーメイド治療における適切な薬剤の選択が可能となる。
【００９６】
（４）本発明の肥満又は痩せの治療又は予防に有効な化合物
【００９７】
ＭＣＰ−１が肥満及び体重変化に関与していることが解明されたので、上記の評価方法により有効であると評価された化合物は、肥満又は痩せの治療又は予防剤として極めて有用である。
【実施例】
【００９８】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００９９】
（肥満モデル動物の作製）
【０１００】
製造例１
（ニューロペプチドＹ（Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｙ：ＮＰＹ）Ｙ５アゴニストｉ．ｃ．ｖ．投与マウス）
【０１０１】
ＮＰＹ Ｙ５アゴニストを投与することにより肥満を呈するモデルマウスを以下の要領で作製した。
【０１０２】
９〜１２週齢の雄マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ：クレア社製）は、室温２３±２℃、湿度５５±１５％の条件下、１プラスチックゲージに１匹ずつ飼育した。また、飼育時の明暗のサイクルは１２時間とし、午前７時に点灯し、午後７時に消灯した。また、マウスは、飼料（ＣＥ−２（タンパク質：２５．４重量％、炭水化物：５０．３重量％、脂質：４．４重量％）：クレア社製）と水は自由に摂取させた。
【０１０３】
マウスは、８０ｍｇ／ｋｇペントバルビタールナトリウム（ダイナボット社製）で麻酔をかけ、滅菌された２８ゲージの脳注入カニューレ（アルゼ（Ａｌｚｅｔ）社製）を右側脳質へ定位的に移植した。カニューレはブレグマより後方へ０．４ｍｍ、側方へ０．８ｍｍ、深さ２ｍｍの位置に、頭蓋骨に対し垂直に固定した。カニューレは歯科用セメントで頭蓋骨に固定した。カニューレは、０．０５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む１０ｍＭのリン酸緩衝液で満たした浸透圧ポンプ（モデルナンバー２００２：アルゼ社製）にポリビニルクロライドチューブで接続した。１０ｍＭ ＰＢＳ（０．０５％ＢＳＡ含む）にＤ−Ｔｒｙ３４ＮＰＹ（５マイクログラム／日になるように調製）を溶解した溶液をポンプに満たした後、マウスの背中の皮下に埋め込み、抗生物質（５０ｍｇ／ｋｇのセファメジン（Ｃｅｆａｍｅｄｉｎｅ）：藤沢薬品社製）を皮下注射した。
【０１０４】
これらのマウスを平均体重を一致させた３つのグループ（溶媒のみを注入したグループ（ｖｅｈｉｃｌｅ ｇｒｏｕｐ）、Ｄ−Ｔｒｙ３４ＮＰＹ（ＮＰＹ Ｙ５アゴニスト）を注入したグループ（ａｄ ｌｉｂ ｆｅｄ ｇｒｏｕｐ）、Ｄ−Ｔｒｙ３４ＮＰＹを注入しペアフィードとしたグループ（ｐａｉｒ−ｆｅｄ ｇｒｏｕｐ））に分けた。
【０１０５】
製造例２
（ＤＩＯ（Ｄｉｅｔ ｉｎｄｕｃｅｄ ｏｂｅｓｉｔｙ）マウス）
【０１０６】
１８週齢のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ：クレア社製）は、室温２３±２℃、湿度５５±１５％の条件下、１プラスチックゲージに１匹ずつ飼育した。このマウスに高カロリー食であるＭＨＦ（タンパク質：１８．２重量％、炭水化物：５５．６重量％、脂質：１５．５重量％）を６ヶ月間に渡って与え、肥満を呈するモデルマウス（ＤＩＯマウス）を作製した。なお、実施例中、「ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ＭＦＤ」は、これ以上体重が増えないようになるまでＭＨＦを与えて飼育したマウスを指す。
【０１０７】
また、前記のマウスにＭＨＦよりさらに高い脂肪を含有する高カロリー食であるＨＦＤ（タンパク質：２０．８重量％、炭水化物：３８．５９重量％、脂質：３２．８８重量％）を与えたＤＩＯマウス（ＨＦＤ）も作製した。
【０１０８】
製造例３
（食事制限をしたマウス）
【０１０９】
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ、１７週齢）は１ケージに１匹ずつ個別に飼育した。また、エサは普通食（ＣＡ−１、ＣＬＥＡ）を与えた。
【０１１０】
摂食制限は、以下のようなスケジュールで行った。すなわち、エサ（ＣＡ−１）を１日につき３時間（１０：００〜１３：００）だけ与え、水は自由に摂取できるようにした。摂食時間の前後で餌の重量を測定し、その差を摂食量とした。また、摂食制限をしている期間は、体重、外見の観察等をモニターした。なお、条件付けに失敗したと思われるマウス（短期間に極度な体重減少（例えば２０％程度の減少）が見られるマウス）は実験には使用しなかった。かかる条件下でマウスを７日間飼育した後、白色脂肪細胞を摘出した。
【０１１１】
実施例１〜３及び比較例１
（白色脂肪細胞におけるＭＣＰ−１の発現）
【０１１２】
ＭＣＰ−１の発現量の定量的な解析は、マウス白色脂肪細胞からＲＴ−ＰＣＲによって得たｃＤＮＡを用い、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法により行った。標準曲線はマウスＭＣＰ−１ ｃＤＮＡ（アクセッションナンバー：ＮＭ０１１３３３）断片を用いて作成し、β−ａｃｔｉｎの発現量に基づいて標準化した。以下に、使用したプライマーの塩基配列を示す。
マウスＭＣＰ−１ｃＤＮＡ断片作製用プライマー
【０１１３】
非処理のＣ５７ＢＬ／６Ｎの白色脂肪細胞におけるＭＣＰ−１及びレプチンの発現量を１とした場合の、ＤＩＯマウス（ＤＩＯ）、Ｄ−Ｔｒｙ３４ＮＰＹ投与マウス（Ｙ５ ａｇｏｎｉｓｔ ＦＦ）、Ｄ−Ｔｒｙ３４ＮＰＹ ｐａｉｒ ｆｅｅｄｉｎｇ投与群マウス（Ｙ５ ａｇｏｎｉｓｔ ＰＦ）及び食事制限をしたマウス（Ｆａｓｔｉｎｇ）におけるこれらの遺伝子の発現量を表１に示す。表１より明らかなように、肥満モデルマウスではＭＣＰ−１の発現量が増加し、食事制限をしたマウスでは、その発現量が低下していた。従って、ＭＣＰ−１の発現量と体重とが相関関係を有していることが明らかとなった。
【０１１４】
【実施例４】
【０１１５】
（肥満モデルマウスにおけるＭＣＰ−１の血中濃度）
【０１１６】
ＤＩＯマウスにおけるＭＣＰ−１の血中濃度の測定を行い、肥満とＭＣＰ−１濃度との関係を検討した。各マウスにおけるＭＣＰ−１の血中濃度の測定は、以下のようにして行った。
【０１１７】
８週齢からＭＨＦを与えて飼育したＤＩＯマウス５５匹について、１５週齢のときに尾静脈より採血を行った。この血漿成分を用いて、ＭＣＰ−１の血中濃度を測定した。具体的には、先ず、マウス尾静脈よりヘパリン採血を行い、遠心操作により血漿成分を採取した。次に、５０マイクロリットルの血漿を抗体固相化プレート中、室温で２時間静置して反応させた。このプレートを緩衝液で洗浄後、酵素標識された抗マウスＭＣＰ−１抗体を加え、室温でさらに２時間静置して反応させた。再びこのプレートを緩衝液で洗浄した後、酵素基質溶液を加え、遮光下、室温で３０分間静置して反応させた。この反応を塩酸で停止させた後、吸光度を測定した。標準曲線用のＭＣＰ−１溶液の吸光度より標準曲線を作製し、血漿中のＭＣＰ−１の濃度を求めた（ＥＩＡサンドイッチ法（Ｒ＆Ｄシステム社製））。
【０１１８】
図１に示すとおり、ＤＩＯマウスでは対照群（Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ）と比較してＭＣＰ−１の血中濃度が著しく上昇していることが分かった。なお、ここで使用したＤＩＯマウスと対照群との体重差を図２に示す。
【０１１９】
また、ＤＩＯマウスにおける体重とＭＣＰ−１の血中濃度との関係を図３に示す。図３から明らかなように、肥満モデルマウスにおいて、ＭＣＰ−１の血中濃度と体重とは一定の相関関係を有することが見出された。
【実施例５】
【０１２０】
（食事制限モデルマウスの白色脂肪細胞におけるＭＣＰ−１の発現）
【０１２１】
製造例３で作製した食事制限モデルマウスを用い、ＭＣＰ−１の発現量を測定した。ここで、ＭＣＰ−１の発現量の測定は、実施例１と同様に実施した。
【０１２２】
図４にモデルマウスの食事制限の前後における体重変化を示す。なお、図４中、縦軸は、食事制限前の体重に対する食事制限後の体重を％で示す。
【０１２３】
また、図５にモデルマウスの食事制限の前後におけるＭＣＰ−１の発現量を示す。図５から明らかなように、食事制限によりＭＣＰ−１の発現量が著しく低下した。なお、図５中、縦軸は食事制限前のＭＣＰ−１の発現量を１とした場合のＭＣＰ−１の発現量を示す。
【０１２４】
以上より、体重の減少とＭＣＰ−１の発現量との間には密接な相関関係があることが明らかとなった。
【実施例６】
【０１２５】
（食事制限モデルマウスにおけるＭＣＰ−１の血中濃度）
【０１２６】
製造例３で作製した食事制限モデルマウスを用い、ＭＣＰ−１の血中濃度の測定を行った。また、ＭＣＰ−１の血中濃度は実施例４と同様にして測定した。
【０１２７】
図６から明らかなように、食事制限の前後でＭＣＰ−１の血中濃度は著しく減少した。このことから、体重の減少と血中のＭＣＰ−１濃度との間には密接な相関関係があることが明らかとなった。
【実施例７〜９】
【０１２８】
（肥満抑制作用を有する化合物投与によるＭＣＰ−１の発現量及び血中濃度の変動）
【０１２９】
ＤＩＯマウス（ＨＦＤ）にＷＯ０１／１４３７６号公報記載の肥満抑制作用を有する化合物（化合物１）を投与した後、当該マウスの白色脂肪細胞におけるＭＣＰ−１の発現量を測定した。図７に示すとおり、ＤＩＯ（ＨＦＤ）マウスではＭＣＰ−１の発現は著しく上昇したが、肥満抑制作用を有する化合物を投与した場合には、その発現は有意に減少した（実施例７）。なお、図７中、ＲＤは普通食を与えたマウス（Ｒｅｇｕｌａｒ ｄｉｅｔ）を示し、縦軸はｍＲＮＡの発現量をβ−ａｃｔｉｎの発現量で補正した値を示す。
【０１３０】
また、ＤＩＯマウスにＷＯ０１／１４３７６号公報記載の肥満抑制作用を有する化合物（化合物１）を投与した後、ＭＣＰ−１の血中濃度を測定した。図８に示すとおり、ＤＩＯ（ＭＨＦ）マウスではＭＣＰ−１の血中濃度は著しく上昇したが、肥満抑制作用を有する化合物を投与した場合には、その血中濃度は有意に減少した（実施例８）。
【０１３１】
さらに、ＤＩＯマウスに前記化合物を投与後、４日目に採血してＭＣＰ−１の血中濃度を測定し、この血中濃度を体重で標準化した。図９より明らかなように、４日目では体重は減少していないにもかかわらず、ＭＣＰ−１の血中濃度は低下した。これは、体重が減少するのに先だってＭＣＰ−１の血中濃度の低下が生じていることを示す（実施例９）。なお、前記化合物投与４日目においては、ＭＣＰ−１遺伝子の発現は減少したが、レプチン遺伝子の発現には変化はなかった。このことより、ＭＣＰ−１は、レプチンよりも先に体重変化に反応することが明らかとなった。
【実施例１０】
【０１３２】
（フローサイトメトリーによるＣＤ１１ｂの発現解析）
【０１３３】
マクロファージの表面抗原であるＣＤ１１ｂの数、すなわち、血中単球がＭＣＰ−１の投与によりどのように変動するかを調べるため、フローサイトメトリーによる解析を行った。
【０１３４】
先ず、ＭＣＰ−１をマウスの皮下に１０ｎｇ／０．５マイクロリットル／時間の割合でオスモティックポンプを用いて２週間に渡って注入した。次に、コントロールマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）、ＤＩＯマウス及びＭＣＰ−１処理したマウスそれぞれの尾静脈から、ヘパリン処理したキャピラリーを用いて血液を採取した。血球細胞は３００×ｇで５分間遠心分離して採取した後、室温で１５分間、ＦＩＴＣラベルした抗マウスＣＤ１１ｂ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）とインキュベートした。また、非特異的結合のコントロールとして、前記の試料はＩｇＧ２ｂアイソタイプともインキュベートした。これらの細胞をＰＢＳで洗浄した後、赤血球を、溶解バッファーを用いて、室温で５分間、溶解した。細胞をＰＢＳで洗浄した後、０．５％ホルムアルデヒド入りのＰＢＳに懸濁した。この懸濁液から単球を同定するため、ＥＰＩＣＳ Ｅｌｉｔｅ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を用いてフローサイトメトリーを行った。ここで、フローサイトメトリーによる解析は、全血球細胞中の単球／マクロファージの集合を決定することにより行った。また、フローサイトメトリーは、蛍光と散乱光を指標にし、各試料につき４０，０００個の細胞を解析した。
【０１３５】
フローサイトメトリーの結果を図１０（ａ）〜（ｆ）に示す。ここで、図１０（ａ）はコントロールマウス由来の血球細胞の結果を示し、図１０（ｂ）はＤＩＯマウス由来の血球細胞の結果を示す。また、図１０（ｃ）はコントロールマウス及びＤＩＯマウスにおけるＣＤ１１ｂ陽性の単球数を示す。一方、図１０（ｄ）はｓａｌｉｎｅ投与したコントロールマウス由来の血球細胞の結果を示し、図１０（ｅ）はＭＣＰ−１投与したマウス由来の血球細胞の結果を示す。また、図１０（ｆ）はｓａｌｉｎｅ投与コントロールマウス及びＭＣＰ−１投与マウスにおけるＣＤ１１ｂ陽性の血球数を示す。図１０（ａ）〜（ｆ）より、ＤＩＯマウス及び体外からＭＣＰ−１を投与したマウスにおいてＣＤ１１ｂ陽性の血球数すなわちマクロファージ数の増加が確認できた。ここで、ＣＤ１１ｂ ｐｏｓｉｔｉｖｅ単球の増加は、単球の動脈硬化巣への走化を促進していると考えられる。すなわち、血管内皮から分泌されたＭＣＰ−１のみならず、体外から投与したＭＣＰ−１によっても単球の走化が起きることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【０１３６】
本発明の検査方法によれば、分子レベルで肥満又は痩せの検査・予測が可能となり、従来の診断方法と比較してより的確な診断が可能となる。また、本発明の化合物の評価方法によれば、肥満又は痩せの治療薬や診断薬のスクリーニング等、各種評価が可能となる。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＣＰ−１遺伝子の被検組織又は被検細胞における発現レベルを測定することを特徴とする肥満又は痩せの検査方法。
【請求項２】
ＭＣＰ−１タンパク質の被検組織又は被検細胞における発現レベルを測定することを特徴とする肥満又は痩せの検査方法。
【請求項３】
ＭＣＰ−１遺伝子の被検組織又は被検細胞における発現レベルの変化を検出することを特徴とする肥満又は痩せの検査方法。
【請求項４】
ＭＣＰ−１タンパク質の被検組織又は被検細胞における発現レベルの変化を検出することを特徴とする肥満又は痩せの検査方法。
【請求項５】
被検組織又は被検細胞におけるＭＣＰ−１遺伝子に存在する多型を検出することを特徴とする肥満又は痩せの検査方法。
【請求項６】
ＭＣＰ−１タンパク質と相互作用することによりＭＣＰ−１遺伝子の発現量に影響を及ぼすタンパク質の発現量又は活性を検出することを特徴とする肥満又は痩せの検査方法。
【請求項７】
ＭＣＰ−１タンパク質に対する抗体を有効成分として含むことを特徴とする肥満又は痩せの検査薬。
【請求項８】
ＭＣＰ−１タンパク質に対する抗体を含むことを特徴とする肥満又は痩せの検査キット。
【請求項９】
被検化合物を、被検動物又は被検細胞に、投与又は接触させる工程と、被検化合物が、被検動物又は被検細胞中でＭＣＰ−１遺伝子あるいは該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現レベルを調節するか否かを確認する工程、を含むことを特徴とする肥満又は痩せの治療又は予防に有効な化合物の評価方法。
【請求項１０】
被検化合物を、被検動物又は被検細胞に、投与又は接触させる工程と、被検化合物が、被検動物又は被検細胞中でＭＣＰ−１タンパク質あるいは該タンパク質と機能的に等価なタンパク質の発現レベルを調節するか否かを確認する工程、を含むことを特徴とする肥満又は痩せの治療又は予防に有効な化合物の評価方法。
【請求項１１】
被検化合物を、ＭＣＰ−１タンパク質に接触させる工程と、被検化合物が、前記タンパク質の活性に影響を与えるか否かを確認する工程、を含むことを特徴とする肥満又は痩せの治療又は予防に有効な化合物の評価方法。
【請求項１２】
請求項９〜１１のいずれか一項に記載の評価方法により、肥満又は痩せの治療又は予防に有効であると評価された化合物。
【請求項１】
ＭＣＰ−１遺伝子の被検組織又は被検細胞における発現レベルを測定することを特徴とする肥満又は痩せの検査方法。
【請求項２】
ＭＣＰ−１タンパク質の被検組織又は被検細胞における発現レベルを測定することを特徴とする肥満又は痩せの検査方法。
【請求項３】
ＭＣＰ−１遺伝子の被検組織又は被検細胞における発現レベルの変化を検出することを特徴とする肥満又は痩せの検査方法。
【請求項４】
ＭＣＰ−１タンパク質の被検組織又は被検細胞における発現レベルの変化を検出することを特徴とする肥満又は痩せの検査方法。
【請求項５】
被検組織又は被検細胞におけるＭＣＰ−１遺伝子に存在する多型を検出することを特徴とする肥満又は痩せの検査方法。
【請求項６】
ＭＣＰ−１タンパク質と相互作用することによりＭＣＰ−１遺伝子の発現量に影響を及ぼすタンパク質の発現量又は活性を検出することを特徴とする肥満又は痩せの検査方法。
【請求項７】
ＭＣＰ−１タンパク質に対する抗体を有効成分として含むことを特徴とする肥満又は痩せの検査薬。
【請求項８】
ＭＣＰ−１タンパク質に対する抗体を含むことを特徴とする肥満又は痩せの検査キット。
【請求項９】
被検化合物を、被検動物又は被検細胞に、投与又は接触させる工程と、被検化合物が、被検動物又は被検細胞中でＭＣＰ−１遺伝子あるいは該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現レベルを調節するか否かを確認する工程、を含むことを特徴とする肥満又は痩せの治療又は予防に有効な化合物の評価方法。
【請求項１０】
被検化合物を、被検動物又は被検細胞に、投与又は接触させる工程と、被検化合物が、被検動物又は被検細胞中でＭＣＰ−１タンパク質あるいは該タンパク質と機能的に等価なタンパク質の発現レベルを調節するか否かを確認する工程、を含むことを特徴とする肥満又は痩せの治療又は予防に有効な化合物の評価方法。
【請求項１１】
被検化合物を、ＭＣＰ−１タンパク質に接触させる工程と、被検化合物が、前記タンパク質の活性に影響を与えるか否かを確認する工程、を含むことを特徴とする肥満又は痩せの治療又は予防に有効な化合物の評価方法。
【請求項１２】
請求項９〜１１のいずれか一項に記載の評価方法により、肥満又は痩せの治療又は予防に有効であると評価された化合物。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９２３６８
【国際公開日】平成１６年１０月２８日（２００４．１０．２８）
【発行日】平成１８年７月６日（２００６．７．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０５３４３（Ｐ２００５−５０５３４３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００３４５２
【国際出願日】平成１６年３月１２日（２００４．３．１２）
【出願人】（０００００５０７２）萬有製薬株式会社 (51)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年１０月２８日（２００４．１０．２８）
【発行日】平成１８年７月６日（２００６．７．６）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００３４５２
【国際出願日】平成１６年３月１２日（２００４．３．１２）
【出願人】（０００００５０７２）萬有製薬株式会社 (51)
【Ｆターム（参考）】
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