肺癌治療用薬学的組成物、肺癌の成長または浸潤を抑制する方法、および肺癌の治療方法
肺癌の細胞表面タンパク質であるＬ１ＣＡＭの活性または発現を抑制する物質を含む、肺癌の成長または転移を抑制する薬学的組成物、およびこれを用いた治療方法が開示される。前記肺癌細胞表面のＬ１ＣＡＭタンパク質を認識し、肺癌の癌組織に特異的に結合するマウスモノクローナル抗体、またはｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｈＲＮＡは、肺癌細胞の成長、浸潤または移動を抑制することにより、肺癌の治療に有用に利用できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肺癌の細胞表面に存在するタンパク質であるＬ１ＣＡＭの活性または発現を抑制する物質を含む、肺癌の成長または転移を抑制する薬学的組成物、およびこれを用いた治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肺癌は、主に発癌物質によって誘発され、発生率が全世界的に増加している趨勢にある。現に、肺癌は、韓国における癌死亡の主な原因である。肺癌は、治療と関連しては、小細胞癌（ＳＣＬＣ）と非小細胞癌（ＮＳＣＬＣ）の２つに分類される。ＮＳＣＬＣはさらに腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌、腺扁平上皮癌などの組織型に分類される。このような相異なる種類の組織型によって、発病し易い部位、進行形式、速度および症状などの臨床的特徴が様々であり、治療方法もいろいろである(Brambilla et al., Eur Respir J. 18(6):1059-68, 2001)。
【０００３】
大部分の肺癌は化学療法と放射線療法によっては治療できない。化学療法および放射線療法は、腫瘍の大きさを縮小させることにより小細胞癌に適用できるが、これによっては癌の完全な治療を期待することができない。非小細胞肺癌は、小細胞肺癌に比べて抗癌剤の効果が少なくて化学療法のみでは治療が殆ど不可能なので、腫瘍を外科的に完全に除去することが唯一の効果的な治療法である。ところが、肺癌患者の３０％以下が診断の際に完全には切除し得ない腫瘍を有し、 それらの３分の１以下のみが外科的切除術以後５年間生存する。よって、肺癌の早期診断、癌拡散度のより正確な診断およびより効率的な治療を実現することが可能な方法が大きく求められる。
【０００４】
一方、Ｌ１ＣＡＭ(L1 cell adhesion molecule)は、細胞の表面上で細胞間接着(cell-to-cell adhesion)を仲介する免疫グロブリンスーパーファミリー細胞接着分子(immunoglobulin superfamily cell adhesion molecules、ＣＡＭｓ)に属する内在性膜糖タンパク質(integral membrane glycoprotein)の一つであって、その分子量が２２０ｋＤａにも達する。Ｌ１ＣＡＭは元々ニューロンなどから発見され(Bateman, et al, EMBO J. 15:6050-6059:1996)、ニューロンの移動、神経突起の成長および細胞移動などの機能を有する。Ｌ１ＣＡＭは元々脳から発見されるものと知られているが、腎臓小管でも発現し、最近では様々な癌細胞でも発見され始めている(Huszar, M. et al., Expression profile analysis in multiple human tumors identifies L1 (CD171) as a molecular marker for differential diagnosis and targeted therapy. Human Pathology 37, 1000-1008, 2006)。
【０００５】
Ｌ１ＣＡＭと癌との連関性は、Ｌ１ＣＡＭが黒色腫(melanoma)、神経芽細胞腫(neuroblastoma)、卵素癌および大腸癌などの様々な癌で発現することが報告された(Takeda, et al., J. Neurochem. 66:2338-2349, 1996; Thies et al, Eur. J. Cancer, 38:1708-1716, 2002; Arlt et al., Cancer Res. 66:936-943, 2006; Gavert et al., J. Cell Biol. 168:633-642, 2005)。膜結合型(membrane bound form)の他にも、切断された産物(cleavage product)が細胞外に分泌されることが発見された(Gutwein et al., FASEP J. 17(2):292-4, 2003)。そして、最近、癌細胞の成長に重要な役割を果たす分子の一つとして探索されることにより(Primiano, et al., Cancer Cell. 4(1):41-53 2003)、癌治療の新しいターゲットとして浮上した（ＵＳ２００４／０１１５２０６ Ａ１出願２００４．６．１７）。
【０００６】
肺癌、特に小細胞肺癌におけるＬ１ＣＡＭの発現については、Ｌ１ＣＡＭが小細胞肺癌組織に発現している事実は明らかになったが(Huszar, M. et al., Human Pathology 37, 1000-1008, 2006; Miyahara, R. et al., J. Surg. Oncol. 77,49-54, 2001)、Ｌ１ＣＡＭの発現は小細胞肺癌細胞の増殖と連関性がないものと報告された(Miyahara, R. et al., J. Surg. Oncol. 77,49-54, 2001)。非小細胞肺癌の場合、１０つの扁平上皮癌と５つの腺上皮癌に対してＬ１ＣＡＭの発現有無を試験したが、検出されなくて(Huszar, M. et al. Human Pathology 37, 1000-1008, 2006)、その発現事実は知られていない。よって、Ｌ１ＣＡＭが肺癌細胞の成長と転移に関連しているという事実は未だ知られておらず、しかもＬ１ＣＡＭに対する抗体が肺癌の増殖および転移を抑制することにより、治療剤として可能性があるという事実は未だ知られていない。
【０００７】
米国特許出願ＵＳ２００４／０１１５２０６号は、Ｌ１ＣＡＭに特異的に結合する抗体を用いて癌細胞の死滅を誘導する製剤、および細胞死滅のために前記抗体を使用する手段、およびＬ１ＣＡＭ抗体が含まれた薬学的組成物について開示しているとともに、癌細胞で細胞成長を阻害し細胞死を誘導することが可能な有効量の抗Ｌ１ＣＡＭ抗体を細胞に接触させることにより細胞の成長を抑制し細胞死滅を誘導することについて開示している。ところが、この文献も、Ｌ１ＣＡＭが発現する癌の例として乳癌、大腸癌および子宮頸癌についてのみ言及しており、肺癌との関連性については言及しておらず、抗Ｌ１ＣＡＭ抗体を癌細胞に接触させることにより細胞成長抑制および細胞死滅を誘導することについてのみ開示しており、癌細胞の移動、浸潤および転移を抑制し得ることについては開示していない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、癌の診断または治療に使用可能な抗体を開発するために努力したところ、最近確立された胆管癌細胞株(Kim et al, Genes, chromosome & Cancer 30:48-56, 2001)をマウスに免疫注射し、胆管癌の表面上でＬ１ＣＡＭに特異的に結合するモノクローナル抗体を得、これをＡ１０−Ａ３抗体と命名した。Ｌ１ＣＡＭが肺癌細胞でも発現するかを分析するために、Ａ１０−Ａ３抗体を用いて小細胞癌組織を免疫組織化学染色した結果、小細胞肺癌では約８５％（陽性４９／５８組織の数）、非小細胞肺癌では約１０％（陽性４／３７組織の数）のＬ１ＣＡＭ発現率を確認し、また、小細胞肺癌細胞株と非小細胞肺癌細胞株の表面でもＬ１ＣＡＭが発現することを確認した。これまでＬ１ＣＡＭの非小細胞 癌における発現事実は知られておらず、Ｌ１ＣＡＭが小細胞肺癌で細胞の増殖とは関係ないものと知られているので、本発明者らは、Ｌ１ＣＡＭが肺癌細胞の成長または転移に作用するかを分析するために、ｓｉＲＮＡを用いてＬ１ＣＡＭの発現を抑制させ、あるいはＡ１０−Ａ３抗体を用いてＬ１ＣＡＭの活性を抑制させた結果、肺癌細胞の増殖または移動が減少することを観察した。この結果はＬ１ＣＡＭが肺癌細胞の癌進行に重要に作用することを示唆する。
【０００９】
また、本発明者らは、Ａ１０−Ａ３抗体が小細胞肺癌細胞の成長または移動を抑制する効果を持つことを確認した。また、ヒト胚芽幹細胞をマウスに免疫注射して得たハイブリドーマ（ＫＣＴＣ１０９６６ＢＰ）が生産するモノクローナル抗体４−６３と公知のＬ１ＣＡＭに対する抗体ＵＪ１２７も癌細胞表面のＬ１ＣＡＭを認識し、小細胞肺癌の成長を抑制した。また、公知のＬ１ＣＡＭに対する抗体ＵＪ１２７も小細胞肺癌細胞に結合してその成長を抑制することを確認した。よって、Ｌ１ＣＡＭに対する抗体が肺癌の診断および治療、特に死亡率が高い肺癌の転移を早期に診断および治療して治療効果を高めることができることを見出すことにより、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の目的は、Ｌ１ＣＡＭの活性または発現を抑制する物質を含む、肺癌の成長または転移を抑制する薬学的組成物を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記薬学的組成物を用いて肺癌を治療する方法を提供することにある。
本発明の別の目的は、Ｌ１ＣＡＭの活性を抑制するＬ１ＣＡＭに対する抗体を提供することにある。
本発明の別の目的は、Ｌ１ＣＡＭの発現を抑制するオリゴヌクレオチドを提供することにある。
本発明の別の目的は、前記薬学的組成物を用いて肺癌細胞の成長または転移を抑制する方法を提供することにある。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１はマウスモノクローナル抗体Ａ１０−Ａ３（Ａ）と４−６３（Ｂ）、および公知の抗体５Ｇ３（Ｃ）とＵＪ１２７（Ｄ）が胆管癌および肺癌などの様々な癌細胞および正常細胞の表面に結合するか否かを蛍光細胞染色およびフローサイトメトリーによって分析した結果を示す図である。
【図２】図２はＡ１０−Ａ３抗体の結合する抗原がＬ１ＣＡＭタンパク質であることを免疫沈降とウエスタンブロット方法によって証明した結果を示す。Ａは胆管癌細胞Ｃｈｏｉ−ＣＫ細胞の表面をビオチン化させた後、抗体Ａ１０−Ａ３または公知の抗−Ｌ１ＣＡＭモノクローナル抗体ＵＪ１２７で免疫沈降させた後、沈降したタンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥとストレプトアビジン−ＨＲＰを用いたウエスタンブロットを行った結果である。Ｂは抗体Ａ１０−Ａ３で免疫沈降させたタンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで公知の抗−Ｌ１ＣＡＭ抗体ＵＪ１２７を用いたウエスタンブロットを行った結果、Ｌ１ＣＡＭが検出されることを確認したものであり、ここで、「Ｐｒｅｃｌｅａｒｉｎｇ」は抗体を入れずに免疫沈降させた陰性対照群、「ＩＰ ｗｉｔｈ Ａ１０−Ａ３」は抗体Ａ１０−Ａ３で免疫沈降させたもの、「ＩＰ ｗｉｔｈ ａｎｔｉ−Ｌ１ＣＡＭ」はＬ１ＣＡＭに対する公知のモノクローナル抗体で免疫沈降させたもの、「Ａ１０−Ａ３ ｏｎｌｙ」は抗体自体のみをＳＤＳ−ＰＡＧＥしたものをそれぞれ示す。Ｃは水溶性Ｌ１を発現させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞培養液を公知の抗体ＵＪ１２７と５Ｇ３、Ａ１０−Ａ３抗体および４−６３抗体を用いてウエスタンブロットした結果であり、ここで、「−」はＬ１発現ベクターを入れていない細胞培養液、「＋」は水溶性Ｌ１発現ベクターを入れて培養した細胞培養液をそれぞれ示す。
【図３】図３はＱ−ＴＯＦ分析した結果を示したものである。Ｃｈｏｉ−ＣＫ細胞でＡ１０−Ａ３抗体を用いて免疫沈降させたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離してトリプシンによって切断した後、Ｑ−ＴＯＦ分析によって、得たペプチドが Ｌ１ＣＡＭであることを確認した図であって、下側のアミノ酸配列は全長Ｌ１ＡＭを示し、上側のアミノ酸配列は全長Ｌ１ＣＡＭ配列の下線部分にそれぞれ相当する、分析されたペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図４】図４は肺癌患者組織をＡ１０−Ａ３（ＡおよびＣ）と４−６３（Ｂ）の抗体を用いて免疫組織化学染色した結果であって、正常肺組織には結合せず、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）と小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）の組織には結合することを示す写真である。
【図５】図５はＬ１ＣＡＭの発現抑制によって小細胞肺癌細胞の活性が減少することを示す。ＡはＤＭＳ１１４およびＤＭＳ５３にＬ１ＣＡＭに対するｓｉＲＮＡまたは非特異的なｓｉＲＮＡを形質感染させてから、７２時間経過の後、フローサイトメトリーによって分析した結果を示す。ＢおよびＣはＬ１ＣＡＭに対するｓｉＲＮＡを肺癌細胞に形質感染させた後、７２時間経過の後、細胞の移動または増殖を分析した結果をそれぞれ示す。
【図６】図６はＬ１ＣＡＭに対する抗体による小細胞肺癌細胞の成長阻害効果を示す。Ａは抗体Ａ１０−Ａ３によるＤＭＳ５３細胞の成長抑制効果を分析したもので、抗体の陰性対照群としては抗体を入れないか（ｍｏｃｋ）、あるいは抗体を沸かして不活性化させた抗体（ｂｏｉｌｅｄ Ａ１０−Ａ３）または正常マウスＩｇＧ（ｎｏｒｍａｌ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ）使用したものである。Ｂは抗体Ａ１０−Ａ３によるＤＭＳ１１４細胞の成長抑制効果を分析したものである。Ｃは抗体４−６３、公知の抗体ＵＪ１２７および５Ｇ３によるＤＭＳ１１４細胞の成長抑制効果を分析したもので、細胞成長の度合いを、抗体を入れていない対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて百分率で表現したものである。
【図７】図７は抗体による小細胞肺癌細胞の浸潤および移動が抑制される効果を分析したものである。ＡはＡ１０−Ａ３抗体によるＤＭＳ１１４、ＤＭＳ５３細胞の浸潤抑制効果を示し、ＢはＡ１０−Ａ３抗体によるＤＭＳ１１４、ＤＭＳ５３細胞の移動抑制効果を示し、ＣはＵＪ１２７、４−６３、５Ｇ３抗体によるＤＭＳ１１４、ＤＭＳ５３細胞の浸潤抑制効果を示し、ＤはＵＪ２７、４−６３、５Ｇ３抗体によるＤＭＳ１１４、ＤＭＳ５３細胞の移動抑制効果を示すもので、抗体の陰性対照群としては抗体を入れないか（ｃｏｎｔｒｏｌ）、あるいは正常マウスＩｇＧ（ｍＩｇＧ）を使用し、細胞の浸潤と移動の度合いを、抗体を入れていない対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）に対する百分率で表現したものである。
【図８】図８はＤＭＳ１１４、ＤＭＳ５３細胞の成長、移動および生存に関与する細胞信号伝達がＡ１０−Ａ３によって抑制されるかを分析した結果を示すもので、前記細胞培地に抗体を添加して３０分、６０分、１２０分培養した後、収去した細胞抽出物の量を取ってβ−ａｃｔｉｎに対する抗体を用いて確認し、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫ１／２、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＡＫＴ、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＦＡＫに対する抗体を用いてウエスタンブロットを行った写真である。
【図９】図９はＡ１０−Ａ３抗体による非小細胞肺癌細胞Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ５２２の成長（Ａ）および移動（Ｂ）抑制効果を示す図で、抗体の陰性対照群としては抗体を入れないか（ＰＢＳ）、あるいは正常マウスＩｇＧ（ｍＩｇＧ）を使用したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
一様態において、本発明は、Ｌ１ＣＡＭの活性または発現を抑制する物質を含む、小細胞肺癌の成長または転移を抑制する薬学的組成物に関する。
具体的な一様態において、本発明の薬学的組成物は、Ｌ１ＣＡＭの活性を抑制する物質を含むことができる。好ましくは、前記活性抑制物質は肺癌細胞表面抗原または分泌された表面抗原（Ｌ１ＣＡＭ）を特異的に認識する抗体である。このような抗体は、モノクローナル抗体およびこれらのキメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体を全て含み、新規の抗体以外に、当該技術分野における公知の抗体も含むことができる。さらに好ましくは、前記抗体は新規のＬ１ＣＡＭに対するモノクローナル抗体Ａ１０−Ａ３、４−６３、またはＬ１ＣＡＭに対する公知のモノクローナル抗体ＵＪ１２７、およびこれらのキメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体である。これらのＡ１０−Ａ３および４−６３抗体はそれぞれ受託番号ＫＣＴＣ１０９０９ＢＰおよびＫＣＴＣ１０９６６ＢＰによって分泌されて生産される。
【００１３】
前記抗体は、Ｌ１ＣＡＭを特異的に認識する結合の特性を持つ限りは、２つの重鎖と２つの軽鎖の全長を有する完全な形態だけでなく、抗体分子の機能的断片を含む。抗体分子の機能的断片とは、少なくとも抗原結合機能を保有している断片を意味し、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖなどがある。
【００１４】
別の様態において、前記薬学的組成物は、Ｌ１ＣＡＭの発現を抑制する物質を含むことができる。Ｌ１ＣＡＭを発現する癌細胞においてＬ１ＣＡＭの発現を抑制する物質を用いてＬ１ＣＡＭの発現を抑制させると、癌細胞の成長と転移の役割を果たすＬ１ＣＡＭの作用が減少して癌治療が可能である。好ましくは、前記Ｌ１ＣＡＭの発現を抑制する物質はｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびアンチセンスオリゴヌクレオチド(antisense oligonucleotide)よりなる群から選択され、さらに好ましくは５’−ＴＧＧＴＡＣＡＧＴＣＴＧＧＧｄｔｄｔ−３または５’−ＣＡＧＣＡＡＣＴＴＴＧＣＴＣＡＧＡＧＧｄｔｄｔ−３’の配列を含むｓｉＲＮＡである。
【００１５】
用語「ｓｉＲＮＡ」は、ＲＮＡ干渉または遺伝子サイレンシング(silencing)を媒介することが可能な約２０ヌクレオチドサイズの小さい核酸分子を意味し、「ｓｈＲＮＡ」は、ｓｉＲＮＡターゲット配列のセンスおよびアンチセンス配列が５〜９個の塩基よりなるループを挟んで位置した短いヘアピンＲＮＡ(short hairpin RNA)を意味する。最近、遺伝子水準でタンパク質の発現を調節するための方法として、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）現象を用いた方法が研究されている。 ｓｉＲＮＡは、一般に、相補的な配列を有するｍＲＮＡに特異的に結合してタンパク質発現を抑制することが明らかになっている。
【００１６】
本発明の組成物に含まれるｓｉＲＮＡを製造する方法には、ｓｉＲＮＡを直接化学的に合成する方法(Sui G et al., (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99:5515-5520)や、ｉｎｖｉｔｒｏ転写を用いたｓｉＲＮＡの合成法(Brummelkamp TR et al., (2002) Science296:550-553)などがあるが、これに限定されない。また、ｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡの高価の生合成費用や、低い細胞形質感染効率によるＲＮＡ干渉効果の短時間維持などの欠点を克服するためのもので、ＲＮＡ重合酵素IIIのプロモータからアデノウイルス、レンチウイルスおよびプラスミド発現ベクターシステムを用いてこれを細胞内に導入して発現させることができる。このようなｓｈＲＮＡは、細胞内に存在するｓｉＲＮＡプロセシング酵素(Dicer or Rnase III)によって、正確な構造を持つｓｉＲＮＡに転換され、目的遺伝子のサイレンシングを誘導することが広く知られている。
【００１７】
用語「アンチセンス」は、アンチセンスオリゴマーがワトソン・クリック塩基対の形成によってＲＮＡ内の標的配列と混成化されて、標的配列内における、典型的にｍＲＮＡとＲＮＡ：オリゴマーへテロ二本鎖の形成を許容する、ヌクレオチド塩基の配列およびサブユニット間のバックボーンを有するオリゴマーを指す。オリゴマーは、標的配列に対する正確な配列相補性または近似相補性を持つことができる。このアンチセンスオリゴマーは、ｍＲＮＡの翻訳を遮断または阻害し、ｍＲＮＡのスプライス変異体を生産するｍＲＮＡのプロセシング過程を変化させることができる。よって、本発明のアンチセンスオリゴマーは、Ｌ１ＣＡＭ遺伝子のｍＲＮＡに相補的なアンチセンスオリゴマーである。
【００１８】
好ましくは、本発明の組成物には、公知の治療剤を直接的または間接的に結合させるか、あるいは一緒に含ませることができる。抗体と結合可能な治療剤には放射性核種、薬剤、リンフォカイン、毒素または二重特異的抗体などが含まれる。ところが、本発明の組成物に含まれる治療剤は、これに限定されず、抗体と結合させることができるか、あるいは抗体、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドと共に投与して癌治療効果を得ることが可能な公知の治療剤であれば可能である。
【００１９】
前述した放射線核種には、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉおよび１８６Ｒｅなどがあり、これに限定されない。
【００２０】
前述した薬剤および毒素には、エトポシド、テニポシド、アドリアマイシン、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン類、シス−白金およびシス−白金同族体、ブレオマイシン類、エスペラマイシン類、５−フルオロウラシル、メルファラン、およびその他の窒素マスタードなどがあり、これに限定されない。
好ましくは、本発明の組成物は投与方式によって許容可能な担体を含むことができる。
【００２１】
投与方式に適した製剤は、当該分野に公知になっている。また、本発明の薬学的組成物は癌治療のために薬学的有効量で投与できる。典型的な投与量の水準は標準臨床的技術を用いて最適化することができる。
【００２２】
また、本発明は前記薬学的組成物を用いて肺癌を治療する方法に関する。
具体的に、本発明の治療方法は、薬学的組成物を薬学的有効量で人体内に投与することを含む。前記薬学的組成物は、非経口、皮下、腹腔内、肺内、および鼻腔内に投与でき、局部的免疫抑制治療のために、必要であれば病変内投与を含む適切な方法によって投与できる。非経口注入には筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内または皮下投与が含まれる。好ましい投与方式は静脈注射、皮下注射、皮内注射、筋肉注射および点滴注射である。
【００２３】
本発明の薬学的組成物を人体内に投与し、これに含まれたＬ１ＣＡＭに特異的な抗体を癌細胞の表面抗原Ｌ１ＣＡＭに結合させて癌細胞の増殖または転移を抑制させることにより、胆管癌を治療することができる。
【００２４】
また、本発明の薬学的組成物を人体内に投与し、抗体を分泌されたＬ１ＣＡＭと結合させて癌細胞の成長および転移を遮断させることにより、肺癌を治療することができるうえ、これを人体内に投与して癌細胞の表面抗原Ｌ１ＣＡＭに結合させて、これを認知する免疫細胞が肺癌細胞を捕食、自殺および殺害させることにより、小細胞肺癌を治療することができる。
【００２５】
また、本発明の薬学的組成物に含まれたＬ１ＣＡＭの発現抑制物質を用いてＬ１ＣＡＭの発現を抑制させると、肺癌細胞の成長および転移の役割を果たすＬ１ＣＡＭの作用が減少して肺癌治療が可能である。
【００２６】
別の様態において、本発明は、Ｌ１ＣＡＭの活性を抑制するＬ１ＣＡＭに対する抗体、またはＬ１ＣＡＭの発現を抑制するＬ１ＣＡＭに対するオリゴヌクレオチドに関する。
具体的な一様態において、前記抗体は、本発明に係る組成物で言及したように、Ｌ１ＣＡＭに特異的に結合する特性を持つ限りは、２つの重鎖と２つの軽鎖の全長を有する完全な形態だけでなく、抗体分子の機能的断片も含む。抗体分子の機能的断片とは、少なくとも抗原結合機能を保有している断片を意味し、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖなどがある。
【００２７】
好ましくは、前記抗体は、肺癌細胞の表面抗原または分泌された表面抗原（Ｌ１ＣＡＭ）を認識する抗体である。前記抗体は、肺癌細胞の表面タンパク質Ｌ１ＣＡＭと結合してその作用を抑制または中和(neutralization)させ、癌細胞と結合して癌細胞の成長および転移抑制を図り、癌細胞を捕食、自殺または殺害させることができることを特徴とする。
【００２８】
前述したＵＳ２００４／０１１５２０６に開示されているように、Ｌ１ＣＡＭの抗体はＬ１ＣＡＭの作用を必ずしも抑制するのではない。本発明の抗体は、Ｌ１ＣＡＭの作用を促進する抗体ではなく、Ｌ１ＣＡＭの活性を抑制する抗体であることを特徴とする。
さらに好ましくは、前記抗体は新規のモノクローナル抗体Ａ１０−Ａ３または４−６３である。
【００２９】
具体的な別の一様態において、本発明のＬ１ＣＡＭの発現を抑制するＬ１ＣＡＭに対するオリゴヌクレオチドは、本発明の組成物で言及されたＬ１ＣＡＭに対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドから選択される。
【００３０】
具体的な一実施例として、本発明者らは、胆管癌細胞を大量培養した後、マウスの足底に前記細胞を注入し、前記マウスのリンパ節(lymph node)からリンパ球を分離して骨髄腫(myeloma)癌細胞と細胞融合させることにより、胆管癌細胞に結合する抗体を生産するマウスハイブリドーマを製造した。
【００３１】
より具体的に、本発明者らは、胆管癌細胞ＳＣＫとＣｈｏｉ−ＣＫをマウスの足底に注射し、前記マウスのリンパ節からリンパ球を分離した。その後、前記リンパ球とＦＯ骨髄腫細胞株とを細胞融合させた後、抗体が発現するクローンを選別した。前記製造したクローンの中で、比較的安定的にモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ上澄み液の胆管癌と肺癌細胞に対する結合能を調査し、これらのモノクローナル抗体、およびモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマをハイブリドーマＡ１０−Ａ３と命名し、これを２００６年２月２０日付で韓国生命工学研究院の遺伝子銀行に寄託した（住宅番号：ＫＣＴＣ１０９０９ＢＰ）。また、ヒト胚芽幹細胞を注射して得た抗体のうち、Ｌ１ＣＡＭを認識する抗体４−６３を得て、この抗体も胆管癌と肺癌に結合することを確認し、これを２００６年７月１３日付で韓国生命工学研究院の遺伝子銀行に寄託した（受託番号：ＫＣＴＣ１０９６６ＢＰ）。前記モノクローナル抗体は、本発明に係る前記ハイブリドーマによって分泌され、胆管癌または肺癌の癌細胞表面タンパク質としてのＬ１ＣＡＭに特異的に結合した。具体的に、前記モノクローナル抗体が認識する癌細胞は、胆管癌、肺癌などの癌細胞株には結合するが（図１参照）、肝細胞、ＨＵＶＥＣ（ヒト由来の臍帯静脈内皮細胞）および抹消血液リンパ球(peripheral blood lymphocyte)などの正常細胞には結合せず（図１参照）、これらの抗体を使用したときに肺癌細胞の成長、移動または浸潤が抑制された。また、公知のＬ１ＣＡＭに対する抗体５Ｇ３は、肺癌細胞に結合するが、癌の成長を抑制することはできなかった（図５および図６参照）。別の公知の抗体ＵＪ１２７は肺癌細胞に結合してそれらの成長を抑制した。これにより、Ｌ１ＣＡＭの抗体が必ずしもＬ１ＣＡＭの作用を抑制するのではないことが分かった。
【００３２】
前述したように、これまではＬ１ＣＡＭが肺癌では発現するが、細胞の増殖とは関係ないものと知られているが、本発明者らは、Ｌ１ＣＡＭが肺癌で発現するだけでなく、肺癌細胞の成長、転移、増殖および移動に関連し、よってＬ１ＣＡＭが肺癌細胞の癌進行に重要に作用することを最初に確認した。
【００３３】
したがって、本発明に係るＬ１ＣＡＭに特異的な抗体、またはｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドなどのＬ１ＣＡＭの活性または発現を抑制する物質、およびこれらを含む薬学的組成物は、肺癌の診断および治療、特に死亡率の高い肺癌の転移を早期に診断および治療して治療効果を高めることができる。
以下、本発明を実施例によってさらに詳細に説明するが、下記実施例は本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容を限定するものではない。
【実施例】
【００３４】
実施例１：癌細胞の培養
癌細胞株は、全て１０％牛胎児血清（Ｇｉｂｃｏ社）を含有する次の培地を用いて、５％の二酸化炭素が維持される３７℃の恒温培養器で培養した。ＳＨ−Ｊ１(hepatocellular carcinoma)、ＳＣＫ(cholangiocarcinoma)、Ｃｈｏｉ−ＣＫ(cholangiocarcinoma)およびＡＣＨＮ(Renal cell adenocarcinoma)細胞はＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社）培地を用い、ＳＫ−ＯＶ３(ovary adenocarcinoma)細胞はＭｃＣｏｙ ５Ａ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ社）培地を用いた。Ａ５４９(non small cell lung carcinoma)はＨａｍ’ｓ Ｆ１２Ｋ培地で培養し、ＮＣＩ−Ｈ５２２(non small cell lung carcinoma)、ＤＭＳ１１４(small cell lung carcinoma)、ＤＭＳ５３(small cell lung carcinoma)、ＮＣＩ−Ｈ６９(small cell lung carcinoma)はＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。ＳＨ−Ｊ１、ＳＣＫおよびＣｈｏｉ−ＣＫ細胞株はキムデゴン博士（全北大学校医科大学）から得た。その外の癌細胞株はＡＴＣＣから購入した。
【００３５】
正常細胞である肝細胞(hepatocyte)はＣａｍｂｒａｘ社から購入し、ＨＵＶＥＣ細胞もＣａｍｂｒａｘ社から購入した後、１０％の牛胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を含有するＥＧＭ−２（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）培地を用いて、５％の二酸化炭素が維持される３７℃の恒温培養器で培養した。 抹消血液リンパ球（ＰＢＬ）は、ヒトの血液からフィコール密度勾配で遠心分離により分離した後で収得した。
【００３６】
実施例２：モノクローナル抗体Ａ１０−Ａ３の製造
培養した癌細胞Ｃｈｏｉ−ＣＫとＳＣＫを細胞分離緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて取り外し、約５×１０５の細胞を３０μＬのＰＢＳに浮遊させた後、細胞をＢａｌｂ／ｃマウスの右足底にＣｈｏｉ−ＣＫを注射し、３日後に左足底にはＳＣＫを注射した。これを３〜４日の間隔で６回反復投与し、細胞融合１日の前にさらに注射した。リンパ節細胞と融合させるＦＯ骨髄腫細胞株（ＡＴＣＣ、ＵＳＡ）は、１０％の牛胎児血清を含有したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社）培地で２週前から培養して準備した。
【００３７】
癌細胞Ｃｈｏｉ−ＣＫとＳＣＫで免疫させたマウスの膝窩リンパ節をそれぞれ取り出してＤＭＥＭ（ Ｇｉｂｃｏ社）培地でよく洗浄し、培養皿でよく粉砕して細胞浮遊物を１５ｍＬのチューブに移した。ＦＯ骨髄腫細胞を遠心分離して収去し、１０ｍＬのＤＭＥＭ培地に懸濁して前記リンパ節の細胞と共に細胞数を計数した。その後、１０６個の骨髄腫細胞（ＦＯ）と１０７個のリンパ節細胞を５０ｍＬのチューブに移して混ぜた後、２００×ｇで５分間遠心分離して上澄み液を除去し、しかる後に、３７℃の水が充填されたビーカーに２分間放置した。チューブを軽く叩いて細胞を柔らかくし、３７℃の水に漬浸した状態でゆっくり振とうしながら、１ｍＬのＰＥＧ溶液（Ｇｉｂｃｏ社）を１分間徐々に添加した。１００×ｇで２分間遠心分離し、５ｍＬのＤＭＥＭ培地を３分にわたって徐々に添加し、さらに５ｍＬのＤＭＥＭ培地を２分間ゆっくり添加した後、２００×ｇで遠心分離して細胞を回収した。そして、細胞融合効率および生存率を高めるために、ハイブリドーマクローニング因子(Hybridoma Cloning Factor)（ＢｉｏＶｅｒｉｓ社、ＵＳＡ）を予め１０％で正常培地（ＤＭＥＭ＋２０％の牛胎児血清）で混ぜておいた。回収した細胞を、ハイブリドーマクローニング因子を混ぜた３０ｍＬの正常培地（ＤＭＥＭ＋２０％の牛胎児血清）に丁寧に懸濁した。３７℃のＣＯ２培養器で３０分間放置した後、９６ウェルプレートにウェル当り７０μＬずつ１０５個の細胞となるように分注して３７℃のＣＯ２培養器で培養した。翌日７０μＬのＨＡＴを加え、３日間隔でＨＡＴ培地で２週以上成長させながら、成長するコロニーを観察した。このようにＣｈｏｉ−ＣＫ細胞を免疫注射したリンパ節と、ＳＣＫ細胞を免疫注射したリンパ節から分離したリンパ球を骨髄腫細胞と融合させて得たハイブリドーマコロニーの上澄み液を用いて次の実験を行った。
【００３８】
抗体が発現するクローンを選別するために、サンドイッチＥＬＩＳＡ(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)法を使用した。抗マウスＩｇＧまたはＩｇＭ抗体を、２μｇ／ｍＬでコートしたプレートにハイブリドーマ培養液１００μＬを添加して３７℃で１時間反応させ、さらに抗マウスＩｇＧまたはＩｇＭのＨＲＰ（horseradish peroxidase、Ｓｉｇｍａ社）の１／５０００希釈液と１時間さらに反応させた。０．０５％のツイン２０を添加したリン酸緩衝液によって培養容器を洗浄し、ＯＰＤ（Ｓｉｇｍａ社）および過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の含まれた基質溶液を添加し、波長４９２ｎｍの吸光分析器で吸光度を測定して抗体を生産するクローンを選別した。
【００３９】
これらの製造したクローンの中で、比較的安定的に抗体を分泌するハイブリドーマ上澄み液のＳＣＫおよびＣｈｏｉ−ＣＫ細胞に対する結合能を調査した。具体的に、培養されたＣｈｏｉ−ＣＫ細胞を細胞分離緩衝液（Ｇｉｂｃｏ）を用いて２０分間３７℃で処理して単一細胞に分離した後、４０μｍのストレーナーを通過させて５×１０５細胞をフローサイトメトリーに使用した。まず、単一細胞化されたＳＣＫおよびＣｈｏｉ−ＣＫ細胞をＰＢＡ（１％のＢＳＡをＰＢＳに溶解）に浮遊させ、抗体上澄み液を４℃で３０分間反応させた。４℃で１２００ｒｐｍにて５分間遠心分離して上澄み液１００μＬを除去し、ここに抗マウスＩｇ−ＦＩＴＣ（ＢＤ）を２００倍希釈させて４℃で３０分間反応させた後、ＰＢＡで２回洗浄し、ヨウ化プロピジウム（Propoidium Iodide、ＰＩ）陰性の細胞のみを選んでフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ ｃａｌｉｂｅｒ）によってＳＣＫおよびＣｈｏｉ−ＣＫ細胞に対する結合能を分析した。
【００４０】
その結果、ＳＣＫおよびＣｈｏｉ−ＣＫに結合する抗体を分泌する様々なハイブリドーマを選別し、持続的な継代培養によって安定化を維持させた後、サブクローニングした。前記サブクローニングによって確実に安定性を維持させたＳＣＫおよびＣｈｏｉ−ＣＫ細胞に対する特異性を維持した抗体Ａ１０−Ａ３を分泌するハイブリドーマを選別した。
【００４１】
前記モノクローナル抗体Ａ１０−Ａ３を分泌するハイブリドーマをハイブリドーマＡ１０−Ａ３（受託番号：ＫＣＴＣ１０９０９ＢＰ）と命名し、これらを２００６年２月２０日付でＫＣＴＣ（Korean Collection for Type Cultures、韓国大田市儒城区魚隠洞５２番地に所在する韓国生命工学研究院）に寄託した。
【００４２】
実施例３：モノクローナル抗体Ａ１０−Ａ３が認識する抗原の分離および同定
実施例３−１：抗原の分離
モノクローナル抗体Ａ１０−Ａ３が認識する細胞表面認識因子を分離するために、まず、培養したＣｈｏｉ−ＣＫ細胞をＰＢＳ緩衝溶液で洗浄し、ＥＺ−Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）でビオチン化させた後、細胞を溶解溶液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、２μｇ／ｍＬのアポロチニン、１００μｇ／ｍＬのフェニルメチルスルホニルフッ化物、５μｇ／ｍＬのロイペプチン）で２０分間４℃で反応させた後、細胞残骸(debris)を除去するために遠心分離を行った。上澄み液のみを回収してＢＣＡ(bicinchoninic acid)タンパク質検定キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてタンパク質の濃度を決定した。
【００４３】
タンパク質Ｇプラス−セファロース（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）に非特異的に結合するタンパク質は、細胞溶解液を２０μＬのタンパク質Ｇプラス−セファロースと４℃で２時間反応させた後、遠心分離して上澄み液のみを回収して準備し、回収した上澄み液はさらに約１μｇの抗体と４℃で１２時間反応させた。ここに２０μＬのタンパク質Ｇプラス−セファロースを添加して４℃で２時間反応させた後、遠心分離して沈殿物を回収した。回収した沈殿物を細胞溶解液で１０回以上洗浄し、残っているタンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。
【００４４】
このタンパク質をニトロセルロース膜に移してウエスタンブロットを行った。ニトロセルロース膜を５％脱脂油含有のＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．１％のＴｗｅｅｎ２０）緩衝溶液で１時間反応させてから、前記ＰＢＳＴ緩衝溶液で２回以上洗浄した。前記反応されたニトロセルロース膜を、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）コンジュゲート（１：１５００、Ａｍｅｒｓｈａｍｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加して１時間反応させた。前記ＰＢＳＴ緩衝溶液で５回洗浄した後、ビオチン化タンパク質をＥＣＬ検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で発色させた。
【００４５】
その結果、約２００ｋＤａサイズのタンパク質にＡ１０−Ａ３抗体が結合することを確認した（図２のパネルＡ）。抗体Ａ１０−Ａ３によって免疫沈降するタンパク質を集めるために、１×１０８のＣｈｏｉ−ＣＫ細胞から得た細胞溶解液を前述の方法で免疫沈降させた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離した。このゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｇ２５０（Ｂｉｏｒａｄ）で染色した。
【００４６】
実施例３−２：質量分析（Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）による抗原の同定
Ａ１０−Ａ３によって免疫沈降したタンパク質を含むＳＤＳゲルを、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｇ２５０（ＢＩＯ−ＲＡＤ）で供給者のプロトコール通りに染色した。タンパク質含有部分を切り出し、３０％のメタノールで５分間洗浄した後、細かく粉砕した。ゲル切片を３０％のメタノールによって染色が完全に脱色するまで反応させてから、１００％のアセトニトリルによって１０分間水分を除去し、３０分間真空遠心分離器によって乾燥させた。乾燥したゲル切片は５０ｍＭの重炭酸アンモニウム溶液で３００ｎｇのトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）と１６時間３７℃で反応させた。切断されたペプチドは３回１００μＬの５０ｍＭ重炭酸アンモニウムで抽出し、真空遠心分離器で乾燥させた。ペプチド混合物は、Ｑ−ＴＯＦ ｍｉｃｒｏ（ＭｉｃｒｏＭａｓｓ）でＥＳＩ Ｑ−ＴＯＦ ＭＳ／ＭＳ(electrospray quadrupole time of flight tandem mass spectrometry)によって分析した。その結果、このタンパク質がＬ１ＣＡＭ(L1 Cell Adhesion molecule)であることを確認した（図３）。図３における下線部分は、実際アミノ酸配列がＱ−ＴＯＦで解明されたことを表示する。よって、実際Ｌ１ＣＡＭに対する抗モノクローナル抗体ＵＪ２７．１１をＣｈｅｍｉｃｏｎ（ＵＳＡ）社から購入してビオチン標識付きＣｈｏｉ−ＣＫ細胞溶解液を用いて実施例４−１のように免疫沈降させ、ＥＣＬで確認した。図２のパネルＡに示すように、Ａ１０−Ａ３と抗−Ｌ１ＣＡＭ抗体が約２００ｋＤａの同一位置にタンパク質を免疫沈降させることが分かる。
【００４７】
実施例３−３：ウエスタンブロットによるＬ１ＣＡＭ抗原の確認
Ａ１０−Ａ３抗体が本当にＬ１ＣＡＭを認識するかを再確認するために、Ｃｈｏｉ−ＣＫの細胞溶解液を用いてこの抗体でまず免疫沈降を行った。タンパク質Ｇプラス−セファロース（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）に非特異的に結合するタンパク質は、細胞溶解液を２０μＬのタンパク質Ｇプラス−セファロースと４℃で２時間反応させた後、遠心分離して上澄み液のみを回収して準備し（図２のｐｒｅｃｌｅａｒｉｎｇ）、回収した上澄み液はさらに約１μｇの抗体と４℃で１２時間反応させた。ここに２０μＬのタンパク質Ｇプラス−セファロースを添加して４℃で２時間反応させた後、遠心分離して沈殿物を回収した。回収した沈殿物を細胞溶解液で１０回以上洗浄し、残っているタンパク質を１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで２−メルカプトエタノールなしに分離した。
【００４８】
このタンパク質をニトロセルロース膜に移してウエスタンブロットを行った。ニトロセルロース膜を５％脱脂乳含有のＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）緩衝溶液で１時間反応させてから、前記ＰＢＳＴ緩衝溶液で２回以上洗浄した。前記反応されたニトロセルロース膜を、公知の抗−Ｌ１ＣＡＭ抗体ＵＪ１２７（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を１次抗体として添加して１時間反応させた。前記ＰＢＳＴ緩衝溶液で５回洗浄した後、抗−マウスＩｇＧのホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート（１：５０００、Ｓｉｇｍａ）で１時間反応させた。さらにＰＢＳＴ緩衝溶液で５回洗浄した後、ＥＣＬ検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で発色させた。その結果、Ａ１０−Ａ３によって免疫沈降した約２００ｋＤａサイズのタンパク質にＬ１ＣＡＭ抗体が結合することを確認した（図２のパネルＢ）。これはさらにＡ１０−Ａ３抗体がＬ１ＣＡＭを認識することを示す。
【００４９】
実施例３−４：水溶性Ｌ１ＣＡＭの発現
水溶性Ｌ１ＣＡＭを発現させるための発現ベクターを製作するために、培養された癌細胞Ｃｈｏｉ−ＣＫからＲＮＡ抽出キット（Ｒｏｃｈｅ ｃｏ．）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを分離した。分離されたｔｏｔａｌ ＲＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲキット（Ｒｏｃｈｅ ｃｏ．）を用いて、２つの両末端プライマーＩｇ−ｄｏｍ−Ｆ（５’−ｇＡｇ ｇＡｇ ｇＡＡ ＴＴＣ Ｃｇｇ ＣｇＣ Ｃｇｇ ｇＡＡ ＡｇＡ Ｔｇｇ ＴＣｇ Ｔｇｇ Ｃｇ−３’、３８ｍｅｒ）とＬ１−Ｆｎ−Ｓｔｏｐ−Ｒ（５’−ＣＴＣ ＴＡｇ ＡｇＴ ＴＣＴ ＣｇＡ ｇＴＣ ＡｇＡ ｇＣＣ ＴＣＡ ＣｇＣ ｇｇＣ Ｃ−３’、３４ｍｅｒ）とｐｆｕ重合酵素（Ｓｏｌｇｅｎｔ ｃｏ．）を用いて９５℃で５分間前処理反応させた後、９５℃、３０秒／５８℃、３０秒／７２℃、２分間２５回連鎖重合反応を行い、７２℃で１０分間重合反応を行って増幅した。
【００５０】
増幅された水溶性Ｌ１ ＤＮＡ断片をｐＪＫ−ｄｈｆｒ２発現ベクター（Ａｐｒｏｇｅｎ）に挿入するために、ベクターと増幅されたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩとＸｈｏＩ酵素でそれぞれ切断し、１％アガロースゲルに電気泳動して当該断片を切り取った後、Ｇｅｌ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｉｎｔｒｏｎ ｃｏ．）を用いて回収した。回収された２つのＤＮＡ断片をＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｒｏｃｈｅ ｃｏ．）を用いて１６℃で３０分間反応させることにより、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α）にヒートショック(heat shock)法によって形質転換させた。形質転換された細胞からプラスミドＤＮＡを分離して塩基配列を分析することにより、水溶性Ｌ１ＣＡＭのｃＤＮＡがクローニングされていることを確認した。製造された発現ベクターはｐＪＫ−ｄｈｆｒ２−Ｌ１−ｍｏｎｏｍｅｒと命名した。
【００５１】
水溶性Ｌ１ＣＡＭを発現させるために、ｐＪＫ−ｄｈｆｒ２−Ｌ１−ｍｏｎｏｍｅｒ ＤＮＡをＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１１２６８、以下「２９３Ｔ」という）に形質転換してＬ１−ｍｏｎｏｍｅｒを発現させた。５００μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）にリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏ．）と前記発現ベクター１０μｇをそれぞれ混入して５分間常温で反応させる。２つの反応液を合わせた後、１５分間常温でさらに反応させる。２つの反応液を常温で反応させる間、２９３Ｔ細胞をＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ７．４）で丁寧に洗浄して除去し、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地を入れた後、さらに除去する。リポフェクタミン２０００とＤＮＡとを反応させた溶液にＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地４ｍＬを入れて攪拌した後、これを２９３Ｔ細胞のある培養容器に注意深く仕込み、５％の二酸化炭素が維持される３７℃の恒温培養器で培養した。６時間の培養後、５ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地をさらに添加し、３日間培養した。
【００５２】
実施例３−５：抗体の水溶性Ｌ１ＣＡＭに対する結合特異性の確認
２９３Ｔ細胞で水溶性Ｌ１ＣＡＭを発現させた細胞培養液と、水溶性Ｌ１ＣＡＭを発現させていない細胞培養液に対して１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥとウエスタンブロットを行った。ニトロセルロース膜を５％脱脂乳含有のＴＢＳＴ（ＴＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）緩衝溶液を用いて４℃で１２時間反応させてから、前記ＴＢＳＴ緩衝溶液で２回以上洗浄した。公知の抗−Ｌ１ＣＡＭ抗体ＵＪ１２７（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）および５Ｇ３（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と前記Ａ１０−Ａ３および４−６３抗体を、５％脱脂乳含有のＴＢＳＴ緩衝溶液に１：１００００で希釈された１次抗体と１時間反応させた。前記ＴＢＳＴ緩衝溶液で５回洗浄した後、抗マウスＩｇＧのホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート（１：５０００、Ｓｉｇｍａ）で１時間反応させた。さらにＴＢＳＴ緩衝溶液で５回洗浄した後、ＥＣＬ検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で発色させた。その結果、前記各抗体は約２００ｋＤａサイズの水溶性Ｌ１ＣＡＭに結合することを確認した（図２のパネルＣ）。また、前記Ｌ１発現細胞培養液に対して前記抗体を用いてＥＬＩＳＡを行った結果、各抗体は発現した水溶性Ｌ１ＣＡＭに対する結合特異性があることを確認した。
【００５３】
実施例４：Ｌ１ＣＡＭの肺癌細胞株表面における発現分析
Ａ１０−Ａ３ハイブリドーマ細胞株を無血清培地（ＰＦＨＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で培養した後、培養液からタンパク質Ｇ−セファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スウェーデン）を用いて精製した(Fike et al., Focus 12:79, 1990)。精製されたＡ１０−Ａ３抗体の様々な癌細胞に対する結合能を蛍光細胞染色によって実施例２と同様の方法で調査した（図１）。図１において、実線部分はモノクローナル抗体Ａ１０−Ａ３、４−６３、およびＬ１ＣＡＭに対する公知の抗体５Ｇ３（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＵＳＡ）とＵＪ１２７（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）であり、陰影部分は２次抗体のみを含んだものである。様々な癌細胞に対するＡ１０−Ａ３、４−６３、５ＧおよびＵＪ１２７の結合能力を測定するために、フローサイトメトリーを用いた。その結果、前記モノクローナル抗体が肺癌細胞ＮＣＩ−Ｈ５２２、Ａ５４９、ＤＭＳ１１４、ＤＭＳ５３およびＮＣＩ−Ｈ６９に結合することを観察することができた（図１のパネルＡ、Ｂ、ＣおよびＤ）。ところが、癌細胞のＡＣＨＮと、正常細胞の肝細胞、ＨＵＶＥＣおよび抹消血液リンパ球（ＰＢＬ）とは結合しない結果を示した。
【００５４】
実施例５：肺癌組織におけるＬ１ＣＡＭ発現の分析
免疫組織化学染色のために、それぞれの癌腫から厚さ３μｍの切片を準備した。この切片を、それぞれポリ−Ｌ−リジンを塗布したスライドに接着させた。まず、６０℃のオーブンで３時間乾燥させた後、キシレンによって室温で５分間３回脱パラフィン化させた。１００％、９０％、８０％および７０％のアルコールでそれぞれ１分間処理し、抗原性回復のためにｔａｒｇｅｔ ｒｅｔｒｉｅｖａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＤＡＫＯ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）にスライドを浸漬した後、圧力釜を用いて４分間沸かしたＴＢＳＴ緩衝溶液（Ｔｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ−Ｔｗｅｅｎ２０）で水洗した。高感度の免疫組織化学染色のために、Ｂｉｏｔｉｎ−ｆｒｅｅ Ｔｙｒａｍｉｄｅ Ｓｉｇｎａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＳｙｓｔｅｍであるＣＳＡIIｋｉｔ（ＤＡＫＯ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）を用いた。非特異抗原を除去するために、３％の過酸化水素に５分間反応させた後、緩衝溶液で５分間２回洗浄し、非特異タンパクの結合を除去するために、十分な無血清タンパク質ブロック(serum-free protein block)で５分間反応させた。１次抗体（Ａ１０−Ａ３、４−６３、１：５０希釈）を塗布して１５分間反応させ、抗マウス免疫グロブリン−ＨＲＰに１５分間処理した。その後、増幅剤に１５分間放置した後、抗−フルオレセイン−ＨＲＰに１５分間反応させた。ＤＡＢを用いて５分間発色させた後、Ｍｅｙｅｒ’ｓ ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎで対照染色を行った。それぞれの段階が終わると、ＴＢＳＴ緩衝溶液で５分間２回洗浄した。陰性対照群は、染色の際に１次抗体を除外して正常羊血清を添加し、あるいは１次抗体の代わりに正常マウスＩｇＧ１血清を添加し、残りの全ての過程は同様にした。
【００５５】
その結果、Ａ１０−Ａ３および４−６３抗体は、正常組織には結合せず、非小細胞肺癌の大部分を占める偏平上皮癌(squamous cell carcinoma)、腺状皮癌(adenocarcinoma)および小細胞肺癌の組織によく結合することが分かった（図４のパネルＡおよびＢ）。Ｌ１ＣＡＭの発現率は、小細胞肺癌患者の８５％（陽性４９／５８組織数）、非小細胞肺癌患者の約１０％（陽性４／３９組織数）であった。図４のパネルＣに示すように、小細胞肺癌の右部分のように高分化型(well-differentiated)ＳＣＬＣに比べて右部分の低分化型(poorly-differentiated)ＳＣＬＣでＡ１０−Ａ３抗体が良く結合した。これはＬ１ＣＡＭがＳＣＬＣの進行過程で発現することを示唆する。よって、Ｌ１ＣＡＭに対する抗体が小細胞肺癌の進行を遮断することにより、小細胞肺癌の効果的な治療剤になれることを示唆する。このため、本発明では、Ｌ１ＣＡＭの発現を抑制させるｓｉＲＮＡが小細胞肺癌細胞の増殖または移動を減少させるかを分析した。
【００５６】
実施例６：Ｌ１ＣＡＭに対するｓｉＲＮＡの肺癌細胞阻害効果
実施例６−１：小細胞肺癌細胞におけるｓｉＲＮＡを用いたＬ１ＣＡＭの発現抑制
Ｌ１ＣＡＭを細胞の表面で発現する小細胞肺癌細胞ＤＭＳ１１４およびＤＭＳ５３でＬ１ＣＡＭの発現をノックダウンさせるために、Ｌ１ＣＡＭに対するｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド（５’−ＴＧＧＴＡＣＡＧＴＣＴＧＧＧｄｔｄｔ−３’および５’−ＣＡＧＣＡＡＣＴＴＴＧＣＴＣＡＧＡＧＧｄｔｄｔ−３’）および非特異的なオリゴヌクレオチド（５’−ＣＡＧＴＣＧＣＧＴＴＴＧＣＧＡＣＴＧＧｄｔｄｔ−３’）をそれぞれ形質感染させた後、７２時間培養した。Ｌ１ＣＡＭのノックダウンはＡ１０−Ａ３を用いたフローサイトメトリー、ＲＴ−ＰＣＲおよびウエスタンブロットによって確認した。Ｌ１ＣＡＭに対するｓｉＲＮＡをＤＭＳ１１４およびＤＭＳ５３に処理した結果を、非特異的なｓｉＲＮＡを処理した対照群と比較したとき、Ｌ１ＣＡＭの全体発現量と細胞の表面に存在するＬ１ＣＡＭの量が減少することを確認した（図５のパネルＡ）。
【００５７】
実施例６−２：Ｌ１ＣＡＭ発現抑制後の小細胞肺癌細胞の活性分析
Ｌ１ＣＡＭに対するｓｉＲＮＡを形質感染させた肺癌細胞と、非特異的なｓｉＲＮＡを形質感染させた肺癌細胞の増殖(proliferation)および移動(migration)の度合いを比較した。増殖の度合いはそれぞれ同数の細胞を計数して７２時間後の細胞をトリファンブルー(Tryphan Blue)溶液を用いて測定した。移動の度合いは、ＱＣＭ ２４−ｗｅｌｌ ｃｅｌｌ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）とＱＣＭ ２４−ｗｅｌｌ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を用いて分析した。その結果、ｓｉＲＮＡによってＬ１ＣＡＭの発現が減少した細胞群は、Ｌ１ＣＡＭが正常的に発現する細胞群に比べて移動（図５のパネルＢ）および増殖（図５のパネルＣ）の度合いが減少することを確認した。これはＬ１ＣＡＭが小細胞肺癌細胞の成長および移動に作用していることを示唆する。
【００５８】
実施例７：Ｌ１ＣＡＭ特異的抗体による小細胞肺癌細胞の成長抑制
Ｌ１ＣＡＭに対する抗体が小細胞肺癌細胞の成長を阻害するかを実験するために、Ａ１０−Ａ３抗体が結合するＤＭＳ５３（図６のパネルＡ）およびＤＭＳ１１４（図６のパネルＢ）を用いた。１ｍＬの培地内に１×１０４ｃｅｌｌずつ入れて２４ウェルプレートで培養し、Ａ１０−Ａ３、４−６３、ＵＪ１２７、または５Ｇ３抗体を１０μｇ／ｍＬの濃度で添加した後、細胞を３７℃のＣＯ２反応器で１０日間反応させた。２日間隔で、抗体を含有させた新鮮な培地で取り替えた。２日間隔で細胞を回収して０．２％のトリファンブルー溶液における生存細胞の数を数え、全体細胞中の生存細胞の数を求めた。その結果、Ａ１０−Ａ３抗体によってＤＭＳ１１４およびＤＭＳ５３細胞の成長が約３０％程度減少する結果を観察した。
【００５９】
Ｌ１ＣＡＭに特異的に結合するものと知られている４−６３抗体と公知の抗体ＵＪ１２７（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）および５Ｇ３（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）をＤＭＳ１１４細胞に処理したとき、４−６３抗体とＵＪ１２７抗体は前記癌細胞に結合して（図１のパネルＢおよびＤ）細胞の成長を約３０％阻害したが、５Ｇ３抗体の場合、ＤＭＳ１１４に結合したが（図１のパネルＣ）細胞の成長は阻害しないことを観察した（図６のパネルＣ）。この結果は、モノクローナル抗体が癌細胞に結合するとしても、必ずしも癌細胞の成長を阻害するのではないことを示唆する。図７のパネルＢからも分かるように、５Ｇ３抗体はＤＭＳ１１４細胞の浸潤作用を阻害しなかった。
【００６０】
実施例８：Ｌ１ＣＡＭ特異的抗体による小細胞肺癌細胞の浸潤および移動の抑制
インベイジョンアッセイ(Invasion assay)を行うために、ＣＨＥＭＩＣＯＮ社のＱＣＭ ２４−ｗｅｌｌ ｃｅｌｌ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔを使用した。インサート(insert)のＥＣＭ層を再水和するために、予め温め直した３００μＬの無血清培地（ＲＰＭＩ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）をインサートに入れ、常温で３０分間放置しておいた。Ｃｈｏｉ−ＣＫ、ＳＣＫ、ＳＫ−ＯＶ３、ＤＭＳ１１４およびＡＣＨＮをＰＢＳによって２回洗浄した後、３ｍＬのトリプシン−ＥＤＴＡを添加し、３７℃の培養器に入れた。インベイジョン培地（ＲＰＭＩ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．５％ＢＳＡ）から取り外した細胞を収去し、細胞数を１×１０５／２００μＬのインベイジョン培地に合わせた後、それぞれのインサートに細胞を仕込み、抗体Ａ１０−Ａ３、４−６３または公知の抗体５Ｇ３（１０μｇ／ｍＬ）と正常マウスＩｇＧ（１０μｇ／ｍＬ）を処理した。Ｌｏｗｅｒ ｃｈａｍｂｅｒに１０％のＦＢＳを入れたインベイジョン培地を仕込み、７２時間３７℃の培養器で培養した。培養が終わった後、インサートに残った細胞と培地を除去し、インサートを新規のウェルに移した。予め温め直した細胞分離溶液２２５μＬにインサートを乗せ、３７℃の培養器で３０分間培養した。残った細胞を完全に取り外すためにインサートを振とうし、細胞分離溶液と細胞混入溶液に７５μＬのＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ／Ｄｙｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎを仕込み、常温で１５分間放置した。２００μＬの溶液を９６ウェルに移して４８０ｎｍ／５２０ｎｍのｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅで読み取った。その結果、Ａ１０−Ａ３はＤＭＳ１１４およびＤＭＳ５３細胞の浸潤を約３０％抑制することが分かった（図７のパネルＡ）。４−６３、ＵＪ１２７抗体も２細胞の浸潤を約３０％抑制したが、公知の抗体５Ｇ３はＤＭＳ１１４の浸潤を阻害しなかった（図７のパネルＣ）。
【００６１】
マイグレーションアッセイ(Migration assay)の際には、ＱＣＭ ２４−ｗｅｌｌ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を用いて分析した。実験方法はインベイジョンアッセイと同様であった。その結果、Ａ１０−Ａ３がＤＭＳ１１４よびＤＭＳ５３の移動を約３０％抑制することが分かった（図７のパネルＢ）。４−６３、ＵＪ１２７抗体も２細胞の移動を約２０％抑制した（図７のパネルＤ）。
【００６２】
実施例９：Ａ１０−Ａ３抗体による小細胞肺癌細胞の信号伝達抑制
実施例９−１：ＥＲＫリン酸化の抑制
癌細胞の成長、移動および生存に関与するＥＲＫ(extracellular signal-regulated kinases)１／２リン酸化がＡ１０−Ａ３抗体によって減少するかをウエスタンブロットで検証するために、ＤＭＳ１１４およびＤＭＳ５３細胞にＡ１０−Ａ３抗体を１０μｇ／ｍＬでそれぞれ３０分、６０分、１２０分間それぞれ処理した後、細胞を収去して細胞溶解液に溶かした。ＢＣＡ(Bicinchoninic acid)のタンパク質検定キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてタンパク質の濃度を決定した後、４０μｇのタンパク質を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、ニトロセルロース膜に２５Ｖで９０分間ウエスタントランスファーした。膜を５％脱脂乳で一晩４℃でブロッキングし、Ｒａｂｂｉｔ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ ＥＲＫ１／２（Ａｂ Ｃａｍ、１：１０００）抗体と１％脱脂乳で一晩反応させた。リン酸化していないＥＲＫ１／２の発現を調査するためには、同量のタンパク質を前述と同様に処理し、ブロッキングしたニトロセルロース膜をａｎｔｉ−ＥＲＫ１／２（Ａｂ Ｃａｍ、１：１０００）抗体と１時間反応させた。抗−ウサギホースラディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、１：１００００）と１時間反応させ、ＰＢＳＴで洗浄した後、ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）でｐｈｏｓｐｈｏ ＥＲＫ１／２とＥＲＫ１／２を検出した。同一のＥＲＫ１／２が発現するＤＭＳ１１４、ＤＭＳ５３細胞で抗体Ａ１０−Ａ３を処理した細胞でのみｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫ１／２の量が著しく減少することを観察することができた（図８）。
【００６３】
実施例９−２：Ａ１０−Ａ３抗体によるＡＫＴリン酸化の抑制
癌細胞の生存に関与するＡｋｔリン酸化がＡ１０−Ａ３抗体によって減少するかをウエスタンブロットによって検証するために、ＤＭＳ１１４、ＤＭＳ５３細胞に１０μｇ／ｍＬの抗体Ａ１０−Ａ３ をそれぞれ３０分、６０分、１２０分間それぞれ処理した後、細胞を収去して細胞溶解液に溶かした。ＢＣＡ(bicinchoninic acid)タンパク質検定キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてタンパク質の濃度を決定した後、４０μｇのタンパク質を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、ニトロセルロース膜に２５Ｖで９０分間ウエスタントランスファーした。膜を５％脱脂乳で一晩４℃でブロッキングし、Ｒａｂｂｉｔ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ Ａｋｔ（Ａｂ ｃａｍ、１：１０００）抗体およびＲａｂｂｉｔ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉ−Ａｋｔ（Ａｂ ｃａｍ、１：１０００）と１％脱脂乳で一晩反応させ、ａｎｔｉ− ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ ＨＲＰ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、１：１００００）抗体と１時間反応させた。ＰＢＳＴで洗浄した後、ＥＣＬ(enhanced chemiluminescence reagent)（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）でｐｈｏｓｐｈｏ Ａｋｔと全体Ａｋｔを検出した。抗体Ａ１０−Ａ３を処理した細胞でｐｈｏｓｐｈｏ Ａｋｔの量が減少することを観察することができた（図８）。
【００６４】
実施例９−３：Ａ１０−Ａ３抗体によるＦＡＫ活性化の抑制
癌細胞の成長および移動に重要に作用するＦＡＫ(focal adhesion kinase)のリン酸化がＡ１０−Ａ３抗体によって減少するかをウエスタンブロットによって分析するために、ＤＭＳ１１４、ＤＭＳ５３細胞に抗体Ａ１０−Ａ３を３０分、６０分、１２０分間それぞれ処理した後、細胞を収去して細胞溶解液に溶かした。ＢＣＡタンパク質検定キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてタンパク質の濃度を決定した後、４０μｇのタンパク質を７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、ニトロセルロース膜に２５Ｖで９０分間ウエスタントランスファーした。膜を５％脱脂乳で一晩４℃でブロッキングし、ｒａｂｂｉｔ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ ＦＡＫ（Ａｂ ｃａｍ、１：１０００）抗体と１％脱脂乳で一晩反応させ、ａｎｔｉ−β ａｃｔｉｎ（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１：４０００）抗体と１時間反応させた。そして、抗−ウサギホースラディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、１：１００００）と１時間反応させ、ＰＢＳＴで洗浄した後、ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）でｐｈｏｓｐｈｏ ＦＡＫとβ−ａｃｔｉｎを検出した。抗体Ａ１０−Ａ３を処理したＤＭ１１４とＤＭＳ５３でｐｈｏｓｐｈｏ−ＦＡＫの量が著しく減少することを観察することができた（図８）。
【００６５】
実施例１０：Ｌ１ＣＡＭ特異的抗体の非小細胞肺癌細胞の成長抑制
実施例５に示すように非小細胞肺癌でもＬ１ＣＡＭが発現するため、Ｌ１ＣＡＭに対する抗体が非小細胞肺癌細胞の成長または移動を阻害するかを分析してみた。
【００６６】
実施例１０−１：Ｌ１ＣＡＭに対する抗体の非小細胞肺癌細胞の成長抑制効果
Ｌ１ＣＡＭに対する抗体が非小細胞肺癌細胞の成長を阻害するかを分析するために、Ａ１０−Ａ３抗体が結合するＡ５４９およびＮＣＩ−Ｈ５２２細胞を用いて、実施例７と同様にして細胞増殖抑制実験を行った。Ａ１０−Ａ３抗体を１０μｇ／ｍＬの濃度で細胞培養液に添加した後、２日間隔で抗体を含有させた新鮮な培地で取り替えた。２日間隔で細胞を回収して、０．２％トリファンブルー溶液で生きている細胞を計数し、全体細胞中に生きている細胞の細胞数を求めた。その結果、Ａ１０−Ａ３抗体によってＡ５４９、ＮＣＩ−Ｈ５２２細胞の成長が減少したが、その抑制効果はＡ１０−Ａ３抗体による他の癌細胞（例えば、胆管癌細胞または小細胞肺癌細胞）の成長抑制効果より低かった（図９のパネルＡ）。公知の抗体ＵＪ１２７を使用した結果もほぼ同一であった。
【００６７】
実施例１０−２：Ｌ１ＣＡＭに対する抗体の非小細胞肺癌細胞の移動抑制効果
実施例８と同様の方法によってＡ１０−Ａ３がＡ５４９、ＮＣＩ−Ｈ５２２細胞の移動を抑制するかを分析した結果、Ａ１０−Ａ３抗体はＡ５４９、ＮＣＩ−Ｈ５２２細胞の移動を著しく減少させた（図９のパネルＢ）。公知の抗体ＵＪ１２７を使用した結果もほぼ同一であった。この結果はＬ１ＣＡＭに対する抗体が非小細胞肺癌の転移を抑制することにより、非小細胞肺癌の治療効果を示すことができることを示唆する。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
上述したように、本発明者らは、Ｌ１ＣＡＭが周知とは異なり小細胞肺癌の進行に重要に作用することを明らかにした。よって、本発明の小細胞肺癌細胞表面のＬ１ＣＡＭタンパク質を認識しながら、小細胞肺癌の癌組織に特異的に結合する抗体または小細胞肺癌細胞のＬ１ＣＡＭの発現を抑制するｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｈＲＮＡ、これを含む薬学的組成物は、小細胞肺癌細胞の成長、浸潤および移動を阻害させるので、小さ細胞肺癌の治療に有用に利用できる。また、本発明では、非小細胞肺癌でもＬ１ＣＡＭが発現し、Ｌ１ＣＡＭに対する抗体が非小細胞肺癌の移動を減少させる作用を解明したので、非小細胞肺癌のＬ１ＣＡＭに特異的に結合してその活性を抑制させる抗体が、非小細胞肺癌の治療に有用に利用できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肺癌の細胞表面に存在するタンパク質であるＬ１ＣＡＭの活性または発現を抑制する物質を含む、肺癌の成長または転移を抑制する薬学的組成物、およびこれを用いた治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肺癌は、主に発癌物質によって誘発され、発生率が全世界的に増加している趨勢にある。現に、肺癌は、韓国における癌死亡の主な原因である。肺癌は、治療と関連しては、小細胞癌（ＳＣＬＣ）と非小細胞癌（ＮＳＣＬＣ）の２つに分類される。ＮＳＣＬＣはさらに腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌、腺扁平上皮癌などの組織型に分類される。このような相異なる種類の組織型によって、発病し易い部位、進行形式、速度および症状などの臨床的特徴が様々であり、治療方法もいろいろである(Brambilla et al., Eur Respir J. 18(6):1059-68, 2001)。
【０００３】
大部分の肺癌は化学療法と放射線療法によっては治療できない。化学療法および放射線療法は、腫瘍の大きさを縮小させることにより小細胞癌に適用できるが、これによっては癌の完全な治療を期待することができない。非小細胞肺癌は、小細胞肺癌に比べて抗癌剤の効果が少なくて化学療法のみでは治療が殆ど不可能なので、腫瘍を外科的に完全に除去することが唯一の効果的な治療法である。ところが、肺癌患者の３０％以下が診断の際に完全には切除し得ない腫瘍を有し、 それらの３分の１以下のみが外科的切除術以後５年間生存する。よって、肺癌の早期診断、癌拡散度のより正確な診断およびより効率的な治療を実現することが可能な方法が大きく求められる。
【０００４】
一方、Ｌ１ＣＡＭ(L1 cell adhesion molecule)は、細胞の表面上で細胞間接着(cell-to-cell adhesion)を仲介する免疫グロブリンスーパーファミリー細胞接着分子(immunoglobulin superfamily cell adhesion molecules、ＣＡＭｓ)に属する内在性膜糖タンパク質(integral membrane glycoprotein)の一つであって、その分子量が２２０ｋＤａにも達する。Ｌ１ＣＡＭは元々ニューロンなどから発見され(Bateman, et al, EMBO J. 15:6050-6059:1996)、ニューロンの移動、神経突起の成長および細胞移動などの機能を有する。Ｌ１ＣＡＭは元々脳から発見されるものと知られているが、腎臓小管でも発現し、最近では様々な癌細胞でも発見され始めている(Huszar, M. et al., Expression profile analysis in multiple human tumors identifies L1 (CD171) as a molecular marker for differential diagnosis and targeted therapy. Human Pathology 37, 1000-1008, 2006)。
【０００５】
Ｌ１ＣＡＭと癌との連関性は、Ｌ１ＣＡＭが黒色腫(melanoma)、神経芽細胞腫(neuroblastoma)、卵素癌および大腸癌などの様々な癌で発現することが報告された(Takeda, et al., J. Neurochem. 66:2338-2349, 1996; Thies et al, Eur. J. Cancer, 38:1708-1716, 2002; Arlt et al., Cancer Res. 66:936-943, 2006; Gavert et al., J. Cell Biol. 168:633-642, 2005)。膜結合型(membrane bound form)の他にも、切断された産物(cleavage product)が細胞外に分泌されることが発見された(Gutwein et al., FASEP J. 17(2):292-4, 2003)。そして、最近、癌細胞の成長に重要な役割を果たす分子の一つとして探索されることにより(Primiano, et al., Cancer Cell. 4(1):41-53 2003)、癌治療の新しいターゲットとして浮上した（ＵＳ２００４／０１１５２０６ Ａ１出願２００４．６．１７）。
【０００６】
肺癌、特に小細胞肺癌におけるＬ１ＣＡＭの発現については、Ｌ１ＣＡＭが小細胞肺癌組織に発現している事実は明らかになったが(Huszar, M. et al., Human Pathology 37, 1000-1008, 2006; Miyahara, R. et al., J. Surg. Oncol. 77,49-54, 2001)、Ｌ１ＣＡＭの発現は小細胞肺癌細胞の増殖と連関性がないものと報告された(Miyahara, R. et al., J. Surg. Oncol. 77,49-54, 2001)。非小細胞肺癌の場合、１０つの扁平上皮癌と５つの腺上皮癌に対してＬ１ＣＡＭの発現有無を試験したが、検出されなくて(Huszar, M. et al. Human Pathology 37, 1000-1008, 2006)、その発現事実は知られていない。よって、Ｌ１ＣＡＭが肺癌細胞の成長と転移に関連しているという事実は未だ知られておらず、しかもＬ１ＣＡＭに対する抗体が肺癌の増殖および転移を抑制することにより、治療剤として可能性があるという事実は未だ知られていない。
【０００７】
米国特許出願ＵＳ２００４／０１１５２０６号は、Ｌ１ＣＡＭに特異的に結合する抗体を用いて癌細胞の死滅を誘導する製剤、および細胞死滅のために前記抗体を使用する手段、およびＬ１ＣＡＭ抗体が含まれた薬学的組成物について開示しているとともに、癌細胞で細胞成長を阻害し細胞死を誘導することが可能な有効量の抗Ｌ１ＣＡＭ抗体を細胞に接触させることにより細胞の成長を抑制し細胞死滅を誘導することについて開示している。ところが、この文献も、Ｌ１ＣＡＭが発現する癌の例として乳癌、大腸癌および子宮頸癌についてのみ言及しており、肺癌との関連性については言及しておらず、抗Ｌ１ＣＡＭ抗体を癌細胞に接触させることにより細胞成長抑制および細胞死滅を誘導することについてのみ開示しており、癌細胞の移動、浸潤および転移を抑制し得ることについては開示していない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、癌の診断または治療に使用可能な抗体を開発するために努力したところ、最近確立された胆管癌細胞株(Kim et al, Genes, chromosome & Cancer 30:48-56, 2001)をマウスに免疫注射し、胆管癌の表面上でＬ１ＣＡＭに特異的に結合するモノクローナル抗体を得、これをＡ１０−Ａ３抗体と命名した。Ｌ１ＣＡＭが肺癌細胞でも発現するかを分析するために、Ａ１０−Ａ３抗体を用いて小細胞癌組織を免疫組織化学染色した結果、小細胞肺癌では約８５％（陽性４９／５８組織の数）、非小細胞肺癌では約１０％（陽性４／３７組織の数）のＬ１ＣＡＭ発現率を確認し、また、小細胞肺癌細胞株と非小細胞肺癌細胞株の表面でもＬ１ＣＡＭが発現することを確認した。これまでＬ１ＣＡＭの非小細胞 癌における発現事実は知られておらず、Ｌ１ＣＡＭが小細胞肺癌で細胞の増殖とは関係ないものと知られているので、本発明者らは、Ｌ１ＣＡＭが肺癌細胞の成長または転移に作用するかを分析するために、ｓｉＲＮＡを用いてＬ１ＣＡＭの発現を抑制させ、あるいはＡ１０−Ａ３抗体を用いてＬ１ＣＡＭの活性を抑制させた結果、肺癌細胞の増殖または移動が減少することを観察した。この結果はＬ１ＣＡＭが肺癌細胞の癌進行に重要に作用することを示唆する。
【０００９】
また、本発明者らは、Ａ１０−Ａ３抗体が小細胞肺癌細胞の成長または移動を抑制する効果を持つことを確認した。また、ヒト胚芽幹細胞をマウスに免疫注射して得たハイブリドーマ（ＫＣＴＣ１０９６６ＢＰ）が生産するモノクローナル抗体４−６３と公知のＬ１ＣＡＭに対する抗体ＵＪ１２７も癌細胞表面のＬ１ＣＡＭを認識し、小細胞肺癌の成長を抑制した。また、公知のＬ１ＣＡＭに対する抗体ＵＪ１２７も小細胞肺癌細胞に結合してその成長を抑制することを確認した。よって、Ｌ１ＣＡＭに対する抗体が肺癌の診断および治療、特に死亡率が高い肺癌の転移を早期に診断および治療して治療効果を高めることができることを見出すことにより、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の目的は、Ｌ１ＣＡＭの活性または発現を抑制する物質を含む、肺癌の成長または転移を抑制する薬学的組成物を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記薬学的組成物を用いて肺癌を治療する方法を提供することにある。
本発明の別の目的は、Ｌ１ＣＡＭの活性を抑制するＬ１ＣＡＭに対する抗体を提供することにある。
本発明の別の目的は、Ｌ１ＣＡＭの発現を抑制するオリゴヌクレオチドを提供することにある。
本発明の別の目的は、前記薬学的組成物を用いて肺癌細胞の成長または転移を抑制する方法を提供することにある。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１はマウスモノクローナル抗体Ａ１０−Ａ３（Ａ）と４−６３（Ｂ）、および公知の抗体５Ｇ３（Ｃ）とＵＪ１２７（Ｄ）が胆管癌および肺癌などの様々な癌細胞および正常細胞の表面に結合するか否かを蛍光細胞染色およびフローサイトメトリーによって分析した結果を示す図である。
【図２】図２はＡ１０−Ａ３抗体の結合する抗原がＬ１ＣＡＭタンパク質であることを免疫沈降とウエスタンブロット方法によって証明した結果を示す。Ａは胆管癌細胞Ｃｈｏｉ−ＣＫ細胞の表面をビオチン化させた後、抗体Ａ１０−Ａ３または公知の抗−Ｌ１ＣＡＭモノクローナル抗体ＵＪ１２７で免疫沈降させた後、沈降したタンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥとストレプトアビジン−ＨＲＰを用いたウエスタンブロットを行った結果である。Ｂは抗体Ａ１０−Ａ３で免疫沈降させたタンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで公知の抗−Ｌ１ＣＡＭ抗体ＵＪ１２７を用いたウエスタンブロットを行った結果、Ｌ１ＣＡＭが検出されることを確認したものであり、ここで、「Ｐｒｅｃｌｅａｒｉｎｇ」は抗体を入れずに免疫沈降させた陰性対照群、「ＩＰ ｗｉｔｈ Ａ１０−Ａ３」は抗体Ａ１０−Ａ３で免疫沈降させたもの、「ＩＰ ｗｉｔｈ ａｎｔｉ−Ｌ１ＣＡＭ」はＬ１ＣＡＭに対する公知のモノクローナル抗体で免疫沈降させたもの、「Ａ１０−Ａ３ ｏｎｌｙ」は抗体自体のみをＳＤＳ−ＰＡＧＥしたものをそれぞれ示す。Ｃは水溶性Ｌ１を発現させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞培養液を公知の抗体ＵＪ１２７と５Ｇ３、Ａ１０−Ａ３抗体および４−６３抗体を用いてウエスタンブロットした結果であり、ここで、「−」はＬ１発現ベクターを入れていない細胞培養液、「＋」は水溶性Ｌ１発現ベクターを入れて培養した細胞培養液をそれぞれ示す。
【図３】図３はＱ−ＴＯＦ分析した結果を示したものである。Ｃｈｏｉ−ＣＫ細胞でＡ１０−Ａ３抗体を用いて免疫沈降させたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離してトリプシンによって切断した後、Ｑ−ＴＯＦ分析によって、得たペプチドが Ｌ１ＣＡＭであることを確認した図であって、下側のアミノ酸配列は全長Ｌ１ＡＭを示し、上側のアミノ酸配列は全長Ｌ１ＣＡＭ配列の下線部分にそれぞれ相当する、分析されたペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図４】図４は肺癌患者組織をＡ１０−Ａ３（ＡおよびＣ）と４−６３（Ｂ）の抗体を用いて免疫組織化学染色した結果であって、正常肺組織には結合せず、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）と小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）の組織には結合することを示す写真である。
【図５】図５はＬ１ＣＡＭの発現抑制によって小細胞肺癌細胞の活性が減少することを示す。ＡはＤＭＳ１１４およびＤＭＳ５３にＬ１ＣＡＭに対するｓｉＲＮＡまたは非特異的なｓｉＲＮＡを形質感染させてから、７２時間経過の後、フローサイトメトリーによって分析した結果を示す。ＢおよびＣはＬ１ＣＡＭに対するｓｉＲＮＡを肺癌細胞に形質感染させた後、７２時間経過の後、細胞の移動または増殖を分析した結果をそれぞれ示す。
【図６】図６はＬ１ＣＡＭに対する抗体による小細胞肺癌細胞の成長阻害効果を示す。Ａは抗体Ａ１０−Ａ３によるＤＭＳ５３細胞の成長抑制効果を分析したもので、抗体の陰性対照群としては抗体を入れないか（ｍｏｃｋ）、あるいは抗体を沸かして不活性化させた抗体（ｂｏｉｌｅｄ Ａ１０−Ａ３）または正常マウスＩｇＧ（ｎｏｒｍａｌ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ）使用したものである。Ｂは抗体Ａ１０−Ａ３によるＤＭＳ１１４細胞の成長抑制効果を分析したものである。Ｃは抗体４−６３、公知の抗体ＵＪ１２７および５Ｇ３によるＤＭＳ１１４細胞の成長抑制効果を分析したもので、細胞成長の度合いを、抗体を入れていない対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて百分率で表現したものである。
【図７】図７は抗体による小細胞肺癌細胞の浸潤および移動が抑制される効果を分析したものである。ＡはＡ１０−Ａ３抗体によるＤＭＳ１１４、ＤＭＳ５３細胞の浸潤抑制効果を示し、ＢはＡ１０−Ａ３抗体によるＤＭＳ１１４、ＤＭＳ５３細胞の移動抑制効果を示し、ＣはＵＪ１２７、４−６３、５Ｇ３抗体によるＤＭＳ１１４、ＤＭＳ５３細胞の浸潤抑制効果を示し、ＤはＵＪ２７、４−６３、５Ｇ３抗体によるＤＭＳ１１４、ＤＭＳ５３細胞の移動抑制効果を示すもので、抗体の陰性対照群としては抗体を入れないか（ｃｏｎｔｒｏｌ）、あるいは正常マウスＩｇＧ（ｍＩｇＧ）を使用し、細胞の浸潤と移動の度合いを、抗体を入れていない対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）に対する百分率で表現したものである。
【図８】図８はＤＭＳ１１４、ＤＭＳ５３細胞の成長、移動および生存に関与する細胞信号伝達がＡ１０−Ａ３によって抑制されるかを分析した結果を示すもので、前記細胞培地に抗体を添加して３０分、６０分、１２０分培養した後、収去した細胞抽出物の量を取ってβ−ａｃｔｉｎに対する抗体を用いて確認し、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫ１／２、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＡＫＴ、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＦＡＫに対する抗体を用いてウエスタンブロットを行った写真である。
【図９】図９はＡ１０−Ａ３抗体による非小細胞肺癌細胞Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ５２２の成長（Ａ）および移動（Ｂ）抑制効果を示す図で、抗体の陰性対照群としては抗体を入れないか（ＰＢＳ）、あるいは正常マウスＩｇＧ（ｍＩｇＧ）を使用したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
一様態において、本発明は、Ｌ１ＣＡＭの活性または発現を抑制する物質を含む、小細胞肺癌の成長または転移を抑制する薬学的組成物に関する。
具体的な一様態において、本発明の薬学的組成物は、Ｌ１ＣＡＭの活性を抑制する物質を含むことができる。好ましくは、前記活性抑制物質は肺癌細胞表面抗原または分泌された表面抗原（Ｌ１ＣＡＭ）を特異的に認識する抗体である。このような抗体は、モノクローナル抗体およびこれらのキメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体を全て含み、新規の抗体以外に、当該技術分野における公知の抗体も含むことができる。さらに好ましくは、前記抗体は新規のＬ１ＣＡＭに対するモノクローナル抗体Ａ１０−Ａ３、４−６３、またはＬ１ＣＡＭに対する公知のモノクローナル抗体ＵＪ１２７、およびこれらのキメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体である。これらのＡ１０−Ａ３および４−６３抗体はそれぞれ受託番号ＫＣＴＣ１０９０９ＢＰおよびＫＣＴＣ１０９６６ＢＰによって分泌されて生産される。
【００１３】
前記抗体は、Ｌ１ＣＡＭを特異的に認識する結合の特性を持つ限りは、２つの重鎖と２つの軽鎖の全長を有する完全な形態だけでなく、抗体分子の機能的断片を含む。抗体分子の機能的断片とは、少なくとも抗原結合機能を保有している断片を意味し、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖなどがある。
【００１４】
別の様態において、前記薬学的組成物は、Ｌ１ＣＡＭの発現を抑制する物質を含むことができる。Ｌ１ＣＡＭを発現する癌細胞においてＬ１ＣＡＭの発現を抑制する物質を用いてＬ１ＣＡＭの発現を抑制させると、癌細胞の成長と転移の役割を果たすＬ１ＣＡＭの作用が減少して癌治療が可能である。好ましくは、前記Ｌ１ＣＡＭの発現を抑制する物質はｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびアンチセンスオリゴヌクレオチド(antisense oligonucleotide)よりなる群から選択され、さらに好ましくは５’−ＴＧＧＴＡＣＡＧＴＣＴＧＧＧｄｔｄｔ−３または５’−ＣＡＧＣＡＡＣＴＴＴＧＣＴＣＡＧＡＧＧｄｔｄｔ−３’の配列を含むｓｉＲＮＡである。
【００１５】
用語「ｓｉＲＮＡ」は、ＲＮＡ干渉または遺伝子サイレンシング(silencing)を媒介することが可能な約２０ヌクレオチドサイズの小さい核酸分子を意味し、「ｓｈＲＮＡ」は、ｓｉＲＮＡターゲット配列のセンスおよびアンチセンス配列が５〜９個の塩基よりなるループを挟んで位置した短いヘアピンＲＮＡ(short hairpin RNA)を意味する。最近、遺伝子水準でタンパク質の発現を調節するための方法として、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）現象を用いた方法が研究されている。 ｓｉＲＮＡは、一般に、相補的な配列を有するｍＲＮＡに特異的に結合してタンパク質発現を抑制することが明らかになっている。
【００１６】
本発明の組成物に含まれるｓｉＲＮＡを製造する方法には、ｓｉＲＮＡを直接化学的に合成する方法(Sui G et al., (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99:5515-5520)や、ｉｎｖｉｔｒｏ転写を用いたｓｉＲＮＡの合成法(Brummelkamp TR et al., (2002) Science296:550-553)などがあるが、これに限定されない。また、ｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡの高価の生合成費用や、低い細胞形質感染効率によるＲＮＡ干渉効果の短時間維持などの欠点を克服するためのもので、ＲＮＡ重合酵素IIIのプロモータからアデノウイルス、レンチウイルスおよびプラスミド発現ベクターシステムを用いてこれを細胞内に導入して発現させることができる。このようなｓｈＲＮＡは、細胞内に存在するｓｉＲＮＡプロセシング酵素(Dicer or Rnase III)によって、正確な構造を持つｓｉＲＮＡに転換され、目的遺伝子のサイレンシングを誘導することが広く知られている。
【００１７】
用語「アンチセンス」は、アンチセンスオリゴマーがワトソン・クリック塩基対の形成によってＲＮＡ内の標的配列と混成化されて、標的配列内における、典型的にｍＲＮＡとＲＮＡ：オリゴマーへテロ二本鎖の形成を許容する、ヌクレオチド塩基の配列およびサブユニット間のバックボーンを有するオリゴマーを指す。オリゴマーは、標的配列に対する正確な配列相補性または近似相補性を持つことができる。このアンチセンスオリゴマーは、ｍＲＮＡの翻訳を遮断または阻害し、ｍＲＮＡのスプライス変異体を生産するｍＲＮＡのプロセシング過程を変化させることができる。よって、本発明のアンチセンスオリゴマーは、Ｌ１ＣＡＭ遺伝子のｍＲＮＡに相補的なアンチセンスオリゴマーである。
【００１８】
好ましくは、本発明の組成物には、公知の治療剤を直接的または間接的に結合させるか、あるいは一緒に含ませることができる。抗体と結合可能な治療剤には放射性核種、薬剤、リンフォカイン、毒素または二重特異的抗体などが含まれる。ところが、本発明の組成物に含まれる治療剤は、これに限定されず、抗体と結合させることができるか、あるいは抗体、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドと共に投与して癌治療効果を得ることが可能な公知の治療剤であれば可能である。
【００１９】
前述した放射線核種には、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉおよび１８６Ｒｅなどがあり、これに限定されない。
【００２０】
前述した薬剤および毒素には、エトポシド、テニポシド、アドリアマイシン、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン類、シス−白金およびシス−白金同族体、ブレオマイシン類、エスペラマイシン類、５−フルオロウラシル、メルファラン、およびその他の窒素マスタードなどがあり、これに限定されない。
好ましくは、本発明の組成物は投与方式によって許容可能な担体を含むことができる。
【００２１】
投与方式に適した製剤は、当該分野に公知になっている。また、本発明の薬学的組成物は癌治療のために薬学的有効量で投与できる。典型的な投与量の水準は標準臨床的技術を用いて最適化することができる。
【００２２】
また、本発明は前記薬学的組成物を用いて肺癌を治療する方法に関する。
具体的に、本発明の治療方法は、薬学的組成物を薬学的有効量で人体内に投与することを含む。前記薬学的組成物は、非経口、皮下、腹腔内、肺内、および鼻腔内に投与でき、局部的免疫抑制治療のために、必要であれば病変内投与を含む適切な方法によって投与できる。非経口注入には筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内または皮下投与が含まれる。好ましい投与方式は静脈注射、皮下注射、皮内注射、筋肉注射および点滴注射である。
【００２３】
本発明の薬学的組成物を人体内に投与し、これに含まれたＬ１ＣＡＭに特異的な抗体を癌細胞の表面抗原Ｌ１ＣＡＭに結合させて癌細胞の増殖または転移を抑制させることにより、胆管癌を治療することができる。
【００２４】
また、本発明の薬学的組成物を人体内に投与し、抗体を分泌されたＬ１ＣＡＭと結合させて癌細胞の成長および転移を遮断させることにより、肺癌を治療することができるうえ、これを人体内に投与して癌細胞の表面抗原Ｌ１ＣＡＭに結合させて、これを認知する免疫細胞が肺癌細胞を捕食、自殺および殺害させることにより、小細胞肺癌を治療することができる。
【００２５】
また、本発明の薬学的組成物に含まれたＬ１ＣＡＭの発現抑制物質を用いてＬ１ＣＡＭの発現を抑制させると、肺癌細胞の成長および転移の役割を果たすＬ１ＣＡＭの作用が減少して肺癌治療が可能である。
【００２６】
別の様態において、本発明は、Ｌ１ＣＡＭの活性を抑制するＬ１ＣＡＭに対する抗体、またはＬ１ＣＡＭの発現を抑制するＬ１ＣＡＭに対するオリゴヌクレオチドに関する。
具体的な一様態において、前記抗体は、本発明に係る組成物で言及したように、Ｌ１ＣＡＭに特異的に結合する特性を持つ限りは、２つの重鎖と２つの軽鎖の全長を有する完全な形態だけでなく、抗体分子の機能的断片も含む。抗体分子の機能的断片とは、少なくとも抗原結合機能を保有している断片を意味し、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖなどがある。
【００２７】
好ましくは、前記抗体は、肺癌細胞の表面抗原または分泌された表面抗原（Ｌ１ＣＡＭ）を認識する抗体である。前記抗体は、肺癌細胞の表面タンパク質Ｌ１ＣＡＭと結合してその作用を抑制または中和(neutralization)させ、癌細胞と結合して癌細胞の成長および転移抑制を図り、癌細胞を捕食、自殺または殺害させることができることを特徴とする。
【００２８】
前述したＵＳ２００４／０１１５２０６に開示されているように、Ｌ１ＣＡＭの抗体はＬ１ＣＡＭの作用を必ずしも抑制するのではない。本発明の抗体は、Ｌ１ＣＡＭの作用を促進する抗体ではなく、Ｌ１ＣＡＭの活性を抑制する抗体であることを特徴とする。
さらに好ましくは、前記抗体は新規のモノクローナル抗体Ａ１０−Ａ３または４−６３である。
【００２９】
具体的な別の一様態において、本発明のＬ１ＣＡＭの発現を抑制するＬ１ＣＡＭに対するオリゴヌクレオチドは、本発明の組成物で言及されたＬ１ＣＡＭに対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドから選択される。
【００３０】
具体的な一実施例として、本発明者らは、胆管癌細胞を大量培養した後、マウスの足底に前記細胞を注入し、前記マウスのリンパ節(lymph node)からリンパ球を分離して骨髄腫(myeloma)癌細胞と細胞融合させることにより、胆管癌細胞に結合する抗体を生産するマウスハイブリドーマを製造した。
【００３１】
より具体的に、本発明者らは、胆管癌細胞ＳＣＫとＣｈｏｉ−ＣＫをマウスの足底に注射し、前記マウスのリンパ節からリンパ球を分離した。その後、前記リンパ球とＦＯ骨髄腫細胞株とを細胞融合させた後、抗体が発現するクローンを選別した。前記製造したクローンの中で、比較的安定的にモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ上澄み液の胆管癌と肺癌細胞に対する結合能を調査し、これらのモノクローナル抗体、およびモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマをハイブリドーマＡ１０−Ａ３と命名し、これを２００６年２月２０日付で韓国生命工学研究院の遺伝子銀行に寄託した（住宅番号：ＫＣＴＣ１０９０９ＢＰ）。また、ヒト胚芽幹細胞を注射して得た抗体のうち、Ｌ１ＣＡＭを認識する抗体４−６３を得て、この抗体も胆管癌と肺癌に結合することを確認し、これを２００６年７月１３日付で韓国生命工学研究院の遺伝子銀行に寄託した（受託番号：ＫＣＴＣ１０９６６ＢＰ）。前記モノクローナル抗体は、本発明に係る前記ハイブリドーマによって分泌され、胆管癌または肺癌の癌細胞表面タンパク質としてのＬ１ＣＡＭに特異的に結合した。具体的に、前記モノクローナル抗体が認識する癌細胞は、胆管癌、肺癌などの癌細胞株には結合するが（図１参照）、肝細胞、ＨＵＶＥＣ（ヒト由来の臍帯静脈内皮細胞）および抹消血液リンパ球(peripheral blood lymphocyte)などの正常細胞には結合せず（図１参照）、これらの抗体を使用したときに肺癌細胞の成長、移動または浸潤が抑制された。また、公知のＬ１ＣＡＭに対する抗体５Ｇ３は、肺癌細胞に結合するが、癌の成長を抑制することはできなかった（図５および図６参照）。別の公知の抗体ＵＪ１２７は肺癌細胞に結合してそれらの成長を抑制した。これにより、Ｌ１ＣＡＭの抗体が必ずしもＬ１ＣＡＭの作用を抑制するのではないことが分かった。
【００３２】
前述したように、これまではＬ１ＣＡＭが肺癌では発現するが、細胞の増殖とは関係ないものと知られているが、本発明者らは、Ｌ１ＣＡＭが肺癌で発現するだけでなく、肺癌細胞の成長、転移、増殖および移動に関連し、よってＬ１ＣＡＭが肺癌細胞の癌進行に重要に作用することを最初に確認した。
【００３３】
したがって、本発明に係るＬ１ＣＡＭに特異的な抗体、またはｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドなどのＬ１ＣＡＭの活性または発現を抑制する物質、およびこれらを含む薬学的組成物は、肺癌の診断および治療、特に死亡率の高い肺癌の転移を早期に診断および治療して治療効果を高めることができる。
以下、本発明を実施例によってさらに詳細に説明するが、下記実施例は本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容を限定するものではない。
【実施例】
【００３４】
実施例１：癌細胞の培養
癌細胞株は、全て１０％牛胎児血清（Ｇｉｂｃｏ社）を含有する次の培地を用いて、５％の二酸化炭素が維持される３７℃の恒温培養器で培養した。ＳＨ−Ｊ１(hepatocellular carcinoma)、ＳＣＫ(cholangiocarcinoma)、Ｃｈｏｉ−ＣＫ(cholangiocarcinoma)およびＡＣＨＮ(Renal cell adenocarcinoma)細胞はＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社）培地を用い、ＳＫ−ＯＶ３(ovary adenocarcinoma)細胞はＭｃＣｏｙ ５Ａ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ社）培地を用いた。Ａ５４９(non small cell lung carcinoma)はＨａｍ’ｓ Ｆ１２Ｋ培地で培養し、ＮＣＩ−Ｈ５２２(non small cell lung carcinoma)、ＤＭＳ１１４(small cell lung carcinoma)、ＤＭＳ５３(small cell lung carcinoma)、ＮＣＩ−Ｈ６９(small cell lung carcinoma)はＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。ＳＨ−Ｊ１、ＳＣＫおよびＣｈｏｉ−ＣＫ細胞株はキムデゴン博士（全北大学校医科大学）から得た。その外の癌細胞株はＡＴＣＣから購入した。
【００３５】
正常細胞である肝細胞(hepatocyte)はＣａｍｂｒａｘ社から購入し、ＨＵＶＥＣ細胞もＣａｍｂｒａｘ社から購入した後、１０％の牛胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を含有するＥＧＭ−２（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）培地を用いて、５％の二酸化炭素が維持される３７℃の恒温培養器で培養した。 抹消血液リンパ球（ＰＢＬ）は、ヒトの血液からフィコール密度勾配で遠心分離により分離した後で収得した。
【００３６】
実施例２：モノクローナル抗体Ａ１０−Ａ３の製造
培養した癌細胞Ｃｈｏｉ−ＣＫとＳＣＫを細胞分離緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて取り外し、約５×１０５の細胞を３０μＬのＰＢＳに浮遊させた後、細胞をＢａｌｂ／ｃマウスの右足底にＣｈｏｉ−ＣＫを注射し、３日後に左足底にはＳＣＫを注射した。これを３〜４日の間隔で６回反復投与し、細胞融合１日の前にさらに注射した。リンパ節細胞と融合させるＦＯ骨髄腫細胞株（ＡＴＣＣ、ＵＳＡ）は、１０％の牛胎児血清を含有したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社）培地で２週前から培養して準備した。
【００３７】
癌細胞Ｃｈｏｉ−ＣＫとＳＣＫで免疫させたマウスの膝窩リンパ節をそれぞれ取り出してＤＭＥＭ（ Ｇｉｂｃｏ社）培地でよく洗浄し、培養皿でよく粉砕して細胞浮遊物を１５ｍＬのチューブに移した。ＦＯ骨髄腫細胞を遠心分離して収去し、１０ｍＬのＤＭＥＭ培地に懸濁して前記リンパ節の細胞と共に細胞数を計数した。その後、１０６個の骨髄腫細胞（ＦＯ）と１０７個のリンパ節細胞を５０ｍＬのチューブに移して混ぜた後、２００×ｇで５分間遠心分離して上澄み液を除去し、しかる後に、３７℃の水が充填されたビーカーに２分間放置した。チューブを軽く叩いて細胞を柔らかくし、３７℃の水に漬浸した状態でゆっくり振とうしながら、１ｍＬのＰＥＧ溶液（Ｇｉｂｃｏ社）を１分間徐々に添加した。１００×ｇで２分間遠心分離し、５ｍＬのＤＭＥＭ培地を３分にわたって徐々に添加し、さらに５ｍＬのＤＭＥＭ培地を２分間ゆっくり添加した後、２００×ｇで遠心分離して細胞を回収した。そして、細胞融合効率および生存率を高めるために、ハイブリドーマクローニング因子(Hybridoma Cloning Factor)（ＢｉｏＶｅｒｉｓ社、ＵＳＡ）を予め１０％で正常培地（ＤＭＥＭ＋２０％の牛胎児血清）で混ぜておいた。回収した細胞を、ハイブリドーマクローニング因子を混ぜた３０ｍＬの正常培地（ＤＭＥＭ＋２０％の牛胎児血清）に丁寧に懸濁した。３７℃のＣＯ２培養器で３０分間放置した後、９６ウェルプレートにウェル当り７０μＬずつ１０５個の細胞となるように分注して３７℃のＣＯ２培養器で培養した。翌日７０μＬのＨＡＴを加え、３日間隔でＨＡＴ培地で２週以上成長させながら、成長するコロニーを観察した。このようにＣｈｏｉ−ＣＫ細胞を免疫注射したリンパ節と、ＳＣＫ細胞を免疫注射したリンパ節から分離したリンパ球を骨髄腫細胞と融合させて得たハイブリドーマコロニーの上澄み液を用いて次の実験を行った。
【００３８】
抗体が発現するクローンを選別するために、サンドイッチＥＬＩＳＡ(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)法を使用した。抗マウスＩｇＧまたはＩｇＭ抗体を、２μｇ／ｍＬでコートしたプレートにハイブリドーマ培養液１００μＬを添加して３７℃で１時間反応させ、さらに抗マウスＩｇＧまたはＩｇＭのＨＲＰ（horseradish peroxidase、Ｓｉｇｍａ社）の１／５０００希釈液と１時間さらに反応させた。０．０５％のツイン２０を添加したリン酸緩衝液によって培養容器を洗浄し、ＯＰＤ（Ｓｉｇｍａ社）および過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の含まれた基質溶液を添加し、波長４９２ｎｍの吸光分析器で吸光度を測定して抗体を生産するクローンを選別した。
【００３９】
これらの製造したクローンの中で、比較的安定的に抗体を分泌するハイブリドーマ上澄み液のＳＣＫおよびＣｈｏｉ−ＣＫ細胞に対する結合能を調査した。具体的に、培養されたＣｈｏｉ−ＣＫ細胞を細胞分離緩衝液（Ｇｉｂｃｏ）を用いて２０分間３７℃で処理して単一細胞に分離した後、４０μｍのストレーナーを通過させて５×１０５細胞をフローサイトメトリーに使用した。まず、単一細胞化されたＳＣＫおよびＣｈｏｉ−ＣＫ細胞をＰＢＡ（１％のＢＳＡをＰＢＳに溶解）に浮遊させ、抗体上澄み液を４℃で３０分間反応させた。４℃で１２００ｒｐｍにて５分間遠心分離して上澄み液１００μＬを除去し、ここに抗マウスＩｇ−ＦＩＴＣ（ＢＤ）を２００倍希釈させて４℃で３０分間反応させた後、ＰＢＡで２回洗浄し、ヨウ化プロピジウム（Propoidium Iodide、ＰＩ）陰性の細胞のみを選んでフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ ｃａｌｉｂｅｒ）によってＳＣＫおよびＣｈｏｉ−ＣＫ細胞に対する結合能を分析した。
【００４０】
その結果、ＳＣＫおよびＣｈｏｉ−ＣＫに結合する抗体を分泌する様々なハイブリドーマを選別し、持続的な継代培養によって安定化を維持させた後、サブクローニングした。前記サブクローニングによって確実に安定性を維持させたＳＣＫおよびＣｈｏｉ−ＣＫ細胞に対する特異性を維持した抗体Ａ１０−Ａ３を分泌するハイブリドーマを選別した。
【００４１】
前記モノクローナル抗体Ａ１０−Ａ３を分泌するハイブリドーマをハイブリドーマＡ１０−Ａ３（受託番号：ＫＣＴＣ１０９０９ＢＰ）と命名し、これらを２００６年２月２０日付でＫＣＴＣ（Korean Collection for Type Cultures、韓国大田市儒城区魚隠洞５２番地に所在する韓国生命工学研究院）に寄託した。
【００４２】
実施例３：モノクローナル抗体Ａ１０−Ａ３が認識する抗原の分離および同定
実施例３−１：抗原の分離
モノクローナル抗体Ａ１０−Ａ３が認識する細胞表面認識因子を分離するために、まず、培養したＣｈｏｉ−ＣＫ細胞をＰＢＳ緩衝溶液で洗浄し、ＥＺ−Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）でビオチン化させた後、細胞を溶解溶液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、２μｇ／ｍＬのアポロチニン、１００μｇ／ｍＬのフェニルメチルスルホニルフッ化物、５μｇ／ｍＬのロイペプチン）で２０分間４℃で反応させた後、細胞残骸(debris)を除去するために遠心分離を行った。上澄み液のみを回収してＢＣＡ(bicinchoninic acid)タンパク質検定キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてタンパク質の濃度を決定した。
【００４３】
タンパク質Ｇプラス−セファロース（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）に非特異的に結合するタンパク質は、細胞溶解液を２０μＬのタンパク質Ｇプラス−セファロースと４℃で２時間反応させた後、遠心分離して上澄み液のみを回収して準備し、回収した上澄み液はさらに約１μｇの抗体と４℃で１２時間反応させた。ここに２０μＬのタンパク質Ｇプラス−セファロースを添加して４℃で２時間反応させた後、遠心分離して沈殿物を回収した。回収した沈殿物を細胞溶解液で１０回以上洗浄し、残っているタンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。
【００４４】
このタンパク質をニトロセルロース膜に移してウエスタンブロットを行った。ニトロセルロース膜を５％脱脂油含有のＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．１％のＴｗｅｅｎ２０）緩衝溶液で１時間反応させてから、前記ＰＢＳＴ緩衝溶液で２回以上洗浄した。前記反応されたニトロセルロース膜を、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）コンジュゲート（１：１５００、Ａｍｅｒｓｈａｍｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加して１時間反応させた。前記ＰＢＳＴ緩衝溶液で５回洗浄した後、ビオチン化タンパク質をＥＣＬ検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で発色させた。
【００４５】
その結果、約２００ｋＤａサイズのタンパク質にＡ１０−Ａ３抗体が結合することを確認した（図２のパネルＡ）。抗体Ａ１０−Ａ３によって免疫沈降するタンパク質を集めるために、１×１０８のＣｈｏｉ−ＣＫ細胞から得た細胞溶解液を前述の方法で免疫沈降させた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離した。このゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｇ２５０（Ｂｉｏｒａｄ）で染色した。
【００４６】
実施例３−２：質量分析（Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）による抗原の同定
Ａ１０−Ａ３によって免疫沈降したタンパク質を含むＳＤＳゲルを、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｇ２５０（ＢＩＯ−ＲＡＤ）で供給者のプロトコール通りに染色した。タンパク質含有部分を切り出し、３０％のメタノールで５分間洗浄した後、細かく粉砕した。ゲル切片を３０％のメタノールによって染色が完全に脱色するまで反応させてから、１００％のアセトニトリルによって１０分間水分を除去し、３０分間真空遠心分離器によって乾燥させた。乾燥したゲル切片は５０ｍＭの重炭酸アンモニウム溶液で３００ｎｇのトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）と１６時間３７℃で反応させた。切断されたペプチドは３回１００μＬの５０ｍＭ重炭酸アンモニウムで抽出し、真空遠心分離器で乾燥させた。ペプチド混合物は、Ｑ−ＴＯＦ ｍｉｃｒｏ（ＭｉｃｒｏＭａｓｓ）でＥＳＩ Ｑ−ＴＯＦ ＭＳ／ＭＳ(electrospray quadrupole time of flight tandem mass spectrometry)によって分析した。その結果、このタンパク質がＬ１ＣＡＭ(L1 Cell Adhesion molecule)であることを確認した（図３）。図３における下線部分は、実際アミノ酸配列がＱ−ＴＯＦで解明されたことを表示する。よって、実際Ｌ１ＣＡＭに対する抗モノクローナル抗体ＵＪ２７．１１をＣｈｅｍｉｃｏｎ（ＵＳＡ）社から購入してビオチン標識付きＣｈｏｉ−ＣＫ細胞溶解液を用いて実施例４−１のように免疫沈降させ、ＥＣＬで確認した。図２のパネルＡに示すように、Ａ１０−Ａ３と抗−Ｌ１ＣＡＭ抗体が約２００ｋＤａの同一位置にタンパク質を免疫沈降させることが分かる。
【００４７】
実施例３−３：ウエスタンブロットによるＬ１ＣＡＭ抗原の確認
Ａ１０−Ａ３抗体が本当にＬ１ＣＡＭを認識するかを再確認するために、Ｃｈｏｉ−ＣＫの細胞溶解液を用いてこの抗体でまず免疫沈降を行った。タンパク質Ｇプラス−セファロース（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）に非特異的に結合するタンパク質は、細胞溶解液を２０μＬのタンパク質Ｇプラス−セファロースと４℃で２時間反応させた後、遠心分離して上澄み液のみを回収して準備し（図２のｐｒｅｃｌｅａｒｉｎｇ）、回収した上澄み液はさらに約１μｇの抗体と４℃で１２時間反応させた。ここに２０μＬのタンパク質Ｇプラス−セファロースを添加して４℃で２時間反応させた後、遠心分離して沈殿物を回収した。回収した沈殿物を細胞溶解液で１０回以上洗浄し、残っているタンパク質を１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで２−メルカプトエタノールなしに分離した。
【００４８】
このタンパク質をニトロセルロース膜に移してウエスタンブロットを行った。ニトロセルロース膜を５％脱脂乳含有のＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）緩衝溶液で１時間反応させてから、前記ＰＢＳＴ緩衝溶液で２回以上洗浄した。前記反応されたニトロセルロース膜を、公知の抗−Ｌ１ＣＡＭ抗体ＵＪ１２７（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を１次抗体として添加して１時間反応させた。前記ＰＢＳＴ緩衝溶液で５回洗浄した後、抗−マウスＩｇＧのホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート（１：５０００、Ｓｉｇｍａ）で１時間反応させた。さらにＰＢＳＴ緩衝溶液で５回洗浄した後、ＥＣＬ検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で発色させた。その結果、Ａ１０−Ａ３によって免疫沈降した約２００ｋＤａサイズのタンパク質にＬ１ＣＡＭ抗体が結合することを確認した（図２のパネルＢ）。これはさらにＡ１０−Ａ３抗体がＬ１ＣＡＭを認識することを示す。
【００４９】
実施例３−４：水溶性Ｌ１ＣＡＭの発現
水溶性Ｌ１ＣＡＭを発現させるための発現ベクターを製作するために、培養された癌細胞Ｃｈｏｉ−ＣＫからＲＮＡ抽出キット（Ｒｏｃｈｅ ｃｏ．）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを分離した。分離されたｔｏｔａｌ ＲＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲキット（Ｒｏｃｈｅ ｃｏ．）を用いて、２つの両末端プライマーＩｇ−ｄｏｍ−Ｆ（５’−ｇＡｇ ｇＡｇ ｇＡＡ ＴＴＣ Ｃｇｇ ＣｇＣ Ｃｇｇ ｇＡＡ ＡｇＡ Ｔｇｇ ＴＣｇ Ｔｇｇ Ｃｇ−３’、３８ｍｅｒ）とＬ１−Ｆｎ−Ｓｔｏｐ−Ｒ（５’−ＣＴＣ ＴＡｇ ＡｇＴ ＴＣＴ ＣｇＡ ｇＴＣ ＡｇＡ ｇＣＣ ＴＣＡ ＣｇＣ ｇｇＣ Ｃ−３’、３４ｍｅｒ）とｐｆｕ重合酵素（Ｓｏｌｇｅｎｔ ｃｏ．）を用いて９５℃で５分間前処理反応させた後、９５℃、３０秒／５８℃、３０秒／７２℃、２分間２５回連鎖重合反応を行い、７２℃で１０分間重合反応を行って増幅した。
【００５０】
増幅された水溶性Ｌ１ ＤＮＡ断片をｐＪＫ−ｄｈｆｒ２発現ベクター（Ａｐｒｏｇｅｎ）に挿入するために、ベクターと増幅されたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩとＸｈｏＩ酵素でそれぞれ切断し、１％アガロースゲルに電気泳動して当該断片を切り取った後、Ｇｅｌ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｉｎｔｒｏｎ ｃｏ．）を用いて回収した。回収された２つのＤＮＡ断片をＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｒｏｃｈｅ ｃｏ．）を用いて１６℃で３０分間反応させることにより、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α）にヒートショック(heat shock)法によって形質転換させた。形質転換された細胞からプラスミドＤＮＡを分離して塩基配列を分析することにより、水溶性Ｌ１ＣＡＭのｃＤＮＡがクローニングされていることを確認した。製造された発現ベクターはｐＪＫ−ｄｈｆｒ２−Ｌ１−ｍｏｎｏｍｅｒと命名した。
【００５１】
水溶性Ｌ１ＣＡＭを発現させるために、ｐＪＫ−ｄｈｆｒ２−Ｌ１−ｍｏｎｏｍｅｒ ＤＮＡをＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１１２６８、以下「２９３Ｔ」という）に形質転換してＬ１−ｍｏｎｏｍｅｒを発現させた。５００μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）にリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏ．）と前記発現ベクター１０μｇをそれぞれ混入して５分間常温で反応させる。２つの反応液を合わせた後、１５分間常温でさらに反応させる。２つの反応液を常温で反応させる間、２９３Ｔ細胞をＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ７．４）で丁寧に洗浄して除去し、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地を入れた後、さらに除去する。リポフェクタミン２０００とＤＮＡとを反応させた溶液にＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地４ｍＬを入れて攪拌した後、これを２９３Ｔ細胞のある培養容器に注意深く仕込み、５％の二酸化炭素が維持される３７℃の恒温培養器で培養した。６時間の培養後、５ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地をさらに添加し、３日間培養した。
【００５２】
実施例３−５：抗体の水溶性Ｌ１ＣＡＭに対する結合特異性の確認
２９３Ｔ細胞で水溶性Ｌ１ＣＡＭを発現させた細胞培養液と、水溶性Ｌ１ＣＡＭを発現させていない細胞培養液に対して１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥとウエスタンブロットを行った。ニトロセルロース膜を５％脱脂乳含有のＴＢＳＴ（ＴＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）緩衝溶液を用いて４℃で１２時間反応させてから、前記ＴＢＳＴ緩衝溶液で２回以上洗浄した。公知の抗−Ｌ１ＣＡＭ抗体ＵＪ１２７（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）および５Ｇ３（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と前記Ａ１０−Ａ３および４−６３抗体を、５％脱脂乳含有のＴＢＳＴ緩衝溶液に１：１００００で希釈された１次抗体と１時間反応させた。前記ＴＢＳＴ緩衝溶液で５回洗浄した後、抗マウスＩｇＧのホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート（１：５０００、Ｓｉｇｍａ）で１時間反応させた。さらにＴＢＳＴ緩衝溶液で５回洗浄した後、ＥＣＬ検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で発色させた。その結果、前記各抗体は約２００ｋＤａサイズの水溶性Ｌ１ＣＡＭに結合することを確認した（図２のパネルＣ）。また、前記Ｌ１発現細胞培養液に対して前記抗体を用いてＥＬＩＳＡを行った結果、各抗体は発現した水溶性Ｌ１ＣＡＭに対する結合特異性があることを確認した。
【００５３】
実施例４：Ｌ１ＣＡＭの肺癌細胞株表面における発現分析
Ａ１０−Ａ３ハイブリドーマ細胞株を無血清培地（ＰＦＨＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で培養した後、培養液からタンパク質Ｇ−セファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スウェーデン）を用いて精製した(Fike et al., Focus 12:79, 1990)。精製されたＡ１０−Ａ３抗体の様々な癌細胞に対する結合能を蛍光細胞染色によって実施例２と同様の方法で調査した（図１）。図１において、実線部分はモノクローナル抗体Ａ１０−Ａ３、４−６３、およびＬ１ＣＡＭに対する公知の抗体５Ｇ３（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＵＳＡ）とＵＪ１２７（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）であり、陰影部分は２次抗体のみを含んだものである。様々な癌細胞に対するＡ１０−Ａ３、４−６３、５ＧおよびＵＪ１２７の結合能力を測定するために、フローサイトメトリーを用いた。その結果、前記モノクローナル抗体が肺癌細胞ＮＣＩ−Ｈ５２２、Ａ５４９、ＤＭＳ１１４、ＤＭＳ５３およびＮＣＩ−Ｈ６９に結合することを観察することができた（図１のパネルＡ、Ｂ、ＣおよびＤ）。ところが、癌細胞のＡＣＨＮと、正常細胞の肝細胞、ＨＵＶＥＣおよび抹消血液リンパ球（ＰＢＬ）とは結合しない結果を示した。
【００５４】
実施例５：肺癌組織におけるＬ１ＣＡＭ発現の分析
免疫組織化学染色のために、それぞれの癌腫から厚さ３μｍの切片を準備した。この切片を、それぞれポリ−Ｌ−リジンを塗布したスライドに接着させた。まず、６０℃のオーブンで３時間乾燥させた後、キシレンによって室温で５分間３回脱パラフィン化させた。１００％、９０％、８０％および７０％のアルコールでそれぞれ１分間処理し、抗原性回復のためにｔａｒｇｅｔ ｒｅｔｒｉｅｖａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＤＡＫＯ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）にスライドを浸漬した後、圧力釜を用いて４分間沸かしたＴＢＳＴ緩衝溶液（Ｔｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ−Ｔｗｅｅｎ２０）で水洗した。高感度の免疫組織化学染色のために、Ｂｉｏｔｉｎ−ｆｒｅｅ Ｔｙｒａｍｉｄｅ Ｓｉｇｎａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＳｙｓｔｅｍであるＣＳＡIIｋｉｔ（ＤＡＫＯ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）を用いた。非特異抗原を除去するために、３％の過酸化水素に５分間反応させた後、緩衝溶液で５分間２回洗浄し、非特異タンパクの結合を除去するために、十分な無血清タンパク質ブロック(serum-free protein block)で５分間反応させた。１次抗体（Ａ１０−Ａ３、４−６３、１：５０希釈）を塗布して１５分間反応させ、抗マウス免疫グロブリン−ＨＲＰに１５分間処理した。その後、増幅剤に１５分間放置した後、抗−フルオレセイン−ＨＲＰに１５分間反応させた。ＤＡＢを用いて５分間発色させた後、Ｍｅｙｅｒ’ｓ ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎで対照染色を行った。それぞれの段階が終わると、ＴＢＳＴ緩衝溶液で５分間２回洗浄した。陰性対照群は、染色の際に１次抗体を除外して正常羊血清を添加し、あるいは１次抗体の代わりに正常マウスＩｇＧ１血清を添加し、残りの全ての過程は同様にした。
【００５５】
その結果、Ａ１０−Ａ３および４−６３抗体は、正常組織には結合せず、非小細胞肺癌の大部分を占める偏平上皮癌(squamous cell carcinoma)、腺状皮癌(adenocarcinoma)および小細胞肺癌の組織によく結合することが分かった（図４のパネルＡおよびＢ）。Ｌ１ＣＡＭの発現率は、小細胞肺癌患者の８５％（陽性４９／５８組織数）、非小細胞肺癌患者の約１０％（陽性４／３９組織数）であった。図４のパネルＣに示すように、小細胞肺癌の右部分のように高分化型(well-differentiated)ＳＣＬＣに比べて右部分の低分化型(poorly-differentiated)ＳＣＬＣでＡ１０−Ａ３抗体が良く結合した。これはＬ１ＣＡＭがＳＣＬＣの進行過程で発現することを示唆する。よって、Ｌ１ＣＡＭに対する抗体が小細胞肺癌の進行を遮断することにより、小細胞肺癌の効果的な治療剤になれることを示唆する。このため、本発明では、Ｌ１ＣＡＭの発現を抑制させるｓｉＲＮＡが小細胞肺癌細胞の増殖または移動を減少させるかを分析した。
【００５６】
実施例６：Ｌ１ＣＡＭに対するｓｉＲＮＡの肺癌細胞阻害効果
実施例６−１：小細胞肺癌細胞におけるｓｉＲＮＡを用いたＬ１ＣＡＭの発現抑制
Ｌ１ＣＡＭを細胞の表面で発現する小細胞肺癌細胞ＤＭＳ１１４およびＤＭＳ５３でＬ１ＣＡＭの発現をノックダウンさせるために、Ｌ１ＣＡＭに対するｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド（５’−ＴＧＧＴＡＣＡＧＴＣＴＧＧＧｄｔｄｔ−３’および５’−ＣＡＧＣＡＡＣＴＴＴＧＣＴＣＡＧＡＧＧｄｔｄｔ−３’）および非特異的なオリゴヌクレオチド（５’−ＣＡＧＴＣＧＣＧＴＴＴＧＣＧＡＣＴＧＧｄｔｄｔ−３’）をそれぞれ形質感染させた後、７２時間培養した。Ｌ１ＣＡＭのノックダウンはＡ１０−Ａ３を用いたフローサイトメトリー、ＲＴ−ＰＣＲおよびウエスタンブロットによって確認した。Ｌ１ＣＡＭに対するｓｉＲＮＡをＤＭＳ１１４およびＤＭＳ５３に処理した結果を、非特異的なｓｉＲＮＡを処理した対照群と比較したとき、Ｌ１ＣＡＭの全体発現量と細胞の表面に存在するＬ１ＣＡＭの量が減少することを確認した（図５のパネルＡ）。
【００５７】
実施例６−２：Ｌ１ＣＡＭ発現抑制後の小細胞肺癌細胞の活性分析
Ｌ１ＣＡＭに対するｓｉＲＮＡを形質感染させた肺癌細胞と、非特異的なｓｉＲＮＡを形質感染させた肺癌細胞の増殖(proliferation)および移動(migration)の度合いを比較した。増殖の度合いはそれぞれ同数の細胞を計数して７２時間後の細胞をトリファンブルー(Tryphan Blue)溶液を用いて測定した。移動の度合いは、ＱＣＭ ２４−ｗｅｌｌ ｃｅｌｌ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）とＱＣＭ ２４−ｗｅｌｌ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を用いて分析した。その結果、ｓｉＲＮＡによってＬ１ＣＡＭの発現が減少した細胞群は、Ｌ１ＣＡＭが正常的に発現する細胞群に比べて移動（図５のパネルＢ）および増殖（図５のパネルＣ）の度合いが減少することを確認した。これはＬ１ＣＡＭが小細胞肺癌細胞の成長および移動に作用していることを示唆する。
【００５８】
実施例７：Ｌ１ＣＡＭ特異的抗体による小細胞肺癌細胞の成長抑制
Ｌ１ＣＡＭに対する抗体が小細胞肺癌細胞の成長を阻害するかを実験するために、Ａ１０−Ａ３抗体が結合するＤＭＳ５３（図６のパネルＡ）およびＤＭＳ１１４（図６のパネルＢ）を用いた。１ｍＬの培地内に１×１０４ｃｅｌｌずつ入れて２４ウェルプレートで培養し、Ａ１０−Ａ３、４−６３、ＵＪ１２７、または５Ｇ３抗体を１０μｇ／ｍＬの濃度で添加した後、細胞を３７℃のＣＯ２反応器で１０日間反応させた。２日間隔で、抗体を含有させた新鮮な培地で取り替えた。２日間隔で細胞を回収して０．２％のトリファンブルー溶液における生存細胞の数を数え、全体細胞中の生存細胞の数を求めた。その結果、Ａ１０−Ａ３抗体によってＤＭＳ１１４およびＤＭＳ５３細胞の成長が約３０％程度減少する結果を観察した。
【００５９】
Ｌ１ＣＡＭに特異的に結合するものと知られている４−６３抗体と公知の抗体ＵＪ１２７（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）および５Ｇ３（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）をＤＭＳ１１４細胞に処理したとき、４−６３抗体とＵＪ１２７抗体は前記癌細胞に結合して（図１のパネルＢおよびＤ）細胞の成長を約３０％阻害したが、５Ｇ３抗体の場合、ＤＭＳ１１４に結合したが（図１のパネルＣ）細胞の成長は阻害しないことを観察した（図６のパネルＣ）。この結果は、モノクローナル抗体が癌細胞に結合するとしても、必ずしも癌細胞の成長を阻害するのではないことを示唆する。図７のパネルＢからも分かるように、５Ｇ３抗体はＤＭＳ１１４細胞の浸潤作用を阻害しなかった。
【００６０】
実施例８：Ｌ１ＣＡＭ特異的抗体による小細胞肺癌細胞の浸潤および移動の抑制
インベイジョンアッセイ(Invasion assay)を行うために、ＣＨＥＭＩＣＯＮ社のＱＣＭ ２４−ｗｅｌｌ ｃｅｌｌ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔを使用した。インサート(insert)のＥＣＭ層を再水和するために、予め温め直した３００μＬの無血清培地（ＲＰＭＩ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）をインサートに入れ、常温で３０分間放置しておいた。Ｃｈｏｉ−ＣＫ、ＳＣＫ、ＳＫ−ＯＶ３、ＤＭＳ１１４およびＡＣＨＮをＰＢＳによって２回洗浄した後、３ｍＬのトリプシン−ＥＤＴＡを添加し、３７℃の培養器に入れた。インベイジョン培地（ＲＰＭＩ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．５％ＢＳＡ）から取り外した細胞を収去し、細胞数を１×１０５／２００μＬのインベイジョン培地に合わせた後、それぞれのインサートに細胞を仕込み、抗体Ａ１０−Ａ３、４−６３または公知の抗体５Ｇ３（１０μｇ／ｍＬ）と正常マウスＩｇＧ（１０μｇ／ｍＬ）を処理した。Ｌｏｗｅｒ ｃｈａｍｂｅｒに１０％のＦＢＳを入れたインベイジョン培地を仕込み、７２時間３７℃の培養器で培養した。培養が終わった後、インサートに残った細胞と培地を除去し、インサートを新規のウェルに移した。予め温め直した細胞分離溶液２２５μＬにインサートを乗せ、３７℃の培養器で３０分間培養した。残った細胞を完全に取り外すためにインサートを振とうし、細胞分離溶液と細胞混入溶液に７５μＬのＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ／Ｄｙｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎを仕込み、常温で１５分間放置した。２００μＬの溶液を９６ウェルに移して４８０ｎｍ／５２０ｎｍのｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅで読み取った。その結果、Ａ１０−Ａ３はＤＭＳ１１４およびＤＭＳ５３細胞の浸潤を約３０％抑制することが分かった（図７のパネルＡ）。４−６３、ＵＪ１２７抗体も２細胞の浸潤を約３０％抑制したが、公知の抗体５Ｇ３はＤＭＳ１１４の浸潤を阻害しなかった（図７のパネルＣ）。
【００６１】
マイグレーションアッセイ(Migration assay)の際には、ＱＣＭ ２４−ｗｅｌｌ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を用いて分析した。実験方法はインベイジョンアッセイと同様であった。その結果、Ａ１０−Ａ３がＤＭＳ１１４よびＤＭＳ５３の移動を約３０％抑制することが分かった（図７のパネルＢ）。４−６３、ＵＪ１２７抗体も２細胞の移動を約２０％抑制した（図７のパネルＤ）。
【００６２】
実施例９：Ａ１０−Ａ３抗体による小細胞肺癌細胞の信号伝達抑制
実施例９−１：ＥＲＫリン酸化の抑制
癌細胞の成長、移動および生存に関与するＥＲＫ(extracellular signal-regulated kinases)１／２リン酸化がＡ１０−Ａ３抗体によって減少するかをウエスタンブロットで検証するために、ＤＭＳ１１４およびＤＭＳ５３細胞にＡ１０−Ａ３抗体を１０μｇ／ｍＬでそれぞれ３０分、６０分、１２０分間それぞれ処理した後、細胞を収去して細胞溶解液に溶かした。ＢＣＡ(Bicinchoninic acid)のタンパク質検定キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてタンパク質の濃度を決定した後、４０μｇのタンパク質を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、ニトロセルロース膜に２５Ｖで９０分間ウエスタントランスファーした。膜を５％脱脂乳で一晩４℃でブロッキングし、Ｒａｂｂｉｔ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ ＥＲＫ１／２（Ａｂ Ｃａｍ、１：１０００）抗体と１％脱脂乳で一晩反応させた。リン酸化していないＥＲＫ１／２の発現を調査するためには、同量のタンパク質を前述と同様に処理し、ブロッキングしたニトロセルロース膜をａｎｔｉ−ＥＲＫ１／２（Ａｂ Ｃａｍ、１：１０００）抗体と１時間反応させた。抗−ウサギホースラディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、１：１００００）と１時間反応させ、ＰＢＳＴで洗浄した後、ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）でｐｈｏｓｐｈｏ ＥＲＫ１／２とＥＲＫ１／２を検出した。同一のＥＲＫ１／２が発現するＤＭＳ１１４、ＤＭＳ５３細胞で抗体Ａ１０−Ａ３を処理した細胞でのみｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫ１／２の量が著しく減少することを観察することができた（図８）。
【００６３】
実施例９−２：Ａ１０−Ａ３抗体によるＡＫＴリン酸化の抑制
癌細胞の生存に関与するＡｋｔリン酸化がＡ１０−Ａ３抗体によって減少するかをウエスタンブロットによって検証するために、ＤＭＳ１１４、ＤＭＳ５３細胞に１０μｇ／ｍＬの抗体Ａ１０−Ａ３ をそれぞれ３０分、６０分、１２０分間それぞれ処理した後、細胞を収去して細胞溶解液に溶かした。ＢＣＡ(bicinchoninic acid)タンパク質検定キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてタンパク質の濃度を決定した後、４０μｇのタンパク質を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、ニトロセルロース膜に２５Ｖで９０分間ウエスタントランスファーした。膜を５％脱脂乳で一晩４℃でブロッキングし、Ｒａｂｂｉｔ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ Ａｋｔ（Ａｂ ｃａｍ、１：１０００）抗体およびＲａｂｂｉｔ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉ−Ａｋｔ（Ａｂ ｃａｍ、１：１０００）と１％脱脂乳で一晩反応させ、ａｎｔｉ− ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ ＨＲＰ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、１：１００００）抗体と１時間反応させた。ＰＢＳＴで洗浄した後、ＥＣＬ(enhanced chemiluminescence reagent)（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）でｐｈｏｓｐｈｏ Ａｋｔと全体Ａｋｔを検出した。抗体Ａ１０−Ａ３を処理した細胞でｐｈｏｓｐｈｏ Ａｋｔの量が減少することを観察することができた（図８）。
【００６４】
実施例９−３：Ａ１０−Ａ３抗体によるＦＡＫ活性化の抑制
癌細胞の成長および移動に重要に作用するＦＡＫ(focal adhesion kinase)のリン酸化がＡ１０−Ａ３抗体によって減少するかをウエスタンブロットによって分析するために、ＤＭＳ１１４、ＤＭＳ５３細胞に抗体Ａ１０−Ａ３を３０分、６０分、１２０分間それぞれ処理した後、細胞を収去して細胞溶解液に溶かした。ＢＣＡタンパク質検定キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてタンパク質の濃度を決定した後、４０μｇのタンパク質を７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、ニトロセルロース膜に２５Ｖで９０分間ウエスタントランスファーした。膜を５％脱脂乳で一晩４℃でブロッキングし、ｒａｂｂｉｔ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ ＦＡＫ（Ａｂ ｃａｍ、１：１０００）抗体と１％脱脂乳で一晩反応させ、ａｎｔｉ−β ａｃｔｉｎ（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１：４０００）抗体と１時間反応させた。そして、抗−ウサギホースラディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、１：１００００）と１時間反応させ、ＰＢＳＴで洗浄した後、ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）でｐｈｏｓｐｈｏ ＦＡＫとβ−ａｃｔｉｎを検出した。抗体Ａ１０−Ａ３を処理したＤＭ１１４とＤＭＳ５３でｐｈｏｓｐｈｏ−ＦＡＫの量が著しく減少することを観察することができた（図８）。
【００６５】
実施例１０：Ｌ１ＣＡＭ特異的抗体の非小細胞肺癌細胞の成長抑制
実施例５に示すように非小細胞肺癌でもＬ１ＣＡＭが発現するため、Ｌ１ＣＡＭに対する抗体が非小細胞肺癌細胞の成長または移動を阻害するかを分析してみた。
【００６６】
実施例１０−１：Ｌ１ＣＡＭに対する抗体の非小細胞肺癌細胞の成長抑制効果
Ｌ１ＣＡＭに対する抗体が非小細胞肺癌細胞の成長を阻害するかを分析するために、Ａ１０−Ａ３抗体が結合するＡ５４９およびＮＣＩ−Ｈ５２２細胞を用いて、実施例７と同様にして細胞増殖抑制実験を行った。Ａ１０−Ａ３抗体を１０μｇ／ｍＬの濃度で細胞培養液に添加した後、２日間隔で抗体を含有させた新鮮な培地で取り替えた。２日間隔で細胞を回収して、０．２％トリファンブルー溶液で生きている細胞を計数し、全体細胞中に生きている細胞の細胞数を求めた。その結果、Ａ１０−Ａ３抗体によってＡ５４９、ＮＣＩ−Ｈ５２２細胞の成長が減少したが、その抑制効果はＡ１０−Ａ３抗体による他の癌細胞（例えば、胆管癌細胞または小細胞肺癌細胞）の成長抑制効果より低かった（図９のパネルＡ）。公知の抗体ＵＪ１２７を使用した結果もほぼ同一であった。
【００６７】
実施例１０−２：Ｌ１ＣＡＭに対する抗体の非小細胞肺癌細胞の移動抑制効果
実施例８と同様の方法によってＡ１０−Ａ３がＡ５４９、ＮＣＩ−Ｈ５２２細胞の移動を抑制するかを分析した結果、Ａ１０−Ａ３抗体はＡ５４９、ＮＣＩ−Ｈ５２２細胞の移動を著しく減少させた（図９のパネルＢ）。公知の抗体ＵＪ１２７を使用した結果もほぼ同一であった。この結果はＬ１ＣＡＭに対する抗体が非小細胞肺癌の転移を抑制することにより、非小細胞肺癌の治療効果を示すことができることを示唆する。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
上述したように、本発明者らは、Ｌ１ＣＡＭが周知とは異なり小細胞肺癌の進行に重要に作用することを明らかにした。よって、本発明の小細胞肺癌細胞表面のＬ１ＣＡＭタンパク質を認識しながら、小細胞肺癌の癌組織に特異的に結合する抗体または小細胞肺癌細胞のＬ１ＣＡＭの発現を抑制するｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｈＲＮＡ、これを含む薬学的組成物は、小細胞肺癌細胞の成長、浸潤および移動を阻害させるので、小さ細胞肺癌の治療に有用に利用できる。また、本発明では、非小細胞肺癌でもＬ１ＣＡＭが発現し、Ｌ１ＣＡＭに対する抗体が非小細胞肺癌の移動を減少させる作用を解明したので、非小細胞肺癌のＬ１ＣＡＭに特異的に結合してその活性を抑制させる抗体が、非小細胞肺癌の治療に有用に利用できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ１ＣＡＭの活性または発現を抑制する物質を含んでなり、
前記Ｌ１ＣＡＭの活性を抑制する物質はＬ１ＣＡＭの活性を抑制するＬ１ＣＡＭ特異的な抗−Ｌ１ＣＡＭ抗体、該抗−Ｌ１ＣＡＭ抗体の抗原結合断片、および抗−Ｌ１ＣＡＭ抗体またはその抗原結合断片の変異体から選ばれるものであり、前記Ｌ１ＣＡＭの発現を抑制する物質は前記Ｌ１ＣＡＭの発現を抑制するオリゴヌクレオチドである、肺癌の成長または転移を抑制する薬学的組成物。
【請求項２】
前記Ｌ１ＣＡＭの活性を抑制する物質が、細胞膜結合形態または細胞膜から遊離された形態を認識することを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
Ｌ１ＣＡＭの発現を抑制するオリゴヌクレオチドが、Ｌ１ＣＡＭをコードする遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡよりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記抗体が、受託番号ＫＣＴＣ１０９６６ＢＰのハイブリドーマによって分泌される４−６３、またはＵＪ１２７であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ｓｉＲＮＡが５’−ＴＧＧＴＡＣＡＧＴＣＴＧＧＧｄｔｄｔ−３または５’−ＣＡＧＣＡＡＣＴＴＴＧＣＴＣＡＧＡＧＧｄｔｄｔ−３’の配列を有することを特徴とする、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
請求項１の組成物を投与する段階を含む、肺癌の治療方法。
【請求項７】
Ｌ１ＣＡＭの発現または活性を抑制することにより肺癌の成長または転移を抑制する方法。
【請求項８】
Ｌ１ＣＡＭに特異的な抗−Ｌ１ＣＡＭ抗体を用いて肺癌を診断する方法。
【請求項１】
Ｌ１ＣＡＭの活性または発現を抑制する物質を含んでなり、
前記Ｌ１ＣＡＭの活性を抑制する物質はＬ１ＣＡＭの活性を抑制するＬ１ＣＡＭ特異的な抗−Ｌ１ＣＡＭ抗体、該抗−Ｌ１ＣＡＭ抗体の抗原結合断片、および抗−Ｌ１ＣＡＭ抗体またはその抗原結合断片の変異体から選ばれるものであり、前記Ｌ１ＣＡＭの発現を抑制する物質は前記Ｌ１ＣＡＭの発現を抑制するオリゴヌクレオチドである、肺癌の成長または転移を抑制する薬学的組成物。
【請求項２】
前記Ｌ１ＣＡＭの活性を抑制する物質が、細胞膜結合形態または細胞膜から遊離された形態を認識することを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
Ｌ１ＣＡＭの発現を抑制するオリゴヌクレオチドが、Ｌ１ＣＡＭをコードする遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡよりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記抗体が、受託番号ＫＣＴＣ１０９６６ＢＰのハイブリドーマによって分泌される４−６３、またはＵＪ１２７であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ｓｉＲＮＡが５’−ＴＧＧＴＡＣＡＧＴＣＴＧＧＧｄｔｄｔ−３または５’−ＣＡＧＣＡＡＣＴＴＴＧＣＴＣＡＧＡＧＧｄｔｄｔ−３’の配列を有することを特徴とする、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
請求項１の組成物を投与する段階を含む、肺癌の治療方法。
【請求項７】
Ｌ１ＣＡＭの発現または活性を抑制することにより肺癌の成長または転移を抑制する方法。
【請求項８】
Ｌ１ＣＡＭに特異的な抗−Ｌ１ＣＡＭ抗体を用いて肺癌を診断する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２０１０−５０１５４８（Ｐ２０１０−５０１５４８Ａ）
【公表日】平成２２年１月２１日（２０１０．１．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５２５４９７（Ｐ２００９−５２５４９７）
【出願日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００７／００４０４５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０２３９４６
【国際公開日】平成２０年２月２８日（２００８．２．２８）
【出願人】（５０１２４５９９７）コリア リサーチ インスティテュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジー (15)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１月２１日（２０１０．１．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００７／００４０４５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０２３９４６
【国際公開日】平成２０年２月２８日（２００８．２．２８）
【出願人】（５０１２４５９９７）コリア リサーチ インスティテュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジー (15)
【Ｆターム（参考）】
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