脂質に被包された治療剤の製造方法
【課題】脂質で十分に被包された治療剤の粒子の生成。
【解決手段】帯電した治療剤の電荷と反対の電荷を持つ帯電脂質と、凝集を制御するための立体構造の障壁部分を有する修飾脂質とを含有する脂質小胞を形成する。前記脂質小胞は、予め形成された脂質小胞を含有する脂質組成物と、帯電した治療剤と、不安定化剤とを結合させて、不安定化溶媒中で予め形成された小胞と治療剤の混合物を形成することによって調製される。該不安定化溶媒は、該予め形成された脂質小胞を崩壊することなく該脂質小胞の膜を不安定化するのに有効である。前記の得られた混合物は、前記予め形成された脂質小胞の内部に前記治療剤を被包させるのに十分な時間の間、定温放置される。次いで、前記不安定化剤が除去され、形成される。
【解決手段】帯電した治療剤の電荷と反対の電荷を持つ帯電脂質と、凝集を制御するための立体構造の障壁部分を有する修飾脂質とを含有する脂質小胞を形成する。前記脂質小胞は、予め形成された脂質小胞を含有する脂質組成物と、帯電した治療剤と、不安定化剤とを結合させて、不安定化溶媒中で予め形成された小胞と治療剤の混合物を形成することによって調製される。該不安定化溶媒は、該予め形成された脂質小胞を崩壊することなく該脂質小胞の膜を不安定化するのに有効である。前記の得られた混合物は、前記予め形成された脂質小胞の内部に前記治療剤を被包させるのに十分な時間の間、定温放置される。次いで、前記不安定化剤が除去され、形成される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の詳細な説明）
（発明の分野）
本発明は、脂質で被包された（lipid-encapsulated）治療剤の粒子（とりわけ、アンチセンス療法又は遺伝子治療に有用である、脂質で被包された治療用核酸粒子）の新規な製造方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
治療剤用キャリヤとして脂質粒子を使用する概念は、多数の人々によって検討されてきた。製剤は、脂質の外側に対する治療剤の錯形成反応（complexation; 錯化）、或いは治療剤の実際的閉じ込め（entrapment）に依存してきた。とはいえ、いずれのタイプの製剤を造る能力も、脂質粒子を造るために採用される方法だけでなく、脂質及び治療剤の特性の適合性（matching）に左右される。治療剤が閉じ込められた粒子の場合、閉じ込め方法は、受動的である（即ち、諸脂質粒子は治療剤の存在下で組み立てられ、治療剤の幾らかは偶然に閉じ込められる）か；又は能動的である（即ち、誘導されたある種の勾配の結果として、脂質粒子の内側の中に、治療剤が引張られるか又は推し進められる）ことがある。脂質粒子をキャリヤとして利用する努力が多く成されているにもかかわらず、脂質で閉じ込められた治療剤を実際に適用することを制限する諸問題が残されている。これら問題には、薬物／脂質の基部上への治療剤の取り込みレベルが低いこと；治療剤を捕獲する効率が低いこと；及び脂質被包された治療剤の粒子を大規模に製造するための適切な手段が欠如していること；が含まれる。
【０００３】
脂質と治療剤の間にかなりの静電的相互作用が存在しており、脂質で十分に被包された治療剤の粒子は、大規模には製造されてこなかった。基本的な問題は凝集である。帯電した脂質を逆符号に帯電した治療剤と混合すると、通常、凝集が生じ、治療に使用できないどころか、その後の処理加工に使用することができない乳白色の毛房状塊を含有する溶液が生じる結果となる。この凝集の問題は、非常に有用である治療用組成物の開発を妨げてきた。
【０００４】
帯電脂質及び逆符号に帯電した治療剤を用いたベンチスケール（bench scale; 卓上規模）の製剤は、バリー（Bally）等の米国特許第５，７０５，３８５号明細書（ＰＣＴ出願番号ＷＯ９６／４０９６４号明細書；米国特許出願シリアル番号０８／４８４，２８２号明細書；同０８／４８５，４５８号明細書；同０８／６６０，０２５号明細書；及び同０９／１４０，４７６号明細書も参照のこと）並びにセンプル（Semple）等のＰＣＴ特許出願番号ＷＯ９８／５１２７８号明細書（米国特許出願シリアル番号０８／８５６，３７４号明細書も参照のこと）に記述される受動的カプセル化方法で、カチオン性脂質及びアニオン核酸を使用してうまく達成された。これら米国特許及び特許出願は全て本発明の譲受人に譲渡されている。また、これら明細書に言及することにより、それらの内容を本明細書に組み入れる。更に、「ウィーラー（Wheeler）等：安定化されたプラスミド−脂質の粒子（Stabilized plasmid-lipid particles），構造と特徴（Construction and characterization），Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．６：２７１〜２８１（１９９９）」も参照のこと。これらの技術では、ＰＥＧ−脂質、ＡＴＴＡ−脂質等の凝集防止性脂質（同時係属出願の米国特許出願０８／９９６，７８３号明細書に開示されている。この明細書に言及することにより、その内容を本明細書に組み入れる）が採用されている。その凝集防止性脂質によって、複雑な凝集形成が効果的に防止される。得られた、脂質で十分に被包された治療剤の粒子は、（３０〜２５０ｎｍの範囲に）制御された大きさ；（例えば、ヌクレアーゼ抵抗によって測定される）十分なカプセル化；血清中での安定性；等の優れた薬物特性を有する。
【０００５】
ＷＯ９８／５１２７８号明細書には、受動的閉じ込め（entrapment）を使用して、脂質被包された治療剤の粒子を調製するためのベンチスケール法が記述されている。この既知の方法には、脂質の水和工程及びリポソームのサイジング工程という２つの基本工程が採用されている。脂質の水和工程では、カチオン性脂質溶液（９５％ＥｔＯＨ溶媒）が、クエン酸塩緩衝液（ｐＨ ３．８）に入れたポリヌクレオチド治療剤の入っている容器の中に１滴ずつ撹拌されながら添加され、ＥｔＯＨ ４０％、脂質 ９．９ｍｇ／ｍｌ及びポリヌクレオチド ２．０ｍｇ／ｍｌの最終組成物となる。この水和工程から得られる脂質の粒子は、典型的には直径４００ｎｍ以上であって、治療に役立つものとして一般的に使用するには大き過ぎる。このため、適切な大きさの脂質粒子を得るためには、高温押し出し（６５℃で）、及び随意的には凍結融解（液体窒素から６５℃水浴まで）のような、大規模な二次生成処理が必要である。これを使用したカプセル化の効率は、回収される最終［薬物］：［脂質］比に関してはかなり高い（６０〜９０％）が、最終粒子製剤の中に出発ポリヌクレオチドが取り込まれる絶対効率（absolute efficiency）は、準最適である（２５〜４５％）。
【０００６】
リポソームの分野で採用されている従来の諸方法を用いて、これらの粒子を商業的に大規模に製造しても、効率よくは達成されない。「バンガン（Bangham），ＡＤ．等：カチオンに対するリン脂質構造の透過性に及ぼすステロイド及びストレプトリシンＳの影響（The action of steroid and streptolysin S on the permeability of phospholipid structures to cations），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３，１３８〜１４７（１９６５）」によってリポソームの調製方法が最初に記述されて以来、リポソーム／薬物の製剤を製造することに関する多くの技術が出現してきたにもかかわらず、これらの問題は存在する。
【０００７】
脂質粒子を大規模に製造する既知技術は、次のカテゴリー：（１）脂質膜の水和（即ち、受動的閉じ込め）；（２）逆相蒸発；（３）高圧押し出し；及び（４）溶媒注入（希釈化）；に大きく分類することができる［例えば、マーチン（Martin）等の米国特許第４，７５２，４２５号明細書；同第４，７３７，３２３号明細書を参照のこと］。当業界で開示されている、脂質粒子を製造するための詳細な文書には、シュナイダー（Schneider）等の米国特許第５，２７０，０５３号明細書、同第５，４６６，４６８号明細書； 「アイゼル（Isele），Ｕ．等：有機溶媒の制御希釈による単量体亜鉛フタロシアニンを含有するリポソームの大規模製造（Large-Scale Production of Liposomes Containing Monomeric Zinc Phthalocyanine by Controlled Dilution of Organic Solvents），Ｊ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．第８３巻（１１），１６０８〜１６１６（１９９４）」；「クリフナー（Kriftner），ＲＷ．：リポソームの製造（Liposome Production）（１９９２）」；「ブルアン−ファルコ（Bruan-Falco）等編集：エタノール注入技術（The Ethanol Injection Technique），リポソーム誘導体（Liposome Derivatives），Berlin, Springer-Verlag, 第９１頁〜１００頁（１９９２）」；「クレマー（Kremer）等：変形注入法により調製した可変直径の小胞（Vesicles of Variable Diameter Prepared by a Modified Injection Method）, 生化学（Biochemistry）１６（１７）、 ３９３２〜３９３５（１９７７）」；「バツリ（Batzri），Ｓ及びコーン（Korn），ＥＤ．：高周波分解なしで調製した単二重層リポソーム（Single Bilayer Liposome Prepared Without Sonication），Ｂｉｏｃｈ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ２９８，１０１５〜１０１９（１９７３）」；が包含される。
【０００８】
上記に言及した諸方法又は諸文書のいずれも、上記バリー（Bally）等及び上記センプル（Semple）等の優れた薬物特性を有する、帯電脂質及び逆に帯電した治療剤から成る製剤のスケールアップには適していない。上記バリー（Bally）等及び上記センプル（Semple）等に記述されている製造技術は、わずか１〜１００ｍｌのために開発されたものであり、扱い難く、しかも、大規模製造（即ち、２０〜２００リットルの規模のもの）では維持できないほど非効率なものとなる。
本発明によって、脂質で十分に被包された治療剤の粒子を大規模に調製する方法であって、脂質及び治療剤が逆に帯電している該調製方法が初めて提供される。これらの粒子は、治療用組成物として、また、試験等のために有用である。
【０００９】
（発明の概要）
本発明による、帯電した治療剤が脂質で十分に被包された治療剤の粒子は、予め形成された脂質小胞、帯電した治療剤及び不安定化剤（destabilizing agent）から成る脂質組成物を結合させて、予め形成された小胞と治療剤の混合物を不安定化溶媒中で形成することによって調製する。不安定化溶媒は、予め形成された脂質小胞を崩壊することなく、該脂質小胞の膜を不安定化するのに有効である。得られた混合物は、予め形成された脂質小胞の内部に、治療剤をカプセル封じ（encapsulation）させるのに十分な時間の間、定温放置（incubate）する。次いで、不安定化剤を除去して、脂質で十分に被包された治療剤の粒子を得る。予め形成された脂質小胞は、帯電した治療剤の電荷と反対の電荷を持つ帯電脂質と、凝集を制御するための立体構造の障壁部分を有する修飾脂質とを含有する。修飾脂質は、予め形成された小胞の凝集を遅らせるが妨げないのに有効な量で、予め形成された小胞中に存在する。本発明の好ましい態様において、脂質粒子を大規模（例えば、２０〜２００リットル）で効率的に形成するのに有効な、核酸（例えば、アンチセンス・オリゴデオキシヌクレオチド）を含有する治療剤溶液は、エタノールの２５〜４０％水溶液に入れた予め形成された脂質小胞と結合させる。脂質で十分に被包された治療剤の粒子が自然発生的に製造される結果となるには、この混合物を約１時間の間、定温放置すれば十分である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の方法に関する、諸手順工程の考えられるモデルを示す。
【図２】被包効率（encapsulation efficiencies）を、ＰＥＧ−Ｃｅｒ １０モル％を含有するリポソームのためのエタノール濃度の関数として表わす。
【図３Ａ】エタノール濃度の関数としての、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＣｅｒＣ14／ＤＯＤＡＰのリポソーム中の自己消光（self-quenching）濃度で閉じ込められたカルセインの解放（黒丸）を、同じ脂質組成のリポソームを用いて得られた被包効率（白丸）と共に描く。
【図３Ｂ】本発明の方法を用いて、脂質で閉じ込められた核酸を形成する間の、脂質の迅速な交換を示す。
【図４】温度の関数としてプロットした、閉じ込め効率と、カルセイン漏出のデータとを示す。
【図５】Ａ、Ｂ及びＣは、脂質と結合したオリゴヌクレオチドのＮＭＲスペクトルを示す。
【図６】初期［オリゴヌクレオチド］対［脂質］比の関数としてプロットした、閉じ込め効率のグラフを示す。
【図７】幾つかの種類のアンチセンス・オリゴデオキシヌクレオチドとプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）とに対する被包効率を示す。
【００１１】
（発明の詳細な説明）
（定義）
本出願書類で使用する用語は、当業者に理解される通常の意味に解釈されるように意図されているが、幾つかの用語については、いかなる不明確さをも避けるために明確に定義する。従って、本出願の明細書（及び特許請求の範囲）において使用する用語：
「帯電脂質（charged lipid）」は、カチオン電荷若しくは負電荷を有する脂質種、又は、正味中和していない、両性イオンである脂質種のことを言い、概して、その脂質が見出される溶液のｐＨを参照する必要がある。
【００１２】
「不安定化（destabilization）」は、脂質膜が溶媒と相互作用する結果としての、脂質膜の特性の変化を言う。脂質膜が不安定化するとき、初期の脂質膜の基本形態は維持されている。しかし、低分子量の溶質の漏れ速度が増大し、脂質はその脂質膜を横切って「フリップ・フロップし（flip-flop）」、急速に他の脂質粒子に変化し得る。本発明における脂質膜の不安定化は、例えば、２５〜４０％のエタノール濃度で観察される。本明細書では、脂質小胞を不安定化させるが崩壊はさせない溶媒を、不安定化性溶媒（destabilizing solvents）と呼ぶ。
「崩壊（disruption）」は、初期の脂質膜の基本形態が喪失する程度に、脂質膜の性質が変成することを言う。脂質膜の崩壊は、例えば、６０％を越えるエタノール濃度で観察される。
【００１３】
「十分に被包された（fully encapsulated; 十分にカプセルに包まれた）」は、脂質粒子であってそこでは治療剤がリポソーム等の脂質小胞の内腔（lumen）の中に入っているか又は脂質粒子の二重層の内部に埋め込まれていて、治療剤のいかなる部分も脂質粒子を取り囲む外部媒体に直接接近することができない該脂質粒子を言う。脂質粒子であってそこでは治療剤が十分に被包されている該脂質粒子は、粒子であってそこでは治療剤が（例えば、イオン的相互作用によって）その脂質粒子の外部と複合体を形成している該粒子、或いは、粒子であってそこでは治療剤が部分的に脂質内に埋め込まれ、また部分的に外部媒体にさらされている該粒子とは全く異なる。被包（encapsulation; カプセル化; カプセル封じ）の程度は、入手可能な治療剤を劣化させる諸方法を用いて、決定することができる。ポリヌクレオチドの場合、これらの方法には、Ｓ１ヌクレアーゼ消化（Nuclease Digestion）、血清ヌクレアーゼ（Serum Nuclease）、及び小球菌ヌクレアーゼ（Micrococcal Nuclease）分析法が包含される。もう１つの方法として、オリグリーン（OliGreen）（登録商標）検定法を採用することができる。定量的な意味において、「十分に被包された」治療剤は、治療剤の９０％より多い量が自由形態（free form; 拘束されていない形態）で劣化するという条件下で、脂質粒子中における治療剤の１０％未満（好ましくは治療剤の５％未満）が劣化する治療剤である。更に、本発明から逸脱することなく、十分には被包されていない１種以上の追加治療剤を、錯形成反応（complexation）又は別のやり方で、その脂質粒子と結合させることができる。
【００１４】
「水和（hydration）」は、脂質粒子（リポソームを包含する）を形成する一般的プロセスを言う。このプロセスにおいて、脂質を取り囲む溶媒中の水の量は、約５％未満の濃度（この濃度で脂質分子は、通常、個々に溶媒和されている）から４０〜６０％以上の濃度（この濃度で脂質は、自発的に膜、ミセル又は粒子の形を取る）まで増加する。
「脂質（lipid）」は、脂肪酸のエステルであって水には溶けないが多くの有機溶媒には溶けることを特徴とする諸有機化合物の群を言う。それらは通常、少なくとも３つの種類：（１）ワックスの他に油脂を包含する「単純脂質」；（２）リン脂質及び糖脂質を包含する「複合脂質」；並びに、（３）ステロイド等の「誘導脂質」；に分けられる。多種多様の脂質が本発明に使用することができ、それらの幾つかを下記に説明する。
【００１５】
「予め形成された小胞」（preformed vesicle）」は、本発明の方法で使用される出発脂質組成物を言い、脂質小胞が包含される。これら小胞は、概して球形又は卵形の自己閉鎖構造（self-closed structure）を有する。この自己閉鎖構造は、１つ以上の脂質層から形成され、また、溶媒の一部を含有する内腔（interior lumen）を有する。これら小胞は、単層構造、少層構造（oligolamellar structure）又は多重膜構造である場合がある。
【００１６】
本明細書に開示する発明は、脂質で被包された治療剤の粒子を造るするための新規な方法であって、とりわけ、カチオン性脂質及びアニオンポリヌクレオチドを形成するときに見られるように、脂質及び治療剤が逆に帯電している場合、そのような諸粒子の大規模製造に適用することのできる該方法に関する。本発明は、予め形成された脂質小胞を治療剤の溶液と混ぜ合わせれば、結果的に、治療上有用な粒度の、脂質で十分に被包された治療剤が自発的に形成され得るという予期されない驚くべき観察結果に依る。従って、脂質で十分に被包された治療剤の粒子は、予め形成された脂質小胞を含有する脂質組成物と治療剤の溶液とを混合し、次いで、前記脂質小胞中に前記治療剤を被包するの時間の間、前記の得られた混合物を定温放置する諸工程を含む方法による本発明に従って形成される。脂質成分は、小胞を破壊することなく、脂質の膜を不安定化するのに有効な溶媒系を更に含有する。
【００１７】
本発明の方法は、該方法を当業界にとって実質的に有用であるようにする幾つかの重要な特徴を有する。第１に、該方法は、単一バッチ中における被包済み治療剤のかなりの量（例えば、１００ｇを超える量）を製造するのに使用することのできる大規模な方法である。第２に、治療剤を導入して、治療する上で有用な粒度の粒子を得た後に脂質粒子を処理することが必要でないようなやり方で、予め形成された脂質小胞の粒度は実質的に維持される。第３に、被包の効率は高い。第４に、粒子の中に負荷される治療剤の量は多い。
【００１８】
本発明で使用される脂質粒子は、少なくとも（１）治療剤の電荷と反対の実効電荷を有する帯電脂質；及び（２）凝集を制限するのに有用な、ポリエチレングリコール置換基等の変性剤を含有する修飾脂質；を包含する幾つかの種類の脂質を組み合わせることによって形成される。加えて、製剤には、中性脂質又はステロールが含有されることがある。上述の全ての成分を用いて脂質粒子を配合する場合、次の量の各脂質成分：帯電脂質 １０〜４０モル％；中性脂質 ２５〜４０モル％；ステロール ３５〜５５モル％；及び修飾脂質０．５〜１５モル％；を使用するのが適切である。特定の脂質諸成分は、次の非制限的諸例の中から選定することができる。
【００１９】
帯電脂質
生理的ｐＨでカチオンに帯電した脂質は、Ｎ,Ｎ−ジオレイル−Ｎ,Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）； Ｎ−（２,３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）； Ｎ,Ｎ−ジステアリル−Ｎ,Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）； Ｎ−（２,３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）； ３β−（Ｎ−（Ｎ’,Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）； Ｎ−（１,２−ジミリスチルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ,Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）（N-（1,2-dimyristyloxyprop-3-yl）-N,N-dimethyl-N-hydroxyethyl ammonium bromide）；を包含するが、それらに限定されない。更に、本発明で使用することができる多数のカチオン性脂質製剤が、市販されている。これら製剤には、例えば、リポフェクチン（Lipofectin）（登録商標）［米国ニューヨーク州、グランドアイランド、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬからの、ＤＯＴＭＡと、１,２−ジオレオイル−ｓｎ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）とを含有する、市販のカチオンリポソーム］；リポフェクタミン（Lipofectamine）（登録商標）［ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬからの、Ｎ−（１−（２,３−ジオレイロキシ）プロピル）−Ｎ−（２−（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ,Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）と、ＤＯＰＥとを含有する、市販のカチオンリポソーム］；及び、トランスフェクタム（Transfectam） （登録商標）［米国ウィスコンシン州、プロメガ社（Promega Corp.）からの、エタノールに入ったジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（ＤＯＧＳ）を含有する、市販のカチオン性脂質］；が包含される。
【００２０】
幾つかのカチオン帯電脂質は、滴定することが可能である。即ち、それら脂質は、生理的ｐＨ又はその近辺でのｐＫａを有し、また、それら脂質が緩酸ではカチオン性が強く、生理的ｐＨではカチオン性が弱い（又はカチオンではない）という、本発明にとって重要な結果を与える。そのようなカチオン帯電脂質は、Ｎ−（２,３−ジオレイロキシ）プロピル）−Ｎ,Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＭＡ）及び１,２−ジオレイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＤＡＰ）を包含するが、それらに限定されない。
【００２１】
生理的ｐＨでのアニオン性帯電脂質は、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ジホスファチジルグリセロール、ポリ（エチレングリコール）−ホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジラウリロイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアリロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルリン酸、ジパルミトイルリン酸、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、脳ホスファチジルセリン等を包含するが、それらに限定されない。
【００２２】
幾つかのアニオン帯電脂質は、滴定することが可能である。即ち、それら脂質は、生理的ｐＨ又はその近辺でのｐＫａを有し、また、それら脂質が緩酸ではアニオン性が強く、生理的ｐＨではアニオン性が弱い（又はアニオンではない）という、本発明にとって重要な結果を与える。当業者は、本明細書に開示する原理に基づいて、そのようなアニオン帯電脂質を認識することができる。
【００２３】
中性脂質及びステロール
用語「中性脂質（neutral lipid）」は、生理的ｐＨにおいて非荷電形態又は両性イオン形態で存在する多くの脂質種のあらゆる物を言う。そのような脂質には、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、コレステロール、セレブドシド及びジアシルグリセロールが包含される。
【００２４】
修飾脂質
本発明で使用される好ましい製剤の中には、ＰＥＧ−脂質、ポリアミドオリゴマー−脂質（例えば、ＡＴＴＡ−脂質）等の凝集防止性脂質、及び立体障壁又は「ステルス（ｓｔｅａｌｔｈ）」−脂質を含有するものが幾つかある。そのような諸脂質は、シアーズ（Sears）の米国特許第４，３２０，１２１号明細書；チョウイ（Choi）等の米国特許第５，８２０，８７３号明細書；ホランド（Holland）等の米国特許第５，８８５，６１３号明細書；ＷＯ９８／５１２７８［発明者 センプル（Semple）等］；及びポリアミドオリゴマーに関する米国特許出願シリアルＮｏ．０９／２１８９８８号明細書；に記述されている。これらは全て、言及することによって、本願明細書に組み入れる。これらの脂質は、逆に帯電した脂質と治療剤とを含有する製剤が沈降したり、凝集するのを防止する。これらの脂質はまた、生体内における循環寿命（circulation lifetime）を改善するのに使用することができる［クリバノフ（Klibanov）等：ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２６８（１），２３５〜２３７（１９９０）を参照］か、又は、それら脂質は、生体内で製剤から外れて迅速に交換されるように選定することができる（米国特許第５，８８５，６１３号明細書を参照）。とりわけ有用な交換性脂質は、一層短いアクリル鎖を有するＰＥＧ−セラミド（即ち、Ｃ１４若しくはＣ１８、本明細書ではＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４及びＰＥＧ−ＣｅｒＣ１８と称する）、又はＣ１４アクリル鎖を有するＰＥＧ−ＰＥである。
【００２５】
幾つかの脂質粒子製剤は、ある種の標的細胞又は標的組織でリポソームの局在化（localization）を助長するように設計されたターゲッティング成分（targeting moieties）を有することがある。ターゲッティング成分は、調製の間か又は調製の後、脂質粒子の外部二重層に連結させることができる。これらの方法は、当業界では周知である。加えて、幾つかの脂質粒子製剤は、ＰＥＡＡ等のフソジェニックポリマー（fusogenic polymers）；血球凝集素；他のリポペプチド（米国特許出願シリアルＮｏ．０８／８３５，２８１号明細書、及び同６０／０８３，２９４号明細書を参照。これら明細書は、言及することによって本明細書に組み入れる）；並びに、生体内及び／又は細胞内運搬（intracellular delivery）のために有用な他の特徴；を使用することができる。
【００２６】
予め形成された脂質小胞は、エタノール又は他の有機溶媒の溶液中、単一脂質水和工程を用いて調製することができる。エタノール又は他の有機溶媒の割合は、脂質粒子がその溶媒（通常、６０％を超える量のエタノール）の中に分解もされず再融解もされないが、本発明の自発的被包化プロセスを可能にする条件（エタノール約５％〜５０％、一層好ましくはエタノール ２５〜４０％）を与えるようなやり方で、選定しなければならない。別の方法として、膜の不安定化に寄与する、洗剤等の追加配合剤を、脂質小胞の溶液中に含有させることができる。本明細のために、「有機溶媒（organic solvent）」は、完全に有機の溶媒（即ち、１００％エタノール）か、又は部分的に有機の溶媒（例えば、水中のエタノール等、即ち、２０％エタノール、４０％エタノール等）を意味する。エタノール又は他のアルコール類、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ＤＭＳＯ、アセトン、他のケトン類、その他同種類のものを包含する、多種多様の水混和性有機溶媒を使用することができる。一層大きい極性又は一層小さい極性を有する溶媒が有用な場合もある。洗剤溶液には、β−Ｄ−グルコピラノシド；トウィーン（Tween）２０；ＷＯ ９６／４０９６４号明細書及び米国特許出願シリアルＮｏ．０９／１６９５７３号明細書（これら両方の明細書は、言及することによって本明細書に組み入れる）に開示されているもの；並びに、逆に帯電した脂質及び治療剤を混合する間、粒子の凝集を防止することができるところの、及び／又は、同じ溶解度の特徴を与えることができるところの、他のあらゆる洗剤若しくは立体障壁化合物；が包含される。全ての有機溶媒又は洗剤溶液は、配合プロセスによって患者への投与が妨げられないように、薬学的に痕跡量又はそれ以上の量で許容され得るのが好ましい。
【００２７】
アニオン性治療剤には、実質的に負の電荷を有するか；又は、該治療剤の他のカチオン電荷の基によって妨げられることなくカチオン性脂質と相互作用をすることのできる、負に帯電した基を有する；あらゆる治療剤が包含される。そのような治療剤には、オリゴヌクレオチド；核酸；（タンパク質−核酸等を包含する）変性核酸；負の電荷の基を有するペプチド及びタンパク質；植物アルカロイド等の従来の薬物；並びに、負の電荷の基を有する類似体；等（しかし、それらに限定されない）の薬物並びに化合物の全てを包含する、既知の又は潜在的な治療剤のいかなる物も包含される。本質的にアニオン性でない諸治療剤は、本発明で容易に使用するためにアニオン基で誘導してもよい。例えば、パクリタキセルは、その２’炭素に結合したポリグルタミン酸基で誘導することができる。
【００２８】
カチオン性治療剤には、実質的に正の電荷を有するか；又は、該治療剤の他の負電荷の基によって妨げられることなく負の脂質と相互作用をすることのできる、正に帯電した基を有する；あらゆる治療剤が包含される。そのような治療剤には、カチオン電荷に結合した修飾核酸；正の電荷の基を有するペプチド及びタンパク質；植物アルカロイド等の従来の薬物；並びに、正の電荷の基を有する類似体；等（しかし、それらに限定されない）の薬物並びに化合物の全てを包含する、既知の又は潜在的な治療剤のいかなる物も包含される。本質的にカチオン性でない諸治療剤は、本発明で容易に使用するためにカチオン基で誘導してもよい。
【００２９】
帯電した諸治療剤は典型的には当初、通常、ある量のエタノール又は他の有機溶媒を含有する緩衝水溶液に入れる。塩濃度は、本発明で使用する自己集合プロセス(self assembly process)（米国特許出願シリアルＮｏ．０９／１６９５７３号明細書；これに言及することにより本明細書に組み入れる）に強い影響を及ぼす場合があるので、使用する緩衝塩は注意深く選定しなければならない。更に、全ての緩衝液は、微量が最終製剤に残存することがあるため、薬学的に受け入れられなければならない。適切な緩衝液は、ホスホロチオエート型オリゴデオキシヌクレオチドに対しては３００ｍＭクエン酸塩緩衝液である。一層小さい結合親和性(binding affinities)を有する、ホスホジエステルベースのオリゴデオキシヌクレオチド及びプラスミドＤＮＡに対しては、イオン強度が一層小さい緩衝液が適切である。例えば、典型的なクエン酸塩濃度は２５〜１５０ｍＭであり、最大の閉じ込めが生じるのは約５０ｍＭである。エタノール、又は含有されることもある他の有機溶媒は、水性有機混合物中の治療剤の溶解度によって制御されるし、また、治療剤と予め形成された脂質小胞との最終混合物の望ましい特性によっても制御される。
【００３０】
脂質、不安定化溶媒及び治療剤は、一緒に作用して、脂質で十分に被包された組成物が提供されるように選定する。従って、もし治療剤がポリアニオン性オリゴヌクレオチドであるならば、脂質成分は、安定化溶媒中の諸条件下でカチオン性である脂質を含有するように選定する。逆に、もし治療剤がカチオン性であるならば、脂質成分は、不安定化溶媒中の諸条件下でアニオン性である脂質を含有するように選定すべきである。このことは、脂質溶液中に含有される全ての脂質が帯電していなければならないことも、幾らかの量の、同様に帯電している脂質若しくは両性イオン性脂質の取り込みを排除することも意味していない。上記のことは単に、脂質溶液が、治療剤の実効電荷と反対の実効電荷を有する脂質を持っていなければならないことを意味する。
【００３１】
本発明の方法では、脂質粒子及び治療剤の比較的希薄な溶液を使用する。治療剤溶液は通常、治療剤 １〜１０００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度を持ち、０．２〜１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１〜２ｍｇ／ｍｌの範囲の（予め形成された脂質小胞と混合した後の）最終濃度を生じる。予め形成された脂質小胞は治療剤溶液と混合して、（治療剤溶液と混合した後の）得られた脂質濃度が約１．５〜３０ｍｇ／ｍｌ（約２〜４０ｍＭ）、好ましくは１０ｍｇ／ｍｌとなるようにする。ポリヌクレオチド治療剤と共に使用する予め形成された小胞の好ましい組成物は、標準的脂質比［ＰＥＧ−ｃｅｒＣ14：ＤＯＤＡＰ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ（モル比 ５：２５：２５：４５）］で造られる。この溶液は、１００％エタノールに入れ、水性緩衝液（例えば、ｐＨ ４．０の３００ｍＭクエン酸塩）と混合することによって、エタノール５〜５０％（好ましくはエタノール４０％）に希釈する。
【００３２】
被包化は、脂質溶液とオリゴヌクレオチド溶液とを一緒に十分に混合されるまで撹拌し；次いで、全く混合しないで、或いは約１〜２時間の間、穏かに混合して、定温放置する；ときに生じる。次いで、得られた溶液を透析して、エタノール；又は脂質粒子の膜を不安定にする他の物質；を取り除く。粒子の外部と複合体を形成するかも知れない治療剤を解放するために、（帯電脂質が滴定可能である場合）ｐＨを調整し、表面電荷を中性化することもある。
【００３３】
本発明の方法によると、定温放置工程の終りに、自発的に形成され、十分に被包された治療剤の粒子であって、治療用途に受け入れられ；且つ、予め形成された脂質小胞の出発サイドに基づいて予測することのできる；粒度を有する該粒子が生じることとなる。従って、当業者に知られているタイプの分粒工程(sizing step)は通常、必要でない。このことは好都合である。なぜなら、治療剤を取り込んだ後、脂質小胞に対して何ら機械的応力を加える必要がなく；また、治療剤を減損させる危険性も、治療剤を損傷させる危険性も全くないからである。生成物粒子を更に分粒することが望まれるなら、得られた脂質粒子を分流するための随意的工程を採用することができる。また、分粒工程は、望ましい粒度の出発小胞を得るために、治療剤を導入する前の予め形成された小胞を調製する工程の一部として、採用することができる。
【００３４】
脂質粒子を分粒するための方法は幾つかあり、通常、これらの方法のいずれも、分粒することが本発明の一部として使用されるとき、採用することができる。押し出し(extrusion)方法は、リポソームを分流するための好ましい方法である。「ホープ(Hope)，ＭＪ等：押し出しによるリポソーム粒度の減縮及び単層小胞の調製(Reduction of Liposome Size and Preparation of Unilamellar Vesicles by Extrusion Techniques)，Ｉｎ：Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｇ．，グレゴリアディス(Gregoriadis)，編集）」を参照。この方法は、小孔ポリカーボネート膜又は非対称のセラミック膜を通過させてリポソームを押し出し、リポソーム粒度を小さくして比較的明確な粒度分布にすることから成る。典型的には、リポソームの望ましい粒度分布が達成されるまで、懸濁液をその膜に１回以上循環させる。リポソームは、リポソーム粒度を漸進的に小さくするために、孔が逐次的に小さくなって孔膜を通過させて押し出すことができる。
【００３５】
リポソーム［サイジング・リポソーム(sizing reposomes)］の母集団の粒度を小さくするためには、当業者に知られている種々の代替的方法を利用することができる。１つの分粒方法は、米国特許第４，７３７，３２３号明細書に記述されており、その明細書は言及することにより本明細書に組み入れる。浴超音波分解若しくはプローブ超音波分解によりリポソーム懸濁液を超音波処理することによって、粒度を漸進的に小さくし、直径が約０．０５μｍ未満の小さい単層小胞にする。均質化(homogenization)はもう１つの方法である。この方法は、大きいリポソームを崩壊させて一層小さいリポソームにするためのエネルギーを奪い取ることに依る。典型的な均質化において、多重膜小胞は、選定したリポソーム粒度（典型的には、約０．１〜０．５μｍ）が観測されるまで、標準エマルション・ホモジェナイザー(standard emulsion homogenizer)を通して再循環させる。リポソーム小胞の粒度は、「Ｂｌｏｏｍｆｉｅｌｄ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１０，４２１〜４５０（１９８１）」に記述されるように、準電光散乱(quasi-electric light scattering)（ＱＥＬＳ）によって決定することができる。リポソームの平均直径は、形成されたリポソームの超音波分解により小さくすることができる。断続的超音波分解サイクルは、ＱＥＬＳ評価と交互に入れ替えて、能率的なリポソーム合成を導くことができる。
【００３６】
種々のリポソーム分粒方法によって造られたリポソームの好ましい粒度は、ある程度、リポソームが造られている用途に左右されるが、通常、２５〜２５０ｎｍの範囲内となる。適切な粒度の具体的な諸例は、以下の諸例に開示する。
本発明により造られる脂質粒子の研究において、中空の大きい単層膜小胞（ＬＵＶ）は、閉じ込められた治療剤を有する多重膜小胞に転化されるということが、意外なことに発見された。いかなる特定の機構に縛られる意図はないが、生じているプロセスは、図１に示されるようなものであって、カチオンに帯電した脂質と、アニオン性治療剤とが想定される。そのプロセスは、単層小胞１０で出発する。単層小胞１０は、カチオン性脂質を含有する結果として、二重層壁の内側表面及び外側表面に正の表面電荷を有する。アンチセンス・オリゴヌクレオチド１１等のアニオン性治療剤を添加することによって、中間複合体１２が形成されることとなる。中間複合体１２において、治療剤の分子１１は、イオン機構／静電気機構によって、ＬＵＶの表面上で、逆に帯電した脂質に結合されている。
【００３７】
このプロセスの次工程は、凝集工程であると思われる。凝集工程において、ＬＵＶ／治療剤の複合体の凝集体１３が形成される。この凝集工程は非常に複雑であり、帯電した治療剤によって影響されるだけでなく；外見上、不安定化剤（例えば、エタノール）の量、及び予め形成された小胞中の変性脂質の量に依存しているようである。これらの諸プロセスに関するある種の限定された知識は、当業者に提供されているが、本発明のベースとなっている現象を当業者は、予測することも説明することもできない。カチオン性のリポソーム／ＤＮＡ複合体は、接触領域の平らな二重層隔膜を有する凝集したリポソームのクラスター(clusters)；ＤＮＡで被覆されたリポソーム；及び、（凝集した）多重膜構造であって、脂質の二重層の間にＤＮＡが挟まれている該構造；を包含する多種多様の異なった構造を示すことが知られている［グスタフソン(Gustafsson)等，１９９５；ラシク(Lasic)，１９９７；ラシク等，１９９７；ヒューブナー(Huebner)等，１９９９；シュ(Xu)等，１９９９］。後者の構造は、二重層又はリポソームを平らに積み重ねたものであり、それら構造の外部表面にはしばしば、開放二重層セグメントを示す。類似の諸構造は、負に帯電したリポソームにＣａ2+が結合した後で観察されてきた［パパハドジョポーロス(Papahadjopoulos)，１９７５；ミラー(Miller)及びダール(Dahl)，１９８２；ランド(Rand)等，１９８５；カカール(Kachar)等，１９８６］。これらの系で構造変形が生じることは、二重層の破壊及び融合のような、接着媒介プロセスの結果であると考えられた［ランド(Rand)等，１９８５；カカール(Kachar)等，１９８６；ヒューブナー(Huebner)等，１９９９］。第１に、リポソームは、ＤＮＡ又はＣａ2+によって架橋して凝集する。接触領域の急速な広がりは、諸リポソームが互いに平らになるように変形する。このために、二重層は増大した張力下に置かれる。もし張力（接着エネルギー）が十分に大きいならば、脂質膜上にかかる応力は、融合（面積／体積比の増大）及び／又は破壊（体積損）によって取り除かれる。面積が約３％だけ増大したとき、大抵の二重層は破壊する［エバンズ(Evans)及びパルセジアン(Parsegian)，１９８３］。二重層が破壊するとき、小胞は互いに平らになって崩壊し、多重膜の積み重なったもの(stacks)を形成する。エタノール等の膜不安定化剤は、カチオン性リポソームが、ＤＮＡ又はオリゴヌクレオチドと相互作用を起こすとき、構造の再配列が生じるのを調整することができる。
【００３８】
本発明の方法において、エタノールの存在下で単層小胞から多重膜リポソームが形成されることはまた、それらの形成のための接着媒介プロセス(adhesion-mediated process)の証拠となる。しかし、この場合の生成物は同心二重層殻であるため、そのプロセスは、ある点で、終端膜(terminated membranes)を有する複合体と相違する。後者の諸構造を形成するためには、エタノール又は類似の不安定化剤が必要であるが、これらの構造の再配列がどのように影響を受けるのかはっきりしていない。これらの再配列は、脂質のフリップ・フロップ（これは、アルコール濃度と相関がある）だけでなく；一層小さい諸分子に対する膜透過性障壁の損失、及び迅速な脂質交換とも相関がある。加えて、ＬＵＶから変性脂質を交換することは、脂質小胞の再組織化にとって重要な因子である。いずれにしても、ある種の機構によって、凝集体１３は再配列して、薄層間及び小胞の内部に閉じ込められた治療剤を有する多重膜小胞１４を形成する。この再配列は、形成される凝集体の性質だけでなく、凝集体が定温放置される温度にも左右される。治療剤の中には、多重膜小胞の外部の電荷と結合したままであるものがある。これらは、電荷の中和(neutralization)（例えば、滴定可能な帯電済み脂質の場合は、酸若しくは塩基を用いて）、又はイオン交換によって取り除くことができる。
【００３９】
脂質小胞及び不安定化溶媒の幾つかの特性は、最終生成物の特性に重要であり；また、これらの諸特性の選定は、生成物の多重膜小胞の特性を制御するのに使用することができる；ことが実験によって見出された。これらの諸特性には、
（１）予め形成された脂質小胞中に、治療剤の電荷と逆の電荷を有する帯電脂質が含有されていること；
（２）凝集を遅らせるには十分な量であるが、凝集を妨げるには十分でない量で、修飾脂質が含有されていること。ＰＥＧ−ＣｅｒＣ14の場合、その量は、約２．５〜１０％であることが分かった；
（３）不安定溶媒中に、（例えば、エタノール、洗剤等の）不安定剤が、予め形成された脂質小胞を不安定にするがそれら予め形成された脂質小胞を崩壊しない量で含有されていること；及び
（４）凝集工程及び閉じ込め工程が減結合しない(decoupled)温度で、脂質で十分に被包された治療剤の粒子の集合体を予め形成すること。通常、これは、室温（〜２０ｏＣ）以上の温度範囲で操作する必要があり、この温度範囲は不安定剤の濃度及び脂質の組成に左右される；
が包含される。
【００４０】
本発明の方法は、従来の混合装置を用いて実施することができる。しかし、大規模製造のためには、同時に出願されたＰＣＴ出願［主題：脂質小胞を調製するための方法と装置(Methods and Apparatus for Preparation of Lipid Vesicles)；シリアル番号はまだ与えられていない；出願日：２０００年７月１４日；代理人生理番号：８０４７２−６］に記載されている、特別に適合した装置を使用することが望ましい。その明細書は、言及することによって本明細書に組み入れる。
さて、本発明の方法は、次の非限定的諸例に言及して、更に説明される。
【００４１】
例
次の諸例で使用する諸物質は次のように供給される：
この研究で使用した、ホスホロチオエート・アンチセンス・オリゴデオキシヌクレオチド及びプラスミドＤＮＡは、イネックス製薬（Inex Pharmaceuticals）（バーナビー（Burnaby），ＢＣ，カナダ）によって提供された。オリゴヌクレオチドのｍＲＮＡ標的及び配列は次の通りである：
ヒトｃ−ｍｙｃ，５’−ＴＡＡＣＧＴＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴ−３’（配列ＩＤ番号１）；
ヒトＩＣＡＭ−１，５’−ＧＣＣＣＡＡＧＣＴＧＧＣＡＴＣＣＧＴＣＡ−３’（配列ＩＤ番号２）；及び
ＦＩＴＣ−標識ヒトＥＧＦＲ，５’−ＣＣＧＴＧＧＴＣＡＴＧＣＴＣＣ−３’（配列ＩＤ番号３）。
【００４２】
１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）は、ノーザン・リピッズ（Northern Lipids）（バンクーバー（Vancouver），ＢＣ，カナダ）から購入した。また、１,２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）；１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホセリン−Ｎ−（７−ニトロ−２−１,３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル）（ＮＢＤ−ＰＳ）；１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（リサミン ローダミン ｂ スルホニル）[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-（lissamine rhodamine b sulfonyl）]（ＬＲｈ−ＰＥ）；及び１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（７−ニトロ−２−１,３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル）（ＮＢＤ−ＰＥ）；は、アバンチ・ポーラー・リピッヅ（Avanti Polar Lipids）（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）から購入した。１−ヘキサデカノイル−２−（１−ピレンデカノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン[1-Hexadecanoyl-2-（1-pyrenedecanoyl）-sn-glycero-3-phosphocholine]（Ｐｙ-ＨＰＣ）；及びオリゴヌクレオチド−結合染料オリグリーン[oligonucleotide-binding dye OliGreen]は、モレキュラ・プローブズ（Molecular Probes）（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から入手した。１−Ｏ−（２’−（ω−メトキシポリエチレン−グリコール）スクシノイル）−２−Ｎ−ミリストイルスフィンゴシン（ＰＥＧ-ＣｅｒＣ14）；放射能標識［3Ｈ］−ＰＥＧ−ＣｅｒＣ14；及び１−Ｏ−（２’−（ω−メトキシポリエチレン−グリコール）スクシノイル）−２−Ｎ−ドデカノイルスフィンゴシン（ＰＥＧ-ＣｅｒＣ20）；は、ＩＮＥＸ ファルマシューティカルズ（Pharmaceuticals）（Ｂｕｒｎａｂｙ，ＢＣ，カナダ）によって提供された。コレステロール（chol）；ｎ−オクチル β−Ｄ−グルコピラノシド（ＯＧＰ）；トリトン（Triton） Ｘ−１００；カルセイン；ジクロロジメチルシラン；ヒドロ亜硫酸ナトリウム（亜ジチオン酸塩）；２−ｐ−トルイジニルナフタレン−６−スルホネート（ＴＮＳ）；ポリアネトールスルホン酸（ＰＡＳＡ）；は、シグマ（Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ，カナダ）から入手した。四酸化オスミウム；クエン酸鉛；マレイン酸；カコジル酸ナトリウム；及び埋め込み樹脂Ｅｍｂｅｄ ８１２；は、エレクトロン・マイクロスコープ・サイエンシズ（Electron Microscopy Sciences）（フォートワシントン（Fort Washington），ＰＡ）から購入し、また、低融点（Ｌ．Ｍ．Ｐ）アガロースは、ライフ・テクノロジーズ（Life Technologies）（Ｂｕｒｌｉｎｔｏｎ，オンタリオ）から購入した。コレステロール（ＣＨＯＬ）は、シグマ・ケミカル・カンパニー（Sigma Chemical Company）（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ミズリー州，米国）から購入した。ＰＥＧ−セラミドは、ＰＣＴ ＷＯ ９６／４０９６４号明細書（この明細書は、言及することによって本明細書に組み入れる）記述されている手順を用いながら、イネックス・ファルマシューティカルズ社（Inex Pharmaceuticals Corp.）のチャオ・ワング（Zhao Wang）博士が合成した。［3Ｈ］又は［14Ｃ］−ＣＨＥは、ＮＥＮ（米国マサチューセッツ州、ボストン）から購入した。脂質は全て、９９％を越える純度であった。エタノール（９５％）、メタノール、クロロホルム、クエン酸、ＨＥＰＥＳ及びＮａＣｌは全て、商業的供給業者から購入した。
【００４３】
分析方法： 脂質−治療剤が「十分に被包」されているように「被包」されているかどうかを決定するために使用した分析方法は、ＷＯ ９８／５１２７８号明細書に開示されている（その明細書は、言及することによって本明細書に組み入れる）。そのような方法には、Ｓ１ヌクレアーゼ消化、血清ヌクレアーゼ、及び小球菌ヌクレアーゼ分析法が包含される。
【００４４】
オリグリーン（Oligreen）分析は、小胞の中に負荷されたオリゴヌクレオチドを定量するのに使用した。水溶液中の１本鎖オリゴヌクレオチドを定量するための蛍光染料結合分析（fluorescent dye binding assay）は、ビオルミン（Biolumin）（登録商標）９６０蛍光プレート・リーダー［米国カリフォルニア州サニーベール、モレキュラー・ダイナミックス（Molecular Dynamics）］を用いて確立した。手短に言えば、被包済みオリゴヌクレオチドのアリコートは、ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水（ＨＢＳ；２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１４５ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ ７．５）で希釈した。希釈率１：２００のオリグリーン（Oligreen）（登録商標）試薬の１００μリットル［トリトン（Triton）Ｘ−１００洗剤 ０．１％を含有するものと含有しないものの両方］に、希釈試料の１０μリットルアリコートを添加した。被包済みオリゴを定量するため、トリトンＸ−１００洗剤 ０．１％を含有するものと含有しないものを用いて、オリゴ標準曲線を作成した。オリグリーン（Oligreen）（登録商標）−アンチセンス複合体の蛍光性（fluorescence）は、４８５ｎｍの励起波長及び５２０ｎｍの発光波長を用いて測定した。表面関連アンチセンス（surface associated antisense）は、洗剤の不存在下及び存在下の蛍光測定値を比較することによって決定した。
【００４５】
動的光散乱（dynamic light scattering）： 粒度は、ＮＩＣＯＭＰ３７０粒度測定器［カリフォルニア州サンタバーバラ、ニコン・パーティクル・サイジング社（Nicomp Particle Sizing Inc.）］を用いて、動的光散乱によって決定した。本出願書類全体に渡り、実験による相関関数からのキュムラント適合度（cumulant fit）によって得られた数平均粒度（number-averaged sizes）が与えられている。多分散性（polydispersity）は、モノモードガウス粒度分布（monomodal Gaussian size distribution）の半値高さ半値幅（half-width at half-height）として表わす。エタノール／クエン酸塩緩衝液の粘度は、ウベローデ型粘度計［キャノン（Cannon） ５０］を用いて決定した。２３℃の水と比較して測定した、同一温度のエタノール／３００ｍＭクエン酸塩緩衝液［４０／６０（ｖ／ｖ）］の粘度は、２．６７４ｍＰａ*ｓであることが分かった。ゼータ電位は、クールター（Coulter）光散乱計器［ＤＥＬＳＡ，クールター電子社（Coulter Electronics Inc.），ＦＬ］を用いた、電気泳動光散乱によって決定した。
【００４６】
脂質のフリップ・フロップ（flip-flop）： 脂質のフリップ・フロップは、亜ジチオン酸ナトリウムを用いて［マッキンタイヤ（McIntyre）及びスレイト（Sleight）（１９９１）；レンツ（Lentz）等（１９９７）］、蛍光脂質、ＮＢＤ−ＰＳを、非蛍光化合物まで化学還元することによって決定した。リポソームは、２０ｍＭ脂質で、１モル％ ＮＢＤ−ＰＳの存在下、押し出すことによって調製した。外部単一層に位置するＮＢＤ−ＰＳのみが、外部媒体に添加された還元剤（亜ジチオン酸塩）に接近することができる。内部単一層から外部単一層までのそれの再分配は、外部膜のリーフレット（leaflet）中でＮＢＤ−ＰＳが還元された後、生じる。１モルの亜ジチオン酸ナトリウムを、１モルのＴＲＩＳで新たに調製した。外部単一層中のＮＢＤ−ＰＳは、ＮＢＤに応じた亜ジチオン酸ナトリウムの１００倍過剰のモルを添加し；次いで、１０分間定温放置する；ことによって還元した。反応の完了は、４６５ｎｍでの還元励起（reduction exciting）の前後において、５２０ｎｍでの亜ジチオン酸塩の蛍光発光を測定することによって調べた。次いで、過剰の亜ジチオン酸塩は、「セファデックス（Sephadex） Ｇ５０ カラム」でのサイズ排除クロマトグラフィー（size exclusion chromatography）によって排除した。リポソームは、４０％エタノールの存在下で定温放置し、最終脂質濃度 １５０μＭに対応するアリコートを種々の時間ポイントで測定のために取り去った。
【００４７】
漏出試験： ＬＵＶｓのエタノール誘導透過性を、種々の温度で、また、閉じ込められた溶質の大きさ（分子量）の関数として測定した。漏出に対する低分子量のマーカーとしては、カルセインを使用し、また、高分子量のマーカーとしては、ＦＩＴＣ−デキストラン（dextran）（分子量 １９５００）を使用した。自己消光濃度で閉じ込められたカルセインの漏出の後、カルセインの蛍光の脱消光（dequenching）をモニタリングした。ＬＵＶｓは、水酸化ナトリウムを添加することによってｐＨ ７．５に調整した、カルセイン ７５ｍＭ及びＨＥＰＥＳ ５ｍＭを含有する水溶液で、脂質膜を水和し；次いで、５回の凍結／融解サイクルにかけ；二重に積み重ねた１００ｎｍフィルタを通して（１０回通過）押し出しを行う；ことによって調製した。ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＣｅｒＣ14／ＤＯＤＡＰの押し出しは、６０℃で行った。閉じ込められなかったカルセインは、「ＤＥＡＥ セファローズ（Sepharose）ＣＬ６Ｂカラム」でのアニオン交換クロマトグラフィによって、等浸透圧性（isoosmotic）ＨＢＳ緩衝液に対して交換した。リポソームの原液（stock solution; 貯蔵液）は、２５℃、４０℃又は６０℃で予備均衡化された、変動量のエタノールを含有するＨＢＳで、３μＭの脂質濃度に希釈した。対応する温度で５分間定温放置を行った後、「Perkin Elmer ＬＳ５０ 蛍光計（Perkin Elmer）」を用いて、５２０ｎｍでの蛍光を測定した［励起波長 ４８８ｎｍ；４３０ｎｍでのロングパス・フィルタ（long-pass filter）］。１０％「Triton Ｘ−１００」溶液を添加して、最終濃度を０．０５％にすることによって、１００％漏出（最大の脱消光）のための値を得た。カルセインの漏出は、
漏出（％）＝（Ｆs−Ｆb）／（ＦTx−Ｆb）*１００
［式中、Ｆｓは試料の蛍光であり；Ｆbは、エタノールの不存在下で、カルセイン含有リポソームに対応するバックグラウンドであり；ＦTxは、「Triton Ｘ−１００」値である］に従って計算した。
【００４８】
ＦＩＴＣ−デキストラン（dextran）（分子量 １９５００）は、０．５モル％ ＬＲｈ−ＰＥを取り入れて、４５ｍｇ／ｍｌの最終濃度にして、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＣｅｒＣ14／ＤＯＤＡＰのリポソーム中に閉じ込めた。閉じ込めは、エタノールに溶解した脂質を、ＨＢＳに入れたＦＩＴＣ−デキストラン溶液に添加し；次いで、押し出しを行い（二重に積み重ねた１００ｎｍフィルタ、２回通過）；次いで、透析によってエタノールを除去する；ことによって実施した。閉じ込められなかったＦＩＴＣ−デキストランは、「セファローズ（Sepharose）ＣＬ４Ｂ カラム（１．５×１．５ｃｍ）」でのサイズ排除クロマトグラフィーによって排除した。４０％エタノールにさらされたリポソームからのＦＩＴＣ−デキストランの損失は、「セファローズ ＣＬ４Ｂ カラム（１．５×１．５ｃｍ）」でのサイズ排除クロマトグラフィーによって解放されるＦＩＴＣ−デキストランを除去した後、決定した。ＦＩＴＣ／ＬＲｈ−ＰＥの比は、エタノール添加の前後に測定した。ＦＩＴＣ及びＬＲｈ−ＰＥの蛍光は、励起波長をそれぞれ４８５ｎｍ及び５６０ｎｍに設定して、５１５ｎｍ及び５９０ｎｍで測定した。
【００４９】
脂質混合（Lipid mixing）： ドナー（ＮＢＤ−ＰＥ）とアクセプター（ＬＲｈ−ＰＥ）の間で、共鳴エネルギー移動の損失が生じた後に、エタノール誘導脂質混合／交換が生じ、また、これらドナー及びアクセプターは、非標識標的膜の中にプローブが希釈されるとき、極めて接近している［ストラック（Struck）等，１９８１］。ＬＵＶｓは、ＮＢＤ−ＰＥとＬＲｈ−ＰＥの両方を０．７５モル％含有した。標識リポソーム及び非標識リポソームは、ｐＨ ７．５のＨＢＳ中で、２０ｍＭの脂質濃度で押し出しを行うことによって調製した。標識リポソーム及び非標識リポソームにエタノールを添加して、最終エタノール濃度が４０％（ｖ／ｖ）になるようにした。次いで、標識リポソーム及び非標識リポソームのエタノール性分散系を、１：５のモル脂質比で混合し；次いで、適切な温度で定温放置した。所定の時間ポイントで、アリコートを回収し；次いで、ＨＢＳ ２ｍｌに加えて、１５０μＭの最終脂質濃度を与えた。ＮＢＤ及びＬＲｈの発光スペクトルは、励起波長を４６５ｎｍに設定して（４３０ｎｍ発光、ロングパス・フィルタ）、５０５〜６５０ｎｍの範囲で測定した。バックグラウンドを差し引いた後（１５０μＭ脂質の非標識リポソーム）、共鳴エネルギー移動の損失は、ＮＢＤ／ＬＲｈ比の増加として表わした。
【００５０】
ピレン−ＨＰＣ分析： ピレン−ＨＰＣは、高濃度で励起状態の二量体を形成し、モノマーとは異なる波長で蛍光を発する。エキシマーの形成は、拡散律速過程であり、２つの分子が一緒になって二量体を形成する必要がある。膜中のピレン−ＨＰＣの横への可動性（lateral mobility）が減少することも、脂質を混合すること（標的膜）も、ピレンエキシマーの蛍光が減少することとなり得る［フックストラ（Hoekstra），１９９０；デュポールテイル（Duportail）及びリアノス（Lianos），１９９６］。外側相を分離すれば、通常、ピレンエキシマーの蛍光が減少することとなる［デュポールテイル及びリアノス，１９９６］。この試験の理論的根拠は、リポソーム膜に及ぼすオリゴヌクレオチド結合の影響を調べることであった。オリゴヌクレオチドを閉じ込めるリポソームのピレン−ＨＰＣの蛍光は、膜間ｐＨ勾配が減損する前後に、中空の対照リポソームと比較した。内部のｐＨが７．５に増大することによって、膜結合済みオリゴヌクレオチドが解放されることになる。７モル％の濃度でピレン−ＨＰＣを取り込んでいるリポソームは、ｐＨ ４のクエン酸塩緩衝液に、エタノールに溶解した脂質を添加することによって調製した。アリコートを取り去り、上述のようにオリゴヌクレオチドを被包した。残りの初期リポソームは、後続の諸工程の全てにおいて同様のやり方で処理した（以下の閉じ込みを参照）。ｐＨ勾配は、ｐＨ ７．５に調整した酢酸アンモニウムを用いて消失させた。リポソームは、適切な緩衝液、ｐＨ ７．５のＨＢＳ、又はｐＨ ７．５の１５０ｍＭ 酢酸アンモニウムで希釈して、２μＭの最終脂質濃度にした。ピレン−ＨＰＣ発光スペクトルは、３４５ｎｍで励起し、３５０ｎｍの発光カットオフ・フィルタを用いて、３６５〜５５０ｎｍの波長領域で記録した。［３９７ｎｍでのモノマーの蛍光］対［４７８ｎｍでの二量体の蛍光］の強度比は、ｐＨ勾配が消失する前後において、オリゴヌクレオチド含有リポソームに対しても、初期リポソームに対してもプロットした。
【００５１】
31Ｐ ＮＭＲ分光分析法： ８１ＭＨｚで作動する「ブルーカー（Bruker） ＭＳＬ２００」分光計を用いて、31Ｐ ＮＭＲスペクトルを得た。１０ｍｍプローブの２．０ｍｌ試料について、２０００Ｈｚのスペクトル幅と、３秒インターパルス遅れを伴う２．８μｓ５０°パルスとを使用することによって、８００又は２４００走査（scans）に対応する自由誘導減衰（free induction decays）（ＦＩＤｓ）を集めた。減結合している（decoupling）プロトンは全く使用しなかった。線広がり（line broading）の２５Ｈｚに対応する指数的増加は、フーリエ変換を行う前にＦＩＤｓに適用した。化学シフトは、外部の８５％リン酸（Ｈ3ＰＯ4）に関係した。ｐＨ ７．５での遊離オリゴヌクレオチド及び被包されたオリゴヌクレオチドのスピン格子緩和時間（Ｔ1）は、Ｔ1free＝１．７秒、及びＴ1enc.＝２．１秒と本質的に同一であった。Ｔ1値は、逆位−回復パルス配列（inversion-recovery pulse sequence）によって測定した。５０°パルスに対する３秒のインターパルス遅れによって、全てのアンチセンス共鳴の完全な緩和が可能となる。
【００５２】
超遠心分離法（Ultracentrifugation）： オリゴヌクレオチドを被包したリポソーム、及びオリゴヌクレオチドを被包しなかったリポソームは、ｐＨ ７．５のＨＢＳ中のショ糖 １％、２．５％、１０％及び１５％（ｗ／ｖ）であって、それぞれ３．５、３．５、２．５及び１．５ｍｌの段階容量を有するものから成るショ糖段階勾配（sucrose step gradient）について、超遠心分離法によって分別した。「ＳＷ４１Ｔｉ」回転子を組み合わせた「ベックマン（Beckmann）Ｌ８−７０」超遠心分離機を使用して、３６０００ｒｐｍ（ＲＣＲRmax ２２１０００ｘｇ）で２時間の間、諸試料を分離した。勾配は、上部から分別するか；又は針でチューブに穴をあけた後、注射器を用いて個々のバンドを除去した。
【００５３】
極低温透過型電子顕微鏡検査（Cryo-Transmission Electron Microscopy）（cryo-TEM）： 試料の１滴を、穴あき炭素膜を有する、標準電子顕微鏡グリッドに塗った。過剰の液は、炭素膜の穴を覆っている水の薄層を残しながら、ろ紙で吸い取ることによって除去した。グリッドは、液体エタンで急速に凍結し、小胞が無定形氷の薄膜中に埋め込まれる結果となった。「フィリップス（Philips）ＣＭ２００ ＦＥＧ」電子顕微鏡の「Ｇａｔａｎ」低温ホールダーを用い、６６０００倍、１．５μｍ以下の焦点ボケの極低温条件下で、氷中の小胞の画像を得た。
【００５４】
凍結破断電子顕微鏡検査（Freeze-Fracture Electron Microscopy）： 試料は、２５％ グリセロールの存在下、液体Ｎ2で冷却した液体フロン（Freon）２２の中にそれら試料を沈めることによって、極低温固定した。破面は、「バルツァーズ凍結エッチング（Balzers Freeze-Etching） ＢＡＦ ４００Ｄ （リヒテンシュテインのバルツァーズ（Balzers））」を使用して、白金（４５°）で一定方向に影を投じ、また、炭素（９０°）で被覆した。「ＪＥＯＬ Ｍｏｄｅｌ ＪＥＭ １２００ＥＸ」電子顕微鏡［カナダ、ＱＣ、モントリオール、Soquelec］を使用して、レプリカ（replicas）を分析した。
【００５５】
透過型電子顕微鏡検査（Transmission Electron Microscopy）（TEM）： 小胞は、２％ 四酸化オスミウムの１容量を、ＨＢＳに入れた小胞の０．５容量に加えることによって固定し；次いで、１７０００ｘｇ、４℃で４５分間、遠心分離機で分離した。得られたペレットは、等容量の３％アガロース／ＰＢＳと混合し、顕微鏡のスライドの上にピペットで移し、次いで、４℃に冷却した。小胞を含有する、固化したアガロースは、１ｍｍの断片に切断し、次いで、更なる処理を行うため、ガラス管に移した。それらブロック（blocks）は、２％酢酸ウラニルで１時間染色する前に、ｐＨ ５．２の０．０５Ｍ マレイン酸で、３×５分間の間、洗浄した。組織片は、一連の傾斜アルコール（５０〜１００％）で脱水し；［エポキシ樹脂（ＥＭｂｅｄ ８１２）］：［プロピレンオキシド］比を増大させて浸透させ；次いで、１００％「ＥＭｂｅｄ ８１２」の中に６０℃で２４時間の間、埋め込んだ。極薄切片は、２％クエン酸鉛で染色し、次いで、「ツァイス（Zeiss） ＥＭ １０Ｃ」透過型電子顕微鏡（ドイツ、オーベルコッヒェン）を使用して検査を行った。
【００５６】
位相差蛍光顕微鏡検査（Phase contrast and fluorescence microscopy）： 光学的仕様「エキサイテーション ４７５±２０／２色性 ５００／エミッション ５３５±２２．５」を有する、オメガ・オプティカル（Omega Optical）（バーモント州ブラトルバロ）からの「１．６ｘ optovar」レンズ及び「ＸＦ１００」フィルターセットと組み合わせた、「Plan Apochromat 63x/1.4NA」油浸レンズを使用している、「Zeiss Axiovert １００」顕微鏡によって、位相差蛍光顕微鏡検査を行った。画像は、「Zeiss ＭＣ８０ ＤＸ」顕微鏡カメラを用いて、１６００ ＩＳＯの「Kodak Ektachrome Ｐ１６００」カラー・リバーサル・フィルムに記録した。スライド及びカバーガラスは、ジクロロジメチルシランでシリコン化して、さもなければ負に帯電するガラス表面を中和した。
【００５７】
（例１）
ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４、ＤＯＤＡＰ、ＤＰＳＣ及びＣＨＯＬを、５：２５：２５：４５のモル比で含有する脂質混合物から、中空の予め形成された小胞を調製した。それら４種の脂質を１００％エタノールに溶解し、全脂質濃度 ２５ｍｇ／ｍｌ（３３ｍＭ）にした。次いで、エタノール性脂質は、０．２５ｍｍのオリフィス直径を有する噴射ノズルを通して、３００ｍＭのクエン酸塩緩衝液（ｐＨ ４．０）を含有する容器の中に導入した。容器及び全ての溶液は室温であった。エタノール性脂質の全容量は６リットルであり、脂質を導入するための流量は、２００〜３００ｍｌ／分であった。クエン酸塩緩衝液の全容量は９リットルであった。その結果として得られた１５リットルの混合物は、４０％のエタノール濃度と１８０ｍＭのクエン酸塩を有した。中央粒径 １７０±２０ｎｍの小胞が生成した。空の予め形成された小胞は、二枚の８０ｎｍの積み重ね膜を使用している、低圧（最高水準の５００〜１０００ｐ．ｓ．ｉ．から低下させた１００ｐ．ｓ．ｉ．）の押出し回路（extrusion circuit）を、６５℃で１〜３回通過させることによって、中央粒径 ９０〜１２０ｎｍの大きさに造った。次いで、それら中空の予め形成された小胞は、容器（reservoir）２０の中に貯留し、次いで、治療剤の溶液を添加するまで、４０℃に保持した。
【００５８】
（例２）
例１の予め形成された小胞を使用して、治療剤として、オリゴヌクレオチド ＩＮＸ−６２９５（配列ＩＤ番号１）を使用した、脂質で十分に被包された治療剤の粒子を造った。蒸留水に入れたオリゴヌクレオチド ＩＮＸ−６２９５は、１００％エタノールを追加することによって希釈し、４０％エタノールに入っているオリゴヌクレオチド １０、２０、３０、４０又は５０ｍｇ／ｍｌという種々の溶液を作った。エタノール性オリゴヌクレオチドは、４０℃の容器２０に入れた予め形成された小胞に、穏かに混合しながら添加した。エタノール性オリゴヌクレオチドの量及び容量を計算して、［薬物］：［脂質］の最終重量比 ０．１〜０．２５を与えた。次いで、その混合物は、１時間の間、穏かに且つ断続的に混ぜ合わせながら、４０℃で定温放置した。定温放置した後、その溶液は、ダイアフィルトレーション（diafiltration）によって処理し、遊離の又は過剰の付随オリゴヌクレオチドを取り除き、エタノールを除去し、次いで、緩衝系をｐＨ ７．４のリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と交換した。濃化、除菌及びパッケージを行うことによって、商業用製品の製剤が完成する。
【００５９】
（例３）
例２の手順は、種々のパラメータに変化を加えて繰り返して、本発明の、脂質で十分に被包された治療剤の粒子の調製にとっていずれのパラメータが重要であるかを決定した。これらの実験において、全オリゴヌクレオチドの回収率（収率）；全脂質の回収率（収率）；及び被包化効率；は、製品とプロセスの質を示すものと考えた。全オリゴヌクレオチドの回収率は、式：
［｛最終オリゴ濃度（ｍｇ／ｍｌ）×最終容量（ｍｌ）｝／
｛初期オリゴ濃度（ｍｇ／ｍｌ）×初期容量（ｍｌ）｝］×１００％
を用いて計算した。
全脂質の回収率は、式：
［｛最終脂質濃度（ｍｇ／ｍｌ）×最終容量（ｍｌ）｝／
｛初期脂質濃度（ｍｇ／ｍｌ）×初期容量（ｍｌ）｝］×１００％
を用いて計算した。
被包化効率（Ｅ．Ｅ．）；は、
［｛初期オリゴ（ｍｇ／ｍｌ）／初期脂質（ｍｇ／ｍｌ）｝／
｛最終オリゴ（ｍｇ／ｍｌ）／最終脂質（ｍｇ／ｍｌ）｝］×１００％
を用いて計算した。
被包された（即ち、二重層の中に組み込まれたか、又は脂質粒子の内部に閉じ込められた）オリゴの割合は、上述のオリグリーン分析（OliGreen assay）によって決定した。
【００６０】
［初期薬物］：［初期脂質］の比の有意性を判断するために、２つの異なる出発比（starting ratios）を用いて実験を行った。表１にその結果をまとめる。オリゴヌクレオチドを負荷するプロセスに、小胞の粒度の変化は全く観察されなかった。
【００６１】
【表１】
【００６２】
定温放置の温度の有意性を判断するために、室温と２種の高めた温度とで１時間の間、実験を行った。表２にその結果をまとめる。示される通り、６０℃という一層高い温度は、プロセスの有効性を損ない始め、また、粒度を増大させる。従って、一層低い温度が好ましい。
【００６３】
【表２】
【００６４】
定温放置の時間の有意性を判断するために、３種の定温放置時間と、４０℃定温放置温度とで、実験を行った。表３にその結果をまとめる。示される通り、収率は、０．５時間〜１時間の間で改善されるが、１時間を越える定温放置時間では、実質的に改善されない。このように、使用した装置での最も有効なプロセスは、約１時間の定温放置時間を使用することである。
【００６５】
【表３】
【００６６】
オリゴヌクレオチド溶液の緩衝液濃度の有意性を判断するために、クエン酸塩緩衝液の４種の異なる濃度と、初期［薬物］／［脂質］比 ０．１とで、実験を行った。表４にその結果をまとめる。
【００６７】
【表４】
【００６８】
混合工程の間の初期エタノール濃度の有意性を判断するために、２種の初期［薬物］／［脂質］比の各々について３種の異なる初期エタノール濃度で、実験を行った。表５にその結果をまとめる。各々の出発［薬物］／［脂質］比について異なる、最適エタノール濃度が存在するようである。表５には記載していない追加実験では、５０％の初期エタノール濃度を、０．１の［オリゴ］／［脂質］比と一緒に使用した。この実験で、未知の原因による重大な問題に遭遇し、製品の収率は全くなかった。
【００６９】
【表５】
【００７０】
初期オリゴヌクレオチド濃度の有意性（従って、同一の初期［薬物］対［脂質］比を得るための治療剤溶液の容量の有意性）を判断するために、オリゴヌクレオチドの４種の異なる濃度の原液（stock solutions）を使用した。表６にその結果をまとめる。示されるように、このパラメータは、本発明の方法を用いて得られる結果には重要でないように思われる。
【００７１】
【表６】
【００７２】
（例４）
一層大きい治療剤に対する、本発明の適用性を実証するために、プラスミド ｐＩＮＥＸ Ｌ１０１８（ＣＭＶプロモーターに連結したルシフェラーゼ遺伝子をコード化しており、また、ＳＶ４０エンハンサー及びＡｍｐＬ遺伝子を持っている５．５ｋｂプラスミド）を予め形成された脂質小胞の中に負荷した。
予め形成された脂質小胞は、１００％エタノールに溶解した諸脂質（２０／４５／２５／１０モル％比でのＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＯＤＡＰ／ＰＥＧ−Ｃｅｒ１４）１０ｍｇを、２５ｍＭクエン酸塩緩衝液［水酸化ナトリウムでｐＨ ４に調整した、２５ｍＭクエン酸、２５５ｍＭスクロース（ショ糖）］にゆっくり添加することによって調製した。両方の溶液は、混合する前に、４０℃に予熱した。最終エタノール濃度は、４０％（ｖ／ｖ）であった。脂質小胞のエタノール分散系は、室温で、二重に積み重ねた１００ｎｍポリカーボネート・フィルタを２回通過させて押し出した。それら脂質小胞に、４０％エタノールに入れたプラスミドＤＮＡ ０．２５ｍｇを室温で添加し、次いで、その試料は４０℃で１時間の間定温放置した。初期［プラスミド］／［脂質］比は０．０２５であった。続いて、その試料は、ｐＨ ７の２５ｍＭ生理食塩水（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ） ２リットルに対して合計１８〜２０時間の間透析した。
【００７３】
閉じ込め効率（trapping efficiency）は、残存している外部プラスミドＤＮＡを除去した後、ＤＥＡＥセファローズ（Sepharose）ＣＬ６Ｂカラムでのアニオン交換クロマトグラフィによって決定した。プラスミドＤＮＡは、ブライ・ダイアー抽出法（Bligh Dyer extraction）によってプラスミドから分離した後、ＤＮＡ結合系ピコグリーン脂質（DNA Binding System PicoGreen lipid）を用いて、フィスケ・サバロウ（Fiske and Subbarrow）による無機リン酸塩分析によって定量した。加えて、最終脂質濃度は、蛍光標識済み脂質、リサミン ローダミン−ＰＥ ０．２５モル％を、脂質小胞の中に組み入れることによって決定した。
最終のプラスミド 脂質比は０．０２２であった。この値は、８８％の閉じ込めに相当する。得られた脂質被包済み治療剤の粒子は、１００ｎｍの平均粒度と、非常に小さい粒度分布とを有した。
【００７４】
（例５）
リポソームの調製： エタノール／緩衝液の溶液に入った大きい単層リポソームは、押し出したリポソームにエタノールを添加するか；又はエタノールに溶解した脂質を水性緩衝液に添加し、次いで、押し出す；ことによって調製した。両者いずれの方法も、同じ閉じ込め結果を与え、下記に一層詳細に記述する：
１．ｐＨ ４のクエン酸塩緩衝液に入れた脂質膜を水和し、凍結／融解サイクルを５回行った後、二重に積み重ねた１００ｎｍフィルタを通過させて（１０回通過）押し出すことによって、大きな単膜リポソーム（ＬＵＶｓ）を生成した。ＤＯＤＡＰ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−Ｃｅｒ１４のリポソームの場合、押し出しは６０℃で行った。次いで、急速に混合しながら、エタノールをゆっくり添加した。エタノールを除去した後、動的光散乱法によって決定した、典型的なリポソーム粒度は、ＤＯＤＡＰ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−Ｃｅｒ14系について９０±２０ｎｍであった。エタノール濃度がある上限値を越えるや否や、リポソームが不安定になり、合体して大きい脂質構造になるため、エタノールをゆっくり添加すること及び急速に混合することは、重要である。後者は、脂質の組成に依存する。例えば、エタノール濃度が５０％（ｖ／ｖ）を越えるとき、初期に半透明のＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−Ｃｅｒ14／ＤＯＤＡＰリポソーム分散系は、乳白色になる。
【００７５】
２．大きな単膜リポソーム（ＬＵＶｓ）は、エタノール（０．４ｍｌ）に溶解した脂質をｐＨ ４のクエン酸塩緩衝液（０．６ｍｌ）に室温でゆっくり添加し、次いで、二重に積み重ねた１００ｎｍフィルタを通過させて（２回通過）押し出すことによって調製した。エタノール中で行った動的光散乱測定値と、透析によってエタノールを除去した後に行った動的光散乱測定値とは、粒度の有意差を示さず、粒度は典型的には７５±１８ｎｍである。激しく混合しながらエタノールを非常にゆっくり添加して、エタノール濃度が局部的に高くなるのが回避される場合、押し出し工程は省略することができる。
【００７６】
閉じ込め方法： オリゴヌクレオチド溶液は、エタノール性リポソーム分散へ、渦巻き状に撹拌しながらゆっくり添加し；次いで、その溶液は、適切な温度で１時間の間、定温放置し；クエン酸塩緩衝液に対して２時間の間透析して大半のエタノールを除去し；次いで、ＨＢＳ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／１４５ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ ７．５）に対して再び透析した。ＤＯＤＡＰは、ｐＨ ７．５で、電荷中性となり、外側膜表面に結合したオリゴヌクレオチドは、カチオン性脂質との結合から解放される。次いで、ｐＨ ７．５のＨＢＳで平衡状態に保たれている「ＤＥＡＥ−セファローズ（sepharose） ＣＬ−６Ｂ カラム」によるアニオン交換クロマトグラフィにより、被包されなかったオリゴヌクレオチドを取り除いた。エタノールに代えてオクチルグルコシドを使用した場合、洗剤をリポソームに添加して（１：１ ｖ／ｖ）、最終濃度が３０〜４０ｍＭの範囲になるようにした。初期の透析工程をｐＨ ４のクエン酸塩緩衝液に対して行い、その工程を５時間に伸ばしたことを除いて、後続の諸工程は全て上述のように実施した。次の諸例において、別に断らない限り、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−Ｃｅｒ14／ＤＯＤＡＰリポソーム（２０：４５：１０：２５モル％）；ｃ−ｍｙｃ（配列ＩＤ Ｎｏ．１）；４０％（ｖ／ｖ）エタノール；３００ｍＭクエン酸塩緩衝液；及び４０℃での定温放置；を使用した。
【００７７】
閉じ込め効率の決定： 閉じ込め効率は、外部オリゴヌクレオチドを除去した後、アニオン交換クロマトグラフィによって決定した。オリゴヌクレオチドの濃度は、「島津ＵＶ１６０Ｕ 分光光度計」による紫外分光法によって決定した。１：２．１：１のクロロホルム／メタノール／水相（試料／ＨＢＳ）の容量比のクロロホルム／メタノールに試料を可溶化した後、２６０ｎｍでの吸光度を測定した。混合した後、溶液が完全に透明にならなかった場合、メタノール ５０〜１００μｌを更に添加した。もう１つの方法として、１００ｍＭ オクチルグルコシドに試料を可溶化した後、吸光度を読み取った。アンチセンスの濃度は、
ｃ［μｇ／μｌ］＝Ａ260*１ＯＤ260ユニット［μｇ／ｍｌ］*希釈因子（factor）［ｍｌ／μｌ］
（式中、希釈因子は、試料の容量［μｌ］で除した全分析容量［ｍｌ］によって与えられる）に従って計算した。ＯＤ260ユニットは、個々のデオキシヌクレオチドの対吸光係数（pairwise extinction coefficients）から計算した。これら対吸光係数は、隣接相互作用を考慮している。１ＯＤは、３０．９７μｇ／ｍｌのｃ−ｍｙｃ（配列ＩＤ．Ｎｏ．１）；３３．３７μｇ／ｍｌのｈ−ＩＣＡＭ−１（配列ＩＤ．Ｎｏ．２）；及び３４μｇ／ｍｌのＥＧＦＲ（配列ＩＤ．Ｎｏ．３）；に対応する。脂質濃度は、ブライ・ダイアー抽出法（ブライ及びダイアー，１９５９）により、オリゴヌクレオチドから脂質を分離した後、無機リン酸分析によって決定した。手短に言えば、水相（試料／ＨＢＳ） ２５０μｌに、メタノール ５２５μｌ及びクロロホルム ２５０μｌを添加して、透明な単一相［水相／メタノール／クロロホルム（１：２．１：１容量比）］を形成した。溶液が透明でない場合、少量のメタノールを追加した。次いで、ＨＢＳ ２５０μｌ及び等量のクロロホルムを添加した。諸試料は混合し、３０００ｒｐｍで５〜１０分間、遠心分離機で分離した。これによって、透明な２相系が得られた。クロロホルム相は、フィスケ・サバロウ法（１９２５）により、リン脂質含有量を分析した。別に断らない限り、閉じ込め効率は、［オリゴヌクレオチド］対［脂質］重量比（ｗ／ｗ）として表わす。
【００７８】
（例６）
例５の手順の後、押し出しにより調製した１００ｎｍのＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＯＤＡＰリポソーム（変性なし脂質成分）に、増加量のエタノールを添加した。全ての試料は、オリゴヌクレオチドを添加すると直ちに乳白色になった。これは、オリゴヌクレオチドにより誘導された凝集を示す。ｐＨ ４において０．０３５のモル［ＯＤＮ］／［脂質］比でアンチセンス・オリゴヌクレオチドと共に定温放置を行った後、エタノールと、閉じ込められなかったオリゴヌクレオチドとを取り除いた。表７に、得られた多重膜小胞の最終粒度と共に、動的光散乱によって決定した被包効率を記載する。エタノール濃度が増大するにつれて、ますます多くのアンチセンス・オリゴヌクレオチドが閉じ込められる。同時に、粒度及び多分散性（polydispersity）が増大することは、ＬＵＶｓ（大きな単膜リポソーム）が一層大きな脂質構造に漸次再編成されたことを反映している。これら一層大きな脂質構造は、大部分が大きな多重膜リポソームであると思われる。これらの系の粒度のために、閉じ込められなかった外部のオリゴヌクレオチドを除去するのに使用したアニオン交換カラムの上で失われる脂質もあることに注目すべきである。溶出した部分は、全脂質の約５０〜６０％に相当する。４０％以上のエタノール濃度で、初期リポソームは、不安定になり、融合し、乳白色の分散系を形成する。
【００７９】
【表７】
【００８０】
これらの諸結果は、エタノールによって脂質膜が、大きな多重膜リポソームの共心薄層（concentric lamallae）間にオリゴヌクレオチドを閉じ込めさせる構造的再配列（structural rearrangements）を生じ易くなることを実証する。しかし、得られるリポソームの粒度を容易に制御することはできない。
【００８１】
（例７）
修飾脂質（ＰＥＧ−Ｃｅｒ） ２．５〜１０モル％を含有するリポソームを造り、次いで、例５及び６の諸プロトコルを用いて試験を行った。各々の場合、ＰＥＧ−Ｃｅｒ濃度の減少は、ＤＰＳＣレベルの増大によって調整した。リポソームの中に修飾脂質を取り込むこと（incorporation）によって、アンチセンス含有リポソームの最終粒度が調節されることが分かった。リポソームは、ＰＥＧ−Ｃｅｒが存在する場合、それが存在しない場合と比べて、一層大きいエタノール濃度で安定する。ＰＥＧ−Ｃｅｒ ２．５モル％を含有する試料については、濁度がわずかに増大するのが認められたが、４０％エタノール中では、それら分散系は光学的に半透明のままであった。安定性が増大したことはまた、閉じ込め（entrapment）が生じるために必要なエタノールの量が一層多いことに反映される（表８、図２）。図２には、被包効率が、ＰＥＧ−Ｃｅｒ １０モル％を含有するリポソームに対するエタノール濃度の関数として描かれる。最大の閉じ込めは、４０％エタノールで達成され、また、閉じ込めが生じるためには、２５％（ｖ／ｖ）を越えるエタノール濃度（＞４．３Ｍ）が必要であった。エタノールが存在しないと、閉じ込めは全く見出されなかった。表８には、動的光散乱によって決定される閉じ込め効率及び粒度が、図２から決定される最小エタノール濃度及び最大エタノール濃度での、ＰＥＧ−Ｃｅｒ含有量（２．５〜１０モル％）の関数として記載される。初期の被押し出しリポソームの粒度は、括弧内に与えられる。閉じ込めが生じるために必要なエタノールの量は、リポソームのＰＥＧ−Ｃｅｒ含有量に依存する。ＰＥＧ−Ｃｅｒ ２．５モル％を含有するリポソームにでは、２５％エタノールでオリゴヌクレオチドの約１５％が閉じ込められた。対照的に、ＰＥＧ−Ｃｅｒ １０モル％において、２５％エタノールの存在下では実質的に閉じ込めは達成されず（≦５％）、また、４０％エタノールの存在下では６０％であった。全ての場合、初期の［オリゴヌクレオチド］対［脂質］比は０．０３７（モル／モル）であった。ＰＥＧ−Ｃｅｒ含有量が２．５モル％から１０モル％まで増大するとき、閉じ込めレベルは、４０％エタノール中で、４５％からほぼ６０％まで増大した。リポソーム粒度及び多分散性は１３１±４０ｎｍから１００±２６ｎｍまで減少した。
【００８２】
【表８】
【００８３】
（例８）
脂質膜上でエタノールをかき乱す効果は、脂質の水和；アシル鎖のオーダー（order）；小さいイオンの膜透過性；及びＤＰＰＣ系における鎖の相互からみ合いの誘導；の変化に関連して、主に低いエタノール濃度（＜１５％、ｖ／ｖ）で研究されてきた［スレイター（Slater）及びハング（Hung），１９８８；バーチフェルド（Barchfeld）及びディーマー（Deamer），１９８８；シュビッヒテンホーベル（Schwichtenhovel）等，１９９２；スレイター（Slater）等，１９９３；バリー（Barry）及びゴーリッヒ（Gawrisch），１９９４；ビエル（Vierl）等，１９９４；ロベッケ（Lobbecke）及びチェブク（Cevc），１９９５；コマツ（Komatsu）及びオカダ（Okada），１９９６；ホルテ（Holte）及びゴーリッヒ（Gawrisch），１９９７］。閉じ込めるために必要な高濃度のエタノールにおいてリポソームが依然として無傷であるか否かを問うことは道理にかなっている。図３Ａには、エタノールの濃度の関数として、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＣｅｒＣ14／ＤＯＤＡＰリポソーム中の自己消光濃度（self-quenching concentrations）で閉じ込められたカルセインの解放（黒丸）が、同一の脂質組成のリポソームを使用して得られた被包効率と共に描かれている。漏出の実験も被包の実験も、４０℃で行った。カルセイン（６２３の分子量を持つ小さい分子）の漏出は、３０％以下のエタノールで出発し、約４０％のエタノールで最大に達する。オリゴヌクレオチドの閉じ込めは、類似のエタノール依存を示し、その閉じ込めが、リポソーム膜の透過性障壁の不安定性と相関関係が高いことを表わしている。カルセインとは対照的に、ＦＩＴＣ−デキストラン（分子量 １９５００）の解放は、４０％エタノール中で１０％未満である。このことは、オクチルグルコシド等の洗剤についても報告されてきたように［アルモッグ（Almog）等，１９９０］、透過性障壁の損失が、分子量依存であることを示す。４０％エタノールに入った巨大リポソームの位相差顕微鏡検査によっても、無傷のリポソーム構造が明らかとなった。
【００８４】
脂質はまた、リポソームの間、並びにリポソームから成る脂質二重層の内部単一層及び外部単一層の間で、迅速に交換できる。図３Ｂに示されるように、ＮＢＤ−ＰＥ／ＬＲｈ−ＰＥ ＦＲＥＴ分析によって検出されるような脂質混合（lipid mixing）は、４０％エタノール中で、有効に隣接している。小胞粒度の増大は全く観察されず、脂質混合がリポソームの融合よりむしろリポソーム間の迅速な脂質交換から生じていることを示している。図３Ｂに示される結果はまた、亜ジチオン酸ナトリウムとの化学還元に基づく、外部脂質単一層中に位置しているＮＢＤ−ＰＳの蛍光の損失によって示される通り、諸脂質が、リポソーム脂質の二重層の一方側から他方側へ迅速に移動する（フリップ・フロップする）ことを実証する。
【００８５】
（例９）
被包に基づく濁度の増大は、閉じ込みが初期凝集工程［小凝集（microaggregates）の形成］によって先行されることを示す。その凝集工程及び閉じ込みは、低温で切り離すことができる。オリゴヌクレオチドを添加する時又は添加の直後に、試料は濁り、また、濁度は時間が経てば増大する。エタノールが存在しない場合、濁度がわずかに増大するのみであり、その後、光の透過率は一定のままである。４０℃で調製した試料とは対照的に、４℃で定温放置した試料は、エタノールを除去すると、再び半透明になり、リポソームはオリゴヌクレオチドを閉じ込めない。図４には、閉じ込め効率が、温度の関数として、カルセインの漏出データと共にプロットされている。漏出データは、カルセインの５０％解放を引き起こすのに必要なエタノール濃度として与えられる。また、リポソーム膜の不安定性と閉じ込め効率の間には、質的な相関関係が存在する。
【００８６】
（例１０）
31Ｐ−ＮＭＲは、オリゴヌクレオチドの閉じ込みを分析するのに使用することができる。図５のＡ及び図５のＢは、溶解状態のｃ−ｍｙｃの31Ｐ−ＮＭＲスペクトルを示し（図５のＡ）、また、ＤＯＤＡＰ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＣｅｒＣ14リポソームに閉じ込められたｃ−ｍｙｃの31Ｐ−ＮＭＲスペクトルを示す（図５のＢ）。それらリポソームは、初期に、内部ｐＨが４であり外部ｐＨが７．５である膜間ｐＨ勾配を示した。これらの条件下で、閉じ込められたオリゴヌクレオチドは、正に帯電したリポソーム膜としっかりと結合している。この固定化によって、ＮＭＲ信号は消失する（disappearance）（幅が広がる）結果となる（図５のＢ）。酢酸アンモニウムの添加によってｐＨ勾配が消滅し、外部ｐＨが７．５に調整されるとき、ＤＯＤＡＰは脱プロトン化し、オリゴヌクレオチドはリポソーム膜から解離する。このことは、ＮＭＲ信号の回復（recovery）（図５のＣ）によって実証される。しかし、この回復は不完全であり、初期信号の約５０％である。この信号の減衰は、ＮＭＲ共鳴の飽和に起因するものではない。それは、２つの可能性：被包されたアンチセンスの量がその溶解度を越えて、その一部が沈降すること；又は、アンチセンス分子の移動度が、例えば、２つの接近して並んでいる二重層の間に固定化されることによって、空間的に制約されること；に起因するのかも知れない（図３Ａを参照）。オリゴヌクレオチドが、被包されてリポソームの水性内部に局部集中したことを確認するために、ＭｎＳＯ4 ５ｍＭを外部溶液に添加した（図５のＤ）。Ｍｎ2+は、膜不透過性常磁性線広がり剤（membrane impermeable paramagnetic line broadening agent）であって、オリゴヌクレオチドだけでなく、接近可能な全てのリン酸基、リン脂質の信号を消滅させる。しかし、オリゴヌクレオチドの信号は、影響されないままであり、ＯＧＰを有するリポソームの可溶化に基づいてのみ消滅した（図５のＥ）。初期リポソーム（図５のＢ）が、Ｍｎ2+の不存在下で、ＯＧＰにより可溶化されるとき、全体のオリゴヌクレオチド信号は回復する。これらのデータによって、オリゴヌクレオチドがリポソーム内に閉じ込められ、また、外部膜と単純には結合しないことが明白に実証される。閉じ込められたオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド結合性染料オリグリーン（OliGreen）に接近しなかったことにも注目すべきである。
【００８７】
オリゴヌクレオチドの全体像から見たＮＭＲ研究によって、オリゴヌクレオチドとリポソームの間の相互作用が説明される。脂質の動特性の変化及び膜組織は、ピレン標識脂質を用いて精査することができる［デュポーテイル（Duportail）及びリアノス（Lianos），１９９６］。ピレン標識脂質は、高濃度で、励起状態の二量体を形成する。これら二量体は、モノマーと異なる波長で蛍光を発する。エキシマーの形成は、拡散律速過程（diffusion-controlled process）であって、一緒になって二量体を形成する２つの分子を必要とする。それらオリゴヌクレオチドの結合によって、リポソームを制御するのに関与し、オリゴヌクレオチドを含有しない全ての脂質種の横への移動性（lateral mobility）が著しく減少する結果となる。その膜は横方向に圧搾される。これは、ピレン−ＨＰＣのエキシマー蛍光の減少が観測されることによって得られる。膜間ｐＨ勾配の減損によって、エキシマー蛍光が増加し、脂質の移動性が回復する結果となる。
【００８８】
（例１１）
閉じ込め効率と同様、アンチセンスを閉じ込めているリポソームの粒度も、初期［アンチセンス］対［脂質］比に依存する。図６は、高い［アンチセンス］対［脂質］比でオリゴヌクレオチドを効率よく閉じ込め得ることを示す。閉じ込め効率は、初期［オリゴヌクレオチド］対［脂質］比の関数としてプロットされている。最大閉じ込め効率での結合レベルは、脂質１ｍｇ当りオリゴヌクレオチド ０．１６ｍｇ（０．０２４モル／モル）である。これは、１００ｎｍのリポソーム当り約２２５０分子のオリゴヌクレオチドに相当し、また、この閉じ込め手順が高効率であることを実証する。閉じ込め効率は、受動的被包化（passive encapsulation）によって得られたものより、約３桁大きい。
［オリゴヌクレオチド］対［脂質］比を増大させるとき、試料の多分散性も粒度も、リポソーム単独の７０±１０ｎｍから、０．２の初期［ＯＤＮ］対［脂質］重量比の１１０±３０ｎｍまでわずかに増大する。凍結破断電子顕微鏡検査（freeze-fracture electron microscopy）により、初期［オリゴヌクレオチド］対［脂質］比の増大と共に、一層大きいリポソームの数が増大することが分かった。また、初期に半透明であったリポソーム分散系は、［アンチセンス］対［脂質］比が増大するにつれて、ますます濁ってくることに注目すべきである。
【００８９】
（例１２）
接近して向き合っている膜であってそれら膜の多層構造がＴＥＭ（透過型電子顕微鏡検査）によって観察される該膜の形成を、ＰＥＧコーティングは妨げることが期待される。従って、放射能標識ＰＥＧ−ＣｅｒＣ14を使用することによって、ＰＥＧ−Ｃｅｒの命運について試験を行った。アンチセンス・オリゴヌクレオチドを、非標識ＰＥＧ−ＣｅｒＣ14 １０モル％と、５．９の［3Ｈ］／［Ｃ14］比での、コレステロールマーカーとしての［14Ｃ］−コレステロールヘキサデシルエーテル（ＣＨＥ）とに加えて、痕跡量の［3Ｈ］−ＰＥＧ−ＣｅｒＣ14を含有するリポソーム中に被包した。この比は、見掛けの［ＰＥＧ−Ｃｅｒ］／［Ｃｈｏｌ］比を表わし、また、［ＰＥＧ−Ｃｅｒ］／［Ｃｈｏｌ］のモル比に代えて使用される。初期の［アンチセンス］対［脂質］重量比は０．２９であった。閉じ込めは、最終的に０．１６の最終［アンチセンス］対［脂質］比となった。遊離のＰＥＧ−Ｃｅｒミセル及びＰＥＧミセルは、ショ糖段階勾配（sucrose step gradient）［ＨＢＳに入ったショ糖 １％、２．５％、１０％、１５％（ｗ／ｖ）］を用いて、超遠心分離法によってリポソームから分離した。中空のリポソームは、５．５の見掛け［ＰＥＧ−Ｃｅｒ］／［Ｃｈｏｌ］比で、２．５％ショ糖と１０％ショ糖の境界に集まる。このバンド（band）は、全脂質の約８０％を占める。アンチセンス含有リポソームは、同一の位置に弱いバンドを示し、このバンドは全脂質の９％未満に相当する。しかし、大抵のリポソームアンチセンスは、１５％ショ糖層又は下部のペレットに移動する。表９に、勾配のリポソーム含有フラクション（fractions）の全分析を示す。それら結果は、高い［オリゴヌクレオチド］対［脂質］比で調製した試料を表わす。相対的な［ＰＥＧ−Ｃｅｒ］／［Ｃｈｏｌ］比は、勾配の下部の方に向かい漸進的に減少している。ＰＥＧ−Ｃｅｒの５０％以上が、初期リポソーム（見掛け［ＰＥＧ−Ｃｅｒ］／［Ｃｈｏｌ］比は５．５）に比べて下部フラクションから失われている。［ＤＳＰＣ］／［Ｃｈｏｌ］比は変化していない。ＰＥＧ−Ｃｅｒの２７％は、コレステロールの６．６％と共に、上部フラクションに見出すことができる。ほぼ同じ量の非リポソーム結合ＰＥＧ−Ｃｅｒが、中空の対照リポソームに見られる。
【００９０】
上記勾配の諸フラクションの更なる分析によって、アンチセンス含有リポソームはそれらのアンチセンス含有量及び粒度において大きな差異を示すことが分かる（表９）。平均粒度も［オリゴヌクレオチド］対［脂質］比も、上部から下部へ増大する。三つの主要集団を、明瞭なバンドとして確認することができる（表１０）。それらの相対割合は、初期［オリゴヌクレオチド］対［脂質］比に依存する（表１０）。第１の集団は、低い［ＯＤＮ］／［脂質］比（０．０３〜０．０５）のアンチセンス含有リポソームである。第２の集団は、０．１４〜０．１５の［ＯＤＮ］／［脂質］比を有するリポソームである。最後の集団は、非常に高い［ＯＤＮ］／［脂質］比（０．２９ｍｇ／ｍｇ）を有するリポソームである。最後の集団は、初期［ＯＤＮ］／［脂質］比が減少しているそれら初めの２つの集団に有利なように減少している。最後の集団は、光学的に濁っているのに対して、他の２つの集団は、半透明である。閉じ込み率と粒度の観測差異を、極低温透過型電子顕微鏡検査によって認識される形態の不均質性と関連付けることを試みた。アンチセンスは、高い初期［オリゴヌクレオチド］／［脂質］比（０．２８ｍｇ／ｍｇ）で閉じ込められ、また、表１０のフラクション１５及び１７に対応する２つの主要フラクションは、透析によりショ糖を除去した後、極低温透過型電子顕微鏡検査によって検査した。上部のフラクションは専ら、二重層リポソームであってそれらの多くがバルブ（bulbs）を示す該二重層リポソームから成るのに対し、下部のフラクションは、二重層リポソームと多重膜リポソームの混合物を含有した。
【００９１】
【表９】
【００９２】
【表１０】
【００９３】
（例１３）
エタノールの存在下、カチオン性リポソームにオリゴヌクレオチドを添加すれば、ドメイン形成を生じさせることができる。見られる多重膜リポソームの形成は、リポソームの接着によって先行されなければならない。しかし、エタノールの不存在下では、１０モル％ＰＥＧ−Ｃｅｒは接着を完全に妨げる。エタノールの存在下では、２つの効果：即ち、第１に、迅速な脂質交換による、非膜取り込み済み（non membrane-incorporated）ＰＥＧ−Ｃｅｒの量の増加；及び、ＰＥＧ−Ｃｅｒ中で消耗されアンチセンス・オリゴヌクレオチド中で富化される小さいドメインの形成；が、リポソームの接着に寄与し得る。後者の可能性を研究した。オリゴヌクレオチド結合の効果は、ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドと併せてＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＯＤＡＰ／ＰＥＧ−ＣｅｒＣ14の巨大リポソームを用いて、位相差蛍光顕微鏡により視覚化した。観察された大抵のリポソームは、多重膜であり、内部構造を示した。エタノールの不存在下で、巨大リポソームは崩壊して不規則形状の凝集体となり、また、アンチセンスの添加によって一層小さいリポソームとなった。グリーンＦＩＴＣ蛍光発光（green FITC fluorescence）によって、オリゴヌクレオチドの位置が明らかとなった。４０％エタノールの存在下では、全く異なる事態が与えられる。初期に丸いリポソームは、オリゴヌクレオチドを添加して５〜１０分間は西洋なし形状をしており、また、これらオリゴヌクレオチドは、これらリポソーム構造体の一方側では半円形で置かれている。内部膜は、この馬蹄形のものから圧搾される。この馬蹄形のものは、（とりわけ、温度が上昇するとき）引き離されて崩壊し、蛍光が完全にグリーンに見える、緻密でわずかに不規則な構造体となる。オリゴヌクレオチドの分離は、エタノールがドメインの形成を刺激し得ることを表わしている。
【００９４】
（例１４）
本発明の被包化手順は、特定のオリゴヌクレオチド及び脂質の組成に左右されないし、また、使用される高いクエン酸塩濃度にも制限されない。被包化は、５０ｍＭクエン酸塩緩衝液で最も効率が高く、一層低いクエン酸塩濃度でも一層高いクエン酸塩濃度でも減少する。粒度及び多分散性は、２５ｍＭ以下のクエン酸塩濃度ではかなり増大する。図７は、プラスミド−ＤＮＡも、ｃ−ｍｙｃ（配列ＩＤ番号１）以外の諸オリゴヌクレオチドも、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＯＤＡＰ／ＰＥＧ−ＣｅｒＣ14のリポソーム中に効率よく閉じ込めることができることを示す。初期の［オリゴヌクレオチド］対［脂質］重量比は０．１ｍｇ／ｍｇであり、オリゴヌクレオチドを閉じ込めるために、３００ｍＭクエン酸塩緩衝液を使用した。ｐＤＮＡの閉じ込めは、０．０３の［ｐＤＮＡ］対［脂質］重量比で、５０ｍＭクエン酸塩緩衝液中で行った。ホスホロチオエート型アンチセンス・オリゴヌクレオチドと異なり、ホスホジエステルベースの分子は、３００ｍＭクエン酸塩緩衝液等の高いイオン強度の緩衝液では、被包することができない。これは恐らく、結合親和性（binding affinities）の差異を反映する［センプル（Semple）等，２０００］。大きい分子の効率のよい被包化とは対照的に、ＡＴＰの１０％未満は、０．２ｍｇ／ｍｇの初期［ＡＴＰ］対［脂質］比で、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＯＤＡＰ／ＰＥＧ−ＣｅｒＣ14のリポソーム中に閉じ込めることができる。ＡＴＰの閉じ込めは、５０ｍＭクエン酸塩緩衝液中で行った。表５は、この閉じ込め手順が、ＤＯＰＥ系を含有する他の諸脂質組成物に拡張することができることを実証する。負に帯電したリポソーム；及び正に帯電した、ポリリシンを含む高分子電解質；に関する予備結果によって、閉じ込みが、エタノール中における、高分子電解質と、逆に帯電したリポソームとの相互作用の一般的特徴であることが分かる。
【００９５】
（例１５）
エタノールに代えて、オクチルグルコシド（ＯＧＰ）を使用した。洗剤をリポソームに添加し（１：１ ｖ／ｖ）、最終濃度を３０〜４０ｍＭの範囲とした。後続の諸工程は全て、例５で記述した通りに実施した。但し、ｐＨ ４のクエン酸塩緩衝液に対する初期透析工程は５時間に延長した。オリゴヌクレオチドは、外部から添加されるオリグリーン（Oligreen）、蛍光オリゴ−結合性染料から保護されるべきことが分かった。初期［オリゴヌクレオチド］対［脂質］比は、０．２３（ｍｇ／ｍｇ）であった。粒度は、数平均粒度を表わす。ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＯＤＡＰ／ＰＥＧ−ＣｅｒＣ14は、２０／４５／２５／１０モル％であった。表１１に、被包化の観察レベル、及び最終粒度をまとめる。
【００９６】
【表１１】
【００９７】
当業者が、本発明、及び本明細書の諸技術を使用すれば、脂質で十分に被包された治療剤の粒子を生成するための、他の方法並びに手段を認識することが可能であり、それら方法及び手段の全ては、特許請求の範囲に包含される。
【００９８】
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カチャー（Kachar），Ｂ．；Ｎ．，フラー（Fuller）；Ｒ．Ｐ．，ランド（Rand）：ホスホファチジルセリン含有小胞のカルシウム誘導相互作用に対する形態学的反応（Morphological responses to calcium-induced interactions of phosphatidylserine-containing vesicles），Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，５０，７７９〜８８（１９８１）．
【０１０２】
コマツ（Komatsu），Ｈ．；Ｓ．，オカダ（Okada）：エタノール誘導の外側相の分離による、ホスホファチジルコリン／ホスホファチジルエタノールアミン混合のリポソーム膜のエタノール強化透過（Ethanol-enhanced permeation of phosphaditylcholine/phosphatidylethanolamine mixed liposomal membranes due to ethanol-induced lateral phase separation），Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２８３，７３〜７９（１９９６）．
ラシック（Lasic），Ｄ．Ｄ．：遺伝子運搬におけるリポソーム（Liposomes in Gene Delivery），Ｃｈａｐｔｅｒ ７，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ（１９９７ａ）．
ラシック（Lasic），Ｄ．Ｄ．；Ｈ．，ストレイ（Strey）；Ｍ．Ｃ．Ａ．，スチュアート（Stuart）；Ｒ．，ポドゴールニック（Podgornik）；Ｐ．Ｍ．，フレデリック（Frederik）：ＤＮＡリポソーム複合体の構造（The structure of DNA-liposome complexes），Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１９，８３２〜３３（１９９７ｂ）．
レックバンド（Leckband），Ｄ．Ｅ．；Ｃ．Ａ．，ヘルム（Helm）；Ｊ．，イスラエルアクビリ（Israelachvili）：二重層の接着と融合におけるカルシウムの役割（Role of calcium in adhesion and fusion of bilayers），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，１１２７〜１１４０（１９９３）．
レンツ（Lentz），Ｂ．Ｒ．；Ｗ．，タルボット（Talbot）；Ｊ．，リー（Lee）；Ｌ．-Ｘ．，チョン（Zheng）：トランス二重層脂質の再分配はモデル膜のポリ（エチレングリコール）処理を伴うが融合により誘導されない（Transbilayer lipid redistribution accompanies poly（ethylene glycol） treatment of model membranes but is not induced by fusion），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６，２０７６〜２０８３（１９９７）．
【０１０３】
ロベッケ（Lobbecke），Ｌ．；Ｇ．，チェブク（Cevc）：ホスファチジルコリンの二重層膜の相挙動と相互連結とに及ぼす短鎖アルコールの影響（Effects of short-chain alcohols on the phase behavior and interdigitation of phosphatidylcholine bilayer membranes），Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２３７，５９〜６９（１９９５）．
リポースキー（Lipowsky），Ｒ．：膜の立体配座（The conformation of membranes），Ｎａｔｕｒｅ，３４９，４７５〜８１（１９９１）．
マクドナルド（Macdnald），Ｐ．Ｍ．；Ｋ．Ｊ．，クローウェル（Crowell）；Ｃ．Ｍ．，フランシン（Franzin）；Ｐ．，ミトラコス（Mitrakos）；Ｄ．Ｊ．，セムキシン（Semchyschyn）：脂質の二重層膜中の高分子電解質誘導ドメイン：重水素ＮＭＲ透視図（Polyelectrolyte-induced domains in lipid bilayer membranes: the deuterium NMR perspective），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，７６，４５２〜４６４（１９９８）．
マウレル（Maurer），Ｎ．；Ａ．，モリ（Mori）；Ｌ．，パルマー（Palmer）；Ｍ．Ａ．，モンク（Monck）；Ｋ．Ｗ．Ｃ．，モク（Mok）；Ｂ．，ムイ（Mui）；Ｑ．Ｆ．，アクホング（Akhong）；Ｐ．Ｒ．，カリス（Cullis）：遺伝子薬物の細胞内運搬のための脂質ベース系（Lipid-based systems for the intracellular delivery of genetic drugs），Ｍｏｌ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．，１６，１２９〜１４０（１９９９）．
マッキンタイア（McIntyre），Ｊ．Ｃ．；Ｒ．Ｇ．，スレイト（Sleight）：リン脂質膜の不斉性のための蛍光分析（Fluorescence assay for phospholipid membrane asymmetry），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０，１１８１９〜２７（１９９１）．
【０１０４】
メイ（May），Ｓ．；Ｄ．，ハリス（Harris）；Ａ．，ベン・ショール（Ben-Shaul）：カチオン性脂質ＤＮＡ複合体の相挙動（The phase behavior of cationic lipid-DNA complexes），Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，７８，１６８１〜９７（２０００）．
マイアー（Meyer），Ｏ．；Ｄ．，キルポーチン（Kirpotin）；Ｋ．，ホン（Hong）；Ｂ．，シュテルンベルク（Sternberg）；Ｊ．Ｗ．，パーク（Park）；Ｍ．Ｃ．，ウッドル（Woodle）；Ｄ．パパハジョロポーロス（Papahadjopoulos）：オリゴヌクレオチドのキャリヤとしてのポリエチレングリコールで被覆したカチオンリポソーム（Cationic liposomes coated with polyethylene glycol as carriers for oligonucleotides），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，１５６２１〜７（１９９８）．
ミラー（Miller），Ｄ．Ｃ．；Ｇ．Ｐ．，ダール（Dahl）：カルシウム誘導リポソーム融合における初期事象（Early events in calcium-induced liposome fusion），Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，６８９，１６５〜９（１９８２）．
ミトラコス（Mitrakos），Ｐ．；Ｐ．Ｍ．，マクドナルド（Macdonald）：2Ｈ ＮＭＲで検出される、脂質二重層膜中のカチオン性両親媒性物質のＤＮＡ誘導外側分離（DNA-induced lateral segregation of cationic amphiphiles in lipid bilayer membranes as detected via 2H NMR），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５，１６７１４〜２２（１９９６）．
ニーダム（Needham），Ｄ．；Ｅ．，エバンス（Evans）：２０℃以下１０℃以上の巨大脂質（ＤＭＰＣ）の小胞二重層の構造と機械的性質、２４℃での液晶−結晶相転移（Structure and mechanical properties of giant lipid （DMPC） vesicle bilayers from 20oC below to 10oC above the liquid crystal-crystalline phase transition at 24oC），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７，８２６１〜６９（１９８８）．
オリボン（Ollivon），Ｍ．；Ｏ．，アイデルマン（Eidelman），Ｒ．，ブルーメンソール（Blumenthal）；Ａ．，ウォルター（Walter）：卵ホスファチジルコリン及びオクチルグルコシドのミセル−小胞転移（Micell-vesicle transition of egg phosphatidylcholine and octyl glucoside），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７，１６９５〜１７０３（１９８８）．
【０１０５】
パパハドロポーロス（Papahadlopoulos），Ｄ．；Ｗ．Ｊ．，ベイル（Vail）；Ｋ．，ヤコブソン（Jacobson）；Ｇ．，ポステ（Poste）：渦巻き型脂質シリンダー：単層脂質小胞の融合による製剤（Cochleate lipid cylinders: formation by fusion of unilamellar lipid vesicles），Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，３９４，４８３〜９１（１９７５）．
ラドラー（Radler），Ｊ．Ｏ．；Ｉ．，コルトバー（Koltover）；Ａ．，ジェーミソン（Jamieson）；Ｔ．，サルディット（Salditt）；Ｃ．Ｒ．，サフィーニャ（Safinya）：自己集合したカチオン性脂質−ＤＮＡ遺伝子キャリヤ複合体の構造及び界面の特徴（Structure and interfacial aspects of self-assembled cationic lipid-DNA gene carrier complexes），Ｌａｎｇｍｕｉｒ，１４，４２７２〜８３（１９９８）．
ランド（Rand），Ｒ．Ｐ．；Ｂ．，カチャー（Kachar）；Ｔ．Ｓ．，リース（Reese）：諸ホスファチジルセリン小胞の間のカルシウム誘導相互作用の動的形態（Dynamic morphology of calcium-induced interactions between phosphatidylserine vesicles），Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，４７，４８３〜９（１９８５）．
ザックマン（Sackmann），Ｅ．：小胞及び細胞の形状と形状転移とに関する膜曲げエネルギーの概念（Membrane bending energy concept of vesicle- and cell-shapes and shape transitions），ＦＥＢＳ Ｌｅｔ．，３４６，３〜１６（１９９４）．
【０１０６】
サフィーニャ（Safinya），Ｃ．Ｒ．；Ｅ．Ｂ．，シロタ（Sirota）；Ｄ．，ルー（Roux）；Ｇ．Ｓ．，スミス（Smith）：興味ある膜の一般性：界面の剛性に及ぼす共界面活性剤の影響（Universality in interesting membranes: The effect of cosurfactants on the interfacial rigidity），Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ｌｅｔｔ．，６２，１１３４〜３７（１９８９）．
センプル（Semple），Ｓ．Ｃ．；Ｓ．Ｋ．，クリマック（Klimuk）；Ｔ．Ｏ．，ハラシム（Harasym）；Ｎ．，ドスサントス（Dos Santos）；Ｓ．Ｍ．，アンセル（Ansell）；Ｋ．Ｆ．，ウォン（Wong）；Ｎ．，マウレル（Maurer）；Ｈ．，スターク（Stark）；Ｐ．Ｒ．，カリス（Cullis）；Ｍ．Ｊ．，ホープ（Hope）；Ｐ．，シェラー（Scherrer）：イオン性アミノ脂質を用いた脂質小胞中のアンチセンス・オリゴヌクレオチドの効率的被包化：新規で小さな多重膜リポソーム構造体の形成
（Efficient encapsulation of antisense oligonucleotide in lipid vesicles using ionizable aminolipids: formation of novel small multilamellar vesicle structures）（２０００）．
ジーゲル（Siegel），Ｄ．Ｐ．；Ｗ．Ｊ．，グリーン（Green）；Ｙ．，タルモン（Talmon）：ラメラ相−反転ヘキサゴナル相転移の機構：温度ジャンプ極低温透過電子顕微鏡を用いた研究（The mechanism of lamellar-to-inverted hexagonal phase transitions: a study using temperature-jump cryotransmission electron microscopy），Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，６６，４０２〜１４（１９９４）．
ジーゲル（Siegel），Ｄ．Ｐ．；Ｒ．Ｍ．，エパンド（Epand）：ホスファチジルエタノールアミンにおける、ラメラ相−反転ヘキサゴナル相転移の機構：膜融合機構の影響（The mechanism of lamellar-to-inverted hexagonal phase transition in phosphatidylethanolamine: implications for membrane fusion mechanisms），Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，７３，３０８９〜３１１１（１９９７）．
【０１０７】
スレイター（Slater），Ｓ．Ｊ．；Ｃ．，ホー（Ho）；Ｆ．Ｊ．，タッデオ（Taddeo）；Ｍ．Ｂ．，ケリー（Kelly）；Ｃ．Ｄ．，スタッブス（Stubbs）：膜中の脂質−脂質相互作用に対する水素結合の寄与及び脂質順序の役割：コレステロール、増加したリン脂質の不飽和度及びエタノールの影響（Contribution of hydrogen bonding to lipid-lipid interactions in membranes and the role of lipid order: effects of cholesterol, increased phospholipid unsaturation, and ethanol），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，３７１４〜３７２１．
スレイター（Slater），Ｊ．Ｌ．；ファング（Huang），Ｃ．-Ｈ．：相互にかみ合った二重層膜（Interdigitated bilayer membranes），Ｐｒｏｇ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，２７，３２５〜３５９（１９８８）．
ストラック（Struck），Ｄ．Ｋ．；Ｄ．，フックストラ（Hoekstra）；Ｒ．Ｅ．，パガーノ（Pagano）：膜をモニタリングするための共鳴伝達の使用方法（Use of resonance energy transfer to monitor membrane fusion），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０，４０９３〜４０９９（１９８１）．
トーカン（Tocanne），Ｊ．Ｆ．；Ｊ．，テシエ（Teissie）：膜モデル系における、リン脂質のイオン化及びプロトンのリン脂質支持界面側方拡散（Ionization of phospholipids and phospholipid-supported interfacial lateral diffusion of protons in membrane model systems），Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１０３１，１１１〜１４２（１９９０）．
ホイラー（Wheeler），Ｊ．Ｊ．；Ｌ．，パルマー（Palmer）；Ｍ．，オッサンロー（Ossanlou）；Ｉ．，マクラクラン（MacLachlan）；Ｒ．Ｗ．，グラハム（Graham）；Ｍ．Ｊ．，ホープ（Hope）；Ｐ．，シェラー（Scherrer）；Ｐ．Ｒ．，カリス（Cullis）：安定化したプラスミド脂質粒子：構造と特性（Stabilized plasmid-lipid particles: construction and characterization），Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，６，２７１〜２８１（１９９９）．
フィール（Vierl），Ｕ．；Ｌ．，ロベッケ（Lobbecke）；Ｎ．，ナーゲル（Nagel）；Ｇ．，チェブク（Cevc）：脂質の二重層膜のコロイドと相の挙動に及ぼす溶質の影響：エタノール−ジパルミトイルホスファチジルコリン混合物（Solute effects on the colloidal and phase behavior of lipid bilayer membranes: ethanol-dipalmitoylphosphatidylcholine mixtures），Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，６７，１０６７〜１０７９（１９９４）．
シュ（Xu），Ｙ．；Ｓ．Ｗ．，ホイ（Hui）；Ｐ．，フレデリック（Frederick）；Ｆ．Ｃ．，ショカ（Szoka）：カチオンリポソームの物理化学特性と精製（Physicochemical characterization and purification of cationic liposomes），Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，７７，３４１〜５３（１９９９）．
【技術分野】
【０００１】
（発明の詳細な説明）
（発明の分野）
本発明は、脂質で被包された（lipid-encapsulated）治療剤の粒子（とりわけ、アンチセンス療法又は遺伝子治療に有用である、脂質で被包された治療用核酸粒子）の新規な製造方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
治療剤用キャリヤとして脂質粒子を使用する概念は、多数の人々によって検討されてきた。製剤は、脂質の外側に対する治療剤の錯形成反応（complexation; 錯化）、或いは治療剤の実際的閉じ込め（entrapment）に依存してきた。とはいえ、いずれのタイプの製剤を造る能力も、脂質粒子を造るために採用される方法だけでなく、脂質及び治療剤の特性の適合性（matching）に左右される。治療剤が閉じ込められた粒子の場合、閉じ込め方法は、受動的である（即ち、諸脂質粒子は治療剤の存在下で組み立てられ、治療剤の幾らかは偶然に閉じ込められる）か；又は能動的である（即ち、誘導されたある種の勾配の結果として、脂質粒子の内側の中に、治療剤が引張られるか又は推し進められる）ことがある。脂質粒子をキャリヤとして利用する努力が多く成されているにもかかわらず、脂質で閉じ込められた治療剤を実際に適用することを制限する諸問題が残されている。これら問題には、薬物／脂質の基部上への治療剤の取り込みレベルが低いこと；治療剤を捕獲する効率が低いこと；及び脂質被包された治療剤の粒子を大規模に製造するための適切な手段が欠如していること；が含まれる。
【０００３】
脂質と治療剤の間にかなりの静電的相互作用が存在しており、脂質で十分に被包された治療剤の粒子は、大規模には製造されてこなかった。基本的な問題は凝集である。帯電した脂質を逆符号に帯電した治療剤と混合すると、通常、凝集が生じ、治療に使用できないどころか、その後の処理加工に使用することができない乳白色の毛房状塊を含有する溶液が生じる結果となる。この凝集の問題は、非常に有用である治療用組成物の開発を妨げてきた。
【０００４】
帯電脂質及び逆符号に帯電した治療剤を用いたベンチスケール（bench scale; 卓上規模）の製剤は、バリー（Bally）等の米国特許第５，７０５，３８５号明細書（ＰＣＴ出願番号ＷＯ９６／４０９６４号明細書；米国特許出願シリアル番号０８／４８４，２８２号明細書；同０８／４８５，４５８号明細書；同０８／６６０，０２５号明細書；及び同０９／１４０，４７６号明細書も参照のこと）並びにセンプル（Semple）等のＰＣＴ特許出願番号ＷＯ９８／５１２７８号明細書（米国特許出願シリアル番号０８／８５６，３７４号明細書も参照のこと）に記述される受動的カプセル化方法で、カチオン性脂質及びアニオン核酸を使用してうまく達成された。これら米国特許及び特許出願は全て本発明の譲受人に譲渡されている。また、これら明細書に言及することにより、それらの内容を本明細書に組み入れる。更に、「ウィーラー（Wheeler）等：安定化されたプラスミド−脂質の粒子（Stabilized plasmid-lipid particles），構造と特徴（Construction and characterization），Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．６：２７１〜２８１（１９９９）」も参照のこと。これらの技術では、ＰＥＧ−脂質、ＡＴＴＡ−脂質等の凝集防止性脂質（同時係属出願の米国特許出願０８／９９６，７８３号明細書に開示されている。この明細書に言及することにより、その内容を本明細書に組み入れる）が採用されている。その凝集防止性脂質によって、複雑な凝集形成が効果的に防止される。得られた、脂質で十分に被包された治療剤の粒子は、（３０〜２５０ｎｍの範囲に）制御された大きさ；（例えば、ヌクレアーゼ抵抗によって測定される）十分なカプセル化；血清中での安定性；等の優れた薬物特性を有する。
【０００５】
ＷＯ９８／５１２７８号明細書には、受動的閉じ込め（entrapment）を使用して、脂質被包された治療剤の粒子を調製するためのベンチスケール法が記述されている。この既知の方法には、脂質の水和工程及びリポソームのサイジング工程という２つの基本工程が採用されている。脂質の水和工程では、カチオン性脂質溶液（９５％ＥｔＯＨ溶媒）が、クエン酸塩緩衝液（ｐＨ ３．８）に入れたポリヌクレオチド治療剤の入っている容器の中に１滴ずつ撹拌されながら添加され、ＥｔＯＨ ４０％、脂質 ９．９ｍｇ／ｍｌ及びポリヌクレオチド ２．０ｍｇ／ｍｌの最終組成物となる。この水和工程から得られる脂質の粒子は、典型的には直径４００ｎｍ以上であって、治療に役立つものとして一般的に使用するには大き過ぎる。このため、適切な大きさの脂質粒子を得るためには、高温押し出し（６５℃で）、及び随意的には凍結融解（液体窒素から６５℃水浴まで）のような、大規模な二次生成処理が必要である。これを使用したカプセル化の効率は、回収される最終［薬物］：［脂質］比に関してはかなり高い（６０〜９０％）が、最終粒子製剤の中に出発ポリヌクレオチドが取り込まれる絶対効率（absolute efficiency）は、準最適である（２５〜４５％）。
【０００６】
リポソームの分野で採用されている従来の諸方法を用いて、これらの粒子を商業的に大規模に製造しても、効率よくは達成されない。「バンガン（Bangham），ＡＤ．等：カチオンに対するリン脂質構造の透過性に及ぼすステロイド及びストレプトリシンＳの影響（The action of steroid and streptolysin S on the permeability of phospholipid structures to cations），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３，１３８〜１４７（１９６５）」によってリポソームの調製方法が最初に記述されて以来、リポソーム／薬物の製剤を製造することに関する多くの技術が出現してきたにもかかわらず、これらの問題は存在する。
【０００７】
脂質粒子を大規模に製造する既知技術は、次のカテゴリー：（１）脂質膜の水和（即ち、受動的閉じ込め）；（２）逆相蒸発；（３）高圧押し出し；及び（４）溶媒注入（希釈化）；に大きく分類することができる［例えば、マーチン（Martin）等の米国特許第４，７５２，４２５号明細書；同第４，７３７，３２３号明細書を参照のこと］。当業界で開示されている、脂質粒子を製造するための詳細な文書には、シュナイダー（Schneider）等の米国特許第５，２７０，０５３号明細書、同第５，４６６，４６８号明細書； 「アイゼル（Isele），Ｕ．等：有機溶媒の制御希釈による単量体亜鉛フタロシアニンを含有するリポソームの大規模製造（Large-Scale Production of Liposomes Containing Monomeric Zinc Phthalocyanine by Controlled Dilution of Organic Solvents），Ｊ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．第８３巻（１１），１６０８〜１６１６（１９９４）」；「クリフナー（Kriftner），ＲＷ．：リポソームの製造（Liposome Production）（１９９２）」；「ブルアン−ファルコ（Bruan-Falco）等編集：エタノール注入技術（The Ethanol Injection Technique），リポソーム誘導体（Liposome Derivatives），Berlin, Springer-Verlag, 第９１頁〜１００頁（１９９２）」；「クレマー（Kremer）等：変形注入法により調製した可変直径の小胞（Vesicles of Variable Diameter Prepared by a Modified Injection Method）, 生化学（Biochemistry）１６（１７）、 ３９３２〜３９３５（１９７７）」；「バツリ（Batzri），Ｓ及びコーン（Korn），ＥＤ．：高周波分解なしで調製した単二重層リポソーム（Single Bilayer Liposome Prepared Without Sonication），Ｂｉｏｃｈ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ２９８，１０１５〜１０１９（１９７３）」；が包含される。
【０００８】
上記に言及した諸方法又は諸文書のいずれも、上記バリー（Bally）等及び上記センプル（Semple）等の優れた薬物特性を有する、帯電脂質及び逆に帯電した治療剤から成る製剤のスケールアップには適していない。上記バリー（Bally）等及び上記センプル（Semple）等に記述されている製造技術は、わずか１〜１００ｍｌのために開発されたものであり、扱い難く、しかも、大規模製造（即ち、２０〜２００リットルの規模のもの）では維持できないほど非効率なものとなる。
本発明によって、脂質で十分に被包された治療剤の粒子を大規模に調製する方法であって、脂質及び治療剤が逆に帯電している該調製方法が初めて提供される。これらの粒子は、治療用組成物として、また、試験等のために有用である。
【０００９】
（発明の概要）
本発明による、帯電した治療剤が脂質で十分に被包された治療剤の粒子は、予め形成された脂質小胞、帯電した治療剤及び不安定化剤（destabilizing agent）から成る脂質組成物を結合させて、予め形成された小胞と治療剤の混合物を不安定化溶媒中で形成することによって調製する。不安定化溶媒は、予め形成された脂質小胞を崩壊することなく、該脂質小胞の膜を不安定化するのに有効である。得られた混合物は、予め形成された脂質小胞の内部に、治療剤をカプセル封じ（encapsulation）させるのに十分な時間の間、定温放置（incubate）する。次いで、不安定化剤を除去して、脂質で十分に被包された治療剤の粒子を得る。予め形成された脂質小胞は、帯電した治療剤の電荷と反対の電荷を持つ帯電脂質と、凝集を制御するための立体構造の障壁部分を有する修飾脂質とを含有する。修飾脂質は、予め形成された小胞の凝集を遅らせるが妨げないのに有効な量で、予め形成された小胞中に存在する。本発明の好ましい態様において、脂質粒子を大規模（例えば、２０〜２００リットル）で効率的に形成するのに有効な、核酸（例えば、アンチセンス・オリゴデオキシヌクレオチド）を含有する治療剤溶液は、エタノールの２５〜４０％水溶液に入れた予め形成された脂質小胞と結合させる。脂質で十分に被包された治療剤の粒子が自然発生的に製造される結果となるには、この混合物を約１時間の間、定温放置すれば十分である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の方法に関する、諸手順工程の考えられるモデルを示す。
【図２】被包効率（encapsulation efficiencies）を、ＰＥＧ−Ｃｅｒ １０モル％を含有するリポソームのためのエタノール濃度の関数として表わす。
【図３Ａ】エタノール濃度の関数としての、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＣｅｒＣ14／ＤＯＤＡＰのリポソーム中の自己消光（self-quenching）濃度で閉じ込められたカルセインの解放（黒丸）を、同じ脂質組成のリポソームを用いて得られた被包効率（白丸）と共に描く。
【図３Ｂ】本発明の方法を用いて、脂質で閉じ込められた核酸を形成する間の、脂質の迅速な交換を示す。
【図４】温度の関数としてプロットした、閉じ込め効率と、カルセイン漏出のデータとを示す。
【図５】Ａ、Ｂ及びＣは、脂質と結合したオリゴヌクレオチドのＮＭＲスペクトルを示す。
【図６】初期［オリゴヌクレオチド］対［脂質］比の関数としてプロットした、閉じ込め効率のグラフを示す。
【図７】幾つかの種類のアンチセンス・オリゴデオキシヌクレオチドとプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）とに対する被包効率を示す。
【００１１】
（発明の詳細な説明）
（定義）
本出願書類で使用する用語は、当業者に理解される通常の意味に解釈されるように意図されているが、幾つかの用語については、いかなる不明確さをも避けるために明確に定義する。従って、本出願の明細書（及び特許請求の範囲）において使用する用語：
「帯電脂質（charged lipid）」は、カチオン電荷若しくは負電荷を有する脂質種、又は、正味中和していない、両性イオンである脂質種のことを言い、概して、その脂質が見出される溶液のｐＨを参照する必要がある。
【００１２】
「不安定化（destabilization）」は、脂質膜が溶媒と相互作用する結果としての、脂質膜の特性の変化を言う。脂質膜が不安定化するとき、初期の脂質膜の基本形態は維持されている。しかし、低分子量の溶質の漏れ速度が増大し、脂質はその脂質膜を横切って「フリップ・フロップし（flip-flop）」、急速に他の脂質粒子に変化し得る。本発明における脂質膜の不安定化は、例えば、２５〜４０％のエタノール濃度で観察される。本明細書では、脂質小胞を不安定化させるが崩壊はさせない溶媒を、不安定化性溶媒（destabilizing solvents）と呼ぶ。
「崩壊（disruption）」は、初期の脂質膜の基本形態が喪失する程度に、脂質膜の性質が変成することを言う。脂質膜の崩壊は、例えば、６０％を越えるエタノール濃度で観察される。
【００１３】
「十分に被包された（fully encapsulated; 十分にカプセルに包まれた）」は、脂質粒子であってそこでは治療剤がリポソーム等の脂質小胞の内腔（lumen）の中に入っているか又は脂質粒子の二重層の内部に埋め込まれていて、治療剤のいかなる部分も脂質粒子を取り囲む外部媒体に直接接近することができない該脂質粒子を言う。脂質粒子であってそこでは治療剤が十分に被包されている該脂質粒子は、粒子であってそこでは治療剤が（例えば、イオン的相互作用によって）その脂質粒子の外部と複合体を形成している該粒子、或いは、粒子であってそこでは治療剤が部分的に脂質内に埋め込まれ、また部分的に外部媒体にさらされている該粒子とは全く異なる。被包（encapsulation; カプセル化; カプセル封じ）の程度は、入手可能な治療剤を劣化させる諸方法を用いて、決定することができる。ポリヌクレオチドの場合、これらの方法には、Ｓ１ヌクレアーゼ消化（Nuclease Digestion）、血清ヌクレアーゼ（Serum Nuclease）、及び小球菌ヌクレアーゼ（Micrococcal Nuclease）分析法が包含される。もう１つの方法として、オリグリーン（OliGreen）（登録商標）検定法を採用することができる。定量的な意味において、「十分に被包された」治療剤は、治療剤の９０％より多い量が自由形態（free form; 拘束されていない形態）で劣化するという条件下で、脂質粒子中における治療剤の１０％未満（好ましくは治療剤の５％未満）が劣化する治療剤である。更に、本発明から逸脱することなく、十分には被包されていない１種以上の追加治療剤を、錯形成反応（complexation）又は別のやり方で、その脂質粒子と結合させることができる。
【００１４】
「水和（hydration）」は、脂質粒子（リポソームを包含する）を形成する一般的プロセスを言う。このプロセスにおいて、脂質を取り囲む溶媒中の水の量は、約５％未満の濃度（この濃度で脂質分子は、通常、個々に溶媒和されている）から４０〜６０％以上の濃度（この濃度で脂質は、自発的に膜、ミセル又は粒子の形を取る）まで増加する。
「脂質（lipid）」は、脂肪酸のエステルであって水には溶けないが多くの有機溶媒には溶けることを特徴とする諸有機化合物の群を言う。それらは通常、少なくとも３つの種類：（１）ワックスの他に油脂を包含する「単純脂質」；（２）リン脂質及び糖脂質を包含する「複合脂質」；並びに、（３）ステロイド等の「誘導脂質」；に分けられる。多種多様の脂質が本発明に使用することができ、それらの幾つかを下記に説明する。
【００１５】
「予め形成された小胞」（preformed vesicle）」は、本発明の方法で使用される出発脂質組成物を言い、脂質小胞が包含される。これら小胞は、概して球形又は卵形の自己閉鎖構造（self-closed structure）を有する。この自己閉鎖構造は、１つ以上の脂質層から形成され、また、溶媒の一部を含有する内腔（interior lumen）を有する。これら小胞は、単層構造、少層構造（oligolamellar structure）又は多重膜構造である場合がある。
【００１６】
本明細書に開示する発明は、脂質で被包された治療剤の粒子を造るするための新規な方法であって、とりわけ、カチオン性脂質及びアニオンポリヌクレオチドを形成するときに見られるように、脂質及び治療剤が逆に帯電している場合、そのような諸粒子の大規模製造に適用することのできる該方法に関する。本発明は、予め形成された脂質小胞を治療剤の溶液と混ぜ合わせれば、結果的に、治療上有用な粒度の、脂質で十分に被包された治療剤が自発的に形成され得るという予期されない驚くべき観察結果に依る。従って、脂質で十分に被包された治療剤の粒子は、予め形成された脂質小胞を含有する脂質組成物と治療剤の溶液とを混合し、次いで、前記脂質小胞中に前記治療剤を被包するの時間の間、前記の得られた混合物を定温放置する諸工程を含む方法による本発明に従って形成される。脂質成分は、小胞を破壊することなく、脂質の膜を不安定化するのに有効な溶媒系を更に含有する。
【００１７】
本発明の方法は、該方法を当業界にとって実質的に有用であるようにする幾つかの重要な特徴を有する。第１に、該方法は、単一バッチ中における被包済み治療剤のかなりの量（例えば、１００ｇを超える量）を製造するのに使用することのできる大規模な方法である。第２に、治療剤を導入して、治療する上で有用な粒度の粒子を得た後に脂質粒子を処理することが必要でないようなやり方で、予め形成された脂質小胞の粒度は実質的に維持される。第３に、被包の効率は高い。第４に、粒子の中に負荷される治療剤の量は多い。
【００１８】
本発明で使用される脂質粒子は、少なくとも（１）治療剤の電荷と反対の実効電荷を有する帯電脂質；及び（２）凝集を制限するのに有用な、ポリエチレングリコール置換基等の変性剤を含有する修飾脂質；を包含する幾つかの種類の脂質を組み合わせることによって形成される。加えて、製剤には、中性脂質又はステロールが含有されることがある。上述の全ての成分を用いて脂質粒子を配合する場合、次の量の各脂質成分：帯電脂質 １０〜４０モル％；中性脂質 ２５〜４０モル％；ステロール ３５〜５５モル％；及び修飾脂質０．５〜１５モル％；を使用するのが適切である。特定の脂質諸成分は、次の非制限的諸例の中から選定することができる。
【００１９】
帯電脂質
生理的ｐＨでカチオンに帯電した脂質は、Ｎ,Ｎ−ジオレイル−Ｎ,Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）； Ｎ−（２,３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）； Ｎ,Ｎ−ジステアリル−Ｎ,Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）； Ｎ−（２,３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）； ３β−（Ｎ−（Ｎ’,Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）； Ｎ−（１,２−ジミリスチルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ,Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）（N-（1,2-dimyristyloxyprop-3-yl）-N,N-dimethyl-N-hydroxyethyl ammonium bromide）；を包含するが、それらに限定されない。更に、本発明で使用することができる多数のカチオン性脂質製剤が、市販されている。これら製剤には、例えば、リポフェクチン（Lipofectin）（登録商標）［米国ニューヨーク州、グランドアイランド、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬからの、ＤＯＴＭＡと、１,２−ジオレオイル−ｓｎ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）とを含有する、市販のカチオンリポソーム］；リポフェクタミン（Lipofectamine）（登録商標）［ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬからの、Ｎ−（１−（２,３−ジオレイロキシ）プロピル）−Ｎ−（２−（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ,Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）と、ＤＯＰＥとを含有する、市販のカチオンリポソーム］；及び、トランスフェクタム（Transfectam） （登録商標）［米国ウィスコンシン州、プロメガ社（Promega Corp.）からの、エタノールに入ったジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（ＤＯＧＳ）を含有する、市販のカチオン性脂質］；が包含される。
【００２０】
幾つかのカチオン帯電脂質は、滴定することが可能である。即ち、それら脂質は、生理的ｐＨ又はその近辺でのｐＫａを有し、また、それら脂質が緩酸ではカチオン性が強く、生理的ｐＨではカチオン性が弱い（又はカチオンではない）という、本発明にとって重要な結果を与える。そのようなカチオン帯電脂質は、Ｎ−（２,３−ジオレイロキシ）プロピル）−Ｎ,Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＭＡ）及び１,２−ジオレイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＤＡＰ）を包含するが、それらに限定されない。
【００２１】
生理的ｐＨでのアニオン性帯電脂質は、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ジホスファチジルグリセロール、ポリ（エチレングリコール）−ホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジラウリロイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアリロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルリン酸、ジパルミトイルリン酸、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、脳ホスファチジルセリン等を包含するが、それらに限定されない。
【００２２】
幾つかのアニオン帯電脂質は、滴定することが可能である。即ち、それら脂質は、生理的ｐＨ又はその近辺でのｐＫａを有し、また、それら脂質が緩酸ではアニオン性が強く、生理的ｐＨではアニオン性が弱い（又はアニオンではない）という、本発明にとって重要な結果を与える。当業者は、本明細書に開示する原理に基づいて、そのようなアニオン帯電脂質を認識することができる。
【００２３】
中性脂質及びステロール
用語「中性脂質（neutral lipid）」は、生理的ｐＨにおいて非荷電形態又は両性イオン形態で存在する多くの脂質種のあらゆる物を言う。そのような脂質には、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、コレステロール、セレブドシド及びジアシルグリセロールが包含される。
【００２４】
修飾脂質
本発明で使用される好ましい製剤の中には、ＰＥＧ−脂質、ポリアミドオリゴマー−脂質（例えば、ＡＴＴＡ−脂質）等の凝集防止性脂質、及び立体障壁又は「ステルス（ｓｔｅａｌｔｈ）」−脂質を含有するものが幾つかある。そのような諸脂質は、シアーズ（Sears）の米国特許第４，３２０，１２１号明細書；チョウイ（Choi）等の米国特許第５，８２０，８７３号明細書；ホランド（Holland）等の米国特許第５，８８５，６１３号明細書；ＷＯ９８／５１２７８［発明者 センプル（Semple）等］；及びポリアミドオリゴマーに関する米国特許出願シリアルＮｏ．０９／２１８９８８号明細書；に記述されている。これらは全て、言及することによって、本願明細書に組み入れる。これらの脂質は、逆に帯電した脂質と治療剤とを含有する製剤が沈降したり、凝集するのを防止する。これらの脂質はまた、生体内における循環寿命（circulation lifetime）を改善するのに使用することができる［クリバノフ（Klibanov）等：ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２６８（１），２３５〜２３７（１９９０）を参照］か、又は、それら脂質は、生体内で製剤から外れて迅速に交換されるように選定することができる（米国特許第５，８８５，６１３号明細書を参照）。とりわけ有用な交換性脂質は、一層短いアクリル鎖を有するＰＥＧ−セラミド（即ち、Ｃ１４若しくはＣ１８、本明細書ではＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４及びＰＥＧ−ＣｅｒＣ１８と称する）、又はＣ１４アクリル鎖を有するＰＥＧ−ＰＥである。
【００２５】
幾つかの脂質粒子製剤は、ある種の標的細胞又は標的組織でリポソームの局在化（localization）を助長するように設計されたターゲッティング成分（targeting moieties）を有することがある。ターゲッティング成分は、調製の間か又は調製の後、脂質粒子の外部二重層に連結させることができる。これらの方法は、当業界では周知である。加えて、幾つかの脂質粒子製剤は、ＰＥＡＡ等のフソジェニックポリマー（fusogenic polymers）；血球凝集素；他のリポペプチド（米国特許出願シリアルＮｏ．０８／８３５，２８１号明細書、及び同６０／０８３，２９４号明細書を参照。これら明細書は、言及することによって本明細書に組み入れる）；並びに、生体内及び／又は細胞内運搬（intracellular delivery）のために有用な他の特徴；を使用することができる。
【００２６】
予め形成された脂質小胞は、エタノール又は他の有機溶媒の溶液中、単一脂質水和工程を用いて調製することができる。エタノール又は他の有機溶媒の割合は、脂質粒子がその溶媒（通常、６０％を超える量のエタノール）の中に分解もされず再融解もされないが、本発明の自発的被包化プロセスを可能にする条件（エタノール約５％〜５０％、一層好ましくはエタノール ２５〜４０％）を与えるようなやり方で、選定しなければならない。別の方法として、膜の不安定化に寄与する、洗剤等の追加配合剤を、脂質小胞の溶液中に含有させることができる。本明細のために、「有機溶媒（organic solvent）」は、完全に有機の溶媒（即ち、１００％エタノール）か、又は部分的に有機の溶媒（例えば、水中のエタノール等、即ち、２０％エタノール、４０％エタノール等）を意味する。エタノール又は他のアルコール類、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ＤＭＳＯ、アセトン、他のケトン類、その他同種類のものを包含する、多種多様の水混和性有機溶媒を使用することができる。一層大きい極性又は一層小さい極性を有する溶媒が有用な場合もある。洗剤溶液には、β−Ｄ−グルコピラノシド；トウィーン（Tween）２０；ＷＯ ９６／４０９６４号明細書及び米国特許出願シリアルＮｏ．０９／１６９５７３号明細書（これら両方の明細書は、言及することによって本明細書に組み入れる）に開示されているもの；並びに、逆に帯電した脂質及び治療剤を混合する間、粒子の凝集を防止することができるところの、及び／又は、同じ溶解度の特徴を与えることができるところの、他のあらゆる洗剤若しくは立体障壁化合物；が包含される。全ての有機溶媒又は洗剤溶液は、配合プロセスによって患者への投与が妨げられないように、薬学的に痕跡量又はそれ以上の量で許容され得るのが好ましい。
【００２７】
アニオン性治療剤には、実質的に負の電荷を有するか；又は、該治療剤の他のカチオン電荷の基によって妨げられることなくカチオン性脂質と相互作用をすることのできる、負に帯電した基を有する；あらゆる治療剤が包含される。そのような治療剤には、オリゴヌクレオチド；核酸；（タンパク質−核酸等を包含する）変性核酸；負の電荷の基を有するペプチド及びタンパク質；植物アルカロイド等の従来の薬物；並びに、負の電荷の基を有する類似体；等（しかし、それらに限定されない）の薬物並びに化合物の全てを包含する、既知の又は潜在的な治療剤のいかなる物も包含される。本質的にアニオン性でない諸治療剤は、本発明で容易に使用するためにアニオン基で誘導してもよい。例えば、パクリタキセルは、その２’炭素に結合したポリグルタミン酸基で誘導することができる。
【００２８】
カチオン性治療剤には、実質的に正の電荷を有するか；又は、該治療剤の他の負電荷の基によって妨げられることなく負の脂質と相互作用をすることのできる、正に帯電した基を有する；あらゆる治療剤が包含される。そのような治療剤には、カチオン電荷に結合した修飾核酸；正の電荷の基を有するペプチド及びタンパク質；植物アルカロイド等の従来の薬物；並びに、正の電荷の基を有する類似体；等（しかし、それらに限定されない）の薬物並びに化合物の全てを包含する、既知の又は潜在的な治療剤のいかなる物も包含される。本質的にカチオン性でない諸治療剤は、本発明で容易に使用するためにカチオン基で誘導してもよい。
【００２９】
帯電した諸治療剤は典型的には当初、通常、ある量のエタノール又は他の有機溶媒を含有する緩衝水溶液に入れる。塩濃度は、本発明で使用する自己集合プロセス(self assembly process)（米国特許出願シリアルＮｏ．０９／１６９５７３号明細書；これに言及することにより本明細書に組み入れる）に強い影響を及ぼす場合があるので、使用する緩衝塩は注意深く選定しなければならない。更に、全ての緩衝液は、微量が最終製剤に残存することがあるため、薬学的に受け入れられなければならない。適切な緩衝液は、ホスホロチオエート型オリゴデオキシヌクレオチドに対しては３００ｍＭクエン酸塩緩衝液である。一層小さい結合親和性(binding affinities)を有する、ホスホジエステルベースのオリゴデオキシヌクレオチド及びプラスミドＤＮＡに対しては、イオン強度が一層小さい緩衝液が適切である。例えば、典型的なクエン酸塩濃度は２５〜１５０ｍＭであり、最大の閉じ込めが生じるのは約５０ｍＭである。エタノール、又は含有されることもある他の有機溶媒は、水性有機混合物中の治療剤の溶解度によって制御されるし、また、治療剤と予め形成された脂質小胞との最終混合物の望ましい特性によっても制御される。
【００３０】
脂質、不安定化溶媒及び治療剤は、一緒に作用して、脂質で十分に被包された組成物が提供されるように選定する。従って、もし治療剤がポリアニオン性オリゴヌクレオチドであるならば、脂質成分は、安定化溶媒中の諸条件下でカチオン性である脂質を含有するように選定する。逆に、もし治療剤がカチオン性であるならば、脂質成分は、不安定化溶媒中の諸条件下でアニオン性である脂質を含有するように選定すべきである。このことは、脂質溶液中に含有される全ての脂質が帯電していなければならないことも、幾らかの量の、同様に帯電している脂質若しくは両性イオン性脂質の取り込みを排除することも意味していない。上記のことは単に、脂質溶液が、治療剤の実効電荷と反対の実効電荷を有する脂質を持っていなければならないことを意味する。
【００３１】
本発明の方法では、脂質粒子及び治療剤の比較的希薄な溶液を使用する。治療剤溶液は通常、治療剤 １〜１０００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度を持ち、０．２〜１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１〜２ｍｇ／ｍｌの範囲の（予め形成された脂質小胞と混合した後の）最終濃度を生じる。予め形成された脂質小胞は治療剤溶液と混合して、（治療剤溶液と混合した後の）得られた脂質濃度が約１．５〜３０ｍｇ／ｍｌ（約２〜４０ｍＭ）、好ましくは１０ｍｇ／ｍｌとなるようにする。ポリヌクレオチド治療剤と共に使用する予め形成された小胞の好ましい組成物は、標準的脂質比［ＰＥＧ−ｃｅｒＣ14：ＤＯＤＡＰ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ（モル比 ５：２５：２５：４５）］で造られる。この溶液は、１００％エタノールに入れ、水性緩衝液（例えば、ｐＨ ４．０の３００ｍＭクエン酸塩）と混合することによって、エタノール５〜５０％（好ましくはエタノール４０％）に希釈する。
【００３２】
被包化は、脂質溶液とオリゴヌクレオチド溶液とを一緒に十分に混合されるまで撹拌し；次いで、全く混合しないで、或いは約１〜２時間の間、穏かに混合して、定温放置する；ときに生じる。次いで、得られた溶液を透析して、エタノール；又は脂質粒子の膜を不安定にする他の物質；を取り除く。粒子の外部と複合体を形成するかも知れない治療剤を解放するために、（帯電脂質が滴定可能である場合）ｐＨを調整し、表面電荷を中性化することもある。
【００３３】
本発明の方法によると、定温放置工程の終りに、自発的に形成され、十分に被包された治療剤の粒子であって、治療用途に受け入れられ；且つ、予め形成された脂質小胞の出発サイドに基づいて予測することのできる；粒度を有する該粒子が生じることとなる。従って、当業者に知られているタイプの分粒工程(sizing step)は通常、必要でない。このことは好都合である。なぜなら、治療剤を取り込んだ後、脂質小胞に対して何ら機械的応力を加える必要がなく；また、治療剤を減損させる危険性も、治療剤を損傷させる危険性も全くないからである。生成物粒子を更に分粒することが望まれるなら、得られた脂質粒子を分流するための随意的工程を採用することができる。また、分粒工程は、望ましい粒度の出発小胞を得るために、治療剤を導入する前の予め形成された小胞を調製する工程の一部として、採用することができる。
【００３４】
脂質粒子を分粒するための方法は幾つかあり、通常、これらの方法のいずれも、分粒することが本発明の一部として使用されるとき、採用することができる。押し出し(extrusion)方法は、リポソームを分流するための好ましい方法である。「ホープ(Hope)，ＭＪ等：押し出しによるリポソーム粒度の減縮及び単層小胞の調製(Reduction of Liposome Size and Preparation of Unilamellar Vesicles by Extrusion Techniques)，Ｉｎ：Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｇ．，グレゴリアディス(Gregoriadis)，編集）」を参照。この方法は、小孔ポリカーボネート膜又は非対称のセラミック膜を通過させてリポソームを押し出し、リポソーム粒度を小さくして比較的明確な粒度分布にすることから成る。典型的には、リポソームの望ましい粒度分布が達成されるまで、懸濁液をその膜に１回以上循環させる。リポソームは、リポソーム粒度を漸進的に小さくするために、孔が逐次的に小さくなって孔膜を通過させて押し出すことができる。
【００３５】
リポソーム［サイジング・リポソーム(sizing reposomes)］の母集団の粒度を小さくするためには、当業者に知られている種々の代替的方法を利用することができる。１つの分粒方法は、米国特許第４，７３７，３２３号明細書に記述されており、その明細書は言及することにより本明細書に組み入れる。浴超音波分解若しくはプローブ超音波分解によりリポソーム懸濁液を超音波処理することによって、粒度を漸進的に小さくし、直径が約０．０５μｍ未満の小さい単層小胞にする。均質化(homogenization)はもう１つの方法である。この方法は、大きいリポソームを崩壊させて一層小さいリポソームにするためのエネルギーを奪い取ることに依る。典型的な均質化において、多重膜小胞は、選定したリポソーム粒度（典型的には、約０．１〜０．５μｍ）が観測されるまで、標準エマルション・ホモジェナイザー(standard emulsion homogenizer)を通して再循環させる。リポソーム小胞の粒度は、「Ｂｌｏｏｍｆｉｅｌｄ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１０，４２１〜４５０（１９８１）」に記述されるように、準電光散乱(quasi-electric light scattering)（ＱＥＬＳ）によって決定することができる。リポソームの平均直径は、形成されたリポソームの超音波分解により小さくすることができる。断続的超音波分解サイクルは、ＱＥＬＳ評価と交互に入れ替えて、能率的なリポソーム合成を導くことができる。
【００３６】
種々のリポソーム分粒方法によって造られたリポソームの好ましい粒度は、ある程度、リポソームが造られている用途に左右されるが、通常、２５〜２５０ｎｍの範囲内となる。適切な粒度の具体的な諸例は、以下の諸例に開示する。
本発明により造られる脂質粒子の研究において、中空の大きい単層膜小胞（ＬＵＶ）は、閉じ込められた治療剤を有する多重膜小胞に転化されるということが、意外なことに発見された。いかなる特定の機構に縛られる意図はないが、生じているプロセスは、図１に示されるようなものであって、カチオンに帯電した脂質と、アニオン性治療剤とが想定される。そのプロセスは、単層小胞１０で出発する。単層小胞１０は、カチオン性脂質を含有する結果として、二重層壁の内側表面及び外側表面に正の表面電荷を有する。アンチセンス・オリゴヌクレオチド１１等のアニオン性治療剤を添加することによって、中間複合体１２が形成されることとなる。中間複合体１２において、治療剤の分子１１は、イオン機構／静電気機構によって、ＬＵＶの表面上で、逆に帯電した脂質に結合されている。
【００３７】
このプロセスの次工程は、凝集工程であると思われる。凝集工程において、ＬＵＶ／治療剤の複合体の凝集体１３が形成される。この凝集工程は非常に複雑であり、帯電した治療剤によって影響されるだけでなく；外見上、不安定化剤（例えば、エタノール）の量、及び予め形成された小胞中の変性脂質の量に依存しているようである。これらの諸プロセスに関するある種の限定された知識は、当業者に提供されているが、本発明のベースとなっている現象を当業者は、予測することも説明することもできない。カチオン性のリポソーム／ＤＮＡ複合体は、接触領域の平らな二重層隔膜を有する凝集したリポソームのクラスター(clusters)；ＤＮＡで被覆されたリポソーム；及び、（凝集した）多重膜構造であって、脂質の二重層の間にＤＮＡが挟まれている該構造；を包含する多種多様の異なった構造を示すことが知られている［グスタフソン(Gustafsson)等，１９９５；ラシク(Lasic)，１９９７；ラシク等，１９９７；ヒューブナー(Huebner)等，１９９９；シュ(Xu)等，１９９９］。後者の構造は、二重層又はリポソームを平らに積み重ねたものであり、それら構造の外部表面にはしばしば、開放二重層セグメントを示す。類似の諸構造は、負に帯電したリポソームにＣａ2+が結合した後で観察されてきた［パパハドジョポーロス(Papahadjopoulos)，１９７５；ミラー(Miller)及びダール(Dahl)，１９８２；ランド(Rand)等，１９８５；カカール(Kachar)等，１９８６］。これらの系で構造変形が生じることは、二重層の破壊及び融合のような、接着媒介プロセスの結果であると考えられた［ランド(Rand)等，１９８５；カカール(Kachar)等，１９８６；ヒューブナー(Huebner)等，１９９９］。第１に、リポソームは、ＤＮＡ又はＣａ2+によって架橋して凝集する。接触領域の急速な広がりは、諸リポソームが互いに平らになるように変形する。このために、二重層は増大した張力下に置かれる。もし張力（接着エネルギー）が十分に大きいならば、脂質膜上にかかる応力は、融合（面積／体積比の増大）及び／又は破壊（体積損）によって取り除かれる。面積が約３％だけ増大したとき、大抵の二重層は破壊する［エバンズ(Evans)及びパルセジアン(Parsegian)，１９８３］。二重層が破壊するとき、小胞は互いに平らになって崩壊し、多重膜の積み重なったもの(stacks)を形成する。エタノール等の膜不安定化剤は、カチオン性リポソームが、ＤＮＡ又はオリゴヌクレオチドと相互作用を起こすとき、構造の再配列が生じるのを調整することができる。
【００３８】
本発明の方法において、エタノールの存在下で単層小胞から多重膜リポソームが形成されることはまた、それらの形成のための接着媒介プロセス(adhesion-mediated process)の証拠となる。しかし、この場合の生成物は同心二重層殻であるため、そのプロセスは、ある点で、終端膜(terminated membranes)を有する複合体と相違する。後者の諸構造を形成するためには、エタノール又は類似の不安定化剤が必要であるが、これらの構造の再配列がどのように影響を受けるのかはっきりしていない。これらの再配列は、脂質のフリップ・フロップ（これは、アルコール濃度と相関がある）だけでなく；一層小さい諸分子に対する膜透過性障壁の損失、及び迅速な脂質交換とも相関がある。加えて、ＬＵＶから変性脂質を交換することは、脂質小胞の再組織化にとって重要な因子である。いずれにしても、ある種の機構によって、凝集体１３は再配列して、薄層間及び小胞の内部に閉じ込められた治療剤を有する多重膜小胞１４を形成する。この再配列は、形成される凝集体の性質だけでなく、凝集体が定温放置される温度にも左右される。治療剤の中には、多重膜小胞の外部の電荷と結合したままであるものがある。これらは、電荷の中和(neutralization)（例えば、滴定可能な帯電済み脂質の場合は、酸若しくは塩基を用いて）、又はイオン交換によって取り除くことができる。
【００３９】
脂質小胞及び不安定化溶媒の幾つかの特性は、最終生成物の特性に重要であり；また、これらの諸特性の選定は、生成物の多重膜小胞の特性を制御するのに使用することができる；ことが実験によって見出された。これらの諸特性には、
（１）予め形成された脂質小胞中に、治療剤の電荷と逆の電荷を有する帯電脂質が含有されていること；
（２）凝集を遅らせるには十分な量であるが、凝集を妨げるには十分でない量で、修飾脂質が含有されていること。ＰＥＧ−ＣｅｒＣ14の場合、その量は、約２．５〜１０％であることが分かった；
（３）不安定溶媒中に、（例えば、エタノール、洗剤等の）不安定剤が、予め形成された脂質小胞を不安定にするがそれら予め形成された脂質小胞を崩壊しない量で含有されていること；及び
（４）凝集工程及び閉じ込め工程が減結合しない(decoupled)温度で、脂質で十分に被包された治療剤の粒子の集合体を予め形成すること。通常、これは、室温（〜２０ｏＣ）以上の温度範囲で操作する必要があり、この温度範囲は不安定剤の濃度及び脂質の組成に左右される；
が包含される。
【００４０】
本発明の方法は、従来の混合装置を用いて実施することができる。しかし、大規模製造のためには、同時に出願されたＰＣＴ出願［主題：脂質小胞を調製するための方法と装置(Methods and Apparatus for Preparation of Lipid Vesicles)；シリアル番号はまだ与えられていない；出願日：２０００年７月１４日；代理人生理番号：８０４７２−６］に記載されている、特別に適合した装置を使用することが望ましい。その明細書は、言及することによって本明細書に組み入れる。
さて、本発明の方法は、次の非限定的諸例に言及して、更に説明される。
【００４１】
例
次の諸例で使用する諸物質は次のように供給される：
この研究で使用した、ホスホロチオエート・アンチセンス・オリゴデオキシヌクレオチド及びプラスミドＤＮＡは、イネックス製薬（Inex Pharmaceuticals）（バーナビー（Burnaby），ＢＣ，カナダ）によって提供された。オリゴヌクレオチドのｍＲＮＡ標的及び配列は次の通りである：
ヒトｃ−ｍｙｃ，５’−ＴＡＡＣＧＴＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴ−３’（配列ＩＤ番号１）；
ヒトＩＣＡＭ−１，５’−ＧＣＣＣＡＡＧＣＴＧＧＣＡＴＣＣＧＴＣＡ−３’（配列ＩＤ番号２）；及び
ＦＩＴＣ−標識ヒトＥＧＦＲ，５’−ＣＣＧＴＧＧＴＣＡＴＧＣＴＣＣ−３’（配列ＩＤ番号３）。
【００４２】
１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）は、ノーザン・リピッズ（Northern Lipids）（バンクーバー（Vancouver），ＢＣ，カナダ）から購入した。また、１,２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）；１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホセリン−Ｎ−（７−ニトロ−２−１,３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル）（ＮＢＤ−ＰＳ）；１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（リサミン ローダミン ｂ スルホニル）[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-（lissamine rhodamine b sulfonyl）]（ＬＲｈ−ＰＥ）；及び１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（７−ニトロ−２−１,３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル）（ＮＢＤ−ＰＥ）；は、アバンチ・ポーラー・リピッヅ（Avanti Polar Lipids）（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）から購入した。１−ヘキサデカノイル−２−（１−ピレンデカノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン[1-Hexadecanoyl-2-（1-pyrenedecanoyl）-sn-glycero-3-phosphocholine]（Ｐｙ-ＨＰＣ）；及びオリゴヌクレオチド−結合染料オリグリーン[oligonucleotide-binding dye OliGreen]は、モレキュラ・プローブズ（Molecular Probes）（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から入手した。１−Ｏ−（２’−（ω−メトキシポリエチレン−グリコール）スクシノイル）−２−Ｎ−ミリストイルスフィンゴシン（ＰＥＧ-ＣｅｒＣ14）；放射能標識［3Ｈ］−ＰＥＧ−ＣｅｒＣ14；及び１−Ｏ−（２’−（ω−メトキシポリエチレン−グリコール）スクシノイル）−２−Ｎ−ドデカノイルスフィンゴシン（ＰＥＧ-ＣｅｒＣ20）；は、ＩＮＥＸ ファルマシューティカルズ（Pharmaceuticals）（Ｂｕｒｎａｂｙ，ＢＣ，カナダ）によって提供された。コレステロール（chol）；ｎ−オクチル β−Ｄ−グルコピラノシド（ＯＧＰ）；トリトン（Triton） Ｘ−１００；カルセイン；ジクロロジメチルシラン；ヒドロ亜硫酸ナトリウム（亜ジチオン酸塩）；２−ｐ−トルイジニルナフタレン−６−スルホネート（ＴＮＳ）；ポリアネトールスルホン酸（ＰＡＳＡ）；は、シグマ（Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ，カナダ）から入手した。四酸化オスミウム；クエン酸鉛；マレイン酸；カコジル酸ナトリウム；及び埋め込み樹脂Ｅｍｂｅｄ ８１２；は、エレクトロン・マイクロスコープ・サイエンシズ（Electron Microscopy Sciences）（フォートワシントン（Fort Washington），ＰＡ）から購入し、また、低融点（Ｌ．Ｍ．Ｐ）アガロースは、ライフ・テクノロジーズ（Life Technologies）（Ｂｕｒｌｉｎｔｏｎ，オンタリオ）から購入した。コレステロール（ＣＨＯＬ）は、シグマ・ケミカル・カンパニー（Sigma Chemical Company）（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ミズリー州，米国）から購入した。ＰＥＧ−セラミドは、ＰＣＴ ＷＯ ９６／４０９６４号明細書（この明細書は、言及することによって本明細書に組み入れる）記述されている手順を用いながら、イネックス・ファルマシューティカルズ社（Inex Pharmaceuticals Corp.）のチャオ・ワング（Zhao Wang）博士が合成した。［3Ｈ］又は［14Ｃ］−ＣＨＥは、ＮＥＮ（米国マサチューセッツ州、ボストン）から購入した。脂質は全て、９９％を越える純度であった。エタノール（９５％）、メタノール、クロロホルム、クエン酸、ＨＥＰＥＳ及びＮａＣｌは全て、商業的供給業者から購入した。
【００４３】
分析方法： 脂質−治療剤が「十分に被包」されているように「被包」されているかどうかを決定するために使用した分析方法は、ＷＯ ９８／５１２７８号明細書に開示されている（その明細書は、言及することによって本明細書に組み入れる）。そのような方法には、Ｓ１ヌクレアーゼ消化、血清ヌクレアーゼ、及び小球菌ヌクレアーゼ分析法が包含される。
【００４４】
オリグリーン（Oligreen）分析は、小胞の中に負荷されたオリゴヌクレオチドを定量するのに使用した。水溶液中の１本鎖オリゴヌクレオチドを定量するための蛍光染料結合分析（fluorescent dye binding assay）は、ビオルミン（Biolumin）（登録商標）９６０蛍光プレート・リーダー［米国カリフォルニア州サニーベール、モレキュラー・ダイナミックス（Molecular Dynamics）］を用いて確立した。手短に言えば、被包済みオリゴヌクレオチドのアリコートは、ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水（ＨＢＳ；２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１４５ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ ７．５）で希釈した。希釈率１：２００のオリグリーン（Oligreen）（登録商標）試薬の１００μリットル［トリトン（Triton）Ｘ−１００洗剤 ０．１％を含有するものと含有しないものの両方］に、希釈試料の１０μリットルアリコートを添加した。被包済みオリゴを定量するため、トリトンＸ−１００洗剤 ０．１％を含有するものと含有しないものを用いて、オリゴ標準曲線を作成した。オリグリーン（Oligreen）（登録商標）−アンチセンス複合体の蛍光性（fluorescence）は、４８５ｎｍの励起波長及び５２０ｎｍの発光波長を用いて測定した。表面関連アンチセンス（surface associated antisense）は、洗剤の不存在下及び存在下の蛍光測定値を比較することによって決定した。
【００４５】
動的光散乱（dynamic light scattering）： 粒度は、ＮＩＣＯＭＰ３７０粒度測定器［カリフォルニア州サンタバーバラ、ニコン・パーティクル・サイジング社（Nicomp Particle Sizing Inc.）］を用いて、動的光散乱によって決定した。本出願書類全体に渡り、実験による相関関数からのキュムラント適合度（cumulant fit）によって得られた数平均粒度（number-averaged sizes）が与えられている。多分散性（polydispersity）は、モノモードガウス粒度分布（monomodal Gaussian size distribution）の半値高さ半値幅（half-width at half-height）として表わす。エタノール／クエン酸塩緩衝液の粘度は、ウベローデ型粘度計［キャノン（Cannon） ５０］を用いて決定した。２３℃の水と比較して測定した、同一温度のエタノール／３００ｍＭクエン酸塩緩衝液［４０／６０（ｖ／ｖ）］の粘度は、２．６７４ｍＰａ*ｓであることが分かった。ゼータ電位は、クールター（Coulter）光散乱計器［ＤＥＬＳＡ，クールター電子社（Coulter Electronics Inc.），ＦＬ］を用いた、電気泳動光散乱によって決定した。
【００４６】
脂質のフリップ・フロップ（flip-flop）： 脂質のフリップ・フロップは、亜ジチオン酸ナトリウムを用いて［マッキンタイヤ（McIntyre）及びスレイト（Sleight）（１９９１）；レンツ（Lentz）等（１９９７）］、蛍光脂質、ＮＢＤ−ＰＳを、非蛍光化合物まで化学還元することによって決定した。リポソームは、２０ｍＭ脂質で、１モル％ ＮＢＤ−ＰＳの存在下、押し出すことによって調製した。外部単一層に位置するＮＢＤ−ＰＳのみが、外部媒体に添加された還元剤（亜ジチオン酸塩）に接近することができる。内部単一層から外部単一層までのそれの再分配は、外部膜のリーフレット（leaflet）中でＮＢＤ−ＰＳが還元された後、生じる。１モルの亜ジチオン酸ナトリウムを、１モルのＴＲＩＳで新たに調製した。外部単一層中のＮＢＤ−ＰＳは、ＮＢＤに応じた亜ジチオン酸ナトリウムの１００倍過剰のモルを添加し；次いで、１０分間定温放置する；ことによって還元した。反応の完了は、４６５ｎｍでの還元励起（reduction exciting）の前後において、５２０ｎｍでの亜ジチオン酸塩の蛍光発光を測定することによって調べた。次いで、過剰の亜ジチオン酸塩は、「セファデックス（Sephadex） Ｇ５０ カラム」でのサイズ排除クロマトグラフィー（size exclusion chromatography）によって排除した。リポソームは、４０％エタノールの存在下で定温放置し、最終脂質濃度 １５０μＭに対応するアリコートを種々の時間ポイントで測定のために取り去った。
【００４７】
漏出試験： ＬＵＶｓのエタノール誘導透過性を、種々の温度で、また、閉じ込められた溶質の大きさ（分子量）の関数として測定した。漏出に対する低分子量のマーカーとしては、カルセインを使用し、また、高分子量のマーカーとしては、ＦＩＴＣ−デキストラン（dextran）（分子量 １９５００）を使用した。自己消光濃度で閉じ込められたカルセインの漏出の後、カルセインの蛍光の脱消光（dequenching）をモニタリングした。ＬＵＶｓは、水酸化ナトリウムを添加することによってｐＨ ７．５に調整した、カルセイン ７５ｍＭ及びＨＥＰＥＳ ５ｍＭを含有する水溶液で、脂質膜を水和し；次いで、５回の凍結／融解サイクルにかけ；二重に積み重ねた１００ｎｍフィルタを通して（１０回通過）押し出しを行う；ことによって調製した。ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＣｅｒＣ14／ＤＯＤＡＰの押し出しは、６０℃で行った。閉じ込められなかったカルセインは、「ＤＥＡＥ セファローズ（Sepharose）ＣＬ６Ｂカラム」でのアニオン交換クロマトグラフィによって、等浸透圧性（isoosmotic）ＨＢＳ緩衝液に対して交換した。リポソームの原液（stock solution; 貯蔵液）は、２５℃、４０℃又は６０℃で予備均衡化された、変動量のエタノールを含有するＨＢＳで、３μＭの脂質濃度に希釈した。対応する温度で５分間定温放置を行った後、「Perkin Elmer ＬＳ５０ 蛍光計（Perkin Elmer）」を用いて、５２０ｎｍでの蛍光を測定した［励起波長 ４８８ｎｍ；４３０ｎｍでのロングパス・フィルタ（long-pass filter）］。１０％「Triton Ｘ−１００」溶液を添加して、最終濃度を０．０５％にすることによって、１００％漏出（最大の脱消光）のための値を得た。カルセインの漏出は、
漏出（％）＝（Ｆs−Ｆb）／（ＦTx−Ｆb）*１００
［式中、Ｆｓは試料の蛍光であり；Ｆbは、エタノールの不存在下で、カルセイン含有リポソームに対応するバックグラウンドであり；ＦTxは、「Triton Ｘ−１００」値である］に従って計算した。
【００４８】
ＦＩＴＣ−デキストラン（dextran）（分子量 １９５００）は、０．５モル％ ＬＲｈ−ＰＥを取り入れて、４５ｍｇ／ｍｌの最終濃度にして、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＣｅｒＣ14／ＤＯＤＡＰのリポソーム中に閉じ込めた。閉じ込めは、エタノールに溶解した脂質を、ＨＢＳに入れたＦＩＴＣ−デキストラン溶液に添加し；次いで、押し出しを行い（二重に積み重ねた１００ｎｍフィルタ、２回通過）；次いで、透析によってエタノールを除去する；ことによって実施した。閉じ込められなかったＦＩＴＣ−デキストランは、「セファローズ（Sepharose）ＣＬ４Ｂ カラム（１．５×１．５ｃｍ）」でのサイズ排除クロマトグラフィーによって排除した。４０％エタノールにさらされたリポソームからのＦＩＴＣ−デキストランの損失は、「セファローズ ＣＬ４Ｂ カラム（１．５×１．５ｃｍ）」でのサイズ排除クロマトグラフィーによって解放されるＦＩＴＣ−デキストランを除去した後、決定した。ＦＩＴＣ／ＬＲｈ−ＰＥの比は、エタノール添加の前後に測定した。ＦＩＴＣ及びＬＲｈ−ＰＥの蛍光は、励起波長をそれぞれ４８５ｎｍ及び５６０ｎｍに設定して、５１５ｎｍ及び５９０ｎｍで測定した。
【００４９】
脂質混合（Lipid mixing）： ドナー（ＮＢＤ−ＰＥ）とアクセプター（ＬＲｈ−ＰＥ）の間で、共鳴エネルギー移動の損失が生じた後に、エタノール誘導脂質混合／交換が生じ、また、これらドナー及びアクセプターは、非標識標的膜の中にプローブが希釈されるとき、極めて接近している［ストラック（Struck）等，１９８１］。ＬＵＶｓは、ＮＢＤ−ＰＥとＬＲｈ−ＰＥの両方を０．７５モル％含有した。標識リポソーム及び非標識リポソームは、ｐＨ ７．５のＨＢＳ中で、２０ｍＭの脂質濃度で押し出しを行うことによって調製した。標識リポソーム及び非標識リポソームにエタノールを添加して、最終エタノール濃度が４０％（ｖ／ｖ）になるようにした。次いで、標識リポソーム及び非標識リポソームのエタノール性分散系を、１：５のモル脂質比で混合し；次いで、適切な温度で定温放置した。所定の時間ポイントで、アリコートを回収し；次いで、ＨＢＳ ２ｍｌに加えて、１５０μＭの最終脂質濃度を与えた。ＮＢＤ及びＬＲｈの発光スペクトルは、励起波長を４６５ｎｍに設定して（４３０ｎｍ発光、ロングパス・フィルタ）、５０５〜６５０ｎｍの範囲で測定した。バックグラウンドを差し引いた後（１５０μＭ脂質の非標識リポソーム）、共鳴エネルギー移動の損失は、ＮＢＤ／ＬＲｈ比の増加として表わした。
【００５０】
ピレン−ＨＰＣ分析： ピレン−ＨＰＣは、高濃度で励起状態の二量体を形成し、モノマーとは異なる波長で蛍光を発する。エキシマーの形成は、拡散律速過程であり、２つの分子が一緒になって二量体を形成する必要がある。膜中のピレン−ＨＰＣの横への可動性（lateral mobility）が減少することも、脂質を混合すること（標的膜）も、ピレンエキシマーの蛍光が減少することとなり得る［フックストラ（Hoekstra），１９９０；デュポールテイル（Duportail）及びリアノス（Lianos），１９９６］。外側相を分離すれば、通常、ピレンエキシマーの蛍光が減少することとなる［デュポールテイル及びリアノス，１９９６］。この試験の理論的根拠は、リポソーム膜に及ぼすオリゴヌクレオチド結合の影響を調べることであった。オリゴヌクレオチドを閉じ込めるリポソームのピレン−ＨＰＣの蛍光は、膜間ｐＨ勾配が減損する前後に、中空の対照リポソームと比較した。内部のｐＨが７．５に増大することによって、膜結合済みオリゴヌクレオチドが解放されることになる。７モル％の濃度でピレン−ＨＰＣを取り込んでいるリポソームは、ｐＨ ４のクエン酸塩緩衝液に、エタノールに溶解した脂質を添加することによって調製した。アリコートを取り去り、上述のようにオリゴヌクレオチドを被包した。残りの初期リポソームは、後続の諸工程の全てにおいて同様のやり方で処理した（以下の閉じ込みを参照）。ｐＨ勾配は、ｐＨ ７．５に調整した酢酸アンモニウムを用いて消失させた。リポソームは、適切な緩衝液、ｐＨ ７．５のＨＢＳ、又はｐＨ ７．５の１５０ｍＭ 酢酸アンモニウムで希釈して、２μＭの最終脂質濃度にした。ピレン−ＨＰＣ発光スペクトルは、３４５ｎｍで励起し、３５０ｎｍの発光カットオフ・フィルタを用いて、３６５〜５５０ｎｍの波長領域で記録した。［３９７ｎｍでのモノマーの蛍光］対［４７８ｎｍでの二量体の蛍光］の強度比は、ｐＨ勾配が消失する前後において、オリゴヌクレオチド含有リポソームに対しても、初期リポソームに対してもプロットした。
【００５１】
31Ｐ ＮＭＲ分光分析法： ８１ＭＨｚで作動する「ブルーカー（Bruker） ＭＳＬ２００」分光計を用いて、31Ｐ ＮＭＲスペクトルを得た。１０ｍｍプローブの２．０ｍｌ試料について、２０００Ｈｚのスペクトル幅と、３秒インターパルス遅れを伴う２．８μｓ５０°パルスとを使用することによって、８００又は２４００走査（scans）に対応する自由誘導減衰（free induction decays）（ＦＩＤｓ）を集めた。減結合している（decoupling）プロトンは全く使用しなかった。線広がり（line broading）の２５Ｈｚに対応する指数的増加は、フーリエ変換を行う前にＦＩＤｓに適用した。化学シフトは、外部の８５％リン酸（Ｈ3ＰＯ4）に関係した。ｐＨ ７．５での遊離オリゴヌクレオチド及び被包されたオリゴヌクレオチドのスピン格子緩和時間（Ｔ1）は、Ｔ1free＝１．７秒、及びＴ1enc.＝２．１秒と本質的に同一であった。Ｔ1値は、逆位−回復パルス配列（inversion-recovery pulse sequence）によって測定した。５０°パルスに対する３秒のインターパルス遅れによって、全てのアンチセンス共鳴の完全な緩和が可能となる。
【００５２】
超遠心分離法（Ultracentrifugation）： オリゴヌクレオチドを被包したリポソーム、及びオリゴヌクレオチドを被包しなかったリポソームは、ｐＨ ７．５のＨＢＳ中のショ糖 １％、２．５％、１０％及び１５％（ｗ／ｖ）であって、それぞれ３．５、３．５、２．５及び１．５ｍｌの段階容量を有するものから成るショ糖段階勾配（sucrose step gradient）について、超遠心分離法によって分別した。「ＳＷ４１Ｔｉ」回転子を組み合わせた「ベックマン（Beckmann）Ｌ８−７０」超遠心分離機を使用して、３６０００ｒｐｍ（ＲＣＲRmax ２２１０００ｘｇ）で２時間の間、諸試料を分離した。勾配は、上部から分別するか；又は針でチューブに穴をあけた後、注射器を用いて個々のバンドを除去した。
【００５３】
極低温透過型電子顕微鏡検査（Cryo-Transmission Electron Microscopy）（cryo-TEM）： 試料の１滴を、穴あき炭素膜を有する、標準電子顕微鏡グリッドに塗った。過剰の液は、炭素膜の穴を覆っている水の薄層を残しながら、ろ紙で吸い取ることによって除去した。グリッドは、液体エタンで急速に凍結し、小胞が無定形氷の薄膜中に埋め込まれる結果となった。「フィリップス（Philips）ＣＭ２００ ＦＥＧ」電子顕微鏡の「Ｇａｔａｎ」低温ホールダーを用い、６６０００倍、１．５μｍ以下の焦点ボケの極低温条件下で、氷中の小胞の画像を得た。
【００５４】
凍結破断電子顕微鏡検査（Freeze-Fracture Electron Microscopy）： 試料は、２５％ グリセロールの存在下、液体Ｎ2で冷却した液体フロン（Freon）２２の中にそれら試料を沈めることによって、極低温固定した。破面は、「バルツァーズ凍結エッチング（Balzers Freeze-Etching） ＢＡＦ ４００Ｄ （リヒテンシュテインのバルツァーズ（Balzers））」を使用して、白金（４５°）で一定方向に影を投じ、また、炭素（９０°）で被覆した。「ＪＥＯＬ Ｍｏｄｅｌ ＪＥＭ １２００ＥＸ」電子顕微鏡［カナダ、ＱＣ、モントリオール、Soquelec］を使用して、レプリカ（replicas）を分析した。
【００５５】
透過型電子顕微鏡検査（Transmission Electron Microscopy）（TEM）： 小胞は、２％ 四酸化オスミウムの１容量を、ＨＢＳに入れた小胞の０．５容量に加えることによって固定し；次いで、１７０００ｘｇ、４℃で４５分間、遠心分離機で分離した。得られたペレットは、等容量の３％アガロース／ＰＢＳと混合し、顕微鏡のスライドの上にピペットで移し、次いで、４℃に冷却した。小胞を含有する、固化したアガロースは、１ｍｍの断片に切断し、次いで、更なる処理を行うため、ガラス管に移した。それらブロック（blocks）は、２％酢酸ウラニルで１時間染色する前に、ｐＨ ５．２の０．０５Ｍ マレイン酸で、３×５分間の間、洗浄した。組織片は、一連の傾斜アルコール（５０〜１００％）で脱水し；［エポキシ樹脂（ＥＭｂｅｄ ８１２）］：［プロピレンオキシド］比を増大させて浸透させ；次いで、１００％「ＥＭｂｅｄ ８１２」の中に６０℃で２４時間の間、埋め込んだ。極薄切片は、２％クエン酸鉛で染色し、次いで、「ツァイス（Zeiss） ＥＭ １０Ｃ」透過型電子顕微鏡（ドイツ、オーベルコッヒェン）を使用して検査を行った。
【００５６】
位相差蛍光顕微鏡検査（Phase contrast and fluorescence microscopy）： 光学的仕様「エキサイテーション ４７５±２０／２色性 ５００／エミッション ５３５±２２．５」を有する、オメガ・オプティカル（Omega Optical）（バーモント州ブラトルバロ）からの「１．６ｘ optovar」レンズ及び「ＸＦ１００」フィルターセットと組み合わせた、「Plan Apochromat 63x/1.4NA」油浸レンズを使用している、「Zeiss Axiovert １００」顕微鏡によって、位相差蛍光顕微鏡検査を行った。画像は、「Zeiss ＭＣ８０ ＤＸ」顕微鏡カメラを用いて、１６００ ＩＳＯの「Kodak Ektachrome Ｐ１６００」カラー・リバーサル・フィルムに記録した。スライド及びカバーガラスは、ジクロロジメチルシランでシリコン化して、さもなければ負に帯電するガラス表面を中和した。
【００５７】
（例１）
ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４、ＤＯＤＡＰ、ＤＰＳＣ及びＣＨＯＬを、５：２５：２５：４５のモル比で含有する脂質混合物から、中空の予め形成された小胞を調製した。それら４種の脂質を１００％エタノールに溶解し、全脂質濃度 ２５ｍｇ／ｍｌ（３３ｍＭ）にした。次いで、エタノール性脂質は、０．２５ｍｍのオリフィス直径を有する噴射ノズルを通して、３００ｍＭのクエン酸塩緩衝液（ｐＨ ４．０）を含有する容器の中に導入した。容器及び全ての溶液は室温であった。エタノール性脂質の全容量は６リットルであり、脂質を導入するための流量は、２００〜３００ｍｌ／分であった。クエン酸塩緩衝液の全容量は９リットルであった。その結果として得られた１５リットルの混合物は、４０％のエタノール濃度と１８０ｍＭのクエン酸塩を有した。中央粒径 １７０±２０ｎｍの小胞が生成した。空の予め形成された小胞は、二枚の８０ｎｍの積み重ね膜を使用している、低圧（最高水準の５００〜１０００ｐ．ｓ．ｉ．から低下させた１００ｐ．ｓ．ｉ．）の押出し回路（extrusion circuit）を、６５℃で１〜３回通過させることによって、中央粒径 ９０〜１２０ｎｍの大きさに造った。次いで、それら中空の予め形成された小胞は、容器（reservoir）２０の中に貯留し、次いで、治療剤の溶液を添加するまで、４０℃に保持した。
【００５８】
（例２）
例１の予め形成された小胞を使用して、治療剤として、オリゴヌクレオチド ＩＮＸ−６２９５（配列ＩＤ番号１）を使用した、脂質で十分に被包された治療剤の粒子を造った。蒸留水に入れたオリゴヌクレオチド ＩＮＸ−６２９５は、１００％エタノールを追加することによって希釈し、４０％エタノールに入っているオリゴヌクレオチド １０、２０、３０、４０又は５０ｍｇ／ｍｌという種々の溶液を作った。エタノール性オリゴヌクレオチドは、４０℃の容器２０に入れた予め形成された小胞に、穏かに混合しながら添加した。エタノール性オリゴヌクレオチドの量及び容量を計算して、［薬物］：［脂質］の最終重量比 ０．１〜０．２５を与えた。次いで、その混合物は、１時間の間、穏かに且つ断続的に混ぜ合わせながら、４０℃で定温放置した。定温放置した後、その溶液は、ダイアフィルトレーション（diafiltration）によって処理し、遊離の又は過剰の付随オリゴヌクレオチドを取り除き、エタノールを除去し、次いで、緩衝系をｐＨ ７．４のリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と交換した。濃化、除菌及びパッケージを行うことによって、商業用製品の製剤が完成する。
【００５９】
（例３）
例２の手順は、種々のパラメータに変化を加えて繰り返して、本発明の、脂質で十分に被包された治療剤の粒子の調製にとっていずれのパラメータが重要であるかを決定した。これらの実験において、全オリゴヌクレオチドの回収率（収率）；全脂質の回収率（収率）；及び被包化効率；は、製品とプロセスの質を示すものと考えた。全オリゴヌクレオチドの回収率は、式：
［｛最終オリゴ濃度（ｍｇ／ｍｌ）×最終容量（ｍｌ）｝／
｛初期オリゴ濃度（ｍｇ／ｍｌ）×初期容量（ｍｌ）｝］×１００％
を用いて計算した。
全脂質の回収率は、式：
［｛最終脂質濃度（ｍｇ／ｍｌ）×最終容量（ｍｌ）｝／
｛初期脂質濃度（ｍｇ／ｍｌ）×初期容量（ｍｌ）｝］×１００％
を用いて計算した。
被包化効率（Ｅ．Ｅ．）；は、
［｛初期オリゴ（ｍｇ／ｍｌ）／初期脂質（ｍｇ／ｍｌ）｝／
｛最終オリゴ（ｍｇ／ｍｌ）／最終脂質（ｍｇ／ｍｌ）｝］×１００％
を用いて計算した。
被包された（即ち、二重層の中に組み込まれたか、又は脂質粒子の内部に閉じ込められた）オリゴの割合は、上述のオリグリーン分析（OliGreen assay）によって決定した。
【００６０】
［初期薬物］：［初期脂質］の比の有意性を判断するために、２つの異なる出発比（starting ratios）を用いて実験を行った。表１にその結果をまとめる。オリゴヌクレオチドを負荷するプロセスに、小胞の粒度の変化は全く観察されなかった。
【００６１】
【表１】
【００６２】
定温放置の温度の有意性を判断するために、室温と２種の高めた温度とで１時間の間、実験を行った。表２にその結果をまとめる。示される通り、６０℃という一層高い温度は、プロセスの有効性を損ない始め、また、粒度を増大させる。従って、一層低い温度が好ましい。
【００６３】
【表２】
【００６４】
定温放置の時間の有意性を判断するために、３種の定温放置時間と、４０℃定温放置温度とで、実験を行った。表３にその結果をまとめる。示される通り、収率は、０．５時間〜１時間の間で改善されるが、１時間を越える定温放置時間では、実質的に改善されない。このように、使用した装置での最も有効なプロセスは、約１時間の定温放置時間を使用することである。
【００６５】
【表３】
【００６６】
オリゴヌクレオチド溶液の緩衝液濃度の有意性を判断するために、クエン酸塩緩衝液の４種の異なる濃度と、初期［薬物］／［脂質］比 ０．１とで、実験を行った。表４にその結果をまとめる。
【００６７】
【表４】
【００６８】
混合工程の間の初期エタノール濃度の有意性を判断するために、２種の初期［薬物］／［脂質］比の各々について３種の異なる初期エタノール濃度で、実験を行った。表５にその結果をまとめる。各々の出発［薬物］／［脂質］比について異なる、最適エタノール濃度が存在するようである。表５には記載していない追加実験では、５０％の初期エタノール濃度を、０．１の［オリゴ］／［脂質］比と一緒に使用した。この実験で、未知の原因による重大な問題に遭遇し、製品の収率は全くなかった。
【００６９】
【表５】
【００７０】
初期オリゴヌクレオチド濃度の有意性（従って、同一の初期［薬物］対［脂質］比を得るための治療剤溶液の容量の有意性）を判断するために、オリゴヌクレオチドの４種の異なる濃度の原液（stock solutions）を使用した。表６にその結果をまとめる。示されるように、このパラメータは、本発明の方法を用いて得られる結果には重要でないように思われる。
【００７１】
【表６】
【００７２】
（例４）
一層大きい治療剤に対する、本発明の適用性を実証するために、プラスミド ｐＩＮＥＸ Ｌ１０１８（ＣＭＶプロモーターに連結したルシフェラーゼ遺伝子をコード化しており、また、ＳＶ４０エンハンサー及びＡｍｐＬ遺伝子を持っている５．５ｋｂプラスミド）を予め形成された脂質小胞の中に負荷した。
予め形成された脂質小胞は、１００％エタノールに溶解した諸脂質（２０／４５／２５／１０モル％比でのＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＯＤＡＰ／ＰＥＧ−Ｃｅｒ１４）１０ｍｇを、２５ｍＭクエン酸塩緩衝液［水酸化ナトリウムでｐＨ ４に調整した、２５ｍＭクエン酸、２５５ｍＭスクロース（ショ糖）］にゆっくり添加することによって調製した。両方の溶液は、混合する前に、４０℃に予熱した。最終エタノール濃度は、４０％（ｖ／ｖ）であった。脂質小胞のエタノール分散系は、室温で、二重に積み重ねた１００ｎｍポリカーボネート・フィルタを２回通過させて押し出した。それら脂質小胞に、４０％エタノールに入れたプラスミドＤＮＡ ０．２５ｍｇを室温で添加し、次いで、その試料は４０℃で１時間の間定温放置した。初期［プラスミド］／［脂質］比は０．０２５であった。続いて、その試料は、ｐＨ ７の２５ｍＭ生理食塩水（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ） ２リットルに対して合計１８〜２０時間の間透析した。
【００７３】
閉じ込め効率（trapping efficiency）は、残存している外部プラスミドＤＮＡを除去した後、ＤＥＡＥセファローズ（Sepharose）ＣＬ６Ｂカラムでのアニオン交換クロマトグラフィによって決定した。プラスミドＤＮＡは、ブライ・ダイアー抽出法（Bligh Dyer extraction）によってプラスミドから分離した後、ＤＮＡ結合系ピコグリーン脂質（DNA Binding System PicoGreen lipid）を用いて、フィスケ・サバロウ（Fiske and Subbarrow）による無機リン酸塩分析によって定量した。加えて、最終脂質濃度は、蛍光標識済み脂質、リサミン ローダミン−ＰＥ ０．２５モル％を、脂質小胞の中に組み入れることによって決定した。
最終のプラスミド 脂質比は０．０２２であった。この値は、８８％の閉じ込めに相当する。得られた脂質被包済み治療剤の粒子は、１００ｎｍの平均粒度と、非常に小さい粒度分布とを有した。
【００７４】
（例５）
リポソームの調製： エタノール／緩衝液の溶液に入った大きい単層リポソームは、押し出したリポソームにエタノールを添加するか；又はエタノールに溶解した脂質を水性緩衝液に添加し、次いで、押し出す；ことによって調製した。両者いずれの方法も、同じ閉じ込め結果を与え、下記に一層詳細に記述する：
１．ｐＨ ４のクエン酸塩緩衝液に入れた脂質膜を水和し、凍結／融解サイクルを５回行った後、二重に積み重ねた１００ｎｍフィルタを通過させて（１０回通過）押し出すことによって、大きな単膜リポソーム（ＬＵＶｓ）を生成した。ＤＯＤＡＰ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−Ｃｅｒ１４のリポソームの場合、押し出しは６０℃で行った。次いで、急速に混合しながら、エタノールをゆっくり添加した。エタノールを除去した後、動的光散乱法によって決定した、典型的なリポソーム粒度は、ＤＯＤＡＰ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−Ｃｅｒ14系について９０±２０ｎｍであった。エタノール濃度がある上限値を越えるや否や、リポソームが不安定になり、合体して大きい脂質構造になるため、エタノールをゆっくり添加すること及び急速に混合することは、重要である。後者は、脂質の組成に依存する。例えば、エタノール濃度が５０％（ｖ／ｖ）を越えるとき、初期に半透明のＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−Ｃｅｒ14／ＤＯＤＡＰリポソーム分散系は、乳白色になる。
【００７５】
２．大きな単膜リポソーム（ＬＵＶｓ）は、エタノール（０．４ｍｌ）に溶解した脂質をｐＨ ４のクエン酸塩緩衝液（０．６ｍｌ）に室温でゆっくり添加し、次いで、二重に積み重ねた１００ｎｍフィルタを通過させて（２回通過）押し出すことによって調製した。エタノール中で行った動的光散乱測定値と、透析によってエタノールを除去した後に行った動的光散乱測定値とは、粒度の有意差を示さず、粒度は典型的には７５±１８ｎｍである。激しく混合しながらエタノールを非常にゆっくり添加して、エタノール濃度が局部的に高くなるのが回避される場合、押し出し工程は省略することができる。
【００７６】
閉じ込め方法： オリゴヌクレオチド溶液は、エタノール性リポソーム分散へ、渦巻き状に撹拌しながらゆっくり添加し；次いで、その溶液は、適切な温度で１時間の間、定温放置し；クエン酸塩緩衝液に対して２時間の間透析して大半のエタノールを除去し；次いで、ＨＢＳ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／１４５ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ ７．５）に対して再び透析した。ＤＯＤＡＰは、ｐＨ ７．５で、電荷中性となり、外側膜表面に結合したオリゴヌクレオチドは、カチオン性脂質との結合から解放される。次いで、ｐＨ ７．５のＨＢＳで平衡状態に保たれている「ＤＥＡＥ−セファローズ（sepharose） ＣＬ−６Ｂ カラム」によるアニオン交換クロマトグラフィにより、被包されなかったオリゴヌクレオチドを取り除いた。エタノールに代えてオクチルグルコシドを使用した場合、洗剤をリポソームに添加して（１：１ ｖ／ｖ）、最終濃度が３０〜４０ｍＭの範囲になるようにした。初期の透析工程をｐＨ ４のクエン酸塩緩衝液に対して行い、その工程を５時間に伸ばしたことを除いて、後続の諸工程は全て上述のように実施した。次の諸例において、別に断らない限り、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−Ｃｅｒ14／ＤＯＤＡＰリポソーム（２０：４５：１０：２５モル％）；ｃ−ｍｙｃ（配列ＩＤ Ｎｏ．１）；４０％（ｖ／ｖ）エタノール；３００ｍＭクエン酸塩緩衝液；及び４０℃での定温放置；を使用した。
【００７７】
閉じ込め効率の決定： 閉じ込め効率は、外部オリゴヌクレオチドを除去した後、アニオン交換クロマトグラフィによって決定した。オリゴヌクレオチドの濃度は、「島津ＵＶ１６０Ｕ 分光光度計」による紫外分光法によって決定した。１：２．１：１のクロロホルム／メタノール／水相（試料／ＨＢＳ）の容量比のクロロホルム／メタノールに試料を可溶化した後、２６０ｎｍでの吸光度を測定した。混合した後、溶液が完全に透明にならなかった場合、メタノール ５０〜１００μｌを更に添加した。もう１つの方法として、１００ｍＭ オクチルグルコシドに試料を可溶化した後、吸光度を読み取った。アンチセンスの濃度は、
ｃ［μｇ／μｌ］＝Ａ260*１ＯＤ260ユニット［μｇ／ｍｌ］*希釈因子（factor）［ｍｌ／μｌ］
（式中、希釈因子は、試料の容量［μｌ］で除した全分析容量［ｍｌ］によって与えられる）に従って計算した。ＯＤ260ユニットは、個々のデオキシヌクレオチドの対吸光係数（pairwise extinction coefficients）から計算した。これら対吸光係数は、隣接相互作用を考慮している。１ＯＤは、３０．９７μｇ／ｍｌのｃ−ｍｙｃ（配列ＩＤ．Ｎｏ．１）；３３．３７μｇ／ｍｌのｈ−ＩＣＡＭ−１（配列ＩＤ．Ｎｏ．２）；及び３４μｇ／ｍｌのＥＧＦＲ（配列ＩＤ．Ｎｏ．３）；に対応する。脂質濃度は、ブライ・ダイアー抽出法（ブライ及びダイアー，１９５９）により、オリゴヌクレオチドから脂質を分離した後、無機リン酸分析によって決定した。手短に言えば、水相（試料／ＨＢＳ） ２５０μｌに、メタノール ５２５μｌ及びクロロホルム ２５０μｌを添加して、透明な単一相［水相／メタノール／クロロホルム（１：２．１：１容量比）］を形成した。溶液が透明でない場合、少量のメタノールを追加した。次いで、ＨＢＳ ２５０μｌ及び等量のクロロホルムを添加した。諸試料は混合し、３０００ｒｐｍで５〜１０分間、遠心分離機で分離した。これによって、透明な２相系が得られた。クロロホルム相は、フィスケ・サバロウ法（１９２５）により、リン脂質含有量を分析した。別に断らない限り、閉じ込め効率は、［オリゴヌクレオチド］対［脂質］重量比（ｗ／ｗ）として表わす。
【００７８】
（例６）
例５の手順の後、押し出しにより調製した１００ｎｍのＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＯＤＡＰリポソーム（変性なし脂質成分）に、増加量のエタノールを添加した。全ての試料は、オリゴヌクレオチドを添加すると直ちに乳白色になった。これは、オリゴヌクレオチドにより誘導された凝集を示す。ｐＨ ４において０．０３５のモル［ＯＤＮ］／［脂質］比でアンチセンス・オリゴヌクレオチドと共に定温放置を行った後、エタノールと、閉じ込められなかったオリゴヌクレオチドとを取り除いた。表７に、得られた多重膜小胞の最終粒度と共に、動的光散乱によって決定した被包効率を記載する。エタノール濃度が増大するにつれて、ますます多くのアンチセンス・オリゴヌクレオチドが閉じ込められる。同時に、粒度及び多分散性（polydispersity）が増大することは、ＬＵＶｓ（大きな単膜リポソーム）が一層大きな脂質構造に漸次再編成されたことを反映している。これら一層大きな脂質構造は、大部分が大きな多重膜リポソームであると思われる。これらの系の粒度のために、閉じ込められなかった外部のオリゴヌクレオチドを除去するのに使用したアニオン交換カラムの上で失われる脂質もあることに注目すべきである。溶出した部分は、全脂質の約５０〜６０％に相当する。４０％以上のエタノール濃度で、初期リポソームは、不安定になり、融合し、乳白色の分散系を形成する。
【００７９】
【表７】
【００８０】
これらの諸結果は、エタノールによって脂質膜が、大きな多重膜リポソームの共心薄層（concentric lamallae）間にオリゴヌクレオチドを閉じ込めさせる構造的再配列（structural rearrangements）を生じ易くなることを実証する。しかし、得られるリポソームの粒度を容易に制御することはできない。
【００８１】
（例７）
修飾脂質（ＰＥＧ−Ｃｅｒ） ２．５〜１０モル％を含有するリポソームを造り、次いで、例５及び６の諸プロトコルを用いて試験を行った。各々の場合、ＰＥＧ−Ｃｅｒ濃度の減少は、ＤＰＳＣレベルの増大によって調整した。リポソームの中に修飾脂質を取り込むこと（incorporation）によって、アンチセンス含有リポソームの最終粒度が調節されることが分かった。リポソームは、ＰＥＧ−Ｃｅｒが存在する場合、それが存在しない場合と比べて、一層大きいエタノール濃度で安定する。ＰＥＧ−Ｃｅｒ ２．５モル％を含有する試料については、濁度がわずかに増大するのが認められたが、４０％エタノール中では、それら分散系は光学的に半透明のままであった。安定性が増大したことはまた、閉じ込め（entrapment）が生じるために必要なエタノールの量が一層多いことに反映される（表８、図２）。図２には、被包効率が、ＰＥＧ−Ｃｅｒ １０モル％を含有するリポソームに対するエタノール濃度の関数として描かれる。最大の閉じ込めは、４０％エタノールで達成され、また、閉じ込めが生じるためには、２５％（ｖ／ｖ）を越えるエタノール濃度（＞４．３Ｍ）が必要であった。エタノールが存在しないと、閉じ込めは全く見出されなかった。表８には、動的光散乱によって決定される閉じ込め効率及び粒度が、図２から決定される最小エタノール濃度及び最大エタノール濃度での、ＰＥＧ−Ｃｅｒ含有量（２．５〜１０モル％）の関数として記載される。初期の被押し出しリポソームの粒度は、括弧内に与えられる。閉じ込めが生じるために必要なエタノールの量は、リポソームのＰＥＧ−Ｃｅｒ含有量に依存する。ＰＥＧ−Ｃｅｒ ２．５モル％を含有するリポソームにでは、２５％エタノールでオリゴヌクレオチドの約１５％が閉じ込められた。対照的に、ＰＥＧ−Ｃｅｒ １０モル％において、２５％エタノールの存在下では実質的に閉じ込めは達成されず（≦５％）、また、４０％エタノールの存在下では６０％であった。全ての場合、初期の［オリゴヌクレオチド］対［脂質］比は０．０３７（モル／モル）であった。ＰＥＧ−Ｃｅｒ含有量が２．５モル％から１０モル％まで増大するとき、閉じ込めレベルは、４０％エタノール中で、４５％からほぼ６０％まで増大した。リポソーム粒度及び多分散性は１３１±４０ｎｍから１００±２６ｎｍまで減少した。
【００８２】
【表８】
【００８３】
（例８）
脂質膜上でエタノールをかき乱す効果は、脂質の水和；アシル鎖のオーダー（order）；小さいイオンの膜透過性；及びＤＰＰＣ系における鎖の相互からみ合いの誘導；の変化に関連して、主に低いエタノール濃度（＜１５％、ｖ／ｖ）で研究されてきた［スレイター（Slater）及びハング（Hung），１９８８；バーチフェルド（Barchfeld）及びディーマー（Deamer），１９８８；シュビッヒテンホーベル（Schwichtenhovel）等，１９９２；スレイター（Slater）等，１９９３；バリー（Barry）及びゴーリッヒ（Gawrisch），１９９４；ビエル（Vierl）等，１９９４；ロベッケ（Lobbecke）及びチェブク（Cevc），１９９５；コマツ（Komatsu）及びオカダ（Okada），１９９６；ホルテ（Holte）及びゴーリッヒ（Gawrisch），１９９７］。閉じ込めるために必要な高濃度のエタノールにおいてリポソームが依然として無傷であるか否かを問うことは道理にかなっている。図３Ａには、エタノールの濃度の関数として、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＣｅｒＣ14／ＤＯＤＡＰリポソーム中の自己消光濃度（self-quenching concentrations）で閉じ込められたカルセインの解放（黒丸）が、同一の脂質組成のリポソームを使用して得られた被包効率と共に描かれている。漏出の実験も被包の実験も、４０℃で行った。カルセイン（６２３の分子量を持つ小さい分子）の漏出は、３０％以下のエタノールで出発し、約４０％のエタノールで最大に達する。オリゴヌクレオチドの閉じ込めは、類似のエタノール依存を示し、その閉じ込めが、リポソーム膜の透過性障壁の不安定性と相関関係が高いことを表わしている。カルセインとは対照的に、ＦＩＴＣ−デキストラン（分子量 １９５００）の解放は、４０％エタノール中で１０％未満である。このことは、オクチルグルコシド等の洗剤についても報告されてきたように［アルモッグ（Almog）等，１９９０］、透過性障壁の損失が、分子量依存であることを示す。４０％エタノールに入った巨大リポソームの位相差顕微鏡検査によっても、無傷のリポソーム構造が明らかとなった。
【００８４】
脂質はまた、リポソームの間、並びにリポソームから成る脂質二重層の内部単一層及び外部単一層の間で、迅速に交換できる。図３Ｂに示されるように、ＮＢＤ−ＰＥ／ＬＲｈ−ＰＥ ＦＲＥＴ分析によって検出されるような脂質混合（lipid mixing）は、４０％エタノール中で、有効に隣接している。小胞粒度の増大は全く観察されず、脂質混合がリポソームの融合よりむしろリポソーム間の迅速な脂質交換から生じていることを示している。図３Ｂに示される結果はまた、亜ジチオン酸ナトリウムとの化学還元に基づく、外部脂質単一層中に位置しているＮＢＤ−ＰＳの蛍光の損失によって示される通り、諸脂質が、リポソーム脂質の二重層の一方側から他方側へ迅速に移動する（フリップ・フロップする）ことを実証する。
【００８５】
（例９）
被包に基づく濁度の増大は、閉じ込みが初期凝集工程［小凝集（microaggregates）の形成］によって先行されることを示す。その凝集工程及び閉じ込みは、低温で切り離すことができる。オリゴヌクレオチドを添加する時又は添加の直後に、試料は濁り、また、濁度は時間が経てば増大する。エタノールが存在しない場合、濁度がわずかに増大するのみであり、その後、光の透過率は一定のままである。４０℃で調製した試料とは対照的に、４℃で定温放置した試料は、エタノールを除去すると、再び半透明になり、リポソームはオリゴヌクレオチドを閉じ込めない。図４には、閉じ込め効率が、温度の関数として、カルセインの漏出データと共にプロットされている。漏出データは、カルセインの５０％解放を引き起こすのに必要なエタノール濃度として与えられる。また、リポソーム膜の不安定性と閉じ込め効率の間には、質的な相関関係が存在する。
【００８６】
（例１０）
31Ｐ−ＮＭＲは、オリゴヌクレオチドの閉じ込みを分析するのに使用することができる。図５のＡ及び図５のＢは、溶解状態のｃ−ｍｙｃの31Ｐ−ＮＭＲスペクトルを示し（図５のＡ）、また、ＤＯＤＡＰ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＣｅｒＣ14リポソームに閉じ込められたｃ−ｍｙｃの31Ｐ−ＮＭＲスペクトルを示す（図５のＢ）。それらリポソームは、初期に、内部ｐＨが４であり外部ｐＨが７．５である膜間ｐＨ勾配を示した。これらの条件下で、閉じ込められたオリゴヌクレオチドは、正に帯電したリポソーム膜としっかりと結合している。この固定化によって、ＮＭＲ信号は消失する（disappearance）（幅が広がる）結果となる（図５のＢ）。酢酸アンモニウムの添加によってｐＨ勾配が消滅し、外部ｐＨが７．５に調整されるとき、ＤＯＤＡＰは脱プロトン化し、オリゴヌクレオチドはリポソーム膜から解離する。このことは、ＮＭＲ信号の回復（recovery）（図５のＣ）によって実証される。しかし、この回復は不完全であり、初期信号の約５０％である。この信号の減衰は、ＮＭＲ共鳴の飽和に起因するものではない。それは、２つの可能性：被包されたアンチセンスの量がその溶解度を越えて、その一部が沈降すること；又は、アンチセンス分子の移動度が、例えば、２つの接近して並んでいる二重層の間に固定化されることによって、空間的に制約されること；に起因するのかも知れない（図３Ａを参照）。オリゴヌクレオチドが、被包されてリポソームの水性内部に局部集中したことを確認するために、ＭｎＳＯ4 ５ｍＭを外部溶液に添加した（図５のＤ）。Ｍｎ2+は、膜不透過性常磁性線広がり剤（membrane impermeable paramagnetic line broadening agent）であって、オリゴヌクレオチドだけでなく、接近可能な全てのリン酸基、リン脂質の信号を消滅させる。しかし、オリゴヌクレオチドの信号は、影響されないままであり、ＯＧＰを有するリポソームの可溶化に基づいてのみ消滅した（図５のＥ）。初期リポソーム（図５のＢ）が、Ｍｎ2+の不存在下で、ＯＧＰにより可溶化されるとき、全体のオリゴヌクレオチド信号は回復する。これらのデータによって、オリゴヌクレオチドがリポソーム内に閉じ込められ、また、外部膜と単純には結合しないことが明白に実証される。閉じ込められたオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド結合性染料オリグリーン（OliGreen）に接近しなかったことにも注目すべきである。
【００８７】
オリゴヌクレオチドの全体像から見たＮＭＲ研究によって、オリゴヌクレオチドとリポソームの間の相互作用が説明される。脂質の動特性の変化及び膜組織は、ピレン標識脂質を用いて精査することができる［デュポーテイル（Duportail）及びリアノス（Lianos），１９９６］。ピレン標識脂質は、高濃度で、励起状態の二量体を形成する。これら二量体は、モノマーと異なる波長で蛍光を発する。エキシマーの形成は、拡散律速過程（diffusion-controlled process）であって、一緒になって二量体を形成する２つの分子を必要とする。それらオリゴヌクレオチドの結合によって、リポソームを制御するのに関与し、オリゴヌクレオチドを含有しない全ての脂質種の横への移動性（lateral mobility）が著しく減少する結果となる。その膜は横方向に圧搾される。これは、ピレン−ＨＰＣのエキシマー蛍光の減少が観測されることによって得られる。膜間ｐＨ勾配の減損によって、エキシマー蛍光が増加し、脂質の移動性が回復する結果となる。
【００８８】
（例１１）
閉じ込め効率と同様、アンチセンスを閉じ込めているリポソームの粒度も、初期［アンチセンス］対［脂質］比に依存する。図６は、高い［アンチセンス］対［脂質］比でオリゴヌクレオチドを効率よく閉じ込め得ることを示す。閉じ込め効率は、初期［オリゴヌクレオチド］対［脂質］比の関数としてプロットされている。最大閉じ込め効率での結合レベルは、脂質１ｍｇ当りオリゴヌクレオチド ０．１６ｍｇ（０．０２４モル／モル）である。これは、１００ｎｍのリポソーム当り約２２５０分子のオリゴヌクレオチドに相当し、また、この閉じ込め手順が高効率であることを実証する。閉じ込め効率は、受動的被包化（passive encapsulation）によって得られたものより、約３桁大きい。
［オリゴヌクレオチド］対［脂質］比を増大させるとき、試料の多分散性も粒度も、リポソーム単独の７０±１０ｎｍから、０．２の初期［ＯＤＮ］対［脂質］重量比の１１０±３０ｎｍまでわずかに増大する。凍結破断電子顕微鏡検査（freeze-fracture electron microscopy）により、初期［オリゴヌクレオチド］対［脂質］比の増大と共に、一層大きいリポソームの数が増大することが分かった。また、初期に半透明であったリポソーム分散系は、［アンチセンス］対［脂質］比が増大するにつれて、ますます濁ってくることに注目すべきである。
【００８９】
（例１２）
接近して向き合っている膜であってそれら膜の多層構造がＴＥＭ（透過型電子顕微鏡検査）によって観察される該膜の形成を、ＰＥＧコーティングは妨げることが期待される。従って、放射能標識ＰＥＧ−ＣｅｒＣ14を使用することによって、ＰＥＧ−Ｃｅｒの命運について試験を行った。アンチセンス・オリゴヌクレオチドを、非標識ＰＥＧ−ＣｅｒＣ14 １０モル％と、５．９の［3Ｈ］／［Ｃ14］比での、コレステロールマーカーとしての［14Ｃ］−コレステロールヘキサデシルエーテル（ＣＨＥ）とに加えて、痕跡量の［3Ｈ］−ＰＥＧ−ＣｅｒＣ14を含有するリポソーム中に被包した。この比は、見掛けの［ＰＥＧ−Ｃｅｒ］／［Ｃｈｏｌ］比を表わし、また、［ＰＥＧ−Ｃｅｒ］／［Ｃｈｏｌ］のモル比に代えて使用される。初期の［アンチセンス］対［脂質］重量比は０．２９であった。閉じ込めは、最終的に０．１６の最終［アンチセンス］対［脂質］比となった。遊離のＰＥＧ−Ｃｅｒミセル及びＰＥＧミセルは、ショ糖段階勾配（sucrose step gradient）［ＨＢＳに入ったショ糖 １％、２．５％、１０％、１５％（ｗ／ｖ）］を用いて、超遠心分離法によってリポソームから分離した。中空のリポソームは、５．５の見掛け［ＰＥＧ−Ｃｅｒ］／［Ｃｈｏｌ］比で、２．５％ショ糖と１０％ショ糖の境界に集まる。このバンド（band）は、全脂質の約８０％を占める。アンチセンス含有リポソームは、同一の位置に弱いバンドを示し、このバンドは全脂質の９％未満に相当する。しかし、大抵のリポソームアンチセンスは、１５％ショ糖層又は下部のペレットに移動する。表９に、勾配のリポソーム含有フラクション（fractions）の全分析を示す。それら結果は、高い［オリゴヌクレオチド］対［脂質］比で調製した試料を表わす。相対的な［ＰＥＧ−Ｃｅｒ］／［Ｃｈｏｌ］比は、勾配の下部の方に向かい漸進的に減少している。ＰＥＧ−Ｃｅｒの５０％以上が、初期リポソーム（見掛け［ＰＥＧ−Ｃｅｒ］／［Ｃｈｏｌ］比は５．５）に比べて下部フラクションから失われている。［ＤＳＰＣ］／［Ｃｈｏｌ］比は変化していない。ＰＥＧ−Ｃｅｒの２７％は、コレステロールの６．６％と共に、上部フラクションに見出すことができる。ほぼ同じ量の非リポソーム結合ＰＥＧ−Ｃｅｒが、中空の対照リポソームに見られる。
【００９０】
上記勾配の諸フラクションの更なる分析によって、アンチセンス含有リポソームはそれらのアンチセンス含有量及び粒度において大きな差異を示すことが分かる（表９）。平均粒度も［オリゴヌクレオチド］対［脂質］比も、上部から下部へ増大する。三つの主要集団を、明瞭なバンドとして確認することができる（表１０）。それらの相対割合は、初期［オリゴヌクレオチド］対［脂質］比に依存する（表１０）。第１の集団は、低い［ＯＤＮ］／［脂質］比（０．０３〜０．０５）のアンチセンス含有リポソームである。第２の集団は、０．１４〜０．１５の［ＯＤＮ］／［脂質］比を有するリポソームである。最後の集団は、非常に高い［ＯＤＮ］／［脂質］比（０．２９ｍｇ／ｍｇ）を有するリポソームである。最後の集団は、初期［ＯＤＮ］／［脂質］比が減少しているそれら初めの２つの集団に有利なように減少している。最後の集団は、光学的に濁っているのに対して、他の２つの集団は、半透明である。閉じ込み率と粒度の観測差異を、極低温透過型電子顕微鏡検査によって認識される形態の不均質性と関連付けることを試みた。アンチセンスは、高い初期［オリゴヌクレオチド］／［脂質］比（０．２８ｍｇ／ｍｇ）で閉じ込められ、また、表１０のフラクション１５及び１７に対応する２つの主要フラクションは、透析によりショ糖を除去した後、極低温透過型電子顕微鏡検査によって検査した。上部のフラクションは専ら、二重層リポソームであってそれらの多くがバルブ（bulbs）を示す該二重層リポソームから成るのに対し、下部のフラクションは、二重層リポソームと多重膜リポソームの混合物を含有した。
【００９１】
【表９】
【００９２】
【表１０】
【００９３】
（例１３）
エタノールの存在下、カチオン性リポソームにオリゴヌクレオチドを添加すれば、ドメイン形成を生じさせることができる。見られる多重膜リポソームの形成は、リポソームの接着によって先行されなければならない。しかし、エタノールの不存在下では、１０モル％ＰＥＧ−Ｃｅｒは接着を完全に妨げる。エタノールの存在下では、２つの効果：即ち、第１に、迅速な脂質交換による、非膜取り込み済み（non membrane-incorporated）ＰＥＧ−Ｃｅｒの量の増加；及び、ＰＥＧ−Ｃｅｒ中で消耗されアンチセンス・オリゴヌクレオチド中で富化される小さいドメインの形成；が、リポソームの接着に寄与し得る。後者の可能性を研究した。オリゴヌクレオチド結合の効果は、ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドと併せてＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＯＤＡＰ／ＰＥＧ−ＣｅｒＣ14の巨大リポソームを用いて、位相差蛍光顕微鏡により視覚化した。観察された大抵のリポソームは、多重膜であり、内部構造を示した。エタノールの不存在下で、巨大リポソームは崩壊して不規則形状の凝集体となり、また、アンチセンスの添加によって一層小さいリポソームとなった。グリーンＦＩＴＣ蛍光発光（green FITC fluorescence）によって、オリゴヌクレオチドの位置が明らかとなった。４０％エタノールの存在下では、全く異なる事態が与えられる。初期に丸いリポソームは、オリゴヌクレオチドを添加して５〜１０分間は西洋なし形状をしており、また、これらオリゴヌクレオチドは、これらリポソーム構造体の一方側では半円形で置かれている。内部膜は、この馬蹄形のものから圧搾される。この馬蹄形のものは、（とりわけ、温度が上昇するとき）引き離されて崩壊し、蛍光が完全にグリーンに見える、緻密でわずかに不規則な構造体となる。オリゴヌクレオチドの分離は、エタノールがドメインの形成を刺激し得ることを表わしている。
【００９４】
（例１４）
本発明の被包化手順は、特定のオリゴヌクレオチド及び脂質の組成に左右されないし、また、使用される高いクエン酸塩濃度にも制限されない。被包化は、５０ｍＭクエン酸塩緩衝液で最も効率が高く、一層低いクエン酸塩濃度でも一層高いクエン酸塩濃度でも減少する。粒度及び多分散性は、２５ｍＭ以下のクエン酸塩濃度ではかなり増大する。図７は、プラスミド−ＤＮＡも、ｃ−ｍｙｃ（配列ＩＤ番号１）以外の諸オリゴヌクレオチドも、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＯＤＡＰ／ＰＥＧ−ＣｅｒＣ14のリポソーム中に効率よく閉じ込めることができることを示す。初期の［オリゴヌクレオチド］対［脂質］重量比は０．１ｍｇ／ｍｇであり、オリゴヌクレオチドを閉じ込めるために、３００ｍＭクエン酸塩緩衝液を使用した。ｐＤＮＡの閉じ込めは、０．０３の［ｐＤＮＡ］対［脂質］重量比で、５０ｍＭクエン酸塩緩衝液中で行った。ホスホロチオエート型アンチセンス・オリゴヌクレオチドと異なり、ホスホジエステルベースの分子は、３００ｍＭクエン酸塩緩衝液等の高いイオン強度の緩衝液では、被包することができない。これは恐らく、結合親和性（binding affinities）の差異を反映する［センプル（Semple）等，２０００］。大きい分子の効率のよい被包化とは対照的に、ＡＴＰの１０％未満は、０．２ｍｇ／ｍｇの初期［ＡＴＰ］対［脂質］比で、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＯＤＡＰ／ＰＥＧ−ＣｅｒＣ14のリポソーム中に閉じ込めることができる。ＡＴＰの閉じ込めは、５０ｍＭクエン酸塩緩衝液中で行った。表５は、この閉じ込め手順が、ＤＯＰＥ系を含有する他の諸脂質組成物に拡張することができることを実証する。負に帯電したリポソーム；及び正に帯電した、ポリリシンを含む高分子電解質；に関する予備結果によって、閉じ込みが、エタノール中における、高分子電解質と、逆に帯電したリポソームとの相互作用の一般的特徴であることが分かる。
【００９５】
（例１５）
エタノールに代えて、オクチルグルコシド（ＯＧＰ）を使用した。洗剤をリポソームに添加し（１：１ ｖ／ｖ）、最終濃度を３０〜４０ｍＭの範囲とした。後続の諸工程は全て、例５で記述した通りに実施した。但し、ｐＨ ４のクエン酸塩緩衝液に対する初期透析工程は５時間に延長した。オリゴヌクレオチドは、外部から添加されるオリグリーン（Oligreen）、蛍光オリゴ−結合性染料から保護されるべきことが分かった。初期［オリゴヌクレオチド］対［脂質］比は、０．２３（ｍｇ／ｍｇ）であった。粒度は、数平均粒度を表わす。ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＯＤＡＰ／ＰＥＧ−ＣｅｒＣ14は、２０／４５／２５／１０モル％であった。表１１に、被包化の観察レベル、及び最終粒度をまとめる。
【００９６】
【表１１】
【００９７】
当業者が、本発明、及び本明細書の諸技術を使用すれば、脂質で十分に被包された治療剤の粒子を生成するための、他の方法並びに手段を認識することが可能であり、それら方法及び手段の全ては、特許請求の範囲に包含される。
【００９８】
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センプル（Semple），Ｓ．Ｃ．；Ｓ．Ｋ．，クリマック（Klimuk）；Ｔ．Ｏ．，ハラシム（Harasym）；Ｎ．，ドスサントス（Dos Santos）；Ｓ．Ｍ．，アンセル（Ansell）；Ｋ．Ｆ．，ウォン（Wong）；Ｎ．，マウレル（Maurer）；Ｈ．，スターク（Stark）；Ｐ．Ｒ．，カリス（Cullis）；Ｍ．Ｊ．，ホープ（Hope）；Ｐ．，シェラー（Scherrer）：イオン性アミノ脂質を用いた脂質小胞中のアンチセンス・オリゴヌクレオチドの効率的被包化：新規で小さな多重膜リポソーム構造体の形成
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
帯電した治療剤の、脂質で十分に被包された治療剤粒子を製造する方法であって、
予め形成された脂質小胞から成る脂質組成物と、帯電した治療剤と、不安定化溶媒中で予め形成された小胞と治療剤の混合物を形成するための不安定化剤とを混合する工程であって、不安定化溶媒は、予め形成された脂質小胞を崩壊することなく脂質小胞の膜を不安定化するのに有効であり、
予め形成された脂質小胞の内部に治療剤を被包するのに十分な時間、前記混合物を定温放置する工程、
前記不安定化剤を除去する工程、
からなり、予め形成された脂質小胞が、帯電した治療剤の電荷と反対の電荷を持つ帯電脂質と、凝集を制御するための立体構造の障壁部分を有する修飾脂質からなり、及び、修飾脂質が、予め形成された小胞の凝集を遅らせるものの妨げない有効な量で、予め形成された小胞中に存在する、上記製造方法。
【請求項２】
予め形成された脂質小胞中の帯電脂質がカチオン性脂質からなり、治療剤がアニオン性治療剤である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
治療剤がポリヌクレオチドである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
カチオン性脂質が、
ジオレイル−Ｎ,Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）；
Ｎ−（２,３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；
Ｎ,Ｎ−ジステアリル−Ｎ,Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）；
Ｎ−（２,３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）；
３β−（Ｎ−（Ｎ’,Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）；
Ｎ−（１,２−ジミリスチルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ,Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）；
ＤＯＴＭＡ及び１,２−ジオレオイル−ｓｎ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から成るカチオン性リポソーム；
Ｎ−（１−（２,３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−（２−（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ,Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）及びＤＯＰＥから成るカチオン性リポソーム；
エタノール中のジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（ＤＯＧＳ）から成るカチオン性脂質；
Ｎ−（２,３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ,Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＭＡ）及び１,２−ジオレイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＤＡＰ）
から成る群から選ばれる、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
脂質組成物が、帯電脂質 １０〜４０モル％、中性脂質 ２５〜４０モル％、ステロール ３５〜５５モル％、及び修飾脂質２．５〜１０モル％から成る、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
不安定化剤がエタノールである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
エタノールが、不安定化溶媒中に２５〜４０％の濃度で存在する、請求項６記載の方法。
【請求項８】
不安定化剤が界面活性剤である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
不安定化溶媒が、更にクエン酸塩緩衝液 ２５〜３００ｍＭから成る、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
混合物は、約４０℃の温度で定温放置する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
修飾脂質が、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ14である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
予め形成された脂質小胞が、カチオン性脂質；ＤＯＰＥ及びＤＳＰＣから成る群から選ばれる中性脂質；修飾脂質；並びにコレステロールを含有する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１】
帯電した治療剤の、脂質で十分に被包された治療剤粒子を製造する方法であって、
予め形成された脂質小胞から成る脂質組成物と、帯電した治療剤と、不安定化溶媒中で予め形成された小胞と治療剤の混合物を形成するための不安定化剤とを混合する工程であって、不安定化溶媒は、予め形成された脂質小胞を崩壊することなく脂質小胞の膜を不安定化するのに有効であり、
予め形成された脂質小胞の内部に治療剤を被包するのに十分な時間、前記混合物を定温放置する工程、
前記不安定化剤を除去する工程、
からなり、予め形成された脂質小胞が、帯電した治療剤の電荷と反対の電荷を持つ帯電脂質と、凝集を制御するための立体構造の障壁部分を有する修飾脂質からなり、及び、修飾脂質が、予め形成された小胞の凝集を遅らせるものの妨げない有効な量で、予め形成された小胞中に存在する、上記製造方法。
【請求項２】
予め形成された脂質小胞中の帯電脂質がカチオン性脂質からなり、治療剤がアニオン性治療剤である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
治療剤がポリヌクレオチドである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
カチオン性脂質が、
ジオレイル−Ｎ,Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）；
Ｎ−（２,３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；
Ｎ,Ｎ−ジステアリル−Ｎ,Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）；
Ｎ−（２,３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）；
３β−（Ｎ−（Ｎ’,Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）；
Ｎ−（１,２−ジミリスチルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ,Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）；
ＤＯＴＭＡ及び１,２−ジオレオイル−ｓｎ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から成るカチオン性リポソーム；
Ｎ−（１−（２,３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−（２−（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ,Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）及びＤＯＰＥから成るカチオン性リポソーム；
エタノール中のジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（ＤＯＧＳ）から成るカチオン性脂質；
Ｎ−（２,３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ,Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＭＡ）及び１,２−ジオレイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＤＡＰ）
から成る群から選ばれる、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
脂質組成物が、帯電脂質 １０〜４０モル％、中性脂質 ２５〜４０モル％、ステロール ３５〜５５モル％、及び修飾脂質２．５〜１０モル％から成る、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
不安定化剤がエタノールである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
エタノールが、不安定化溶媒中に２５〜４０％の濃度で存在する、請求項６記載の方法。
【請求項８】
不安定化剤が界面活性剤である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
不安定化溶媒が、更にクエン酸塩緩衝液 ２５〜３００ｍＭから成る、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
混合物は、約４０℃の温度で定温放置する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
修飾脂質が、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ14である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
予め形成された脂質小胞が、カチオン性脂質；ＤＯＰＥ及びＤＳＰＣから成る群から選ばれる中性脂質；修飾脂質；並びにコレステロールを含有する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１１−２２５６１８（Ｐ２０１１−２２５６１８Ａ）
【公開日】平成２３年１１月１０日（２０１１．１１．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１７２６５６（Ｐ２０１１−１７２６５６）
【出願日】平成２３年８月８日（２０１１．８．８）
【分割の表示】特願２００１−５１０４３１（Ｐ２００１−５１０４３１）の分割
【原出願日】平成１２年７月１４日（２０００．７．１４）
【出願人】（３０００６６８７４）ザ・ユニバーシティ・オブ・ブリティッシュ・コロンビア (24)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１１月１０日（２０１１．１１．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年８月８日（２０１１．８．８）
【分割の表示】特願２００１−５１０４３１（Ｐ２００１−５１０４３１）の分割
【原出願日】平成１２年７月１４日（２０００．７．１４）
【出願人】（３０００６６８７４）ザ・ユニバーシティ・オブ・ブリティッシュ・コロンビア (24)
【Ｆターム（参考）】
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