腎臓尿酸トランスポーター
【課題】高尿酸血症は、有意な罹患率に関与する。腎臓排出が主に血漿尿酸塩濃度を決定するにもかかわらず、その分子機構はつかまえにくいままである。
【解決手段】以前、我々は、腎臓近位尿細管の主要尿酸塩再吸収可能なトランスポーターURAT1/SLC22A12を確認した。ここで、我々は、GLUT9/SLC2A9が電圧駆動尿酸トランスポーター（URATv1に名前を変更される）（細胞からの尿酸塩退出を伝達しそうな）として機能すると報告する。GLUT9の生体内役割はSLC22A12のいかなる突然変異のない腎臓低尿酸血症患者もSLC2A9のミスセンス突然変異を有するとわかったという事実で支えられた。そして、それは生体外で尿酸塩輸送活性を廃止した。これらのデータに基づいて、我々は、チューブ状セルの尿酸塩の経細胞輸送の新規なモデルを提案する。尿酸塩は頂点部分に位置するURAT1を介して始められる。そして、細胞内尿酸塩は基底部分に位置するURATv1を介して細胞を出る。
【解決手段】以前、我々は、腎臓近位尿細管の主要尿酸塩再吸収可能なトランスポーターURAT1/SLC22A12を確認した。ここで、我々は、GLUT9/SLC2A9が電圧駆動尿酸トランスポーター（URATv1に名前を変更される）（細胞からの尿酸塩退出を伝達しそうな）として機能すると報告する。GLUT9の生体内役割はSLC22A12のいかなる突然変異のない腎臓低尿酸血症患者もSLC2A9のミスセンス突然変異を有するとわかったという事実で支えられた。そして、それは生体外で尿酸塩輸送活性を廃止した。これらのデータに基づいて、我々は、チューブ状セルの尿酸塩の経細胞輸送の新規なモデルを提案する。尿酸塩は頂点部分に位置するURAT1を介して始められる。そして、細胞内尿酸塩は基底部分に位置するURATv1を介して細胞を出る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は腎臓尿酸トランスポーターに関し、特にヒトGULT9、電圧駆動型腎臓尿酸トランスポーター、これが、直接的に血漿中の尿酸塩濃度を制御し、そして、低尿酸血症の新しい原因となる遺伝子であり痛風の有望な治療的標的であることを提案している。
【背景技術】
【０００２】
尿酸塩（尿酸）は、人体においては肝臓ウリカーゼの遺伝子抑制のため、プリン代謝の最終産物であるが、現在は神経保護作用の特性を持つ天然酸化防止剤として評価されている。低い血清尿酸値は、多発性硬化症、パーキンソン病およびアルツハイマー病と関係がある（1）。その有益な役割にもかかわらず、血清尿酸値の上昇は、痛風、高血圧、心血管疾患（例えば心筋梗塞および脳卒中）、および腎疾患（例えば急性尿酸腎症および腎石症（1、2）と相関している。腎臓は、排出プロセスを通じて血清尿酸値を維持することにおいて、優位な役割を果たす：それは、１日の尿酸塩生産(3)のほぼ70%を除去する。従って、尿酸塩の排出不足（underexcretion）が大多数の高尿酸血症患者(4)において、示されたので、腎臓尿酸塩処理の機構を理解することは重要である。
【０００３】
尿酸塩が生理的pHにおいて弱酸であるので（pKa、5.75）、それは輸送タンパク質(4)の非存在下では細胞の原形質膜にほとんど浸透しない。尿酸トランスポーターがキー分子であることが提案されたにもかかわらず、腎臓尿酸塩輸送の正確な機構はその種違いおよびその多様性のため、理解されなかった：ネフロンの尿酸塩の双方向性輸送は、「4-構成要素モデル」(5)として古典的に説明される。2002年に、我々は長く仮定された尿酸アニオン交換体、腎臓近位尿細管(6)の舌尖側で局所化されている、SLC22A12に分類されるURAT1を確認した。現在まで、URAT1は、腎臓尿酸塩再吸収での生理的役割がURAT1の機能突然変異の損失によって、腎臓低尿酸血症(6)が生じるという事実に基づいて確証される、唯一のトランスポーターである。しかしながら、URAT1を介して尿酸塩がどのようにチューブ状セルから出るかは、わかっていない。さらに、URAT1の存在しない伝達された尿酸塩再吸収システムの存在が、イチダ等、ワキダ等により示唆されている。彼等は、SLC22A12（7、8）の突然変異がなかった腎臓低尿酸血症患者を報告した。
同じ線に沿って、Slc22a12-ヌルマウスを使用している最近の研究で腎臓尿酸塩再吸収の大半が保存される（9）ことが分かった。但し、人間の腎臓尿酸塩処理に対するこの発見の生理的関連は定められないままである。URAT1の識別で、尿酸塩輸送のためのいくつかの潜在的候補タンパク質は、提案された：UAT、OAT1、OAT3、OAT4、OATv1/NPT1、MRP4および最近確認されたOAT10は、生体外で（10-12）尿酸塩輸送を伝達することも示した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】１．M. K. Kutzing、B. L. Firestein、J. Pharmacol. Exp. Ther、第324巻、第1-7頁（2008年）
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【非特許文献３】3．D. A.Sica, A. C. Schoolwerth, in The Kidney (WB Saunders, Philadelphia, ed.),pp. 第680-700頁（2000年）
【非特許文献４】４．N. Anzai, H. Endou, ExpertOpin. Drug Discov. 第2巻,第1251−1261頁 (2007年)
【非特許文献５】５．D. B.Mount, Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 第14巻, 第460−463頁 (2005年)
【非特許文献６】６．A.Enomoto, H. Kimura, A. Chairoungdua, et al. Nature 第417巻, 第 447−452 頁(2002年)
【非特許文献７】７．K.Ichida, M. Hosoyamada, I. Hisatome, et al. J. Am. Soc. Nephrol. 第15巻, 第164−173 頁(2004年).
【非特許文献８】８．N.Wakida, D. G. Tuyen, M. Adachi, et al. J. Clin. Endocrinol. Metab.第90巻, 第2169−2174頁 (2005年).
【非特許文献９】９．S. A. Eraly, V. Vallon,T. Rieg, et al. Physiol. Genomics 第33巻, 第180−192頁 (2008年).
【非特許文献１０】10．M. A. Hediger, R. J. Johnson, H. Miyazaki, H. Endou, Physiology 第20巻,第125−133頁(2004年).
【非特許文献１１】11. M. A. Rafey, M. S. Lipkowitz, E. Leal-Pinto, R. G. Abramson, Curr.Opin. Nephrol. Hypertens. 第12巻、第511−516 頁(2003年)
【非特許文献１２】12．A. Bahn, Y. Hagos, S. Reuter, et al. J. Biol. Chem. in press
【非特許文献１３】13．K. Mori, Y. Ogawa, K. Ebihara, et al. FEBS Lett. 第417巻, 第371−374頁 (1997年).
【非特許文献１４】14．S. H. Cha, T. Sekine, H. Kusuhara,et al. J. Biol. Chem. 第275号,第4507−4512号 (2000年).
【非特許文献１５】15．M. Uldry, B. Thorens, Pflugers Arch. 第447号、第480−489号(2004年).
【非特許文献１６】16．J. E. Phay, H. B. Hussain, J. F. Moley, Genomics 第66巻, 第217-220頁 (2000年).
【非特許文献１７】17．H. Doege, A. Bocianski, H.-G. Joost, A. Schurmann, Biochem. J.第350号, 第771-776頁 (2000年).
【非特許文献１８】18．R. Augustin, M. O. Carayannopoulos, L. O. Dowd, et al. J. Biol. Chem. 第279巻, 第16229-16236頁 (2004年).
【非特許文献１９】19．B. T. Emmerson, N.Engl. J. Med. 第334巻, 第445-451頁 (1996年).
【非特許文献２０】20．O. Sperling, Mol. Genet. Metab. 第89巻, 第14-18頁 (2006年)
【非特許文献２１】21．T.H. Steele, Ann. Intern. Med. 第79巻, 第734-737頁 (1973年)
【非特許文献２２】22．Y. Kikuchi, H. Koga, Y. Yasutomo, et al. Clin. Nephrol.第53巻, 第467-472頁 (2000年)
【非特許文献２３】23．H.-G. Joost, B. Thorens, Mol. Membr. Biol. 第18号, 第247-256頁 (2001年)
【非特許文献２４】24．D. M. Papazian, L. C. Timpe, Y. N. Jan, L. Y. Jan, Nature 第349巻, 第305-310頁 (1991年)
【非特許文献２５】25．S. Li, S. Sanna, A. Maschio, et al. PLoS Genet. 第3巻, 第194頁 (2007年)
【非特許文献２６】26．A. Doring, C. Gieger, D. Mehta, et al. Nat Genet. 第40巻, 第430-436頁 (2008年)
【非特許文献２７】27．V. Vitart, I. Rudan, C. Hayward, et al. Nat Genet. 第40巻, 第437-442頁 (2008年)
【発明の概要】
【０００５】
ここで、我々は腎臓近位尿細管の基底面側でこれまで未知の尿酸トランスポーターを報告する。そして、それは、人間において、生体内その生理的役割については、尿酸塩再吸収のためのURAT1とタンデムで、作用しそうである。
【０００６】
新規な腎臓尿酸トランスポーターを確認するために、我々は人間およびマウスURAT1/Urat1（SLC22A12/Slc22a12）およびヒトOAT4（SLC22A11）シーケンス（6、13、14）を使用している異体同形検索（blastp）を実行した。そして、それは、NCBIのSwissprotタンパク質データベースに対して、尿酸塩の輸送を伝達することは公知である。驚くべきことに、我々は、促進グルコーストランスポーター（SLC2）ファミリー（GLUT6、9、10、12、および14）のいくつかのものにはSLC22A11に遠隔類似点があることを発見した。これらの分子の中で、それが肝臓と同様に腎臓に主に局所化するので、我々は、拡張した（クラスII）SLC2ファミリーに属するもののうちの1つである、GLUT9として分類されていたSLC2A9を特徴づけることに決めた(15)。
ヒトGLUT9は、最初は機能未知の遺伝子として同定された(16)。GLUT9のグルコーストランスポーター活性が示されたにもかかわらず、それは古典的（クラスＩ）グルコーストランスポーターGLUT4（17、18）ほど効率的なようでない。ヒトGLUT9は、異なるアミノ末端を有する2つのスプライスバリアントを有する：アイソフォーム1（トランスクリプトバリアント1：Genbankアセッション NM_020041）そして、アイソフォーム2（トランスクリプトバリアント2：Genbankアセッション NM_001001290）。これらの2つのアイソフォームの違いは、アイソフォーム1だけの第一エキソンがあり、分極化したMDCK細胞において、ターゲティングの違いとなる。
【０００７】
第一に、我々は、アフリカツメガエル卵細胞発現システムを使用してGLUT9の両方のアイソフォームの膜組織発現および尿酸輸送活性を調べた。GLUT9の両方のアイソフォームの原形質膜発現は、GLUT9相補RNA（cRNAs）の卵母細胞への注入において、免疫蛍光分析（図4A）により確認された。両方のそのアイソフォームが同程度の尿酸塩輸送活性（図4B）を示すことを確認したあと、我々は更なるキャラクタリゼーションのためのアイソフォーム2を使用した。GLUT9が発現している卵母細胞の［14C］尿酸の取り込み率はコントロール卵母細胞のそれより９倍高かった。その一方で、［14C］グルコースおよび［14C］フルクトースの非常に低い取り込み率が観察された。GLUT9は、ＰＡＨ（パラアミノヒプル酸塩）、硫酸エストロン、サリチル酸塩のような代表的な有機陰イオン基質や、例えば、乳酸塩、ニコチネート、β-ヒドロキシ酪酸塩、サリチル酸塩（図4C）のような、古典的な腎臓尿酸輸送システム（URAT1を含む）でインタラクタとして既知の基質を有意に取り込まなかった。このように、GLUT9は、URAT1より狭い基質特異性を有した。
【０００８】
次に、我々は、GLUT9の尿酸塩輸送特性を調べた。GLUT9 cRNAを注入されたアフリカツメガエル属卵母細胞は、［14C］尿酸塩（図1A）の輸送活性に時間依存を呈した。
尿酸塩のGLUT9により媒介される取り込みは、飽和可能な動力学を明らかにして、ミカエリス‐メンテンの式を求めた。
【０００９】
イーディー‐ホフステープロットは、尿酸塩に対して、Km 365±42μMおよびVmax 5,521±291pmol/hr/oocyte（5つの別々の実験の±S.E.を意味する）となり、GLUT9はURAT1と同様に尿酸塩に対して高い親和性を有することが示唆された（図１B）。細胞外Na+の除去がGLUT9によって、尿酸塩輸送に影響を及ぼさなかったという事実は、それが直接的なNa+−尿酸塩共輸送を含まないことを示した。
【００１０】
GLUT9活性は、外部のK+を上昇（アフリカツメガエル卵細胞の原形質膜を減極する）が、尿酸塩の取り込みを促進するため、膜電位に影響された（図１C）。この電位依存性は、細胞内部の電気陰性のため、チューブ状セルから尿酸塩の流出を好まなければならない。我々は、それから尿酸塩取り込み上の外向きのCl-勾配（細胞内から細胞外へ）の効果を測定した。外部のCl-の完全な除去によって、Cl-勾配を課すことはGLUT9を介した尿酸塩取り込みを加速せず、GLUT9がURAT1において、観察される無機Cl-のための交換メカニズムを有しないことを示した（図1C）。加えて、URAT1とは異なり、細胞外pHの尿酸塩輸送活性の依存は、GLUT9において、観察された（図1D）。
【００１１】
更にGLUT9の基質選択性を調査するために、阻害研究は、GLUT9を発現している卵母細胞を使用して実行された。GLUT9により媒介される［14C］尿酸塩（10μM）取り込みの1mM（ベンズブロマロンを除いて、50μMで）のさまざまな物質のシス阻害効果（すなわち、阻害剤は、放射性同位元素で識別された尿酸塩と同じ側において、加えられた。）は、調査された（表1）。GLUT9は、再びURAT1のそれらと異なる薬理学的特性を呈した(6)。我々は、GLUT9を経た尿酸塩輸送が尿酸塩によって、強く抑制され、そして、硫酸エストロンによって、弱く抑制されることがわかった。
【００１２】
グルコースおよびフルクトースのようなヘキソースおよび乳酸塩、ニコチネート、オロチン酸およびケトン体（例えばアセト酢酸塩およびβ-ヒドロキシ酪酸塩）のような単カルボン酸塩は、GLUT9を介して尿酸塩取り込みを阻害しなかった。これらの結果は、尿酸塩が、図4Cで示すように、GLUT9の唯一の基質であるように見えたという初めの観察と整合している。我々も、尿酸排泄物質の影響を試験した（3、19）。プロベネシドおよびベンズブロマロン（50μＭ）は適度に尿酸塩取り込みをシス阻害したが、フェニルブタゾンおよびスルフィンピラゾンは弱くそれをシス阻害した。利尿薬は、GLUT9を介した尿酸塩取り込みを阻害しなかった。非ステロイド性の抗炎症剤の中で、インドメタシンは強く尿酸塩取り込みをシス阻害し、そして、ナプロキセンは弱くそれをした。面白いことに、ピラジノアート（PZA）（広く抗結核薬として使用されており、URAT1(6)に対するインタラクタとして公知のピラジンアミドの活性代謝物質）は、GLUT9を介した尿酸塩取り込みに対して、いかなる阻害効果も及ぼさなかった。
ロサルタン、アンギオテンシンＩＩ受容体ブロッカ（ARB）は、適度に尿酸塩取り込みをシス阻害した。
これらの結果は尿酸塩がGLUT9の実質的に唯一の輸送基質であり、そして、URAT1と比較したとき、それが異なる反応を潜在的に腎臓尿酸塩処理に影響を及ぼしているさまざまな薬に示したことを証明し、そして、GLUT9が新規な尿酸排泄薬品の潜在的標的でありえることを示した。
【００１３】
GLUT9の輸送モードを明らかにするために、我々は、トランス促進実験（すなわち、基質は、［14C］尿酸塩取り込みの前に、卵母細胞に注入された）を行った。細胞内にロードした尿酸塩（100mM）は、GLUT9を介する［14C］尿酸塩取り込みを、著しく促進した（図5A）。グルコース、フルクトース、乳酸塩、ニコチネート、PZA、オロチン酸、β-ヒドロキシ酪酸塩およびサリチル酸塩による尿酸取り込みのシス阻害の欠落から予想されるように、これらの物質の細胞内へのロードは、トランス促進作用を示さなかった（図5A）。
【００１４】
図1Cに示される尿酸塩の電位依存性輸送を与えられて、尿酸塩は、生理的状態（すなわち細胞内部で負）の電気勾配に沿って、細胞内区画から細胞外区画まで輸送されることもできる。図2Aに示すように、標準取り込み溶液において培養されるときに、［14C］尿酸塩があらかじめロードされているGLUT9を発現している卵母細胞は、放射能の時間依存性のある外部流出を示した。この機能的な特徴は、細胞から尿酸塩出口経路にかなり適している。以前の報告（それは近位チューブ状セルの基底面膜に主に局所化されるそのヒトGLUT9を示した(18)）からみて、我々はGLUT9がURAT1によって媒介される初期ステップの後、再吸収の第二段階として細胞から管周囲間隙へと尿酸塩を動かす役割を果たすことを提案する（図２B）。
【００１５】
GLUT9がエクスチェンジャーか促進トランスポーターであるかどうか決定するために、［14C］尿酸塩がプレロードされた卵母細胞からの放射能の流出が、細胞外尿酸塩、グルコースおよびフルクトースの不存在および存在において、比較された。放射能の流出は細胞外で適用尿酸塩に影響を受けたが、細胞外グルコースまたはフルクトース（図5B）に影響を受けず、そして、尿酸塩の基質結合部位がグルコースおよびフルクトースに対するものと異なることを示唆した。従って、GLUT9を経た尿酸塩輸送は、これらの糖の血清濃度によって、変えられない。
【００１６】
特発性腎臓低尿酸血症（または、単に、腎臓低尿酸血症：MIM220150）は、腎臓近位尿細管の尿酸塩のための膜輸送の単離された先天的な欠陥によって、生じる異常にさらなる腎臓尿酸塩除去によって、特徴づけられる遺伝病である（２１）。SLC22A12の突然変異が腎臓低尿酸血症と関係していることはよく知られているにもかかわらず、SLC22A12の突然変異がない腎臓低尿酸血症患者がいる（7、8）。GLUT9がURAT1に相前後して尿酸塩再吸収経路において、作用する場合、この種の患者がSLC2A9遺伝子の突然変異を有するかもしれない。従って、我々は、SLC22A12のコード領域の突然変異なしの日本の腎臓低尿酸血症患者のSLC2A9のシーケンス変異を捜した。URAT1異種接合体突然変異（例えばW258X）をもつ腎臓低尿酸血症患者を有する同程度の範囲で、これらの患者のうちの1人（43歳の男性）は、2.7mg/dlの血漿尿酸塩濃度を有していた（正常範囲は、〜5mg/dlである）。尿酸塩の微小な排出は、14.6％であった（通常<10％）、そして、患者は、ピラジンアミドを負荷する試験において通常の反応を有したため（21、22）、彼はPZAの既知の標的であるURAT1において、機能的な変更を有しなかったことを示す。患者のゲノムDNAからのGLUT9-コード領域のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）産物の分析は、アルギニン380（CGG）をトリプトファン（TGG）に変えた、SLC2A9（図3A）のエクソン10の範囲内のヌクレオチド1138でCからTへ移行した異種接合体の存在を示した。この残基（R380）は、細胞質の側に向かっているループ8に位置して（図6）、すべてのSLC2ファミリーメンバー（23）の節約されたモティーフ（D/E-X-X-G-R-R）の中にあった。我々は、静電荷の損失（R380W）が、GLUT9（電位依存性トランスポーター）の尿酸塩輸送機能を変えると推測した。興味深い平行は、アルギニンが電圧センサとして作用することを示す領域（24）である電位依存的なシェーカーK+チャネルにおける、このアルギニン残基およびS4部分のそれによって、見られることが可能である。この突然変異は、50人のランダムに選ばれたコントロールの日本の個人において、確認されなかった。変異体GLUT9の機能を確認するために、我々は、野生型または変異したGLUT9のcRNAを卵母細胞への注入の後、尿酸塩輸送活性を分析して、この置換（R380W）が、原形質膜のその発現を変えることのなく、尿酸塩輸送活性を廃止するとわかった（図3B、C）。これらの生体内および生体外データは、GLUT9の突然変異によって、この患者の腎臓低尿酸血症が生じることを示した。図2Bに示される我々のモデルに基づいて、両方のトランスポーターは相前後して同じ経路で作用するので、我々はURAT1およびGLUT9の完全な機能が腎臓近位尿細管の通常の尿酸塩再吸収のために必要であると予測する。従って、通常のURAT1は、GLUT9機能およびその逆の損失を補償することが可能ではなくてもよい。我々のデータは、腎臓低尿酸血症の遺伝子の異質性を確立して、生体内での尿酸塩の腎臓再吸収のGLUT9の回動役割を示した。
【００１７】
リ等は、最近、血清尿酸塩濃度と、染色体4のGLUT9（SLC2A9）遺伝子領域の一般の遺伝子の異型との関連性を報告し、領域のSNPが、糖代謝および尿酸塩合成および／または腎臓再吸収に影響を及ぼすことができ、血清尿酸塩濃度に影響を及ぼすことを示唆した（25）。我々の所見は、GLUT9が腎臓尿酸塩排出に影響を及ぼすというそれらの第3の考えと整合している。加えて、我々の結果は、血清尿酸塩濃度がSNPｓと相関があること又はSLC2A9に非常に近いことを証明する、二つの新しいゲノム全体の関連研究への非常に強い（病理）生理的補助を与えなければならない。合わせて考えると、SLC2A9によりコード化されるタンパク質は、腎臓において、チューブ状細胞と尿酸塩の排出再吸収活動する尿酸トランスポーターとして機能し、それらの尿酸塩輸送活性は血清尿酸塩濃度に影響を与える。
従って、我々は、SLC2A9によって、コード化されるタンパク質が、GLUT9と換わって、URATv1（電圧駆動尿酸塩トランスポーター1）と呼ばれることを提案する。
【００１８】
【表１】
【実施例】
【００１９】
タンパク質データ
免疫細胞化学のために、cRNAsにより注入されるアフリカツメガエル卵母細胞はパラホルムアルデヒドを据えられて、抗GLUT9抗体（alfaDiagnostics）（1:500）によって培養し、続いてAlexa546のラベルのヤギ抗ウサギイムノグロブリン（IgG）で処理した（和光；1:200で希釈）。区画は、共焦点レーザースキャン顕微鏡（Fluoview FV500、オリンパス）の下で観察された。Alexa546の蛍光は、波長543 nmの緑色のHeNeレーザー光により励起されていた。
【００２０】
発現および輸送試験
GLU9のアイソフォーム１と２のｃDNAは、オリジェンテクノロジー（OriGen
Technologies）（アイソフォーム２）とオープンバイオシステムズ（Open Biosystems）（アイソフォーム１）から購入した。生体外における、転写およびキャップされたcRNA（1卵母細胞あたり３０−５０ｎｇ）の卵細胞への注入は、前述したように実行された（1,2）。卵母細胞は、使用の前に18℃で２−３ｄで、バッファー１２浴漕の中で維持された。ND96バッファー12は、96 NaCl、2 KCl、1 MgCl2、1.8 CaCl2および5 HEPESバッファ（pH 7.4）（単位はｍＭ）を含んでいた。0 Cl-浴槽において、Cl-は、グルコン酸塩の等モルの量と置き換えられた。輸送試験およびGLUT9を経た尿酸塩取り込みの動力学的パラメータの評価は、前述したように実行された（1,2）。実験は3つのバッチの卵母細胞を使用して実行された、そして、代表的な実験からの結果は平均±SEM.として表される。統計的有意性は、スチューデントｔ−テストにより測定された。
【００２１】
突然変異分析および突然変異ｃＤＮＡの構造
GLUT9シーケンスの決定のために、我々は、S.リにより記載されている、わずかな変更態様を有するプライマーを使用した（表2）。いくつかのプライマー配列は、ヒトGLUT9のゲノム構造に従って、新しく選択された（図6を参照）。高分子量ゲノムDNAは、周辺の全部の血球（3、4）から抽出されて（3、4）、PCRにより増幅された。PCR産物は、3130xl遺伝子アナライザ（アプライドバイオシステム）を使用して、両方の方向から配列決定された（3）。GLUT9（R380W）のエクソン10の突然変異は、50人のコントロールの日本人の個人の中からランダムに選ばれた分析のためのBtsCIを有するPCR産物（表2）の規制消化により検出された。R380W変異体の生成のための突然変異誘発性オリゴヌクレオチドプライマは、5'-GGTGTGCGGGACTG(A)ACACTGCTGCAGC-3'および5'-GGGGCCTGCAGGA（T）CTGTGGAGGGTGGCTG-3'であった。変異するcDNAの適当な構造は、完全な塩基配列決定により確認された。
【００２２】
【表２】
【００２３】
実施例における参考文献
1. A. Enomoto, H. Kimura, A. Chairoungdua, et al. Nature 第417巻, 第447-452頁 (2002年)
2. Jutabha P, Kanai Y, Hosoyamada M, et al. J. Biol. Chem. 第278巻, 第27930-27938頁 (2003年)
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第721-726頁 (1999年)
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】アフリカツメガエル卵細胞におけるGLUT9の機能的発現。(A) GLUT9による尿酸塩取り込みの時間コース。水を注入された卵母細胞（コントロール）およびGLUT9を発現している卵母細胞の20μM［14C］尿酸塩の取り込みは、120分の培養の間、測定された。(B) GLUT9の輸送動力学。尿酸塩輸送は、10−1,500μMの尿酸塩濃度範囲で、コントロール卵母細胞およびGLUT9を発現している卵母細胞において、測定された。GLUT9を発現している卵母細胞のGLUT9に特有の輸送活性は、コントロール卵母細胞の基質輸送活性を減算することにより算出された。これらのGLUT9に特有の輸送活性が、動力学的分析において、使われた。挿入紙、Eadie−Hofsteeプロット線。(C)GLUT9による［14C］尿酸塩取り込みは、外部のNa+のK+置換により促進される。コントロール卵母細胞およびGLUT9を発現している卵母細胞の［14C］尿酸塩（20のμM）の輸送率は、細胞外Na+、K+およびCl-の有無のもとで、1h測定された。***, ND96と比較してP<0.001。(D) GLUT9により媒介される尿酸塩輸送のpH依存が観察された。尿酸塩輸送率（20μM）は、ND96溶液を使用しているコントロール卵母細胞（オープンスクエア）およびGLUT9を発現している卵母細胞（クローズドスクエア）において、測定された。異なるpH値を有する取り込み溶液を準備するために、MES-NaOH、HEPES-NaOHおよびTris-HClが、バッファシステムとして用いられた。ND96浴槽の酸性細胞外pHにおいて、正味の尿酸塩取り込み率は、増加した。***, pH7.4と比較してP<0.001。すべてのデータは、n = 8−10を有する平均値±SEM（エラーバー）である。
【図２】(A)［14C］尿酸塩の流出は、GLUT9によって、仲介した。GLUT9を発現している卵母細胞（クローズドサークル）からの放射能の流出は、コントロール（オープンサークル）と比較して、標準培養溶液において、測定された。値は、卵母細胞に詰められる全体の放射能のパーセンテージとして表される。(B)URAT1およびURATv1（GLUT9から名前を変えられた）を経た尿酸塩の経細胞輸送の提案されたモデル。ピラジノアート（PZA）を含む単カルボン酸塩（Monocarboxylates ：MCｓ）は、近位尿細管の光（頂点をなす）側にあって、ナトリウムに依存するモノカルボン酸系トランスポーター1（SMCT1）および2（SMCT2）を経由してセルの中で蓄積される。尿酸塩は、頂点に位置するURAT1を介してPZAを含んでいる細胞内MCｓと引きかえに、細胞の中に入る。再吸収された尿酸は、基底面に存在するＵＲＡＴｖ１（ＧＬＵＴ９）を介して、電気化学的勾配によって、細胞を出る。
【図３】SLC2A9の中の突然変異は、特発性腎臓低尿酸血症と関係している。(A)患者（43歳の男性）で見つかる異型の点突発変異（R380W）を示しているSLC2A9のエクソン10の部分的な配列の電気泳動図。このR380W突然変異は、腎臓低尿酸血症と互換性を持つ臨床特徴を呈している患者において、収容されていた。(B)患者からの疾患関連のGLUT9変異体は、完全に尿酸塩輸送活性を失う。尿酸塩の取り込み（20μM）は、野生型又は変異させたｃＲＮＡの注入された卵母細胞において、測定された。データは、グループにつき8つまたは10の卵母細胞の平均値±ＳＥＭである。(C)野生型又はＲ３８０Ｗ変異の卵細胞の亜細胞性のローカライゼーション。抗GLUT9抗体の免疫検出は、野生型およびR380Wタンパク質が原形質膜で発現されることを示したが、蛍光レベルは水が注入された卵母細胞において、検知されなかった。
【図４】(A)水及びGLUT9のcRNAの2つのアイソフォームが注入された卵母細胞の免疫組織化学的な分析。コントロール（水を注入された）、GLUT9 cRNAのアイソフォーム1および２が注入された卵母細胞は、示された。(B) GLUT9のアイソフォーム1及びアイソフォーム２のための尿酸塩輸送活性の比較。(C) GLUT9のアイソフォーム2によるさまざまな放射性同位元素で識別された合成物の取り込み。***,コントロールと比較してP<0.001。
【図５】(A)GLUT9により媒介される尿酸塩取り込みのプレロードされている有機陰イオンのトランス促進効果。コントロールまたはGLUT9を発現している卵母細胞は、50nlの水または非標識の試験陰イオン（100mＭ、pH 7.4）をファインチップドマイクロピペットを使用して、注入されて、それから、20μM［14C］尿酸塩を含んでいるND96浴槽へ移されて、1hの取り込み率は、決定された。*,水を注入されるものと比較してp<0.05。(B)GLUT9により媒介される尿酸塩の排出における、細胞外尿酸塩、グルコースおよびフルクトースのトランス促進効果。コントロールまたはGLUT9を発現している卵母細胞は、50nlの［14C］尿酸塩を注入されて、非標識の合成物（0.5および1mＭの尿酸塩、および、0.5および3mＭのグルコースおよびフルクトース）の存在する又はしないND96溶液へ移されて、室温で、培養された。60分間の［14C］尿酸塩流出の量は、プレロードされている量のパーセンテージとして示される。コントロールと比較して**, p<0.01、***,p<0.001。すべてのデータは、n = 8−10を有する平均値±SEMである。
【図６】(A) SLC2A9の予測された膜-トポロジーモデルの突然変異の位置。(B)GLUT9/SLC2A9遺伝子のゲノム構造。(C)GLUT9/SLC2A9遺伝子のエクソン-イントロン境界。
【図７】配列１
【図８】配列２
【図９】配列３
【図１０】配列４
【技術分野】
【０００１】
本発明は腎臓尿酸トランスポーターに関し、特にヒトGULT9、電圧駆動型腎臓尿酸トランスポーター、これが、直接的に血漿中の尿酸塩濃度を制御し、そして、低尿酸血症の新しい原因となる遺伝子であり痛風の有望な治療的標的であることを提案している。
【背景技術】
【０００２】
尿酸塩（尿酸）は、人体においては肝臓ウリカーゼの遺伝子抑制のため、プリン代謝の最終産物であるが、現在は神経保護作用の特性を持つ天然酸化防止剤として評価されている。低い血清尿酸値は、多発性硬化症、パーキンソン病およびアルツハイマー病と関係がある（1）。その有益な役割にもかかわらず、血清尿酸値の上昇は、痛風、高血圧、心血管疾患（例えば心筋梗塞および脳卒中）、および腎疾患（例えば急性尿酸腎症および腎石症（1、2）と相関している。腎臓は、排出プロセスを通じて血清尿酸値を維持することにおいて、優位な役割を果たす：それは、１日の尿酸塩生産(3)のほぼ70%を除去する。従って、尿酸塩の排出不足（underexcretion）が大多数の高尿酸血症患者(4)において、示されたので、腎臓尿酸塩処理の機構を理解することは重要である。
【０００３】
尿酸塩が生理的pHにおいて弱酸であるので（pKa、5.75）、それは輸送タンパク質(4)の非存在下では細胞の原形質膜にほとんど浸透しない。尿酸トランスポーターがキー分子であることが提案されたにもかかわらず、腎臓尿酸塩輸送の正確な機構はその種違いおよびその多様性のため、理解されなかった：ネフロンの尿酸塩の双方向性輸送は、「4-構成要素モデル」(5)として古典的に説明される。2002年に、我々は長く仮定された尿酸アニオン交換体、腎臓近位尿細管(6)の舌尖側で局所化されている、SLC22A12に分類されるURAT1を確認した。現在まで、URAT1は、腎臓尿酸塩再吸収での生理的役割がURAT1の機能突然変異の損失によって、腎臓低尿酸血症(6)が生じるという事実に基づいて確証される、唯一のトランスポーターである。しかしながら、URAT1を介して尿酸塩がどのようにチューブ状セルから出るかは、わかっていない。さらに、URAT1の存在しない伝達された尿酸塩再吸収システムの存在が、イチダ等、ワキダ等により示唆されている。彼等は、SLC22A12（7、8）の突然変異がなかった腎臓低尿酸血症患者を報告した。
同じ線に沿って、Slc22a12-ヌルマウスを使用している最近の研究で腎臓尿酸塩再吸収の大半が保存される（9）ことが分かった。但し、人間の腎臓尿酸塩処理に対するこの発見の生理的関連は定められないままである。URAT1の識別で、尿酸塩輸送のためのいくつかの潜在的候補タンパク質は、提案された：UAT、OAT1、OAT3、OAT4、OATv1/NPT1、MRP4および最近確認されたOAT10は、生体外で（10-12）尿酸塩輸送を伝達することも示した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】１．M. K. Kutzing、B. L. Firestein、J. Pharmacol. Exp. Ther、第324巻、第1-7頁（2008年）
【非特許文献２】2．M. A.Becker, M. Jolly, Rheum. Dis. Clin. N. Am. 第32巻, 第275-293頁(2006年)
【非特許文献３】3．D. A.Sica, A. C. Schoolwerth, in The Kidney (WB Saunders, Philadelphia, ed.),pp. 第680-700頁（2000年）
【非特許文献４】４．N. Anzai, H. Endou, ExpertOpin. Drug Discov. 第2巻,第1251−1261頁 (2007年)
【非特許文献５】５．D. B.Mount, Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 第14巻, 第460−463頁 (2005年)
【非特許文献６】６．A.Enomoto, H. Kimura, A. Chairoungdua, et al. Nature 第417巻, 第 447−452 頁(2002年)
【非特許文献７】７．K.Ichida, M. Hosoyamada, I. Hisatome, et al. J. Am. Soc. Nephrol. 第15巻, 第164−173 頁(2004年).
【非特許文献８】８．N.Wakida, D. G. Tuyen, M. Adachi, et al. J. Clin. Endocrinol. Metab.第90巻, 第2169−2174頁 (2005年).
【非特許文献９】９．S. A. Eraly, V. Vallon,T. Rieg, et al. Physiol. Genomics 第33巻, 第180−192頁 (2008年).
【非特許文献１０】10．M. A. Hediger, R. J. Johnson, H. Miyazaki, H. Endou, Physiology 第20巻,第125−133頁(2004年).
【非特許文献１１】11. M. A. Rafey, M. S. Lipkowitz, E. Leal-Pinto, R. G. Abramson, Curr.Opin. Nephrol. Hypertens. 第12巻、第511−516 頁(2003年)
【非特許文献１２】12．A. Bahn, Y. Hagos, S. Reuter, et al. J. Biol. Chem. in press
【非特許文献１３】13．K. Mori, Y. Ogawa, K. Ebihara, et al. FEBS Lett. 第417巻, 第371−374頁 (1997年).
【非特許文献１４】14．S. H. Cha, T. Sekine, H. Kusuhara,et al. J. Biol. Chem. 第275号,第4507−4512号 (2000年).
【非特許文献１５】15．M. Uldry, B. Thorens, Pflugers Arch. 第447号、第480−489号(2004年).
【非特許文献１６】16．J. E. Phay, H. B. Hussain, J. F. Moley, Genomics 第66巻, 第217-220頁 (2000年).
【非特許文献１７】17．H. Doege, A. Bocianski, H.-G. Joost, A. Schurmann, Biochem. J.第350号, 第771-776頁 (2000年).
【非特許文献１８】18．R. Augustin, M. O. Carayannopoulos, L. O. Dowd, et al. J. Biol. Chem. 第279巻, 第16229-16236頁 (2004年).
【非特許文献１９】19．B. T. Emmerson, N.Engl. J. Med. 第334巻, 第445-451頁 (1996年).
【非特許文献２０】20．O. Sperling, Mol. Genet. Metab. 第89巻, 第14-18頁 (2006年)
【非特許文献２１】21．T.H. Steele, Ann. Intern. Med. 第79巻, 第734-737頁 (1973年)
【非特許文献２２】22．Y. Kikuchi, H. Koga, Y. Yasutomo, et al. Clin. Nephrol.第53巻, 第467-472頁 (2000年)
【非特許文献２３】23．H.-G. Joost, B. Thorens, Mol. Membr. Biol. 第18号, 第247-256頁 (2001年)
【非特許文献２４】24．D. M. Papazian, L. C. Timpe, Y. N. Jan, L. Y. Jan, Nature 第349巻, 第305-310頁 (1991年)
【非特許文献２５】25．S. Li, S. Sanna, A. Maschio, et al. PLoS Genet. 第3巻, 第194頁 (2007年)
【非特許文献２６】26．A. Doring, C. Gieger, D. Mehta, et al. Nat Genet. 第40巻, 第430-436頁 (2008年)
【非特許文献２７】27．V. Vitart, I. Rudan, C. Hayward, et al. Nat Genet. 第40巻, 第437-442頁 (2008年)
【発明の概要】
【０００５】
ここで、我々は腎臓近位尿細管の基底面側でこれまで未知の尿酸トランスポーターを報告する。そして、それは、人間において、生体内その生理的役割については、尿酸塩再吸収のためのURAT1とタンデムで、作用しそうである。
【０００６】
新規な腎臓尿酸トランスポーターを確認するために、我々は人間およびマウスURAT1/Urat1（SLC22A12/Slc22a12）およびヒトOAT4（SLC22A11）シーケンス（6、13、14）を使用している異体同形検索（blastp）を実行した。そして、それは、NCBIのSwissprotタンパク質データベースに対して、尿酸塩の輸送を伝達することは公知である。驚くべきことに、我々は、促進グルコーストランスポーター（SLC2）ファミリー（GLUT6、9、10、12、および14）のいくつかのものにはSLC22A11に遠隔類似点があることを発見した。これらの分子の中で、それが肝臓と同様に腎臓に主に局所化するので、我々は、拡張した（クラスII）SLC2ファミリーに属するもののうちの1つである、GLUT9として分類されていたSLC2A9を特徴づけることに決めた(15)。
ヒトGLUT9は、最初は機能未知の遺伝子として同定された(16)。GLUT9のグルコーストランスポーター活性が示されたにもかかわらず、それは古典的（クラスＩ）グルコーストランスポーターGLUT4（17、18）ほど効率的なようでない。ヒトGLUT9は、異なるアミノ末端を有する2つのスプライスバリアントを有する：アイソフォーム1（トランスクリプトバリアント1：Genbankアセッション NM_020041）そして、アイソフォーム2（トランスクリプトバリアント2：Genbankアセッション NM_001001290）。これらの2つのアイソフォームの違いは、アイソフォーム1だけの第一エキソンがあり、分極化したMDCK細胞において、ターゲティングの違いとなる。
【０００７】
第一に、我々は、アフリカツメガエル卵細胞発現システムを使用してGLUT9の両方のアイソフォームの膜組織発現および尿酸輸送活性を調べた。GLUT9の両方のアイソフォームの原形質膜発現は、GLUT9相補RNA（cRNAs）の卵母細胞への注入において、免疫蛍光分析（図4A）により確認された。両方のそのアイソフォームが同程度の尿酸塩輸送活性（図4B）を示すことを確認したあと、我々は更なるキャラクタリゼーションのためのアイソフォーム2を使用した。GLUT9が発現している卵母細胞の［14C］尿酸の取り込み率はコントロール卵母細胞のそれより９倍高かった。その一方で、［14C］グルコースおよび［14C］フルクトースの非常に低い取り込み率が観察された。GLUT9は、ＰＡＨ（パラアミノヒプル酸塩）、硫酸エストロン、サリチル酸塩のような代表的な有機陰イオン基質や、例えば、乳酸塩、ニコチネート、β-ヒドロキシ酪酸塩、サリチル酸塩（図4C）のような、古典的な腎臓尿酸輸送システム（URAT1を含む）でインタラクタとして既知の基質を有意に取り込まなかった。このように、GLUT9は、URAT1より狭い基質特異性を有した。
【０００８】
次に、我々は、GLUT9の尿酸塩輸送特性を調べた。GLUT9 cRNAを注入されたアフリカツメガエル属卵母細胞は、［14C］尿酸塩（図1A）の輸送活性に時間依存を呈した。
尿酸塩のGLUT9により媒介される取り込みは、飽和可能な動力学を明らかにして、ミカエリス‐メンテンの式を求めた。
【０００９】
イーディー‐ホフステープロットは、尿酸塩に対して、Km 365±42μMおよびVmax 5,521±291pmol/hr/oocyte（5つの別々の実験の±S.E.を意味する）となり、GLUT9はURAT1と同様に尿酸塩に対して高い親和性を有することが示唆された（図１B）。細胞外Na+の除去がGLUT9によって、尿酸塩輸送に影響を及ぼさなかったという事実は、それが直接的なNa+−尿酸塩共輸送を含まないことを示した。
【００１０】
GLUT9活性は、外部のK+を上昇（アフリカツメガエル卵細胞の原形質膜を減極する）が、尿酸塩の取り込みを促進するため、膜電位に影響された（図１C）。この電位依存性は、細胞内部の電気陰性のため、チューブ状セルから尿酸塩の流出を好まなければならない。我々は、それから尿酸塩取り込み上の外向きのCl-勾配（細胞内から細胞外へ）の効果を測定した。外部のCl-の完全な除去によって、Cl-勾配を課すことはGLUT9を介した尿酸塩取り込みを加速せず、GLUT9がURAT1において、観察される無機Cl-のための交換メカニズムを有しないことを示した（図1C）。加えて、URAT1とは異なり、細胞外pHの尿酸塩輸送活性の依存は、GLUT9において、観察された（図1D）。
【００１１】
更にGLUT9の基質選択性を調査するために、阻害研究は、GLUT9を発現している卵母細胞を使用して実行された。GLUT9により媒介される［14C］尿酸塩（10μM）取り込みの1mM（ベンズブロマロンを除いて、50μMで）のさまざまな物質のシス阻害効果（すなわち、阻害剤は、放射性同位元素で識別された尿酸塩と同じ側において、加えられた。）は、調査された（表1）。GLUT9は、再びURAT1のそれらと異なる薬理学的特性を呈した(6)。我々は、GLUT9を経た尿酸塩輸送が尿酸塩によって、強く抑制され、そして、硫酸エストロンによって、弱く抑制されることがわかった。
【００１２】
グルコースおよびフルクトースのようなヘキソースおよび乳酸塩、ニコチネート、オロチン酸およびケトン体（例えばアセト酢酸塩およびβ-ヒドロキシ酪酸塩）のような単カルボン酸塩は、GLUT9を介して尿酸塩取り込みを阻害しなかった。これらの結果は、尿酸塩が、図4Cで示すように、GLUT9の唯一の基質であるように見えたという初めの観察と整合している。我々も、尿酸排泄物質の影響を試験した（3、19）。プロベネシドおよびベンズブロマロン（50μＭ）は適度に尿酸塩取り込みをシス阻害したが、フェニルブタゾンおよびスルフィンピラゾンは弱くそれをシス阻害した。利尿薬は、GLUT9を介した尿酸塩取り込みを阻害しなかった。非ステロイド性の抗炎症剤の中で、インドメタシンは強く尿酸塩取り込みをシス阻害し、そして、ナプロキセンは弱くそれをした。面白いことに、ピラジノアート（PZA）（広く抗結核薬として使用されており、URAT1(6)に対するインタラクタとして公知のピラジンアミドの活性代謝物質）は、GLUT9を介した尿酸塩取り込みに対して、いかなる阻害効果も及ぼさなかった。
ロサルタン、アンギオテンシンＩＩ受容体ブロッカ（ARB）は、適度に尿酸塩取り込みをシス阻害した。
これらの結果は尿酸塩がGLUT9の実質的に唯一の輸送基質であり、そして、URAT1と比較したとき、それが異なる反応を潜在的に腎臓尿酸塩処理に影響を及ぼしているさまざまな薬に示したことを証明し、そして、GLUT9が新規な尿酸排泄薬品の潜在的標的でありえることを示した。
【００１３】
GLUT9の輸送モードを明らかにするために、我々は、トランス促進実験（すなわち、基質は、［14C］尿酸塩取り込みの前に、卵母細胞に注入された）を行った。細胞内にロードした尿酸塩（100mM）は、GLUT9を介する［14C］尿酸塩取り込みを、著しく促進した（図5A）。グルコース、フルクトース、乳酸塩、ニコチネート、PZA、オロチン酸、β-ヒドロキシ酪酸塩およびサリチル酸塩による尿酸取り込みのシス阻害の欠落から予想されるように、これらの物質の細胞内へのロードは、トランス促進作用を示さなかった（図5A）。
【００１４】
図1Cに示される尿酸塩の電位依存性輸送を与えられて、尿酸塩は、生理的状態（すなわち細胞内部で負）の電気勾配に沿って、細胞内区画から細胞外区画まで輸送されることもできる。図2Aに示すように、標準取り込み溶液において培養されるときに、［14C］尿酸塩があらかじめロードされているGLUT9を発現している卵母細胞は、放射能の時間依存性のある外部流出を示した。この機能的な特徴は、細胞から尿酸塩出口経路にかなり適している。以前の報告（それは近位チューブ状セルの基底面膜に主に局所化されるそのヒトGLUT9を示した(18)）からみて、我々はGLUT9がURAT1によって媒介される初期ステップの後、再吸収の第二段階として細胞から管周囲間隙へと尿酸塩を動かす役割を果たすことを提案する（図２B）。
【００１５】
GLUT9がエクスチェンジャーか促進トランスポーターであるかどうか決定するために、［14C］尿酸塩がプレロードされた卵母細胞からの放射能の流出が、細胞外尿酸塩、グルコースおよびフルクトースの不存在および存在において、比較された。放射能の流出は細胞外で適用尿酸塩に影響を受けたが、細胞外グルコースまたはフルクトース（図5B）に影響を受けず、そして、尿酸塩の基質結合部位がグルコースおよびフルクトースに対するものと異なることを示唆した。従って、GLUT9を経た尿酸塩輸送は、これらの糖の血清濃度によって、変えられない。
【００１６】
特発性腎臓低尿酸血症（または、単に、腎臓低尿酸血症：MIM220150）は、腎臓近位尿細管の尿酸塩のための膜輸送の単離された先天的な欠陥によって、生じる異常にさらなる腎臓尿酸塩除去によって、特徴づけられる遺伝病である（２１）。SLC22A12の突然変異が腎臓低尿酸血症と関係していることはよく知られているにもかかわらず、SLC22A12の突然変異がない腎臓低尿酸血症患者がいる（7、8）。GLUT9がURAT1に相前後して尿酸塩再吸収経路において、作用する場合、この種の患者がSLC2A9遺伝子の突然変異を有するかもしれない。従って、我々は、SLC22A12のコード領域の突然変異なしの日本の腎臓低尿酸血症患者のSLC2A9のシーケンス変異を捜した。URAT1異種接合体突然変異（例えばW258X）をもつ腎臓低尿酸血症患者を有する同程度の範囲で、これらの患者のうちの1人（43歳の男性）は、2.7mg/dlの血漿尿酸塩濃度を有していた（正常範囲は、〜5mg/dlである）。尿酸塩の微小な排出は、14.6％であった（通常<10％）、そして、患者は、ピラジンアミドを負荷する試験において通常の反応を有したため（21、22）、彼はPZAの既知の標的であるURAT1において、機能的な変更を有しなかったことを示す。患者のゲノムDNAからのGLUT9-コード領域のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）産物の分析は、アルギニン380（CGG）をトリプトファン（TGG）に変えた、SLC2A9（図3A）のエクソン10の範囲内のヌクレオチド1138でCからTへ移行した異種接合体の存在を示した。この残基（R380）は、細胞質の側に向かっているループ8に位置して（図6）、すべてのSLC2ファミリーメンバー（23）の節約されたモティーフ（D/E-X-X-G-R-R）の中にあった。我々は、静電荷の損失（R380W）が、GLUT9（電位依存性トランスポーター）の尿酸塩輸送機能を変えると推測した。興味深い平行は、アルギニンが電圧センサとして作用することを示す領域（24）である電位依存的なシェーカーK+チャネルにおける、このアルギニン残基およびS4部分のそれによって、見られることが可能である。この突然変異は、50人のランダムに選ばれたコントロールの日本の個人において、確認されなかった。変異体GLUT9の機能を確認するために、我々は、野生型または変異したGLUT9のcRNAを卵母細胞への注入の後、尿酸塩輸送活性を分析して、この置換（R380W）が、原形質膜のその発現を変えることのなく、尿酸塩輸送活性を廃止するとわかった（図3B、C）。これらの生体内および生体外データは、GLUT9の突然変異によって、この患者の腎臓低尿酸血症が生じることを示した。図2Bに示される我々のモデルに基づいて、両方のトランスポーターは相前後して同じ経路で作用するので、我々はURAT1およびGLUT9の完全な機能が腎臓近位尿細管の通常の尿酸塩再吸収のために必要であると予測する。従って、通常のURAT1は、GLUT9機能およびその逆の損失を補償することが可能ではなくてもよい。我々のデータは、腎臓低尿酸血症の遺伝子の異質性を確立して、生体内での尿酸塩の腎臓再吸収のGLUT9の回動役割を示した。
【００１７】
リ等は、最近、血清尿酸塩濃度と、染色体4のGLUT9（SLC2A9）遺伝子領域の一般の遺伝子の異型との関連性を報告し、領域のSNPが、糖代謝および尿酸塩合成および／または腎臓再吸収に影響を及ぼすことができ、血清尿酸塩濃度に影響を及ぼすことを示唆した（25）。我々の所見は、GLUT9が腎臓尿酸塩排出に影響を及ぼすというそれらの第3の考えと整合している。加えて、我々の結果は、血清尿酸塩濃度がSNPｓと相関があること又はSLC2A9に非常に近いことを証明する、二つの新しいゲノム全体の関連研究への非常に強い（病理）生理的補助を与えなければならない。合わせて考えると、SLC2A9によりコード化されるタンパク質は、腎臓において、チューブ状細胞と尿酸塩の排出再吸収活動する尿酸トランスポーターとして機能し、それらの尿酸塩輸送活性は血清尿酸塩濃度に影響を与える。
従って、我々は、SLC2A9によって、コード化されるタンパク質が、GLUT9と換わって、URATv1（電圧駆動尿酸塩トランスポーター1）と呼ばれることを提案する。
【００１８】
【表１】
【実施例】
【００１９】
タンパク質データ
免疫細胞化学のために、cRNAsにより注入されるアフリカツメガエル卵母細胞はパラホルムアルデヒドを据えられて、抗GLUT9抗体（alfaDiagnostics）（1:500）によって培養し、続いてAlexa546のラベルのヤギ抗ウサギイムノグロブリン（IgG）で処理した（和光；1:200で希釈）。区画は、共焦点レーザースキャン顕微鏡（Fluoview FV500、オリンパス）の下で観察された。Alexa546の蛍光は、波長543 nmの緑色のHeNeレーザー光により励起されていた。
【００２０】
発現および輸送試験
GLU9のアイソフォーム１と２のｃDNAは、オリジェンテクノロジー（OriGen
Technologies）（アイソフォーム２）とオープンバイオシステムズ（Open Biosystems）（アイソフォーム１）から購入した。生体外における、転写およびキャップされたcRNA（1卵母細胞あたり３０−５０ｎｇ）の卵細胞への注入は、前述したように実行された（1,2）。卵母細胞は、使用の前に18℃で２−３ｄで、バッファー１２浴漕の中で維持された。ND96バッファー12は、96 NaCl、2 KCl、1 MgCl2、1.8 CaCl2および5 HEPESバッファ（pH 7.4）（単位はｍＭ）を含んでいた。0 Cl-浴槽において、Cl-は、グルコン酸塩の等モルの量と置き換えられた。輸送試験およびGLUT9を経た尿酸塩取り込みの動力学的パラメータの評価は、前述したように実行された（1,2）。実験は3つのバッチの卵母細胞を使用して実行された、そして、代表的な実験からの結果は平均±SEM.として表される。統計的有意性は、スチューデントｔ−テストにより測定された。
【００２１】
突然変異分析および突然変異ｃＤＮＡの構造
GLUT9シーケンスの決定のために、我々は、S.リにより記載されている、わずかな変更態様を有するプライマーを使用した（表2）。いくつかのプライマー配列は、ヒトGLUT9のゲノム構造に従って、新しく選択された（図6を参照）。高分子量ゲノムDNAは、周辺の全部の血球（3、4）から抽出されて（3、4）、PCRにより増幅された。PCR産物は、3130xl遺伝子アナライザ（アプライドバイオシステム）を使用して、両方の方向から配列決定された（3）。GLUT9（R380W）のエクソン10の突然変異は、50人のコントロールの日本人の個人の中からランダムに選ばれた分析のためのBtsCIを有するPCR産物（表2）の規制消化により検出された。R380W変異体の生成のための突然変異誘発性オリゴヌクレオチドプライマは、5'-GGTGTGCGGGACTG(A)ACACTGCTGCAGC-3'および5'-GGGGCCTGCAGGA（T）CTGTGGAGGGTGGCTG-3'であった。変異するcDNAの適当な構造は、完全な塩基配列決定により確認された。
【００２２】
【表２】
【００２３】
実施例における参考文献
1. A. Enomoto, H. Kimura, A. Chairoungdua, et al. Nature 第417巻, 第447-452頁 (2002年)
2. Jutabha P, Kanai Y, Hosoyamada M, et al. J. Biol. Chem. 第278巻, 第27930-27938頁 (2003年)
3. H. Matsuo, K. Kamakura, S. Matsushita, et al. Am. J. Med. Genet. 第88巻,
第733-737頁 (1999年)
4. H. Matsuo, K. Kamakura, M. Saito, et al. Arch. Neurol. 第56巻,
第721-726頁 (1999年)
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】アフリカツメガエル卵細胞におけるGLUT9の機能的発現。(A) GLUT9による尿酸塩取り込みの時間コース。水を注入された卵母細胞（コントロール）およびGLUT9を発現している卵母細胞の20μM［14C］尿酸塩の取り込みは、120分の培養の間、測定された。(B) GLUT9の輸送動力学。尿酸塩輸送は、10−1,500μMの尿酸塩濃度範囲で、コントロール卵母細胞およびGLUT9を発現している卵母細胞において、測定された。GLUT9を発現している卵母細胞のGLUT9に特有の輸送活性は、コントロール卵母細胞の基質輸送活性を減算することにより算出された。これらのGLUT9に特有の輸送活性が、動力学的分析において、使われた。挿入紙、Eadie−Hofsteeプロット線。(C)GLUT9による［14C］尿酸塩取り込みは、外部のNa+のK+置換により促進される。コントロール卵母細胞およびGLUT9を発現している卵母細胞の［14C］尿酸塩（20のμM）の輸送率は、細胞外Na+、K+およびCl-の有無のもとで、1h測定された。***, ND96と比較してP<0.001。(D) GLUT9により媒介される尿酸塩輸送のpH依存が観察された。尿酸塩輸送率（20μM）は、ND96溶液を使用しているコントロール卵母細胞（オープンスクエア）およびGLUT9を発現している卵母細胞（クローズドスクエア）において、測定された。異なるpH値を有する取り込み溶液を準備するために、MES-NaOH、HEPES-NaOHおよびTris-HClが、バッファシステムとして用いられた。ND96浴槽の酸性細胞外pHにおいて、正味の尿酸塩取り込み率は、増加した。***, pH7.4と比較してP<0.001。すべてのデータは、n = 8−10を有する平均値±SEM（エラーバー）である。
【図２】(A)［14C］尿酸塩の流出は、GLUT9によって、仲介した。GLUT9を発現している卵母細胞（クローズドサークル）からの放射能の流出は、コントロール（オープンサークル）と比較して、標準培養溶液において、測定された。値は、卵母細胞に詰められる全体の放射能のパーセンテージとして表される。(B)URAT1およびURATv1（GLUT9から名前を変えられた）を経た尿酸塩の経細胞輸送の提案されたモデル。ピラジノアート（PZA）を含む単カルボン酸塩（Monocarboxylates ：MCｓ）は、近位尿細管の光（頂点をなす）側にあって、ナトリウムに依存するモノカルボン酸系トランスポーター1（SMCT1）および2（SMCT2）を経由してセルの中で蓄積される。尿酸塩は、頂点に位置するURAT1を介してPZAを含んでいる細胞内MCｓと引きかえに、細胞の中に入る。再吸収された尿酸は、基底面に存在するＵＲＡＴｖ１（ＧＬＵＴ９）を介して、電気化学的勾配によって、細胞を出る。
【図３】SLC2A9の中の突然変異は、特発性腎臓低尿酸血症と関係している。(A)患者（43歳の男性）で見つかる異型の点突発変異（R380W）を示しているSLC2A9のエクソン10の部分的な配列の電気泳動図。このR380W突然変異は、腎臓低尿酸血症と互換性を持つ臨床特徴を呈している患者において、収容されていた。(B)患者からの疾患関連のGLUT9変異体は、完全に尿酸塩輸送活性を失う。尿酸塩の取り込み（20μM）は、野生型又は変異させたｃＲＮＡの注入された卵母細胞において、測定された。データは、グループにつき8つまたは10の卵母細胞の平均値±ＳＥＭである。(C)野生型又はＲ３８０Ｗ変異の卵細胞の亜細胞性のローカライゼーション。抗GLUT9抗体の免疫検出は、野生型およびR380Wタンパク質が原形質膜で発現されることを示したが、蛍光レベルは水が注入された卵母細胞において、検知されなかった。
【図４】(A)水及びGLUT9のcRNAの2つのアイソフォームが注入された卵母細胞の免疫組織化学的な分析。コントロール（水を注入された）、GLUT9 cRNAのアイソフォーム1および２が注入された卵母細胞は、示された。(B) GLUT9のアイソフォーム1及びアイソフォーム２のための尿酸塩輸送活性の比較。(C) GLUT9のアイソフォーム2によるさまざまな放射性同位元素で識別された合成物の取り込み。***,コントロールと比較してP<0.001。
【図５】(A)GLUT9により媒介される尿酸塩取り込みのプレロードされている有機陰イオンのトランス促進効果。コントロールまたはGLUT9を発現している卵母細胞は、50nlの水または非標識の試験陰イオン（100mＭ、pH 7.4）をファインチップドマイクロピペットを使用して、注入されて、それから、20μM［14C］尿酸塩を含んでいるND96浴槽へ移されて、1hの取り込み率は、決定された。*,水を注入されるものと比較してp<0.05。(B)GLUT9により媒介される尿酸塩の排出における、細胞外尿酸塩、グルコースおよびフルクトースのトランス促進効果。コントロールまたはGLUT9を発現している卵母細胞は、50nlの［14C］尿酸塩を注入されて、非標識の合成物（0.5および1mＭの尿酸塩、および、0.5および3mＭのグルコースおよびフルクトース）の存在する又はしないND96溶液へ移されて、室温で、培養された。60分間の［14C］尿酸塩流出の量は、プレロードされている量のパーセンテージとして示される。コントロールと比較して**, p<0.01、***,p<0.001。すべてのデータは、n = 8−10を有する平均値±SEMである。
【図６】(A) SLC2A9の予測された膜-トポロジーモデルの突然変異の位置。(B)GLUT9/SLC2A9遺伝子のゲノム構造。(C)GLUT9/SLC2A9遺伝子のエクソン-イントロン境界。
【図７】配列１
【図８】配列２
【図９】配列３
【図１０】配列４
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＬＵＴ９を使用する、腎臓からの尿酸排出を促進する作用を有する物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
ＧＬＵＴ９を使用する、尿酸の血液濃度を低める作用を有する物質のスクリーニング方法。
【請求項３】
ＧＬＵＴ９を使用する、局所的炎症を軽減する作用を有する物質のスクリーニング方法。
【請求項４】
ＧＬＵＴ９を使用する、動脈硬化の進行において阻害作用を有する物質のスクリーニング方法。
【請求項５】
腎臓からの尿酸排出を促進する作用を有する物質のスクリーニング方法であって、
ａ）ＧＬＵＴ９が発現した細胞を準備し、
ｂ）上記細胞を物質と尿酸の存在下で培養し、
ｃ）細胞による尿酸の取り込み量に基いて、上記物質が腎臓からの尿酸排出を促進する作用を有するか否かを決定する、スクリーニング方法。
【請求項１】
ＧＬＵＴ９を使用する、腎臓からの尿酸排出を促進する作用を有する物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
ＧＬＵＴ９を使用する、尿酸の血液濃度を低める作用を有する物質のスクリーニング方法。
【請求項３】
ＧＬＵＴ９を使用する、局所的炎症を軽減する作用を有する物質のスクリーニング方法。
【請求項４】
ＧＬＵＴ９を使用する、動脈硬化の進行において阻害作用を有する物質のスクリーニング方法。
【請求項５】
腎臓からの尿酸排出を促進する作用を有する物質のスクリーニング方法であって、
ａ）ＧＬＵＴ９が発現した細胞を準備し、
ｂ）上記細胞を物質と尿酸の存在下で培養し、
ｃ）細胞による尿酸の取り込み量に基いて、上記物質が腎臓からの尿酸排出を促進する作用を有するか否かを決定する、スクリーニング方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２００９−２９４０５７（Ｐ２００９−２９４０５７Ａ）
【公開日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２００８−１４７４９６（Ｐ２００８−１４７４９６）
【出願日】平成２０年６月４日（２００８．６．４）
【出願人】（５０６３３４３１１）ジェイファーマ株式会社 (4)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１４７４９６（Ｐ２００８−１４７４９６）
【出願日】平成２０年６月４日（２００８．６．４）
【出願人】（５０６３３４３１１）ジェイファーマ株式会社 (4)
【Ｆターム（参考）】
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