腸がん抑制剤及び腸がん抑制作用を有する物質のスクリーニング方法
【課題】腸がんを抑制し得る新規物質と、これを有効成分として含有する腸がん抑制剤の提供。
【解決手段】芳香族炭化水素受容体を活性化する物質を有効成分として含有する腸がん抑制剤を提供する。この腸がん抑制剤は、有効成分としてインドール誘導体、あるいはフラボノイド類を含有するものとできる。また、培養細胞に被験物質を添加し、培養細胞に発現する芳香族炭化水素受容体の活性化を検出する手順を含む、腸がん抑制作用を有する物質のスクリーニング方法をも提供する。
【解決手段】芳香族炭化水素受容体を活性化する物質を有効成分として含有する腸がん抑制剤を提供する。この腸がん抑制剤は、有効成分としてインドール誘導体、あるいはフラボノイド類を含有するものとできる。また、培養細胞に被験物質を添加し、培養細胞に発現する芳香族炭化水素受容体の活性化を検出する手順を含む、腸がん抑制作用を有する物質のスクリーニング方法をも提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腸がん抑制剤及び腸がん抑制作用を有する物質のスクリーニング方法に関する。より詳しくは、芳香族炭化水素受容体を活性化する物質を有効成分として含有する腸がん抑制剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
腸がんは、ヒトに最も頻発するがんのひとつである。特に大腸がんは、消化器がんでは胃がんに次いで死亡率が高く、食習慣の欧米化に伴って急増している。近年、大腸がんの原因遺伝子や発生メカニズムの解析が積極的に行われており、例えば、ＡＰＣ（adenomatous polyposis coli）遺伝子の変異によるＷｎｔシグナルカスケードの異常な活性化が、発がん促進物質であるβ−カテニンの安定化と蓄積を引き起こし、がんを誘発することが明らかにされている（非特許文献１参照）。
【０００３】
大腸がんを予防又は治療するため、従来、種々の医薬製剤や食品が開発されてきている。例えば、特許文献１には、「スフィンゴ糖脂質又はスフィンゴ糖脂質を含有することを特徴とする大腸癌予防剤」が提案されている。また、特許文献２には、卵白中のタンパク質の一種であるオボトランスフェリンを有効成分として含有することを特徴とする大腸癌予防剤が開示されている。
【０００４】
芳香族炭化水素受容体（Aryl Hydrocarbon Receptor：ＡｈＲ）は、bHLH-PAS（Basic Helix-Loop-Helix−Per-Arnt-Sim）ファミリーに属する転写因子であり、ダイオキシンレセプターとしても知られている。ＡｈＲはリガンドが結合していない状態では不活性で、細胞質に優位に存在している。リガンドである芳香族炭化水素化合物が結合すると、ＡｈＲは核内に移行する。核内で、ＡｈＲはＡＲＮＴ（AhR Nuclear Translocator）と呼ばれる分子とヘテロ二量体を形成し、ＤＮＡ上のエンハンサー配列に結合して、転写活性化を引き起こす。ＡｈＲは、薬物代謝酵素であるチロクローム１ａ１や、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ−Ｙａサブユニット、ＵＤＰ−グルクロニルトランスフェラーゼなどの誘導に関与し、異物の代謝に機能することが知られている。
【０００５】
また、ＡｈＲについては、エストロジェンレセプターやアンドロジェンレセプターなどの核内レセプターのリガンド依存性Ｅ３ユビキチンリガーゼとしても機能することが明らかになっている（非特許文献２参照）。
【０００６】
ＡｈＲのリガンドとしては、３−インドール酢酸（ＩＡＡ）やインドール−３−カルビノール（Ｉ３Ｃ）、３，３´−ジインドリルメタン（ＤＩＭ）等のインドール誘導体が天然由来のリガンドとなり得ることが報告されている（非特許文献３・４参照）。これらのインドール誘導体は、アブラナ科野菜に多く含まれるグルコシノレート（カラシ油配糖体）や摂食されたトリプトファンなどから代謝反応や腸内細菌の関与のもとに生成される。これまでに、インドール誘導体が、結直腸がんに対して発がん予防効果を示すことが報告されている（非特許文献参照５〜７参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００６−２９０８５６号公報
【特許文献２】特開２００５−３５０４２０号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】"Wnt signalling in stem cells and cancer." Nature, 2005, Apr 14;434(7035):843-50
【非特許文献２】"Dioxin receptor is a ligand-dependent E3 ubiquitin ligase." Nature, 2007, Mar 29;446(7135):562-6
【非特許文献３】"The search for endogenous activators of the aryl hydrocarbon receptor." Chem. Res. Toxicol., 2008, 21:102-116
【非特許文献４】"Activation of the Ah receptor by tryptophan and tryptophan metabolites." Biochemistry, 1998, 37:11508-11515
【非特許文献５】"Targets for indole-3-carbinol in cancer prevention." J. Nut. Biochem., 2005, 16:65-73
【非特許文献６】"Dietary indoles and isothiocyanates that are generated from cruciferous vegetables can both stimulate apoptosis and confer protection against DNA damage in human colon cell lines." Cancer Res., 2001, 61:6120-6130
【非特許文献７】"Vegetables, fruit, and phytoestrogens as preventive agents." IARC Sci. Publ., 1996, 139:61-90
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、腸がんを抑制し得る新規物質と、これを有効成分として含有する腸がん抑制剤を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題解決のため、本発明は、芳香族炭化水素受容体を活性化する物質を有効成分として含有する腸がん抑制剤を提供する。
この腸がん抑制剤は、有効成分としてインドール誘導体、あるいはフラボノイド類を含有するものとできる。
本発明は、また、培養細胞に被験物質を添加し、培養細胞に発現する芳香族炭化水素受容体のＥ３ユビキチンリガーゼ活性の上昇を検出する手順を含む、腸がん抑制作用を有する物質のスクリーニング方法をも提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、腸がんを抑制し得る新規物質と、これを有効成分として含有する腸がん抑制剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＡｈＲ−／−マウスの大腸にみられる腫瘍を例示する図面代用写真である（試験例１）。
【図２】ＡｈＲ−／−マウスにおける腫瘍発生率及び腫瘍サイズの経時変化を説明するための図である（試験例１）。
【図３】ＡｈＲ−／−マウスにおける腫瘍の組織学的異型性の経時変化を説明するための図である（試験例１）。
【図４】ＡｈＲ−／−マウスにみられる腺がんの典型的なＨＥ染色像（Ａ）と、β−カテニン（Ｂ）及びｃ−ｍｙｃ（Ｃ）の免疫染色像を示す図面代用写真である（試験例１）。
【図５】ＡｈＲ−／−マウスとＡｈＲ＋／＋マウスの腸上皮のＨＥ染色像と免疫染色像を示す図面代用写真である（試験例２）。
【図６】ＡｈＲ−／−マウスとＡｈＲ＋／＋マウスの盲腸におけるＡｈＲとβ−カテニンの量をウェスタンブロット法により解析した結果を示す図である（試験例２）。
【図７】ＡｈＲ−／−マウス及びＡｈＲ＋／＋マウスの盲腸上皮におけるＡｈＲｍＲＮＡとβ−カテニン ｍＲＮＡの量を、ＲＴ−ＰＣＲ法により解析した結果を示す図である（試験例２）。
【図８】ＡｈＲリガンドを添加した培養細胞内のβ−カテニン量の変化を説明するための図である（試験例３）。
【図９】ＡｈＲリガンドを添加した細胞の溶解液を抗ＡｈＲ抗体で免疫沈降し、抗β−カテニン抗体でブロットした結果を示す図である（試験例３）。
【図１０】ＡｈＲリガンドを添加した細胞の溶解液を抗ＤＤＢ１抗体で免疫沈降し、抗β−カテニン抗体及び抗ＣＵＬ４Ｂ抗体でブロットした結果示す図である（試験例３）。
【図１１】ＡｈＲリガンドを投与したマウス盲腸上皮内のβ−カテニン量の変化を説明するための図である（試験例３）。
【図１２】ＡｐｃＭｉｎ／＋マウスを用いて、天然ＡｈＲリガンドの発がん抑制作用を評価した結果を示す図である（試験例４）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明者らは、今回、ＡｈＲ欠損マウス（ＡｈＲ−／−マウス）の消化管を詳細に調べ、ＡｈＲ−／−マウスが大腸がんを頻発することを新たに見出した。そして、ＡｈＲ−／−マウスにおける大腸がんの発生メカニズムの解析を行い、（１）ＡｈＲがＥ３ユビキチンリガーゼ活性によってβ−カテニンの分解に機能すること、（２）ＡｈＲリガンドによってＡｈＲを活性化し、β−カテニンの分解を促進することで、大腸がんの発生を抑制できること、を初めて明らかにした。本発明に係る腸がん抑制剤及び腸がん抑制作用を有する物質のスクリーニング方法は、これらの知見により新規に得られたものであり、それぞれＡｈＲを活性化する物質を有効成分として含有すること、ＡｈＲの活性化を検出する手順を含むことを特徴とする。以下、本発明に係る腸がん抑制剤及び腸がん抑制作用を有する物質のスクリーニング方法について順に説明する。
【００１４】
１．腸がん抑制剤
本発明に係る腸がん抑制剤は、ＡｈＲを活性化する物質を有効成分として含有することを特徴とする。
【００１５】
ＡｈＲを活性化する物質は、「リガンド」と「非リガンド」に大別することができる。
リガンドは、「非生体由来（Xenobiotic）リガンド」と「生体由来（Endogenous）リガンド」に分けられる。
非生体由来リガンドとしては、例えば、ハロゲン化芳香族炭化水素類や芳香族炭化水素類、ＰＣＢ類が挙げられる。
ハロゲン化芳香族炭化水素類としては、2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin（TCDD）等のダイオキシン類、2,3,7,8-Tetrachlorodibenzofuran（TCDF）等のジベンゾフラン類、3,3’,4,4’-Tetrachloroazoxybenzene等のアゾベンゼン類、2,3,6,7-Tetra- chloronaphthalene等のナフタレン類などが挙げられる。
また、芳香族炭化水素類には、３−メチルコラントレン（３−ＭＣ）やベンゾピレン、 12-dimethylbenz(a)anthracene（DMBA）などが、ＰＣＢ類には、3,3’,4,4’,5-Pentachlorobiphenylなどがある。
【００１６】
生体由来リガンドとしては、インディゴ（indigo）やインデイルビン（indirubin）等のインディゴイド（indigoides）類、ブタ肺から単離されたＩＴＥ（2-(1’H-indole-3’-carbonyl)-thiazole-4-carboxylic acid methyl ester）、ウマ尿中エストロゲンであるエキレニン（equilenin）が挙げられる。また、リポキシンＡ４やプロスタグランジンＧ２等のアラキドン酸代謝産物、ビリルビンやビリベルジン、ヘミン等のヘム代謝産物、３−インドール酢酸（ＩＡＡ）等のトリプトファン代謝産物、紫外線照射によってトリプトファンから生成する6-formylindolo[3,2-b]carbazole（FICZ）なども挙げられる。
さらに、食餌中に含まれ得る生体由来リガンドとして、インドール誘導体や植物性フラボノイドなどが挙げられる。インドール誘導体には、インドール−３−カルビノール（Ｉ３Ｃ）、３，３´−ジインドリルメタン（ＤＩＭ）、indolo[3,2-b]carbazole （ICZ）, 2-(indol-3-ylmethyl)-3,3’-diindolylmethane（LTr-1）などが含まれる。植物性フラボノイドには、a−ナフトフラボン（βＮＦ）等のフラボン類や、ダイゼイン、ゲニステイン等の大豆イソフラボン類などが含まれる。
【００１７】
ＡｈＲを活性化する非リガンド物質としては、プロトンポンプ阻害薬として用いられるオメプラゾール（"Regulation of dioxin receptor function by omeprazole." J. Biol. Chem., 1997, Vol.272, No.19, p.12705-12713参照）や、ＬＤＬ（Low-density lipoprotein）（"The aryl hydrocarbon receptor is activated by modified low-density lipoprotein." Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 2007, Vol.104, No.4, p.1412-1417参照）などがある。
【００１８】
本発明に係る腸がん抑制剤は、腸がんの予防又は治療のために用いられ得る。治療には、腸がんの治癒に限らず、腸がんの進行抑制をも含むものとする。
本発明に係る腸がん抑制剤は、アブラナ科野菜に多く含まれるグルコシノレートや摂食されたトリプトファンなどから代謝反応や腸内細菌の関与のもとに生成されるインドール誘導体のような天然ＡｈＲリガンドを有効成分とできる。この場合、長期適用の安全性にも優れるため、予防的な適用、特に遺伝的に発症する家族性大腸腺腫症（家族性大腸ポリポーシス：ＦＡＰ）の予防や発症遅延のための適用に適している。
ＦＡＰは１７，０００人〜１８，０００人に一人の割合で発症する疾患であり、日本人全体で約１０、０００人の患者がいると見積もられている。ＦＡＰは、ＡＰＣ遺伝子の変異に起因して、若年でほぼ１００％発症する。
【００１９】
本発明に係る腸がん抑制剤は、種々の剤型に製剤でき、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液又は懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。
医薬製剤は、本発明に係る腸がん抑制剤を、生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造される。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。
医薬製剤の投与量は、剤型の種類、投与方法、投与対象（動物を含む）の年齢や体重、症状等を考慮して決定されるものである。
【００２０】
また、本発明に係る腸がん抑制剤は、食品組成物としては、例えば、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助食品、経腸栄養食品等にも配合され得る。
食品組成物は、本発明に係る腸がん抑制剤に、ブドウ糖、果糖、ショ糖、マルトース、ソルビトール、ステビオサイド、ルブソサイド、コーンシロップ、乳糖、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、乳酸、Ｌ−アスコルビン酸、ｄｌ−α−トコフェロール、エリソルビン酸ナトリウム、グリセリン、プロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、アラビアガム、カラギーナン、カゼイン、ゼラチン、ペクチン、寒天、ビタミンＢ類、ニコチン酸アミド、パントテン酸カルシウム、アミノ酸類、カルシウム塩類、色素、香料、保存剤等の通常食品原料として使用されているものを適宜配合して製造される。
また、本発明に係る腸がん抑制剤は、一般に食品材料として使用される米、小麦、トウモロコシ、ジャガイモ、スイートポテト、大豆、昆布、ワカメ、テングサなどを混合してもよい。
【００２１】
２．腸がん抑制作用を有する物質のスクリーニング方法
本発明に係る腸がん抑制作用を有する物質のスクリーニング方法は、培養細胞に被験物質を添加し、培養細胞に発現するＡｈＲのＥ３ユビキチンリガーゼ活性の上昇を検出する手順を含むことを特徴とする。
【００２２】
このスクリーニング方法において、ＡｈＲのＥ３ユビキチンリガーゼ活性の上昇は、ＡｈＲを構成要素とするＥ３ユビキチンリガーゼ複合体の形成の有無を検出することにより、あるいは同複合体の形成量を評価することにより、検出できる。
被験物質を添加していない細胞との間で、Ｅ３ユビキチンリガーゼ複合体の形成の有無あるいは形成量を比較することにより、Ｅ３ユビキチンリガーゼ複合体の形成を促進し、β−カテニンを分解して、腸がんの発生を抑制する物質を得ることができる。
【００２３】
ＡｈＲを構成要素とするＥ３ユビキチンリガーゼ複合体は、被験物質を添加した細胞の溶解液を、Ｅ３ユビキチンリガーゼ複合体の他の構成要素であるＤＤＢ１、ＣＵＬ４Ｂ、ＴＢＬ３、Ａｒｎｔ等に対する抗体で免疫沈降し、沈降物を抗ＡｈＲ抗体によってウェスタンブロットすることにより検出できる（後述の試験例３参照）。
また、ＡｈＲを構成要素とするＥ３ユビキチンリガーゼ複合体の検出は、タンパク質の相互作用解析のための従来公知の分析機器を用いて行うこともできる。このような分析器として、表面プラズモン共鳴センサ（SPR）や水晶振動子マイクロバランス(QCM)バイオセンサー等がある。
【実施例】
【００２４】
＜試験例１＞
１．ＡｈＲ−／−マウスの表現型解析
本試験例では、ＡｈＲ−／−マウスの消化管を詳細に調べ、ＡｈＲ−／−マウスが大腸がんを頻発することを明らかにした。
【００２５】
ＡｈＲ−／−マウス、ＡｈＲ＋／−マウス及びＡｈＲ＋／＋マウスの消化管を摘出し、長軸方向に切開し、病変の有無を確認した。図１に、ＡｈＲ−／−マウスの大腸がん病変部を示す。ＡｈＲ−／−マウス（２１週齢）では、特に回盲部近傍の盲腸において、高頻度で腫瘍の発生がみられた（図１（Ａ）参照）。一方、同週齢のＡｈＲ＋／−マウス（図１（Ｂ）参照）及びＡｈＲ＋／＋マウス（図１（Ｃ）参照）では、腫瘍の発生はみられなかった。なお、ＡｈＲ−／−マウスは、Ｃ５７Ｂ／６バックグランドのものを用いた。ＡｈＲ＋／＋マウスは、Ｃ５７Ｂ／６の野生型を用いた。これらは、日本クレア株式会社から購入した。
【００２６】
図２に、ＡｈＲ−／−マウスにおける腫瘍発生率及び腫瘍サイズの経時変化を示す。ＡｈＲ−／−マウスでは、８週齢において１００％の発生率で腫瘍が発生した。発生した腫瘍は、加齢に伴って次第に大きくなり、３０〜４０週齢で最大に達した。なお、腫瘍の大きさ（ｍｍ２）は、汎用の画像処理解析ソフト（NIH Image）を用いて測定した。
【００２７】
図３に、ＡｈＲ−／−マウスにおける腫瘍の組織学的異型性の経時変化を示す。異型性の評価は、以下の基準に基づいて行った。図３中、ＡｈＲ＋／＋マウスを青色の四角で、ＡｈＲ＋／−マウスを緑色の三角で、ＡｈＲ−／−マウスを黄色の円で示す。グレード５のＡｈＲ−／−マウスのうち、粘膜下領域まで、あるいは粘膜下領域を越えて腺がんが浸潤していた個体を赤色の円で、粘膜内に浸潤していた個体をピンク色の円で別個に示す。
グレード１：正常
グレード２：軽度過形成
グレード３：中度過形成
グレード４：腺腫（重度異形）
グレード５：腺がん
【００２８】
ＡｈＲ＋／＋マウス及びＡｈＲ＋／−マウスでは、全ての週齢で、グレード１あるいはグレード２と評価された。これに対して、ＡｈＲ−／−マウスでは、１１週齢以降で、軽度の悪性ポリープから重度の腺がんまでの幅広い異型性を示す組織像が認められた。これらの異型性を示す異常な組織像は、加齢に伴ってさらに増悪した。
【００２９】
図４に、ＡｈＲ−／−マウスにみられる腺がんの典型的な組織像を示す。ＡｈＲ−／−マウスにみられた盲腸がんの多くは、管状腺がんであり、細胞異形と粘膜下領域に浸潤した融合した管状構造とを伴う、中程度に分化した腺がんであった（図４（Ａ）参照）。これらの腺がんについて、免疫組織学的手法によりβ−カテニンとｃ−ｍｙｃの発現を調べたところ、いずれも陽性であった（図４（Ｂ）・（Ｃ）参照）。なお、β−カテニンに対する抗体は、Ｃ末端に対するマウスモノクローナル抗体（Clone 14, BD Bioscience）を用いた。また、抗ｃ−ｍｙｃ抗体は、Santa Cruz Biotechnology社から購入したものを用いた。
【００３０】
＜試験例２＞
２．ＡｈＲ−／−マウスにおける大腸がんの発生メカニズム解析
本試験例では、ＡｈＲ−／−マウスにおける大腸がんの発生メカニズムを明らかにするため、６週齢のＡｈＲ−／−マウス及びＡｈＲ＋／＋マウスの腸におけるＡｈＲとβ−カテニンの発現解析を行った。
【００３１】
図５に、ＡｈＲ−／−マウス及びＡｈＲ＋／＋マウスの腸上皮におけるＡｈＲとβ−カテニンの量を、免疫組織学的手法により解析した結果を示す。図５（Ａ）最上段は、小腸のＨＥ染色像である。２〜４段目は、それぞれ小腸のＡｈＲ免疫染色像、β−カテニン免疫染色像、ｃ−ｍｙｃ免疫染色像である。また、図５（Ｂ）は、結腸のβ−カテニン免疫染色像、図５（Ｃ）は、盲腸のβ−カテニン免疫染色像である。なお、図中、矢頭は、パネート細胞の核内に蓄積しているβ−カテニンを示す。
【００３２】
図５（Ａ）最上段に示すように、６週齢では、ＡｈＲ−／−マウス及びＡｈＲ＋／＋マウスともに、形態学的に正常な腸上皮を示した。ＡｈＲの発現は、ＡｈＲ＋／＋マウスにおいては、パネート細胞で特に顕著であった。一方、ＡｈＲ−／−マウスでは、ＡｈＲが発現していないことが確認された。
【００３３】
β−カテニンの発現は、ＡｈＲ−／−マウスの回腸、結腸、盲腸において、ＡｈＲ＋／＋マウスに比して特に顕著に亢進していた（図５（Ａ）〜（Ｃ）参照）。β−カテニンの発現亢進は、特にパネート細胞の核内で観察された（図中、矢頭参照）。
【００３４】
図６に、ＡｈＲ−／−マウス及びＡｈＲ＋／＋マウスの盲腸におけるＡｈＲとβ−カテニンの量を、ウェスタンブロット法により解析した結果を示す。また、図７に、ＡｈＲ−／−マウス及びＡｈＲ＋／＋マウスの盲腸上皮におけるＡｈＲｍＲＮＡとβ−カテニン ｍＲＮＡの発現量を、ＲＴ−ＰＣＲ法により解析した結果を示す。図６下段は、ウェスタンブロットによるβ−カテニン、ＡｈＲ、α−アクチンの検出バンドを示し、上段は、画像処理解析ソフト（NIH Image）による検出バンドの定量値（相対値）を示す。図７は、β−カテニン、ＡｈＲ、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡのＰＣＲ増幅産物の検出バンドを示す。ＲＴ−ＰＣＲは、文献記載の条件により行った（"Control of Treg and TH17 cell differentiation by the aryl hydrocarbon receptor." Nature, 453:65-71参照）。
【００３５】
ＡｈＲ−／−マウスの盲腸では、ＡｈＲ＋／＋マウスに比して有意に高いβ−カテニン量が確認された（図６参照）。一方、図７に示すように、β−カテニン ｍＲＮＡの発現量については、ＡｈＲ−／−マウスとＡｈＲ＋／＋マウスとの間で変化がみられなかった。
【００３６】
以上の本試験例の結果から、ＡｈＲ−／−マウスの腸では、β−カテニンが安定化されることによって蓄積し、がん化傾向あるいは前がん段階の状態が引き起こされていることが明らかになった。
【００３７】
＜試験例３＞
３．ＡｈＲのβ−カテニン分解機能の解析
本試験例では、既に報告されているエストロジェンレセプターやアンドロジェンレセプターの分解と同様に、β−カテニンの分解にも、ＡｈＲのＥ３ユビキチンリガーゼ活性が関与していることを明らかにした。
【００３８】
まず、細胞培養液中に、ＡｈＲリガンドである３−メチルコラントレン（３−ＭＣ）又はβ−ナフトフラボン（βＮＦ）、３−インドール酢酸（ＩＡＡ）を添加してＡｈＲを活性化した際の細胞内β−カテニン量の変化を調べた。
【００３９】
細胞には、結腸がん由来のＤＬＤ−１細胞、ＳＷ４８０細胞、ＨＣＴ１１６細胞を用いた。細胞培養液中に、３−ＭＣ（１μＭ）、βＮＦ（１μＭ）あるいはＩＡＡ（１００μＭ）を添加し、プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２（１μＭ）の存在下又は非存在下で培養した。３時間あるいは６時間培養後、細胞を溶解し、ウェスタンブロット法によりβ−カテニン量を評価した。
【００４０】
結果を図８に示す。ＡｈＲリガンドである３−ＭＣ、βＮＦ、ＩＡＡの添加により、細胞内のβ−カテニン量は減少した。プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２の存在下では、β−カテニン量の減少は認められなかった。
【００４１】
また、細胞溶解液を抗ＡｈＲ抗体で免疫沈降させ、抗β−カテニン抗体でブロットした結果を図９に、細胞溶解液を抗ＤＤＢ１抗体で免疫沈降させ、抗β−カテニン抗体及び抗ＣＵＬ４Ｂ抗体でブロットした結果を図１０に示す。なお、ＤＤＢ１及びＣＵＬ４Ｂは、Ｅ３ユビキチンリガーゼ複合体の構成要素である。３−ＭＣ又はＩＡＡの添加により、ＡｈＲと複合体を形成するβ−カテニン量が増加した（図９参照）。また、３−ＭＣ又はＩＡＡの添加により、ＡｈＲ、ＤＤＢ１及びＣＵＬ４Ｂを構成要素とするＥ３ユビキチンリガーゼ複合体の形成が促進され、β−カテニンのポリユビキチン化が引き起こされていることが確認された（図１０参照）。
【００４２】
これらのことから、β−カテニンがＡｈＲリガンド依存的にプロテアソーム系により分解されていること、すなわち、ＡｈＲがＥ３ユビキチンリガーゼ活性によってβ−カテニンの分解に機能していることが明らかになった。
【００４３】
次に、マウスにＡｈＲリガンドを投与してＡｈＲを活性化した際の盲腸上皮内β−カテニン量の変化を調べた。
【００４４】
ＡｈＲ＋／＋マウスに、３−ＭＣ（４ｍｇ／ｋｇ体重）を腹腔内に単回投与し、投与後３，６，１２，２４時間後に盲腸上皮を採材し、ウェスタンブロット法によりβ−カテニン量を評価した。抗チトクローム１a１抗体は、Chemicon International社から購入したものを用いた。
【００４５】
結果を図１１に示す。３−ＭＣの投与により、３時間後をピークにして上皮内のβ−カテニン量が減少した（図１１（Ａ）参照）。また、３−ＭＣの投与により、チトクローム１a１の顕著な発現誘導が確認された。なお、３時間後をピークとしたβ−カテニン量の一過性の減少は、ＡｈＲの活性化によってＡｈＲの発現に負のフィードバックがかかったためと考えられる。
【００４６】
ＡｈＲ−／−マウスでは、ＡｈＲリガンドの投与によってもβ−カテニン量に変化がみられなかったことから、この３−ＭＣ投与によるβ−カテニンの減少は、ＡｈＲ依存性であり、ＡｈＲのユビキチンリガーゼ活性によるものであると考えられた。
【００４７】
さらに、ＡｈＲの活性化によるβ−カテニンの分解は、天然ＡｈＲリガンドであるＩＡＡ及びインドール−３−カルビノール（Ｉ３Ｃ）を腹腔内投与（２５ｍｇ／ｋｇ体重、単回）した場合にも認められた（図１１（Ｂ）参照）。
【００４８】
以上の本試験例の結果から、ＡｈＲ Ｅ３ユビキチンリガーゼがβ−カテニンの分解に機能し、ＡｈＲリガンドによってＡｈＲを活性化し、β−カテニンの分解を促進することで、腸がんの発生を抑制できる可能性が強く示唆された。
【００４９】
＜試験例４＞
４．天然ＡｈＲリガンドによる発がん抑制試験
本試験例では、ＡｈＲリガンドが実際に腸がんの発生を抑制し得るかについて、ＡｐｃＭｉｎ／＋マウスを用いて検討を行った。
【００５０】
ＡＰＣ遺伝子は、家族性大腸腺腫様ポリポーシスと称される遺伝性がんの原因遺伝子としてみつかった遺伝子である（"Identification of FAP locus genes from chromosome 5q21." Science, 1991, 253:661-665、"Mutations of chromosome 5q21 genes in FAP and colorectal cancer patients." Science, 1991, 253:665-669参照）。ＡＰＣ遺伝子の変異は、β−カテニンの異常蓄積を伴う散発性結直腸がんの多くでも認められている（"Lessons from hereditary colorectal cancer." Cell, 1996, 87:159-170参照）。ＡＰＣ遺伝子に変異を有するＡｐｃＭｉｎ／＋マウスは、家族性大腸腺腫様ポリポーシスのモデルとして用いられており、主として小腸に多数の腺腫様ポリポーシスを発症することが知られている。
【００５１】
ＡｐｃＭｉｎ／＋マウスと、ＡｐｃＭｉｎ／＋・ＡｈＲ＋／−マウスに、３〜４週齢の離乳直後から、天然ＡｈＲリガンドであるＩ３Ｃ又は３，３´−ジインドリルメタン（ＤＩＭ）を含有する飼料（Ｆ２、フナバシファーム）を給餌した。飼料中のＩ３Ｃ（シグマアルドリッチ）の含有量は０．１％とし、ＤＩＭ（和光純薬）の含有量は０．０１％とした。ＡｐｃＭｉｎ／＋マウスは、ジャクソン研究所（The Jackson Laboratory）から購入した。
【００５２】
結果を図１２に示す。図１２（Ａ），（Ｂ），（Ｅ）はＡｐｃＭｉｎ／＋マウスの結果を、（Ｃ），（Ｄ）はＡｐｃＭｉｎ／＋・ＡｈＲ＋／−マウスの結果を示す。通常飼料を給餌したＡｐｃＭｉｎ／＋マウスでは、１０週齢経過後からポリープが生じ、２５週齢では全ての個体にポリープが認められた（図１２（Ａ）参照）。ポリープを含む腫瘍の数は１０〜１５週齢で最大数に達し、個体あたり３０個程度の腫瘍が確認された（図１２（Ｂ）参照）。これに対して、Ｉ３Ｃ又はＤＩＭ含有飼料を給餌したＡｐｃＭｉｎ／＋マウスでは、ポリープの発生時期が２０週齢前後に遅延され、２５週齢におけるポリープの発生率も５０％程度に抑制された（図１２（Ａ）参照）。さらに、ポリープを含む腫瘍の数も、顕著に減少した（図１２（Ｂ）参照）。Ｉ３Ｃ又はＤＩＭ含有飼料の給餌による腫瘍発生の抑制は、ＡｐｃＭｉｎ／＋・ＡｈＲ＋／−マウスにおいても同様に確認された（図１２（Ｃ）・（Ｄ））参照）。しかし、ＡｈＲ−／−マウスでは、Ｉ３Ｃ又はＤＩＭ含有飼料の給餌による腫瘍発生抑制効果は認められなかった。
【００５３】
さらに、Ｉ３Ｃ又はＤＩＭ含有飼料を給餌したＡｐｃＭｉｎ／＋マウス（１５週齢）の盲腸及び小腸では、通常飼料を給餌したマウスに比べて、細胞間接着部分以外のβ−カテニン量の顕著な減少が観察された（図１２（Ｅ）参照）。
【００５４】
以上の本実施例の結果から、ＡｈＲリガンドは、ＡｈＲ Ｅ３ユビキチンリガーゼを活性化し、β−カテニンの分解を促進することによって、発がんを抑制することが示された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腸がん抑制剤及び腸がん抑制作用を有する物質のスクリーニング方法に関する。より詳しくは、芳香族炭化水素受容体を活性化する物質を有効成分として含有する腸がん抑制剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
腸がんは、ヒトに最も頻発するがんのひとつである。特に大腸がんは、消化器がんでは胃がんに次いで死亡率が高く、食習慣の欧米化に伴って急増している。近年、大腸がんの原因遺伝子や発生メカニズムの解析が積極的に行われており、例えば、ＡＰＣ（adenomatous polyposis coli）遺伝子の変異によるＷｎｔシグナルカスケードの異常な活性化が、発がん促進物質であるβ−カテニンの安定化と蓄積を引き起こし、がんを誘発することが明らかにされている（非特許文献１参照）。
【０００３】
大腸がんを予防又は治療するため、従来、種々の医薬製剤や食品が開発されてきている。例えば、特許文献１には、「スフィンゴ糖脂質又はスフィンゴ糖脂質を含有することを特徴とする大腸癌予防剤」が提案されている。また、特許文献２には、卵白中のタンパク質の一種であるオボトランスフェリンを有効成分として含有することを特徴とする大腸癌予防剤が開示されている。
【０００４】
芳香族炭化水素受容体（Aryl Hydrocarbon Receptor：ＡｈＲ）は、bHLH-PAS（Basic Helix-Loop-Helix−Per-Arnt-Sim）ファミリーに属する転写因子であり、ダイオキシンレセプターとしても知られている。ＡｈＲはリガンドが結合していない状態では不活性で、細胞質に優位に存在している。リガンドである芳香族炭化水素化合物が結合すると、ＡｈＲは核内に移行する。核内で、ＡｈＲはＡＲＮＴ（AhR Nuclear Translocator）と呼ばれる分子とヘテロ二量体を形成し、ＤＮＡ上のエンハンサー配列に結合して、転写活性化を引き起こす。ＡｈＲは、薬物代謝酵素であるチロクローム１ａ１や、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ−Ｙａサブユニット、ＵＤＰ−グルクロニルトランスフェラーゼなどの誘導に関与し、異物の代謝に機能することが知られている。
【０００５】
また、ＡｈＲについては、エストロジェンレセプターやアンドロジェンレセプターなどの核内レセプターのリガンド依存性Ｅ３ユビキチンリガーゼとしても機能することが明らかになっている（非特許文献２参照）。
【０００６】
ＡｈＲのリガンドとしては、３−インドール酢酸（ＩＡＡ）やインドール−３−カルビノール（Ｉ３Ｃ）、３，３´−ジインドリルメタン（ＤＩＭ）等のインドール誘導体が天然由来のリガンドとなり得ることが報告されている（非特許文献３・４参照）。これらのインドール誘導体は、アブラナ科野菜に多く含まれるグルコシノレート（カラシ油配糖体）や摂食されたトリプトファンなどから代謝反応や腸内細菌の関与のもとに生成される。これまでに、インドール誘導体が、結直腸がんに対して発がん予防効果を示すことが報告されている（非特許文献参照５〜７参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００６−２９０８５６号公報
【特許文献２】特開２００５−３５０４２０号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】"Wnt signalling in stem cells and cancer." Nature, 2005, Apr 14;434(7035):843-50
【非特許文献２】"Dioxin receptor is a ligand-dependent E3 ubiquitin ligase." Nature, 2007, Mar 29;446(7135):562-6
【非特許文献３】"The search for endogenous activators of the aryl hydrocarbon receptor." Chem. Res. Toxicol., 2008, 21:102-116
【非特許文献４】"Activation of the Ah receptor by tryptophan and tryptophan metabolites." Biochemistry, 1998, 37:11508-11515
【非特許文献５】"Targets for indole-3-carbinol in cancer prevention." J. Nut. Biochem., 2005, 16:65-73
【非特許文献６】"Dietary indoles and isothiocyanates that are generated from cruciferous vegetables can both stimulate apoptosis and confer protection against DNA damage in human colon cell lines." Cancer Res., 2001, 61:6120-6130
【非特許文献７】"Vegetables, fruit, and phytoestrogens as preventive agents." IARC Sci. Publ., 1996, 139:61-90
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、腸がんを抑制し得る新規物質と、これを有効成分として含有する腸がん抑制剤を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題解決のため、本発明は、芳香族炭化水素受容体を活性化する物質を有効成分として含有する腸がん抑制剤を提供する。
この腸がん抑制剤は、有効成分としてインドール誘導体、あるいはフラボノイド類を含有するものとできる。
本発明は、また、培養細胞に被験物質を添加し、培養細胞に発現する芳香族炭化水素受容体のＥ３ユビキチンリガーゼ活性の上昇を検出する手順を含む、腸がん抑制作用を有する物質のスクリーニング方法をも提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、腸がんを抑制し得る新規物質と、これを有効成分として含有する腸がん抑制剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＡｈＲ−／−マウスの大腸にみられる腫瘍を例示する図面代用写真である（試験例１）。
【図２】ＡｈＲ−／−マウスにおける腫瘍発生率及び腫瘍サイズの経時変化を説明するための図である（試験例１）。
【図３】ＡｈＲ−／−マウスにおける腫瘍の組織学的異型性の経時変化を説明するための図である（試験例１）。
【図４】ＡｈＲ−／−マウスにみられる腺がんの典型的なＨＥ染色像（Ａ）と、β−カテニン（Ｂ）及びｃ−ｍｙｃ（Ｃ）の免疫染色像を示す図面代用写真である（試験例１）。
【図５】ＡｈＲ−／−マウスとＡｈＲ＋／＋マウスの腸上皮のＨＥ染色像と免疫染色像を示す図面代用写真である（試験例２）。
【図６】ＡｈＲ−／−マウスとＡｈＲ＋／＋マウスの盲腸におけるＡｈＲとβ−カテニンの量をウェスタンブロット法により解析した結果を示す図である（試験例２）。
【図７】ＡｈＲ−／−マウス及びＡｈＲ＋／＋マウスの盲腸上皮におけるＡｈＲｍＲＮＡとβ−カテニン ｍＲＮＡの量を、ＲＴ−ＰＣＲ法により解析した結果を示す図である（試験例２）。
【図８】ＡｈＲリガンドを添加した培養細胞内のβ−カテニン量の変化を説明するための図である（試験例３）。
【図９】ＡｈＲリガンドを添加した細胞の溶解液を抗ＡｈＲ抗体で免疫沈降し、抗β−カテニン抗体でブロットした結果を示す図である（試験例３）。
【図１０】ＡｈＲリガンドを添加した細胞の溶解液を抗ＤＤＢ１抗体で免疫沈降し、抗β−カテニン抗体及び抗ＣＵＬ４Ｂ抗体でブロットした結果示す図である（試験例３）。
【図１１】ＡｈＲリガンドを投与したマウス盲腸上皮内のβ−カテニン量の変化を説明するための図である（試験例３）。
【図１２】ＡｐｃＭｉｎ／＋マウスを用いて、天然ＡｈＲリガンドの発がん抑制作用を評価した結果を示す図である（試験例４）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明者らは、今回、ＡｈＲ欠損マウス（ＡｈＲ−／−マウス）の消化管を詳細に調べ、ＡｈＲ−／−マウスが大腸がんを頻発することを新たに見出した。そして、ＡｈＲ−／−マウスにおける大腸がんの発生メカニズムの解析を行い、（１）ＡｈＲがＥ３ユビキチンリガーゼ活性によってβ−カテニンの分解に機能すること、（２）ＡｈＲリガンドによってＡｈＲを活性化し、β−カテニンの分解を促進することで、大腸がんの発生を抑制できること、を初めて明らかにした。本発明に係る腸がん抑制剤及び腸がん抑制作用を有する物質のスクリーニング方法は、これらの知見により新規に得られたものであり、それぞれＡｈＲを活性化する物質を有効成分として含有すること、ＡｈＲの活性化を検出する手順を含むことを特徴とする。以下、本発明に係る腸がん抑制剤及び腸がん抑制作用を有する物質のスクリーニング方法について順に説明する。
【００１４】
１．腸がん抑制剤
本発明に係る腸がん抑制剤は、ＡｈＲを活性化する物質を有効成分として含有することを特徴とする。
【００１５】
ＡｈＲを活性化する物質は、「リガンド」と「非リガンド」に大別することができる。
リガンドは、「非生体由来（Xenobiotic）リガンド」と「生体由来（Endogenous）リガンド」に分けられる。
非生体由来リガンドとしては、例えば、ハロゲン化芳香族炭化水素類や芳香族炭化水素類、ＰＣＢ類が挙げられる。
ハロゲン化芳香族炭化水素類としては、2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin（TCDD）等のダイオキシン類、2,3,7,8-Tetrachlorodibenzofuran（TCDF）等のジベンゾフラン類、3,3’,4,4’-Tetrachloroazoxybenzene等のアゾベンゼン類、2,3,6,7-Tetra- chloronaphthalene等のナフタレン類などが挙げられる。
また、芳香族炭化水素類には、３−メチルコラントレン（３−ＭＣ）やベンゾピレン、 12-dimethylbenz(a)anthracene（DMBA）などが、ＰＣＢ類には、3,3’,4,4’,5-Pentachlorobiphenylなどがある。
【００１６】
生体由来リガンドとしては、インディゴ（indigo）やインデイルビン（indirubin）等のインディゴイド（indigoides）類、ブタ肺から単離されたＩＴＥ（2-(1’H-indole-3’-carbonyl)-thiazole-4-carboxylic acid methyl ester）、ウマ尿中エストロゲンであるエキレニン（equilenin）が挙げられる。また、リポキシンＡ４やプロスタグランジンＧ２等のアラキドン酸代謝産物、ビリルビンやビリベルジン、ヘミン等のヘム代謝産物、３−インドール酢酸（ＩＡＡ）等のトリプトファン代謝産物、紫外線照射によってトリプトファンから生成する6-formylindolo[3,2-b]carbazole（FICZ）なども挙げられる。
さらに、食餌中に含まれ得る生体由来リガンドとして、インドール誘導体や植物性フラボノイドなどが挙げられる。インドール誘導体には、インドール−３−カルビノール（Ｉ３Ｃ）、３，３´−ジインドリルメタン（ＤＩＭ）、indolo[3,2-b]carbazole （ICZ）, 2-(indol-3-ylmethyl)-3,3’-diindolylmethane（LTr-1）などが含まれる。植物性フラボノイドには、a−ナフトフラボン（βＮＦ）等のフラボン類や、ダイゼイン、ゲニステイン等の大豆イソフラボン類などが含まれる。
【００１７】
ＡｈＲを活性化する非リガンド物質としては、プロトンポンプ阻害薬として用いられるオメプラゾール（"Regulation of dioxin receptor function by omeprazole." J. Biol. Chem., 1997, Vol.272, No.19, p.12705-12713参照）や、ＬＤＬ（Low-density lipoprotein）（"The aryl hydrocarbon receptor is activated by modified low-density lipoprotein." Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 2007, Vol.104, No.4, p.1412-1417参照）などがある。
【００１８】
本発明に係る腸がん抑制剤は、腸がんの予防又は治療のために用いられ得る。治療には、腸がんの治癒に限らず、腸がんの進行抑制をも含むものとする。
本発明に係る腸がん抑制剤は、アブラナ科野菜に多く含まれるグルコシノレートや摂食されたトリプトファンなどから代謝反応や腸内細菌の関与のもとに生成されるインドール誘導体のような天然ＡｈＲリガンドを有効成分とできる。この場合、長期適用の安全性にも優れるため、予防的な適用、特に遺伝的に発症する家族性大腸腺腫症（家族性大腸ポリポーシス：ＦＡＰ）の予防や発症遅延のための適用に適している。
ＦＡＰは１７，０００人〜１８，０００人に一人の割合で発症する疾患であり、日本人全体で約１０、０００人の患者がいると見積もられている。ＦＡＰは、ＡＰＣ遺伝子の変異に起因して、若年でほぼ１００％発症する。
【００１９】
本発明に係る腸がん抑制剤は、種々の剤型に製剤でき、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液又は懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。
医薬製剤は、本発明に係る腸がん抑制剤を、生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造される。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。
医薬製剤の投与量は、剤型の種類、投与方法、投与対象（動物を含む）の年齢や体重、症状等を考慮して決定されるものである。
【００２０】
また、本発明に係る腸がん抑制剤は、食品組成物としては、例えば、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助食品、経腸栄養食品等にも配合され得る。
食品組成物は、本発明に係る腸がん抑制剤に、ブドウ糖、果糖、ショ糖、マルトース、ソルビトール、ステビオサイド、ルブソサイド、コーンシロップ、乳糖、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、乳酸、Ｌ−アスコルビン酸、ｄｌ−α−トコフェロール、エリソルビン酸ナトリウム、グリセリン、プロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、アラビアガム、カラギーナン、カゼイン、ゼラチン、ペクチン、寒天、ビタミンＢ類、ニコチン酸アミド、パントテン酸カルシウム、アミノ酸類、カルシウム塩類、色素、香料、保存剤等の通常食品原料として使用されているものを適宜配合して製造される。
また、本発明に係る腸がん抑制剤は、一般に食品材料として使用される米、小麦、トウモロコシ、ジャガイモ、スイートポテト、大豆、昆布、ワカメ、テングサなどを混合してもよい。
【００２１】
２．腸がん抑制作用を有する物質のスクリーニング方法
本発明に係る腸がん抑制作用を有する物質のスクリーニング方法は、培養細胞に被験物質を添加し、培養細胞に発現するＡｈＲのＥ３ユビキチンリガーゼ活性の上昇を検出する手順を含むことを特徴とする。
【００２２】
このスクリーニング方法において、ＡｈＲのＥ３ユビキチンリガーゼ活性の上昇は、ＡｈＲを構成要素とするＥ３ユビキチンリガーゼ複合体の形成の有無を検出することにより、あるいは同複合体の形成量を評価することにより、検出できる。
被験物質を添加していない細胞との間で、Ｅ３ユビキチンリガーゼ複合体の形成の有無あるいは形成量を比較することにより、Ｅ３ユビキチンリガーゼ複合体の形成を促進し、β−カテニンを分解して、腸がんの発生を抑制する物質を得ることができる。
【００２３】
ＡｈＲを構成要素とするＥ３ユビキチンリガーゼ複合体は、被験物質を添加した細胞の溶解液を、Ｅ３ユビキチンリガーゼ複合体の他の構成要素であるＤＤＢ１、ＣＵＬ４Ｂ、ＴＢＬ３、Ａｒｎｔ等に対する抗体で免疫沈降し、沈降物を抗ＡｈＲ抗体によってウェスタンブロットすることにより検出できる（後述の試験例３参照）。
また、ＡｈＲを構成要素とするＥ３ユビキチンリガーゼ複合体の検出は、タンパク質の相互作用解析のための従来公知の分析機器を用いて行うこともできる。このような分析器として、表面プラズモン共鳴センサ（SPR）や水晶振動子マイクロバランス(QCM)バイオセンサー等がある。
【実施例】
【００２４】
＜試験例１＞
１．ＡｈＲ−／−マウスの表現型解析
本試験例では、ＡｈＲ−／−マウスの消化管を詳細に調べ、ＡｈＲ−／−マウスが大腸がんを頻発することを明らかにした。
【００２５】
ＡｈＲ−／−マウス、ＡｈＲ＋／−マウス及びＡｈＲ＋／＋マウスの消化管を摘出し、長軸方向に切開し、病変の有無を確認した。図１に、ＡｈＲ−／−マウスの大腸がん病変部を示す。ＡｈＲ−／−マウス（２１週齢）では、特に回盲部近傍の盲腸において、高頻度で腫瘍の発生がみられた（図１（Ａ）参照）。一方、同週齢のＡｈＲ＋／−マウス（図１（Ｂ）参照）及びＡｈＲ＋／＋マウス（図１（Ｃ）参照）では、腫瘍の発生はみられなかった。なお、ＡｈＲ−／−マウスは、Ｃ５７Ｂ／６バックグランドのものを用いた。ＡｈＲ＋／＋マウスは、Ｃ５７Ｂ／６の野生型を用いた。これらは、日本クレア株式会社から購入した。
【００２６】
図２に、ＡｈＲ−／−マウスにおける腫瘍発生率及び腫瘍サイズの経時変化を示す。ＡｈＲ−／−マウスでは、８週齢において１００％の発生率で腫瘍が発生した。発生した腫瘍は、加齢に伴って次第に大きくなり、３０〜４０週齢で最大に達した。なお、腫瘍の大きさ（ｍｍ２）は、汎用の画像処理解析ソフト（NIH Image）を用いて測定した。
【００２７】
図３に、ＡｈＲ−／−マウスにおける腫瘍の組織学的異型性の経時変化を示す。異型性の評価は、以下の基準に基づいて行った。図３中、ＡｈＲ＋／＋マウスを青色の四角で、ＡｈＲ＋／−マウスを緑色の三角で、ＡｈＲ−／−マウスを黄色の円で示す。グレード５のＡｈＲ−／−マウスのうち、粘膜下領域まで、あるいは粘膜下領域を越えて腺がんが浸潤していた個体を赤色の円で、粘膜内に浸潤していた個体をピンク色の円で別個に示す。
グレード１：正常
グレード２：軽度過形成
グレード３：中度過形成
グレード４：腺腫（重度異形）
グレード５：腺がん
【００２８】
ＡｈＲ＋／＋マウス及びＡｈＲ＋／−マウスでは、全ての週齢で、グレード１あるいはグレード２と評価された。これに対して、ＡｈＲ−／−マウスでは、１１週齢以降で、軽度の悪性ポリープから重度の腺がんまでの幅広い異型性を示す組織像が認められた。これらの異型性を示す異常な組織像は、加齢に伴ってさらに増悪した。
【００２９】
図４に、ＡｈＲ−／−マウスにみられる腺がんの典型的な組織像を示す。ＡｈＲ−／−マウスにみられた盲腸がんの多くは、管状腺がんであり、細胞異形と粘膜下領域に浸潤した融合した管状構造とを伴う、中程度に分化した腺がんであった（図４（Ａ）参照）。これらの腺がんについて、免疫組織学的手法によりβ−カテニンとｃ−ｍｙｃの発現を調べたところ、いずれも陽性であった（図４（Ｂ）・（Ｃ）参照）。なお、β−カテニンに対する抗体は、Ｃ末端に対するマウスモノクローナル抗体（Clone 14, BD Bioscience）を用いた。また、抗ｃ−ｍｙｃ抗体は、Santa Cruz Biotechnology社から購入したものを用いた。
【００３０】
＜試験例２＞
２．ＡｈＲ−／−マウスにおける大腸がんの発生メカニズム解析
本試験例では、ＡｈＲ−／−マウスにおける大腸がんの発生メカニズムを明らかにするため、６週齢のＡｈＲ−／−マウス及びＡｈＲ＋／＋マウスの腸におけるＡｈＲとβ−カテニンの発現解析を行った。
【００３１】
図５に、ＡｈＲ−／−マウス及びＡｈＲ＋／＋マウスの腸上皮におけるＡｈＲとβ−カテニンの量を、免疫組織学的手法により解析した結果を示す。図５（Ａ）最上段は、小腸のＨＥ染色像である。２〜４段目は、それぞれ小腸のＡｈＲ免疫染色像、β−カテニン免疫染色像、ｃ−ｍｙｃ免疫染色像である。また、図５（Ｂ）は、結腸のβ−カテニン免疫染色像、図５（Ｃ）は、盲腸のβ−カテニン免疫染色像である。なお、図中、矢頭は、パネート細胞の核内に蓄積しているβ−カテニンを示す。
【００３２】
図５（Ａ）最上段に示すように、６週齢では、ＡｈＲ−／−マウス及びＡｈＲ＋／＋マウスともに、形態学的に正常な腸上皮を示した。ＡｈＲの発現は、ＡｈＲ＋／＋マウスにおいては、パネート細胞で特に顕著であった。一方、ＡｈＲ−／−マウスでは、ＡｈＲが発現していないことが確認された。
【００３３】
β−カテニンの発現は、ＡｈＲ−／−マウスの回腸、結腸、盲腸において、ＡｈＲ＋／＋マウスに比して特に顕著に亢進していた（図５（Ａ）〜（Ｃ）参照）。β−カテニンの発現亢進は、特にパネート細胞の核内で観察された（図中、矢頭参照）。
【００３４】
図６に、ＡｈＲ−／−マウス及びＡｈＲ＋／＋マウスの盲腸におけるＡｈＲとβ−カテニンの量を、ウェスタンブロット法により解析した結果を示す。また、図７に、ＡｈＲ−／−マウス及びＡｈＲ＋／＋マウスの盲腸上皮におけるＡｈＲｍＲＮＡとβ−カテニン ｍＲＮＡの発現量を、ＲＴ−ＰＣＲ法により解析した結果を示す。図６下段は、ウェスタンブロットによるβ−カテニン、ＡｈＲ、α−アクチンの検出バンドを示し、上段は、画像処理解析ソフト（NIH Image）による検出バンドの定量値（相対値）を示す。図７は、β−カテニン、ＡｈＲ、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡのＰＣＲ増幅産物の検出バンドを示す。ＲＴ−ＰＣＲは、文献記載の条件により行った（"Control of Treg and TH17 cell differentiation by the aryl hydrocarbon receptor." Nature, 453:65-71参照）。
【００３５】
ＡｈＲ−／−マウスの盲腸では、ＡｈＲ＋／＋マウスに比して有意に高いβ−カテニン量が確認された（図６参照）。一方、図７に示すように、β−カテニン ｍＲＮＡの発現量については、ＡｈＲ−／−マウスとＡｈＲ＋／＋マウスとの間で変化がみられなかった。
【００３６】
以上の本試験例の結果から、ＡｈＲ−／−マウスの腸では、β−カテニンが安定化されることによって蓄積し、がん化傾向あるいは前がん段階の状態が引き起こされていることが明らかになった。
【００３７】
＜試験例３＞
３．ＡｈＲのβ−カテニン分解機能の解析
本試験例では、既に報告されているエストロジェンレセプターやアンドロジェンレセプターの分解と同様に、β−カテニンの分解にも、ＡｈＲのＥ３ユビキチンリガーゼ活性が関与していることを明らかにした。
【００３８】
まず、細胞培養液中に、ＡｈＲリガンドである３−メチルコラントレン（３−ＭＣ）又はβ−ナフトフラボン（βＮＦ）、３−インドール酢酸（ＩＡＡ）を添加してＡｈＲを活性化した際の細胞内β−カテニン量の変化を調べた。
【００３９】
細胞には、結腸がん由来のＤＬＤ−１細胞、ＳＷ４８０細胞、ＨＣＴ１１６細胞を用いた。細胞培養液中に、３−ＭＣ（１μＭ）、βＮＦ（１μＭ）あるいはＩＡＡ（１００μＭ）を添加し、プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２（１μＭ）の存在下又は非存在下で培養した。３時間あるいは６時間培養後、細胞を溶解し、ウェスタンブロット法によりβ−カテニン量を評価した。
【００４０】
結果を図８に示す。ＡｈＲリガンドである３−ＭＣ、βＮＦ、ＩＡＡの添加により、細胞内のβ−カテニン量は減少した。プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２の存在下では、β−カテニン量の減少は認められなかった。
【００４１】
また、細胞溶解液を抗ＡｈＲ抗体で免疫沈降させ、抗β−カテニン抗体でブロットした結果を図９に、細胞溶解液を抗ＤＤＢ１抗体で免疫沈降させ、抗β−カテニン抗体及び抗ＣＵＬ４Ｂ抗体でブロットした結果を図１０に示す。なお、ＤＤＢ１及びＣＵＬ４Ｂは、Ｅ３ユビキチンリガーゼ複合体の構成要素である。３−ＭＣ又はＩＡＡの添加により、ＡｈＲと複合体を形成するβ−カテニン量が増加した（図９参照）。また、３−ＭＣ又はＩＡＡの添加により、ＡｈＲ、ＤＤＢ１及びＣＵＬ４Ｂを構成要素とするＥ３ユビキチンリガーゼ複合体の形成が促進され、β−カテニンのポリユビキチン化が引き起こされていることが確認された（図１０参照）。
【００４２】
これらのことから、β−カテニンがＡｈＲリガンド依存的にプロテアソーム系により分解されていること、すなわち、ＡｈＲがＥ３ユビキチンリガーゼ活性によってβ−カテニンの分解に機能していることが明らかになった。
【００４３】
次に、マウスにＡｈＲリガンドを投与してＡｈＲを活性化した際の盲腸上皮内β−カテニン量の変化を調べた。
【００４４】
ＡｈＲ＋／＋マウスに、３−ＭＣ（４ｍｇ／ｋｇ体重）を腹腔内に単回投与し、投与後３，６，１２，２４時間後に盲腸上皮を採材し、ウェスタンブロット法によりβ−カテニン量を評価した。抗チトクローム１a１抗体は、Chemicon International社から購入したものを用いた。
【００４５】
結果を図１１に示す。３−ＭＣの投与により、３時間後をピークにして上皮内のβ−カテニン量が減少した（図１１（Ａ）参照）。また、３−ＭＣの投与により、チトクローム１a１の顕著な発現誘導が確認された。なお、３時間後をピークとしたβ−カテニン量の一過性の減少は、ＡｈＲの活性化によってＡｈＲの発現に負のフィードバックがかかったためと考えられる。
【００４６】
ＡｈＲ−／−マウスでは、ＡｈＲリガンドの投与によってもβ−カテニン量に変化がみられなかったことから、この３−ＭＣ投与によるβ−カテニンの減少は、ＡｈＲ依存性であり、ＡｈＲのユビキチンリガーゼ活性によるものであると考えられた。
【００４７】
さらに、ＡｈＲの活性化によるβ−カテニンの分解は、天然ＡｈＲリガンドであるＩＡＡ及びインドール−３−カルビノール（Ｉ３Ｃ）を腹腔内投与（２５ｍｇ／ｋｇ体重、単回）した場合にも認められた（図１１（Ｂ）参照）。
【００４８】
以上の本試験例の結果から、ＡｈＲ Ｅ３ユビキチンリガーゼがβ−カテニンの分解に機能し、ＡｈＲリガンドによってＡｈＲを活性化し、β−カテニンの分解を促進することで、腸がんの発生を抑制できる可能性が強く示唆された。
【００４９】
＜試験例４＞
４．天然ＡｈＲリガンドによる発がん抑制試験
本試験例では、ＡｈＲリガンドが実際に腸がんの発生を抑制し得るかについて、ＡｐｃＭｉｎ／＋マウスを用いて検討を行った。
【００５０】
ＡＰＣ遺伝子は、家族性大腸腺腫様ポリポーシスと称される遺伝性がんの原因遺伝子としてみつかった遺伝子である（"Identification of FAP locus genes from chromosome 5q21." Science, 1991, 253:661-665、"Mutations of chromosome 5q21 genes in FAP and colorectal cancer patients." Science, 1991, 253:665-669参照）。ＡＰＣ遺伝子の変異は、β−カテニンの異常蓄積を伴う散発性結直腸がんの多くでも認められている（"Lessons from hereditary colorectal cancer." Cell, 1996, 87:159-170参照）。ＡＰＣ遺伝子に変異を有するＡｐｃＭｉｎ／＋マウスは、家族性大腸腺腫様ポリポーシスのモデルとして用いられており、主として小腸に多数の腺腫様ポリポーシスを発症することが知られている。
【００５１】
ＡｐｃＭｉｎ／＋マウスと、ＡｐｃＭｉｎ／＋・ＡｈＲ＋／−マウスに、３〜４週齢の離乳直後から、天然ＡｈＲリガンドであるＩ３Ｃ又は３，３´−ジインドリルメタン（ＤＩＭ）を含有する飼料（Ｆ２、フナバシファーム）を給餌した。飼料中のＩ３Ｃ（シグマアルドリッチ）の含有量は０．１％とし、ＤＩＭ（和光純薬）の含有量は０．０１％とした。ＡｐｃＭｉｎ／＋マウスは、ジャクソン研究所（The Jackson Laboratory）から購入した。
【００５２】
結果を図１２に示す。図１２（Ａ），（Ｂ），（Ｅ）はＡｐｃＭｉｎ／＋マウスの結果を、（Ｃ），（Ｄ）はＡｐｃＭｉｎ／＋・ＡｈＲ＋／−マウスの結果を示す。通常飼料を給餌したＡｐｃＭｉｎ／＋マウスでは、１０週齢経過後からポリープが生じ、２５週齢では全ての個体にポリープが認められた（図１２（Ａ）参照）。ポリープを含む腫瘍の数は１０〜１５週齢で最大数に達し、個体あたり３０個程度の腫瘍が確認された（図１２（Ｂ）参照）。これに対して、Ｉ３Ｃ又はＤＩＭ含有飼料を給餌したＡｐｃＭｉｎ／＋マウスでは、ポリープの発生時期が２０週齢前後に遅延され、２５週齢におけるポリープの発生率も５０％程度に抑制された（図１２（Ａ）参照）。さらに、ポリープを含む腫瘍の数も、顕著に減少した（図１２（Ｂ）参照）。Ｉ３Ｃ又はＤＩＭ含有飼料の給餌による腫瘍発生の抑制は、ＡｐｃＭｉｎ／＋・ＡｈＲ＋／−マウスにおいても同様に確認された（図１２（Ｃ）・（Ｄ））参照）。しかし、ＡｈＲ−／−マウスでは、Ｉ３Ｃ又はＤＩＭ含有飼料の給餌による腫瘍発生抑制効果は認められなかった。
【００５３】
さらに、Ｉ３Ｃ又はＤＩＭ含有飼料を給餌したＡｐｃＭｉｎ／＋マウス（１５週齢）の盲腸及び小腸では、通常飼料を給餌したマウスに比べて、細胞間接着部分以外のβ−カテニン量の顕著な減少が観察された（図１２（Ｅ）参照）。
【００５４】
以上の本実施例の結果から、ＡｈＲリガンドは、ＡｈＲ Ｅ３ユビキチンリガーゼを活性化し、β−カテニンの分解を促進することによって、発がんを抑制することが示された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
芳香族炭化水素受容体を活性化する物質を有効成分として含有する腸がん抑制剤。
【請求項２】
前記物質がインドール誘導体である請求項１記載の腸がん抑制剤。
【請求項３】
前記物質がフラボノイド類である請求項１記載の腸がん抑制剤。
【請求項４】
培養細胞に被験物質を添加し、培養細胞に発現する芳香族炭化水素受容体のＥ３ユビキチンリガーゼ活性の上昇を検出する手順を含む、腸がん抑制作用を有する物質のスクリーニング方法。
【請求項１】
芳香族炭化水素受容体を活性化する物質を有効成分として含有する腸がん抑制剤。
【請求項２】
前記物質がインドール誘導体である請求項１記載の腸がん抑制剤。
【請求項３】
前記物質がフラボノイド類である請求項１記載の腸がん抑制剤。
【請求項４】
培養細胞に被験物質を添加し、培養細胞に発現する芳香族炭化水素受容体のＥ３ユビキチンリガーゼ活性の上昇を検出する手順を含む、腸がん抑制作用を有する物質のスクリーニング方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２０１１−１６２４８２（Ｐ２０１１−１６２４８２Ａ）
【公開日】平成２３年８月２５日（２０１１．８．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２７５７８（Ｐ２０１０−２７５７８）
【出願日】平成２２年２月１０日（２０１０．２．１０）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 全米科学アカデミー（Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）、１０６巻（Ｖｏｌ．１０６）、３２号（Ｎｏ．３２）、ページ１３４８１〜１３４８６
【出願人】（５１００３９００２）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年８月２５日（２０１１．８．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月１０日（２０１０．２．１０）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 全米科学アカデミー（Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）、１０６巻（Ｖｏｌ．１０６）、３２号（Ｎｏ．３２）、ページ１３４８１〜１３４８６
【出願人】（５１００３９００２）
【Ｆターム（参考）】
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