腸内細菌におけるチトクロムＰ４５０の発現
【課題】高レベルの真核生物異物代謝Ｐ４５０を発現する細菌を提供する。
【解決手段】 機能性チトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ系を含む菌細胞であって、該細胞がチトクロムＰ４５０を発現し得る遺伝子作成物と上記チトクロムＰ４５０とは別個にチトクロムＰ４５０レダクターゼを発現し得る遺伝子作成物を含み、チトクロムＰ４５０のＮ末端とチトクロムＰ４５０レダクターゼのＮ末端がそれぞれ上記細胞内において上記チトクロムＰ４５０と上記チトクロムＰ４５０レダクターゼの機能性カップリングを可能にするように適合化されている。チトクロムＰ４５０を含む菌細胞において、上記チトクロムＰ４５０をコード化し、かつ発現し得る遺伝子作成物を含有し、チトクロムＰ４５０が、菌細胞の細胞区画又は膜にチトクロムＰ４５０を方向付けるＮ末端部分を含む。
【解決手段】 機能性チトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ系を含む菌細胞であって、該細胞がチトクロムＰ４５０を発現し得る遺伝子作成物と上記チトクロムＰ４５０とは別個にチトクロムＰ４５０レダクターゼを発現し得る遺伝子作成物を含み、チトクロムＰ４５０のＮ末端とチトクロムＰ４５０レダクターゼのＮ末端がそれぞれ上記細胞内において上記チトクロムＰ４５０と上記チトクロムＰ４５０レダクターゼの機能性カップリングを可能にするように適合化されている。チトクロムＰ４５０を含む菌細胞において、上記チトクロムＰ４５０をコード化し、かつ発現し得る遺伝子作成物を含有し、チトクロムＰ４５０が、菌細胞の細胞区画又は膜にチトクロムＰ４５０を方向付けるＮ末端部分を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌におけるチトクロムＰ４５０の発現に関する。特に、本発明は、細菌、特に腸内細菌における真核生物の活性なチトクロムＰ４５０酵素系の発現に関する。
【背景技術】
【０００２】
チトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（Ｐ４５０類）は、広範囲の化合物の代謝を触媒するヘムタンパク質の上科を形成する。これは、酸素分子の一つの原子の基質内への挿入を通じて親油性化学物質の酸化を触媒する（非特許文献１）。哺乳動物のＰ４５０類は、ステロイド類、治療薬及び発ガン物質を含む、内因性及び外因性化合物の代謝を触媒する（非特許文献２; 非特許文献３; 非特許文献４）。異なった哺乳動物のＰ４５０類は独特であるが重複する基質特異性を示し、強い位置及びステレオ選択性を示す（非特許文献５）。哺乳動物のＰ４５０類は、その主要な機能に基づき２つの主要なクラスに小分類することができる。すなわち、ステロイド類と胆汁酸の代謝に主に関与するものと、生体異物を主に代謝するものとに分類される。異物代謝Ｐ４５０類は、典型的には例えば肝細胞のようなある種の哺乳動物細胞の小胞体中に見出され、ミクロソームＰ４５０類と称される。
【０００３】
後者のグループのＰ４５０類により代謝される化合物には、例えばシクロスポリン、ニフェジピン及びデブリソキンのような治療薬並びに例えば多環式芳香族炭化水素類、ニトロサミン及びアリールアミン類のような発ガン物質が含まれる。ミクロソームＰ４５０類が触媒的に活性であるには、ＮＡＤＰＨ-チトクロムＰ４５０オキシドレダクターゼ（Ｐ４５０レダクターゼ；ＥＣ１.６.２.４）のＦＭＮ及びＦＡＤ補欠分子族を経由してＮＡＤＰＨから送られる電子の供与が必要となる（非特許文献６）。
【０００４】
Ｐ４５０類の一次構造を比較すると、これらは構造的に相互に関連しており、共通の祖先から由来している可能性が高いことが分かる。その一次構造に基づき、Ｐ４５０類は例えばＣＹＰ１、ＣＹＰ２等々のようなファミリーに分類される（非特許文献７）。
【０００５】
治療化合物と発ガン物質の代謝において哺乳動物のＰ４５０類が重要であることから、異種性の系において哺乳動物のＰ４５０類を発現させる試みがなされてきた。例えば、非特許文献８、非特許文献９及び非特許文献１０により記載されているように異種的にＰ４５０類を発現させるために哺乳動物の細胞が用いられている。
【０００６】
酵母細胞もまた例えば非特許文献１１と非特許文献１２により、Ｐ４５０類の異種的な発現のために用いられている。
【０００７】
更に最近では哺乳動物のＰ４５０類が大腸菌において発現されている。
【０００８】
非特許文献１３には、修飾されたヒトチトクロムＰ４５０ ３Ａ４の大腸菌における発現と該酵素の精製と再構成が記載されている。
【０００９】
非特許文献１４には、大腸菌における組換えチトクロムＰ４５０ １７α−水酸化酵素の発現と酵素活性が記載されている。
【００１０】
非特許文献１５には、疎水性のＮＨ２-末端セグメントを欠くチトクロムＰ４５０ ＩＩＥ１の発現が触媒活性を保持することが記載されている。
【００１１】
非特許文献１６には、大腸菌において発現されたヒトチトクロムＰ４５０酵素によるプロ発ガン物質の活性化が記載されている。
【００１２】
非特許文献１７には、ＮＡＤＰＨ-Ｐ４５０レダクターゼを含む精製された組換え融合タンパク質の酵素学的性質が記載されている。
【００１３】
非特許文献１８には、ヒトＰ４５０ ３Ａ４のヘム領域とラットチトクロムＰ４５０レダクターゼのフラビン領域を含む組換え融合タンパク質の幾つかの性質が記載されている。
【００１４】
非特許文献１９には、大腸菌由来のＮＡＤＰＨ-フラボドキシンレダクターゼとフラボドキシンがウシチトクロムＰ４５０ ｃ１７水酸化酵素活性を支援することが記載されている。
【００１５】
非特許文献２０には、ヒトＰ４５０ １Ａ２の大腸菌における発現が記載されている。
【００１６】
非特許文献２０には、哺乳動物のチトクロムＰ４５０とＮＡＤＰＨ-Ｐ４５０レダクターゼフラボタンパク質の領域を含む融合タンパク質の大腸菌における発現が記載されている。
【００１７】
非特許文献２１には、コレステロール ７α-水酸化酵素チトクロムＰ４５０の大腸菌における発現が記載されている。
【００１８】
非特許文献２２には、２Ｃ亜科のヒト及びウサギチトクロムＰ４５０の大腸菌における発現が記載されている。
【００１９】
非特許文献２３には、チトクロムＰ４５０ ２Ｄ６の大腸菌における発現が記載されている。
【００２０】
非特許文献２４には、ompＡシグナルペプチドへのＮ末端融合を含むＰ４５０レダクターゼが、Ｐ４５０の第２コドン（セリン）がアラニンに置換され、Ｐ４５０につき他の変更はなされていないヒトＰ４５０ ２Ｅ１と共に大腸菌において同時発現される研究が記載されている。インビボにおいて、細胞全体の活性は証明されなかった。
【００２１】
特許文献１には、Ｐ４５０１７α-水酸化酵素の大腸菌における発現とＰ４５０レダクターゼ酵素領域へのその融合及び融合タンパク質の大腸菌における発現が記載されている。ウシＰ４５０１７α−水酸化酵素由来の９個のＮ末端アミノ酸を含むＰ４５０酵素ハイブリッドもまた開示されている。
【００２２】
特許文献２には、チトクロムＰ４５０レダクターゼの同時発現又は混合を必要としないで生物学的に活性な形でのＰ４５０１７α-水酸化酵素の大腸菌における発現が記載されている。
【００２３】
非特許文献２５には、チトクロムＰ４５０ ３Ａ５の大腸菌における発現が記載されている。
【００２４】
非特許文献２６には、修飾されたヒトチトクロムＰ４５０ ２Ｅ１の大腸菌における発現が記載されている。
【００２５】
非特許文献２７には、ウシＰ４５０ １７ＡとラットＮＡＤＰＨ-Ｐ４５０レダクターゼの領域を含む組換え融合タンパク質の大腸菌における発現が記載されている。
【００２６】
非特許文献２８には、ネズミチフス菌において発現された組換えヒトチトクロムＰ４５０ １Ａ２による芳香族アミン類の生物活性化が記載されている。
【特許文献１】国際公開ＷＯ９４／０１５６８号パンフレット
【特許文献２】米国特許第５２４０８３１号明細書
【非特許文献１】Porterと Coon (1991) J. Biol. Chem. 261, 13469-13472
【非特許文献２】Guengerich (1987) "Enzymology of rat liver cytochromes P450", F.P.Guengerich編, CRC Press, Boca Raton FL, Vol. 1, pp 1-54
【非特許文献３】GuengerichとShimada (1991) Chem. Res. Toxicol.4, 391-407
【非特許文献４】Gonzalez (1992) Trends in Pharmacol. Sci. 12, 346-352
【非特許文献５】Crespiほか(1993) Toxicology 82, 89-104
【非特許文献６】Smithほか(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 8710-8714
【非特許文献７】Nelsonほか(1996) Pharmacogenetics 6, 1-42
【非特許文献８】Doehmerほか(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5769-5773
【非特許文献９】Aoyamaほか(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 4790-4793
【非特許文献１０】Crespiほか(1991) Carcinogenesis 12, 355-359
【非特許文献１１】Renaudほか(1993) Toxicology 82, 39-52
【非特許文献１２】Blighほか(1992) Gene 110, 33-39
【非特許文献１３】Gillamほか(1993) Arch. Biochem. Biophys. 305, 123-131
【非特許文献１４】Barnesほか(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 5597-5601
【非特許文献１５】Larsonほか(1991) J. Biol. Chem. 266, 7321-7324
【非特許文献１６】Shimadaほか(1994) Carcinogenesis 15, 2523-2529
【非特許文献１７】Shetほか(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 11748-11752
【非特許文献１８】Shetほか(1995) Arch. Biochem. Biophys. 318, 314-321
【非特許文献１９】JenkinsとWaterman(1994) J. Biol. Chem. 269, 27401-27408
【非特許文献２０】Fisherほか(1992) FASEB J. 6, 759-764
【非特許文献２１】ChunとChiang(1991) J. Biol. Chem. 266, 19186-19191
【非特許文献２２】Richardsonほか(1995) Arch. Biochem. Biophys. 323, 87-96
【非特許文献２３】Gillamほか(1995) Arch. Biochem. Biophys. 319, 540-550
【非特許文献２４】DongとPorter(1996) Arch. Biochem. Biophys. 327, 254-259
【非特許文献２５】Gillamほか(1995) Arch. Biochem. Biophys. 317, 374-384
【非特許文献２６】Gillamほか(1994) Arch. Biochem. Biophys. 312, 59-66
【非特許文献２７】Shetほか(1994) Arch. Biochem. Biophys. 311, 402-417
【非特許文献２８】Josephyほか(1995) Cancer Res. 55, 799-802
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２７】
有効な真核生物、特に哺乳動物のＰ４５０モノオキシゲナーゼ酵素系を細菌において発現させるための広範な努力にも拘わらず、細胞全体において化合物を代謝し得る系は今日まで考案されていない。これは、酵素活性に対してＰ４５０レダクターゼを必要とする異物代謝Ｐ４５０類の場合は特にしかりである。より詳細には、チトクロムＰ４５０とチトクロムＰ４５０レダクターゼが同一の菌細胞において別々に発現されたときに機能チトクロムＰ４５０レダクターゼ系を形成する菌細胞系は過去には考案されていない。同様に、高レベルの真核生物異物代謝Ｐ４５０を発現する細菌を生産する努力が鋭意なされてきたにも拘わらず、満足できる系はこれまで考案されていない。
【００２８】
本発明の一つの目的は、無処置の菌細胞において機能的な形でＰ４５０類を発現する優れた系を提供することである。
【００２９】
本発明の更なる目的は、Ｐ４５０レダクターゼと共であってもなくともＰ４５０類を発現する改良系を提供することである。
【００３０】
機能Ｐ４５０酵素系を細胞全体において発現する細菌系は「バイオリアクター」として有用であるか、薬物試験又は発ガン物質試験系において、またはバイオセンサーとして、あるいは環境のレメディエーション又はホルモンの生産等において用途が見出される。細菌における真核生物Ｐ４５０類の高レベルの発現は構造研究用のＰ４５０源を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００３１】
本発明の第１の観点では、機能性チトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ系を含む菌細胞であって、該細胞がチトクロムＰ４５０を発現し得る遺伝子作成物と上記チトクロムＰ４５０とは別個にチトクロムＰ４５０レダクターゼを発現し得る遺伝子作成物を含み、チトクロムＰ４５０のＮ末端とチトクロムＰ４５０レダクターゼのＮ末端が上記細胞内における上記チトクロムＰ４５０と上記チトクロムＰ４５０レダクターゼの機能性カップリングを可能にするようにそれぞれ適合された菌細胞が提供される。
【００３２】
好ましくは、菌細胞は、少なくとも５０pmol/min/mgタンパク、より好ましくは少なくとも２５０pmol/min/mgタンパク、更により好ましくは少なくとも５００pmol/min/mgタンパクの比活性を有するチトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼを発現する。これらの量はチトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ系に対する好適で効果的な基質を使用して測定される。好ましくは、上記好適な比活性は細胞全体のものであるが、該活性は例えば膜画分のような細胞の画分に見出されるものでもよい。
【００３３】
しかして、機能性チトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ系を含む菌細胞であって、チトクロムＰ４５０を発現する遺伝子作成物と上記チトクロムＰ４５０とは別個にチトクロムＰ４５０レダクターゼを発現する遺伝子作成物を含み、上記チトクロムＰ４５０と上記チトクロムＰ４５０レダクターゼが上記細胞内において機能的にカップリングする菌細胞が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
「チトクロムＰ４５０」には、ヘムのＦｅ(ＩＩ)のＣＯ付加物の形成により還元ＣＯ差スペクトルにおいて４５０ｎｍ±５ｎｍの領域に吸収極大を示すあらゆるヘム含有ポリペプチドが含まれる。
【００３５】
如何なるチトクロムＰ４５０についても本発明を実施することができると考えられる。
【００３６】
チトクロムＰ４５０は、好適には、真核生物のチトクロムＰ４５０である。より好ましくは、チトクロムＰ４５０は哺乳動物チトクロムＰ４５０であり、更により好ましくはチトクロムＰ４５０はヒトのチトクロムＰ４５０である。
【００３７】
非常に多くの真核生物のチトクロムＰ４５０のｃＤＮＡ、特に哺乳動物のチトクロムＰ４５０のｃＤＮＡを含む非常に多数のチトクロムＰ４５０のｃＤＮＡ又は遺伝子がクローン化されている。例えば、出典明示によりここに取込まれる非特許文献７には、既知のチトクロムＰ４５０のｃＤＮＡと遺伝子が列挙され、配列相同性とある程度は染色体局在化に基づいて遺伝子ファミリー及びサブファミリーに分類されている。チトクロムＰ４５０の配列の詳細はまたワールドワイドウェブサイトhttp://drnelson.utmem.edu./homepage.htmlで入手できる。
【００３８】
これらのチトクロムＰ４５０のｃＤＮＡと遺伝子は、従来から周知のクローニング法を使用して即座に得ることができ、その方法の幾つかは以下と例えばSambrookほか（(1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring House, New York）に記載されている。
【００３９】
チトクロムＰ４５０はチトクロムＰ４５０のＣＹＰ１、ＣＹＰ２、ＣＹＰ３又はＣＹＰ４ファミリーの何れかのメンバーであれば特に好適である。チトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ系は生体異物を代謝するものであれば尚更好ましい。
【００４０】
チトクロムＰ４５０ファミリーＣＹＰ１、ＣＹＰ２及びＣＹＰ３の少なくとも幾つかのメンバーは例えば治療薬のような生体異物化合物の代謝に関与している。チトクロムＰ４５０のＣＹＰ１ファミリーのメンバーは、例えばカフェイン、ベンズフェタミン、フェナセチン、テオフィリン、アセトアミノフェン、アンチピリン、２-ヒドロキシエストラジオール、イミプラミン、タモキシフェン及びゾキサゾラミンの代謝に関与する。チトクロムＣＹＰ２ファミリーのメンバーは、例えばテストステロン、アフラトキシン、ベンズフェタミン、シクロホスファミド、ヘキソバルビタール、６-アミノクリセン、レチノール、トルブタミド（メチル）、フェニトイン、Ｓ-ワルファリン、ティエニル酸、ジアゼパム、プロパナロール、アミトリプチリン、ブフラロール、ブプラノロール、クロザピン、コデイン、デブリソキン、デシプラミン、デキストロモルファン、エチルモルヒネ、フレカイニド、ハロペリドール、リドカイン、ノルトリプチリン、プロパノロール、スパルテイン、タキソール、テトラヒドロカナビノール、プロゲステロン及びメフェニトインの代謝に関与する。
【００４１】
チトクロムＣＹＰ３ファミリーのメンバーは、例えばロバスタチン、ニフェジピン、タキソール、テニポシド、テストステロン、ベラパミル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ベンズフェタミン、コルチソル、シクロスポリンＡ及びＧ、ジアゼパム、ジヒドロエルゴタミン、エストラジオール、エチニルエストラジオール、イミプラミン及びリドカインの代謝に関与する。
【００４２】
より好ましくは、チトクロムＰ４５０はＰ４５０類のＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ２Ｄ９及びＣＹＰ２Ｃ９の何れかである。
【００４３】
簡便には、チトクロムＰ４５０は、そのＮ末端の適合化は別にして、天然のチトクロムＰ４５０と同じポリペプチド配列から本質的になる。しかしながら、「チトクロムＰ４５０」という用語は、天然チトクロムＰ４５０に対する修飾、例えば天然チトクロムＰ４５０に存在しうる任意の疎水性Ｎ末端部分の長さ又は他の性質を変更する修飾又は天然チトクロムＰ４５０と比較してチトクロムＰ４５０の基質特異性を変更する修飾、例えば単一又は多点突然変異又は欠失のような修飾を特に含む。
【００４４】
「チトクロムＰ４５０レダクターゼ」には、ＮＡＤＰＨからチトクロムＰ４５０に電子を移動させることができるあらゆるＮＡＤＰＨ-チトクロムＰ４５０オキシドレダクターゼが含まれる。哺乳動物のチトクロムＰ４５０レダクターゼはＦＭＨ及びＦＡＤ補欠分子族を一つずつ含む。チトクロムＰ４５０レダクターゼは、菌細胞中に発現されたチトクロムＰ４５０と同じ種から由来するのが好ましい。チトクロムＰ４５０レダクターゼは、哺乳動物のチトクロムＰ４５０レダクターゼであれば特に好ましい。ラット又はヒトのチトクロムＰ４５０レダクターゼが特に好ましい。ヒトのチトクロムＰ４５０レダクターゼｃＤＮＡは、非特許文献６に記載されている。ラットのチトクロムＰ４５０レダクターゼｃＤＮＡは、Porterほか（(1990) Biochemistry 29, 9814-9818）に記載されている。
【００４５】
チトクロムＰ４５０レダクターゼのｃＤＮＡと遺伝子は従来から公知のクローニング法を用いて即座に得ることができ、その方法の幾つかは以下に記載する。
【００４６】
簡便には、チトクロムＰ４５０レダクターゼは、そのＮ末端の適合化は別にして、天然チトクロムＰ４５０レダクターゼと同じポリペプチド配列から本質的になる。しかしながら、「チトクロムＰ４５０レダクターゼ」という用語には、天然チトクロムＰ４５０に対する修飾、例えば補助因子結合を変更する単一又は多点突然変異又は欠失を特に含む。
【００４７】
チトクロムＰ４５０がヒトのチトクロムＰ４５０である場合、チトクロムＰ４５０レダクターゼはヒトのチトクロムＰ４５０レダクターゼであるのが好ましい。
【００４８】
「機能性チトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ系」とは、チトクロムＰ４５０とチトクロムＰ４５０レダクターゼが菌細胞においてひとたび発現されれば、十分な補助因子、例えばＮＡＤＰＨ及び酸素が存在すると仮定して、上記チトクロムＰ４５０と上記チトクロムＰ４５０レダクターゼが存在するために、該細胞がチトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ系の基質を生成物に転換することができることを意味する。
【００４９】
「細胞内における上記チトクロムＰ４５０と上記チトクロムＰ４５０レダクターゼの機能性カップリング」とは、チトクロムＰ４５０レダクターゼが、直接的であれ間接的であれ、触媒作用中にチトクロムＰ４５０に電子を供与することができるように、チトクロムＰ４５０とチトクロムＰ４５０レダクターゼが細胞内において隣接させられることを意味する。チトクロムＰ４５０のＮ末端又はチトクロムＰ４５０レダクターゼのＮ末端の適合化は、単に、細胞内における上記チトクロムＰ４５０と上記チトクロムＰ４５０レダクターゼの機能発現とカップリングを可能にするものである。適合化はチトクロムＰ４５０とチトクロムＰ４５０レダクターゼの隣接化を助けるものとすることができる。
【００５０】
「細胞内」には、特に、機能性カップリングが、細胞膜周辺腔を含む細胞の任意の膜又は区画もしくは周辺質に伴う任意の膜内又はこれに関連して生じることが含まれる。
チトクロムＰ４５０を最適に発現する菌細胞の培養のチトクロムＰ４５０量は、少なくとも１００nmol/l培養（細胞全体）、好ましくは少なくとも１５０nmol/l培養（細胞全体）、より好ましくは少なくとも約２５０nmol/l培養（細胞全体）、更により好ましくは約５００nmol/l培養（細胞全体）、最も好ましくは約１０００nmol/lであることが好ましい。典型的には、チトクロムＰ４５０量は約２００nmol/l培養（細胞全体）である。
【００５１】
上記チトクロムＰ４５０と上記チトクロムＰ４５０レダクターゼの機能性カップリングを可能にするチトクロムＰ４５０とチトクロムＰ４５０レダクターゼの各Ｎ末端の適合化を以下に議論する。
【００５２】
必須ではないが、チトクロムＰ４５０又はチトクロムＰ４５０レダクターゼがそれ自身のＮ末端配列を保持し、例えば以下に議論するシグナルペプチドのような更なる部分がチトクロムＰ４５０又はチトクロムＰ４５０レダクターゼ又は双方のＮ末端に付加されることが好ましい。
【００５３】
如何なる好気性又は通性の嫌気性菌細胞も適切であると考えられるけれども、菌細胞はグラム陰性であるのが好ましく、また菌細胞は腸内細菌科の細菌、例えば大腸菌の細胞であるのが好ましい。大腸菌に最も密接に関連する腸内細菌は、サルモネラ属と赤痢菌属由来のものであり、やや密接に関連するものはエンテロバクター属、セラチア属、プロテウス属及びエルウィニア（Erwinia）属である。大腸菌とネズミチフス菌が本発明に対して最も好適な菌宿主細胞である。大腸菌株Ｋ１２が最も好ましい。大腸菌Ｋ１２は非病原性である標準的実験用菌株であるからである。
【００５４】
ある種のチトクロムＰ４５０基質は、チトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ系により作用せしめられるために菌細胞中に浸透することができるが、本発明の菌細胞は、基質への浸透性が増大したもの、もしくは菌細胞を適切な培地に配したときに基質により浸透するようになるものであるのが好ましい。加えて、あるいは代わりに、菌細胞が、基質の膜浸透を容易にするように膜の性質を変化させたものか、性質を変化させることができる膜であれば、より好ましい。例えば、大腸菌のtolＣ突然変異体は、野生型大腸菌よりもより浸透性の膜を有しており（Chatterjee (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 8950-8954）、ネズミチフス菌株のＴＡ系列は深部ラフ型変異により浸透性が増大していて、変異原性試験に頻繁に用いられている（例えば、Simulaほか(1993) Carcinogenesis 14, 1371-1376 を参照）。ネズミチフス菌ＴＡ９７、９８、１００及び１０２並びにＴＡ１５３５及びＴＡ１５３８は医薬産業において薬物安全性評価の際の変異原性試験に用いられている。これらと他の適切な菌株を用いる本発明は、これらがヒト化変異原性系を提供し代謝活性化系としてげっ歯類肝臓抽出物（げっ歯類肝臓由来のＳ９画分）に依存しないので、これらの手順を改善する可能性がある。本発明に基づく系は、代謝活性化系と変異原性の標的、すなわちＤＮＡが同じ細胞内にあり、標準的なエイムス試験におけるように物理的に分離した実体ではないという利点も有する。このことは、短命な代謝物がより良く検出され、反応性代謝物がそのＤＮＡ標的まで到達するのを膜障壁が妨げないという利点を有している。このことと本発明の他の観点は、以下に更に詳細に議論する。
【００５５】
細胞は、適当な環境中に配することによりより浸透性にできるものがまた好ましい。適切な多くの緩衝液系があるが、発現段階に続いて菌細胞、特に大腸菌細胞がトリス-スクロース-ＥＤＴＡすなわちＴＳＥ中に再懸濁されるのが好ましい。ＴＳＥは５０ｍＭのトリスアセテート（ｐＨ７．６）、０．２５Ｍのスクロース、０．２５ｍＭのＥＤＴＡである。これにより、細胞の浸透性を幾つかの方法で増大させることができる。第１に、最初に二倍に強めた緩衝液中に細胞を再懸濁させ、ついで等しい容量の水で速やかに希釈する。これは、瞬間的に外膜を破壊することにより、周辺質タンパクを放出させるという効果を有する。第２に、ＥＤＴＡは浸透性に直接影響を及ぼすことが知られており、細胞をある種の疎水性薬剤に対してより敏感にすることができる。第３に、緩衝液中のトリスは、外膜におけるリポ多糖の構造に影響を与えることができ、再び浸透性を変える。大腸菌とネズミチフス菌の外膜の浸透性を増加させるための更に詳細な方法は、NikaidoとVaara（(1987) pp.7-22 "Escherichia coli and Salmonella typhimurium. Cellular and Molecular Biology" Vol. 1, F.C. Neidhardt編, Am. Soc. Microbiol., Washington DC）に与えられている。
【００５６】
有利には、特に菌細胞がバイオリアクターに用いられるとき、細胞は溶剤耐性を有する。溶剤耐性の大腸菌細胞は、例えばFerranteほか（(1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 7617-7621）により従来から知られている。
【００５７】
チトクロムＰ４５０レダクターゼは菌細胞の細胞区画又は膜にチトクロムＰ４５０レダクターゼを方向付けるＮ末端部分を含むのが好ましい。特に、上記Ｎ末端部分がチトクロムＰ４５０レダクターゼを膜に方向付けるのが好ましい。
【００５８】
チトクロムＰ４５０とチトクロムＰ４５０レダクターゼは菌細胞中の膜と結合するのが好ましい。特に、チトクロムＰ４５０とチトクロムＰ４５０レダクターゼは、細菌の内膜（特に大腸菌とネズミチフス菌の場合）に、その活性部位を細胞質に位置させて結合しているのが好ましい。
【００５９】
一つの好適な実施態様では、Ｎ末端部分は細菌タンパクのＮ末端部分から由来したあるいは該部分に基づくもので、上記細菌タンパクが細胞膜周辺腔に方向付けされているもの、あるいは菌細胞から分泌されることになるものである。例えば、ompＡ、pelＢ、malＥ又はphoＡ遺伝子によりコード化されている大腸菌タンパクはそのような細菌タンパクである。Ｎ末端部分の存在により、チトクロムＰ４５０又はチトクロムＰ４５０レダクターゼの正しい折畳みが助けられるのが望ましい。
【００６０】
細菌タンパクを通常周辺質中に方向付ける細菌のリーダー配列又はシグナルペプチドは、これまでは、結果として生じる融合タンパク質を周辺質の酸化環境に搬出する目的で、二三の哺乳動物タンパク質のＮ末端に融合されている。従って、そのような細菌のリーダー配列又はシグナルペプチドは、例えば免疫グロブリン又はその断片のような哺乳動物の分泌タンパク質の発現において使用されている。これに対して、哺乳動物の異物代謝チトクロムＰ４５０類は、天然の小胞体中に見出される場合、通常は還元環境にさらされる。
【００６１】
従って、特に好適な実施態様は、Ｎ末端部分がompＡ、pelＢ、malＥ又はphoＡシグナルペプチド又はリーダー配列あるいはその機能的に等価な変異体の何れかを含有するものである。
【００６２】
「その機能的に等価な変異体」には、天然の上記細菌タンパク中に存在しているならば、天然のシグナルペプチドと同じ細胞位置に上記タンパク質を方向付けるあらゆるペプチド配列が含まれる。
【００６３】
チトクロムＰ４５０とチトクロムＰ４５０レダクターゼのそれぞれのＮ末端部分がシグナルペプチド又はシグナルペプチド様Ｎ末端部分であれば好ましい。
【００６４】
特に、Ｎ末端部分が、一般的分泌経路に対してompＡリーダーと競合するか、シグナル認識粒子とトリガー因子を含むシグナル認識機構に対してompＡと競合するものが好ましい。
【００６５】
一般的分泌経路とその成分は、出典明示によりここに取込まれるPugsley（(1993) Microbiol. Rev 57, 50-108）に記載され、シグナル認識粒子とトリガー因子は、出典明示によりここに取込まれるValentほか（(1995) EMBO J. 14, 5494-5505）に記載されている。ompＡシグナルペプチドと推定シグナルペプチドの間の競合アッセイは、PugsleyとValentほかの教示を用いる従来公知の方法を使用して実施することができる。
【００６６】
pelＢリーダー配列は、ＭＫＹＬＬＰＴＡＡＡＧＬＬＬＬＡＡＱＰＡＭＡ（配列番号１）なるアミノ酸配列からなる。
【００６７】
ompＡリーダー配列は、ＭＫＫＴＡＩＡＩＡＶＡＬＡＧＦＡＴＶＡＱＡ（配列番号２）なるアミノ酸配列からなる。
【００６８】
シグナルペプチドは、ある種の認識できる共通の特徴を有しており、これは、Heijne（(1986) Nucl Acids Res 14, 4683-4690）、Gierasch（(1989) Biochemistry 28, 923-930）及び"Escherichia coli and Salmonella typhimurium Cellular and Molecular Biology"（Vol. 1, F.C. Neidhardt編, Am. Soc. Microbiol, Washington DC）の周辺質とタンパク質分泌に関する Oliverの章（1987, pp56-69）に詳細が記されている。第１に、可変長のＮ末端の正味の正荷電領域（ｎ領域）がある。これには１０±３のアミノ酸の疎水性コア（ｈ領域）が続き、これはロイシン、アラニン、メチオニン、バリン、イソロイシン、フェニルアラニン及びトリプトファン残基に富む。最後に、典型的には５−７のアミノ酸のｃ領域があり、これはｈ領域のものより一般に僅かに極性が強い。このｃ領域における最も重要なアミノ酸はシグナル切断部位に対して３位と１位にあるもの（「-３、-１ルール」）であり、これらの位置に存在しうる可能なアミノ酸には厳しい制約があるようである：すなわち、短い側鎖のものだけが許容される。従って、アラニン、グリシン、ロイシン、セリン、スレオニン及びバリンのみが３位に見出され（アラニンが強く好まれる）、アラニン、グリシン、セリン及びスレオニンが１位に見出される（アラニンがまた最も強く好まれる）。証拠は、このシグナルプロセシング領域におけるβターン形成がシグナル切断が生じるために重要であることを示唆している（例えば、Barkocy-Gallagherほか(1994) J Biol Chem 269, 13609-13613及びDuffaudとInouye(1988) J Biol Chem 263, 10224-10228を参照）。
【００６９】
シグナルペプチド切断が生じるのが好ましい。従って、シグナルペプチド、すなわち発現されるタンパク質の直ぐ下流の適切なアミノ酸配列が含まれていると、これが尚「切断部位」の一部を形成するので、好ましい。例えば、＋１位のプロリンはシグナル除去を阻害する（Barkocy-Gallagherほか(1992) J. Biol. Chem. 267, 1231-1238）。例としてompＡを用いると、完全な切断を確実にするには、それが望ましいならば、作成物において成熟ompＡタンパクの、ompＡリーダーの直ぐ後とＰ４５０又はレダクターゼ配列の直ぐ前の最初の二三のアミノ酸が含まれる。シグナルペプチド切断は、特定のシグナルペプチダーゼ酵素、例えばシグナルペプチダーゼＩにより引き起こされる。好適な実施態様では、シグナルペプチダーゼＩは菌細胞（例えば大腸菌）において過剰生産され、望まれるならばシグナルペプチドの切断を助ける（Dijlほか(1991) Mol. Gen. Genet. 227, 40-48を参照）。
【００７０】
成熟ompＡタンパクの最初の二つのアミノ酸（すなわち、ＡlaＰro）がompＡシグナルペプチドの直ぐ下流でＰ４５０のＮ末端の前に挿入されるのが特に好ましい。
【００７１】
シグナルペプチド切断の確率を増大させる他の好適な可能性はシグナルペプチドとＰ４５０との間に短いリンカー配列を導入することであり、あるいは異なる株における発現により、例えばＤＨ５αにおける発現と比較して、シグナルペプチドの切断が増加したり減少したりする。
【００７２】
従って、Ｎ末端部分は、その天然のポリペプチド中に存在するとき、膜挿入と細胞膜周辺腔中への細胞質膜を通過しての天然のポリペプチドの搬出を媒介する機能を有するシグナルペプチドであることが好ましいことが分る。リーダー配列又はシグナルペプチドの配列は通常は４０までのアミノ酸残基である。リーダーはその機能的性質を変更しないで修飾することができると考えられる。
【００７３】
本発明の更なる実施態様では、チトクロムＰ４５０が菌細胞の細胞区画又は膜にチトクロムＰ４５０を方向付けるＮ末端部分を含むのが好適である。特に、上記Ｎ末端部分がチトクロムＰ４５０を膜に方向付けるのが好ましい。
【００７４】
この実施態様の好適なＮ末端部分はチトクロムＰ４５０レダクターゼの好適なＮ末端部分と同じである。チトクロムＰ４５０のＮ末端部分は、ompＡ、pelＢ、malＥ又はphoＡシグナルペプチド又はリーダー配列あるいはその機能的に等価な変異体の何れかを含むのが特に好ましい。ompＡシグナルペプチドが特に好ましい。
【００７５】
更なる特に好適な実施態様では、チトクロムＰ４５０のＮ末端部分とチトクロムＰ４５０レダクターゼのＮ末端部分のそれぞれが、上記チトクロムＰ４５０又はチトクロムＰ４５０レダクターゼを同じ細胞区画又は膜に方向付ける。これは、細胞内における上記チトクロムｐ４５０と上記チトクロムＰ４５０レダクターゼの機能性カップリングを増大させあるいは改善するので、特に有利である。チトクロムＰ４５０とチトクロムＰ４５０レダクターゼが、細菌の細胞質ＮＡＤＰＨプールへのアクセスが得られる内膜の細胞質側に方向付けられるのが特に好ましい。
【００７６】
更に好ましくは、チトクロムＰ４５０のＮ末端部分はチトクロムＰ４５０レダクターゼのＮ末端部分と実質的に同じである。
【００７７】
更なる実施態様では、チトクロムＰ４５０は、上記菌細胞中における上記チトクロムＰ４５０の翻訳性を増大させるか折畳みを修正するように適合化されたＮ末端部分を含む。
【００７８】
好ましくは、チトクロムＰ４５０は、その天然配列と比較して、そのＮ末端において修飾される。
【００７９】
「翻訳性」とは、与えられたＲＮＡ分子をポリペプチドに翻訳することができる効率を意味する。
【００８０】
翻訳性を改善する最適化ＣＹＰ３Ａ４配列の幾つかの特徴がある。
【００８１】
これらの特徴は次のものを含む：
１． 大腸菌に好適に適合するように変えられた第２コドン（しばしばアラニンをコードしているＧＣＴ）。これは、Loomanほか（(1987) EMBO J 6, 2489-2492）により証明されている。
【００８２】
２． 開始コドンの廻りのｍＲＮＡ２次構造に対する潜在性を最小化するために、（可能な場合には）Ａ及びＴ残基に富むようにされたコドン４と５。リボソーム結合部位と開始コドンの廻りのｍＲＮＡ構造の最小化は、「翻訳性」に大きな影響を有し得る（例えばWangほか(1995) Protein Expr Purif 6, 284-290を参照）。
【００８３】
リーダー配列の使用に関し、主な利点は、それらが細菌遺伝子から由来しているので、その性質上、細菌の発現に対して既に「最適化」されていることである。これはしばしば例えば上述の二つの特徴を有しており、双方のpelＢとompＡリーダーは第２コドンとしてＡＡＡ（Ｌys）を含み、このコドンは「翻訳性」についてLoomanほかの文献では最良の性能の第２コドンであった。加えて、これらは、リボソーム結合部位と開始コドンの廻りの２次構造を減少させた（例えば、ompＡ遺伝子構造についてMovvaほか(1980) J Mol Biol 143, 317-328を参照）。
【００８４】
Ｎ末端シグナルペプチド融合を用いる更なる利点は、Ｐ４５０またはレダクターゼのｃＤＮＡにおける希なコドンのあらゆる影響を最小化することに関する。例えば、ＡＧＡ／ＡＧＧコドンは大腸菌において最も希に用いられるものであり（ChenとInoue(1990) Nucl Acids Res 18, 1465-1473）、対応する荷電ｔＲＮＡ分子の限られた利用性の結果、翻訳を遅延させる。しかし、そのような希なコドンのマイナスの効果は開始コドンからの距離が増加するにつれて減少する（Chen とInoue、上掲）。Ｐ４５０（又はレダクターゼ）のＮ末端に「最適化」された細菌リーダー配列（典型的には２０−２５のアミノ酸長さ）を付加することにより、Ｐ４５０のｃＤＮＡの５'末端に近い任意の希なコドンが、開始コドンから更に遠くに離れるように移動され、従って影響は更に少ない。
【００８５】
従って、「翻訳性」を次の一又は複数の手段により改良するのが好ましい：
１． Ｐ４５０又はレダクターゼのｃＤＮＡから希なコドン（上掲のChenとInoue参照）、例えばＡＧＧ／ＡＧＡ（アルギニン）、ＣＵＡ（ロイシン）、ＡＵＡ（イソロイシン）、ＣＣＣ（プロリン）、及びＧＧＡ／ＧＧＧ（グリシン））を除去、特に開始コドンから２５−３０コドン未満のものを除去すること。
【００８６】
２． 上記の代わりに、あるいは上記と共に、希なｔＲＮＡシンターゼをコードしている遺伝子、例えばＡＧＧ／ＡＧＡに対するdnaＹ遺伝子を導入すること。
【００８７】
３． 大腸菌の好適性を反映させるためにＤＮＡ配列について他の変更を行うこと、例えばコドン対の非ランダム的利用（GutmanとHatfield(1989) Proc Natl Acad Sci USA 86, 3699-3703）。
【００８８】
４． 二次構造の潜在性を最小化しリボソーム結合部位と開始コドンの間の距離を最適化するために発現ベクター内におけるプロモーター／リボソーム結合部位を変化させること（上掲のWangほか(1995)参照）。
【００８９】
チトクロムＰ４５０が米国特許第５２４０８３１号に従って、あるいは非特許文献２５の一般的な方法によって、修飾されたＮ末端を有するのがまた好適であり、これら双方の文献を出典明示によりここに取込む。
【００９０】
本発明の菌細胞はチトクロムＰ４５０を発現し得る遺伝子作成物とチトクロムＰ４５０レダクターゼを発現し得る遺伝子作成物を含有する。
【００９１】
簡便には、細胞は、チトクロムＰ４５０とチトクロムＰ４５０レダクターゼの双方を発現し得る一つの遺伝子作成物を含むことができ、あるいはチトクロムＰ４５０及びチトクロムＰ４５０レダクターゼを別の遺伝子作成物から発現させることができる。
【００９２】
遺伝子作成物はＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。ＤＮＡが好ましい。
【００９３】
遺伝子作成物は、典型的には例えばプラスミド又はバクテリオファージゲノムのような染色体外遺伝因子であるが、「遺伝子作成物」という用語は、特に遺伝子作成物が細菌の染色体の一部であり得ることを含む。例えば、遺伝子作成物は細菌染色体を溶原化したバクテリオファージの一部であり得る。
【００９４】
遺伝子作成物は菌細胞におけるチトクロムＰ４５０又はチトクロムＰ４５０レダクターゼの発現に必要である遺伝因子を含む。
【００９５】
菌細胞における転写と翻訳に必要な因子には、プロモーター、リボソーム結合部位、チトクロムＰ４５０又はチトクロムＰ４５０レダクターゼの翻訳領域が含まれる。
【００９６】
プロモーターについては、選択された菌細胞において機能性がある実質的に全てのプロモーターを用いることができると考えられる。しかし、好適なプロモーターには、lac、lacＵＶ５、tac、trc、λＰＬ、Ｔ７、lpp、lpp-lac又はＴ３プロモーターが含まれる。もちろん、λＰＬ、Ｔ７及びＴ３プロモーターはバクテリオファージ由来のものであり、大腸菌のような細菌において機能性を有することが知られている。
【００９７】
調節可能なプロモーター、例えばlacプロモーターの使用が好ましい。例えばＴ７プロモーターのような強いプロモーターは用いないのが好ましい。
【００９８】
細菌の発現をなすのに適切なリボソーム結合部位を、真核生物のチトクロムＰ４５０領域含有遺伝子中に含有せしめることがしばしば望まれる。しばしば、リボソーム結合部位とプロモーターは、所望の因子を含有し、その二つの末端に有用な制限酵素認識部位を有する近接した予め製作されたＤＮＡセグメントとして定義される「カセット」として導入することができ、簡単な遺伝子操作により所望のチトクロムＰ４５０遺伝子又はｃＤＮＡあるいはチトクロムＰ４５０レダクターゼ内の適切な点に即座に挿入される。
【００９９】
最も簡便には、相同系由来のプロモーターとリボソーム結合部位、例えばｌａｃプロモーターとその随伴ＲＢＳを単に用いることが望ましい。しかし、一般には、任意の有効な細菌リボソーム結合部位を用いることが提案され、大腸菌、λ、Ｔ７又はＴ３由来のＲＢＳが好ましい。更により好ましいリボソーム結合部位は、Ｔ７遺伝子１０、又は大腸菌lacＡ、lacＺ、trpＡ、trpＢ、trpＣ、trpＤ、trpＥ、trpＬ、trpＲ又はtrpＳ遺伝子由来のものである。特に好適なリボソーム結合部位とスペーサー領域は、５'-ＡＧＧＡＧＧＴＣＡＴ-３'（配列番号３）を含み、ここで下線部分はリボソーム結合部位であり、隣接するＣＡＴ配列はスペーサー領域である。（スペーサー領域はリボソーム部位とＡＴＧ開始コドンの間の配列である。）
典型的には、ＤＮＡをＲＮＡに転写する酵素である、細菌ＲＮＡポリメラーゼの機能を終結させる機能を果たす適当な細菌の転写ターミネーターを、本発明に従って調製される遺伝子中に含有させることが望ましい。機能性細菌転写ターミネーターに対する要求はかなり単純であり、ＧＣに富む二分子対称領域が先行する一連のＴ残基により通常は特徴付けられる。より好ましいターミネーターはＴＲＰ遺伝子からのもの、リボソームターミネーター、rrnＢ又はＴ７ファージからのターミネーター配列である。実際、Ｔ７ターミネーター配列は、メッセージ分解を明らかに遅延させるｍＲＮＡの３'末端にステムループ構造を持つＲＮアーゼＩＩＩ切断部位を含む。
【０１００】
遺伝子作成物は菌細胞中において増殖することができ、未来の世代に安定して伝達される。
【０１０１】
相補的な付着末端を介してベクターにＤＮＡを作用可能に連結する様々な方法が開発されている。例えば、相補的なホモポリマー路を、ベクターＤＮＡに挿入されるＤＮＡセグメントに付加することができる。ベクターとＤＮＡセグメントはついで相補的ホモポリマー尾端間に水素結合により結合されて組換えＤＮＡ分子が形成される。
【０１０２】
一又は複数の制限部位を含む合成リンカーは、ＤＮＡセグメントをベクターに結合させる代替方法を提供する。以前に記載されたようにエンドヌクレアーゼ制限消化により産生されたＤＮＡセグメントは、バクテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼ又は大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、つまりその３'-５'-ヌクレオチド鎖末端切断（exonucleolytic）活性で一本鎖突出３'末端を除去し、その重合活性で陥凹３'末端を満たす酵素で処理する。
【０１０３】
従って、これらの活性の組合せは、平滑末端ＤＮＡセグメントを産生する。ついで平滑末端セグメントは、例えばバクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼのような平滑末端ＤＮＡ分子の連結を触媒することができる酵素の存在下で過剰モルのリンカー分子と共にインキュベートされる。しかして、反応産物はその末端にポリマーリンカー配列を担持するＤＮＡセグメントである。ついでこれらのＤＮＡセグメントは適切な制限酵素で切断され、該ＤＮＡセグメントのものと適合性のある末端をつくる酵素で切断された発現ベクターに連結される。
【０１０４】
様々な制限酵素部位を含む合成リンカーは、インターナショナル・バイオテクノロジー・インク（New Haven, CN, USA）を含む多数の供給源から市販されている。
【０１０５】
本発明のポリペプチドをコードしているＤＮＡを修飾する望ましい方法は、Saikiほか（(1988) Science 239, 487-491）により開示されているようなポリメラーゼ連鎖反応を用いるものである。
【０１０６】
この方法では、酵素的に増幅されるＤＮＡには、それ自身が増幅ＤＮＡ内に組入れられた２つの特異的なオリゴヌクレオチドプライマーが隣接する。上記特異的プライマーは従来から知られている方法を用いて発現ベクター中へのクローニングに使用することができる制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むことができる。
【０１０７】
好適には、ベクターは、原核生物における増殖のための、例えばＣolＥloriのような原核生物レプリコンを含む。ベクターは、また、それと共に形質転換された大腸菌のような宿主菌細胞において遺伝子の発現（転写と翻訳）を方向付け得る、例えば原核生物プロモーターのような適切なプロモーターを含むことができる。
【０１０８】
プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合と転写を生じせしめるＤＮＡ配列により形成された発現調節領域である。代表的細菌宿主と適合性のあるプロモーター配列は、典型的には本発明のＤＮＡセグメントの挿入に好都合な制限部位を含むプラスミドベクター中に提供される。
【０１０９】
典型的な原核生物のベクタープラスミドは、バイオラッド・ラボラトリーズ（Richmond, CA, USA）から入手できるｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２及びｐＢＲ３２９と、ファーマシア（Piscataway, NJ, USA）から入手できるｐＴｒｃ９９ＡとｐＫＫ２２３-３である。
【０１１０】
本発明のＤＮＡ作成物での適当な細胞宿主の形質転換は、典型的には用いられるベクターに依存する周知の方法により達成される。宿主菌細胞の形質転換に関しては、例えば、Cohenほか（(1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110）及びSambrookほか（(1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY）を参照のこと。
【０１１１】
細胞を形質転換するには電気穿孔法もまた有用であり、菌細胞の形質転換について従来から良く知られている。
【０１１２】
例えば、多くの細菌種が、出典明示によりここに取込まれるLuchanskyほか（(1988) Mol. Microbiol. 2, 637-646）に記載されている方法により形質転換され得る。最大数の形質転換体が２５μＦＤで１ｃｍ当り６２５０Ｖを用いて２．５Ｘ ＰＥＢ中に懸濁されたＤＮＡ-細胞混合物のエレクトロポレーションにより一貫して回収される。
【０１１３】
形質転換が成功した細胞、すなわち上記チトクロムＰ４５０又はチトクロムＰ４５０レダクターゼを発現し得るＤＮＡ作成物を含む細胞は良く知られた技術により同定することができる。例えば、本発明の発現作成物の導入により得られた細胞を育成してチトクロムＰ４５０又はチトクロムＰ４５０レダクターゼを生産することができる。Southern（(1975) J. Mol. Biol. 98, 503）又はBerentほか（(1985) Biotech. 3, 208）により記載されているような方法を使用して、細胞を収集し、溶解し、そのＤＮＡ内容物についてＤＮＡの存在を検査する。あるいは、上清中のタンパク質の有無は以下に記載する抗体を用いて検出することができる。
【０１１４】
形質転換の成功は、組換えＤＮＡの存在を直接的に検定することに加えて、組換えＤＮＡがタンパク質の発現を方向付け得るときには、良く知られた免疫学的方法により確認することができる。例えば、発現ベクターでの形質転換が成功した細胞は適切な抗原性を示すタンパク質を産生する。形質転換されていると推量される細胞の試料を収集し、適当な抗体を用いてタンパク質を検定する。
【０１１５】
従って、本発明は、形質転換された宿主細胞自体に加えて、栄養培地中での、その細胞の培養、好ましくはモノクローナル（クローン的に均質）培養、又はモノクローナル培養由来の培養をまた考慮する。
【０１１６】
更なる好適な実施態様では、菌細胞はチトクロムＰ４５０又はチトクロムＰ４５０レダクターゼの正しい折畳みを助けるポリペプチド補助因子を発現し得る遺伝子作成物を更に含有する。
【０１１７】
そのようなポリペプチド補助因子の存在は、ポリペプチド補助因子の不存在下では、チトクロムＰ４５０又はチトクロムＰ４５０レダクターゼが非機能性封入体を形成しうる強いプロモーターからチトクロムＰ４５０又はチトクロムＰ４５０レダクターゼを発現するときに特に好適である。
【０１１８】
好適には、ポリペプチド補助因子は、例えばＧｒｏＥＬＳ複合体、SecＢ、SecＤ、SecＦ、ＤnaＪ／ＤnaＫ／ＧrpＥ複合体、ペプチジルプロピル-シス、トランス異性化酵素、遺伝子dsbＡ、dsbＢ、dsbＣ及びdsbＤによりコード化されているプロテインジスルフィドイソメラーゼ様タンパク質、clpＢによりコード化されている周辺質シャペロン又はチオレドキシンのようなシャペロン分子である。大腸菌において発現される外来タンパク質の溶解度は細菌チオレドキシンの同時生産により増加する（Yasukawa ほか(1995) J. Biol. Chem. 270, 25328-25331；出典明示によりここに取込む）。
【０１１９】
また、次の系又は宿主又は発現系を用いるのが有用である。
【０１２０】
１． 発現されたタンパク質（類）の分解を低減することができる大腸菌のプロテアーゼ欠乏株（例えばompＴ−、lon−、degＰ−）の使用。分泌された組換えタンパク質のタンパク分解性に影響を及ぼすあらゆる既知の座位が欠乏した一群の大腸菌株は、MeermanとGeorgion（(1994) Biotechnology 12, 1107-1110）に記載されている。
【０１２１】
２． 何れも発現を向上させる、例えばユビキチン（Bakerほか(1994) J. Biol. Chem. 269, 25381-25386）、チオレドキシン（例えばインビトロゲンのpＴrxＦusベクター）、グルタチオンＳ-トランスフェラーゼ（例えばファーマシアのｐＧＥＸベクター）又はプロテインＡ（例えばファーマシアのｐＲＩＴ２Ｔベクター）との融合タンパクとしてのＰ４５０及び／又はレダクターゼの発現。
【０１２２】
更にまた好適な実施態様では、菌細胞は、チトクロムＰ４５０とチトクロムＰ４５０レダクターゼの間の電子の伝達を助けるポリペプチド補助因子を発現し得る遺伝子作成物を更に含有する。好ましくは、上記補助因子はチトクロムｂ５又はチトクロムＰ４５０レダクターゼのＦＭＮ領域である。
【０１２３】
電子の伝達を助ける他の補助因子には、アドレノドキシン／アドレノドキシンレダクターゼ及びＮＡＤＨチトクロムｂ５レダクターゼ（チトクロムｂ５と共に）が含まれる。本発明においてはＮＡＤＰＨよりもむしろ、ＮＡＤＨから電子を取る補助因子を用いるか、あるいは特に細胞全体の代謝を取扱うときは（「バイオリアクター」）、双方の補助因子を一緒に用いることが特に有益であると信じられる。これは、大腸菌における（ＮＡＤＰ＋ＮＡＤＰＨ）に対する（ＮＡＤ＋ＮＡＤＨ）の細胞内比率が約４：１であるためである。従って、還元等価物がＮＡＤＰＨよりもＮＡＤＨであるならば、Ｐ４５０還元（従って酵素活性）に対して遥かに大なる可能性がある。この点に関して、本発明は、細胞全体における酵素活性を増大させる手段として、細胞質プールにおけるＮＡＤＨ及び／又はＮＡＤＰＨの増大に至らせる付加又は修飾を含む。これは、細胞外媒質（取込み機構が存在するもの、例えばニコチンアミド）に対する前駆物質の付加、あるいはＮＡＤＰＨを破壊する酵素の阻害を含む。
【０１２４】
チトクロムＰ４５０レダクターゼのＦＭＮ領域は、非特許文献６に記載されているように発現させることができ、チトクロムｂ５はHolmansほか（(1994) Arch. Biochem. Biophys. 312, 554-565）に記載されているように発現させることができる。チトクロムＰ４５０がＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ３Ａ７、ＣＹＰ２Ｅ１及びＣＹＰ１Ａ１の何れかである場合、電子の伝達を助けるポリペプチド補助因子が含まれるのが好ましい。チトクロムｂ５がＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ３Ａ７又はＣＹＰ２Ｅ１の何れかと同時発現されるのが特に好ましい。
【０１２５】
また、ＦＭＮ領域がＣＹＰ１Ａ１と同時発現されるのが、特に好ましい。
【０１２６】
ある場合において、上記補助因子は菌細胞の細胞区画又は膜に補助因子を方向付けるＮ末端部分を含むことができると予想されるが、菌細胞において発現される場合、チトクロムｂ５又はチトクロムＰ４５０レダクターゼのＦＭＮ領域にそのような修飾を行わないのが好ましい。
【０１２７】
更なる実施態様は、チトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ系により触媒される反応の生成物を代謝し得る任意の酵素を発現し得る遺伝子作成物を更に含有する本発明の菌細胞からなる。
【０１２８】
真核生物、特に哺乳動物の細胞又は動物、特に哺乳動物からの器官による化合物の代謝を模倣しようとするには、本発明の菌細胞において、真核細胞又は動物においてチトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ系の産物を更に代謝し得る一又は複数の更なるポリペプチドを発現することが望ましい。これは、本発明の菌細胞が変異原性試験のためあるいは薬物代謝モデルとして使用される場合に特に有益である。
【０１２９】
簡便には、酵素は、グルタチオンＳ-トランスフェラーゼ、エポキシドヒドラーゼ又はＵＤＰ-グルクロノシルトランスフェラーゼの何れかである。他の酵素には、スルホトランスフェラーゼ、Ｎ-アセチルトランスフェラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、γ-グルタミルトランスペプチダーゼ、システイン抱合β-リアーゼ、メチルトランスフェラーゼ、チオールトランスフェラーゼ、ＤＴ-ジアフォラーゼ、キノンレダクターゼ又はグリオキサラーゼが含まれる。
【０１３０】
幾つかの遺伝子作成物、例えばチトクロムＰ４５０とチトクロムＰ４５０レダクターゼ、そして時にはチトクロムｂ５又はチトクロムＰ４５０レダクターゼのＦＭＮ領域あるいは更なる酵素を発現する作成物は同じ菌細胞中に存在し得るので、その染色体中に取込まれる一つ又は複数の遺伝子作成物を有する菌株が提供されるのが好都合であり、これらの菌株を更なる遺伝因子の導入に対する「マスター」株として用いることができることが理解される。例えば、細菌「マスター」株が細菌染色体中に組込まれたチトクロムＰ４５０レダクターゼ遺伝子作成物を含有するのが特に好ましい。また、細菌「マスター」株は、細菌染色体からチトクロムＰ４５０レダクターゼとチトクロムｂ５の双方を発現する遺伝子作成物又は作成物類を含有するのが好ましい。これらの「マスター」株はついでチトクロムＰ４５０を発現し得る遺伝子作成物で形質転換される。
【０１３１】
本発明の更なる観点では、本発明の第１の観点の細胞を培養する方法が提供される。任意の適切な培地を使用することができる。栄養分に富むブロス、例えばテリフィックブロスを用いるのが好ましい。また、培地はヘム合成を助ける化合物を含んでいるのが好ましい。δ-アミノレブリン酸（ＡＬＡ）が特に好ましい。
【０１３２】
菌細胞が二つ又はそれ以上の遺伝子作成物を含む本発明の全ての形態において、それら遺伝子作成物は同じ菌細胞において相互に適合性があると認識される。一般に、染色体に組込まれる遺伝子作成物は相互に適合性があり、２つの遺伝子作成物は、一方が染色体に組込まれ、他方がプラスミドのような自己レプリコンであるとき通常互いに適合性がある。一般に、本発明の遺伝子作成物を構成する同じ細胞を持たない２つ又はそれ以上の異なるプラスミドがあるとき、それらが適合性のあるプラスミド、例えば異なる複製起点を有するプラスミドであるのが望ましい。異なるプラスミドが、菌細胞が培地で育成させられるときに該異なるプラスミドの全てを選択できるように、異なる抗生物質耐性遺伝子をコード化するのがまた望ましい。
【０１３３】
本発明の第２の観点では、チトクロムＰ４５０の基質を製品に転換する方法であって、本発明の第１の観点に係る菌細胞と上記基質を混合することを含み、上記細胞が上記基質を転換することができる機能性チトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ系を含む方法が提供される。
【０１３４】
本発明の第３の観点では、チトクロムＰ４５０の基質を製品に転換するための本発明の第１の観点に係る菌細胞の用途が提供される。
【０１３５】
本発明の菌細胞、特に機能性チトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ系を発現する本発明の第１の観点の細胞は、多くの技術分野において用途が見出せる。
【０１３６】
次は、本発明の菌細胞が用いられる幾つかの特定の用途であるが、例えば、チトクロムＰ４５０基質を生成物に転換することが望まれる場合のように、他にも多くの用途があることが思料される。
【０１３７】
ａ）薬物開発と薬物試験
安全な新薬を市場にもたらすことは費用がかかり、複雑でありかつ時間がかかる。薬物動態学的パラメータ、薬物／薬物相互作用及び毒性に関する市場製品の効果と安全性は、薬物開発に用いられるモデルに大きく依存する。リード化合物の欠点が開発の最も早期の段階で予測できるならば薬物開発において大きな進歩が達成できる。
【０１３８】
ヒトに対する動物モデルからの薬物毒性学的データの外挿には深刻な問題がある。これらはしばしば、大抵の治療薬の薬理学的かつ毒性学的性質を決定する薬物代謝酵素の触媒特性の種による顕著な差のためである。
【０１３９】
本発明の一部を構成し機能性Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ系を発現する菌細胞、特に大腸菌とネズミチフス菌細胞は、ヒトの薬物代謝を模倣する理想的なモデルであり、酵母及び哺乳動物細胞に基づくモデルよりも取扱いが容易である。これらの細胞は、最適化された薬物代謝特性に関して薬物の高処理スクリーニング系を可能にする。この問題は、数百の化合物の薬物代謝特性の評価を短時間で行うことが必要となるコンビナトリアル化学ライブラリーの出現で特に重要となる。
【０１４０】
この実施態様では、菌細胞がここに記載した他の薬物代謝酵素もまた発現するのが有用である。
【０１４１】
ｂ）バイオリアクター
本発明の菌細胞は、Ｐ４５０類により触媒される酸化反応の高い基質、位置及びステレオ選択性のために、ファイン又はバルク化学薬品の合成及び化学反応中間物の合成に有用である。
【０１４２】
この実施態様では、適切な基質特異性を有するチトクロムＰ４５０を発現する本発明の菌細胞が選ばれることは明らかである。多くのチトクロムＰ４５０類の基質特異性は従来から知られており、従って適切なチトクロムＰ４５０が即座に選択できる。しかし、多くのチトクロムＰ４５０遺伝子が見出されるので、本発明においてそれらを用いることができ、実際新規なチトクロムＰ４５０を発現する本発明の菌細胞をその基質特異性を決定するために使用することができる。
【０１４３】
あるチトクロムＰ４５０類はアルカンをアルコールに、又は芳香族化合物をフェノール化合物に転換することができるので、本発明の菌細胞はそのようなアルコールとフェノール化合物が必要とされるバルク化学工業において有用であると認められる。しかし、チトクロムＰ４５０類により触媒される反応の多くは、複合構造の選択的酸化（ヒドロキシル化を含む）がしばしば必要となるファイン化学工業及び医薬産業において本発明の細胞が有用なものとなる。本発明の細胞はステロイドホルモン類とその類似体の合成に特に適していると思料される。
【０１４４】
ｃ）生体触媒反応
本発明において開発された系により、部位特異的変異誘発により産生されるＰ４５０変異体の迅速な機能性試験が可能になる。従って、改良された触媒特性を持つ新規なＰ４５０類を短時間で産生することができる。
【０１４５】
ｄ）バイオ及び化学センサー
本発明の菌細胞はバイオ又は化学センサーとしても有用である。特に、細胞から単離された膜が有用である。（検知又は検出される分子である）基質の結合は、菌細胞又は細胞から単離された膜が電極表面上に存在するときに電位変化をもたらし、よって基質分子の検出を可能にする。検出と分析のための固定化細胞の使用は Kambeと Nakanishi（(1994) Current Opinion in Biotechnology 5, 54-59）に記載されている。
【０１４６】
ｅ）バイオレメディエーション
本発明の菌細胞はバイオレメディエーションにおいてもまた有用である。例えば、チトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ系は有害な化合物を解毒することができる。有害な化合物を酸化することができる適切なチトクロムＰ４５０を発現する適切な菌細胞は上記化合物をより無害なようにするのに有用である。
【０１４７】
ｆ）発ガン性試験
他のところでより詳細に記載されているように、本発明の細胞、特にネズミチフス菌細胞は発ガン性試験において有用である。
【０１４８】
本発明の細胞は、無処置の細胞内において機能性チトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ系を提供するので、特に有用であると考えられるが、膜が該細胞から単離され、該膜が細胞全体と比較してチトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ系に富むこともまた本発明の一部である。菌細胞からの膜の単離は従来から良く知られている。本発明の細胞からの膜の単離は実施例でより詳細に記載する。
【０１４９】
本発明の第４の観点では、チトクロムＰ４５０を含む菌細胞であって、該細胞が上記チトクロムＰ４５０を発現し得る遺伝子作成物を含有し、チトクロムＰ４５０が菌細胞の細胞区画又は膜にチトクロムＰ４５０を方向付けるＮ末端部分を含む菌細胞が提供される。
【０１５０】
Ｎ末端部分はチトクロムＰ４５０を膜に方向付けることが好ましい。
【０１５１】
Ｎ末端部分はompＡ、pelＢ、malＥ又はphoＡシグナルペプチド又はその機能的等価変異体を含むことが更に好ましい。
【０１５２】
Ｎ末端部分の好適な特徴、特にシグナルペプチド又はリーダー配列のものは、本発明の前記の観点において好適なものである。
【０１５３】
更に、チトクロムＰ４５０が菌細胞からのチトクロムＰ４５０の精製を助けるペプチド配列を更に含有することがより好ましい。更に好ましくは、上記ペプチド配列は化合物に対する結合部位を含む。
【０１５４】
上記ペプチド配列が-(Ｈis)-ｎ（ここでｎ≧４）で上記化合物がニッケルであれば特に好適である。
【０１５５】
本発明の第４の観点は、チトクロムＰ４５０レダクターゼと通常はカップリングするチトクロムＰ４５０類と、アドレノドキシン／アドレノドキシンレダクターゼをカップリングするもの又は等価な電子伝達化合物のような他のチトクロムＰ４５０類の双方に対して有用であることが考えられる。従って、本発明の第４の観点の好適な実施態様においては、細胞は、等価な電子伝達成分のアドレノドキシン又はアドレノドキシンレダクターゼの各々又は双方を発現し得る遺伝子作成物を更に含有する。「等価な電子伝達成分」には、ＮＡＤＨからチトクロムＰ４５０へ電子を伝達できるあらゆる他の機能的に等価な成分、特にその自然の機能がＮＡＤＨから特定のチトクロムＰ４５０類に電子を伝達することである成分が含まれる。
【０１５６】
本発明の第５の観点では、チトクロムＰ４５０を調製する方法であって、（ａ）本発明の第４の観点に係る充分な量の細胞を提供し（ｂ）他の細胞区画からチトクロムＰ４５０を分離する方法が提供される。
【０１５７】
本発明の更なる観点では、チトクロムＰ４５０を発現し得る遺伝子作成物であって、チトクロムＰ４５０が菌細胞の細胞区画又は膜にチトクロムＰ４５０を方向付けるＮ末端部分を含有する作成物が提供される。Ｎ末端部分の好ましい特徴は、本発明の他の観点に関連して好適なものである。Ｎ末端部分がompＡ、pelＢ、melＥ又はphoＡシグナルペプチド又は機能的に等価なその変異体を含んでなるものであれば特に好ましい。遺伝子作成物の他の好適な特徴は本発明の前述の観点において好ましいものである。本発明の他の更なる観点では、複数の本発明の第１又は第４の観点の菌細胞であって、各細胞が異なるチトクロムＰ４５０を発現し得る遺伝子作成物を含むか、チトクロムＰ４５０とチトクロムＰ４５０レダクターゼの異なる組み合わせをコード化する遺伝子作成物又は作成物群を含み、更に必要ならば、電子伝達を助けるもの又はチトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ系の基質との反応の生成物を更に代謝するもののような他のポリペプチドを含むものが提供される。
【０１５８】
このような複数の細胞（又は細胞のライブラリー）は、例えばフリーザー中に適切な条件で、そして例えばマイクロタイタープレートで簡便に貯蔵することができ、各ウェルは異なる菌細胞を含む。複数の細胞は薬物試験又は発ガン性試験に対して、また上述したような他の目的に対して有用である。
【実施例】
【０１５９】
次の実施例と図面を参照して、以下に本発明を更に詳細に説明する。
【０１６０】
＜実施例１＞
１．材料と方法
【０１６１】
菌株とプラスミド
大腸菌Ｋ１２株ＪＭ１０９（Yanisch ほか (1989) Gene 33, 103-19）及びＤＨ５α（Woodcock ほか (1989) Nucleic Acids Res 17, 3469-78）中における同時発現を比較した。全体を通じて選択し使用した菌株はＪＭ１０９であった。ベクターｐＣＷは、過去にＣＹＰ３Ａ４を含む幾つかの哺乳動物Ｐ４５０のｃＤＮＡの発現に対して成功裡に使用されているので（非特許文献１３）、これをレダクターゼの発現に用いた。プラスミドｐＢ２０７は、細菌pelＢシグナル配列に翻訳的に融合したヒトレダクターゼｃＤＮＡを含むｐＣＷベクターを含有する。ｃＤＮＡの５'末端の配列は、［ＡＴＧＡＡＡＴＡＣＣＴＧＣＴＧＣＣＧＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＴＣＴＧＣＴＧＣＴＣＣＴＣＧＣＴＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＧＡＴＧＧＣＣＡＴＧＧＡＴＡＴＣＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＣＧＣＡＡＣＡＴＧ-ヒトレダクターゼｃＤＮＡ（〜２ｋｂ）］（配列番号４）であり、ここでpelＢリーダー配列には下線が付され、天然のレダクターゼＡＴＧは強調文字で示されている。ＮＦ１４（最適化ＣＹＰ３Ａ４配列を含むｐＣＷ）を 非特許文献１３のものと同じような方法で作成した。転写ターミネーターを含むＮＦ１４のSalＩ-BglＩＩ断片を、次の配列（最初の鎖のみを示す）のtrpＡ転写ターミネーターを含むSalＩ-BglＩＩ二本鎖オリゴヌクレオチドと置換することによりプラスミドｐＢ２１５を作成した：ＴＣＧＡＣＡＧＣＣＣＧＣＣＴＡＡＴＧＡＧＣＧＧＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＡ（配列番号５）。発現シグナルと共にpelＢ-レダクターゼｃＤＮＡを含むｐＢ２０７からのBclＩ-BglＩＩ断片を、独特のBglＩＩ部位でｐＢ２１５にサブクローン化してｐＢ２１６を作成した。
【０１６２】
ＣＹＰ３Ａ４とレダクターゼの大腸菌中の同時発現
発現条件は過去に記載されたもの（非特許文献１３）を修正したものとした。ＪＭ１０９細胞を、開示された（Inoueほか (1990) Gene 96, 23-8）ｐＢ２１６で形質転換し、形質転換体を５０μg/mlのアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上で単離した。単一のコロニーを調製し、アンピシリンを含むＬＢブロス中で５ｍｌのスターター培養を播種するために使用し、これを３７℃で一晩かけて振盪して成長させた。発現培養は、開示されたように（非特許文献１３）改変され補填されたテリフィックブロスを含む略１００ｍｌの培養（１ｌのフラスコ中）であった。発現培養は１ｍｌの一晩の培養で播種され、１ｍＭのＩＰＴＧでの誘導と０．５ｍＭのδ-アミノレブリン酸の添加に先立って４−５時間の間、３０℃、２００ｒｐｍで振盪して育成した。ついで、異種性タンパクの育成と発現を２００ｒｐｍで振盪しながら３０℃で２０−２４時間継続した。
【０１６３】
培養の収集と発現レベルの決定
開示されているようにして（非特許文献１３）、細胞を収穫し、５ｍｌの１００ｍＭトリスアセテート（ｐＨ７．６）、０．５Ｍのスクロース、０．５ｍＭのＥＤＴＡ（２ｘＴＳＥ）中に再懸濁させた。ついで、等しい量の氷冷蒸留水を添加した。ＣＹＰ３Ａ４量は、Ｆｅ２＋-ＣＯ対Ｆｅ２＋差スペクトルを用いて、１ｘＴＳＥ中の５０μｌのホールセル懸濁液を９５０μｌの１００ｍＭのトリスＣｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭのＣＨＡＰＳ、２０％（v/v）のグリセロール、１ｍＭのＥＤＴＡに加え、数粒子の亜ジチオン酸ナトリウムを加えて還元することにより決定した。ゼロ吸収のベースラインを５００ｎｍと４００ｎｍの間で記録し、ついで試料キュベットを約１分間の間定常ＣＯ流下でバブリングした。ついで、スペクトルを記録し、スペクトル的に活性なＣＹＰ３Ａ４／ｌ培養の収量を決定した。この段階で、一定分量の細胞全体を代謝の研究用に取り出した。膜画分は開示されたように（非特許文献１３）残りの細胞から単離した。膜のＣＹＰ３Ａ４とレダクターゼ量を決定した。活性なレダクターゼの収量は、次のようにして、分光光度アッセイにより評価した。０．３Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．７）中の９９０μｌの５０μＭのチトクロムｃに、１−１０μｇの膜タンパクを添加し、ベースライン量を記録した。５０μＭのＮＡＤＰＨを加えてΔＡ５５０ｎｍを経時的に記録した。膜のＰ４５０量を決定するために、細胞全体についてスペクトルを得た。
【０１６４】
異種的に発現されたＣＹＰ３Ａ４とレダクターゼの免疫検出
ＳＤＳ−９％ポリアクリルアミドゲル上にトラック当り１０μｇの膜タンパクを載せ電気泳動法により分離した。ついでタンパク質をＥＣＬ-ニトロセルロース膜（アメルシャム）に移し、ＴＢＳ-Ｔ［５０ｍＭのトリスＣｌ（ｐＨ７．９）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のトウィーン２０］中に１０％のミルク粉末を含むもので２０分間ブロックし、希釈した一次抗体とともに１時間までインキュベートした（ウサギの抗ＣＹＰ３Ａと抗レダクターゼ免疫グロブリンの混合物を使用した）。ついで膜をＴＢＳ-Ｔで洗浄し、希釈ＨＲＰ-結合ロバ抗ウサギ抗血清中で約４５分間インキュベートした。洗浄後、レダクターゼとＣＹＰ３Ａ４をＥＣＬ試薬（アメルシャム）を使用して検出した。抗レダクターゼ及び抗ＣＹＰ３Ａ４抗血清はＩＣＲＦクレア・ホール・ファシリティにより提供され、ＨＲＰ-結合ロバ抗ウサギ抗体はスコットランド・アンチボディ・プロダクション・ユニットから得た。
【０１６５】
テストステロン６β-水酸化酵素アッセイ
細胞と膜画分で検定を行った。双方の場合において、約１００pmolのＰ４５０を、３０ｍＭのＭｇＣｌ２を含むＴＳＥ中で振盪しながらインキュベートした。テストステロンの最終濃度は０．２ｍＭであった。膜を用いた場合、ＮＡＤＰＨ産生系を添加した（最終濃度１ｍＭのＮＡＤＰ、５ｍＭのグルコース-６-ホスファート、１単位のグルコース-６-ホスファートデヒドロゲナーゼ）。反応を５分間３７℃で行わせ、１ｍｌの氷冷メタノールを添加して停止させ、１０分間氷上に放置した。遠心分離に続き、上清を等しい量の氷冷水で希釈し、IsoluteＣ１８カラム（ＩＳＴ社）を用いてテストステロン代謝物を抽出し、１ｍｌのメタノールに溶出させた。メタノールをSpeedVacで蒸発させ、代謝物をついで２００μｌの３５％（v/v）メタノール中に再懸濁し、ＨＰＬＣバイアルに移した。代謝物を、水、メタノール及びアセトニトリルに基づく勾配を使用して１ｍｌ／分の流量で、SpherisorbのＯＤＳ-２（５μｍ）２５０ｘ４．６ｍｍカラム上でＨＰＬＣにより分離し、２４０ｎｍで検出した。６β-ヒドロキシテストステロンの収量は既知の濃度の標準物質を参照して算定し、これによりテストステロンに対する組換えＣＹＰ３Ａ４の比活性の決定が可能になった。ＨＰＬＣ法はGlaxo-Wellcomeから提供され、テストステロン代謝物はSteraloids社から提供された（Stering Winthropから贈られたもの）。
【０１６６】
エリスロマイシンＮ-デメチラーゼのアッセイ
細菌膜画分を、ＮＡＤＰＨ産生系（上述のもの）の存在下で１５０ｍＭのＫＣｌと１０ｍＭのＭｇＣｌ２を含む５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）中に含めた０．５ｍＭのエリスロマイシンと共に、３７℃で２０分間の間、インキュベートした。ついで、７．５％（w/v）のトリクロロ酢酸の添加により反応を停止させ、遠心分離によりタンパク沈殿物を集めた。ついで、エリスロマイシンＮ-デメチラーゼの活性を、Ａ４１２ｎｍを測定する、Ｎａｓｈ試薬［６Ｍの酢酸アンモニウム、６０ｍＭのアセチルアセトン、１５０ｍＭの酢酸；Nash (1953) Biochem. J 55, 416-421］を使用して分光光度アッセイにより決定した。
【０１６７】
ニフェジピンオキシダーゼのアッセイ
細胞又は細菌膜画分を、３０ｍＭのＭｇＣｌ２を含むＴＳＥ中に含めた０．２ｍＭのニフェディピンで、振盪しながら１０分間の間、３７℃でインキュベートした。膜画分を使用した場合は、ＮＡＤＰＨ産生系（上述のもの）を含めた。氷冷メタノール（３０％（v/v）の最終濃度）と過塩素酸（１．５v/v最終濃度）を添加して反応を停止させ、遠心分離により沈殿タンパク質を集めた。上清をＨＰＬＣバイアルに移し、ニフェディピンとその酸化代謝物を、メタノール、アセトニトリル及び水（体積比２５：３０：４５）の移動相を用いて、SpherisorbのＯＤＳ-２（５μｍ）２５０ｘ４．６ｍｍカラム上でアイソクラティックに分離し、ＨＰＬＣにより２５４ｎｍで検出した。生成物の量は既知の酸化ニフェディピン濃度を含む標準物質を参照して算出した。
【０１６８】
２．結果
ＣＹＰ３Ａ４とレダクターゼの同時発現用のプラスミドの作成
大腸菌中でのレダクターゼの発現を最適化する予備実験では、ヒトレダクターゼのｃＤＮＡがそのＮ末端で細菌pelＢリーダー配列に翻訳的に融合され、ｐＢ２０７と称されるプラスミドにおいてｐＣＷのＰｔａｃＰｔａｃプロモーターから発現させたときに高レベルの調節可能な発現が達成された。これらの発現レベルはｐｅｌＢリーダーを欠く匹敵する作成物から得られるもの（データは示さず）よりも大幅に高かった。これらの結果は、他の細菌のシグナル配列、ompＡに融合されたラットのレダクターゼの過去の発現（Shenほか (1989) J. Biol. Chem. 264, 7584-7589）と一致している。同時発現プラスミドは、次のようにして、最適化されたＣＹＰ３Ａ４発現プラスミドＮＦ１４にpelＢ-レダクターゼｃＤＮＡをサブクローン化することにより作成された（非特許文献１３）（本発明に対して再作成した）。ベクター内のBglＩＩ制限部位の一つを除去することによりＮＦ１４を修飾し、ＣＹＰ３Ａ４発現のターミネーターを保持しながらレダクターゼの次のクローン化に下流のBglＩＩ部位が用いられるようにした（詳しくは方法と材料の項と図１のｐＢ２１５を参照のこと）。pelＢ-レダクターゼｃＤＮＡとそのＰｔａｃＰｔａｃプロモーターを含むｐＢ２０７からのBclI-BglII断片をついでBglII部位でｐＢ２１５にサブクローン化し、それぞれがＰｔａｃＰｔａｃプロモーターを担持している２つのｃＤＮＡがヘッドツーテイルで配置されたプラスミドｐＢ２１６を作成した（図１参照）。
【０１６９】
ｐＢ２１６からのレダクターゼとＣＹＰ３Ａ４の同時発現の最適化
理想的な培養条件は、培養にδ-アミノレブリン酸を補填するとＣＹＰ３Ａ４の発現を大幅的に増大させる（未公開データ）ことを除いて、ＮＦ１４からのＣＹＰ３Ａ４の発現に最適であるとされたもの（非特許文献１３）と同様であることが見出され、従って今回は常套的に使用される。大腸菌株ＪＭ１０９とＤＨ５αにおける発現レベルが比較され、レダクターゼの発現レベルはＪＭ１０９におけるよりもＤＨ５αにおいて僅かに高いけれども、これはＣＹＰ３Ａ４レベルを犠牲にしたものであったことが見出された（データは示さず）。従って、ＣＹＰ３Ａ４発現のレベルを優先させるべきであると決定されたので、ＪＭ１０９を発現株として選択した。
【０１７０】
大腸菌におけるレダクターゼの発現の過去の報告によれば、育成地にはリボフラボンが追加されることが示されている（Shenほか (1989) J. Biol. Chem. 264, 7584-7589）。我々は、リボフラボンを添加した場合の活性なレダクターゼの発現レベルに対する差異は無視できることを見出したので、発現培養にリボフラボンを含めなかった。
【０１７１】
発現レベルの決定
細菌細胞全体におけるＣＹＰ３Ａ４量はＦｅ２＋-ＣＯ対Ｆｅ２＋差スペクトルを用いて決定することができるが、レダクターゼの発現レベルの評価には細菌膜画分が開示されたようにして（非特許文献１３）調製された。これが必要であったのは、レダクターゼアッセイがチトクロムｃの還元速度を測定するからであり、ＪＭ１０９細胞において測定された背景活性が禁止的に高く、細胞又はスフェロプラストからの直接の測定を可能にする。ｐＢ２１６からのレダクターゼの発現に対しては、得られたレダクターゼの比活性は、膜調製物によるチトクロムｃの還元の速度により計算して、４００pmolレダクターゼ／mg膜タンパクの範囲にあった。膜中に測定されたＣＹＰ３Ａ４量は典型的にはおよそ２００pmol／mg膜タンパクであった。従って、ｐＢ２１６からのＣＹＰ３Ａ４とレダクターゼの同時発現後に、細菌膜は、およそ２：１の比率のＰ４５０に対するＰ４５０レダクターゼを含んでいる。
【０１７２】
異種的に発現されたＣＹＰ３Ａ４とレダクターゼの免疫検出
異種的に発現されたレダクターゼとＣＹＰ３Ａ４を示す典型的なウェスタンブロットを図２に示す。レダクターゼとＣＹＰ３Ａ４に対応するバンドはｐＢ２１６由来の膜画分において検出できる一方（トラック５及び６）、レダクターゼのみとＣＹＰ３Ａ４のみはＰＢ２０７（トラック１及び２）とＮＦ１４（トラック３及び４）由来の試料においてそれぞれ検出することができる。その発現がＩＰＴＧの添加によっては誘導されなかった（トラック４及び６）細菌培養から由来するトラックのレダクターゼとＣＹＰ３Ａ４バンドの出現から観測されるように、発現は非誘導条件下では完全には抑制されなかった。しかし、これらの画分から由来する活性なレダクターゼとスペクトル的に活性なＣＹＰ３Ａ４の量は誘導された培養から由来するものよりも更に低いことが見出され（データは示さず）、これが、バンドの検出が試料中のＣＹＰ３Ａ４とレダクターゼの量に対して線形の応答ではないことを示しているのかも知れない。ＪＭ１０９ｐＢ２１６膜画分において異種的に発現されたＣＹＰ３Ａ４とレダクターゼの量はヒトの肝臓のミクロソームの試料において検出されたものと同様であるようである（トラック６及び９）。
【０１７３】
細胞全体におけるＣＹＰ３Ａ４活性のアッセイ
ＪＭ１０９ｐＢ２１６の細胞全体はテストステロンを代謝することが見出された。６β-ヒドロキシテストステロンは負の対照株ＪＭ１０９ｐＣＷ（ベクターのみ）又はＪＭ１０９ｐＢ２０７（レダクターゼ発現のみ）と共にテストステロンをインキュベートした後には検出されなかった。これは、大腸菌がＣＹＰ３Ａ４が無い場合にテストステロンの６β-ヒドロキシル化を触媒することができないことを示している。ＣＹＰ３Ａ４だけを発現する細胞（ＪＭ１０９ＮＦ１４）もまた検出可能なレベルの代謝物を生産せず、ＣＹＰ３Ａ４に電子を供与して触媒機能を許容し得る内因性タンパク質はないことを示している。しかしながら、１００μＭのクメンハイドロペルオキシドがＪＭ１０９ＮＦ１４細胞を含む反応物に添加されるときは、６β-ヒドロキシテストステロンが形成された。これは、ＪＭ１０９ＮＦ１４細胞におけるＣＹＰ３Ａ４が機能性であるが、利用できる電子の細胞内供給はないことを示唆している。達成された低い活性は細胞全体内でクメンヒドロペルオキシドに対するＰ４５０の隔絶性を反映する。レダクターゼとのＣＹＰ３Ａ４の同時発現の際に、比較的高い速度のテストステロン代謝が生じる（ＪＭ１０９ｐＢ２１６試料）。これは、同時発現されたレダクターゼとＣＹＰ３Ａ４が細胞全体中でカップリングして機能性モノオキシゲナーゼ系を産生することを示している。
【０１７４】
この実験では、６β-水酸化酵素活性は〜１７．３nmol産生６β-ヒドロキシテストステロン／分／nmolＰ４５０と計算された。細菌的に発現されたＣＹＰ３Ａ４を含む再構築系での過去の結果は１０nmol６β-ヒドロキシテストステロン／分／nmolＰ４５０までの代謝回転速度を得ていた（非特許文献１３）。
【０１７５】
ＪＭ１０９ｐＢ２１６膜によるテストステロン、エリスロマイシン及びニフェジピンの代謝
ｐＢ２１６由来の膜画分はリン脂質、洗浄剤、グルタチオン又はチトクロムｂ５の補填なしにＣＹＰ３Ａ４基質テストステロン、ニフェジピン及びエリスロマイシンの代謝を媒介することが見出された。これらのアッセイにおいては、１００pmolのＣＹＰ３Ａ４を含む膜画分をＮＡＤＰＨ産生系の存在下で基質と共に単にインキュベートした。典型的な活性を表２に示す。結果は、ＪＭ１０９ｐＢ２１６膜画分が３つのＣＹＰ３Ａ４基質の代謝に優れていることを示している。エリスロマイシンＮ-デメチラーゼ活性は、細菌的に発現されたＣＹＰ３Ａ４を含む再構築系において過去に観察された（非特許文献２５）よりも〜２．５倍少なかった。しかしながら、これに対して、ニフェジピンオキシダーゼ活性は再構築系について過去に観察されたもの（非特許文献１３）と同様であった。
【０１７６】
表１：ＪＭ１０９ＮＦ１４とＪＭ１０９ｐＢ２１６細胞及び／又は膜のチトクロムＰ４５０量及びチトクロムｃレダクターゼ活性
【０１７７】
【表１】
【０１７８】
Ｐ４５０量はＦｅ２＋−ＣＯ対Ｆｅ２＋差スペクトルにより測定した。含量は４回の実験の平均±ＳＤとして表している。
【０１７９】
＊量は１ｘＴＳＥ中に含めた５０μｌ細胞において測定した（〜０．５ｍｌ培養）。
†量は組換え細菌由来の膜画分中のｍｇタンパク質当りで評価した。
レダクターゼ活性は膜画分中のｍｇタンパク質当りのチトクロムｃの還元速度を測定することにより計算し、値を４回の平均±ＳＤとした。
ｎ．ｄ．＝検出可能な活性はなし
【０１８０】
表２：ＪＭ１０９ｐB２１６細胞と膜によるテストステロン、ニフェジピン及びエリスロマイシンのＣＹＰ３Ａ４-依存性代謝
【０１８１】
【表２】
【０１８２】
組換えＣＹＰ３Ａ４とｐ４５０レダクターゼを含む細胞又は膜による３種の既知のＣＹＰ３Ａ４基質の代謝を評価した。代謝回転数は、nmol生成物／分／nmolP450として記録し、±ＳＤで示した。検出された生成物は６βヒドロキシテストステロン、酸化ニフェジピン及びホルムアルデヒドであった。活性が検出されなかった場合は、検出レベルを示す。テストステロンの代謝では、ＣＹＰ３Ａ４又はＰ４５０レダクターゼの何れかを欠く細胞又は膜と共に６０分インキュベートした後でさえ６βヒドロキシテストステロンは生成されなかった。
【０１８３】
＊エリスロマイシンの代謝に対しては、細胞全体によるホルムアルデヒド生成の背景レベルが非常に高かったので、活性は膜についてのみ記録することができた。
【０１８４】
３．議論
この実施例では、我々は、ヒトＣＹＰ３Ａ４及びＰ４５０レダクターゼをコードしているｃＤＮＡの同時発現による機能性Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ系の産生を記述する。我々の知る限りでは、これは、哺乳動物の異物代謝Ｐ４５０が未処理の大腸菌細胞において触媒的に活性であることが示された最初の例である。ステロイド産生Ｐ４５０ １７α-水酸化酵素／１７-,２０-リアーゼ（Ｐ４５０ｃ１７）は、細菌フラボドキシン／ＮＡＤＰＨ-フラボドキシンレダクターゼ系から電子を受け取るその能力のために大腸菌において機能性であるけれども（非特許文献１９）、ＣＹＰ３Ａ４だけを発現する大腸菌細胞（ＪＭ１０９ＮＦ１４細胞）は電子の外来性の供与がない場合には（この場合にはクメンヒドロペルオキシドから）ＣＹＰ３Ａ４基質テストステロンを代謝しなかった。従って、ＣＹＰ３Ａ４はこのあるいは他の細菌レダクターゼとはカップリングし得ないと結論できる。
【０１８５】
我々は、これらの細胞を有用なＰ４５０代謝物の生産に対する生体触媒として使用できるかもしれないことから、ＣＹＰ３Ａ４とヒトＰ４５０レダクターゼの大腸菌における同時発現系を開発した。単一プラスミドｐＢ２１６において別個のＰｔａｃＰｔａｃプロモーターのもとで両方のｃＤＮＡが発現され、ＣＹＰ３Ａ４とレダクターゼの協調性発現がＩＰＴＧにより誘導された。発現の最適レベルを達成するために、双方のｃＤＮＡをその元の形態から改変した。ＣＹＰ３Ａ４のｃＤＮＡの５'末端を過去に記載されているようにして改変した（非特許文献１３）。Ｐ４５０レダクターゼの効果的な発現には、細菌のpelＢシグナルペプチドをコードしている配列との融合によりｃＤＮＡの５'末端を伸展させることが必要であることが分かった。２００pmol／mg膜タンパクのＣＹＰ３Ａ４の収量と４００pmol／mg膜タンパクのレダクターゼの収量が得られた。
【０１８６】
同時発現されたＣＹＰ３Ａ４及びpelＢ-レダクターゼは、これらから単離されたＪＭ１０９ｐＢ２１６細胞と膜がＣＹＰ３Ａ４基質に対して活性であるので、細菌の周辺質膜の同じ面上に局在化しうると思われ、これはタンパク質が効果的にカップリングできなければならないことを示している。基質に対して測定された活性は、再構築系において精製された細菌発現ＣＹＰ３Ａ４で得られた過去の結果（非特許文献１３；非特許文献１５）よりも高いことが分かった。このような再構築系は精製ＣＹＰ３Ａ４、レダクターゼ、チトクロムｂ５、グルタチオン、洗浄剤及び最適化リン脂質組成物を含む。チトクロムｂ５は、ＣＹＰ３Ａ４-レダクターゼ融合タンパク質に対する特定の基質に対して最大のＣＹＰ３Ａ４活性を得るのに重要であることが示されている一方（非特許文献１７）、リン脂質組成物とグルタチオン濃度もまたＣＹＰ３Ａ４を含む再構築系において重要であることも示された（非特許文献１３）。これらの付属的な因子がない場合は、テストステロンに対するＣＹＰ３Ａ４活性は、ここで用いた単純な緩衝系内では細胞全体及び膜においてむしろ予期されなかった。従って、これらの基質に対する高レベルのＣＹＰ３Ａ４活性が、我々の研究では、外来的に添加されるチトクロムｂ５の不存在下で観察されたことは極めて興味深かった。
【０１８７】
要約すると、我々は、大腸菌におけるＣＹＰ３Ａ４とヒトＰ４５０レダクターゼの高レベルの同時発現を成功裡に達成した。結果として得られた菌株は外来的に適用されたＮＡＤＰＨの不存在下においてさえもテストステロンとニフェジピンのホールセル代謝に好適であり、（少なくとも）レダクターゼ活性部位が細胞質的に配向していることを示唆している。細菌由来の膜は、ＮＡＤＰＨのみが補充された簡単な緩衝液中においてテストステロン、ニフェジピン及びエリスロマイシンを代謝する。我々の同時発現菌株から達成される特異的活性は再構築系で過去に得られたよりも高い。代謝回転速度を改善するためにこの矛盾の可能な理由を調査することを我々は望む。本実施例において記載された菌株はＣＹＰ３Ａ４代謝物の生産に対する生物工学的ツールとしての用途があり、大腸菌におけるＰ４５０レダクターゼとの他のＰ４５０のアイソフォームの将来の同時発現のモデル系として使用される。
【０１８８】
＜実施例２＞
１．材料と方法
菌株とプラスミド
大腸菌Ｋ-１２株ＪＭ１０９（Yanisch ほか (1985) Gene 33, 103-19）を全体を通じて使用した。チトクロムＰ４５０ｃＤＮＡをプラスミドｐＣＷから発現させた。このプラスミドは、β-ラクタマーゼ遺伝子を含み、よってアンピシリン又はカルベニシリンのような薬剤の存在下で育成された菌細胞において安定に維持することができる。ヒトＰ４５０レダクターゼｃＤＮＡはプラスミドｐＡＣＹＣ１８４から発現され、該プラスミドはクロラムフェニコールの存在下で菌細胞中に安定に維持することができる。
【０１８９】
細菌シグナルペプチドコード配列の単離と発現作成物の産生
細菌pelＢシグナルペプチドに対するコード配列の供給源は市販のベクターｐＥＴ-２０ｂ（ノバゲン）であった。染色体ＤＮＡを大腸菌株ＪＭ１０９から抽出し、特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用するＰＣＲによるompＡリーダー配列の単離に対する鋳型として使用した。このＰＣＲ産物をサブクローン化し、ジデオキシ配列決定を行い、ＧｅｎＥＭＢＬデータベースに既に登録されているompＡリーダー配列（目録番号：ｖ００３０７）、すなわち：
５'ＡＴＧＡＡＡＡＡＧＡＣＡＧＣＴＡＴＣＧＣＧＡＴＴＧＣＡＧＴＧＧＣＡＣＴＧＧＣＴＧＧＴＴＴＣＧＣＴＡＣＣＧＴＡＧＣＧＣＡＧＧＣＣ-３'（配列番号６）と同一であることが分かった。
【０１９０】
ＰＣＲ融合技術（Yon ほか (1989) Nucleic Acids Res. 17, 4895）を使用して全長Ｐ４５０ｃＤＮＡの５'末端にインフレームで細菌pelＢ又はompＡシグナルペプチドのコード配列を融合させた。この方法を使用して、pelＢ-ＣＹＰ３Ａ４、ompＡ-ＣＹＰ３Ａ４、ompＡ-ＣＹＰ２Ｄ６、ompＡ-ＣＹＰ２Ａ６及びompＡ-ＣＹＰ２Ｅ１融合を作成し、各々の場合において作成物の５'末端のＮdeI制限部位を操作してｐＣＷへのサブクローン化を容易にした。全てのＰＣＲ由来断片はジデオキシ配列決定により確かめた。
【０１９１】
過去に記載されたpelＢ-ヒトレダクターゼ作成物を上流（ｔａｃ）２プロモーターカセットと共に、ＢclI-ＢglII断片として、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４の独特のＢamＨＩ部位にサブクローン化して、プラスミドｐＪＲ７を生産した。
【０１９２】
細菌リーダー配列に融合したヒトＰ４５０類の大腸菌における発現
【０１９３】
ＪＭ１０９細胞をｐＣＷ／pelＢ-ＣＹＰ３Ａ４、ｐＣＷ／ompＡ-ＣＹＰ３Ａ４、ｐＣＷ／ompＡ-ＣＹＰ２Ｄ６、ｐＣＷ／ompＡ-ＣＹＰ２Ａ６又はｐＣＷ／ompＡ-ＣＹＰ２Ｅ１で形質転換した（Inoueほか (1990) Gene 96, 23-28）。形質転換細胞をアンピシリンで選択し、更なる研究用に増幅した。同時発現では、ＪＭ１０９細胞をプラスミドｐＣＷ／ompＡ-ＣＹＰ２Ｄ６及びｐＪＲ７で同時形質転換し、アンピシリンとクロラムフェニコールの両方で選択した。
【０１９４】
標準的なプロトコールを全ての発現及び同時発現実験に対して用いた。形質転換体は、凍結グリセロール貯蔵物から、アンピシリンだけか（ｐ４５０の発現に対して）アンピシリンとクロラムフェニコール（Ｐ４５０とレダクターゼの同時発現に対して）を含むＬＢ寒天プレート上に画線され、３７℃で１２−１４時間インキュベートされた。ついで、単一の単離コロニーを数ｍｌのＬＢブロス（適当な抗生物質を含む）中に播種し、３７℃で一晩振盪させた。このスターター培養を、１ｌの三角フラスコ中において、開示された（非特許文献１３）ようにして改変され補充され、しかしレダクターゼが同時発現されるときはクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）が添加された１００ｍｌのテリフィックブロス中に１：１００で希釈した。これらの培養を振盪しながら３０℃で４−５時間インキュベートした。ついで、ヘム前駆物質δ-アミノレブリン酸を、０．５ｍＭの最終濃度になるまで添加し、１ｍＭになるまで誘導剤ＩＰＴＧを添加した。ついで異種性タンパク質の発現を３０℃で２２−２３時間の間継続させた。
【０１９５】
培養の収集と発現レベルの決定
−先に記載されたとおり
【０１９６】
異種的に発現されたＰ４５０とレダクターゼの免疫検出
ＳＤＳ-９％ポリアクリルアミドゲル上でタンパク質を分離し、ついでHybond-ＥＣＬ膜（アメルシャム、ＵＫ）上に移した。該膜を、ＴＢＳ-Ｘ［５０ｍＭのトリスＣｌ（ｐＨ７．９）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１０％のトリトンＸ-１００］中に５％のミルク粉末を含むもので１時間ブロックし、希釈した一次抗体と共に４５−６０分間インキュベートした。用いた一次抗体は、ウサギ抗-ＣＹＰ３Ａ、ウサギ抗-ＣＹＰ２Ｄ６、ウサギ抗レダクターゼ、又はヒツジ抗-ＣＹＰ２Ｅ１免疫グロブリンであった。ついで膜をＴＢＳ-Ｘで４回洗浄し、２５−３５分間二次抗体（適当なＨＲＰ-結合ロバ抗ウサギ又は抗ヒツジＩｇＧ）でインキュベートした。ＴＢＳ-Ｘで４回洗浄した後、ＥＣＬ（アメルシャム、ＵＫ）を用いて化学ルミネッセンスにより組換えタンパク質を検出した。二次抗体は、スコットランド・アンチボディ・プロダクション・ユニットから得た。
【０１９７】
ブフラロール１'-水酸化酵素アッセイ
３００μｌの全容積中に２０又は５０pmolのＣＹＰ２Ｄ６、５０μＭ(±)-ブフラロール及びＮＡＤＰＨ産生系（実施例１を参照）を含む５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．４中において３７℃で細菌膜画分について検定を行った。ｐＣＷ／ompＡ-ＣＹＰ２Ｄ６のみ（すなわち同時発現されるレダクターゼはなし）を担持する細胞から単離された膜に対しては、ＮＡＤＰＨ産生系は１００μＭのクメンヒドロペルオキシドにより置換した。反応を１５μｌの６０％過塩素酸の添加により停止させ、５−１０分間氷上に置いた。沈殿したタンパク質を遠心分離により除去し、ついで上清について、信頼性のある標準物質を参照して、逆相ＨＰＬＣにより１'-ヒドロキシブフラロールを分析した。分離は、Spherisorbの５μｍのＯＤＳ-２カラム２５ｃｍｘ４．６ｍｍと、アセトニトリルの線形勾配（１２分で２７から５１％）を持つ０．１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ５．０）の移動相を用いて達成した。検出は、それぞれ２５２ｎｍと３０２ｎｍの励起及び放射波長を使用した蛍光法によった。
【０１９８】
細胞全体についての検定を５０ｍｌの三角フラスコ中で３７℃で実施した。５ｍｌの全容積中に５０pmolのＣＹＰ２Ｄ６、５０μＭ(±)-ブフラロール及び１ｘＴＳＥ緩衝液を含んでいた。試料（３００μｌ）を、氷上に６０％過塩素酸を１５μｌ含む管内に０、２、５及び１０分で取り出した。ついで膜のアッセイ（上記）と同様にして分析を進めた。
【０１９９】
ミカエリス-メンテン動力学パラメータの決定に対しては、２０pmolのＣＹＰ２Ｄ６で５分間、基質の濃度を変えながら（０から１００μＭ）インキュベーションを行った。Ｋｍとｖｍａｘは初期反応速度対基質濃度の二重逆数プロットから推定した。
【０２００】
２．結果
Ｐ４５０とＰ４５０レダクターゼのｃＤＮＡの単離：
ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ａ６及びＣＹＰ２Ｅ１及びＰ４５０レダクターゼに対するｃＤＮＡを、刊行されている配列情報に基づいて合成されたアンプリマーを使用してＲＴ-ＰＣＲにより単離した。ｃＤＮＡはＤＮＡ配列決定により確証され、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ａ６及びＣＹＰ２Ｅ１及びヒトＰ４５０レダクターゼに対して刊行されたものと同一の一次構造を持つタンパク質をコードすることが分かった。
【０２０１】
pelＢリーダー配列に融合したヒトＰ４５０レダクターゼの作成と発現
Ｐ４５０レダクターゼはヒトＰ４５０類の触媒活性に必要であり、大腸菌中には存在しない。我々は、大腸菌において天然のＰ４５０レダクターゼ又はpelＢリーダー配列（ＭＫＹＬＬＰＴＡＡＡＧＬＬＬＬＡＡＱＰＡＭＡ-）（配列番号１）にそのＮ末端で融合したＰ４５０レダクターゼを発現させようと試みた。最初は、プラスミドｐＣＷにおいてＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）誘導性(tac)２プロモーターの調節下で両方のタンパク質を発現させようと試みた（図３）。天然のＰ４５０-レダクターゼ及びpelＢ-レダクターゼが宿っている大腸菌から膜を単離し、免疫ブロットにより分析した（図４）。ＩＰＴＧがない場合は、無視できる量のＰ４５０レダクターゼが検出され、組換えタンパク質の明白な誘導がＩＰＴＧの添加時に観察された。プラスミドｐＪＲ１からの天然Ｐ４５０レダクターゼの発現は低い一方、高レベルのpelＢ-Ｐ４５０レダクターゼがプラスミドｐＪＲ２から得られた。これらの差異は、二つの組換えタンパク質を含む膜において検出されたチトクロムｃに対するＰ４５０-レダクターゼ活性にもまた反映されていた。これらの調製物において、pelＢ-レダクターゼは天然のＰ４５０レダクターゼと比較しておよそ１０倍強いレダクターゼ活性を示した（図４）。これらの結果は、大腸菌における機能性Ｐ４５０レダクターゼの最適な発現は細菌リーダー配列へのこのタンパク質の融合の後にのみ可能になることを明らかに証明している。
【０２０２】
細菌リーダー配列に融合したＣＹＰ３Ａ４の作成と発現
ＣＹＰ３Ａ４は主要なヒトの肝臓のＰ４５０であり（Shimadaほか (1994) J. Pharmacol. Exp. Ther. 270, 414-423）、広範囲の治療薬並びに化学発ガン物質の代謝に関与している。この重要なＰ４５０の効果的な発現を達成するために、我々は、任意の部位において任意の二つの配列の融合を可能にすることが示されているＰＣＲベースの戦略（Yonほか (1989) Nucleic Acids. Res. 17, 4895）を使用して、細菌pelＢ又は細菌ompＡリーダー配列（ＭＫＫＴＡＩＡＩＡＶＡＬＡＧＦＡＴＶＡＱＡ）（配列番号２）にそのＮ末端で融合したＣＹＰ３Ａ４をコードする一連の修飾ＣＹＰ３Ａ４のｃＤＮＡを作成した。結果的に得られたｃＤＮＡ作成物を配列決定し、ベクターｐＣＷにクローン化し、発現のために大腸菌株ＪＭ１０９に形質転換した。
【０２０３】
アンピシリンの存在下で成長したコロニーを更なるＤＮＡ及びタンパク質の分析用に選択した。発現作成物を含む大腸菌をテリフィックブロス中で成長させ、材料と方法の項に記載されたようにしてＩＰＴＧによりＰ４５０発現を誘導した。細菌膜の免疫ブロット分析（図５）及び細胞全体又は膜のスペクトル分析（図６）によりＣＹＰ３Ａ４の発現を検出した。図５から分かるように、免疫反応性pelＢ-ＣＹＰ３Ａ４のレベルはヒトの肝臓ミクロソームに見出されるＣＹＰ３Ａ４レベルと同様である一方、免疫反応性ompＡ-ＣＹＰ３Ａ４のレベルは少なくとも一桁強かった。興味深いことに、pelＢ-ＣＹＰ３Ａ４は２つの接近して遊走する免疫反応性タンパク質を産生した。同様な結果が、ニッケル-アガロースアフィニティクロマトグラフィーによるＨisタグpelＢ-３Ａ４の精製後にも得られ、また精製されたompＡ-３Ａ４は同様に均質なタンパク質を産生した。pelＢ-ＣＹＰ３Ａ４とompＡ-ＣＹＰ３Ａ４は、Ｐ４５０ヘモタンパク質に典型的なＦｅ２＋対Ｆｅ２＋-ＣＯスペクトルを示した（図６）。スペクトル的に活性なpelＢ-ＣＹＰ３Ａ４の収量（ompＡ-ＣＹＰ３Ａ４タンパク質のものではない）は、成長培地におけるδ-アミノラエブリン酸（ＡＬＡ）の存在下で強く刺激された（図７）。免疫ブロット分析から予期されたほど差異は顕著ではないが、これらの条件下で、ompＡ-３Ａ４は、pelＢ-ＣＹＰ３Ａ４と比較してより多くのスペクトル的に活性なＰ４５０を産生した（それぞれ５００nmol/l培養対１４３nmol/l培養）。培地中のＡＬＡの存在により、組換えＰ４５０のスペクトル分析において４２０ｎｍの吸収ピークが出現する（図６、ＡＬＡの存在下で発現されたpelＢ-３Ａ４及びＡＬＡの不存在下で発現されたompＡ-３Ａ４を参照せよ）。
【０２０４】
発現されたタンパク質の触媒活性の直接的な測定は、細菌膜中にＰ４５０レダクターゼがないので可能ではなかった。従って、Ｐ４５０酵素活性は、Ｐ４５０類に対する人工的な酸素供与体となるクメンヒドロペルオキシドの存在下で測定した。この分析において、テストステロンの６β-水酸化に対するpelＢ-ＣＹＰ３Ａ４とompＡ-ＣＹＰ３Ａ４の代謝回転数はそれぞれ４．２min-1及び３．２min-1であった。これらの結果は、大腸菌においてこれらのＰ４５０類はスペクトル的にかつ触媒的に活性な酵素に正しく折畳まれることを明白に証明している。
【０２０５】
ompＡリーダー配列に融合したＣＹＰ２Ｄ６の作成と発現
ompＡ-ＣＹＰ３Ａ４に対して得られた収量はpelＢ-ＣＹＰ３Ａ４に対するよりも更に高かったことを我々は見出したので、様々な治療的に重要な化合物の代謝に関与しているＰ４５０であるＣＹＰ２Ｄ６のＮ末端にompＡ配列を排他的に融合させることを決めた。
【０２０６】
ＣＹＰ２Ｄ６ｃＤＮＡへのompＡシグナル配列の融合に用いたＰＣＲ技術はompＡ-ＣＹＰ３Ａ４の作成に用いられた戦略と同様であった。この作成物はベクターｐＣＷから発現された。図８は、ompＡ-ＣＹＰ２Ｄ６のｃＤＮＡ作成物を含んでいる大腸菌から得られた細菌膜の免疫ブロットを示している（レーン２）。組換えＣＹＰ２Ｄ６に対応する免疫反応性バンドがこれらの膜において検出されたが、これは空の発現プラスミドｐＣＷを担持する細菌から単離された膜には存在していなかった（レーン１）。ompＡ-ＣＹＰ２Ｄ６は典型的なＰ４５０のＦｅ２＋対Ｆｅ２＋-ＣＯスペクトルを示した（図９）。スペクトル的に活性なＣＹＰ２Ｄ６の収量（４８１nmol/l培養、図１０）はompＡ-ＣＹＰ３Ａ４に対して得られた収量と同様であり、前者のヘモタンパク質を発現する細菌は明確な赤色に着色された。スペクトル的に活性なompＡ-ＣＹＰ２Ｄ６のＡＬＡに依存した増大はpelＢ-ＣＹＰ３Ａ４に対するよりも更に強かった。クメンヒドロペルオキシドの存在下では、ompＡ-ＣＹＰ２Ｄ６は、５０±３min-1の代謝回転数で典型的なＣＹＰ２Ｄ６基質ブフラロールの水酸化を触媒した。
【０２０７】
細菌リーダー配列に融合したＰ４５０とＰ４５０-レダクターゼの同時発現は大腸菌において機能性モノオキシゲナーゼ系を産生する：
機能性Ｐ４５０-モノオキシゲナーゼ系を産生するために、我々は大腸菌においてＰ４５０とＰ４５０-レダクターゼを同時発現することを試みた。大腸菌において２つのタンパク質の同時発現を達成するには３つの主要な方法を考えることができる。第１は、２つのｃＤＮＡを同じ細胞において分離した適合性プラスミドから発現させることができる：例えばＰ４５０をｐＣＷから、Ｐ４５０レダクターゼを別個のベクターから発現させることができる。第２に、双方のｃＤＮＡを同じプラスミドにサブクローン化することができる。第３に、Ｐ４５０又はＰ４５０レダクターゼをコードしているｃＤＮＡの一つ又は双方を細菌染色体に組込むことができる。我々は、技術的な要求が最も少ない最初の戦略を選択した。
【０２０８】
pelＢ-レダクターゼｃＤＮＡをベクターｐＡＣＹＣ１８４中に（図３）クローン化してベクターｐＪＲ７を産生した。この作成物の利点は、ｐＡＣＹＣ１８４がｐＣＷとは異なる複製開始点を含むことである。加えて、これらのベクターは異なる選択マーカーを含み、これにより一つはＰ４５０-レダクターゼの発現（ｐＡＣＹＣ１８４）、他方（ｐＣＷ）はＰ４５０の発現に対して、２つの別個のプラスミドでの安定した同時形質転換が可能となる。大腸菌は、ompＡ-ＣＹＰ２Ｄ６のｃＤＮＡを担持するｐＣＷ及びｐＪＲ７で形質転換をした。形質転換体をアンピシリンとクロラムフェニコール上で選択し、更なる分析のために拡大した。免疫ブロット（図８）により同時発現菌株から単離された膜における組換えＰ４５０レダクターゼとＣＹＰ２Ｄ６に対応する免疫反応性バンドが明らかになり（レーン３と４）、これは空の発現ベクターｐＣＷを担持する細菌から単離された膜には両方とも無かった（レーン１)。ompＡ-ＣＹＰ２Ｄ６とpelＢ-レダクターゼを同時発現する大腸菌は典型的なＦｅ２＋対Ｆｅ２＋-ＣＯスペクトル（図９）を示した。スペクトル的に活性なompＡ-ＣＹＰ２Ｄ６の細胞全体の収量は同時発現株において３６５nmol／l培養であり、これはＣＹＰ２Ｄ６だけを発現する大腸菌におけるよりも２５％だけ低かった（図１０）。ompＡ-ＣＹＰ２Ｄ６とＰ４５０-レダクターゼを含む膜は５３０nmol／min／mgのチトクロムｃレダクターゼ活性を示し、これはヒト肝臓ミクロソームに対して報告された値より２倍高い。
【０２０９】
最も重要な点は、ompＡ-ＣＹＰ２Ｄ６とpelＢ-レダクターゼを同時発現する未処理の細菌並びにその由来の膜が、それぞれ４．６min-1と５．７min-1の代謝回転数と、ヒト肝臓ミクロソームに対して報告された値より４０倍高い比活性（１．２nmol／min／mg膜タンパク）で、極めて効率良く典型的なＣＹＰ２Ｄ６基質ブフラロールの水酸化を触媒した。ブフラロールの１'-水酸化を触媒したＣＹＰ２Ｄ６に対するＶmaxとＫｍはそれぞれ１３．３min-1と１１．１μＭであった（図１１）。
【０２１０】
ompＡシグナルペプチドに融合したＣＹＰ２Ａ６の作成と発現
ompＡシグナルペプチドを全長ＣＹＰ２Ａ６のＮ末端にＰＣＲ法により融合させた。ｐＣＷから発現した組換えompＡ-ＣＹＰ２Ａ６は、細胞全体と膜の双方がこれらの細胞から由来する典型的なＦｅ2+対Ｆｅ2+-ＣＯ差スペクトルを示した（図１３）。細胞全体におけるスペクトル的に活性なＣＹＰ３Ａ６の収量（１９３nmol／l培養、図１４）は類似作成物から発現されたＣＹＰ３Ａ４かＣＹＰ２Ｄ６の何れよりも幾分低かった。しかし、これらの細胞から単離された膜の特異的ＣＹＰ２Ａ６量はヒト肝臓ミクロソームに見出されるレベルを大きく越えていた。
【０２１１】
ompＡシグナルペプチドに融合したＣＹＰ２Ｅ１の作成と発現
ompＡシグナルペプチドを全長ＣＹＰ２Ｅ１のＮ末端に融合させるために同じＰＣＲベースの戦略を用いた。ｐＣＷからの発現により、特異的抗-ＣＹＰ２Ｅ１抗体を使用する免疫ブロット法で検出可能であったタンパク質が細菌膜に出現し（図１５、レーン３）、これはヒト肝臓ミクロソーム（図１５、ライン１）の試料におけるＣＹＰ２Ｅ１と同じ見かけサイズであった。このタンパク質は、空の発現プラスミド、ｐＣＷを担持する大腸菌から単離された膜の試料では見出せなかった（レーン２)。相対的なバンド強度（レーン１と３を比較）から、この細菌株において非常に高いレベルの組換えＣＹＰ２Ｅ１が生産されたことが示唆される。
【０２１２】
更に、ｐＣＷ／ompＡ-ＣＹＰ２Ｅ１からの発現により、菌細胞全体において典型的な還元Ｆｅ-ＣＯ差スペクトルがつくられた（図１６）。但し、この例では、約４２０ｎｍでの吸収極大は他のＰ４５０-発現作成物のものよりもむしろより明白であった。ｐＣＷ/ompＡ-ＣＹＰ２Ｅ１を担持する大腸菌全体におけるスペクトル的に活性なＣＹＰ２Ｅ１の収量は４５１nmol／l培養と推定され、これは類似のompＡ-作成物から細胞全体において生産されるＣＹＰ３Ａ４及びＣＹＰ２Ｄ６のレベルとほぼ同じである。
【０２１３】
３．議論
この実施例は、例えばpelＢ及びompＡのような細菌リーダー配列にＰ４５０類並びにＰ４５０レダクターゼを融合させることにより、大腸菌において非常に機能性のモノオキシゲナーゼ系をつくることができることを証明している。このことは、pelＢリーダー配列への天然Ｐ４５０レダクターゼの融合及びベクターｐＣＷからのこの作成物の発現の後に得られるほぼ十倍増加する機能性Ｐ４５０レダクターゼレベルにより明白に例証される（図１）。Ｐ４５０類とＰ４５０-レダクターゼの同時発現に対して我々が用いたベクターｐＡＣＹＣ１８４からのpelＢ-レダクターゼの発現により、ヒト肝臓ミクロソームにおいて見出されたものと同様の大腸菌膜におけるＰ４５０-レダクターゼレベルを産生した（１００pmolＰ４５０-レダクターゼ／mgタンパク）。我々のアプローチ法の利用性は、pelＢ-Ｐ４５０レダクターゼを、大腸菌において達成されるレベルと同様のレベルでネズミチフス菌においても発現させることができるので（データは示さず）、大腸菌におけるＰ４５０-レダクターゼの発現にのみ限られるものではない。
【０２１４】
更に、細菌リーダー配列に融合したＰ４５０類は、最適なＰ４５０発現に対して必須であると過去には考えられていた（非特許文献１４; 非特許文献１３; Larsonほか (1991) J. Biol. Chem. 266, 7321-7324）Ｐ４５０Ｎ末端の広範な修飾に依存しないで大腸菌において効率的に発現させることができることを我々は証明した。我々の遺伝子融合アプローチは、ＣＹＰ３Ａ４，ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ａ６及びＣＹＰ２Ｅ１（図５、８及び１５）を全てこの戦略を用いて大腸菌において発現できることを我々は示すことができたので、異なる遺伝子ファミリーに属するＰ４５０類に対しても適用可能である。我々は最近このアプローチをＣＹＰ２Ｃ９とＣＹＰ２Ｄ９にも拡張した。
【０２１５】
以前はＣＹＰ３Ａ４とＣＹＰ２Ｄ６のｃＤＮＡは、二次構造を形成する可能性を持つ領域を除去するためにその５'末端を修飾した後に大腸菌において発現されていた（Gonzalezほか (1995) Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 35, 369-390）。これらの修飾はＣＹＰ３Ａ４とＣＹＰ２Ｄ６のＮ末端領域の広範な変化になって現れた（以下これらの修飾タンパク質をそれぞれ１７α-ＣＹＰ３Ａ４及び１７α-ＣＹＰ２Ｄ６と称す）。Ｐ４５０の収量に関しては、ベクターｐＣＷから発現されたompＡ-ＣＹＰ３Ａ４及びompＡ-ＣＹＰ２Ｄ６の収量は１７α-ＣＹＰ３Ａ４及び１７α-ＣＹＰ２Ｄ６に対する刊行値よりも少なくとも１．７及び４．８の係数だけそれぞれ高いので、Ｐ４５０の収量に関し少なくとも我々が試みたＰ４５０類に対しては、我々の遺伝子融合戦略はこのアプローチより優れている（図１２）。我々は、刊行された手順（非特許文献１３; Gillamほか (1995) Arch. Biochem. Biophys. 319, 540-550）に従って我々の研究所において産生された作成物から１７α-ＣＹＰ３Ａ４と１７α-ＣＹＰ２Ｄ６の発現を繰り返すことにより、この観察を補強した。我々はヒスチジン残基の伸展を含むＣ末端伸展を有するpelＢ-ＣＹＰ３Ａ４及びompＡ-ＣＹＰ３Ａ４を発現した。我々はニッケルアガロースアフィニティクロマトグラフィーを使用する構造解析のためにこれらのタンパク質のｍｇ量を精製することができた。
【０２１６】
我々はompＡリーダー融合戦略を拡張して、２つの更なるヒトチトクロムＰ４５０、すなわちＣＹＰ２Ａ６及びＣＹＰ２Ｅ１の発現を可能にした。ＣＹＰ２Ｅ１に対しては、４５１nmol／l培養という我々の発現レベル（図１６）は、通常の配列最適化法を使用して、大腸菌におけるこの酵素の過去に発表された発現レベル（４０nmol/l, 非特許文献２６）よりも一桁大きい。我々の知る限りでは、大腸菌におけるＣＹＰ２Ａ６の発現はこれまで全く報告されていない。従って、我々は我々の系の単純性と多用途性を証明することができた。
【０２１７】
最も重要なことは、遺伝子融合アプローチを、大腸菌における非常に機能性のヒトＰ４５０モノオキシゲナーゼ系を産生するために使用することができることを示したことである。このことは、ompＡ-ＣＹＰ２Ｄ６とpelＢ-Ｐ４５０レダクターゼを同時発現する未処理の大腸菌に観察される高いブフラロール１'-水酸化酵素活性により明白に証明される。この活性（１．２nmol／min／mgタンパク）はヒト肝臓ミクロソームのパネルに対して報告された平均のブフラロール水酸化酵素活性よりも約２０倍高い。また、この大腸菌株から単離された細菌膜は同様の高いＰ４５０酵素活性を示す。ompＡ-ＣＹＰ２Ｄ６はヒト肝臓ミクロソームに対して計算された値（１min-1）よりも、また最適化された細胞遊離系において再構成されたＣＹＰ２Ｄ６について報告されたデータよりも高い基質代謝回転数（４．６min-1）を示す。この結果は、ompＡ-ＣＹＰ２Ｄ６とpelＢ-Ｐ４５０レダクターゼが大腸菌において非常に効率よくカップリングすることを明らかに証明しており、両方のタンパク質が、再構築系において用いられる複合リン脂質組成物と少なくとも同じほど最適であるリン脂質環境において細菌膜の同じ側に位置していることを示唆している。
【０２１８】
ompＡ-ＣＹＰ２Ｄ６及びpelＢ-レダクターゼを発現する大腸菌は、外因的に加えられるＮＡＤＰＨの不存在下でＰ４５０酵素活性を示したので、等価物を還元するソースとして内因性ＮＡＤＰＨを使用することに留意することは重要である。この知見は、レダクターゼ活性部位が、ＮＡＤＰＨの細胞内プールを用いることができる内膜の細胞質側に位置していることを示唆している。この性質は、組換えタンパク質の高収量と技術的に簡単な維持と組み合わせて、系をバイオリアクター用に理想的に適したものとする。しかしながら、我々は、本研究において使用された緩衝液中よりも培養ブロス中に維持したときは、Ｐ４５０基質は、Ｐ４５０類とＰ４５０レダクターゼを同時発現する大腸菌により不充分に代謝されることを観察した。これは、前者の条件下では、基質が菌細胞壁と膜を浸透することができなかったことを示しているのかもしれない。従って、我々は我々の戦略を更に進め、ネズミチフス菌株のＴＡ系列おいて機能性Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ系を発現させた。これらの菌株は、浸透性細胞壁が生じる深部ラフ型変異を含むので、発ガン性試験に頻繁に用いられており、大きなパネルの構造的に雑多な化合物により貫通され得る（Amesほか (1975) Mutat. Res. 31, 347-364; Shimadaほか (1993) Carcinogenesis 14, 1371-1376）。我々は、我々の遺伝子融合戦略を使用して機能性Ｐ４５０-モノオキシゲナーゼ系をネズミチフス菌において産生することができることを示すことができた。
【０２１９】
大腸菌におけるＰ４５０とＰ４５０−レダクターゼ発現レベルは他のベクター又は他の細菌宿主を使用して更に増大させることができる。例えば、我々は、細菌的に発現されたompＡ-ＣＹＰ２Ｄ６のあるものは不適当に折畳まれ、封入体を形成したかもしれないことを観察した。最近、分子シャペロンとチオレドキシンを発現する大腸菌株が入手できるようになった（Yasukawaほか (1995) J. Biol. Chem. 270, 25328-25331）。新たに合成されたタンパク質の間違った折畳みを防止するこれらのタンパク質を発現させると、幾つかの組換えタンパク質に対して更に高い収量が得られるようになる。これらの菌株はまたｐＣＷよりもより強い細菌プロモーターを含む発現ベクターからＰ４５０類を発現させるために用いることもできる。例えば、我々は、ｐＥＴ系列のベクターにおいて強力なＴ７ポリメラーゼプロモーターの調節下で高レベルの組換えＣＹＰ３Ａ４を大腸菌において発現できることを観察した。しかしながら、組換えＣＹＰ３Ａ４のほんの僅かな画分だけがスペクトル的に活性であった。更に、Ｐ４５０類のＰ４５０-レダクターゼとのカップリングが、Ｐ４５０とＰ４５０レダクターゼを含む再構築系においてＰ４５０酵素活性を刺激することが最近示されたＰ４５０-レダクターゼＦＭＮドメインの同時発現により更に改良することができると思料される。
【０２２０】
要約すると、我々は、Ｐ４５０類の効率的な細菌発現に対する一般的なアプローチ法を開発し、このアプローチ法を非常に高い機能性のＰ４５０依存性モノオキシゲナーゼ系を含む細菌を産生するために使用することができることを証明した。これらのモデルは薬物開発及び生体触媒反応において重要な商業的用途を有している。
【０２２１】
＜実施例３＞
【０２２２】
ネズミチフス菌における発現
例えばＴＡ１５３８とＴＡ１５３５のようなある種のネズミチフス菌株におけるＰ４５０とＰ４５０類の同時発現は上述の大腸菌系から即座に適応化される。双方の種において同じベクター系を用いることができる。ベクターは、Ｐ４５０発現に使用される大腸菌株（例えばＪＭ１０９又はＤＨ５α）から大腸菌株ＬＡ５０００を通って、またそこからネズミチフス菌株まで先ず通過する。しかし、変異原生試験において頻繁に使用されるネズミチフス菌株ＴＡ９８とＴＡ１００におけるＰ４５０類の発現には、戦略は僅かに修正されなければならない。ＴＡ９８とＴＡ１００は、これらの菌株においてＳＯＳ修復を増大させ、同時に変異誘発物質に対する感受性を増大させるプラスミドｐＫＭ１０１を担持する。しかし、このプラスミドはまたアンピシリナーゼをコード化する。これらの菌株における発現プラスミドｐＣＷからのＰ４５０類の発現には、ｐＣＷ上のアンピシリナーゼマーカーをテトラサイクリン耐性マーカーと置換しなければならない。ネズミチフス菌におけるＰ４５０発現の他の育成条件及び誘導は大腸菌系と同様である。しかし、Ｐ４５０誘導期の間は育成培地からテトラサイクリンを省くことが望ましいことを我々は見出した。
【０２２３】
＜実施例４＞
外膜浸透性を変更した場合の大腸菌とネズミチフス菌株におけるＣＹＰ３Ａ４とＰ４５０レダクターゼの発現
【０２２４】
１．材料と方法
細菌株とプラスミド
用いた大腸菌Ｋ-１２株はＪＭ１０９（Yanisch ほか (1989) Gene 33, 103-19）、ＡＢ１１５７（Howard-Flandersほか (1964) Genetics 49, 237-246）及びＮＳ３８７８（ChaterjeeとSternberg (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92, 8950-8954）であった。ネズミチフス菌株はＴＡ１５３５であった（Ames (1975) Mutat. Res. 31, 347-352）。ＮＳ３６７８は株ＡＢ１１５７tolＣ(λＬＰ１)であり、tolＣ突然変異はＴｎl０tetｒ挿入による。ＴolＣ-変異体は疎水性薬剤に極めて敏感であり（Whitney (1970) Genetics 30, 39-59）、このタンパク質は外膜におけるリポ多糖の構築においてある役割を担うと提案されている（Schnaitmannと Klena (1993) Microbiol. Rev 57, 655,682）。ネズミチフス菌株ＴＡ１５３５はrfa突然変異を担持し、欠陥のある外膜を有している。ＣＹＰ３Ａ４とＰ４５０レダクターゼの同時発現は以前の例において記載されているプラスミドｐＢ２１６を使用して達成された。
【０２２５】
ＣＹＰ３Ａ４とＰ４５０レダクターゼの同時発現
発現に用いたプロトコールは、ＮＳ３６７８[ｐＢ２１６]に対してテトラサイクリン（１０μg/l）が画線プレートと一晩のＬＢ培養に含まれ、テリフィックブロスには含まれなかったことを除いて先に記載したものと同じであった。ＣＹＰ３Ａ４量はＦｅ２＋-ＣＯ対Ｆｅ２＋差スペクトルを使用して細菌細胞全体において決定した。
【０２２６】
ＣＹＰ３Ａ４基質での未処理細胞のインキュベーション
通常の２０−２４時間の誘導後、遠心分離により収集する前に細胞を氷上で１０分間冷却した。ついで、１／１０容量のＭ９＋グルコース（１０ｍＭ）中に再懸濁する前に等しい容量の氷冷１ｘＭ９塩溶液で細胞を一度洗浄した。細胞に激しいピペッティングを被らせないように留意した。ＣＹＰ３Ａ４基質でのインキュベーションに必要になるまで、細胞懸濁液を氷上に貯蔵し、５００μｌを除去し、４．５ｍｌのＭ９＋グルコースを含む５０ｍｌのポリプロピレン管に加えた。２００μＭの最終濃度でテストステロン又はニフェジピンの何れかを添加して反応を開始させる前に３７℃で軌道振盪機において５−１０分間管をプレインキュベートした。必要に応じて、２００μｌの細胞懸濁液を除去し、１００μｌのメタノールと５μｌの６０％過塩素酸を含む１．５ｍｌのエッペンドルフマイクロ遠心管に移した。この管を逆にして混合し、遠心分離して沈殿物を除去する前に１０分間氷上に保管した。上清をＨＰＬＣ分析のためにマイクロバイアルに移した。先に記載されているようにして代謝物を分離し、既知の標準物質を参照して６β-ＯＨＴ又はニフェジピンオキシドの収量を計算した。
【０２２７】
２．結果
４種の菌株におけるＣＹＰ３Ａ４とＰ４５０レダクターゼの発現
Ｐ４５０発現とＰ４５０レダクターゼ活性のレベルを表Ａに示す。ＮＳ３６７８[ｐＢ２１６]細胞におけるＣＹＰ３Ａ４量は、他の３つの菌株におけるよりも有意に低く、典型的には約３０nmol／lである。この理由は不明であり、この菌株における発現には更なる最適化が必要となる。
【０２２８】
表Ａ：未処理のＪＭ１０９、ＡＢ１１５７、ＮＳ３６７８及びＴＡ１５３５ｐＢ２１６細胞によるテストステロン及びニフェジピンにおけるＣＹＰ３Ａ４の発現レベルとそのＣＹＰ３Ａ４-依存性代謝
【０２２９】
【表３】
【０２３０】
Ｐ４５０量はＦｅ２＋-ＣＯ対Ｆｅ２＋差スペクトルにより測定した。含量は少なくとも３回の実験の平均±ＳＤとして表す。
【０２３１】
代謝回転数はnmol生成物／min／nmolP450として記録し、±ＳＤとして示す。検出された生成物は６βヒドロキシテストステロンとニフェジピンオキシドであった。
【０２３２】
ＣＹＰ３Ａ４及びＰ４５０レダクターゼを発現する未処理大腸菌及びネズミチフス菌によるテストステロン及びニフェジピンの代謝
【０２３３】
４つの菌株によるテストステロンとニフェジピンの代謝回転を表Ａに示す。ＪＭ１０９[ｐＢ２１６]を用いる過去の研究から、細胞がＥＤＴＡを含む緩衝液（ＴＳＥ）中に懸濁されて浸透圧ショックを受けないならばテストステロンの代謝は無視できることが示されている。このことはここで確認され、１０分のインキュベーション後の代謝回転は０．１５nmol６β-ＯＨＴ／nmolP450／分だけであった。これに対して、他の２つの大腸菌株におけるテストステロン代謝は更により広範であり、ＮＳ３６７８[ｐＢ２１６]はＪＭ１０９[ｐＢ２１６]よりも１００倍高い１５．３の代謝回転を持ち特に印象的である。ネズミチフス菌株ＴＡ１５３５[ｐＢ２１６]もまたテストステロンに対してＪＭ１０９[ｐＢ２１６]よりも強い活性を示したが、３−４倍に過ぎなかった。ニフェジピンに対する代謝回転は、株内差異がテストステロンの場合ほど顕著ではないが、同様なパターンに従った。大腸菌株ＮＳ３６７８［ｐＢ２１６］とＡＢ１１５７[ｐＢ２１６]もまた約１８nmolニフェジピンオキシド／nmolＰ４５０／分で最も高い活性を示し、ＴＡ１５３５[ｐＢ２１６]とＪＭ１０９[ｐＢ２１６]に対する代謝回転はそれぞれ約３及び１５倍低かった。
２つの基質ニフェジピンとテストステロンでの時間経過インキュベーションの結果を図１７と図１８にそれぞれ示す。２つの最も広範に代謝する菌株ＡＢ１１５７とＮＳ３６７８では、代謝物の蓄積は１−２時間継続し、２０−３０％の収量を表す３０−４０μＭの範囲の代謝物最終濃度になった。およそ１時間のインキュベーションの後の線形性の喪失はＣＹＰ３Ａ４の喪失又は代謝物の阻害によるものであろう。
【０２３４】
３．議論
先の実施例に記載した研究は、常套的に発現に用いられている大腸菌株であるＪＭ１０９は、細胞をＴＳＥ緩衝液中で浸透圧ショックを受けさせないなら、ＣＹＰ３Ａ４とレダクターゼを同時発現するとき、テストステロンの水酸化を触媒することができなかったことを示している。この代謝の欠如はほぼ間違いなく大きな疎水性分子に対する大腸菌外膜の不浸透性のためであり（NikaidoとVaara (1985) Microbiol. Rev 49, 1-32）、バイオリアクター系における多量のある種のＰ４５０代謝物の産生にはこの菌株は適さない。外膜浸透性は必ずしも全てのＰ４５０基質にとっての問題ではないと思われ、例えば我々は、ＣＹＰ１Ａ２とＰ４５０レダクターゼを発現する未処理のＪＭ１０９における７-エトキシレゾルフィンの代謝回転は浸透圧的にショックを受けた細胞のものに匹敵することを見出した（データは示さず）。突然変異体tolＣ遺伝子を担持するＮＳ３６７８のような大腸菌株は疎水性薬剤に対して過敏であることが知られ、Ｐ４５０基質に対する浸透性もまた増加することが予想された。ＪＭ１０９[ｐＢ２１６]に対してＮＳ３６７８[ｐＢ２１６]によるテストステロンとニフェジピンの極めて高い代謝回転に基づくと、この通りであると思われる。現在のところ、菌株ＮＳ３６７８におけるＰ４５０発現レベルは比較的低い。これは、成長条件を最適化することにより改善することができるものと思われる。しかしながら、親株ＡＢ１１５７[ｐＢ２１６]における発現レベルはＪＭ１０９[ｐＢ２１６]のものに匹敵し、基質代謝回転がかなりより高いという利点がある。これは、部分的に欠陥のある外膜をもたらすこの菌株によりなされるrfbＤ１変異によると思われる。我々の研究は、大腸菌の「浸透性」株における機能性Ｐ４５０モノオキシゲナーゼの発現の最初の例である。ここに記載した系は全てのＰ４５０類の発現に対して適用することができ、「バイオリアクター」系における広範囲のＰ４５０代謝物の生産を容易にする。
【０２３５】
４．まとめ
Ｐ４５０レダクターゼと共にＰ４５０類を同時発現した大腸菌ＪＭ１０９又はＤＨ５αは、膜の浸透性を変更する緩衝液（ＴＳＥ）での処理の後にのみ基質を代謝した。我々は今これらの酵素を浸透性細胞壁を持つネズミチフス菌ＴＡ１５３５及び大腸菌株において発現させた。生理的ブロス（最少培地＋グルコース）の存在下で、基質の代謝はＴＳＥ緩衝液に再懸濁された細胞を用いて見出されたものに近づく代謝回転速度で６０分を越えて線形であることを示すことができた。
【０２３６】
＜実施例５＞
レダクターゼとのompＡ-及びompＡ(+2)-Ｐ４５０類の同時発現
【０２３７】
１．材料と方法
プラスミド
２つのＰ４５０発現プラスミド、ｐＣＷ／ompＡ(+2)-ＣＹＰ３Ａ４とｐＣＷ／ompＡ(+2)-ＣＹＰ２Ａ６を作成した。それぞれの場合、ＯmpＡシグナルペプチドとＰ４５０Ｎ末端の間に、成熟ＯmpＡタンパクの最初の２つのアミノ酸に対応するジペプチド「リンカー」(-Ａla-Ｐro-)を挿入するためにＰＣＲ法を用いた。Ｎ末端配列解析のためのアフィニティクロマトグラフィーによる組換えＣＹＰ３Ａ４の容易な精製を可能にするために（以下を参照）、２つの更なるプラスミド、ｐＣＷ／ompＡ-ＣＹＰ３Ａ４(Ｈis)６及びｐＣＷ／ompＡ(+2)-ＣＹＰ３Ａ４(his)６をまた作成した。ここで、６つのヒスチジン残基がＰ４５０のＣ末端に添付された。
【０２３８】
２．同時発現方法
別個の適合性があるプラスミドからのＰ４５０とレダクターゼの同時発現に対する基本的な方法はこれまでの実施例に既に記載している。
【０２３９】
クマリン７-水酸化酵素アッセイ
５００μｌの全容量中に２０pmolのＣＹＰ２Ａ６、５０μＭのクマリン、及びＮＡＤＰＨ産生系（先に実施例１に記載）を含む１００ｍＭのトリス-ＨＣｌ（ｐＨ７．４）において膜アッセイを実施した。菌細胞についてのアッセイは、５ｍｌの全容積のＴＳＥ緩衝液中で行い、１mlインキュベーション当り５０pmolのＣＹＰ２Ａ６と５０μＭのクマリンを含んでいた。試料（５００μｌ）を時折取り出し、代謝物生成につき分析した。細胞と膜のアッセイからの試料の処理は同じであった：反応は７２μｌの１２．５％トリクロロ酢酸の添加により停止させ、氷上に配した。ついでジクロロメタン（１ｍｌ）を添加し、管を激しくボルテックスした。ついで２つの相に分離する遠心分離に続いて、上（水性）層を破棄した。下の有機相の一定分量（５００μｌ）をついで３ｍｌの３０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）を含む新しい管に移した。ついで管をボルテックスし、もう一度遠心分離した。ついで上（水性）相中の代謝物を、信頼性のある標準物質（ウンベリフェロン、シグマ）を参照して、それぞれ３５８及び４５８ｎｍの励起及び放射波長を用いて、蛍光定量的に定量した。
【０２４０】
組換えＰ４５０の精製とＮ末端配列分析
ｐＣＷ／ompＡ-ＣＹＰ３Ａ４(Ｈis)６及びｐＣＷ／ompＡ(+2)-ＣＹＰ３Ａ４(his)６の発現を先に記載されたようにして実施した。細胞のリゾチーム処理と遠心分離に続いて、スフェロプラストを結合緩衝液（５００ｍＭの塩化カリウムと２０％のグリセロール(v/v)を含む２０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．４）に再懸濁し、−７０℃で貯蔵した。１２５ｍｌの培養から採られたスフェロプラストは典型的には９ｍｌの緩衝液中に再懸濁された。Ｐ４５０の精製では、スフェロプラストを氷上で融解し、７０％の出力でＭＳＥ SoniPrep１５０超音波処理器を使用して、プロテアーゼインヒビター、アプロチニン（１μg/ml）、ロイペプチン（１μg/ml）及びＰＭＳＦ（１ｍＭ）の存在下で超音波処理した。遠心分離（１．２ｘ１０４ｇ、１２分、４℃）後、上清タンパクをEmulgen９１１（１mg/mgタンパク）の存在下で４℃で６０分間攪拌して溶解させた。混合物を遠心分離（１０５ｇ、６０分、４℃）により清澄化し、ついでニッケルイオンが充填され０．１０％のEmulgen９１１(w/v)を含む結合緩衝液で予備平衡化されたＨｉ-Ｔｒａｐキレートカラム（ファーマシア）上に配置した。カラムを更に１０カラム容量の結合緩衝液（Emulgen911を含む）で洗浄し、ついで弱く結合したタンパク質を５カラム容量の洗浄緩衝液（０．１０％のEmulgen911(w/v)と７５ｍMのイミダゾールを含む結合緩衝液）で除去した。赤色のＰ４５０バンドを溶出緩衝液（０．１０％のEmulgen911(w/v)と１Ｍのイミダゾールを含む結合緩衝液）で溶出させた。−イミダゾール濃度を高く保ち、Ｐ４５０をできるだけ少ない容量に溶出させた。タンパク質の試料はアニオン交換緩衝液（２０％のグリセロール(v/v)、０．２ｍＭのジチオスレイトール、１ｍＭのＥＤＴＡ及び０．１０％のEmulgen９１１(w/v)を含む２０ｍＭのトリス-Ｃｌ、ｐＨ７．５）を数回交換して４℃で一晩かけて透析し、Ｈｉ-ＴｒａｐＱカラム（ファーマシア）上に配した。Ｐ４５０を含む流通画分を、２０％のグリセロール(v/v)、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ及び０．０５％のナトリウムキレート(w/v)を含む１０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４で平衡化したEcono-Pac(登録商標)ＨＴＰカートリッジ（バイオラッド）上に配した。リン酸ナトリウムの濃度をカラム洗浄の間２５ｍＭまで、ついで１００ｍＭまで増加させ、Ｐ４５０を４００ｍＭのリン酸塩で溶出させた。手順の各段階におけるＰ４５０調製物の純度はＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により、クーマシーブリリアントブルーＲ-２５０で染色した９％のアクリルアミド(w/v)ゲル上で評価した。Ｎ末端配列決定精製タンパクはついでＰｒｏ-Ｂｌｏｔポリビニリデンフロリド膜（アプライドバイオシステム）上に移され、染色された。Ｎ末端アミノ酸配列解析を、４ないし６サイクルのエドマン分解でモデル４７６Ａ機器（アプライドバイオシステム）を用いてダンディー大学の生化学学部において実施した。
【０２４１】
３．結果
レダクターゼとのompＡ-Ｐ４５０類の同時発現
先に報告されているように、ｐＣＷ／ompＡ-ＣＹＰ２Ｄ６から発現されたＰ４５０は同時発現されたレダクターゼとよくカップリングし典型的なＣＹＰ２Ｄ６-依存性活性を触媒する（実施例２を参照）。ompＡ-ＣＹＰ２Ｄ６に対して測定された代謝回転は、一般に、対応するｐＣＷ／１７α-ＣＹＰ２Ｄ６作成物から測定されたものよりも僅かに高かった（データは示さず）。
【０２４２】
我々はそれ以来、ＣＹＰ３Ａ４及びＣＹＰ２Ａ６を含む大腸菌においてレダクターゼと共に多くの他のompＡ-Ｐ４５０類を同時発現させた。ＣＹＰ２Ｄ６に対して、これらの２つのompＡ-Ｐ４５０類は、プローブ基質に対する酵素活性が一般により低いので対応する１７α-Ｐ４５０類と同じほどレダクターゼと効率的にはカップリングしないようである。例えば、細胞と膜の双方におけるクマリン７-水酸化酵素活性は、１７α-ＣＹＰ２Ａ６と比較してompＡ-ＣＹＰ２Ａ６では一桁以上低い（表Ｂ）。同様に、ＣＹＰ３Ａ４に対しては、膜画分におけるテストステロン６β-水酸化酵素活性はompＡ-作成物では減少する（表Ｃ）。しかし、２つの作成物の間のこの差異は、我々が用いた異なるプローブ基質であるニフェジピンではみられないことは興味深い（表Ｃ）。このことは可能な場合はどこででも数種のマーカー活性を用いる必要性を強調する。
【０２４３】
表Ｂ：２つのプラスミド系におけるレダクターゼと同時発現されたＣＹＰ２Ａ６の収量と活性
【０２４４】
【表４】
【０２４５】
可能な場合は、値は、少なくとも３回の独立した測定に基づき、平均±ＳＤとして表した。チトクロムＰ４５０は、２０％(v/v)グリセロール、１０ｍＭのＣＨＡＰＳ及び１ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭのトリス-ＨＣｌ、ｐＨ７．４中でのＦｅ２＋-ＣＯ対Ｆｅ２＋差分光法により定量化した。
【０２４６】
＊ＣＹＰ２Ａ６に対するプローブ活性は蛍光定量的に測定した。
【０２４７】
レダクターゼとのompＡ-Ｐ４５０類のカップリングが相対的に欠けることに対する説明を見つけるために、６のヒスチジン残基をｐＣＷ／ompＡ-ＣＹＰ３Ａ４から発現されたＰ４５０のＣ末端に添付した。これにより、ニッケルキレートアフィニティクロマトグラフィー（材料と方法において記載）による組換えタンパク質の精製が容易になった。これは、ompＡ-Ｐ４５０が細菌シグナルペプチダーゼによる予期されたプロセシング（そこではシグナルペプチドが保持される）を受けていなかったことを明らかにした。これは、シグナルペプチダーゼの利用性が、特に低いプロセシング効率を持つハイブリッド前駆物質に対しては限られていることが知られているので、Ｐ４５０の過剰発現の一般的レベルを反映する（van Dijlほか (1991) Mol. Gen. Genet. 227, 40-48）。
【０２４８】
シグナルペプチダーゼ活性に強く影響を与える他の因子は、シグナルペプチドの後の最初の数個のアミノ酸を含む（Barkocy-GallagherとBassford (1992) J. Biol. Chem. 267, 1231-1238; Nilssonとvon Heijne (1992) FEBS Lett. 299, 243-246）、シグナル切断の部位の周りの構造である（DuffaudとInoyue (1988) J. Biol. Chem. 263, 10224-10228; Barkocy-Gallagherほか (1994) J. Biol. Chem. 269, 13609-13613）。非切断シグナルペプチドを持つタンパク質の過剰発現は、細胞の転位置装置を完全にブロックすることができ、タンパク前駆物質の蓄積に至る（Barkocy-GallagherとBassford (1992) J. Biol. Chem. 267, 1231-1238）。我々の作成物では、シグナルペプチドに直ぐに続く配列はＣＹＰ３Ａ４のＮ末端である。切断部位に対して＋１の位置にあるアミノ酸は従ってメチオニンであり、一方細菌遺伝子中のこの位置にはアラニンが強く望まれる（von Heijne (1986) Nucl. Acids Res. 14, 4683-4690）。
【０２４９】
従って、我々はシグナルペプチドの除去の確率を改善するために３つの可能な戦略を考えることができる。第１に、細菌シグナルペプチダーゼを別個の適合性があるプラスミドから過剰発現させるもので、その幾つかのものは開示されている（van Dijlほか (1991) Mol. Gen. Genet. 227, 40-48; DalbeyとWickner (1985) J. Biol. Chem. 260, 15925-15931; MarchとInoue (1985) J. Biol. Chem. 260, 7206-7213）。この最初のアプローチに対する代替方法として、あるいは恐らくそれと共に、短いＮ末端伸展を持つＰ４５０を生産するという不具合があるかも知れないけれども、シグナルペプチドとＰ４５０の間に短い「リンカー」配列を導入することが推奨される。最後に、異なった細菌株において発現を試みることも、ハイブリッド融合タンパクからのシグナルペプチドの除去度合いに影響を及ぼすことが示されているので、試みることができる（Monteilhetほか (1993) Gene 125, 223-228）。
【０２５０】
シグナル保持のこの問題を解決するために、我々は、ＯmpＡリーダーとＰ４５０のＮ末端との間に成熟ＯmpＡタンパクの最初の２つのアミノ酸（-Ala-Pro-）を導入することにより切断部位を修飾することに決めた。その結果、ｐＣＷ／ompＡ(+2)+ＣＹＰ２Ａ６とｐＣＷ／ompＡ(+2)-ＣＹＰ３Ａ４（上述）の作成物が得られた。ompＡ-Ｐ４５０類に対して、これらのompＡ(+2)-Ｐ４５０類は同時発現されるレダクターゼとより効率的にカップリングし、より高い基質代謝回転をもたらすようである（表Ｂ及びＣ）。ｐＣＷ／ompＡ(+2)-ＣＹＰ３Ａ４(Ｈis)６から発現される組換えタンパク質をついで精製し、Ｎ末端配列分析を行う。これにより、細菌シグナルペプチダーゼによりタンパク質が正しくプロセシングを受け、Ｎ末端にアラニン-プロリン−を含む天然ＣＹＰ３Ａ４の細菌膜に蓄積されるようになることが明らかになった。
【０２５１】
表Ｃ：２つのプラスミド系におけるレダクターゼとの同時発現ＣＹＰ３Ａ４の収量と活性
【０２５２】
【表５】
【０２５３】
可能な場合は、値は、少なくとも３回の独立した測定に基づき、平均±ＳＤとして表した。
チトクロムＰ４５０は、２０％(v/v)グリセロール、１０ｍＭのＣＨＡＰＳ及び１ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭのトリス-ＨＣｌ、ｐＨ７．４中でのＦｅ２＋-ＣＯ対Ｆｅ２＋差分光法により定量化した。
【０２５４】
＊ 細菌膜画分において測定
§レダクターゼ活性の１単位は毎分当たりに還元されたチトクロムｃの１nmolとして定義される。
†２つの既知のＣＹＰ３Ａ４基質の代謝は３０ｍＭのＭｇＣｌ２の存在下で膜画分において評価された。
活性はｎｍｏｌＣＹＰ３Ａ４当り毎分当りに形成されたｎｍｏｌの代謝回転として表した。
【０２５５】
４．まとめ
Ｐ４５０類に対するｏｍｐＡリーダー配列の直接の融合は、同時発現されたレダクターゼとカップリングするＰ４５０アイソザイムには必ずしもならない。Ｐ４５０配列に融合したｏｍｐＡ配列の潜在的な切断部位のアミノ酸残基を変更すると、カップリングとリーダー配列の効果的な除去がもたらされる。
【図面の簡単な説明】
【０２５６】
【図１】ｐＢ２１６の作成 プラスミドＮＦ１４は、ＳａｌＩとＢｇｌＩＩ末端を持つｔｒｐＡターミネーターからなる徐冷オリゴヌクレオチド対により、存在する転写ターミネーターを置換することにより修飾した。この修飾により第２のＢｇｌＩＩ部位を除去し、残りのＢｇｌＩＩ部位で続くクローニングをなし、プラスミドｐＢ２１５を作成した。ＰｔａｃＰｔａｃプロモーターと共にｐｅｌＢレダクターゼを含むＢｃｌＩ−ＢｇｌＩＩ断片をｐＢ２０７からｐＢ２１５のＢｇｌＩＩ部位にサブクローニングし、同時発現プラスミドｐＢ２１６を作成した。ｐｅｌＢ−レダクターゼ挿入断片の配向は示されている通りであることが見出された。
【図２】大腸菌において発現されたレダクターゼとＣＹＰ３Ａ４を含む膜画分のウェスタンブロット １０μの各膜画分を各トラックに載せた。負荷の順序はブロットの上に沿って示されている。各発現サンプルはその非誘導対応物と並べて示されている。免疫検出はレダクターゼとＣＹＰ３Ａに対する抗体を用いて実施された。ヒトの肝臓ミクロソームのトラック（１０μｇのミクロソームタンパク質）を参照トラックとして含めた。
【図３】本研究に用いられる２つの発現ベクターの提示 プラスミドｐＣＷ（図３Ａ）は、ｃｏｌＥ１複製開始点とβ−ラクタマーゼ遺伝子を含み、アンピシリンやカルベニシリンのような抗生物質に対する耐性をもたらす。これはＰ４５０のｃＤＮＡの発現に使用した。プラスミドｐＡＣＹＣ１８４（図３Ｂ）はｐ１５Ａ複製開始点を含み、Ｐ４５０ｃＤＮＡをｐＣＷから同時に発現されているときに、Ｐ４５０レダクターゼのｃＤＮＡを発現するために使用した。ｐＡＣＹＣ１８４の選択に使用された抗生物質はクロラムフェニコールであった。独特の制限部位が強調文字で示されている。
【図４】細菌膜におけるＰ４５０レダクターゼの発現を示すウェスタンブロット タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロース膜上に移し、ウサギの抗レダクターゼ一次抗体と西洋わさびペルオキシダーゼ連結抗ウサギＩｇＧ二次抗体で探索した。検出は化学ルミネッセンスによった。タンパク質負荷はトラック当り１０μｇであった。非誘導及び誘導条件下での野生型Ｐ４５０レダクターゼのｃＤＮＡの発現はトラック１及び２にそれぞれ示す。細菌ｐｅｌＢリーダー−Ｐ４５０レダクターゼＮ末端融合タンパクの対応する発現はトラック３及び４に示す。ヒトの肝臓ミクロソームの試料を比較のためにトラック５に示す。レダクターゼ活性（ｍｇタンパク質当り分当りに還元されたチトクロムｃのｎｍｏｌ）は図の下に示す。
【図５】細菌膜におけるｐｅｌＢ−及びｏｍｐＡ−ＣＹ３Ａ４の発現を示すウェスタンブロット タンパク質を９％のアクリルアミドゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロース上に移し、ウサギの抗ＣＹＰ３Ａ一次抗体と西洋わさびペルオキシダーゼ連結抗ウサギＩｇＧ二次抗体で探索した。検出は化学ルミネッセンスによった。レーン２と３は、それぞれｐｅｌＢ−ＣＹＰ３Ａ４かｏｍｐＡ−ＣＹＰ３Ａ４の何れかを発現する細菌から単離した膜を含む（トラック当り２４μｇのタンパク質）。レーン１はヒトの肝臓ミクロソームの試料を比較のために含む（８μｇのタンパク質）。
【図６】ｐｅｌＢ−ＣＹＰ３Ａ４（図６Ａ）、ｏｍｐＡ−ＣＹＰ３Ａ４（図６Ｂ）を発現する細菌全体、あるいはこれらの細胞由来の膜から得られた還元Ｆｅ−ＣＯスペクトル 一定分量の細胞又は膜を１：２０で２０％のグリセロール、１０ｍＭのＣＨＡＰＳ及び１ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４中に希釈し、数結晶の亜ジチオン酸ナトリウムを添加して還元し、ついで一対の適合ガラスキュベット間に等しく分けた。５００から４００ｎｍの範囲に対するベースラインスペクトルの決定に続いて、試料キュベットを約１分間ＣＯで穏やかに泡立てた。ついで走査を繰り返し、９１ｍＭ−１ｃｍ−１の消衰係数を用いてＰ４５０量を推定した。
【図７】還元Ｆｅ−ＣＯ差スペクトル（上記参照）から推定した大腸菌における異なる作成物からのＣＹＰ３Ａ４の発現レベルのまとめ 結果を平均±ＳＤとして表した。尚、側定数は括弧で示す。標準化した条件（テリフィックブロス、３０℃、２４時間誘導）±０．５ｍＭδ−ＡＬＡ下で細胞を育成した。
【図８】細菌膜におけるｏｍｐＡ−ＣＹＰ２Ｄ６の発現を示すウェスタンブロット タンパク質を９％のアクリルアミドゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロース上に移し、ウサギ抗ＣＹＰ２Ｄ６及び抗レダクターゼ一次抗体の混合物で探索し、続いて西洋わさびペルオキシダーゼ連結抗ウサギＩｇＧ二次抗体で探索した。検出は化学ルミネッセンスによった。トラック１ないし４はそれぞれ２．５μｇの細菌膜タンパクを含む。トラック５は１０μｇのヒト肝臓ミクロソームを含み、トラック６はタンパク標準物質を含む。膜は、空の発現ベクター、ｐＣＷ（レーン１）、ｏｍｐＡ−２Ｄ６のみ（レーン２）、又はヘム前駆物質δアミノレブリン酸の不存在下（レーン３）又は存在下（レーン４）の何れかで培養したｏｍｐＡ−２Ｄ６プラスＰ４５０レダクターゼを担持する細胞から単離した。
【図９】ｏｍｐＡ−ＣＹＰ２Ｄ６のみ（図４Ａ）、Ｐ４５０レダクターゼと同時発現されたｏｍｐＡ−ＣＹＰ２Ｄ６（図４Ｂ）を発現する細菌全体、あるいはこれらの細胞由来の膜から得られた還元Ｆｅ−ＣＯスペクトル 一定分量の細胞又は膜を１：２０で２０％のグリセロール、１０ｍＭのＣＨＡＰＳ及び１ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４中に希釈し、数結晶の亜ジチオン酸ナトリウムを添加して還元し、ついで一対の適合ガラスキュベット間に等しく分けた。５００から４００ｎｍの間のベースラインスペクトルの決定に続いて、試料キュベットを約１分間ＣＯで穏やかに泡立てた。ついで走査を繰り返し、９１ｍＭ−１ｃｍ−１の消衰係数を用いてＰ４５０量を推定した。
【図１０】還元Ｆｅ−ＣＯ差スペクトル（上記参照）から推定した大腸菌において単独で発現されたとき又はＰ４５０レダクターゼと同時発現されたときのｏｍｐＡ−ＣＹＰ２Ｄ６の観測レベルのまとめ 結果を平均±ＳＤとして表した。尚、側定数は括弧で示す。標準化した条件（テリフィックブロス、３０℃、２４時間誘導）±０．５ｍＭδ−ＡＬＡ下で細胞を育成した。
【図１１】ｏｍｐＡ−ＣＹＰ２Ｄ６とＰ４５０レダクターゼを同時発現する細菌膜におけるブフラロールの１’−ヒドロキシル化に対して決定された動力学的パラメータ タンパク質と時間（図示せず）に関して比例した生成物の形成をもたらす条件でＮＡＤＰＨ産生系の存在下で基質の濃度を変えて（０−１００μＭ）３７℃で膜をインキュベートした。生成物形成の度合いを信頼のおける標準品を基準にして逆相ＨＰＬＣにより評価した。動力学的パラメータを基質濃度に対する初速度の二重逆数プロットから推定した。
【図１２】欠失と突然変異によるＰ４５０のＮ末端の修飾後に他のものにより得られた収量と比較した、遺伝子融合戦略を用いて大腸菌において達成されたＰ４５０の収量
【図１３】ompＡ-ＣＹＰ２Ａ６を発現する細菌全体、あるいはこれらの細胞由来の膜から得られた還元Ｆｅ-ＣＯスペクトル 一定分量の細胞又は膜を１：２０で２０％のグリセロール、１０ｍＭのＣＨＡＰＳ及び１ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭのトリス-ＨＣｌ、ｐＨ７．４中に希釈し、数結晶の亜ジチオン酸ナトリウムを添加して還元し、ついで一対の適合ガラスキュベット間に等しく分けた。５００から４００ｎｍの間のベースラインスペクトルの決定に続いて、試料キュベットを１分間ＣＯで穏やかに泡立てた。走査を繰り返し、９１ｍＭ−１ｃｍ−１の消衰係数を用いてＰ４５０量を推定した。
【図１４】還元Ｆｅ−ＣＯスペクトル（上記参照）から推定した、大腸菌において単独で発現されたときのｏｍｐＡ−ＣＹＰ２Ａ６の観測レベルのまとめ 結果を平均±ＳＤ、ｎ＝３として表した。尚、側定数は括弧で示す。δアミノレブリン酸（０．５ｍＭ）の存在下で標準化した条件（テリフィックブロス、３０℃、２４時間誘導）で細胞を育成した。
【図１５】細菌膜におけるｏｍｐＡ−ＣＹＰ２Ｅ１の発現を示すウェスタンブロット タンパク質を９％のアクリルアミドゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロース上に移し、ヒツジ抗ＣＹＰ２Ｅ１一次抗体と西洋わさびペルオキシダーゼ連結抗ヒツジＩｇＧ二次抗体で探索した。検出は化学ルミネッセンスによった。レーン２は空の発現プラスミド、ｐＣＷを送り出す対照細菌から単離された膜を、レーン３はｏｍｐＡ−ＣＹＰ２Ｅ１から単離された膜を含む（それぞれの場合トラック当り２４μｇのタンパク質）。レーン１は比較のためのヒト肝臓ミクロソームの試料（８μｇのタンパク質）を含む。
【図１６】ｏｍｐＡ−ＣＹＰ２Ｅ１を発現する細菌全体から得られた還元Ｆｅ−ＣＯスペクトル 一定分量の細胞を１：２０で２０％のグリセロール、１０ｍＭのＣＨＡＰＳ及び１ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４中に希釈し、数結晶の亜ジチオン酸ナトリウムを添加して還元し、ついで一対の適合ガラスキュベット間に等しく分けた。５００から４００ｎｍの間のベースラインスキャンの決定に続いて、試料を１分間ＣＯで穏やかに泡立てた。走査を繰り返し、９１ｍＭ−１ｃｍ−１の消衰係数を用いてＰ４５０量を推定した。 発現レベル：細胞全体で４５１ｎｍｏｌ／ｌ培養。
【図１７】未処理のＪＭ１０９、ＡＢ１１５７、ＮＳ３６７８及びＴＡ１５３５［ｐＢ２１６］細胞におけるＣＹＰ３Ａ４によるニフェジピンの代謝 グルコース（１０ｍＭ）を補充したＭ９塩において振盪（２００ｒｐｍ）しながら３７℃でインキュベーションを行った。０．５ｍｌの１０ｘ濃縮細胞を４．５ｍｌの緩衝液に加え、２００μＭの最終濃度までニフェジピンを添加するまで５−１０分間３７℃で前もって平衡化した。時々、２００μｌの分量を除去して、実施例４における材料と方法に記載されているようにＨＰＬＣ分析のために処理した。
【図１８】未処理のＪＭ１０９、ＡＢ１１５７、ＮＳ３６７８及びＴＡ１５３５［ｐＢ２１６］細胞におけるＣＹＰ３Ａ４によるテストステロンの代謝 グルコース（１０ｍＭ）を補充したＭ９塩において振盪（２００ｒｐｍ）しながら３７℃でインキュベーションを行った。０．５ｍｌの１０ｘ濃縮細胞を４．５ｍｌの緩衝液に加え、２００μＭの最終濃度までテストステロンを添加するまで５−１０分間３７℃で前もって平衡化した。時々、２００μｌの分量を除去して、実施例４における材料と方法に記載されているようにＨＰＬＣ分析のために処理した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌におけるチトクロムＰ４５０の発現に関する。特に、本発明は、細菌、特に腸内細菌における真核生物の活性なチトクロムＰ４５０酵素系の発現に関する。
【背景技術】
【０００２】
チトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（Ｐ４５０類）は、広範囲の化合物の代謝を触媒するヘムタンパク質の上科を形成する。これは、酸素分子の一つの原子の基質内への挿入を通じて親油性化学物質の酸化を触媒する（非特許文献１）。哺乳動物のＰ４５０類は、ステロイド類、治療薬及び発ガン物質を含む、内因性及び外因性化合物の代謝を触媒する（非特許文献２; 非特許文献３; 非特許文献４）。異なった哺乳動物のＰ４５０類は独特であるが重複する基質特異性を示し、強い位置及びステレオ選択性を示す（非特許文献５）。哺乳動物のＰ４５０類は、その主要な機能に基づき２つの主要なクラスに小分類することができる。すなわち、ステロイド類と胆汁酸の代謝に主に関与するものと、生体異物を主に代謝するものとに分類される。異物代謝Ｐ４５０類は、典型的には例えば肝細胞のようなある種の哺乳動物細胞の小胞体中に見出され、ミクロソームＰ４５０類と称される。
【０００３】
後者のグループのＰ４５０類により代謝される化合物には、例えばシクロスポリン、ニフェジピン及びデブリソキンのような治療薬並びに例えば多環式芳香族炭化水素類、ニトロサミン及びアリールアミン類のような発ガン物質が含まれる。ミクロソームＰ４５０類が触媒的に活性であるには、ＮＡＤＰＨ-チトクロムＰ４５０オキシドレダクターゼ（Ｐ４５０レダクターゼ；ＥＣ１.６.２.４）のＦＭＮ及びＦＡＤ補欠分子族を経由してＮＡＤＰＨから送られる電子の供与が必要となる（非特許文献６）。
【０００４】
Ｐ４５０類の一次構造を比較すると、これらは構造的に相互に関連しており、共通の祖先から由来している可能性が高いことが分かる。その一次構造に基づき、Ｐ４５０類は例えばＣＹＰ１、ＣＹＰ２等々のようなファミリーに分類される（非特許文献７）。
【０００５】
治療化合物と発ガン物質の代謝において哺乳動物のＰ４５０類が重要であることから、異種性の系において哺乳動物のＰ４５０類を発現させる試みがなされてきた。例えば、非特許文献８、非特許文献９及び非特許文献１０により記載されているように異種的にＰ４５０類を発現させるために哺乳動物の細胞が用いられている。
【０００６】
酵母細胞もまた例えば非特許文献１１と非特許文献１２により、Ｐ４５０類の異種的な発現のために用いられている。
【０００７】
更に最近では哺乳動物のＰ４５０類が大腸菌において発現されている。
【０００８】
非特許文献１３には、修飾されたヒトチトクロムＰ４５０ ３Ａ４の大腸菌における発現と該酵素の精製と再構成が記載されている。
【０００９】
非特許文献１４には、大腸菌における組換えチトクロムＰ４５０ １７α−水酸化酵素の発現と酵素活性が記載されている。
【００１０】
非特許文献１５には、疎水性のＮＨ２-末端セグメントを欠くチトクロムＰ４５０ ＩＩＥ１の発現が触媒活性を保持することが記載されている。
【００１１】
非特許文献１６には、大腸菌において発現されたヒトチトクロムＰ４５０酵素によるプロ発ガン物質の活性化が記載されている。
【００１２】
非特許文献１７には、ＮＡＤＰＨ-Ｐ４５０レダクターゼを含む精製された組換え融合タンパク質の酵素学的性質が記載されている。
【００１３】
非特許文献１８には、ヒトＰ４５０ ３Ａ４のヘム領域とラットチトクロムＰ４５０レダクターゼのフラビン領域を含む組換え融合タンパク質の幾つかの性質が記載されている。
【００１４】
非特許文献１９には、大腸菌由来のＮＡＤＰＨ-フラボドキシンレダクターゼとフラボドキシンがウシチトクロムＰ４５０ ｃ１７水酸化酵素活性を支援することが記載されている。
【００１５】
非特許文献２０には、ヒトＰ４５０ １Ａ２の大腸菌における発現が記載されている。
【００１６】
非特許文献２０には、哺乳動物のチトクロムＰ４５０とＮＡＤＰＨ-Ｐ４５０レダクターゼフラボタンパク質の領域を含む融合タンパク質の大腸菌における発現が記載されている。
【００１７】
非特許文献２１には、コレステロール ７α-水酸化酵素チトクロムＰ４５０の大腸菌における発現が記載されている。
【００１８】
非特許文献２２には、２Ｃ亜科のヒト及びウサギチトクロムＰ４５０の大腸菌における発現が記載されている。
【００１９】
非特許文献２３には、チトクロムＰ４５０ ２Ｄ６の大腸菌における発現が記載されている。
【００２０】
非特許文献２４には、ompＡシグナルペプチドへのＮ末端融合を含むＰ４５０レダクターゼが、Ｐ４５０の第２コドン（セリン）がアラニンに置換され、Ｐ４５０につき他の変更はなされていないヒトＰ４５０ ２Ｅ１と共に大腸菌において同時発現される研究が記載されている。インビボにおいて、細胞全体の活性は証明されなかった。
【００２１】
特許文献１には、Ｐ４５０１７α-水酸化酵素の大腸菌における発現とＰ４５０レダクターゼ酵素領域へのその融合及び融合タンパク質の大腸菌における発現が記載されている。ウシＰ４５０１７α−水酸化酵素由来の９個のＮ末端アミノ酸を含むＰ４５０酵素ハイブリッドもまた開示されている。
【００２２】
特許文献２には、チトクロムＰ４５０レダクターゼの同時発現又は混合を必要としないで生物学的に活性な形でのＰ４５０１７α-水酸化酵素の大腸菌における発現が記載されている。
【００２３】
非特許文献２５には、チトクロムＰ４５０ ３Ａ５の大腸菌における発現が記載されている。
【００２４】
非特許文献２６には、修飾されたヒトチトクロムＰ４５０ ２Ｅ１の大腸菌における発現が記載されている。
【００２５】
非特許文献２７には、ウシＰ４５０ １７ＡとラットＮＡＤＰＨ-Ｐ４５０レダクターゼの領域を含む組換え融合タンパク質の大腸菌における発現が記載されている。
【００２６】
非特許文献２８には、ネズミチフス菌において発現された組換えヒトチトクロムＰ４５０ １Ａ２による芳香族アミン類の生物活性化が記載されている。
【特許文献１】国際公開ＷＯ９４／０１５６８号パンフレット
【特許文献２】米国特許第５２４０８３１号明細書
【非特許文献１】Porterと Coon (1991) J. Biol. Chem. 261, 13469-13472
【非特許文献２】Guengerich (1987) "Enzymology of rat liver cytochromes P450", F.P.Guengerich編, CRC Press, Boca Raton FL, Vol. 1, pp 1-54
【非特許文献３】GuengerichとShimada (1991) Chem. Res. Toxicol.4, 391-407
【非特許文献４】Gonzalez (1992) Trends in Pharmacol. Sci. 12, 346-352
【非特許文献５】Crespiほか(1993) Toxicology 82, 89-104
【非特許文献６】Smithほか(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 8710-8714
【非特許文献７】Nelsonほか(1996) Pharmacogenetics 6, 1-42
【非特許文献８】Doehmerほか(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5769-5773
【非特許文献９】Aoyamaほか(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 4790-4793
【非特許文献１０】Crespiほか(1991) Carcinogenesis 12, 355-359
【非特許文献１１】Renaudほか(1993) Toxicology 82, 39-52
【非特許文献１２】Blighほか(1992) Gene 110, 33-39
【非特許文献１３】Gillamほか(1993) Arch. Biochem. Biophys. 305, 123-131
【非特許文献１４】Barnesほか(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 5597-5601
【非特許文献１５】Larsonほか(1991) J. Biol. Chem. 266, 7321-7324
【非特許文献１６】Shimadaほか(1994) Carcinogenesis 15, 2523-2529
【非特許文献１７】Shetほか(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 11748-11752
【非特許文献１８】Shetほか(1995) Arch. Biochem. Biophys. 318, 314-321
【非特許文献１９】JenkinsとWaterman(1994) J. Biol. Chem. 269, 27401-27408
【非特許文献２０】Fisherほか(1992) FASEB J. 6, 759-764
【非特許文献２１】ChunとChiang(1991) J. Biol. Chem. 266, 19186-19191
【非特許文献２２】Richardsonほか(1995) Arch. Biochem. Biophys. 323, 87-96
【非特許文献２３】Gillamほか(1995) Arch. Biochem. Biophys. 319, 540-550
【非特許文献２４】DongとPorter(1996) Arch. Biochem. Biophys. 327, 254-259
【非特許文献２５】Gillamほか(1995) Arch. Biochem. Biophys. 317, 374-384
【非特許文献２６】Gillamほか(1994) Arch. Biochem. Biophys. 312, 59-66
【非特許文献２７】Shetほか(1994) Arch. Biochem. Biophys. 311, 402-417
【非特許文献２８】Josephyほか(1995) Cancer Res. 55, 799-802
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２７】
有効な真核生物、特に哺乳動物のＰ４５０モノオキシゲナーゼ酵素系を細菌において発現させるための広範な努力にも拘わらず、細胞全体において化合物を代謝し得る系は今日まで考案されていない。これは、酵素活性に対してＰ４５０レダクターゼを必要とする異物代謝Ｐ４５０類の場合は特にしかりである。より詳細には、チトクロムＰ４５０とチトクロムＰ４５０レダクターゼが同一の菌細胞において別々に発現されたときに機能チトクロムＰ４５０レダクターゼ系を形成する菌細胞系は過去には考案されていない。同様に、高レベルの真核生物異物代謝Ｐ４５０を発現する細菌を生産する努力が鋭意なされてきたにも拘わらず、満足できる系はこれまで考案されていない。
【００２８】
本発明の一つの目的は、無処置の菌細胞において機能的な形でＰ４５０類を発現する優れた系を提供することである。
【００２９】
本発明の更なる目的は、Ｐ４５０レダクターゼと共であってもなくともＰ４５０類を発現する改良系を提供することである。
【００３０】
機能Ｐ４５０酵素系を細胞全体において発現する細菌系は「バイオリアクター」として有用であるか、薬物試験又は発ガン物質試験系において、またはバイオセンサーとして、あるいは環境のレメディエーション又はホルモンの生産等において用途が見出される。細菌における真核生物Ｐ４５０類の高レベルの発現は構造研究用のＰ４５０源を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００３１】
本発明の第１の観点では、機能性チトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ系を含む菌細胞であって、該細胞がチトクロムＰ４５０を発現し得る遺伝子作成物と上記チトクロムＰ４５０とは別個にチトクロムＰ４５０レダクターゼを発現し得る遺伝子作成物を含み、チトクロムＰ４５０のＮ末端とチトクロムＰ４５０レダクターゼのＮ末端が上記細胞内における上記チトクロムＰ４５０と上記チトクロムＰ４５０レダクターゼの機能性カップリングを可能にするようにそれぞれ適合された菌細胞が提供される。
【００３２】
好ましくは、菌細胞は、少なくとも５０pmol/min/mgタンパク、より好ましくは少なくとも２５０pmol/min/mgタンパク、更により好ましくは少なくとも５００pmol/min/mgタンパクの比活性を有するチトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼを発現する。これらの量はチトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ系に対する好適で効果的な基質を使用して測定される。好ましくは、上記好適な比活性は細胞全体のものであるが、該活性は例えば膜画分のような細胞の画分に見出されるものでもよい。
【００３３】
しかして、機能性チトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ系を含む菌細胞であって、チトクロムＰ４５０を発現する遺伝子作成物と上記チトクロムＰ４５０とは別個にチトクロムＰ４５０レダクターゼを発現する遺伝子作成物を含み、上記チトクロムＰ４５０と上記チトクロムＰ４５０レダクターゼが上記細胞内において機能的にカップリングする菌細胞が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
「チトクロムＰ４５０」には、ヘムのＦｅ(ＩＩ)のＣＯ付加物の形成により還元ＣＯ差スペクトルにおいて４５０ｎｍ±５ｎｍの領域に吸収極大を示すあらゆるヘム含有ポリペプチドが含まれる。
【００３５】
如何なるチトクロムＰ４５０についても本発明を実施することができると考えられる。
【００３６】
チトクロムＰ４５０は、好適には、真核生物のチトクロムＰ４５０である。より好ましくは、チトクロムＰ４５０は哺乳動物チトクロムＰ４５０であり、更により好ましくはチトクロムＰ４５０はヒトのチトクロムＰ４５０である。
【００３７】
非常に多くの真核生物のチトクロムＰ４５０のｃＤＮＡ、特に哺乳動物のチトクロムＰ４５０のｃＤＮＡを含む非常に多数のチトクロムＰ４５０のｃＤＮＡ又は遺伝子がクローン化されている。例えば、出典明示によりここに取込まれる非特許文献７には、既知のチトクロムＰ４５０のｃＤＮＡと遺伝子が列挙され、配列相同性とある程度は染色体局在化に基づいて遺伝子ファミリー及びサブファミリーに分類されている。チトクロムＰ４５０の配列の詳細はまたワールドワイドウェブサイトhttp://drnelson.utmem.edu./homepage.htmlで入手できる。
【００３８】
これらのチトクロムＰ４５０のｃＤＮＡと遺伝子は、従来から周知のクローニング法を使用して即座に得ることができ、その方法の幾つかは以下と例えばSambrookほか（(1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring House, New York）に記載されている。
【００３９】
チトクロムＰ４５０はチトクロムＰ４５０のＣＹＰ１、ＣＹＰ２、ＣＹＰ３又はＣＹＰ４ファミリーの何れかのメンバーであれば特に好適である。チトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ系は生体異物を代謝するものであれば尚更好ましい。
【００４０】
チトクロムＰ４５０ファミリーＣＹＰ１、ＣＹＰ２及びＣＹＰ３の少なくとも幾つかのメンバーは例えば治療薬のような生体異物化合物の代謝に関与している。チトクロムＰ４５０のＣＹＰ１ファミリーのメンバーは、例えばカフェイン、ベンズフェタミン、フェナセチン、テオフィリン、アセトアミノフェン、アンチピリン、２-ヒドロキシエストラジオール、イミプラミン、タモキシフェン及びゾキサゾラミンの代謝に関与する。チトクロムＣＹＰ２ファミリーのメンバーは、例えばテストステロン、アフラトキシン、ベンズフェタミン、シクロホスファミド、ヘキソバルビタール、６-アミノクリセン、レチノール、トルブタミド（メチル）、フェニトイン、Ｓ-ワルファリン、ティエニル酸、ジアゼパム、プロパナロール、アミトリプチリン、ブフラロール、ブプラノロール、クロザピン、コデイン、デブリソキン、デシプラミン、デキストロモルファン、エチルモルヒネ、フレカイニド、ハロペリドール、リドカイン、ノルトリプチリン、プロパノロール、スパルテイン、タキソール、テトラヒドロカナビノール、プロゲステロン及びメフェニトインの代謝に関与する。
【００４１】
チトクロムＣＹＰ３ファミリーのメンバーは、例えばロバスタチン、ニフェジピン、タキソール、テニポシド、テストステロン、ベラパミル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ベンズフェタミン、コルチソル、シクロスポリンＡ及びＧ、ジアゼパム、ジヒドロエルゴタミン、エストラジオール、エチニルエストラジオール、イミプラミン及びリドカインの代謝に関与する。
【００４２】
より好ましくは、チトクロムＰ４５０はＰ４５０類のＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ２Ｄ９及びＣＹＰ２Ｃ９の何れかである。
【００４３】
簡便には、チトクロムＰ４５０は、そのＮ末端の適合化は別にして、天然のチトクロムＰ４５０と同じポリペプチド配列から本質的になる。しかしながら、「チトクロムＰ４５０」という用語は、天然チトクロムＰ４５０に対する修飾、例えば天然チトクロムＰ４５０に存在しうる任意の疎水性Ｎ末端部分の長さ又は他の性質を変更する修飾又は天然チトクロムＰ４５０と比較してチトクロムＰ４５０の基質特異性を変更する修飾、例えば単一又は多点突然変異又は欠失のような修飾を特に含む。
【００４４】
「チトクロムＰ４５０レダクターゼ」には、ＮＡＤＰＨからチトクロムＰ４５０に電子を移動させることができるあらゆるＮＡＤＰＨ-チトクロムＰ４５０オキシドレダクターゼが含まれる。哺乳動物のチトクロムＰ４５０レダクターゼはＦＭＨ及びＦＡＤ補欠分子族を一つずつ含む。チトクロムＰ４５０レダクターゼは、菌細胞中に発現されたチトクロムＰ４５０と同じ種から由来するのが好ましい。チトクロムＰ４５０レダクターゼは、哺乳動物のチトクロムＰ４５０レダクターゼであれば特に好ましい。ラット又はヒトのチトクロムＰ４５０レダクターゼが特に好ましい。ヒトのチトクロムＰ４５０レダクターゼｃＤＮＡは、非特許文献６に記載されている。ラットのチトクロムＰ４５０レダクターゼｃＤＮＡは、Porterほか（(1990) Biochemistry 29, 9814-9818）に記載されている。
【００４５】
チトクロムＰ４５０レダクターゼのｃＤＮＡと遺伝子は従来から公知のクローニング法を用いて即座に得ることができ、その方法の幾つかは以下に記載する。
【００４６】
簡便には、チトクロムＰ４５０レダクターゼは、そのＮ末端の適合化は別にして、天然チトクロムＰ４５０レダクターゼと同じポリペプチド配列から本質的になる。しかしながら、「チトクロムＰ４５０レダクターゼ」という用語には、天然チトクロムＰ４５０に対する修飾、例えば補助因子結合を変更する単一又は多点突然変異又は欠失を特に含む。
【００４７】
チトクロムＰ４５０がヒトのチトクロムＰ４５０である場合、チトクロムＰ４５０レダクターゼはヒトのチトクロムＰ４５０レダクターゼであるのが好ましい。
【００４８】
「機能性チトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ系」とは、チトクロムＰ４５０とチトクロムＰ４５０レダクターゼが菌細胞においてひとたび発現されれば、十分な補助因子、例えばＮＡＤＰＨ及び酸素が存在すると仮定して、上記チトクロムＰ４５０と上記チトクロムＰ４５０レダクターゼが存在するために、該細胞がチトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ系の基質を生成物に転換することができることを意味する。
【００４９】
「細胞内における上記チトクロムＰ４５０と上記チトクロムＰ４５０レダクターゼの機能性カップリング」とは、チトクロムＰ４５０レダクターゼが、直接的であれ間接的であれ、触媒作用中にチトクロムＰ４５０に電子を供与することができるように、チトクロムＰ４５０とチトクロムＰ４５０レダクターゼが細胞内において隣接させられることを意味する。チトクロムＰ４５０のＮ末端又はチトクロムＰ４５０レダクターゼのＮ末端の適合化は、単に、細胞内における上記チトクロムＰ４５０と上記チトクロムＰ４５０レダクターゼの機能発現とカップリングを可能にするものである。適合化はチトクロムＰ４５０とチトクロムＰ４５０レダクターゼの隣接化を助けるものとすることができる。
【００５０】
「細胞内」には、特に、機能性カップリングが、細胞膜周辺腔を含む細胞の任意の膜又は区画もしくは周辺質に伴う任意の膜内又はこれに関連して生じることが含まれる。
チトクロムＰ４５０を最適に発現する菌細胞の培養のチトクロムＰ４５０量は、少なくとも１００nmol/l培養（細胞全体）、好ましくは少なくとも１５０nmol/l培養（細胞全体）、より好ましくは少なくとも約２５０nmol/l培養（細胞全体）、更により好ましくは約５００nmol/l培養（細胞全体）、最も好ましくは約１０００nmol/lであることが好ましい。典型的には、チトクロムＰ４５０量は約２００nmol/l培養（細胞全体）である。
【００５１】
上記チトクロムＰ４５０と上記チトクロムＰ４５０レダクターゼの機能性カップリングを可能にするチトクロムＰ４５０とチトクロムＰ４５０レダクターゼの各Ｎ末端の適合化を以下に議論する。
【００５２】
必須ではないが、チトクロムＰ４５０又はチトクロムＰ４５０レダクターゼがそれ自身のＮ末端配列を保持し、例えば以下に議論するシグナルペプチドのような更なる部分がチトクロムＰ４５０又はチトクロムＰ４５０レダクターゼ又は双方のＮ末端に付加されることが好ましい。
【００５３】
如何なる好気性又は通性の嫌気性菌細胞も適切であると考えられるけれども、菌細胞はグラム陰性であるのが好ましく、また菌細胞は腸内細菌科の細菌、例えば大腸菌の細胞であるのが好ましい。大腸菌に最も密接に関連する腸内細菌は、サルモネラ属と赤痢菌属由来のものであり、やや密接に関連するものはエンテロバクター属、セラチア属、プロテウス属及びエルウィニア（Erwinia）属である。大腸菌とネズミチフス菌が本発明に対して最も好適な菌宿主細胞である。大腸菌株Ｋ１２が最も好ましい。大腸菌Ｋ１２は非病原性である標準的実験用菌株であるからである。
【００５４】
ある種のチトクロムＰ４５０基質は、チトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ系により作用せしめられるために菌細胞中に浸透することができるが、本発明の菌細胞は、基質への浸透性が増大したもの、もしくは菌細胞を適切な培地に配したときに基質により浸透するようになるものであるのが好ましい。加えて、あるいは代わりに、菌細胞が、基質の膜浸透を容易にするように膜の性質を変化させたものか、性質を変化させることができる膜であれば、より好ましい。例えば、大腸菌のtolＣ突然変異体は、野生型大腸菌よりもより浸透性の膜を有しており（Chatterjee (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 8950-8954）、ネズミチフス菌株のＴＡ系列は深部ラフ型変異により浸透性が増大していて、変異原性試験に頻繁に用いられている（例えば、Simulaほか(1993) Carcinogenesis 14, 1371-1376 を参照）。ネズミチフス菌ＴＡ９７、９８、１００及び１０２並びにＴＡ１５３５及びＴＡ１５３８は医薬産業において薬物安全性評価の際の変異原性試験に用いられている。これらと他の適切な菌株を用いる本発明は、これらがヒト化変異原性系を提供し代謝活性化系としてげっ歯類肝臓抽出物（げっ歯類肝臓由来のＳ９画分）に依存しないので、これらの手順を改善する可能性がある。本発明に基づく系は、代謝活性化系と変異原性の標的、すなわちＤＮＡが同じ細胞内にあり、標準的なエイムス試験におけるように物理的に分離した実体ではないという利点も有する。このことは、短命な代謝物がより良く検出され、反応性代謝物がそのＤＮＡ標的まで到達するのを膜障壁が妨げないという利点を有している。このことと本発明の他の観点は、以下に更に詳細に議論する。
【００５５】
細胞は、適当な環境中に配することによりより浸透性にできるものがまた好ましい。適切な多くの緩衝液系があるが、発現段階に続いて菌細胞、特に大腸菌細胞がトリス-スクロース-ＥＤＴＡすなわちＴＳＥ中に再懸濁されるのが好ましい。ＴＳＥは５０ｍＭのトリスアセテート（ｐＨ７．６）、０．２５Ｍのスクロース、０．２５ｍＭのＥＤＴＡである。これにより、細胞の浸透性を幾つかの方法で増大させることができる。第１に、最初に二倍に強めた緩衝液中に細胞を再懸濁させ、ついで等しい容量の水で速やかに希釈する。これは、瞬間的に外膜を破壊することにより、周辺質タンパクを放出させるという効果を有する。第２に、ＥＤＴＡは浸透性に直接影響を及ぼすことが知られており、細胞をある種の疎水性薬剤に対してより敏感にすることができる。第３に、緩衝液中のトリスは、外膜におけるリポ多糖の構造に影響を与えることができ、再び浸透性を変える。大腸菌とネズミチフス菌の外膜の浸透性を増加させるための更に詳細な方法は、NikaidoとVaara（(1987) pp.7-22 "Escherichia coli and Salmonella typhimurium. Cellular and Molecular Biology" Vol. 1, F.C. Neidhardt編, Am. Soc. Microbiol., Washington DC）に与えられている。
【００５６】
有利には、特に菌細胞がバイオリアクターに用いられるとき、細胞は溶剤耐性を有する。溶剤耐性の大腸菌細胞は、例えばFerranteほか（(1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 7617-7621）により従来から知られている。
【００５７】
チトクロムＰ４５０レダクターゼは菌細胞の細胞区画又は膜にチトクロムＰ４５０レダクターゼを方向付けるＮ末端部分を含むのが好ましい。特に、上記Ｎ末端部分がチトクロムＰ４５０レダクターゼを膜に方向付けるのが好ましい。
【００５８】
チトクロムＰ４５０とチトクロムＰ４５０レダクターゼは菌細胞中の膜と結合するのが好ましい。特に、チトクロムＰ４５０とチトクロムＰ４５０レダクターゼは、細菌の内膜（特に大腸菌とネズミチフス菌の場合）に、その活性部位を細胞質に位置させて結合しているのが好ましい。
【００５９】
一つの好適な実施態様では、Ｎ末端部分は細菌タンパクのＮ末端部分から由来したあるいは該部分に基づくもので、上記細菌タンパクが細胞膜周辺腔に方向付けされているもの、あるいは菌細胞から分泌されることになるものである。例えば、ompＡ、pelＢ、malＥ又はphoＡ遺伝子によりコード化されている大腸菌タンパクはそのような細菌タンパクである。Ｎ末端部分の存在により、チトクロムＰ４５０又はチトクロムＰ４５０レダクターゼの正しい折畳みが助けられるのが望ましい。
【００６０】
細菌タンパクを通常周辺質中に方向付ける細菌のリーダー配列又はシグナルペプチドは、これまでは、結果として生じる融合タンパク質を周辺質の酸化環境に搬出する目的で、二三の哺乳動物タンパク質のＮ末端に融合されている。従って、そのような細菌のリーダー配列又はシグナルペプチドは、例えば免疫グロブリン又はその断片のような哺乳動物の分泌タンパク質の発現において使用されている。これに対して、哺乳動物の異物代謝チトクロムＰ４５０類は、天然の小胞体中に見出される場合、通常は還元環境にさらされる。
【００６１】
従って、特に好適な実施態様は、Ｎ末端部分がompＡ、pelＢ、malＥ又はphoＡシグナルペプチド又はリーダー配列あるいはその機能的に等価な変異体の何れかを含有するものである。
【００６２】
「その機能的に等価な変異体」には、天然の上記細菌タンパク中に存在しているならば、天然のシグナルペプチドと同じ細胞位置に上記タンパク質を方向付けるあらゆるペプチド配列が含まれる。
【００６３】
チトクロムＰ４５０とチトクロムＰ４５０レダクターゼのそれぞれのＮ末端部分がシグナルペプチド又はシグナルペプチド様Ｎ末端部分であれば好ましい。
【００６４】
特に、Ｎ末端部分が、一般的分泌経路に対してompＡリーダーと競合するか、シグナル認識粒子とトリガー因子を含むシグナル認識機構に対してompＡと競合するものが好ましい。
【００６５】
一般的分泌経路とその成分は、出典明示によりここに取込まれるPugsley（(1993) Microbiol. Rev 57, 50-108）に記載され、シグナル認識粒子とトリガー因子は、出典明示によりここに取込まれるValentほか（(1995) EMBO J. 14, 5494-5505）に記載されている。ompＡシグナルペプチドと推定シグナルペプチドの間の競合アッセイは、PugsleyとValentほかの教示を用いる従来公知の方法を使用して実施することができる。
【００６６】
pelＢリーダー配列は、ＭＫＹＬＬＰＴＡＡＡＧＬＬＬＬＡＡＱＰＡＭＡ（配列番号１）なるアミノ酸配列からなる。
【００６７】
ompＡリーダー配列は、ＭＫＫＴＡＩＡＩＡＶＡＬＡＧＦＡＴＶＡＱＡ（配列番号２）なるアミノ酸配列からなる。
【００６８】
シグナルペプチドは、ある種の認識できる共通の特徴を有しており、これは、Heijne（(1986) Nucl Acids Res 14, 4683-4690）、Gierasch（(1989) Biochemistry 28, 923-930）及び"Escherichia coli and Salmonella typhimurium Cellular and Molecular Biology"（Vol. 1, F.C. Neidhardt編, Am. Soc. Microbiol, Washington DC）の周辺質とタンパク質分泌に関する Oliverの章（1987, pp56-69）に詳細が記されている。第１に、可変長のＮ末端の正味の正荷電領域（ｎ領域）がある。これには１０±３のアミノ酸の疎水性コア（ｈ領域）が続き、これはロイシン、アラニン、メチオニン、バリン、イソロイシン、フェニルアラニン及びトリプトファン残基に富む。最後に、典型的には５−７のアミノ酸のｃ領域があり、これはｈ領域のものより一般に僅かに極性が強い。このｃ領域における最も重要なアミノ酸はシグナル切断部位に対して３位と１位にあるもの（「-３、-１ルール」）であり、これらの位置に存在しうる可能なアミノ酸には厳しい制約があるようである：すなわち、短い側鎖のものだけが許容される。従って、アラニン、グリシン、ロイシン、セリン、スレオニン及びバリンのみが３位に見出され（アラニンが強く好まれる）、アラニン、グリシン、セリン及びスレオニンが１位に見出される（アラニンがまた最も強く好まれる）。証拠は、このシグナルプロセシング領域におけるβターン形成がシグナル切断が生じるために重要であることを示唆している（例えば、Barkocy-Gallagherほか(1994) J Biol Chem 269, 13609-13613及びDuffaudとInouye(1988) J Biol Chem 263, 10224-10228を参照）。
【００６９】
シグナルペプチド切断が生じるのが好ましい。従って、シグナルペプチド、すなわち発現されるタンパク質の直ぐ下流の適切なアミノ酸配列が含まれていると、これが尚「切断部位」の一部を形成するので、好ましい。例えば、＋１位のプロリンはシグナル除去を阻害する（Barkocy-Gallagherほか(1992) J. Biol. Chem. 267, 1231-1238）。例としてompＡを用いると、完全な切断を確実にするには、それが望ましいならば、作成物において成熟ompＡタンパクの、ompＡリーダーの直ぐ後とＰ４５０又はレダクターゼ配列の直ぐ前の最初の二三のアミノ酸が含まれる。シグナルペプチド切断は、特定のシグナルペプチダーゼ酵素、例えばシグナルペプチダーゼＩにより引き起こされる。好適な実施態様では、シグナルペプチダーゼＩは菌細胞（例えば大腸菌）において過剰生産され、望まれるならばシグナルペプチドの切断を助ける（Dijlほか(1991) Mol. Gen. Genet. 227, 40-48を参照）。
【００７０】
成熟ompＡタンパクの最初の二つのアミノ酸（すなわち、ＡlaＰro）がompＡシグナルペプチドの直ぐ下流でＰ４５０のＮ末端の前に挿入されるのが特に好ましい。
【００７１】
シグナルペプチド切断の確率を増大させる他の好適な可能性はシグナルペプチドとＰ４５０との間に短いリンカー配列を導入することであり、あるいは異なる株における発現により、例えばＤＨ５αにおける発現と比較して、シグナルペプチドの切断が増加したり減少したりする。
【００７２】
従って、Ｎ末端部分は、その天然のポリペプチド中に存在するとき、膜挿入と細胞膜周辺腔中への細胞質膜を通過しての天然のポリペプチドの搬出を媒介する機能を有するシグナルペプチドであることが好ましいことが分る。リーダー配列又はシグナルペプチドの配列は通常は４０までのアミノ酸残基である。リーダーはその機能的性質を変更しないで修飾することができると考えられる。
【００７３】
本発明の更なる実施態様では、チトクロムＰ４５０が菌細胞の細胞区画又は膜にチトクロムＰ４５０を方向付けるＮ末端部分を含むのが好適である。特に、上記Ｎ末端部分がチトクロムＰ４５０を膜に方向付けるのが好ましい。
【００７４】
この実施態様の好適なＮ末端部分はチトクロムＰ４５０レダクターゼの好適なＮ末端部分と同じである。チトクロムＰ４５０のＮ末端部分は、ompＡ、pelＢ、malＥ又はphoＡシグナルペプチド又はリーダー配列あるいはその機能的に等価な変異体の何れかを含むのが特に好ましい。ompＡシグナルペプチドが特に好ましい。
【００７５】
更なる特に好適な実施態様では、チトクロムＰ４５０のＮ末端部分とチトクロムＰ４５０レダクターゼのＮ末端部分のそれぞれが、上記チトクロムＰ４５０又はチトクロムＰ４５０レダクターゼを同じ細胞区画又は膜に方向付ける。これは、細胞内における上記チトクロムｐ４５０と上記チトクロムＰ４５０レダクターゼの機能性カップリングを増大させあるいは改善するので、特に有利である。チトクロムＰ４５０とチトクロムＰ４５０レダクターゼが、細菌の細胞質ＮＡＤＰＨプールへのアクセスが得られる内膜の細胞質側に方向付けられるのが特に好ましい。
【００７６】
更に好ましくは、チトクロムＰ４５０のＮ末端部分はチトクロムＰ４５０レダクターゼのＮ末端部分と実質的に同じである。
【００７７】
更なる実施態様では、チトクロムＰ４５０は、上記菌細胞中における上記チトクロムＰ４５０の翻訳性を増大させるか折畳みを修正するように適合化されたＮ末端部分を含む。
【００７８】
好ましくは、チトクロムＰ４５０は、その天然配列と比較して、そのＮ末端において修飾される。
【００７９】
「翻訳性」とは、与えられたＲＮＡ分子をポリペプチドに翻訳することができる効率を意味する。
【００８０】
翻訳性を改善する最適化ＣＹＰ３Ａ４配列の幾つかの特徴がある。
【００８１】
これらの特徴は次のものを含む：
１． 大腸菌に好適に適合するように変えられた第２コドン（しばしばアラニンをコードしているＧＣＴ）。これは、Loomanほか（(1987) EMBO J 6, 2489-2492）により証明されている。
【００８２】
２． 開始コドンの廻りのｍＲＮＡ２次構造に対する潜在性を最小化するために、（可能な場合には）Ａ及びＴ残基に富むようにされたコドン４と５。リボソーム結合部位と開始コドンの廻りのｍＲＮＡ構造の最小化は、「翻訳性」に大きな影響を有し得る（例えばWangほか(1995) Protein Expr Purif 6, 284-290を参照）。
【００８３】
リーダー配列の使用に関し、主な利点は、それらが細菌遺伝子から由来しているので、その性質上、細菌の発現に対して既に「最適化」されていることである。これはしばしば例えば上述の二つの特徴を有しており、双方のpelＢとompＡリーダーは第２コドンとしてＡＡＡ（Ｌys）を含み、このコドンは「翻訳性」についてLoomanほかの文献では最良の性能の第２コドンであった。加えて、これらは、リボソーム結合部位と開始コドンの廻りの２次構造を減少させた（例えば、ompＡ遺伝子構造についてMovvaほか(1980) J Mol Biol 143, 317-328を参照）。
【００８４】
Ｎ末端シグナルペプチド融合を用いる更なる利点は、Ｐ４５０またはレダクターゼのｃＤＮＡにおける希なコドンのあらゆる影響を最小化することに関する。例えば、ＡＧＡ／ＡＧＧコドンは大腸菌において最も希に用いられるものであり（ChenとInoue(1990) Nucl Acids Res 18, 1465-1473）、対応する荷電ｔＲＮＡ分子の限られた利用性の結果、翻訳を遅延させる。しかし、そのような希なコドンのマイナスの効果は開始コドンからの距離が増加するにつれて減少する（Chen とInoue、上掲）。Ｐ４５０（又はレダクターゼ）のＮ末端に「最適化」された細菌リーダー配列（典型的には２０−２５のアミノ酸長さ）を付加することにより、Ｐ４５０のｃＤＮＡの５'末端に近い任意の希なコドンが、開始コドンから更に遠くに離れるように移動され、従って影響は更に少ない。
【００８５】
従って、「翻訳性」を次の一又は複数の手段により改良するのが好ましい：
１． Ｐ４５０又はレダクターゼのｃＤＮＡから希なコドン（上掲のChenとInoue参照）、例えばＡＧＧ／ＡＧＡ（アルギニン）、ＣＵＡ（ロイシン）、ＡＵＡ（イソロイシン）、ＣＣＣ（プロリン）、及びＧＧＡ／ＧＧＧ（グリシン））を除去、特に開始コドンから２５−３０コドン未満のものを除去すること。
【００８６】
２． 上記の代わりに、あるいは上記と共に、希なｔＲＮＡシンターゼをコードしている遺伝子、例えばＡＧＧ／ＡＧＡに対するdnaＹ遺伝子を導入すること。
【００８７】
３． 大腸菌の好適性を反映させるためにＤＮＡ配列について他の変更を行うこと、例えばコドン対の非ランダム的利用（GutmanとHatfield(1989) Proc Natl Acad Sci USA 86, 3699-3703）。
【００８８】
４． 二次構造の潜在性を最小化しリボソーム結合部位と開始コドンの間の距離を最適化するために発現ベクター内におけるプロモーター／リボソーム結合部位を変化させること（上掲のWangほか(1995)参照）。
【００８９】
チトクロムＰ４５０が米国特許第５２４０８３１号に従って、あるいは非特許文献２５の一般的な方法によって、修飾されたＮ末端を有するのがまた好適であり、これら双方の文献を出典明示によりここに取込む。
【００９０】
本発明の菌細胞はチトクロムＰ４５０を発現し得る遺伝子作成物とチトクロムＰ４５０レダクターゼを発現し得る遺伝子作成物を含有する。
【００９１】
簡便には、細胞は、チトクロムＰ４５０とチトクロムＰ４５０レダクターゼの双方を発現し得る一つの遺伝子作成物を含むことができ、あるいはチトクロムＰ４５０及びチトクロムＰ４５０レダクターゼを別の遺伝子作成物から発現させることができる。
【００９２】
遺伝子作成物はＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。ＤＮＡが好ましい。
【００９３】
遺伝子作成物は、典型的には例えばプラスミド又はバクテリオファージゲノムのような染色体外遺伝因子であるが、「遺伝子作成物」という用語は、特に遺伝子作成物が細菌の染色体の一部であり得ることを含む。例えば、遺伝子作成物は細菌染色体を溶原化したバクテリオファージの一部であり得る。
【００９４】
遺伝子作成物は菌細胞におけるチトクロムＰ４５０又はチトクロムＰ４５０レダクターゼの発現に必要である遺伝因子を含む。
【００９５】
菌細胞における転写と翻訳に必要な因子には、プロモーター、リボソーム結合部位、チトクロムＰ４５０又はチトクロムＰ４５０レダクターゼの翻訳領域が含まれる。
【００９６】
プロモーターについては、選択された菌細胞において機能性がある実質的に全てのプロモーターを用いることができると考えられる。しかし、好適なプロモーターには、lac、lacＵＶ５、tac、trc、λＰＬ、Ｔ７、lpp、lpp-lac又はＴ３プロモーターが含まれる。もちろん、λＰＬ、Ｔ７及びＴ３プロモーターはバクテリオファージ由来のものであり、大腸菌のような細菌において機能性を有することが知られている。
【００９７】
調節可能なプロモーター、例えばlacプロモーターの使用が好ましい。例えばＴ７プロモーターのような強いプロモーターは用いないのが好ましい。
【００９８】
細菌の発現をなすのに適切なリボソーム結合部位を、真核生物のチトクロムＰ４５０領域含有遺伝子中に含有せしめることがしばしば望まれる。しばしば、リボソーム結合部位とプロモーターは、所望の因子を含有し、その二つの末端に有用な制限酵素認識部位を有する近接した予め製作されたＤＮＡセグメントとして定義される「カセット」として導入することができ、簡単な遺伝子操作により所望のチトクロムＰ４５０遺伝子又はｃＤＮＡあるいはチトクロムＰ４５０レダクターゼ内の適切な点に即座に挿入される。
【００９９】
最も簡便には、相同系由来のプロモーターとリボソーム結合部位、例えばｌａｃプロモーターとその随伴ＲＢＳを単に用いることが望ましい。しかし、一般には、任意の有効な細菌リボソーム結合部位を用いることが提案され、大腸菌、λ、Ｔ７又はＴ３由来のＲＢＳが好ましい。更により好ましいリボソーム結合部位は、Ｔ７遺伝子１０、又は大腸菌lacＡ、lacＺ、trpＡ、trpＢ、trpＣ、trpＤ、trpＥ、trpＬ、trpＲ又はtrpＳ遺伝子由来のものである。特に好適なリボソーム結合部位とスペーサー領域は、５'-ＡＧＧＡＧＧＴＣＡＴ-３'（配列番号３）を含み、ここで下線部分はリボソーム結合部位であり、隣接するＣＡＴ配列はスペーサー領域である。（スペーサー領域はリボソーム部位とＡＴＧ開始コドンの間の配列である。）
典型的には、ＤＮＡをＲＮＡに転写する酵素である、細菌ＲＮＡポリメラーゼの機能を終結させる機能を果たす適当な細菌の転写ターミネーターを、本発明に従って調製される遺伝子中に含有させることが望ましい。機能性細菌転写ターミネーターに対する要求はかなり単純であり、ＧＣに富む二分子対称領域が先行する一連のＴ残基により通常は特徴付けられる。より好ましいターミネーターはＴＲＰ遺伝子からのもの、リボソームターミネーター、rrnＢ又はＴ７ファージからのターミネーター配列である。実際、Ｔ７ターミネーター配列は、メッセージ分解を明らかに遅延させるｍＲＮＡの３'末端にステムループ構造を持つＲＮアーゼＩＩＩ切断部位を含む。
【０１００】
遺伝子作成物は菌細胞中において増殖することができ、未来の世代に安定して伝達される。
【０１０１】
相補的な付着末端を介してベクターにＤＮＡを作用可能に連結する様々な方法が開発されている。例えば、相補的なホモポリマー路を、ベクターＤＮＡに挿入されるＤＮＡセグメントに付加することができる。ベクターとＤＮＡセグメントはついで相補的ホモポリマー尾端間に水素結合により結合されて組換えＤＮＡ分子が形成される。
【０１０２】
一又は複数の制限部位を含む合成リンカーは、ＤＮＡセグメントをベクターに結合させる代替方法を提供する。以前に記載されたようにエンドヌクレアーゼ制限消化により産生されたＤＮＡセグメントは、バクテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼ又は大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、つまりその３'-５'-ヌクレオチド鎖末端切断（exonucleolytic）活性で一本鎖突出３'末端を除去し、その重合活性で陥凹３'末端を満たす酵素で処理する。
【０１０３】
従って、これらの活性の組合せは、平滑末端ＤＮＡセグメントを産生する。ついで平滑末端セグメントは、例えばバクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼのような平滑末端ＤＮＡ分子の連結を触媒することができる酵素の存在下で過剰モルのリンカー分子と共にインキュベートされる。しかして、反応産物はその末端にポリマーリンカー配列を担持するＤＮＡセグメントである。ついでこれらのＤＮＡセグメントは適切な制限酵素で切断され、該ＤＮＡセグメントのものと適合性のある末端をつくる酵素で切断された発現ベクターに連結される。
【０１０４】
様々な制限酵素部位を含む合成リンカーは、インターナショナル・バイオテクノロジー・インク（New Haven, CN, USA）を含む多数の供給源から市販されている。
【０１０５】
本発明のポリペプチドをコードしているＤＮＡを修飾する望ましい方法は、Saikiほか（(1988) Science 239, 487-491）により開示されているようなポリメラーゼ連鎖反応を用いるものである。
【０１０６】
この方法では、酵素的に増幅されるＤＮＡには、それ自身が増幅ＤＮＡ内に組入れられた２つの特異的なオリゴヌクレオチドプライマーが隣接する。上記特異的プライマーは従来から知られている方法を用いて発現ベクター中へのクローニングに使用することができる制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むことができる。
【０１０７】
好適には、ベクターは、原核生物における増殖のための、例えばＣolＥloriのような原核生物レプリコンを含む。ベクターは、また、それと共に形質転換された大腸菌のような宿主菌細胞において遺伝子の発現（転写と翻訳）を方向付け得る、例えば原核生物プロモーターのような適切なプロモーターを含むことができる。
【０１０８】
プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合と転写を生じせしめるＤＮＡ配列により形成された発現調節領域である。代表的細菌宿主と適合性のあるプロモーター配列は、典型的には本発明のＤＮＡセグメントの挿入に好都合な制限部位を含むプラスミドベクター中に提供される。
【０１０９】
典型的な原核生物のベクタープラスミドは、バイオラッド・ラボラトリーズ（Richmond, CA, USA）から入手できるｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２及びｐＢＲ３２９と、ファーマシア（Piscataway, NJ, USA）から入手できるｐＴｒｃ９９ＡとｐＫＫ２２３-３である。
【０１１０】
本発明のＤＮＡ作成物での適当な細胞宿主の形質転換は、典型的には用いられるベクターに依存する周知の方法により達成される。宿主菌細胞の形質転換に関しては、例えば、Cohenほか（(1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110）及びSambrookほか（(1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY）を参照のこと。
【０１１１】
細胞を形質転換するには電気穿孔法もまた有用であり、菌細胞の形質転換について従来から良く知られている。
【０１１２】
例えば、多くの細菌種が、出典明示によりここに取込まれるLuchanskyほか（(1988) Mol. Microbiol. 2, 637-646）に記載されている方法により形質転換され得る。最大数の形質転換体が２５μＦＤで１ｃｍ当り６２５０Ｖを用いて２．５Ｘ ＰＥＢ中に懸濁されたＤＮＡ-細胞混合物のエレクトロポレーションにより一貫して回収される。
【０１１３】
形質転換が成功した細胞、すなわち上記チトクロムＰ４５０又はチトクロムＰ４５０レダクターゼを発現し得るＤＮＡ作成物を含む細胞は良く知られた技術により同定することができる。例えば、本発明の発現作成物の導入により得られた細胞を育成してチトクロムＰ４５０又はチトクロムＰ４５０レダクターゼを生産することができる。Southern（(1975) J. Mol. Biol. 98, 503）又はBerentほか（(1985) Biotech. 3, 208）により記載されているような方法を使用して、細胞を収集し、溶解し、そのＤＮＡ内容物についてＤＮＡの存在を検査する。あるいは、上清中のタンパク質の有無は以下に記載する抗体を用いて検出することができる。
【０１１４】
形質転換の成功は、組換えＤＮＡの存在を直接的に検定することに加えて、組換えＤＮＡがタンパク質の発現を方向付け得るときには、良く知られた免疫学的方法により確認することができる。例えば、発現ベクターでの形質転換が成功した細胞は適切な抗原性を示すタンパク質を産生する。形質転換されていると推量される細胞の試料を収集し、適当な抗体を用いてタンパク質を検定する。
【０１１５】
従って、本発明は、形質転換された宿主細胞自体に加えて、栄養培地中での、その細胞の培養、好ましくはモノクローナル（クローン的に均質）培養、又はモノクローナル培養由来の培養をまた考慮する。
【０１１６】
更なる好適な実施態様では、菌細胞はチトクロムＰ４５０又はチトクロムＰ４５０レダクターゼの正しい折畳みを助けるポリペプチド補助因子を発現し得る遺伝子作成物を更に含有する。
【０１１７】
そのようなポリペプチド補助因子の存在は、ポリペプチド補助因子の不存在下では、チトクロムＰ４５０又はチトクロムＰ４５０レダクターゼが非機能性封入体を形成しうる強いプロモーターからチトクロムＰ４５０又はチトクロムＰ４５０レダクターゼを発現するときに特に好適である。
【０１１８】
好適には、ポリペプチド補助因子は、例えばＧｒｏＥＬＳ複合体、SecＢ、SecＤ、SecＦ、ＤnaＪ／ＤnaＫ／ＧrpＥ複合体、ペプチジルプロピル-シス、トランス異性化酵素、遺伝子dsbＡ、dsbＢ、dsbＣ及びdsbＤによりコード化されているプロテインジスルフィドイソメラーゼ様タンパク質、clpＢによりコード化されている周辺質シャペロン又はチオレドキシンのようなシャペロン分子である。大腸菌において発現される外来タンパク質の溶解度は細菌チオレドキシンの同時生産により増加する（Yasukawa ほか(1995) J. Biol. Chem. 270, 25328-25331；出典明示によりここに取込む）。
【０１１９】
また、次の系又は宿主又は発現系を用いるのが有用である。
【０１２０】
１． 発現されたタンパク質（類）の分解を低減することができる大腸菌のプロテアーゼ欠乏株（例えばompＴ−、lon−、degＰ−）の使用。分泌された組換えタンパク質のタンパク分解性に影響を及ぼすあらゆる既知の座位が欠乏した一群の大腸菌株は、MeermanとGeorgion（(1994) Biotechnology 12, 1107-1110）に記載されている。
【０１２１】
２． 何れも発現を向上させる、例えばユビキチン（Bakerほか(1994) J. Biol. Chem. 269, 25381-25386）、チオレドキシン（例えばインビトロゲンのpＴrxＦusベクター）、グルタチオンＳ-トランスフェラーゼ（例えばファーマシアのｐＧＥＸベクター）又はプロテインＡ（例えばファーマシアのｐＲＩＴ２Ｔベクター）との融合タンパクとしてのＰ４５０及び／又はレダクターゼの発現。
【０１２２】
更にまた好適な実施態様では、菌細胞は、チトクロムＰ４５０とチトクロムＰ４５０レダクターゼの間の電子の伝達を助けるポリペプチド補助因子を発現し得る遺伝子作成物を更に含有する。好ましくは、上記補助因子はチトクロムｂ５又はチトクロムＰ４５０レダクターゼのＦＭＮ領域である。
【０１２３】
電子の伝達を助ける他の補助因子には、アドレノドキシン／アドレノドキシンレダクターゼ及びＮＡＤＨチトクロムｂ５レダクターゼ（チトクロムｂ５と共に）が含まれる。本発明においてはＮＡＤＰＨよりもむしろ、ＮＡＤＨから電子を取る補助因子を用いるか、あるいは特に細胞全体の代謝を取扱うときは（「バイオリアクター」）、双方の補助因子を一緒に用いることが特に有益であると信じられる。これは、大腸菌における（ＮＡＤＰ＋ＮＡＤＰＨ）に対する（ＮＡＤ＋ＮＡＤＨ）の細胞内比率が約４：１であるためである。従って、還元等価物がＮＡＤＰＨよりもＮＡＤＨであるならば、Ｐ４５０還元（従って酵素活性）に対して遥かに大なる可能性がある。この点に関して、本発明は、細胞全体における酵素活性を増大させる手段として、細胞質プールにおけるＮＡＤＨ及び／又はＮＡＤＰＨの増大に至らせる付加又は修飾を含む。これは、細胞外媒質（取込み機構が存在するもの、例えばニコチンアミド）に対する前駆物質の付加、あるいはＮＡＤＰＨを破壊する酵素の阻害を含む。
【０１２４】
チトクロムＰ４５０レダクターゼのＦＭＮ領域は、非特許文献６に記載されているように発現させることができ、チトクロムｂ５はHolmansほか（(1994) Arch. Biochem. Biophys. 312, 554-565）に記載されているように発現させることができる。チトクロムＰ４５０がＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ３Ａ７、ＣＹＰ２Ｅ１及びＣＹＰ１Ａ１の何れかである場合、電子の伝達を助けるポリペプチド補助因子が含まれるのが好ましい。チトクロムｂ５がＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ３Ａ７又はＣＹＰ２Ｅ１の何れかと同時発現されるのが特に好ましい。
【０１２５】
また、ＦＭＮ領域がＣＹＰ１Ａ１と同時発現されるのが、特に好ましい。
【０１２６】
ある場合において、上記補助因子は菌細胞の細胞区画又は膜に補助因子を方向付けるＮ末端部分を含むことができると予想されるが、菌細胞において発現される場合、チトクロムｂ５又はチトクロムＰ４５０レダクターゼのＦＭＮ領域にそのような修飾を行わないのが好ましい。
【０１２７】
更なる実施態様は、チトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ系により触媒される反応の生成物を代謝し得る任意の酵素を発現し得る遺伝子作成物を更に含有する本発明の菌細胞からなる。
【０１２８】
真核生物、特に哺乳動物の細胞又は動物、特に哺乳動物からの器官による化合物の代謝を模倣しようとするには、本発明の菌細胞において、真核細胞又は動物においてチトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ系の産物を更に代謝し得る一又は複数の更なるポリペプチドを発現することが望ましい。これは、本発明の菌細胞が変異原性試験のためあるいは薬物代謝モデルとして使用される場合に特に有益である。
【０１２９】
簡便には、酵素は、グルタチオンＳ-トランスフェラーゼ、エポキシドヒドラーゼ又はＵＤＰ-グルクロノシルトランスフェラーゼの何れかである。他の酵素には、スルホトランスフェラーゼ、Ｎ-アセチルトランスフェラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、γ-グルタミルトランスペプチダーゼ、システイン抱合β-リアーゼ、メチルトランスフェラーゼ、チオールトランスフェラーゼ、ＤＴ-ジアフォラーゼ、キノンレダクターゼ又はグリオキサラーゼが含まれる。
【０１３０】
幾つかの遺伝子作成物、例えばチトクロムＰ４５０とチトクロムＰ４５０レダクターゼ、そして時にはチトクロムｂ５又はチトクロムＰ４５０レダクターゼのＦＭＮ領域あるいは更なる酵素を発現する作成物は同じ菌細胞中に存在し得るので、その染色体中に取込まれる一つ又は複数の遺伝子作成物を有する菌株が提供されるのが好都合であり、これらの菌株を更なる遺伝因子の導入に対する「マスター」株として用いることができることが理解される。例えば、細菌「マスター」株が細菌染色体中に組込まれたチトクロムＰ４５０レダクターゼ遺伝子作成物を含有するのが特に好ましい。また、細菌「マスター」株は、細菌染色体からチトクロムＰ４５０レダクターゼとチトクロムｂ５の双方を発現する遺伝子作成物又は作成物類を含有するのが好ましい。これらの「マスター」株はついでチトクロムＰ４５０を発現し得る遺伝子作成物で形質転換される。
【０１３１】
本発明の更なる観点では、本発明の第１の観点の細胞を培養する方法が提供される。任意の適切な培地を使用することができる。栄養分に富むブロス、例えばテリフィックブロスを用いるのが好ましい。また、培地はヘム合成を助ける化合物を含んでいるのが好ましい。δ-アミノレブリン酸（ＡＬＡ）が特に好ましい。
【０１３２】
菌細胞が二つ又はそれ以上の遺伝子作成物を含む本発明の全ての形態において、それら遺伝子作成物は同じ菌細胞において相互に適合性があると認識される。一般に、染色体に組込まれる遺伝子作成物は相互に適合性があり、２つの遺伝子作成物は、一方が染色体に組込まれ、他方がプラスミドのような自己レプリコンであるとき通常互いに適合性がある。一般に、本発明の遺伝子作成物を構成する同じ細胞を持たない２つ又はそれ以上の異なるプラスミドがあるとき、それらが適合性のあるプラスミド、例えば異なる複製起点を有するプラスミドであるのが望ましい。異なるプラスミドが、菌細胞が培地で育成させられるときに該異なるプラスミドの全てを選択できるように、異なる抗生物質耐性遺伝子をコード化するのがまた望ましい。
【０１３３】
本発明の第２の観点では、チトクロムＰ４５０の基質を製品に転換する方法であって、本発明の第１の観点に係る菌細胞と上記基質を混合することを含み、上記細胞が上記基質を転換することができる機能性チトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ系を含む方法が提供される。
【０１３４】
本発明の第３の観点では、チトクロムＰ４５０の基質を製品に転換するための本発明の第１の観点に係る菌細胞の用途が提供される。
【０１３５】
本発明の菌細胞、特に機能性チトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ系を発現する本発明の第１の観点の細胞は、多くの技術分野において用途が見出せる。
【０１３６】
次は、本発明の菌細胞が用いられる幾つかの特定の用途であるが、例えば、チトクロムＰ４５０基質を生成物に転換することが望まれる場合のように、他にも多くの用途があることが思料される。
【０１３７】
ａ）薬物開発と薬物試験
安全な新薬を市場にもたらすことは費用がかかり、複雑でありかつ時間がかかる。薬物動態学的パラメータ、薬物／薬物相互作用及び毒性に関する市場製品の効果と安全性は、薬物開発に用いられるモデルに大きく依存する。リード化合物の欠点が開発の最も早期の段階で予測できるならば薬物開発において大きな進歩が達成できる。
【０１３８】
ヒトに対する動物モデルからの薬物毒性学的データの外挿には深刻な問題がある。これらはしばしば、大抵の治療薬の薬理学的かつ毒性学的性質を決定する薬物代謝酵素の触媒特性の種による顕著な差のためである。
【０１３９】
本発明の一部を構成し機能性Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ系を発現する菌細胞、特に大腸菌とネズミチフス菌細胞は、ヒトの薬物代謝を模倣する理想的なモデルであり、酵母及び哺乳動物細胞に基づくモデルよりも取扱いが容易である。これらの細胞は、最適化された薬物代謝特性に関して薬物の高処理スクリーニング系を可能にする。この問題は、数百の化合物の薬物代謝特性の評価を短時間で行うことが必要となるコンビナトリアル化学ライブラリーの出現で特に重要となる。
【０１４０】
この実施態様では、菌細胞がここに記載した他の薬物代謝酵素もまた発現するのが有用である。
【０１４１】
ｂ）バイオリアクター
本発明の菌細胞は、Ｐ４５０類により触媒される酸化反応の高い基質、位置及びステレオ選択性のために、ファイン又はバルク化学薬品の合成及び化学反応中間物の合成に有用である。
【０１４２】
この実施態様では、適切な基質特異性を有するチトクロムＰ４５０を発現する本発明の菌細胞が選ばれることは明らかである。多くのチトクロムＰ４５０類の基質特異性は従来から知られており、従って適切なチトクロムＰ４５０が即座に選択できる。しかし、多くのチトクロムＰ４５０遺伝子が見出されるので、本発明においてそれらを用いることができ、実際新規なチトクロムＰ４５０を発現する本発明の菌細胞をその基質特異性を決定するために使用することができる。
【０１４３】
あるチトクロムＰ４５０類はアルカンをアルコールに、又は芳香族化合物をフェノール化合物に転換することができるので、本発明の菌細胞はそのようなアルコールとフェノール化合物が必要とされるバルク化学工業において有用であると認められる。しかし、チトクロムＰ４５０類により触媒される反応の多くは、複合構造の選択的酸化（ヒドロキシル化を含む）がしばしば必要となるファイン化学工業及び医薬産業において本発明の細胞が有用なものとなる。本発明の細胞はステロイドホルモン類とその類似体の合成に特に適していると思料される。
【０１４４】
ｃ）生体触媒反応
本発明において開発された系により、部位特異的変異誘発により産生されるＰ４５０変異体の迅速な機能性試験が可能になる。従って、改良された触媒特性を持つ新規なＰ４５０類を短時間で産生することができる。
【０１４５】
ｄ）バイオ及び化学センサー
本発明の菌細胞はバイオ又は化学センサーとしても有用である。特に、細胞から単離された膜が有用である。（検知又は検出される分子である）基質の結合は、菌細胞又は細胞から単離された膜が電極表面上に存在するときに電位変化をもたらし、よって基質分子の検出を可能にする。検出と分析のための固定化細胞の使用は Kambeと Nakanishi（(1994) Current Opinion in Biotechnology 5, 54-59）に記載されている。
【０１４６】
ｅ）バイオレメディエーション
本発明の菌細胞はバイオレメディエーションにおいてもまた有用である。例えば、チトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ系は有害な化合物を解毒することができる。有害な化合物を酸化することができる適切なチトクロムＰ４５０を発現する適切な菌細胞は上記化合物をより無害なようにするのに有用である。
【０１４７】
ｆ）発ガン性試験
他のところでより詳細に記載されているように、本発明の細胞、特にネズミチフス菌細胞は発ガン性試験において有用である。
【０１４８】
本発明の細胞は、無処置の細胞内において機能性チトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ系を提供するので、特に有用であると考えられるが、膜が該細胞から単離され、該膜が細胞全体と比較してチトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ系に富むこともまた本発明の一部である。菌細胞からの膜の単離は従来から良く知られている。本発明の細胞からの膜の単離は実施例でより詳細に記載する。
【０１４９】
本発明の第４の観点では、チトクロムＰ４５０を含む菌細胞であって、該細胞が上記チトクロムＰ４５０を発現し得る遺伝子作成物を含有し、チトクロムＰ４５０が菌細胞の細胞区画又は膜にチトクロムＰ４５０を方向付けるＮ末端部分を含む菌細胞が提供される。
【０１５０】
Ｎ末端部分はチトクロムＰ４５０を膜に方向付けることが好ましい。
【０１５１】
Ｎ末端部分はompＡ、pelＢ、malＥ又はphoＡシグナルペプチド又はその機能的等価変異体を含むことが更に好ましい。
【０１５２】
Ｎ末端部分の好適な特徴、特にシグナルペプチド又はリーダー配列のものは、本発明の前記の観点において好適なものである。
【０１５３】
更に、チトクロムＰ４５０が菌細胞からのチトクロムＰ４５０の精製を助けるペプチド配列を更に含有することがより好ましい。更に好ましくは、上記ペプチド配列は化合物に対する結合部位を含む。
【０１５４】
上記ペプチド配列が-(Ｈis)-ｎ（ここでｎ≧４）で上記化合物がニッケルであれば特に好適である。
【０１５５】
本発明の第４の観点は、チトクロムＰ４５０レダクターゼと通常はカップリングするチトクロムＰ４５０類と、アドレノドキシン／アドレノドキシンレダクターゼをカップリングするもの又は等価な電子伝達化合物のような他のチトクロムＰ４５０類の双方に対して有用であることが考えられる。従って、本発明の第４の観点の好適な実施態様においては、細胞は、等価な電子伝達成分のアドレノドキシン又はアドレノドキシンレダクターゼの各々又は双方を発現し得る遺伝子作成物を更に含有する。「等価な電子伝達成分」には、ＮＡＤＨからチトクロムＰ４５０へ電子を伝達できるあらゆる他の機能的に等価な成分、特にその自然の機能がＮＡＤＨから特定のチトクロムＰ４５０類に電子を伝達することである成分が含まれる。
【０１５６】
本発明の第５の観点では、チトクロムＰ４５０を調製する方法であって、（ａ）本発明の第４の観点に係る充分な量の細胞を提供し（ｂ）他の細胞区画からチトクロムＰ４５０を分離する方法が提供される。
【０１５７】
本発明の更なる観点では、チトクロムＰ４５０を発現し得る遺伝子作成物であって、チトクロムＰ４５０が菌細胞の細胞区画又は膜にチトクロムＰ４５０を方向付けるＮ末端部分を含有する作成物が提供される。Ｎ末端部分の好ましい特徴は、本発明の他の観点に関連して好適なものである。Ｎ末端部分がompＡ、pelＢ、melＥ又はphoＡシグナルペプチド又は機能的に等価なその変異体を含んでなるものであれば特に好ましい。遺伝子作成物の他の好適な特徴は本発明の前述の観点において好ましいものである。本発明の他の更なる観点では、複数の本発明の第１又は第４の観点の菌細胞であって、各細胞が異なるチトクロムＰ４５０を発現し得る遺伝子作成物を含むか、チトクロムＰ４５０とチトクロムＰ４５０レダクターゼの異なる組み合わせをコード化する遺伝子作成物又は作成物群を含み、更に必要ならば、電子伝達を助けるもの又はチトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ系の基質との反応の生成物を更に代謝するもののような他のポリペプチドを含むものが提供される。
【０１５８】
このような複数の細胞（又は細胞のライブラリー）は、例えばフリーザー中に適切な条件で、そして例えばマイクロタイタープレートで簡便に貯蔵することができ、各ウェルは異なる菌細胞を含む。複数の細胞は薬物試験又は発ガン性試験に対して、また上述したような他の目的に対して有用である。
【実施例】
【０１５９】
次の実施例と図面を参照して、以下に本発明を更に詳細に説明する。
【０１６０】
＜実施例１＞
１．材料と方法
【０１６１】
菌株とプラスミド
大腸菌Ｋ１２株ＪＭ１０９（Yanisch ほか (1989) Gene 33, 103-19）及びＤＨ５α（Woodcock ほか (1989) Nucleic Acids Res 17, 3469-78）中における同時発現を比較した。全体を通じて選択し使用した菌株はＪＭ１０９であった。ベクターｐＣＷは、過去にＣＹＰ３Ａ４を含む幾つかの哺乳動物Ｐ４５０のｃＤＮＡの発現に対して成功裡に使用されているので（非特許文献１３）、これをレダクターゼの発現に用いた。プラスミドｐＢ２０７は、細菌pelＢシグナル配列に翻訳的に融合したヒトレダクターゼｃＤＮＡを含むｐＣＷベクターを含有する。ｃＤＮＡの５'末端の配列は、［ＡＴＧＡＡＡＴＡＣＣＴＧＣＴＧＣＣＧＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＴＣＴＧＣＴＧＣＴＣＣＴＣＧＣＴＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＧＡＴＧＧＣＣＡＴＧＧＡＴＡＴＣＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＣＧＣＡＡＣＡＴＧ-ヒトレダクターゼｃＤＮＡ（〜２ｋｂ）］（配列番号４）であり、ここでpelＢリーダー配列には下線が付され、天然のレダクターゼＡＴＧは強調文字で示されている。ＮＦ１４（最適化ＣＹＰ３Ａ４配列を含むｐＣＷ）を 非特許文献１３のものと同じような方法で作成した。転写ターミネーターを含むＮＦ１４のSalＩ-BglＩＩ断片を、次の配列（最初の鎖のみを示す）のtrpＡ転写ターミネーターを含むSalＩ-BglＩＩ二本鎖オリゴヌクレオチドと置換することによりプラスミドｐＢ２１５を作成した：ＴＣＧＡＣＡＧＣＣＣＧＣＣＴＡＡＴＧＡＧＣＧＧＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＡ（配列番号５）。発現シグナルと共にpelＢ-レダクターゼｃＤＮＡを含むｐＢ２０７からのBclＩ-BglＩＩ断片を、独特のBglＩＩ部位でｐＢ２１５にサブクローン化してｐＢ２１６を作成した。
【０１６２】
ＣＹＰ３Ａ４とレダクターゼの大腸菌中の同時発現
発現条件は過去に記載されたもの（非特許文献１３）を修正したものとした。ＪＭ１０９細胞を、開示された（Inoueほか (1990) Gene 96, 23-8）ｐＢ２１６で形質転換し、形質転換体を５０μg/mlのアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上で単離した。単一のコロニーを調製し、アンピシリンを含むＬＢブロス中で５ｍｌのスターター培養を播種するために使用し、これを３７℃で一晩かけて振盪して成長させた。発現培養は、開示されたように（非特許文献１３）改変され補填されたテリフィックブロスを含む略１００ｍｌの培養（１ｌのフラスコ中）であった。発現培養は１ｍｌの一晩の培養で播種され、１ｍＭのＩＰＴＧでの誘導と０．５ｍＭのδ-アミノレブリン酸の添加に先立って４−５時間の間、３０℃、２００ｒｐｍで振盪して育成した。ついで、異種性タンパクの育成と発現を２００ｒｐｍで振盪しながら３０℃で２０−２４時間継続した。
【０１６３】
培養の収集と発現レベルの決定
開示されているようにして（非特許文献１３）、細胞を収穫し、５ｍｌの１００ｍＭトリスアセテート（ｐＨ７．６）、０．５Ｍのスクロース、０．５ｍＭのＥＤＴＡ（２ｘＴＳＥ）中に再懸濁させた。ついで、等しい量の氷冷蒸留水を添加した。ＣＹＰ３Ａ４量は、Ｆｅ２＋-ＣＯ対Ｆｅ２＋差スペクトルを用いて、１ｘＴＳＥ中の５０μｌのホールセル懸濁液を９５０μｌの１００ｍＭのトリスＣｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭのＣＨＡＰＳ、２０％（v/v）のグリセロール、１ｍＭのＥＤＴＡに加え、数粒子の亜ジチオン酸ナトリウムを加えて還元することにより決定した。ゼロ吸収のベースラインを５００ｎｍと４００ｎｍの間で記録し、ついで試料キュベットを約１分間の間定常ＣＯ流下でバブリングした。ついで、スペクトルを記録し、スペクトル的に活性なＣＹＰ３Ａ４／ｌ培養の収量を決定した。この段階で、一定分量の細胞全体を代謝の研究用に取り出した。膜画分は開示されたように（非特許文献１３）残りの細胞から単離した。膜のＣＹＰ３Ａ４とレダクターゼ量を決定した。活性なレダクターゼの収量は、次のようにして、分光光度アッセイにより評価した。０．３Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．７）中の９９０μｌの５０μＭのチトクロムｃに、１−１０μｇの膜タンパクを添加し、ベースライン量を記録した。５０μＭのＮＡＤＰＨを加えてΔＡ５５０ｎｍを経時的に記録した。膜のＰ４５０量を決定するために、細胞全体についてスペクトルを得た。
【０１６４】
異種的に発現されたＣＹＰ３Ａ４とレダクターゼの免疫検出
ＳＤＳ−９％ポリアクリルアミドゲル上にトラック当り１０μｇの膜タンパクを載せ電気泳動法により分離した。ついでタンパク質をＥＣＬ-ニトロセルロース膜（アメルシャム）に移し、ＴＢＳ-Ｔ［５０ｍＭのトリスＣｌ（ｐＨ７．９）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のトウィーン２０］中に１０％のミルク粉末を含むもので２０分間ブロックし、希釈した一次抗体とともに１時間までインキュベートした（ウサギの抗ＣＹＰ３Ａと抗レダクターゼ免疫グロブリンの混合物を使用した）。ついで膜をＴＢＳ-Ｔで洗浄し、希釈ＨＲＰ-結合ロバ抗ウサギ抗血清中で約４５分間インキュベートした。洗浄後、レダクターゼとＣＹＰ３Ａ４をＥＣＬ試薬（アメルシャム）を使用して検出した。抗レダクターゼ及び抗ＣＹＰ３Ａ４抗血清はＩＣＲＦクレア・ホール・ファシリティにより提供され、ＨＲＰ-結合ロバ抗ウサギ抗体はスコットランド・アンチボディ・プロダクション・ユニットから得た。
【０１６５】
テストステロン６β-水酸化酵素アッセイ
細胞と膜画分で検定を行った。双方の場合において、約１００pmolのＰ４５０を、３０ｍＭのＭｇＣｌ２を含むＴＳＥ中で振盪しながらインキュベートした。テストステロンの最終濃度は０．２ｍＭであった。膜を用いた場合、ＮＡＤＰＨ産生系を添加した（最終濃度１ｍＭのＮＡＤＰ、５ｍＭのグルコース-６-ホスファート、１単位のグルコース-６-ホスファートデヒドロゲナーゼ）。反応を５分間３７℃で行わせ、１ｍｌの氷冷メタノールを添加して停止させ、１０分間氷上に放置した。遠心分離に続き、上清を等しい量の氷冷水で希釈し、IsoluteＣ１８カラム（ＩＳＴ社）を用いてテストステロン代謝物を抽出し、１ｍｌのメタノールに溶出させた。メタノールをSpeedVacで蒸発させ、代謝物をついで２００μｌの３５％（v/v）メタノール中に再懸濁し、ＨＰＬＣバイアルに移した。代謝物を、水、メタノール及びアセトニトリルに基づく勾配を使用して１ｍｌ／分の流量で、SpherisorbのＯＤＳ-２（５μｍ）２５０ｘ４．６ｍｍカラム上でＨＰＬＣにより分離し、２４０ｎｍで検出した。６β-ヒドロキシテストステロンの収量は既知の濃度の標準物質を参照して算定し、これによりテストステロンに対する組換えＣＹＰ３Ａ４の比活性の決定が可能になった。ＨＰＬＣ法はGlaxo-Wellcomeから提供され、テストステロン代謝物はSteraloids社から提供された（Stering Winthropから贈られたもの）。
【０１６６】
エリスロマイシンＮ-デメチラーゼのアッセイ
細菌膜画分を、ＮＡＤＰＨ産生系（上述のもの）の存在下で１５０ｍＭのＫＣｌと１０ｍＭのＭｇＣｌ２を含む５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）中に含めた０．５ｍＭのエリスロマイシンと共に、３７℃で２０分間の間、インキュベートした。ついで、７．５％（w/v）のトリクロロ酢酸の添加により反応を停止させ、遠心分離によりタンパク沈殿物を集めた。ついで、エリスロマイシンＮ-デメチラーゼの活性を、Ａ４１２ｎｍを測定する、Ｎａｓｈ試薬［６Ｍの酢酸アンモニウム、６０ｍＭのアセチルアセトン、１５０ｍＭの酢酸；Nash (1953) Biochem. J 55, 416-421］を使用して分光光度アッセイにより決定した。
【０１６７】
ニフェジピンオキシダーゼのアッセイ
細胞又は細菌膜画分を、３０ｍＭのＭｇＣｌ２を含むＴＳＥ中に含めた０．２ｍＭのニフェディピンで、振盪しながら１０分間の間、３７℃でインキュベートした。膜画分を使用した場合は、ＮＡＤＰＨ産生系（上述のもの）を含めた。氷冷メタノール（３０％（v/v）の最終濃度）と過塩素酸（１．５v/v最終濃度）を添加して反応を停止させ、遠心分離により沈殿タンパク質を集めた。上清をＨＰＬＣバイアルに移し、ニフェディピンとその酸化代謝物を、メタノール、アセトニトリル及び水（体積比２５：３０：４５）の移動相を用いて、SpherisorbのＯＤＳ-２（５μｍ）２５０ｘ４．６ｍｍカラム上でアイソクラティックに分離し、ＨＰＬＣにより２５４ｎｍで検出した。生成物の量は既知の酸化ニフェディピン濃度を含む標準物質を参照して算出した。
【０１６８】
２．結果
ＣＹＰ３Ａ４とレダクターゼの同時発現用のプラスミドの作成
大腸菌中でのレダクターゼの発現を最適化する予備実験では、ヒトレダクターゼのｃＤＮＡがそのＮ末端で細菌pelＢリーダー配列に翻訳的に融合され、ｐＢ２０７と称されるプラスミドにおいてｐＣＷのＰｔａｃＰｔａｃプロモーターから発現させたときに高レベルの調節可能な発現が達成された。これらの発現レベルはｐｅｌＢリーダーを欠く匹敵する作成物から得られるもの（データは示さず）よりも大幅に高かった。これらの結果は、他の細菌のシグナル配列、ompＡに融合されたラットのレダクターゼの過去の発現（Shenほか (1989) J. Biol. Chem. 264, 7584-7589）と一致している。同時発現プラスミドは、次のようにして、最適化されたＣＹＰ３Ａ４発現プラスミドＮＦ１４にpelＢ-レダクターゼｃＤＮＡをサブクローン化することにより作成された（非特許文献１３）（本発明に対して再作成した）。ベクター内のBglＩＩ制限部位の一つを除去することによりＮＦ１４を修飾し、ＣＹＰ３Ａ４発現のターミネーターを保持しながらレダクターゼの次のクローン化に下流のBglＩＩ部位が用いられるようにした（詳しくは方法と材料の項と図１のｐＢ２１５を参照のこと）。pelＢ-レダクターゼｃＤＮＡとそのＰｔａｃＰｔａｃプロモーターを含むｐＢ２０７からのBclI-BglII断片をついでBglII部位でｐＢ２１５にサブクローン化し、それぞれがＰｔａｃＰｔａｃプロモーターを担持している２つのｃＤＮＡがヘッドツーテイルで配置されたプラスミドｐＢ２１６を作成した（図１参照）。
【０１６９】
ｐＢ２１６からのレダクターゼとＣＹＰ３Ａ４の同時発現の最適化
理想的な培養条件は、培養にδ-アミノレブリン酸を補填するとＣＹＰ３Ａ４の発現を大幅的に増大させる（未公開データ）ことを除いて、ＮＦ１４からのＣＹＰ３Ａ４の発現に最適であるとされたもの（非特許文献１３）と同様であることが見出され、従って今回は常套的に使用される。大腸菌株ＪＭ１０９とＤＨ５αにおける発現レベルが比較され、レダクターゼの発現レベルはＪＭ１０９におけるよりもＤＨ５αにおいて僅かに高いけれども、これはＣＹＰ３Ａ４レベルを犠牲にしたものであったことが見出された（データは示さず）。従って、ＣＹＰ３Ａ４発現のレベルを優先させるべきであると決定されたので、ＪＭ１０９を発現株として選択した。
【０１７０】
大腸菌におけるレダクターゼの発現の過去の報告によれば、育成地にはリボフラボンが追加されることが示されている（Shenほか (1989) J. Biol. Chem. 264, 7584-7589）。我々は、リボフラボンを添加した場合の活性なレダクターゼの発現レベルに対する差異は無視できることを見出したので、発現培養にリボフラボンを含めなかった。
【０１７１】
発現レベルの決定
細菌細胞全体におけるＣＹＰ３Ａ４量はＦｅ２＋-ＣＯ対Ｆｅ２＋差スペクトルを用いて決定することができるが、レダクターゼの発現レベルの評価には細菌膜画分が開示されたようにして（非特許文献１３）調製された。これが必要であったのは、レダクターゼアッセイがチトクロムｃの還元速度を測定するからであり、ＪＭ１０９細胞において測定された背景活性が禁止的に高く、細胞又はスフェロプラストからの直接の測定を可能にする。ｐＢ２１６からのレダクターゼの発現に対しては、得られたレダクターゼの比活性は、膜調製物によるチトクロムｃの還元の速度により計算して、４００pmolレダクターゼ／mg膜タンパクの範囲にあった。膜中に測定されたＣＹＰ３Ａ４量は典型的にはおよそ２００pmol／mg膜タンパクであった。従って、ｐＢ２１６からのＣＹＰ３Ａ４とレダクターゼの同時発現後に、細菌膜は、およそ２：１の比率のＰ４５０に対するＰ４５０レダクターゼを含んでいる。
【０１７２】
異種的に発現されたＣＹＰ３Ａ４とレダクターゼの免疫検出
異種的に発現されたレダクターゼとＣＹＰ３Ａ４を示す典型的なウェスタンブロットを図２に示す。レダクターゼとＣＹＰ３Ａ４に対応するバンドはｐＢ２１６由来の膜画分において検出できる一方（トラック５及び６）、レダクターゼのみとＣＹＰ３Ａ４のみはＰＢ２０７（トラック１及び２）とＮＦ１４（トラック３及び４）由来の試料においてそれぞれ検出することができる。その発現がＩＰＴＧの添加によっては誘導されなかった（トラック４及び６）細菌培養から由来するトラックのレダクターゼとＣＹＰ３Ａ４バンドの出現から観測されるように、発現は非誘導条件下では完全には抑制されなかった。しかし、これらの画分から由来する活性なレダクターゼとスペクトル的に活性なＣＹＰ３Ａ４の量は誘導された培養から由来するものよりも更に低いことが見出され（データは示さず）、これが、バンドの検出が試料中のＣＹＰ３Ａ４とレダクターゼの量に対して線形の応答ではないことを示しているのかも知れない。ＪＭ１０９ｐＢ２１６膜画分において異種的に発現されたＣＹＰ３Ａ４とレダクターゼの量はヒトの肝臓のミクロソームの試料において検出されたものと同様であるようである（トラック６及び９）。
【０１７３】
細胞全体におけるＣＹＰ３Ａ４活性のアッセイ
ＪＭ１０９ｐＢ２１６の細胞全体はテストステロンを代謝することが見出された。６β-ヒドロキシテストステロンは負の対照株ＪＭ１０９ｐＣＷ（ベクターのみ）又はＪＭ１０９ｐＢ２０７（レダクターゼ発現のみ）と共にテストステロンをインキュベートした後には検出されなかった。これは、大腸菌がＣＹＰ３Ａ４が無い場合にテストステロンの６β-ヒドロキシル化を触媒することができないことを示している。ＣＹＰ３Ａ４だけを発現する細胞（ＪＭ１０９ＮＦ１４）もまた検出可能なレベルの代謝物を生産せず、ＣＹＰ３Ａ４に電子を供与して触媒機能を許容し得る内因性タンパク質はないことを示している。しかしながら、１００μＭのクメンハイドロペルオキシドがＪＭ１０９ＮＦ１４細胞を含む反応物に添加されるときは、６β-ヒドロキシテストステロンが形成された。これは、ＪＭ１０９ＮＦ１４細胞におけるＣＹＰ３Ａ４が機能性であるが、利用できる電子の細胞内供給はないことを示唆している。達成された低い活性は細胞全体内でクメンヒドロペルオキシドに対するＰ４５０の隔絶性を反映する。レダクターゼとのＣＹＰ３Ａ４の同時発現の際に、比較的高い速度のテストステロン代謝が生じる（ＪＭ１０９ｐＢ２１６試料）。これは、同時発現されたレダクターゼとＣＹＰ３Ａ４が細胞全体中でカップリングして機能性モノオキシゲナーゼ系を産生することを示している。
【０１７４】
この実験では、６β-水酸化酵素活性は〜１７．３nmol産生６β-ヒドロキシテストステロン／分／nmolＰ４５０と計算された。細菌的に発現されたＣＹＰ３Ａ４を含む再構築系での過去の結果は１０nmol６β-ヒドロキシテストステロン／分／nmolＰ４５０までの代謝回転速度を得ていた（非特許文献１３）。
【０１７５】
ＪＭ１０９ｐＢ２１６膜によるテストステロン、エリスロマイシン及びニフェジピンの代謝
ｐＢ２１６由来の膜画分はリン脂質、洗浄剤、グルタチオン又はチトクロムｂ５の補填なしにＣＹＰ３Ａ４基質テストステロン、ニフェジピン及びエリスロマイシンの代謝を媒介することが見出された。これらのアッセイにおいては、１００pmolのＣＹＰ３Ａ４を含む膜画分をＮＡＤＰＨ産生系の存在下で基質と共に単にインキュベートした。典型的な活性を表２に示す。結果は、ＪＭ１０９ｐＢ２１６膜画分が３つのＣＹＰ３Ａ４基質の代謝に優れていることを示している。エリスロマイシンＮ-デメチラーゼ活性は、細菌的に発現されたＣＹＰ３Ａ４を含む再構築系において過去に観察された（非特許文献２５）よりも〜２．５倍少なかった。しかしながら、これに対して、ニフェジピンオキシダーゼ活性は再構築系について過去に観察されたもの（非特許文献１３）と同様であった。
【０１７６】
表１：ＪＭ１０９ＮＦ１４とＪＭ１０９ｐＢ２１６細胞及び／又は膜のチトクロムＰ４５０量及びチトクロムｃレダクターゼ活性
【０１７７】
【表１】
【０１７８】
Ｐ４５０量はＦｅ２＋−ＣＯ対Ｆｅ２＋差スペクトルにより測定した。含量は４回の実験の平均±ＳＤとして表している。
【０１７９】
＊量は１ｘＴＳＥ中に含めた５０μｌ細胞において測定した（〜０．５ｍｌ培養）。
†量は組換え細菌由来の膜画分中のｍｇタンパク質当りで評価した。
レダクターゼ活性は膜画分中のｍｇタンパク質当りのチトクロムｃの還元速度を測定することにより計算し、値を４回の平均±ＳＤとした。
ｎ．ｄ．＝検出可能な活性はなし
【０１８０】
表２：ＪＭ１０９ｐB２１６細胞と膜によるテストステロン、ニフェジピン及びエリスロマイシンのＣＹＰ３Ａ４-依存性代謝
【０１８１】
【表２】
【０１８２】
組換えＣＹＰ３Ａ４とｐ４５０レダクターゼを含む細胞又は膜による３種の既知のＣＹＰ３Ａ４基質の代謝を評価した。代謝回転数は、nmol生成物／分／nmolP450として記録し、±ＳＤで示した。検出された生成物は６βヒドロキシテストステロン、酸化ニフェジピン及びホルムアルデヒドであった。活性が検出されなかった場合は、検出レベルを示す。テストステロンの代謝では、ＣＹＰ３Ａ４又はＰ４５０レダクターゼの何れかを欠く細胞又は膜と共に６０分インキュベートした後でさえ６βヒドロキシテストステロンは生成されなかった。
【０１８３】
＊エリスロマイシンの代謝に対しては、細胞全体によるホルムアルデヒド生成の背景レベルが非常に高かったので、活性は膜についてのみ記録することができた。
【０１８４】
３．議論
この実施例では、我々は、ヒトＣＹＰ３Ａ４及びＰ４５０レダクターゼをコードしているｃＤＮＡの同時発現による機能性Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ系の産生を記述する。我々の知る限りでは、これは、哺乳動物の異物代謝Ｐ４５０が未処理の大腸菌細胞において触媒的に活性であることが示された最初の例である。ステロイド産生Ｐ４５０ １７α-水酸化酵素／１７-,２０-リアーゼ（Ｐ４５０ｃ１７）は、細菌フラボドキシン／ＮＡＤＰＨ-フラボドキシンレダクターゼ系から電子を受け取るその能力のために大腸菌において機能性であるけれども（非特許文献１９）、ＣＹＰ３Ａ４だけを発現する大腸菌細胞（ＪＭ１０９ＮＦ１４細胞）は電子の外来性の供与がない場合には（この場合にはクメンヒドロペルオキシドから）ＣＹＰ３Ａ４基質テストステロンを代謝しなかった。従って、ＣＹＰ３Ａ４はこのあるいは他の細菌レダクターゼとはカップリングし得ないと結論できる。
【０１８５】
我々は、これらの細胞を有用なＰ４５０代謝物の生産に対する生体触媒として使用できるかもしれないことから、ＣＹＰ３Ａ４とヒトＰ４５０レダクターゼの大腸菌における同時発現系を開発した。単一プラスミドｐＢ２１６において別個のＰｔａｃＰｔａｃプロモーターのもとで両方のｃＤＮＡが発現され、ＣＹＰ３Ａ４とレダクターゼの協調性発現がＩＰＴＧにより誘導された。発現の最適レベルを達成するために、双方のｃＤＮＡをその元の形態から改変した。ＣＹＰ３Ａ４のｃＤＮＡの５'末端を過去に記載されているようにして改変した（非特許文献１３）。Ｐ４５０レダクターゼの効果的な発現には、細菌のpelＢシグナルペプチドをコードしている配列との融合によりｃＤＮＡの５'末端を伸展させることが必要であることが分かった。２００pmol／mg膜タンパクのＣＹＰ３Ａ４の収量と４００pmol／mg膜タンパクのレダクターゼの収量が得られた。
【０１８６】
同時発現されたＣＹＰ３Ａ４及びpelＢ-レダクターゼは、これらから単離されたＪＭ１０９ｐＢ２１６細胞と膜がＣＹＰ３Ａ４基質に対して活性であるので、細菌の周辺質膜の同じ面上に局在化しうると思われ、これはタンパク質が効果的にカップリングできなければならないことを示している。基質に対して測定された活性は、再構築系において精製された細菌発現ＣＹＰ３Ａ４で得られた過去の結果（非特許文献１３；非特許文献１５）よりも高いことが分かった。このような再構築系は精製ＣＹＰ３Ａ４、レダクターゼ、チトクロムｂ５、グルタチオン、洗浄剤及び最適化リン脂質組成物を含む。チトクロムｂ５は、ＣＹＰ３Ａ４-レダクターゼ融合タンパク質に対する特定の基質に対して最大のＣＹＰ３Ａ４活性を得るのに重要であることが示されている一方（非特許文献１７）、リン脂質組成物とグルタチオン濃度もまたＣＹＰ３Ａ４を含む再構築系において重要であることも示された（非特許文献１３）。これらの付属的な因子がない場合は、テストステロンに対するＣＹＰ３Ａ４活性は、ここで用いた単純な緩衝系内では細胞全体及び膜においてむしろ予期されなかった。従って、これらの基質に対する高レベルのＣＹＰ３Ａ４活性が、我々の研究では、外来的に添加されるチトクロムｂ５の不存在下で観察されたことは極めて興味深かった。
【０１８７】
要約すると、我々は、大腸菌におけるＣＹＰ３Ａ４とヒトＰ４５０レダクターゼの高レベルの同時発現を成功裡に達成した。結果として得られた菌株は外来的に適用されたＮＡＤＰＨの不存在下においてさえもテストステロンとニフェジピンのホールセル代謝に好適であり、（少なくとも）レダクターゼ活性部位が細胞質的に配向していることを示唆している。細菌由来の膜は、ＮＡＤＰＨのみが補充された簡単な緩衝液中においてテストステロン、ニフェジピン及びエリスロマイシンを代謝する。我々の同時発現菌株から達成される特異的活性は再構築系で過去に得られたよりも高い。代謝回転速度を改善するためにこの矛盾の可能な理由を調査することを我々は望む。本実施例において記載された菌株はＣＹＰ３Ａ４代謝物の生産に対する生物工学的ツールとしての用途があり、大腸菌におけるＰ４５０レダクターゼとの他のＰ４５０のアイソフォームの将来の同時発現のモデル系として使用される。
【０１８８】
＜実施例２＞
１．材料と方法
菌株とプラスミド
大腸菌Ｋ-１２株ＪＭ１０９（Yanisch ほか (1985) Gene 33, 103-19）を全体を通じて使用した。チトクロムＰ４５０ｃＤＮＡをプラスミドｐＣＷから発現させた。このプラスミドは、β-ラクタマーゼ遺伝子を含み、よってアンピシリン又はカルベニシリンのような薬剤の存在下で育成された菌細胞において安定に維持することができる。ヒトＰ４５０レダクターゼｃＤＮＡはプラスミドｐＡＣＹＣ１８４から発現され、該プラスミドはクロラムフェニコールの存在下で菌細胞中に安定に維持することができる。
【０１８９】
細菌シグナルペプチドコード配列の単離と発現作成物の産生
細菌pelＢシグナルペプチドに対するコード配列の供給源は市販のベクターｐＥＴ-２０ｂ（ノバゲン）であった。染色体ＤＮＡを大腸菌株ＪＭ１０９から抽出し、特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用するＰＣＲによるompＡリーダー配列の単離に対する鋳型として使用した。このＰＣＲ産物をサブクローン化し、ジデオキシ配列決定を行い、ＧｅｎＥＭＢＬデータベースに既に登録されているompＡリーダー配列（目録番号：ｖ００３０７）、すなわち：
５'ＡＴＧＡＡＡＡＡＧＡＣＡＧＣＴＡＴＣＧＣＧＡＴＴＧＣＡＧＴＧＧＣＡＣＴＧＧＣＴＧＧＴＴＴＣＧＣＴＡＣＣＧＴＡＧＣＧＣＡＧＧＣＣ-３'（配列番号６）と同一であることが分かった。
【０１９０】
ＰＣＲ融合技術（Yon ほか (1989) Nucleic Acids Res. 17, 4895）を使用して全長Ｐ４５０ｃＤＮＡの５'末端にインフレームで細菌pelＢ又はompＡシグナルペプチドのコード配列を融合させた。この方法を使用して、pelＢ-ＣＹＰ３Ａ４、ompＡ-ＣＹＰ３Ａ４、ompＡ-ＣＹＰ２Ｄ６、ompＡ-ＣＹＰ２Ａ６及びompＡ-ＣＹＰ２Ｅ１融合を作成し、各々の場合において作成物の５'末端のＮdeI制限部位を操作してｐＣＷへのサブクローン化を容易にした。全てのＰＣＲ由来断片はジデオキシ配列決定により確かめた。
【０１９１】
過去に記載されたpelＢ-ヒトレダクターゼ作成物を上流（ｔａｃ）２プロモーターカセットと共に、ＢclI-ＢglII断片として、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４の独特のＢamＨＩ部位にサブクローン化して、プラスミドｐＪＲ７を生産した。
【０１９２】
細菌リーダー配列に融合したヒトＰ４５０類の大腸菌における発現
【０１９３】
ＪＭ１０９細胞をｐＣＷ／pelＢ-ＣＹＰ３Ａ４、ｐＣＷ／ompＡ-ＣＹＰ３Ａ４、ｐＣＷ／ompＡ-ＣＹＰ２Ｄ６、ｐＣＷ／ompＡ-ＣＹＰ２Ａ６又はｐＣＷ／ompＡ-ＣＹＰ２Ｅ１で形質転換した（Inoueほか (1990) Gene 96, 23-28）。形質転換細胞をアンピシリンで選択し、更なる研究用に増幅した。同時発現では、ＪＭ１０９細胞をプラスミドｐＣＷ／ompＡ-ＣＹＰ２Ｄ６及びｐＪＲ７で同時形質転換し、アンピシリンとクロラムフェニコールの両方で選択した。
【０１９４】
標準的なプロトコールを全ての発現及び同時発現実験に対して用いた。形質転換体は、凍結グリセロール貯蔵物から、アンピシリンだけか（ｐ４５０の発現に対して）アンピシリンとクロラムフェニコール（Ｐ４５０とレダクターゼの同時発現に対して）を含むＬＢ寒天プレート上に画線され、３７℃で１２−１４時間インキュベートされた。ついで、単一の単離コロニーを数ｍｌのＬＢブロス（適当な抗生物質を含む）中に播種し、３７℃で一晩振盪させた。このスターター培養を、１ｌの三角フラスコ中において、開示された（非特許文献１３）ようにして改変され補充され、しかしレダクターゼが同時発現されるときはクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）が添加された１００ｍｌのテリフィックブロス中に１：１００で希釈した。これらの培養を振盪しながら３０℃で４−５時間インキュベートした。ついで、ヘム前駆物質δ-アミノレブリン酸を、０．５ｍＭの最終濃度になるまで添加し、１ｍＭになるまで誘導剤ＩＰＴＧを添加した。ついで異種性タンパク質の発現を３０℃で２２−２３時間の間継続させた。
【０１９５】
培養の収集と発現レベルの決定
−先に記載されたとおり
【０１９６】
異種的に発現されたＰ４５０とレダクターゼの免疫検出
ＳＤＳ-９％ポリアクリルアミドゲル上でタンパク質を分離し、ついでHybond-ＥＣＬ膜（アメルシャム、ＵＫ）上に移した。該膜を、ＴＢＳ-Ｘ［５０ｍＭのトリスＣｌ（ｐＨ７．９）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１０％のトリトンＸ-１００］中に５％のミルク粉末を含むもので１時間ブロックし、希釈した一次抗体と共に４５−６０分間インキュベートした。用いた一次抗体は、ウサギ抗-ＣＹＰ３Ａ、ウサギ抗-ＣＹＰ２Ｄ６、ウサギ抗レダクターゼ、又はヒツジ抗-ＣＹＰ２Ｅ１免疫グロブリンであった。ついで膜をＴＢＳ-Ｘで４回洗浄し、２５−３５分間二次抗体（適当なＨＲＰ-結合ロバ抗ウサギ又は抗ヒツジＩｇＧ）でインキュベートした。ＴＢＳ-Ｘで４回洗浄した後、ＥＣＬ（アメルシャム、ＵＫ）を用いて化学ルミネッセンスにより組換えタンパク質を検出した。二次抗体は、スコットランド・アンチボディ・プロダクション・ユニットから得た。
【０１９７】
ブフラロール１'-水酸化酵素アッセイ
３００μｌの全容積中に２０又は５０pmolのＣＹＰ２Ｄ６、５０μＭ(±)-ブフラロール及びＮＡＤＰＨ産生系（実施例１を参照）を含む５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．４中において３７℃で細菌膜画分について検定を行った。ｐＣＷ／ompＡ-ＣＹＰ２Ｄ６のみ（すなわち同時発現されるレダクターゼはなし）を担持する細胞から単離された膜に対しては、ＮＡＤＰＨ産生系は１００μＭのクメンヒドロペルオキシドにより置換した。反応を１５μｌの６０％過塩素酸の添加により停止させ、５−１０分間氷上に置いた。沈殿したタンパク質を遠心分離により除去し、ついで上清について、信頼性のある標準物質を参照して、逆相ＨＰＬＣにより１'-ヒドロキシブフラロールを分析した。分離は、Spherisorbの５μｍのＯＤＳ-２カラム２５ｃｍｘ４．６ｍｍと、アセトニトリルの線形勾配（１２分で２７から５１％）を持つ０．１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ５．０）の移動相を用いて達成した。検出は、それぞれ２５２ｎｍと３０２ｎｍの励起及び放射波長を使用した蛍光法によった。
【０１９８】
細胞全体についての検定を５０ｍｌの三角フラスコ中で３７℃で実施した。５ｍｌの全容積中に５０pmolのＣＹＰ２Ｄ６、５０μＭ(±)-ブフラロール及び１ｘＴＳＥ緩衝液を含んでいた。試料（３００μｌ）を、氷上に６０％過塩素酸を１５μｌ含む管内に０、２、５及び１０分で取り出した。ついで膜のアッセイ（上記）と同様にして分析を進めた。
【０１９９】
ミカエリス-メンテン動力学パラメータの決定に対しては、２０pmolのＣＹＰ２Ｄ６で５分間、基質の濃度を変えながら（０から１００μＭ）インキュベーションを行った。Ｋｍとｖｍａｘは初期反応速度対基質濃度の二重逆数プロットから推定した。
【０２００】
２．結果
Ｐ４５０とＰ４５０レダクターゼのｃＤＮＡの単離：
ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ａ６及びＣＹＰ２Ｅ１及びＰ４５０レダクターゼに対するｃＤＮＡを、刊行されている配列情報に基づいて合成されたアンプリマーを使用してＲＴ-ＰＣＲにより単離した。ｃＤＮＡはＤＮＡ配列決定により確証され、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ａ６及びＣＹＰ２Ｅ１及びヒトＰ４５０レダクターゼに対して刊行されたものと同一の一次構造を持つタンパク質をコードすることが分かった。
【０２０１】
pelＢリーダー配列に融合したヒトＰ４５０レダクターゼの作成と発現
Ｐ４５０レダクターゼはヒトＰ４５０類の触媒活性に必要であり、大腸菌中には存在しない。我々は、大腸菌において天然のＰ４５０レダクターゼ又はpelＢリーダー配列（ＭＫＹＬＬＰＴＡＡＡＧＬＬＬＬＡＡＱＰＡＭＡ-）（配列番号１）にそのＮ末端で融合したＰ４５０レダクターゼを発現させようと試みた。最初は、プラスミドｐＣＷにおいてＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）誘導性(tac)２プロモーターの調節下で両方のタンパク質を発現させようと試みた（図３）。天然のＰ４５０-レダクターゼ及びpelＢ-レダクターゼが宿っている大腸菌から膜を単離し、免疫ブロットにより分析した（図４）。ＩＰＴＧがない場合は、無視できる量のＰ４５０レダクターゼが検出され、組換えタンパク質の明白な誘導がＩＰＴＧの添加時に観察された。プラスミドｐＪＲ１からの天然Ｐ４５０レダクターゼの発現は低い一方、高レベルのpelＢ-Ｐ４５０レダクターゼがプラスミドｐＪＲ２から得られた。これらの差異は、二つの組換えタンパク質を含む膜において検出されたチトクロムｃに対するＰ４５０-レダクターゼ活性にもまた反映されていた。これらの調製物において、pelＢ-レダクターゼは天然のＰ４５０レダクターゼと比較しておよそ１０倍強いレダクターゼ活性を示した（図４）。これらの結果は、大腸菌における機能性Ｐ４５０レダクターゼの最適な発現は細菌リーダー配列へのこのタンパク質の融合の後にのみ可能になることを明らかに証明している。
【０２０２】
細菌リーダー配列に融合したＣＹＰ３Ａ４の作成と発現
ＣＹＰ３Ａ４は主要なヒトの肝臓のＰ４５０であり（Shimadaほか (1994) J. Pharmacol. Exp. Ther. 270, 414-423）、広範囲の治療薬並びに化学発ガン物質の代謝に関与している。この重要なＰ４５０の効果的な発現を達成するために、我々は、任意の部位において任意の二つの配列の融合を可能にすることが示されているＰＣＲベースの戦略（Yonほか (1989) Nucleic Acids. Res. 17, 4895）を使用して、細菌pelＢ又は細菌ompＡリーダー配列（ＭＫＫＴＡＩＡＩＡＶＡＬＡＧＦＡＴＶＡＱＡ）（配列番号２）にそのＮ末端で融合したＣＹＰ３Ａ４をコードする一連の修飾ＣＹＰ３Ａ４のｃＤＮＡを作成した。結果的に得られたｃＤＮＡ作成物を配列決定し、ベクターｐＣＷにクローン化し、発現のために大腸菌株ＪＭ１０９に形質転換した。
【０２０３】
アンピシリンの存在下で成長したコロニーを更なるＤＮＡ及びタンパク質の分析用に選択した。発現作成物を含む大腸菌をテリフィックブロス中で成長させ、材料と方法の項に記載されたようにしてＩＰＴＧによりＰ４５０発現を誘導した。細菌膜の免疫ブロット分析（図５）及び細胞全体又は膜のスペクトル分析（図６）によりＣＹＰ３Ａ４の発現を検出した。図５から分かるように、免疫反応性pelＢ-ＣＹＰ３Ａ４のレベルはヒトの肝臓ミクロソームに見出されるＣＹＰ３Ａ４レベルと同様である一方、免疫反応性ompＡ-ＣＹＰ３Ａ４のレベルは少なくとも一桁強かった。興味深いことに、pelＢ-ＣＹＰ３Ａ４は２つの接近して遊走する免疫反応性タンパク質を産生した。同様な結果が、ニッケル-アガロースアフィニティクロマトグラフィーによるＨisタグpelＢ-３Ａ４の精製後にも得られ、また精製されたompＡ-３Ａ４は同様に均質なタンパク質を産生した。pelＢ-ＣＹＰ３Ａ４とompＡ-ＣＹＰ３Ａ４は、Ｐ４５０ヘモタンパク質に典型的なＦｅ２＋対Ｆｅ２＋-ＣＯスペクトルを示した（図６）。スペクトル的に活性なpelＢ-ＣＹＰ３Ａ４の収量（ompＡ-ＣＹＰ３Ａ４タンパク質のものではない）は、成長培地におけるδ-アミノラエブリン酸（ＡＬＡ）の存在下で強く刺激された（図７）。免疫ブロット分析から予期されたほど差異は顕著ではないが、これらの条件下で、ompＡ-３Ａ４は、pelＢ-ＣＹＰ３Ａ４と比較してより多くのスペクトル的に活性なＰ４５０を産生した（それぞれ５００nmol/l培養対１４３nmol/l培養）。培地中のＡＬＡの存在により、組換えＰ４５０のスペクトル分析において４２０ｎｍの吸収ピークが出現する（図６、ＡＬＡの存在下で発現されたpelＢ-３Ａ４及びＡＬＡの不存在下で発現されたompＡ-３Ａ４を参照せよ）。
【０２０４】
発現されたタンパク質の触媒活性の直接的な測定は、細菌膜中にＰ４５０レダクターゼがないので可能ではなかった。従って、Ｐ４５０酵素活性は、Ｐ４５０類に対する人工的な酸素供与体となるクメンヒドロペルオキシドの存在下で測定した。この分析において、テストステロンの６β-水酸化に対するpelＢ-ＣＹＰ３Ａ４とompＡ-ＣＹＰ３Ａ４の代謝回転数はそれぞれ４．２min-1及び３．２min-1であった。これらの結果は、大腸菌においてこれらのＰ４５０類はスペクトル的にかつ触媒的に活性な酵素に正しく折畳まれることを明白に証明している。
【０２０５】
ompＡリーダー配列に融合したＣＹＰ２Ｄ６の作成と発現
ompＡ-ＣＹＰ３Ａ４に対して得られた収量はpelＢ-ＣＹＰ３Ａ４に対するよりも更に高かったことを我々は見出したので、様々な治療的に重要な化合物の代謝に関与しているＰ４５０であるＣＹＰ２Ｄ６のＮ末端にompＡ配列を排他的に融合させることを決めた。
【０２０６】
ＣＹＰ２Ｄ６ｃＤＮＡへのompＡシグナル配列の融合に用いたＰＣＲ技術はompＡ-ＣＹＰ３Ａ４の作成に用いられた戦略と同様であった。この作成物はベクターｐＣＷから発現された。図８は、ompＡ-ＣＹＰ２Ｄ６のｃＤＮＡ作成物を含んでいる大腸菌から得られた細菌膜の免疫ブロットを示している（レーン２）。組換えＣＹＰ２Ｄ６に対応する免疫反応性バンドがこれらの膜において検出されたが、これは空の発現プラスミドｐＣＷを担持する細菌から単離された膜には存在していなかった（レーン１）。ompＡ-ＣＹＰ２Ｄ６は典型的なＰ４５０のＦｅ２＋対Ｆｅ２＋-ＣＯスペクトルを示した（図９）。スペクトル的に活性なＣＹＰ２Ｄ６の収量（４８１nmol/l培養、図１０）はompＡ-ＣＹＰ３Ａ４に対して得られた収量と同様であり、前者のヘモタンパク質を発現する細菌は明確な赤色に着色された。スペクトル的に活性なompＡ-ＣＹＰ２Ｄ６のＡＬＡに依存した増大はpelＢ-ＣＹＰ３Ａ４に対するよりも更に強かった。クメンヒドロペルオキシドの存在下では、ompＡ-ＣＹＰ２Ｄ６は、５０±３min-1の代謝回転数で典型的なＣＹＰ２Ｄ６基質ブフラロールの水酸化を触媒した。
【０２０７】
細菌リーダー配列に融合したＰ４５０とＰ４５０-レダクターゼの同時発現は大腸菌において機能性モノオキシゲナーゼ系を産生する：
機能性Ｐ４５０-モノオキシゲナーゼ系を産生するために、我々は大腸菌においてＰ４５０とＰ４５０-レダクターゼを同時発現することを試みた。大腸菌において２つのタンパク質の同時発現を達成するには３つの主要な方法を考えることができる。第１は、２つのｃＤＮＡを同じ細胞において分離した適合性プラスミドから発現させることができる：例えばＰ４５０をｐＣＷから、Ｐ４５０レダクターゼを別個のベクターから発現させることができる。第２に、双方のｃＤＮＡを同じプラスミドにサブクローン化することができる。第３に、Ｐ４５０又はＰ４５０レダクターゼをコードしているｃＤＮＡの一つ又は双方を細菌染色体に組込むことができる。我々は、技術的な要求が最も少ない最初の戦略を選択した。
【０２０８】
pelＢ-レダクターゼｃＤＮＡをベクターｐＡＣＹＣ１８４中に（図３）クローン化してベクターｐＪＲ７を産生した。この作成物の利点は、ｐＡＣＹＣ１８４がｐＣＷとは異なる複製開始点を含むことである。加えて、これらのベクターは異なる選択マーカーを含み、これにより一つはＰ４５０-レダクターゼの発現（ｐＡＣＹＣ１８４）、他方（ｐＣＷ）はＰ４５０の発現に対して、２つの別個のプラスミドでの安定した同時形質転換が可能となる。大腸菌は、ompＡ-ＣＹＰ２Ｄ６のｃＤＮＡを担持するｐＣＷ及びｐＪＲ７で形質転換をした。形質転換体をアンピシリンとクロラムフェニコール上で選択し、更なる分析のために拡大した。免疫ブロット（図８）により同時発現菌株から単離された膜における組換えＰ４５０レダクターゼとＣＹＰ２Ｄ６に対応する免疫反応性バンドが明らかになり（レーン３と４）、これは空の発現ベクターｐＣＷを担持する細菌から単離された膜には両方とも無かった（レーン１)。ompＡ-ＣＹＰ２Ｄ６とpelＢ-レダクターゼを同時発現する大腸菌は典型的なＦｅ２＋対Ｆｅ２＋-ＣＯスペクトル（図９）を示した。スペクトル的に活性なompＡ-ＣＹＰ２Ｄ６の細胞全体の収量は同時発現株において３６５nmol／l培養であり、これはＣＹＰ２Ｄ６だけを発現する大腸菌におけるよりも２５％だけ低かった（図１０）。ompＡ-ＣＹＰ２Ｄ６とＰ４５０-レダクターゼを含む膜は５３０nmol／min／mgのチトクロムｃレダクターゼ活性を示し、これはヒト肝臓ミクロソームに対して報告された値より２倍高い。
【０２０９】
最も重要な点は、ompＡ-ＣＹＰ２Ｄ６とpelＢ-レダクターゼを同時発現する未処理の細菌並びにその由来の膜が、それぞれ４．６min-1と５．７min-1の代謝回転数と、ヒト肝臓ミクロソームに対して報告された値より４０倍高い比活性（１．２nmol／min／mg膜タンパク）で、極めて効率良く典型的なＣＹＰ２Ｄ６基質ブフラロールの水酸化を触媒した。ブフラロールの１'-水酸化を触媒したＣＹＰ２Ｄ６に対するＶmaxとＫｍはそれぞれ１３．３min-1と１１．１μＭであった（図１１）。
【０２１０】
ompＡシグナルペプチドに融合したＣＹＰ２Ａ６の作成と発現
ompＡシグナルペプチドを全長ＣＹＰ２Ａ６のＮ末端にＰＣＲ法により融合させた。ｐＣＷから発現した組換えompＡ-ＣＹＰ２Ａ６は、細胞全体と膜の双方がこれらの細胞から由来する典型的なＦｅ2+対Ｆｅ2+-ＣＯ差スペクトルを示した（図１３）。細胞全体におけるスペクトル的に活性なＣＹＰ３Ａ６の収量（１９３nmol／l培養、図１４）は類似作成物から発現されたＣＹＰ３Ａ４かＣＹＰ２Ｄ６の何れよりも幾分低かった。しかし、これらの細胞から単離された膜の特異的ＣＹＰ２Ａ６量はヒト肝臓ミクロソームに見出されるレベルを大きく越えていた。
【０２１１】
ompＡシグナルペプチドに融合したＣＹＰ２Ｅ１の作成と発現
ompＡシグナルペプチドを全長ＣＹＰ２Ｅ１のＮ末端に融合させるために同じＰＣＲベースの戦略を用いた。ｐＣＷからの発現により、特異的抗-ＣＹＰ２Ｅ１抗体を使用する免疫ブロット法で検出可能であったタンパク質が細菌膜に出現し（図１５、レーン３）、これはヒト肝臓ミクロソーム（図１５、ライン１）の試料におけるＣＹＰ２Ｅ１と同じ見かけサイズであった。このタンパク質は、空の発現プラスミド、ｐＣＷを担持する大腸菌から単離された膜の試料では見出せなかった（レーン２)。相対的なバンド強度（レーン１と３を比較）から、この細菌株において非常に高いレベルの組換えＣＹＰ２Ｅ１が生産されたことが示唆される。
【０２１２】
更に、ｐＣＷ／ompＡ-ＣＹＰ２Ｅ１からの発現により、菌細胞全体において典型的な還元Ｆｅ-ＣＯ差スペクトルがつくられた（図１６）。但し、この例では、約４２０ｎｍでの吸収極大は他のＰ４５０-発現作成物のものよりもむしろより明白であった。ｐＣＷ/ompＡ-ＣＹＰ２Ｅ１を担持する大腸菌全体におけるスペクトル的に活性なＣＹＰ２Ｅ１の収量は４５１nmol／l培養と推定され、これは類似のompＡ-作成物から細胞全体において生産されるＣＹＰ３Ａ４及びＣＹＰ２Ｄ６のレベルとほぼ同じである。
【０２１３】
３．議論
この実施例は、例えばpelＢ及びompＡのような細菌リーダー配列にＰ４５０類並びにＰ４５０レダクターゼを融合させることにより、大腸菌において非常に機能性のモノオキシゲナーゼ系をつくることができることを証明している。このことは、pelＢリーダー配列への天然Ｐ４５０レダクターゼの融合及びベクターｐＣＷからのこの作成物の発現の後に得られるほぼ十倍増加する機能性Ｐ４５０レダクターゼレベルにより明白に例証される（図１）。Ｐ４５０類とＰ４５０-レダクターゼの同時発現に対して我々が用いたベクターｐＡＣＹＣ１８４からのpelＢ-レダクターゼの発現により、ヒト肝臓ミクロソームにおいて見出されたものと同様の大腸菌膜におけるＰ４５０-レダクターゼレベルを産生した（１００pmolＰ４５０-レダクターゼ／mgタンパク）。我々のアプローチ法の利用性は、pelＢ-Ｐ４５０レダクターゼを、大腸菌において達成されるレベルと同様のレベルでネズミチフス菌においても発現させることができるので（データは示さず）、大腸菌におけるＰ４５０-レダクターゼの発現にのみ限られるものではない。
【０２１４】
更に、細菌リーダー配列に融合したＰ４５０類は、最適なＰ４５０発現に対して必須であると過去には考えられていた（非特許文献１４; 非特許文献１３; Larsonほか (1991) J. Biol. Chem. 266, 7321-7324）Ｐ４５０Ｎ末端の広範な修飾に依存しないで大腸菌において効率的に発現させることができることを我々は証明した。我々の遺伝子融合アプローチは、ＣＹＰ３Ａ４，ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ａ６及びＣＹＰ２Ｅ１（図５、８及び１５）を全てこの戦略を用いて大腸菌において発現できることを我々は示すことができたので、異なる遺伝子ファミリーに属するＰ４５０類に対しても適用可能である。我々は最近このアプローチをＣＹＰ２Ｃ９とＣＹＰ２Ｄ９にも拡張した。
【０２１５】
以前はＣＹＰ３Ａ４とＣＹＰ２Ｄ６のｃＤＮＡは、二次構造を形成する可能性を持つ領域を除去するためにその５'末端を修飾した後に大腸菌において発現されていた（Gonzalezほか (1995) Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 35, 369-390）。これらの修飾はＣＹＰ３Ａ４とＣＹＰ２Ｄ６のＮ末端領域の広範な変化になって現れた（以下これらの修飾タンパク質をそれぞれ１７α-ＣＹＰ３Ａ４及び１７α-ＣＹＰ２Ｄ６と称す）。Ｐ４５０の収量に関しては、ベクターｐＣＷから発現されたompＡ-ＣＹＰ３Ａ４及びompＡ-ＣＹＰ２Ｄ６の収量は１７α-ＣＹＰ３Ａ４及び１７α-ＣＹＰ２Ｄ６に対する刊行値よりも少なくとも１．７及び４．８の係数だけそれぞれ高いので、Ｐ４５０の収量に関し少なくとも我々が試みたＰ４５０類に対しては、我々の遺伝子融合戦略はこのアプローチより優れている（図１２）。我々は、刊行された手順（非特許文献１３; Gillamほか (1995) Arch. Biochem. Biophys. 319, 540-550）に従って我々の研究所において産生された作成物から１７α-ＣＹＰ３Ａ４と１７α-ＣＹＰ２Ｄ６の発現を繰り返すことにより、この観察を補強した。我々はヒスチジン残基の伸展を含むＣ末端伸展を有するpelＢ-ＣＹＰ３Ａ４及びompＡ-ＣＹＰ３Ａ４を発現した。我々はニッケルアガロースアフィニティクロマトグラフィーを使用する構造解析のためにこれらのタンパク質のｍｇ量を精製することができた。
【０２１６】
我々はompＡリーダー融合戦略を拡張して、２つの更なるヒトチトクロムＰ４５０、すなわちＣＹＰ２Ａ６及びＣＹＰ２Ｅ１の発現を可能にした。ＣＹＰ２Ｅ１に対しては、４５１nmol／l培養という我々の発現レベル（図１６）は、通常の配列最適化法を使用して、大腸菌におけるこの酵素の過去に発表された発現レベル（４０nmol/l, 非特許文献２６）よりも一桁大きい。我々の知る限りでは、大腸菌におけるＣＹＰ２Ａ６の発現はこれまで全く報告されていない。従って、我々は我々の系の単純性と多用途性を証明することができた。
【０２１７】
最も重要なことは、遺伝子融合アプローチを、大腸菌における非常に機能性のヒトＰ４５０モノオキシゲナーゼ系を産生するために使用することができることを示したことである。このことは、ompＡ-ＣＹＰ２Ｄ６とpelＢ-Ｐ４５０レダクターゼを同時発現する未処理の大腸菌に観察される高いブフラロール１'-水酸化酵素活性により明白に証明される。この活性（１．２nmol／min／mgタンパク）はヒト肝臓ミクロソームのパネルに対して報告された平均のブフラロール水酸化酵素活性よりも約２０倍高い。また、この大腸菌株から単離された細菌膜は同様の高いＰ４５０酵素活性を示す。ompＡ-ＣＹＰ２Ｄ６はヒト肝臓ミクロソームに対して計算された値（１min-1）よりも、また最適化された細胞遊離系において再構成されたＣＹＰ２Ｄ６について報告されたデータよりも高い基質代謝回転数（４．６min-1）を示す。この結果は、ompＡ-ＣＹＰ２Ｄ６とpelＢ-Ｐ４５０レダクターゼが大腸菌において非常に効率よくカップリングすることを明らかに証明しており、両方のタンパク質が、再構築系において用いられる複合リン脂質組成物と少なくとも同じほど最適であるリン脂質環境において細菌膜の同じ側に位置していることを示唆している。
【０２１８】
ompＡ-ＣＹＰ２Ｄ６及びpelＢ-レダクターゼを発現する大腸菌は、外因的に加えられるＮＡＤＰＨの不存在下でＰ４５０酵素活性を示したので、等価物を還元するソースとして内因性ＮＡＤＰＨを使用することに留意することは重要である。この知見は、レダクターゼ活性部位が、ＮＡＤＰＨの細胞内プールを用いることができる内膜の細胞質側に位置していることを示唆している。この性質は、組換えタンパク質の高収量と技術的に簡単な維持と組み合わせて、系をバイオリアクター用に理想的に適したものとする。しかしながら、我々は、本研究において使用された緩衝液中よりも培養ブロス中に維持したときは、Ｐ４５０基質は、Ｐ４５０類とＰ４５０レダクターゼを同時発現する大腸菌により不充分に代謝されることを観察した。これは、前者の条件下では、基質が菌細胞壁と膜を浸透することができなかったことを示しているのかもしれない。従って、我々は我々の戦略を更に進め、ネズミチフス菌株のＴＡ系列おいて機能性Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ系を発現させた。これらの菌株は、浸透性細胞壁が生じる深部ラフ型変異を含むので、発ガン性試験に頻繁に用いられており、大きなパネルの構造的に雑多な化合物により貫通され得る（Amesほか (1975) Mutat. Res. 31, 347-364; Shimadaほか (1993) Carcinogenesis 14, 1371-1376）。我々は、我々の遺伝子融合戦略を使用して機能性Ｐ４５０-モノオキシゲナーゼ系をネズミチフス菌において産生することができることを示すことができた。
【０２１９】
大腸菌におけるＰ４５０とＰ４５０−レダクターゼ発現レベルは他のベクター又は他の細菌宿主を使用して更に増大させることができる。例えば、我々は、細菌的に発現されたompＡ-ＣＹＰ２Ｄ６のあるものは不適当に折畳まれ、封入体を形成したかもしれないことを観察した。最近、分子シャペロンとチオレドキシンを発現する大腸菌株が入手できるようになった（Yasukawaほか (1995) J. Biol. Chem. 270, 25328-25331）。新たに合成されたタンパク質の間違った折畳みを防止するこれらのタンパク質を発現させると、幾つかの組換えタンパク質に対して更に高い収量が得られるようになる。これらの菌株はまたｐＣＷよりもより強い細菌プロモーターを含む発現ベクターからＰ４５０類を発現させるために用いることもできる。例えば、我々は、ｐＥＴ系列のベクターにおいて強力なＴ７ポリメラーゼプロモーターの調節下で高レベルの組換えＣＹＰ３Ａ４を大腸菌において発現できることを観察した。しかしながら、組換えＣＹＰ３Ａ４のほんの僅かな画分だけがスペクトル的に活性であった。更に、Ｐ４５０類のＰ４５０-レダクターゼとのカップリングが、Ｐ４５０とＰ４５０レダクターゼを含む再構築系においてＰ４５０酵素活性を刺激することが最近示されたＰ４５０-レダクターゼＦＭＮドメインの同時発現により更に改良することができると思料される。
【０２２０】
要約すると、我々は、Ｐ４５０類の効率的な細菌発現に対する一般的なアプローチ法を開発し、このアプローチ法を非常に高い機能性のＰ４５０依存性モノオキシゲナーゼ系を含む細菌を産生するために使用することができることを証明した。これらのモデルは薬物開発及び生体触媒反応において重要な商業的用途を有している。
【０２２１】
＜実施例３＞
【０２２２】
ネズミチフス菌における発現
例えばＴＡ１５３８とＴＡ１５３５のようなある種のネズミチフス菌株におけるＰ４５０とＰ４５０類の同時発現は上述の大腸菌系から即座に適応化される。双方の種において同じベクター系を用いることができる。ベクターは、Ｐ４５０発現に使用される大腸菌株（例えばＪＭ１０９又はＤＨ５α）から大腸菌株ＬＡ５０００を通って、またそこからネズミチフス菌株まで先ず通過する。しかし、変異原生試験において頻繁に使用されるネズミチフス菌株ＴＡ９８とＴＡ１００におけるＰ４５０類の発現には、戦略は僅かに修正されなければならない。ＴＡ９８とＴＡ１００は、これらの菌株においてＳＯＳ修復を増大させ、同時に変異誘発物質に対する感受性を増大させるプラスミドｐＫＭ１０１を担持する。しかし、このプラスミドはまたアンピシリナーゼをコード化する。これらの菌株における発現プラスミドｐＣＷからのＰ４５０類の発現には、ｐＣＷ上のアンピシリナーゼマーカーをテトラサイクリン耐性マーカーと置換しなければならない。ネズミチフス菌におけるＰ４５０発現の他の育成条件及び誘導は大腸菌系と同様である。しかし、Ｐ４５０誘導期の間は育成培地からテトラサイクリンを省くことが望ましいことを我々は見出した。
【０２２３】
＜実施例４＞
外膜浸透性を変更した場合の大腸菌とネズミチフス菌株におけるＣＹＰ３Ａ４とＰ４５０レダクターゼの発現
【０２２４】
１．材料と方法
細菌株とプラスミド
用いた大腸菌Ｋ-１２株はＪＭ１０９（Yanisch ほか (1989) Gene 33, 103-19）、ＡＢ１１５７（Howard-Flandersほか (1964) Genetics 49, 237-246）及びＮＳ３８７８（ChaterjeeとSternberg (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92, 8950-8954）であった。ネズミチフス菌株はＴＡ１５３５であった（Ames (1975) Mutat. Res. 31, 347-352）。ＮＳ３６７８は株ＡＢ１１５７tolＣ(λＬＰ１)であり、tolＣ突然変異はＴｎl０tetｒ挿入による。ＴolＣ-変異体は疎水性薬剤に極めて敏感であり（Whitney (1970) Genetics 30, 39-59）、このタンパク質は外膜におけるリポ多糖の構築においてある役割を担うと提案されている（Schnaitmannと Klena (1993) Microbiol. Rev 57, 655,682）。ネズミチフス菌株ＴＡ１５３５はrfa突然変異を担持し、欠陥のある外膜を有している。ＣＹＰ３Ａ４とＰ４５０レダクターゼの同時発現は以前の例において記載されているプラスミドｐＢ２１６を使用して達成された。
【０２２５】
ＣＹＰ３Ａ４とＰ４５０レダクターゼの同時発現
発現に用いたプロトコールは、ＮＳ３６７８[ｐＢ２１６]に対してテトラサイクリン（１０μg/l）が画線プレートと一晩のＬＢ培養に含まれ、テリフィックブロスには含まれなかったことを除いて先に記載したものと同じであった。ＣＹＰ３Ａ４量はＦｅ２＋-ＣＯ対Ｆｅ２＋差スペクトルを使用して細菌細胞全体において決定した。
【０２２６】
ＣＹＰ３Ａ４基質での未処理細胞のインキュベーション
通常の２０−２４時間の誘導後、遠心分離により収集する前に細胞を氷上で１０分間冷却した。ついで、１／１０容量のＭ９＋グルコース（１０ｍＭ）中に再懸濁する前に等しい容量の氷冷１ｘＭ９塩溶液で細胞を一度洗浄した。細胞に激しいピペッティングを被らせないように留意した。ＣＹＰ３Ａ４基質でのインキュベーションに必要になるまで、細胞懸濁液を氷上に貯蔵し、５００μｌを除去し、４．５ｍｌのＭ９＋グルコースを含む５０ｍｌのポリプロピレン管に加えた。２００μＭの最終濃度でテストステロン又はニフェジピンの何れかを添加して反応を開始させる前に３７℃で軌道振盪機において５−１０分間管をプレインキュベートした。必要に応じて、２００μｌの細胞懸濁液を除去し、１００μｌのメタノールと５μｌの６０％過塩素酸を含む１．５ｍｌのエッペンドルフマイクロ遠心管に移した。この管を逆にして混合し、遠心分離して沈殿物を除去する前に１０分間氷上に保管した。上清をＨＰＬＣ分析のためにマイクロバイアルに移した。先に記載されているようにして代謝物を分離し、既知の標準物質を参照して６β-ＯＨＴ又はニフェジピンオキシドの収量を計算した。
【０２２７】
２．結果
４種の菌株におけるＣＹＰ３Ａ４とＰ４５０レダクターゼの発現
Ｐ４５０発現とＰ４５０レダクターゼ活性のレベルを表Ａに示す。ＮＳ３６７８[ｐＢ２１６]細胞におけるＣＹＰ３Ａ４量は、他の３つの菌株におけるよりも有意に低く、典型的には約３０nmol／lである。この理由は不明であり、この菌株における発現には更なる最適化が必要となる。
【０２２８】
表Ａ：未処理のＪＭ１０９、ＡＢ１１５７、ＮＳ３６７８及びＴＡ１５３５ｐＢ２１６細胞によるテストステロン及びニフェジピンにおけるＣＹＰ３Ａ４の発現レベルとそのＣＹＰ３Ａ４-依存性代謝
【０２２９】
【表３】
【０２３０】
Ｐ４５０量はＦｅ２＋-ＣＯ対Ｆｅ２＋差スペクトルにより測定した。含量は少なくとも３回の実験の平均±ＳＤとして表す。
【０２３１】
代謝回転数はnmol生成物／min／nmolP450として記録し、±ＳＤとして示す。検出された生成物は６βヒドロキシテストステロンとニフェジピンオキシドであった。
【０２３２】
ＣＹＰ３Ａ４及びＰ４５０レダクターゼを発現する未処理大腸菌及びネズミチフス菌によるテストステロン及びニフェジピンの代謝
【０２３３】
４つの菌株によるテストステロンとニフェジピンの代謝回転を表Ａに示す。ＪＭ１０９[ｐＢ２１６]を用いる過去の研究から、細胞がＥＤＴＡを含む緩衝液（ＴＳＥ）中に懸濁されて浸透圧ショックを受けないならばテストステロンの代謝は無視できることが示されている。このことはここで確認され、１０分のインキュベーション後の代謝回転は０．１５nmol６β-ＯＨＴ／nmolP450／分だけであった。これに対して、他の２つの大腸菌株におけるテストステロン代謝は更により広範であり、ＮＳ３６７８[ｐＢ２１６]はＪＭ１０９[ｐＢ２１６]よりも１００倍高い１５．３の代謝回転を持ち特に印象的である。ネズミチフス菌株ＴＡ１５３５[ｐＢ２１６]もまたテストステロンに対してＪＭ１０９[ｐＢ２１６]よりも強い活性を示したが、３−４倍に過ぎなかった。ニフェジピンに対する代謝回転は、株内差異がテストステロンの場合ほど顕著ではないが、同様なパターンに従った。大腸菌株ＮＳ３６７８［ｐＢ２１６］とＡＢ１１５７[ｐＢ２１６]もまた約１８nmolニフェジピンオキシド／nmolＰ４５０／分で最も高い活性を示し、ＴＡ１５３５[ｐＢ２１６]とＪＭ１０９[ｐＢ２１６]に対する代謝回転はそれぞれ約３及び１５倍低かった。
２つの基質ニフェジピンとテストステロンでの時間経過インキュベーションの結果を図１７と図１８にそれぞれ示す。２つの最も広範に代謝する菌株ＡＢ１１５７とＮＳ３６７８では、代謝物の蓄積は１−２時間継続し、２０−３０％の収量を表す３０−４０μＭの範囲の代謝物最終濃度になった。およそ１時間のインキュベーションの後の線形性の喪失はＣＹＰ３Ａ４の喪失又は代謝物の阻害によるものであろう。
【０２３４】
３．議論
先の実施例に記載した研究は、常套的に発現に用いられている大腸菌株であるＪＭ１０９は、細胞をＴＳＥ緩衝液中で浸透圧ショックを受けさせないなら、ＣＹＰ３Ａ４とレダクターゼを同時発現するとき、テストステロンの水酸化を触媒することができなかったことを示している。この代謝の欠如はほぼ間違いなく大きな疎水性分子に対する大腸菌外膜の不浸透性のためであり（NikaidoとVaara (1985) Microbiol. Rev 49, 1-32）、バイオリアクター系における多量のある種のＰ４５０代謝物の産生にはこの菌株は適さない。外膜浸透性は必ずしも全てのＰ４５０基質にとっての問題ではないと思われ、例えば我々は、ＣＹＰ１Ａ２とＰ４５０レダクターゼを発現する未処理のＪＭ１０９における７-エトキシレゾルフィンの代謝回転は浸透圧的にショックを受けた細胞のものに匹敵することを見出した（データは示さず）。突然変異体tolＣ遺伝子を担持するＮＳ３６７８のような大腸菌株は疎水性薬剤に対して過敏であることが知られ、Ｐ４５０基質に対する浸透性もまた増加することが予想された。ＪＭ１０９[ｐＢ２１６]に対してＮＳ３６７８[ｐＢ２１６]によるテストステロンとニフェジピンの極めて高い代謝回転に基づくと、この通りであると思われる。現在のところ、菌株ＮＳ３６７８におけるＰ４５０発現レベルは比較的低い。これは、成長条件を最適化することにより改善することができるものと思われる。しかしながら、親株ＡＢ１１５７[ｐＢ２１６]における発現レベルはＪＭ１０９[ｐＢ２１６]のものに匹敵し、基質代謝回転がかなりより高いという利点がある。これは、部分的に欠陥のある外膜をもたらすこの菌株によりなされるrfbＤ１変異によると思われる。我々の研究は、大腸菌の「浸透性」株における機能性Ｐ４５０モノオキシゲナーゼの発現の最初の例である。ここに記載した系は全てのＰ４５０類の発現に対して適用することができ、「バイオリアクター」系における広範囲のＰ４５０代謝物の生産を容易にする。
【０２３５】
４．まとめ
Ｐ４５０レダクターゼと共にＰ４５０類を同時発現した大腸菌ＪＭ１０９又はＤＨ５αは、膜の浸透性を変更する緩衝液（ＴＳＥ）での処理の後にのみ基質を代謝した。我々は今これらの酵素を浸透性細胞壁を持つネズミチフス菌ＴＡ１５３５及び大腸菌株において発現させた。生理的ブロス（最少培地＋グルコース）の存在下で、基質の代謝はＴＳＥ緩衝液に再懸濁された細胞を用いて見出されたものに近づく代謝回転速度で６０分を越えて線形であることを示すことができた。
【０２３６】
＜実施例５＞
レダクターゼとのompＡ-及びompＡ(+2)-Ｐ４５０類の同時発現
【０２３７】
１．材料と方法
プラスミド
２つのＰ４５０発現プラスミド、ｐＣＷ／ompＡ(+2)-ＣＹＰ３Ａ４とｐＣＷ／ompＡ(+2)-ＣＹＰ２Ａ６を作成した。それぞれの場合、ＯmpＡシグナルペプチドとＰ４５０Ｎ末端の間に、成熟ＯmpＡタンパクの最初の２つのアミノ酸に対応するジペプチド「リンカー」(-Ａla-Ｐro-)を挿入するためにＰＣＲ法を用いた。Ｎ末端配列解析のためのアフィニティクロマトグラフィーによる組換えＣＹＰ３Ａ４の容易な精製を可能にするために（以下を参照）、２つの更なるプラスミド、ｐＣＷ／ompＡ-ＣＹＰ３Ａ４(Ｈis)６及びｐＣＷ／ompＡ(+2)-ＣＹＰ３Ａ４(his)６をまた作成した。ここで、６つのヒスチジン残基がＰ４５０のＣ末端に添付された。
【０２３８】
２．同時発現方法
別個の適合性があるプラスミドからのＰ４５０とレダクターゼの同時発現に対する基本的な方法はこれまでの実施例に既に記載している。
【０２３９】
クマリン７-水酸化酵素アッセイ
５００μｌの全容量中に２０pmolのＣＹＰ２Ａ６、５０μＭのクマリン、及びＮＡＤＰＨ産生系（先に実施例１に記載）を含む１００ｍＭのトリス-ＨＣｌ（ｐＨ７．４）において膜アッセイを実施した。菌細胞についてのアッセイは、５ｍｌの全容積のＴＳＥ緩衝液中で行い、１mlインキュベーション当り５０pmolのＣＹＰ２Ａ６と５０μＭのクマリンを含んでいた。試料（５００μｌ）を時折取り出し、代謝物生成につき分析した。細胞と膜のアッセイからの試料の処理は同じであった：反応は７２μｌの１２．５％トリクロロ酢酸の添加により停止させ、氷上に配した。ついでジクロロメタン（１ｍｌ）を添加し、管を激しくボルテックスした。ついで２つの相に分離する遠心分離に続いて、上（水性）層を破棄した。下の有機相の一定分量（５００μｌ）をついで３ｍｌの３０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）を含む新しい管に移した。ついで管をボルテックスし、もう一度遠心分離した。ついで上（水性）相中の代謝物を、信頼性のある標準物質（ウンベリフェロン、シグマ）を参照して、それぞれ３５８及び４５８ｎｍの励起及び放射波長を用いて、蛍光定量的に定量した。
【０２４０】
組換えＰ４５０の精製とＮ末端配列分析
ｐＣＷ／ompＡ-ＣＹＰ３Ａ４(Ｈis)６及びｐＣＷ／ompＡ(+2)-ＣＹＰ３Ａ４(his)６の発現を先に記載されたようにして実施した。細胞のリゾチーム処理と遠心分離に続いて、スフェロプラストを結合緩衝液（５００ｍＭの塩化カリウムと２０％のグリセロール(v/v)を含む２０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．４）に再懸濁し、−７０℃で貯蔵した。１２５ｍｌの培養から採られたスフェロプラストは典型的には９ｍｌの緩衝液中に再懸濁された。Ｐ４５０の精製では、スフェロプラストを氷上で融解し、７０％の出力でＭＳＥ SoniPrep１５０超音波処理器を使用して、プロテアーゼインヒビター、アプロチニン（１μg/ml）、ロイペプチン（１μg/ml）及びＰＭＳＦ（１ｍＭ）の存在下で超音波処理した。遠心分離（１．２ｘ１０４ｇ、１２分、４℃）後、上清タンパクをEmulgen９１１（１mg/mgタンパク）の存在下で４℃で６０分間攪拌して溶解させた。混合物を遠心分離（１０５ｇ、６０分、４℃）により清澄化し、ついでニッケルイオンが充填され０．１０％のEmulgen９１１(w/v)を含む結合緩衝液で予備平衡化されたＨｉ-Ｔｒａｐキレートカラム（ファーマシア）上に配置した。カラムを更に１０カラム容量の結合緩衝液（Emulgen911を含む）で洗浄し、ついで弱く結合したタンパク質を５カラム容量の洗浄緩衝液（０．１０％のEmulgen911(w/v)と７５ｍMのイミダゾールを含む結合緩衝液）で除去した。赤色のＰ４５０バンドを溶出緩衝液（０．１０％のEmulgen911(w/v)と１Ｍのイミダゾールを含む結合緩衝液）で溶出させた。−イミダゾール濃度を高く保ち、Ｐ４５０をできるだけ少ない容量に溶出させた。タンパク質の試料はアニオン交換緩衝液（２０％のグリセロール(v/v)、０．２ｍＭのジチオスレイトール、１ｍＭのＥＤＴＡ及び０．１０％のEmulgen９１１(w/v)を含む２０ｍＭのトリス-Ｃｌ、ｐＨ７．５）を数回交換して４℃で一晩かけて透析し、Ｈｉ-ＴｒａｐＱカラム（ファーマシア）上に配した。Ｐ４５０を含む流通画分を、２０％のグリセロール(v/v)、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ及び０．０５％のナトリウムキレート(w/v)を含む１０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４で平衡化したEcono-Pac(登録商標)ＨＴＰカートリッジ（バイオラッド）上に配した。リン酸ナトリウムの濃度をカラム洗浄の間２５ｍＭまで、ついで１００ｍＭまで増加させ、Ｐ４５０を４００ｍＭのリン酸塩で溶出させた。手順の各段階におけるＰ４５０調製物の純度はＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により、クーマシーブリリアントブルーＲ-２５０で染色した９％のアクリルアミド(w/v)ゲル上で評価した。Ｎ末端配列決定精製タンパクはついでＰｒｏ-Ｂｌｏｔポリビニリデンフロリド膜（アプライドバイオシステム）上に移され、染色された。Ｎ末端アミノ酸配列解析を、４ないし６サイクルのエドマン分解でモデル４７６Ａ機器（アプライドバイオシステム）を用いてダンディー大学の生化学学部において実施した。
【０２４１】
３．結果
レダクターゼとのompＡ-Ｐ４５０類の同時発現
先に報告されているように、ｐＣＷ／ompＡ-ＣＹＰ２Ｄ６から発現されたＰ４５０は同時発現されたレダクターゼとよくカップリングし典型的なＣＹＰ２Ｄ６-依存性活性を触媒する（実施例２を参照）。ompＡ-ＣＹＰ２Ｄ６に対して測定された代謝回転は、一般に、対応するｐＣＷ／１７α-ＣＹＰ２Ｄ６作成物から測定されたものよりも僅かに高かった（データは示さず）。
【０２４２】
我々はそれ以来、ＣＹＰ３Ａ４及びＣＹＰ２Ａ６を含む大腸菌においてレダクターゼと共に多くの他のompＡ-Ｐ４５０類を同時発現させた。ＣＹＰ２Ｄ６に対して、これらの２つのompＡ-Ｐ４５０類は、プローブ基質に対する酵素活性が一般により低いので対応する１７α-Ｐ４５０類と同じほどレダクターゼと効率的にはカップリングしないようである。例えば、細胞と膜の双方におけるクマリン７-水酸化酵素活性は、１７α-ＣＹＰ２Ａ６と比較してompＡ-ＣＹＰ２Ａ６では一桁以上低い（表Ｂ）。同様に、ＣＹＰ３Ａ４に対しては、膜画分におけるテストステロン６β-水酸化酵素活性はompＡ-作成物では減少する（表Ｃ）。しかし、２つの作成物の間のこの差異は、我々が用いた異なるプローブ基質であるニフェジピンではみられないことは興味深い（表Ｃ）。このことは可能な場合はどこででも数種のマーカー活性を用いる必要性を強調する。
【０２４３】
表Ｂ：２つのプラスミド系におけるレダクターゼと同時発現されたＣＹＰ２Ａ６の収量と活性
【０２４４】
【表４】
【０２４５】
可能な場合は、値は、少なくとも３回の独立した測定に基づき、平均±ＳＤとして表した。チトクロムＰ４５０は、２０％(v/v)グリセロール、１０ｍＭのＣＨＡＰＳ及び１ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭのトリス-ＨＣｌ、ｐＨ７．４中でのＦｅ２＋-ＣＯ対Ｆｅ２＋差分光法により定量化した。
【０２４６】
＊ＣＹＰ２Ａ６に対するプローブ活性は蛍光定量的に測定した。
【０２４７】
レダクターゼとのompＡ-Ｐ４５０類のカップリングが相対的に欠けることに対する説明を見つけるために、６のヒスチジン残基をｐＣＷ／ompＡ-ＣＹＰ３Ａ４から発現されたＰ４５０のＣ末端に添付した。これにより、ニッケルキレートアフィニティクロマトグラフィー（材料と方法において記載）による組換えタンパク質の精製が容易になった。これは、ompＡ-Ｐ４５０が細菌シグナルペプチダーゼによる予期されたプロセシング（そこではシグナルペプチドが保持される）を受けていなかったことを明らかにした。これは、シグナルペプチダーゼの利用性が、特に低いプロセシング効率を持つハイブリッド前駆物質に対しては限られていることが知られているので、Ｐ４５０の過剰発現の一般的レベルを反映する（van Dijlほか (1991) Mol. Gen. Genet. 227, 40-48）。
【０２４８】
シグナルペプチダーゼ活性に強く影響を与える他の因子は、シグナルペプチドの後の最初の数個のアミノ酸を含む（Barkocy-GallagherとBassford (1992) J. Biol. Chem. 267, 1231-1238; Nilssonとvon Heijne (1992) FEBS Lett. 299, 243-246）、シグナル切断の部位の周りの構造である（DuffaudとInoyue (1988) J. Biol. Chem. 263, 10224-10228; Barkocy-Gallagherほか (1994) J. Biol. Chem. 269, 13609-13613）。非切断シグナルペプチドを持つタンパク質の過剰発現は、細胞の転位置装置を完全にブロックすることができ、タンパク前駆物質の蓄積に至る（Barkocy-GallagherとBassford (1992) J. Biol. Chem. 267, 1231-1238）。我々の作成物では、シグナルペプチドに直ぐに続く配列はＣＹＰ３Ａ４のＮ末端である。切断部位に対して＋１の位置にあるアミノ酸は従ってメチオニンであり、一方細菌遺伝子中のこの位置にはアラニンが強く望まれる（von Heijne (1986) Nucl. Acids Res. 14, 4683-4690）。
【０２４９】
従って、我々はシグナルペプチドの除去の確率を改善するために３つの可能な戦略を考えることができる。第１に、細菌シグナルペプチダーゼを別個の適合性があるプラスミドから過剰発現させるもので、その幾つかのものは開示されている（van Dijlほか (1991) Mol. Gen. Genet. 227, 40-48; DalbeyとWickner (1985) J. Biol. Chem. 260, 15925-15931; MarchとInoue (1985) J. Biol. Chem. 260, 7206-7213）。この最初のアプローチに対する代替方法として、あるいは恐らくそれと共に、短いＮ末端伸展を持つＰ４５０を生産するという不具合があるかも知れないけれども、シグナルペプチドとＰ４５０の間に短い「リンカー」配列を導入することが推奨される。最後に、異なった細菌株において発現を試みることも、ハイブリッド融合タンパクからのシグナルペプチドの除去度合いに影響を及ぼすことが示されているので、試みることができる（Monteilhetほか (1993) Gene 125, 223-228）。
【０２５０】
シグナル保持のこの問題を解決するために、我々は、ＯmpＡリーダーとＰ４５０のＮ末端との間に成熟ＯmpＡタンパクの最初の２つのアミノ酸（-Ala-Pro-）を導入することにより切断部位を修飾することに決めた。その結果、ｐＣＷ／ompＡ(+2)+ＣＹＰ２Ａ６とｐＣＷ／ompＡ(+2)-ＣＹＰ３Ａ４（上述）の作成物が得られた。ompＡ-Ｐ４５０類に対して、これらのompＡ(+2)-Ｐ４５０類は同時発現されるレダクターゼとより効率的にカップリングし、より高い基質代謝回転をもたらすようである（表Ｂ及びＣ）。ｐＣＷ／ompＡ(+2)-ＣＹＰ３Ａ４(Ｈis)６から発現される組換えタンパク質をついで精製し、Ｎ末端配列分析を行う。これにより、細菌シグナルペプチダーゼによりタンパク質が正しくプロセシングを受け、Ｎ末端にアラニン-プロリン−を含む天然ＣＹＰ３Ａ４の細菌膜に蓄積されるようになることが明らかになった。
【０２５１】
表Ｃ：２つのプラスミド系におけるレダクターゼとの同時発現ＣＹＰ３Ａ４の収量と活性
【０２５２】
【表５】
【０２５３】
可能な場合は、値は、少なくとも３回の独立した測定に基づき、平均±ＳＤとして表した。
チトクロムＰ４５０は、２０％(v/v)グリセロール、１０ｍＭのＣＨＡＰＳ及び１ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭのトリス-ＨＣｌ、ｐＨ７．４中でのＦｅ２＋-ＣＯ対Ｆｅ２＋差分光法により定量化した。
【０２５４】
＊ 細菌膜画分において測定
§レダクターゼ活性の１単位は毎分当たりに還元されたチトクロムｃの１nmolとして定義される。
†２つの既知のＣＹＰ３Ａ４基質の代謝は３０ｍＭのＭｇＣｌ２の存在下で膜画分において評価された。
活性はｎｍｏｌＣＹＰ３Ａ４当り毎分当りに形成されたｎｍｏｌの代謝回転として表した。
【０２５５】
４．まとめ
Ｐ４５０類に対するｏｍｐＡリーダー配列の直接の融合は、同時発現されたレダクターゼとカップリングするＰ４５０アイソザイムには必ずしもならない。Ｐ４５０配列に融合したｏｍｐＡ配列の潜在的な切断部位のアミノ酸残基を変更すると、カップリングとリーダー配列の効果的な除去がもたらされる。
【図面の簡単な説明】
【０２５６】
【図１】ｐＢ２１６の作成 プラスミドＮＦ１４は、ＳａｌＩとＢｇｌＩＩ末端を持つｔｒｐＡターミネーターからなる徐冷オリゴヌクレオチド対により、存在する転写ターミネーターを置換することにより修飾した。この修飾により第２のＢｇｌＩＩ部位を除去し、残りのＢｇｌＩＩ部位で続くクローニングをなし、プラスミドｐＢ２１５を作成した。ＰｔａｃＰｔａｃプロモーターと共にｐｅｌＢレダクターゼを含むＢｃｌＩ−ＢｇｌＩＩ断片をｐＢ２０７からｐＢ２１５のＢｇｌＩＩ部位にサブクローニングし、同時発現プラスミドｐＢ２１６を作成した。ｐｅｌＢ−レダクターゼ挿入断片の配向は示されている通りであることが見出された。
【図２】大腸菌において発現されたレダクターゼとＣＹＰ３Ａ４を含む膜画分のウェスタンブロット １０μの各膜画分を各トラックに載せた。負荷の順序はブロットの上に沿って示されている。各発現サンプルはその非誘導対応物と並べて示されている。免疫検出はレダクターゼとＣＹＰ３Ａに対する抗体を用いて実施された。ヒトの肝臓ミクロソームのトラック（１０μｇのミクロソームタンパク質）を参照トラックとして含めた。
【図３】本研究に用いられる２つの発現ベクターの提示 プラスミドｐＣＷ（図３Ａ）は、ｃｏｌＥ１複製開始点とβ−ラクタマーゼ遺伝子を含み、アンピシリンやカルベニシリンのような抗生物質に対する耐性をもたらす。これはＰ４５０のｃＤＮＡの発現に使用した。プラスミドｐＡＣＹＣ１８４（図３Ｂ）はｐ１５Ａ複製開始点を含み、Ｐ４５０ｃＤＮＡをｐＣＷから同時に発現されているときに、Ｐ４５０レダクターゼのｃＤＮＡを発現するために使用した。ｐＡＣＹＣ１８４の選択に使用された抗生物質はクロラムフェニコールであった。独特の制限部位が強調文字で示されている。
【図４】細菌膜におけるＰ４５０レダクターゼの発現を示すウェスタンブロット タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロース膜上に移し、ウサギの抗レダクターゼ一次抗体と西洋わさびペルオキシダーゼ連結抗ウサギＩｇＧ二次抗体で探索した。検出は化学ルミネッセンスによった。タンパク質負荷はトラック当り１０μｇであった。非誘導及び誘導条件下での野生型Ｐ４５０レダクターゼのｃＤＮＡの発現はトラック１及び２にそれぞれ示す。細菌ｐｅｌＢリーダー−Ｐ４５０レダクターゼＮ末端融合タンパクの対応する発現はトラック３及び４に示す。ヒトの肝臓ミクロソームの試料を比較のためにトラック５に示す。レダクターゼ活性（ｍｇタンパク質当り分当りに還元されたチトクロムｃのｎｍｏｌ）は図の下に示す。
【図５】細菌膜におけるｐｅｌＢ−及びｏｍｐＡ−ＣＹ３Ａ４の発現を示すウェスタンブロット タンパク質を９％のアクリルアミドゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロース上に移し、ウサギの抗ＣＹＰ３Ａ一次抗体と西洋わさびペルオキシダーゼ連結抗ウサギＩｇＧ二次抗体で探索した。検出は化学ルミネッセンスによった。レーン２と３は、それぞれｐｅｌＢ−ＣＹＰ３Ａ４かｏｍｐＡ−ＣＹＰ３Ａ４の何れかを発現する細菌から単離した膜を含む（トラック当り２４μｇのタンパク質）。レーン１はヒトの肝臓ミクロソームの試料を比較のために含む（８μｇのタンパク質）。
【図６】ｐｅｌＢ−ＣＹＰ３Ａ４（図６Ａ）、ｏｍｐＡ−ＣＹＰ３Ａ４（図６Ｂ）を発現する細菌全体、あるいはこれらの細胞由来の膜から得られた還元Ｆｅ−ＣＯスペクトル 一定分量の細胞又は膜を１：２０で２０％のグリセロール、１０ｍＭのＣＨＡＰＳ及び１ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４中に希釈し、数結晶の亜ジチオン酸ナトリウムを添加して還元し、ついで一対の適合ガラスキュベット間に等しく分けた。５００から４００ｎｍの範囲に対するベースラインスペクトルの決定に続いて、試料キュベットを約１分間ＣＯで穏やかに泡立てた。ついで走査を繰り返し、９１ｍＭ−１ｃｍ−１の消衰係数を用いてＰ４５０量を推定した。
【図７】還元Ｆｅ−ＣＯ差スペクトル（上記参照）から推定した大腸菌における異なる作成物からのＣＹＰ３Ａ４の発現レベルのまとめ 結果を平均±ＳＤとして表した。尚、側定数は括弧で示す。標準化した条件（テリフィックブロス、３０℃、２４時間誘導）±０．５ｍＭδ−ＡＬＡ下で細胞を育成した。
【図８】細菌膜におけるｏｍｐＡ−ＣＹＰ２Ｄ６の発現を示すウェスタンブロット タンパク質を９％のアクリルアミドゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロース上に移し、ウサギ抗ＣＹＰ２Ｄ６及び抗レダクターゼ一次抗体の混合物で探索し、続いて西洋わさびペルオキシダーゼ連結抗ウサギＩｇＧ二次抗体で探索した。検出は化学ルミネッセンスによった。トラック１ないし４はそれぞれ２．５μｇの細菌膜タンパクを含む。トラック５は１０μｇのヒト肝臓ミクロソームを含み、トラック６はタンパク標準物質を含む。膜は、空の発現ベクター、ｐＣＷ（レーン１）、ｏｍｐＡ−２Ｄ６のみ（レーン２）、又はヘム前駆物質δアミノレブリン酸の不存在下（レーン３）又は存在下（レーン４）の何れかで培養したｏｍｐＡ−２Ｄ６プラスＰ４５０レダクターゼを担持する細胞から単離した。
【図９】ｏｍｐＡ−ＣＹＰ２Ｄ６のみ（図４Ａ）、Ｐ４５０レダクターゼと同時発現されたｏｍｐＡ−ＣＹＰ２Ｄ６（図４Ｂ）を発現する細菌全体、あるいはこれらの細胞由来の膜から得られた還元Ｆｅ−ＣＯスペクトル 一定分量の細胞又は膜を１：２０で２０％のグリセロール、１０ｍＭのＣＨＡＰＳ及び１ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４中に希釈し、数結晶の亜ジチオン酸ナトリウムを添加して還元し、ついで一対の適合ガラスキュベット間に等しく分けた。５００から４００ｎｍの間のベースラインスペクトルの決定に続いて、試料キュベットを約１分間ＣＯで穏やかに泡立てた。ついで走査を繰り返し、９１ｍＭ−１ｃｍ−１の消衰係数を用いてＰ４５０量を推定した。
【図１０】還元Ｆｅ−ＣＯ差スペクトル（上記参照）から推定した大腸菌において単独で発現されたとき又はＰ４５０レダクターゼと同時発現されたときのｏｍｐＡ−ＣＹＰ２Ｄ６の観測レベルのまとめ 結果を平均±ＳＤとして表した。尚、側定数は括弧で示す。標準化した条件（テリフィックブロス、３０℃、２４時間誘導）±０．５ｍＭδ−ＡＬＡ下で細胞を育成した。
【図１１】ｏｍｐＡ−ＣＹＰ２Ｄ６とＰ４５０レダクターゼを同時発現する細菌膜におけるブフラロールの１’−ヒドロキシル化に対して決定された動力学的パラメータ タンパク質と時間（図示せず）に関して比例した生成物の形成をもたらす条件でＮＡＤＰＨ産生系の存在下で基質の濃度を変えて（０−１００μＭ）３７℃で膜をインキュベートした。生成物形成の度合いを信頼のおける標準品を基準にして逆相ＨＰＬＣにより評価した。動力学的パラメータを基質濃度に対する初速度の二重逆数プロットから推定した。
【図１２】欠失と突然変異によるＰ４５０のＮ末端の修飾後に他のものにより得られた収量と比較した、遺伝子融合戦略を用いて大腸菌において達成されたＰ４５０の収量
【図１３】ompＡ-ＣＹＰ２Ａ６を発現する細菌全体、あるいはこれらの細胞由来の膜から得られた還元Ｆｅ-ＣＯスペクトル 一定分量の細胞又は膜を１：２０で２０％のグリセロール、１０ｍＭのＣＨＡＰＳ及び１ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭのトリス-ＨＣｌ、ｐＨ７．４中に希釈し、数結晶の亜ジチオン酸ナトリウムを添加して還元し、ついで一対の適合ガラスキュベット間に等しく分けた。５００から４００ｎｍの間のベースラインスペクトルの決定に続いて、試料キュベットを１分間ＣＯで穏やかに泡立てた。走査を繰り返し、９１ｍＭ−１ｃｍ−１の消衰係数を用いてＰ４５０量を推定した。
【図１４】還元Ｆｅ−ＣＯスペクトル（上記参照）から推定した、大腸菌において単独で発現されたときのｏｍｐＡ−ＣＹＰ２Ａ６の観測レベルのまとめ 結果を平均±ＳＤ、ｎ＝３として表した。尚、側定数は括弧で示す。δアミノレブリン酸（０．５ｍＭ）の存在下で標準化した条件（テリフィックブロス、３０℃、２４時間誘導）で細胞を育成した。
【図１５】細菌膜におけるｏｍｐＡ−ＣＹＰ２Ｅ１の発現を示すウェスタンブロット タンパク質を９％のアクリルアミドゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロース上に移し、ヒツジ抗ＣＹＰ２Ｅ１一次抗体と西洋わさびペルオキシダーゼ連結抗ヒツジＩｇＧ二次抗体で探索した。検出は化学ルミネッセンスによった。レーン２は空の発現プラスミド、ｐＣＷを送り出す対照細菌から単離された膜を、レーン３はｏｍｐＡ−ＣＹＰ２Ｅ１から単離された膜を含む（それぞれの場合トラック当り２４μｇのタンパク質）。レーン１は比較のためのヒト肝臓ミクロソームの試料（８μｇのタンパク質）を含む。
【図１６】ｏｍｐＡ−ＣＹＰ２Ｅ１を発現する細菌全体から得られた還元Ｆｅ−ＣＯスペクトル 一定分量の細胞を１：２０で２０％のグリセロール、１０ｍＭのＣＨＡＰＳ及び１ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４中に希釈し、数結晶の亜ジチオン酸ナトリウムを添加して還元し、ついで一対の適合ガラスキュベット間に等しく分けた。５００から４００ｎｍの間のベースラインスキャンの決定に続いて、試料を１分間ＣＯで穏やかに泡立てた。走査を繰り返し、９１ｍＭ−１ｃｍ−１の消衰係数を用いてＰ４５０量を推定した。 発現レベル：細胞全体で４５１ｎｍｏｌ／ｌ培養。
【図１７】未処理のＪＭ１０９、ＡＢ１１５７、ＮＳ３６７８及びＴＡ１５３５［ｐＢ２１６］細胞におけるＣＹＰ３Ａ４によるニフェジピンの代謝 グルコース（１０ｍＭ）を補充したＭ９塩において振盪（２００ｒｐｍ）しながら３７℃でインキュベーションを行った。０．５ｍｌの１０ｘ濃縮細胞を４．５ｍｌの緩衝液に加え、２００μＭの最終濃度までニフェジピンを添加するまで５−１０分間３７℃で前もって平衡化した。時々、２００μｌの分量を除去して、実施例４における材料と方法に記載されているようにＨＰＬＣ分析のために処理した。
【図１８】未処理のＪＭ１０９、ＡＢ１１５７、ＮＳ３６７８及びＴＡ１５３５［ｐＢ２１６］細胞におけるＣＹＰ３Ａ４によるテストステロンの代謝 グルコース（１０ｍＭ）を補充したＭ９塩において振盪（２００ｒｐｍ）しながら３７℃でインキュベーションを行った。０．５ｍｌの１０ｘ濃縮細胞を４．５ｍｌの緩衝液に加え、２００μＭの最終濃度までテストステロンを添加するまで５−１０分間３７℃で前もって平衡化した。時々、２００μｌの分量を除去して、実施例４における材料と方法に記載されているようにＨＰＬＣ分析のために処理した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能性チトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ系を含む菌細胞であって、該細胞がチトクロムＰ４５０を発現し得る遺伝子作成物と上記チトクロムＰ４５０とは別個にチトクロムＰ４５０レダクターゼを発現し得る遺伝子作成物を含み、チトクロムＰ４５０とチトクロムＰ４５０レダクターゼのそれぞれがそのＮ末端に細菌シグナルペプチドを有する菌細胞。
【請求項２】
上記細胞が腸内細菌科の菌細胞である、請求項１に記載の菌細胞。
【請求項３】
上記チトクロムＰ４５０はチトクロムＰ４５０のＣＹＰ１、ＣＹＰ２、ＣＹＰ３又はＣＹＰ４ファミリーの何れかのメンバーである、請求項１又は２に記載の菌細胞。
【請求項４】
上記チトクロムＰ４５０は、チトクロムＰ４５０のＣＹＰ１Ａ、ＣＹＰ１Ｂ、ＣＹＰ２Ａ、ＣＹＰ２Ｂ、ＣＹＰ２Ｃ、ＣＹＰ２Ｄ、ＣＹＰ２Ｅ、ＣＹＰ３Ａ、ＣＹＰ４Ａ又はＣＹＰ４Ｂ亜科の何れかである、請求項１ないし３の何れか１項に記載の菌細胞。
【請求項５】
チトクロムＰ４５０は、チトクロムＰ４５０のＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｄ９、ＣＹＰ２Ａ６及びＣＹＰ２Ｅ１の何れかである、請求項４に記載の菌細胞。
【請求項６】
チトクロムＰ４５０レダクターゼは、ヒトチトクロムＰ４５０レダクターゼである、請求項１ないし５の何れか１項に記載の菌細胞。
【請求項７】
細胞は大腸菌細胞又はネズミチフス菌細胞である、請求項２ないし６の何れか１項に記載の菌細胞。
【請求項８】
細菌シグナルペプチドは、ｏｍｐＡ、ｐｅｌＢ、ｍａｌＥ又はｐｈｏＡシグナルペプチド又はその機能的に等価な変異体の何れかである、請求項１に記載の菌細胞。
【請求項９】
チトクロムＰ４５０の細菌シグナルペプチドはチトクロムＰ４５０レダクターゼの細菌シグナルペプチドと同一である、請求項１ないし８の何れか１項に記載の菌細胞。
【請求項１０】
チトクロムＰ４５０又はチトクロムＰ４５０レダクターゼの正しい折畳みを助けるポリペプチド補助因子を発現し得る遺伝子作成物を更に含有する、請求項１ないし９の何れか１項に記載の菌細胞。
【請求項１１】
上記ポリペプチド補助因子は分子シャペロンである、請求項１０に記載の菌細胞。
【請求項１２】
チトクロムＰ４５０とチトクロムＰ４５０レダクターゼの間の電子の伝達を助けるポリペプチド補助因子を発現し得る遺伝子作成物を更に含有する、請求項１ないし１１の何れか１項に記載の菌細胞。
【請求項１３】
チトクロムＰ４５０とチトクロムＰ４５０レダクターゼの間の電子の伝達を助ける上記補助因子は、チトクロムｂ５又はチトクロムＰ４５０レダクターゼのＦＭＮ領域である、請求項１２に記載の菌細胞。
【請求項１４】
チトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ系により触媒される反応の生成物を代謝し得る任意の酵素を発現し得る遺伝子作成物を更に含有する、請求項１ないし１３の何れか１項に記載の菌細胞。
【請求項１５】
上記酵素は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、エポキシドヒドロラーゼ又はＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼの何れかである、請求項１４に記載の菌細胞。
【請求項１６】
チトクロムＰ４５０とチトクロムＰ４５０レダクターゼは異なる遺伝子作成物によりコード化されている、請求項１ないし１５の何れか１項に記載の菌細胞。
【請求項１７】
チトクロムＰ４５０とチトクロムＰ４５０レダクターゼは同じ遺伝子作成物によりコード化されている、請求項１ないし１５の何れか１項に記載の菌細胞。
【請求項１８】
上記細胞は、チトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ系の基質である化合物に対して浸透性である、請求項１ないし１７の何れか１項に記載の菌細胞。
【請求項１９】
チトクロムＰ４５０の基質を生成物に転換する方法であって、請求項１ないし１８の何れか１項に記載の菌細胞と上記基質を混合することを含み、上記細胞が上記基質を転換し得る機能性チトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ系を含む方法。
【請求項２０】
チトクロムＰ４５０の基質を生成物に転換するための、請求項１ないし１８の何れか１項に記載の菌細胞の使用。
【請求項２１】
チトクロムＰ４５０を含む菌細胞において、上記チトクロムＰ４５０をコード化し、かつ発現し得る遺伝子作成物を含有し、チトクロムＰ４５０がそのＮ末端に細菌シグナルペプチドを含む、菌細胞。
【請求項２２】
細菌シグナルペプチドは、ｏｍｐＡ、ｐｅｌＢ、ｍａｌＥ又はｐｈｏＡシグナルペプチド又はその機能的に等価な変異体の何れかである、請求項２１に記載の菌細胞。
【請求項２３】
チトクロムＰ４５０は、菌細胞からチトクロムＰ４５０の精製を助けるペプチド配列を更に含む、請求項２１又は２２に記載の菌細胞。
【請求項２４】
上記ペプチド配列は化合物に対する結合部位を含む、請求項２３に記載の菌細胞。
【請求項２５】
上記ペプチド配列が−（Ｈｉｓ）ｎ（ここで６≧ｎ≧４）で、上記化合物がニッケルである、請求項２４に記載の菌細胞。
【請求項２６】
上記細胞は腸内細菌科の菌細胞である、請求項２１ないし２５の何れか１項に記載の菌細胞。
【請求項２７】
上記チトクロムＰ４５０が請求項３ないし５の何れか１項に記載されたものである、請求項２１ないし２６の何れか１項に記載の菌細胞。
【請求項２８】
チトクロムＰ４５０を調製する方法であって、（ａ）請求項２１ないし２７の何れか１項に記載の細胞を充分な量提供する工程と、（ｂ）他の細胞区画からチトクロムＰ４５０を分離する工程を含んでなる方法。
【請求項２９】
チトクロムＰ４５０を発現し得る遺伝子作成物であって、チトクロムＰ４５０がそのＮ末端に細菌シグナルペプチドを含む遺伝子作成物。
【請求項３０】
請求項１に記載の複数の菌細胞であって、各細胞がチトクロムＰ４５０とチトクロムＰ４５０レダクターゼの異なる組合せ又は他のポリペプチドの更なる組合せをコード化する遺伝子作成物又は作成物群を含む菌細胞。
【請求項３１】
請求項２１に記載の複数の菌細胞であって、各細胞が異なるチトクロムＰ４５０をコード化する遺伝子作成物を含む菌細胞。
【請求項１】
機能性チトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ系を含む菌細胞であって、該細胞がチトクロムＰ４５０を発現し得る遺伝子作成物と上記チトクロムＰ４５０とは別個にチトクロムＰ４５０レダクターゼを発現し得る遺伝子作成物を含み、チトクロムＰ４５０とチトクロムＰ４５０レダクターゼのそれぞれがそのＮ末端に細菌シグナルペプチドを有する菌細胞。
【請求項２】
上記細胞が腸内細菌科の菌細胞である、請求項１に記載の菌細胞。
【請求項３】
上記チトクロムＰ４５０はチトクロムＰ４５０のＣＹＰ１、ＣＹＰ２、ＣＹＰ３又はＣＹＰ４ファミリーの何れかのメンバーである、請求項１又は２に記載の菌細胞。
【請求項４】
上記チトクロムＰ４５０は、チトクロムＰ４５０のＣＹＰ１Ａ、ＣＹＰ１Ｂ、ＣＹＰ２Ａ、ＣＹＰ２Ｂ、ＣＹＰ２Ｃ、ＣＹＰ２Ｄ、ＣＹＰ２Ｅ、ＣＹＰ３Ａ、ＣＹＰ４Ａ又はＣＹＰ４Ｂ亜科の何れかである、請求項１ないし３の何れか１項に記載の菌細胞。
【請求項５】
チトクロムＰ４５０は、チトクロムＰ４５０のＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｄ９、ＣＹＰ２Ａ６及びＣＹＰ２Ｅ１の何れかである、請求項４に記載の菌細胞。
【請求項６】
チトクロムＰ４５０レダクターゼは、ヒトチトクロムＰ４５０レダクターゼである、請求項１ないし５の何れか１項に記載の菌細胞。
【請求項７】
細胞は大腸菌細胞又はネズミチフス菌細胞である、請求項２ないし６の何れか１項に記載の菌細胞。
【請求項８】
細菌シグナルペプチドは、ｏｍｐＡ、ｐｅｌＢ、ｍａｌＥ又はｐｈｏＡシグナルペプチド又はその機能的に等価な変異体の何れかである、請求項１に記載の菌細胞。
【請求項９】
チトクロムＰ４５０の細菌シグナルペプチドはチトクロムＰ４５０レダクターゼの細菌シグナルペプチドと同一である、請求項１ないし８の何れか１項に記載の菌細胞。
【請求項１０】
チトクロムＰ４５０又はチトクロムＰ４５０レダクターゼの正しい折畳みを助けるポリペプチド補助因子を発現し得る遺伝子作成物を更に含有する、請求項１ないし９の何れか１項に記載の菌細胞。
【請求項１１】
上記ポリペプチド補助因子は分子シャペロンである、請求項１０に記載の菌細胞。
【請求項１２】
チトクロムＰ４５０とチトクロムＰ４５０レダクターゼの間の電子の伝達を助けるポリペプチド補助因子を発現し得る遺伝子作成物を更に含有する、請求項１ないし１１の何れか１項に記載の菌細胞。
【請求項１３】
チトクロムＰ４５０とチトクロムＰ４５０レダクターゼの間の電子の伝達を助ける上記補助因子は、チトクロムｂ５又はチトクロムＰ４５０レダクターゼのＦＭＮ領域である、請求項１２に記載の菌細胞。
【請求項１４】
チトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ系により触媒される反応の生成物を代謝し得る任意の酵素を発現し得る遺伝子作成物を更に含有する、請求項１ないし１３の何れか１項に記載の菌細胞。
【請求項１５】
上記酵素は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、エポキシドヒドロラーゼ又はＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼの何れかである、請求項１４に記載の菌細胞。
【請求項１６】
チトクロムＰ４５０とチトクロムＰ４５０レダクターゼは異なる遺伝子作成物によりコード化されている、請求項１ないし１５の何れか１項に記載の菌細胞。
【請求項１７】
チトクロムＰ４５０とチトクロムＰ４５０レダクターゼは同じ遺伝子作成物によりコード化されている、請求項１ないし１５の何れか１項に記載の菌細胞。
【請求項１８】
上記細胞は、チトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ系の基質である化合物に対して浸透性である、請求項１ないし１７の何れか１項に記載の菌細胞。
【請求項１９】
チトクロムＰ４５０の基質を生成物に転換する方法であって、請求項１ないし１８の何れか１項に記載の菌細胞と上記基質を混合することを含み、上記細胞が上記基質を転換し得る機能性チトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ系を含む方法。
【請求項２０】
チトクロムＰ４５０の基質を生成物に転換するための、請求項１ないし１８の何れか１項に記載の菌細胞の使用。
【請求項２１】
チトクロムＰ４５０を含む菌細胞において、上記チトクロムＰ４５０をコード化し、かつ発現し得る遺伝子作成物を含有し、チトクロムＰ４５０がそのＮ末端に細菌シグナルペプチドを含む、菌細胞。
【請求項２２】
細菌シグナルペプチドは、ｏｍｐＡ、ｐｅｌＢ、ｍａｌＥ又はｐｈｏＡシグナルペプチド又はその機能的に等価な変異体の何れかである、請求項２１に記載の菌細胞。
【請求項２３】
チトクロムＰ４５０は、菌細胞からチトクロムＰ４５０の精製を助けるペプチド配列を更に含む、請求項２１又は２２に記載の菌細胞。
【請求項２４】
上記ペプチド配列は化合物に対する結合部位を含む、請求項２３に記載の菌細胞。
【請求項２５】
上記ペプチド配列が−（Ｈｉｓ）ｎ（ここで６≧ｎ≧４）で、上記化合物がニッケルである、請求項２４に記載の菌細胞。
【請求項２６】
上記細胞は腸内細菌科の菌細胞である、請求項２１ないし２５の何れか１項に記載の菌細胞。
【請求項２７】
上記チトクロムＰ４５０が請求項３ないし５の何れか１項に記載されたものである、請求項２１ないし２６の何れか１項に記載の菌細胞。
【請求項２８】
チトクロムＰ４５０を調製する方法であって、（ａ）請求項２１ないし２７の何れか１項に記載の細胞を充分な量提供する工程と、（ｂ）他の細胞区画からチトクロムＰ４５０を分離する工程を含んでなる方法。
【請求項２９】
チトクロムＰ４５０を発現し得る遺伝子作成物であって、チトクロムＰ４５０がそのＮ末端に細菌シグナルペプチドを含む遺伝子作成物。
【請求項３０】
請求項１に記載の複数の菌細胞であって、各細胞がチトクロムＰ４５０とチトクロムＰ４５０レダクターゼの異なる組合せ又は他のポリペプチドの更なる組合せをコード化する遺伝子作成物又は作成物群を含む菌細胞。
【請求項３１】
請求項２１に記載の複数の菌細胞であって、各細胞が異なるチトクロムＰ４５０をコード化する遺伝子作成物を含む菌細胞。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【公開番号】特開２００８−４３３３８（Ｐ２００８−４３３３８Ａ）
【公開日】平成２０年２月２８日（２００８．２．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２３５０４０（Ｐ２００７−２３５０４０）
【出願日】平成１９年９月１１日（２００７．９．１１）
【分割の表示】特願平１０−５０５７５５の分割
【原出願日】平成９年７月１７日（１９９７．７．１７）
【出願人】（５０１２６０９０１）ビーティージー・インターナショナル・リミテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年２月２８日（２００８．２．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年９月１１日（２００７．９．１１）
【分割の表示】特願平１０−５０５７５５の分割
【原出願日】平成９年７月１７日（１９９７．７．１７）
【出願人】（５０１２６０９０１）ビーティージー・インターナショナル・リミテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
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