腸管免疫亢進用乳酸菌、これを用いた腸管免疫亢進用乳酸菌添加含有製品及びその製造方法
【課題】 ＩｇＡ活性機能とともに新たな腸管免疫亢進作用を用途とするラクトバチルス・ガセリ乳酸菌を提供する。
【解決手段】 ラクトバチルス・ガセリ乳酸菌から選別したＦＥＲＭ Ｐ−２１３９９に、自然免疫系の免疫応答を引起す腸上皮細胞内レセプターのＮＯＤ２、腸管指向性を示すリンパ球に特有のケモカインレセプターＣＣＲ９、リンパ球が腸管へ遊走する際に必要な小腸の高内皮細静脈における接着因子のＭＡｄＣＡＭ１の顕著な発現誘導が認められ、従って該乳酸菌には自然免疫系の活性化と腸管へのリンパ球遊走促進機能があると認められる。該乳酸菌の摂取によって、腸上皮細胞のＮＯＤ２発現の誘導、ＣＣＲ９陽性リンパ球の腸管への遊走による免疫応答の活性化とこれによる腸管免疫機能の回復乃至亢進作用が期待される。乳酸菌として、発酵乳等の各種食品、サプリメント、医薬品等、経口投与のための食品として使用できる。
【解決手段】 ラクトバチルス・ガセリ乳酸菌から選別したＦＥＲＭ Ｐ−２１３９９に、自然免疫系の免疫応答を引起す腸上皮細胞内レセプターのＮＯＤ２、腸管指向性を示すリンパ球に特有のケモカインレセプターＣＣＲ９、リンパ球が腸管へ遊走する際に必要な小腸の高内皮細静脈における接着因子のＭＡｄＣＡＭ１の顕著な発現誘導が認められ、従って該乳酸菌には自然免疫系の活性化と腸管へのリンパ球遊走促進機能があると認められる。該乳酸菌の摂取によって、腸上皮細胞のＮＯＤ２発現の誘導、ＣＣＲ９陽性リンパ球の腸管への遊走による免疫応答の活性化とこれによる腸管免疫機能の回復乃至亢進作用が期待される。乳酸菌として、発酵乳等の各種食品、サプリメント、医薬品等、経口投与のための食品として使用できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腸管免疫亢進用乳酸菌に関し、腸管免疫亢進用乳酸菌添加含有製品及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト由来の乳酸菌中のラクトバチルス属ガセリ種（以下ラクトバチルス・ガセリ又はガセリと省略表記し、他の属及び種の乳酸菌についても同様に・で属と種を区別し又は種によって省略表記する。）が、免疫グロブリンＡ（以下ＩｇＡという）産生誘導機能を発揮し、特に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター寄託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２１３９９のガセリ菌株が、他のガセリ菌株の５〜７倍程度に高度なＩｇＡ産生誘導機能を発揮する事実を知見することによって、本出願人は、該ガセリ菌株を、免疫賦活作用を有する乳酸菌とすること、該乳酸菌を添加含有して免疫賦活作用を有する製品とすること、更に該乳酸菌を添加含有して該免疫賦活作用を有する製品の製造方法とすることを提案済みである。
【０００３】
即ち、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・ラムノサス、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・クリスパタスの多数の乳酸菌株についてマウスパイエル板細胞を用いてそのＩｇＡ誘導活性能を研究評価した結果、ＩｇＡ誘導活性能を強く呈するもの（菌体無添加時のＩｇＡ値を１とした場合のＩｇＡ量の相対値が３以上のもの）は、クリスパタス、ガセリに認められるが、ガゼリ、中でも上記特許生物寄託センターに寄託した乳酸菌の菌株ＦＥＲＭ Ｐ−２１３９９の相対値は６．４倍という顕著なＩｇＡ産生誘導活性を発揮するものであり、また同時に乳発酵性、耐酸・耐胆汁酸性及び腸管接着性においても好適なものと認められ、従ってガセリ菌株、特に上記ＦＥＲＭ Ｐ−２１３９９のガセリ菌株は免疫賦活作用に優れた免疫機能を発揮するものであった。
【０００４】
【特許文献１】特開２００８−１７９６３０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このようにガセリ菌株、特に上記ＦＥＲＭ Ｐ−２１３９９のガセリ菌株は、その免疫賦活作用に優れた免疫機能を発揮するものであるところ、このガセリ菌株の免疫機能は、上記ＩｇＡ産生誘導活性による獲得免疫に対する賦活作用に止まるのか否かについては、必ずしも明瞭ではなく、この点の解明が求められる。
【０００６】
本発明はかかる事情に鑑みてなされたものであって、その解決課題は、上記ＩｇＡ産生誘導活性に加えてガセリ菌株が備えたその余の有用な免疫機能に対する作用を明らかにすることにより、該免疫作用を用途とする乳酸菌を提供し、該乳酸菌を添加含有した製品を提供し、また該製品の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題に沿って、更に研究を重ねたところ、ガセリ乳酸菌、特にＦＥＲＭ Ｐ−２１３９９ガセリ乳酸菌の菌株が、上記ＩｇＡ産生誘導作用に止まらず、腸管の自然免疫系を活性化する機能及び腸管へのリンパ球遊走を促進する機能を有しており、該リンパ球遊走の促進で腸管免疫における免疫応答の活性化とこれによる腸管免疫機能の回復乃至亢進作用が期待されるとの知見を得た。このリンパ球遊走促進の機能は、上記ガセリ乳酸菌が、細菌構成成分に対する腸上皮細胞内レセプターとして自然免疫系を活性化するとされるＮＯＤタンパク質ファミリーのＮＯＤ２の発現誘導機能を発揮すること、腸管指向性を有するリンパ球に特有のケモカインレセプターＣＣＲ９、ＣＣＲ６、ＣＣＲ１０等の発現誘導機能を発揮すること、該ＣＣＲ９を有するリンパ球の腸管への遊走に必要な高内皮細静脈における接着因子ＭＡｄＣＡＭ１やその余の接着因子の発現作用を発揮すること、の各発現誘導機能を発揮するとの事実を見出した。即ちこの各発現誘導機能は、ヒトの免疫機能にあって、ＮＯＤ２が自然免疫系を活性化し、ＣＣＲ９を備えて腸管指向性を有するリンパ球の遊走をＭＡｄＣＡＭ１が促進し、特にヒトの腸管免疫機能の回復亢進作用、即ち腸管免疫亢進作用を顕著に呈するに至るものと認められ、従って該ガセリ乳酸菌を摂取することによって、例えば、低下・抑制・破壊・破綻した腸管免疫を活性化させるように、腸管免疫の異常に伴う感染症・炎症性疾患・アレルギー疾患の治療・予防および改善に活用し得るとの知見を得るに至った。
【０００８】
本発明はかかる知見に基づいてなされたもので、即ち、請求項１に記載の発明を、腸管の自然免疫系活性化及び腸管へのリンパ球遊走促進機能を有するラクトバチルス・ガセリ乳酸菌であることを特徴とする腸管免疫亢進用乳酸菌とし、請求項２に記載の発明を、上記ラクトバチルス・ガセリ乳酸菌が、ＮＯＤ２の発現誘導機能及びＣＣＲ９等のケモカインレセプターの発現誘導機能、ＭＡｄＣＡＭ１等の接着因子の発現誘導機能を有し且つ上記自然免疫系活性化をＮＯＤ２の発現誘導機能により、リンパ球遊走促進機能を上記ケモカインレセプター及び接着因子の発現誘導機能によるものとしてなることを特徴とする請求項１に記載の腸管免疫亢進用乳酸菌とし、請求項３に記載の発明を、上記ラクトバチルス・ガセリ乳酸菌を、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター寄託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２１３９９のラクトバチルス・ガセリ菌株としてなることを特徴とする請求項１又は２に記載の腸管免疫亢進用乳酸菌とし、請求項４に記載の発明を、請求項１、２又は３に記載のラクトバチルス・ガセリ乳酸菌を、腸管の自然免疫系活性化と腸管へのリンパ球遊走促進機能を発揮させるために添加含有してなることを特徴とする腸管免疫亢進用製品とし、請求項５に記載の発明を、上記ラクトバチルス・ガセリ乳酸菌を含有した製品を、発酵乳、乳酸菌飲料、清涼飲料水、ガム、グミ、その他の食品又は顆粒、粉末、錠剤、その他のサプリメント乃至医薬品としてなることを特徴とする請求項４に記載の腸管免疫亢進用乳酸菌添加含有製品とし、請求項６に記載の発明を、請求項１、２又は３に記載のラクトバチルス・ガセリ乳酸菌を、腸管の自然免疫系活性化と腸管へのリンパ球遊走促進機能を発揮させるために添加して含有させることを特徴とする腸管免疫亢進用乳酸菌添加含有製品の製造方法としたものであり、本発明はこれらをそれぞれ発明の要旨として、上記課題解決の手段としたものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明は以上のとおりに構成したから、請求項１乃至３に記載の発明は、自然免疫系の活性化と腸管へのリンパ球遊走の促進で腸管免疫における免疫応答の活性化、これによる腸管免疫機能の回復乃至亢進作用を有して、低下、抑制、破壊、破綻した腸管免疫機能を活性化させ、該腸管免疫の異常に伴う感染症・炎症性疾患・アレルギー疾患の治療、予防及び改善に有効に用いられる腸管免疫亢進用乳酸菌を提供することができ、請求項４及び５に記載の発明は、該乳酸菌を添加含有することによって、同じく腸管免疫機能の低下、抑制、破壊、破綻に伴う各種疾患の治療、予防及び改善に有効に用いられる各種の腸管免疫亢進用乳酸菌添加含有製品を提供することができ、請求項６に記載の発明は、該製品の製造方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の乳酸菌は、腸管の自然免疫系活性化及び腸管へのリンパ球遊走促進機能を有するラクトバチルス・ガセリ乳酸菌である腸管免疫亢進用乳酸菌であり、また該ラクトバチルス・ガセリ乳酸菌が、ＮＯＤ２の発現誘導機能及びＣＣＲ９等のケモカインレセプターの発現誘導機能、ＭＡｄＣＡＭ１等の接着因子の発現誘導機能を有し且つ上記自然免疫系活性化をＮＯＤ２の発現誘導機能により、リンパ球遊走促進機能を上記ケモカインレセプター及び接着因子の発現誘導機能によるものとしており、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター寄託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２１３９９のラクトバチルス・ガセリ菌株にあって、該腸管へのリンパ球遊走促進機能が特に顕著に見られ、有効な腸管免疫亢進作用を呈する。
【００１１】
即ち、マウス実験によれば、ヒト由来のガセリ乳酸菌には、腸管へのリンパ球遊走促進機能が認められ、該リンパ球遊走の促進によって有効な腸管免疫亢進作用を呈するものである。該ガセリ乳酸菌には、自然免疫系を活性化するＮＯＤ２の発現誘導機能、ＣＣＲ９等のケモカインレセプターの発現誘導機能、ＭＡｄＣＡＭ１等の接着因子の発現誘導機能が顕著に見られ、上記リンパ球遊走促進機能は、これらＣＣＲ９及びＭＡｄＣＡＭ１等の発現誘導機能に依存するものと認められる。即ちＮＯＤ２は、腸上皮細胞の細胞内レセプターとして、自然免疫系の感染や貪食能によって細胞内に取り込んだバクテリア菌体構成成分であるペプチドグリカンのムラミルジペプチドを認識し、ＮＦ−κＢを活性化して、種々の免疫応答を引き起こすレセプターとされ、ＣＣＲ９は、腸管指向性を有するリンパ球に発現している特有のケモカインレセプターであり、またＭＡｄＣＡＭ１は小腸の高内皮細静脈に発現して、リンパ球のインテグリン分子と接着して、高内皮細静脈を通って腸管に遊走してくるＣＣＲ９陽性細胞の遊走を促進する接着因子であるとされる。従って、自然免疫系の活性化、ガセリ乳酸菌の腸管へのリンパ球遊走促進機能とこれによる腸管免疫亢進作用のメカニズムは必ずしも明らかではないが、最大の免疫臓器である腸管にあって、ガセリ乳酸菌がＮＯＤ２を発現して腸管の自然免疫系を活性化するとともにリンパ球に特有のケモカインレセプターＣＣＲ９を発現し且つこれとは別に高内皮細静脈において接着因子ＭＡｄＣＡＭ１を発現することから、該ガセリ乳酸菌の摂取によって、腸上皮細胞のＮＯＤ２の発現が誘導されて、ＮＦ−κＢの活性化を介して種々の免疫応答を促進する一方、ＭＡｄＣＡＭ１の発現が誘導されて、ＣＣＲ９陽性のリンパ球の腸管への遊走を活性化させ、その結果、リンパ球の有効な遊走が得られて、腸管での免疫応答を活性化とこれによる腸内免疫機能を回復乃至亢進の作用を発揮するに至るためと認められる。
【００１２】
本発明にあってこのようにガセリ乳酸菌が腸管免疫機能を回復乃至亢進するのは、次のマウスを用いて行なった遺伝子発現試験によって、これを確認することができる。
【００１３】
即ち、該試験の乳酸菌には、既にＩｇＡ産生誘導作用を高度に発揮することが認められ且つその生理生化学的性状が確認されているＦＥＲＭ Ｐ−２１３９９乳酸菌（出願人において保有するラクトバチルス・ガセリＧＣＬ１３５５を使用した。該菌種は特許文献１におけるラクトバチルス・ガセリＡ１０−０２Ｃと同一菌種である。）を用い、該乳酸菌をＭＲＳ培地で終夜培養後、ＰＢＳで２回洗浄し、その後菌液０．１ｍｌあたり１×１０１０ ＣＦＵとなるように調整して被検菌株液とした。遺伝子発現試験における、被検動物の飼育および被検菌株の投与、試料の採取、試料からのＲＮＡ抽出、リアルタイムＰＣＲ法による遺伝子発現解析は、以下のとおりである。
【００１４】
１． 被検動物の飼育および被検菌株の投与
妊娠１４日目のＢａｌｂ／ｃマウス（日本ＳＬＣ株式会社製）を４腹購入し、分娩させた。仔は生後１０日目までは自身の親に哺育させ、生後１０日目で全ての仔を混合し群分けを行った。群分けは、母マウス毎に腹ごとの偏りがでないよう考慮し、さらに仔の平均体重にばらつきが出ないよう配慮してそれぞれの母マウスに割り付けた。２群を対照群とし、残り２群を乳酸菌投与群とした。乳酸菌投与群には被検菌株液を、２０日齢から２２日齢の３日間、仔マウスに０．１ｍｌ経口投与した。離乳は生後２１日目に強制的に行った。母マウスおよび離乳後の仔マウスの飼料には実験基礎飼料（ラボＭＲストック；日本農産工業株式会社製）を用いた。飼料と飲水は未滅菌のものを使用し、自由摂取とした。飼育室は、９時点灯、２１時消灯の明暗周期で室温２５℃±２℃に設定した。
【００１５】
２． 試料の採取
生後２８日目に以下に示すように剖検を行った。ソムノペンチル（シェリング・プラウ・アニマルヘルス社製）をＰＢＳで２０倍希釈したもの１００μｌを腹腔内に注射し、全身麻酔下においた。その後開腹し小腸組織を採取した。小腸は、腸間膜脂肪を取り除いてから、小腸を８等分し、胃側から８番目の部分から５ｍｍずつＲＮＡ抽出用の組織を採取し、ＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）に浸漬した。
【００１６】
３． 試料からのＲＮＡ抽出
採取した小腸組織を上記ＲＮＡｌａｔｅｒから取り出し２ｍｌのジルコニアビーズ（アズワン社製）入りねじ口チューブに移した。ＱｕｉｃｋＧｅｎｅ ＲＮＡ ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ Ｓ II（ＦＵＪＩＦＩＬＭ社製）付属のＬＲＴ溶液とβ-メルカプトエタノールの混合液（ＬＲＴ溶液：β‐ＭＥ＝１００：１）５００μｌを試料の入ったチューブに入れ、ＦａｓｔＰｒｅｐでｓｐｅｅｄ６．０、２０秒間の組織破砕を３回行った。その後、ＱｕｉｃｋＧｅｎｅ ＲＮＡ ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ Ｓ IIのプロトコールに従い、ＲＮＡ抽出、ＤＮａｓｅ処理を行った。ＤＮａｓｅは、ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ I（ＴａＫａＲａ社製）を用いた。ｃＤＮＡの合成にはＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴ ｒｅａｇａｎｔ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ）（ＴａＫａＲａ社製）を使用し、全ＲＮＡ２００ｎｇを逆転写に供した。
【００１７】
４． リアルタイムＰＣＲ法による遺伝子発現解析
小腸組織におけるｍＲＮＡの定量を行うため、得られたｃＤＮＡを滅菌水で１０倍希釈したものを鋳型としてＲｅａｌ‐ｔｉｍｅ ＰＣＲ（Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ４８０：Ｒｏｃｈｅ社製）による遺伝子発現解析を行った。Ｒｅａｌ‐ｔｉｍｅ ＰＣＲはＬｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０ ＰｒｏｂｅｓＭａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて行った。ＰＣＲに使用したプライマーとプローブは表1のとおりである。全てのＲｅａｌ‐ｔｉｍｅ ＰＣＲの反応液組成は２．８６μｌ蒸留水、５μｌＰｒｏｂｅｓＭａｓｔｅｒ、それぞれ０．０２μｌのＦｏｒｗａｒｄとＲｅｖｅｒｓｅのプライマー（１００ｐｍｏｌ）、０．１μｌのプローブ、２．０μｌのＤＮＡテンプレート、計１０μｌで行った。反応条件は、９５℃、５分間の初期変性後、９５℃、１０秒間、６０℃、２０秒間を５５サイクルで行った。得られたデータをＬｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ４８０付属のソフトウェア（Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ４８０ ＳＷ １．５）およびＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社製）で解析しそれぞれの遺伝子の発現量を、Ｇａｐｄｈ遺伝子をハウスキーピング遺伝子とし、比較Ｃｔ法に基づき、相対定量を行った。
【００１８】
以上の遺伝子発現誘導試験による採取した組織中の遺伝子発現量の測定結果（ｎ＝５の平均値）を表２に示す。表２によれば、ガセリＧＣＬ１３５５株を投与した群では、対照群の１．０に対して、自然免疫系のレセプターであるＮＯＤ２の発現は２４．０倍と、その顕著な増加が認められた。また、腸管指向性を示すリンパ球に特有のＣＣＲ９及びリンパ球が腸管へ遊走する際に必要な接着因子であるＭＡｄＣＡＭ１の発現も４５３倍、２２．６倍と対照群に比して顕著な増加が認められた。これらＮＯＤ２、ＣＣＲ９及びＭＡｄＣＡＭ１の顕著な発現誘導機能は、ガセリ菌の投与によって腸管へのリンパ球の遊走が活性化し、該ガセリ菌株の経口投与が、腸管免疫の低下・抑制・破壊・破綻といった異常に対してその回復乃至亢進機能を有意に発揮するものであると認められる。
【００１９】
このように腸管免疫亢進機能を発揮するラクトバチルス・ガセリ乳酸菌は、これを、該菌株として、例えば凍結乾燥した乳酸菌粉末として、市場に供給することができるが、更に該ガセリ乳酸菌を、自然免疫系の活性化と腸管へのリンパ球遊走促進機能を発揮させるために添加含有した腸管免疫亢進用乳酸菌添加含有製品、即ちＮＯＤ２の発現誘導機能及びＣＣＲ９等のケモカインレセプターの発現誘導機能、ＭＡｄＣＡＭ１等の接着因子の発現誘導機能を発揮させる製品とすることができる。該腸管免疫亢進用乳酸菌添加含有製品として、発酵乳、乳酸菌飲料、清涼飲料水、ガム、グミ、その他の食品又は顆粒、粉末、錠剤、その他のサプリメント乃至医薬品があげられる。即ち、例えばヨーグルト等発酵食品のスターターとして添加発酵して、該菌株を含有する発酵食品とする他、一般に用いられる各種の飲料、食品、食品素材、食品添加物、医薬品、サプリメント等に添加することによって、腸管免疫亢進機能を発揮する製品とすることができる。これら製品は、上記乳酸菌又はその乳酸菌粉末を、組成原料の製造段階を含めて、その製造工程の適宜段階に添加して含有させることによって、その製造方法とすることができる。更に、例えばオリゴ糖を同時に添加することによって、これら製品を、プロバイオティクス用途とともにプレバイオティクス用途のものとすることができ、また各種ビタミン類やその他の人体に有益な成分を添加することができ、更に家畜類の飼料としても同様に使用することができる。
【００２０】
これら腸管免疫亢進用乳酸菌添加含有製品の製造及び組成は、常法に従ってこれを行なうことができ、そのリンパ球遊走促進機能とこれによる腸管免疫亢進作用の発揮に、特段の条件や製造方法を採用する必要はない。
【００２１】
これらラクトバチルス・ガセリの乳酸菌には、人体に害を及ぼす可能性はないものと認められるから、乳児用の飲料、食品等の製品に、上記と同様に使用することができる上、特殊用途の医薬品にも特段の制限なく使用することができる。またその添加量についても制限がないが、一般には極く微量を添加することで、腸管免疫亢進作用を発揮することができる。なお該ラクトバチルス・ガセリ乳酸菌は、上記のとおりＩｇＡ活性作用を有しているので、該腸管免疫亢進作用とＩｇＡ活性作用の双方の作用発揮により有効な免疫機能を有するものとすることができる。
【００２２】
本説明は以上のとおりとしたが、本発明の実施に当って、上記ラクトバチルス・ガセリ乳酸菌、これによる腸管免疫亢進用乳酸菌添加含有製品、その製造方法等の、各具体的な形態は、上記発明の要旨に反しない限り、様々な形態のものとすることができる。
【００２３】
【表１】
【００２４】
【表２】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腸管免疫亢進用乳酸菌に関し、腸管免疫亢進用乳酸菌添加含有製品及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト由来の乳酸菌中のラクトバチルス属ガセリ種（以下ラクトバチルス・ガセリ又はガセリと省略表記し、他の属及び種の乳酸菌についても同様に・で属と種を区別し又は種によって省略表記する。）が、免疫グロブリンＡ（以下ＩｇＡという）産生誘導機能を発揮し、特に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター寄託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２１３９９のガセリ菌株が、他のガセリ菌株の５〜７倍程度に高度なＩｇＡ産生誘導機能を発揮する事実を知見することによって、本出願人は、該ガセリ菌株を、免疫賦活作用を有する乳酸菌とすること、該乳酸菌を添加含有して免疫賦活作用を有する製品とすること、更に該乳酸菌を添加含有して該免疫賦活作用を有する製品の製造方法とすることを提案済みである。
【０００３】
即ち、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・ラムノサス、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・クリスパタスの多数の乳酸菌株についてマウスパイエル板細胞を用いてそのＩｇＡ誘導活性能を研究評価した結果、ＩｇＡ誘導活性能を強く呈するもの（菌体無添加時のＩｇＡ値を１とした場合のＩｇＡ量の相対値が３以上のもの）は、クリスパタス、ガセリに認められるが、ガゼリ、中でも上記特許生物寄託センターに寄託した乳酸菌の菌株ＦＥＲＭ Ｐ−２１３９９の相対値は６．４倍という顕著なＩｇＡ産生誘導活性を発揮するものであり、また同時に乳発酵性、耐酸・耐胆汁酸性及び腸管接着性においても好適なものと認められ、従ってガセリ菌株、特に上記ＦＥＲＭ Ｐ−２１３９９のガセリ菌株は免疫賦活作用に優れた免疫機能を発揮するものであった。
【０００４】
【特許文献１】特開２００８−１７９６３０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このようにガセリ菌株、特に上記ＦＥＲＭ Ｐ−２１３９９のガセリ菌株は、その免疫賦活作用に優れた免疫機能を発揮するものであるところ、このガセリ菌株の免疫機能は、上記ＩｇＡ産生誘導活性による獲得免疫に対する賦活作用に止まるのか否かについては、必ずしも明瞭ではなく、この点の解明が求められる。
【０００６】
本発明はかかる事情に鑑みてなされたものであって、その解決課題は、上記ＩｇＡ産生誘導活性に加えてガセリ菌株が備えたその余の有用な免疫機能に対する作用を明らかにすることにより、該免疫作用を用途とする乳酸菌を提供し、該乳酸菌を添加含有した製品を提供し、また該製品の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題に沿って、更に研究を重ねたところ、ガセリ乳酸菌、特にＦＥＲＭ Ｐ−２１３９９ガセリ乳酸菌の菌株が、上記ＩｇＡ産生誘導作用に止まらず、腸管の自然免疫系を活性化する機能及び腸管へのリンパ球遊走を促進する機能を有しており、該リンパ球遊走の促進で腸管免疫における免疫応答の活性化とこれによる腸管免疫機能の回復乃至亢進作用が期待されるとの知見を得た。このリンパ球遊走促進の機能は、上記ガセリ乳酸菌が、細菌構成成分に対する腸上皮細胞内レセプターとして自然免疫系を活性化するとされるＮＯＤタンパク質ファミリーのＮＯＤ２の発現誘導機能を発揮すること、腸管指向性を有するリンパ球に特有のケモカインレセプターＣＣＲ９、ＣＣＲ６、ＣＣＲ１０等の発現誘導機能を発揮すること、該ＣＣＲ９を有するリンパ球の腸管への遊走に必要な高内皮細静脈における接着因子ＭＡｄＣＡＭ１やその余の接着因子の発現作用を発揮すること、の各発現誘導機能を発揮するとの事実を見出した。即ちこの各発現誘導機能は、ヒトの免疫機能にあって、ＮＯＤ２が自然免疫系を活性化し、ＣＣＲ９を備えて腸管指向性を有するリンパ球の遊走をＭＡｄＣＡＭ１が促進し、特にヒトの腸管免疫機能の回復亢進作用、即ち腸管免疫亢進作用を顕著に呈するに至るものと認められ、従って該ガセリ乳酸菌を摂取することによって、例えば、低下・抑制・破壊・破綻した腸管免疫を活性化させるように、腸管免疫の異常に伴う感染症・炎症性疾患・アレルギー疾患の治療・予防および改善に活用し得るとの知見を得るに至った。
【０００８】
本発明はかかる知見に基づいてなされたもので、即ち、請求項１に記載の発明を、腸管の自然免疫系活性化及び腸管へのリンパ球遊走促進機能を有するラクトバチルス・ガセリ乳酸菌であることを特徴とする腸管免疫亢進用乳酸菌とし、請求項２に記載の発明を、上記ラクトバチルス・ガセリ乳酸菌が、ＮＯＤ２の発現誘導機能及びＣＣＲ９等のケモカインレセプターの発現誘導機能、ＭＡｄＣＡＭ１等の接着因子の発現誘導機能を有し且つ上記自然免疫系活性化をＮＯＤ２の発現誘導機能により、リンパ球遊走促進機能を上記ケモカインレセプター及び接着因子の発現誘導機能によるものとしてなることを特徴とする請求項１に記載の腸管免疫亢進用乳酸菌とし、請求項３に記載の発明を、上記ラクトバチルス・ガセリ乳酸菌を、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター寄託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２１３９９のラクトバチルス・ガセリ菌株としてなることを特徴とする請求項１又は２に記載の腸管免疫亢進用乳酸菌とし、請求項４に記載の発明を、請求項１、２又は３に記載のラクトバチルス・ガセリ乳酸菌を、腸管の自然免疫系活性化と腸管へのリンパ球遊走促進機能を発揮させるために添加含有してなることを特徴とする腸管免疫亢進用製品とし、請求項５に記載の発明を、上記ラクトバチルス・ガセリ乳酸菌を含有した製品を、発酵乳、乳酸菌飲料、清涼飲料水、ガム、グミ、その他の食品又は顆粒、粉末、錠剤、その他のサプリメント乃至医薬品としてなることを特徴とする請求項４に記載の腸管免疫亢進用乳酸菌添加含有製品とし、請求項６に記載の発明を、請求項１、２又は３に記載のラクトバチルス・ガセリ乳酸菌を、腸管の自然免疫系活性化と腸管へのリンパ球遊走促進機能を発揮させるために添加して含有させることを特徴とする腸管免疫亢進用乳酸菌添加含有製品の製造方法としたものであり、本発明はこれらをそれぞれ発明の要旨として、上記課題解決の手段としたものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明は以上のとおりに構成したから、請求項１乃至３に記載の発明は、自然免疫系の活性化と腸管へのリンパ球遊走の促進で腸管免疫における免疫応答の活性化、これによる腸管免疫機能の回復乃至亢進作用を有して、低下、抑制、破壊、破綻した腸管免疫機能を活性化させ、該腸管免疫の異常に伴う感染症・炎症性疾患・アレルギー疾患の治療、予防及び改善に有効に用いられる腸管免疫亢進用乳酸菌を提供することができ、請求項４及び５に記載の発明は、該乳酸菌を添加含有することによって、同じく腸管免疫機能の低下、抑制、破壊、破綻に伴う各種疾患の治療、予防及び改善に有効に用いられる各種の腸管免疫亢進用乳酸菌添加含有製品を提供することができ、請求項６に記載の発明は、該製品の製造方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の乳酸菌は、腸管の自然免疫系活性化及び腸管へのリンパ球遊走促進機能を有するラクトバチルス・ガセリ乳酸菌である腸管免疫亢進用乳酸菌であり、また該ラクトバチルス・ガセリ乳酸菌が、ＮＯＤ２の発現誘導機能及びＣＣＲ９等のケモカインレセプターの発現誘導機能、ＭＡｄＣＡＭ１等の接着因子の発現誘導機能を有し且つ上記自然免疫系活性化をＮＯＤ２の発現誘導機能により、リンパ球遊走促進機能を上記ケモカインレセプター及び接着因子の発現誘導機能によるものとしており、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター寄託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２１３９９のラクトバチルス・ガセリ菌株にあって、該腸管へのリンパ球遊走促進機能が特に顕著に見られ、有効な腸管免疫亢進作用を呈する。
【００１１】
即ち、マウス実験によれば、ヒト由来のガセリ乳酸菌には、腸管へのリンパ球遊走促進機能が認められ、該リンパ球遊走の促進によって有効な腸管免疫亢進作用を呈するものである。該ガセリ乳酸菌には、自然免疫系を活性化するＮＯＤ２の発現誘導機能、ＣＣＲ９等のケモカインレセプターの発現誘導機能、ＭＡｄＣＡＭ１等の接着因子の発現誘導機能が顕著に見られ、上記リンパ球遊走促進機能は、これらＣＣＲ９及びＭＡｄＣＡＭ１等の発現誘導機能に依存するものと認められる。即ちＮＯＤ２は、腸上皮細胞の細胞内レセプターとして、自然免疫系の感染や貪食能によって細胞内に取り込んだバクテリア菌体構成成分であるペプチドグリカンのムラミルジペプチドを認識し、ＮＦ−κＢを活性化して、種々の免疫応答を引き起こすレセプターとされ、ＣＣＲ９は、腸管指向性を有するリンパ球に発現している特有のケモカインレセプターであり、またＭＡｄＣＡＭ１は小腸の高内皮細静脈に発現して、リンパ球のインテグリン分子と接着して、高内皮細静脈を通って腸管に遊走してくるＣＣＲ９陽性細胞の遊走を促進する接着因子であるとされる。従って、自然免疫系の活性化、ガセリ乳酸菌の腸管へのリンパ球遊走促進機能とこれによる腸管免疫亢進作用のメカニズムは必ずしも明らかではないが、最大の免疫臓器である腸管にあって、ガセリ乳酸菌がＮＯＤ２を発現して腸管の自然免疫系を活性化するとともにリンパ球に特有のケモカインレセプターＣＣＲ９を発現し且つこれとは別に高内皮細静脈において接着因子ＭＡｄＣＡＭ１を発現することから、該ガセリ乳酸菌の摂取によって、腸上皮細胞のＮＯＤ２の発現が誘導されて、ＮＦ−κＢの活性化を介して種々の免疫応答を促進する一方、ＭＡｄＣＡＭ１の発現が誘導されて、ＣＣＲ９陽性のリンパ球の腸管への遊走を活性化させ、その結果、リンパ球の有効な遊走が得られて、腸管での免疫応答を活性化とこれによる腸内免疫機能を回復乃至亢進の作用を発揮するに至るためと認められる。
【００１２】
本発明にあってこのようにガセリ乳酸菌が腸管免疫機能を回復乃至亢進するのは、次のマウスを用いて行なった遺伝子発現試験によって、これを確認することができる。
【００１３】
即ち、該試験の乳酸菌には、既にＩｇＡ産生誘導作用を高度に発揮することが認められ且つその生理生化学的性状が確認されているＦＥＲＭ Ｐ−２１３９９乳酸菌（出願人において保有するラクトバチルス・ガセリＧＣＬ１３５５を使用した。該菌種は特許文献１におけるラクトバチルス・ガセリＡ１０−０２Ｃと同一菌種である。）を用い、該乳酸菌をＭＲＳ培地で終夜培養後、ＰＢＳで２回洗浄し、その後菌液０．１ｍｌあたり１×１０１０ ＣＦＵとなるように調整して被検菌株液とした。遺伝子発現試験における、被検動物の飼育および被検菌株の投与、試料の採取、試料からのＲＮＡ抽出、リアルタイムＰＣＲ法による遺伝子発現解析は、以下のとおりである。
【００１４】
１． 被検動物の飼育および被検菌株の投与
妊娠１４日目のＢａｌｂ／ｃマウス（日本ＳＬＣ株式会社製）を４腹購入し、分娩させた。仔は生後１０日目までは自身の親に哺育させ、生後１０日目で全ての仔を混合し群分けを行った。群分けは、母マウス毎に腹ごとの偏りがでないよう考慮し、さらに仔の平均体重にばらつきが出ないよう配慮してそれぞれの母マウスに割り付けた。２群を対照群とし、残り２群を乳酸菌投与群とした。乳酸菌投与群には被検菌株液を、２０日齢から２２日齢の３日間、仔マウスに０．１ｍｌ経口投与した。離乳は生後２１日目に強制的に行った。母マウスおよび離乳後の仔マウスの飼料には実験基礎飼料（ラボＭＲストック；日本農産工業株式会社製）を用いた。飼料と飲水は未滅菌のものを使用し、自由摂取とした。飼育室は、９時点灯、２１時消灯の明暗周期で室温２５℃±２℃に設定した。
【００１５】
２． 試料の採取
生後２８日目に以下に示すように剖検を行った。ソムノペンチル（シェリング・プラウ・アニマルヘルス社製）をＰＢＳで２０倍希釈したもの１００μｌを腹腔内に注射し、全身麻酔下においた。その後開腹し小腸組織を採取した。小腸は、腸間膜脂肪を取り除いてから、小腸を８等分し、胃側から８番目の部分から５ｍｍずつＲＮＡ抽出用の組織を採取し、ＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）に浸漬した。
【００１６】
３． 試料からのＲＮＡ抽出
採取した小腸組織を上記ＲＮＡｌａｔｅｒから取り出し２ｍｌのジルコニアビーズ（アズワン社製）入りねじ口チューブに移した。ＱｕｉｃｋＧｅｎｅ ＲＮＡ ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ Ｓ II（ＦＵＪＩＦＩＬＭ社製）付属のＬＲＴ溶液とβ-メルカプトエタノールの混合液（ＬＲＴ溶液：β‐ＭＥ＝１００：１）５００μｌを試料の入ったチューブに入れ、ＦａｓｔＰｒｅｐでｓｐｅｅｄ６．０、２０秒間の組織破砕を３回行った。その後、ＱｕｉｃｋＧｅｎｅ ＲＮＡ ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ Ｓ IIのプロトコールに従い、ＲＮＡ抽出、ＤＮａｓｅ処理を行った。ＤＮａｓｅは、ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ I（ＴａＫａＲａ社製）を用いた。ｃＤＮＡの合成にはＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴ ｒｅａｇａｎｔ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ）（ＴａＫａＲａ社製）を使用し、全ＲＮＡ２００ｎｇを逆転写に供した。
【００１７】
４． リアルタイムＰＣＲ法による遺伝子発現解析
小腸組織におけるｍＲＮＡの定量を行うため、得られたｃＤＮＡを滅菌水で１０倍希釈したものを鋳型としてＲｅａｌ‐ｔｉｍｅ ＰＣＲ（Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ４８０：Ｒｏｃｈｅ社製）による遺伝子発現解析を行った。Ｒｅａｌ‐ｔｉｍｅ ＰＣＲはＬｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０ ＰｒｏｂｅｓＭａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて行った。ＰＣＲに使用したプライマーとプローブは表1のとおりである。全てのＲｅａｌ‐ｔｉｍｅ ＰＣＲの反応液組成は２．８６μｌ蒸留水、５μｌＰｒｏｂｅｓＭａｓｔｅｒ、それぞれ０．０２μｌのＦｏｒｗａｒｄとＲｅｖｅｒｓｅのプライマー（１００ｐｍｏｌ）、０．１μｌのプローブ、２．０μｌのＤＮＡテンプレート、計１０μｌで行った。反応条件は、９５℃、５分間の初期変性後、９５℃、１０秒間、６０℃、２０秒間を５５サイクルで行った。得られたデータをＬｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ４８０付属のソフトウェア（Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ４８０ ＳＷ １．５）およびＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社製）で解析しそれぞれの遺伝子の発現量を、Ｇａｐｄｈ遺伝子をハウスキーピング遺伝子とし、比較Ｃｔ法に基づき、相対定量を行った。
【００１８】
以上の遺伝子発現誘導試験による採取した組織中の遺伝子発現量の測定結果（ｎ＝５の平均値）を表２に示す。表２によれば、ガセリＧＣＬ１３５５株を投与した群では、対照群の１．０に対して、自然免疫系のレセプターであるＮＯＤ２の発現は２４．０倍と、その顕著な増加が認められた。また、腸管指向性を示すリンパ球に特有のＣＣＲ９及びリンパ球が腸管へ遊走する際に必要な接着因子であるＭＡｄＣＡＭ１の発現も４５３倍、２２．６倍と対照群に比して顕著な増加が認められた。これらＮＯＤ２、ＣＣＲ９及びＭＡｄＣＡＭ１の顕著な発現誘導機能は、ガセリ菌の投与によって腸管へのリンパ球の遊走が活性化し、該ガセリ菌株の経口投与が、腸管免疫の低下・抑制・破壊・破綻といった異常に対してその回復乃至亢進機能を有意に発揮するものであると認められる。
【００１９】
このように腸管免疫亢進機能を発揮するラクトバチルス・ガセリ乳酸菌は、これを、該菌株として、例えば凍結乾燥した乳酸菌粉末として、市場に供給することができるが、更に該ガセリ乳酸菌を、自然免疫系の活性化と腸管へのリンパ球遊走促進機能を発揮させるために添加含有した腸管免疫亢進用乳酸菌添加含有製品、即ちＮＯＤ２の発現誘導機能及びＣＣＲ９等のケモカインレセプターの発現誘導機能、ＭＡｄＣＡＭ１等の接着因子の発現誘導機能を発揮させる製品とすることができる。該腸管免疫亢進用乳酸菌添加含有製品として、発酵乳、乳酸菌飲料、清涼飲料水、ガム、グミ、その他の食品又は顆粒、粉末、錠剤、その他のサプリメント乃至医薬品があげられる。即ち、例えばヨーグルト等発酵食品のスターターとして添加発酵して、該菌株を含有する発酵食品とする他、一般に用いられる各種の飲料、食品、食品素材、食品添加物、医薬品、サプリメント等に添加することによって、腸管免疫亢進機能を発揮する製品とすることができる。これら製品は、上記乳酸菌又はその乳酸菌粉末を、組成原料の製造段階を含めて、その製造工程の適宜段階に添加して含有させることによって、その製造方法とすることができる。更に、例えばオリゴ糖を同時に添加することによって、これら製品を、プロバイオティクス用途とともにプレバイオティクス用途のものとすることができ、また各種ビタミン類やその他の人体に有益な成分を添加することができ、更に家畜類の飼料としても同様に使用することができる。
【００２０】
これら腸管免疫亢進用乳酸菌添加含有製品の製造及び組成は、常法に従ってこれを行なうことができ、そのリンパ球遊走促進機能とこれによる腸管免疫亢進作用の発揮に、特段の条件や製造方法を採用する必要はない。
【００２１】
これらラクトバチルス・ガセリの乳酸菌には、人体に害を及ぼす可能性はないものと認められるから、乳児用の飲料、食品等の製品に、上記と同様に使用することができる上、特殊用途の医薬品にも特段の制限なく使用することができる。またその添加量についても制限がないが、一般には極く微量を添加することで、腸管免疫亢進作用を発揮することができる。なお該ラクトバチルス・ガセリ乳酸菌は、上記のとおりＩｇＡ活性作用を有しているので、該腸管免疫亢進作用とＩｇＡ活性作用の双方の作用発揮により有効な免疫機能を有するものとすることができる。
【００２２】
本説明は以上のとおりとしたが、本発明の実施に当って、上記ラクトバチルス・ガセリ乳酸菌、これによる腸管免疫亢進用乳酸菌添加含有製品、その製造方法等の、各具体的な形態は、上記発明の要旨に反しない限り、様々な形態のものとすることができる。
【００２３】
【表１】
【００２４】
【表２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腸管の自然免疫系活性化及び腸管へのリンパ球遊走促進機能を有するラクトバチルス・ガセリ乳酸菌であることを特徴とする腸管免疫亢進用乳酸菌。
【請求項２】
上記ラクトバチルス・ガセリ乳酸菌が、ＮＯＤ２の発現誘導機能及びＣＣＲ９等のケモカインレセプターの発現誘導機能、ＭＡｄＣＡＭ１等の接着因子の発現誘導機能を有し且つ上記自然免疫系活性化をＮＯＤ２の発現誘導機能により、リンパ球遊走促進機能を上記ケモカインレセプター及び接着因子の発現誘導機能によるものとしてなることを特徴とする請求項１に記載の腸管免疫亢進用乳酸菌。
【請求項３】
上記ラクトバチルス・ガセリ乳酸菌を、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター寄託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２１３９９のラクトバチルス・ガセリ菌株としてなることを特徴とする請求項１又は２に記載の腸管免疫亢進用乳酸菌。
【請求項４】
請求項１、２又は３に記載のラクトバチルス・ガセリ乳酸菌を、腸管の自然免疫系活性化と腸管へのリンパ球遊走促進機能を発揮させるために添加含有してなることを特徴とする腸管免疫亢進用乳酸菌添加含有製品。
【請求項５】
上記ラクトバチルス・ガセリ乳酸菌を含有した製品を、発酵乳、乳酸菌飲料、清涼飲料水、ガム、グミ、その他の食品又は顆粒、粉末、錠剤、その他のサプリメント乃至医薬品としてなることを特徴とする請求項４に記載の腸管免疫亢進用乳酸菌添加含有製品。
【請求項６】
請求項１、２又は３に記載のラクトバチルス・ガセリ乳酸菌を、腸管の自然免疫系活性化と腸管へのリンパ球遊走促進機能を発揮させるために添加して含有させることを特徴とする腸管免疫亢進用乳酸菌添加含有製品の製造方法。
【請求項１】
腸管の自然免疫系活性化及び腸管へのリンパ球遊走促進機能を有するラクトバチルス・ガセリ乳酸菌であることを特徴とする腸管免疫亢進用乳酸菌。
【請求項２】
上記ラクトバチルス・ガセリ乳酸菌が、ＮＯＤ２の発現誘導機能及びＣＣＲ９等のケモカインレセプターの発現誘導機能、ＭＡｄＣＡＭ１等の接着因子の発現誘導機能を有し且つ上記自然免疫系活性化をＮＯＤ２の発現誘導機能により、リンパ球遊走促進機能を上記ケモカインレセプター及び接着因子の発現誘導機能によるものとしてなることを特徴とする請求項１に記載の腸管免疫亢進用乳酸菌。
【請求項３】
上記ラクトバチルス・ガセリ乳酸菌を、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター寄託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２１３９９のラクトバチルス・ガセリ菌株としてなることを特徴とする請求項１又は２に記載の腸管免疫亢進用乳酸菌。
【請求項４】
請求項１、２又は３に記載のラクトバチルス・ガセリ乳酸菌を、腸管の自然免疫系活性化と腸管へのリンパ球遊走促進機能を発揮させるために添加含有してなることを特徴とする腸管免疫亢進用乳酸菌添加含有製品。
【請求項５】
上記ラクトバチルス・ガセリ乳酸菌を含有した製品を、発酵乳、乳酸菌飲料、清涼飲料水、ガム、グミ、その他の食品又は顆粒、粉末、錠剤、その他のサプリメント乃至医薬品としてなることを特徴とする請求項４に記載の腸管免疫亢進用乳酸菌添加含有製品。
【請求項６】
請求項１、２又は３に記載のラクトバチルス・ガセリ乳酸菌を、腸管の自然免疫系活性化と腸管へのリンパ球遊走促進機能を発揮させるために添加して含有させることを特徴とする腸管免疫亢進用乳酸菌添加含有製品の製造方法。
【公開番号】特開２０１０−１３０９５４（Ｐ２０１０−１３０９５４Ａ）
【公開日】平成２２年６月１７日（２０１０．６．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３１０２２３（Ｐ２００８−３１０２２３）
【出願日】平成２０年１２月４日（２００８．１２．４）
【出願人】（３９０００１２７０）グリコ乳業株式会社 (29)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年６月１７日（２０１０．６．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月４日（２００８．１２．４）
【出願人】（３９０００１２７０）グリコ乳業株式会社 (29)
【Ｆターム（参考）】
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