腹膜透析液
本発明は、アリスキレン又はその任意の誘導体、少なくとも１種の電解質、少なくとも１種の緩衝液、及び少なくとも１種の浸透圧剤を含むタイプの腹膜透析液に関する。この透析液は、これらの常用される腹膜透析液の腹膜中皮細胞に対する毒性の低減を可能にする。一方で、本発明は、慢性腎不全の場合のように腹膜透析を必要としているプロセスでのこれらのタイプの溶液の使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［説明］
本発明は、アリスキレン、少なくとも１種の電解質、少なくとも１種の緩衝液、及び少なくとも１種の浸透圧剤を含むタイプの腹膜透析液に関する。この透析液は、これらの常用腹膜透析液の腹膜中皮細胞に対する毒性の低減を可能にする。一方で、本発明は、慢性腎不全の場合のように腹膜透析が必要とされるプロセスのためのこのタイプの溶液の使用に関する。
【０００２】
［従来の技術］
腹膜透析（ＰＤ）は、慢性腎不全に有効な療法であり、腹膜を、血液から尿素及びカリウムなどの有害物質並びに過剰な液体を除去するための半透膜として利用する。ＰＤは、患者の家庭又は職場で通常実施されるという事実のため、この治療を受ける患者は、病院に頻繁に滞在することなしに、活動的な生活を送ることができる利点を有する（Ｇｒａｓｓｍａｎｎ Ａ、Ｇｉｏｂｅｒｇｅ Ｓ、Ｍｏｅｌｌｅｒ Ｓら、Ｎｅｐｈｒｏｌ Ｄｉａｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ２００５；２０：２５８７〜９３及びＢｕｒｋａｒｔ ＪＭ、Ｎｏｌｐｈ ＫＤ．ＮＩＤＤＫ ２００６；６：１〜２４）。
【０００３】
最大限の無菌状態を確実にするように特別に設計された新たな連結システムの出現以来、その発生率は劇的に低下したが、この透析法の主な欠点は、腹膜感染症（腹膜炎）になる傾向があることである。一方で、腹膜機能の劣化速度に影響を及ぼす因子は完全には明らかでないが、透析用液体への継続的暴露は、腹膜の透析能力の劣化を引き起こし、これは線維症及び血管症に関連している（Ｇｉｌｌｅｒｏｔ Ｇ、Ｄｅｖｕｙｓｔ Ｏ、Ｃｌｉｎ Ｎｅｐｈｒｏｌ ２００３；６０：１〜６）。
【０００４】
腹膜を構成する中皮細胞の、高い浸透圧濃度及びグルコース濃度を有する透析用液体への継続的暴露の結果としての変化は、腹膜機能不全に関係する機構の１つである可能性がある（Ｃｏｌｅｓ ＧＡ、Ｔｏｐｌｅｙ Ｎ、Ａｄｖ Ｒｅｎ Ｒｅｐｌａｃｅ Ｔｈｅｒ ２０００；７：２８９〜３０１）。サイトカイン、ホルモン、感染症又は薬物などの多くのタイプの刺激がアポトーシスを誘導することが知られている（Ｃａｔａｌａｎ ＭＰ、Ｓｕｂｉｒａ Ｄ、Ｒｅｙｅｒｏ Ａら、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ ２００３；６４：３２１〜３０；Ｚｈｅｎｇ Ｚ、Ｙｅ Ｒ、Ｙｕ Ｘら、Ａｄｖ Ｐｅｒｉｔ Ｄｉａｌ ２００１；１７：５３〜７）。さらに、高濃度のグルコースは、中皮細胞を含めて多くの細胞型においてアポトーシスを誘導することが知られている（Ｓｈａｒｉｆｉ ＡＭ、Ｍｏｕｓａｖｉ ＳＨ、Ｆａｒｈａｄｉ Ｍら、Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ ２００７；１０４：２５８〜６２）。
【０００５】
腹膜中皮細胞培養物で実施される研究に加えて、最も高頻度に使用されるＰＤ動物モデルはラットである（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｍａｔｅｏ ＧＴ、Ｌｏｕｒｅｉｒｏ−Ａｌｖａｒｅｚ Ｊ、Ｒａｙｅｇｏ−Ｍａｔｅｏｓ Ｓら、Ｎｅｆｒｏｌｏｇｉａ ２００８；２８（Ｓｕｐｐｌ ６）：１７〜２２）。これらのモデルで実施された初期の研究は、透析用液体の生体適合性、透析用液体への暴露に対して腹膜中で発現される炎症応答、血管新生及び腹膜の浸透性又は線維症における血管網の重要性、並びに腹膜損傷に対する腹膜炎の寄与に焦点が当てられてきた（Ｋｒｅｄｉｅｔ ＲＴ、Ｚｗｅｅｒｓ ＭＭ、Ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａｌ ＡＣら、Ｐｅｒｉｔ Ｄｉａｌ Ｉｎｔ ２０００；２０（Ｓｕｐｐｌ ２）：Ｓ１９〜２５）；Ｂａｚａｒｇａｎｉ Ｆ．Ｓｗｅｄ Ｄｅｎｔ Ｊ Ｓｕｐｐｌ ２００５；１７１：１〜５７；Ｈｕｒｓｔ ＳＭ、ＭｃＬｏｕｇｈｌｉｎ ＲＭ、Ｍｏｎｓｌｏｗ Ｊら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００２；１６９：５２４４〜５１；Ｋｉｍ ＹＬ、Ｄｏ Ｊ、Ｐａｒｋ ＳＨら、Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ（Ｃａｒｌｔｏｎ）２００３；８（Ｓｕｐｐｌ）：Ｓ２８〜３２；Ｇｉｌｌｅｒｏｔ Ｇ、Ｄｅｖｕｙｓｔ Ｏ．Ｃｌｉｎ Ｎｅｐｈｒｏｌ ２００３；６０：１〜６；Ｌａｍｅｉｒｅ Ｎ、Ｖａｎ Ｂｉｅｓｅｎ Ｗ、Ｍｏｒｔｉｅｒ Ｓら、Ｃｏｎｔｒｉｂ Ｎｅｐｈｒｏｌ ２００６；１５０：７０〜６；Ｍａｒｇｅｔｔｓ ＰＪ、Ｂｏｎｎｉａｕｄ Ｐ、Ｌｉｕ Ｌら、Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ ２００５；１６：４２５〜３６；Ｍａｒｇｅｔｔｓ ＰＪ、Ｋｏｌｂ Ｍ、Ｇａｌｔ Ｔら、Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ ２００１；１２：２０２９〜３９）。
【０００６】
ＰＤの研究は、初めは尿毒症の事例、続いて急性又は慢性腎不全の事例に関して研究された、２０世紀中頃にさかのぼる。しかし、その継続的な外来患者モダリティーにおいて現在理解されているようなＰＤは、１９７８年に、Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＲＰ、Ｍｏｎｃｒｉｅｆ ＪＷ、Ｎｏｌｐｈ ＫＤらによって考え出された（Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ １９９９；１０：９０１〜１０）。それ以来、ＰＤの使用は、ますます広がり、世界的には１８０，０００人を超える患者にまで拡大している（Ｌｙｓａｇｈｔ ＭＪ、Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ ２００２；１３（Ｓｕｐｐｌ １）：Ｓ３７〜４０）。近年における増加は、それぞれの国で極めて多様であり、メキシコでは９０％に、スカンジナビア諸国及びカナダでは３０〜５０％に、米国では１７％に、中央及び南ヨーロッパ諸国では８〜１１％に、日本では５％に達する（Ｌｙｓａｇｈｔ ＭＪ．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ ２００２；１３（Ｓｕｐｐｌ １）：Ｓ３７〜４０）。
【０００７】
毎年、ＰＤ患者の３分の１が、腹膜の有効性を喪失した後に、血液透析に移行され（Ｋａｗａｇｕｃｈｉ Ｙ．Ｐｅｒｉｔ Ｄｉａｌ Ｉｎｔ １９９９；１９：Ｓ３２７〜８）、それゆえ、慢性腎不全患者における腹膜の潜在的透析能力の増大を達成し、その平均余命を延ばすために、研究を継続しなければならない。このことは、本発明中で提供されるものなどの透析用液体において薬理学的添加物を使用して、おそらくは達成されるであろう。
【０００８】
患者１人の１年当たりのおおよその透析費用は、ほぼ６０，０００ユーロに達する。現在透析治療を必要とする多数の患者を考慮に入れると、腎不全治療の全世界にわたる費用は、１年につき総計でほぼ６００億ユーロになる。世界の人口は、１．３％の比率で増加し、一方、透析人口の増加率は、年率７〜８％で増大している（Ｌｙｓａｇｈｔ ＭＪ．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ ２００２；１３（Ｓｕｐｐｌ １）：Ｓ３７〜４０）。我々は、２０１０年までにほぼ２００万人の患者が存在するような形で、透析人口の膨大な世界的増加を、結果として経済的費用と共に経験することは明らかである。
【０００９】
代用治療を常用している腎不全患者の中で、６８％は血液透析で治療を受けており、腎臓移植で２３％が、ＰＤで９％のみが生存している。（Ｌｙｓａｇｈｔ ＭＪ．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ ２００２；１３（Ｓｕｐｐｌ １）：Ｓ３７〜４０）。ＰＤで治療される患者の進展は、相当に増大し、そのため、ＰＤは血液透析に等価な治療として現在認められている。近年、ＰＤは、少なくとも最初の４又は５年間の使用において、平均余命及び生活の質に関して、並びに妥当な費用／有効性の比率に関して、血液透析と同様に有効であることが判明している。
【００１０】
今までのところ、ＰＤは、その有用性を立証し、すべての困難を超えて確立されたその有利な特性：
特に西欧において、血液透析に比べて費用がかからない、
血液透析の平均余命と同様の、及び最初の２〜３年でより長い平均余命、
子供及び若年者に好ましい治療、
腎臓移植の前の最適な治療、
のため、血液透析に代わる優れた代替手段として、特に初期の代用治療として定着するようになった。
【００１１】
しかし、ＰＤが、広範な賛成を獲得し使用割合を高めるためには、ＰＤのより多くの使用を損なう種々の問題を解決しなければならない。２つの重要な問題点が存在する：
ＰＤは血液透析に比べて失敗率が高い。実際、中期及び長期にわたる限界濾過のより低い失敗率、改善された溶質クリアランス、並びに腹膜炎のより低い発生率を達成するための研究を継続しなければならない。
長期間の間に腹膜の構造及び機能に対してもたらされる変化のため、長期にわたるＰＤで患者を（１０年を超えて）守ることはまだ不可能である。これに関して、この腹膜損傷を回避する新たな薬理学的治療に関して実施される研究が、ＰＤの使用を増加させること、及び血液透析の使用によって現在必要とされる費用を低減することにとって非常に重要である。
【００１２】
透析用液体の低いｐＨ、その高い浸透力、液体を導入及び回収する機械的プロセス、グルコース及びその分解産物によって、腹膜透析は、腹膜腔を損傷する可能性がある生体に適合しないプロセスとなる。それゆえ、これらの溶液への暴露のインビトロ及びインビボでの効果を評価するための分子及び細胞レベルでのさらなる研究、並びにＰＤを必要とする患者で現れる可能性のある有害副作用を最小化する新たな薬理学的治療に関する研究が必要とされる。
【００１３】
アポトーシス又はプログラム細胞死は、遺伝子的に制御された細胞プロセスであり、それによって、細胞は、特定の刺激に応答してそれらの細胞自身の死を誘導する。ＰＤ液への暴露は、腹膜中皮細胞中での活性酸素種（ＲＯＳ）の発生を増加させ、アポトーシスを誘導する（Ｙａｎｇ ＡＨ、Ｃｈｅｎ ＪＹ、Ｌｉｎ ＹＰら、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ １９９７；５１：１２８０〜８）。ＲＯＳが、ｐ３８ＭＡＰＫを活性化し、アポトーシスプロセスを誘発し、透析用液体の細胞障害性を増強する可能性のある炎症促進性メディエーターの発現を増大させることが知られているので、これらの２つのプロセスは、関連している可能性がある。誘導性アポトーシスの際に、ｐ３８ＭＡＰＫのリン酸化の増加が起こること（Ｓｅｐｕｌｖｅｄａ ＪＣ、Ｍｏｒｅｎｏ Ｍａｎｚａｎｏ Ｖ、Ａｌｉｑｕｅ Ｍら、Ｎｅｆｒｏｌｏｇｉａ ２００５；２５：１３１〜４０）、及びこれに反して、抗アポトーシス治療は、ｐ３８ＭＡＰＫのリン酸化を減少させること（Ｖｏｒｏｂｉｏｖ Ｍ、Ｍａｌｋｉ Ｍ、Ｓｈｎａｉｄｅｒ Ａら、Ｐｅｒｉｔ Ｄｉａｌ Ｉｎｔ ２００８；２８：６４８〜５４）が観察されている。それゆえ、リンタンパク質３８（リン酸化−ｐ３８）ＭＡＰＫの測定は、様々な薬剤の抗アポトーシス効果を評価するのに役立つ。
【００１４】
腹膜透析用液体への暴露によって誘発されるもう１つのプロセスは、フィブロネクチンの産生である（Ｈａ Ｈ、Ｙｕ ＭＲ、Ｌｅｅ ＨＢ、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ ２００１；５９：４６３〜７０；Ｌｅｅ ＨＢ、Ｙｕ ＭＲ、Ｓｏｎｇ ＪＳら、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ ２００４；６５：１１７０〜９）。このタンパク質は、腹膜中皮細胞の線維化プロセス及び上皮間葉転換において重要である。双方のプロセスは、腹膜の透析能力の喪失に関連している。
【００１５】
ＰＤで治療される患者において、長期の透析液によって引き起こされる損傷を軽減する治療用補体が求められている。
【００１６】
レニンは、動脈圧の調節において極めて重要な役割を果たす、レニン−アンジオテンシン−アルドロステロン系の最初の酵素である。レニンは、アンジオテンシノゲンをアンジオテンシンＩに変換し、アンジオテンシンＩは、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）によってアンジオテンシンＩＩに変換される。一方で、アンジオテンシンＩＩは、動脈平滑筋の収縮をもたらし、血管収縮及び動脈圧の上昇につながる。一方で、アンジオテンシンＩＩは、腎尿細管でのナトリウム及び水の貯留、血漿量の増加、及び間接的には動脈圧の増加をもたらすアルドステロンの合成を増大させる。アリスキレン（国際公開第２００７／１４７５９６号パンフレット）は、アンジオテンシンＩのアンジオテンシンＩＩへの変換に必須であるＳ３ｂｐタンパク質に結合し、その結果、レニンの合成を妨害する（Ｒａｈｕｅｌ Ｊ、Ｒａｓｅｔｔｉ Ｖ、Ｍａｉｂａｕｍ Ｊら、Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２０００；７：４９３〜５０４）。
【００１７】
したがって、前述のすべての問題を解決する腹膜透析用の新たな溶液を開発しなければならない。この状況において、現行技術で開示されているその他の溶液の欠陥を防ぐ新たなタイプの透析液が、本発明において開発された。
【００１８】
［発明の説明］
本発明は、腹膜透析を受ける腎不全患者を治療するための、アリスキレン、少なくとも１種の電解質、少なくとも１種の緩衝液、及び少なくとも１種の浸透圧剤を含む腹膜透析液に関する。
【００１９】
この溶液は、二重の機能、すなわち、透析用液体に属する第１の又は古典的な機能、及びアリスキレンによる第２の機能を付与し、腹膜中皮細胞に対するこれらの溶液の毒性を低減する。これは、活性酸素種、ｐ３８ＭＡＰＫのリン酸化及びカスパーゼ−３の活性化、腹膜透析液中に含まれる高濃度グルコースによって生じる可能性のあるプロセスの低減のためである。
【００２０】
したがって、本発明の腹膜透析液は、酸化ストレス、アポトーシスプロセス、及び結果として起こる腹膜損傷を予防し、結果として、患者が、血液透析に移行する前に腹膜透析を利用できる期間を延長させる。
【００２１】
したがって、本発明の第１の本質的態様は、下記成分
ａ）少なくとも１種の電解質
ｂ）少なくとも１種の緩衝液
ｃ）少なくとも１種の浸透圧調節剤
ｄ）アリスキレン又はその任意の誘導体
を含む、腹膜透析液に関する。
【００２２】
好ましい実施形態において、電解質（複数可）は、次の電解質：種々の塩のＮａ＋、Ｋ＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｌ−又はこれらの任意の組合せによって構成される群から選択される。添加される電解質の濃度は、Ｎａ １００〜２００ｍｍｏｌ／ｌ、Ｋ ０〜４ｍｍｏｌ／ｌ、Ｍｇ ０．１〜２ｍｍｏｌ／ｌ、Ｃａ ０．５〜３ｍｍｏｌ／ｌ、Ｃｌ ５０〜２００ｍｍｏｌ／ｌである。
【００２３】
別の好ましい実施形態において、血液から過剰な水を除去するのに使用される腹膜透析液の浸透圧剤は、グルコース、ポリグルコース、マンニトール、グリセロール、アミノ酸、ポリペプチド、又はこれらの任意の組合せによって構成される群から非限定的に選択される。添加される浸透圧剤の量は、１００〜６００ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲にある。
【００２４】
別の好ましい実施形態によれば、アリスキレンは、腹膜に対する腹膜透析液の毒性の原因である機構、中でも酸素フリーラジカルの産生を含む機構に対するアリスキレンの抑制効果のために、ｐ３８ＭＡＰＫチャネル及びカスパーゼ−３チャネルに対するアリスキレンの抑制効果のために、腹膜透析液中、５０ｎＭ〜１ｍＭの濃度で使用される。
【化１】
【００２５】
本発明の第２の本質的な態様は、薬剤を調製するための前記腹膜透析液の使用に関する。
【００２６】
好ましい実施形態は、腎疾患を予防及び／又は治療するための薬剤を調製するための前記透析液の使用に関する。
【００２７】
別の好ましい実施形態は、腹膜中皮細胞に対する毒性を予防及び／又は治療するための薬剤を調製するための前記透析液の使用に関する。
【００２８】
別の好ましい実施形態は、活性酸素種、ｐ３８ＭＡＰＫタンパク質のリン酸化、及びカスパーゼ−３の活性化を予防及び／又は治療するための薬剤を調製するための前記透析液の使用に関する。
【００２９】
別の好ましい実施形態は、酸化ストレス、アポトーシスプロセス、腹膜細胞への損傷を引き起こす遺伝子発現、及び透析液によって生じる腹膜損傷を予防及び／又は治療するための薬剤を調製するための前記透析液の使用に関する。
【００３０】
別の好ましい実施形態は、慢性腎不全を予防及び／又は治療するための薬剤を調製するための前記透析液の使用に関する。
【００３１】
通常、本発明の腹膜透析液は、１日に４回、投与当たり２リットルの量で投与される。該溶液は、慢性腎不全を患う患者に、腹膜透析を実施するのに通常使用される方法に従って投与される。より具体的には、該溶液は、腹膜に前もって埋め込まれたカテーテルを経由して腹膜に投与される。腎不全患者の血液中に蓄積された代謝廃棄物を除去するには、通常、およそ４〜６時間を要する。
【００３２】
方法例及び本発明を支持する結果を以下で説明するが、本発明の範囲は、それらの説明に限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ラット腹膜中皮細胞の初代培養物における陽性ＨＢＭＥ−１での免疫組織化学染色を示す図である（１００倍）。
【図２】ラットＰＭＣ中での活性酸素種（ＲＯＳ）の産生に対する５０ｍＭ（Ａ）及び８３ｍＭ（Ｂ）のＤ−グルコースの効果を示す図である。細胞を担体又はＤ−グルコース（５０ｍＭ又は８３ｍＭ）中で１〜８時間インキュベートした後、フローサイトメトリーを利用してジクロロフルオレセイン（ＤＣＦ）強度を、材料及び方法に記載のように測定した。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）として表す。*ｐ＜０．０５、担体（Ｖ）と対比して。
【図３】ＰＭＣ中で５０ｍＭ（Ａ）及び８３ｍＭ（Ｂ）のＤ−グルコースによって仲介される細胞毒性におけるカスパーゼ−３の役割を示す図である。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）として表す。*ｐ＜０．０５、担体（Ｖ）と対比して。
【図４】ラットＰＭＣ中でのｐ３８マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）のリン酸化に対する、５０ｍＭ（Ａ）及び８３ｍＭ（Ｂ）のＤ−グルコースの効果を示す図である。上部パネル：代表的実験。下部パネル：担体（Ｖ）で処理された細胞に対するリン酸化−ｐ３８の正規化レベルのデンシトメトリー分析。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）として表す。*ｐ＜０．０５、担体（Ｖ）と対比して。
【図５】ラットＰＭＣに対するアリスキレンの毒性効果を示す図である。細胞を担体又はアリスキレンで７２時間処理し、細胞生存率を、培養培地中に放出されたＬＤＨを定量することによって評価した。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝１２）として表す。*ｐ＜０．０５、対照（担体）と対比して。
【図６】ラットＰＭＣ上での活性酸素種（ＲＯＳ）の産生における、５０ｍＭ（Ａ）及び８３ｍＭ（Ｂ）のＤ−グルコースによってもたらされる変化に対するアリスキレンの効果を示す図である。細胞を、５０ｍＭ（Ａ）及び８３ｍＭ（Ｂ）のＤ−グルコース中、アリスキレン（１０〜１００μＭ）の存在下又は非存在下で８時間インキュベートし、フローサイトメトリーを利用して、材料及び方法に記載のようにジクロロフルオレセイン（ＤＣＦ）強度を測定した。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）として表す。*ｐ＜０．０５、未処理細胞（対照）と対比して。＃ｐ＜０．０５、担体（０）の存在下でＤ−グルコースで処理された細胞と対比して。
【図７】ラットＰＭＣ中でのカスパーゼ−３活性における、５０ｍＭのＤ−グルコースによってもたらされる変化に対するアリスキレンの効果を示す図である。細胞を、５０ｍＭのＤ−グルコース中、アリスキレン（１０〜１００μＭ）の存在下又は非存在下で２４時間インキュベートし、カスパーゼ−３活性を材料及び方法に記載のように測定した。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）として表す。*ｐ＜０．０５、対照（Ｃ）と対比して。＃ｐ＜０．０５、未処理細胞（対照）と対比して。＃ｐ＜０．０５、担体（０）の存在下にＤ−グルコースで処理された細胞と対比して。
【図８】ラットＰＭＣ中でのｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）のリン酸化における、５０ｍＭのＤ−グルコースによってもたらされる変化に対するアリスキレンの効果を示す図である。リン酸化−ｐ３８レベルのデンシトメトリー分析は対照（Ｃ）に対して正規化した。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）として表す。*ｐ＜０．０５、未処理細胞（対照）と対比して。＃ｐ＜０．０５、担体（０）の存在下でＤ−グルコースで処理された細胞と対比して。
【図９】培養培地中で１：１に希釈された１．５％のグルコースを含むＰＤＦ（ＰＤＦ１．５％）に暴露されたラットＰＭＣ中でのコラーゲンＩの遺伝子発現に対するアリスキレンの効果を示す図である。培養培地中で１：１に希釈された１．５％ＰＤＦ中でラットＰＭＣを、担体又は種々の濃度のアリスキレン（１０〜１００μＭ）の存在下又は非存在下で２４時間インキュベートした後、全ＲＮＡを単離し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを材料及び方法に記載のように実施した。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）として表す。*ｐ＜０．０５、未処理細胞（対照）と対比して。＃ｐ＜０．０５、担体（０）の存在下に１．５％ＰＤＦで処理された細胞と対比して。
【図１０】培養培地中で１：１に希釈された１．５％のグルコースを含むＰＤＦ（ＰＤＦ１．５％）に暴露されたラットＰＭＣ中でのコラーゲンＩＩＩの遺伝子発現に対するアリスキレンの効果を示す図である。培養培地中で１：１に希釈された１．５％ＰＤＦ中でラットＰＭＣを、アリスキレン（１０〜１００μＭ）の存在下又は非存在下で２４時間インキュベートした後、全ＲＮＡを単離し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを材料及び方法に記載のように実施した。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）として表す。*ｐ＜０．０５、未処理細胞（対照）と対比して。＃ｐ＜０．０５、担体（０）の存在下に１．５％ＰＤＦで処理された細胞と対比して。
【図１１】培養培地中で１：１に希釈された１．５％のグルコースを含むＰＤＦ（ＰＤＦ１．５％）に暴露されたラットＰＭＣ中でのフィブロネクチンの遺伝子発現に対するアリスキレンの効果を示す図である。培養培地中で１：１に希釈された１．５％ＰＤＦ中でラットＰＭＣを、担体又は種々の濃度のアリスキレン（１０〜１００μＭ）の存在下又は非存在下で２４時間インキュベートした後、全ＲＮＡを単離し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを材料及び方法に記載のように実施した。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）として表す。*ｐ＜０．０５、未処理細胞（対照）と対比して。＃ｐ＜０．０５、担体（０）の存在下に１．５％ＰＤＦで処理された細胞と対比して。
【図１２】ラットにおける４週間にわたるＰＤＦへの透析後のＤ２／Ｄ０グルコースのレベルを示す図である。ラットを、４週間毎日、担体、０．１ｍｇ／ｋｇアリスキレン又は１ｍｇ／ｋｇアリスキレンを補足された担体（生理食塩水血清）、１．５％ＰＤＦ、２．３％ＰＤＦ、又は４．５％ＰＤＦに暴露した。データは、平均±ＳＥＭ（群ごとにｎ＝６のラット）として表す。*ｐ＜０．０５、アリスキレンの存在しない担体で処理された群（担体）と対比して。＃ｐ＜０．０５、アリスキレンの存在しないＰＤＦで処理されたそれぞれの群と対比して。
【図１３】ラットにおける４週間にわたるＰＤＦへの透析後のＤ２／Ｐ２クレアチニンのレベルを示す図である。ラットを、４週間毎日、担体、０．１ｍｇ／ｋｇアリスキレン又は１ｍｇ／ｋｇアリスキレンを補足された担体（生理食塩水血清）、１．５％ＰＤＦ、２．３％ＰＤＦ、又は４．５％ＰＤＦに暴露した。データは、平均中央値±ＳＥＭ（群ごとにｎ＝６のラット）として表す。*ｐ＜０．０５、アリスキレンの存在しない担体で処理された群（担体）と対比して。＃ｐ＜０．０５、アリスキレンの存在しないＰＤＦで処理されたそれぞれの群と対比して。
【図１４】ラットにおける４週間にわたるＰＤＦへの透析後のｐ５３の遺伝子発現を示す図である。ラットを、４週間毎日、０．１ｍｇ／ｋｇアリスキレン又は１ｍｇ／ｋｇアリスキレンを補足された担体（生理食塩水血清）、１．５％ＰＤＦ、２．３％ＰＤＦ、又は４．５％ＰＤＦに暴露した。データは、平均±ＳＥＭ（群ごとにｎ＝６のラット）として表す。*ｐ＜０．０５、アリスキレンの存在しない担体で処理された群（担体）と対比して。＃ｐ＜０．０５、アリスキレンの存在しないＰＤＦで処理されたそれぞれの群と対比して。
【図１５】ラットにおける４週間にわたるＰＤＦへの透析後のＢＡＸに関するｍＲＮＡのレベルを示す図である。ラットを、４週間毎日、担体、０．１ｍｇ／ｋｇアリスキレン又は１ｍｇ／ｋｇアリスキレンを補足された担体（生理食塩水血清）、１．５％ＰＤＦ、２．３％ＰＤＦ、又は４．５％ＰＤＦに暴露した。データは、平均±ＳＥＭ（群ごとにｎ＝６のラット）として表す。*ｐ＜０．０５、アリスキレンの存在しない担体で処理された群（担体）と対比して。＃ｐ＜０．０５、アリスキレンの存在しないＰＤＦで処理されたそれぞれの群と対比して。
【図１６】ラットにおける４週間にわたるＰＤＦへの透析後のＢｃｌ−２に関するｍＲＮＡのレベルを示す図である。ラットを、４週間毎日、担体、０．１ｍｇ／ｋｇアリスキレン又は１ｍｇ／ｋｇアリスキレンを補足された担体（生理食塩水血清）、１．５％ＰＤＦ、２．３％ＰＤＦ、又は４．５％ＰＤＦに暴露した。データは、平均±ＳＥＭ（群ごとにｎ＝６のラット）として表す。*ｐ＜０．０５、アリスキレンの存在しない担体で処理された群（担体）と対比して。＃ｐ＜０．０５、アリスキレンの存在しないＰＤＦで処理されたそれぞれの群と対比して。
【図１７】ラットにおける４週間にわたるＰＤＦへの透析後のフィブロネクチンに関するｍＲＮＡのレベルを示す図である。ラットを、４週間毎日、担体、０．１ｍｇ／ｋｇアリスキレン又は１ｍｇ／ｋｇアリスキレンを補足された担体（生理食塩水血清）、１．５％ＰＤＦ、２．３％ＰＤＦ、又は４．５％ＰＤＦに暴露した。データは、平均±ＳＥＭ（群ごとにｎ＝６のラット）として表す。*ｐ＜０．０５、アリスキレンの存在しない担体で処理された群（担体）と対比して。＃ｐ＜０．０５、アリスキレンの存在しないＰＤＦで処理されたそれぞれの群と対比して。
【図１８】ラットにおける４週間にわたるＰＤＦへの透析後のコラーゲンＩＩＩに関するｍＲＮＡのレベルを示す図である。ラットを、４週間毎日、担体、０．１ｍｇ／ｋｇアリスキレン又は１ｍｇ／ｋｇアリスキレンを補足された担体（生理食塩水血清）、１．５％ＰＤＦ、２．３％ＰＤＦ、又は４．５％ＰＤＦに暴露した。データは、平均±ＳＥＭ（群ごとにｎ＝６のラット）として表す。*ｐ＜０．０５、アリスキレンの存在しない担体で処理された群（担体）と対比して。＃ｐ＜０．０５、アリスキレンの存在しないＰＤＦで処理されたそれぞれの群と対比して。
【００３４】
［本発明の実施形態の実施例］
以下の実施例は本発明を例示する。しかし、これらの実施例は非限定的な例である。それらの実施例は、単に情報を提供するものであり、使用される方法論を限定するものではなく、それらの実施例を類似の結果を達成する目的のために変更することができる。
【００３５】
本明細書において、本明細書の方法、図及び実施例中で使用される記号及び慣習は、国際的な方式及び現代の科学文献、例えば医化学雑誌中で使用されるものからなる。そうでないことを指摘しない限り、すべての材料は、商業的供給業者から入手し、さらなる精製なしで使用した。具体的には、次の省略形を、実施例中、及び明細書中を通して使用することができる：ｇ（グラム）、ｍｇ（ミリグラム）、ｋｇ（キログラム）、ｍＬ（ミリリットル）、μＬ（マイクロリットル）、ｍｍｏｌ（ミリモル）、Ｍ．Ｐ（融点）、Ｈｚ（ヘルツ）、ＭＨｚ（メガヘルツ）、δ（ケミカルシフト）、ｐｐｍ（パーツパーミリオン）、ｓ（一重線）、ｄ（二重線）、ｔ（三重線）、ｑ（四重線）、ｃ（五重線）、ｍ（多重線）、Ｊ（カップリング定数）、ＮＭＲ（核磁気共鳴）、ＭＳ（質量スペクトル）、ＥＳ（エレクトロスプレー）、ｍ／ｚ（質量／電荷比）、Ａｎａｌ（元素分析）、Ｙｌｄ（収率）、ＴＥＡ（トリエチルアミン）、ＣＨ２Ｃｌ２（ジクロロメタン）、ＣＤＣｌ３（重水素化クロロホルム）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、ｉ．ｐ．（非経口投与）。温度は、すべて℃（摂氏）で表現される。
【００３６】
［実施例］
（ラット腹膜中皮細胞の培養）
ラット腹膜中皮細胞を、Ｈｊｅｌｌｅ ＪＴ、Ｇｏｌｉｎｓｋａ ＢＴ、Ｗａｔｅｒｓ ＤＣら、Ｐｅｒｉｔ Ｄｉａｌ Ｉｎｔ １９８９；９：３４１〜７中に記載のプロトコールに従って、酵素的消化により単離した。簡潔には、体重が２００〜４００ｇの雌性スプラーグドーリー系ラットを、実験及びその他の科学目的に使用される動物の保護に関する１０月１０日の勅令１２０１／２００５に従って屠殺した。腹腔を速やかに開き、腹壁（腹膜及び平滑筋）を無菌条件下で取り出した。腹壁の内部表面から、前記表面を１９９培養培地（Ｓｉｇｍａ）及び０．５ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ）中、３７℃で３０分間インキュベートする酵素的消化によって、中皮細胞を分離した。インキュベーションの後、消化された腹壁表面をかき取り、接着された中皮細胞を完全に剥離した。得られた中皮細胞を増殖及びその研究用の培養皿に播種し、１０％ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補足された１９９培地中に維持した。各培養の後、腹膜中皮細胞の存在を、その組織形態学的外観及び特異的マーカーの発現により確認した。細胞は、３〜６代の間に使用した。
【００３７】
（インビボでの研究）
動物
体重が２００〜２４０ｇの７８匹の雌性スプラーグドーリー系ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、インビボ実験に使用した。動物は、１２時間の明と１２時間の暗からなる周期で一定温度の雰囲気中に収容した。飼料及び飲料は、自由に与えた。すべての実験プロトコールは、欧州指令「欧州共同体委員会指令８６／６０９／ＥＥＣ」に従って実施した。さらに、動物実験は、アルバセテ（Ａｌｂａｃｅｔｅ）（スペイン）の大学／病院複合体の動物管理使用委員会によって承認された。さらに、動物実験は、アルバセテ（Ａｌｂａｃｅｔｅ）（スペイン）の大学／病院複合体の動物管理使用委員会によって承認された。
【００３８】
インビボ研究及び腹膜平衡試験（ＰＥＴ）の実験計画
インビボ研究のため、体重が２００〜２４０ｇの７８匹の雌性スプラーグドーリー系ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用し：高グルコース腹膜透析液（ＰＤＦ）を投与される動物に５４匹のラットを割り当て、この５４匹を、それぞれ異なるグルコース濃度を有する３種のＰＤＦ（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃａｒ、Ｂａｄ Ｈｏｍｂｕｒｇ、ドイツ）を投与するそれぞれ１８匹のラットからなる３つの異なるサブグループに分割した。さらに、１８匹のラットには担体（生理食塩水血清）を投与し、別の６匹のラットは対照群（透析なし）として使用した。「担体」群の１８匹のラット、並びに１．５％ＰＤＦ群、２．３％ＰＤＦ群及び４．５％ＰＤＦ群に属するラットをそれぞれ６匹のラットからなる別の３つのサブグループに分割した。これらの群のそれぞれに投与されるＰＤＦは、生理食塩水血清、０．１ｍｇ／ｋｇ／日のアリスキレン（Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、マサチューセッツ州、米国）又は１ｍｇ／ｋｇ／日のアリスキレンを補足した。腹膜透析のため、ラットには、４週間にわたって毎日、２２Ｇニードルを介して対応する２０ｍＬのＰＤＦを投与した。
【００３９】
実験期間（４週間）の終末時点で、２．３％のグルコースを含む３０ｍＬの市販ＰＤＦ（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃａｒ、Ｂａｎ Ｈｏｍｂｕｒｇ、ドイツ）を、２２Ｇニードルを使用して腹膜内投与した。２時間後に、動物を、ペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ）を用い腹膜内で麻酔し、心穿刺によって血液を抜き取った。次に、腹部正中切開を行い、シリンジを使用して腹膜から残量を集めた。ＰＥＴの間、動物は覚醒しており、水及び飼料を自由に入手することができた。動物の体重を、実験期間の開始及び終了時に測定した。ラットは死亡せず、すべての動物は、反復ＰＤＦ注入を含む研究中に良好な健康状態にあると思われた。
【００４０】
血液及び透析物のサンプルを遠心分離し、−２０℃で貯蔵した。血清及び透析物中のクレアチニン及びグルコースの濃度を、酵素法を使用して測定した。溶質の腹膜輸送を、一方では、ＰＤＦ中の初期グルコース濃度に対するＰＥＴの２時間後の透析物中のグルコース濃度（Ｄ２／Ｄ０グルコース）として、他方では、ＰＥＴの２時間後の透析物／血清中クレアチニン濃度比（Ｄ２／Ｐ２クレアチニン）として計算した。ＰＥＴの終了時点で、動物を、過剰用量の麻酔剤を使用して屠殺し、腹膜中皮細胞（ＰＭＣ）を単離し、本明細書において後で説明するように培養した。
【００４１】
（本発明の腹膜透析液の調製）
腹膜透析液を、表２に記載の量のアリスキレン及び表３に記載の量のグルコースを、その組成を表１に示す培地Ｍ１９９に添加することによって調製した。表２に記載のそれぞれのアリスキレン濃度と、表３に記載のグルコース濃度との組合せについて研究した。
【００４２】
【表１】
【００４３】
【表２】
【００４４】
【表３】
【００４５】
（細胞毒性研究）
毒性試験は、ラットの腹膜中皮細胞の培養物で実施し、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）酵素の活性を測定した（Ｐｏｓａｄａｓ Ｉ、Ｌｏｐｅｚ−Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ Ｂ、Ｃｌｅｍｅｎｔｅ ＭＩら、Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ ２００９；２６：１１８１〜９１）。これらの研究は、本発明の腹膜透析液の毒性を研究するために実施した。
【００４６】
この目的のため、細胞を、２４ウェルプレートに播種し、本発明の腹膜透析液対象に暴露し、それらの透析液の毒性を研究した。毒性効果は、細胞膜の破壊及び結果としての細胞上清へのＬＤＨの放出をＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）で測定して評価した。細胞を、機械的に取り出し、ＰＢＳで洗浄し、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心した。マイクロプレート分光光度計を波長４９０ｎｍで製造業者の説明書に従って使用して、細胞溶解物及び細胞上清の吸光度を得た。
【００４７】
（フローサイトメトリーを使用する活性酸素種の濃度変化の評価）
ＰＢＳで洗浄した後、細胞を、５．６−クロロメチル−２．７−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート（ＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＤＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に３７℃で１５分間、標準的プロトコールに従ってインキュベートした（Ｌｅｅ ＨＢ、２００４）。インキュベーションの後、コンディション培地を集め、細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理した。トリプシン処理細胞を濃縮培地に結合させることにより得られる懸濁液中に存在する生存及び死滅細胞のすべてを、３０００×ｇ、４℃で５分間遠心した。最後に、細胞をＰＢＳで洗浄し、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ニュージャージー州、米国）での細胞分析用の培養培地１９９中に再懸濁した。活性酸素種の産生は、実験条件ごとに１０，０００個の細胞の評価に基づいて計算した。
【００４８】
（ウェスタンブロットによるｐ３８ＭＡＰＫのリン酸化／脱リン酸化の評価）
細胞培養物の全タンパク質を得るために、培養培地を集めＰＢＳで置き換えた。細胞を、トリプシン処理によって取り出し、捕集培地に結合させた。３０００×ｇ、４℃で５分間の遠心により得られるタンパク質に富むペレットを、細胞溶解物用緩衝液（１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭ ＥＧＴＡ、０．０４％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、及び２０％グリセロール）中にプロテアーゼ阻害剤及びホスファターゼと共に再懸濁し、４℃で６０分間インキュベートした。インキュベーションの後、サンプルを、１３，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心し、上清液を−８０℃で保存した。細胞溶解物のタンパク質含有量を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を標準的プロトコール（Ｖｏｒｏｂｉｏｖ Ｍ、Ｍａｌｋｉ Ｍ、Ｓｈｎａｉｄｅｒ Ａら、Ｐｅｒｉｔ Ｄｉａｌ Ｉｎｔ ２００８；２８：６４８〜５４）に従って使用して測定した。各サンプルを、２０μｇタンパク質／ウェルの量で１０％ポリアクリルアミドゲル上にロードした。セミドライ式ブロッターを使用して、ゲルを、電気泳動によってニトロセルロース膜に転写した。ニトロセルロースに結合されたタンパク質を、ポルソーＳ染色で検視し、５％スキムミルクを含むＴＴＢＳ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５，２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ）でブロックし、続いてｐ３８ＭＡＰＫ又はリン酸化−ｐ３８ＭＡＰＫ一次抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）中、４℃で一夜インキュベートした。ＴＴＢＳで洗浄した後、二次抗体を環境温度で１時間適用した。検出は、ケミルミネセンス（ＥＣＬ）により実施した。バンドの強度は、適切な画像解析装置（Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ）を使用して、グレーレベルで定量化した。
【００４９】
（ＥＬＩＳＡによるカスパーゼ−３活性の測定）
カスパーゼ−３の活性を測定するため（Ｐｏｓａｄａｓ Ｉ、Ｖｅｌｌｅｃｃｏ Ｖ、Ｓａｎｔｏｓ Ｐら、Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ２００７；１５０：５７７〜８５）、ラットの中皮細胞を、６ウェルプレート上に８０％の集密度に到達するまで播種した。アリスキレンを含む腹膜透析液に暴露した後、培養培地を集め、ＰＢＳで置き換えた。細胞を、トリプシン処理によって取り出し、捕集培地に結合させた。３０００×ｇ、４℃で５分間の遠心により得られるタンパク質に富むペレットを、細胞溶解物用緩衝液（１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭ ＥＧＴＡ、０．０４％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、及び２０％グリセロール）中に再懸濁し、４℃で６０分間インキュベートした。インキュベーションの後、サンプルを、１３，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心し、上清液中のタンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を標準的プロトコールに従って使用して測定した。細胞抽出物（４０μｇのタンパク質）を、蛍光基質である５０μＭのＡｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−７−アミノ−４−トリフルオロメチル−クマリル（Ｚ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣ）を含む反応緩衝液（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０％ショ糖、０．１％３−［（３−クロルアミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸、１０ｍＭ ＤＴＴ）中、３７℃で１時間インキュベートした。蛍光発光を、分光蛍光光度計（Ｔｅｃａｎ、オーストリア）を用いて４００ｎｍの励起波長及び５０５ｎｍの発光波長で測定した。
【００５０】
（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ）
ＲＮＡの発現を、ＰＭＣにおいてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって評価した。全ＲＮＡを、製造業者の説明書に従って市販の反応試薬（Ｔｒｉｐｕｒｅ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）を使用して単離した。ＲＮＡの品質及び濃度は、１μＬのＲＮＡサンプルを使用し、分光光度法（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ２００、Ｔｅｃａｎ、Ｓａｌｚｂｕｒｇ、オーストリア）によって評価した。全ＲＮＡは、１８Ｓ及び２８ＳのｍＲＮＡバンドの完全性を確認するため、アガロースゲルで試験した。ｃＤＮＡは、高性能ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州）を使用して合成した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲの場合、ｃＤＮＡはＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲマスターミックスを使用し、１ステップリアルタイムＰＣＲシステム及びソフトウェアＳｔｅｐＯｎｅ ｖ２．０（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州）を用いて増幅した。増幅には次のプライマー対を使用した：フィブロネクチンでは５’−ＧＣＡ−ＣＡＧ−ＧＧＧ−ＡＡＧ−ＡＡＡ−ＡＧＧ−ＡＧ−３’（センス）及び５’-ＴＴＧ−ＡＧＴ−ＧＧＡ−ＴＧＧ−ＧＡＧ−ＧＡＧ−ＡＧ−３’（アンチセンス）；コラーゲンＩでは５’−ＴＣＡ−ＣＣＴ−ＡＣＡ−ＧＣＡ−ＣＧＣ−ＴＴＧ−３’（センス）及び５’−ＧＧＴ−ＣＴＧ−ＴＴＴ−ＣＣＡ−ＧＧＧ−ＴＴＧ−３’（アンチセンス）；コラーゲンＩＩＩでは５’−ＡＴＡ−ＴＣＡ−ＡＡＣ−ＡＣＧ−ＣＡＡ−ＧＧＣ−３’（センス）及び５’−ＧＡＴ−ＴＡＡ−ＡＧＣ−ＡＡＧ−ＡＧＧ−ＡＡＣ−ＡＣ−３’（アンチセンス）；Ｐ５３では５’−ＣＣＴ−ＣＣＴ−ＣＡＧ−ＣＡＴ−ＣＴＴ−ＡＴＣ−ＣＧ−３’（センス）及び５’−ＣＡＣ−ＡＡＡ−ＣＡＣ−ＧＣＡ−ＣＣＴ−ＣＡＡ−Ａ−３’（アンチセンス）；ＢＡＸでは５’−ＧＡＴ−ＧＣＧ−ＴＣＣ−ＡＣＣ−ＡＡＧ−ＡＡ−３’（センス）及び５’−ＡＧＴ−ＡＧＡ−ＡＧＡ−ＧＧＧ−ＣＡＡ−ＣＣＡ−Ｃ−３’（アンチセンス）；並びにＢｃｌ−２では５’−ＣＣＣ−ＡＡＧ−ＧＧＡ−ＡＧＡ−ＣＧＡ−ＴＧ−３’（センス）及び５’−ＧＡＧ−ＣＧＧ−ＧＴＡ−ＧＧＧ−ＡＡＡ−ＧＡ−３’（アンチセンス）。該プライマー配列は、６０℃に近いアニーリング温度を有する。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ反応は、９５℃で１０分間、続いて９５℃で１５秒間、６０℃で１分間の４０サイクルで実施した。解離曲線を分析して単一ＰＣＲ産物の増幅を確認した。すべてのサンプルをトリプリケートで処理した。各実験において、平均サイクル閾値（ＣＴ）を、調べる各遺伝子についてトリプリケートから計算し、種々の処置後の遺伝子発現の比較を可能にした（Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５、４０２〜４０８（２００１））。データを正規化するため、β−アクチンの遺伝子発現を内在性対照として使用した。
【００５１】
（データの収集及び解析）
得られた各値は、デュプリケートで実施された少なくとも３回の実験に対応する。すべてのデータは平均±ＳＥＭとして提示される。解析されるパラメーターのそれぞれに関する群間差を、ノンパラメトリックＡＮＯＶＡ検定（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ）、続いてホック検定（Ｄｕｎｎｅｔｔ）を使用して解析した。０．０５以下のｐ値を有意とみなした。ＳＰＳＳ１３．０（Ｃｈｉｃａｇｏ、イリノイ州）ソフトウェアを使用して統計解析を実施した。
【００５２】
（結果）
本発明の実験で使用される中皮細胞培養物は、ＨＢＭＥ−１に反応性を示す（図１）。
【００５３】
透析用液体中の種々の濃度のグルコースへの暴露時間を増加させることは、中皮細胞に対して毒性があり、腹膜に対する腹膜透析液の毒性の基礎を構成する。グルコースへの暴露時間の増加は、中皮細胞中での遊離ラジカルの産生を増大させることが観察できる（図２）。
【００５４】
この遊離ラジカルの産生のため、カスパーゼ−３の活性化などの細胞死のエフェクター機構が活性化される（図３）。
【００５５】
高グルコース濃度の溶液への暴露は、中皮細胞における毒性指標と考えられるｐ３８タンパク質のリン酸化を増大させる（図４）。
【００５６】
培養培地へのアリスキレンの添加は、１ｍＭの濃度に達するまで中皮細胞に対して毒性を示さなかった（図５）。
【００５７】
透析培地へのアリスキレンの添加は、培養された腹膜細胞における活性酸素種の産生（図６）及びカスパーゼの活性化（図７）、並びにタンパク質ｐ３８のリン酸化（図８）の双方を予防した。
【００５８】
透析培地へのアリスキレンの添加は、培養された腹膜細胞における腹膜線維症のマーカーであるコラーゲンＩ（図９）、コラーゲンＩＩＩ（図１０）、及びフィブロネクチン（図１１）に関するｍＲＮＡレベルを低下させた。
【００５９】
透析培地中でのアリスキレンの存在は、透析されたラットにおけるインビボでの腹膜損傷を低減した（図１２及び１３）。
【００６０】
ラットにおける長期腹膜分析中にアリスキレンが存在することは、前記ラットから得られた腹膜細胞中での、アポトーシス促進性タンパク質ｐ５３（図１４）及びＢａｘ（図１５）に関するｍＲＮＡの発現を低減した。
【００６１】
ラットにおける長期腹膜透析中にアリスキレンが存在することは、前記ラットから得られる腹膜細胞中での、抗アポトーシス性タンパク質Ｂｃｌ−２に関するｍＲＮＡの発現を増加した（図１６）。
【００６２】
ラットにおける長期腹膜透析中にアリスキレンが存在することは、前記ラットから得られる腹膜細胞中での、腹膜線維症のマーカーであるフィブロネクチン（図１７）及びコラーゲンＩＩＩ（図１８）に関するｍＲＮＡの発現を増大させた。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［説明］
本発明は、アリスキレン、少なくとも１種の電解質、少なくとも１種の緩衝液、及び少なくとも１種の浸透圧剤を含むタイプの腹膜透析液に関する。この透析液は、これらの常用腹膜透析液の腹膜中皮細胞に対する毒性の低減を可能にする。一方で、本発明は、慢性腎不全の場合のように腹膜透析が必要とされるプロセスのためのこのタイプの溶液の使用に関する。
【０００２】
［従来の技術］
腹膜透析（ＰＤ）は、慢性腎不全に有効な療法であり、腹膜を、血液から尿素及びカリウムなどの有害物質並びに過剰な液体を除去するための半透膜として利用する。ＰＤは、患者の家庭又は職場で通常実施されるという事実のため、この治療を受ける患者は、病院に頻繁に滞在することなしに、活動的な生活を送ることができる利点を有する（Ｇｒａｓｓｍａｎｎ Ａ、Ｇｉｏｂｅｒｇｅ Ｓ、Ｍｏｅｌｌｅｒ Ｓら、Ｎｅｐｈｒｏｌ Ｄｉａｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ２００５；２０：２５８７〜９３及びＢｕｒｋａｒｔ ＪＭ、Ｎｏｌｐｈ ＫＤ．ＮＩＤＤＫ ２００６；６：１〜２４）。
【０００３】
最大限の無菌状態を確実にするように特別に設計された新たな連結システムの出現以来、その発生率は劇的に低下したが、この透析法の主な欠点は、腹膜感染症（腹膜炎）になる傾向があることである。一方で、腹膜機能の劣化速度に影響を及ぼす因子は完全には明らかでないが、透析用液体への継続的暴露は、腹膜の透析能力の劣化を引き起こし、これは線維症及び血管症に関連している（Ｇｉｌｌｅｒｏｔ Ｇ、Ｄｅｖｕｙｓｔ Ｏ、Ｃｌｉｎ Ｎｅｐｈｒｏｌ ２００３；６０：１〜６）。
【０００４】
腹膜を構成する中皮細胞の、高い浸透圧濃度及びグルコース濃度を有する透析用液体への継続的暴露の結果としての変化は、腹膜機能不全に関係する機構の１つである可能性がある（Ｃｏｌｅｓ ＧＡ、Ｔｏｐｌｅｙ Ｎ、Ａｄｖ Ｒｅｎ Ｒｅｐｌａｃｅ Ｔｈｅｒ ２０００；７：２８９〜３０１）。サイトカイン、ホルモン、感染症又は薬物などの多くのタイプの刺激がアポトーシスを誘導することが知られている（Ｃａｔａｌａｎ ＭＰ、Ｓｕｂｉｒａ Ｄ、Ｒｅｙｅｒｏ Ａら、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ ２００３；６４：３２１〜３０；Ｚｈｅｎｇ Ｚ、Ｙｅ Ｒ、Ｙｕ Ｘら、Ａｄｖ Ｐｅｒｉｔ Ｄｉａｌ ２００１；１７：５３〜７）。さらに、高濃度のグルコースは、中皮細胞を含めて多くの細胞型においてアポトーシスを誘導することが知られている（Ｓｈａｒｉｆｉ ＡＭ、Ｍｏｕｓａｖｉ ＳＨ、Ｆａｒｈａｄｉ Ｍら、Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ ２００７；１０４：２５８〜６２）。
【０００５】
腹膜中皮細胞培養物で実施される研究に加えて、最も高頻度に使用されるＰＤ動物モデルはラットである（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｍａｔｅｏ ＧＴ、Ｌｏｕｒｅｉｒｏ−Ａｌｖａｒｅｚ Ｊ、Ｒａｙｅｇｏ−Ｍａｔｅｏｓ Ｓら、Ｎｅｆｒｏｌｏｇｉａ ２００８；２８（Ｓｕｐｐｌ ６）：１７〜２２）。これらのモデルで実施された初期の研究は、透析用液体の生体適合性、透析用液体への暴露に対して腹膜中で発現される炎症応答、血管新生及び腹膜の浸透性又は線維症における血管網の重要性、並びに腹膜損傷に対する腹膜炎の寄与に焦点が当てられてきた（Ｋｒｅｄｉｅｔ ＲＴ、Ｚｗｅｅｒｓ ＭＭ、Ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａｌ ＡＣら、Ｐｅｒｉｔ Ｄｉａｌ Ｉｎｔ ２０００；２０（Ｓｕｐｐｌ ２）：Ｓ１９〜２５）；Ｂａｚａｒｇａｎｉ Ｆ．Ｓｗｅｄ Ｄｅｎｔ Ｊ Ｓｕｐｐｌ ２００５；１７１：１〜５７；Ｈｕｒｓｔ ＳＭ、ＭｃＬｏｕｇｈｌｉｎ ＲＭ、Ｍｏｎｓｌｏｗ Ｊら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００２；１６９：５２４４〜５１；Ｋｉｍ ＹＬ、Ｄｏ Ｊ、Ｐａｒｋ ＳＨら、Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ（Ｃａｒｌｔｏｎ）２００３；８（Ｓｕｐｐｌ）：Ｓ２８〜３２；Ｇｉｌｌｅｒｏｔ Ｇ、Ｄｅｖｕｙｓｔ Ｏ．Ｃｌｉｎ Ｎｅｐｈｒｏｌ ２００３；６０：１〜６；Ｌａｍｅｉｒｅ Ｎ、Ｖａｎ Ｂｉｅｓｅｎ Ｗ、Ｍｏｒｔｉｅｒ Ｓら、Ｃｏｎｔｒｉｂ Ｎｅｐｈｒｏｌ ２００６；１５０：７０〜６；Ｍａｒｇｅｔｔｓ ＰＪ、Ｂｏｎｎｉａｕｄ Ｐ、Ｌｉｕ Ｌら、Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ ２００５；１６：４２５〜３６；Ｍａｒｇｅｔｔｓ ＰＪ、Ｋｏｌｂ Ｍ、Ｇａｌｔ Ｔら、Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ ２００１；１２：２０２９〜３９）。
【０００６】
ＰＤの研究は、初めは尿毒症の事例、続いて急性又は慢性腎不全の事例に関して研究された、２０世紀中頃にさかのぼる。しかし、その継続的な外来患者モダリティーにおいて現在理解されているようなＰＤは、１９７８年に、Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＲＰ、Ｍｏｎｃｒｉｅｆ ＪＷ、Ｎｏｌｐｈ ＫＤらによって考え出された（Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ １９９９；１０：９０１〜１０）。それ以来、ＰＤの使用は、ますます広がり、世界的には１８０，０００人を超える患者にまで拡大している（Ｌｙｓａｇｈｔ ＭＪ、Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ ２００２；１３（Ｓｕｐｐｌ １）：Ｓ３７〜４０）。近年における増加は、それぞれの国で極めて多様であり、メキシコでは９０％に、スカンジナビア諸国及びカナダでは３０〜５０％に、米国では１７％に、中央及び南ヨーロッパ諸国では８〜１１％に、日本では５％に達する（Ｌｙｓａｇｈｔ ＭＪ．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ ２００２；１３（Ｓｕｐｐｌ １）：Ｓ３７〜４０）。
【０００７】
毎年、ＰＤ患者の３分の１が、腹膜の有効性を喪失した後に、血液透析に移行され（Ｋａｗａｇｕｃｈｉ Ｙ．Ｐｅｒｉｔ Ｄｉａｌ Ｉｎｔ １９９９；１９：Ｓ３２７〜８）、それゆえ、慢性腎不全患者における腹膜の潜在的透析能力の増大を達成し、その平均余命を延ばすために、研究を継続しなければならない。このことは、本発明中で提供されるものなどの透析用液体において薬理学的添加物を使用して、おそらくは達成されるであろう。
【０００８】
患者１人の１年当たりのおおよその透析費用は、ほぼ６０，０００ユーロに達する。現在透析治療を必要とする多数の患者を考慮に入れると、腎不全治療の全世界にわたる費用は、１年につき総計でほぼ６００億ユーロになる。世界の人口は、１．３％の比率で増加し、一方、透析人口の増加率は、年率７〜８％で増大している（Ｌｙｓａｇｈｔ ＭＪ．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ ２００２；１３（Ｓｕｐｐｌ １）：Ｓ３７〜４０）。我々は、２０１０年までにほぼ２００万人の患者が存在するような形で、透析人口の膨大な世界的増加を、結果として経済的費用と共に経験することは明らかである。
【０００９】
代用治療を常用している腎不全患者の中で、６８％は血液透析で治療を受けており、腎臓移植で２３％が、ＰＤで９％のみが生存している。（Ｌｙｓａｇｈｔ ＭＪ．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ ２００２；１３（Ｓｕｐｐｌ １）：Ｓ３７〜４０）。ＰＤで治療される患者の進展は、相当に増大し、そのため、ＰＤは血液透析に等価な治療として現在認められている。近年、ＰＤは、少なくとも最初の４又は５年間の使用において、平均余命及び生活の質に関して、並びに妥当な費用／有効性の比率に関して、血液透析と同様に有効であることが判明している。
【００１０】
今までのところ、ＰＤは、その有用性を立証し、すべての困難を超えて確立されたその有利な特性：
特に西欧において、血液透析に比べて費用がかからない、
血液透析の平均余命と同様の、及び最初の２〜３年でより長い平均余命、
子供及び若年者に好ましい治療、
腎臓移植の前の最適な治療、
のため、血液透析に代わる優れた代替手段として、特に初期の代用治療として定着するようになった。
【００１１】
しかし、ＰＤが、広範な賛成を獲得し使用割合を高めるためには、ＰＤのより多くの使用を損なう種々の問題を解決しなければならない。２つの重要な問題点が存在する：
ＰＤは血液透析に比べて失敗率が高い。実際、中期及び長期にわたる限界濾過のより低い失敗率、改善された溶質クリアランス、並びに腹膜炎のより低い発生率を達成するための研究を継続しなければならない。
長期間の間に腹膜の構造及び機能に対してもたらされる変化のため、長期にわたるＰＤで患者を（１０年を超えて）守ることはまだ不可能である。これに関して、この腹膜損傷を回避する新たな薬理学的治療に関して実施される研究が、ＰＤの使用を増加させること、及び血液透析の使用によって現在必要とされる費用を低減することにとって非常に重要である。
【００１２】
透析用液体の低いｐＨ、その高い浸透力、液体を導入及び回収する機械的プロセス、グルコース及びその分解産物によって、腹膜透析は、腹膜腔を損傷する可能性がある生体に適合しないプロセスとなる。それゆえ、これらの溶液への暴露のインビトロ及びインビボでの効果を評価するための分子及び細胞レベルでのさらなる研究、並びにＰＤを必要とする患者で現れる可能性のある有害副作用を最小化する新たな薬理学的治療に関する研究が必要とされる。
【００１３】
アポトーシス又はプログラム細胞死は、遺伝子的に制御された細胞プロセスであり、それによって、細胞は、特定の刺激に応答してそれらの細胞自身の死を誘導する。ＰＤ液への暴露は、腹膜中皮細胞中での活性酸素種（ＲＯＳ）の発生を増加させ、アポトーシスを誘導する（Ｙａｎｇ ＡＨ、Ｃｈｅｎ ＪＹ、Ｌｉｎ ＹＰら、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ １９９７；５１：１２８０〜８）。ＲＯＳが、ｐ３８ＭＡＰＫを活性化し、アポトーシスプロセスを誘発し、透析用液体の細胞障害性を増強する可能性のある炎症促進性メディエーターの発現を増大させることが知られているので、これらの２つのプロセスは、関連している可能性がある。誘導性アポトーシスの際に、ｐ３８ＭＡＰＫのリン酸化の増加が起こること（Ｓｅｐｕｌｖｅｄａ ＪＣ、Ｍｏｒｅｎｏ Ｍａｎｚａｎｏ Ｖ、Ａｌｉｑｕｅ Ｍら、Ｎｅｆｒｏｌｏｇｉａ ２００５；２５：１３１〜４０）、及びこれに反して、抗アポトーシス治療は、ｐ３８ＭＡＰＫのリン酸化を減少させること（Ｖｏｒｏｂｉｏｖ Ｍ、Ｍａｌｋｉ Ｍ、Ｓｈｎａｉｄｅｒ Ａら、Ｐｅｒｉｔ Ｄｉａｌ Ｉｎｔ ２００８；２８：６４８〜５４）が観察されている。それゆえ、リンタンパク質３８（リン酸化−ｐ３８）ＭＡＰＫの測定は、様々な薬剤の抗アポトーシス効果を評価するのに役立つ。
【００１４】
腹膜透析用液体への暴露によって誘発されるもう１つのプロセスは、フィブロネクチンの産生である（Ｈａ Ｈ、Ｙｕ ＭＲ、Ｌｅｅ ＨＢ、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ ２００１；５９：４６３〜７０；Ｌｅｅ ＨＢ、Ｙｕ ＭＲ、Ｓｏｎｇ ＪＳら、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ ２００４；６５：１１７０〜９）。このタンパク質は、腹膜中皮細胞の線維化プロセス及び上皮間葉転換において重要である。双方のプロセスは、腹膜の透析能力の喪失に関連している。
【００１５】
ＰＤで治療される患者において、長期の透析液によって引き起こされる損傷を軽減する治療用補体が求められている。
【００１６】
レニンは、動脈圧の調節において極めて重要な役割を果たす、レニン−アンジオテンシン−アルドロステロン系の最初の酵素である。レニンは、アンジオテンシノゲンをアンジオテンシンＩに変換し、アンジオテンシンＩは、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）によってアンジオテンシンＩＩに変換される。一方で、アンジオテンシンＩＩは、動脈平滑筋の収縮をもたらし、血管収縮及び動脈圧の上昇につながる。一方で、アンジオテンシンＩＩは、腎尿細管でのナトリウム及び水の貯留、血漿量の増加、及び間接的には動脈圧の増加をもたらすアルドステロンの合成を増大させる。アリスキレン（国際公開第２００７／１４７５９６号パンフレット）は、アンジオテンシンＩのアンジオテンシンＩＩへの変換に必須であるＳ３ｂｐタンパク質に結合し、その結果、レニンの合成を妨害する（Ｒａｈｕｅｌ Ｊ、Ｒａｓｅｔｔｉ Ｖ、Ｍａｉｂａｕｍ Ｊら、Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２０００；７：４９３〜５０４）。
【００１７】
したがって、前述のすべての問題を解決する腹膜透析用の新たな溶液を開発しなければならない。この状況において、現行技術で開示されているその他の溶液の欠陥を防ぐ新たなタイプの透析液が、本発明において開発された。
【００１８】
［発明の説明］
本発明は、腹膜透析を受ける腎不全患者を治療するための、アリスキレン、少なくとも１種の電解質、少なくとも１種の緩衝液、及び少なくとも１種の浸透圧剤を含む腹膜透析液に関する。
【００１９】
この溶液は、二重の機能、すなわち、透析用液体に属する第１の又は古典的な機能、及びアリスキレンによる第２の機能を付与し、腹膜中皮細胞に対するこれらの溶液の毒性を低減する。これは、活性酸素種、ｐ３８ＭＡＰＫのリン酸化及びカスパーゼ−３の活性化、腹膜透析液中に含まれる高濃度グルコースによって生じる可能性のあるプロセスの低減のためである。
【００２０】
したがって、本発明の腹膜透析液は、酸化ストレス、アポトーシスプロセス、及び結果として起こる腹膜損傷を予防し、結果として、患者が、血液透析に移行する前に腹膜透析を利用できる期間を延長させる。
【００２１】
したがって、本発明の第１の本質的態様は、下記成分
ａ）少なくとも１種の電解質
ｂ）少なくとも１種の緩衝液
ｃ）少なくとも１種の浸透圧調節剤
ｄ）アリスキレン又はその任意の誘導体
を含む、腹膜透析液に関する。
【００２２】
好ましい実施形態において、電解質（複数可）は、次の電解質：種々の塩のＮａ＋、Ｋ＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｌ−又はこれらの任意の組合せによって構成される群から選択される。添加される電解質の濃度は、Ｎａ １００〜２００ｍｍｏｌ／ｌ、Ｋ ０〜４ｍｍｏｌ／ｌ、Ｍｇ ０．１〜２ｍｍｏｌ／ｌ、Ｃａ ０．５〜３ｍｍｏｌ／ｌ、Ｃｌ ５０〜２００ｍｍｏｌ／ｌである。
【００２３】
別の好ましい実施形態において、血液から過剰な水を除去するのに使用される腹膜透析液の浸透圧剤は、グルコース、ポリグルコース、マンニトール、グリセロール、アミノ酸、ポリペプチド、又はこれらの任意の組合せによって構成される群から非限定的に選択される。添加される浸透圧剤の量は、１００〜６００ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲にある。
【００２４】
別の好ましい実施形態によれば、アリスキレンは、腹膜に対する腹膜透析液の毒性の原因である機構、中でも酸素フリーラジカルの産生を含む機構に対するアリスキレンの抑制効果のために、ｐ３８ＭＡＰＫチャネル及びカスパーゼ−３チャネルに対するアリスキレンの抑制効果のために、腹膜透析液中、５０ｎＭ〜１ｍＭの濃度で使用される。
【化１】
【００２５】
本発明の第２の本質的な態様は、薬剤を調製するための前記腹膜透析液の使用に関する。
【００２６】
好ましい実施形態は、腎疾患を予防及び／又は治療するための薬剤を調製するための前記透析液の使用に関する。
【００２７】
別の好ましい実施形態は、腹膜中皮細胞に対する毒性を予防及び／又は治療するための薬剤を調製するための前記透析液の使用に関する。
【００２８】
別の好ましい実施形態は、活性酸素種、ｐ３８ＭＡＰＫタンパク質のリン酸化、及びカスパーゼ−３の活性化を予防及び／又は治療するための薬剤を調製するための前記透析液の使用に関する。
【００２９】
別の好ましい実施形態は、酸化ストレス、アポトーシスプロセス、腹膜細胞への損傷を引き起こす遺伝子発現、及び透析液によって生じる腹膜損傷を予防及び／又は治療するための薬剤を調製するための前記透析液の使用に関する。
【００３０】
別の好ましい実施形態は、慢性腎不全を予防及び／又は治療するための薬剤を調製するための前記透析液の使用に関する。
【００３１】
通常、本発明の腹膜透析液は、１日に４回、投与当たり２リットルの量で投与される。該溶液は、慢性腎不全を患う患者に、腹膜透析を実施するのに通常使用される方法に従って投与される。より具体的には、該溶液は、腹膜に前もって埋め込まれたカテーテルを経由して腹膜に投与される。腎不全患者の血液中に蓄積された代謝廃棄物を除去するには、通常、およそ４〜６時間を要する。
【００３２】
方法例及び本発明を支持する結果を以下で説明するが、本発明の範囲は、それらの説明に限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ラット腹膜中皮細胞の初代培養物における陽性ＨＢＭＥ−１での免疫組織化学染色を示す図である（１００倍）。
【図２】ラットＰＭＣ中での活性酸素種（ＲＯＳ）の産生に対する５０ｍＭ（Ａ）及び８３ｍＭ（Ｂ）のＤ−グルコースの効果を示す図である。細胞を担体又はＤ−グルコース（５０ｍＭ又は８３ｍＭ）中で１〜８時間インキュベートした後、フローサイトメトリーを利用してジクロロフルオレセイン（ＤＣＦ）強度を、材料及び方法に記載のように測定した。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）として表す。*ｐ＜０．０５、担体（Ｖ）と対比して。
【図３】ＰＭＣ中で５０ｍＭ（Ａ）及び８３ｍＭ（Ｂ）のＤ−グルコースによって仲介される細胞毒性におけるカスパーゼ−３の役割を示す図である。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）として表す。*ｐ＜０．０５、担体（Ｖ）と対比して。
【図４】ラットＰＭＣ中でのｐ３８マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）のリン酸化に対する、５０ｍＭ（Ａ）及び８３ｍＭ（Ｂ）のＤ−グルコースの効果を示す図である。上部パネル：代表的実験。下部パネル：担体（Ｖ）で処理された細胞に対するリン酸化−ｐ３８の正規化レベルのデンシトメトリー分析。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）として表す。*ｐ＜０．０５、担体（Ｖ）と対比して。
【図５】ラットＰＭＣに対するアリスキレンの毒性効果を示す図である。細胞を担体又はアリスキレンで７２時間処理し、細胞生存率を、培養培地中に放出されたＬＤＨを定量することによって評価した。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝１２）として表す。*ｐ＜０．０５、対照（担体）と対比して。
【図６】ラットＰＭＣ上での活性酸素種（ＲＯＳ）の産生における、５０ｍＭ（Ａ）及び８３ｍＭ（Ｂ）のＤ−グルコースによってもたらされる変化に対するアリスキレンの効果を示す図である。細胞を、５０ｍＭ（Ａ）及び８３ｍＭ（Ｂ）のＤ−グルコース中、アリスキレン（１０〜１００μＭ）の存在下又は非存在下で８時間インキュベートし、フローサイトメトリーを利用して、材料及び方法に記載のようにジクロロフルオレセイン（ＤＣＦ）強度を測定した。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）として表す。*ｐ＜０．０５、未処理細胞（対照）と対比して。＃ｐ＜０．０５、担体（０）の存在下でＤ−グルコースで処理された細胞と対比して。
【図７】ラットＰＭＣ中でのカスパーゼ−３活性における、５０ｍＭのＤ−グルコースによってもたらされる変化に対するアリスキレンの効果を示す図である。細胞を、５０ｍＭのＤ−グルコース中、アリスキレン（１０〜１００μＭ）の存在下又は非存在下で２４時間インキュベートし、カスパーゼ−３活性を材料及び方法に記載のように測定した。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）として表す。*ｐ＜０．０５、対照（Ｃ）と対比して。＃ｐ＜０．０５、未処理細胞（対照）と対比して。＃ｐ＜０．０５、担体（０）の存在下にＤ−グルコースで処理された細胞と対比して。
【図８】ラットＰＭＣ中でのｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）のリン酸化における、５０ｍＭのＤ−グルコースによってもたらされる変化に対するアリスキレンの効果を示す図である。リン酸化−ｐ３８レベルのデンシトメトリー分析は対照（Ｃ）に対して正規化した。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）として表す。*ｐ＜０．０５、未処理細胞（対照）と対比して。＃ｐ＜０．０５、担体（０）の存在下でＤ−グルコースで処理された細胞と対比して。
【図９】培養培地中で１：１に希釈された１．５％のグルコースを含むＰＤＦ（ＰＤＦ１．５％）に暴露されたラットＰＭＣ中でのコラーゲンＩの遺伝子発現に対するアリスキレンの効果を示す図である。培養培地中で１：１に希釈された１．５％ＰＤＦ中でラットＰＭＣを、担体又は種々の濃度のアリスキレン（１０〜１００μＭ）の存在下又は非存在下で２４時間インキュベートした後、全ＲＮＡを単離し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを材料及び方法に記載のように実施した。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）として表す。*ｐ＜０．０５、未処理細胞（対照）と対比して。＃ｐ＜０．０５、担体（０）の存在下に１．５％ＰＤＦで処理された細胞と対比して。
【図１０】培養培地中で１：１に希釈された１．５％のグルコースを含むＰＤＦ（ＰＤＦ１．５％）に暴露されたラットＰＭＣ中でのコラーゲンＩＩＩの遺伝子発現に対するアリスキレンの効果を示す図である。培養培地中で１：１に希釈された１．５％ＰＤＦ中でラットＰＭＣを、アリスキレン（１０〜１００μＭ）の存在下又は非存在下で２４時間インキュベートした後、全ＲＮＡを単離し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを材料及び方法に記載のように実施した。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）として表す。*ｐ＜０．０５、未処理細胞（対照）と対比して。＃ｐ＜０．０５、担体（０）の存在下に１．５％ＰＤＦで処理された細胞と対比して。
【図１１】培養培地中で１：１に希釈された１．５％のグルコースを含むＰＤＦ（ＰＤＦ１．５％）に暴露されたラットＰＭＣ中でのフィブロネクチンの遺伝子発現に対するアリスキレンの効果を示す図である。培養培地中で１：１に希釈された１．５％ＰＤＦ中でラットＰＭＣを、担体又は種々の濃度のアリスキレン（１０〜１００μＭ）の存在下又は非存在下で２４時間インキュベートした後、全ＲＮＡを単離し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを材料及び方法に記載のように実施した。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）として表す。*ｐ＜０．０５、未処理細胞（対照）と対比して。＃ｐ＜０．０５、担体（０）の存在下に１．５％ＰＤＦで処理された細胞と対比して。
【図１２】ラットにおける４週間にわたるＰＤＦへの透析後のＤ２／Ｄ０グルコースのレベルを示す図である。ラットを、４週間毎日、担体、０．１ｍｇ／ｋｇアリスキレン又は１ｍｇ／ｋｇアリスキレンを補足された担体（生理食塩水血清）、１．５％ＰＤＦ、２．３％ＰＤＦ、又は４．５％ＰＤＦに暴露した。データは、平均±ＳＥＭ（群ごとにｎ＝６のラット）として表す。*ｐ＜０．０５、アリスキレンの存在しない担体で処理された群（担体）と対比して。＃ｐ＜０．０５、アリスキレンの存在しないＰＤＦで処理されたそれぞれの群と対比して。
【図１３】ラットにおける４週間にわたるＰＤＦへの透析後のＤ２／Ｐ２クレアチニンのレベルを示す図である。ラットを、４週間毎日、担体、０．１ｍｇ／ｋｇアリスキレン又は１ｍｇ／ｋｇアリスキレンを補足された担体（生理食塩水血清）、１．５％ＰＤＦ、２．３％ＰＤＦ、又は４．５％ＰＤＦに暴露した。データは、平均中央値±ＳＥＭ（群ごとにｎ＝６のラット）として表す。*ｐ＜０．０５、アリスキレンの存在しない担体で処理された群（担体）と対比して。＃ｐ＜０．０５、アリスキレンの存在しないＰＤＦで処理されたそれぞれの群と対比して。
【図１４】ラットにおける４週間にわたるＰＤＦへの透析後のｐ５３の遺伝子発現を示す図である。ラットを、４週間毎日、０．１ｍｇ／ｋｇアリスキレン又は１ｍｇ／ｋｇアリスキレンを補足された担体（生理食塩水血清）、１．５％ＰＤＦ、２．３％ＰＤＦ、又は４．５％ＰＤＦに暴露した。データは、平均±ＳＥＭ（群ごとにｎ＝６のラット）として表す。*ｐ＜０．０５、アリスキレンの存在しない担体で処理された群（担体）と対比して。＃ｐ＜０．０５、アリスキレンの存在しないＰＤＦで処理されたそれぞれの群と対比して。
【図１５】ラットにおける４週間にわたるＰＤＦへの透析後のＢＡＸに関するｍＲＮＡのレベルを示す図である。ラットを、４週間毎日、担体、０．１ｍｇ／ｋｇアリスキレン又は１ｍｇ／ｋｇアリスキレンを補足された担体（生理食塩水血清）、１．５％ＰＤＦ、２．３％ＰＤＦ、又は４．５％ＰＤＦに暴露した。データは、平均±ＳＥＭ（群ごとにｎ＝６のラット）として表す。*ｐ＜０．０５、アリスキレンの存在しない担体で処理された群（担体）と対比して。＃ｐ＜０．０５、アリスキレンの存在しないＰＤＦで処理されたそれぞれの群と対比して。
【図１６】ラットにおける４週間にわたるＰＤＦへの透析後のＢｃｌ−２に関するｍＲＮＡのレベルを示す図である。ラットを、４週間毎日、担体、０．１ｍｇ／ｋｇアリスキレン又は１ｍｇ／ｋｇアリスキレンを補足された担体（生理食塩水血清）、１．５％ＰＤＦ、２．３％ＰＤＦ、又は４．５％ＰＤＦに暴露した。データは、平均±ＳＥＭ（群ごとにｎ＝６のラット）として表す。*ｐ＜０．０５、アリスキレンの存在しない担体で処理された群（担体）と対比して。＃ｐ＜０．０５、アリスキレンの存在しないＰＤＦで処理されたそれぞれの群と対比して。
【図１７】ラットにおける４週間にわたるＰＤＦへの透析後のフィブロネクチンに関するｍＲＮＡのレベルを示す図である。ラットを、４週間毎日、担体、０．１ｍｇ／ｋｇアリスキレン又は１ｍｇ／ｋｇアリスキレンを補足された担体（生理食塩水血清）、１．５％ＰＤＦ、２．３％ＰＤＦ、又は４．５％ＰＤＦに暴露した。データは、平均±ＳＥＭ（群ごとにｎ＝６のラット）として表す。*ｐ＜０．０５、アリスキレンの存在しない担体で処理された群（担体）と対比して。＃ｐ＜０．０５、アリスキレンの存在しないＰＤＦで処理されたそれぞれの群と対比して。
【図１８】ラットにおける４週間にわたるＰＤＦへの透析後のコラーゲンＩＩＩに関するｍＲＮＡのレベルを示す図である。ラットを、４週間毎日、担体、０．１ｍｇ／ｋｇアリスキレン又は１ｍｇ／ｋｇアリスキレンを補足された担体（生理食塩水血清）、１．５％ＰＤＦ、２．３％ＰＤＦ、又は４．５％ＰＤＦに暴露した。データは、平均±ＳＥＭ（群ごとにｎ＝６のラット）として表す。*ｐ＜０．０５、アリスキレンの存在しない担体で処理された群（担体）と対比して。＃ｐ＜０．０５、アリスキレンの存在しないＰＤＦで処理されたそれぞれの群と対比して。
【００３４】
［本発明の実施形態の実施例］
以下の実施例は本発明を例示する。しかし、これらの実施例は非限定的な例である。それらの実施例は、単に情報を提供するものであり、使用される方法論を限定するものではなく、それらの実施例を類似の結果を達成する目的のために変更することができる。
【００３５】
本明細書において、本明細書の方法、図及び実施例中で使用される記号及び慣習は、国際的な方式及び現代の科学文献、例えば医化学雑誌中で使用されるものからなる。そうでないことを指摘しない限り、すべての材料は、商業的供給業者から入手し、さらなる精製なしで使用した。具体的には、次の省略形を、実施例中、及び明細書中を通して使用することができる：ｇ（グラム）、ｍｇ（ミリグラム）、ｋｇ（キログラム）、ｍＬ（ミリリットル）、μＬ（マイクロリットル）、ｍｍｏｌ（ミリモル）、Ｍ．Ｐ（融点）、Ｈｚ（ヘルツ）、ＭＨｚ（メガヘルツ）、δ（ケミカルシフト）、ｐｐｍ（パーツパーミリオン）、ｓ（一重線）、ｄ（二重線）、ｔ（三重線）、ｑ（四重線）、ｃ（五重線）、ｍ（多重線）、Ｊ（カップリング定数）、ＮＭＲ（核磁気共鳴）、ＭＳ（質量スペクトル）、ＥＳ（エレクトロスプレー）、ｍ／ｚ（質量／電荷比）、Ａｎａｌ（元素分析）、Ｙｌｄ（収率）、ＴＥＡ（トリエチルアミン）、ＣＨ２Ｃｌ２（ジクロロメタン）、ＣＤＣｌ３（重水素化クロロホルム）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、ｉ．ｐ．（非経口投与）。温度は、すべて℃（摂氏）で表現される。
【００３６】
［実施例］
（ラット腹膜中皮細胞の培養）
ラット腹膜中皮細胞を、Ｈｊｅｌｌｅ ＪＴ、Ｇｏｌｉｎｓｋａ ＢＴ、Ｗａｔｅｒｓ ＤＣら、Ｐｅｒｉｔ Ｄｉａｌ Ｉｎｔ １９８９；９：３４１〜７中に記載のプロトコールに従って、酵素的消化により単離した。簡潔には、体重が２００〜４００ｇの雌性スプラーグドーリー系ラットを、実験及びその他の科学目的に使用される動物の保護に関する１０月１０日の勅令１２０１／２００５に従って屠殺した。腹腔を速やかに開き、腹壁（腹膜及び平滑筋）を無菌条件下で取り出した。腹壁の内部表面から、前記表面を１９９培養培地（Ｓｉｇｍａ）及び０．５ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ）中、３７℃で３０分間インキュベートする酵素的消化によって、中皮細胞を分離した。インキュベーションの後、消化された腹壁表面をかき取り、接着された中皮細胞を完全に剥離した。得られた中皮細胞を増殖及びその研究用の培養皿に播種し、１０％ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補足された１９９培地中に維持した。各培養の後、腹膜中皮細胞の存在を、その組織形態学的外観及び特異的マーカーの発現により確認した。細胞は、３〜６代の間に使用した。
【００３７】
（インビボでの研究）
動物
体重が２００〜２４０ｇの７８匹の雌性スプラーグドーリー系ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、インビボ実験に使用した。動物は、１２時間の明と１２時間の暗からなる周期で一定温度の雰囲気中に収容した。飼料及び飲料は、自由に与えた。すべての実験プロトコールは、欧州指令「欧州共同体委員会指令８６／６０９／ＥＥＣ」に従って実施した。さらに、動物実験は、アルバセテ（Ａｌｂａｃｅｔｅ）（スペイン）の大学／病院複合体の動物管理使用委員会によって承認された。さらに、動物実験は、アルバセテ（Ａｌｂａｃｅｔｅ）（スペイン）の大学／病院複合体の動物管理使用委員会によって承認された。
【００３８】
インビボ研究及び腹膜平衡試験（ＰＥＴ）の実験計画
インビボ研究のため、体重が２００〜２４０ｇの７８匹の雌性スプラーグドーリー系ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用し：高グルコース腹膜透析液（ＰＤＦ）を投与される動物に５４匹のラットを割り当て、この５４匹を、それぞれ異なるグルコース濃度を有する３種のＰＤＦ（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃａｒ、Ｂａｄ Ｈｏｍｂｕｒｇ、ドイツ）を投与するそれぞれ１８匹のラットからなる３つの異なるサブグループに分割した。さらに、１８匹のラットには担体（生理食塩水血清）を投与し、別の６匹のラットは対照群（透析なし）として使用した。「担体」群の１８匹のラット、並びに１．５％ＰＤＦ群、２．３％ＰＤＦ群及び４．５％ＰＤＦ群に属するラットをそれぞれ６匹のラットからなる別の３つのサブグループに分割した。これらの群のそれぞれに投与されるＰＤＦは、生理食塩水血清、０．１ｍｇ／ｋｇ／日のアリスキレン（Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、マサチューセッツ州、米国）又は１ｍｇ／ｋｇ／日のアリスキレンを補足した。腹膜透析のため、ラットには、４週間にわたって毎日、２２Ｇニードルを介して対応する２０ｍＬのＰＤＦを投与した。
【００３９】
実験期間（４週間）の終末時点で、２．３％のグルコースを含む３０ｍＬの市販ＰＤＦ（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃａｒ、Ｂａｎ Ｈｏｍｂｕｒｇ、ドイツ）を、２２Ｇニードルを使用して腹膜内投与した。２時間後に、動物を、ペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ）を用い腹膜内で麻酔し、心穿刺によって血液を抜き取った。次に、腹部正中切開を行い、シリンジを使用して腹膜から残量を集めた。ＰＥＴの間、動物は覚醒しており、水及び飼料を自由に入手することができた。動物の体重を、実験期間の開始及び終了時に測定した。ラットは死亡せず、すべての動物は、反復ＰＤＦ注入を含む研究中に良好な健康状態にあると思われた。
【００４０】
血液及び透析物のサンプルを遠心分離し、−２０℃で貯蔵した。血清及び透析物中のクレアチニン及びグルコースの濃度を、酵素法を使用して測定した。溶質の腹膜輸送を、一方では、ＰＤＦ中の初期グルコース濃度に対するＰＥＴの２時間後の透析物中のグルコース濃度（Ｄ２／Ｄ０グルコース）として、他方では、ＰＥＴの２時間後の透析物／血清中クレアチニン濃度比（Ｄ２／Ｐ２クレアチニン）として計算した。ＰＥＴの終了時点で、動物を、過剰用量の麻酔剤を使用して屠殺し、腹膜中皮細胞（ＰＭＣ）を単離し、本明細書において後で説明するように培養した。
【００４１】
（本発明の腹膜透析液の調製）
腹膜透析液を、表２に記載の量のアリスキレン及び表３に記載の量のグルコースを、その組成を表１に示す培地Ｍ１９９に添加することによって調製した。表２に記載のそれぞれのアリスキレン濃度と、表３に記載のグルコース濃度との組合せについて研究した。
【００４２】
【表１】
【００４３】
【表２】
【００４４】
【表３】
【００４５】
（細胞毒性研究）
毒性試験は、ラットの腹膜中皮細胞の培養物で実施し、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）酵素の活性を測定した（Ｐｏｓａｄａｓ Ｉ、Ｌｏｐｅｚ−Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ Ｂ、Ｃｌｅｍｅｎｔｅ ＭＩら、Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ ２００９；２６：１１８１〜９１）。これらの研究は、本発明の腹膜透析液の毒性を研究するために実施した。
【００４６】
この目的のため、細胞を、２４ウェルプレートに播種し、本発明の腹膜透析液対象に暴露し、それらの透析液の毒性を研究した。毒性効果は、細胞膜の破壊及び結果としての細胞上清へのＬＤＨの放出をＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）で測定して評価した。細胞を、機械的に取り出し、ＰＢＳで洗浄し、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心した。マイクロプレート分光光度計を波長４９０ｎｍで製造業者の説明書に従って使用して、細胞溶解物及び細胞上清の吸光度を得た。
【００４７】
（フローサイトメトリーを使用する活性酸素種の濃度変化の評価）
ＰＢＳで洗浄した後、細胞を、５．６−クロロメチル−２．７−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート（ＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＤＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に３７℃で１５分間、標準的プロトコールに従ってインキュベートした（Ｌｅｅ ＨＢ、２００４）。インキュベーションの後、コンディション培地を集め、細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理した。トリプシン処理細胞を濃縮培地に結合させることにより得られる懸濁液中に存在する生存及び死滅細胞のすべてを、３０００×ｇ、４℃で５分間遠心した。最後に、細胞をＰＢＳで洗浄し、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ニュージャージー州、米国）での細胞分析用の培養培地１９９中に再懸濁した。活性酸素種の産生は、実験条件ごとに１０，０００個の細胞の評価に基づいて計算した。
【００４８】
（ウェスタンブロットによるｐ３８ＭＡＰＫのリン酸化／脱リン酸化の評価）
細胞培養物の全タンパク質を得るために、培養培地を集めＰＢＳで置き換えた。細胞を、トリプシン処理によって取り出し、捕集培地に結合させた。３０００×ｇ、４℃で５分間の遠心により得られるタンパク質に富むペレットを、細胞溶解物用緩衝液（１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭ ＥＧＴＡ、０．０４％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、及び２０％グリセロール）中にプロテアーゼ阻害剤及びホスファターゼと共に再懸濁し、４℃で６０分間インキュベートした。インキュベーションの後、サンプルを、１３，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心し、上清液を−８０℃で保存した。細胞溶解物のタンパク質含有量を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を標準的プロトコール（Ｖｏｒｏｂｉｏｖ Ｍ、Ｍａｌｋｉ Ｍ、Ｓｈｎａｉｄｅｒ Ａら、Ｐｅｒｉｔ Ｄｉａｌ Ｉｎｔ ２００８；２８：６４８〜５４）に従って使用して測定した。各サンプルを、２０μｇタンパク質／ウェルの量で１０％ポリアクリルアミドゲル上にロードした。セミドライ式ブロッターを使用して、ゲルを、電気泳動によってニトロセルロース膜に転写した。ニトロセルロースに結合されたタンパク質を、ポルソーＳ染色で検視し、５％スキムミルクを含むＴＴＢＳ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５，２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ）でブロックし、続いてｐ３８ＭＡＰＫ又はリン酸化−ｐ３８ＭＡＰＫ一次抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）中、４℃で一夜インキュベートした。ＴＴＢＳで洗浄した後、二次抗体を環境温度で１時間適用した。検出は、ケミルミネセンス（ＥＣＬ）により実施した。バンドの強度は、適切な画像解析装置（Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ）を使用して、グレーレベルで定量化した。
【００４９】
（ＥＬＩＳＡによるカスパーゼ−３活性の測定）
カスパーゼ−３の活性を測定するため（Ｐｏｓａｄａｓ Ｉ、Ｖｅｌｌｅｃｃｏ Ｖ、Ｓａｎｔｏｓ Ｐら、Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ２００７；１５０：５７７〜８５）、ラットの中皮細胞を、６ウェルプレート上に８０％の集密度に到達するまで播種した。アリスキレンを含む腹膜透析液に暴露した後、培養培地を集め、ＰＢＳで置き換えた。細胞を、トリプシン処理によって取り出し、捕集培地に結合させた。３０００×ｇ、４℃で５分間の遠心により得られるタンパク質に富むペレットを、細胞溶解物用緩衝液（１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭ ＥＧＴＡ、０．０４％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、及び２０％グリセロール）中に再懸濁し、４℃で６０分間インキュベートした。インキュベーションの後、サンプルを、１３，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心し、上清液中のタンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を標準的プロトコールに従って使用して測定した。細胞抽出物（４０μｇのタンパク質）を、蛍光基質である５０μＭのＡｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−７−アミノ−４−トリフルオロメチル−クマリル（Ｚ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣ）を含む反応緩衝液（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０％ショ糖、０．１％３−［（３−クロルアミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸、１０ｍＭ ＤＴＴ）中、３７℃で１時間インキュベートした。蛍光発光を、分光蛍光光度計（Ｔｅｃａｎ、オーストリア）を用いて４００ｎｍの励起波長及び５０５ｎｍの発光波長で測定した。
【００５０】
（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ）
ＲＮＡの発現を、ＰＭＣにおいてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって評価した。全ＲＮＡを、製造業者の説明書に従って市販の反応試薬（Ｔｒｉｐｕｒｅ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）を使用して単離した。ＲＮＡの品質及び濃度は、１μＬのＲＮＡサンプルを使用し、分光光度法（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ２００、Ｔｅｃａｎ、Ｓａｌｚｂｕｒｇ、オーストリア）によって評価した。全ＲＮＡは、１８Ｓ及び２８ＳのｍＲＮＡバンドの完全性を確認するため、アガロースゲルで試験した。ｃＤＮＡは、高性能ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州）を使用して合成した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲの場合、ｃＤＮＡはＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲマスターミックスを使用し、１ステップリアルタイムＰＣＲシステム及びソフトウェアＳｔｅｐＯｎｅ ｖ２．０（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州）を用いて増幅した。増幅には次のプライマー対を使用した：フィブロネクチンでは５’−ＧＣＡ−ＣＡＧ−ＧＧＧ−ＡＡＧ−ＡＡＡ−ＡＧＧ−ＡＧ−３’（センス）及び５’-ＴＴＧ−ＡＧＴ−ＧＧＡ−ＴＧＧ−ＧＡＧ−ＧＡＧ−ＡＧ−３’（アンチセンス）；コラーゲンＩでは５’−ＴＣＡ−ＣＣＴ−ＡＣＡ−ＧＣＡ−ＣＧＣ−ＴＴＧ−３’（センス）及び５’−ＧＧＴ−ＣＴＧ−ＴＴＴ−ＣＣＡ−ＧＧＧ−ＴＴＧ−３’（アンチセンス）；コラーゲンＩＩＩでは５’−ＡＴＡ−ＴＣＡ−ＡＡＣ−ＡＣＧ−ＣＡＡ−ＧＧＣ−３’（センス）及び５’−ＧＡＴ−ＴＡＡ−ＡＧＣ−ＡＡＧ−ＡＧＧ−ＡＡＣ−ＡＣ−３’（アンチセンス）；Ｐ５３では５’−ＣＣＴ−ＣＣＴ−ＣＡＧ−ＣＡＴ−ＣＴＴ−ＡＴＣ−ＣＧ−３’（センス）及び５’−ＣＡＣ−ＡＡＡ−ＣＡＣ−ＧＣＡ−ＣＣＴ−ＣＡＡ−Ａ−３’（アンチセンス）；ＢＡＸでは５’−ＧＡＴ−ＧＣＧ−ＴＣＣ−ＡＣＣ−ＡＡＧ−ＡＡ−３’（センス）及び５’−ＡＧＴ−ＡＧＡ−ＡＧＡ−ＧＧＧ−ＣＡＡ−ＣＣＡ−Ｃ−３’（アンチセンス）；並びにＢｃｌ−２では５’−ＣＣＣ−ＡＡＧ−ＧＧＡ−ＡＧＡ−ＣＧＡ−ＴＧ−３’（センス）及び５’−ＧＡＧ−ＣＧＧ−ＧＴＡ−ＧＧＧ−ＡＡＡ−ＧＡ−３’（アンチセンス）。該プライマー配列は、６０℃に近いアニーリング温度を有する。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ反応は、９５℃で１０分間、続いて９５℃で１５秒間、６０℃で１分間の４０サイクルで実施した。解離曲線を分析して単一ＰＣＲ産物の増幅を確認した。すべてのサンプルをトリプリケートで処理した。各実験において、平均サイクル閾値（ＣＴ）を、調べる各遺伝子についてトリプリケートから計算し、種々の処置後の遺伝子発現の比較を可能にした（Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５、４０２〜４０８（２００１））。データを正規化するため、β−アクチンの遺伝子発現を内在性対照として使用した。
【００５１】
（データの収集及び解析）
得られた各値は、デュプリケートで実施された少なくとも３回の実験に対応する。すべてのデータは平均±ＳＥＭとして提示される。解析されるパラメーターのそれぞれに関する群間差を、ノンパラメトリックＡＮＯＶＡ検定（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ）、続いてホック検定（Ｄｕｎｎｅｔｔ）を使用して解析した。０．０５以下のｐ値を有意とみなした。ＳＰＳＳ１３．０（Ｃｈｉｃａｇｏ、イリノイ州）ソフトウェアを使用して統計解析を実施した。
【００５２】
（結果）
本発明の実験で使用される中皮細胞培養物は、ＨＢＭＥ−１に反応性を示す（図１）。
【００５３】
透析用液体中の種々の濃度のグルコースへの暴露時間を増加させることは、中皮細胞に対して毒性があり、腹膜に対する腹膜透析液の毒性の基礎を構成する。グルコースへの暴露時間の増加は、中皮細胞中での遊離ラジカルの産生を増大させることが観察できる（図２）。
【００５４】
この遊離ラジカルの産生のため、カスパーゼ−３の活性化などの細胞死のエフェクター機構が活性化される（図３）。
【００５５】
高グルコース濃度の溶液への暴露は、中皮細胞における毒性指標と考えられるｐ３８タンパク質のリン酸化を増大させる（図４）。
【００５６】
培養培地へのアリスキレンの添加は、１ｍＭの濃度に達するまで中皮細胞に対して毒性を示さなかった（図５）。
【００５７】
透析培地へのアリスキレンの添加は、培養された腹膜細胞における活性酸素種の産生（図６）及びカスパーゼの活性化（図７）、並びにタンパク質ｐ３８のリン酸化（図８）の双方を予防した。
【００５８】
透析培地へのアリスキレンの添加は、培養された腹膜細胞における腹膜線維症のマーカーであるコラーゲンＩ（図９）、コラーゲンＩＩＩ（図１０）、及びフィブロネクチン（図１１）に関するｍＲＮＡレベルを低下させた。
【００５９】
透析培地中でのアリスキレンの存在は、透析されたラットにおけるインビボでの腹膜損傷を低減した（図１２及び１３）。
【００６０】
ラットにおける長期腹膜分析中にアリスキレンが存在することは、前記ラットから得られた腹膜細胞中での、アポトーシス促進性タンパク質ｐ５３（図１４）及びＢａｘ（図１５）に関するｍＲＮＡの発現を低減した。
【００６１】
ラットにおける長期腹膜透析中にアリスキレンが存在することは、前記ラットから得られる腹膜細胞中での、抗アポトーシス性タンパク質Ｂｃｌ−２に関するｍＲＮＡの発現を増加した（図１６）。
【００６２】
ラットにおける長期腹膜透析中にアリスキレンが存在することは、前記ラットから得られる腹膜細胞中での、腹膜線維症のマーカーであるフィブロネクチン（図１７）及びコラーゲンＩＩＩ（図１８）に関するｍＲＮＡの発現を増大させた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記成分
ａ）少なくとも１種の電解質、
ｂ）少なくとも１種の緩衝液、
ｃ）少なくとも１種の浸透圧調節剤、及び
ｄ）アリスキレン又はその誘導体
を含む、腹膜透析液。
【請求項２】
前記電解質が、Ｎａ＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｌ−及びこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１に記載の腹膜透析液。
【請求項３】
各電解質が、下記濃度範囲：
Ｎａ １００〜２００ｍｍｏｌ／ｌ；
Ｋ ０〜４ｍｍｏｌ／ｌ；
Ｍｇ ０．１〜２ｍｍｏｌ／ｌ；
Ｃａ ０．５〜３ｍｍｏｌ／ｌ；
Ｃｌ ５０〜２００ｍｍｏｌ／ｌ；
にある、請求項２に記載の腹膜透析液。
【請求項４】
前記緩衝液が、乳酸塩、重炭酸塩又はこれらの組合せから選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の腹膜透析液。
【請求項５】
前記緩衝液の濃度が１０〜１５０ｍｍｏｌ／ｌの範囲にある、請求項４に記載の腹膜透析液。
【請求項６】
前記浸透圧剤が、グルコース、ポリグルコース、マンニトール、グリセロール、アミノ酸、ポリペプチド、及びこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の腹膜透析液。
【請求項７】
添加される前記浸透圧剤の量が、１００〜６００ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲にある、請求項６に記載の腹膜透析液。
【請求項８】
アリスキレン又はその誘導体の濃度が、５０ｎＭ〜１ｍＭの範囲にある、請求項１〜７のいずれか一項に記載の腹膜透析液。
【請求項９】
薬剤を調製するための前記腹膜透析液の使用。
【請求項１０】
腎疾患を予防及び／又は治療するための薬剤を調製するための前記透析液の使用。
【請求項１１】
腹膜中皮細胞に対する毒性を予防及び／又は治療するための薬剤を調製するための前記透析液の使用。
【請求項１２】
活性酸素種、タンパク質ｐ３９ＭＡＰＫのリン酸化、及びカスパーゼ−３の活性化を予防及び／又は低減するための薬剤を調製するための前記透析液の使用。
【請求項１３】
酸化ストレス、アポトーシスプロセス、腹膜細胞に有害な遺伝子の発現、及び透析用液体によって引き起こされる腹膜損傷を予防及び／又は治療するための薬剤を調製するための前記透析液の使用。
【請求項１４】
慢性腎不全を予防及び／又は治療するための薬剤を調製するための前記透析液の使用。
【請求項１】
下記成分
ａ）少なくとも１種の電解質、
ｂ）少なくとも１種の緩衝液、
ｃ）少なくとも１種の浸透圧調節剤、及び
ｄ）アリスキレン又はその誘導体
を含む、腹膜透析液。
【請求項２】
前記電解質が、Ｎａ＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｌ−及びこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１に記載の腹膜透析液。
【請求項３】
各電解質が、下記濃度範囲：
Ｎａ １００〜２００ｍｍｏｌ／ｌ；
Ｋ ０〜４ｍｍｏｌ／ｌ；
Ｍｇ ０．１〜２ｍｍｏｌ／ｌ；
Ｃａ ０．５〜３ｍｍｏｌ／ｌ；
Ｃｌ ５０〜２００ｍｍｏｌ／ｌ；
にある、請求項２に記載の腹膜透析液。
【請求項４】
前記緩衝液が、乳酸塩、重炭酸塩又はこれらの組合せから選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の腹膜透析液。
【請求項５】
前記緩衝液の濃度が１０〜１５０ｍｍｏｌ／ｌの範囲にある、請求項４に記載の腹膜透析液。
【請求項６】
前記浸透圧剤が、グルコース、ポリグルコース、マンニトール、グリセロール、アミノ酸、ポリペプチド、及びこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の腹膜透析液。
【請求項７】
添加される前記浸透圧剤の量が、１００〜６００ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲にある、請求項６に記載の腹膜透析液。
【請求項８】
アリスキレン又はその誘導体の濃度が、５０ｎＭ〜１ｍＭの範囲にある、請求項１〜７のいずれか一項に記載の腹膜透析液。
【請求項９】
薬剤を調製するための前記腹膜透析液の使用。
【請求項１０】
腎疾患を予防及び／又は治療するための薬剤を調製するための前記透析液の使用。
【請求項１１】
腹膜中皮細胞に対する毒性を予防及び／又は治療するための薬剤を調製するための前記透析液の使用。
【請求項１２】
活性酸素種、タンパク質ｐ３９ＭＡＰＫのリン酸化、及びカスパーゼ−３の活性化を予防及び／又は低減するための薬剤を調製するための前記透析液の使用。
【請求項１３】
酸化ストレス、アポトーシスプロセス、腹膜細胞に有害な遺伝子の発現、及び透析用液体によって引き起こされる腹膜損傷を予防及び／又は治療するための薬剤を調製するための前記透析液の使用。
【請求項１４】
慢性腎不全を予防及び／又は治療するための薬剤を調製するための前記透析液の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図４】
【図２】
【図３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図４】
【公表番号】特表２０１３−５２１３２９（Ｐ２０１３−５２１３２９Ａ）
【公表日】平成２５年６月１０日（２０１３．６．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５５６５５０（Ｐ２０１２−５５６５５０）
【出願日】平成２３年３月４日（２０１１．３．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＳ２０１１／０７０１４２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／１０７６４９
【国際公開日】平成２３年９月９日（２０１１．９．９）
【出願人】（５１２２３０９３７）ユニヴェルシダード デ カスティーリャ ラ マンチャ (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年６月１０日（２０１３．６．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月４日（２０１１．３．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＳ２０１１／０７０１４２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／１０７６４９
【国際公開日】平成２３年９月９日（２０１１．９．９）
【出願人】（５１２２３０９３７）ユニヴェルシダード デ カスティーリャ ラ マンチャ (2)
【Ｆターム（参考）】
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