自己相補的なＡＡＶが媒介する眼の障害を処置または予防するための干渉ＲＮＡ分子の送達
本発明は、干渉ＲＮＡ分子を患者の眼に送達することによって眼の障害を処置するための方法を提供する。特に、本発明の方法は、患者の眼に干渉ＲＮＡ分子を送達することによって眼の障害に関連する遺伝子の発現を阻害できる自己相補的なアデノ随伴（ｓｃＡＡＶ）ウイルスベクターの使用を含む。本発明はまた、治療上有効な量の干渉ＲＮＡ分子および眼に許容できる担体を有する自己相補的なアデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）ベクターを含む医薬組成物も提供し、この干渉ＲＮＡ分子は眼の障害に関連する遺伝子の発現を低減できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項の下、２００７年１０月１日に出願された米国仮特許出願第６０／９７６，５５２号の利益を主張し、この米国仮特許出願の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、自己相補的なアデノ随伴（ｓｅｌｆ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ：ｓｃＡＡＶ）ウイルスベクターを介して、干渉ＲＮＡ分子を患者の眼に送達する方法に関する。本発明は、本発明の干渉ＲＮＡ分子−ｓｃＡＡＶベクターをそれを必要とする患者に投与することによって、眼の障害を処置するための方法にも関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：ＲＮＡｉ）とは、２本鎖ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ：ｄｓＲＮＡ）を用いて遺伝子発現を停止させるプロセスである。ＲＮＡｉは、細胞中に存在する短い（すなわち＜３０ヌクレオチドの）２本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）分子によって誘導される（非特許文献１）。これらの短いｄｓＲＮＡ分子は「短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）」または「ｓｉＲＮＡ」と呼ばれ、１ヌクレオチド分解能内でｓｉＲＮＡとの配列相同性を共有するメッセンジャーＲＮＡ（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ；「ｍＲＮＡ」）の破壊をもたらす（非特許文献２）。ｓｉＲＮＡの一方の鎖は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ：ＲＩＳＣ）として公知であるリボ核タンパク質複合体に取込まれると考えられている。ＲＩＳＣはこのｓｉＲＮＡ鎖を用いて、取込まれたｓｉＲＮＡ鎖と少なくとも部分的に相補的であるｍＲＮＡ分子を識別し、これらの標的ｍＲＮＡを切断するか、またはその翻訳を妨げる。ｓｉＲＮＡは多重代謝回転酵素と同様に再利用されていることが明らかであり、１個のｓｉＲＮＡ分子が約１０００個のｍＲＮＡ分子の切断を誘導できる。したがって、ｍＲＮＡのｓｉＲＮＡ媒介型ＲＮＡｉ分解は、標的遺伝子の発現を阻害するための現在利用可能な技術よりも効果的である。
【０００４】
ＲＮＡｉは、疾患を処置および／または予防するための非常に興味深いアプローチを提供する。さまざまな伝統的治療アプローチに比べて、ＲＮＡｉは以下を含むいくつかの主要な利点を有する：ＲＮＡｉは疾患プロセスに関与する非常に特定的な遺伝子を高度に特異的に標的にできるため、オフターゲットの影響を低減または除去できる；ＲＮＡｉは、高度に特異的なＲＮＡ分解を起こし、遺伝子サイレンシング効果を細胞間に広げる通常の細胞プロセスである；ＲＮＡｉは、多くの抗体に基づく療法のように宿主の免疫応答を誘発しない。
【０００５】
ｓｉＲＮＡを用いた眼の疾患の標的遺伝子の特定的なインビボターゲティングおよびノックダウンは、ｓｉＲＮＡを小柱網（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｍｅｓｈｗｏｒｋ：ＴＭ）標的組織に送達する際のある種の物理的制限を伴う。加えて、核酸は一般的に硝子体内半減期が短いため、干渉ＲＮＡを連続的に存在させるために繰り返し眼内注射を行なう必要があるかもしれない。これらの理由から、長期送達のための方法が必要とされる。
【０００６】
いくつかの干渉ＲＮＡ送達方法がインビボでの使用のためにテスト／開発されている。たとえば、ｓｉＲＮＡは、食塩水中で「裸で」；ポリカチオン、カチオン性脂質／脂質トランスフェクション試薬、またはカチオン性ペプチドと複合化して；定めた分子結合体の構成要素として（例、コレステロール修飾されたｓｉＲＮＡ、ＴＡＴ−ＤＲＢＤ／ｓｉＲＮＡ複合体）；リポソームの構成要素として；および、ナノ粒子の構成要素として送達されてもよい。
【０００７】
硝子体内または前房内に送達されたアデノウイルスｓｈＲＮＡを用いたＴＭのウイルス形質導入は可能なアプローチの１つだが、これはヒトでの使用においていくつかのネガティブな結果が得られており、その中には抗アデノウイルス応答による除去のため発現が一時的であることが含まれる。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は１本鎖ＤＮＡゲノムからなっており、毒性が僅かであるので遺伝子療法のためのウイルスベクターとして使用されている。残念ながら、ＡＡＶはＴＭ細胞を効率的に形質導入しない。
【０００８】
これらのアプローチは成功の程度にばらつきを示したため、インビボでｓｉＲＮＡ分子を送達してＲＮＡｉの治療上の可能性を達成しかつ高めるための新しい改善された方法がなおも必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ ３９１：８０６−８１１
【非特許文献２】Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ，１５：１８８−２００
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は、患者の眼における標的ｍＲＮＡの発現を低減させる方法を提供し、この方法は（ａ）干渉ＲＮＡ分子を含む自己相補的なアデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）ベクターを与えるステップと；（ｂ）ｓｃＡＡＶベクターを患者の眼に投与するステップとを含み、この干渉ＲＮＡ分子は眼における標的ｍＲＮＡの発現を低減できる。
【００１１】
１つの局面において、患者は眼の障害、たとえば眼の血管新生、ドライアイ、眼の炎症状態、高眼圧または緑内障を有する。別の局面において、干渉ＲＮＡ分子は眼の障害、たとえば眼の血管新生、ドライアイ、眼の炎症状態、高眼圧または緑内障に関連する遺伝子を標的とする。
【００１２】
ベクターは、たとえば眼内注射、眼への局所適用、静脈内注射、経口投与、筋内注射、腹腔内注射、経皮適用または経粘膜適用によって投与されてもよい。
【００１３】
本発明は、治療上有効な量の干渉ＲＮＡ分子および眼に許容できる担体を有する自己相補的なアデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）ベクターを含む医薬組成物も提供し、この干渉ＲＮＡ分子は眼の障害に関連する遺伝子の発現を低減できる。ｓｃＡＡＶベクターはｓｃＡＡＶビリオン中にパッケージングされてもよい。
【００１４】
特定の好ましい実施形態の以下のより詳細な説明および本特許請求の範囲から、本発明の特定の好ましい実施形態が明らかになるであろう。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（発明の詳細な説明）
本明細書中の事項は、例としておよび本発明の好ましい実施形態の例示的な考察の目的のためにのみ示されるものであり、本発明のさまざまな実施形態の原理および概念的局面を最も有用かつ容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために示されている。このことに関して、本発明の構造的詳細を本発明の基本的な理解のために必要である以上に詳細に示すための試みはなされておらず、図面および／または実施例を伴う説明によって、本発明のいくつかの形態をどのようにして実際に実施できるかを当業者に明らかにするものである。
【００１６】
以下の実施例において明瞭かつ明白に変更されていない限り、またはその意味を適用することによっていずれかの構成が無意味もしくは本質的に無意味にならない限り、以下の定義および説明はあらゆる今後の構成を統制することを意味して意図されるものである。その用語の構成が無意味または本質的に無意味になる場合には、定義をＷｅｂｓｔｅｒ’ｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙの第３版または当業者に公知の辞書、たとえばＯｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｎｔｈｏｎｙ Ｓｍｉｔｈ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、２００４）から取るべきである。
【００１７】
別様に述べられていない限り、本明細書で用いられるすべてのパーセンテージは重量パーセントである。
【００１８】
本明細書で用いられていて別様に示されていない限り、“ａ”および“ａｎ”という用語は「１つ」、「少なくとも１つ」または「１つまたは複数」を意味するものとする。文脈によって別様に要求されない限り、本明細書で用いられる単数形用語は複数を含み、複数形用語は単数形を含む。
【００１９】
特定の実施形態において、本発明は患者の眼における標的ｍＲＮＡの発現を低減させる方法を提供し、この方法は（ａ）眼の中で発現される遺伝子を標的とする干渉ＲＮＡ分子を含む自己相補的なアデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）ベクターを与えるステップと；（ｂ）ｓｃＡＡＶベクターを患者の眼に投与するステップとを含み、この干渉ＲＮＡ分子は眼における標的ｍＲＮＡの発現を低減できる。特定の実施形態において、ｓｃＡＡＶベクターはｓｃＡＡＶビリオン中にパッケージングされる。
【００２０】
特定の実施形態において、本発明は患者の眼の障害を予防または処置する方法を提供し、この方法は（ａ）眼の障害に関連する遺伝子を標的とする干渉ＲＮＡ分子を含む自己相補的なアデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）ベクターを与えるステップと；（ｂ）ｓｃＡＡＶベクターを患者の眼に投与するステップとを含み、この干渉ＲＮＡ分子は眼の障害に関連する遺伝子の発現を低減できる。ｓｃＡＡＶベクターはｓｃＡＡＶビリオン中にパッケージングされてもよい。特定の実施形態において、眼の障害は眼内圧（ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒ ｐｒｅｓｓｕｒｅ：ＩＯＰ）の上昇、たとえば高眼圧または緑内障に関連する。
【００２１】
本明細書で用いられる「患者」という用語は、眼の障害を有するかまたは眼の障害を有する危険性のあるヒトまたはその他の哺乳動物を意味する。こうした障害に関連する眼の構造は、たとえば眼球、網膜、脈絡膜、水晶体、角膜、小柱網、虹彩、視神経、視神経乳頭、強膜、前区もしくは後区、または毛様体を含んでもよい。特定の実施形態において、患者は小柱網（ＴＭ）細胞、毛様体上皮細胞、または眼の別の細胞型に関連する眼の障害を有する。
【００２２】
本明細書で用いられる「眼の障害」という用語は、眼の血管新生、ドライアイ、炎症状態、高眼圧および眼内圧（ＩＯＰ）の上昇に関連する眼の疾患、たとえば緑内障に関連する状態を含む。
【００２３】
本明細書で用いられる「眼の血管新生」という用語は、眼の血管新生促進状態および眼の血管新生状態を含み、たとえば眼の血管新生、眼の新血管新生、網膜浮腫、糖尿病性網膜症、網膜虚血に伴う後遺症、後区新血管新生（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ｓｅｇｍｅｎｔ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ：ＰＳＮＶ）、および血管新生緑内障を含む。本発明の方法において用いられる干渉ＲＮＡは、たとえば眼の血管新生、眼の新血管新生、網膜浮腫、糖尿病性網膜症、網膜虚血に伴う後遺症、後区新血管新生（ＰＳＮＶ）、および血管新生緑内障の患者、またはこうした状態を発生させる危険性のある患者を処置するために有用である。「眼の新血管新生」という用語は、加齢黄斑変性、白内障、急性虚血性視神経障害（ａｃｕｔｅ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｏｐｔｉｃ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ：ＡＩＯＮ）、網膜振とう症、網膜剥離、網膜裂孔または網膜円孔、医原性網膜症およびその他の虚血性網膜症または視神経障害、近眼、網膜色素変性などを含む。
【００２４】
本明細書で用いられる「炎症状態」という用語は、眼の炎症およびアレルギー性結膜炎などの状態を含む。
【００２５】
本明細書で用いられる「組換えＡＡＶ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＡＡＶ：ｒＡＡＶ）ベクター」という用語は、少なくとも１つの末端繰り返し配列を含有する組換えＡＡＶ由来核酸を意味する。自己相補的なＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクターは、１つのｒＡＡＶ ＴＲから末端分解部位（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｉｔｅ：ＴＲ）を除去し、変異端部における複製の開始を防ぐことによって生成された２本鎖ベクターゲノムを含有する。これらの構築物は、各端部に野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ：ｗｔ）ＴＲを、中央に変異ＴＲを有する１本鎖の逆方向反復ゲノムを生じる。いくつかの自然発生するハイブリッドＡＡＶ血清型が公知であり、それはＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３Ａ、ＡＡＶ−３Ｂ、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−９、ＡＡＶ−１０、およびＡＡＶ−１１を含む（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：２９９−３１０）。ＡＡＶのこれらの血清型または他の血清型のいずれかに基づいてｓｃＡＡＶベクターを生成できることが当業者に認識されるだろう。
【００２６】
本明細書で用いられる「ｓｃＡＡＶビリオン」という言い回しは、本明細書に記載される本発明に従って宿主細胞に感染して宿主細胞に干渉ＲＮＡ分子を送達することのできる、ｓｃＡＡＶベクターおよびタンパク質コートを含む完全なウイルス粒子を意味する。
【００２７】
本明細書において提供されるものなどの干渉ＲＮＡ分子を含むｓｃＡＡＶベクターおよびｓｃＡＡＶビリオンの生成については、Ｘｕら（２００５，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １１：５２３−５３０）およびＢｏｒｒａｓら（２００６，Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ ８：５８９−６０２）によってさらに論じられている。Ｘｕらは、ＭＤＲ１遺伝子発現を抑制するためにｓｃＡＡＶベクターを用いてｓｉＲＮＡを多剤耐性のヒトの乳癌および口腔癌細胞に送達した。Ｂｏｒｒａｓらは、ヒト小柱網（ＴＭ）細胞およびヒトＴＭ灌流器官培養物の非常に効率的なｓｃＡＡＶ形質導入を示した。加えて、Ｙｏｋｏｉ，Ｋ．ら（２００７，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ，４８：３３２４−３３２８）はタイプ２ｓｃＡＡＶベクターを網膜下腔に注射して、網膜上皮細胞における緑色蛍光タンパク質の発現を観察した。
【００２８】
本発明の方法は、ＲＮＡ干渉を用いて患者の眼の特定の遺伝子の発現を低減させるために有用である。
【００２９】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）とは、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を用いて遺伝子発現を停止させるプロセスである。理論に束縛されることは望まないが、ＲＮＡｉは、ＲＮアーゼＩＩＩ様酵素であるダイサーによって、長いｄｓＲＮＡが短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に切断されることによって始まる。ｓｉＲＮＡは、通常は長さが約１９ヌクレオチドから２８ヌクレオチド、または２０ヌクレオチドから２５ヌクレオチド、または２１ヌクレオチドから２２ヌクレオチドのｄｓＲＮＡであり、しばしば２ヌクレオチドの３’オーバーハング、ならびに５’リン酸末端および３’ヒドロキシル末端を含有する。ｓｉＲＮＡの一方の鎖は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として公知であるリボ核タンパク質複合体に取込まれる。ＲＩＳＣはこのｓｉＲＮＡ鎖を用いて、取込まれたｓｉＲＮＡ鎖と少なくとも部分的に相補的であるｍＲＮＡ分子を識別し、これらの標的ｍＲＮＡを切断するか、またはその翻訳を妨げる。したがって、ＲＩＳＣに取込まれるｓｉＲＮＡ鎖はガイド鎖またはアンチセンス鎖として公知である。他方のｓｉＲＮＡ鎖はパッセンジャー鎖またはセンス鎖として公知であり、これはｓｉＲＮＡから取除かれ、標的ｍＲＮＡと少なくとも部分的に相同である。原則として、ｓｉＲＮＡのどちらの鎖もＲＩＳＣに取込まれてガイド鎖として機能し得ることが当業者に認識されるであろう。しかし、ｓｉＲＮＡ設計（例、所望のガイド鎖の５’末端におけるｓｉＲＮＡ２本鎖安定性の減少）によって、所望のガイド鎖のＲＩＳＣへの取込みを有利にできる。
【００３０】
ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、次の点においてｓｉＲＮＡの活性誘導剤である。すなわち、アンチセンス鎖はＲＩＳＣに取込まれることによって、ＲＩＳＣが切断または翻訳抑制のためにアンチセンスｓｉＲＮＡ鎖に対する少なくとも部分的な相補性を有する標的ｍＲＮＡを識別することを可能にする。ガイド鎖と少なくとも部分的に相補である配列を有するｍＲＮＡをＲＩＳＣを介して切断することにより、そのｍＲＮＡおよびこのｍＲＮＡがコードする対応タンパク質の定常状態レベルが減少する。代替的には、ＲＩＳＣは標的ｍＲＮＡを切断することなく翻訳抑制を介して対応タンパク質の発現を減少させることもできる。
【００３１】
干渉ＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの切断に対して触媒的な態様で作用するように見える。すなわち、干渉ＲＮＡは準化学量論的な量で標的ｍＲＮＡの阻害に影響できる。アンチセンス療法と比較して、こうした切断状態下で治療効果を与えるために必要な干渉ＲＮＡはかなり少なくなる。
【００３２】
特定の実施形態において、本発明は、干渉ＲＮＡを送達して標的ｍＲＮＡの発現を阻害することによって、眼の障害を有する患者における標的ｍＲＮＡレベルを減少させる方法を提供する。
【００３３】
本明細書で用いられる「標的ｍＲＮＡの発現を低減させる」という言い回しは、ある量の干渉ＲＮＡ（例、ｓｉＲＮＡ）を投与または発現させて、ｍＲＮＡの切断または翻訳の直接的阻害のいずれかによって、標的ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を減らすことを意味する。本明細書で用いられる「阻害する」、「サイレンシング」、および「低減する」という用語は、本発明の方法において用いられる干渉ＲＮＡの不在下での標的ｍＲＮＡまたは対応タンパク質の発現と比較したときの、標的ｍＲＮＡまたは対応タンパク質の発現が測定可能なほどに減少することを示す。標的ｍＲＮＡまたは対応タンパク質の発現の減少は一般的には「ノックダウン」と呼ばれ、非ターゲティング対照ＲＮＡ（例、非ターゲティング対照ｓｉＲＮＡ）の投与または発現の後に存在するレベルと比較して報告される。本明細書の実施形態では、５０％から１００％の間を含む量の発現のノックダウンが予期される。しかし、本発明の目的のためにこうしたノックダウンレベルを達成することが必要なわけではない。
【００３４】
ノックダウンは通常、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ：ｑＰＣＲ）増幅を用いてｍＲＮＡレベルを測定するか、またはウエスタンブロットもしくは酵素結合免疫吸着検定法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）によってタンパク質レベルを測定することによって評価される。タンパク質レベルの分析によって、ｍＲＮＡ切断および翻訳阻害の両方の評価が得られる。ノックダウンを測定するためのさらなる技術には、ＲＮＡ溶液ハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼプロテクション、ノーザンハイブリダイゼーション、マイクロアレイによる遺伝子発現モニタリング、抗体結合、ラジオイムノアッセイ、および蛍光標識細胞分析が含まれる。
【００３５】
干渉ＲＮＡ分子による標的遺伝子発現の低減は、ヒトまたはその他の哺乳動物において、眼の障害の症状の改善、たとえば緑内障標的遺伝子の阻害を示す眼内圧の低下を観察することによって推測できる。
【００３６】
実施形態の１つにおいては、単一の干渉ＲＮＡ分子が送達されて標的ｍＲＮＡレベルを低下させる。他の実施形態においては、ｍＲＮＡを標的とする２つまたはそれを超える干渉ＲＮＡが投与されて標的ｍＲＮＡレベルを低下させる。複数の干渉ＲＮＡは同じｓｃＡＡＶベクターで送達されても、別個のベクターで送達されてもよい。
【００３７】
本明細書で用いられる「干渉ＲＮＡ」および「干渉ＲＮＡ分子」という用語は、ＲＩＳＣと相互作用してＲＩＳＣの媒介する遺伝子発現変化に関与することができるすべてのＲＮＡ分子またはＲＮＡ様分子を示す。ＲＩＳＣと相互作用できる他の干渉ＲＮＡ分子の例には、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ：ｓｈＲＮＡ）、１本鎖ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ）、およびダイサー−基質の２７マーの２本鎖が含まれる。ＲＩＳＣと相互作用できる「ＲＮＡ様」分子の例には、１つもしくは複数の化学修飾されたヌクレオチド、１つもしくは複数の非ヌクレオチド、１つもしくは複数のデオキシリボヌクレオチド、ならびに／または１つもしくは複数の非ホスホジエステル結合を含有するｓｉＲＮＡ、１本鎖ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡ分子が含まれる。よってｓｉＲＮＡ、１本鎖ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびダイサー−基質の２７マーの２本鎖は、「干渉ＲＮＡ」または「干渉ＲＮＡ分子」のサブセットである。
【００３８】
本明細書で用いられる「ｓｉＲＮＡ」という用語は、別様に述べられていない限り２本鎖干渉ＲＮＡを示す。典型的には、本発明の方法で用いられるｓｉＲＮＡは２本のヌクレオチド鎖を含む２本鎖の核酸分子であり、各々の鎖は約１９ヌクレオチドから約２８ヌクレオチド（すなわち、約１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、または２８ヌクレオチド）を有する。典型的には、本発明の方法で用いられる干渉ＲＮＡは約１９ヌクレオチドから約４９ヌクレオチドの長さである。２本鎖干渉ＲＮＡを示すときの「１９ヌクレオチドから４９ヌクレオチドの長さ」という言い回しは、アンチセンス鎖およびセンス鎖が独立に約１９ヌクレオチドから約４９ヌクレオチドの長さを有することを意味しており、そこにはセンス鎖およびアンチセンス鎖がリンカー分子によって接続された干渉ＲＮＡ分子が含まれる。
【００３９】
１本鎖干渉ＲＮＡは、２本鎖ＲＮＡほど効率的ではないがｍＲＮＡサイレンシングをもたらすことが見出されている。したがって、本発明の実施形態は１本鎖干渉ＲＮＡの投与も提供する。上述の２本鎖干渉ＲＮＡと同様に、１本鎖干渉ＲＮＡは約１９ヌクレオチドから約４９ヌクレオチドの長さを有する。１本鎖干渉ＲＮＡは５’リン酸を有するか、または５’位置にてインサイツもしくはインビボでリン酸化されている。「５’リン酸化」という用語は、たとえばポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの５’末端において糖（例、リボース、デオキシリボースまたはその類似物）のＣ５ヒドロキシルにエステル結合を介して結合したリン酸基を有するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを説明するために用いられる。
【００４０】
１本鎖干渉ＲＮＡは化学的に、またはインビトロ転写によって合成されてもよいし、２本鎖干渉ＲＮＡに関して本明細書に記載されるものと同様にベクターまたは発現カセットから内因的に発現されてもよい。５’リン酸基はキナーゼを介して付加されてもよいし、ＲＮＡのヌクレアーゼ切断の結果として５’リン酸が得られてもよい。ヘアピン干渉ＲＮＡは、ステムループまたはヘアピン構造中に干渉ＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む単一分子（例、単一のオリゴヌクレオチド鎖）である（例、ｓｈＲＮＡ）。たとえば、センス干渉ＲＮＡ鎖をコードするＤＮＡオリゴヌクレオチドが、短いスペーサーによって逆の相補的アンチセンス干渉ＲＮＡ鎖をコードするＤＮＡオリゴヌクレオチドに結合されているようなＤＮＡベクターからｓｈＲＮＡが発現されてもよい。選択される発現ベクターに対して必要であれば、３’末端Ｔおよび制限酵素部位を形成するヌクレオチドが付加されてもよい。その結果得られるＲＮＡ転写物は、自身の上に折り返してステムループ構造を形成する。
【００４１】
本明細書で用いられる「標的配列」および「標的ｍＲＮＡ」という言い回しは、本発明の方法で用いられる干渉ＲＮＡが認識できるｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ配列の部分を示し、これによって干渉ＲＮＡは本明細書に考察されるとおりに遺伝子発現を停止させることができる。
【００４２】
標的ｍＲＮＡ配列内の干渉ＲＮＡ標的配列（例、ｓｉＲＮＡ標的配列）は、利用可能な設計ツールを用いて選択される。ｓｉＲＮＡに対する標的配列を選択するための技術は、たとえばＴｕｓｃｈｌ，Ｔ．ら、“Ｔｈｅ ｓｉＲＮＡ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ”、２００４年５月６日改訂、Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙウェブサイトにて入手可能；Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ＃５０６、“ｓｉＲＮＡ Ｄｅｓｉｇｎ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ”、Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．、Ａｍｂｉｏｎのウェブサイト；およびその他のウェブに基づく設計ツール、たとえばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、またはＰｒｏｌｉｇｏのウェブサイト上のものによって提供されている。最初のサーチパラメータは、３５％から５５％のＧ／Ｃ含有量および１９ヌクレオチドから２７ヌクレオチドのｓｉＲＮＡの長さを含んでもよい。標的配列は、ｍＲＮＡのコード領域に位置しても、５’または３’非翻訳領域に位置してもよい。標的配列を用いて、本明細書に記載されるものなどの干渉ＲＮＡ分子を得ることができる。標的配列に対応する干渉ＲＮＡは、標的ｍＲＮＡを発現する細胞のトランスフェクションの後に本明細書に記載されるとおりのノックダウンの評価を行なうことによって、インビトロでテストできる。干渉ＲＮＡは、当業者に公知の動物モデルを用いて、インビボでさらに評価されてもよい。
【００４３】
たとえばＨｅＬａ細胞における内因性標的遺伝子発現のレベルを干渉ＲＮＡがノックダウンする能力は、以下のとおりにインビトロで評価できる。ＨｅＬａ細胞を、トランスフェクションの２４時間前に標準的な増殖培地（例、ＤＭＥＭに１０％ウシ胎児血清を補ったもの）にてプレート培養する。０．１ｎＭ〜１００ｎＭの範囲の干渉ＲＮＡ濃度にて、たとえばＤｈａｒｍａｆｅｃｔ １（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）を用いて、製造者の指示書に従ってトランスフェクションを行なう。ＳｉＣＯＮＴＲＯＬ（商標）Ｎｏｎ−Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｉＲＮＡ ＃１およびｓｉＣＯＮＴＲＯＬ（商標）Ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ Ｂ ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）は、それぞれ負の対照および正の対照として用いられる。標的ｍＲＮＡレベルおよびシクロフィリンＢ ｍＲＮＡ（ＰＰＩＢ，ＮＭ＿０００９４２）レベルは、たとえば好ましくは標的部位が重複したＴＡＱＭＡＮ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて、トランスフェクションの２４時間後にｑＰＣＲによって評価される。トランスフェクション効率が１００％のとき、正の対照ｓｉＲＮＡはシクロフィリンＢ ｍＲＮＡの本質的に完全なノックダウンを与える。したがって、シクロフィリンＢ ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされた細胞におけるシクロフィリンＢ ｍＲＮＡレベルを参照して、標的ｍＲＮＡノックダウンをトランスフェクション効率に対して修正する。標的タンパク質レベルは、たとえばウエスタンブロットによってトランスフェクションの約７２時間後（実際の時間はタンパク質の代謝回転速度によって変わる）に評価されてもよい。培養細胞からのＲＮＡおよび／またはタンパク質単離のための標準的な技術は当業者に周知である。非特異的なオフターゲットの影響がもたらされる機会を減らすために、標的遺伝子発現において所望レベルのノックダウンを生じる可能な最も低濃度の干渉ＲＮＡが用いられる。内在性標的遺伝子のノックダウンレベルに対する干渉ＲＮＡの能力を評価するために、ヒト角膜上皮細胞またはその他のヒトの眼の細胞系も用いられてよい。
【００４４】
特定の実施形態において、干渉ＲＮＡ分子−リガンド結合体は、眼の障害に関連する遺伝子を標的とする干渉ＲＮＡ分子を含む。本発明の干渉ＲＮＡが標的とするように設計されているｍＲＮＡ標的遺伝子の例は、網膜に影響する障害に関連する遺伝子、緑内障に関連する遺伝子、および眼の炎症に関連する遺伝子を含む。
【００４５】
網膜の障害に関連するｍＲＮＡ標的遺伝子の例は、チロシンキナーゼ、内皮（ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ，ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ：ＴＥＫ）；補体因子Ｂ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｆａｃｔｏｒ Ｂ：ＣＦＢ）；低酸素誘導因子１、αサブユニット（ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ １，α ｓｕｂｕｎｉｔ：ＨＩＦ１Ａ）；ＨｔｒＡセリンペプチダーゼ１（ＨｔｒＡ ｓｅｒｉｎｅ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ １：ＨＴＲＡ１）；血小板由来成長因子受容体β（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ β：ＰＤＧＦＲＢ）；ケモカイン、ＣＸＣモチーフ、受容体４（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ，ＣＸＣ ｍｏｔｉｆ，ｒｅｃｅｐｔｏｒ ４：ＣＸＣＲ４）；インスリン様成長因子Ｉ受容体（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ Ｉ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＩＧＦ１Ｒ）；アンジオポエチン２（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ ２：ＡＮＧＰＴ２）；ｖ−ｆｏｓ ＦＢＪネズミ骨肉腫ウイルス癌遺伝子相同体（ＦＯＳ）；カテプシンＬ１、転写物変異体１（ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｌｌ，ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｖａｒｉａｎｔ １：ＣＴＳＬ１）；カテプシンＬ１、転写物変異体２（ＣＴＳＬ２）；細胞内接着分子１（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ １：ＩＣＡＭ１）；インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ１）；インテグリンα５（ｉｎｔｅｇｒｉｎ α５：ＩＴＧＡ５）；インテグリンβ１（ｉｎｔｅｇｒｉｎ β１：ＩＴＧＢ１）；核性因子カッパ−Ｂ、サブユニット１（ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｋａｐｐａ−Ｂ，ｓｕｂｕｎｉｔ １：ＮＦＫＢ１）；核性因子カッパ−Ｂ、サブユニット２（ＮＦＫＢ２）；ケモカイン、ＣＸＣモチーフ、リガンド１２（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ，ＣＸＣ ｍｏｔｉｆ，ｌｉｇａｎｄ １２：ＣＸＣＬ１２）；腫瘍壊死因子アルファ―変換酵素（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ：ＴＡＣＥ）；およびキナーゼ挿入ドメイン受容体（ｋｉｎａｓｅ ｉｎｓｅｒｔ ｄｏｍａｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＫＤＲ）を含む。
【００４６】
緑内障に関連する標的遺伝子の例は、炭酸脱水酵素ＩＩ（ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ ＩＩ：ＣＡ２）；炭酸脱水酵素ＩＶ（ＣＡ４）；炭酸脱水酵素ＸＩＩ（ＣＡ１２）；β１アドレナリン作用受容体（β１ ａｎｄｒｅｎｅｒｇｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＡＤＢＲ１）；β２アドレナリン作用受容体（ＡＤＢＲ２）；アセチルコリンエステラーゼ（ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ：ＡＣＨＥ）；Ｎａ＋／Ｋ＋− ＡＴＰアーゼ；溶質運搬体ファミリー１２（ナトリウム／カリウム／塩化物トランスポーター）、メンバー１（ｓｏｌｕｔｅ ｃａｒｒｉｅｒ ｆａｍｉｌｙ １２（ｓｏｄｉｕｍ／ｐｏｔａｓｓｉｕｍ／ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ），ｍｅｍｂｅｒ １：ＳＬＣ１２Ａ１）；溶質運搬体ファミリー１２（ナトリウム／カリウム／塩化物トランスポーター）、メンバー２（ＳＬＣ１２Ａ２）；結合組織成長因子（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ＣＴＧＦ）；血清アミロイドＡ（ｓｅｒｕｍ ａｍｙｌｏｉｄ Ａ：ＳＡＡ）；分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質１（ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｆｒｉｚｚｌｅｄ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １：ｓＦＲＰ１）；グレムリン（ｇｒｅｍｌｉｎ：ＧＲＥＭ１）；リシルオキシダーゼ（ｌｙｓｙｌ ｏｘｉｄａｓｅ：ＬＯＸ）；ｃ−Ｍａｆ；ｒｈｏ関連コイルドコイル含有プロテインキナーゼ１（ｒｈｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ １：ＲＯＣＫ１）；ｒｈｏ関連コイルドコイル含有プロテインキナーゼ２（ＲＯＣＫ２）；プラスミノーゲン活性化因子阻害因子１（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １：ＰＡＩ−１）；内皮分化、スフィンゴ脂質Ｇ−タンパク質共役受容体、３（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，ｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，３：Ｅｄｇ３ Ｒ）；ミオシリン（ｍｙｏｃｉｌｉｎ：ＭＹＯＣ）；ＮＡＤＰＨオキシダーゼ４（ＮＡＤＰＨ ｏｘｉｄａｓｅ ４：ＮＯＸ４）；プロテインキナーゼＣδ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ Ｃδ：ＰＫＣδ）；アクアポリン１（Ａｑｕａｐｏｒｉｎ １：ＡＱＰ１）；アクアポリン４（ＡＱＰ４）；補体カスケードのメンバー；ＡＴＰアーゼ、Ｈ＋輸送、リソソームＶ１サブユニットＡ（ＡＴＰａｓｅ，Ｈ＋ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ，ｌｙｓｏｓｏｍａｌ Ｖ１ ｓｕｂｕｎｉｔ Ａ：ＡＴＰ６Ｖ１Ａ）；ギャップ結合タンパク質α−１（ｇａｐ ｊｕｎｃｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ α−１：ＧＪＡ１）；ホルミルペプチド受容体１（ｆｏｒｍｙｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １：ＦＰＲ１）；ホルミルペプチド受容体様１（ｆｏｒｍｙｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ １：ＦＰＲＬ１）；インターロイキン８（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ８：ＩＬ８）；核性因子カッパ−Ｂ、サブユニット１（ＮＦＫＢ１）；核性因子カッパ−Ｂ、サブユニット２（ＮＦＫＢ２）；プレセニリン１（ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ １：ＰＳＥＮｌ）；腫瘍壊死因子アルファ―変換酵素（ＴＡＣＥ）；トランスフォーミング成長因子β２（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ β２：ＴＧＦＢ２）；一過性受容器電位カチオンチャネル、サブファミリーＶ、メンバー１（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｃａｔｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌ，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ Ｖ，ｍｅｍｂｅｒ １：ＴＲＰＶ１）；塩素イオンチャネル３（ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｃｈａｎｎｅｌ ３：ＣＬＣＮ３）；ギャップ結合タンパク質α５（ＧＪＡ５）；およびキチナーゼ３様２（ｃｈｉｔｉｎａｓｅ ３−ｌｉｋｅ ２：ＣＨＩ３Ｌ２）を含む。
【００４７】
眼の炎症に関連するｍＲＮＡ標的遺伝子の例は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー１Ａ（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，ｍｅｍｂｅｒ １Ａ：ＴＮＦＲＳＦ１Ａ）；ホスホジエステラーゼ４Ｄ、ｃＡＭＰ特異的（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ ４Ｄ，ｃＡＭＰ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ：ＰＤＥ４Ｄ）；ヒスタミン受容体Ｈ１（ｈｉｓｔａｍｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｈ１：ＨＲＨ１）；脾臓チロシンキナーゼ（ｓｐｌｅｅｎ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ：ＳＹＫ）；インターロイキン１β（ＩＬ１Ｂ）；核性因子カッパ−Ｂ、サブユニット１（ＮＦＫＢ１）；核性因子カッパ−Ｂ、サブユニット２（ＮＦＫＢ２）；および腫瘍壊死因子アルファ―変換酵素（ＴＡＣＥ）を含む。
【００４８】
こうした標的遺伝子は、たとえば米国特許出願の公開番号第２００６０１６６９１９号、第２００６０１７２９６１号、第２００６０１７２９６３号、第２００６０１７２９６５号、第２００６０２２３７７３号、第２００７０１４９４７３号、および第２００７０１５５６９０号に記載されており、これらの開示はその全体にわたり引用により援用される。
【００４９】
特定の実施形態において、本発明は患者の眼内圧を下げるための眼の医薬組成物を提供し、この医薬組成物は、眼に許容できる担体中に治療上有効な量の干渉ＲＮＡ分子を発現できる自己相補的なアデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）ベクターを含み、この干渉ＲＮＡ分子は眼の障害に関連する遺伝子の発現を低減できる。ｓｃＡＡＶベクターはｓｃＡＡＶビリオン中にパッケージングされてもよい。
【００５０】
本発明の医薬組成物は好ましくは、干渉ＲＮＡまたはその塩を最高で９９重量％含み、生理学的に許容できる担体媒質、たとえば以下に記載されるものおよび水、緩衝液、食塩水、グリシン、ヒアルロン酸、マンニトールなどと混合された調合物である。
【００５１】
本発明の干渉ＲＮＡを含むｓｃＡＡＶベクターまたは医薬組成物は、溶液、懸濁液またはエマルションとして投与されてもよい。以下は、本発明の方法において用いられ得る医薬組成物調合物の例である。
【００５２】
【化１】
【００５３】
【化２】
本明細書で用いられる「治療上有効な量」という用語は、哺乳動物において治療的応答を生じると判定される干渉ＲＮＡまたは干渉ＲＮＡを含む医薬組成物の量を示す。こうした治療上有効な量は、当業者によって本明細書に記載される方法を用いて容易に確定される。
【００５４】
一般的に、本発明の干渉ＲＮＡの治療上有効な量によって、標的細胞の表面における細胞外濃度は１００ｐＭから１μＭ、または１ｎＭから１００ｎＭ、または５ｎＭから約５０ｎＭ、または約２５ｎＭとなる。この局所濃度を達成するために必要な用量は、送達方法、送達部位、送達部位と標的細胞または組織との間の細胞層の数、送達が局所的か全身的かなどを含む多数の因子によって変動する。送達部位における濃度は、標的細胞または組織の表面での濃度よりもかなり高くなってもよい。熟練した臨床医のルーチン的判断に従って、局所組成物が眼などの標的器官の表面に１日１回から４回送達されても、または延長された送達スケジュールによって、たとえば毎日、毎週、隔週、毎月、またはそれより長く送達されてもよい。調合物のｐＨは約ｐＨ４．０から約ｐＨ９．０、または約ｐＨ４．５から約ｐＨ７．４である。
【００５５】
調合物の治療上有効な量は、たとえば対象の年齢、人種および性別、標的遺伝子転写物／タンパク質の代謝回転速度、干渉ＲＮＡの効力、および干渉ＲＮＡの安定性などの因子に依存し得る。実施形態の１つにおいて、干渉ＲＮＡを含むｓｃＡＡＶベクターは標的器官に局所的に送達されて、治療的用量で小柱網、網膜または視神経乳頭などの標的ｍＲＮＡ含有組織に到達することによって、標的遺伝子が関わる疾患プロセスを改善する。
【００５６】
標的ｍＲＮＡに向けられた干渉ＲＮＡによる患者の治療処置は、作用の持続時間を増やして投薬の頻度を減らして患者コンプライアンスを大きくすることによって、および標的特異性を上げて副作用を減らすことによって、小分子処置を超えて有益になることが期待される。
【００５７】
本明細書で用いられる「眼に許容できる担体」とは、たいていの場合、眼にほとんどまたはまったく刺激をもたらさず、必要であれば好適な保存状態を提供し、かつ本発明の１つまたは複数の干渉ＲＮＡを同質の用量で送達する担体を示す。本発明の実施形態の干渉ＲＮＡの投与に対して許容できる担体は、カチオン性脂質ベースのトランスフェクション試薬のＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）−ＴＫＯ（Ｍｉｒｕｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）またはＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）；ポリエチレンイミンなどのポリカチオン；カチオン性ペプチド、たとえばＴａｔ、ポリアルギニンまたはＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ（Ａｎｔｐペプチド）；ナノ粒子；またはリポソームを含む。リポソームは、標準的な小胞形成脂質およびコレステロールなどのステロールから形成され、たとえば細胞表面抗原に対する結合親和性を有するモノクローナル抗体などのターゲティング分子を含んでもよい。さらに、リポソームはペグ化リポソームであってもよい。
【００５８】
本発明の干渉ＲＮＡを含むｓｃＡＡＶベクターまたは医薬組成物は、溶液、懸濁液、または生物侵食性（ｂｉｏｅｒｏｄｉｂｌｅ）もしくは非生物侵食性の送達装置にて送達されてもよい。本発明の干渉ＲＮＡを含むｓｃＡＡＶベクターまたは医薬組成物は、たとえばエアロゾル投与、頬側投与、皮膚投与、皮内投与、吸入投与、筋内投与、鼻腔内投与、眼内投与、肺内投与、静脈内投与、腹膜内投与、経鼻投与、経眼投与、経口投与、経耳投与、非経口投与、パッチ投与、皮下投与、舌下投与、局所投与、または経皮投与を介して送達されてもよい。
【００５９】
特定の実施形態において、干渉ＲＮＡ分子による眼の障害の処置は、本発明の干渉ＲＮＡを含むｓｃＡＡＶベクターまたは医薬組成物を眼に直接投与することによって達成される。眼への局所投与は、以下を含む多くの理由によって有利である：全身的送達よりも用量を小さくでき、この分子が眼以外の組織で遺伝子標的をサイレンシングする機会が減る。
【００６０】
多くの研究によって、干渉ＲＮＡ分子の眼へのインビボ送達が成功し効果的であったことが示されている。たとえばＫｉｍらは、ＶＥＧＦ経路遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡの結膜下注射および全身的送達によって、マウスの眼の新脈管生成が阻害されたことを示した（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６５：２１７７−２１８５）。加えて、硝子体腔に送達されたｓｉＲＮＡは眼全体に拡散でき、注射の５日後まで検出可能であることが研究によって示されている（Ｃａｍｐｏｃｈｉａｒｏ，２００６，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １３：５５９−５６２）。
【００６１】
ｓｃＡＡＶベクターのヒト小柱網（ＴＭ）細胞への効果的なインビボ形質導入も研究によって示されている。たとえばＢｏｒｒａｓらは、ｓｃＡＡＶベクターを用いて、解離ＨＴＭ細胞および死後のドナーからのインタクトな組織におけるＴＭの形質導入を達成できたことを示した（Ｂｏｒｒａｓ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ ８：５８９−６０２）。
【００６２】
本発明の干渉ＲＮＡを含むｓｃＡＡＶベクターまたは医薬組成物は、眼組織注射、たとえば眼周囲への注射、結膜への注射、テノン嚢下注射、前房内への注射、硝子体内注射、眼内注射、網膜下注射、結膜下注射、眼球後注射、または小管内注射によって；カテーテルまたはその他の配置装置、たとえば網膜ペレット、眼内挿入、坐薬、または多孔性、非多孔性もしくはゼラチン状の材料を含む移植片を用いた眼への直接適用によって；局所的な点眼薬または軟膏によって；または盲嚢中にあるか、強膜に近接して移植される（経強膜）か、強膜中に移植される（強膜内）か、もしくは眼の中に移植される徐放性装置（ｓｌｏｗ ｒｅｌｅａｓｅ ｄｅｖｉｃｅ）によって、眼に直接送達されてもよい。前房内への注射は、薬剤が角膜を通って前房に入ることによって、小柱網への到達を可能にすることができる。小管内注射は、シュレム管を排出する静脈の集合チャネル（ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ ｃｈａｎｎｅｌｓ）に入るか、またはシュレム管に入ってもよい。
【００６３】
眼への送達のために、本発明の干渉ＲＮＡを含むｓｃＡＡＶベクターまたは医薬組成物は、眼に許容できる保存剤、共溶媒、界面活性剤、増粘剤、浸透促進剤、緩衝液、塩化ナトリウム、または水と組合されて、水性で無菌の眼科用懸濁液または溶液を形成してもよい。溶液調合物は、本発明の干渉ＲＮＡを含むｓｃＡＡＶベクターまたは医薬組成物を、生理学的に許容できる等張性の水性緩衝液に溶解することによって調製されてもよい。さらにこの溶液は、本発明の干渉ＲＮＡを含むｓｃＡＡＶベクターまたは医薬組成物の溶解を助けるために、許容できる界面活性剤を含んでもよい。粘度上昇剤、たとえばヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどを本発明の組成物に加えることで、化合物の保持を改善してもよい。
【００６４】
無菌の眼軟膏調合物を調製するために、本発明の干渉ＲＮＡを含むｓｃＡＡＶベクターまたは医薬組成物は、ミネラルオイル、液体ラノリン、または白色ワセリンなどの適切な媒体中の保存剤と組合される。無菌の眼ゲル調合物は、当該技術分野において公知の方法に従って、たとえばＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）−９４０（ＢＦ Ｇｏｏｄｒｉｃｈ，Ｃｈａｒｌｏｔｔｅ，ＮＣ）などの組合せから調製される親水性塩基に干渉ＲＮＡを懸濁することによって調製されてもよい。たとえば、ＶＩＳＣＯＡＴ（登録商標）（Ａｌｃｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｒｔ Ｗｏｒｔｈ，ＴＸ）が眼内注射に用いられてもよい。本発明の他の組成物は、万一、干渉ＲＮＡが眼に浸透しにくい場合には、ｃｒｅｍｅｐｈｏｒおよびＴＷＥＥＮ（登録商標）８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）などの浸透促進剤を含有してもよい。
【００６５】
特定の実施形態において、本発明は、細胞中で本明細書に挙げられるとおりのｍＲＮＡの発現を低減させるための試薬を含むキットも提供する。このキットは、眼の障害に関連する遺伝子の発現を低減できる干渉ＲＮＡ、および／またはｓｃＡＡＶベクター、および／またはｓｃＡＡＶベクター生成のために必要な構成要素（例、パッケージング細胞系、ならびにウイルスベクター鋳型を含むベクターおよびパッケージングのための付加的なヘルパーベクター）を含む。キットは、正および負の対照ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ発現ベクター（例、非ターゲティング対照ｓｉＲＮＡまたは無関係のｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ）も含んでいてもよい。キットは、意図される標的遺伝子のノックダウンを評価するための試薬（例、標的ｍＲＮＡを検出するための定量的ＰＣＲに対するプライマおよびプローブ、および／またはウエスタンブロットのための対応タンパク質に対する抗体）も含んでいてもよい。代替的には、キットはｓｉＲＮＡ配列またはｓｈＲＮＡ配列、ならびにインビトロ転写によってｓｉＲＮＡを生成するかまたはｓｈＲＮＡ発現ベクターを構築するために必要な指示書および材料を含んでもよい。
【００６６】
容器媒体を厳重に閉じ込めて収容する適合された担体媒体と、干渉ＲＮＡ組成物およびｓｃＡＡＶベクターを含む最初の容器媒体とをパッケージングされた組合せで含む、キット形式の医薬的組合せがさらに提供される。当業者に容易に明らかとなるとおり、こうしたキットは所望であれば、さまざまな従来の医薬キット構成要素の１つまたは複数、たとえば１つもしくは複数の医薬的に許容できる担体を有する容器、付加的な容器などをさらに含んでもよい。キットには、投与される構成要素の量、投与のための指針、および／または構成要素を混合するための指針を示す、挿入物またはラベルとしての印刷された指示書も含まれていてもよい。
【００６７】
本明細書に引用される参考文献は、本明細書に示されるものの例示的手順またはその他の詳細の補足を与える程度まで、特定的に引用により援用される。
【００６８】
当業者は本開示に照らして、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に開示される実施形態の明らかな修正を行ない得ることを認めるであろう。本明細書に開示されるすべての実施形態は、本開示に照らして過度の実験なしに作成および実行できる。本開示およびそれと同等の実施形態には、本発明のすべての範囲が示されている。本明細書は、本発明が権利を有する保護のすべての範囲を不当に狭くするものと解釈されるべきではない。
【００６９】
前述の開示は本発明のある特定の実施形態を強調したものであり、それと同等のすべての修正形または代替形は、添付の特許請求の範囲に示されるとおりの本発明の精神および範囲内にあることが理解されるべきである。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項の下、２００７年１０月１日に出願された米国仮特許出願第６０／９７６，５５２号の利益を主張し、この米国仮特許出願の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、自己相補的なアデノ随伴（ｓｅｌｆ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ：ｓｃＡＡＶ）ウイルスベクターを介して、干渉ＲＮＡ分子を患者の眼に送達する方法に関する。本発明は、本発明の干渉ＲＮＡ分子−ｓｃＡＡＶベクターをそれを必要とする患者に投与することによって、眼の障害を処置するための方法にも関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：ＲＮＡｉ）とは、２本鎖ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ：ｄｓＲＮＡ）を用いて遺伝子発現を停止させるプロセスである。ＲＮＡｉは、細胞中に存在する短い（すなわち＜３０ヌクレオチドの）２本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）分子によって誘導される（非特許文献１）。これらの短いｄｓＲＮＡ分子は「短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）」または「ｓｉＲＮＡ」と呼ばれ、１ヌクレオチド分解能内でｓｉＲＮＡとの配列相同性を共有するメッセンジャーＲＮＡ（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ；「ｍＲＮＡ」）の破壊をもたらす（非特許文献２）。ｓｉＲＮＡの一方の鎖は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ：ＲＩＳＣ）として公知であるリボ核タンパク質複合体に取込まれると考えられている。ＲＩＳＣはこのｓｉＲＮＡ鎖を用いて、取込まれたｓｉＲＮＡ鎖と少なくとも部分的に相補的であるｍＲＮＡ分子を識別し、これらの標的ｍＲＮＡを切断するか、またはその翻訳を妨げる。ｓｉＲＮＡは多重代謝回転酵素と同様に再利用されていることが明らかであり、１個のｓｉＲＮＡ分子が約１０００個のｍＲＮＡ分子の切断を誘導できる。したがって、ｍＲＮＡのｓｉＲＮＡ媒介型ＲＮＡｉ分解は、標的遺伝子の発現を阻害するための現在利用可能な技術よりも効果的である。
【０００４】
ＲＮＡｉは、疾患を処置および／または予防するための非常に興味深いアプローチを提供する。さまざまな伝統的治療アプローチに比べて、ＲＮＡｉは以下を含むいくつかの主要な利点を有する：ＲＮＡｉは疾患プロセスに関与する非常に特定的な遺伝子を高度に特異的に標的にできるため、オフターゲットの影響を低減または除去できる；ＲＮＡｉは、高度に特異的なＲＮＡ分解を起こし、遺伝子サイレンシング効果を細胞間に広げる通常の細胞プロセスである；ＲＮＡｉは、多くの抗体に基づく療法のように宿主の免疫応答を誘発しない。
【０００５】
ｓｉＲＮＡを用いた眼の疾患の標的遺伝子の特定的なインビボターゲティングおよびノックダウンは、ｓｉＲＮＡを小柱網（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｍｅｓｈｗｏｒｋ：ＴＭ）標的組織に送達する際のある種の物理的制限を伴う。加えて、核酸は一般的に硝子体内半減期が短いため、干渉ＲＮＡを連続的に存在させるために繰り返し眼内注射を行なう必要があるかもしれない。これらの理由から、長期送達のための方法が必要とされる。
【０００６】
いくつかの干渉ＲＮＡ送達方法がインビボでの使用のためにテスト／開発されている。たとえば、ｓｉＲＮＡは、食塩水中で「裸で」；ポリカチオン、カチオン性脂質／脂質トランスフェクション試薬、またはカチオン性ペプチドと複合化して；定めた分子結合体の構成要素として（例、コレステロール修飾されたｓｉＲＮＡ、ＴＡＴ−ＤＲＢＤ／ｓｉＲＮＡ複合体）；リポソームの構成要素として；および、ナノ粒子の構成要素として送達されてもよい。
【０００７】
硝子体内または前房内に送達されたアデノウイルスｓｈＲＮＡを用いたＴＭのウイルス形質導入は可能なアプローチの１つだが、これはヒトでの使用においていくつかのネガティブな結果が得られており、その中には抗アデノウイルス応答による除去のため発現が一時的であることが含まれる。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は１本鎖ＤＮＡゲノムからなっており、毒性が僅かであるので遺伝子療法のためのウイルスベクターとして使用されている。残念ながら、ＡＡＶはＴＭ細胞を効率的に形質導入しない。
【０００８】
これらのアプローチは成功の程度にばらつきを示したため、インビボでｓｉＲＮＡ分子を送達してＲＮＡｉの治療上の可能性を達成しかつ高めるための新しい改善された方法がなおも必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ ３９１：８０６−８１１
【非特許文献２】Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ，１５：１８８−２００
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は、患者の眼における標的ｍＲＮＡの発現を低減させる方法を提供し、この方法は（ａ）干渉ＲＮＡ分子を含む自己相補的なアデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）ベクターを与えるステップと；（ｂ）ｓｃＡＡＶベクターを患者の眼に投与するステップとを含み、この干渉ＲＮＡ分子は眼における標的ｍＲＮＡの発現を低減できる。
【００１１】
１つの局面において、患者は眼の障害、たとえば眼の血管新生、ドライアイ、眼の炎症状態、高眼圧または緑内障を有する。別の局面において、干渉ＲＮＡ分子は眼の障害、たとえば眼の血管新生、ドライアイ、眼の炎症状態、高眼圧または緑内障に関連する遺伝子を標的とする。
【００１２】
ベクターは、たとえば眼内注射、眼への局所適用、静脈内注射、経口投与、筋内注射、腹腔内注射、経皮適用または経粘膜適用によって投与されてもよい。
【００１３】
本発明は、治療上有効な量の干渉ＲＮＡ分子および眼に許容できる担体を有する自己相補的なアデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）ベクターを含む医薬組成物も提供し、この干渉ＲＮＡ分子は眼の障害に関連する遺伝子の発現を低減できる。ｓｃＡＡＶベクターはｓｃＡＡＶビリオン中にパッケージングされてもよい。
【００１４】
特定の好ましい実施形態の以下のより詳細な説明および本特許請求の範囲から、本発明の特定の好ましい実施形態が明らかになるであろう。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（発明の詳細な説明）
本明細書中の事項は、例としておよび本発明の好ましい実施形態の例示的な考察の目的のためにのみ示されるものであり、本発明のさまざまな実施形態の原理および概念的局面を最も有用かつ容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために示されている。このことに関して、本発明の構造的詳細を本発明の基本的な理解のために必要である以上に詳細に示すための試みはなされておらず、図面および／または実施例を伴う説明によって、本発明のいくつかの形態をどのようにして実際に実施できるかを当業者に明らかにするものである。
【００１６】
以下の実施例において明瞭かつ明白に変更されていない限り、またはその意味を適用することによっていずれかの構成が無意味もしくは本質的に無意味にならない限り、以下の定義および説明はあらゆる今後の構成を統制することを意味して意図されるものである。その用語の構成が無意味または本質的に無意味になる場合には、定義をＷｅｂｓｔｅｒ’ｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙの第３版または当業者に公知の辞書、たとえばＯｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｎｔｈｏｎｙ Ｓｍｉｔｈ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、２００４）から取るべきである。
【００１７】
別様に述べられていない限り、本明細書で用いられるすべてのパーセンテージは重量パーセントである。
【００１８】
本明細書で用いられていて別様に示されていない限り、“ａ”および“ａｎ”という用語は「１つ」、「少なくとも１つ」または「１つまたは複数」を意味するものとする。文脈によって別様に要求されない限り、本明細書で用いられる単数形用語は複数を含み、複数形用語は単数形を含む。
【００１９】
特定の実施形態において、本発明は患者の眼における標的ｍＲＮＡの発現を低減させる方法を提供し、この方法は（ａ）眼の中で発現される遺伝子を標的とする干渉ＲＮＡ分子を含む自己相補的なアデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）ベクターを与えるステップと；（ｂ）ｓｃＡＡＶベクターを患者の眼に投与するステップとを含み、この干渉ＲＮＡ分子は眼における標的ｍＲＮＡの発現を低減できる。特定の実施形態において、ｓｃＡＡＶベクターはｓｃＡＡＶビリオン中にパッケージングされる。
【００２０】
特定の実施形態において、本発明は患者の眼の障害を予防または処置する方法を提供し、この方法は（ａ）眼の障害に関連する遺伝子を標的とする干渉ＲＮＡ分子を含む自己相補的なアデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）ベクターを与えるステップと；（ｂ）ｓｃＡＡＶベクターを患者の眼に投与するステップとを含み、この干渉ＲＮＡ分子は眼の障害に関連する遺伝子の発現を低減できる。ｓｃＡＡＶベクターはｓｃＡＡＶビリオン中にパッケージングされてもよい。特定の実施形態において、眼の障害は眼内圧（ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒ ｐｒｅｓｓｕｒｅ：ＩＯＰ）の上昇、たとえば高眼圧または緑内障に関連する。
【００２１】
本明細書で用いられる「患者」という用語は、眼の障害を有するかまたは眼の障害を有する危険性のあるヒトまたはその他の哺乳動物を意味する。こうした障害に関連する眼の構造は、たとえば眼球、網膜、脈絡膜、水晶体、角膜、小柱網、虹彩、視神経、視神経乳頭、強膜、前区もしくは後区、または毛様体を含んでもよい。特定の実施形態において、患者は小柱網（ＴＭ）細胞、毛様体上皮細胞、または眼の別の細胞型に関連する眼の障害を有する。
【００２２】
本明細書で用いられる「眼の障害」という用語は、眼の血管新生、ドライアイ、炎症状態、高眼圧および眼内圧（ＩＯＰ）の上昇に関連する眼の疾患、たとえば緑内障に関連する状態を含む。
【００２３】
本明細書で用いられる「眼の血管新生」という用語は、眼の血管新生促進状態および眼の血管新生状態を含み、たとえば眼の血管新生、眼の新血管新生、網膜浮腫、糖尿病性網膜症、網膜虚血に伴う後遺症、後区新血管新生（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ｓｅｇｍｅｎｔ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ：ＰＳＮＶ）、および血管新生緑内障を含む。本発明の方法において用いられる干渉ＲＮＡは、たとえば眼の血管新生、眼の新血管新生、網膜浮腫、糖尿病性網膜症、網膜虚血に伴う後遺症、後区新血管新生（ＰＳＮＶ）、および血管新生緑内障の患者、またはこうした状態を発生させる危険性のある患者を処置するために有用である。「眼の新血管新生」という用語は、加齢黄斑変性、白内障、急性虚血性視神経障害（ａｃｕｔｅ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｏｐｔｉｃ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ：ＡＩＯＮ）、網膜振とう症、網膜剥離、網膜裂孔または網膜円孔、医原性網膜症およびその他の虚血性網膜症または視神経障害、近眼、網膜色素変性などを含む。
【００２４】
本明細書で用いられる「炎症状態」という用語は、眼の炎症およびアレルギー性結膜炎などの状態を含む。
【００２５】
本明細書で用いられる「組換えＡＡＶ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＡＡＶ：ｒＡＡＶ）ベクター」という用語は、少なくとも１つの末端繰り返し配列を含有する組換えＡＡＶ由来核酸を意味する。自己相補的なＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクターは、１つのｒＡＡＶ ＴＲから末端分解部位（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｉｔｅ：ＴＲ）を除去し、変異端部における複製の開始を防ぐことによって生成された２本鎖ベクターゲノムを含有する。これらの構築物は、各端部に野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ：ｗｔ）ＴＲを、中央に変異ＴＲを有する１本鎖の逆方向反復ゲノムを生じる。いくつかの自然発生するハイブリッドＡＡＶ血清型が公知であり、それはＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３Ａ、ＡＡＶ−３Ｂ、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−９、ＡＡＶ−１０、およびＡＡＶ−１１を含む（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：２９９−３１０）。ＡＡＶのこれらの血清型または他の血清型のいずれかに基づいてｓｃＡＡＶベクターを生成できることが当業者に認識されるだろう。
【００２６】
本明細書で用いられる「ｓｃＡＡＶビリオン」という言い回しは、本明細書に記載される本発明に従って宿主細胞に感染して宿主細胞に干渉ＲＮＡ分子を送達することのできる、ｓｃＡＡＶベクターおよびタンパク質コートを含む完全なウイルス粒子を意味する。
【００２７】
本明細書において提供されるものなどの干渉ＲＮＡ分子を含むｓｃＡＡＶベクターおよびｓｃＡＡＶビリオンの生成については、Ｘｕら（２００５，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １１：５２３−５３０）およびＢｏｒｒａｓら（２００６，Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ ８：５８９−６０２）によってさらに論じられている。Ｘｕらは、ＭＤＲ１遺伝子発現を抑制するためにｓｃＡＡＶベクターを用いてｓｉＲＮＡを多剤耐性のヒトの乳癌および口腔癌細胞に送達した。Ｂｏｒｒａｓらは、ヒト小柱網（ＴＭ）細胞およびヒトＴＭ灌流器官培養物の非常に効率的なｓｃＡＡＶ形質導入を示した。加えて、Ｙｏｋｏｉ，Ｋ．ら（２００７，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ，４８：３３２４−３３２８）はタイプ２ｓｃＡＡＶベクターを網膜下腔に注射して、網膜上皮細胞における緑色蛍光タンパク質の発現を観察した。
【００２８】
本発明の方法は、ＲＮＡ干渉を用いて患者の眼の特定の遺伝子の発現を低減させるために有用である。
【００２９】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）とは、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を用いて遺伝子発現を停止させるプロセスである。理論に束縛されることは望まないが、ＲＮＡｉは、ＲＮアーゼＩＩＩ様酵素であるダイサーによって、長いｄｓＲＮＡが短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に切断されることによって始まる。ｓｉＲＮＡは、通常は長さが約１９ヌクレオチドから２８ヌクレオチド、または２０ヌクレオチドから２５ヌクレオチド、または２１ヌクレオチドから２２ヌクレオチドのｄｓＲＮＡであり、しばしば２ヌクレオチドの３’オーバーハング、ならびに５’リン酸末端および３’ヒドロキシル末端を含有する。ｓｉＲＮＡの一方の鎖は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として公知であるリボ核タンパク質複合体に取込まれる。ＲＩＳＣはこのｓｉＲＮＡ鎖を用いて、取込まれたｓｉＲＮＡ鎖と少なくとも部分的に相補的であるｍＲＮＡ分子を識別し、これらの標的ｍＲＮＡを切断するか、またはその翻訳を妨げる。したがって、ＲＩＳＣに取込まれるｓｉＲＮＡ鎖はガイド鎖またはアンチセンス鎖として公知である。他方のｓｉＲＮＡ鎖はパッセンジャー鎖またはセンス鎖として公知であり、これはｓｉＲＮＡから取除かれ、標的ｍＲＮＡと少なくとも部分的に相同である。原則として、ｓｉＲＮＡのどちらの鎖もＲＩＳＣに取込まれてガイド鎖として機能し得ることが当業者に認識されるであろう。しかし、ｓｉＲＮＡ設計（例、所望のガイド鎖の５’末端におけるｓｉＲＮＡ２本鎖安定性の減少）によって、所望のガイド鎖のＲＩＳＣへの取込みを有利にできる。
【００３０】
ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、次の点においてｓｉＲＮＡの活性誘導剤である。すなわち、アンチセンス鎖はＲＩＳＣに取込まれることによって、ＲＩＳＣが切断または翻訳抑制のためにアンチセンスｓｉＲＮＡ鎖に対する少なくとも部分的な相補性を有する標的ｍＲＮＡを識別することを可能にする。ガイド鎖と少なくとも部分的に相補である配列を有するｍＲＮＡをＲＩＳＣを介して切断することにより、そのｍＲＮＡおよびこのｍＲＮＡがコードする対応タンパク質の定常状態レベルが減少する。代替的には、ＲＩＳＣは標的ｍＲＮＡを切断することなく翻訳抑制を介して対応タンパク質の発現を減少させることもできる。
【００３１】
干渉ＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの切断に対して触媒的な態様で作用するように見える。すなわち、干渉ＲＮＡは準化学量論的な量で標的ｍＲＮＡの阻害に影響できる。アンチセンス療法と比較して、こうした切断状態下で治療効果を与えるために必要な干渉ＲＮＡはかなり少なくなる。
【００３２】
特定の実施形態において、本発明は、干渉ＲＮＡを送達して標的ｍＲＮＡの発現を阻害することによって、眼の障害を有する患者における標的ｍＲＮＡレベルを減少させる方法を提供する。
【００３３】
本明細書で用いられる「標的ｍＲＮＡの発現を低減させる」という言い回しは、ある量の干渉ＲＮＡ（例、ｓｉＲＮＡ）を投与または発現させて、ｍＲＮＡの切断または翻訳の直接的阻害のいずれかによって、標的ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を減らすことを意味する。本明細書で用いられる「阻害する」、「サイレンシング」、および「低減する」という用語は、本発明の方法において用いられる干渉ＲＮＡの不在下での標的ｍＲＮＡまたは対応タンパク質の発現と比較したときの、標的ｍＲＮＡまたは対応タンパク質の発現が測定可能なほどに減少することを示す。標的ｍＲＮＡまたは対応タンパク質の発現の減少は一般的には「ノックダウン」と呼ばれ、非ターゲティング対照ＲＮＡ（例、非ターゲティング対照ｓｉＲＮＡ）の投与または発現の後に存在するレベルと比較して報告される。本明細書の実施形態では、５０％から１００％の間を含む量の発現のノックダウンが予期される。しかし、本発明の目的のためにこうしたノックダウンレベルを達成することが必要なわけではない。
【００３４】
ノックダウンは通常、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ：ｑＰＣＲ）増幅を用いてｍＲＮＡレベルを測定するか、またはウエスタンブロットもしくは酵素結合免疫吸着検定法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）によってタンパク質レベルを測定することによって評価される。タンパク質レベルの分析によって、ｍＲＮＡ切断および翻訳阻害の両方の評価が得られる。ノックダウンを測定するためのさらなる技術には、ＲＮＡ溶液ハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼプロテクション、ノーザンハイブリダイゼーション、マイクロアレイによる遺伝子発現モニタリング、抗体結合、ラジオイムノアッセイ、および蛍光標識細胞分析が含まれる。
【００３５】
干渉ＲＮＡ分子による標的遺伝子発現の低減は、ヒトまたはその他の哺乳動物において、眼の障害の症状の改善、たとえば緑内障標的遺伝子の阻害を示す眼内圧の低下を観察することによって推測できる。
【００３６】
実施形態の１つにおいては、単一の干渉ＲＮＡ分子が送達されて標的ｍＲＮＡレベルを低下させる。他の実施形態においては、ｍＲＮＡを標的とする２つまたはそれを超える干渉ＲＮＡが投与されて標的ｍＲＮＡレベルを低下させる。複数の干渉ＲＮＡは同じｓｃＡＡＶベクターで送達されても、別個のベクターで送達されてもよい。
【００３７】
本明細書で用いられる「干渉ＲＮＡ」および「干渉ＲＮＡ分子」という用語は、ＲＩＳＣと相互作用してＲＩＳＣの媒介する遺伝子発現変化に関与することができるすべてのＲＮＡ分子またはＲＮＡ様分子を示す。ＲＩＳＣと相互作用できる他の干渉ＲＮＡ分子の例には、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ：ｓｈＲＮＡ）、１本鎖ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ）、およびダイサー−基質の２７マーの２本鎖が含まれる。ＲＩＳＣと相互作用できる「ＲＮＡ様」分子の例には、１つもしくは複数の化学修飾されたヌクレオチド、１つもしくは複数の非ヌクレオチド、１つもしくは複数のデオキシリボヌクレオチド、ならびに／または１つもしくは複数の非ホスホジエステル結合を含有するｓｉＲＮＡ、１本鎖ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡ分子が含まれる。よってｓｉＲＮＡ、１本鎖ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびダイサー−基質の２７マーの２本鎖は、「干渉ＲＮＡ」または「干渉ＲＮＡ分子」のサブセットである。
【００３８】
本明細書で用いられる「ｓｉＲＮＡ」という用語は、別様に述べられていない限り２本鎖干渉ＲＮＡを示す。典型的には、本発明の方法で用いられるｓｉＲＮＡは２本のヌクレオチド鎖を含む２本鎖の核酸分子であり、各々の鎖は約１９ヌクレオチドから約２８ヌクレオチド（すなわち、約１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、または２８ヌクレオチド）を有する。典型的には、本発明の方法で用いられる干渉ＲＮＡは約１９ヌクレオチドから約４９ヌクレオチドの長さである。２本鎖干渉ＲＮＡを示すときの「１９ヌクレオチドから４９ヌクレオチドの長さ」という言い回しは、アンチセンス鎖およびセンス鎖が独立に約１９ヌクレオチドから約４９ヌクレオチドの長さを有することを意味しており、そこにはセンス鎖およびアンチセンス鎖がリンカー分子によって接続された干渉ＲＮＡ分子が含まれる。
【００３９】
１本鎖干渉ＲＮＡは、２本鎖ＲＮＡほど効率的ではないがｍＲＮＡサイレンシングをもたらすことが見出されている。したがって、本発明の実施形態は１本鎖干渉ＲＮＡの投与も提供する。上述の２本鎖干渉ＲＮＡと同様に、１本鎖干渉ＲＮＡは約１９ヌクレオチドから約４９ヌクレオチドの長さを有する。１本鎖干渉ＲＮＡは５’リン酸を有するか、または５’位置にてインサイツもしくはインビボでリン酸化されている。「５’リン酸化」という用語は、たとえばポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの５’末端において糖（例、リボース、デオキシリボースまたはその類似物）のＣ５ヒドロキシルにエステル結合を介して結合したリン酸基を有するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを説明するために用いられる。
【００４０】
１本鎖干渉ＲＮＡは化学的に、またはインビトロ転写によって合成されてもよいし、２本鎖干渉ＲＮＡに関して本明細書に記載されるものと同様にベクターまたは発現カセットから内因的に発現されてもよい。５’リン酸基はキナーゼを介して付加されてもよいし、ＲＮＡのヌクレアーゼ切断の結果として５’リン酸が得られてもよい。ヘアピン干渉ＲＮＡは、ステムループまたはヘアピン構造中に干渉ＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む単一分子（例、単一のオリゴヌクレオチド鎖）である（例、ｓｈＲＮＡ）。たとえば、センス干渉ＲＮＡ鎖をコードするＤＮＡオリゴヌクレオチドが、短いスペーサーによって逆の相補的アンチセンス干渉ＲＮＡ鎖をコードするＤＮＡオリゴヌクレオチドに結合されているようなＤＮＡベクターからｓｈＲＮＡが発現されてもよい。選択される発現ベクターに対して必要であれば、３’末端Ｔおよび制限酵素部位を形成するヌクレオチドが付加されてもよい。その結果得られるＲＮＡ転写物は、自身の上に折り返してステムループ構造を形成する。
【００４１】
本明細書で用いられる「標的配列」および「標的ｍＲＮＡ」という言い回しは、本発明の方法で用いられる干渉ＲＮＡが認識できるｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ配列の部分を示し、これによって干渉ＲＮＡは本明細書に考察されるとおりに遺伝子発現を停止させることができる。
【００４２】
標的ｍＲＮＡ配列内の干渉ＲＮＡ標的配列（例、ｓｉＲＮＡ標的配列）は、利用可能な設計ツールを用いて選択される。ｓｉＲＮＡに対する標的配列を選択するための技術は、たとえばＴｕｓｃｈｌ，Ｔ．ら、“Ｔｈｅ ｓｉＲＮＡ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ”、２００４年５月６日改訂、Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙウェブサイトにて入手可能；Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ＃５０６、“ｓｉＲＮＡ Ｄｅｓｉｇｎ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ”、Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．、Ａｍｂｉｏｎのウェブサイト；およびその他のウェブに基づく設計ツール、たとえばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、またはＰｒｏｌｉｇｏのウェブサイト上のものによって提供されている。最初のサーチパラメータは、３５％から５５％のＧ／Ｃ含有量および１９ヌクレオチドから２７ヌクレオチドのｓｉＲＮＡの長さを含んでもよい。標的配列は、ｍＲＮＡのコード領域に位置しても、５’または３’非翻訳領域に位置してもよい。標的配列を用いて、本明細書に記載されるものなどの干渉ＲＮＡ分子を得ることができる。標的配列に対応する干渉ＲＮＡは、標的ｍＲＮＡを発現する細胞のトランスフェクションの後に本明細書に記載されるとおりのノックダウンの評価を行なうことによって、インビトロでテストできる。干渉ＲＮＡは、当業者に公知の動物モデルを用いて、インビボでさらに評価されてもよい。
【００４３】
たとえばＨｅＬａ細胞における内因性標的遺伝子発現のレベルを干渉ＲＮＡがノックダウンする能力は、以下のとおりにインビトロで評価できる。ＨｅＬａ細胞を、トランスフェクションの２４時間前に標準的な増殖培地（例、ＤＭＥＭに１０％ウシ胎児血清を補ったもの）にてプレート培養する。０．１ｎＭ〜１００ｎＭの範囲の干渉ＲＮＡ濃度にて、たとえばＤｈａｒｍａｆｅｃｔ １（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）を用いて、製造者の指示書に従ってトランスフェクションを行なう。ＳｉＣＯＮＴＲＯＬ（商標）Ｎｏｎ−Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｉＲＮＡ ＃１およびｓｉＣＯＮＴＲＯＬ（商標）Ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ Ｂ ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）は、それぞれ負の対照および正の対照として用いられる。標的ｍＲＮＡレベルおよびシクロフィリンＢ ｍＲＮＡ（ＰＰＩＢ，ＮＭ＿０００９４２）レベルは、たとえば好ましくは標的部位が重複したＴＡＱＭＡＮ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて、トランスフェクションの２４時間後にｑＰＣＲによって評価される。トランスフェクション効率が１００％のとき、正の対照ｓｉＲＮＡはシクロフィリンＢ ｍＲＮＡの本質的に完全なノックダウンを与える。したがって、シクロフィリンＢ ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされた細胞におけるシクロフィリンＢ ｍＲＮＡレベルを参照して、標的ｍＲＮＡノックダウンをトランスフェクション効率に対して修正する。標的タンパク質レベルは、たとえばウエスタンブロットによってトランスフェクションの約７２時間後（実際の時間はタンパク質の代謝回転速度によって変わる）に評価されてもよい。培養細胞からのＲＮＡおよび／またはタンパク質単離のための標準的な技術は当業者に周知である。非特異的なオフターゲットの影響がもたらされる機会を減らすために、標的遺伝子発現において所望レベルのノックダウンを生じる可能な最も低濃度の干渉ＲＮＡが用いられる。内在性標的遺伝子のノックダウンレベルに対する干渉ＲＮＡの能力を評価するために、ヒト角膜上皮細胞またはその他のヒトの眼の細胞系も用いられてよい。
【００４４】
特定の実施形態において、干渉ＲＮＡ分子−リガンド結合体は、眼の障害に関連する遺伝子を標的とする干渉ＲＮＡ分子を含む。本発明の干渉ＲＮＡが標的とするように設計されているｍＲＮＡ標的遺伝子の例は、網膜に影響する障害に関連する遺伝子、緑内障に関連する遺伝子、および眼の炎症に関連する遺伝子を含む。
【００４５】
網膜の障害に関連するｍＲＮＡ標的遺伝子の例は、チロシンキナーゼ、内皮（ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ，ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ：ＴＥＫ）；補体因子Ｂ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｆａｃｔｏｒ Ｂ：ＣＦＢ）；低酸素誘導因子１、αサブユニット（ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ １，α ｓｕｂｕｎｉｔ：ＨＩＦ１Ａ）；ＨｔｒＡセリンペプチダーゼ１（ＨｔｒＡ ｓｅｒｉｎｅ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ １：ＨＴＲＡ１）；血小板由来成長因子受容体β（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ β：ＰＤＧＦＲＢ）；ケモカイン、ＣＸＣモチーフ、受容体４（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ，ＣＸＣ ｍｏｔｉｆ，ｒｅｃｅｐｔｏｒ ４：ＣＸＣＲ４）；インスリン様成長因子Ｉ受容体（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ Ｉ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＩＧＦ１Ｒ）；アンジオポエチン２（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ ２：ＡＮＧＰＴ２）；ｖ−ｆｏｓ ＦＢＪネズミ骨肉腫ウイルス癌遺伝子相同体（ＦＯＳ）；カテプシンＬ１、転写物変異体１（ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｌｌ，ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｖａｒｉａｎｔ １：ＣＴＳＬ１）；カテプシンＬ１、転写物変異体２（ＣＴＳＬ２）；細胞内接着分子１（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ １：ＩＣＡＭ１）；インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ１）；インテグリンα５（ｉｎｔｅｇｒｉｎ α５：ＩＴＧＡ５）；インテグリンβ１（ｉｎｔｅｇｒｉｎ β１：ＩＴＧＢ１）；核性因子カッパ−Ｂ、サブユニット１（ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｋａｐｐａ−Ｂ，ｓｕｂｕｎｉｔ １：ＮＦＫＢ１）；核性因子カッパ−Ｂ、サブユニット２（ＮＦＫＢ２）；ケモカイン、ＣＸＣモチーフ、リガンド１２（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ，ＣＸＣ ｍｏｔｉｆ，ｌｉｇａｎｄ １２：ＣＸＣＬ１２）；腫瘍壊死因子アルファ―変換酵素（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ：ＴＡＣＥ）；およびキナーゼ挿入ドメイン受容体（ｋｉｎａｓｅ ｉｎｓｅｒｔ ｄｏｍａｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＫＤＲ）を含む。
【００４６】
緑内障に関連する標的遺伝子の例は、炭酸脱水酵素ＩＩ（ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ ＩＩ：ＣＡ２）；炭酸脱水酵素ＩＶ（ＣＡ４）；炭酸脱水酵素ＸＩＩ（ＣＡ１２）；β１アドレナリン作用受容体（β１ ａｎｄｒｅｎｅｒｇｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＡＤＢＲ１）；β２アドレナリン作用受容体（ＡＤＢＲ２）；アセチルコリンエステラーゼ（ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ：ＡＣＨＥ）；Ｎａ＋／Ｋ＋− ＡＴＰアーゼ；溶質運搬体ファミリー１２（ナトリウム／カリウム／塩化物トランスポーター）、メンバー１（ｓｏｌｕｔｅ ｃａｒｒｉｅｒ ｆａｍｉｌｙ １２（ｓｏｄｉｕｍ／ｐｏｔａｓｓｉｕｍ／ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ），ｍｅｍｂｅｒ １：ＳＬＣ１２Ａ１）；溶質運搬体ファミリー１２（ナトリウム／カリウム／塩化物トランスポーター）、メンバー２（ＳＬＣ１２Ａ２）；結合組織成長因子（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ＣＴＧＦ）；血清アミロイドＡ（ｓｅｒｕｍ ａｍｙｌｏｉｄ Ａ：ＳＡＡ）；分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質１（ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｆｒｉｚｚｌｅｄ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １：ｓＦＲＰ１）；グレムリン（ｇｒｅｍｌｉｎ：ＧＲＥＭ１）；リシルオキシダーゼ（ｌｙｓｙｌ ｏｘｉｄａｓｅ：ＬＯＸ）；ｃ−Ｍａｆ；ｒｈｏ関連コイルドコイル含有プロテインキナーゼ１（ｒｈｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ １：ＲＯＣＫ１）；ｒｈｏ関連コイルドコイル含有プロテインキナーゼ２（ＲＯＣＫ２）；プラスミノーゲン活性化因子阻害因子１（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １：ＰＡＩ−１）；内皮分化、スフィンゴ脂質Ｇ−タンパク質共役受容体、３（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，ｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，３：Ｅｄｇ３ Ｒ）；ミオシリン（ｍｙｏｃｉｌｉｎ：ＭＹＯＣ）；ＮＡＤＰＨオキシダーゼ４（ＮＡＤＰＨ ｏｘｉｄａｓｅ ４：ＮＯＸ４）；プロテインキナーゼＣδ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ Ｃδ：ＰＫＣδ）；アクアポリン１（Ａｑｕａｐｏｒｉｎ １：ＡＱＰ１）；アクアポリン４（ＡＱＰ４）；補体カスケードのメンバー；ＡＴＰアーゼ、Ｈ＋輸送、リソソームＶ１サブユニットＡ（ＡＴＰａｓｅ，Ｈ＋ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ，ｌｙｓｏｓｏｍａｌ Ｖ１ ｓｕｂｕｎｉｔ Ａ：ＡＴＰ６Ｖ１Ａ）；ギャップ結合タンパク質α−１（ｇａｐ ｊｕｎｃｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ α−１：ＧＪＡ１）；ホルミルペプチド受容体１（ｆｏｒｍｙｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １：ＦＰＲ１）；ホルミルペプチド受容体様１（ｆｏｒｍｙｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ １：ＦＰＲＬ１）；インターロイキン８（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ８：ＩＬ８）；核性因子カッパ−Ｂ、サブユニット１（ＮＦＫＢ１）；核性因子カッパ−Ｂ、サブユニット２（ＮＦＫＢ２）；プレセニリン１（ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ １：ＰＳＥＮｌ）；腫瘍壊死因子アルファ―変換酵素（ＴＡＣＥ）；トランスフォーミング成長因子β２（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ β２：ＴＧＦＢ２）；一過性受容器電位カチオンチャネル、サブファミリーＶ、メンバー１（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｃａｔｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌ，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ Ｖ，ｍｅｍｂｅｒ １：ＴＲＰＶ１）；塩素イオンチャネル３（ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｃｈａｎｎｅｌ ３：ＣＬＣＮ３）；ギャップ結合タンパク質α５（ＧＪＡ５）；およびキチナーゼ３様２（ｃｈｉｔｉｎａｓｅ ３−ｌｉｋｅ ２：ＣＨＩ３Ｌ２）を含む。
【００４７】
眼の炎症に関連するｍＲＮＡ標的遺伝子の例は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー１Ａ（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，ｍｅｍｂｅｒ １Ａ：ＴＮＦＲＳＦ１Ａ）；ホスホジエステラーゼ４Ｄ、ｃＡＭＰ特異的（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ ４Ｄ，ｃＡＭＰ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ：ＰＤＥ４Ｄ）；ヒスタミン受容体Ｈ１（ｈｉｓｔａｍｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｈ１：ＨＲＨ１）；脾臓チロシンキナーゼ（ｓｐｌｅｅｎ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ：ＳＹＫ）；インターロイキン１β（ＩＬ１Ｂ）；核性因子カッパ−Ｂ、サブユニット１（ＮＦＫＢ１）；核性因子カッパ−Ｂ、サブユニット２（ＮＦＫＢ２）；および腫瘍壊死因子アルファ―変換酵素（ＴＡＣＥ）を含む。
【００４８】
こうした標的遺伝子は、たとえば米国特許出願の公開番号第２００６０１６６９１９号、第２００６０１７２９６１号、第２００６０１７２９６３号、第２００６０１７２９６５号、第２００６０２２３７７３号、第２００７０１４９４７３号、および第２００７０１５５６９０号に記載されており、これらの開示はその全体にわたり引用により援用される。
【００４９】
特定の実施形態において、本発明は患者の眼内圧を下げるための眼の医薬組成物を提供し、この医薬組成物は、眼に許容できる担体中に治療上有効な量の干渉ＲＮＡ分子を発現できる自己相補的なアデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）ベクターを含み、この干渉ＲＮＡ分子は眼の障害に関連する遺伝子の発現を低減できる。ｓｃＡＡＶベクターはｓｃＡＡＶビリオン中にパッケージングされてもよい。
【００５０】
本発明の医薬組成物は好ましくは、干渉ＲＮＡまたはその塩を最高で９９重量％含み、生理学的に許容できる担体媒質、たとえば以下に記載されるものおよび水、緩衝液、食塩水、グリシン、ヒアルロン酸、マンニトールなどと混合された調合物である。
【００５１】
本発明の干渉ＲＮＡを含むｓｃＡＡＶベクターまたは医薬組成物は、溶液、懸濁液またはエマルションとして投与されてもよい。以下は、本発明の方法において用いられ得る医薬組成物調合物の例である。
【００５２】
【化１】
【００５３】
【化２】
本明細書で用いられる「治療上有効な量」という用語は、哺乳動物において治療的応答を生じると判定される干渉ＲＮＡまたは干渉ＲＮＡを含む医薬組成物の量を示す。こうした治療上有効な量は、当業者によって本明細書に記載される方法を用いて容易に確定される。
【００５４】
一般的に、本発明の干渉ＲＮＡの治療上有効な量によって、標的細胞の表面における細胞外濃度は１００ｐＭから１μＭ、または１ｎＭから１００ｎＭ、または５ｎＭから約５０ｎＭ、または約２５ｎＭとなる。この局所濃度を達成するために必要な用量は、送達方法、送達部位、送達部位と標的細胞または組織との間の細胞層の数、送達が局所的か全身的かなどを含む多数の因子によって変動する。送達部位における濃度は、標的細胞または組織の表面での濃度よりもかなり高くなってもよい。熟練した臨床医のルーチン的判断に従って、局所組成物が眼などの標的器官の表面に１日１回から４回送達されても、または延長された送達スケジュールによって、たとえば毎日、毎週、隔週、毎月、またはそれより長く送達されてもよい。調合物のｐＨは約ｐＨ４．０から約ｐＨ９．０、または約ｐＨ４．５から約ｐＨ７．４である。
【００５５】
調合物の治療上有効な量は、たとえば対象の年齢、人種および性別、標的遺伝子転写物／タンパク質の代謝回転速度、干渉ＲＮＡの効力、および干渉ＲＮＡの安定性などの因子に依存し得る。実施形態の１つにおいて、干渉ＲＮＡを含むｓｃＡＡＶベクターは標的器官に局所的に送達されて、治療的用量で小柱網、網膜または視神経乳頭などの標的ｍＲＮＡ含有組織に到達することによって、標的遺伝子が関わる疾患プロセスを改善する。
【００５６】
標的ｍＲＮＡに向けられた干渉ＲＮＡによる患者の治療処置は、作用の持続時間を増やして投薬の頻度を減らして患者コンプライアンスを大きくすることによって、および標的特異性を上げて副作用を減らすことによって、小分子処置を超えて有益になることが期待される。
【００５７】
本明細書で用いられる「眼に許容できる担体」とは、たいていの場合、眼にほとんどまたはまったく刺激をもたらさず、必要であれば好適な保存状態を提供し、かつ本発明の１つまたは複数の干渉ＲＮＡを同質の用量で送達する担体を示す。本発明の実施形態の干渉ＲＮＡの投与に対して許容できる担体は、カチオン性脂質ベースのトランスフェクション試薬のＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）−ＴＫＯ（Ｍｉｒｕｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）またはＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）；ポリエチレンイミンなどのポリカチオン；カチオン性ペプチド、たとえばＴａｔ、ポリアルギニンまたはＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ（Ａｎｔｐペプチド）；ナノ粒子；またはリポソームを含む。リポソームは、標準的な小胞形成脂質およびコレステロールなどのステロールから形成され、たとえば細胞表面抗原に対する結合親和性を有するモノクローナル抗体などのターゲティング分子を含んでもよい。さらに、リポソームはペグ化リポソームであってもよい。
【００５８】
本発明の干渉ＲＮＡを含むｓｃＡＡＶベクターまたは医薬組成物は、溶液、懸濁液、または生物侵食性（ｂｉｏｅｒｏｄｉｂｌｅ）もしくは非生物侵食性の送達装置にて送達されてもよい。本発明の干渉ＲＮＡを含むｓｃＡＡＶベクターまたは医薬組成物は、たとえばエアロゾル投与、頬側投与、皮膚投与、皮内投与、吸入投与、筋内投与、鼻腔内投与、眼内投与、肺内投与、静脈内投与、腹膜内投与、経鼻投与、経眼投与、経口投与、経耳投与、非経口投与、パッチ投与、皮下投与、舌下投与、局所投与、または経皮投与を介して送達されてもよい。
【００５９】
特定の実施形態において、干渉ＲＮＡ分子による眼の障害の処置は、本発明の干渉ＲＮＡを含むｓｃＡＡＶベクターまたは医薬組成物を眼に直接投与することによって達成される。眼への局所投与は、以下を含む多くの理由によって有利である：全身的送達よりも用量を小さくでき、この分子が眼以外の組織で遺伝子標的をサイレンシングする機会が減る。
【００６０】
多くの研究によって、干渉ＲＮＡ分子の眼へのインビボ送達が成功し効果的であったことが示されている。たとえばＫｉｍらは、ＶＥＧＦ経路遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡの結膜下注射および全身的送達によって、マウスの眼の新脈管生成が阻害されたことを示した（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６５：２１７７−２１８５）。加えて、硝子体腔に送達されたｓｉＲＮＡは眼全体に拡散でき、注射の５日後まで検出可能であることが研究によって示されている（Ｃａｍｐｏｃｈｉａｒｏ，２００６，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １３：５５９−５６２）。
【００６１】
ｓｃＡＡＶベクターのヒト小柱網（ＴＭ）細胞への効果的なインビボ形質導入も研究によって示されている。たとえばＢｏｒｒａｓらは、ｓｃＡＡＶベクターを用いて、解離ＨＴＭ細胞および死後のドナーからのインタクトな組織におけるＴＭの形質導入を達成できたことを示した（Ｂｏｒｒａｓ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ ８：５８９−６０２）。
【００６２】
本発明の干渉ＲＮＡを含むｓｃＡＡＶベクターまたは医薬組成物は、眼組織注射、たとえば眼周囲への注射、結膜への注射、テノン嚢下注射、前房内への注射、硝子体内注射、眼内注射、網膜下注射、結膜下注射、眼球後注射、または小管内注射によって；カテーテルまたはその他の配置装置、たとえば網膜ペレット、眼内挿入、坐薬、または多孔性、非多孔性もしくはゼラチン状の材料を含む移植片を用いた眼への直接適用によって；局所的な点眼薬または軟膏によって；または盲嚢中にあるか、強膜に近接して移植される（経強膜）か、強膜中に移植される（強膜内）か、もしくは眼の中に移植される徐放性装置（ｓｌｏｗ ｒｅｌｅａｓｅ ｄｅｖｉｃｅ）によって、眼に直接送達されてもよい。前房内への注射は、薬剤が角膜を通って前房に入ることによって、小柱網への到達を可能にすることができる。小管内注射は、シュレム管を排出する静脈の集合チャネル（ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ ｃｈａｎｎｅｌｓ）に入るか、またはシュレム管に入ってもよい。
【００６３】
眼への送達のために、本発明の干渉ＲＮＡを含むｓｃＡＡＶベクターまたは医薬組成物は、眼に許容できる保存剤、共溶媒、界面活性剤、増粘剤、浸透促進剤、緩衝液、塩化ナトリウム、または水と組合されて、水性で無菌の眼科用懸濁液または溶液を形成してもよい。溶液調合物は、本発明の干渉ＲＮＡを含むｓｃＡＡＶベクターまたは医薬組成物を、生理学的に許容できる等張性の水性緩衝液に溶解することによって調製されてもよい。さらにこの溶液は、本発明の干渉ＲＮＡを含むｓｃＡＡＶベクターまたは医薬組成物の溶解を助けるために、許容できる界面活性剤を含んでもよい。粘度上昇剤、たとえばヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどを本発明の組成物に加えることで、化合物の保持を改善してもよい。
【００６４】
無菌の眼軟膏調合物を調製するために、本発明の干渉ＲＮＡを含むｓｃＡＡＶベクターまたは医薬組成物は、ミネラルオイル、液体ラノリン、または白色ワセリンなどの適切な媒体中の保存剤と組合される。無菌の眼ゲル調合物は、当該技術分野において公知の方法に従って、たとえばＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）−９４０（ＢＦ Ｇｏｏｄｒｉｃｈ，Ｃｈａｒｌｏｔｔｅ，ＮＣ）などの組合せから調製される親水性塩基に干渉ＲＮＡを懸濁することによって調製されてもよい。たとえば、ＶＩＳＣＯＡＴ（登録商標）（Ａｌｃｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｒｔ Ｗｏｒｔｈ，ＴＸ）が眼内注射に用いられてもよい。本発明の他の組成物は、万一、干渉ＲＮＡが眼に浸透しにくい場合には、ｃｒｅｍｅｐｈｏｒおよびＴＷＥＥＮ（登録商標）８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）などの浸透促進剤を含有してもよい。
【００６５】
特定の実施形態において、本発明は、細胞中で本明細書に挙げられるとおりのｍＲＮＡの発現を低減させるための試薬を含むキットも提供する。このキットは、眼の障害に関連する遺伝子の発現を低減できる干渉ＲＮＡ、および／またはｓｃＡＡＶベクター、および／またはｓｃＡＡＶベクター生成のために必要な構成要素（例、パッケージング細胞系、ならびにウイルスベクター鋳型を含むベクターおよびパッケージングのための付加的なヘルパーベクター）を含む。キットは、正および負の対照ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ発現ベクター（例、非ターゲティング対照ｓｉＲＮＡまたは無関係のｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ）も含んでいてもよい。キットは、意図される標的遺伝子のノックダウンを評価するための試薬（例、標的ｍＲＮＡを検出するための定量的ＰＣＲに対するプライマおよびプローブ、および／またはウエスタンブロットのための対応タンパク質に対する抗体）も含んでいてもよい。代替的には、キットはｓｉＲＮＡ配列またはｓｈＲＮＡ配列、ならびにインビトロ転写によってｓｉＲＮＡを生成するかまたはｓｈＲＮＡ発現ベクターを構築するために必要な指示書および材料を含んでもよい。
【００６６】
容器媒体を厳重に閉じ込めて収容する適合された担体媒体と、干渉ＲＮＡ組成物およびｓｃＡＡＶベクターを含む最初の容器媒体とをパッケージングされた組合せで含む、キット形式の医薬的組合せがさらに提供される。当業者に容易に明らかとなるとおり、こうしたキットは所望であれば、さまざまな従来の医薬キット構成要素の１つまたは複数、たとえば１つもしくは複数の医薬的に許容できる担体を有する容器、付加的な容器などをさらに含んでもよい。キットには、投与される構成要素の量、投与のための指針、および／または構成要素を混合するための指針を示す、挿入物またはラベルとしての印刷された指示書も含まれていてもよい。
【００６７】
本明細書に引用される参考文献は、本明細書に示されるものの例示的手順またはその他の詳細の補足を与える程度まで、特定的に引用により援用される。
【００６８】
当業者は本開示に照らして、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に開示される実施形態の明らかな修正を行ない得ることを認めるであろう。本明細書に開示されるすべての実施形態は、本開示に照らして過度の実験なしに作成および実行できる。本開示およびそれと同等の実施形態には、本発明のすべての範囲が示されている。本明細書は、本発明が権利を有する保護のすべての範囲を不当に狭くするものと解釈されるべきではない。
【００６９】
前述の開示は本発明のある特定の実施形態を強調したものであり、それと同等のすべての修正形または代替形は、添付の特許請求の範囲に示されるとおりの本発明の精神および範囲内にあることが理解されるべきである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の眼における標的ｍＲＮＡの発現を低減させる方法であって、
（ａ）干渉ＲＮＡ分子を含む自己相補的なアデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）ベクターを与えるステップと；
（ｂ）該ｓｃＡＡＶベクターを該患者の眼に投与するステップと
を含み、該干渉ＲＮＡ分子は該眼における該標的ｍＲＮＡの発現を低減できる、方法。
【請求項２】
前記ｓｃＡＡＶベクターはｓｃＡＡＶビリオン中にパッケージングされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ベクターは、眼内注射、眼への局所適用、静脈内注射、経口投与、筋内注射、腹腔内注射、経皮適用、または経粘膜適用によって投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記干渉ＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記標的ｍＲＮＡは眼の障害に関連する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記眼の障害は、眼の血管新生、ドライアイ、眼の炎症状態、高眼圧または緑内障に関連する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
治療上有効な量の干渉ＲＮＡ分子および眼に許容できる担体を有する自己相補的なアデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）ベクターを含む医薬組成物であって、該干渉ＲＮＡ分子は眼の障害に関連する遺伝子の発現を低減できる、医薬組成物。
【請求項８】
前記ｓｃＡＡＶベクターはｓｃＡＡＶビリオン中にパッケージングされる、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記干渉ＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記眼の障害は、眼の血管新生、ドライアイ、眼の炎症状態、高眼圧または緑内障に関連する、請求項７に記載の方法。
【請求項１】
患者の眼における標的ｍＲＮＡの発現を低減させる方法であって、
（ａ）干渉ＲＮＡ分子を含む自己相補的なアデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）ベクターを与えるステップと；
（ｂ）該ｓｃＡＡＶベクターを該患者の眼に投与するステップと
を含み、該干渉ＲＮＡ分子は該眼における該標的ｍＲＮＡの発現を低減できる、方法。
【請求項２】
前記ｓｃＡＡＶベクターはｓｃＡＡＶビリオン中にパッケージングされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ベクターは、眼内注射、眼への局所適用、静脈内注射、経口投与、筋内注射、腹腔内注射、経皮適用、または経粘膜適用によって投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記干渉ＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記標的ｍＲＮＡは眼の障害に関連する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記眼の障害は、眼の血管新生、ドライアイ、眼の炎症状態、高眼圧または緑内障に関連する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
治療上有効な量の干渉ＲＮＡ分子および眼に許容できる担体を有する自己相補的なアデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）ベクターを含む医薬組成物であって、該干渉ＲＮＡ分子は眼の障害に関連する遺伝子の発現を低減できる、医薬組成物。
【請求項８】
前記ｓｃＡＡＶベクターはｓｃＡＡＶビリオン中にパッケージングされる、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記干渉ＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記眼の障害は、眼の血管新生、ドライアイ、眼の炎症状態、高眼圧または緑内障に関連する、請求項７に記載の方法。
【公表番号】特表２０１０−５４０５６４（Ｐ２０１０−５４０５６４Ａ）
【公表日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２７２５１（Ｐ２０１０−５２７２５１）
【出願日】平成２０年１０月１日（２００８．１０．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７８３８０
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０４６０５９
【国際公開日】平成２１年４月９日（２００９．４．９）
【出願人】（５０８１８５０７４）アルコン リサーチ， リミテッド (160)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月１日（２００８．１０．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７８３８０
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０４６０５９
【国際公開日】平成２１年４月９日（２００９．４．９）
【出願人】（５０８１８５０７４）アルコン リサーチ， リミテッド (160)
【Ｆターム（参考）】
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