自己組織化生分解性ポリマーソーム
【解決手段】 本発明は、ポリエチレンオキシド及びポリカプロラクトンのブロックコポリマーに関するものであり、前記ポリエチレンオキシドは、約２．０〜約３．８ｋＤａの数平均分子量を有しており、前記ブロックコポリマーは、約１１．８〜約８．８重量パーセントの割合のポリエチレンオキシドを有しているものである。本発明はさらに、そのようなコポリマーから製造されるポリマーソーム、及び前記ポリマーソームを製造する方法にも関するものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００６年１月２３日に出願された米国仮出願第６０／７６１，３２２号、及び２００５年９月２８日に出願された米国仮出願第６０／７２１，１６３号に対して権利を主張するものである。
【０００２】
技術分野
本発明は、生分解性ポリマーソームに関するものであり、より詳細には、ポリ（エチレンオキシド）−ｂ−ポリカプロラクトンジブロックコポリマーからなるポリマーソームに関するものである。
【背景技術】
【０００３】
両親媒性ブロックコポリマーから形成された５０ｎｍ〜５０μｍ直径の小胞である、ポリマーソームは、従来の脂質ベース小胞（リポソーム）及びミセルと比較した場合、それらの優れた機械安定性及び独自の化学的特性によって注目されていた。一般的に、Ｄｉｓｃｈｅｒ，Ｄ．Ｅ．；Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２，２９７，９６７−９７３；Ｄｉｓｃｈｅｒ，Ｂ．Ｍ．；Ｗｏｎ，Ｙ．Ｙ．；Ｅｇｅ，Ｄ．Ｓ．；Ｌｅｅ，Ｊ．Ｃ．Ｍ．；Ｂａｔｅｓ，Ｆ．Ｓ．；Ｄｉｓｃｈｅｒ，Ｄ．Ｅ．；Ｈａｍｍｅｒ，Ｄ．Ａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９９，２８４，１１４３−１１４６；Ｌｅｅ，Ｊ．Ｃ．Ｍ．；Ｂｅｒｍｕｄｅｚ，Ｈ．；Ｄｉｓｃｈｅｒ，Ｂ．Ｍ．；Ｓｈｅｅｈａｎ，Ｍ．Ａ．；Ｗｏｎ，Ｙ．Ｙ．；Ｂａｔｅｓ，Ｆ．Ｓ．；Ｄｉｓｃｈｅｒ，Ｄ．Ｅ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．２００１，７３，１３５−１４５，Ｂｅｒｍｕｄｅｚ，Ｈ．；Ｂｒａｎｎａｎ，Ａ．Ｋ．；Ｈａｍｍｅｒ，Ｄ．Ａ．；Ｂａｔｅｓ，Ｆ．Ｓ．；Ｄｉｓｃｈｅｒ，Ｄ．Ｅ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２００２，３５，８２０３−８２０８，ａｎｄ Ｇｈｏｒｏｇｈｃｈｉａｎ，Ｐ．Ｐ．；Ｆｒａｉｌ，Ｐ．Ｒ．；Ｓｕｓｕｍｕ，Ｋ．；Ｂｌｅｓｓｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．；Ｂｒａｎｎａｎ，Ａ．Ｋ．；Ｂａｔｅｓ，Ｆ．Ｓ．；Ｃｈａｎｃｅ，Ｂ．；Ｈａｍｍｅｒ，Ｄ．Ａ．；Ｔｈｅｒｉｅｎ，Ｍ．Ｊ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ（ＰＮＡＳ），２００５，１０２，２９２２−２９２７を参照のこと。ポリマー小胞はさらに、水溶性親水性化合物（薬剤、ビタミン、フルオロフォアなど）をそれらの水性空洞の内部に封入するだけでなく、疎水性分子をそれらの厚いラメラ膜の中に封入する能力を有すると証明された。さらに、サイズ、膜の厚さ、及びそれらの合成小胞の安定性は、ブロックコポリマー化学的構造、数平均分子量、親水性から疎水性体積分率、及び様々な調合方法を介するかを選択することによって合理的に調整され得る。従って、ポリマーソームは、医療画像、ドラッグデリバリー及び美容装置におけるそれらの潜在的な適用に役立つ多くの魅力ある特徴を有している。Ｄｉｓｃｈｅｒ，Ｄ．Ｅ．；Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２，２９７，９６７−９７３，Ｆｒａｉｌ，Ｐ．Ｒ．；Ｓｕｓｕｍｕ，Ｋ．；Ｂｌｅｓｓｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．；Ｂｒａｎｎａｎ，Ａ．Ｋ．；Ｂａｔｅｓ，Ｆ．Ｓ．；Ｃｈａｎｃｅ，Ｂ．；Ｈａｍｍｅｒ，Ｄ．Ａ．；Ｔｈｅｒｉｅｎ，Ｍ．Ｊ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ（ＰＮＡＳ），２００５，１０２，２９２２−２９２７．及びＭｅｎｇ Ｆ．；Ｅｎｇｂｅｒｓ，Ｇ．Ｈ．Ｍ．；Ｆｅｉｊｅｎ Ｊ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，２００５，１０１，１８７−１９８．を参照のこと。
【０００４】
現在までに、ポリマーソームは、ポリ（エチレンオキシド）−ｂ−ポリブタジエン（ＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ）、ポリ（エチレンオキシド）−ｂ−ポリエチルエチレン（ＰＥＯ−ｂ−ＰＥＥ）、ポリスチレン−ｂ−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＳ−ｂ−ＰＥＯ）、ポリ（エチレンオキシド）−ｂ−ポリ（プロピレンオキシド）−ｂ−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ｂ−ＰＲＯ−ｂ−ＰＥＯ）トリブロックコポリマー、ポリスチレン−ｂ−ポリ（アクリル酸）（ＰＳ−ｂ−ＰＡＡ）、ポリ（２−メチルオキサゾリン）−ｂ−ポリ（ジメチルシロキサン）−ｂ−ポリ（２−メチルオキサゾリン）（ＰＭＯＸＡ−ｂ−ＰＤＭＳ−ｂ−ＰＭＯＸＡ）などを含む、多くの異なる両親媒性ブロックコポリマーから形成されていた。しかしながら、これらの処方は、ヒトｉｎ ｖｉｖｏ適用に必要な自己組織化で且つ完全に生分解性であるポリマーソームを産出しない。Ｆｅｉｊｉｎらは、生分解可能なポリマーソームは有機共溶媒／水注入／抽出システムを用いることによって、ＰＥＯ及び脂肪族ポリエステル／ポリカーボネートの両親媒性生分解可能ジブロックコポリマーから調合され得ると報告した。Ｍｅｎｇ Ｆ．；Ｈｉｅｍｓｔｒａ，Ｃ．；Ｅｎｇｂｅｒｓ，Ｇ．Ｈ．Ｍ．；Ｆｅｉｊｅｎ Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２００３，３６，３００４−３００６．を参照のこと。自己組織化（すなわちフィルム水和、バルク水和或いは電気形成）に基づいた他のポリマーソーム調合方法と比較して、このシステムの主な欠点は、有機共溶媒が組織化後の水性ポリマーソーム懸濁液から完全に除去されなくてはならないということである。そのような工程に関連する余計な時間と費用に加えて、あらゆる残存有機溶媒はヒト体内で極めて毒性である。
【０００５】
容易に組織化し、有機／水共溶媒／抽出システムを使用するシステムの欠点を持たない、完全に生分解可能なポリマーソームに対する本分野のニーズが存在する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
いくつかの実施形態において、本発明は、ポリエチレンオキシド及びポリカプロラクトンのブロックコポリマーから製造された小胞或いはポリマーソームに関するものである。前記ポリエチレンオキシドは、約２．０〜約３．８ｋＤａの数平均分子量を有するものである。前記ブロックコポリマーは約１１〜２０重量パーセントの割合のポリエチレンオキシドを有する。いくつかの実施形態において、前記ポリエチレンオキシドの割合は、約１２〜１９重量パーセントである。他の実施形態において、前記割合は約１１．８〜１８．８重量パーセントである。
【０００７】
いくつかの観点において、本発明は、前述のポリマーソームを調合するための方法に関するものである。特定の好ましい実施形態において、前記ポリマーソームは自己組織化する能力を有している。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
いくつかの実施形態において、本発明は、部分的に或いは完全にポリエチレンオキシド及びポリカプロラクトンのブロックコポリマーで構成された小胞に関するものである。前記ポリエチレンオキシドは、約２．０〜約３．８ｋＤの平均分子量を有するものである。前記ブロックコポリマーは、わずか約１１〜約２０重量パーセントのポリエチレンオキシドを有するものである。特定の実施形態において、前記ブロックコポリマーは、付加的単量体ユニット或いはブロックを有するものである。これらのブロックは、付加的ポリエチレンオキシド或いはポリカプロラクトンブロックである、若しくは異なる物質である。
【０００９】
いくつかの実施形態において、前記ポリマーソームは、対応するポリエチレンオキシドポリマーブロックとの組み合わせで使用される、疎水性ポリカプロラクトン、ポリ乳酸、ポリグリコライド（ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｄｅ）、或いはポリメチレンカーボネートポリマーブロックを含む。特定の実施形態において、前記ポリマーソームは、オリゴカプロラクトン成分が存在する分離ポリエチレンオキシドブロック及びランダム疎水性ポリマーブロックから成る両親媒性ランダムコポリマー、及び疎水性ポリ乳酸、ポリグリコライド或いはポリメチレンカーボネートオリゴマーに基づいている。
【００１０】
両親媒性コポリマーは、フリーラジカル開始、アニオン性重合、ペプチド合成、或いは転移ＲＮＡを用いたリボソーム合成によって製造されたポリマーから成る。
【００１１】
いくつかの実施形態において、前記小胞は、わずか約１２〜約１９重量パーセントのポリエチレンオキシドを有する。他の実施形態において、前記小胞は、わずか約１１．８〜１８．８重量パーセントのポリエチレンオキシドを有する。
【００１２】
本明細書で記載された組成物において、親水性ブロックとしてポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）を用いることができることは注意すべきである。ＰＥＧは、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）と同様な特性を有することが知られている。そのようなものとして、ポリ（エチレングリコール）−ポリカプロラクトンジブロックは、ポリエチレンオキシド−ポリカプロラクトン組成物として同様な方法で機能すべきである。本発明の観点内である付加的な組成物は、２若しくはそれ以上のＰＥＯ、ポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）、及びＰＥＧの混合物である。
【００１３】
ポリカプロラクトンの平均分子量は、約９〜約２３ｋＤである。いくつかの実施形態において、前記ポリカプロラクトンの平均分子量は、約９．５〜約２２．２ｋＤである。Ｍｎは本発明者らの研究ではＧＰＣ及びＮＭＲによって決定した。そのような技術は、本分野の当業者には既知の標準法である。例えば、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １−２，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｂｒａｎｄｒｕｐ （Ｅｄｉｔｏｒ），Ｅｄｍｕｎｄ Ｈ．Ｉｍｍｅｒｇｕｔ（Ｅｄｉｔｏｒ），Ｅｒｉｃ Ａ．Ｇｒｕｌｋｅ，Ａｋｉｈｉｒｏ Ａｂｅ，Ｄａｎｉｅｌ Ｒ．Ｂｌｏｃｈ；ＩＳＢＮ：０−４７１−４７９３６−５；及びＢｌｏｃｋ Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｉｋｏｓ Ｈａｄｊｉｃｈｒｉｓｔｉｄｉｓ，Ｓｔｅｒｇｉｏｓ Ｐｉｓｐａｓ，Ｇｅｏｒｇｅ Ｆｌｏｕｄａｓ，ＩＳＢＮ：０−４７１−３９４３６−Ｘ．を参照のこと。
【００１４】
１つの好ましい実施形態において、前記ポリエチレンオキシドの分子量は約２ｋＤであり、前記ポリカプロラクトンの分子量は約１２ｋＤである。
【００１５】
特定の好ましい実施形態において、前記小胞は生体吸収性である。「生体吸収性」という用語は、化学反応によって分解された場合、他の化学種の合成に対する構成ブロックとして生体細胞によって使用され得る、若しくは老廃物として排出され得る置換成分を導く分子を意味する。
【００１６】
ポリエチレンオキシドは、前記小胞の表面に生体適合性を与え、血液循環時間を延長させる疎水性ブロックである。ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）は小胞の疎水性膜部分を構成する。ＰＣＬは、生理学的条件下（ヒト体内など）でそのエステル結合の加水分解によって分解されるため、薬物送達装置、生体吸収性縫合、接着バリアにおける移植可能な生体物質として、及び組織工学を介した創傷治癒に対する足場として使用するための大きな注目を浴びている。他の生分解性脂肪族ポリエステルと比較して、ＰＣＬはいくつかの優れた特性を有しており、これには：１）小薬剤分子に対する高い透過性；２）分解に対する中性ｐＨの維持；３）他のポリマーとの混合形成時の能力；及び４）ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコライド（ＰＧＡ）、及びポリ乳酸−同時−グリコール酸（ＰＬＧＡ）と比較した場合の、遅浸食動態学によって生じる長期送達に対する適合性が含まれる。本発明者らの処方における疎水性ブロックとしてのＰＣＬの利用は、結果生じるポリマーソームは安全で完全なｉｎ ｖｉｖｏ分解をするということを確実にする。
【００１７】
両親媒性ポリエチレンオキシド−ｂ−ポリカプロラクトンは、スズ（ＩＩ）オクテート（ＳｎＯｃｔ）及びモノシアノ−或いはモノメトキシ−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ、０．７５ｋ、１．１ｋ、１．５ｋ、２ｋ、５ｋ、５．５ｋ；Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｏｕｒｃｅ、Ｄｏｒｖａｌ、カナダ）の存在下で、サイクリックε−カプロラクトン（ＣＬ）の開環重合を介して製造され得る。Ｂｏｇｄａｎｏｖ，Ｂ．；Ｖｉｄｔｓ，Ａ．；Ｖａｎ Ｄｅｎ Ｂｕｌｃｋｅ，Ａ．；Ｖｅｒｂｅｅｃｋ，Ｒ．；Ｓｃｈａｃｈｔ，Ｅ．Ｐｏｌｙｍｅｒ １９９８，３９，（８−９），１６３１−１６３６．を参照のこと。
【００１８】
本発明の組成物は、自己組織化小胞の製造を可能にし、これは、２つの事前ＦＤＡ−承認ポリマーであるポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）及びポリカプロラクトン（ＰＣＬ）の完全な両親媒性ジブロックコポリマーから成る。「生体不活性」及び加水分解性構成成分の混合によって形成された分解性ポリマーとは異なり、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ−ベース小胞は完全な生体吸収性であるべきであり、それらの分解に際して部分的な毒性副産物を残さない。さらに、他の分解可能な（例えば、ペプチド、ポリエステル、或いはポリアンヒドライド−ベース）小胞の公開された報告とは異なり、これら生体吸収性ポリマーソームは、純ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬジブロックコポリマーの自己組織化を通じて自発的に形成されるものである。
【００１９】
前記ポリマーソームのサイズ分布は、超音波処理、凍結／解凍抽出、及びＴｍ＝６０℃以上での押出などの標準技術によって調節され、ｉｎ ｖｉｖｏ適用に有用な、数十ミクロン（共焦点顕微鏡像、図２及び３）〜数百ナノメーターサイズ構造（クリオ−ＴＥＭ顕微鏡像、図４）の範囲のモノ−分散小胞直径を得ることができる。Ｍｏｇｈｉｍｉ，Ｓ．Ｍ．；Ｈｕｎｔｅｒ，Ａ．Ｃ．；Ｍｕｒｒａｙ，Ｊ．Ｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．２００１，５３，（２），２８３−３１８ ａｎｄ Ｇｈｏｒｏｇｈｃｈｉａｎ，Ｐ．Ｐ．；Ｆｒａｉｌ，Ｐ．Ｒ．；Ｓｕｓｕｍｕ，Ｋ．；Ｂｌｅｓｓｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．；Ｂｒａｎｎａｎ，Ａ．Ｋ．；Ｂａｔｅｓ，Ｆ．Ｓ．；Ｃｈａｎｃｅ，Ｂ．；Ｈａｍｍｅｒ，Ｄ．Ａ．；Ｔｈｅｒｉｅｎ，Ｍ．Ｊ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２００５，１０２，（８），２９２２−２９２７．を参照のこと。
【００２０】
特に好ましいのは、ＰＥＯ（２ｋ−３．８ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（９．５ｋ−２２．２ｋ）ジブロックコポリマー（ｗｔ、１１．８−１８．８％の範囲のｆＰＥＯ）であり、これは自己分解性へと自己組織化することができる。これらポリマーの分子量分布は、重要ではないように見られる（すなわちＰＤＩは１．２以下は必要でない）。
【００２１】
以前知られていた全ての小胞製造、自己組織化、両親媒性ジブロックポリマーは、０．３〜０．４の親水性容量率を有していると考えられていた（Ｄｉｓｃｈｅｒ，Ｄ．Ｅ．；Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００２，２９７，（５５８３），９６７−９７３ ａｎｄ Ｂｅｒｍｕｄｅｚ，Ｈ．；Ｂｒａｎｎａｎ，Ａ．Ｋ．；Ｈａｍｍｅｒ，Ｄ．Ａ．；Ｂａｔｅｓ，Ｆ．Ｓ．；Ｄｉｓｃｈｅｒ，Ｄ．Ｅ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２００２，３５，（２１），８２０３−８２０８を参照のこと）一方、注目すべきＰＥＯ（２ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（１２ｋ）は、有意に低い（０．１５以下）算出された率（Ｂｒａｎｄｒｕｐ，Ｊ．；Ｉｍｍｅｒｇｕｔ，Ｅ．Ｈ．；Ｇｒｕｌｋｅ，Ｚ．Ａ．，Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｈａｎｄｂｏｏｋ；Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ&Ｓｏｎｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９９；Ｖｏｌ．６，ｐ５３を参照）を有している。
【００２２】
本発明のＰＥＯ（２ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（１２ｋ）−ベースポリマーソーム及び他のポリマーソームは、リザーバー及び一体化拡散−調節送達装置の両者の要素を組み合わせた独特の生分解性送達小胞を構成する。ＰＥＯ（２ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（１２ｋ）−ベースポリマーソーム大きな膜コアの厚さ（２２．５＋／−２．３ｎｍ）は、単一複合小胞鋳型内に疎水性（隔絶膜）及び親水性（内部水性コア）化合物の両者を取り込むための機会を提供する。これらの生体吸収性ポリマーソームからの放出は、膜を通じた水性コアからの内因性薬剤透過性と同様に、ＰＣＬマトリックス浸食に依存するものであろう。最終的に、前記自己組織化小胞構造は、容易で経済的なメゾスコピック（ナノメーター〜マイクロン）コロイド装置の製造を可能にし、それは組織化後に有機共溶媒除去の必要性を除去する一方、大量産生を可能にするものである。
【００２３】
前記ブロックコポリマーソームの表面は修飾され得る。いくつかの実施形態において、水溶性ポリエチレンオキシドの末端は、化学修飾に対する位置の特異性、及び表面との物理的相互作用のための置換リガンドの有効性のおかげで、置換に対して最も誘引性のある位置である。たくさんの化学変換は末端アルコール（例えばＳｔｒｅｉｔｗｅｉｓｅｒ Ａ，Ｈｅａｔｈｃｏｃｋ ＣＨ，Ｋｏｓｏｗｅｒ ＥＭ．Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（１９９２）を参照のこと）で開始することも可能である。例えば、アクリロニトリルとのＰＥＯ−ＯＨの反応及びその後のプロトン化は、前記末端基を一級アミンへと変換する。反応条件は、全てのポリマー化学に対して一般的に適合可能であり、いくつかのそのような反応は、以下に記載したブロックコポリマーへの適用に最適化されるであろう。広範囲の化学機能基へ生体分子を接着する技術は、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｌｉｇａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９２）によってカタログ化された。
【００２４】
いくつかの小胞は、生物学的位置で特異的な結合に対する標的部位として使用される末端に結合された化合物を有している。いくつかの実施形態において、前記標的部位は、生理学的条件下で生物学的位置と特異的に結合する。標的部位としては、抗体、抗体断片、及び所定の受容体結合部位に特異的な物質を含む。前記受容体結合部位、或いは標的部位は、受容体特異的ペプチド、糖、脂質、ヌクレオシド、ペプチド核酸、或いはそれらの組み合わせから成る。
【００２５】
前記標的部位は、連結基によって前記小胞或いはポリマーソームへ任意に結合されるものである。適切な連結基は、前記ポリマーソーム／画像化剤システムへの有害な効果なしで、望ましい程度の可動性を提供するものである。
【００２６】
いくつかの実施形態において、前記小胞は付加的に、前記ブロックコポリマーの親水性末端に共役結合したタンパク質、ペプチド、糖類、ヌクレオシド、無機化合物、或いは有機化合物を有する。
【００２７】
いくつかの実施形態において、前記小胞は付加的に、前記水性ポリマーソーム内部に区分されたタンパク質、ペプチド、糖類、ヌクレオシド、無機化合物、或いは有機化合物を有する。他の実施形態において、前記小胞は付加的に、前記疎水性小胞膜内に区分されたタンパク質、ペプチド、糖類、ヌクレオシド、無機化合物、或いは有機化合物を有する。
【００２８】
いくつかの実施形態において、前記区分された因子は、ヒト体内で治療上価値のあるものである。いくつかの実施形態において、前記小胞は、ｉｎ ｖｉｖｏでの使用に対して米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認された、区分された或いは共役結合した成分を含む。
【００２９】
いくつかの小胞は付加的に、前記疎水性小胞膜内へ区分された、放射性因子、細胞毒性因子、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）因子、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）因子、放射線画像法因子或いは光線力学的治療（ＰＤＴ）因子の少なくとも１つを有する。いくつかの実施形態において、前記放射性因子は、前記疎水性小胞膜内に区分されるものである。他の実施形態において、前記区分されたＭＲＩ因子は、前記疎水性小胞膜内に存在するものである。特定の実施形態において、前記ＰＥＴ因子は、前記疎水性小胞膜内に区分されるものである。いくつかの組成物は、少なくとも１つの、前記疎水性小胞膜内に区分された放射線画像法因子を有するものである。いくつかの組成物は、少なくとも１つの前記疎水性小胞膜内に区分されたＰＤＴ因子を有するものである。他の実施形態において、前記因子は、前記水性ポリマーソーム内部に区分されているものである。
【００３０】
前記小胞は付加的に、前記疎水性小胞膜内へ区分された、二次放射性因子、細胞毒性因子、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）因子、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）因子、放射線画像法因子或いは光線力学的治療（ＰＤＴ）因子の少なくとも１つを有する。いくつかの実施形態において、前記二次放射性因子は、前記水性ポリマーソーム内部に区分されているものである。
【００３１】
いくつかの実施形態において、本発明のポリマーソームは、前記ポリマーソーム膜内で分散された、少なくとも１つの可視或いは近赤外線放射性因子を含むものである。いくつかの放射性因子は、７００〜１１００ｎｍスペクトル型の光を発する。
【００３２】
特定の放射性因子は、ポルフィリン部位を有している。いくつかの実施形態において、前記放射性因子は、少なくとも２つのポルフィリン部位を有しており、ここは、前記ポルフィリン部位が少なくとも１つの不飽和部位を有する炭化水素架橋によって結合されている場所である。
【００３３】
本発明に有用ないくつかの放射性因子は、ポルフィセン、ルビリン、ロサリン（ｒｏｓａｒｉｎ）、ヘキサフィリン、サッフィリン（ｓａｐｐｈｙｒｉｎ）、クロロフィル、塩素（ｃｈｌｏｒｉｎ）、フタロシアニン、ポルフィラジン（ｐｏｒｐｈｙｒａｚｉｎｅ）、バクテリオクロロフィル、フェオフィチン、テキサフィリン大環状ベース化合物、或いはそれらのメタル化（ｍｅｔａｌａｔｅｄ）誘導体である。
【００３４】
有用な放射性因子は、レーザー色素、フルオロフォア、ルモフォア（ｌｕｍｏｐｈｏｒｅ）或いは蛍光体である放射性因子を含む。
【００３５】
適切なレーザー色素は、ｐ−テルフェニル、スルホローダミンＢ、ｐ−クアテルフィニル、ローダミン１０１、カルボスチニル１２４、クレシルバイオレット過塩素酸塩、ｐｏｐｏｐ、ＤＯＤＣイオジン、クマリン１２０、スルホローダミン１０１、クマリン２、オキソジン４過塩素酸塩、クマリン３３９、ＰＣＭ、クマリン１、オキサジン１７０過塩素酸塩、クマリン１３８、ナイルブルーＡ過塩素酸塩、クマリン１０６、オキサチン１過塩素酸塩、クマリン１０２、ピリジン１、クマリン３１４Ｔ、スチリル７、クマリン３３８、ヨウ化ＨＩＤＣ、クマリン１５１、ヨウ化ＰＴＰＣ、クマリン５００、ＨＩＴＣ過塩素酸塩、クマリン３０７、ヨウ化ＰＴＴＣ、クマリン３３４、ＤＴＴＣ過塩素酸塩、クマリン７、ＩＲ−１４４、クマリン３４３、ＨＤＩＴＣ過塩素酸塩、クマリン３３７、ＩＲ−ＮＯ、クマリン６、ＩＲ−１３２、クマリン１５２、ＩＲ−１２５、クマリン１５３、ホウ素−ジピロメゼア（ｄｉｐｙｒｒｏｍｅｔｈｅｒｅ）、ＨＰＴＳ、フルオレセイン、ローダミン１１０、２、７−ジクロロフルオレセイン、ローダミン６５及びローダミン１８過塩素酸塩、ローダミンｂを含み、前記レーザー色素は疎水性置換基の付加によって修飾され、前記レーザー色素は実質的に前記ポリマーソーム膜内に存在するものである。
【００３６】
いくつかの組成物は、少なくとも１つの放射性因子を有しており、これは、ジ−及びトリカルボシアニン色素、クロコニウム色素、少なくとも１つの電子求引性置換基で置換されたチエニレンフェニレンビニレン種である近赤外線（ＮＩＲ）放射性種であり、前記レーザー色素は実質的に前記ポリマーソーム膜内に存在するものである。
【００３７】
特定の放射性因子は、少なくとも２つの共有結合部位を有している放射性共役化合物であり；それによって前記化合物をエネルギー源に一定時間、前記化合物が波長７００〜１１００ｎｍの間で光を発するようにするのに有効な条件下で曝露した場合、個々に共有結合部位のどちらかによって発された光の合計以上の強度を有するものである。
【００３８】
前記放射性因子は、少なくとも２つの共有結合部位を有する放射性共役化合物であり；それによって前記化合物をエネルギー源に一定時間、前記化合物が波長７００〜１１００ｎｍの間で光を発するようにするのに有効な条件下で曝露した場合、個々の前記部位のどちらかによって示された放射オシレーター強度以上の総放射オシレーター強度を示すものである。
【００３９】
いくつかの放射性因子は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合、炭素−炭素三重結合、若しくはそれらの組み合わせによって結合されている放射性種を定義する共有結合部位を有している。放射性種を定義する前記共有結合部位は、エチニル、エセニル、アレニル、ブタジニル、ポリビニル、チオフェニル、フラニル、ピロリル或いはｐ−ジエチリルアレニルリンカーによって結合される、若しくはジエチニル、ジ（ポリビニニル）、ジニビニル、ジ（ポリビニル）或いはジ（チオフェニル）置換基を有する共役複素環によって結合され得る。特定の実施形態において、放射性種を定義する前記共役結合部位は、少なくとも１つのイミン、フェニレン、チオフェン、或いはアミド、エーテル、チオエーテル、エステル、ケトン、スルホン、若しくはカルボジイミド基によって結合されている。
【００４０】
いくつかの小胞は、ホルフィネート（ｐｈｏｒｐｈｉｎａｔｏ）画像剤を含んでおり、これは、６００〜１１０ｎｍスペクトル型において放射可能なβ−β、メソ−β、或いはメソ−メソ結合形態画像剤を特徴付けるエチニル−或いはブタジニル−架橋マルチ（ホルフィリン）化合物である。いくつかの適切なホルフィリン−ベース画像剤は、以下の構造式を有しており：
【化１】
【００４１】
ここにおいて、Ｍは金属或いはＨ２であり、Ｈ２は大環状分子の遊離リガンド型を表示し；ＲＡ及びＲＢはそれぞれ独立してＨ、Ｃ１−Ｃ２０アルキル或いはＣ１−Ｃ２０ヘテロアルキル、Ｃ６−Ｃ２０アリール或いはヘテロアリール、Ｃ（ＲＣ）＝Ｃ（ＲＤ）（ＲＥ）、Ｃ＝Ｃ（ＲＤ）、若しくは、ペプチド、ヌクレオシド或いは糖類を有する化学機能基であり、ここにおいてＲＣ、ＲＤ及びＲＥはそれぞれ独立してＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、Ｃ４−Ｃ２０ヘテロアルキル、アリール或いはヘテロアリール、Ｃ２−Ｃ２０アルケニル或いはへテロアルケニル、アルケニル或いはＣ２−Ｃ２０ ヘテロアルキニル、トリアルキルシリル或いはホルフィリネートであり；ｎは１〜１０の整数である。いくつかの実施形態において、ｎは１〜８の整数である。
【００４２】
ホルフィリン−ベース画像剤のＭは、亜鉛、マグネシウム、白金、パラジウム、或いはＨ２であり、Ｈ２は大環状分子の遊離リガンド型を表示している。
【００４３】
いくつかの実施形態において、前記ポリマーソームホルフィリン−ベース画像剤は放射性である。いくつかの薬剤は、マルチ（ホルフィリン）画像剤であり、これはメソ−メソエチン−或いはブタジエン−架橋結合形態を有しており、前記画像剤は６００〜１１００ｎｍスペクトル型において放射することができる。
【００４４】
本分野の当業者は、ホルフィリン−含有化合物から調合され得る広範囲のダイマー、トリマー、オリゴマー或いはポリマーを認識するであろう。そのような化合物は、例えば米国特許第１０／７７７，５５２号に見いだされ、この参照によって本明細書にその全体が組み込まれるものである。
【００４５】
本発明は、以下の実施例によって説明されるが限定されることを意図しているものではない。
【００４６】
実験
材料
ε−カプロラクトン（ε−ＣＬ）は、Ａｌｄｒｉｃｈより購入し、室温で４８時間水素化カルシウム（ＣａＨ２）で乾燥させ、減圧下で蒸留した。１末端−ＯＨ基を有し、５０００、２０００、１１００及び７５０のＭｎを有するモノメトキシルポリ（エチレンオキシド）（ＭｅＰＥＯ）ホモポリマーは、Ｆｌｕｋａから購入した。大きなＭｅＰＥＯブロック（Ｍｎ＝１１００、２０００及び５０００）は、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中への溶解し、その後エーテルへ沈殿させ、その後４０℃、１０ｍｍＨｇで２４時間乾燥させることによって精製した。他のＭｅＰＥＯブロック（Ｍｗ＝７５０）は、レシーブ（ｒｅｃｅｉｖｅｄ）として使用した。スズ（ＩＩ）オクトネート（ＳｔＯｃｔ２）はＳｉｇｍａから購入し、レシーブとして使用した。エチレンオキシド（ＥＯ）はＡｌｄｒｉｃｈから購入し、水酸化カリウムを通過させることによって精製し、２時間混ぜてＣａＨ２へ濃縮し、最終的に蒸留によって回収した。ナフタレンは使用前にエーテルから再結晶化し、ＴＨＦはＮａマイナーを蒸留した。他の化学薬品は商業的に利用可能であり、レシーブとして使用した。
【００４７】
重合化反応
開環重合：モノメトキシルポリ（エチレンオキシド）（ＭｅＰＥＯ）をアルゴン下で火炎フラスコへ満たした。カプロラクトンモノマー（ＭｅＰＥＯに対して様々な算出重量率を有する）を次にシリンジを介して前記フラスコへ注入し、ＳｎＯｃｔ２の少量２滴を反応混合物へ添加した。前記フラスコはバキュームラインへ連結し、気体を抜き、密閉し、１３０℃のオイル槽へ浸した。大量の同種混合物の粘性が進行的に増加し、これは重合化の間いつも観察された。コポリマーは、前記反応混合物を室温まで冷却することによって２４時間後に回収された。その結果生じたブロックコポリマーは、塩化メチレンへ溶解し、過剰冷却メタノール／ヘキサン（４℃）へ沈殿させた。白色粉末産物が得られ、真空条件下で２日以上、４０℃で乾燥させた。
【００４８】
アニオン性リビング（ｌｉｖｉｎｇ）重合化：火炎乾燥及びアルゴン浄化フラスコにおいて、３０ｍＬの無水ＴＨＦ、０．５５ｍＬ（１０ｍｍｏｌ）アセトニトリル、及び５ｍＬカリウムナフタレン／ＴＨＦ溶液（１ｍｍｏｌ／ｍＬ）をアルゴン流下で添加した。勢いよく混ぜ（７０分、２０℃）、その混合物は氷−水槽において冷却し、蒸留されたＥＯを冷却シリンジによって添加した。室温での４８時間重合後、反応産物のサンプル（約５ｍＬ ＣＮ−ＰＥＯ）を除去し、酢酸含有のアセトン溶液で処理し、過剰ジエチルエーテルで沈殿させ、室温の真空下で乾燥させた。次に、算出モル率のＣＬ／ＥＯでＴＨＦに溶解されたε−カプロラクトンをＣＮ−ＰＥＯの残存反応混合物へ添加した。０℃で５〜１０分後、酢酸を含有した過剰なアセトン溶液を添加することによって重合化をクエンチし；最終コポリマーはジエチルエーテルにおいて沈殿することによって除去し、４０℃で２日間、真空下で乾燥させた。
【００４９】
コポリマー特徴化
ＰＥＯポリマー及びコポリマーは、Ｂｒｕｋｅｒ ３００ＭＨｚ或いは５００ＭＨｚ装置を用いたＮＭＲ１Ｈ−ＮＭＲ（電子核磁気共鳴）分光法によって特徴付けされた。重水素化クロロホルム（ＣＤＣｌ３）を溶液として使用し、テトラメチルシラン（ＴＭＳ）を内部標準として使用した。各コポリマー処方に対する重量平均分子量（Ｍｗ）値及び多分散指標（Ｍｗ／Ｍｎ）は、動的レーザー錯乱及び屈折指標検出器を介して、２つの分離カラム（ＰＬゲル５μ混合、３００Ｘ７．５ｍｍ）を用いて、室温（２５℃）で、ＧＰＣ（ＲＡＩＮＩＮ ＨＰＸＬ）によって決定した。ＴＨＦは溶出溶液として利用した。ＰＥＯ標準は、屈折指標データから前記コポリマーの分子量を較正するために使用した。
【００５０】
ポリマーソームの調合
２つの調合方法である、薄膜水和を介した自己組織化及び有機共溶媒／水性抽出物を介した小胞形成を使用し、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬコポリマーを様々な水性形態へ組織化した。膜水和は、ＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ及びＰＥＯ−ｂ−ＰＥＥジブロックコポリマーを有する非分解性ポリマーソームを調合するために広範囲で利用されていた。Ｄｉｓｃｈｅｒ，Ｄ．Ｅ．；Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２，２９７，９６７−９７３ ａｎｄ Ｇｈｏｒｏｇｈｃｈｉａｎ，Ｐ．Ｐ．；Ｆｒａｉｌ，Ｐ．Ｒ．；Ｓｕｓｕｍｕ，Ｋ．；Ｂｌｅｓｓｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．；Ｂｒａｎｎａｎ，Ａ．Ｋ．；Ｂａｔｅｓ，Ｆ．Ｓ．；Ｃｈａｎｃｅ，Ｂ．；Ｈａｍｍｅｒ，Ｄ．Ａ．；Ｔｈｅｒｉｅｎ，Ｍ．Ｊ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ（ＰＮＡＳ），２００５，１０２，２９２２−２９２７．を参照のこと。簡潔には、クロロホルム（１ｍｏｌ％ナイルレッド有無）において２００マイクロリットルの５〜１０ｍｇ／ｍＬ ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬコポリマー溶液を粗面Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）プレートの表面へ均一にコーティングし、その後１２時間以上真空下で前記溶液を蒸発させた。水溶液（例えば２５０−３００ミリオスモルスクロール或いはＰＢＳ）の添加、及び６０℃での４８時間加熱によって、巨大な（５〜２０μｍ）生分解性ポリマーソームの自発性突出（ｂｕｄｄｉｎｇ）を導き、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）堆積薄膜を前記水溶液へはがした。ＰＢＳは、ｐＨ７．２の５０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４及び１４０ｍＭ ＮａＣｌである水性緩衝液である。ナイルレッドは、自己組織化の間に前記ポリマーソーム膜へ取り込まれ、結果生じるコポリマー水性形態の共焦点蛍光顕微鏡を介した容易な可視化を可能にした。
【００５１】
適切な狭いサイズ分布を有する小さな（３００ｎｍ直径以下）単層ポリマーソームは、小さな脂質小胞を処方するために使用される手順（超音波処理、凍結解凍抽出及び押出）に類似した手順を介して調合した。Ｇｈｏｒｏｇｈｃｈｉａｎ，Ｐ．Ｐ．；Ｆｒａｉｌ，Ｐ．Ｒ．；Ｓｕｓｕｍｕ，Ｋ．；Ｂｌｅｓｓｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．；Ｂｒａｎｎａｎ，Ａ．Ｋ．；Ｂａｔｅｓ，Ｆ．Ｓ．；Ｃｈａｎｃｅ，Ｂ．；Ｈａｍｍｅｒ，Ｄ．Ａ．；Ｔｈｅｒｉｅｎ，Ｍ．Ｊ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ（ＰＮＡＳ），２００５，１０２，２９２２−２９２７．を参照のこと。超音波処理手順では、水性−ベース溶液及び乾燥させた（Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）膜などのポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）膜上に均一に堆積させたポリマーの）薄膜処方を含むサンプルバイアルを槽ソニケーター（Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｍｏｄｅｌ ＦＳ２０）へ置き、３０分間撹拌する工程が含まれる。凍結−解凍抽出の複数サイクルを行い、その後前記サンプルバイアル（３００ｎｍ〜５００ｎｍ直径ポリマーソームの溶液を含有）を液体Ｎ２へ置く工程が続いた。鎮静した液体Ｎ２から泡立ったら、前記バイアルを次に６０℃の水槽へ移した。小さい（例えば、１００ｎｍ直径）小胞のモノ−分散懸濁液への抽出は、ポリマーソーム溶液を加圧窒素ガスへ連結した温度調節ステンレススチールシリンダーへ導入することによって進行した。ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ懸濁液のサイズ分布は、動的光錯乱によって各ケースにおいて決定した。
【００５２】
共溶媒／水抽出方法に対して、前記ジブロックコポリマーは、クロロホルム或いはテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（１０ｍｇ／ｍＬ）に溶解し、１：１００重量％で水溶液（スクロース、ＰＢＳ、或いはベンゼン／アルコール水溶液）へ有機共溶媒注入を介して添加した。これらジブロックコポリマーから形成された様々な構造は、室温で２４時間、水性透析（有機共溶媒除去のため）によって前記溶媒混合液から抽出した。
【００５３】
ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ−ベース小胞内への疎水性及び親水性化合物の取り込み
水性不溶性化合物（例えばナイルレッド色素）を、まず同じ有機溶液（一般的にはクロロホルム、塩化メチレン、テトラヒドロフラン、エタノール、メタノール或いはそれらの組み合わせ）においてそれらを大量のポリマーと共溶解することによって、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ−ベース小胞の疎水性膜内へ取り込ませた。前記有機溶液（疎水性分子及びポリマー含有）は次に、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）上で薄膜として乾燥させた。前記薄膜の水性水和及び前記ポリマーの溶解温度（５２℃以上）での加熱を行うと、小胞はそれらの薄い層状膜内に前記水性不溶性化合物を含有する水溶液において形成される（例えば、図２及び３のＰＥＯ（２ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（１２ｋ）−ベースポリマーソーム内のナイルレッド取り込みを参照のこと）。
【００５４】
ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ−ベースポリマーソームの水性環境内の親水性化合物（例えばカルセイン色素）の封入は、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）上での前記ジブロックコポリマーの乾燥薄膜処方を水和するのに使用される水溶液へのそれらの導入に際して生じる。小胞自己組織化後、前記因子の取り込まれなかった部分は、水性透析によって前記小胞を取り囲んでいる外部溶液から除去され得る（図２は、ＰＥＯ（２ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（１２ｋ）−ベースポリマーソームの内部環境内の水性可溶性カルセイン色素を示している）。
【００５５】
小胞サイズの縮小
適切に狭小なサイズ分布（１００〜２００μｍ直径範囲内）を有する小さな小胞は、小さい単層リポソームを処方するために使用される手順（超音波処理、凍結解凍抽出及び押出）と類似した手順を介して調合され得る。
【００５６】
超音波処理手順は、水性ベース溶液及び（Ｔｅｆｌｏｎ上に均一に堆積されたポリマー及びＮＩＲＦ種の）乾燥薄膜処方サンプルバイアルを３０分間、一定に撹拌しながらバスソニケーター（Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｆａｉｒ Ｌａｗｎ、ニュージャージー州；Ｍｏｄｅｌ ＦＳ２０）へ置く方法を含む。いくつかの（ｘ３〜５）サイクルの凍結解凍抽出の後、続いて前記サンプルバイアル（中サイズ、３００ｎｍのＮＩＲ−放射性ポリマーソームの溶液含有）を液体Ｎ２に置いた。鎮静した液体Ｎ２から泡立ったら、前記バイアルを次に５６℃の水槽へ移した。
【００５７】
小さい（１００ｎｍ直径）小胞のモノ分散懸濁液への押出は、圧縮窒素ガスに連結された温度調節性ステンレススチールシリンダーへの水溶液の導入によって開始した。前記小胞溶液は、前記シリンダーの底で丸いスチールふるいによって、支持された０．１μｍポリカーボネートフィルター（Ｏｓｍｏｎｉｃｓ、Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ、カリフォルニア州）を通して押し出し、ここにおいて前記小胞溶液は押出後に回収した。この手順は複数回繰り返し、前記小胞のサイズ分布は動的光錯乱（ＤｙｎａＰｒｏ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ、バージニア州）によって測定した。
【００５８】
大量で、水性小胞懸濁液内のＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬの熱転移の特徴付け
示差走査熱量測定法（ＤＳＣ；ＴＡ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｑ１００，Ｎｅｗ Ｃａｓｔｌｅ、デラウェア州）を利用し、大量で、水性小胞溶液内のＰＥＯ（２ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（１２ｋ）の熱転移を明らかにした（図５）。図５Ａは、２つの結晶化可能ホモポリマーから成るジブロックコポリマーと一致している、大量ＰＥＯ（２ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（１２ｋ）における２つの異なる一次転移を示したものである（溶解開始＝５２．６℃；総熱転移＝９０．２Ｊ／ｇ）。Ｂｏｇｄａｎｏｖ，Ｂ．；Ｖｉｄｔｓ，Ａ．；Ｖａｎ Ｄｅｎ Ｂｕｌｃｋｅ，Ａ．；Ｖｅｒｂｅｅｃｋ，Ｒ．；Ｓｃｈａｃｈｔ，Ｅ．Ｐｏｌｙｍｅｒ １９９８，３９，（８−９），１６３１−１６３６．及びＧａｎ，Ｚ．Ｈ．；Ｊｉａｎｇ，Ｂ．Ｚ．；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｏｌｙ．Ｓｃｉ．１９９６，５９，（６），９６１−９６７．を参照のこと。水中での前記乾燥ポリマー（３０ｍｇ／ｍＬでの）の溶解後すぐに、二重溶解ピークは、二次加熱において５２．３℃のピーク溶解温度の単一一次転移へ移った（溶解開始＝４８．８℃；熱転移＝３２．２Ｊ／ｇ；図５Ｂ）。前記ポリマーは、水性溶解でのその熱転移及び６０℃で４８時間での等温加熱において更なる変化を生じなかった。その構造を低温貯蔵透過型電子顕微鏡（クリオ（ｃｒｙｏ）−ＴＥＭ）によって観察し、そのサイズ分布を動的光錯乱によって決定した、ＰＥＯ（２ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（１２ｋ）−ベースポリマーソームのＤＳＣは、加熱時に小胞サイズに無関係な、同様な一次転移を示した（溶解開始＝４８℃；ピーク＝５２℃；熱転移＝４３Ｊ／ｇ）。大量なＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬの等温結晶化及び溶解挙動は、以前ＷＡＸＤ、ＳＡＸＳ及びＤＳＣにおって研究されており、これはＰＥＯホモポリマーにおける強度な結晶化能にも関わらず、ＰＥＯ重量比が２０％以下の場合、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬコポリマーにおけるＰＣＬブロックのみ結晶可能であった。Ｇａｎ，Ｚ．Ｈ．；Ｊｉａｎｇ，Ｂ．Ｚ．；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｏｌｙ．Ｓｃｉ．１９９６，５９，（６），９６１−９６７．を参照のこと。そのように、ＰＥＯ（２ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（１２ｋ）−ベース小胞において、前記膜は、外部溶液及び内部水性環境へ向けたＰＥＯコロナを有する完全なＰＣＬ薄層から成るということが強く示唆された。
【００５９】
希釈水溶液におけるＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ形態の特徴付け
共焦点レーザー走査顕微鏡（ＢｉｏＲａｄ Ｒａｄｉａｎｃｅ ２０００）及び落射蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００）を用い、蛍光ナイルレッド（ポリマーに対して１ｍｏｌ％色素）を取り込んだＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬの自己組織化水性形態を特徴付けした。前記顕微鏡は、前記色素に対して適切な励起及び放射フィルターを取り付けた。
【００６０】
生分解性ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬジブロックコポリマーの合成及び特徴付け
一連のＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬジブロックコポリマーは、ε−カプロラクトン及び商業的に利用可能なＭｅＰＥＯ（Ｍｎ＝５０００、２０００、１１００及び７５０）の開環重合を介して合成した。１つのヒドロキシル末端基を有するＭｅＰＥＯは、スズ（ＩＩ）オクテート（ｏｃｔｏａｔｅ）（ＳｎＯｃｔ２）触媒下でのε−ＣＬモノマーの重合（１３０℃で２４時間）を活性化するためのマクロイニシエーターとして使用した（スキーム１）。ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬジブロックコポリマーは以前、無触媒スキームでの方法（Ｊｅｏｎｇ，Ｙ．；Ｋａｎｇ，Ｍ．；Ｓｕｎ，Ｈ．；Ｋａｎｇ，Ｓ．；Ｋｉｍ，Ｈ．；Ｍｏｏｎ，Ｋ．；Ｌｅｅ，Ｋ．；Ｋｉｍ，Ｓ．；Ｊｕｎｇ，Ｓ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２００４，２７３，９５−１０７．及びＣｅｒｒｉ，Ｐ．；Ｔｒｉｃｏｌｉ，Ｍ．；Ａｎｄｒｕｚｚｉ，Ｆ．；Ｐａｃｉ，Ｍ．Ｐｏｌｙｍｅｒ，１９８９，３０，３３８−３４３を参照のこと）と同様に、多くの異なる触媒システムを用いることによって合成されていた（Ｍｅｎｇ Ｆ．；Ｈｉｅｍｓｔｒａ，Ｃ．；Ｅｎｇｂｅｒｓ，Ｇ．Ｈ．Ｍ．；Ｆｅｉｊｅｎ Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２００３，３６，３００４−３００６，Ｚａｓｔｒｅ，Ｊ．；Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｊ．；Ｂａｊｗａ，Ｍ．；Ｌｉｇｇｉｎｓ，Ｒ．；Ｉｑｂａｌ，Ｆ．；Ｂｕｒｔ，Ｈ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２００２，５４，２９９−３０９，２０，Ｂｏｇｄａｎｏｖ，Ｂ．；Ｖｉｄｔｓ，Ａ．；Ｖａｎ Ｄｅｎ Ｂｕｃｋｅ，Ａ．；Ｖｅｒｂｅｅｃｋ，Ｒ．；Ｓｃｈａｃｈｔ，Ｅ．Ｐｏｌｙｍｅｒ，１９９８，３９，１６３１−１６３６，及びＨｓｕ，Ｓ．；Ｔａｎｇ，Ｃ．；Ｌｉｎ，Ｃ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２００４，２５，５５９３−５６０１．を参照のこと）。ＳｎＯｃｔ２は、商業的に利用可能である、取り扱いが容易である、共通有機溶媒及び環状エステルモノマーに可溶性であるという理由より、生分解性ポリエステルの産生に対して最も広く使用された触媒であり、多くの国で食品添加物として許可されている（Ｄｏｎｇ，Ｃ．；Ｑｉｕ，Ｋ．；Ｇｕ，Ｚ．；Ｆｅｎｇ，Ｘ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２００１，３４，４６９１−４６９６を参照のこと）。さらに、ＣＬの非触媒開環重合は、高温（１８０℃以上）で数日実行されなくてはならない。そのように、ＳｎＯｃｔ２は本発明者らのシステムでも、穏やかな反応下でのＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬコポリマーの合成に対する触媒として使用した。この開環重合によって合成された全てのＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬジブロックコポリマーは、表１〜３にまとめた。
【００６１】
【化２】
【００６２】
ε−カプロラクトンの開環重合ＭｅＰＥＯからのＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬコポリマーの合成は容易であるけれども、ＭｅＰＥＯホモポリマーの商業的利用可能性が制限されているため、高度に制御可能なＰＥＯブロック分子量を有するコポリマーを得るのは難しい。代替戦略として、本発明者らは、アニオン性リビング重合化：その手順としては酸化エチレンモノマーから開始し、カプロラクトン重合化が続く、を利用し、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬコポリマーの合成に対する他の経路を提供し、これによって広範囲な利用可能ＰＥＯブロック分子量を得ることができる。さらに、前記コポリマーの末端基（ＰＥＯブロック上）は目的に合わせて作られており、この合成戦略によって簡単に変換する事ができる。Ｎ−末端基を有し、アニオン生リビング重合化を介したＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬジブロックコポリマーの合成に使用された戦略は、スキーム２に示されるものである。
【００６３】
【化３】
【００６４】
カリウムナフタレニドは以下の以前確立された方法論で合成した（Ｈｉｌｌｍｙｅｒ，Ｍ．Ａ．；Ｂａｔｅｓ，Ｆ．Ｓ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１９９６，２９，６９９４−７００２．及びＣａｍｍａｓ，Ｓ．；Ｎａｇａｓａｋｉ，Ｙ．；Ｋａｔａｏｋａ，Ｋ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，１９９５，６，２２６−２３０を参照のこと）。シノメチル（ｃｙｎｏｍｅｔｈｙｌ）カリウムは次に、ＴＨＦにおけるナフタレニドカリウムでのアセトニロリルのメタル化（Ｎａｇａｓａｋｉ，Ｙ．；Ｉｉｊｉｍａ，Ｍ．； Ｋａｔｏ，Ｍ．；Ｋａｔａｏｋａ，Ｋ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，１９９５，６，７０２−７０４．及びＤｅｎｇ，Ｍ．；Ｗａｎｇ，Ｒ．；Ｒｏｎｇ，Ｇ．；Ｓｕｎ，Ｊ．；Ｚｈａｎｇ，Ｘ．；Ｃｈｅｎ Ｘ．；Ｊｉｎｇ，Ｘ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２００４，２５，３５５３−３５５８を参照のこと）によって調合し、エチレンオキシド重合化に対するマクロイニシエーターとして利用した。以前に、低分子量（高ＰＥＯ重量比）ＰＥＯ（２．２ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（１．２ｋ）はこのアニオン性リビング重合化戦略によって合成された（Ｄｅｎｇ，Ｍ．；Ｗａｎｇ，Ｒ．；Ｒｏｎｇ，Ｇ．；Ｓｕｎ，Ｊ．；Ｚｈａｎｇ，Ｘ．；Ｃｈｅｎ Ｘ．；Ｊｉｎｇ，Ｘ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２００４，２５，３５５３−３５５８を参照のこと）。本発明者らは、修正した反応条件（スキームＩＩ参照）を使用し、一連のＰＥＯブロック分子量（すなわち１．５ｋ、２．２ｋ、２．６ｋ、３ｋ、３．８ｋ及び５．８ｋ）、低ＰＥＯ重量比（９．９〜２４．３％），及び広範囲のコポリマーＭｎ（７．８〜４７ｋ）を有するＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬを合成するのに成功した。
【００６５】
１Ｈ−ＮＭＲ分光法は、異なる末端基を有するＰＥＯホモポリマー及びＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬジブロックコポリマーの化学構造及び平均分子量の特徴付けに対して実績がありとても有用な技術であった（Ｍｅｎｇ Ｆ．；Ｈｉｅｍｓｔｒａ，Ｃ．；Ｅｎｇｂｅｒｓ，Ｇ．Ｈ．Ｍ．；Ｆｅｉｊｅｎ Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２００３，３６，３００４−３００６，Ｚａｓｔｒｅ，Ｊ．；Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｊ．；Ｂａｊｗａ，Ｍ．；Ｌｉｇｇｉｎｓ，Ｒ．；Ｉｑｂａｌ，Ｆ．；Ｂｕｒｔ，Ｈ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２００２，５４，２９９−３０９，Ｊｅｏｎｇ，Ｙ．；Ｋａｎｇ，Ｍ．；Ｓｕｎ，Ｈ．；Ｋａｎｇ，Ｓ．；Ｋｉｍ，Ｈ．；Ｍｏｏｎ，Ｋ．；Ｌｅｅ，Ｋ．；Ｋｉｍ，Ｓ．；Ｊｕｎｇ，Ｓ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２００４，２７３，９５−１０７，Ｃｅｒｒｉ，Ｐ．；Ｔｒｉｃｏｌｉ，Ｍ．；Ａｎｄｒｕｚｚｉ，Ｆ．；Ｐａｃｉ，Ｍ．Ｐｏｌｙｍｅｒ，１９８９，３０，３３８−３４３，Ｂｏｇｄａｎｏｖ，Ｂ．；Ｖｉｄｔｓ，Ａ．；Ｖａｎ Ｄｅｎ Ｂｕｃｋｅ，Ａ．；Ｖｅｒｂｅｅｃｋ，Ｒ．；Ｓｃｈａｃｈｔ，Ｅ．Ｐｏｌｙｍｅｒ，１９９８，３９，１６３１−１６３６，Ｈｓｕ，Ｓ．；Ｔａｎｇ，Ｃ．；Ｌｉｎ，Ｃ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２００４，２５，５５９３−５６０１，及びＮａｇａｓａｋｉ，Ｙ．；Ｉｉｊｉｍａ，Ｍ．；Ｋａｔｏ，Ｍ．；Ｋａｔａｏｋａ，Ｋ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，１９９５，６，７０２−７０４を参照のこと）。ＭｅＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬに対する典型的なＮＭＲスペクトルは図１に示した。１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおけるＰＥＯブロックの末端メチレン基と一致する４．２０ｐｐｍ（ｂ’）周辺の小さなピークの出現は、最終反応産物がＰＥＯ及びＰＣＬのジブロックコポリマーのみに限定されたことを意味している。３．３８ｐｐｍでの小さく鋭いピーク及び３．６５ｐｐｍでの非常に強いピークは、それぞれ、メチル（ａ、ＣＨ３Ｏ−末端ＰＥＯ）及びメチレン基（ｂ、ＭｅＰＥＯの繰り返しユニット）によるものであると考えられた。２．２３ｐｐｍ、１．６３ｐｐｍ、１．３８ｐｐｍ及び４．０６ｐｐｍでのピークは、ＰＣＬ繰り返しユニットにおけるプロトンであると割り当てられた（ｃ、ｄ、ｅ及びｆメチレン）。ＰＥＯブロックのメチレンプロトンからの３．６５ｐｐｍでのピーク、及びＰＣＬブロックにおけるカプロラクトン繰り返しユニット（ｂ、ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）のメチレンプロトンからの２．２３ｐｐｍでの三重線（トリプレット）は、ある程度のＰＣＬブロック重合化及びＭｎ（ＮＭＲ）を達成するために使用した。１Ｈ−ＮＭＲ分光法はさらに、末端基（すなわちＣＨ３Ｏ−或いはＣＮＣＨ２ＣＨ２−）のプロトンピークと比較することによって、算出エチレンオキシド繰り返しユニット数からＰＥＯの平均分子量を特徴付けするために使用した。ＣＮ−ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ及びＭｅＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬジブロックコポリマーの間の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおけるたった１つの違いは、３．３８ｐｐｍ（ＣＨ３Ｏ−）（ＭｅＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬに見られるＰＥＯブロック末端基）での弱いピークと置き換わった、ＣＮ−ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬのＰＥＯ末端基に対する２．２５ｐｐｍ（ＣＮ、ＣＮ−ＣＨ２−ＣＨ２へ結合した第一のメチレン）及び１．９０ｐｐｍ（ＣＮ−ＣＨ２−ＣＨ２に対する第二のメチレン）周辺の２５つの弱いピークと一致する。ＣＮ−ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬジブロックコポリマーの平均分子量値はさらにＮＭＲスペクトルから計算した。
【００６６】
【化４】
【００６７】
ＧＰＣは、各ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬジブロックコポリマー処方の分子量（Ｍｗ）及び分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）（ＰＤＩ）を特徴付けするために使用した。２タイプの平均分子量はそれぞれ、ＰＥＯ標準サンプルを用いることによって、及び動的光錯乱データを利用することによって、反応性指標データから計算した（表１参照のこと）。ＰＥＯ（５．８ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（２４．０ｋ）、ＰＥＯ（５ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（２２ｋ）、ＰＥＯ（２ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（１２ｋ）及びＰＥＯ（２ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（１５ｋ）などのいくつかのコポリマーは、１Ｈ−ＮＭＲから決定された値と比較した場合、ＧＰＣから得られたように同様な分子量値を示した。とりわけ、合成された最も大きいコポリマーであるＰＥＯ（５．８ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（３３．６ｋ）及び最も小さいコポリマーであるＰＥＯ（２ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（９．５ｋ）はしかしながら、１Ｈ−ＮＭＲデータ対ＧＰＣデータから決定したＭｗにおいて著しい差異が見られた。ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬジブロックコポリマー標準サンプルがＲＩデータ（ＧＰＣ）の検定に商業的に利用可能できないため、前記コポリマーのｄｎ／ｄｃ値は、ＰＳ標準サンプルから得て、ＤＬＳデータを検定するために使用し、従って２つの方法（ＧＰＣ及び１Ｈ−ＮＭＲ）によって得られた分子量値決定における差異を説明するように思われる。
【００６８】
ＧＰＣデータから、アニオン性リビング重合化によって合成した、様々なＰＥＯ分子量（２．２ｋ、２．６ｋ、３ｋ、３．８ｋ及び５．８ｋ）を有するＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬジブロックコポリマーは、全体で最も狭い分子量分布（ＰＤＩ：１．２−１．２７）を示した。開環重合を介してＰＥＯ（２ｋ）から合成されたＰＥＯ−ＰＣＬジブロックコポリマーは、狭い分子量分布（１．１−１．２）を示した一方、ＰＥＯ（５ｋ）由来のコポリマーはわずかに広い分子量分布（ＰＤＩ：１．３２−１．３７）を示した。従って、アニオン性リビング重合化は、調節されたＰＥＯブロック分子量、様々なＰＥＯ／ＰＣＬブロック比及び狭い分子量分布を有するＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬジブロックコポリマーの合成に対して最高の経路を提供する。
【００６９】
【表１】
【００７０】
ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬジブロックコポリマーの水性組織化
膜水和及び有機共溶媒注入／抽出という２つの調合方法は、様々な水性形態（ポリマーソームを含む）へと両親媒性ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬジブロックコポリマーを組織化するために選択した。膜水和はコポリマーの水性自己組織化を促進し、組織化後処理の必要性を取り除く一方、容易な大量産生を可能にするので、優先的に利用した。表２及び３は、様々なＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬジブロックコポリマー処方の観察された（１ｍｏｌ％ナイルレッドの取り込みによって決定され、蛍光共焦点及び光学顕微鏡によって可視化したように）水性形態をまとめたものである。
【００７１】
【表２】
【００７２】
【表３】
【００７３】
ポリマーソームはＰＥＯ（２ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（１２ｋ）ジブロックコポリマー（ＦＰＥＯ＝１４．３％）（共焦点蛍光顕微鏡像、図２）の水性水和及び自己組織化から独自にほぼ定量的比率で得られた。いくつかのポリマーソームは、１１．８〜１８．８％の範囲のｗｔ−ＦＰＥＯを有するＰＥＯ（２ｋ−３．８ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（９．５ｋ−２２．２ｋ）ジブロックコポリマーの水性調合において不規則な粒子と共に存在することが見いだされた。従来の小胞産生ＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤコポリマーとは異なり、ＦＰＥＯ（１１．８〜１８．８％）の範囲、ＰＥＯブロックサイズ（２ｋ−３．８ｋ）及びポリマーソーム形成ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬジブロックコポリマーにおける総ジブロックＭｎ（１．５ｋ〜２６ｋ）は、非常に狭い。より高い（５ｋ或いは５．８ｋ）或いはより低い（７５０−１．５ｋ）分子量ＰＥＯブロック由来のＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬジブロックコポリマーの水性懸濁液において、ＰＥＯ／ＰＣＬ比に関係なくポリマーソームは観察されなかった。
【００７４】
ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬポリマーソームは、単層（図２ｄ）或いは多層（図２ｃ）膜構造を所有する膜水和から産生した。ＰＥＯ（２ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（１２ｋ）（ＰＤＩ：１．２）と比較した際、ＰＥＯ（２ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（９．５ｋ）は非常に狭い分子量分布（ＰＤＩ：１．１）を有するにも関わらず、このジブロックコポリマー処方から得られたポリマーソームの州立は僅かに低いものであった。さらに、前記コポリマーの多分散指標は、ポリマーソーム処方に対してほとんど影響を与えないように見えた。小さなポリマーソーム（直径１００ｎｍ）は、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）上でのＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬの乾燥薄膜処方の水性超音波処理によって製造し、その後複数（ｘ３）サイクルの凍結／解凍抽出及び膜押出を行った。これらの小さい単層ポリマーソームは、クリオ（ｃｒｙｏ）−ＴＥＭによって特徴付けを行い、ＰＥＯ（２ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（１２ｋ）ジブロックコポリマー由来のそれらの膜の厚さは、２２．５＋／−２．３ｎｍであると見いだした。
【００７５】
小胞処方に対するジブロックコポリマー分子量分布の影響を明らかにするために、様々なＰＥＯブロックサイズ（２．６ｋ、３ｋ或いは３．８ｋ）及び非常に狭い分子量分布（ＰＤＩ＝１．１）を有するＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬジブロックコポリマーは、ＧＰＣによって分離し、ポリマーソームを製造するために使用した。しかしながら、これらのサンプルからの小胞の収率における改善は観察されなかった。さらにＰＥＯ（５．８ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（２４ｋ）は溶媒注入技術を介して小胞を形成すると以前示された一方、ポリマーソームは、薄膜水和を介して形成されたこのジブロック（ＰＤＩ＝１．２）の水性懸濁液においては観察されなかった。さらに、多くのポリマーソーム（図４）は、より広い分子量分布を有するＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬジブロックコポリマーの混合物から得られた。そのように、分子量分布はＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬジブロックコポリマーから形成された生分解性ポリマーソームに対してほとんど影響を与えないということが決定した。
【００７６】
低いＰＥＯ重量比（１２％以下）を有するＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬジブロックコポリマーが（水性水和後に）Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）膜に対して強固な粘着性を有するので、有機共溶媒水注入／抽出法は、これらのコポリマーの小さなサブセットからポリマーソームを調合するための試みにおいて使用した。この抽出法によってポリマーソームは得られなかった一方、いくつかの完璧な微粒子（マイクロスフェア）（球状粒子で満たされている）は、透析を介した有機共溶媒除去によって見られた；これらの粒子の典型的な形態は蛍光顕微像において示された（図４）。前記球状粒子は多孔性表面（図４ａ）及び効果的に封入されたナイルレッド（図４ｂ）を有するように見えた。
【００７７】
【表４】
【００７８】
これらの実施例は、ＰＥＯブロックサイズ（Ｍｎ：７５０、１１００、２０００及び５０００）、ｗｔ−ｆＰＥＯ（７．７％−３３．３％）及びＭｎ（３．７ｋ−５７ｋ）を変える一連のＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬジブロックコポリマーを示し、これらは商業的に利用可能なＭｅＰＥＯをマクロイニシエーターとして使用するε−カプロラクトンモノマーの開環重合によって合成した。アニオン性リビング重合化もまた、広範囲の調節されたＰＥＯブロックサイズ（Ｍｎ：１５００、２２００、２６００、３０００、３８００及び５８００）、ＰＥＯブロック末端基としてのＣＮ、ｗｔ−ｆＰＥＯ＝９．９−２３．４％、及び７．８ｋ〜４７ｋの範囲のＭｎを有するＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬを合成するために使用した。全てのコポリマーはＧＰＣによって単離し、適切な狭い分子量分布（１．１４〜１．３７のＰＤＩ）を有していた。前記ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬジブロックコポリマーは次に、２つの異なる調合方法：膜水和及び有機共溶媒／水注入／抽出を介して、様々な水性形態へ組織化する能力をスクリーニングした。ポリマーソームは、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）上に堆積した乾燥薄膜の水和による自己組織化を介して、ＰＥＯ（２ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（１２ｋ）ジブロックコポリマー（ＰＤＩ：１．２１）から独自にほぼ定量的比率で得られた。２ｋ〜３．８ｋのＰＥＯブロックサイズ及び１１．８〜１８．８％の範囲のｗｔ−ｆＰＥＯを有するＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬジブロックコポリマーのみが生分解性ポリマーソームへ組織化すると見いだされた一方、これらコポリマーの分子量分布は小胞形成に対して影響を与えなかった。最終的に、有機共溶媒／水注入／抽出によって小胞形成に対して確立された方法と比較した場合、膜水和を介した自己組織化は、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ−ベース生分解性ポリマーソームの調合に対してより容易で有効な方法であると証明された。そのように、これは、化粧品、画像化及び薬物送達適用などの適用に対するこれらのメソ構造生体物質の費用効率が高い大量産生を可能にするものとなるであろう。
【００７９】
ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬジブロックコポリマーへの治療化合物の取り込み
この実施例は、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ−ベースポリマーソームにおける治療化合物であるドキソルビシン（ＤＯＸ）の添加及び押出を示したものである。薄膜水和を介した自己組織化は、ＰＥＯ（２ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（１２ｋ）−ベース小胞を形成するために使用した。膜水和はＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ及びＰＥＯ−ｂ−ＰＥＥジブロックコポリマーを有する非分解性ポリマーソームを調合するために広く利用されていた。Ｄｉｓｃｈｅｒ，Ｂ．Ｍ．；Ｗｏｎ，Ｙ．Ｙ．；Ｅｇｅ，Ｄ．Ｓ．；Ｌｅｅ，Ｊ．Ｃ．Ｍ．；Ｂａｔｅｓ，Ｆ．Ｓ．；Ｄｉｓｃｈｅｒ，Ｄ．Ｅ．；Ｈａｍｍｅｒ，Ｄ．Ａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９９，２８４，（５４１７），１１４３−１１４６．及びＧｈｏｒｏｇｈｃｈｉａｎ，Ｐ．Ｐ．；Ｆｒａｉｌ，Ｐ．Ｒ．；Ｓｕｓｕｍｕ，Ｋ．；Ｂｌｅｓｓｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．；Ｂｒａｎｎａｎ，Ａ．Ｋ．；Ｂａｔｅｓ，Ｆ．Ｓ．；Ｃｈａｎｃｅ，Ｂ．；Ｈａｍｍｅｒ，Ｄ．Ａ．；Ｔｈｅｒｉｅｎ，Ｍ．Ｊ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２００５，１０２，（８），２９２２−２９２７．を参照のこと。簡潔には、塩化メチレン中の２００マイクロリットルの７ｍｇ／ｍＬ ＰＥＯ（２ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（１２ｋ）コポリマー溶液を、粗いＴｅｆｌｏｎ（登録商標）プレートの表面へ均一に堆積させ、１２時間以上溶媒を蒸発させた。水溶液（２９０ミリオスモル硫酸アンモニウム、ｐＨ５．５）の添加及び超音波処理によって、生分解性ポリマーソームの自発性突出を導き、Ｔｅｆｌｏｎ−堆積薄膜を前記水溶液へはがした。超音波処理手順では、水性ベース溶液及び乾燥させた（Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）上に均一に堆積させたポリマーの）薄膜処方を含有したサンプルバイアルをソニケーター槽（Ｂｒａｎｓｏｎ；Ｍｏｄｅｌ ３５１０）へ置き、６５℃で６０分間撹拌する工程が含まれる。５サイクルの凍結−解凍抽出を行い、その後前記サンプルバイアルを液体Ｎ２に置く工程、及び次に６５℃水槽でそれらを解凍させる工程が続いた。６５℃で圧力駆動Ｌｉｐｅｘ ｔｈｅｒｍｏｂａｒｒｅｌ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（１．５ｍＬ容量）を用いた押出は、適切に狭いサイズ分布を揺する小さな（直径２００ｎｍ以下）単層ポリマーソームを産生するために実行した。小胞のサイズ分布は動的光錯乱によって決定した（図９参照）。
【００８０】
押出サンプルは、等張酢酸ナトリウム溶液（５０ｍＭ酢酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４以下）において透析した。透析溶液は、約３０時間で３回交換した。透析後ドキソルビシンを、硫酸アンモニウム勾配を介して前記ポリマーソームへ添加した。Ｈａｒａｎ，Ｇ．；Ｃｏｈｅｎ，Ｒ．；Ｂａｒ，Ｌ．Ｋ．；Ｂａｒｅｎｈｏｌｚ，Ｙ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １９９３，１１５１，（２），２０１−２１５；Ｂｏｌｏｔｉｎ，Ｅ．Ｍ．；Ｃｏｈｅｎ，Ｒ．；Ｂａｒ，Ｌ．Ｋ．；Ｎ．，Ｅ．；Ｎｉｎｉｏ，Ｓ．；Ｌａｓｉｃ，Ｄ．Ｄ．；Ｂａｒｅｎｈｏｌｚ，Ｙ．Ｊ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｒｅｓ．１９９４，４，４５５−４７９；及びｄｅ Ｍｅｎｅｚｅｓ，Ｄ．Ｅ．Ｌ．；Ｐｉｌａｒｓｋｉ，Ｌ．Ｍ．；Ａｌｌｅｎ，Ｔ．Ｍ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９８，５８，（１５），３３２０−３３３０．を参照のこと。前記ポリマーソームは、７時間、メインゲルが液体−結晶相移行温度（６５℃）以上になる温度で、１：０．２のポリマー：薬剤（ｗ／ｗ）の割合でドキソルビシンとインキュベーションした。前記ポリマーソームコア内でのＤＯＸの凝集によって、その蛍光放射はクエンチングした。非封入ＤＯＸは、Ｆｒａｃ ９５０を有するＡｃｔａ Ｂａｓｉｃ １０ ＨＰＬＣを用いて除去した：前記溶液はＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ５００−ＨＲメディアを有するＣ−１６４０カラムを通過した。回収したＤＯＸ−添加ポリマーソーム懸濁液を遠心分離し、約１ｍＬ容量まで濃縮した。次に前記小胞を、各バッファーに対してＮ＝４サンプルで、ｐＨを７．４以下に緩衝した様々な（２９０ｍＯｓｍ）溶液へ分注した。前記添加ポリマーソームからのＤＯＸの放出実験は分注後すぐに開始し：ＤＯＸ蛍光は、１４日間までの様々な間隔で蛍光定量的に（ＳＰＥＸ Ｆｌｕｏｒｏｌｏｇ−３蛍光光度計：λｅｘ＝４８０ｎｍ、λｅｍ＝５９０ｎｍを用いて）測定した。ＤＯＸが前記ポリマーソームコアから放出され、周囲溶液へ希釈されるので、その蛍光放射は時間につれて増加した。この実験の最高点で、前記サンプルはＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を用いて可溶化させた。長期に亘るパーセント放出は、この実験の完了時にＴｒｉｔｏｎＸ−１００での残存無処理ポリマーソームの可溶化で決定したように、最終ＤＯＸ蛍光に対する各時点での測定蛍光を比較することによって計算した。
【００８１】
図８Ａは、１４日間蛍光定量的（λｅｘ＝４８０ｎｍ、λｅｍ＝５９０ｎｍ）にモニタリングした様々な生理学条件（ｐＨ５．５及び７．４；Ｔ＝３７℃）におけるＤＯＸのｉｎ ｓｉｔｕ放出を示したものである。ＤＯＸの放出はｐＨ５．５及び７．４の２つのｐＨで、及び３７℃で測定した。
【００８２】
両条件下で、本発明者らは徐放後、即時バースト放出相（０〜８時間の２０％以下の初期小胞添加）を観察した。放出の動態は２つのｐＨで異なるものであった。ｐＨ７．４での放出では、αとβと示された２つの異なる相が観察でき、これは指数関数回帰解析（Ｒ２＝０．９９）とよく一致していた。α相（１−５日、点線、図８）は、ＤＯＸ放出がＰＣＬ膜を介した薬剤透過の割合に主に依存している状態（レジメ）と一致し、これはより遅い割合のマトリックス浸食（模式的な図８Ｃを参照のこと）を支配していることを示す。β相（５−１４日、実線、図８Ｂ）は、著しい加水分解性膜分解によって主に容易にされたＤＯＸ放出と一致した。ｐＨ５．４で、単一相（β’）が観察された。この相における放出に対する割合定数は、ｐＨ＝７．４のベータ相の間に観察された定数と類似しており、これは放出のメカニズムが類似していることを示している。しかしながら、ＰＣＬ膜の酸触媒性加水分解が短時間での優性メカニズムであるので、ｐＨ＝５．４でのＤＯＸ放出はより素早い。
【００８３】
そのように、これら生体吸収性ポリマーソームからのｉｎ ｖｉｖｏ薬剤放出は、ＰＣＬマトリックス浸食及び膜を通じた水性コアからの薬剤の本質的な透過性の両方に依存しているようである。とりわけ、混合「生体−不活性」で加水分解可能な成分（τ１／２放出＝τ１／２循環を数十時間）（Ａｈｍｅｄ，Ｆ．；Ｈａｔｅｇａｎ，Ａ．；Ｄｉｓｃｈｅｒ，Ｄ．Ｅ．；Ｄｉｓｃｈｅｒ，Ｂ．Ｍ．Ｌａｎｇｍｕｉｒ ２００３，１９，（１６），６５０５−６５１１；Ａｈｍｅｄ，Ｆ．；Ｄｉｓｃｈｅｒ，Ｄ．Ｅ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ２００４，９６，（１），３７−５３；及びＰｈｏｔｏｓ，Ｐ．Ｊ．；Ｂａｃａｋｏｖａ，Ｌ．；Ｄｉｓｃｈｅｒ，Ｂ．；Ｂａｔｅｓ，Ｆ．Ｓ．；Ｄｉｓｃｈｅｒ，Ｄ．Ｅ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ２００３，９０，（３），３２３−３３４．を参照のこと）から形成した分解可能なポリマーソームと比較した場合、ＰＥＯ（２ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（１２ｋ）−ベース小胞はより低い放出動態（τ１／２放出を数日）を有し、これは将来の血管内薬剤送達適用に対する潜在的な利点を提供するものである。さらに、それらの大きな膜コアの厚さ（２２．５＋／−２．３ｎｍ）は、疎水性（膜隔絶）及び親水性（内部水性コア）化合物両者の単一複合送達小胞内の容易な取り込みに対する機会を与える。最終的に、自己組織化小胞構造は、メゾスコピック（ナノメートル〜ミクロン）コロイド状装置の容易で経済的な製造を可能にし、これにより、費用のかかる、組織化後の有機共溶媒の除去の必要性を取り除く一方、大量生産が可能になる。
【００８４】
本明細書で参照された全ての特許及び刊行物は、その全体が組み込まれるものである。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】図１は、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬジブロックコポリマーの代表的な１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示したものである。
【図２】図２は、膜被包ナイルレッド及び水性−内部移行カルセイン色素を含有するＰＥＯ（２ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（１２ｋ）−ベースポリマーソームの共焦点レーザー蛍光顕微鏡像（λｅｘ ＝ ４８８ｎｍ）を示したものである。
【図３】図３は、テフロン（Ｔｅｆｌｏｎ）（登録商標）上に１：１：１モルの割合で沈着させたポリマーの薄膜の水性水和によって形成された、ＰＥＯ（２ｋ）−ｂ−（９．５ｋ）／ＰＥＯ（２ｋ）−ｂ−（１２ｋ）／ＰＥＯ（２ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（１５ｋ）の混合物から成るポリマーソームの共焦点レーザー蛍光顕微鏡像を示したものである。
【図４】図４は、ＤＩ水におけるＰＥＯ（２ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（１２ｋ）−ベース小胞（５ｍｇ／ｍＬ）の低温貯蔵伝達電子顕微鏡像を示したものである。前記小胞の膜コアの厚さは２２．５＋／−ｎｍである。
【図５】図５は、水溶液におけるＰＥＯ（５ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（５２ｋ）の有機共溶媒抽出に由来する微粒子（（ａ）光学顕微鏡像及び（ｂ）共焦点蛍光顕微鏡像）を示したものである。
【図６】図６は、ＰＥＯ（２ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（１２ｋ）の熱転移を明らかにするための示差走査熱量測定を示したものである。
【図７】図７は、ポリマーソームの調合方法を示したものである。
【図８】図８は、様々な生理学的条件（ｐＨ５．５及び７．４；Ｔ＝３７℃）におけるｉｎ ｓｉｔｕ ＤＯＸ押出を示したものである。
【図９】図９は、２５℃での動的光錯乱（ＤＬＳ）を介して得られたようなＰＥＯ（２ｋ）−ＰＣＬ（１２ｋ）−ベースポリマーソームのサイズ分布の累積ヒストグラムを示したものである。
【図１０】図１０は、薄膜自己組織化（６５℃で１時間）を介した２００ｎｍ直径ポリマーソームを産生し、その後の凍結解凍抽出及び押出の５サイクルを介したサイジングの（Ａ）以前及び（Ｂ）以後のＰＥＯ（２Ｋ）−Ｂ−ＰＣＬ（１２Ｋ）ジブロックコポリマーのＨ１−ＮＭＲスペクトルを示したものである。
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００６年１月２３日に出願された米国仮出願第６０／７６１，３２２号、及び２００５年９月２８日に出願された米国仮出願第６０／７２１，１６３号に対して権利を主張するものである。
【０００２】
技術分野
本発明は、生分解性ポリマーソームに関するものであり、より詳細には、ポリ（エチレンオキシド）−ｂ−ポリカプロラクトンジブロックコポリマーからなるポリマーソームに関するものである。
【背景技術】
【０００３】
両親媒性ブロックコポリマーから形成された５０ｎｍ〜５０μｍ直径の小胞である、ポリマーソームは、従来の脂質ベース小胞（リポソーム）及びミセルと比較した場合、それらの優れた機械安定性及び独自の化学的特性によって注目されていた。一般的に、Ｄｉｓｃｈｅｒ，Ｄ．Ｅ．；Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２，２９７，９６７−９７３；Ｄｉｓｃｈｅｒ，Ｂ．Ｍ．；Ｗｏｎ，Ｙ．Ｙ．；Ｅｇｅ，Ｄ．Ｓ．；Ｌｅｅ，Ｊ．Ｃ．Ｍ．；Ｂａｔｅｓ，Ｆ．Ｓ．；Ｄｉｓｃｈｅｒ，Ｄ．Ｅ．；Ｈａｍｍｅｒ，Ｄ．Ａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９９，２８４，１１４３−１１４６；Ｌｅｅ，Ｊ．Ｃ．Ｍ．；Ｂｅｒｍｕｄｅｚ，Ｈ．；Ｄｉｓｃｈｅｒ，Ｂ．Ｍ．；Ｓｈｅｅｈａｎ，Ｍ．Ａ．；Ｗｏｎ，Ｙ．Ｙ．；Ｂａｔｅｓ，Ｆ．Ｓ．；Ｄｉｓｃｈｅｒ，Ｄ．Ｅ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．２００１，７３，１３５−１４５，Ｂｅｒｍｕｄｅｚ，Ｈ．；Ｂｒａｎｎａｎ，Ａ．Ｋ．；Ｈａｍｍｅｒ，Ｄ．Ａ．；Ｂａｔｅｓ，Ｆ．Ｓ．；Ｄｉｓｃｈｅｒ，Ｄ．Ｅ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２００２，３５，８２０３−８２０８，ａｎｄ Ｇｈｏｒｏｇｈｃｈｉａｎ，Ｐ．Ｐ．；Ｆｒａｉｌ，Ｐ．Ｒ．；Ｓｕｓｕｍｕ，Ｋ．；Ｂｌｅｓｓｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．；Ｂｒａｎｎａｎ，Ａ．Ｋ．；Ｂａｔｅｓ，Ｆ．Ｓ．；Ｃｈａｎｃｅ，Ｂ．；Ｈａｍｍｅｒ，Ｄ．Ａ．；Ｔｈｅｒｉｅｎ，Ｍ．Ｊ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ（ＰＮＡＳ），２００５，１０２，２９２２−２９２７を参照のこと。ポリマー小胞はさらに、水溶性親水性化合物（薬剤、ビタミン、フルオロフォアなど）をそれらの水性空洞の内部に封入するだけでなく、疎水性分子をそれらの厚いラメラ膜の中に封入する能力を有すると証明された。さらに、サイズ、膜の厚さ、及びそれらの合成小胞の安定性は、ブロックコポリマー化学的構造、数平均分子量、親水性から疎水性体積分率、及び様々な調合方法を介するかを選択することによって合理的に調整され得る。従って、ポリマーソームは、医療画像、ドラッグデリバリー及び美容装置におけるそれらの潜在的な適用に役立つ多くの魅力ある特徴を有している。Ｄｉｓｃｈｅｒ，Ｄ．Ｅ．；Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２，２９７，９６７−９７３，Ｆｒａｉｌ，Ｐ．Ｒ．；Ｓｕｓｕｍｕ，Ｋ．；Ｂｌｅｓｓｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．；Ｂｒａｎｎａｎ，Ａ．Ｋ．；Ｂａｔｅｓ，Ｆ．Ｓ．；Ｃｈａｎｃｅ，Ｂ．；Ｈａｍｍｅｒ，Ｄ．Ａ．；Ｔｈｅｒｉｅｎ，Ｍ．Ｊ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ（ＰＮＡＳ），２００５，１０２，２９２２−２９２７．及びＭｅｎｇ Ｆ．；Ｅｎｇｂｅｒｓ，Ｇ．Ｈ．Ｍ．；Ｆｅｉｊｅｎ Ｊ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，２００５，１０１，１８７−１９８．を参照のこと。
【０００４】
現在までに、ポリマーソームは、ポリ（エチレンオキシド）−ｂ−ポリブタジエン（ＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ）、ポリ（エチレンオキシド）−ｂ−ポリエチルエチレン（ＰＥＯ−ｂ−ＰＥＥ）、ポリスチレン−ｂ−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＳ−ｂ−ＰＥＯ）、ポリ（エチレンオキシド）−ｂ−ポリ（プロピレンオキシド）−ｂ−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ｂ−ＰＲＯ−ｂ−ＰＥＯ）トリブロックコポリマー、ポリスチレン−ｂ−ポリ（アクリル酸）（ＰＳ−ｂ−ＰＡＡ）、ポリ（２−メチルオキサゾリン）−ｂ−ポリ（ジメチルシロキサン）−ｂ−ポリ（２−メチルオキサゾリン）（ＰＭＯＸＡ−ｂ−ＰＤＭＳ−ｂ−ＰＭＯＸＡ）などを含む、多くの異なる両親媒性ブロックコポリマーから形成されていた。しかしながら、これらの処方は、ヒトｉｎ ｖｉｖｏ適用に必要な自己組織化で且つ完全に生分解性であるポリマーソームを産出しない。Ｆｅｉｊｉｎらは、生分解可能なポリマーソームは有機共溶媒／水注入／抽出システムを用いることによって、ＰＥＯ及び脂肪族ポリエステル／ポリカーボネートの両親媒性生分解可能ジブロックコポリマーから調合され得ると報告した。Ｍｅｎｇ Ｆ．；Ｈｉｅｍｓｔｒａ，Ｃ．；Ｅｎｇｂｅｒｓ，Ｇ．Ｈ．Ｍ．；Ｆｅｉｊｅｎ Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２００３，３６，３００４−３００６．を参照のこと。自己組織化（すなわちフィルム水和、バルク水和或いは電気形成）に基づいた他のポリマーソーム調合方法と比較して、このシステムの主な欠点は、有機共溶媒が組織化後の水性ポリマーソーム懸濁液から完全に除去されなくてはならないということである。そのような工程に関連する余計な時間と費用に加えて、あらゆる残存有機溶媒はヒト体内で極めて毒性である。
【０００５】
容易に組織化し、有機／水共溶媒／抽出システムを使用するシステムの欠点を持たない、完全に生分解可能なポリマーソームに対する本分野のニーズが存在する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
いくつかの実施形態において、本発明は、ポリエチレンオキシド及びポリカプロラクトンのブロックコポリマーから製造された小胞或いはポリマーソームに関するものである。前記ポリエチレンオキシドは、約２．０〜約３．８ｋＤａの数平均分子量を有するものである。前記ブロックコポリマーは約１１〜２０重量パーセントの割合のポリエチレンオキシドを有する。いくつかの実施形態において、前記ポリエチレンオキシドの割合は、約１２〜１９重量パーセントである。他の実施形態において、前記割合は約１１．８〜１８．８重量パーセントである。
【０００７】
いくつかの観点において、本発明は、前述のポリマーソームを調合するための方法に関するものである。特定の好ましい実施形態において、前記ポリマーソームは自己組織化する能力を有している。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
いくつかの実施形態において、本発明は、部分的に或いは完全にポリエチレンオキシド及びポリカプロラクトンのブロックコポリマーで構成された小胞に関するものである。前記ポリエチレンオキシドは、約２．０〜約３．８ｋＤの平均分子量を有するものである。前記ブロックコポリマーは、わずか約１１〜約２０重量パーセントのポリエチレンオキシドを有するものである。特定の実施形態において、前記ブロックコポリマーは、付加的単量体ユニット或いはブロックを有するものである。これらのブロックは、付加的ポリエチレンオキシド或いはポリカプロラクトンブロックである、若しくは異なる物質である。
【０００９】
いくつかの実施形態において、前記ポリマーソームは、対応するポリエチレンオキシドポリマーブロックとの組み合わせで使用される、疎水性ポリカプロラクトン、ポリ乳酸、ポリグリコライド（ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｄｅ）、或いはポリメチレンカーボネートポリマーブロックを含む。特定の実施形態において、前記ポリマーソームは、オリゴカプロラクトン成分が存在する分離ポリエチレンオキシドブロック及びランダム疎水性ポリマーブロックから成る両親媒性ランダムコポリマー、及び疎水性ポリ乳酸、ポリグリコライド或いはポリメチレンカーボネートオリゴマーに基づいている。
【００１０】
両親媒性コポリマーは、フリーラジカル開始、アニオン性重合、ペプチド合成、或いは転移ＲＮＡを用いたリボソーム合成によって製造されたポリマーから成る。
【００１１】
いくつかの実施形態において、前記小胞は、わずか約１２〜約１９重量パーセントのポリエチレンオキシドを有する。他の実施形態において、前記小胞は、わずか約１１．８〜１８．８重量パーセントのポリエチレンオキシドを有する。
【００１２】
本明細書で記載された組成物において、親水性ブロックとしてポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）を用いることができることは注意すべきである。ＰＥＧは、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）と同様な特性を有することが知られている。そのようなものとして、ポリ（エチレングリコール）−ポリカプロラクトンジブロックは、ポリエチレンオキシド−ポリカプロラクトン組成物として同様な方法で機能すべきである。本発明の観点内である付加的な組成物は、２若しくはそれ以上のＰＥＯ、ポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）、及びＰＥＧの混合物である。
【００１３】
ポリカプロラクトンの平均分子量は、約９〜約２３ｋＤである。いくつかの実施形態において、前記ポリカプロラクトンの平均分子量は、約９．５〜約２２．２ｋＤである。Ｍｎは本発明者らの研究ではＧＰＣ及びＮＭＲによって決定した。そのような技術は、本分野の当業者には既知の標準法である。例えば、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １−２，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｂｒａｎｄｒｕｐ （Ｅｄｉｔｏｒ），Ｅｄｍｕｎｄ Ｈ．Ｉｍｍｅｒｇｕｔ（Ｅｄｉｔｏｒ），Ｅｒｉｃ Ａ．Ｇｒｕｌｋｅ，Ａｋｉｈｉｒｏ Ａｂｅ，Ｄａｎｉｅｌ Ｒ．Ｂｌｏｃｈ；ＩＳＢＮ：０−４７１−４７９３６−５；及びＢｌｏｃｋ Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｉｋｏｓ Ｈａｄｊｉｃｈｒｉｓｔｉｄｉｓ，Ｓｔｅｒｇｉｏｓ Ｐｉｓｐａｓ，Ｇｅｏｒｇｅ Ｆｌｏｕｄａｓ，ＩＳＢＮ：０−４７１−３９４３６−Ｘ．を参照のこと。
【００１４】
１つの好ましい実施形態において、前記ポリエチレンオキシドの分子量は約２ｋＤであり、前記ポリカプロラクトンの分子量は約１２ｋＤである。
【００１５】
特定の好ましい実施形態において、前記小胞は生体吸収性である。「生体吸収性」という用語は、化学反応によって分解された場合、他の化学種の合成に対する構成ブロックとして生体細胞によって使用され得る、若しくは老廃物として排出され得る置換成分を導く分子を意味する。
【００１６】
ポリエチレンオキシドは、前記小胞の表面に生体適合性を与え、血液循環時間を延長させる疎水性ブロックである。ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）は小胞の疎水性膜部分を構成する。ＰＣＬは、生理学的条件下（ヒト体内など）でそのエステル結合の加水分解によって分解されるため、薬物送達装置、生体吸収性縫合、接着バリアにおける移植可能な生体物質として、及び組織工学を介した創傷治癒に対する足場として使用するための大きな注目を浴びている。他の生分解性脂肪族ポリエステルと比較して、ＰＣＬはいくつかの優れた特性を有しており、これには：１）小薬剤分子に対する高い透過性；２）分解に対する中性ｐＨの維持；３）他のポリマーとの混合形成時の能力；及び４）ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコライド（ＰＧＡ）、及びポリ乳酸−同時−グリコール酸（ＰＬＧＡ）と比較した場合の、遅浸食動態学によって生じる長期送達に対する適合性が含まれる。本発明者らの処方における疎水性ブロックとしてのＰＣＬの利用は、結果生じるポリマーソームは安全で完全なｉｎ ｖｉｖｏ分解をするということを確実にする。
【００１７】
両親媒性ポリエチレンオキシド−ｂ−ポリカプロラクトンは、スズ（ＩＩ）オクテート（ＳｎＯｃｔ）及びモノシアノ−或いはモノメトキシ−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ、０．７５ｋ、１．１ｋ、１．５ｋ、２ｋ、５ｋ、５．５ｋ；Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｏｕｒｃｅ、Ｄｏｒｖａｌ、カナダ）の存在下で、サイクリックε−カプロラクトン（ＣＬ）の開環重合を介して製造され得る。Ｂｏｇｄａｎｏｖ，Ｂ．；Ｖｉｄｔｓ，Ａ．；Ｖａｎ Ｄｅｎ Ｂｕｌｃｋｅ，Ａ．；Ｖｅｒｂｅｅｃｋ，Ｒ．；Ｓｃｈａｃｈｔ，Ｅ．Ｐｏｌｙｍｅｒ １９９８，３９，（８−９），１６３１−１６３６．を参照のこと。
【００１８】
本発明の組成物は、自己組織化小胞の製造を可能にし、これは、２つの事前ＦＤＡ−承認ポリマーであるポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）及びポリカプロラクトン（ＰＣＬ）の完全な両親媒性ジブロックコポリマーから成る。「生体不活性」及び加水分解性構成成分の混合によって形成された分解性ポリマーとは異なり、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ−ベース小胞は完全な生体吸収性であるべきであり、それらの分解に際して部分的な毒性副産物を残さない。さらに、他の分解可能な（例えば、ペプチド、ポリエステル、或いはポリアンヒドライド−ベース）小胞の公開された報告とは異なり、これら生体吸収性ポリマーソームは、純ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬジブロックコポリマーの自己組織化を通じて自発的に形成されるものである。
【００１９】
前記ポリマーソームのサイズ分布は、超音波処理、凍結／解凍抽出、及びＴｍ＝６０℃以上での押出などの標準技術によって調節され、ｉｎ ｖｉｖｏ適用に有用な、数十ミクロン（共焦点顕微鏡像、図２及び３）〜数百ナノメーターサイズ構造（クリオ−ＴＥＭ顕微鏡像、図４）の範囲のモノ−分散小胞直径を得ることができる。Ｍｏｇｈｉｍｉ，Ｓ．Ｍ．；Ｈｕｎｔｅｒ，Ａ．Ｃ．；Ｍｕｒｒａｙ，Ｊ．Ｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．２００１，５３，（２），２８３−３１８ ａｎｄ Ｇｈｏｒｏｇｈｃｈｉａｎ，Ｐ．Ｐ．；Ｆｒａｉｌ，Ｐ．Ｒ．；Ｓｕｓｕｍｕ，Ｋ．；Ｂｌｅｓｓｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．；Ｂｒａｎｎａｎ，Ａ．Ｋ．；Ｂａｔｅｓ，Ｆ．Ｓ．；Ｃｈａｎｃｅ，Ｂ．；Ｈａｍｍｅｒ，Ｄ．Ａ．；Ｔｈｅｒｉｅｎ，Ｍ．Ｊ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２００５，１０２，（８），２９２２−２９２７．を参照のこと。
【００２０】
特に好ましいのは、ＰＥＯ（２ｋ−３．８ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（９．５ｋ−２２．２ｋ）ジブロックコポリマー（ｗｔ、１１．８−１８．８％の範囲のｆＰＥＯ）であり、これは自己分解性へと自己組織化することができる。これらポリマーの分子量分布は、重要ではないように見られる（すなわちＰＤＩは１．２以下は必要でない）。
【００２１】
以前知られていた全ての小胞製造、自己組織化、両親媒性ジブロックポリマーは、０．３〜０．４の親水性容量率を有していると考えられていた（Ｄｉｓｃｈｅｒ，Ｄ．Ｅ．；Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００２，２９７，（５５８３），９６７−９７３ ａｎｄ Ｂｅｒｍｕｄｅｚ，Ｈ．；Ｂｒａｎｎａｎ，Ａ．Ｋ．；Ｈａｍｍｅｒ，Ｄ．Ａ．；Ｂａｔｅｓ，Ｆ．Ｓ．；Ｄｉｓｃｈｅｒ，Ｄ．Ｅ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２００２，３５，（２１），８２０３−８２０８を参照のこと）一方、注目すべきＰＥＯ（２ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（１２ｋ）は、有意に低い（０．１５以下）算出された率（Ｂｒａｎｄｒｕｐ，Ｊ．；Ｉｍｍｅｒｇｕｔ，Ｅ．Ｈ．；Ｇｒｕｌｋｅ，Ｚ．Ａ．，Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｈａｎｄｂｏｏｋ；Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ&Ｓｏｎｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９９；Ｖｏｌ．６，ｐ５３を参照）を有している。
【００２２】
本発明のＰＥＯ（２ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（１２ｋ）−ベースポリマーソーム及び他のポリマーソームは、リザーバー及び一体化拡散−調節送達装置の両者の要素を組み合わせた独特の生分解性送達小胞を構成する。ＰＥＯ（２ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（１２ｋ）−ベースポリマーソーム大きな膜コアの厚さ（２２．５＋／−２．３ｎｍ）は、単一複合小胞鋳型内に疎水性（隔絶膜）及び親水性（内部水性コア）化合物の両者を取り込むための機会を提供する。これらの生体吸収性ポリマーソームからの放出は、膜を通じた水性コアからの内因性薬剤透過性と同様に、ＰＣＬマトリックス浸食に依存するものであろう。最終的に、前記自己組織化小胞構造は、容易で経済的なメゾスコピック（ナノメーター〜マイクロン）コロイド装置の製造を可能にし、それは組織化後に有機共溶媒除去の必要性を除去する一方、大量産生を可能にするものである。
【００２３】
前記ブロックコポリマーソームの表面は修飾され得る。いくつかの実施形態において、水溶性ポリエチレンオキシドの末端は、化学修飾に対する位置の特異性、及び表面との物理的相互作用のための置換リガンドの有効性のおかげで、置換に対して最も誘引性のある位置である。たくさんの化学変換は末端アルコール（例えばＳｔｒｅｉｔｗｅｉｓｅｒ Ａ，Ｈｅａｔｈｃｏｃｋ ＣＨ，Ｋｏｓｏｗｅｒ ＥＭ．Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（１９９２）を参照のこと）で開始することも可能である。例えば、アクリロニトリルとのＰＥＯ−ＯＨの反応及びその後のプロトン化は、前記末端基を一級アミンへと変換する。反応条件は、全てのポリマー化学に対して一般的に適合可能であり、いくつかのそのような反応は、以下に記載したブロックコポリマーへの適用に最適化されるであろう。広範囲の化学機能基へ生体分子を接着する技術は、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｌｉｇａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９２）によってカタログ化された。
【００２４】
いくつかの小胞は、生物学的位置で特異的な結合に対する標的部位として使用される末端に結合された化合物を有している。いくつかの実施形態において、前記標的部位は、生理学的条件下で生物学的位置と特異的に結合する。標的部位としては、抗体、抗体断片、及び所定の受容体結合部位に特異的な物質を含む。前記受容体結合部位、或いは標的部位は、受容体特異的ペプチド、糖、脂質、ヌクレオシド、ペプチド核酸、或いはそれらの組み合わせから成る。
【００２５】
前記標的部位は、連結基によって前記小胞或いはポリマーソームへ任意に結合されるものである。適切な連結基は、前記ポリマーソーム／画像化剤システムへの有害な効果なしで、望ましい程度の可動性を提供するものである。
【００２６】
いくつかの実施形態において、前記小胞は付加的に、前記ブロックコポリマーの親水性末端に共役結合したタンパク質、ペプチド、糖類、ヌクレオシド、無機化合物、或いは有機化合物を有する。
【００２７】
いくつかの実施形態において、前記小胞は付加的に、前記水性ポリマーソーム内部に区分されたタンパク質、ペプチド、糖類、ヌクレオシド、無機化合物、或いは有機化合物を有する。他の実施形態において、前記小胞は付加的に、前記疎水性小胞膜内に区分されたタンパク質、ペプチド、糖類、ヌクレオシド、無機化合物、或いは有機化合物を有する。
【００２８】
いくつかの実施形態において、前記区分された因子は、ヒト体内で治療上価値のあるものである。いくつかの実施形態において、前記小胞は、ｉｎ ｖｉｖｏでの使用に対して米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認された、区分された或いは共役結合した成分を含む。
【００２９】
いくつかの小胞は付加的に、前記疎水性小胞膜内へ区分された、放射性因子、細胞毒性因子、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）因子、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）因子、放射線画像法因子或いは光線力学的治療（ＰＤＴ）因子の少なくとも１つを有する。いくつかの実施形態において、前記放射性因子は、前記疎水性小胞膜内に区分されるものである。他の実施形態において、前記区分されたＭＲＩ因子は、前記疎水性小胞膜内に存在するものである。特定の実施形態において、前記ＰＥＴ因子は、前記疎水性小胞膜内に区分されるものである。いくつかの組成物は、少なくとも１つの、前記疎水性小胞膜内に区分された放射線画像法因子を有するものである。いくつかの組成物は、少なくとも１つの前記疎水性小胞膜内に区分されたＰＤＴ因子を有するものである。他の実施形態において、前記因子は、前記水性ポリマーソーム内部に区分されているものである。
【００３０】
前記小胞は付加的に、前記疎水性小胞膜内へ区分された、二次放射性因子、細胞毒性因子、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）因子、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）因子、放射線画像法因子或いは光線力学的治療（ＰＤＴ）因子の少なくとも１つを有する。いくつかの実施形態において、前記二次放射性因子は、前記水性ポリマーソーム内部に区分されているものである。
【００３１】
いくつかの実施形態において、本発明のポリマーソームは、前記ポリマーソーム膜内で分散された、少なくとも１つの可視或いは近赤外線放射性因子を含むものである。いくつかの放射性因子は、７００〜１１００ｎｍスペクトル型の光を発する。
【００３２】
特定の放射性因子は、ポルフィリン部位を有している。いくつかの実施形態において、前記放射性因子は、少なくとも２つのポルフィリン部位を有しており、ここは、前記ポルフィリン部位が少なくとも１つの不飽和部位を有する炭化水素架橋によって結合されている場所である。
【００３３】
本発明に有用ないくつかの放射性因子は、ポルフィセン、ルビリン、ロサリン（ｒｏｓａｒｉｎ）、ヘキサフィリン、サッフィリン（ｓａｐｐｈｙｒｉｎ）、クロロフィル、塩素（ｃｈｌｏｒｉｎ）、フタロシアニン、ポルフィラジン（ｐｏｒｐｈｙｒａｚｉｎｅ）、バクテリオクロロフィル、フェオフィチン、テキサフィリン大環状ベース化合物、或いはそれらのメタル化（ｍｅｔａｌａｔｅｄ）誘導体である。
【００３４】
有用な放射性因子は、レーザー色素、フルオロフォア、ルモフォア（ｌｕｍｏｐｈｏｒｅ）或いは蛍光体である放射性因子を含む。
【００３５】
適切なレーザー色素は、ｐ−テルフェニル、スルホローダミンＢ、ｐ−クアテルフィニル、ローダミン１０１、カルボスチニル１２４、クレシルバイオレット過塩素酸塩、ｐｏｐｏｐ、ＤＯＤＣイオジン、クマリン１２０、スルホローダミン１０１、クマリン２、オキソジン４過塩素酸塩、クマリン３３９、ＰＣＭ、クマリン１、オキサジン１７０過塩素酸塩、クマリン１３８、ナイルブルーＡ過塩素酸塩、クマリン１０６、オキサチン１過塩素酸塩、クマリン１０２、ピリジン１、クマリン３１４Ｔ、スチリル７、クマリン３３８、ヨウ化ＨＩＤＣ、クマリン１５１、ヨウ化ＰＴＰＣ、クマリン５００、ＨＩＴＣ過塩素酸塩、クマリン３０７、ヨウ化ＰＴＴＣ、クマリン３３４、ＤＴＴＣ過塩素酸塩、クマリン７、ＩＲ−１４４、クマリン３４３、ＨＤＩＴＣ過塩素酸塩、クマリン３３７、ＩＲ−ＮＯ、クマリン６、ＩＲ−１３２、クマリン１５２、ＩＲ−１２５、クマリン１５３、ホウ素−ジピロメゼア（ｄｉｐｙｒｒｏｍｅｔｈｅｒｅ）、ＨＰＴＳ、フルオレセイン、ローダミン１１０、２、７−ジクロロフルオレセイン、ローダミン６５及びローダミン１８過塩素酸塩、ローダミンｂを含み、前記レーザー色素は疎水性置換基の付加によって修飾され、前記レーザー色素は実質的に前記ポリマーソーム膜内に存在するものである。
【００３６】
いくつかの組成物は、少なくとも１つの放射性因子を有しており、これは、ジ−及びトリカルボシアニン色素、クロコニウム色素、少なくとも１つの電子求引性置換基で置換されたチエニレンフェニレンビニレン種である近赤外線（ＮＩＲ）放射性種であり、前記レーザー色素は実質的に前記ポリマーソーム膜内に存在するものである。
【００３７】
特定の放射性因子は、少なくとも２つの共有結合部位を有している放射性共役化合物であり；それによって前記化合物をエネルギー源に一定時間、前記化合物が波長７００〜１１００ｎｍの間で光を発するようにするのに有効な条件下で曝露した場合、個々に共有結合部位のどちらかによって発された光の合計以上の強度を有するものである。
【００３８】
前記放射性因子は、少なくとも２つの共有結合部位を有する放射性共役化合物であり；それによって前記化合物をエネルギー源に一定時間、前記化合物が波長７００〜１１００ｎｍの間で光を発するようにするのに有効な条件下で曝露した場合、個々の前記部位のどちらかによって示された放射オシレーター強度以上の総放射オシレーター強度を示すものである。
【００３９】
いくつかの放射性因子は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合、炭素−炭素三重結合、若しくはそれらの組み合わせによって結合されている放射性種を定義する共有結合部位を有している。放射性種を定義する前記共有結合部位は、エチニル、エセニル、アレニル、ブタジニル、ポリビニル、チオフェニル、フラニル、ピロリル或いはｐ−ジエチリルアレニルリンカーによって結合される、若しくはジエチニル、ジ（ポリビニニル）、ジニビニル、ジ（ポリビニル）或いはジ（チオフェニル）置換基を有する共役複素環によって結合され得る。特定の実施形態において、放射性種を定義する前記共役結合部位は、少なくとも１つのイミン、フェニレン、チオフェン、或いはアミド、エーテル、チオエーテル、エステル、ケトン、スルホン、若しくはカルボジイミド基によって結合されている。
【００４０】
いくつかの小胞は、ホルフィネート（ｐｈｏｒｐｈｉｎａｔｏ）画像剤を含んでおり、これは、６００〜１１０ｎｍスペクトル型において放射可能なβ−β、メソ−β、或いはメソ−メソ結合形態画像剤を特徴付けるエチニル−或いはブタジニル−架橋マルチ（ホルフィリン）化合物である。いくつかの適切なホルフィリン−ベース画像剤は、以下の構造式を有しており：
【化１】
【００４１】
ここにおいて、Ｍは金属或いはＨ２であり、Ｈ２は大環状分子の遊離リガンド型を表示し；ＲＡ及びＲＢはそれぞれ独立してＨ、Ｃ１−Ｃ２０アルキル或いはＣ１−Ｃ２０ヘテロアルキル、Ｃ６−Ｃ２０アリール或いはヘテロアリール、Ｃ（ＲＣ）＝Ｃ（ＲＤ）（ＲＥ）、Ｃ＝Ｃ（ＲＤ）、若しくは、ペプチド、ヌクレオシド或いは糖類を有する化学機能基であり、ここにおいてＲＣ、ＲＤ及びＲＥはそれぞれ独立してＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、Ｃ４−Ｃ２０ヘテロアルキル、アリール或いはヘテロアリール、Ｃ２−Ｃ２０アルケニル或いはへテロアルケニル、アルケニル或いはＣ２−Ｃ２０ ヘテロアルキニル、トリアルキルシリル或いはホルフィリネートであり；ｎは１〜１０の整数である。いくつかの実施形態において、ｎは１〜８の整数である。
【００４２】
ホルフィリン−ベース画像剤のＭは、亜鉛、マグネシウム、白金、パラジウム、或いはＨ２であり、Ｈ２は大環状分子の遊離リガンド型を表示している。
【００４３】
いくつかの実施形態において、前記ポリマーソームホルフィリン−ベース画像剤は放射性である。いくつかの薬剤は、マルチ（ホルフィリン）画像剤であり、これはメソ−メソエチン−或いはブタジエン−架橋結合形態を有しており、前記画像剤は６００〜１１００ｎｍスペクトル型において放射することができる。
【００４４】
本分野の当業者は、ホルフィリン−含有化合物から調合され得る広範囲のダイマー、トリマー、オリゴマー或いはポリマーを認識するであろう。そのような化合物は、例えば米国特許第１０／７７７，５５２号に見いだされ、この参照によって本明細書にその全体が組み込まれるものである。
【００４５】
本発明は、以下の実施例によって説明されるが限定されることを意図しているものではない。
【００４６】
実験
材料
ε−カプロラクトン（ε−ＣＬ）は、Ａｌｄｒｉｃｈより購入し、室温で４８時間水素化カルシウム（ＣａＨ２）で乾燥させ、減圧下で蒸留した。１末端−ＯＨ基を有し、５０００、２０００、１１００及び７５０のＭｎを有するモノメトキシルポリ（エチレンオキシド）（ＭｅＰＥＯ）ホモポリマーは、Ｆｌｕｋａから購入した。大きなＭｅＰＥＯブロック（Ｍｎ＝１１００、２０００及び５０００）は、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中への溶解し、その後エーテルへ沈殿させ、その後４０℃、１０ｍｍＨｇで２４時間乾燥させることによって精製した。他のＭｅＰＥＯブロック（Ｍｗ＝７５０）は、レシーブ（ｒｅｃｅｉｖｅｄ）として使用した。スズ（ＩＩ）オクトネート（ＳｔＯｃｔ２）はＳｉｇｍａから購入し、レシーブとして使用した。エチレンオキシド（ＥＯ）はＡｌｄｒｉｃｈから購入し、水酸化カリウムを通過させることによって精製し、２時間混ぜてＣａＨ２へ濃縮し、最終的に蒸留によって回収した。ナフタレンは使用前にエーテルから再結晶化し、ＴＨＦはＮａマイナーを蒸留した。他の化学薬品は商業的に利用可能であり、レシーブとして使用した。
【００４７】
重合化反応
開環重合：モノメトキシルポリ（エチレンオキシド）（ＭｅＰＥＯ）をアルゴン下で火炎フラスコへ満たした。カプロラクトンモノマー（ＭｅＰＥＯに対して様々な算出重量率を有する）を次にシリンジを介して前記フラスコへ注入し、ＳｎＯｃｔ２の少量２滴を反応混合物へ添加した。前記フラスコはバキュームラインへ連結し、気体を抜き、密閉し、１３０℃のオイル槽へ浸した。大量の同種混合物の粘性が進行的に増加し、これは重合化の間いつも観察された。コポリマーは、前記反応混合物を室温まで冷却することによって２４時間後に回収された。その結果生じたブロックコポリマーは、塩化メチレンへ溶解し、過剰冷却メタノール／ヘキサン（４℃）へ沈殿させた。白色粉末産物が得られ、真空条件下で２日以上、４０℃で乾燥させた。
【００４８】
アニオン性リビング（ｌｉｖｉｎｇ）重合化：火炎乾燥及びアルゴン浄化フラスコにおいて、３０ｍＬの無水ＴＨＦ、０．５５ｍＬ（１０ｍｍｏｌ）アセトニトリル、及び５ｍＬカリウムナフタレン／ＴＨＦ溶液（１ｍｍｏｌ／ｍＬ）をアルゴン流下で添加した。勢いよく混ぜ（７０分、２０℃）、その混合物は氷−水槽において冷却し、蒸留されたＥＯを冷却シリンジによって添加した。室温での４８時間重合後、反応産物のサンプル（約５ｍＬ ＣＮ−ＰＥＯ）を除去し、酢酸含有のアセトン溶液で処理し、過剰ジエチルエーテルで沈殿させ、室温の真空下で乾燥させた。次に、算出モル率のＣＬ／ＥＯでＴＨＦに溶解されたε−カプロラクトンをＣＮ−ＰＥＯの残存反応混合物へ添加した。０℃で５〜１０分後、酢酸を含有した過剰なアセトン溶液を添加することによって重合化をクエンチし；最終コポリマーはジエチルエーテルにおいて沈殿することによって除去し、４０℃で２日間、真空下で乾燥させた。
【００４９】
コポリマー特徴化
ＰＥＯポリマー及びコポリマーは、Ｂｒｕｋｅｒ ３００ＭＨｚ或いは５００ＭＨｚ装置を用いたＮＭＲ１Ｈ−ＮＭＲ（電子核磁気共鳴）分光法によって特徴付けされた。重水素化クロロホルム（ＣＤＣｌ３）を溶液として使用し、テトラメチルシラン（ＴＭＳ）を内部標準として使用した。各コポリマー処方に対する重量平均分子量（Ｍｗ）値及び多分散指標（Ｍｗ／Ｍｎ）は、動的レーザー錯乱及び屈折指標検出器を介して、２つの分離カラム（ＰＬゲル５μ混合、３００Ｘ７．５ｍｍ）を用いて、室温（２５℃）で、ＧＰＣ（ＲＡＩＮＩＮ ＨＰＸＬ）によって決定した。ＴＨＦは溶出溶液として利用した。ＰＥＯ標準は、屈折指標データから前記コポリマーの分子量を較正するために使用した。
【００５０】
ポリマーソームの調合
２つの調合方法である、薄膜水和を介した自己組織化及び有機共溶媒／水性抽出物を介した小胞形成を使用し、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬコポリマーを様々な水性形態へ組織化した。膜水和は、ＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ及びＰＥＯ−ｂ−ＰＥＥジブロックコポリマーを有する非分解性ポリマーソームを調合するために広範囲で利用されていた。Ｄｉｓｃｈｅｒ，Ｄ．Ｅ．；Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２，２９７，９６７−９７３ ａｎｄ Ｇｈｏｒｏｇｈｃｈｉａｎ，Ｐ．Ｐ．；Ｆｒａｉｌ，Ｐ．Ｒ．；Ｓｕｓｕｍｕ，Ｋ．；Ｂｌｅｓｓｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．；Ｂｒａｎｎａｎ，Ａ．Ｋ．；Ｂａｔｅｓ，Ｆ．Ｓ．；Ｃｈａｎｃｅ，Ｂ．；Ｈａｍｍｅｒ，Ｄ．Ａ．；Ｔｈｅｒｉｅｎ，Ｍ．Ｊ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ（ＰＮＡＳ），２００５，１０２，２９２２−２９２７．を参照のこと。簡潔には、クロロホルム（１ｍｏｌ％ナイルレッド有無）において２００マイクロリットルの５〜１０ｍｇ／ｍＬ ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬコポリマー溶液を粗面Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）プレートの表面へ均一にコーティングし、その後１２時間以上真空下で前記溶液を蒸発させた。水溶液（例えば２５０−３００ミリオスモルスクロール或いはＰＢＳ）の添加、及び６０℃での４８時間加熱によって、巨大な（５〜２０μｍ）生分解性ポリマーソームの自発性突出（ｂｕｄｄｉｎｇ）を導き、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）堆積薄膜を前記水溶液へはがした。ＰＢＳは、ｐＨ７．２の５０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４及び１４０ｍＭ ＮａＣｌである水性緩衝液である。ナイルレッドは、自己組織化の間に前記ポリマーソーム膜へ取り込まれ、結果生じるコポリマー水性形態の共焦点蛍光顕微鏡を介した容易な可視化を可能にした。
【００５１】
適切な狭いサイズ分布を有する小さな（３００ｎｍ直径以下）単層ポリマーソームは、小さな脂質小胞を処方するために使用される手順（超音波処理、凍結解凍抽出及び押出）に類似した手順を介して調合した。Ｇｈｏｒｏｇｈｃｈｉａｎ，Ｐ．Ｐ．；Ｆｒａｉｌ，Ｐ．Ｒ．；Ｓｕｓｕｍｕ，Ｋ．；Ｂｌｅｓｓｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．；Ｂｒａｎｎａｎ，Ａ．Ｋ．；Ｂａｔｅｓ，Ｆ．Ｓ．；Ｃｈａｎｃｅ，Ｂ．；Ｈａｍｍｅｒ，Ｄ．Ａ．；Ｔｈｅｒｉｅｎ，Ｍ．Ｊ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ（ＰＮＡＳ），２００５，１０２，２９２２−２９２７．を参照のこと。超音波処理手順では、水性−ベース溶液及び乾燥させた（Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）膜などのポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）膜上に均一に堆積させたポリマーの）薄膜処方を含むサンプルバイアルを槽ソニケーター（Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｍｏｄｅｌ ＦＳ２０）へ置き、３０分間撹拌する工程が含まれる。凍結−解凍抽出の複数サイクルを行い、その後前記サンプルバイアル（３００ｎｍ〜５００ｎｍ直径ポリマーソームの溶液を含有）を液体Ｎ２へ置く工程が続いた。鎮静した液体Ｎ２から泡立ったら、前記バイアルを次に６０℃の水槽へ移した。小さい（例えば、１００ｎｍ直径）小胞のモノ−分散懸濁液への抽出は、ポリマーソーム溶液を加圧窒素ガスへ連結した温度調節ステンレススチールシリンダーへ導入することによって進行した。ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ懸濁液のサイズ分布は、動的光錯乱によって各ケースにおいて決定した。
【００５２】
共溶媒／水抽出方法に対して、前記ジブロックコポリマーは、クロロホルム或いはテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（１０ｍｇ／ｍＬ）に溶解し、１：１００重量％で水溶液（スクロース、ＰＢＳ、或いはベンゼン／アルコール水溶液）へ有機共溶媒注入を介して添加した。これらジブロックコポリマーから形成された様々な構造は、室温で２４時間、水性透析（有機共溶媒除去のため）によって前記溶媒混合液から抽出した。
【００５３】
ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ−ベース小胞内への疎水性及び親水性化合物の取り込み
水性不溶性化合物（例えばナイルレッド色素）を、まず同じ有機溶液（一般的にはクロロホルム、塩化メチレン、テトラヒドロフラン、エタノール、メタノール或いはそれらの組み合わせ）においてそれらを大量のポリマーと共溶解することによって、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ−ベース小胞の疎水性膜内へ取り込ませた。前記有機溶液（疎水性分子及びポリマー含有）は次に、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）上で薄膜として乾燥させた。前記薄膜の水性水和及び前記ポリマーの溶解温度（５２℃以上）での加熱を行うと、小胞はそれらの薄い層状膜内に前記水性不溶性化合物を含有する水溶液において形成される（例えば、図２及び３のＰＥＯ（２ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（１２ｋ）−ベースポリマーソーム内のナイルレッド取り込みを参照のこと）。
【００５４】
ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ−ベースポリマーソームの水性環境内の親水性化合物（例えばカルセイン色素）の封入は、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）上での前記ジブロックコポリマーの乾燥薄膜処方を水和するのに使用される水溶液へのそれらの導入に際して生じる。小胞自己組織化後、前記因子の取り込まれなかった部分は、水性透析によって前記小胞を取り囲んでいる外部溶液から除去され得る（図２は、ＰＥＯ（２ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（１２ｋ）−ベースポリマーソームの内部環境内の水性可溶性カルセイン色素を示している）。
【００５５】
小胞サイズの縮小
適切に狭小なサイズ分布（１００〜２００μｍ直径範囲内）を有する小さな小胞は、小さい単層リポソームを処方するために使用される手順（超音波処理、凍結解凍抽出及び押出）と類似した手順を介して調合され得る。
【００５６】
超音波処理手順は、水性ベース溶液及び（Ｔｅｆｌｏｎ上に均一に堆積されたポリマー及びＮＩＲＦ種の）乾燥薄膜処方サンプルバイアルを３０分間、一定に撹拌しながらバスソニケーター（Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｆａｉｒ Ｌａｗｎ、ニュージャージー州；Ｍｏｄｅｌ ＦＳ２０）へ置く方法を含む。いくつかの（ｘ３〜５）サイクルの凍結解凍抽出の後、続いて前記サンプルバイアル（中サイズ、３００ｎｍのＮＩＲ−放射性ポリマーソームの溶液含有）を液体Ｎ２に置いた。鎮静した液体Ｎ２から泡立ったら、前記バイアルを次に５６℃の水槽へ移した。
【００５７】
小さい（１００ｎｍ直径）小胞のモノ分散懸濁液への押出は、圧縮窒素ガスに連結された温度調節性ステンレススチールシリンダーへの水溶液の導入によって開始した。前記小胞溶液は、前記シリンダーの底で丸いスチールふるいによって、支持された０．１μｍポリカーボネートフィルター（Ｏｓｍｏｎｉｃｓ、Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ、カリフォルニア州）を通して押し出し、ここにおいて前記小胞溶液は押出後に回収した。この手順は複数回繰り返し、前記小胞のサイズ分布は動的光錯乱（ＤｙｎａＰｒｏ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ、バージニア州）によって測定した。
【００５８】
大量で、水性小胞懸濁液内のＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬの熱転移の特徴付け
示差走査熱量測定法（ＤＳＣ；ＴＡ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｑ１００，Ｎｅｗ Ｃａｓｔｌｅ、デラウェア州）を利用し、大量で、水性小胞溶液内のＰＥＯ（２ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（１２ｋ）の熱転移を明らかにした（図５）。図５Ａは、２つの結晶化可能ホモポリマーから成るジブロックコポリマーと一致している、大量ＰＥＯ（２ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（１２ｋ）における２つの異なる一次転移を示したものである（溶解開始＝５２．６℃；総熱転移＝９０．２Ｊ／ｇ）。Ｂｏｇｄａｎｏｖ，Ｂ．；Ｖｉｄｔｓ，Ａ．；Ｖａｎ Ｄｅｎ Ｂｕｌｃｋｅ，Ａ．；Ｖｅｒｂｅｅｃｋ，Ｒ．；Ｓｃｈａｃｈｔ，Ｅ．Ｐｏｌｙｍｅｒ １９９８，３９，（８−９），１６３１−１６３６．及びＧａｎ，Ｚ．Ｈ．；Ｊｉａｎｇ，Ｂ．Ｚ．；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｏｌｙ．Ｓｃｉ．１９９６，５９，（６），９６１−９６７．を参照のこと。水中での前記乾燥ポリマー（３０ｍｇ／ｍＬでの）の溶解後すぐに、二重溶解ピークは、二次加熱において５２．３℃のピーク溶解温度の単一一次転移へ移った（溶解開始＝４８．８℃；熱転移＝３２．２Ｊ／ｇ；図５Ｂ）。前記ポリマーは、水性溶解でのその熱転移及び６０℃で４８時間での等温加熱において更なる変化を生じなかった。その構造を低温貯蔵透過型電子顕微鏡（クリオ（ｃｒｙｏ）−ＴＥＭ）によって観察し、そのサイズ分布を動的光錯乱によって決定した、ＰＥＯ（２ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（１２ｋ）−ベースポリマーソームのＤＳＣは、加熱時に小胞サイズに無関係な、同様な一次転移を示した（溶解開始＝４８℃；ピーク＝５２℃；熱転移＝４３Ｊ／ｇ）。大量なＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬの等温結晶化及び溶解挙動は、以前ＷＡＸＤ、ＳＡＸＳ及びＤＳＣにおって研究されており、これはＰＥＯホモポリマーにおける強度な結晶化能にも関わらず、ＰＥＯ重量比が２０％以下の場合、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬコポリマーにおけるＰＣＬブロックのみ結晶可能であった。Ｇａｎ，Ｚ．Ｈ．；Ｊｉａｎｇ，Ｂ．Ｚ．；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｏｌｙ．Ｓｃｉ．１９９６，５９，（６），９６１−９６７．を参照のこと。そのように、ＰＥＯ（２ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（１２ｋ）−ベース小胞において、前記膜は、外部溶液及び内部水性環境へ向けたＰＥＯコロナを有する完全なＰＣＬ薄層から成るということが強く示唆された。
【００５９】
希釈水溶液におけるＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ形態の特徴付け
共焦点レーザー走査顕微鏡（ＢｉｏＲａｄ Ｒａｄｉａｎｃｅ ２０００）及び落射蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００）を用い、蛍光ナイルレッド（ポリマーに対して１ｍｏｌ％色素）を取り込んだＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬの自己組織化水性形態を特徴付けした。前記顕微鏡は、前記色素に対して適切な励起及び放射フィルターを取り付けた。
【００６０】
生分解性ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬジブロックコポリマーの合成及び特徴付け
一連のＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬジブロックコポリマーは、ε−カプロラクトン及び商業的に利用可能なＭｅＰＥＯ（Ｍｎ＝５０００、２０００、１１００及び７５０）の開環重合を介して合成した。１つのヒドロキシル末端基を有するＭｅＰＥＯは、スズ（ＩＩ）オクテート（ｏｃｔｏａｔｅ）（ＳｎＯｃｔ２）触媒下でのε−ＣＬモノマーの重合（１３０℃で２４時間）を活性化するためのマクロイニシエーターとして使用した（スキーム１）。ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬジブロックコポリマーは以前、無触媒スキームでの方法（Ｊｅｏｎｇ，Ｙ．；Ｋａｎｇ，Ｍ．；Ｓｕｎ，Ｈ．；Ｋａｎｇ，Ｓ．；Ｋｉｍ，Ｈ．；Ｍｏｏｎ，Ｋ．；Ｌｅｅ，Ｋ．；Ｋｉｍ，Ｓ．；Ｊｕｎｇ，Ｓ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２００４，２７３，９５−１０７．及びＣｅｒｒｉ，Ｐ．；Ｔｒｉｃｏｌｉ，Ｍ．；Ａｎｄｒｕｚｚｉ，Ｆ．；Ｐａｃｉ，Ｍ．Ｐｏｌｙｍｅｒ，１９８９，３０，３３８−３４３を参照のこと）と同様に、多くの異なる触媒システムを用いることによって合成されていた（Ｍｅｎｇ Ｆ．；Ｈｉｅｍｓｔｒａ，Ｃ．；Ｅｎｇｂｅｒｓ，Ｇ．Ｈ．Ｍ．；Ｆｅｉｊｅｎ Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２００３，３６，３００４−３００６，Ｚａｓｔｒｅ，Ｊ．；Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｊ．；Ｂａｊｗａ，Ｍ．；Ｌｉｇｇｉｎｓ，Ｒ．；Ｉｑｂａｌ，Ｆ．；Ｂｕｒｔ，Ｈ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２００２，５４，２９９−３０９，２０，Ｂｏｇｄａｎｏｖ，Ｂ．；Ｖｉｄｔｓ，Ａ．；Ｖａｎ Ｄｅｎ Ｂｕｃｋｅ，Ａ．；Ｖｅｒｂｅｅｃｋ，Ｒ．；Ｓｃｈａｃｈｔ，Ｅ．Ｐｏｌｙｍｅｒ，１９９８，３９，１６３１−１６３６，及びＨｓｕ，Ｓ．；Ｔａｎｇ，Ｃ．；Ｌｉｎ，Ｃ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２００４，２５，５５９３−５６０１．を参照のこと）。ＳｎＯｃｔ２は、商業的に利用可能である、取り扱いが容易である、共通有機溶媒及び環状エステルモノマーに可溶性であるという理由より、生分解性ポリエステルの産生に対して最も広く使用された触媒であり、多くの国で食品添加物として許可されている（Ｄｏｎｇ，Ｃ．；Ｑｉｕ，Ｋ．；Ｇｕ，Ｚ．；Ｆｅｎｇ，Ｘ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２００１，３４，４６９１−４６９６を参照のこと）。さらに、ＣＬの非触媒開環重合は、高温（１８０℃以上）で数日実行されなくてはならない。そのように、ＳｎＯｃｔ２は本発明者らのシステムでも、穏やかな反応下でのＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬコポリマーの合成に対する触媒として使用した。この開環重合によって合成された全てのＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬジブロックコポリマーは、表１〜３にまとめた。
【００６１】
【化２】
【００６２】
ε−カプロラクトンの開環重合ＭｅＰＥＯからのＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬコポリマーの合成は容易であるけれども、ＭｅＰＥＯホモポリマーの商業的利用可能性が制限されているため、高度に制御可能なＰＥＯブロック分子量を有するコポリマーを得るのは難しい。代替戦略として、本発明者らは、アニオン性リビング重合化：その手順としては酸化エチレンモノマーから開始し、カプロラクトン重合化が続く、を利用し、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬコポリマーの合成に対する他の経路を提供し、これによって広範囲な利用可能ＰＥＯブロック分子量を得ることができる。さらに、前記コポリマーの末端基（ＰＥＯブロック上）は目的に合わせて作られており、この合成戦略によって簡単に変換する事ができる。Ｎ−末端基を有し、アニオン生リビング重合化を介したＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬジブロックコポリマーの合成に使用された戦略は、スキーム２に示されるものである。
【００６３】
【化３】
【００６４】
カリウムナフタレニドは以下の以前確立された方法論で合成した（Ｈｉｌｌｍｙｅｒ，Ｍ．Ａ．；Ｂａｔｅｓ，Ｆ．Ｓ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１９９６，２９，６９９４−７００２．及びＣａｍｍａｓ，Ｓ．；Ｎａｇａｓａｋｉ，Ｙ．；Ｋａｔａｏｋａ，Ｋ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，１９９５，６，２２６−２３０を参照のこと）。シノメチル（ｃｙｎｏｍｅｔｈｙｌ）カリウムは次に、ＴＨＦにおけるナフタレニドカリウムでのアセトニロリルのメタル化（Ｎａｇａｓａｋｉ，Ｙ．；Ｉｉｊｉｍａ，Ｍ．； Ｋａｔｏ，Ｍ．；Ｋａｔａｏｋａ，Ｋ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，１９９５，６，７０２−７０４．及びＤｅｎｇ，Ｍ．；Ｗａｎｇ，Ｒ．；Ｒｏｎｇ，Ｇ．；Ｓｕｎ，Ｊ．；Ｚｈａｎｇ，Ｘ．；Ｃｈｅｎ Ｘ．；Ｊｉｎｇ，Ｘ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２００４，２５，３５５３−３５５８を参照のこと）によって調合し、エチレンオキシド重合化に対するマクロイニシエーターとして利用した。以前に、低分子量（高ＰＥＯ重量比）ＰＥＯ（２．２ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（１．２ｋ）はこのアニオン性リビング重合化戦略によって合成された（Ｄｅｎｇ，Ｍ．；Ｗａｎｇ，Ｒ．；Ｒｏｎｇ，Ｇ．；Ｓｕｎ，Ｊ．；Ｚｈａｎｇ，Ｘ．；Ｃｈｅｎ Ｘ．；Ｊｉｎｇ，Ｘ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２００４，２５，３５５３−３５５８を参照のこと）。本発明者らは、修正した反応条件（スキームＩＩ参照）を使用し、一連のＰＥＯブロック分子量（すなわち１．５ｋ、２．２ｋ、２．６ｋ、３ｋ、３．８ｋ及び５．８ｋ）、低ＰＥＯ重量比（９．９〜２４．３％），及び広範囲のコポリマーＭｎ（７．８〜４７ｋ）を有するＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬを合成するのに成功した。
【００６５】
１Ｈ−ＮＭＲ分光法は、異なる末端基を有するＰＥＯホモポリマー及びＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬジブロックコポリマーの化学構造及び平均分子量の特徴付けに対して実績がありとても有用な技術であった（Ｍｅｎｇ Ｆ．；Ｈｉｅｍｓｔｒａ，Ｃ．；Ｅｎｇｂｅｒｓ，Ｇ．Ｈ．Ｍ．；Ｆｅｉｊｅｎ Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２００３，３６，３００４−３００６，Ｚａｓｔｒｅ，Ｊ．；Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｊ．；Ｂａｊｗａ，Ｍ．；Ｌｉｇｇｉｎｓ，Ｒ．；Ｉｑｂａｌ，Ｆ．；Ｂｕｒｔ，Ｈ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２００２，５４，２９９−３０９，Ｊｅｏｎｇ，Ｙ．；Ｋａｎｇ，Ｍ．；Ｓｕｎ，Ｈ．；Ｋａｎｇ，Ｓ．；Ｋｉｍ，Ｈ．；Ｍｏｏｎ，Ｋ．；Ｌｅｅ，Ｋ．；Ｋｉｍ，Ｓ．；Ｊｕｎｇ，Ｓ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２００４，２７３，９５−１０７，Ｃｅｒｒｉ，Ｐ．；Ｔｒｉｃｏｌｉ，Ｍ．；Ａｎｄｒｕｚｚｉ，Ｆ．；Ｐａｃｉ，Ｍ．Ｐｏｌｙｍｅｒ，１９８９，３０，３３８−３４３，Ｂｏｇｄａｎｏｖ，Ｂ．；Ｖｉｄｔｓ，Ａ．；Ｖａｎ Ｄｅｎ Ｂｕｃｋｅ，Ａ．；Ｖｅｒｂｅｅｃｋ，Ｒ．；Ｓｃｈａｃｈｔ，Ｅ．Ｐｏｌｙｍｅｒ，１９９８，３９，１６３１−１６３６，Ｈｓｕ，Ｓ．；Ｔａｎｇ，Ｃ．；Ｌｉｎ，Ｃ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２００４，２５，５５９３−５６０１，及びＮａｇａｓａｋｉ，Ｙ．；Ｉｉｊｉｍａ，Ｍ．；Ｋａｔｏ，Ｍ．；Ｋａｔａｏｋａ，Ｋ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，１９９５，６，７０２−７０４を参照のこと）。ＭｅＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬに対する典型的なＮＭＲスペクトルは図１に示した。１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおけるＰＥＯブロックの末端メチレン基と一致する４．２０ｐｐｍ（ｂ’）周辺の小さなピークの出現は、最終反応産物がＰＥＯ及びＰＣＬのジブロックコポリマーのみに限定されたことを意味している。３．３８ｐｐｍでの小さく鋭いピーク及び３．６５ｐｐｍでの非常に強いピークは、それぞれ、メチル（ａ、ＣＨ３Ｏ−末端ＰＥＯ）及びメチレン基（ｂ、ＭｅＰＥＯの繰り返しユニット）によるものであると考えられた。２．２３ｐｐｍ、１．６３ｐｐｍ、１．３８ｐｐｍ及び４．０６ｐｐｍでのピークは、ＰＣＬ繰り返しユニットにおけるプロトンであると割り当てられた（ｃ、ｄ、ｅ及びｆメチレン）。ＰＥＯブロックのメチレンプロトンからの３．６５ｐｐｍでのピーク、及びＰＣＬブロックにおけるカプロラクトン繰り返しユニット（ｂ、ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）のメチレンプロトンからの２．２３ｐｐｍでの三重線（トリプレット）は、ある程度のＰＣＬブロック重合化及びＭｎ（ＮＭＲ）を達成するために使用した。１Ｈ−ＮＭＲ分光法はさらに、末端基（すなわちＣＨ３Ｏ−或いはＣＮＣＨ２ＣＨ２−）のプロトンピークと比較することによって、算出エチレンオキシド繰り返しユニット数からＰＥＯの平均分子量を特徴付けするために使用した。ＣＮ−ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ及びＭｅＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬジブロックコポリマーの間の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおけるたった１つの違いは、３．３８ｐｐｍ（ＣＨ３Ｏ−）（ＭｅＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬに見られるＰＥＯブロック末端基）での弱いピークと置き換わった、ＣＮ−ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬのＰＥＯ末端基に対する２．２５ｐｐｍ（ＣＮ、ＣＮ−ＣＨ２−ＣＨ２へ結合した第一のメチレン）及び１．９０ｐｐｍ（ＣＮ−ＣＨ２−ＣＨ２に対する第二のメチレン）周辺の２５つの弱いピークと一致する。ＣＮ−ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬジブロックコポリマーの平均分子量値はさらにＮＭＲスペクトルから計算した。
【００６６】
【化４】
【００６７】
ＧＰＣは、各ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬジブロックコポリマー処方の分子量（Ｍｗ）及び分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）（ＰＤＩ）を特徴付けするために使用した。２タイプの平均分子量はそれぞれ、ＰＥＯ標準サンプルを用いることによって、及び動的光錯乱データを利用することによって、反応性指標データから計算した（表１参照のこと）。ＰＥＯ（５．８ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（２４．０ｋ）、ＰＥＯ（５ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（２２ｋ）、ＰＥＯ（２ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（１２ｋ）及びＰＥＯ（２ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（１５ｋ）などのいくつかのコポリマーは、１Ｈ−ＮＭＲから決定された値と比較した場合、ＧＰＣから得られたように同様な分子量値を示した。とりわけ、合成された最も大きいコポリマーであるＰＥＯ（５．８ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（３３．６ｋ）及び最も小さいコポリマーであるＰＥＯ（２ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（９．５ｋ）はしかしながら、１Ｈ−ＮＭＲデータ対ＧＰＣデータから決定したＭｗにおいて著しい差異が見られた。ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬジブロックコポリマー標準サンプルがＲＩデータ（ＧＰＣ）の検定に商業的に利用可能できないため、前記コポリマーのｄｎ／ｄｃ値は、ＰＳ標準サンプルから得て、ＤＬＳデータを検定するために使用し、従って２つの方法（ＧＰＣ及び１Ｈ−ＮＭＲ）によって得られた分子量値決定における差異を説明するように思われる。
【００６８】
ＧＰＣデータから、アニオン性リビング重合化によって合成した、様々なＰＥＯ分子量（２．２ｋ、２．６ｋ、３ｋ、３．８ｋ及び５．８ｋ）を有するＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬジブロックコポリマーは、全体で最も狭い分子量分布（ＰＤＩ：１．２−１．２７）を示した。開環重合を介してＰＥＯ（２ｋ）から合成されたＰＥＯ−ＰＣＬジブロックコポリマーは、狭い分子量分布（１．１−１．２）を示した一方、ＰＥＯ（５ｋ）由来のコポリマーはわずかに広い分子量分布（ＰＤＩ：１．３２−１．３７）を示した。従って、アニオン性リビング重合化は、調節されたＰＥＯブロック分子量、様々なＰＥＯ／ＰＣＬブロック比及び狭い分子量分布を有するＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬジブロックコポリマーの合成に対して最高の経路を提供する。
【００６９】
【表１】
【００７０】
ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬジブロックコポリマーの水性組織化
膜水和及び有機共溶媒注入／抽出という２つの調合方法は、様々な水性形態（ポリマーソームを含む）へと両親媒性ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬジブロックコポリマーを組織化するために選択した。膜水和はコポリマーの水性自己組織化を促進し、組織化後処理の必要性を取り除く一方、容易な大量産生を可能にするので、優先的に利用した。表２及び３は、様々なＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬジブロックコポリマー処方の観察された（１ｍｏｌ％ナイルレッドの取り込みによって決定され、蛍光共焦点及び光学顕微鏡によって可視化したように）水性形態をまとめたものである。
【００７１】
【表２】
【００７２】
【表３】
【００７３】
ポリマーソームはＰＥＯ（２ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（１２ｋ）ジブロックコポリマー（ＦＰＥＯ＝１４．３％）（共焦点蛍光顕微鏡像、図２）の水性水和及び自己組織化から独自にほぼ定量的比率で得られた。いくつかのポリマーソームは、１１．８〜１８．８％の範囲のｗｔ−ＦＰＥＯを有するＰＥＯ（２ｋ−３．８ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（９．５ｋ−２２．２ｋ）ジブロックコポリマーの水性調合において不規則な粒子と共に存在することが見いだされた。従来の小胞産生ＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤコポリマーとは異なり、ＦＰＥＯ（１１．８〜１８．８％）の範囲、ＰＥＯブロックサイズ（２ｋ−３．８ｋ）及びポリマーソーム形成ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬジブロックコポリマーにおける総ジブロックＭｎ（１．５ｋ〜２６ｋ）は、非常に狭い。より高い（５ｋ或いは５．８ｋ）或いはより低い（７５０−１．５ｋ）分子量ＰＥＯブロック由来のＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬジブロックコポリマーの水性懸濁液において、ＰＥＯ／ＰＣＬ比に関係なくポリマーソームは観察されなかった。
【００７４】
ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬポリマーソームは、単層（図２ｄ）或いは多層（図２ｃ）膜構造を所有する膜水和から産生した。ＰＥＯ（２ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（１２ｋ）（ＰＤＩ：１．２）と比較した際、ＰＥＯ（２ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（９．５ｋ）は非常に狭い分子量分布（ＰＤＩ：１．１）を有するにも関わらず、このジブロックコポリマー処方から得られたポリマーソームの州立は僅かに低いものであった。さらに、前記コポリマーの多分散指標は、ポリマーソーム処方に対してほとんど影響を与えないように見えた。小さなポリマーソーム（直径１００ｎｍ）は、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）上でのＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬの乾燥薄膜処方の水性超音波処理によって製造し、その後複数（ｘ３）サイクルの凍結／解凍抽出及び膜押出を行った。これらの小さい単層ポリマーソームは、クリオ（ｃｒｙｏ）−ＴＥＭによって特徴付けを行い、ＰＥＯ（２ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（１２ｋ）ジブロックコポリマー由来のそれらの膜の厚さは、２２．５＋／−２．３ｎｍであると見いだした。
【００７５】
小胞処方に対するジブロックコポリマー分子量分布の影響を明らかにするために、様々なＰＥＯブロックサイズ（２．６ｋ、３ｋ或いは３．８ｋ）及び非常に狭い分子量分布（ＰＤＩ＝１．１）を有するＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬジブロックコポリマーは、ＧＰＣによって分離し、ポリマーソームを製造するために使用した。しかしながら、これらのサンプルからの小胞の収率における改善は観察されなかった。さらにＰＥＯ（５．８ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（２４ｋ）は溶媒注入技術を介して小胞を形成すると以前示された一方、ポリマーソームは、薄膜水和を介して形成されたこのジブロック（ＰＤＩ＝１．２）の水性懸濁液においては観察されなかった。さらに、多くのポリマーソーム（図４）は、より広い分子量分布を有するＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬジブロックコポリマーの混合物から得られた。そのように、分子量分布はＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬジブロックコポリマーから形成された生分解性ポリマーソームに対してほとんど影響を与えないということが決定した。
【００７６】
低いＰＥＯ重量比（１２％以下）を有するＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬジブロックコポリマーが（水性水和後に）Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）膜に対して強固な粘着性を有するので、有機共溶媒水注入／抽出法は、これらのコポリマーの小さなサブセットからポリマーソームを調合するための試みにおいて使用した。この抽出法によってポリマーソームは得られなかった一方、いくつかの完璧な微粒子（マイクロスフェア）（球状粒子で満たされている）は、透析を介した有機共溶媒除去によって見られた；これらの粒子の典型的な形態は蛍光顕微像において示された（図４）。前記球状粒子は多孔性表面（図４ａ）及び効果的に封入されたナイルレッド（図４ｂ）を有するように見えた。
【００７７】
【表４】
【００７８】
これらの実施例は、ＰＥＯブロックサイズ（Ｍｎ：７５０、１１００、２０００及び５０００）、ｗｔ−ｆＰＥＯ（７．７％−３３．３％）及びＭｎ（３．７ｋ−５７ｋ）を変える一連のＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬジブロックコポリマーを示し、これらは商業的に利用可能なＭｅＰＥＯをマクロイニシエーターとして使用するε−カプロラクトンモノマーの開環重合によって合成した。アニオン性リビング重合化もまた、広範囲の調節されたＰＥＯブロックサイズ（Ｍｎ：１５００、２２００、２６００、３０００、３８００及び５８００）、ＰＥＯブロック末端基としてのＣＮ、ｗｔ−ｆＰＥＯ＝９．９−２３．４％、及び７．８ｋ〜４７ｋの範囲のＭｎを有するＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬを合成するために使用した。全てのコポリマーはＧＰＣによって単離し、適切な狭い分子量分布（１．１４〜１．３７のＰＤＩ）を有していた。前記ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬジブロックコポリマーは次に、２つの異なる調合方法：膜水和及び有機共溶媒／水注入／抽出を介して、様々な水性形態へ組織化する能力をスクリーニングした。ポリマーソームは、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）上に堆積した乾燥薄膜の水和による自己組織化を介して、ＰＥＯ（２ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（１２ｋ）ジブロックコポリマー（ＰＤＩ：１．２１）から独自にほぼ定量的比率で得られた。２ｋ〜３．８ｋのＰＥＯブロックサイズ及び１１．８〜１８．８％の範囲のｗｔ−ｆＰＥＯを有するＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬジブロックコポリマーのみが生分解性ポリマーソームへ組織化すると見いだされた一方、これらコポリマーの分子量分布は小胞形成に対して影響を与えなかった。最終的に、有機共溶媒／水注入／抽出によって小胞形成に対して確立された方法と比較した場合、膜水和を介した自己組織化は、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ−ベース生分解性ポリマーソームの調合に対してより容易で有効な方法であると証明された。そのように、これは、化粧品、画像化及び薬物送達適用などの適用に対するこれらのメソ構造生体物質の費用効率が高い大量産生を可能にするものとなるであろう。
【００７９】
ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬジブロックコポリマーへの治療化合物の取り込み
この実施例は、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ−ベースポリマーソームにおける治療化合物であるドキソルビシン（ＤＯＸ）の添加及び押出を示したものである。薄膜水和を介した自己組織化は、ＰＥＯ（２ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（１２ｋ）−ベース小胞を形成するために使用した。膜水和はＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ及びＰＥＯ−ｂ−ＰＥＥジブロックコポリマーを有する非分解性ポリマーソームを調合するために広く利用されていた。Ｄｉｓｃｈｅｒ，Ｂ．Ｍ．；Ｗｏｎ，Ｙ．Ｙ．；Ｅｇｅ，Ｄ．Ｓ．；Ｌｅｅ，Ｊ．Ｃ．Ｍ．；Ｂａｔｅｓ，Ｆ．Ｓ．；Ｄｉｓｃｈｅｒ，Ｄ．Ｅ．；Ｈａｍｍｅｒ，Ｄ．Ａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９９，２８４，（５４１７），１１４３−１１４６．及びＧｈｏｒｏｇｈｃｈｉａｎ，Ｐ．Ｐ．；Ｆｒａｉｌ，Ｐ．Ｒ．；Ｓｕｓｕｍｕ，Ｋ．；Ｂｌｅｓｓｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．；Ｂｒａｎｎａｎ，Ａ．Ｋ．；Ｂａｔｅｓ，Ｆ．Ｓ．；Ｃｈａｎｃｅ，Ｂ．；Ｈａｍｍｅｒ，Ｄ．Ａ．；Ｔｈｅｒｉｅｎ，Ｍ．Ｊ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２００５，１０２，（８），２９２２−２９２７．を参照のこと。簡潔には、塩化メチレン中の２００マイクロリットルの７ｍｇ／ｍＬ ＰＥＯ（２ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（１２ｋ）コポリマー溶液を、粗いＴｅｆｌｏｎ（登録商標）プレートの表面へ均一に堆積させ、１２時間以上溶媒を蒸発させた。水溶液（２９０ミリオスモル硫酸アンモニウム、ｐＨ５．５）の添加及び超音波処理によって、生分解性ポリマーソームの自発性突出を導き、Ｔｅｆｌｏｎ−堆積薄膜を前記水溶液へはがした。超音波処理手順では、水性ベース溶液及び乾燥させた（Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）上に均一に堆積させたポリマーの）薄膜処方を含有したサンプルバイアルをソニケーター槽（Ｂｒａｎｓｏｎ；Ｍｏｄｅｌ ３５１０）へ置き、６５℃で６０分間撹拌する工程が含まれる。５サイクルの凍結−解凍抽出を行い、その後前記サンプルバイアルを液体Ｎ２に置く工程、及び次に６５℃水槽でそれらを解凍させる工程が続いた。６５℃で圧力駆動Ｌｉｐｅｘ ｔｈｅｒｍｏｂａｒｒｅｌ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（１．５ｍＬ容量）を用いた押出は、適切に狭いサイズ分布を揺する小さな（直径２００ｎｍ以下）単層ポリマーソームを産生するために実行した。小胞のサイズ分布は動的光錯乱によって決定した（図９参照）。
【００８０】
押出サンプルは、等張酢酸ナトリウム溶液（５０ｍＭ酢酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４以下）において透析した。透析溶液は、約３０時間で３回交換した。透析後ドキソルビシンを、硫酸アンモニウム勾配を介して前記ポリマーソームへ添加した。Ｈａｒａｎ，Ｇ．；Ｃｏｈｅｎ，Ｒ．；Ｂａｒ，Ｌ．Ｋ．；Ｂａｒｅｎｈｏｌｚ，Ｙ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １９９３，１１５１，（２），２０１−２１５；Ｂｏｌｏｔｉｎ，Ｅ．Ｍ．；Ｃｏｈｅｎ，Ｒ．；Ｂａｒ，Ｌ．Ｋ．；Ｎ．，Ｅ．；Ｎｉｎｉｏ，Ｓ．；Ｌａｓｉｃ，Ｄ．Ｄ．；Ｂａｒｅｎｈｏｌｚ，Ｙ．Ｊ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｒｅｓ．１９９４，４，４５５−４７９；及びｄｅ Ｍｅｎｅｚｅｓ，Ｄ．Ｅ．Ｌ．；Ｐｉｌａｒｓｋｉ，Ｌ．Ｍ．；Ａｌｌｅｎ，Ｔ．Ｍ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９８，５８，（１５），３３２０−３３３０．を参照のこと。前記ポリマーソームは、７時間、メインゲルが液体−結晶相移行温度（６５℃）以上になる温度で、１：０．２のポリマー：薬剤（ｗ／ｗ）の割合でドキソルビシンとインキュベーションした。前記ポリマーソームコア内でのＤＯＸの凝集によって、その蛍光放射はクエンチングした。非封入ＤＯＸは、Ｆｒａｃ ９５０を有するＡｃｔａ Ｂａｓｉｃ １０ ＨＰＬＣを用いて除去した：前記溶液はＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ５００−ＨＲメディアを有するＣ−１６４０カラムを通過した。回収したＤＯＸ−添加ポリマーソーム懸濁液を遠心分離し、約１ｍＬ容量まで濃縮した。次に前記小胞を、各バッファーに対してＮ＝４サンプルで、ｐＨを７．４以下に緩衝した様々な（２９０ｍＯｓｍ）溶液へ分注した。前記添加ポリマーソームからのＤＯＸの放出実験は分注後すぐに開始し：ＤＯＸ蛍光は、１４日間までの様々な間隔で蛍光定量的に（ＳＰＥＸ Ｆｌｕｏｒｏｌｏｇ−３蛍光光度計：λｅｘ＝４８０ｎｍ、λｅｍ＝５９０ｎｍを用いて）測定した。ＤＯＸが前記ポリマーソームコアから放出され、周囲溶液へ希釈されるので、その蛍光放射は時間につれて増加した。この実験の最高点で、前記サンプルはＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を用いて可溶化させた。長期に亘るパーセント放出は、この実験の完了時にＴｒｉｔｏｎＸ−１００での残存無処理ポリマーソームの可溶化で決定したように、最終ＤＯＸ蛍光に対する各時点での測定蛍光を比較することによって計算した。
【００８１】
図８Ａは、１４日間蛍光定量的（λｅｘ＝４８０ｎｍ、λｅｍ＝５９０ｎｍ）にモニタリングした様々な生理学条件（ｐＨ５．５及び７．４；Ｔ＝３７℃）におけるＤＯＸのｉｎ ｓｉｔｕ放出を示したものである。ＤＯＸの放出はｐＨ５．５及び７．４の２つのｐＨで、及び３７℃で測定した。
【００８２】
両条件下で、本発明者らは徐放後、即時バースト放出相（０〜８時間の２０％以下の初期小胞添加）を観察した。放出の動態は２つのｐＨで異なるものであった。ｐＨ７．４での放出では、αとβと示された２つの異なる相が観察でき、これは指数関数回帰解析（Ｒ２＝０．９９）とよく一致していた。α相（１−５日、点線、図８）は、ＤＯＸ放出がＰＣＬ膜を介した薬剤透過の割合に主に依存している状態（レジメ）と一致し、これはより遅い割合のマトリックス浸食（模式的な図８Ｃを参照のこと）を支配していることを示す。β相（５−１４日、実線、図８Ｂ）は、著しい加水分解性膜分解によって主に容易にされたＤＯＸ放出と一致した。ｐＨ５．４で、単一相（β’）が観察された。この相における放出に対する割合定数は、ｐＨ＝７．４のベータ相の間に観察された定数と類似しており、これは放出のメカニズムが類似していることを示している。しかしながら、ＰＣＬ膜の酸触媒性加水分解が短時間での優性メカニズムであるので、ｐＨ＝５．４でのＤＯＸ放出はより素早い。
【００８３】
そのように、これら生体吸収性ポリマーソームからのｉｎ ｖｉｖｏ薬剤放出は、ＰＣＬマトリックス浸食及び膜を通じた水性コアからの薬剤の本質的な透過性の両方に依存しているようである。とりわけ、混合「生体−不活性」で加水分解可能な成分（τ１／２放出＝τ１／２循環を数十時間）（Ａｈｍｅｄ，Ｆ．；Ｈａｔｅｇａｎ，Ａ．；Ｄｉｓｃｈｅｒ，Ｄ．Ｅ．；Ｄｉｓｃｈｅｒ，Ｂ．Ｍ．Ｌａｎｇｍｕｉｒ ２００３，１９，（１６），６５０５−６５１１；Ａｈｍｅｄ，Ｆ．；Ｄｉｓｃｈｅｒ，Ｄ．Ｅ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ２００４，９６，（１），３７−５３；及びＰｈｏｔｏｓ，Ｐ．Ｊ．；Ｂａｃａｋｏｖａ，Ｌ．；Ｄｉｓｃｈｅｒ，Ｂ．；Ｂａｔｅｓ，Ｆ．Ｓ．；Ｄｉｓｃｈｅｒ，Ｄ．Ｅ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ２００３，９０，（３），３２３−３３４．を参照のこと）から形成した分解可能なポリマーソームと比較した場合、ＰＥＯ（２ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（１２ｋ）−ベース小胞はより低い放出動態（τ１／２放出を数日）を有し、これは将来の血管内薬剤送達適用に対する潜在的な利点を提供するものである。さらに、それらの大きな膜コアの厚さ（２２．５＋／−２．３ｎｍ）は、疎水性（膜隔絶）及び親水性（内部水性コア）化合物両者の単一複合送達小胞内の容易な取り込みに対する機会を与える。最終的に、自己組織化小胞構造は、メゾスコピック（ナノメートル〜ミクロン）コロイド状装置の容易で経済的な製造を可能にし、これにより、費用のかかる、組織化後の有機共溶媒の除去の必要性を取り除く一方、大量生産が可能になる。
【００８４】
本明細書で参照された全ての特許及び刊行物は、その全体が組み込まれるものである。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】図１は、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬジブロックコポリマーの代表的な１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示したものである。
【図２】図２は、膜被包ナイルレッド及び水性−内部移行カルセイン色素を含有するＰＥＯ（２ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（１２ｋ）−ベースポリマーソームの共焦点レーザー蛍光顕微鏡像（λｅｘ ＝ ４８８ｎｍ）を示したものである。
【図３】図３は、テフロン（Ｔｅｆｌｏｎ）（登録商標）上に１：１：１モルの割合で沈着させたポリマーの薄膜の水性水和によって形成された、ＰＥＯ（２ｋ）−ｂ−（９．５ｋ）／ＰＥＯ（２ｋ）−ｂ−（１２ｋ）／ＰＥＯ（２ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（１５ｋ）の混合物から成るポリマーソームの共焦点レーザー蛍光顕微鏡像を示したものである。
【図４】図４は、ＤＩ水におけるＰＥＯ（２ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（１２ｋ）−ベース小胞（５ｍｇ／ｍＬ）の低温貯蔵伝達電子顕微鏡像を示したものである。前記小胞の膜コアの厚さは２２．５＋／−ｎｍである。
【図５】図５は、水溶液におけるＰＥＯ（５ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（５２ｋ）の有機共溶媒抽出に由来する微粒子（（ａ）光学顕微鏡像及び（ｂ）共焦点蛍光顕微鏡像）を示したものである。
【図６】図６は、ＰＥＯ（２ｋ）−ｂ−ＰＣＬ（１２ｋ）の熱転移を明らかにするための示差走査熱量測定を示したものである。
【図７】図７は、ポリマーソームの調合方法を示したものである。
【図８】図８は、様々な生理学的条件（ｐＨ５．５及び７．４；Ｔ＝３７℃）におけるｉｎ ｓｉｔｕ ＤＯＸ押出を示したものである。
【図９】図９は、２５℃での動的光錯乱（ＤＬＳ）を介して得られたようなＰＥＯ（２ｋ）−ＰＣＬ（１２ｋ）−ベースポリマーソームのサイズ分布の累積ヒストグラムを示したものである。
【図１０】図１０は、薄膜自己組織化（６５℃で１時間）を介した２００ｎｍ直径ポリマーソームを産生し、その後の凍結解凍抽出及び押出の５サイクルを介したサイジングの（Ａ）以前及び（Ｂ）以後のＰＥＯ（２Ｋ）−Ｂ−ＰＣＬ（１２Ｋ）ジブロックコポリマーのＨ１−ＮＭＲスペクトルを示したものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリエチレンオキシド及びポリカプロラクトンのブロックコポリマーを有する小胞であって、
前記ポリエチレンオキシドは約２．０〜約３．８ｋＤの平均分子量を有し、前記ブロックコポリマーは約１１〜約２０重量パーセントのポリエチレンオキシド比を有するものである、小胞。
【請求項２】
実質的に、ポリエチレンオキシド及びポリカプロラクトンのブロックコポリマーを有する小胞であって、
前記ポリエチレンオキシドは約２．０〜約３．８ｋＤの平均分子量を有し、前記ブロックコポリマーは約１１〜約２０重量パーセントのポリエチレンオキシド比を有するものである、小胞。
【請求項３】
少なくとも１ブロックはポリエチレンオキシドであり、且つ１ブロックはポリカプロラクトンであるブロックコポリマーを有する小胞であって、
前記ポリエチレンオキシドは約２．０〜約３．８ｋＤの平均分子量を有し、前記ブロックコポリマーは約１１〜約２０重量パーセントのポリエチレンオキシド比を有するものである、小胞。
【請求項４】
実質的に、少なくとも１ブロックはポリエチレンオキシドであり、且つ１ブロックはポリカプロラクトンであるブロックコポリマーを有する小胞であって、
前記ポリエチレンオキシドは約２．０〜約３．８ｋＤの平均分子量を有し、前記ブロックコポリマーは約１１〜約２０重量パーセントのポリエチレンオキシド比を有するものである、小胞。
【請求項５】
請求項１記載の小胞において、前記ポリエチレンオキシド比は、約１２〜約１９重量パーセントである。
【請求項６】
請求項１記載の小胞において、前記ポリエチレンオキシド比は、約１１．８〜約１８．８重量パーセントである。
【請求項７】
請求項１記載の小胞において、前記ポリカプロラクトンの平均分子量は、約９〜約２３ｋＤである。
【請求項８】
請求項７記載の小胞において、前記ポリカプロラクトンの平均分子量は、約９．５〜約２２．２ｋＤである。
【請求項９】
請求項７記載の小胞において、前記ポリエチレンオキシドの平均分子量は約２ｋＤであり、前記ポリカプロラクトンの平均分子量は約１２ｋＤである。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか１つ記載の小胞において、この小胞は、更に、
水性ポリマーソーム内部内に区分されたタンパク質、ペプチド、糖類、ヌクレオシド、無機化合物、或いは有機化合物を有するものである。
【請求項１１】
請求項１記載の小胞において、この小胞は、更に、
疎水性小胞膜内に区分されたタンパク質、ペプチド、糖類、ヌクレオシド、無機化合物、或いは有機化合物を有するものである。
【請求項１２】
請求項１記載の小胞において、この小胞は、更に、
前記ブロックコポリマーの親水性末端に共有結合したタンパク質、ペプチド、糖類、ヌクレオシド、無機化合物、或いは有機化合物を有するものである。
【請求項１３】
請求項１０記載の小胞において、前記区分された因子は、ヒト体内において治療的価値を有するものである。
【請求項１４】
請求項１１記載の小胞において、前記区分された因子は、ヒト体内において治療的価値を有するものである。
【請求項１５】
請求項１２記載の小胞において、前記区分された因子は、ヒト体内において治療的価値を有するものである。
【請求項１６】
請求項１２記載の小胞において、前記末端に結合した化合物は、生物学的位置で特異的に結合する標的部位として使用されるものである。
【請求項１７】
請求項１６記載の小胞において、前記標的部位は、生理学条件下において生物学的位置で特異的に結合するものである。
【請求項１８】
請求項１６記載の小胞において、前記標的部位は、抗体、抗体断片、或いは所定の受容体結合部位特異的な物質を有するものである。
【請求項１９】
請求項１６記載の小胞において、前記受容体結合部位或いは標的部位は、受容体特異的ペプチド、糖質、タンパク質、脂質、ヌクレオシド、ペプチド核酸、或いはそれらの組み合わせを有するものである。
【請求項２０】
請求項１記載の小胞において、この小胞は、更に、
前記疎水性小胞膜内に区分された、放射性因子、細胞毒性因子、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）因子、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）因子、放射線画像法因子、或いは光線力学的治療（ＰＤＴ）因子の少なくとも１つを有するものである。
【請求項２１】
請求項１記載の小胞において、この小胞は、更に、
前記疎水性小胞膜内に区分された放射性因子の少なくとも１つを有するものである。
【請求項２２】
請求項１記載の小胞において、この小胞は、更に、
前記疎水性小胞膜内に区分されたＭＲＩ因子の少なくとも１つを有するものである。
【請求項２３】
請求項１記載の小胞において、この小胞は、更に、
前記疎水性小胞膜内に区分されたＰＥＴ因子の少なくとも１つを有するものである。
【請求項２４】
請求項１記載の小胞において、この小胞は、更に、
前記疎水性小胞膜内に区分された放射線画像法因子の少なくとも１つを有するものである。
【請求項２５】
請求項１記載の小胞において、この小胞は、更に、
前記疎水性小胞膜内に区分されたＰＤＴ因子の少なくとも１つを有するものである。
【請求項２６】
請求項１０記載の小胞において、この小胞は、更に、
前記疎水性小胞膜内に区分された、二次放射性因子、細胞毒性因子、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）因子、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）因子、放射線画像法因子、或いは光線力学的治療（ＰＤＴ）因子の少なくとも１つを有するものである。
【請求項２７】
請求項１記載の小胞において、この小胞は、更に、
放射性因子、細胞毒性因子、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）因子、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）因子、光線力学的治療（ＰＤＴ）因子、放射線画像法因子、強磁性因子、或いはフェリ磁性因子の少なくとも１つを有するものであり、前記放射体或いは因子は水性ポリマーソーム内部内に区分されるものである。
【請求項２８】
請求項１記載の小胞において、この小胞は、更に、
前記水性ポリマーソーム内部内に区分された放射性因子の少なくとも１つを有するものである。
【請求項２９】
請求項１記載の小胞において、この小胞は、更に、
前記水性ポリマーソーム内部内に区分されたＭＲＩ因子の少なくとも１つを有するものである。
【請求項３０】
請求項１記載の小胞において、この小胞は、更に、
前記水性ポリマーソーム内部内に区分されたＰＥＴ因子の少なくとも１つを有するものである。
【請求項３１】
請求項１記載の小胞において、この小胞は、更に、
前記水性ポリマーソーム内部内に区分された放射線画像法因子の少なくとも１つを有するものである。
【請求項３２】
請求項１記載の小胞において、この小胞は、更に、
前記水性ポリマーソーム内部内に区分されたＰＤＴ因子の少なくとも１つを有するものである。
【請求項３３】
請求項１１記載の小胞において、この小胞は、更に、
放射性因子、細胞毒性因子、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）因子、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）因子、光線力学的治療（ＰＤＴ）因子、放射線画像法因子、強磁性因子、或いはフェリ磁性因子の少なくとも１つを有するものであり、前記放射体或いは因子は水性ポリマーソーム内部内に区分されるものである。
【請求項３４】
生体吸収性ポリマーソームを製造する方法であって、
溶媒へ溶解された、ポリエチレンオキシド及びポリカプロラクトンから成るブロックコポリマーの溶液を表面上に薄膜でコーティングする工程と、
前記溶媒の少なくとも一部を蒸発させる工程と、
前記ブロックコポリマーでコーティングされた前記膜を水溶液と接触させる工程と、
少なくとも約５０℃の温度で前記水溶液を加熱する工程と
を有する、方法。
【請求項３５】
請求項３４記載の方法において、前記ブロックコポリマーは、分離ポリエチレンオキシド及びポリカプロラクトンブロックから成る両親媒性マルチブロックコポリマーである。
【請求項３６】
請求項３４記載の方法において、前記ブロックコポリマーは、分離ポリエチレンオキシドブロックとオリゴカプロラクトン成分が存在するランダム疎水性ポリマーブロックとから成る両親媒性ランダムコポリマーである。
【請求項３７】
請求項３４記載の方法において、前記ポリエチレンオキシドは約２．０〜約３．８ｋＤの平均分子量を有し、前記ブロックコポリマーは約１１〜約２０重量パーセントのポリエチレンオキシド比を有するものである。
【請求項３８】
請求項３４記載の方法において、前記ポリエチレンオキシド比は約１１．８〜１８．８重量パーセントである。
【請求項３９】
請求項３４記載の方法において、前記ポリカプロラクトンの平均分子量は約９．５〜約２２．２ｋＤである。
【請求項４０】
請求項３４記載の方法において、前記ポリエチレンオキシドの分子量は約２ｋＤであり、前記ポリカプロラクトンの分子量は約１２ｋＤである。
【請求項４１】
請求項３４記載の方法において、溶媒除去は減圧下で行われるものである。
【請求項４２】
請求項３４記載の方法において、前記水溶液は、２００〜３００ミリオスモルのスクロース、０．９ｗｔ％のＮａＣｌ（水中）或いはＰＢＳである。
【請求項４３】
請求項３４記載の方法において、前記溶媒は、クロロホルム、塩化メチレン、テトラヒドロフラン、エタノール、メタノール、ジオキサン、或いはそれらの混合物である。
【請求項４４】
請求項３４記載の方法において、前記表面は、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）或いはガラスである。
【請求項４５】
請求項３４記載の方法において、前記ブロックコポリマーの薄膜でコーティングされる前記表面は、前記水溶液と接触する間、超音波処理、物理的撹拌、及び／若しくは電場にさらされるものである。
【請求項４６】
請求項４５記載の方法において、前記超音波処理は少なくとも２０分間実行されるものである。
【請求項４７】
請求項４５記載の方法において、この方法は、更に、
少なくとも一度、前記水溶液の凍結工程及び解凍工程を有するものである。
【請求項４８】
請求項４５記載の方法において、前記水溶液は圧力を掛けられ、支持膜を通過するものである。
【請求項１】
ポリエチレンオキシド及びポリカプロラクトンのブロックコポリマーを有する小胞であって、
前記ポリエチレンオキシドは約２．０〜約３．８ｋＤの平均分子量を有し、前記ブロックコポリマーは約１１〜約２０重量パーセントのポリエチレンオキシド比を有するものである、小胞。
【請求項２】
実質的に、ポリエチレンオキシド及びポリカプロラクトンのブロックコポリマーを有する小胞であって、
前記ポリエチレンオキシドは約２．０〜約３．８ｋＤの平均分子量を有し、前記ブロックコポリマーは約１１〜約２０重量パーセントのポリエチレンオキシド比を有するものである、小胞。
【請求項３】
少なくとも１ブロックはポリエチレンオキシドであり、且つ１ブロックはポリカプロラクトンであるブロックコポリマーを有する小胞であって、
前記ポリエチレンオキシドは約２．０〜約３．８ｋＤの平均分子量を有し、前記ブロックコポリマーは約１１〜約２０重量パーセントのポリエチレンオキシド比を有するものである、小胞。
【請求項４】
実質的に、少なくとも１ブロックはポリエチレンオキシドであり、且つ１ブロックはポリカプロラクトンであるブロックコポリマーを有する小胞であって、
前記ポリエチレンオキシドは約２．０〜約３．８ｋＤの平均分子量を有し、前記ブロックコポリマーは約１１〜約２０重量パーセントのポリエチレンオキシド比を有するものである、小胞。
【請求項５】
請求項１記載の小胞において、前記ポリエチレンオキシド比は、約１２〜約１９重量パーセントである。
【請求項６】
請求項１記載の小胞において、前記ポリエチレンオキシド比は、約１１．８〜約１８．８重量パーセントである。
【請求項７】
請求項１記載の小胞において、前記ポリカプロラクトンの平均分子量は、約９〜約２３ｋＤである。
【請求項８】
請求項７記載の小胞において、前記ポリカプロラクトンの平均分子量は、約９．５〜約２２．２ｋＤである。
【請求項９】
請求項７記載の小胞において、前記ポリエチレンオキシドの平均分子量は約２ｋＤであり、前記ポリカプロラクトンの平均分子量は約１２ｋＤである。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか１つ記載の小胞において、この小胞は、更に、
水性ポリマーソーム内部内に区分されたタンパク質、ペプチド、糖類、ヌクレオシド、無機化合物、或いは有機化合物を有するものである。
【請求項１１】
請求項１記載の小胞において、この小胞は、更に、
疎水性小胞膜内に区分されたタンパク質、ペプチド、糖類、ヌクレオシド、無機化合物、或いは有機化合物を有するものである。
【請求項１２】
請求項１記載の小胞において、この小胞は、更に、
前記ブロックコポリマーの親水性末端に共有結合したタンパク質、ペプチド、糖類、ヌクレオシド、無機化合物、或いは有機化合物を有するものである。
【請求項１３】
請求項１０記載の小胞において、前記区分された因子は、ヒト体内において治療的価値を有するものである。
【請求項１４】
請求項１１記載の小胞において、前記区分された因子は、ヒト体内において治療的価値を有するものである。
【請求項１５】
請求項１２記載の小胞において、前記区分された因子は、ヒト体内において治療的価値を有するものである。
【請求項１６】
請求項１２記載の小胞において、前記末端に結合した化合物は、生物学的位置で特異的に結合する標的部位として使用されるものである。
【請求項１７】
請求項１６記載の小胞において、前記標的部位は、生理学条件下において生物学的位置で特異的に結合するものである。
【請求項１８】
請求項１６記載の小胞において、前記標的部位は、抗体、抗体断片、或いは所定の受容体結合部位特異的な物質を有するものである。
【請求項１９】
請求項１６記載の小胞において、前記受容体結合部位或いは標的部位は、受容体特異的ペプチド、糖質、タンパク質、脂質、ヌクレオシド、ペプチド核酸、或いはそれらの組み合わせを有するものである。
【請求項２０】
請求項１記載の小胞において、この小胞は、更に、
前記疎水性小胞膜内に区分された、放射性因子、細胞毒性因子、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）因子、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）因子、放射線画像法因子、或いは光線力学的治療（ＰＤＴ）因子の少なくとも１つを有するものである。
【請求項２１】
請求項１記載の小胞において、この小胞は、更に、
前記疎水性小胞膜内に区分された放射性因子の少なくとも１つを有するものである。
【請求項２２】
請求項１記載の小胞において、この小胞は、更に、
前記疎水性小胞膜内に区分されたＭＲＩ因子の少なくとも１つを有するものである。
【請求項２３】
請求項１記載の小胞において、この小胞は、更に、
前記疎水性小胞膜内に区分されたＰＥＴ因子の少なくとも１つを有するものである。
【請求項２４】
請求項１記載の小胞において、この小胞は、更に、
前記疎水性小胞膜内に区分された放射線画像法因子の少なくとも１つを有するものである。
【請求項２５】
請求項１記載の小胞において、この小胞は、更に、
前記疎水性小胞膜内に区分されたＰＤＴ因子の少なくとも１つを有するものである。
【請求項２６】
請求項１０記載の小胞において、この小胞は、更に、
前記疎水性小胞膜内に区分された、二次放射性因子、細胞毒性因子、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）因子、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）因子、放射線画像法因子、或いは光線力学的治療（ＰＤＴ）因子の少なくとも１つを有するものである。
【請求項２７】
請求項１記載の小胞において、この小胞は、更に、
放射性因子、細胞毒性因子、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）因子、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）因子、光線力学的治療（ＰＤＴ）因子、放射線画像法因子、強磁性因子、或いはフェリ磁性因子の少なくとも１つを有するものであり、前記放射体或いは因子は水性ポリマーソーム内部内に区分されるものである。
【請求項２８】
請求項１記載の小胞において、この小胞は、更に、
前記水性ポリマーソーム内部内に区分された放射性因子の少なくとも１つを有するものである。
【請求項２９】
請求項１記載の小胞において、この小胞は、更に、
前記水性ポリマーソーム内部内に区分されたＭＲＩ因子の少なくとも１つを有するものである。
【請求項３０】
請求項１記載の小胞において、この小胞は、更に、
前記水性ポリマーソーム内部内に区分されたＰＥＴ因子の少なくとも１つを有するものである。
【請求項３１】
請求項１記載の小胞において、この小胞は、更に、
前記水性ポリマーソーム内部内に区分された放射線画像法因子の少なくとも１つを有するものである。
【請求項３２】
請求項１記載の小胞において、この小胞は、更に、
前記水性ポリマーソーム内部内に区分されたＰＤＴ因子の少なくとも１つを有するものである。
【請求項３３】
請求項１１記載の小胞において、この小胞は、更に、
放射性因子、細胞毒性因子、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）因子、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）因子、光線力学的治療（ＰＤＴ）因子、放射線画像法因子、強磁性因子、或いはフェリ磁性因子の少なくとも１つを有するものであり、前記放射体或いは因子は水性ポリマーソーム内部内に区分されるものである。
【請求項３４】
生体吸収性ポリマーソームを製造する方法であって、
溶媒へ溶解された、ポリエチレンオキシド及びポリカプロラクトンから成るブロックコポリマーの溶液を表面上に薄膜でコーティングする工程と、
前記溶媒の少なくとも一部を蒸発させる工程と、
前記ブロックコポリマーでコーティングされた前記膜を水溶液と接触させる工程と、
少なくとも約５０℃の温度で前記水溶液を加熱する工程と
を有する、方法。
【請求項３５】
請求項３４記載の方法において、前記ブロックコポリマーは、分離ポリエチレンオキシド及びポリカプロラクトンブロックから成る両親媒性マルチブロックコポリマーである。
【請求項３６】
請求項３４記載の方法において、前記ブロックコポリマーは、分離ポリエチレンオキシドブロックとオリゴカプロラクトン成分が存在するランダム疎水性ポリマーブロックとから成る両親媒性ランダムコポリマーである。
【請求項３７】
請求項３４記載の方法において、前記ポリエチレンオキシドは約２．０〜約３．８ｋＤの平均分子量を有し、前記ブロックコポリマーは約１１〜約２０重量パーセントのポリエチレンオキシド比を有するものである。
【請求項３８】
請求項３４記載の方法において、前記ポリエチレンオキシド比は約１１．８〜１８．８重量パーセントである。
【請求項３９】
請求項３４記載の方法において、前記ポリカプロラクトンの平均分子量は約９．５〜約２２．２ｋＤである。
【請求項４０】
請求項３４記載の方法において、前記ポリエチレンオキシドの分子量は約２ｋＤであり、前記ポリカプロラクトンの分子量は約１２ｋＤである。
【請求項４１】
請求項３４記載の方法において、溶媒除去は減圧下で行われるものである。
【請求項４２】
請求項３４記載の方法において、前記水溶液は、２００〜３００ミリオスモルのスクロース、０．９ｗｔ％のＮａＣｌ（水中）或いはＰＢＳである。
【請求項４３】
請求項３４記載の方法において、前記溶媒は、クロロホルム、塩化メチレン、テトラヒドロフラン、エタノール、メタノール、ジオキサン、或いはそれらの混合物である。
【請求項４４】
請求項３４記載の方法において、前記表面は、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）或いはガラスである。
【請求項４５】
請求項３４記載の方法において、前記ブロックコポリマーの薄膜でコーティングされる前記表面は、前記水溶液と接触する間、超音波処理、物理的撹拌、及び／若しくは電場にさらされるものである。
【請求項４６】
請求項４５記載の方法において、前記超音波処理は少なくとも２０分間実行されるものである。
【請求項４７】
請求項４５記載の方法において、この方法は、更に、
少なくとも一度、前記水溶液の凍結工程及び解凍工程を有するものである。
【請求項４８】
請求項４５記載の方法において、前記水溶液は圧力を掛けられ、支持膜を通過するものである。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２００９−５１０１０９（Ｐ２００９−５１０１０９Ａ）
【公表日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５３３７００（Ｐ２００８−５３３７００）
【出願日】平成１８年９月２８日（２００６．９．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０３８１８９
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０３８７６３
【国際公開日】平成１９年４月５日（２００７．４．５）
【出願人】（５００４２９１０３）ザ・トラスティーズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ペンシルバニア (102)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年９月２８日（２００６．９．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０３８１８９
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０３８７６３
【国際公開日】平成１９年４月５日（２００７．４．５）
【出願人】（５００４２９１０３）ザ・トラスティーズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ペンシルバニア (102)
【Ｆターム（参考）】
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