薬剤
本発明は、炎症症状（好ましくは虚血に関連する症状）を治療するための薬剤であって、ａ）末梢血単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ； ＰＢＭＣ）またはそのサブセットを含有する生理的溶液、またはｂ）上記溶液ａ）の上清を包含し、上記溶液ａ）が、ＰＢＭＣまたはそのサブセットを、ＰＢＭＣ増殖物質およびＰＢＭＣ活性化物質を含有しない生理的溶液中で少なくとも１時間培養することによって得られる、薬剤に関する。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、体内の炎症症状、好ましくは虚血に関連する体内の症状を治療するための薬剤に関する。
【０００２】
酸素が減少した状態である低酸素症は、肺が易感染性になると、または血流が低下すると発生し得る。血流が減少である虚血は、凝血（血栓）もしくは何かしらの外来性の循環物質による動脈もしくは静脈の閉塞（塞栓）によって、または血管障害（例えば粥状動脈硬化）によって引き起こされる可能性がある。血流の減少は、突然発症して持続期間が短い（急性の虚血）こともあれば、発症がゆるやかで持続期間が長いまたは頻繁に再発（慢性の虚血）することもある。急性の虚血は、局所的で不可逆的な組織の壊死（梗塞）に関連していることが多い。一方で、慢性の虚血は通常一過性の低酸素性の組織傷害に関連する。ただし灌流の減少が長引く、あるいは重篤であると、慢性の虚血は梗塞にも関連する。梗塞は脾臓、腎臓、肺、脳、および心臓において頻繁に発生し、例えば腸梗塞、肺梗塞、虚血発作、心筋梗塞などの障害を引き起こす。
【０００３】
虚血性障害における病理的な変化は、虚血の持続期間および重症度ならびに患者の生存期間に依存する。壊死は梗塞内部で最初の２４時間以内に確認できる。また、急性の炎症反応は梗塞部に隣接する生存組織中で進行し、白血球は死滅組織の領域に移動する。これに続く数日の間に、貪食および膠質性瘢痕または神経膠瘢痕との置換によって、梗塞領域内において細胞が徐々に分解および除去される。
【０００４】
１つの器官における低灌流または梗塞が、他の器官に影響を及ぼすことが多い。一例として、例えば肺塞栓症によって引き起こされる肺の虚血は、肺に影響するだけではなく、心臓やその他の器官（例えば脳）をも低酸素性ストレス下におく。心筋梗塞は、血栓症、動脈壁痙攣、または心臓のウイルス感染症に起因する冠動脈の閉塞を伴うことが多く、うっ血性心不全および全身的低血圧症を引き起こす可能性がある。心拍停止が長引いて低灌流が継続すると、二次的な各種合併症（例えば全身的な虚血性脳症）が発症する可能性がある。脳虚血は、最も一般的には粥状動脈硬化を原因とする血管閉塞によって引き起こされ、その重症度は、各種一過性脳虚血発作（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ａｔｔａｃｋ； ＴＩＡ）から大脳梗塞または脳卒中にまでわたり得る。ＴＩＡの症状は一時的かつ可逆的であるが、ＴＩＡは再発する傾向があり、ＴＩＡに続いて脳卒中を起こすことが多い。
【０００５】
閉塞性動脈疾患の例としては、心筋梗塞に繋がるおそれのある冠動脈疾患、ならびに腹部大動脈、腹部大動脈の主要な支脈、および脚の動脈に影響しかねない末梢動脈疾患などが挙げられる。末梢動脈疾患とは、例えばバージャー病、レイノー病、および先端チアノーゼなどである。末梢動脈疾患は一般に粥状動脈硬化によって引き起こされるが、その他の主要な原因の一例としては糖尿病があげられる。末梢動脈疾患に関連する合併症の例としては、重症下肢痙攣、急性扁桃炎、心拍異常、心不全、心発作、脳卒中、腎不全などが挙げられる。
【０００６】
虚血性障害および低酸素性障害は罹患および死亡の主要な原因である。循環器疾患は、世界中の死亡原因の３０％を占める。各種の循環器疾患の中では、虚血性心疾患および脳血管疾患が死亡原因の約１７％である。
【０００７】
現在、虚血性障害および低酸素性障害の治療では、症状の緩和および原因となる疾患の治療に焦点が合わせられている。例えば、心筋梗塞の治療にはニトログリセリンおよび鎮痛薬が用いられ、痛みを制御し心臓の作業負荷を軽減する。ジゴキシン、利尿薬、アムリノン、β遮断薬、高脂血症治療薬、およびアンジオテンシン変換酵素阻害薬を含めた、他の薬物療法が病状の安定化のために使用されるが、これらの治療法はいずれも、虚血および低酸素症によって生じた組織の損傷を直接治療対象とするものではない。
【０００８】
現在の治療法には短所があるために、低酸素症に関連する病状の治療に効果的な方法に対する必要性が依然として存在する。例えば粥状動脈硬化、糖尿病、および肺障害に起因して起きる虚血によって引き起こされる組織の損傷の、効果的な予防法に対する必要性も存在する。
【０００９】
虚血および低酸素症に関連する病状には、通常炎症が併発する。したがって、炎症も緩和する手段および方法が必要とされている。
【００１０】
本発明の目的は、体内の炎症症状、好ましくは虚血に関連する症状を効率的に治療することを可能にする手段を提供することである。
【００１１】
本発明は、体内の炎症症状（好ましくは虚血に関連する体内の症状）を治療するための薬剤であって、ａ）末梢血単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ； ＰＢＭＣ）またはそのサブセットを含有する生理的溶液、またはｂ）溶液ａ）の上清を包含し、溶液ａ）は、ＰＢＭＣ増殖性物質およびＰＢＭＣ活性化物質を含有しない生理的溶液中において、ＰＢＭＣまたはそのサブセットを少なくとも１時間培養することによって得られるものである、薬剤に関する。
【００１２】
上記において定義した薬剤を、体内の炎症症状、好ましくは虚血に関連する体内の症状を患う患者に投与することによって、各症状が軽減され、治癒過程が実現されることが見出された。
【００１３】
本発明に係る薬剤は、培養されたＰＢＭＣもしくはそのサブセット、および／またはＰＢＭＣを培養した培養上清を包含する。ＰＢＭＣの培養過程において、これらのＰＢＭＣ細胞は、活性化ＰＢＭＣにおいて発現および分泌される物質とは異なる、サイトカインなどの物質を発現および分泌する。このことは、本発明のＰＢＭＣのセクレトームが、活性化ＰＢＭＣのセクレトームとは異なることを意味している。本発明のＰＢＭＣ細胞は、細胞の表面以外の部分で誘因されるセクレトーム生成を行う。したがって、ＰＨＡまたはＬＰＳなどのＰＢＭＣを活性化する物質と接触していないＰＢＭＣが、体内の炎症症状、特に虚血に関連する症状の治療に使用可能であることは驚くべきことである。これは、これらのＰＢＭＣ細胞のセクレトームが、上記の症状または同様の症状の治療を支援する物質を含有することを示している。
【００１４】
本発明に係るＰＢＭＣは、ＰＢＭＣ増殖物質およびＰＢＭＣ活性化物質を含有しない生理的溶液中でＰＢＭＣを培養することによって得られる。ただし、このＰＢＭＣは、生理的溶液中で少なくとも１時間インキュベートされる。この最短培養時間は、ＰＢＭＣにサイトカインおよびその他の有益な物質を分泌させるために必要である。
【００１５】
本発明に係る薬剤のうちＰＢＭＣの部分は、例えばフィコール勾配、低浸透圧性溶解などの当該技術分野において公知の方法を用いて、全血から得ることもできる。これらの方法は当該技術分野において周知である。
【００１６】
上記薬剤のＰＢＭＣを、薬剤が投与されるドナー集団または同じ個体から得てもよい。
【００１７】
ＰＢＭＣまたはそのサブセットは、本発明に係る薬剤中に生存可能な形態で存在している。
【００１８】
上清を得る元となる生理的溶液は、溶液１ｍｌあたり、または単位服用量あたり、少なくとも５００個、好ましくは少なくとも１０００個、より好ましくは少なくとも１０５個、さらにより好ましくは少なくとも１０６個のＰＢＭＣ細胞を包含する。
【００１９】
本発明の薬剤は、１ｍｌあたり、または単位服用量あたり、少なくとも５００個、好ましくは少なくとも１０００個、より好ましくは少なくとも１０５個、さらにより好ましくは少なくとも１０６個のＰＢＭＣを含有している。
【００２０】
ここで使用する「生理的溶液」とは、使用に先立って、ＰＢＭＣを本発明に係る薬剤中で培養するための溶液を指す。
【００２１】
「生理的溶液」とは、さらに、ＰＢＭＣの細胞死を１時間以内、好ましくは３０分以内に引き起こさない溶液も指す。生存ＰＢＭＣの個数が、ある溶液中で１時間以内、好ましくは３０分以内に７５％、より好ましくは９０％減少すれば、この溶液はここで定義する「生理的溶液」であるとは見なさない。「生理的溶液」は、ＰＢＭＣがこの溶液に接触しても、ＰＢＭＣの自発的な溶解を引き起こさない。
【００２２】
本文脈において、「培養（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｎｇ）」または「培養（ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ）」工程は、「インキュベーション」工程を含む、または「インキュベーション」工程からなる。なお、この「インキュベーション」工程は、ＰＢＭＣを培養するために通常使用される条件の下で、所定の時間（少なくとも１時間、好ましくは少なくとも４時間、より好ましくは少なくとも８時間、さらにより好ましくは少なくとも１２時間）、ＰＢＭＣ細胞を溶液に接触させる工程である。
【００２３】
本発明の文脈において、「虚血に関連する症状」という用語は「虚血症状」という用語と交換可能に使用可能であって、ヒトまたは動物の体の一部の領域に十分な酸素が供給されず、その結果組織の損傷または機能障害を発生させる、任意の症状、疾患、または障害を表わす。病態は、血管の狭窄または閉塞によって引き起こされる可能性がある、器官または器官の一部の内部における血液供給の減少または消滅という特徴を有していてもよい。このような性状を、ここではまとめて、「虚血」または「虚血関連症状」または「虚血に関連する症状」という用語によって称する。例えば心疾患では、虚血という用語を使って、狭窄または閉塞した冠動脈が原因となって酸素に富む血液が十分な量だけ得られていない心筋に言及することが多い。虚血の症状は「虚血」状態にある器官によって異なる。心臓の場合、虚血の結果、狭心症が起こることが多い。脳では、虚血の結果、脳卒中が起こり得る。虚血症状の場合には炎症が併発する。
【００２４】
炎症、特に虚血に関連する病態の例としては、創傷、心筋虚血、肢虚血、組織の虚血、虚血再灌流障害、狭心症、冠動脈疾患、末梢血管疾患、末梢動脈疾患、脳卒中、虚血発作、慢性の創傷、糖尿病性の創傷、心筋梗塞、うっ血性心不全、肺梗塞、皮膚潰瘍などがあげられるが、これらの例に限定されるものではない。
【００２５】
ただし、本発明の文脈における病態とは、内皮細胞の損傷または機能障害、つまり創傷を特徴とするものであってもよい。本発明に係る薬剤を使用することによって治療してもよい創傷の例としては、慢性の創傷、糖尿病性の創傷、潰瘍、熱傷、炎症性皮膚疾患、腸疾患などがあげられるが、これらの例に限定されるものではない。
【００２６】
「体内の症状」、「体内の炎症症状」、および「虚血に関連する体内の症状」という用語は、最適な機能（例えば骨、心臓、肝臓、腎臓、大脳、皮膚の良好な連携）を実現するために必要な哺乳類の末端器官における、急性または不顕性の低酸素症および炎症が原因となって、個体の体の内部に生じる症状および疾患に関連する。
【００２７】
ここで使用する「生理的溶液」とは、ＰＢＭＣまたはそのサブセットの破壊を引き起こさない浸透圧を示す溶液を指し、個体に直接投与可能である。
【００２８】
「ＰＢＭＣ増殖物質およびＰＢＭＣ活性化物質を含有しない」という用語は、ＰＢＭＣを活性化し、ＰＢＭＣまたはそのサブセットの増殖を誘導する物質を含有しない生理的溶液を指す。このような物質の例としては、ＰＨＡ、ＬＰＳなどがある。
【００２９】
本発明の好適な実施形態によれば、上記炎症症状は、機能性を有する末端器官の低酸素症および炎症に関連する哺乳類の疾患からなる群より選択される。
【００３０】
本発明の特に好適な実施形態によれば、上記体内の炎症症状、好ましくは虚血に関連する体内の症状は、心筋虚血、肢虚血、組織の虚血、虚血再灌流障害、狭心症、冠動脈疾患、末梢血管疾患、末梢動脈疾患、脳卒中、虚血発作、心筋梗塞、うっ血性心不全、外傷、腸疾患、腸間膜梗塞、肺梗塞、骨折、歯を移植した後の組織の再生、自己免疫疾患、リウマチ性疾患、同種移植、および同種移植の拒絶からなる群より選択される。
【００３１】
末梢血単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ； ＰＢＭＣ）のサブセットは、好ましくはＴ細胞、Ｂ細胞、またはＮＫ細胞である。言うまでもなく、これらの細胞の組み合わせ、具体的にはＴ細胞とＢ細胞との組み合わせ、Ｔ細胞とＮＫ細胞との組み合わせ、Ｂ細胞とＮＫ細胞との組み合わせ、Ｔ細胞とＢ細胞とＮＫ細胞との組み合わせを使用することも可能である。これらの細胞を準備および単離する方法は公知である。
【００３２】
驚くべきことに、本発明のＰＢＭＣは、（先に定義したように）溶液が薬学的に許容不可能な物質を含有せず、ＰＢＭＣの突然死を引き起こさず、ＰＢＭＣを活性化せず、かつ、ＰＢＭＣの増殖を刺激しない限り、任意の種類の溶液中で培養可能であることがわかった。したがって、使用される溶液は、少なくともＰＢＭＣの溶解を引き起こさない浸透圧性を示す。生理的溶液は、好ましくは生理食塩水（好ましくは生理的ＮａＣｌ溶液）、全血、血液分画物（好ましくは血清）、または細胞培養培地である。
【００３３】
上記細胞培養培地は、好ましくはＲＰＭＩ、ＤＭＥＭ、Ｘ−ｖｉｖｏ、およびウルトラカルチャー（Ｕｌｔｒａｃｕｌｔｕｒｅ）からなる群より選択される。
【００３４】
本発明の特に好適な実施形態によれば、本発明のＰＢＭＣ細胞はストレスを誘発する条件下で培養される。
【００３５】
ここで使用する「ストレスを誘発する条件下」という用語は、ストレス細胞を引き起こす培養条件を指す。細胞においてストレスを引き起こす条件としては、例えば熱、化学物質、放射線、低酸素症、浸透圧（つまり非生理的な浸透圧条件）などがある。
【００３６】
本発明のＰＢＭＣ細胞にさらにストレスを加えると、体内の炎症症状、好ましくは虚血に関連する体内の症状の治療にとって有益な物質の発現および分泌が一層増加する。
【００３７】
本発明の好適な実施形態によれば、ストレスを誘発する条件には、低酸素症、オゾン、熱（例えば、ＰＢＭＣの最適な培養温度、つまり３７℃より２℃、好ましくは５℃、より好ましくは１０℃を超えて高い温度）、放射線（例えばＵＶ線やγ線）、化学物質、浸透圧（つまり、体液中で、特に血液中で通常生じる浸透圧条件に比べて少なくとも１０％高い浸透圧条件）、ｐＨの変化、またはこれらの組み合わせが含まれる。
【００３８】
放射線を利用して本発明のＰＢＭＣにストレスを与えるのであれば、好ましくは、ＰＢＭＣ細胞を、少なくとも１０Ｇｙ、好ましくは少なくとも２０Ｇｙ、より好ましくは少なくとも４０Ｇｙで暴露する。ここで、放射線の供給源として、好ましくは、Ｃｓ−１３７セシウムが使用される。
【００３９】
本発明の好適な実施形態によれば、不活性化ＰＢＭＣまたはそのサブセットを、培地中で少なくとも４時間、好ましくは少なくとも６時間、より好ましくは少なくとも１２時間培養する。
【００４０】
本発明に係る薬剤は、治療しようとする症状に応じて様々な方法で投与可能である。したがって、この薬剤は、好ましくは皮下投与、筋肉内投与、内器官投与（例えば心筋内への投与）および静脈内投与ができるように構成される。
【００４１】
本発明に係る薬剤は、薬学的に許容可能な賦形剤、例えば希釈剤、安定剤、担体などを包含してもよい。投与経路に応じて、本発明に係る薬剤は各剤形の形態（注射溶液など）で提供される。これを調製する方法は当業者にとって周知である。
【００４２】
本発明に係る薬剤の有効期間を伸ばすために、溶液ａ）または上清ｂ）は凍結乾燥される。このような調製物を凍結乾燥する方法は、当業者にとって周知である。
【００４３】
上記凍結乾燥された調製物を、使用前にバッファ、安定剤、塩などを含む水または水溶液と接触させてもよい。
【００４４】
本発明の他の態様は、上記において定義した薬剤を、体内の炎症症状（好ましくは虚血に関連する体内の症状）を治療するための薬物の製造のために用いる使用方法に関する。
【００４５】
本発明のさらにもう他の態様は、ここに開示する薬剤を調製する方法であって、ａ）末梢血単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ； ＰＢＭＣ）またはそのサブセットを準備する工程と、ｂ）工程ａ）のＰＢＭＣ細胞を、ＰＢＭＣ増殖物質およびＰＢＭＣ活性化物質を含有しない生理的溶液中で少なくとも１時間培養する工程と、ｃ）工程ｂ）の細胞および／またはこの細胞の上清を単離する工程と、ｄ）工程ｃ）の細胞および／または上清を用いて上記薬剤を調製する工程とを含む、方法に関する。
【００４６】
本発明に係る薬剤は、ＰＢＭＣを、生理的溶液中で少なくとも１時間、好ましくは少なくとも４時間、より好ましくは少なくとも８時間、さらにより好ましくは少なくとも１２時間インキュベートまたは培養することによって得ることができる。この工程において、ＰＢＭＣは、体内の炎症症状の治療において有用な物質の合成および分泌を開始する。上記培養工程の前、同工程の後、および同工程の途中で、ＰＢＭＣ細胞は、ＰＨＡまたはＬＰＳなどのＰＢＭＣを活性化する物質を添加することによって活性化されることがない。培養工程の後に、培養物からＰＢＭＣ細胞および／または上清は単離され、最終的な薬剤の調製においてさらに使用される。上述のように、上記薬剤は、培養したＰＢＭＣ、上記細胞をインキュベートした培養物の上清、または培養したＰＢＭＣと培地との両方を包含してもよい。
【００４７】
本発明の好適な実施形態によれば、上記細胞は、工程ｂ）の前または同工程の途中で、ストレスを誘発する条件に曝され、このストレスを誘発する条件には、低酸素症、オゾン、熱、放射線、化学物質、浸透圧（例えば、塩、特にＮａＣｌを添加して、浸透圧を血液中より高くすることによって誘発される）、ｐＨの変化（つまり、酸または水酸化物を添加してｐＨ値を６．５〜７．２または７．５〜８．０とすることによるｐＨ値の変化）、またはこれらの組み合わせが含まれる。
【００４８】
本発明の好適な実施形態によれば、上記細胞は、工程ｂ）の前または同工程の途中で、少なくとも１０Ｇｙ（好ましくは少なくとも２０Ｇｙ、より好ましくは少なくとも４０Ｇｙ）、オゾン、高温、またはＵＶ線に暴露される。
【００４９】
本発明の他の態様は、上述の方法によって得られる薬剤に関する。
【００５０】
本発明のさらに他の態様は、本発明に係る薬剤を適切な量で、必要とする個体に投与することによって、体内の炎症症状、好ましくは虚血に関連する体内の症状を治療する方法に関する。治療しようとする症状に応じて、本発明の薬剤は、筋肉内投与、静脈内投与、器官内投与（例えば心筋内投与）または皮下投与される。
【００５１】
本発明の好適な実施形態において、上記薬剤は、上記において概説した方法によって得られる１ｍｌあたり少なくとも５００個、好ましくは少なくとも１０００個、より好ましくは少なくとも１０５個、さらにより好ましくは少なくとも１０６個のＰＢＭＣを包含する。これに対応して、少なくとも５００個、好ましくは少なくとも１０００個、より好ましくは少なくとも１０５個、さらにより好ましくは少なくとも１０６個のＰＢＭＣが、治療対象である個体に投与される。
【００５２】
本発明を、以下の図面および例によってさらに説明する。ただし本発明はこれらに制限されるものではない。
【００５３】
図１中ａは、心エコー検査、組織学的検査、および免疫組織学的検査による心機能の評価における、実験プロトコルおよび実験時期を示している。図１中ｂは、１８時間の培養期間の後にアネキシンに対して陽性染色したＰＢＭＣであって、放射線の照射を受けたラットのＰＢＭＣおよび放射線の照射を受けていないラットのＰＢＭＣの比率を示している。
【００５４】
図２中ａでは、放射線を照射することによってヒトのＰＢＭＣではアポトーシスを引き起こし、アネキシンの発現が４８時間にわたって時間の経過と共に増加することを、ＦＡＣＳ分析によって示している。図２中ｂでは、ＬＰＳ刺激を受けたＰＢＭＣまたは単球を、放射線を照射したアポトーシス自系ＰＢＭＣと共にインキュベートすることによって、炎症促進性のサイトカインＩＬ−１βの分泌が投与量に応じて減少することが示されている。図２中ｃでは、程度は相対的に低いが、この知見は、ＩＡ−ＰＢＭＣの存在下における、ＬＰＳ刺激ＰＢＭＣおよび単球のＩＬ−６分泌プロファイルにも相関している。図２中ｄでは、ＬＰＳ刺激を伴う混合リンパ球の反応液に、自系ＩＡ−ＰＢＭＣを添加すると、１分毎に測定した（ｃｏｕｎｔｓ ｐｅｒ ｍｉｎｕｔｅ； ｃｐｍ）Ｔ細胞の増殖数が減少している。図２中ｅでは、ＶＥＧＦ、ＩＬ−８／ＣＸＣＬ８、およびＭＭＰの転写物のＲＴ−ＰＣＲ ＲＮＡ発現解析によって、２４時間の培養後に、放射線の照射を受けたＰＢＭＣにおいてＩＬ−８／ＣＸＣＬ８および特にＭＭＰ９の上方制御が起こったことが示されている。図２中ｆでは、ＶＥＧＦ、ＩＬ−８／ＣＸＣＬ８、およびＭＭＰ９のＥＬＩＳＡ解析によって、ＭＭＰ９は大部分が細胞溶解物質中に見られる一方で、ＶＥＧＦおよびＩＬ−８／ＣＸＣＬ８のタンパク質分泌の差が、生細胞においても、ＩＡ−ＰＢＭＣにおいても、ほぼ同じレベルのままであることが示されている。図２中ｇでは、生存ＰＢＭＣまたはＩＡ−ＰＢＭＣの細胞培養物から得られる上清中でインキュベートしたヒトの線維芽細胞が、ＲＴ−ＰＣＲ解析において、ＶＥＧＦ、ＩＬ−８／ＣＸＣＬ８、およびＭＭＰ９転写物の強い上方制御を示している。また、ピーク値は、ＩＡ−ＰＢＭＣの上清中でインキュベートされた線維芽細胞に見られた。
【００５５】
図３中ａ、図３中ｂ、図３中ｃに示すように、人工的に心筋梗塞を起こした後のラットにおいて、尾静脈を介して投与した、ＣＦＳＥで標識された同系ＰＢＭＣは、大部分が脾臓（図３中ｂ）において見られ、これよりは少ない個数が肝臓（図３中ａ）において見られたが、梗塞を起こした心臓（図３中ｃ）ではＰＢＭＣ細胞が全く見られなかった。図３中ｄ、図３中ｅ、図３中ｆに示すように、培地（図３中ｄ）または生存ＰＢＭＣ（図３中ｅ）のいずれかを注射したラットにおいてＨＥ染色した梗塞区域が、免疫細胞が浸潤した虚血の心筋に匹敵するパターンを示し、ＩＡ−ＰＢＭＣを与えられたラットから得られる組織が、非常に高い密度の浸潤を示唆している。図３中ｇ、図３中ｈ、図３中ｉでは、生細胞で治療されたラット（図３中ｈ）の方が、培地で治療されたラット（図３中ｇ）に比べて、梗塞部位において、ＣＤ６８＋で染色された細胞がわずかに多いことがわかる。これとは対照的に、ＩＡ−ＰＢＭＣを注射した動物（ラット）では、３倍の量のＣＤ６８＋が検出された。図３中ｊ、図３中ｋ、図３中ｌに示すように、生存ＰＢＭＣまたはＩＡ−ＰＢＭＣを投与した場合に比べて、培地だけを与えられたラットの方が、高いレベルのＳ１００β＋細胞が見られた。
【００５６】
図４中ａ、図４中ｂ、図４中ｃに示すように、培地（図４中ａ）または生細胞治療（図４中ｂ）の場合に比べて、ＩＡ−ＰＣＭＣを注射した動物から得られる梗塞を起こした心筋組織（ｃ）において、ほぼ４倍の量のＶＥＧＦについて陽性染色された細胞が検出された。図４中ｄ、図４中ｅ、図４中ｆに示すように、ＶＥＧＦ受容体のＫＤＲ／ＦＬＫ１について、同様の発現パターンが見られ、ピーク値は培地（図４中ｄ）および生細胞（図４中ｅ）ではなく、ＩＡ−ＰＢＭＣのグループ（図４中ｆ）において見られた。図４中ｇ、図４中ｈ、図４中ｉに示すように、３つのどのグループにおいてもＣＤ３４について差が検出されなかった。図４中ｊ、図４中ｋ、図４中ｌに示すように、梗塞を起こした心臓におけるマーカーｃ−キットについての免疫組織学的分析によると、ＩＡ−ＰＢＭＣ（図４中ｌ）を注射したラットでは、多量の陽性染色された細胞および高密度な局在性が示され、培地を与えられた動物（図４中ｊ）および生細胞を与えられた動物（図４中ｋ）では、それより少ない個数の細胞が示されている。
【００５７】
図５中ａ、図５中ｂ、図５中ｃに示すように、心筋梗塞（Ｅｌａｓｔｉｃａ ｖａｎ Ｇｉｅｓｏｎ染色法）の誘導から６週間後に外植された虚血性のラットの心臓の組織学的解析の結果である。培地を注射した動物（図５中ａ）から得られた心臓は、他に比べて拡張されているようであり、線維性組織が大きく広がっていた。生細胞を注射したラット（図５中ｂ）では瘢痕の広がりが低減し、拡張の徴候が他に比べて少なかった。瘢痕組織の形成の最低量は、ＩＡ−ＰＢＭＣを注射された動物（図５中ｃ）において検出された。図５中ｄに示すように、ＬＡＤの結紮から６週間後に収集された標本のプラニメーター分析によって得られたデータの統計解析の結果から、瘢痕の広がりの平均値は、培地を注射された動物では２４．９５％±３．６、生存ＰＢＭＣを注射された動物では１４．３％±１．３、ＩＡ−ＰＢＭＣを注射された動物では５．８％±２であることを示している（平均値＋ＳＥＭ）。図５中ｅ、図５中ｆ、図５中ｇでは、心エコー検査によって得られる心機能パラメータ（収縮分画率、駆出分画率、および収縮末期の直径）の評価によって、ＩＡ−ＰＢＭＣを注射した動物では、他に比べて、心筋梗塞後に良好に回復していることが示されている。
【００５８】
図６ａは、無刺激の生存ＰＢＭＣも、ＩＡ−ＰＢＭＣも、どちらも主に単球に由来する炎症促進性のサイトカインＴＮＦ−αを分泌しないことを示している。（有意性は次のとおりである：＊ｐ＝０．０５、＊＊ｐ＝０．００１；ｎ＝８）。
【００５９】
図６ｂは、無刺激のＰＢＭＣに比べると、炎症促進性のインターフェロンγの分泌が、活性化後に強く誘導されることを示している。（有意性は次のとおりである：＊ｐ＝０．０５、＊＊ｐ＝０．００１；ｎ＝８）。
【００６０】
図７ａは、フローサイメトリー法を用いた分析の結果を統合して示している。ＰＢＭＣをＴ細胞についてゲーティングし、活性化マーカーＣＤ６９およびＣＤ２５の発現を評価した。（有意性は次のとおりである：＊ｐ＝０．０５、＊＊ｐ＝０．００１；ｎ＝４）。
【００６１】
図７ｂは、いずれか（ＰＨＡ、ＣＤ３ ｍＡｂ）で活性化されたＰＢＭＣの代表的なＦＡＣＳ分析結果を示す。ゲーティング（ｇａｔｉｎｇ）は陽性細胞の比率を表わす。
【００６２】
図８は、刺激したＰＢＭＣを対象として、３［Ｈ］チミジン取り込み法によって測定した増殖速度が、ＲＰＭＩ中で無刺激で培養される生存ＰＢＭＣに比べて高いことを示している。
【００６３】
図９は、Ｔ細胞増殖アッセイにおいて、ＰＢＭＣセクレトームに対するＴ細胞の応答が阻害されることを示している。
【００６４】
図１０中ａ〜図１０中ｆは、インターロイキン−８、Ｇｒｏ−α、ＥＮＡ−７８、ＩＣＡＭ−１、ＶＥＧＦ、およびインターロイキン−１６の上清のレベルを示している。アポトーシスＰＢＭＣにおいては、血管新生および免疫抑制に関連するこれらのサイトカインおよびケモカイン（ｃｈｅｍｏｋｉｍｅ）の分泌パターンが、生細胞とは顕著に異なる。この効果は、細胞を高密度でインキュベートすると一層顕著であった。
【００６５】
図１１は、実験的にＬＡＤの結紮を実施してから６週間後の、心筋の瘢痕組織の広がりを（左心室を占める％で）示している。アポトーシス細胞に由来する細胞培養物の上清を注射した動物は、コラーゲンの堆積の大幅な減少、瘢痕の広がりの低減、および生存可能な心筋の増加を示す。
【００６６】
図１２中ａ〜図１２中ｃは、実験的に心筋梗塞を起こさせてから６週間後に外植されたラットの心臓の巨視的な外観を示している。放射線の照射を受けたアポトーシス細胞（図１２中ｃ）から得られた上清を注射した動物は、コラーゲンの堆積の減少、および梗塞領域が、培地（図１２中ａ）または生存細胞から得られる上清（図１２中ｂ）を注射したものに比べて非常に小さいことを示す。瘢痕組織は緑色に着色し、より良好に可視化できるようにする。
【００６７】
図１３中ａ〜図１３中ｄは、代表的な心エコー検査（Ｍモード）を示している。心機能は、ＩＡ−ＰＢＭＣの上清を注射したラット（図１３中ｃ）の方が、培地で処理したラット（図１３中ａ）および生細胞で処理したラット（図１３中ｂ）に比べてはるかに良好であった。偽処理を行ったラットから得られた心エコー検査法による撮影画像を図１３中ｄに示す。
【００６８】
図１４中ａおよび図１４中ｂは、心筋梗塞から６週間後に実施した心エコー検査による分析結果を示している。放射線の照射を受けたアポトーシスＰＢＭＣから得られた上清を用いて治療したラットは、培地を注射した動物または生細胞を培養した上清を注射した動物に比べて、はるかに良好な心機能を示している。
【００６９】
図１５は、４つの治療グループすべてのカプラン−マイヤー生存曲線（ｓｕｒｉｖｉａｌ ｃｕｒｖｅ）を示している。生存ＰＢＭＣ細胞培養物の上清を注射した動物も、アポトーシスＰＢＭＣ細胞培養物の上清を注射した動物も、どちらも、培地を注射したラットに比べて良好な生存率を示している。（ｐ＜０．１）。
【００７０】
図１６は、ＰＢＭＣを用いて実施した抗ＣＤ３およびＰＨＡ刺激実験を示している。
【００７１】
図１７は、抗ＣＤ３、ＰＨＡ、および混合リンパ球を用いて刺激をした際のＰＢＭＣの増殖を示している。
【００７２】
図１８は、ＰＢＭＣの上清を用いてインキュベートしたＣＤ４＋細胞の上清のアネキシンＶのレベルおよびＰＩの陽性度を示している。
【００７３】
図１９は、ＰＢＭＣの上清によってＣＤ４＋細胞におけるＣＤ２５およびＣＤ６９の上方制御が阻害されることを示している。
【００７４】
図２０は、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βを機能させないようにしても、ＣＤ４＋細胞の増殖速度が上昇しなかったことを示している。
【００７５】
〔実施例〕
〔実施例１〕
急性心筋梗塞（ａｃｕｔｅ ｍｙｏｃａｒｄｉｃａｌ ｉｎｆａｒｃｔ； ＡＭＩ）は、うっ血性心不全を引き起こすことが多い。現在の薬理学的および機械的な血行再建にもかかわらず、梗塞を起こした心筋を置換するような、効果的な治療法は実験的に確立されていない。ＡＭＩ後の再モデリング過程の不可欠な構成要素は、ＡＭＩ後の炎症反応および血管再生の進行である。これらの過程は、梗塞を起こした心筋中のサイトカインおよび炎症細胞によって媒介され、アポトーシス組織および壊死組織を貪食し、間質性樹状細胞（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ； ＩＤＣ）およびマクロファージの自動誘導を開始する。全身的な免疫抑制（ステロイド）によって梗塞のサイズが拡大し、心筋の治癒が遅延したので、ＡＭＩによって誘導される炎症反応を減弱させることを目的とする臨床治験を、実施した。以上のデータから、ＡＭＩ後の炎症応答が、組織の安定化および瘢痕の形成の原因であると結論した。離れた幹細胞が損傷部位を検知し、構造面の修復および機能面の修復を促進することを研究者が観察したときに、再生循環器学における新分野が出現した。この手法を用いて、Ｏｒｌｉｃらは、ｃ−キット陽性の血管内皮前駆細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ； ＥＰＣ）を、実験的なＡＭＩと増加した血管再生ならびに心筋構造および血管構造の再生との境界領域に注射した。この研究は、「細胞治療」の再生能力を実証する多数の発表の引き金となった。ただし、この治療効果が、移植した細胞自身によってもたらされたのか、常在性の心筋幹細胞の補充によってもたらされたのか、あるいは、未知のパラクリンおよび免疫性のメカニズムの活性化によってもたらされたのか、依然はっきりしないままである。梗塞した心筋における虚血はアポトーシス過程を引き起こし、死にかけている細胞の細胞表面の脂質の変化を惹起する。最もよく特徴がわかっている変化は、リン脂質の非対称の喪失およびホスファチジルセリン（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ； ＰＳ）の曝露である。これらのＰＳは、配位子（例えばトロンボスポンジン、ＣＤ１４、およびＣＤ３６）を介して、マクロファージおよび樹状細胞（抗原提示細胞、ＡＰＣ）によって認識される。これらの受容体は、生理的条件の下では、アポトーシス性および壊死性の組織片を貪食し、静かな「清掃」過程を開始するように作用する。このＡＰＣによる貪食過程は、表現型の抗炎症性反応を引き起こし、これは増大したＩＬ−１０およびＴＧＦ−βの生成および阻害されたＡＰＣの機能によって決定される。臨床的に関連する報告は、アポトーシス細胞の注射が、造血細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌ； ＨＣ）の移植モデルにおいて、同種のＨＣの移植および致死的な急性移植片対宿主病（ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ； ＧＶＨＤ）を遅延させることを実証した報告である。また、臓器移植モデルでは、ドナーのアポトーシス細胞を注射すると、心臓の移植片生着期間が長くなった。炎症とは反対に、また、骨髄（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ； ＢＭ）からの前駆細胞の補充に関連して、アポトーシス細胞のオプソニン作用によって、ＡＰＣによるＶＥＧＦおよびＣＸＣ８／ＩＬ−８の生成の増加が誘導されることが示された。この後者のサイトカインに加えて、ＭＭＰ９も、骨髄からのＥＰＣの補充および遊離にとって非常に重要であるということがわかった。
【００７６】
ＡＭＩの治療に関する現在の「状況」は、急性閉塞冠動脈の早期の再灌流および再開口に向けられており、この状況は心筋障害を増加させ、内在性の修復機構に対して反対に作用するが、梗塞後の心筋の炎症は有利であると考えられる。
【００７７】
〔物質および方法〕
〔ＰＢＭＣにおけるアポトーシスの誘導および上清の生成〕
生体内実験を実施するために、健康な若いボランティアから血液を採取した。インビボ（ラットのＰＢＭＣ）実験を実施するために、６０Ｇｙ（ヒトＰＢＭＣの場合）または４５ＧｙのＣｓ−１３７セシウムを照射することによって、アポトーシスを誘導した。０．２％のゲンタマイシン硫酸塩（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．社、アメリカ）、０．５％のβ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．社、アメリカ）、１％のＬ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．社、アメリカ）を含有するが、血清を含有しないＵｌｔｒａ Ｃｕｌｔｕｒｅ培地（Ｃａｍｂｒｅｘ Ｃｏｒｐ．、アメリカ）中に、細胞を再懸濁し、加湿雰囲気中で２４時間培養して、試験管内実験（細胞濃度、１×１０６ｍｌ）に備えた。アポトーシスの誘導を、アネキシンＶ−フルオレセイン／ヨウ化プロピジウム（ＦＩＴＣ／ＰＩ）の共染色（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、アメリカ）によって、フローサイトメーターで測定した。ＰＢＭＣのアネキシン陽性度を、＞７０％であると判断し、その結果、ＩＡ−ＰＢＭＣと称することにする。放射線の照射を受けていないＰＢＭＣをコントロールとして使用し、生存ＰＢＭＣと称することにする。上清を、どちらの実験的設定環境からも収集し、以下のように（ＳＮ−生存ＰＢＭＣ、ＳＮ−ＩＡ−ＰＢＭＣ）と記載し、実験用実体として使用した。
【００７８】
〔ＬＰＳ刺激実験〕
ヒトＰＢＭＣおよび単球（純度＞９５％）を、磁気ビーズシステム（Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社、アメリカ）を用いて分離した。互いに異なる濃度のアポトーシス自系ＰＢＭＣ（アネキシンの陽性度＞７０％）およびリポ多糖（１ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳ；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．社、アメリカ）を用いて、ＰＢＭＣおよび単球を４時間共インキュベートした。上清を確保し、次の試験まで−８０℃で凍結保管した。ＩＬ−６およびＩＬ−１βの放出量を、市販のＥＬＩＳＡキット（ＢｅｎｄｅｒＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ社、オーストリア）を用いて決定した。
【００７９】
〔単球に由来するＤＣの調製およびＴ細胞の刺激〕
ＰＢＭＣを、フィコール・パク（Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ：ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ社、スウェーデン）を用いた標準的な密度勾配遠心によって、健常なドナーのヘバリン処置した全血から単離した。Ｔ細胞および単球を、ＭＡＣＳ法（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）を用いた磁気的な選別によって分離した。ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３３、およびＭＨＣクラスＩＩの陽性細胞の、各単クローン抗体を用いた陰性除去によって、精製済みＴ細胞を得た。ビオチン化済みＣＤ１４ ｍＡｂ ＶＩＭ１３（純度９５％）を使用することによって、単球を濃縮した。精製済み血中単球をＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）とＩＬ−４（１００Ｕ／ｍｌ）とを組み合わせて用いて７日間培養することによって、ＤＣを生成した。次に、ＤＣに異なる刺激を与えた。大腸菌（血清型０１２７−Ｂ８、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｅ社）から得た１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳだけを２４時間添加するか、あるいは、ＬＰＳを２時間添加し、さらに樹状細胞をアポトーシス細胞とともに１：１の比で２２時間培養するかのいずれかによって、成熟を誘導した。また、アポトーシス細胞だけを用いて（１：１）、ＤＣを２４時間処理した。混合白血球反応（ＭＬＲ）を起こすために、同種間の、精製済みＴ細胞（１×１０５個／ウェル）を、９６個のウェルを有する細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ社）中で、異なる刺激を与えたＤＣを段階的に増やしながら６日間インキュベートした。３組の分析を実施した。５日後に添加する［メチル−３Ｈ］チミジン（ＩＣＮ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社）の取り込み量を測定することによって、Ｔ細胞の増殖を観察した。細胞を１８時間後に回収し、取り込まれた［メチル−３Ｈ］チミジンを、ミクロプレート・シンチレーションカウンターで検出した。
【００８０】
〔生存ＰＢＭＣ、ＩＡ−ＰＢＭＣ、およびＳＮに曝露された線維芽細胞の細胞培養、ＲＮＡ単離、およびｃＤＮＡ調製〕
ＩＡ−ＰＢＭＣ、生存ＰＢＭＣ（細胞は１×１０６個、どちらもＵｌｔｒａ Ｃｕｌｔｕｒｅの培地中で２４時間培養）、およびＳＮ−生存ＰＢＭＣ／ＳＮ−ＩＡ−ＰＢＭＣに曝露した線維芽細胞を（Ｃａｓｃａｄｅ Ｉｎｃ．（アメリカ）から入手した１×１０５個の線維芽細胞を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ、ＰＡＡ社、オーストリア）、２５ｍＭのＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ社、ＢＲＬ、アメリカ）、および１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ社）を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ社 ＢＲＬ、アメリカ）中で培養し、１２個のウェルを有するプレートに播種して調べた。線維芽細胞を、ＳＮ−生存ＰＢＭＣおよびＳＮ−ＩＡ−ＰＢＭＣを用いてそれぞれ４時間および２４時間共インキュベートした）。製造者の指示にしたがって（ＲＮｅａｓｙ（ＱｉＩＡＧＥＮ社、オーストリア）を用いて）、ＰＢＭＣおよび線維芽細胞のＲＮＡ抽出を実施した後、取扱説明書の記載にしたがってｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ合成キット（ＢｉｏＲａｄ社、アメリカ）を用いて、ｃＤＮＡを転写した。
【００８１】
〔定量的リアルタイムＰＣＲ〕
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ Ｆａｓｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ社、Ｐｅｎｚｂｅｒｇ、ドイツ）を製造者のプロトコルにしたがって用いて、ｍＲＮＡの発現を、リアルタイムＰＣＲによって定量化した。ＶＥＧＦのプライマーは、順方向が５´−ＣＣＣＴＧＡＴＧＡＧＡＴＣＧＡＧ−ＴＡＣＡＴＣＴＴ−３´、逆方向が５´−ＡＣＣＧＣＣＴＣＧＧＣＴＴＧＴＣＡＣ−３´であった。ＩＬ−８のプライマーは、順方向が５´−ＣＴＣＴＴＧＧＣＡＧＣＣＴＴＣＣＴＧＡＴＴ−３´、逆方向が５´−ＴＡＴＧＣＡＣＴＧＡＣＡＴＣＴＡＡＧＴＴＣＴＴＴＡＧＣＡ−３´であった。ＭＭＰ９のプライマーは、順方向が５´−ＧＧＧＡＡＧＡＴＧＣＴＧＧＴＧＴＴＣＡ−３´、逆方向が５´−ＣＣＴＧＧＣＡＧＡＡＡＴＡＧＧＣＴＴＣ−３´であった。β−２−ミクログロブリンβ ２Ｍのプライマーは、順方向が５´−ＧＡＴＧＡＧＴＡＴＧＣＣＴＧＣＣＧＴＧＴＧ−３´、逆方向が５´−ＣＡＡＴＣＣＡＡＡＴＧＣＧＧＣＡＴＣＴ−３´であった。標的遺伝子の相対的な発現量を、Ｗｅｌｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（Clinical Chemistry. 47 (2001) 654-660, 25）の式を用いてハウスキーピング遺伝子β２Ｍと比較することによって算出した。プライマー対の効率は記載にしたがって決定した（A. Kadl, et al. Vascular Pharmacology. 38 (2002) 219-227）。
【００８２】
〔培養後の生存ＰＢＭＣおよびＩＡ−ＰＢＭＣによる血管新生促進因子およびＭＭＰ９の放出〕
ＩＡ−ＰＢＭＣ（５×１０５個）および生存ＰＢＭＣを、加湿雰囲気中で２４時間インキュベートした。上清を２４時間後に収集し、−８０℃でただちに凍結し、評価を実施するまで凍結させた。各ＰＢＭＣ細胞の溶解液をコントロールとして使用した。血管新生促進因子（ＶＥＧＦ−Ａ、ＣＸＣＬ−８／ＩＬ−８、ＧＭＣＳＦ、ＧＣＳＦ）およびＭＭＰ９（つまり、ｃ−キット細胞に許容されている遊離因子）の放出を、製造業者の指示にしたがってＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ社、アメリカ）を使用して分析した。プレートを、Ｗａｌｌａｃ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ ｃｏｕｎｔｅｒ １４２０（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、アメリカ）を用いて、４５０ｎｍで読み取った。
【００８３】
〔ＡＭＩの生体内実験のための、同系ＩＡ−ＰＢＭＣおよび生存ＰＢＭＣの取得〕
生体内実験用に、同系のラットのＰＢＭＣを、前もってヘバリン処置しておいたラットから心臓を穿刺（ｐｕｎｃｔｕａｔｉｏｎ）することによって得られた全血から密度勾配遠心によって分離した。生体内実験を実施するために、Ｃｓ−１３７セシウムを４５Ｇｙで照射することによって、アポトーシスを誘導し、上述のように１８時間培養した（アネキシン染色＞ＩＡ−ＰＢＭＣの８０％、アネキシン染色＜生存ＰＢＭＣの３０％、１×１０６個／ｍｌ）。
【００８４】
〔心筋梗塞の誘発〕
上述のようにＬＡＤを結紮することによって、雄の成体のスプラーグドーリーラットにおいて心筋梗塞を誘導した（Ｔｒｅｓｃｈｅｒ Ｋ， ｅｔ ａｌ． Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｒｅｓ． ２００６： ６９（３）： ７４６−５４）。簡潔に説明すると、キシラジン（ｘｙｌａｚｉｎ）（１ｍｇ／身体重量１００ｇ）およびケタミン（ｋｅｔａｍｉｎ）（１０ｍｇ／身体重量１００ｇ）の混合物を用いて、動物に腹腔内麻酔し、機械を用いて人工呼吸を行った。左側方の開胸手術を実施し、６−０ ｐｒｏｌｅｎｅを用いて左心房の下方のＬＡＤの周囲を結紮した。虚血の開始直後に、０．３ｍｌの細胞培養培地に懸濁した８×１０６個のアポトーシスＰＢＭＣを、尾静脈を介して注射した。細胞培養培地だけの注射、生存ＰＢＭＣの注射、および偽処理を、それぞれ、この実験の設定環境においてネガティブコントロールとして使用した。ラットの実験計画を、図１（図１中ａ、図１中ｂ）に示す。
【００８５】
〔アポトーシス細胞の追跡〕
８×１０６個の同系のラットのＰＢＭＣを、１５μＭのカルボキシフルオセイン二酢酸サクシニミジルエステル（ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ； ＣＦＳＥ、Ｆｌｕｋａ Ｂｉｏ−Ｃｈｅｍｉｋａ社、Ｂｕｃｈｓ，スイス）を用いて室温で１０分間標識した。標識を、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を添加することによって停止させた。アポトーシスを誘導し（アネキシンＶ＞７０％）、結紮術後に細胞を注射した。手術の７２時間後にラットを屠殺し、肝臓、脾臓、および心臓を標準的な手順にしたがって処理し、凍結切片（ｎ＝４）を得た。試料を、上述のように共焦点レーザ走査顕微鏡法（ＺＥＩＳＳ ＬＳＭ ５１０レーザ走査顕微鏡、ドイツ）によって分析した（Ker-jaschki D, J Am Soc Nephrol. 2004; 15: 603-12）。
【００８６】
〔インビボの組織分析および免疫組織化学法〕
すべての動物を、実験的に梗塞を起こしてから７２時間後または６週間後に屠殺した。心臓を外植し、次に、梗塞を起こした最大の領域（ｎ＝８〜１０）を薄片化した。薄片を１０％の中性の緩衝化ホルマリンで固定し、（免疫）組織染色をするためにパラフィンに埋め込んだ。組織試料を、ヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）およびｅｌａｓｔｉｃ ｖａｎ Ｇｉｅｓｏｎ（ｅｖｇ）を用いて染色した。免疫組織的評価を、ＣＤ６８（ＭＣＡ ３４１Ｒ、ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ社、イギリス）、ＶＥＧＦ（０５−４４３、Ｕｐｓｔａｔｅ／Ｍｉｌｉｐｏｒｅ、アメリカ）、Ｆｌｋ−１（ｓｃ−６２５１、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、アメリカ）、ＣＤ３４（ｓｃ−５２４７８、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、アメリカ）、ｃ−キット（ｓｃ−１６８、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、アメリカ）、Ｓ１００β（ｓｃ−５８８４１、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、アメリカ）を対象とする以下の抗体を用いて実施した。組織試料を、Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｖａｎｏｘ ＡＨＢＴ３顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｖａｎｏｘ ＡＨＢＴ３、Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｃｏ． Ｌｔｄ．社、日本）を用いて拡大率×２００で評価し、ＰｒｏｇＲｅｓ Ｃａｐｔｕｒｅ−Ｐｒｏ Ｃ１２ ｐｌｕｓ カメラ（Ｊｅｎｏｐｔｉｋ Ｌａｓｅｒ Ｏｐｔｉｋ Ｓｙｓｔｅｍｅ ＧｍｂＨ社、ドイツ）を使用してデジタル方式で撮像した。
【００８７】
〔面積測定による心筋梗塞の大きさの決定〕
梗塞を起こした領域の大きさを決定するために、Ｉｍａｇｅ Ｊプラニメーター分析用ソフトウェア（Ｒａｓｂａｎｄ， Ｗ．Ｓ．， Ｉｍａｇｅ Ｊ， Ｕ． Ｓ． Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、アメリカ）を使用した。梗塞を起こした心筋組織の広がり（左心室における％）を、梗塞を起こした領域の外周の面積を左心室の心内膜および心外膜の外周の面積全体で割り算することによって算出した。壊死した領域が比較しやすいようにｅｖｇで染色した組織試料に対して、面積測定評価を実施した。梗塞の大きさを、左心室の面積全体に対する比率％で示す。
【００８８】
〔心エコー検査による心機能の評価〕
心筋梗塞の誘発の６週間後に、１００ｍｇ／ｋｇケタミン（ｋｅｔａｍｉｎ）および２０ｍｇ／ｋｇキシラジン（ｘｙｌａｚｉｎ）を用いて、ラットを麻酔した。Ｖｉｖｉｄ ５システム（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、アメリカ）を用いて、超音波検査を実施した。動物を割り当てられる投与グループに対して、経験豊富な観察者が盲検式で分析を行った（ＥＷ）。Ｍモード追跡を、傍胸骨の短軸図から記録し、機能的な収縮および拡張パラメータを得た。心室の直径および体積を、収縮期および拡張期において評価した。分画収縮率（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ）を下記のように算出した。
ＦＳ（％）＝（（ＬＶＥＤＤ−ＬＶＥＳＤ）／ＬＶＥＤＤ）×１００％
【００８９】
〔検定手法〕
ＳＰＳＳソフトウェア（ＳＰＳＳ Ｉｎｃ．、アメリカ）を用いて、統計解析を実施した。すべてのデータは、平均値±標準偏差として与えられている。Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｖ試験を利用して、正規分布を検証した。従属変数を対象とする対応のある両側ｔ検定、および独立変数を対象とする対応のないｔ検定を使用して、有意性を算出した。ボンフェローニ・ホルム補正を用いて、複数の試験のｐ値を調節した。ｐ値（＜０．０５）は、統計的に有意であると考えられた。
【００９０】
〔結果〕
〔セシウムの照射によるアポトーシスの誘導（ＩＡ−ＰＢＭＣ）〕
アポトーシス細胞の免疫調節能力を評価するために、まず、ヒトの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）において、セシウム照射によるアポトーシスの誘導に対する細胞の反応を、フローサイトメーターを用いて、アネキシン−Ｖ／ＰＩ染色を利用したフローサイトメトリーによって判定した。生存ＰＢＭＣと比較すると、セシウム照射したＰＢＭＣはアネキシンに対して時間に依存する陽性を示し、２４時間以内にピーク値を示した。生細胞をコントロールとして使用した（図２ａ）。アネキシン−Ｖ結合は、インビトロですべてさらに２４時間後に最高であったので、この培養期間後に調査を実施した（ＩＡ−ＰＢＭＣ）。生存ＰＢＭＣを、ＲＴ−ＰＣＲを用いた実験および上清を用いた実験において、コントロールとして使用した。
【００９１】
〔ＩＡ−ＰＢＭＣは、インビトロで免疫抑制特性を示す〕
インターロイキン−１βおよびＩＬ−６は、インビボにおける心筋梗塞の主要な炎症促進メディエーターであると考えられている。ＩＡ−ＰＢＭＣが細胞反応に対して効果を有するかどうかという仮説をテストするために、ヒトの単球およびＰＢＭＣをＩＡ−ＰＢＭＣとともに共インキュベートし、標的細胞をＬＰＳで刺激した。どちらの細胞型でも、ＥＬＩＳＡによって評価したところ、培養物中におけるＩＬ−１βおよびＩＬ−６の分泌が投与量に応じて減少することがわかった（図２中ｂ、図２中ｃ）。同系モデルにおけるＩＡ−ＰＢＭＣの抗増殖効果を検証するために、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を使用した。同系の精製済みＴ細胞を採用し、これらのエフェクター細胞を、ＩＡ−ＰＢＭＣに添加して、あるいは添加せずに、投与量を段階的に変化させた樹状細胞とともにインキュベートした。図２中ｄは、ＩＡ−ＰＢＭＣの共インキュベートによって、増殖速度が用量に応じて低下することを示している。
【００９２】
〔ＩＡ−ＰＢＭＣおよび生存ＰＢＭＣによって、ＶＥＧＦ、ＩＬ−８／ＣＸＬ８、およびＭＭＰ９のｍＲＮＡの転写が増加することの証明〕
ＥＰＣの分離に関連することが知られているタンパク質のｍＲＮＡの転写が、照射により増加するかどうかを調査するために、分離後、およびアポトーシスの誘導（２４時間）後に、ＰＢＭＣを分析した。生存ＰＢＭＣをコントロール（生存ＰＢＭＣまたはＩＡ−ＰＢＭＣ）として使用した。ＲＮＡ転写は、ＲＴ−ＰＣＲによって決定したＶＥＧＦの発現に比べてほとんど差を示さなかったが、ＩＬ−８／ＣＸＣＬ８およびＭＭＰ９の大幅な増加を示した。ＩＡ−ＰＢＭＣにおけるＩＬ−８／ＣＸＬ８の場合のピークとなる誘導は、それぞれ、生細胞における２倍に対して６倍であり、ＭＭＰ９の場合は５倍に対して３０倍であった（図２中ｅ）。
【００９３】
〔ＩＡ−ＰＢＭＣおよび生存ＰＢＭＣによる、血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）の遊離を引き起こすパラクリン因子の分泌〕
ＩＡ−ＰＢＭＣおよび生存ＰＢＭＣに由来するＳＮを、２４時間の培養の後に、ＥＬＩＳＡを使用して、ＶＥＧＦ、ＩＬ−８／ＣＸＣＬ８、ＧＭＣＳＦ、ＧＣＳＦ、およびＭＭＰ９について定量した。図２中ｆからわかるように、ＶＥＧＦ、ＩＬ−８／ＣＸＣＬ８、およびＭＭＰ９は増加を示した。ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦは検出されなかった。注目すべきは、ＭＭＰ９が細胞溶解物においてピーク値を示すという知見であった。
【００９４】
〔ＩＡ−ＰＢＭＣおよび生存ＰＢＭＣに由来するＳＮによる、間葉系の線維芽細胞における血管新生促進性ｍＲＮＡ転写の増加〕
骨髄中の間質細胞は構造的には線維芽細胞であるから、線維芽細胞とＩＡ−ＰＢＭＣおよび生存ＰＢＭＣに由来するＳＮとの共インキュベーションには、ＥＰＣ分離の原因となる、ＶＥＧＦ、ＩＬ−８／ＣＸＣＬ８、およびＭＭＰ９のｍＲＮＡ転写因子を増加させる能力があるかどうかを調べることが必要であった。ＲＴ−ＰＣＲを４時間後および２４時間後に実施した。ＩＡ−ＰＢＭＣ ＳＮ中で培養された細胞におけるＩＬ−８／ＣＸＣＬ８について、最高レベルの誘導が検出された。誘導レベルは、コントロールに比べると４時間後にほぼ１２０倍に到達した。この反応は２４時間後にも存在する。同等の反応がＶＥＧＦの場合に見られた。その一方で、ＭＭＰ９の上方制御は、主に２４時間が経過してから見られた。このデータは、ＢＭにおける血管新生促進効果の原因となる、線維芽細胞によるｍＲＮＡの生成量の増加を促進するパラクリン因子を、ＳＮが含んでいることを示唆している（図２中ｇ）。
【００９５】
〔ラットの心筋梗塞モデルにおける、ＣＦＳＥ標識ＩＡ−ＰＢＭＣの養子移植〕
培養されたＩＡ−ＰＢＭＣはインビトロでは抗炎症性でもあり、血管新生促進性でもあることは証明できたので、ＩＡ−ＰＢＭＣおよび生存ＰＢＭＣを、急性のラットＡＭＩモデルに注射した。まず、これらの培養細胞が梗塞後にどこに自動誘導されているのかを決定することが必要であった。ＬＡＤの動脈結紮の直後に、ＣＦＳＥ標識ＩＡ−ＰＢＭＣをラットの尾静脈に注射した。代表的な組織像は、図３中ａ、図３中ｂ、図３中ｃに示すとおりである。ＣＦＳＥ ＩＡ−ＰＢＭＣは大部分が、脾臓組織および肝組織において７２時間以内に捕捉される。心臓で観察された細胞はなかった。
【００９６】
〔ＩＡ−ＰＢＭＣで処理したＡＭＩにおける、転送された初期炎症の免疫反応〕
Ｈ．Ｅ．染色をさらに詳しく調べると、コントロールの梗塞および生存白血球（生存ＰＢＭＣ）で処理したＡＭＩのラットは、創傷領域において、肉芽組織に応じた混合細胞浸潤を示し、ＡＭＩから７２時間以内に多量の好中球、マクロファージ／単球、リンパ単核細胞、線維芽細胞、および活性化された増殖性内皮細胞が、ジストロフィーの心筋細胞と混合されていた（図３中ｄ、図３中ｅ）。その一方で、ＩＡ−ＰＢＭＣで処理したＡＭＩのラットは、好酸球性の細胞質、高密度な核、および円形状から紡錘形状の形態を有する中程度の大きさの単球様の細胞からなる創傷領域において、高密度で単形性の浸潤を示した（図３中ｆ）。また、リンパ単核細胞、特に血漿細胞、線維芽細胞、および内皮細胞は、ほとんど検出できなかった。免疫組織学的解析によって、ＩＡ−ＰＢＭＣ ＡＭＩのラットにおける細胞浸潤は、残りの２つのグループでは非常に弱い、大量のＣＤ６８＋単球／マクロファージ（図３中ｉ）からなることがわかった（それぞれ、ＭＣＩ、生存ＰＢＭＣ、ＩＡ−ＰＢＭＣ、強拡大視野、ＨＰＦ、６０．０±３．６、７８．３±３．８、２８５．０±２３．０（ＳＥＭ））（図３中ｇ、図３中ｈ）。ビメンチンについて陽性の間葉系細胞の含有物は、すべてのグループにおいて同様であった。その一方で、Ｓ１００＋樹状細胞は、コントロール梗塞（処置グループ（図３中ｊ、図３中ｋ、図３中ｈの代表的な組織像、ｎ＝５）に比べると、それぞれ、ＡＭＩ、生存ＰＢＭＣ、ＩＡ−ＰＢＭＣ、ＨＰＦ １５．６±１．７、１２．４±２．３、８．４±１．２（ＳＥＭ））において、多く見られた。
【００９７】
〔ＩＡ−ＰＢＭＣで処理したＡＭＩにおけるＶＥＧＦ＋、Ｆｌｋ１＋、およびｃ−キット＋細胞の初期自動誘導〕
ＩＡ−ＰＢＭＣは、好酸球性の細胞質および高密度な核を有する中程度の大きさの単球様の細胞からなる創傷領域において、高密度で単形性の浸潤を示したので、血管再生および再生力に関連する複数の表面マーカーを調査した。ＩＡ−ＰＢＭＣで処理したＡＭＩグループにおいてＨ．Ｅ．染色で特定されるこの細胞集団は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦａ）、Ｆｌｋ−１、およびｃ−キット（ＣＤ１１７）について、非常に高い陽性の染色を示した（図４中ｃ、図４中ｆ、図４中ｉ）。どちらのマーカーの発現も、コントロールＡＭＩおよび生存ＰＢＭＣで処理したＡＭＩグループにおいて低下した（図４中ａ、図４中ｂ、図４中ｄ、図４中ｅ、図４中ｊ）。興味深いことに、ＩＡ−ＰＢＭＣで処理したＡＭＩは、細胞が非常に密集している梗塞を起こした領域の内部において、ＣＤ３４＋細胞の増加を示した。なお、この領域は、コントロール（Ｇ、Ｈ）に比べて、３４＋細胞（Ｉ）のコロニー形成を推定的に指す、血管の構造に由来している（代表的な組織像、ｎ＝５）。
【００９８】
〔ＩＡ−ＰＢＭＣで処理したＡＭＩにおける減弱した梗塞のサイズ〕
心筋梗塞を誘発させてから６週間後に外植した心臓から得た、ＥＶＧで染色した組織試料に対して実施したプラニメーター分析において、生理食塩水を与えられたラットは、左心室の２４．９５％±３．５８（ＳＥＭ）を超えて延び、拡張の徴候を有するコラーゲンの瘢痕を示す。ＩＡ−ＰＢＭＣで処理したラットでは、これらの徴候はほとんど抑止され、梗塞のサイズは５．８１％±２．０２（ＳＥＭ）であった。なお、生存ＰＢＭＣで処理したラットの梗塞のサイズ１４．３％±１．７（ＳＥＭ）であった（図５中ａ、図５中ｂ、図５中ｃ）。
【００９９】
〔ＩＡ−ＰＢＭＣで処理したＡＭＩでは、ＬＶ機能が向上する〕
同系培養ＩＡ−ＰＢＭＣを静脈内に注入すると、生存ＰＢＭＣまたは培地で処置した動物に比べて、心エコー検査のパラメータが大幅に向上する。収縮分画率（ＳＦ）は、偽処理を行った動物では２９．１６％±４．６５（ＳＥＭ）、培地で処理したＡＭＩ動物では１８．７６％±１．１３（ＳＥＭ）、生存ＰＢＭＣで処理したＡＭＩグループでは１８．４６％±１．６７（ＳＥＭ）、ＩＡ−ＰＢＭＣで処理したラットでは２５．１４％±２．６６（ＳＥＭ）であった（図５ｅ）。駆出分画率（ＥＦ）は、偽処理を行ったラットでは６０．５８％±６．８１（ＳＥＭ）であり、培地で処理したＡＭＩの動物では４２．９１％±２．１４（ＳＥＭ）まで低下、生存ＰＢＭＣを与えられた動物では４２．２４％±３．２８（ＳＥＭ）まで低下した。その一方で、ＩＡ−ＰＢＭＣで処理したラットは、ＥＦが５３．４６％±４．２５であった。
【０１００】
収縮末期の直径および拡張終期の直径（ＬＶＥＳＤ、ＬＶＥＤＤ）、ならびに収縮末期の容積および拡張終期の容積（ＬＶＥＳＶ、ＬＶＥＤＶ）の分析は、先に観察された値に匹敵するパターンを示した。生理食塩水を与えた動物および生存ＰＢＭＣで処理したラットは、ＬＶＥＤＤ値がそれぞれ１０．４３ｍｍ±０．２１（ＳＥＭ）および１１．０３ｍｍ±０．４０であった。ＩＡ−ＰＢＭＣで処理したラットでも、左心室の拡張期の直径が、偽処理を行った動物の９．４７ｍｍ±０．６４と比較するとわずかに低減し、８．９９ｍｍ±０．３２であった。収縮期の直径の差はこれほど顕著ではなかったが、同一レベル（パネル５（ａ、ｂ、ｃ）であった。
【０１０１】
〔結論〕
これらの知見によって、放射線の照射を受けたアポトーシスＰＢＭＣ（ＩＡ−ＰＢＭＣ）が、インビトロで免疫抑制を誘導すること、および血管新生促進タンパク質の分泌に関連することが実証された。したがって、培養済み生存ＰＢＭＣおよびＩＡ−ＰＢＭＣを急性のラットＡＭＩモデルに注射し、この治療法がＦＬＫ１＋／ｃ−キット＋陽性のＥＰＣの梗塞心筋への大量の自動誘導を７２時間以内に惹起し、６週間以内に有意な機能回復を引き起こすことを実証した。
【０１０２】
ＩＡ−ＰＢＭＣを免疫アッセイ中で共培養すると、ＩＬ−１βおよびＩＬ−６の生成が低下し、同種の樹状の混合リンパ球反応（ＭＬＲ）が減弱した。免疫のパラメータはどちらも、心筋虚血後の炎症において役割を有すると考えられた。さらに、生存ＰＢＭＣおよびＩＡ−ＰＢＭＣは、２４時間以内に培地にＣＸＣＬ８／ＩＬ−８およびＭＭＰ９を分泌することが示された。これらのタンパク質は、血管再生の原因およびＥＰＣがＢＭから虚血心筋へ補充される原因であると考えられた。ＣＸＣＬ８／ＩＬ−８ケモカインは、内皮細胞に結合し、内皮細胞に対する強力な化学走性の活性を有する、小さな（＜１０ｋＤａ）各種ヘパリン結合性ポリペプチドからなるＣＸＣＬファミリーに属する。Ｎ末端（Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ、ＥＬＲモチーフ）における３つのアミノ酸残基が、内皮細胞上のＣＸＣ受容体１および２への、ＣＸＣケモカイン（例えばＩＬ−８およびＧｒｏ−α）の結合を決定し、内皮の化学遊走および血管新生を促進している。さらに、このマトリクスプロテイナーゼがキット配位子（ｓＫｉｔＬ）を放出するシグナルとして作用することから、ＭＭＰ９の分泌がＥＰＣ動員の中心的な役割をはたしていることがわかった。なお、キット配位子（ｓＫｉｔＬ）とは、ＢＭにおいて内皮および造血幹細胞（ＥＰＣ）が無活動状態の状態から増殖性の状態へ転移する原因となるケモカインである。さらに別のインビトロ分析では、培養された生存ＰＢＭＣおよびＩＡ−ＰＢＭＣに由来する上清（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ；ＳＮ）が、間葉系の線維芽細胞において、ＣＸＣＬ８／ＩＬ−８およびＭＭＰ９のｍＲＮＡ転写を強化する能力を有していることを実証することができた。以上のデータは、生存ＰＢＭＣおよび放射線の照射を受けたＰＢＭＣに由来するＳＮが、ｃ−キット＋ＥＰＣを循環中に溶出させるＢＭにおける、生物学的な状況を与えるパラクリン因子を含有することを示唆している。
【０１０３】
このインビボの培養細胞の懸濁液における何かしらの薬効を証明するために、開胸心筋損傷のモデル、およびラットの動物モデルにおいて、ＬＡＤの結紮直後に、培養し注射した生存ＰＢＭＣおよびＩＡ−ＰＢＭＣを使用した。最初のテストでは、ＣＳＦＥで標識されたＩＡ−ＰＢＭＣの大部分が脾臓および肝臓において捕捉されることが証明された。以上のデータは、「細胞治療」が梗塞心筋では自動誘導されないことを示唆している。これとは対照的に、パラクリン効果は、「修正済み」培地だけによってであっても、または細胞培養懸濁液の暴露に起因する惹起された「免疫が媒介するサイトカインストーム」によってであっても、ＡＭＩの再生効果の原因となる可能性の方がはるかに高い。急性虚血直後の炎症が室の拡張を決定するので、ＡＭＩから７２時間後の組織学的解析への道筋が実施された。ＩＡ−ＰＢＭＣで処理したラットが、この期間における、ＣＤ６８＋およびＶＥＧＦａ／ＦＬＫ１／ｃ−キット＋陽性のＥＰＣ細胞集団における大量の自動誘導の証拠となることも示すことができた。一方、さらに多くのＳ１００β陽性の樹状細胞がコントロールＡＭＩ中に見られた。このことは、コントロールＡＭＩにおけるＡＰＣに基づく炎症が増加したことを示唆している。
【０１０４】
ＩＡ−ＰＢＭＣで処理したラットにおいて見られた結果は、部分的には、心筋梗塞の自然な進行に関して現在認容されている知識と相容れない。炎症に関しては、再設計過程は、通常の条件下では梗塞心筋中のサイトカインおよび炎症細胞によって媒介され、このサイトカインおよび炎症細胞が、壊死組織の食作用および融食作用、サバイビン筋細胞の肥大、血管新生、および（程度は限られているが）前駆細胞の増殖を特徴とする創傷修復過程を開始させる。梗塞後の炎症反応を介在する、ここまでの説明において紹介したどの実験手法も、ＡＭＩモデルにとっては有害であることが示された。この組織に関する短期データを解釈する際には、ＡＭＩ中におけるＩＡ−ＰＢＭＣ細胞の培地であった懸濁液によって、炎症からｃ−キット＋ＥＰＣ修復相への高度な遷移が起こることが示される。従来の研究では、ＡＭＩ後の循環前駆体細胞治療の骨髄が、該細胞の心筋細胞への分化転換が起きているかどうかに関わらず、心機能を改善することが確認されている。ｃ−キット＋ＥＰＣについては、骨髄に由来する細胞は、心臓の修復に必須の大切な役割を有していると考えられる。イマチニブメシル酸塩を用いた薬理学的な阻害およびｃ−キット＋ＥＰＣの非動員によって、ＡＭＩ後の筋線維芽細胞の反応性が減弱し、心機能の急激な衰弱がともなった。
【０１０５】
これらの結果は、「同系」培養されたＩＡ−ＰＢＭＣを、ＡＭＩを患う患者に注射することが再生力を有することを示しており、また、急性のＡＭＩを患う患者は、自己（つまり、治療を受ける患者または同じ種から採取された）ＩＡ−ＰＢＭＣを注射されることによって利点を享受することを示唆している。
【０１０６】
〔実施例２：静止末梢血単核球（ｒｅｓｔｉｎｇ ＰＢＭＣ）による、低活性マーカーおよび炎症性サイトカイン産生の減少の証明〕
活性化された末梢血単核球（ＰＢＭＣ）およびその上清（ＳＮ）は、創傷の再生において有益であると考えられている（Holzinger C et al. Eur J Vasc Surg. 1994 May; 8(3): 351-6.）。不活性化ＰＢＭＣおよび不活性化ＰＢＭＣに由来するＳＮには、実験的な急性心筋梗塞（ＡＭＩ）および創傷を形成したモデルにおいて薬効があることが、実施例１において示された。ＰＢＭＣの不活性化は実験的に検証されなければならないので、ＰＢＭＣの培養が、Ｔ細胞活性化マーカー（ＣＤ６９、ＣＤ２５）の強化または炎症性サイトカインの分泌（単球の活性化＝ＴＮＦα、Ｔ細胞活性化＝ＩＮＦγ）の強化につながるかどうかを調べた。対照実験では、培養されたＴ細胞が、ＣＤ３ ｍＡｂ刺激または植物性血球凝集素（Ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ； ＰＨＡ）によって誘導される。
【０１０７】
〔方法および結果〕
健常人からの静脈血をＥＤＴＡ管に収集した。フィコール・ハイパック密度勾配分離（ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｒａｄｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）を実施した後に、ＰＢＭＣを収集し、生存細胞と放射線の照射を受けたアポトーシス細胞（ＩＡ−ＰＢＭＣ）とに分けた。アポトーシス細胞を得るために、ＰＢＭＣを６０Ｇｙ（セシウム１３７）に暴露した。フローサイメトリー法による分析を実施するために、５００，０００個のＰＢＭＣを２００μｌの無血清培地中で培養した。細胞に対してＰＨＡ（７μｇ／ｍｌ）もしくはＣＤ３−ｍＡｂ（１０μｇ／ｍｌ）で刺激を与えるか、または刺激を全く与えなかった。２４時間のインキュベーションの後に、細胞を洗浄し、ＣＤ３、ＣＤ６９、およびＣＤ２５について染色（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ社）し、ＦＣ５００（Ｃｏｕｌｔｅｒ社）で表面活性化マーカーについて評価した。ＥＬＩＳＡアッセイを実施するために、ＰＢＭＣを、ＰＨＡ刺激またはＣＤ３刺激を与えるものと与えないものとに分けて、２．５×１０６個／ｍｌの密度で一晩培養した。２４時間後に、上清を回収し、−２０℃で凍結させた。ＴＮＦ−α（Ｒ＆Ｄ社）用およびＩＮＦ−γ（Ｂｅｎｄｅｒ社）用の市販のＥＬＩＳＡキットを購入した。簡潔に説明すると、ＭａｘｉＳｏｒｐプレートをＴＮＦ−αおよびＩＮＦ−γに対する抗体でコーティングし、一晩保存した。２４時間後に、プレートを洗浄し、試料を各ウェルに２個ずつ添加した。インキュベーションならびに検出用抗体およびＳｔｒｅｐ−ｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰの添加の後、ＴＭＢ基質を各ウェルに添加した。発色後、スルヒック酸（ｓｕｌｐｈｉｃ ａｃｉｄ）を添加することによって、酵素反応を停止させた。光学濃度値を、Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ３プレート読み取り装置で読み取った。
【０１０８】
〔結果〕
ＦＡＣＳ分析
ＣＤ３で刺激されたＴ細胞およびＰＨＡで刺激されたＴ細胞は、２４時間のインキュベーション後に、活性化マーカーＣＤ６９およびＣＤ２５の上方制御を示した。無刺激の細胞およびアポトーシス細胞は、ほんのわずかな量のＣＤ６９およびＣＤ２５を発現させるだけであった（図６中ａ（代表的な試料、図６中ｂ、ヒストグラム、ｎ＝４）。統計的有意性は星印で表わす（ｘｘｐ＜０．００１、ｘｐ＜０．０５）。
【０１０９】
ＥＬＩＳＡ分析
無刺激のＰＢＭＣに由来する上清においてはＴＮＦ−αもＩＮＦ−γもいずれも検出されなかったが、ＰＨＡまたはＣＤ３で刺激を与えたＰＢＭＣから得られた上清は、ＥＬＩＳＡ分析が示唆するように、これらのサイトカインが高い値であることを示した（星印＊＊ｐ＜０．００１、＊ｐ＜０．０５、ｎ＝８）。この結果は、無刺激のＰＢＭＣとは炎症性サイトカインの分泌パターンが異なることを明確に示している。
【０１１０】
〔結論〕
以上のデータは、「無刺激ＰＢＭＣ」が、刺激ＰＢＭＣ（ＰＨＡおよびＣＤ３ ｍＡｂ）とは異なる別の表現型（活性化マーカー、サイトカインの分泌）であることを示唆している。
【０１１１】
図６中ａは、無刺激の生存ＰＢＭＣも、ＩＡ−ＰＢＭＣも、どちらも主に単球に由来する炎症促進性のサイトカインＴＮＦ−αを分泌しないことを示している。（有意性は次のとおりである：＊ｐ＝０．０５、＊＊ｐ＝０．００１；ｎ＝８）。
【０１１２】
図６中ｂは、無刺激のＰＢＭＣに比べると、炎症促進性のインターフェロンγの分泌が、活性化後に強く誘導されることを示している。（有意性は次のとおりである：＊ｐ＝０．０５、＊＊ｐ＝０．００１；ｎ＝８）。
【０１１３】
図７中ａは、フローサイメトリー法を用いた分析の結果を統合して示している。ＰＢＭＣをＴ細胞に対してゲーティングし、活性化マーカーＣＤ６９およびＣＤ２５の発現を評価した。（有意性は次のとおりである：＊ｐ＝０．０５、＊＊ｐ＝０．００１；ｎ＝４）。
【０１１４】
図７中ｂは、いずれか（ＰＨＡ、ＣＤ３ ｍＡｂ）で活性化されたＰＢＭＣの代表的なＦＡＣＳ分析結果を示す。ゲーティング（ｇａｔｉｎｇ）は陽性細胞の百分率を表わす。
【０１１５】
〔実施例３：生理的溶液中で培養されるＰＢＭＣの増殖活性〕
本実施例の目的は、特異的（ＣＤ３）、非特異的（レクチン、ＰＨＡ）、および同種のＴ細胞の誘発（混合リンパ球反応、ＭＬＲ）を、２日（ＣＤ３、ＰＨＡ）および５日（ＭＬＲ）間の刺激アッセイにおいて利用する免疫アッセイに比べると、ＰＢＭＣは増殖活性を有しないことを証明することである。
【０１１６】
〔物質および方法〕
ＰＢＭＣを、フィコール密度勾配遠心法によって若い健常人から分離し、０．２％のゲンタマイシン硫酸塩（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．社、アメリカ）および１％のＬ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．社、アメリカ）を含有するＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ社、アメリカ）中で、２００μＬにつき細胞１×１０５個の割合で再懸濁した。レスポンダー細胞に、ＭｏＡｂによってＣＤ３（１０μｇ／ｍｌ、ＢＤ社、ＮＪ、アメリカ）、ＰＨＡ（７μＬ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．社、アメリカ）に対して刺激を与えるか、あるいは、放射線の照射を受けた同種のＰＢＭＣを１：１の比（ＭＬＲの場合）で用いることによって刺激を与えた。プレートを４８時間または５日間インキュベートし、その後、３［Ｈ］チミジン（３．７×１０４Ｂｑ／ウェル；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、スウェーデン）を用いて１８時間パルスを与えた。細胞を回収し、３［Ｈ］チミジンの取り込み量を液体シンチレーション計数器において測定した。
【０１１７】
〔結果〕
刺激ＰＢＭＣは、３［Ｈ］チミジン取り込み法によって測定した増殖速度が、ＲＰＭＩ中で無刺激で培養される生存ＰＢＭＣに比べて高いことを示した（図８）。この効果は、Ｔ細胞に特異的な刺激（ＰＨＡ、ＣＤ３）を付加することによって、増殖が抗原提供細胞（ＭＬＲ）によって誘導されたアッセイにおいても、観察された。
【０１１８】
〔結論〕
この一連の実験は、培養液中で最長５日間まで保持される生存ＰＢＭＣが増殖しない一方で、異なる方法で刺激を与えられたＰＢＭＣは顕著な増殖反応を示したことを示唆している。以上のデータから、無刺激でＰＢＭＣを培養しても増殖反応を引き起こさないと結論できる。
【０１１９】
〔実施例４：無菌培養条件の下で保管された分離ＰＢＭＣのセクレトームが有する新たな血管新生能〕
血管再生と炎症とはインビボにおいて強く関連しているので、これらのＰＢＭＣのセクレトームがＴ細胞に対して抗増殖効果をも示し、その結果、炎症の免疫反応に干渉するかどうかを調べた。
【０１２０】
〔物質および方法〕
フィコール密度勾配遠心法によって若い健常人から分離したＰＢＭＣ（２．５×１０６個／ｍｌ）を、０．２％のゲンタマイシン硫酸塩（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．社、アメリカ）および１％のＬ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．社、アメリカ）を含有するＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ社、ＣＡ、アメリカ）中で２４時間インキュベートすることによって、セクレトームを得た。上清を細胞分画から分離し、−８０℃で保存した。増殖アッセイを実施するために、分離後に、同種のＰＢＭＣを２００μＬのＲＰＭＩにつき細胞１×１０５個の割合で再懸濁した。レスポンダー細胞として、ＭｏＡｂによってＣＤ３（１０μｇ／ｍｌ、ＢＤ社、アメリカ）またはＰＨＡ（７μＬ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．社、アメリカ）に対して刺激を与えた。上清の異なる希釈物を添加した。プレートを４８時間インキュベートし、その後、３［Ｈ］−チミジン（３．７×１０４Ｂｑ／ウェル；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、スウェーデン）を用いて１８時間パルスを与えた。細胞を回収し、３［Ｈ］−チミジンの取り込み量を液体シンチレーション計数器において測定した。
【０１２１】
〔結果〕
３［Ｈ］−チミジン取り込み法によって測定する増殖速度は、同種のＰＢＭＣのセクレトームにおいて、正のコントロールに比べて有意に低減することを示した（図９）。この効果は用量に依存し、ＰＨＡ刺激時とともに、抗ＣＤ３刺激時にも観察された。
【０１２２】
〔結果に基づく示唆〕
この一連の実験は、生存ＰＢＭＣから得られるセクレトームを２４時間培養液中に保持すると、有意な抗増殖効果をインビトロで示すことを示唆している。以上のデータは、ＰＢＭＣに由来する上清または凍結乾燥された状態にある上清は、低酸素症によって誘発される炎症またはその他の高炎症疾患（例えば自己免疫疾患、炎症性皮膚疾患など）に関連するヒトの疾患を治療するための、治療用処方物として作用する潜在的な可能性があることを示唆している。
【０１２３】
〔実施例５：末梢血単核球が分泌するパラクリン因子による心機能の保存〕
実施例１では、末梢血液に由来し、放射線の照射を受けた培養後のアポトーシス細胞を注射することによって、ラットにおける実験的な心筋梗塞の後の機能的な心臓の回復が大幅に改善されることが示された。この改善は、アポトーシス細胞が持つ免疫を抑制する特性、血管新生促進効果、およびｃ−キット＋血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）の増大した自動誘導の誘導に基づいている。
【０１２４】
本実施例では、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）（生存ＰＢＭＣまたは６０Ｇｒａｙの放射線の照射を受けたＰＢＭＣ）を２４時間インキュベートし、細胞培養物の上清を生成した。上清を凍結乾燥し、生体内実験において使用するまで凍結したまま保管した。左前側の下行動脈を結紮することによって、スプラーグドーリーラットにおいて心筋梗塞を誘導した。虚血の開始後に、凍結乾燥していた上清を再懸濁し、静脈内に注射した。組織学的評価および免疫組織学的な評価を行うために、心筋梗塞から３日後および６週間後に組織試料を採取した。ＡＭＩから６週間後の心エコー検査によって、心機能を評価した。偽処理を行った動物および無処置の動物を、コントロールとして使用した。
【０１２５】
アポトーシスＰＢＭＣから得られた上清を注射したラットは、コントロールに比べると、心筋の血管新生が増加し、および血管内皮前駆細胞の自動誘導の強化を７２時間以内に示した。線維症の領域のプラニメーター評価は、アポトーシス細胞から得られた上清を用いて治療した動物では梗塞のサイズが低減したことを示唆していた。さらに、心エコー検査は、駆出分画率の損失の減弱および室の形状の保存によって証明されるように、ＡＭＩ後の再設計について大きな改善を示した。アポトーシス細胞から得られた上清を与えたラットにおける左室駆出分画（ＬＶＥＦ）は平均値が５６±４％であり、一方で、偽処理を行った動物の場合には６０±５％であった。また、無処置の動物または生細胞の上清を注射した動物は、それぞれ４４±３％および４１±４％にまで、ＬＶＥＦが大きく衰弱した（ｐ＜０．００１）。
【０１２６】
以上のデータは、実験的ＡＭＩにおいて放射線の照射を受けたアポトーシスＰＢＭＣに由来する上清を注射することによって、炎症が回避でき、心室機能の保存につながる再生ＥＰＣの優先的な自動誘導を引き起こすことを示唆している。
【０１２７】
〔方法〕
〔インビトロアッセイにおけるヒトＰＢＭＣの細胞培養〕
ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、上述のフィコール密度勾配遠心法（Ｆｉｃｏｌｌ ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｒａｄｅ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）によって採取した。ヒトＰＢＭＣにおいてアポトーシスを誘導するために、細胞に６０Ｇｙの放射線を照射した（ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ ａｕｔｏｍａｔ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｂｌｏｏｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ、Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｖｉｅｎｎａ）。生存ＰＢＭＣおよび放射線の照射を受けたアポトーシス（ＩＡ−）ＰＢＭＣを、どちらも各種の細胞密度（１×１０６、５×１０６、１０×１０６、および２５×１０６個の細胞／ミリリットル、ｎ＝５）で３７℃で２４時間インキュベートした。その後、上清を得て、分泌されるタンパク質のレベルを、製造業者が提供するプロトコルにしたがって、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ社、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、アメリカ）によって測定した。
【０１２８】
〔ＡＭＩ生体内実験のための同系ＩＡ−ＰＢＭＣおよび生存ＰＢＭＣの取得〕
生体内実験に用いる同系ラットのＰＢＭＣを、前もってヘバリン処置しておいたラットから、右心房を穿刺することによって得られた全血から、密度勾配遠心法によって分離した。生体内実験を行うために、４５ＧｙのＣｓ−１３７セシウムを照射することによって、アポトーシスを誘導し、３７℃で２５×１０６個の細胞／ミリリットルの細胞密度で培養した。照射によるアポトーシスの誘導を、フローサイトメトリー（ＩＡ−ＰＢＭＣの場合はアネキシンＶ染色＞８０％、生存ＰＢＭＣの場合はアネキシンＶ染色＜２０％）によって測定した。細胞を加湿雰囲気（５％ ＣＯ２、３７℃、相対湿度９５％）中で２４時間インキュベートした。上清を除去し、５０ｍＭの酢酸アンモニウムに対して３．５ｋＤａのカットオフ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｒｅｄａ、オランダ）で４℃で一晩透析した。その後、上清を無菌濾過し、凍結乾燥した。凍結乾燥したセクレトームを−８０℃で保存し、実験を行うたびに新たに再懸濁した。セクレトームを無作為抽出して、そのｐＨ値を計測した。凍結乾燥した粉末を、次の実験を実施するまで−８０℃で保存した。
【０１２９】
〔心筋梗塞の誘発〕
ウイーン医科大学動物研究委員会（ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ ａｎｉｍａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｖｉｅｎｎ）から、動物実験の許可を得た。実験はすべて米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ （ＮＩＨ））が発行するＧｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓにしたがって実施した。左前側の下行動脈（ＬＡＤ）を結紮することによって、雄の成体スプラーグドーリーラットにおいて、心筋梗塞を誘導した。簡潔に説明すると、キシラジン（ｘｙｌａｚｉｎ）（１ｍｇ／身体重量１００ｇ）およびケタミン（ｋｅｔａｍｉｎ）（１０ｍｇ／身体重量１００ｇ）の混合物を用いて、動物に腹腔内麻酔し、機械を用いて人工呼吸を行った。左側方の開胸術を実施し、６−０ ｐｒｏｌｅｎｅを用いて左心房の下方のＬＡＤの周囲を結紮した。虚血の開始直後に、０．３ｍｌ細胞培養培地中に再懸濁された８×１０６個のアポトーシスＰＢＭＣから得られた、凍結乾燥させた上清を、大腿静脈に注射した。細胞培養培地だけの注射、生存ＰＢＭＣの上清の注射、および偽処理を、それぞれ、この実験の設定環境において、ネガティブコントロールとして使用した。実験設計を図１に示す。
【０１３０】
〔インビボにおける組織学および免疫組織化学〕
実施例１を参照する。
【０１３１】
〔プラニメーター分析による心筋梗塞のサイズの決定〕
実施例１を参照する。
【０１３２】
〔心エコー検査による心機能の評価〕
実施例１を参照する。
【０１３３】
〔検定手法〕
ソフトウェア（Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ、アメリカ）を用いて統計解析を実施した。すべてのデータを、平均値±標準誤差として与える。従属変数を対象とする対応のある両側ｔ検定、および独立変数を対象とする対応のないｔ検定を使用して有意性を算出した。
【０１３４】
急性の心筋梗塞の生存率のグループ間の差を、カプラン−マイヤー保険統計解析法によって比較した。ボンフェローニ・ホルム補正を使用して、複数の試験のｐ値を調節した。ｐ値＜０．０５は、統計的に有意であると考えられた。
【０１３５】
〔結果〕
〔ＥＬＩＳＡによるＩＡ−ＰＢＭＣおよび生存ＰＢＭＣが分泌するパラクリン因子の決定〕
結果を図１０〜１５に示す。
【０１３６】
〔実施例６：末梢血単核球が分泌するパラクリン因子が有する免疫抑制特性〕
実施例１では、急性心筋梗塞（ａｃｕｔｅ ｍｙｏｃａｒｄｉｃａｌ ｉｎｆａｒｃｔ； ＡＭＩ）の動物モデルにおける、ＰＢＭＣセクレトームの抗炎症効果が示された。本実施例では、ＡＭＩを誘発後のＰＢＭＣセクレトームの適用が、免疫応答を大きく下方制御することによって心筋の炎症性損傷を阻害することを示す。
【０１３７】
これらの知見に基づいて、試験管内実験におけるセクレトームの考え得る免疫抑制効果について調べた。ＣＤ４＋細胞は、免疫過程において、他の白血球（例えばマクロファージ、Ｂ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞など）の補助にとって重要であって、免疫反応の統合において鍵となる役割を果たす。
【０１３８】
〔物質および方法〕
〔ＰＢＭＣセクレトームの生成〕
健常人から得られるＰＢＭＣを、フィコール密度勾配遠心法によって分離した。細胞を、Ｕｌｔｒａ Ｃｕｌｔｕｒｅの培地（Ｌｏｎｚａ社、Ｂａｓｅｌ、スイス）中で１×１０６個／ｍｌ（ｓｕｐ ｌｉｖ）の濃度で再懸濁した。アポトーシスＰＢＭＣからセクレトームを生成するために、６０Ｇｙ（ｓｕｐ ＡＰＡ）を照射することによって、アポトーシスを誘導した。細胞を、加湿雰囲気（５％ ＣＯ２、３７℃、相対湿度９５％）下で２４時間インキュベートした。上清を除去し、５０ｍＭの酢酸アンモニウムに対して３．５ｋＤａのカットオフ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｒｅｄａ、オランダ）で４℃で一晩透析した。その後、上清を無菌濾過し、凍結乾燥した。凍結乾燥したセクレトームを−８０℃で保存し、実験を行うたびに新たに再懸濁した。セクレトームを無作為抽出して、そのｐＨ値を計測した。
【０１３９】
〔ＣＤ４細胞の分離〕
ＭＡＣＳビーズシステム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）を使用して、ＣＤ４＋Ｔ細胞以外の細胞を枯渇させることによって、ＣＤ４＋細胞を分離した。細胞を新たに準備し、ただちに各実験に使用した。
【０１４０】
〔アポトーシスの測定〕
アポトーシスを、市販のアネキシンＶ／ＰＩキット（ＢＤ社、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、アメリカ）を用いてフローサイトメトリーによって検出した。アポトーシスをアネキシン陽性染色法によって定義し、後期アポトーシスをＰＩの陽性度によって定義した。
【０１４１】
〔増殖実験〕
ＰＢＭＣまたは精製済みＣＤ４＋細胞を、９６個の丸底ウェルを有するプレートにおいて、０．２％のゲンタマイシン硫酸塩（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．社、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、アメリカ）、０．５％のβ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．社、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、アメリカ）、および１％のＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ（インビトロゲン社、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、アメリカ）を補充したＵｌｔｒａ Ｃｕｌｔｕｒｅ中で、１×１０５個／ウェルの濃度にまで希釈した。ＰＨＡ（７μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．社、アメリカ）、ＣＤ３（１０μｇ／ｍｌ、ＢＤ社、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、アメリカ）、ＩＬ−２（１０Ｕ／ｍｌ、ＢＤ社、アメリカ）を用いて、または放射線の照射を受けた（６０Ｇｙ）同種のＰＢＭＣを１：１の比で用いて、ＭＬＲを得るために、細胞に刺激を与えた。細胞を、複数の濃度のＰＢＭＣセクレトーム、ＩＬ−１０、またはＴＧＦ−βを用いて４８時間または５日間（ＭＬＲ）インキュベートした。その後、３［Ｈ］チミジン（３．７×１０４Ｂｑ／ウェル；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）を用いて、細胞に１８時間パルスを与えた。細胞を回収し、３［Ｈ］チミジンの取り込み量を液体シンチレーション計数器において測定した。
【０１４２】
〔活性化マーカー〕
精製済みＣＤ４＋細胞を、抗ＣＤ３（１０μｇ／ｍｌ）を用いて刺激し、複数の濃度のＰＢＭＣセクレトームで共インキュベートした。細胞を、標準的なフローサイメトリー法の染色プロトコルにしたがって、ＣＤ６９およびＣＤ２５について染色し、フローサイトメーターＦＣ５００（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ、アメリカ）で分析した。
【０１４３】
〔結果〕
予備実験において、生細胞（ｓｕｐ ｌｉｖ）から得られるＰＢＭＣの上清の抗増殖特性について試験を行った。抗ＣＤ３刺激実験およびＰＨＡ刺激実験では、増殖速度が、セクレトーム（ｎ＝１０）を添加することによって大幅に低下した。
【０１４４】
これらの細胞は、免疫反応を始動および継続させる際に中心的役割を果たすので、これらの知見に基づいて、Ｔヘルパー細胞の区画に対するＰＢＭＣセクレトームの効果を評価した。図１６と同様に、非常に高度に精製されたＣＤ４＋細胞は、セクレトームを添加することによって増殖能を喪失した。この現象は、放射線の照射を受けたアポトーシスＰＢＭＣ（図１７、ｎ＝５）の上清の場合にも、生存ＰＢＭＣの上清の場合にも観察された。
【０１４５】
次の工程は、細胞生存率に対するセレクトームの考え得る効果を決定することである。したがって、静止ＣＤ４＋細胞を、上清およびアネキシンＶを用いてイノキュベートし、ＰＩの陽性度を評価した。生存ＰＢＭＣから得られる上清も、アポトーシスＰＢＭＣから得られる上清も、どちらも顕著なアポトーシス促進効果を示した（図１８、ｎ＝５）。
【０１４６】
ＰＢＭＣセクレトームがＣＤ４＋細胞活性化を阻害することができるかどうかを試してみるために、ＣＤ４＋細胞の抗ＣＤ３刺激に続いて、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ２５およびＣＤ６９を評価した。どちらのマーカーの上方制御も、ＰＢＭＣセクレトームによって大幅にかつ用量に応じて阻害された（図１９、ｎ＝５）。
【０１４７】
最後の一連の実験では、これらの実験において中和抗体を添加することによる、免疫抑制サイトカインＩＬ−１０およびＴＧＦ−βの効果について検討した。ＩＬ−１０も、ＴＧＦ−βも、これらのサイトカインの効果を失わせても増殖速度は上昇しなかったので（図２０、ｎ＝５）、本発明のＰＢＭＣセクレトームの抗増殖効果の原因ではなかった。
【０１４８】
〔結論〕
これらの実験によって、ＰＢＭＣのセレクトームがインビトロで免疫抑制特性を有することが初めて示された。上清は、ａ）抗ＣＤ３刺激実験、ＰＨＡ刺激実験、およびＭＬＲ刺激実験において増殖速度を低下させ、ｂ）Ｔ細胞の誘導時にＣＤ４＋細胞のアポトーシスを誘導し活性化を阻害する効力を有することが示された。
【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１】図１中ａは、心エコー検査、組織学的検査、および免疫組織学的検査による心機能の評価における、実験プロトコルおよび実験時期を示している。図１中ｂは、１８時間の培養期間の後にアネキシンに対して陽性染色したＰＢＭＣであって、放射線の照射を受けたラットのＰＢＭＣおよび放射線の照射を受けていないラットのＰＢＭＣの比率を示している。
【図２】図２中ａでは、放射線を照射することによってヒトのＰＢＭＣではアポトーシスを引き起こし、アネキシンの発現が４８時間にわたって時間の経過と共に増加することを、ＦＡＣＳ分析によって示している。図２中ｂでは、ＬＰＳ刺激を受けたＰＢＭＣまたは単球を、放射線を照射したアポトーシス自系ＰＢＭＣと共にインキュベートすることによって、炎症促進性のサイトカインＩＬ−１βの分泌が投与量に応じて減少することが示されている。図２中ｃでは、程度は相対的に低いが、この知見は、ＩＡ−ＰＢＭＣの存在下における、ＬＰＳ刺激ＰＢＭＣおよび単球のＩＬ−６分泌プロファイルにも相関している。図２中ｄでは、ＬＰＳ刺激を伴う混合リンパ球の反応液に、自系ＩＡ−ＰＢＭＣを添加すると、１分毎に測定した（ｃｏｕｎｔｓ ｐｅｒ ｍｉｎｕｔｅ； ｃｐｍ）Ｔ細胞の増殖数が減少している。図２中ｅでは、ＶＥＧＦ、ＩＬ−８／ＣＸＣＬ８、およびＭＭＰの転写物のＲＴ−ＰＣＲ ＲＮＡ発現解析によって、２４時間の培養後に、放射線の照射を受けたＰＢＭＣにおいてＩＬ−８／ＣＸＣＬ８および特にＭＭＰ９の上方制御が起こったことが示されている。図２中ｆでは、ＶＥＧＦ、ＩＬ−８／ＣＸＣＬ８、およびＭＭＰ９のＥＬＩＳＡ解析によって、ＭＭＰ９は大部分が細胞溶解物質中に見られる一方で、ＶＥＧＦおよびＩＬ−８／ＣＸＣＬ８のタンパク質分泌の差が、生細胞においても、ＩＡ−ＰＢＭＣにおいても、ほぼ同じレベルのままであることが示されている。図２中ｇでは、生存ＰＢＭＣまたはＩＡ−ＰＢＭＣの細胞培養物から得られる上清中でインキュベートしたヒトの線維芽細胞が、ＲＴ−ＰＣＲ解析において、ＶＥＧＦ、ＩＬ−８／ＣＸＣＬ８、およびＭＭＰ９転写物の強い上方制御を示している。また、ピーク値は、ＩＡ−ＰＢＭＣの上清中でインキュベートされた線維芽細胞に見られた。
【図３】図３中ａ、図３中ｂ、図３中ｃに示すように、人工的に心筋梗塞を起こした後のラットにおいて、尾静脈を介して投与した、ＣＦＳＥで標識された同系ＰＢＭＣは、大部分が脾臓（図３中ｂ）において見られ、これよりは少ない個数が肝臓（図３中ａ）において見られたが、梗塞を起こした心臓（図３中ｃ）ではＰＢＭＣ細胞が全く見られなかった。図３中ｄ、図３中ｅ、図３中ｆに示すように、培地（図３中ｄ）または生存ＰＢＭＣ（図３中ｅ）のいずれかを注射したラットにおいてＨＥ染色した梗塞区域が、免疫細胞が浸潤した虚血の心筋に匹敵するパターンを示し、ＩＡ−ＰＢＭＣを与えられたラットから得られる組織が、非常に高い密度の浸潤を示唆している。図３中ｇ、図３中ｈ、図３中ｉでは、生細胞で治療されたラット（図３中ｈ）の方が、培地で治療されたラット（図３中ｇ）に比べて、梗塞部位において、ＣＤ６８＋で染色された細胞がわずかに多いことがわかる。これとは対照的に、ＩＡ−ＰＢＭＣを注射した動物（ラット）では、３倍の量のＣＤ６８＋が検出された。図３中ｊ、図３中ｋ、図３中ｌに示すように、生存ＰＢＭＣまたはＩＡ−ＰＢＭＣを投与した場合に比べて、培地だけを与えられたラットの方が、高いレベルのＳ１００β＋細胞が見られた。
【図４】図４中ａ、図４中ｂ、図４中ｃに示すように、培地（図４中ａ）または生細胞治療（図４中ｂ）の場合に比べて、ＩＡ−ＰＣＭＣを注射した動物から得られる梗塞を起こした心筋組織（ｃ）において、ほぼ４倍の量のＶＥＧＦについて陽性染色された細胞が検出された。図４中ｄ、図４中ｅ、図４中ｆに示すように、ＶＥＧＦ受容体のＫＤＲ／ＦＬＫ１について、同様の発現パターンが見られ、ピーク値は培地（図４中ｄ）および生細胞（図４中ｅ）ではなく、ＩＡ−ＰＢＭＣのグループ（図４中ｆ）において見られた。図４中ｇ、図４中ｈ、図４中ｉに示すように、３つのどのグループにおいてもＣＤ３４について差が検出されなかった。図４中ｊ、図４中ｋ、図４中ｌに示すように、梗塞を起こした心臓におけるマーカーｃ−キットについての免疫組織学的分析によると、ＩＡ−ＰＢＭＣ（図４中ｌ）を注射したラットでは、多量の陽性染色された細胞および高密度な局在性が示され、培地を与えられた動物（図４中ｊ）および生細胞を与えられた動物（図４中ｋ）では、それより少ない個数の細胞が示されている。
【図５】図５中ａ、図５中ｂ、図５中ｃに示すように、心筋梗塞（Ｅｌａｓｔｉｃａ ｖａｎ Ｇｉｅｓｏｎ染色法）の誘導から６週間後に外植された虚血性のラットの心臓の組織学的解析の結果である。培地を注射した動物（図５中ａ）から得られた心臓は、他に比べて拡張されているようであり、線維性組織が大きく広がっていた。生細胞を注射したラット（図５中ｂ）では瘢痕の広がりが低減し、拡張の徴候が他に比べて少なかった。瘢痕組織の形成の最低量は、ＩＡ−ＰＢＭＣを注射された動物（図５中ｃ）において検出された。図５中ｄに示すように、ＬＡＤの結紮から６週間後に収集された標本のプラニメーター分析によって得られたデータの統計解析の結果から、瘢痕の広がりの平均値は、培地を注射された動物では２４．９５％±３．６、生存ＰＢＭＣを注射された動物では１４．３％±１．３、ＩＡ−ＰＢＭＣを注射された動物では５．８％±２であることを示している（平均値＋ＳＥＭ）。図５中ｅ、図５中ｆ、図５中ｇでは、心エコー検査によって得られる心機能パラメータ（収縮分画率、駆出分画率、および収縮末期の直径）の評価によって、ＩＡ−ＰＢＭＣを注射した動物では、他に比べて、心筋梗塞後に良好に回復していることが示されている。
【図６ａ】図６ａは、無刺激の生存ＰＢＭＣも、ＩＡ−ＰＢＭＣも、どちらも主に単球に由来する炎症促進性のサイトカインＴＮＦ−αを分泌しないことを示している。（有意性は次のとおりである：＊ｐ＝０．０５、＊＊ｐ＝０．００１；ｎ＝８）。
【図６ｂ】図６ｂは、無刺激のＰＢＭＣに比べると、炎症促進性のインターフェロンγの分泌が、活性化後に強く誘導されることを示している。（有意性は次のとおりである：＊ｐ＝０．０５、＊＊ｐ＝０．００１；ｎ＝８）。
【図７ａ】図７ａは、フローサイメトリー法を用いた分析の結果を統合して示している。ＰＢＭＣをＴ細胞についてゲーティングし、活性化マーカーＣＤ６９およびＣＤ２５の発現を評価した。（有意性は次のとおりである：＊ｐ＝０．０５、＊＊ｐ＝０．００１；ｎ＝４）。
【図７ｂ】図７ｂは、いずれか（ＰＨＡ、ＣＤ３ ｍＡｂ）で活性化されたＰＢＭＣの代表的なＦＡＣＳ分析結果を示す。ゲーティング（ｇａｔｉｎｇ）は陽性細胞の比率を表わす。
【図８】図８は、刺激したＰＢＭＣを対象として、３［Ｈ］チミジン取り込み法によって測定した増殖速度が、ＲＰＭＩ中で無刺激で培養される生存ＰＢＭＣに比べて高いことを示している。
【図９】図９は、Ｔ細胞増殖アッセイにおいて、ＰＢＭＣセクレトームに対するＴ細胞の応答が阻害されることを示している。
【図１０】図１０中ａ〜図１０中ｆは、インターロイキン−８、Ｇｒｏ−α、ＥＮＡ−７８、ＩＣＡＭ−１、ＶＥＧＦ、およびインターロイキン−１６の上清のレベルを示している。アポトーシスＰＢＭＣにおいては、血管新生および免疫抑制に関連するこれらのサイトカインおよびケモカイン（ｃｈｅｍｏｋｉｍｅ）の分泌パターンが、生細胞とは顕著に異なる。この効果は、細胞を高密度でインキュベートすると一層顕著であった。
【図１１】図１１は、実験的にＬＡＤの結紮を実施してから６週間後の、心筋の瘢痕組織の広がりを（左心室を占める％で）示している。アポトーシス細胞に由来する細胞培養物の上清を注射した動物は、コラーゲンの堆積の大幅な減少、瘢痕の広がりの低減、および生存可能な心筋の増加を示す。
【図１２】図１２中ａ〜図１２中ｃは、実験的に心筋梗塞を起こさせてから６週間後に外植されたラットの心臓の巨視的な外観を示している。放射線の照射を受けたアポトーシス細胞（図１２中ｃ）から得られた上清を注射した動物は、コラーゲンの堆積の減少、および梗塞領域が、培地（図１２中ａ）または生存細胞から得られる上清（図１２中ｂ）を注射したものに比べて非常に小さいことを示す。瘢痕組織は緑色に着色し、より良好に可視化できるようにする。
【図１３】図１３中ａ〜図１３中ｄは、代表的な心エコー検査（Ｍモード）を示している。心機能は、ＩＡ−ＰＢＭＣの上清を注射したラット（図１３中ｃ）の方が、培地で処理したラット（図１３中ａ）および生細胞で処理したラット（図１３中ｂ）に比べてはるかに良好であった。偽処理を行ったラットから得られた心エコー検査法による撮影画像を図１３中ｄに示す。
【図１４】図１４中ａおよび図１４中ｂは、心筋梗塞から６週間後に実施した心エコー検査による分析結果を示している。放射線の照射を受けたアポトーシスＰＢＭＣから得られた上清を用いて治療したラットは、培地を注射した動物または生細胞を培養した上清を注射した動物に比べて、はるかに良好な心機能を示している。
【図１５】図１５は、４つの治療グループすべてのカプラン−マイヤー生存曲線（ｓｕｒｉｖｉａｌ ｃｕｒｖｅ）を示している。生存ＰＢＭＣ細胞培養物の上清を注射した動物も、アポトーシスＰＢＭＣ細胞培養物の上清を注射した動物も、どちらも、培地を注射したラットに比べて良好な生存率を示している。（ｐ＜０．１）。
【図１６】図１６は、ＰＢＭＣを用いて実施した抗ＣＤ３およびＰＨＡ刺激実験を示している。
【図１７】図１７は、抗ＣＤ３、ＰＨＡ、および混合リンパ球を用いて刺激をした際のＰＢＭＣの増殖を示している。
【図１８】図１８は、ＰＢＭＣの上清を用いてインキュベートしたＣＤ４＋細胞の上清のアネキシンＶのレベルおよびＰＩの陽性度を示している。
【図１９】図１９は、ＰＢＭＣの上清によってＣＤ４＋細胞におけるＣＤ２５およびＣＤ６９の上方制御が阻害されることを示している。
【図２０】図２０は、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βを機能させないようにしても、ＣＤ４＋細胞の増殖速度が上昇しなかったことを示している。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、体内の炎症症状、好ましくは虚血に関連する体内の症状を治療するための薬剤に関する。
【０００２】
酸素が減少した状態である低酸素症は、肺が易感染性になると、または血流が低下すると発生し得る。血流が減少である虚血は、凝血（血栓）もしくは何かしらの外来性の循環物質による動脈もしくは静脈の閉塞（塞栓）によって、または血管障害（例えば粥状動脈硬化）によって引き起こされる可能性がある。血流の減少は、突然発症して持続期間が短い（急性の虚血）こともあれば、発症がゆるやかで持続期間が長いまたは頻繁に再発（慢性の虚血）することもある。急性の虚血は、局所的で不可逆的な組織の壊死（梗塞）に関連していることが多い。一方で、慢性の虚血は通常一過性の低酸素性の組織傷害に関連する。ただし灌流の減少が長引く、あるいは重篤であると、慢性の虚血は梗塞にも関連する。梗塞は脾臓、腎臓、肺、脳、および心臓において頻繁に発生し、例えば腸梗塞、肺梗塞、虚血発作、心筋梗塞などの障害を引き起こす。
【０００３】
虚血性障害における病理的な変化は、虚血の持続期間および重症度ならびに患者の生存期間に依存する。壊死は梗塞内部で最初の２４時間以内に確認できる。また、急性の炎症反応は梗塞部に隣接する生存組織中で進行し、白血球は死滅組織の領域に移動する。これに続く数日の間に、貪食および膠質性瘢痕または神経膠瘢痕との置換によって、梗塞領域内において細胞が徐々に分解および除去される。
【０００４】
１つの器官における低灌流または梗塞が、他の器官に影響を及ぼすことが多い。一例として、例えば肺塞栓症によって引き起こされる肺の虚血は、肺に影響するだけではなく、心臓やその他の器官（例えば脳）をも低酸素性ストレス下におく。心筋梗塞は、血栓症、動脈壁痙攣、または心臓のウイルス感染症に起因する冠動脈の閉塞を伴うことが多く、うっ血性心不全および全身的低血圧症を引き起こす可能性がある。心拍停止が長引いて低灌流が継続すると、二次的な各種合併症（例えば全身的な虚血性脳症）が発症する可能性がある。脳虚血は、最も一般的には粥状動脈硬化を原因とする血管閉塞によって引き起こされ、その重症度は、各種一過性脳虚血発作（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ａｔｔａｃｋ； ＴＩＡ）から大脳梗塞または脳卒中にまでわたり得る。ＴＩＡの症状は一時的かつ可逆的であるが、ＴＩＡは再発する傾向があり、ＴＩＡに続いて脳卒中を起こすことが多い。
【０００５】
閉塞性動脈疾患の例としては、心筋梗塞に繋がるおそれのある冠動脈疾患、ならびに腹部大動脈、腹部大動脈の主要な支脈、および脚の動脈に影響しかねない末梢動脈疾患などが挙げられる。末梢動脈疾患とは、例えばバージャー病、レイノー病、および先端チアノーゼなどである。末梢動脈疾患は一般に粥状動脈硬化によって引き起こされるが、その他の主要な原因の一例としては糖尿病があげられる。末梢動脈疾患に関連する合併症の例としては、重症下肢痙攣、急性扁桃炎、心拍異常、心不全、心発作、脳卒中、腎不全などが挙げられる。
【０００６】
虚血性障害および低酸素性障害は罹患および死亡の主要な原因である。循環器疾患は、世界中の死亡原因の３０％を占める。各種の循環器疾患の中では、虚血性心疾患および脳血管疾患が死亡原因の約１７％である。
【０００７】
現在、虚血性障害および低酸素性障害の治療では、症状の緩和および原因となる疾患の治療に焦点が合わせられている。例えば、心筋梗塞の治療にはニトログリセリンおよび鎮痛薬が用いられ、痛みを制御し心臓の作業負荷を軽減する。ジゴキシン、利尿薬、アムリノン、β遮断薬、高脂血症治療薬、およびアンジオテンシン変換酵素阻害薬を含めた、他の薬物療法が病状の安定化のために使用されるが、これらの治療法はいずれも、虚血および低酸素症によって生じた組織の損傷を直接治療対象とするものではない。
【０００８】
現在の治療法には短所があるために、低酸素症に関連する病状の治療に効果的な方法に対する必要性が依然として存在する。例えば粥状動脈硬化、糖尿病、および肺障害に起因して起きる虚血によって引き起こされる組織の損傷の、効果的な予防法に対する必要性も存在する。
【０００９】
虚血および低酸素症に関連する病状には、通常炎症が併発する。したがって、炎症も緩和する手段および方法が必要とされている。
【００１０】
本発明の目的は、体内の炎症症状、好ましくは虚血に関連する症状を効率的に治療することを可能にする手段を提供することである。
【００１１】
本発明は、体内の炎症症状（好ましくは虚血に関連する体内の症状）を治療するための薬剤であって、ａ）末梢血単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ； ＰＢＭＣ）またはそのサブセットを含有する生理的溶液、またはｂ）溶液ａ）の上清を包含し、溶液ａ）は、ＰＢＭＣ増殖性物質およびＰＢＭＣ活性化物質を含有しない生理的溶液中において、ＰＢＭＣまたはそのサブセットを少なくとも１時間培養することによって得られるものである、薬剤に関する。
【００１２】
上記において定義した薬剤を、体内の炎症症状、好ましくは虚血に関連する体内の症状を患う患者に投与することによって、各症状が軽減され、治癒過程が実現されることが見出された。
【００１３】
本発明に係る薬剤は、培養されたＰＢＭＣもしくはそのサブセット、および／またはＰＢＭＣを培養した培養上清を包含する。ＰＢＭＣの培養過程において、これらのＰＢＭＣ細胞は、活性化ＰＢＭＣにおいて発現および分泌される物質とは異なる、サイトカインなどの物質を発現および分泌する。このことは、本発明のＰＢＭＣのセクレトームが、活性化ＰＢＭＣのセクレトームとは異なることを意味している。本発明のＰＢＭＣ細胞は、細胞の表面以外の部分で誘因されるセクレトーム生成を行う。したがって、ＰＨＡまたはＬＰＳなどのＰＢＭＣを活性化する物質と接触していないＰＢＭＣが、体内の炎症症状、特に虚血に関連する症状の治療に使用可能であることは驚くべきことである。これは、これらのＰＢＭＣ細胞のセクレトームが、上記の症状または同様の症状の治療を支援する物質を含有することを示している。
【００１４】
本発明に係るＰＢＭＣは、ＰＢＭＣ増殖物質およびＰＢＭＣ活性化物質を含有しない生理的溶液中でＰＢＭＣを培養することによって得られる。ただし、このＰＢＭＣは、生理的溶液中で少なくとも１時間インキュベートされる。この最短培養時間は、ＰＢＭＣにサイトカインおよびその他の有益な物質を分泌させるために必要である。
【００１５】
本発明に係る薬剤のうちＰＢＭＣの部分は、例えばフィコール勾配、低浸透圧性溶解などの当該技術分野において公知の方法を用いて、全血から得ることもできる。これらの方法は当該技術分野において周知である。
【００１６】
上記薬剤のＰＢＭＣを、薬剤が投与されるドナー集団または同じ個体から得てもよい。
【００１７】
ＰＢＭＣまたはそのサブセットは、本発明に係る薬剤中に生存可能な形態で存在している。
【００１８】
上清を得る元となる生理的溶液は、溶液１ｍｌあたり、または単位服用量あたり、少なくとも５００個、好ましくは少なくとも１０００個、より好ましくは少なくとも１０５個、さらにより好ましくは少なくとも１０６個のＰＢＭＣ細胞を包含する。
【００１９】
本発明の薬剤は、１ｍｌあたり、または単位服用量あたり、少なくとも５００個、好ましくは少なくとも１０００個、より好ましくは少なくとも１０５個、さらにより好ましくは少なくとも１０６個のＰＢＭＣを含有している。
【００２０】
ここで使用する「生理的溶液」とは、使用に先立って、ＰＢＭＣを本発明に係る薬剤中で培養するための溶液を指す。
【００２１】
「生理的溶液」とは、さらに、ＰＢＭＣの細胞死を１時間以内、好ましくは３０分以内に引き起こさない溶液も指す。生存ＰＢＭＣの個数が、ある溶液中で１時間以内、好ましくは３０分以内に７５％、より好ましくは９０％減少すれば、この溶液はここで定義する「生理的溶液」であるとは見なさない。「生理的溶液」は、ＰＢＭＣがこの溶液に接触しても、ＰＢＭＣの自発的な溶解を引き起こさない。
【００２２】
本文脈において、「培養（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｎｇ）」または「培養（ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ）」工程は、「インキュベーション」工程を含む、または「インキュベーション」工程からなる。なお、この「インキュベーション」工程は、ＰＢＭＣを培養するために通常使用される条件の下で、所定の時間（少なくとも１時間、好ましくは少なくとも４時間、より好ましくは少なくとも８時間、さらにより好ましくは少なくとも１２時間）、ＰＢＭＣ細胞を溶液に接触させる工程である。
【００２３】
本発明の文脈において、「虚血に関連する症状」という用語は「虚血症状」という用語と交換可能に使用可能であって、ヒトまたは動物の体の一部の領域に十分な酸素が供給されず、その結果組織の損傷または機能障害を発生させる、任意の症状、疾患、または障害を表わす。病態は、血管の狭窄または閉塞によって引き起こされる可能性がある、器官または器官の一部の内部における血液供給の減少または消滅という特徴を有していてもよい。このような性状を、ここではまとめて、「虚血」または「虚血関連症状」または「虚血に関連する症状」という用語によって称する。例えば心疾患では、虚血という用語を使って、狭窄または閉塞した冠動脈が原因となって酸素に富む血液が十分な量だけ得られていない心筋に言及することが多い。虚血の症状は「虚血」状態にある器官によって異なる。心臓の場合、虚血の結果、狭心症が起こることが多い。脳では、虚血の結果、脳卒中が起こり得る。虚血症状の場合には炎症が併発する。
【００２４】
炎症、特に虚血に関連する病態の例としては、創傷、心筋虚血、肢虚血、組織の虚血、虚血再灌流障害、狭心症、冠動脈疾患、末梢血管疾患、末梢動脈疾患、脳卒中、虚血発作、慢性の創傷、糖尿病性の創傷、心筋梗塞、うっ血性心不全、肺梗塞、皮膚潰瘍などがあげられるが、これらの例に限定されるものではない。
【００２５】
ただし、本発明の文脈における病態とは、内皮細胞の損傷または機能障害、つまり創傷を特徴とするものであってもよい。本発明に係る薬剤を使用することによって治療してもよい創傷の例としては、慢性の創傷、糖尿病性の創傷、潰瘍、熱傷、炎症性皮膚疾患、腸疾患などがあげられるが、これらの例に限定されるものではない。
【００２６】
「体内の症状」、「体内の炎症症状」、および「虚血に関連する体内の症状」という用語は、最適な機能（例えば骨、心臓、肝臓、腎臓、大脳、皮膚の良好な連携）を実現するために必要な哺乳類の末端器官における、急性または不顕性の低酸素症および炎症が原因となって、個体の体の内部に生じる症状および疾患に関連する。
【００２７】
ここで使用する「生理的溶液」とは、ＰＢＭＣまたはそのサブセットの破壊を引き起こさない浸透圧を示す溶液を指し、個体に直接投与可能である。
【００２８】
「ＰＢＭＣ増殖物質およびＰＢＭＣ活性化物質を含有しない」という用語は、ＰＢＭＣを活性化し、ＰＢＭＣまたはそのサブセットの増殖を誘導する物質を含有しない生理的溶液を指す。このような物質の例としては、ＰＨＡ、ＬＰＳなどがある。
【００２９】
本発明の好適な実施形態によれば、上記炎症症状は、機能性を有する末端器官の低酸素症および炎症に関連する哺乳類の疾患からなる群より選択される。
【００３０】
本発明の特に好適な実施形態によれば、上記体内の炎症症状、好ましくは虚血に関連する体内の症状は、心筋虚血、肢虚血、組織の虚血、虚血再灌流障害、狭心症、冠動脈疾患、末梢血管疾患、末梢動脈疾患、脳卒中、虚血発作、心筋梗塞、うっ血性心不全、外傷、腸疾患、腸間膜梗塞、肺梗塞、骨折、歯を移植した後の組織の再生、自己免疫疾患、リウマチ性疾患、同種移植、および同種移植の拒絶からなる群より選択される。
【００３１】
末梢血単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ； ＰＢＭＣ）のサブセットは、好ましくはＴ細胞、Ｂ細胞、またはＮＫ細胞である。言うまでもなく、これらの細胞の組み合わせ、具体的にはＴ細胞とＢ細胞との組み合わせ、Ｔ細胞とＮＫ細胞との組み合わせ、Ｂ細胞とＮＫ細胞との組み合わせ、Ｔ細胞とＢ細胞とＮＫ細胞との組み合わせを使用することも可能である。これらの細胞を準備および単離する方法は公知である。
【００３２】
驚くべきことに、本発明のＰＢＭＣは、（先に定義したように）溶液が薬学的に許容不可能な物質を含有せず、ＰＢＭＣの突然死を引き起こさず、ＰＢＭＣを活性化せず、かつ、ＰＢＭＣの増殖を刺激しない限り、任意の種類の溶液中で培養可能であることがわかった。したがって、使用される溶液は、少なくともＰＢＭＣの溶解を引き起こさない浸透圧性を示す。生理的溶液は、好ましくは生理食塩水（好ましくは生理的ＮａＣｌ溶液）、全血、血液分画物（好ましくは血清）、または細胞培養培地である。
【００３３】
上記細胞培養培地は、好ましくはＲＰＭＩ、ＤＭＥＭ、Ｘ−ｖｉｖｏ、およびウルトラカルチャー（Ｕｌｔｒａｃｕｌｔｕｒｅ）からなる群より選択される。
【００３４】
本発明の特に好適な実施形態によれば、本発明のＰＢＭＣ細胞はストレスを誘発する条件下で培養される。
【００３５】
ここで使用する「ストレスを誘発する条件下」という用語は、ストレス細胞を引き起こす培養条件を指す。細胞においてストレスを引き起こす条件としては、例えば熱、化学物質、放射線、低酸素症、浸透圧（つまり非生理的な浸透圧条件）などがある。
【００３６】
本発明のＰＢＭＣ細胞にさらにストレスを加えると、体内の炎症症状、好ましくは虚血に関連する体内の症状の治療にとって有益な物質の発現および分泌が一層増加する。
【００３７】
本発明の好適な実施形態によれば、ストレスを誘発する条件には、低酸素症、オゾン、熱（例えば、ＰＢＭＣの最適な培養温度、つまり３７℃より２℃、好ましくは５℃、より好ましくは１０℃を超えて高い温度）、放射線（例えばＵＶ線やγ線）、化学物質、浸透圧（つまり、体液中で、特に血液中で通常生じる浸透圧条件に比べて少なくとも１０％高い浸透圧条件）、ｐＨの変化、またはこれらの組み合わせが含まれる。
【００３８】
放射線を利用して本発明のＰＢＭＣにストレスを与えるのであれば、好ましくは、ＰＢＭＣ細胞を、少なくとも１０Ｇｙ、好ましくは少なくとも２０Ｇｙ、より好ましくは少なくとも４０Ｇｙで暴露する。ここで、放射線の供給源として、好ましくは、Ｃｓ−１３７セシウムが使用される。
【００３９】
本発明の好適な実施形態によれば、不活性化ＰＢＭＣまたはそのサブセットを、培地中で少なくとも４時間、好ましくは少なくとも６時間、より好ましくは少なくとも１２時間培養する。
【００４０】
本発明に係る薬剤は、治療しようとする症状に応じて様々な方法で投与可能である。したがって、この薬剤は、好ましくは皮下投与、筋肉内投与、内器官投与（例えば心筋内への投与）および静脈内投与ができるように構成される。
【００４１】
本発明に係る薬剤は、薬学的に許容可能な賦形剤、例えば希釈剤、安定剤、担体などを包含してもよい。投与経路に応じて、本発明に係る薬剤は各剤形の形態（注射溶液など）で提供される。これを調製する方法は当業者にとって周知である。
【００４２】
本発明に係る薬剤の有効期間を伸ばすために、溶液ａ）または上清ｂ）は凍結乾燥される。このような調製物を凍結乾燥する方法は、当業者にとって周知である。
【００４３】
上記凍結乾燥された調製物を、使用前にバッファ、安定剤、塩などを含む水または水溶液と接触させてもよい。
【００４４】
本発明の他の態様は、上記において定義した薬剤を、体内の炎症症状（好ましくは虚血に関連する体内の症状）を治療するための薬物の製造のために用いる使用方法に関する。
【００４５】
本発明のさらにもう他の態様は、ここに開示する薬剤を調製する方法であって、ａ）末梢血単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ； ＰＢＭＣ）またはそのサブセットを準備する工程と、ｂ）工程ａ）のＰＢＭＣ細胞を、ＰＢＭＣ増殖物質およびＰＢＭＣ活性化物質を含有しない生理的溶液中で少なくとも１時間培養する工程と、ｃ）工程ｂ）の細胞および／またはこの細胞の上清を単離する工程と、ｄ）工程ｃ）の細胞および／または上清を用いて上記薬剤を調製する工程とを含む、方法に関する。
【００４６】
本発明に係る薬剤は、ＰＢＭＣを、生理的溶液中で少なくとも１時間、好ましくは少なくとも４時間、より好ましくは少なくとも８時間、さらにより好ましくは少なくとも１２時間インキュベートまたは培養することによって得ることができる。この工程において、ＰＢＭＣは、体内の炎症症状の治療において有用な物質の合成および分泌を開始する。上記培養工程の前、同工程の後、および同工程の途中で、ＰＢＭＣ細胞は、ＰＨＡまたはＬＰＳなどのＰＢＭＣを活性化する物質を添加することによって活性化されることがない。培養工程の後に、培養物からＰＢＭＣ細胞および／または上清は単離され、最終的な薬剤の調製においてさらに使用される。上述のように、上記薬剤は、培養したＰＢＭＣ、上記細胞をインキュベートした培養物の上清、または培養したＰＢＭＣと培地との両方を包含してもよい。
【００４７】
本発明の好適な実施形態によれば、上記細胞は、工程ｂ）の前または同工程の途中で、ストレスを誘発する条件に曝され、このストレスを誘発する条件には、低酸素症、オゾン、熱、放射線、化学物質、浸透圧（例えば、塩、特にＮａＣｌを添加して、浸透圧を血液中より高くすることによって誘発される）、ｐＨの変化（つまり、酸または水酸化物を添加してｐＨ値を６．５〜７．２または７．５〜８．０とすることによるｐＨ値の変化）、またはこれらの組み合わせが含まれる。
【００４８】
本発明の好適な実施形態によれば、上記細胞は、工程ｂ）の前または同工程の途中で、少なくとも１０Ｇｙ（好ましくは少なくとも２０Ｇｙ、より好ましくは少なくとも４０Ｇｙ）、オゾン、高温、またはＵＶ線に暴露される。
【００４９】
本発明の他の態様は、上述の方法によって得られる薬剤に関する。
【００５０】
本発明のさらに他の態様は、本発明に係る薬剤を適切な量で、必要とする個体に投与することによって、体内の炎症症状、好ましくは虚血に関連する体内の症状を治療する方法に関する。治療しようとする症状に応じて、本発明の薬剤は、筋肉内投与、静脈内投与、器官内投与（例えば心筋内投与）または皮下投与される。
【００５１】
本発明の好適な実施形態において、上記薬剤は、上記において概説した方法によって得られる１ｍｌあたり少なくとも５００個、好ましくは少なくとも１０００個、より好ましくは少なくとも１０５個、さらにより好ましくは少なくとも１０６個のＰＢＭＣを包含する。これに対応して、少なくとも５００個、好ましくは少なくとも１０００個、より好ましくは少なくとも１０５個、さらにより好ましくは少なくとも１０６個のＰＢＭＣが、治療対象である個体に投与される。
【００５２】
本発明を、以下の図面および例によってさらに説明する。ただし本発明はこれらに制限されるものではない。
【００５３】
図１中ａは、心エコー検査、組織学的検査、および免疫組織学的検査による心機能の評価における、実験プロトコルおよび実験時期を示している。図１中ｂは、１８時間の培養期間の後にアネキシンに対して陽性染色したＰＢＭＣであって、放射線の照射を受けたラットのＰＢＭＣおよび放射線の照射を受けていないラットのＰＢＭＣの比率を示している。
【００５４】
図２中ａでは、放射線を照射することによってヒトのＰＢＭＣではアポトーシスを引き起こし、アネキシンの発現が４８時間にわたって時間の経過と共に増加することを、ＦＡＣＳ分析によって示している。図２中ｂでは、ＬＰＳ刺激を受けたＰＢＭＣまたは単球を、放射線を照射したアポトーシス自系ＰＢＭＣと共にインキュベートすることによって、炎症促進性のサイトカインＩＬ−１βの分泌が投与量に応じて減少することが示されている。図２中ｃでは、程度は相対的に低いが、この知見は、ＩＡ−ＰＢＭＣの存在下における、ＬＰＳ刺激ＰＢＭＣおよび単球のＩＬ−６分泌プロファイルにも相関している。図２中ｄでは、ＬＰＳ刺激を伴う混合リンパ球の反応液に、自系ＩＡ−ＰＢＭＣを添加すると、１分毎に測定した（ｃｏｕｎｔｓ ｐｅｒ ｍｉｎｕｔｅ； ｃｐｍ）Ｔ細胞の増殖数が減少している。図２中ｅでは、ＶＥＧＦ、ＩＬ−８／ＣＸＣＬ８、およびＭＭＰの転写物のＲＴ−ＰＣＲ ＲＮＡ発現解析によって、２４時間の培養後に、放射線の照射を受けたＰＢＭＣにおいてＩＬ−８／ＣＸＣＬ８および特にＭＭＰ９の上方制御が起こったことが示されている。図２中ｆでは、ＶＥＧＦ、ＩＬ−８／ＣＸＣＬ８、およびＭＭＰ９のＥＬＩＳＡ解析によって、ＭＭＰ９は大部分が細胞溶解物質中に見られる一方で、ＶＥＧＦおよびＩＬ−８／ＣＸＣＬ８のタンパク質分泌の差が、生細胞においても、ＩＡ−ＰＢＭＣにおいても、ほぼ同じレベルのままであることが示されている。図２中ｇでは、生存ＰＢＭＣまたはＩＡ−ＰＢＭＣの細胞培養物から得られる上清中でインキュベートしたヒトの線維芽細胞が、ＲＴ−ＰＣＲ解析において、ＶＥＧＦ、ＩＬ−８／ＣＸＣＬ８、およびＭＭＰ９転写物の強い上方制御を示している。また、ピーク値は、ＩＡ−ＰＢＭＣの上清中でインキュベートされた線維芽細胞に見られた。
【００５５】
図３中ａ、図３中ｂ、図３中ｃに示すように、人工的に心筋梗塞を起こした後のラットにおいて、尾静脈を介して投与した、ＣＦＳＥで標識された同系ＰＢＭＣは、大部分が脾臓（図３中ｂ）において見られ、これよりは少ない個数が肝臓（図３中ａ）において見られたが、梗塞を起こした心臓（図３中ｃ）ではＰＢＭＣ細胞が全く見られなかった。図３中ｄ、図３中ｅ、図３中ｆに示すように、培地（図３中ｄ）または生存ＰＢＭＣ（図３中ｅ）のいずれかを注射したラットにおいてＨＥ染色した梗塞区域が、免疫細胞が浸潤した虚血の心筋に匹敵するパターンを示し、ＩＡ−ＰＢＭＣを与えられたラットから得られる組織が、非常に高い密度の浸潤を示唆している。図３中ｇ、図３中ｈ、図３中ｉでは、生細胞で治療されたラット（図３中ｈ）の方が、培地で治療されたラット（図３中ｇ）に比べて、梗塞部位において、ＣＤ６８＋で染色された細胞がわずかに多いことがわかる。これとは対照的に、ＩＡ−ＰＢＭＣを注射した動物（ラット）では、３倍の量のＣＤ６８＋が検出された。図３中ｊ、図３中ｋ、図３中ｌに示すように、生存ＰＢＭＣまたはＩＡ−ＰＢＭＣを投与した場合に比べて、培地だけを与えられたラットの方が、高いレベルのＳ１００β＋細胞が見られた。
【００５６】
図４中ａ、図４中ｂ、図４中ｃに示すように、培地（図４中ａ）または生細胞治療（図４中ｂ）の場合に比べて、ＩＡ−ＰＣＭＣを注射した動物から得られる梗塞を起こした心筋組織（ｃ）において、ほぼ４倍の量のＶＥＧＦについて陽性染色された細胞が検出された。図４中ｄ、図４中ｅ、図４中ｆに示すように、ＶＥＧＦ受容体のＫＤＲ／ＦＬＫ１について、同様の発現パターンが見られ、ピーク値は培地（図４中ｄ）および生細胞（図４中ｅ）ではなく、ＩＡ−ＰＢＭＣのグループ（図４中ｆ）において見られた。図４中ｇ、図４中ｈ、図４中ｉに示すように、３つのどのグループにおいてもＣＤ３４について差が検出されなかった。図４中ｊ、図４中ｋ、図４中ｌに示すように、梗塞を起こした心臓におけるマーカーｃ−キットについての免疫組織学的分析によると、ＩＡ−ＰＢＭＣ（図４中ｌ）を注射したラットでは、多量の陽性染色された細胞および高密度な局在性が示され、培地を与えられた動物（図４中ｊ）および生細胞を与えられた動物（図４中ｋ）では、それより少ない個数の細胞が示されている。
【００５７】
図５中ａ、図５中ｂ、図５中ｃに示すように、心筋梗塞（Ｅｌａｓｔｉｃａ ｖａｎ Ｇｉｅｓｏｎ染色法）の誘導から６週間後に外植された虚血性のラットの心臓の組織学的解析の結果である。培地を注射した動物（図５中ａ）から得られた心臓は、他に比べて拡張されているようであり、線維性組織が大きく広がっていた。生細胞を注射したラット（図５中ｂ）では瘢痕の広がりが低減し、拡張の徴候が他に比べて少なかった。瘢痕組織の形成の最低量は、ＩＡ−ＰＢＭＣを注射された動物（図５中ｃ）において検出された。図５中ｄに示すように、ＬＡＤの結紮から６週間後に収集された標本のプラニメーター分析によって得られたデータの統計解析の結果から、瘢痕の広がりの平均値は、培地を注射された動物では２４．９５％±３．６、生存ＰＢＭＣを注射された動物では１４．３％±１．３、ＩＡ−ＰＢＭＣを注射された動物では５．８％±２であることを示している（平均値＋ＳＥＭ）。図５中ｅ、図５中ｆ、図５中ｇでは、心エコー検査によって得られる心機能パラメータ（収縮分画率、駆出分画率、および収縮末期の直径）の評価によって、ＩＡ−ＰＢＭＣを注射した動物では、他に比べて、心筋梗塞後に良好に回復していることが示されている。
【００５８】
図６ａは、無刺激の生存ＰＢＭＣも、ＩＡ−ＰＢＭＣも、どちらも主に単球に由来する炎症促進性のサイトカインＴＮＦ−αを分泌しないことを示している。（有意性は次のとおりである：＊ｐ＝０．０５、＊＊ｐ＝０．００１；ｎ＝８）。
【００５９】
図６ｂは、無刺激のＰＢＭＣに比べると、炎症促進性のインターフェロンγの分泌が、活性化後に強く誘導されることを示している。（有意性は次のとおりである：＊ｐ＝０．０５、＊＊ｐ＝０．００１；ｎ＝８）。
【００６０】
図７ａは、フローサイメトリー法を用いた分析の結果を統合して示している。ＰＢＭＣをＴ細胞についてゲーティングし、活性化マーカーＣＤ６９およびＣＤ２５の発現を評価した。（有意性は次のとおりである：＊ｐ＝０．０５、＊＊ｐ＝０．００１；ｎ＝４）。
【００６１】
図７ｂは、いずれか（ＰＨＡ、ＣＤ３ ｍＡｂ）で活性化されたＰＢＭＣの代表的なＦＡＣＳ分析結果を示す。ゲーティング（ｇａｔｉｎｇ）は陽性細胞の比率を表わす。
【００６２】
図８は、刺激したＰＢＭＣを対象として、３［Ｈ］チミジン取り込み法によって測定した増殖速度が、ＲＰＭＩ中で無刺激で培養される生存ＰＢＭＣに比べて高いことを示している。
【００６３】
図９は、Ｔ細胞増殖アッセイにおいて、ＰＢＭＣセクレトームに対するＴ細胞の応答が阻害されることを示している。
【００６４】
図１０中ａ〜図１０中ｆは、インターロイキン−８、Ｇｒｏ−α、ＥＮＡ−７８、ＩＣＡＭ−１、ＶＥＧＦ、およびインターロイキン−１６の上清のレベルを示している。アポトーシスＰＢＭＣにおいては、血管新生および免疫抑制に関連するこれらのサイトカインおよびケモカイン（ｃｈｅｍｏｋｉｍｅ）の分泌パターンが、生細胞とは顕著に異なる。この効果は、細胞を高密度でインキュベートすると一層顕著であった。
【００６５】
図１１は、実験的にＬＡＤの結紮を実施してから６週間後の、心筋の瘢痕組織の広がりを（左心室を占める％で）示している。アポトーシス細胞に由来する細胞培養物の上清を注射した動物は、コラーゲンの堆積の大幅な減少、瘢痕の広がりの低減、および生存可能な心筋の増加を示す。
【００６６】
図１２中ａ〜図１２中ｃは、実験的に心筋梗塞を起こさせてから６週間後に外植されたラットの心臓の巨視的な外観を示している。放射線の照射を受けたアポトーシス細胞（図１２中ｃ）から得られた上清を注射した動物は、コラーゲンの堆積の減少、および梗塞領域が、培地（図１２中ａ）または生存細胞から得られる上清（図１２中ｂ）を注射したものに比べて非常に小さいことを示す。瘢痕組織は緑色に着色し、より良好に可視化できるようにする。
【００６７】
図１３中ａ〜図１３中ｄは、代表的な心エコー検査（Ｍモード）を示している。心機能は、ＩＡ−ＰＢＭＣの上清を注射したラット（図１３中ｃ）の方が、培地で処理したラット（図１３中ａ）および生細胞で処理したラット（図１３中ｂ）に比べてはるかに良好であった。偽処理を行ったラットから得られた心エコー検査法による撮影画像を図１３中ｄに示す。
【００６８】
図１４中ａおよび図１４中ｂは、心筋梗塞から６週間後に実施した心エコー検査による分析結果を示している。放射線の照射を受けたアポトーシスＰＢＭＣから得られた上清を用いて治療したラットは、培地を注射した動物または生細胞を培養した上清を注射した動物に比べて、はるかに良好な心機能を示している。
【００６９】
図１５は、４つの治療グループすべてのカプラン−マイヤー生存曲線（ｓｕｒｉｖｉａｌ ｃｕｒｖｅ）を示している。生存ＰＢＭＣ細胞培養物の上清を注射した動物も、アポトーシスＰＢＭＣ細胞培養物の上清を注射した動物も、どちらも、培地を注射したラットに比べて良好な生存率を示している。（ｐ＜０．１）。
【００７０】
図１６は、ＰＢＭＣを用いて実施した抗ＣＤ３およびＰＨＡ刺激実験を示している。
【００７１】
図１７は、抗ＣＤ３、ＰＨＡ、および混合リンパ球を用いて刺激をした際のＰＢＭＣの増殖を示している。
【００７２】
図１８は、ＰＢＭＣの上清を用いてインキュベートしたＣＤ４＋細胞の上清のアネキシンＶのレベルおよびＰＩの陽性度を示している。
【００７３】
図１９は、ＰＢＭＣの上清によってＣＤ４＋細胞におけるＣＤ２５およびＣＤ６９の上方制御が阻害されることを示している。
【００７４】
図２０は、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βを機能させないようにしても、ＣＤ４＋細胞の増殖速度が上昇しなかったことを示している。
【００７５】
〔実施例〕
〔実施例１〕
急性心筋梗塞（ａｃｕｔｅ ｍｙｏｃａｒｄｉｃａｌ ｉｎｆａｒｃｔ； ＡＭＩ）は、うっ血性心不全を引き起こすことが多い。現在の薬理学的および機械的な血行再建にもかかわらず、梗塞を起こした心筋を置換するような、効果的な治療法は実験的に確立されていない。ＡＭＩ後の再モデリング過程の不可欠な構成要素は、ＡＭＩ後の炎症反応および血管再生の進行である。これらの過程は、梗塞を起こした心筋中のサイトカインおよび炎症細胞によって媒介され、アポトーシス組織および壊死組織を貪食し、間質性樹状細胞（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ； ＩＤＣ）およびマクロファージの自動誘導を開始する。全身的な免疫抑制（ステロイド）によって梗塞のサイズが拡大し、心筋の治癒が遅延したので、ＡＭＩによって誘導される炎症反応を減弱させることを目的とする臨床治験を、実施した。以上のデータから、ＡＭＩ後の炎症応答が、組織の安定化および瘢痕の形成の原因であると結論した。離れた幹細胞が損傷部位を検知し、構造面の修復および機能面の修復を促進することを研究者が観察したときに、再生循環器学における新分野が出現した。この手法を用いて、Ｏｒｌｉｃらは、ｃ−キット陽性の血管内皮前駆細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ； ＥＰＣ）を、実験的なＡＭＩと増加した血管再生ならびに心筋構造および血管構造の再生との境界領域に注射した。この研究は、「細胞治療」の再生能力を実証する多数の発表の引き金となった。ただし、この治療効果が、移植した細胞自身によってもたらされたのか、常在性の心筋幹細胞の補充によってもたらされたのか、あるいは、未知のパラクリンおよび免疫性のメカニズムの活性化によってもたらされたのか、依然はっきりしないままである。梗塞した心筋における虚血はアポトーシス過程を引き起こし、死にかけている細胞の細胞表面の脂質の変化を惹起する。最もよく特徴がわかっている変化は、リン脂質の非対称の喪失およびホスファチジルセリン（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ； ＰＳ）の曝露である。これらのＰＳは、配位子（例えばトロンボスポンジン、ＣＤ１４、およびＣＤ３６）を介して、マクロファージおよび樹状細胞（抗原提示細胞、ＡＰＣ）によって認識される。これらの受容体は、生理的条件の下では、アポトーシス性および壊死性の組織片を貪食し、静かな「清掃」過程を開始するように作用する。このＡＰＣによる貪食過程は、表現型の抗炎症性反応を引き起こし、これは増大したＩＬ−１０およびＴＧＦ−βの生成および阻害されたＡＰＣの機能によって決定される。臨床的に関連する報告は、アポトーシス細胞の注射が、造血細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌ； ＨＣ）の移植モデルにおいて、同種のＨＣの移植および致死的な急性移植片対宿主病（ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ； ＧＶＨＤ）を遅延させることを実証した報告である。また、臓器移植モデルでは、ドナーのアポトーシス細胞を注射すると、心臓の移植片生着期間が長くなった。炎症とは反対に、また、骨髄（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ； ＢＭ）からの前駆細胞の補充に関連して、アポトーシス細胞のオプソニン作用によって、ＡＰＣによるＶＥＧＦおよびＣＸＣ８／ＩＬ−８の生成の増加が誘導されることが示された。この後者のサイトカインに加えて、ＭＭＰ９も、骨髄からのＥＰＣの補充および遊離にとって非常に重要であるということがわかった。
【００７６】
ＡＭＩの治療に関する現在の「状況」は、急性閉塞冠動脈の早期の再灌流および再開口に向けられており、この状況は心筋障害を増加させ、内在性の修復機構に対して反対に作用するが、梗塞後の心筋の炎症は有利であると考えられる。
【００７７】
〔物質および方法〕
〔ＰＢＭＣにおけるアポトーシスの誘導および上清の生成〕
生体内実験を実施するために、健康な若いボランティアから血液を採取した。インビボ（ラットのＰＢＭＣ）実験を実施するために、６０Ｇｙ（ヒトＰＢＭＣの場合）または４５ＧｙのＣｓ−１３７セシウムを照射することによって、アポトーシスを誘導した。０．２％のゲンタマイシン硫酸塩（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．社、アメリカ）、０．５％のβ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．社、アメリカ）、１％のＬ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．社、アメリカ）を含有するが、血清を含有しないＵｌｔｒａ Ｃｕｌｔｕｒｅ培地（Ｃａｍｂｒｅｘ Ｃｏｒｐ．、アメリカ）中に、細胞を再懸濁し、加湿雰囲気中で２４時間培養して、試験管内実験（細胞濃度、１×１０６ｍｌ）に備えた。アポトーシスの誘導を、アネキシンＶ−フルオレセイン／ヨウ化プロピジウム（ＦＩＴＣ／ＰＩ）の共染色（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、アメリカ）によって、フローサイトメーターで測定した。ＰＢＭＣのアネキシン陽性度を、＞７０％であると判断し、その結果、ＩＡ−ＰＢＭＣと称することにする。放射線の照射を受けていないＰＢＭＣをコントロールとして使用し、生存ＰＢＭＣと称することにする。上清を、どちらの実験的設定環境からも収集し、以下のように（ＳＮ−生存ＰＢＭＣ、ＳＮ−ＩＡ−ＰＢＭＣ）と記載し、実験用実体として使用した。
【００７８】
〔ＬＰＳ刺激実験〕
ヒトＰＢＭＣおよび単球（純度＞９５％）を、磁気ビーズシステム（Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社、アメリカ）を用いて分離した。互いに異なる濃度のアポトーシス自系ＰＢＭＣ（アネキシンの陽性度＞７０％）およびリポ多糖（１ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳ；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．社、アメリカ）を用いて、ＰＢＭＣおよび単球を４時間共インキュベートした。上清を確保し、次の試験まで−８０℃で凍結保管した。ＩＬ−６およびＩＬ−１βの放出量を、市販のＥＬＩＳＡキット（ＢｅｎｄｅｒＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ社、オーストリア）を用いて決定した。
【００７９】
〔単球に由来するＤＣの調製およびＴ細胞の刺激〕
ＰＢＭＣを、フィコール・パク（Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ：ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ社、スウェーデン）を用いた標準的な密度勾配遠心によって、健常なドナーのヘバリン処置した全血から単離した。Ｔ細胞および単球を、ＭＡＣＳ法（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）を用いた磁気的な選別によって分離した。ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３３、およびＭＨＣクラスＩＩの陽性細胞の、各単クローン抗体を用いた陰性除去によって、精製済みＴ細胞を得た。ビオチン化済みＣＤ１４ ｍＡｂ ＶＩＭ１３（純度９５％）を使用することによって、単球を濃縮した。精製済み血中単球をＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）とＩＬ−４（１００Ｕ／ｍｌ）とを組み合わせて用いて７日間培養することによって、ＤＣを生成した。次に、ＤＣに異なる刺激を与えた。大腸菌（血清型０１２７−Ｂ８、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｅ社）から得た１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳだけを２４時間添加するか、あるいは、ＬＰＳを２時間添加し、さらに樹状細胞をアポトーシス細胞とともに１：１の比で２２時間培養するかのいずれかによって、成熟を誘導した。また、アポトーシス細胞だけを用いて（１：１）、ＤＣを２４時間処理した。混合白血球反応（ＭＬＲ）を起こすために、同種間の、精製済みＴ細胞（１×１０５個／ウェル）を、９６個のウェルを有する細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ社）中で、異なる刺激を与えたＤＣを段階的に増やしながら６日間インキュベートした。３組の分析を実施した。５日後に添加する［メチル−３Ｈ］チミジン（ＩＣＮ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社）の取り込み量を測定することによって、Ｔ細胞の増殖を観察した。細胞を１８時間後に回収し、取り込まれた［メチル−３Ｈ］チミジンを、ミクロプレート・シンチレーションカウンターで検出した。
【００８０】
〔生存ＰＢＭＣ、ＩＡ−ＰＢＭＣ、およびＳＮに曝露された線維芽細胞の細胞培養、ＲＮＡ単離、およびｃＤＮＡ調製〕
ＩＡ−ＰＢＭＣ、生存ＰＢＭＣ（細胞は１×１０６個、どちらもＵｌｔｒａ Ｃｕｌｔｕｒｅの培地中で２４時間培養）、およびＳＮ−生存ＰＢＭＣ／ＳＮ−ＩＡ−ＰＢＭＣに曝露した線維芽細胞を（Ｃａｓｃａｄｅ Ｉｎｃ．（アメリカ）から入手した１×１０５個の線維芽細胞を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ、ＰＡＡ社、オーストリア）、２５ｍＭのＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ社、ＢＲＬ、アメリカ）、および１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ社）を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ社 ＢＲＬ、アメリカ）中で培養し、１２個のウェルを有するプレートに播種して調べた。線維芽細胞を、ＳＮ−生存ＰＢＭＣおよびＳＮ−ＩＡ−ＰＢＭＣを用いてそれぞれ４時間および２４時間共インキュベートした）。製造者の指示にしたがって（ＲＮｅａｓｙ（ＱｉＩＡＧＥＮ社、オーストリア）を用いて）、ＰＢＭＣおよび線維芽細胞のＲＮＡ抽出を実施した後、取扱説明書の記載にしたがってｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ合成キット（ＢｉｏＲａｄ社、アメリカ）を用いて、ｃＤＮＡを転写した。
【００８１】
〔定量的リアルタイムＰＣＲ〕
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ Ｆａｓｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ社、Ｐｅｎｚｂｅｒｇ、ドイツ）を製造者のプロトコルにしたがって用いて、ｍＲＮＡの発現を、リアルタイムＰＣＲによって定量化した。ＶＥＧＦのプライマーは、順方向が５´−ＣＣＣＴＧＡＴＧＡＧＡＴＣＧＡＧ−ＴＡＣＡＴＣＴＴ−３´、逆方向が５´−ＡＣＣＧＣＣＴＣＧＧＣＴＴＧＴＣＡＣ−３´であった。ＩＬ−８のプライマーは、順方向が５´−ＣＴＣＴＴＧＧＣＡＧＣＣＴＴＣＣＴＧＡＴＴ−３´、逆方向が５´−ＴＡＴＧＣＡＣＴＧＡＣＡＴＣＴＡＡＧＴＴＣＴＴＴＡＧＣＡ−３´であった。ＭＭＰ９のプライマーは、順方向が５´−ＧＧＧＡＡＧＡＴＧＣＴＧＧＴＧＴＴＣＡ−３´、逆方向が５´−ＣＣＴＧＧＣＡＧＡＡＡＴＡＧＧＣＴＴＣ−３´であった。β−２−ミクログロブリンβ ２Ｍのプライマーは、順方向が５´−ＧＡＴＧＡＧＴＡＴＧＣＣＴＧＣＣＧＴＧＴＧ−３´、逆方向が５´−ＣＡＡＴＣＣＡＡＡＴＧＣＧＧＣＡＴＣＴ−３´であった。標的遺伝子の相対的な発現量を、Ｗｅｌｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（Clinical Chemistry. 47 (2001) 654-660, 25）の式を用いてハウスキーピング遺伝子β２Ｍと比較することによって算出した。プライマー対の効率は記載にしたがって決定した（A. Kadl, et al. Vascular Pharmacology. 38 (2002) 219-227）。
【００８２】
〔培養後の生存ＰＢＭＣおよびＩＡ−ＰＢＭＣによる血管新生促進因子およびＭＭＰ９の放出〕
ＩＡ−ＰＢＭＣ（５×１０５個）および生存ＰＢＭＣを、加湿雰囲気中で２４時間インキュベートした。上清を２４時間後に収集し、−８０℃でただちに凍結し、評価を実施するまで凍結させた。各ＰＢＭＣ細胞の溶解液をコントロールとして使用した。血管新生促進因子（ＶＥＧＦ−Ａ、ＣＸＣＬ−８／ＩＬ−８、ＧＭＣＳＦ、ＧＣＳＦ）およびＭＭＰ９（つまり、ｃ−キット細胞に許容されている遊離因子）の放出を、製造業者の指示にしたがってＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ社、アメリカ）を使用して分析した。プレートを、Ｗａｌｌａｃ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ ｃｏｕｎｔｅｒ １４２０（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、アメリカ）を用いて、４５０ｎｍで読み取った。
【００８３】
〔ＡＭＩの生体内実験のための、同系ＩＡ−ＰＢＭＣおよび生存ＰＢＭＣの取得〕
生体内実験用に、同系のラットのＰＢＭＣを、前もってヘバリン処置しておいたラットから心臓を穿刺（ｐｕｎｃｔｕａｔｉｏｎ）することによって得られた全血から密度勾配遠心によって分離した。生体内実験を実施するために、Ｃｓ−１３７セシウムを４５Ｇｙで照射することによって、アポトーシスを誘導し、上述のように１８時間培養した（アネキシン染色＞ＩＡ−ＰＢＭＣの８０％、アネキシン染色＜生存ＰＢＭＣの３０％、１×１０６個／ｍｌ）。
【００８４】
〔心筋梗塞の誘発〕
上述のようにＬＡＤを結紮することによって、雄の成体のスプラーグドーリーラットにおいて心筋梗塞を誘導した（Ｔｒｅｓｃｈｅｒ Ｋ， ｅｔ ａｌ． Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｒｅｓ． ２００６： ６９（３）： ７４６−５４）。簡潔に説明すると、キシラジン（ｘｙｌａｚｉｎ）（１ｍｇ／身体重量１００ｇ）およびケタミン（ｋｅｔａｍｉｎ）（１０ｍｇ／身体重量１００ｇ）の混合物を用いて、動物に腹腔内麻酔し、機械を用いて人工呼吸を行った。左側方の開胸手術を実施し、６−０ ｐｒｏｌｅｎｅを用いて左心房の下方のＬＡＤの周囲を結紮した。虚血の開始直後に、０．３ｍｌの細胞培養培地に懸濁した８×１０６個のアポトーシスＰＢＭＣを、尾静脈を介して注射した。細胞培養培地だけの注射、生存ＰＢＭＣの注射、および偽処理を、それぞれ、この実験の設定環境においてネガティブコントロールとして使用した。ラットの実験計画を、図１（図１中ａ、図１中ｂ）に示す。
【００８５】
〔アポトーシス細胞の追跡〕
８×１０６個の同系のラットのＰＢＭＣを、１５μＭのカルボキシフルオセイン二酢酸サクシニミジルエステル（ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ； ＣＦＳＥ、Ｆｌｕｋａ Ｂｉｏ−Ｃｈｅｍｉｋａ社、Ｂｕｃｈｓ，スイス）を用いて室温で１０分間標識した。標識を、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を添加することによって停止させた。アポトーシスを誘導し（アネキシンＶ＞７０％）、結紮術後に細胞を注射した。手術の７２時間後にラットを屠殺し、肝臓、脾臓、および心臓を標準的な手順にしたがって処理し、凍結切片（ｎ＝４）を得た。試料を、上述のように共焦点レーザ走査顕微鏡法（ＺＥＩＳＳ ＬＳＭ ５１０レーザ走査顕微鏡、ドイツ）によって分析した（Ker-jaschki D, J Am Soc Nephrol. 2004; 15: 603-12）。
【００８６】
〔インビボの組織分析および免疫組織化学法〕
すべての動物を、実験的に梗塞を起こしてから７２時間後または６週間後に屠殺した。心臓を外植し、次に、梗塞を起こした最大の領域（ｎ＝８〜１０）を薄片化した。薄片を１０％の中性の緩衝化ホルマリンで固定し、（免疫）組織染色をするためにパラフィンに埋め込んだ。組織試料を、ヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）およびｅｌａｓｔｉｃ ｖａｎ Ｇｉｅｓｏｎ（ｅｖｇ）を用いて染色した。免疫組織的評価を、ＣＤ６８（ＭＣＡ ３４１Ｒ、ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ社、イギリス）、ＶＥＧＦ（０５−４４３、Ｕｐｓｔａｔｅ／Ｍｉｌｉｐｏｒｅ、アメリカ）、Ｆｌｋ−１（ｓｃ−６２５１、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、アメリカ）、ＣＤ３４（ｓｃ−５２４７８、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、アメリカ）、ｃ−キット（ｓｃ−１６８、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、アメリカ）、Ｓ１００β（ｓｃ−５８８４１、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、アメリカ）を対象とする以下の抗体を用いて実施した。組織試料を、Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｖａｎｏｘ ＡＨＢＴ３顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｖａｎｏｘ ＡＨＢＴ３、Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｃｏ． Ｌｔｄ．社、日本）を用いて拡大率×２００で評価し、ＰｒｏｇＲｅｓ Ｃａｐｔｕｒｅ−Ｐｒｏ Ｃ１２ ｐｌｕｓ カメラ（Ｊｅｎｏｐｔｉｋ Ｌａｓｅｒ Ｏｐｔｉｋ Ｓｙｓｔｅｍｅ ＧｍｂＨ社、ドイツ）を使用してデジタル方式で撮像した。
【００８７】
〔面積測定による心筋梗塞の大きさの決定〕
梗塞を起こした領域の大きさを決定するために、Ｉｍａｇｅ Ｊプラニメーター分析用ソフトウェア（Ｒａｓｂａｎｄ， Ｗ．Ｓ．， Ｉｍａｇｅ Ｊ， Ｕ． Ｓ． Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、アメリカ）を使用した。梗塞を起こした心筋組織の広がり（左心室における％）を、梗塞を起こした領域の外周の面積を左心室の心内膜および心外膜の外周の面積全体で割り算することによって算出した。壊死した領域が比較しやすいようにｅｖｇで染色した組織試料に対して、面積測定評価を実施した。梗塞の大きさを、左心室の面積全体に対する比率％で示す。
【００８８】
〔心エコー検査による心機能の評価〕
心筋梗塞の誘発の６週間後に、１００ｍｇ／ｋｇケタミン（ｋｅｔａｍｉｎ）および２０ｍｇ／ｋｇキシラジン（ｘｙｌａｚｉｎ）を用いて、ラットを麻酔した。Ｖｉｖｉｄ ５システム（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、アメリカ）を用いて、超音波検査を実施した。動物を割り当てられる投与グループに対して、経験豊富な観察者が盲検式で分析を行った（ＥＷ）。Ｍモード追跡を、傍胸骨の短軸図から記録し、機能的な収縮および拡張パラメータを得た。心室の直径および体積を、収縮期および拡張期において評価した。分画収縮率（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ）を下記のように算出した。
ＦＳ（％）＝（（ＬＶＥＤＤ−ＬＶＥＳＤ）／ＬＶＥＤＤ）×１００％
【００８９】
〔検定手法〕
ＳＰＳＳソフトウェア（ＳＰＳＳ Ｉｎｃ．、アメリカ）を用いて、統計解析を実施した。すべてのデータは、平均値±標準偏差として与えられている。Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｖ試験を利用して、正規分布を検証した。従属変数を対象とする対応のある両側ｔ検定、および独立変数を対象とする対応のないｔ検定を使用して、有意性を算出した。ボンフェローニ・ホルム補正を用いて、複数の試験のｐ値を調節した。ｐ値（＜０．０５）は、統計的に有意であると考えられた。
【００９０】
〔結果〕
〔セシウムの照射によるアポトーシスの誘導（ＩＡ−ＰＢＭＣ）〕
アポトーシス細胞の免疫調節能力を評価するために、まず、ヒトの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）において、セシウム照射によるアポトーシスの誘導に対する細胞の反応を、フローサイトメーターを用いて、アネキシン−Ｖ／ＰＩ染色を利用したフローサイトメトリーによって判定した。生存ＰＢＭＣと比較すると、セシウム照射したＰＢＭＣはアネキシンに対して時間に依存する陽性を示し、２４時間以内にピーク値を示した。生細胞をコントロールとして使用した（図２ａ）。アネキシン−Ｖ結合は、インビトロですべてさらに２４時間後に最高であったので、この培養期間後に調査を実施した（ＩＡ−ＰＢＭＣ）。生存ＰＢＭＣを、ＲＴ−ＰＣＲを用いた実験および上清を用いた実験において、コントロールとして使用した。
【００９１】
〔ＩＡ−ＰＢＭＣは、インビトロで免疫抑制特性を示す〕
インターロイキン−１βおよびＩＬ−６は、インビボにおける心筋梗塞の主要な炎症促進メディエーターであると考えられている。ＩＡ−ＰＢＭＣが細胞反応に対して効果を有するかどうかという仮説をテストするために、ヒトの単球およびＰＢＭＣをＩＡ−ＰＢＭＣとともに共インキュベートし、標的細胞をＬＰＳで刺激した。どちらの細胞型でも、ＥＬＩＳＡによって評価したところ、培養物中におけるＩＬ−１βおよびＩＬ−６の分泌が投与量に応じて減少することがわかった（図２中ｂ、図２中ｃ）。同系モデルにおけるＩＡ−ＰＢＭＣの抗増殖効果を検証するために、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を使用した。同系の精製済みＴ細胞を採用し、これらのエフェクター細胞を、ＩＡ−ＰＢＭＣに添加して、あるいは添加せずに、投与量を段階的に変化させた樹状細胞とともにインキュベートした。図２中ｄは、ＩＡ−ＰＢＭＣの共インキュベートによって、増殖速度が用量に応じて低下することを示している。
【００９２】
〔ＩＡ−ＰＢＭＣおよび生存ＰＢＭＣによって、ＶＥＧＦ、ＩＬ−８／ＣＸＬ８、およびＭＭＰ９のｍＲＮＡの転写が増加することの証明〕
ＥＰＣの分離に関連することが知られているタンパク質のｍＲＮＡの転写が、照射により増加するかどうかを調査するために、分離後、およびアポトーシスの誘導（２４時間）後に、ＰＢＭＣを分析した。生存ＰＢＭＣをコントロール（生存ＰＢＭＣまたはＩＡ−ＰＢＭＣ）として使用した。ＲＮＡ転写は、ＲＴ−ＰＣＲによって決定したＶＥＧＦの発現に比べてほとんど差を示さなかったが、ＩＬ−８／ＣＸＣＬ８およびＭＭＰ９の大幅な増加を示した。ＩＡ−ＰＢＭＣにおけるＩＬ−８／ＣＸＬ８の場合のピークとなる誘導は、それぞれ、生細胞における２倍に対して６倍であり、ＭＭＰ９の場合は５倍に対して３０倍であった（図２中ｅ）。
【００９３】
〔ＩＡ−ＰＢＭＣおよび生存ＰＢＭＣによる、血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）の遊離を引き起こすパラクリン因子の分泌〕
ＩＡ−ＰＢＭＣおよび生存ＰＢＭＣに由来するＳＮを、２４時間の培養の後に、ＥＬＩＳＡを使用して、ＶＥＧＦ、ＩＬ−８／ＣＸＣＬ８、ＧＭＣＳＦ、ＧＣＳＦ、およびＭＭＰ９について定量した。図２中ｆからわかるように、ＶＥＧＦ、ＩＬ−８／ＣＸＣＬ８、およびＭＭＰ９は増加を示した。ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦは検出されなかった。注目すべきは、ＭＭＰ９が細胞溶解物においてピーク値を示すという知見であった。
【００９４】
〔ＩＡ−ＰＢＭＣおよび生存ＰＢＭＣに由来するＳＮによる、間葉系の線維芽細胞における血管新生促進性ｍＲＮＡ転写の増加〕
骨髄中の間質細胞は構造的には線維芽細胞であるから、線維芽細胞とＩＡ−ＰＢＭＣおよび生存ＰＢＭＣに由来するＳＮとの共インキュベーションには、ＥＰＣ分離の原因となる、ＶＥＧＦ、ＩＬ−８／ＣＸＣＬ８、およびＭＭＰ９のｍＲＮＡ転写因子を増加させる能力があるかどうかを調べることが必要であった。ＲＴ−ＰＣＲを４時間後および２４時間後に実施した。ＩＡ−ＰＢＭＣ ＳＮ中で培養された細胞におけるＩＬ−８／ＣＸＣＬ８について、最高レベルの誘導が検出された。誘導レベルは、コントロールに比べると４時間後にほぼ１２０倍に到達した。この反応は２４時間後にも存在する。同等の反応がＶＥＧＦの場合に見られた。その一方で、ＭＭＰ９の上方制御は、主に２４時間が経過してから見られた。このデータは、ＢＭにおける血管新生促進効果の原因となる、線維芽細胞によるｍＲＮＡの生成量の増加を促進するパラクリン因子を、ＳＮが含んでいることを示唆している（図２中ｇ）。
【００９５】
〔ラットの心筋梗塞モデルにおける、ＣＦＳＥ標識ＩＡ−ＰＢＭＣの養子移植〕
培養されたＩＡ−ＰＢＭＣはインビトロでは抗炎症性でもあり、血管新生促進性でもあることは証明できたので、ＩＡ−ＰＢＭＣおよび生存ＰＢＭＣを、急性のラットＡＭＩモデルに注射した。まず、これらの培養細胞が梗塞後にどこに自動誘導されているのかを決定することが必要であった。ＬＡＤの動脈結紮の直後に、ＣＦＳＥ標識ＩＡ−ＰＢＭＣをラットの尾静脈に注射した。代表的な組織像は、図３中ａ、図３中ｂ、図３中ｃに示すとおりである。ＣＦＳＥ ＩＡ−ＰＢＭＣは大部分が、脾臓組織および肝組織において７２時間以内に捕捉される。心臓で観察された細胞はなかった。
【００９６】
〔ＩＡ−ＰＢＭＣで処理したＡＭＩにおける、転送された初期炎症の免疫反応〕
Ｈ．Ｅ．染色をさらに詳しく調べると、コントロールの梗塞および生存白血球（生存ＰＢＭＣ）で処理したＡＭＩのラットは、創傷領域において、肉芽組織に応じた混合細胞浸潤を示し、ＡＭＩから７２時間以内に多量の好中球、マクロファージ／単球、リンパ単核細胞、線維芽細胞、および活性化された増殖性内皮細胞が、ジストロフィーの心筋細胞と混合されていた（図３中ｄ、図３中ｅ）。その一方で、ＩＡ−ＰＢＭＣで処理したＡＭＩのラットは、好酸球性の細胞質、高密度な核、および円形状から紡錘形状の形態を有する中程度の大きさの単球様の細胞からなる創傷領域において、高密度で単形性の浸潤を示した（図３中ｆ）。また、リンパ単核細胞、特に血漿細胞、線維芽細胞、および内皮細胞は、ほとんど検出できなかった。免疫組織学的解析によって、ＩＡ−ＰＢＭＣ ＡＭＩのラットにおける細胞浸潤は、残りの２つのグループでは非常に弱い、大量のＣＤ６８＋単球／マクロファージ（図３中ｉ）からなることがわかった（それぞれ、ＭＣＩ、生存ＰＢＭＣ、ＩＡ−ＰＢＭＣ、強拡大視野、ＨＰＦ、６０．０±３．６、７８．３±３．８、２８５．０±２３．０（ＳＥＭ））（図３中ｇ、図３中ｈ）。ビメンチンについて陽性の間葉系細胞の含有物は、すべてのグループにおいて同様であった。その一方で、Ｓ１００＋樹状細胞は、コントロール梗塞（処置グループ（図３中ｊ、図３中ｋ、図３中ｈの代表的な組織像、ｎ＝５）に比べると、それぞれ、ＡＭＩ、生存ＰＢＭＣ、ＩＡ−ＰＢＭＣ、ＨＰＦ １５．６±１．７、１２．４±２．３、８．４±１．２（ＳＥＭ））において、多く見られた。
【００９７】
〔ＩＡ−ＰＢＭＣで処理したＡＭＩにおけるＶＥＧＦ＋、Ｆｌｋ１＋、およびｃ−キット＋細胞の初期自動誘導〕
ＩＡ−ＰＢＭＣは、好酸球性の細胞質および高密度な核を有する中程度の大きさの単球様の細胞からなる創傷領域において、高密度で単形性の浸潤を示したので、血管再生および再生力に関連する複数の表面マーカーを調査した。ＩＡ−ＰＢＭＣで処理したＡＭＩグループにおいてＨ．Ｅ．染色で特定されるこの細胞集団は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦａ）、Ｆｌｋ−１、およびｃ−キット（ＣＤ１１７）について、非常に高い陽性の染色を示した（図４中ｃ、図４中ｆ、図４中ｉ）。どちらのマーカーの発現も、コントロールＡＭＩおよび生存ＰＢＭＣで処理したＡＭＩグループにおいて低下した（図４中ａ、図４中ｂ、図４中ｄ、図４中ｅ、図４中ｊ）。興味深いことに、ＩＡ−ＰＢＭＣで処理したＡＭＩは、細胞が非常に密集している梗塞を起こした領域の内部において、ＣＤ３４＋細胞の増加を示した。なお、この領域は、コントロール（Ｇ、Ｈ）に比べて、３４＋細胞（Ｉ）のコロニー形成を推定的に指す、血管の構造に由来している（代表的な組織像、ｎ＝５）。
【００９８】
〔ＩＡ−ＰＢＭＣで処理したＡＭＩにおける減弱した梗塞のサイズ〕
心筋梗塞を誘発させてから６週間後に外植した心臓から得た、ＥＶＧで染色した組織試料に対して実施したプラニメーター分析において、生理食塩水を与えられたラットは、左心室の２４．９５％±３．５８（ＳＥＭ）を超えて延び、拡張の徴候を有するコラーゲンの瘢痕を示す。ＩＡ−ＰＢＭＣで処理したラットでは、これらの徴候はほとんど抑止され、梗塞のサイズは５．８１％±２．０２（ＳＥＭ）であった。なお、生存ＰＢＭＣで処理したラットの梗塞のサイズ１４．３％±１．７（ＳＥＭ）であった（図５中ａ、図５中ｂ、図５中ｃ）。
【００９９】
〔ＩＡ−ＰＢＭＣで処理したＡＭＩでは、ＬＶ機能が向上する〕
同系培養ＩＡ−ＰＢＭＣを静脈内に注入すると、生存ＰＢＭＣまたは培地で処置した動物に比べて、心エコー検査のパラメータが大幅に向上する。収縮分画率（ＳＦ）は、偽処理を行った動物では２９．１６％±４．６５（ＳＥＭ）、培地で処理したＡＭＩ動物では１８．７６％±１．１３（ＳＥＭ）、生存ＰＢＭＣで処理したＡＭＩグループでは１８．４６％±１．６７（ＳＥＭ）、ＩＡ−ＰＢＭＣで処理したラットでは２５．１４％±２．６６（ＳＥＭ）であった（図５ｅ）。駆出分画率（ＥＦ）は、偽処理を行ったラットでは６０．５８％±６．８１（ＳＥＭ）であり、培地で処理したＡＭＩの動物では４２．９１％±２．１４（ＳＥＭ）まで低下、生存ＰＢＭＣを与えられた動物では４２．２４％±３．２８（ＳＥＭ）まで低下した。その一方で、ＩＡ−ＰＢＭＣで処理したラットは、ＥＦが５３．４６％±４．２５であった。
【０１００】
収縮末期の直径および拡張終期の直径（ＬＶＥＳＤ、ＬＶＥＤＤ）、ならびに収縮末期の容積および拡張終期の容積（ＬＶＥＳＶ、ＬＶＥＤＶ）の分析は、先に観察された値に匹敵するパターンを示した。生理食塩水を与えた動物および生存ＰＢＭＣで処理したラットは、ＬＶＥＤＤ値がそれぞれ１０．４３ｍｍ±０．２１（ＳＥＭ）および１１．０３ｍｍ±０．４０であった。ＩＡ−ＰＢＭＣで処理したラットでも、左心室の拡張期の直径が、偽処理を行った動物の９．４７ｍｍ±０．６４と比較するとわずかに低減し、８．９９ｍｍ±０．３２であった。収縮期の直径の差はこれほど顕著ではなかったが、同一レベル（パネル５（ａ、ｂ、ｃ）であった。
【０１０１】
〔結論〕
これらの知見によって、放射線の照射を受けたアポトーシスＰＢＭＣ（ＩＡ−ＰＢＭＣ）が、インビトロで免疫抑制を誘導すること、および血管新生促進タンパク質の分泌に関連することが実証された。したがって、培養済み生存ＰＢＭＣおよびＩＡ−ＰＢＭＣを急性のラットＡＭＩモデルに注射し、この治療法がＦＬＫ１＋／ｃ−キット＋陽性のＥＰＣの梗塞心筋への大量の自動誘導を７２時間以内に惹起し、６週間以内に有意な機能回復を引き起こすことを実証した。
【０１０２】
ＩＡ−ＰＢＭＣを免疫アッセイ中で共培養すると、ＩＬ−１βおよびＩＬ−６の生成が低下し、同種の樹状の混合リンパ球反応（ＭＬＲ）が減弱した。免疫のパラメータはどちらも、心筋虚血後の炎症において役割を有すると考えられた。さらに、生存ＰＢＭＣおよびＩＡ−ＰＢＭＣは、２４時間以内に培地にＣＸＣＬ８／ＩＬ−８およびＭＭＰ９を分泌することが示された。これらのタンパク質は、血管再生の原因およびＥＰＣがＢＭから虚血心筋へ補充される原因であると考えられた。ＣＸＣＬ８／ＩＬ−８ケモカインは、内皮細胞に結合し、内皮細胞に対する強力な化学走性の活性を有する、小さな（＜１０ｋＤａ）各種ヘパリン結合性ポリペプチドからなるＣＸＣＬファミリーに属する。Ｎ末端（Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ、ＥＬＲモチーフ）における３つのアミノ酸残基が、内皮細胞上のＣＸＣ受容体１および２への、ＣＸＣケモカイン（例えばＩＬ−８およびＧｒｏ−α）の結合を決定し、内皮の化学遊走および血管新生を促進している。さらに、このマトリクスプロテイナーゼがキット配位子（ｓＫｉｔＬ）を放出するシグナルとして作用することから、ＭＭＰ９の分泌がＥＰＣ動員の中心的な役割をはたしていることがわかった。なお、キット配位子（ｓＫｉｔＬ）とは、ＢＭにおいて内皮および造血幹細胞（ＥＰＣ）が無活動状態の状態から増殖性の状態へ転移する原因となるケモカインである。さらに別のインビトロ分析では、培養された生存ＰＢＭＣおよびＩＡ−ＰＢＭＣに由来する上清（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ；ＳＮ）が、間葉系の線維芽細胞において、ＣＸＣＬ８／ＩＬ−８およびＭＭＰ９のｍＲＮＡ転写を強化する能力を有していることを実証することができた。以上のデータは、生存ＰＢＭＣおよび放射線の照射を受けたＰＢＭＣに由来するＳＮが、ｃ−キット＋ＥＰＣを循環中に溶出させるＢＭにおける、生物学的な状況を与えるパラクリン因子を含有することを示唆している。
【０１０３】
このインビボの培養細胞の懸濁液における何かしらの薬効を証明するために、開胸心筋損傷のモデル、およびラットの動物モデルにおいて、ＬＡＤの結紮直後に、培養し注射した生存ＰＢＭＣおよびＩＡ−ＰＢＭＣを使用した。最初のテストでは、ＣＳＦＥで標識されたＩＡ−ＰＢＭＣの大部分が脾臓および肝臓において捕捉されることが証明された。以上のデータは、「細胞治療」が梗塞心筋では自動誘導されないことを示唆している。これとは対照的に、パラクリン効果は、「修正済み」培地だけによってであっても、または細胞培養懸濁液の暴露に起因する惹起された「免疫が媒介するサイトカインストーム」によってであっても、ＡＭＩの再生効果の原因となる可能性の方がはるかに高い。急性虚血直後の炎症が室の拡張を決定するので、ＡＭＩから７２時間後の組織学的解析への道筋が実施された。ＩＡ−ＰＢＭＣで処理したラットが、この期間における、ＣＤ６８＋およびＶＥＧＦａ／ＦＬＫ１／ｃ−キット＋陽性のＥＰＣ細胞集団における大量の自動誘導の証拠となることも示すことができた。一方、さらに多くのＳ１００β陽性の樹状細胞がコントロールＡＭＩ中に見られた。このことは、コントロールＡＭＩにおけるＡＰＣに基づく炎症が増加したことを示唆している。
【０１０４】
ＩＡ−ＰＢＭＣで処理したラットにおいて見られた結果は、部分的には、心筋梗塞の自然な進行に関して現在認容されている知識と相容れない。炎症に関しては、再設計過程は、通常の条件下では梗塞心筋中のサイトカインおよび炎症細胞によって媒介され、このサイトカインおよび炎症細胞が、壊死組織の食作用および融食作用、サバイビン筋細胞の肥大、血管新生、および（程度は限られているが）前駆細胞の増殖を特徴とする創傷修復過程を開始させる。梗塞後の炎症反応を介在する、ここまでの説明において紹介したどの実験手法も、ＡＭＩモデルにとっては有害であることが示された。この組織に関する短期データを解釈する際には、ＡＭＩ中におけるＩＡ−ＰＢＭＣ細胞の培地であった懸濁液によって、炎症からｃ−キット＋ＥＰＣ修復相への高度な遷移が起こることが示される。従来の研究では、ＡＭＩ後の循環前駆体細胞治療の骨髄が、該細胞の心筋細胞への分化転換が起きているかどうかに関わらず、心機能を改善することが確認されている。ｃ−キット＋ＥＰＣについては、骨髄に由来する細胞は、心臓の修復に必須の大切な役割を有していると考えられる。イマチニブメシル酸塩を用いた薬理学的な阻害およびｃ−キット＋ＥＰＣの非動員によって、ＡＭＩ後の筋線維芽細胞の反応性が減弱し、心機能の急激な衰弱がともなった。
【０１０５】
これらの結果は、「同系」培養されたＩＡ−ＰＢＭＣを、ＡＭＩを患う患者に注射することが再生力を有することを示しており、また、急性のＡＭＩを患う患者は、自己（つまり、治療を受ける患者または同じ種から採取された）ＩＡ−ＰＢＭＣを注射されることによって利点を享受することを示唆している。
【０１０６】
〔実施例２：静止末梢血単核球（ｒｅｓｔｉｎｇ ＰＢＭＣ）による、低活性マーカーおよび炎症性サイトカイン産生の減少の証明〕
活性化された末梢血単核球（ＰＢＭＣ）およびその上清（ＳＮ）は、創傷の再生において有益であると考えられている（Holzinger C et al. Eur J Vasc Surg. 1994 May; 8(3): 351-6.）。不活性化ＰＢＭＣおよび不活性化ＰＢＭＣに由来するＳＮには、実験的な急性心筋梗塞（ＡＭＩ）および創傷を形成したモデルにおいて薬効があることが、実施例１において示された。ＰＢＭＣの不活性化は実験的に検証されなければならないので、ＰＢＭＣの培養が、Ｔ細胞活性化マーカー（ＣＤ６９、ＣＤ２５）の強化または炎症性サイトカインの分泌（単球の活性化＝ＴＮＦα、Ｔ細胞活性化＝ＩＮＦγ）の強化につながるかどうかを調べた。対照実験では、培養されたＴ細胞が、ＣＤ３ ｍＡｂ刺激または植物性血球凝集素（Ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ； ＰＨＡ）によって誘導される。
【０１０７】
〔方法および結果〕
健常人からの静脈血をＥＤＴＡ管に収集した。フィコール・ハイパック密度勾配分離（ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｒａｄｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）を実施した後に、ＰＢＭＣを収集し、生存細胞と放射線の照射を受けたアポトーシス細胞（ＩＡ−ＰＢＭＣ）とに分けた。アポトーシス細胞を得るために、ＰＢＭＣを６０Ｇｙ（セシウム１３７）に暴露した。フローサイメトリー法による分析を実施するために、５００，０００個のＰＢＭＣを２００μｌの無血清培地中で培養した。細胞に対してＰＨＡ（７μｇ／ｍｌ）もしくはＣＤ３−ｍＡｂ（１０μｇ／ｍｌ）で刺激を与えるか、または刺激を全く与えなかった。２４時間のインキュベーションの後に、細胞を洗浄し、ＣＤ３、ＣＤ６９、およびＣＤ２５について染色（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ社）し、ＦＣ５００（Ｃｏｕｌｔｅｒ社）で表面活性化マーカーについて評価した。ＥＬＩＳＡアッセイを実施するために、ＰＢＭＣを、ＰＨＡ刺激またはＣＤ３刺激を与えるものと与えないものとに分けて、２．５×１０６個／ｍｌの密度で一晩培養した。２４時間後に、上清を回収し、−２０℃で凍結させた。ＴＮＦ−α（Ｒ＆Ｄ社）用およびＩＮＦ−γ（Ｂｅｎｄｅｒ社）用の市販のＥＬＩＳＡキットを購入した。簡潔に説明すると、ＭａｘｉＳｏｒｐプレートをＴＮＦ−αおよびＩＮＦ−γに対する抗体でコーティングし、一晩保存した。２４時間後に、プレートを洗浄し、試料を各ウェルに２個ずつ添加した。インキュベーションならびに検出用抗体およびＳｔｒｅｐ−ｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰの添加の後、ＴＭＢ基質を各ウェルに添加した。発色後、スルヒック酸（ｓｕｌｐｈｉｃ ａｃｉｄ）を添加することによって、酵素反応を停止させた。光学濃度値を、Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ３プレート読み取り装置で読み取った。
【０１０８】
〔結果〕
ＦＡＣＳ分析
ＣＤ３で刺激されたＴ細胞およびＰＨＡで刺激されたＴ細胞は、２４時間のインキュベーション後に、活性化マーカーＣＤ６９およびＣＤ２５の上方制御を示した。無刺激の細胞およびアポトーシス細胞は、ほんのわずかな量のＣＤ６９およびＣＤ２５を発現させるだけであった（図６中ａ（代表的な試料、図６中ｂ、ヒストグラム、ｎ＝４）。統計的有意性は星印で表わす（ｘｘｐ＜０．００１、ｘｐ＜０．０５）。
【０１０９】
ＥＬＩＳＡ分析
無刺激のＰＢＭＣに由来する上清においてはＴＮＦ−αもＩＮＦ−γもいずれも検出されなかったが、ＰＨＡまたはＣＤ３で刺激を与えたＰＢＭＣから得られた上清は、ＥＬＩＳＡ分析が示唆するように、これらのサイトカインが高い値であることを示した（星印＊＊ｐ＜０．００１、＊ｐ＜０．０５、ｎ＝８）。この結果は、無刺激のＰＢＭＣとは炎症性サイトカインの分泌パターンが異なることを明確に示している。
【０１１０】
〔結論〕
以上のデータは、「無刺激ＰＢＭＣ」が、刺激ＰＢＭＣ（ＰＨＡおよびＣＤ３ ｍＡｂ）とは異なる別の表現型（活性化マーカー、サイトカインの分泌）であることを示唆している。
【０１１１】
図６中ａは、無刺激の生存ＰＢＭＣも、ＩＡ−ＰＢＭＣも、どちらも主に単球に由来する炎症促進性のサイトカインＴＮＦ−αを分泌しないことを示している。（有意性は次のとおりである：＊ｐ＝０．０５、＊＊ｐ＝０．００１；ｎ＝８）。
【０１１２】
図６中ｂは、無刺激のＰＢＭＣに比べると、炎症促進性のインターフェロンγの分泌が、活性化後に強く誘導されることを示している。（有意性は次のとおりである：＊ｐ＝０．０５、＊＊ｐ＝０．００１；ｎ＝８）。
【０１１３】
図７中ａは、フローサイメトリー法を用いた分析の結果を統合して示している。ＰＢＭＣをＴ細胞に対してゲーティングし、活性化マーカーＣＤ６９およびＣＤ２５の発現を評価した。（有意性は次のとおりである：＊ｐ＝０．０５、＊＊ｐ＝０．００１；ｎ＝４）。
【０１１４】
図７中ｂは、いずれか（ＰＨＡ、ＣＤ３ ｍＡｂ）で活性化されたＰＢＭＣの代表的なＦＡＣＳ分析結果を示す。ゲーティング（ｇａｔｉｎｇ）は陽性細胞の百分率を表わす。
【０１１５】
〔実施例３：生理的溶液中で培養されるＰＢＭＣの増殖活性〕
本実施例の目的は、特異的（ＣＤ３）、非特異的（レクチン、ＰＨＡ）、および同種のＴ細胞の誘発（混合リンパ球反応、ＭＬＲ）を、２日（ＣＤ３、ＰＨＡ）および５日（ＭＬＲ）間の刺激アッセイにおいて利用する免疫アッセイに比べると、ＰＢＭＣは増殖活性を有しないことを証明することである。
【０１１６】
〔物質および方法〕
ＰＢＭＣを、フィコール密度勾配遠心法によって若い健常人から分離し、０．２％のゲンタマイシン硫酸塩（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．社、アメリカ）および１％のＬ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．社、アメリカ）を含有するＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ社、アメリカ）中で、２００μＬにつき細胞１×１０５個の割合で再懸濁した。レスポンダー細胞に、ＭｏＡｂによってＣＤ３（１０μｇ／ｍｌ、ＢＤ社、ＮＪ、アメリカ）、ＰＨＡ（７μＬ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．社、アメリカ）に対して刺激を与えるか、あるいは、放射線の照射を受けた同種のＰＢＭＣを１：１の比（ＭＬＲの場合）で用いることによって刺激を与えた。プレートを４８時間または５日間インキュベートし、その後、３［Ｈ］チミジン（３．７×１０４Ｂｑ／ウェル；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、スウェーデン）を用いて１８時間パルスを与えた。細胞を回収し、３［Ｈ］チミジンの取り込み量を液体シンチレーション計数器において測定した。
【０１１７】
〔結果〕
刺激ＰＢＭＣは、３［Ｈ］チミジン取り込み法によって測定した増殖速度が、ＲＰＭＩ中で無刺激で培養される生存ＰＢＭＣに比べて高いことを示した（図８）。この効果は、Ｔ細胞に特異的な刺激（ＰＨＡ、ＣＤ３）を付加することによって、増殖が抗原提供細胞（ＭＬＲ）によって誘導されたアッセイにおいても、観察された。
【０１１８】
〔結論〕
この一連の実験は、培養液中で最長５日間まで保持される生存ＰＢＭＣが増殖しない一方で、異なる方法で刺激を与えられたＰＢＭＣは顕著な増殖反応を示したことを示唆している。以上のデータから、無刺激でＰＢＭＣを培養しても増殖反応を引き起こさないと結論できる。
【０１１９】
〔実施例４：無菌培養条件の下で保管された分離ＰＢＭＣのセクレトームが有する新たな血管新生能〕
血管再生と炎症とはインビボにおいて強く関連しているので、これらのＰＢＭＣのセクレトームがＴ細胞に対して抗増殖効果をも示し、その結果、炎症の免疫反応に干渉するかどうかを調べた。
【０１２０】
〔物質および方法〕
フィコール密度勾配遠心法によって若い健常人から分離したＰＢＭＣ（２．５×１０６個／ｍｌ）を、０．２％のゲンタマイシン硫酸塩（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．社、アメリカ）および１％のＬ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．社、アメリカ）を含有するＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ社、ＣＡ、アメリカ）中で２４時間インキュベートすることによって、セクレトームを得た。上清を細胞分画から分離し、−８０℃で保存した。増殖アッセイを実施するために、分離後に、同種のＰＢＭＣを２００μＬのＲＰＭＩにつき細胞１×１０５個の割合で再懸濁した。レスポンダー細胞として、ＭｏＡｂによってＣＤ３（１０μｇ／ｍｌ、ＢＤ社、アメリカ）またはＰＨＡ（７μＬ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．社、アメリカ）に対して刺激を与えた。上清の異なる希釈物を添加した。プレートを４８時間インキュベートし、その後、３［Ｈ］−チミジン（３．７×１０４Ｂｑ／ウェル；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、スウェーデン）を用いて１８時間パルスを与えた。細胞を回収し、３［Ｈ］−チミジンの取り込み量を液体シンチレーション計数器において測定した。
【０１２１】
〔結果〕
３［Ｈ］−チミジン取り込み法によって測定する増殖速度は、同種のＰＢＭＣのセクレトームにおいて、正のコントロールに比べて有意に低減することを示した（図９）。この効果は用量に依存し、ＰＨＡ刺激時とともに、抗ＣＤ３刺激時にも観察された。
【０１２２】
〔結果に基づく示唆〕
この一連の実験は、生存ＰＢＭＣから得られるセクレトームを２４時間培養液中に保持すると、有意な抗増殖効果をインビトロで示すことを示唆している。以上のデータは、ＰＢＭＣに由来する上清または凍結乾燥された状態にある上清は、低酸素症によって誘発される炎症またはその他の高炎症疾患（例えば自己免疫疾患、炎症性皮膚疾患など）に関連するヒトの疾患を治療するための、治療用処方物として作用する潜在的な可能性があることを示唆している。
【０１２３】
〔実施例５：末梢血単核球が分泌するパラクリン因子による心機能の保存〕
実施例１では、末梢血液に由来し、放射線の照射を受けた培養後のアポトーシス細胞を注射することによって、ラットにおける実験的な心筋梗塞の後の機能的な心臓の回復が大幅に改善されることが示された。この改善は、アポトーシス細胞が持つ免疫を抑制する特性、血管新生促進効果、およびｃ−キット＋血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）の増大した自動誘導の誘導に基づいている。
【０１２４】
本実施例では、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）（生存ＰＢＭＣまたは６０Ｇｒａｙの放射線の照射を受けたＰＢＭＣ）を２４時間インキュベートし、細胞培養物の上清を生成した。上清を凍結乾燥し、生体内実験において使用するまで凍結したまま保管した。左前側の下行動脈を結紮することによって、スプラーグドーリーラットにおいて心筋梗塞を誘導した。虚血の開始後に、凍結乾燥していた上清を再懸濁し、静脈内に注射した。組織学的評価および免疫組織学的な評価を行うために、心筋梗塞から３日後および６週間後に組織試料を採取した。ＡＭＩから６週間後の心エコー検査によって、心機能を評価した。偽処理を行った動物および無処置の動物を、コントロールとして使用した。
【０１２５】
アポトーシスＰＢＭＣから得られた上清を注射したラットは、コントロールに比べると、心筋の血管新生が増加し、および血管内皮前駆細胞の自動誘導の強化を７２時間以内に示した。線維症の領域のプラニメーター評価は、アポトーシス細胞から得られた上清を用いて治療した動物では梗塞のサイズが低減したことを示唆していた。さらに、心エコー検査は、駆出分画率の損失の減弱および室の形状の保存によって証明されるように、ＡＭＩ後の再設計について大きな改善を示した。アポトーシス細胞から得られた上清を与えたラットにおける左室駆出分画（ＬＶＥＦ）は平均値が５６±４％であり、一方で、偽処理を行った動物の場合には６０±５％であった。また、無処置の動物または生細胞の上清を注射した動物は、それぞれ４４±３％および４１±４％にまで、ＬＶＥＦが大きく衰弱した（ｐ＜０．００１）。
【０１２６】
以上のデータは、実験的ＡＭＩにおいて放射線の照射を受けたアポトーシスＰＢＭＣに由来する上清を注射することによって、炎症が回避でき、心室機能の保存につながる再生ＥＰＣの優先的な自動誘導を引き起こすことを示唆している。
【０１２７】
〔方法〕
〔インビトロアッセイにおけるヒトＰＢＭＣの細胞培養〕
ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、上述のフィコール密度勾配遠心法（Ｆｉｃｏｌｌ ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｒａｄｅ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）によって採取した。ヒトＰＢＭＣにおいてアポトーシスを誘導するために、細胞に６０Ｇｙの放射線を照射した（ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ ａｕｔｏｍａｔ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｂｌｏｏｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ、Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｖｉｅｎｎａ）。生存ＰＢＭＣおよび放射線の照射を受けたアポトーシス（ＩＡ−）ＰＢＭＣを、どちらも各種の細胞密度（１×１０６、５×１０６、１０×１０６、および２５×１０６個の細胞／ミリリットル、ｎ＝５）で３７℃で２４時間インキュベートした。その後、上清を得て、分泌されるタンパク質のレベルを、製造業者が提供するプロトコルにしたがって、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ社、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、アメリカ）によって測定した。
【０１２８】
〔ＡＭＩ生体内実験のための同系ＩＡ−ＰＢＭＣおよび生存ＰＢＭＣの取得〕
生体内実験に用いる同系ラットのＰＢＭＣを、前もってヘバリン処置しておいたラットから、右心房を穿刺することによって得られた全血から、密度勾配遠心法によって分離した。生体内実験を行うために、４５ＧｙのＣｓ−１３７セシウムを照射することによって、アポトーシスを誘導し、３７℃で２５×１０６個の細胞／ミリリットルの細胞密度で培養した。照射によるアポトーシスの誘導を、フローサイトメトリー（ＩＡ−ＰＢＭＣの場合はアネキシンＶ染色＞８０％、生存ＰＢＭＣの場合はアネキシンＶ染色＜２０％）によって測定した。細胞を加湿雰囲気（５％ ＣＯ２、３７℃、相対湿度９５％）中で２４時間インキュベートした。上清を除去し、５０ｍＭの酢酸アンモニウムに対して３．５ｋＤａのカットオフ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｒｅｄａ、オランダ）で４℃で一晩透析した。その後、上清を無菌濾過し、凍結乾燥した。凍結乾燥したセクレトームを−８０℃で保存し、実験を行うたびに新たに再懸濁した。セクレトームを無作為抽出して、そのｐＨ値を計測した。凍結乾燥した粉末を、次の実験を実施するまで−８０℃で保存した。
【０１２９】
〔心筋梗塞の誘発〕
ウイーン医科大学動物研究委員会（ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ ａｎｉｍａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｖｉｅｎｎ）から、動物実験の許可を得た。実験はすべて米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ （ＮＩＨ））が発行するＧｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓにしたがって実施した。左前側の下行動脈（ＬＡＤ）を結紮することによって、雄の成体スプラーグドーリーラットにおいて、心筋梗塞を誘導した。簡潔に説明すると、キシラジン（ｘｙｌａｚｉｎ）（１ｍｇ／身体重量１００ｇ）およびケタミン（ｋｅｔａｍｉｎ）（１０ｍｇ／身体重量１００ｇ）の混合物を用いて、動物に腹腔内麻酔し、機械を用いて人工呼吸を行った。左側方の開胸術を実施し、６−０ ｐｒｏｌｅｎｅを用いて左心房の下方のＬＡＤの周囲を結紮した。虚血の開始直後に、０．３ｍｌ細胞培養培地中に再懸濁された８×１０６個のアポトーシスＰＢＭＣから得られた、凍結乾燥させた上清を、大腿静脈に注射した。細胞培養培地だけの注射、生存ＰＢＭＣの上清の注射、および偽処理を、それぞれ、この実験の設定環境において、ネガティブコントロールとして使用した。実験設計を図１に示す。
【０１３０】
〔インビボにおける組織学および免疫組織化学〕
実施例１を参照する。
【０１３１】
〔プラニメーター分析による心筋梗塞のサイズの決定〕
実施例１を参照する。
【０１３２】
〔心エコー検査による心機能の評価〕
実施例１を参照する。
【０１３３】
〔検定手法〕
ソフトウェア（Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ、アメリカ）を用いて統計解析を実施した。すべてのデータを、平均値±標準誤差として与える。従属変数を対象とする対応のある両側ｔ検定、および独立変数を対象とする対応のないｔ検定を使用して有意性を算出した。
【０１３４】
急性の心筋梗塞の生存率のグループ間の差を、カプラン−マイヤー保険統計解析法によって比較した。ボンフェローニ・ホルム補正を使用して、複数の試験のｐ値を調節した。ｐ値＜０．０５は、統計的に有意であると考えられた。
【０１３５】
〔結果〕
〔ＥＬＩＳＡによるＩＡ−ＰＢＭＣおよび生存ＰＢＭＣが分泌するパラクリン因子の決定〕
結果を図１０〜１５に示す。
【０１３６】
〔実施例６：末梢血単核球が分泌するパラクリン因子が有する免疫抑制特性〕
実施例１では、急性心筋梗塞（ａｃｕｔｅ ｍｙｏｃａｒｄｉｃａｌ ｉｎｆａｒｃｔ； ＡＭＩ）の動物モデルにおける、ＰＢＭＣセクレトームの抗炎症効果が示された。本実施例では、ＡＭＩを誘発後のＰＢＭＣセクレトームの適用が、免疫応答を大きく下方制御することによって心筋の炎症性損傷を阻害することを示す。
【０１３７】
これらの知見に基づいて、試験管内実験におけるセクレトームの考え得る免疫抑制効果について調べた。ＣＤ４＋細胞は、免疫過程において、他の白血球（例えばマクロファージ、Ｂ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞など）の補助にとって重要であって、免疫反応の統合において鍵となる役割を果たす。
【０１３８】
〔物質および方法〕
〔ＰＢＭＣセクレトームの生成〕
健常人から得られるＰＢＭＣを、フィコール密度勾配遠心法によって分離した。細胞を、Ｕｌｔｒａ Ｃｕｌｔｕｒｅの培地（Ｌｏｎｚａ社、Ｂａｓｅｌ、スイス）中で１×１０６個／ｍｌ（ｓｕｐ ｌｉｖ）の濃度で再懸濁した。アポトーシスＰＢＭＣからセクレトームを生成するために、６０Ｇｙ（ｓｕｐ ＡＰＡ）を照射することによって、アポトーシスを誘導した。細胞を、加湿雰囲気（５％ ＣＯ２、３７℃、相対湿度９５％）下で２４時間インキュベートした。上清を除去し、５０ｍＭの酢酸アンモニウムに対して３．５ｋＤａのカットオフ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｒｅｄａ、オランダ）で４℃で一晩透析した。その後、上清を無菌濾過し、凍結乾燥した。凍結乾燥したセクレトームを−８０℃で保存し、実験を行うたびに新たに再懸濁した。セクレトームを無作為抽出して、そのｐＨ値を計測した。
【０１３９】
〔ＣＤ４細胞の分離〕
ＭＡＣＳビーズシステム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）を使用して、ＣＤ４＋Ｔ細胞以外の細胞を枯渇させることによって、ＣＤ４＋細胞を分離した。細胞を新たに準備し、ただちに各実験に使用した。
【０１４０】
〔アポトーシスの測定〕
アポトーシスを、市販のアネキシンＶ／ＰＩキット（ＢＤ社、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、アメリカ）を用いてフローサイトメトリーによって検出した。アポトーシスをアネキシン陽性染色法によって定義し、後期アポトーシスをＰＩの陽性度によって定義した。
【０１４１】
〔増殖実験〕
ＰＢＭＣまたは精製済みＣＤ４＋細胞を、９６個の丸底ウェルを有するプレートにおいて、０．２％のゲンタマイシン硫酸塩（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．社、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、アメリカ）、０．５％のβ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．社、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、アメリカ）、および１％のＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ（インビトロゲン社、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、アメリカ）を補充したＵｌｔｒａ Ｃｕｌｔｕｒｅ中で、１×１０５個／ウェルの濃度にまで希釈した。ＰＨＡ（７μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．社、アメリカ）、ＣＤ３（１０μｇ／ｍｌ、ＢＤ社、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、アメリカ）、ＩＬ−２（１０Ｕ／ｍｌ、ＢＤ社、アメリカ）を用いて、または放射線の照射を受けた（６０Ｇｙ）同種のＰＢＭＣを１：１の比で用いて、ＭＬＲを得るために、細胞に刺激を与えた。細胞を、複数の濃度のＰＢＭＣセクレトーム、ＩＬ−１０、またはＴＧＦ−βを用いて４８時間または５日間（ＭＬＲ）インキュベートした。その後、３［Ｈ］チミジン（３．７×１０４Ｂｑ／ウェル；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）を用いて、細胞に１８時間パルスを与えた。細胞を回収し、３［Ｈ］チミジンの取り込み量を液体シンチレーション計数器において測定した。
【０１４２】
〔活性化マーカー〕
精製済みＣＤ４＋細胞を、抗ＣＤ３（１０μｇ／ｍｌ）を用いて刺激し、複数の濃度のＰＢＭＣセクレトームで共インキュベートした。細胞を、標準的なフローサイメトリー法の染色プロトコルにしたがって、ＣＤ６９およびＣＤ２５について染色し、フローサイトメーターＦＣ５００（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ、アメリカ）で分析した。
【０１４３】
〔結果〕
予備実験において、生細胞（ｓｕｐ ｌｉｖ）から得られるＰＢＭＣの上清の抗増殖特性について試験を行った。抗ＣＤ３刺激実験およびＰＨＡ刺激実験では、増殖速度が、セクレトーム（ｎ＝１０）を添加することによって大幅に低下した。
【０１４４】
これらの細胞は、免疫反応を始動および継続させる際に中心的役割を果たすので、これらの知見に基づいて、Ｔヘルパー細胞の区画に対するＰＢＭＣセクレトームの効果を評価した。図１６と同様に、非常に高度に精製されたＣＤ４＋細胞は、セクレトームを添加することによって増殖能を喪失した。この現象は、放射線の照射を受けたアポトーシスＰＢＭＣ（図１７、ｎ＝５）の上清の場合にも、生存ＰＢＭＣの上清の場合にも観察された。
【０１４５】
次の工程は、細胞生存率に対するセレクトームの考え得る効果を決定することである。したがって、静止ＣＤ４＋細胞を、上清およびアネキシンＶを用いてイノキュベートし、ＰＩの陽性度を評価した。生存ＰＢＭＣから得られる上清も、アポトーシスＰＢＭＣから得られる上清も、どちらも顕著なアポトーシス促進効果を示した（図１８、ｎ＝５）。
【０１４６】
ＰＢＭＣセクレトームがＣＤ４＋細胞活性化を阻害することができるかどうかを試してみるために、ＣＤ４＋細胞の抗ＣＤ３刺激に続いて、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ２５およびＣＤ６９を評価した。どちらのマーカーの上方制御も、ＰＢＭＣセクレトームによって大幅にかつ用量に応じて阻害された（図１９、ｎ＝５）。
【０１４７】
最後の一連の実験では、これらの実験において中和抗体を添加することによる、免疫抑制サイトカインＩＬ−１０およびＴＧＦ−βの効果について検討した。ＩＬ−１０も、ＴＧＦ−βも、これらのサイトカインの効果を失わせても増殖速度は上昇しなかったので（図２０、ｎ＝５）、本発明のＰＢＭＣセクレトームの抗増殖効果の原因ではなかった。
【０１４８】
〔結論〕
これらの実験によって、ＰＢＭＣのセレクトームがインビトロで免疫抑制特性を有することが初めて示された。上清は、ａ）抗ＣＤ３刺激実験、ＰＨＡ刺激実験、およびＭＬＲ刺激実験において増殖速度を低下させ、ｂ）Ｔ細胞の誘導時にＣＤ４＋細胞のアポトーシスを誘導し活性化を阻害する効力を有することが示された。
【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１】図１中ａは、心エコー検査、組織学的検査、および免疫組織学的検査による心機能の評価における、実験プロトコルおよび実験時期を示している。図１中ｂは、１８時間の培養期間の後にアネキシンに対して陽性染色したＰＢＭＣであって、放射線の照射を受けたラットのＰＢＭＣおよび放射線の照射を受けていないラットのＰＢＭＣの比率を示している。
【図２】図２中ａでは、放射線を照射することによってヒトのＰＢＭＣではアポトーシスを引き起こし、アネキシンの発現が４８時間にわたって時間の経過と共に増加することを、ＦＡＣＳ分析によって示している。図２中ｂでは、ＬＰＳ刺激を受けたＰＢＭＣまたは単球を、放射線を照射したアポトーシス自系ＰＢＭＣと共にインキュベートすることによって、炎症促進性のサイトカインＩＬ−１βの分泌が投与量に応じて減少することが示されている。図２中ｃでは、程度は相対的に低いが、この知見は、ＩＡ−ＰＢＭＣの存在下における、ＬＰＳ刺激ＰＢＭＣおよび単球のＩＬ−６分泌プロファイルにも相関している。図２中ｄでは、ＬＰＳ刺激を伴う混合リンパ球の反応液に、自系ＩＡ−ＰＢＭＣを添加すると、１分毎に測定した（ｃｏｕｎｔｓ ｐｅｒ ｍｉｎｕｔｅ； ｃｐｍ）Ｔ細胞の増殖数が減少している。図２中ｅでは、ＶＥＧＦ、ＩＬ−８／ＣＸＣＬ８、およびＭＭＰの転写物のＲＴ−ＰＣＲ ＲＮＡ発現解析によって、２４時間の培養後に、放射線の照射を受けたＰＢＭＣにおいてＩＬ−８／ＣＸＣＬ８および特にＭＭＰ９の上方制御が起こったことが示されている。図２中ｆでは、ＶＥＧＦ、ＩＬ−８／ＣＸＣＬ８、およびＭＭＰ９のＥＬＩＳＡ解析によって、ＭＭＰ９は大部分が細胞溶解物質中に見られる一方で、ＶＥＧＦおよびＩＬ−８／ＣＸＣＬ８のタンパク質分泌の差が、生細胞においても、ＩＡ−ＰＢＭＣにおいても、ほぼ同じレベルのままであることが示されている。図２中ｇでは、生存ＰＢＭＣまたはＩＡ−ＰＢＭＣの細胞培養物から得られる上清中でインキュベートしたヒトの線維芽細胞が、ＲＴ−ＰＣＲ解析において、ＶＥＧＦ、ＩＬ−８／ＣＸＣＬ８、およびＭＭＰ９転写物の強い上方制御を示している。また、ピーク値は、ＩＡ−ＰＢＭＣの上清中でインキュベートされた線維芽細胞に見られた。
【図３】図３中ａ、図３中ｂ、図３中ｃに示すように、人工的に心筋梗塞を起こした後のラットにおいて、尾静脈を介して投与した、ＣＦＳＥで標識された同系ＰＢＭＣは、大部分が脾臓（図３中ｂ）において見られ、これよりは少ない個数が肝臓（図３中ａ）において見られたが、梗塞を起こした心臓（図３中ｃ）ではＰＢＭＣ細胞が全く見られなかった。図３中ｄ、図３中ｅ、図３中ｆに示すように、培地（図３中ｄ）または生存ＰＢＭＣ（図３中ｅ）のいずれかを注射したラットにおいてＨＥ染色した梗塞区域が、免疫細胞が浸潤した虚血の心筋に匹敵するパターンを示し、ＩＡ−ＰＢＭＣを与えられたラットから得られる組織が、非常に高い密度の浸潤を示唆している。図３中ｇ、図３中ｈ、図３中ｉでは、生細胞で治療されたラット（図３中ｈ）の方が、培地で治療されたラット（図３中ｇ）に比べて、梗塞部位において、ＣＤ６８＋で染色された細胞がわずかに多いことがわかる。これとは対照的に、ＩＡ−ＰＢＭＣを注射した動物（ラット）では、３倍の量のＣＤ６８＋が検出された。図３中ｊ、図３中ｋ、図３中ｌに示すように、生存ＰＢＭＣまたはＩＡ−ＰＢＭＣを投与した場合に比べて、培地だけを与えられたラットの方が、高いレベルのＳ１００β＋細胞が見られた。
【図４】図４中ａ、図４中ｂ、図４中ｃに示すように、培地（図４中ａ）または生細胞治療（図４中ｂ）の場合に比べて、ＩＡ−ＰＣＭＣを注射した動物から得られる梗塞を起こした心筋組織（ｃ）において、ほぼ４倍の量のＶＥＧＦについて陽性染色された細胞が検出された。図４中ｄ、図４中ｅ、図４中ｆに示すように、ＶＥＧＦ受容体のＫＤＲ／ＦＬＫ１について、同様の発現パターンが見られ、ピーク値は培地（図４中ｄ）および生細胞（図４中ｅ）ではなく、ＩＡ−ＰＢＭＣのグループ（図４中ｆ）において見られた。図４中ｇ、図４中ｈ、図４中ｉに示すように、３つのどのグループにおいてもＣＤ３４について差が検出されなかった。図４中ｊ、図４中ｋ、図４中ｌに示すように、梗塞を起こした心臓におけるマーカーｃ−キットについての免疫組織学的分析によると、ＩＡ−ＰＢＭＣ（図４中ｌ）を注射したラットでは、多量の陽性染色された細胞および高密度な局在性が示され、培地を与えられた動物（図４中ｊ）および生細胞を与えられた動物（図４中ｋ）では、それより少ない個数の細胞が示されている。
【図５】図５中ａ、図５中ｂ、図５中ｃに示すように、心筋梗塞（Ｅｌａｓｔｉｃａ ｖａｎ Ｇｉｅｓｏｎ染色法）の誘導から６週間後に外植された虚血性のラットの心臓の組織学的解析の結果である。培地を注射した動物（図５中ａ）から得られた心臓は、他に比べて拡張されているようであり、線維性組織が大きく広がっていた。生細胞を注射したラット（図５中ｂ）では瘢痕の広がりが低減し、拡張の徴候が他に比べて少なかった。瘢痕組織の形成の最低量は、ＩＡ−ＰＢＭＣを注射された動物（図５中ｃ）において検出された。図５中ｄに示すように、ＬＡＤの結紮から６週間後に収集された標本のプラニメーター分析によって得られたデータの統計解析の結果から、瘢痕の広がりの平均値は、培地を注射された動物では２４．９５％±３．６、生存ＰＢＭＣを注射された動物では１４．３％±１．３、ＩＡ−ＰＢＭＣを注射された動物では５．８％±２であることを示している（平均値＋ＳＥＭ）。図５中ｅ、図５中ｆ、図５中ｇでは、心エコー検査によって得られる心機能パラメータ（収縮分画率、駆出分画率、および収縮末期の直径）の評価によって、ＩＡ−ＰＢＭＣを注射した動物では、他に比べて、心筋梗塞後に良好に回復していることが示されている。
【図６ａ】図６ａは、無刺激の生存ＰＢＭＣも、ＩＡ−ＰＢＭＣも、どちらも主に単球に由来する炎症促進性のサイトカインＴＮＦ−αを分泌しないことを示している。（有意性は次のとおりである：＊ｐ＝０．０５、＊＊ｐ＝０．００１；ｎ＝８）。
【図６ｂ】図６ｂは、無刺激のＰＢＭＣに比べると、炎症促進性のインターフェロンγの分泌が、活性化後に強く誘導されることを示している。（有意性は次のとおりである：＊ｐ＝０．０５、＊＊ｐ＝０．００１；ｎ＝８）。
【図７ａ】図７ａは、フローサイメトリー法を用いた分析の結果を統合して示している。ＰＢＭＣをＴ細胞についてゲーティングし、活性化マーカーＣＤ６９およびＣＤ２５の発現を評価した。（有意性は次のとおりである：＊ｐ＝０．０５、＊＊ｐ＝０．００１；ｎ＝４）。
【図７ｂ】図７ｂは、いずれか（ＰＨＡ、ＣＤ３ ｍＡｂ）で活性化されたＰＢＭＣの代表的なＦＡＣＳ分析結果を示す。ゲーティング（ｇａｔｉｎｇ）は陽性細胞の比率を表わす。
【図８】図８は、刺激したＰＢＭＣを対象として、３［Ｈ］チミジン取り込み法によって測定した増殖速度が、ＲＰＭＩ中で無刺激で培養される生存ＰＢＭＣに比べて高いことを示している。
【図９】図９は、Ｔ細胞増殖アッセイにおいて、ＰＢＭＣセクレトームに対するＴ細胞の応答が阻害されることを示している。
【図１０】図１０中ａ〜図１０中ｆは、インターロイキン−８、Ｇｒｏ−α、ＥＮＡ−７８、ＩＣＡＭ−１、ＶＥＧＦ、およびインターロイキン−１６の上清のレベルを示している。アポトーシスＰＢＭＣにおいては、血管新生および免疫抑制に関連するこれらのサイトカインおよびケモカイン（ｃｈｅｍｏｋｉｍｅ）の分泌パターンが、生細胞とは顕著に異なる。この効果は、細胞を高密度でインキュベートすると一層顕著であった。
【図１１】図１１は、実験的にＬＡＤの結紮を実施してから６週間後の、心筋の瘢痕組織の広がりを（左心室を占める％で）示している。アポトーシス細胞に由来する細胞培養物の上清を注射した動物は、コラーゲンの堆積の大幅な減少、瘢痕の広がりの低減、および生存可能な心筋の増加を示す。
【図１２】図１２中ａ〜図１２中ｃは、実験的に心筋梗塞を起こさせてから６週間後に外植されたラットの心臓の巨視的な外観を示している。放射線の照射を受けたアポトーシス細胞（図１２中ｃ）から得られた上清を注射した動物は、コラーゲンの堆積の減少、および梗塞領域が、培地（図１２中ａ）または生存細胞から得られる上清（図１２中ｂ）を注射したものに比べて非常に小さいことを示す。瘢痕組織は緑色に着色し、より良好に可視化できるようにする。
【図１３】図１３中ａ〜図１３中ｄは、代表的な心エコー検査（Ｍモード）を示している。心機能は、ＩＡ−ＰＢＭＣの上清を注射したラット（図１３中ｃ）の方が、培地で処理したラット（図１３中ａ）および生細胞で処理したラット（図１３中ｂ）に比べてはるかに良好であった。偽処理を行ったラットから得られた心エコー検査法による撮影画像を図１３中ｄに示す。
【図１４】図１４中ａおよび図１４中ｂは、心筋梗塞から６週間後に実施した心エコー検査による分析結果を示している。放射線の照射を受けたアポトーシスＰＢＭＣから得られた上清を用いて治療したラットは、培地を注射した動物または生細胞を培養した上清を注射した動物に比べて、はるかに良好な心機能を示している。
【図１５】図１５は、４つの治療グループすべてのカプラン−マイヤー生存曲線（ｓｕｒｉｖｉａｌ ｃｕｒｖｅ）を示している。生存ＰＢＭＣ細胞培養物の上清を注射した動物も、アポトーシスＰＢＭＣ細胞培養物の上清を注射した動物も、どちらも、培地を注射したラットに比べて良好な生存率を示している。（ｐ＜０．１）。
【図１６】図１６は、ＰＢＭＣを用いて実施した抗ＣＤ３およびＰＨＡ刺激実験を示している。
【図１７】図１７は、抗ＣＤ３、ＰＨＡ、および混合リンパ球を用いて刺激をした際のＰＢＭＣの増殖を示している。
【図１８】図１８は、ＰＢＭＣの上清を用いてインキュベートしたＣＤ４＋細胞の上清のアネキシンＶのレベルおよびＰＩの陽性度を示している。
【図１９】図１９は、ＰＢＭＣの上清によってＣＤ４＋細胞におけるＣＤ２５およびＣＤ６９の上方制御が阻害されることを示している。
【図２０】図２０は、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βを機能させないようにしても、ＣＤ４＋細胞の増殖速度が上昇しなかったことを示している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
体内の炎症症状（好ましくは虚血に関連する体内の症状）を治療するための薬剤であって、
ａ）末梢血単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ； ＰＢＭＣ）またはそのサブセットを含有する生理的溶液、または
ｂ）上記溶液ａ）の上清を包含し、
上記溶液ａ）が、ＰＢＭＣまたはそのサブセットを、ＰＢＭＣ増殖物質およびＰＢＭＣ活性化物質を含有しない生理的溶液中で、少なくとも１時間培養することによって得られる、薬剤。
【請求項２】
上記炎症症状が、心筋虚血、肢虚血、組織の虚血、虚血再灌流障害、狭心症、冠動脈疾患、末梢血管疾患、末梢動脈疾患、脳卒中、虚血発作、心筋梗塞、うっ血性心不全、外傷、腸疾患、腸間膜梗塞、肺梗塞、骨折、歯を移植した後の組織の再生、自己免疫疾患、リウマチ性疾患、同種移植、および同種移植の拒絶からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
上記末梢血単核球（ＰＢＭＣ）のサブセットが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、またはＮＫ細胞であることを特徴とする、請求項１または２に記載の薬剤。
【請求項４】
上記生理的溶液が、生理食塩水（好ましくは生理的ＮａＣｌ溶液）、全血、血液分画物（好ましくは血清）、または細胞培養培地であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項５】
上記細胞培養培地が、ＲＰＭＩ、ＤＭＥＭ、Ｘ−ｖｉｖｏ、およびウルトラカルチャー（Ｕｌｔｒａｃｕｌｔｕｒｅ）からなる群より選択されることを特徴とする、請求項４に記載の薬剤。
【請求項６】
上記ＰＢＭＣが、ストレスを誘発する条件の下で培養されたものであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項７】
上記ストレスを誘発する条件には、低酸素症、オゾン、熱、放射線、化学物質、浸透圧、ｐＨの変化、またはこれらの組み合わせが含まれることを特徴とする、請求項６に記載の薬剤。
【請求項８】
上記ＰＢＭＣまたはそのサブセットが、少なくとも１０Ｇｙ（好ましくは少なくとも２０Ｇｙ、より好ましくは少なくとも４０Ｇｙ）、オゾン、高温、またはＵＶ線によって培養中にストレスを与えられたものであることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の薬剤であって、皮下投与、筋肉内投与、器官内投与、および静脈内投与を実施できるように構成されたことを特徴とする、薬剤。
【請求項１０】
上記溶液ａ）または上記上清ｂ）が凍結乾燥されたものであることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項１１】
上記ＰＢＭＣまたはそのサブセットが、上記溶液中で少なくとも４時間（好ましくは少なくとも６時間、より好ましくは少なくとも１２時間）培養されたものであることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の薬剤を、体内の炎症症状（好ましくは虚血に関連する体内の症状）を治療するための薬物の製造のために用いる使用方法。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の薬剤を調製する方法であって、
ａ）末梢血単核球（ＰＢＭＣ）またはそのサブセットを準備する工程と、
ｂ）上記工程ａ）のＰＢＭＣを、ＰＢＭＣ増殖物質およびＰＢＭＣ活性化物質を含有しない生理的溶液中で少なくとも１時間培養する工程と、
ｃ）上記工程ｂ）の細胞および／またはこの細胞の上清を単離する工程と、
ｄ）上記工程ｃ）の細胞および／または上清を用いて上記薬剤を調製する工程とを含む、方法。
【請求項１４】
上記工程ｂ）の前または上記工程ｂ）の途中で、上記ＰＢＭＣを、ストレスを引き起こす条件に暴露し、
上記ストレスを引き起こす条件には、低酸素症、オゾン、熱、放射線、化学物質、浸透圧、ｐＨの変化、またはこれらの組み合わせが含まれることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
上記工程ｂ）の前または上記工程ｂ）の途中で、上記ＰＢＭＣが、少なくとも１０Ｇｙ（好ましくは少なくとも２０Ｇｙ、より好ましくは少なくとも４０Ｇｙ）、オゾン、高温、またはＵＶ線に暴露されることを特徴とする、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１３または１５に記載の方法によって得られる薬剤。
【請求項１】
体内の炎症症状（好ましくは虚血に関連する体内の症状）を治療するための薬剤であって、
ａ）末梢血単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ； ＰＢＭＣ）またはそのサブセットを含有する生理的溶液、または
ｂ）上記溶液ａ）の上清を包含し、
上記溶液ａ）が、ＰＢＭＣまたはそのサブセットを、ＰＢＭＣ増殖物質およびＰＢＭＣ活性化物質を含有しない生理的溶液中で、少なくとも１時間培養することによって得られる、薬剤。
【請求項２】
上記炎症症状が、心筋虚血、肢虚血、組織の虚血、虚血再灌流障害、狭心症、冠動脈疾患、末梢血管疾患、末梢動脈疾患、脳卒中、虚血発作、心筋梗塞、うっ血性心不全、外傷、腸疾患、腸間膜梗塞、肺梗塞、骨折、歯を移植した後の組織の再生、自己免疫疾患、リウマチ性疾患、同種移植、および同種移植の拒絶からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
上記末梢血単核球（ＰＢＭＣ）のサブセットが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、またはＮＫ細胞であることを特徴とする、請求項１または２に記載の薬剤。
【請求項４】
上記生理的溶液が、生理食塩水（好ましくは生理的ＮａＣｌ溶液）、全血、血液分画物（好ましくは血清）、または細胞培養培地であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項５】
上記細胞培養培地が、ＲＰＭＩ、ＤＭＥＭ、Ｘ−ｖｉｖｏ、およびウルトラカルチャー（Ｕｌｔｒａｃｕｌｔｕｒｅ）からなる群より選択されることを特徴とする、請求項４に記載の薬剤。
【請求項６】
上記ＰＢＭＣが、ストレスを誘発する条件の下で培養されたものであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項７】
上記ストレスを誘発する条件には、低酸素症、オゾン、熱、放射線、化学物質、浸透圧、ｐＨの変化、またはこれらの組み合わせが含まれることを特徴とする、請求項６に記載の薬剤。
【請求項８】
上記ＰＢＭＣまたはそのサブセットが、少なくとも１０Ｇｙ（好ましくは少なくとも２０Ｇｙ、より好ましくは少なくとも４０Ｇｙ）、オゾン、高温、またはＵＶ線によって培養中にストレスを与えられたものであることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の薬剤であって、皮下投与、筋肉内投与、器官内投与、および静脈内投与を実施できるように構成されたことを特徴とする、薬剤。
【請求項１０】
上記溶液ａ）または上記上清ｂ）が凍結乾燥されたものであることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項１１】
上記ＰＢＭＣまたはそのサブセットが、上記溶液中で少なくとも４時間（好ましくは少なくとも６時間、より好ましくは少なくとも１２時間）培養されたものであることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の薬剤を、体内の炎症症状（好ましくは虚血に関連する体内の症状）を治療するための薬物の製造のために用いる使用方法。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の薬剤を調製する方法であって、
ａ）末梢血単核球（ＰＢＭＣ）またはそのサブセットを準備する工程と、
ｂ）上記工程ａ）のＰＢＭＣを、ＰＢＭＣ増殖物質およびＰＢＭＣ活性化物質を含有しない生理的溶液中で少なくとも１時間培養する工程と、
ｃ）上記工程ｂ）の細胞および／またはこの細胞の上清を単離する工程と、
ｄ）上記工程ｃ）の細胞および／または上清を用いて上記薬剤を調製する工程とを含む、方法。
【請求項１４】
上記工程ｂ）の前または上記工程ｂ）の途中で、上記ＰＢＭＣを、ストレスを引き起こす条件に暴露し、
上記ストレスを引き起こす条件には、低酸素症、オゾン、熱、放射線、化学物質、浸透圧、ｐＨの変化、またはこれらの組み合わせが含まれることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
上記工程ｂ）の前または上記工程ｂ）の途中で、上記ＰＢＭＣが、少なくとも１０Ｇｙ（好ましくは少なくとも２０Ｇｙ、より好ましくは少なくとも４０Ｇｙ）、オゾン、高温、またはＵＶ線に暴露されることを特徴とする、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１３または１５に記載の方法によって得られる薬剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６ａ】
【図６ｂ】
【図７ａ】
【図７ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２ａ】
【図１２ｂ】
【図１２ｃ】
【図１３ａ】
【図１３ｂ】
【図１３ｃ】
【図１３ｄ】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６ａ】
【図６ｂ】
【図７ａ】
【図７ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２ａ】
【図１２ｂ】
【図１２ｃ】
【図１３ａ】
【図１３ｂ】
【図１３ｃ】
【図１３ｄ】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【公表番号】特表２０１２−５１２８４３（Ｐ２０１２−５１２８４３Ａ）
【公表日】平成２４年６月７日（２０１２．６．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４１４７８（Ｐ２０１１−５４１４７８）
【出願日】平成２１年１２月１８日（２００９．１２．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０６７５３６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７０１０５
【国際公開日】平成２２年６月２４日（２０１０．６．２４）
【出願人】（５１０３３９１７５）アポサイエンス アクチエンゲゼルシャフト (4)
【氏名又は名称原語表記】ＡＰＯＳＣＩＥＮＣＥ ＡＧ
【住所又は居所原語表記】Ｒａｕｈｅｎｓｔｅｉｎｇａｓｓｅ ４／３，Ａ−１０１０ Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年６月７日（２０１２．６．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月１８日（２００９．１２．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０６７５３６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７０１０５
【国際公開日】平成２２年６月２４日（２０１０．６．２４）
【出願人】（５１０３３９１７５）アポサイエンス アクチエンゲゼルシャフト (4)
【氏名又は名称原語表記】ＡＰＯＳＣＩＥＮＣＥ ＡＧ
【住所又は居所原語表記】Ｒａｕｈｅｎｓｔｅｉｎｇａｓｓｅ ４／３，Ａ−１０１０ Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ
【Ｆターム（参考）】
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