蛍光エネルギー移動現象を利用した新規グルタミン酸バイオセンサー
【課題】 検体中のグルタミン酸濃度を、小量の検体を用いて、高感度で、高速で測定する。
【解決手段】 代謝型グルタミン酸受容体の細胞外リガンド結合ドメインタンパク質（ＬＢＤ）に２種類の蛍光物質をそれぞれ結合させた蛍光標識ＬＢＤタンパク質ヘテロダイマーであって、２種類の蛍光物質が蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）におけるドナーおよびアクセプターであるヘテロダイマーを検体と接触させ、励起光を照射し、ドナー蛍光物質とアクセプター蛍光物質からの蛍光強度を測定する。
【解決手段】 代謝型グルタミン酸受容体の細胞外リガンド結合ドメインタンパク質（ＬＢＤ）に２種類の蛍光物質をそれぞれ結合させた蛍光標識ＬＢＤタンパク質ヘテロダイマーであって、２種類の蛍光物質が蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）におけるドナーおよびアクセプターであるヘテロダイマーを検体と接触させ、励起光を照射し、ドナー蛍光物質とアクセプター蛍光物質からの蛍光強度を測定する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規グルタミン酸バイオセンサーに関し、詳しくは代謝型グルタミン酸受容体にグルタミン酸が結合した場合に生ずる該受容体の細胞外領域の立体構造の変化を利用したグルタミン酸バイオセンサーおよびグルタミン酸濃度測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルタミン酸は、食品の主な旨み成分でもあり、調味料として、直接料理に使用したり、人工的に生産した調味料に添加するなど様々なものに使用されている。食品以外にも石鹸やシャンプートリートメント、化粧用品やサプリメントなど幅広く利用されている。そのため、これらの加工品を製造するにあたり、調味料の味覚センサーとしての味覚検査や、製品の品質管理・検査などにグルタミン酸を検出、定量する方法などの開発が行われている。
グルタミン酸は、生体内では蛋白質構成アミノ酸のひとつであり、非必須アミノ酸であるが、代謝性ストレスなど異化機能の亢進により、体内での生合成量では不足する場合もあり、準必須アミノ酸として扱われる場合もある。体内では脳神経細胞全般にわたり大量に存在し、中枢神経系の主要な伝達物質である。そのために体内における生理活性は、摂取量と非常に密接な関係を持っていることが明らかになっている。特に、医療分野においてはグルタミン酸センサーとしての診断法、検査法などグルタミン酸の微量な検出、定量などが求められる。現在研究開発されているグルタミン酸センサーは、グルタミン酸脱水素酵素やグルタミン酸酸化酵素などを利用して、それらの酵素反応と電極を組み合わせたものが主流である（非特許文献１）。しかしながら、これらのセンサーは、最初の酵素反応で生じた電子をいくつかの化学反応ステップを介して最終的に電極にまで到達させて結果として生じる電流を検知するため、かなり間接的な測定法であり、その分、センサーの性能が使用中に不安定になる要因が多いといえる。また、電極を用いるため、ある程度の検体量が必要である、また多検体を同時に測定するようなハイスループット化が比較的困難である。
代謝型グルタミン酸受容体は７回膜貫通型ＧＰＣＲであり、チャネル型受容体とは異なり、より長期的な応答を細胞に引き起こす。最近、この受容体の細胞外リガンド結合ドメイン（約５２０アミノ酸）の立体構造が明らかにされた（非特許文献２）。これによりこの受容体のリガンド結合ドメインはジスルフィド結合および疎水性相互作用によりホモダイマーを形成していることが明らかになり、さらにグルタミン酸結合にともなってダイマー間の相対的位置を大きく変化させて活性化されることが示唆された。
【非特許文献１】岡山大学農学部学術報告 Vol. 91, 15-22 （2002）
【非特許文献２】Nature Vol. 407 971-977 （2000）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は検体中のグルタミン酸濃度を簡便かつ迅速に定量することを目的とする。本発明はまた多検体を同時に測定することを可能にすることをも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、代謝型グルタミン酸受容体の細胞外リガンド結合ドメインタンパク質（以下ＬＢＤと略す）が特定の立体構造を有するホモダイマーを形成し、これにリガンドであるグルタミン酸を加えると、グルタミン酸がＬＢＤに結合してＬＢＤホモダイマーの立体構造が変化するという知見に基礎をおいている。ＬＢＤを異なる２種類の蛍光物質でラベルするとＬＢＤヘテロダイマーを形成し、グルタミン酸の結合によるＬＢＤヘテロダイマーの立体構造の変化に伴い、２種類の蛍光物質の間の距離が変化し蛍光エネルギー移動効率も変化する。このことを利用して２種類の蛍光物質からの蛍光強度からグルタミン酸の濃度を測定するのが本発明の原理である。ここに「蛍光エネルギー移動」（ＦＲＥＴ）とは互いの吸収スペクトルがオーバーラップする2種類の蛍光物質（ドナーとアクセプター）が、１００オングストローム程度以内の距離に存在していると、ドナーの励起エネルギーがアクセプターに移動し、直接は励起していないアクセプター色素の方から蛍光が発せられる現象を言う（非特許文献２参照）。ＦＲＥＴにおける「ドナー」とは、励起光を吸収しそのエネルギーの一部分は蛍光として発光し、他の一部分は近接するアクセプターに移動する蛍光物質をいう。ＦＲＥＴにおける「アクセプター」とは、直接励起光を受けなくても、ドナーからのエネルギーを吸収し蛍光を発する蛍光物質をいう。
【非特許文献２】Stryer, L.: Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annu. Rev. Biochem. 47 p819-846 （1978）
【０００５】
即ち、本発明は、
代謝型グルタミン酸受容体の細胞外リガンド結合ドメインタンパク質（ＬＢＤ）に２種類の蛍光物質をそれぞれ結合させた蛍光標識ＬＢＤタンパク質ヘテロダイマーであって、２種類の蛍光物質が蛍光エネルギー移動（fluorescence resonance energy transfer） （ＦＲＥＴ）におけるドナーおよびアクセプターであるヘテロダイマー、
に関する。
「代謝型グルタミン酸受容体の細胞外リガンド結合ドメインタンパク質（ＬＢＤ）」とは代謝型グルタミン酸受容体のＮ−末端の約５２０のアミノ酸残基からなる、同受容体の細胞外に存在する部分でグルタミン酸が結合する部分である。本発明においてはＬＢＤのアミノ酸残基の数は厳密なものである必要はない。
【０００６】
本発明はまた、
１）上記ヘテロダイマーとグルタミン酸を含む検体を接触させ；
２）励起光を照射し、ドナー蛍光物質とアクセプター蛍光物質からの蛍光強度を測定する；
ことを含む試料中のグルタミン酸の濃度を測定する方法に関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明はタンパク質の立体構造の変化から、検体中のグルタミン酸濃度を測定するもので従来のグルタミン酸濃度の測定方法と全く原理を異にし、次のような有利な効果を有する。
１）グルタミン酸の結合が直接光信号へ変換されるため、高感度が期待できる。光検出器に依存するが、現在の光検出技術はシングルフォトン検出が可能である。
２）原理的に、１マイクロリットル以下の極少量のサンプルのグルタミン酸濃度を定量可能である。この場合、本発明のセンサー分子をマイクロビーズ表面に固定し、そのビーズをＣＣＤカメラを用いた顕微鏡イメージングで観察する。
３）代謝型グルタミン酸受容体へのグルタミン酸結合はミリ秒オーダーの反応であり、非常に速いため、検出の高速化が期待できる。また、電極を用いず、光検出を利用するので、多検体をすばやく測定するハイスループット化が容易である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
ＬＢＤを蛍光標識するには２つの方法がある。その１つはＬＢＤと蛍光タンパク質との融合タンパク質を作ることであり、他の１つはＬＢＤのアミノ酸側鎖に低分子蛍光物質を結合させることである。いずれの場合もＦＲＥＴドナーとＦＲＥＴアクセプターの２つの蛍光物質が必要である。ＦＲＥＴドナーの蛍光波長はＦＲＥＴアクセプターの蛍光波長より短くなければならない。またドナーとなる蛍光物質の蛍光スペクトルはアクセプターとなる蛍光物質の吸収スペクトルとオーバーラップしなければならない。
蛍光タンパク質の選択
【０００９】
ＦＲＥＴのドナーとアクセプターとなりうる蛍光タンパク質の組み合わせには、ＣＦＰ （Cyan fluorescent protein:蛍光タンパク質のうちシアン色の蛍光を発するもの）／ＹＦＰ（yellow fluorescent protein：蛍光タンパク質のうち黄色の蛍光を発するもの）のペア、ＧＦＰ（green fluorescent protein：蛍光タンパク質のうち緑色の蛍光を発するもの）／ＲＦＰ（red fluorescent protein：蛍光タンパク質のうち赤色、あるいはそれより長波長の蛍光を発するもの）のペアがある。
Cyan fluorescent proteinとしてはClontech社のECFPが使用可能である。Yellow fluorescent proteinとしてはClontech社のYFPの他にEvrogen社のPhi-Yellowが使用可能である。Green fluorescent proteinとしてはClontech社のEGFPの他にEvrogen社のCop-Greenが使用可能である。Red fluorescent proteinとしてはClontech社のDsRed2、HcRed1の他にEvrogen社のHcRed-Tandemが使用可能である。
（２）ＬＢＤと蛍光タンパク質との融合タンパク質のヘテロダイマーの製造方法
【００１０】
ＬＢＤと蛍光タンパク質との融合タンパク質はつぎのように遺伝子組換法によって便利に製造できる。
代謝型グルタミン酸受容体の細胞外リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）（配列番号１）の遺伝子の３’末端にＦＲＥＴのドナー、アクセプターとなる蛍光タンパク質遺伝子を融合しておく。それをInvitrogen社のpFastBac Dualベクターの２つの発現遺伝子クローニングサイトに挿入する。（或いはpFastBac Dualベクターに１つのＬＢＤ−蛍光タンパク質融合遺伝子を挿入し、それをドナーとアクセプター分の２つ用意する。）そのプラスミドをバクミド調製用大腸菌ＤＨ１０Ｂａｃにトランスフォームし、そこから目的遺伝子を含有するバクミドを精製する。そのバクミドをInvitrogen社のCellfectin reagentを用いて昆虫細胞Ｓｆ９にトランスフェクションし、２７℃で数日培養してその培養上清を回収する。その培養上清には目的遺伝子を持ったバキュロウイルスが含まれている。さらに、より多くのウイルスを調製するためにＳｆ９細胞を大量調製してウイルス増幅を行った後、その培養上清をタンパク質発現用のウイルス溶液として保存しておく。タンパク質発現を行うために、ウイルス溶液をタンパク質発現用昆虫細胞であるHighFive細胞にインフェクションし、数日培養した後、培養上清を回収する。（pFastBac dualベクターにドナー融合遺伝子とアクセプター融合遺伝子の片方ずつを別々にクローニングした場合は、両方のベクターから調製した２つのウイルスを同時に同じ細胞にインフェクションすればよい。）目的遺伝子を持つウイルスはHighFive細胞に感染してその細胞の中で目的タンパク質が生産され培養上清に分泌されている。ＬＢＤはダイマーになる性質があるので、ドナー融合ＬＢＤとアクセプター融合ＬＢＤがヘテロダイマーになって培養上清に分泌されてくる。しかし、この段階では、ドナー融合ＬＢＤどうし、アクセプター融合ＬＢＤどうしがホモダイマーを形成しているものも多く含まれているため、アフィニティークロマトグラフィーを用いて最終的にドナーアクセプターへテロダイマーを調製する。例えば、ドナー融合遺伝子にＦＬＡＧタグ、アクセプター融合遺伝子にＨｉｓタグを付加しておき、これらの２つのアフィニティータグを利用してタンパク質精製を行えば、その結果得られたタンパク質は原理的にドナー融合ＬＢＤとアクセプター融合ＬＢＤのヘテロダイマーになっている。
【００１１】
図１は本発明のＬＢＤと蛍光タンパク質との融合タンパク質のヘテロダイマーの概念図の一例を示す。この例では、ＦＲＥＴドナータンパク質がＣＦＰであり、ＦＲＥＴアクセプタータンパク質がＹＦＰの場合であり、ＬＢＤ／ＣＦＰ融合タンパク質にはＨｉｓタグ、ＬＢＤ／ＹＦＰ融合タンパク質にはＦＬＡＧタグが付けてある。
【００１２】
また本発明の別の態様において、ＦＲＥＴドナータンパク質とＬＢＤ融合タンパク質の代わりに、ルシフェラーゼのような生物発光を触媒する酵素とＬＢＤとの融合タンパク質を用いてもよい。この場合、ルシフェラーゼの基質であるルシフェリンは酸素分子による酸化に伴う自由エネルギーで励起され発光するが、そのエネルギーの一部がＦＲＥＴアクセプタータンパク質に移動して蛍光を発する。
（３）低分子蛍光物質の選択
【００１３】
ＬＢＤを蛍光標識する他の方法はＬＢＤのアミノ酸側鎖に低分子蛍光物質を結合させることである。ＦＲＥＴドナーとなりうる低分子蛍光物質には、１，５−ＩＡＥＤＡＮＳ、ＩＡＡＮＳ、ＭＩＡＮＳ等のナフタレン誘導体、ピレンマレイミド、ピレンヨードアセタミド等のピレン誘導体、ＣＰＭ、ＤＣＩＡ、ＤＡＣＩＡ、ＤＡＣＭ、ＭＤＣＣ、ＩＤＣＣ等のクマリン誘導体、フルオレセインマレイミド、５−ヨードアセタミドフルオレセイン、５−ブロモメチルフルオレセイン、オレゴングリーン４８８マレイミド、オレゴングリーン４８８ヨードアセタミド等のフロレセイン誘導体、アレクサ４８８マレイミド、アレクサ５３２マレイミド、アレクサ５４６マレイミド、アレクサ５６８マレイミド、アレクサ５９４マレイミド、アレクサ５５５マレイミド等のアレクサ誘導体、BODIPY493/503ブロモメチル、BODIPY499/508マレイミド、BODIPY507/545ヨードアセタミド、BODIPY530/550ヨードアセタミド等のBODIPY誘導体、テトラメチルローダミンマレイミド、テトラメチルローダミンヨードアセタミド、ローダミンレッドマレイミド等のローダミン誘導体、テキサスレッドマレイミド、テキサスレッドヨードアセタミド等のテキサスレッド誘導体などがある。
【００１４】
ＦＲＥＴアクセプターとなりうる低分子蛍光物質には、フルオレセインマレイミド、５−ヨードアセタミドフルオレセイン、５−ブロモメチルフルオレセイン、オレゴングリーン４８８マレイミド、オレゴングリーン４８８ヨードアセタミド等のフロレセイン誘導体、アレクサ４８８マレイミド、アレクサ５３２マレイミド、アレクサ５４６マレイミド、アレクサ５６８マレイミド、アレクサ５９４マレイミド、アレクサ５５５マレイミド、アレクサ６３３マレイミド、アレクサ６４７マレイミド、アレクサ６６０マレイミド、アレクサ６８０マレイミド等のアレクサ誘導体、BODIPY493/503ブロモメチル、BODIPY499/508マレイミド、BODIPY507/545ヨードアセタミド、BODIPY530/550ヨードアセタミド、BODIPY577/618マレイミド、BODIPY630/650マレイミド等のBODIPY誘導体、テトラメチルローダミンマレイミド、テトラメチルローダミンヨードアセタミド、ローダミンレッドマレイミド等のローダミン誘導体、テキサスレッドマレイミド、テキサスレッドヨードアセタミド等のテキサスレッド誘導体などがある。
【００１５】
好ましいＦＲＥＴドナー／アクセプターの組み合わせの例はピレンマレイミド／フロレセインマレイミド、ＣＰＭ／フルオレセインマレイミド、フルオレセインマレイミド／テキサスレッドマレイミド、アレクサ４８８マレイミド／テキサスレッドマレイミド、テトラメチルローダミンマレイミド／アレクサ６３３マレイミドなどがある。
（４）ＬＢＤと低分子蛍光物質の結合方法
【００１６】
ＬＢＤと低分子蛍光物質の結合は、ＬＢＤに部位特異的に導入したシステイン残基を標的にして結合させる。まず、ＬＢＤリガンド結合ドメインの中で、蛍光色素を結合させたい位置を立体構造から決定し、その部位のアミノ酸残基をシステインに置換する変異、およびその前後のアミノ酸をアルギニンに置換する変異を、ＬＢＤ遺伝子にＰＣＲを用いて導入する。両サイドをアルギニン残基にすることで標的システインの反応性が増大する。そのＬＢＤ遺伝子からバキュロウイルスをＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステムを用いて作成し、そのウイルスと昆虫細胞ＨｉｇｈＦｉｖｅを使って目的タンパク質を発現させる。そのタンパク質をＦＬＡＧタグを用いて精製し、１０μＭ程度に濃縮、バッファー交換する（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、５０ｍＭ ＮａＣｌ）。次にＴＣＥＰを添加して標的システインを活性化しておき、そこにタンパク質等のモル程度のドナー蛍光物質を添加し、室温で３０分攪拌しながら反応させる。反応後、ゲルろ過により、ラベルタンパク質と残存蛍光物質を分離し、タンパク質は再度濃縮する。次に、タンパク質の１０等量程度のアクセプター蛍光物質を同様に室温で反応させ、再度ゲルろ過によりラベルタンパク質と残存蛍光色素を分離精製する。ここで得られたラベルタンパク質は、ドナーとアクセプターがダブルラベルされたタンパク質（ＬＢＤ）である（ただし、ドナーのラベル率はアクセプターのラベル率よりも小さい。
【００１７】
（５）グルタミン酸濃度の測定
液相法：
このセンサー分子（蛍光標識ヘテロダイマー）の水溶液をグルタミン酸を含む検体と混合し（センサー分子０.５μＭ ｉｎ ２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７.４，５０ｍＭ ＮａＣｌ。検体はこのセンサー溶液約５００μリットルに対して約１μリットル程度添加する）、蛍光光度計を用いて、ドナーの励起光を照射し（励起光の波長はドナー蛍光物質の蛍光波長より短くする）、それぞれの蛍光物質の蛍光強度が単独でピークとなる波長で蛍光強度をそれぞれ測定してその比をとる。一方濃度既知のグルタミン酸溶液を調製し、同様に蛍光強度の比をとり、検量線を作成しておく。この検量線を用いれば検体のグルタミン酸濃度を求めることができる。
【００１８】
固相法：
適当な固体担体、例えば、直径約１００マイクロメーター程度のＦＬＡＧ抗体アガロースビーズ表面にこの蛍光２重標識ＬＢＤをコートし、グルタミン酸を含む検体をビーズと接触させ、そのビーズを蛍光顕微鏡で観察する。検出器側には、ドナー、アクセプター両方の像が同時に観測できるＷ−ｖｉｅｗシステムを導入し、デジタルＣＣＤカメラを用いて画像をコンピュータに取り込む。２つの蛍光物質のそれぞれのチャネルの両画像の蛍光強度比を計算し、その値の違いを色の違いとして画像化する。ビーズの色はグルタミン酸濃度に応じて変化する。
用いるビーズは容積が１μｌ以下であるため、この方法を用いれば、最低その程度の極微量の検体量でグルタミン酸濃度が定量できることが期待される。
【実施例】
【００１９】
実施例１
ＬＢＤ−ＣＦＰ融合タンパク質／ＬＢＤ−ＹＦＰ融合タンパク質ヘテロダイマーの調製とその蛍光スペクトルの測定
代謝型グルタミン酸受容体のリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）（配列番号１）のＣ末端に蛍光タンパク質ＣＦＰ（配列番号３）及びＹＦＰ（配列番号２）を融合するために、Clontech社のpECFP、pEYFPをテンプレートにして、それぞれの蛍光タンパク質遺伝子部分をＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲするためのForward、Reverse両プライマーにはXbaIサイトを挿入しておき、この制限酵素サイトを用いてＬＢＤ遺伝子のＣ末端に連結した。ReverseプライマーのＣ末端にはストップコドンをデザインしておいた。ＹＦＰを融合するＬＢＤのＮ末端にはＦＬＡＧタグ付のヘマグルチニンの分泌シグナル配列を挿入し、ＣＦＰを融合するＬＢＤのＮ末端には本来この受容体がもつ分泌シグナルを挿入した。ＣＦＰ遺伝子を増幅するためのReverseプライマーにはヒスチジンタグを付加した。利用したＬＢＤは、代謝型グルタミン酸サブタイプ１のアミノ酸番号５２２番までをコードする遺伝子である。ＬＢＤ遺伝子（NotI−XbaI領域）とそれぞれの蛍光タンパク質（XbaI-XbaI領域）をXbaIサイトを用いて連結し、ＬＢＤ-蛍光タンパク質融合遺伝子（LBD-CFPとLBD-YFP、NotI−XbaI領域）を作成した。これをInvitrogen社のpFastBac dualベクターにNotI−XbaIサイトを利用してクローニングした。このプラスミドをバクミド産生大腸菌であるDH10BACにトランスフォームし、Luria-agarプレート上でのブルーホワイトセレクションにより目的遺伝子を含むバクミドを生産している大腸菌コロニーをクローニングした。この大腸菌からプラスミドミニプレップアルカリ法によりバクミドを調製した。次に、このバクミドからウイルスを生産するために、バクミドを昆虫細胞Ｓｆ９にCellfectin reagentを用いてトランスフェクションした。２７℃で３日間培養したのち、その培養上清を回収した。また、この時のＳｆ９細胞を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと抗ＦＬＡＧ抗体、抗Ｈｉｓｔａｇ抗体によるウエスタンブロッティングで目的タンパク質が細胞内で発現していることを確認した。この段階での培養上清にはウイルスがまだ少ないため、Ｓｆ９細胞をより大量に調製し、そこにこのウイルスを感染させて、目的遺伝子をコードしたウイルスを増殖させた。このように調製したＬＢＤ−ＣＦＰウイルス、ＬＢＤ−ＹＦＰウイルスの両ウイルスをタンパク質発現用昆虫細胞ＨｉｇｈＦｉｖｅに適量感染させ（２２５ｃｍ２プレート一枚に対して１００マイクロリットルのウイルス溶液を添加した）、４日から５日間培養し、その培養上清を回収してタンパク質精製に用いた（６０００ｒｐｍで１５分間回収した培養上清を遠心し、残存している細胞を除去した）。まず、培養上清にプロテアーゼインヒビターのカクテルを添加し（ＰＭＳＦ、ロイペプチン、ペプスタチン、アプロチニン）、それをＡｎｔｉ−ＦＬＡＧ抗体を架橋してあるアガロース樹脂カラム（約１ｍｌ）に直接通した。流速は１ｍＬ／ｍｉｎ程度で行った。すべての培養上清をカラムに通した後、１０ｍＬのバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７.５， ２０ｍＭ ＮａＣｌ）でカラムを洗った。その後、１５０μｇ／ｍＬのＦＬＡＧペプチド（配列：ＤＹＫＤＤＤＤＫ， ２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７.４ ３００ｍＭ ＮａＣｌ）で目的タンパク質をカラムから溶出した。次に、約１ｍＬのNi-agaroseに抗ＦＬＡＧ抗体カラムから溶出したサンプルを１ｍＬ／ｍｉｎの流速で通した。すべてのサンプルを通し終わった後、２５ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌのバッファーでカラムを洗い、続いて２００ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌのバッファーで目的タンパク質を溶出した。溶出サンプルを用いてウエスタンブロッティングを実施し、得られたタンパク質がＬＢＤ−ＣＦＰ、ＬＢＤ−ＹＦＰのヘテロダイマーであることを確認した。この方法で１リットルの培養上清から約０．５から１ｍｇの目的タンパク質を調製できる。
【００２０】
実施例２
ＬＢＤ−ＣＦＰ融合タンパク質／ＬＢＤ−ＹＦＰ融合タンパク質ヘテロダイマーの蛍光スペクトルの測定
得られたサンプルの蛍光スペクトル測定は、日立製作所社製の蛍光光度分光計（Ｆ−４５００）を用いて測定した。励起光は４３０ｎｍの光で行い、４５０ｎｍから６００ｎｍまでの蛍光スペクトルをコンピュータに記録した。測定バッファーは２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７.４、５０ｍＭ ＮａＣｌで行った。このヘテロダイマー溶液を４３０ｎｍの光で励起した時のスペクトルは図２Ａの実線のようであった。４８０ｎｍ付近をピークにＣＦＰの蛍光が、５３０ｎｍ付近をピークにＹＦＰの蛍光が観測されている。ここに１ｍＭのグルタミン酸を添加すると点線のように蛍光スペクトルが変化し、ＣＦＰの蛍光が上昇し逆にＹＦＰの蛍光が減少することが確認された（図２Ａ）。これはグルタミン酸が結合したことで分子内で構造変化がおこり、ＣＦＰ−ＹＦＰ間の蛍光エネルギー移動効率が変化したことを意味している。
一方、代謝型グルタミン酸受容体のアンタゴニストであるＳ−ＭＣＰＧ（ｓ−アルファメチルカルボキシフェニルグリシン）を添加しても、そのようなスペクトル変化はみられなかったことから（図２Ｂ）、図２Ａの変化はアゴニスト特異的であるといえる。
【００２１】
実施例３
検量線の作成
実施例２において様々なグルタミン酸濃度において、蛍光スペクトルの４８０ｎｍと５３０ｎｍの比をとり、それをプロットすると、１ｎＭから２ｍＭまでのグルタミン酸濃度に応じて、きれいに４８０／５３０の比が変化することがわかった（図３）。これを検量線とすれば、蛍光光度計を用いるこのような方法でサンプル中のグルタミン酸濃度を定量できる。この測定は、５００μｌのサンプル溶液に対して０．５μｌのリガンド溶液を添加して、約１分後に蛍光スペクトルの測定をするという作業を順次行った。最終的なデータはリガンド添加によるサンプル溶液体積の変化を考慮して計算した。
【００２２】
実施例４
固相法によるグルタミン酸濃度の定量
微量検体中のグルタミン酸濃度を定量する方法として、直径約１００マイクロメータ程度のＦＬＡＧ抗体アガロースビーズ表面にこの分子をコートし、検体と接触させ、そのビーズを蛍光顕微鏡観察した。約３００μｇ／ｍｌの濃度のセンサー分子溶液と、５０マイクロリットルの抗ＦＬＡＧ抗体コートアガロースビース（Ｓｉｇｍａ社製）を混合し、４℃で１２時間転倒攪拌して、センサー分子をビーズ表面にコートした。微量遠心機を用いてビーズを沈殿させ（１５０００ｒｐｍ、３０秒）、上清を捨ててＷａｓｈバッファー（２０ｍＭＨＥＰＥＳ ｐＨ７.４、５０ｍＭ ＮａＣｌを３回繰り返し添加してビーズを調製した。カバーガラス上にこのビーズ溶液を１０μｌ程度のせ、蛍光顕微鏡で観察した。対物レンズは１０倍（オリンパス）を使用した。リガンドを添加したときのビーズ蛍光の変化は、リガンド溶液約０．５μｌをビーズ溶液ドロップに添加する形で実施した。検出器側には、ＣＦＰ、ＹＦＰ両方の像が同時に観測できるＷ−ｖｉｅｗシステム（浜松ホトニクス社製）を導入し、デジタルＣＣさＤカメラさを用いて画像をコンピュータに取り込んだ（アクアコスモスイメージングシステム、浜松ホトニクス社製）。ＣＦＰチャネルとＹＦＰチャネルの両画像の蛍光強度比（ＣＦＰ画像強度／ＹＦＰ画像強度）を計算し、その値の違いを色の違いとして画像化した。ビーズの色はグルタミン酸濃度に応じて変化することが確認された（図４Ａ、Ｂ）。
【産業上の利用可能性】
【００２３】
食品等の味覚検査やグルタミン酸を含む製品の品質管理・検査、また医療分野における診断、血液検査など、グルタミン酸を検出、定量、濃度測定するために用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】。本発明のＬＢＤと蛍光タンパク質との融合タンパク質のヘテロダイマーの概念図の一例を示す。この例では、ＦＲＥＴドナータンパク質がＣＦＰであり、ＦＲＥＴアクセプタータンパク質がＹＦＰの場合であり、ＬＢＤ／ＣＦＰ融合タンパク質にはＨｉｓタグ、ＬＢＤ／ＹＦＰ融合タンパク質にはＦＬＡＧタグが付いている。
【図２】Ａ：グルタミン酸センサー分子（ＬＢＤと蛍光タンパク質との融合タンパク質のヘテロダイマー）の蛍光スペクトルを示す。実線はグルタミン酸を添加しない場合、破線は１ｍＭのグルタミン酸を添加した場合である。Ｂ：実線はグルタミン酸を添加しない場合、破線は１ｍＭのＳ−ＭＣＰＧ１を添加した場合である。
【図３】グルタミン酸濃度依存的な蛍光スペクトル変化を示す。
【図４】Ａ：グルタミン酸センサー分子をコートしたアガロースビーズのＲａｔｉｏ画像を示す。グルタミン酸濃度依存的にビーズの色が変化する。Ｂ：各グルタミン酸濃度におけるＲａｔｉｏ画像をグラフ化したものである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規グルタミン酸バイオセンサーに関し、詳しくは代謝型グルタミン酸受容体にグルタミン酸が結合した場合に生ずる該受容体の細胞外領域の立体構造の変化を利用したグルタミン酸バイオセンサーおよびグルタミン酸濃度測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルタミン酸は、食品の主な旨み成分でもあり、調味料として、直接料理に使用したり、人工的に生産した調味料に添加するなど様々なものに使用されている。食品以外にも石鹸やシャンプートリートメント、化粧用品やサプリメントなど幅広く利用されている。そのため、これらの加工品を製造するにあたり、調味料の味覚センサーとしての味覚検査や、製品の品質管理・検査などにグルタミン酸を検出、定量する方法などの開発が行われている。
グルタミン酸は、生体内では蛋白質構成アミノ酸のひとつであり、非必須アミノ酸であるが、代謝性ストレスなど異化機能の亢進により、体内での生合成量では不足する場合もあり、準必須アミノ酸として扱われる場合もある。体内では脳神経細胞全般にわたり大量に存在し、中枢神経系の主要な伝達物質である。そのために体内における生理活性は、摂取量と非常に密接な関係を持っていることが明らかになっている。特に、医療分野においてはグルタミン酸センサーとしての診断法、検査法などグルタミン酸の微量な検出、定量などが求められる。現在研究開発されているグルタミン酸センサーは、グルタミン酸脱水素酵素やグルタミン酸酸化酵素などを利用して、それらの酵素反応と電極を組み合わせたものが主流である（非特許文献１）。しかしながら、これらのセンサーは、最初の酵素反応で生じた電子をいくつかの化学反応ステップを介して最終的に電極にまで到達させて結果として生じる電流を検知するため、かなり間接的な測定法であり、その分、センサーの性能が使用中に不安定になる要因が多いといえる。また、電極を用いるため、ある程度の検体量が必要である、また多検体を同時に測定するようなハイスループット化が比較的困難である。
代謝型グルタミン酸受容体は７回膜貫通型ＧＰＣＲであり、チャネル型受容体とは異なり、より長期的な応答を細胞に引き起こす。最近、この受容体の細胞外リガンド結合ドメイン（約５２０アミノ酸）の立体構造が明らかにされた（非特許文献２）。これによりこの受容体のリガンド結合ドメインはジスルフィド結合および疎水性相互作用によりホモダイマーを形成していることが明らかになり、さらにグルタミン酸結合にともなってダイマー間の相対的位置を大きく変化させて活性化されることが示唆された。
【非特許文献１】岡山大学農学部学術報告 Vol. 91, 15-22 （2002）
【非特許文献２】Nature Vol. 407 971-977 （2000）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は検体中のグルタミン酸濃度を簡便かつ迅速に定量することを目的とする。本発明はまた多検体を同時に測定することを可能にすることをも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、代謝型グルタミン酸受容体の細胞外リガンド結合ドメインタンパク質（以下ＬＢＤと略す）が特定の立体構造を有するホモダイマーを形成し、これにリガンドであるグルタミン酸を加えると、グルタミン酸がＬＢＤに結合してＬＢＤホモダイマーの立体構造が変化するという知見に基礎をおいている。ＬＢＤを異なる２種類の蛍光物質でラベルするとＬＢＤヘテロダイマーを形成し、グルタミン酸の結合によるＬＢＤヘテロダイマーの立体構造の変化に伴い、２種類の蛍光物質の間の距離が変化し蛍光エネルギー移動効率も変化する。このことを利用して２種類の蛍光物質からの蛍光強度からグルタミン酸の濃度を測定するのが本発明の原理である。ここに「蛍光エネルギー移動」（ＦＲＥＴ）とは互いの吸収スペクトルがオーバーラップする2種類の蛍光物質（ドナーとアクセプター）が、１００オングストローム程度以内の距離に存在していると、ドナーの励起エネルギーがアクセプターに移動し、直接は励起していないアクセプター色素の方から蛍光が発せられる現象を言う（非特許文献２参照）。ＦＲＥＴにおける「ドナー」とは、励起光を吸収しそのエネルギーの一部分は蛍光として発光し、他の一部分は近接するアクセプターに移動する蛍光物質をいう。ＦＲＥＴにおける「アクセプター」とは、直接励起光を受けなくても、ドナーからのエネルギーを吸収し蛍光を発する蛍光物質をいう。
【非特許文献２】Stryer, L.: Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annu. Rev. Biochem. 47 p819-846 （1978）
【０００５】
即ち、本発明は、
代謝型グルタミン酸受容体の細胞外リガンド結合ドメインタンパク質（ＬＢＤ）に２種類の蛍光物質をそれぞれ結合させた蛍光標識ＬＢＤタンパク質ヘテロダイマーであって、２種類の蛍光物質が蛍光エネルギー移動（fluorescence resonance energy transfer） （ＦＲＥＴ）におけるドナーおよびアクセプターであるヘテロダイマー、
に関する。
「代謝型グルタミン酸受容体の細胞外リガンド結合ドメインタンパク質（ＬＢＤ）」とは代謝型グルタミン酸受容体のＮ−末端の約５２０のアミノ酸残基からなる、同受容体の細胞外に存在する部分でグルタミン酸が結合する部分である。本発明においてはＬＢＤのアミノ酸残基の数は厳密なものである必要はない。
【０００６】
本発明はまた、
１）上記ヘテロダイマーとグルタミン酸を含む検体を接触させ；
２）励起光を照射し、ドナー蛍光物質とアクセプター蛍光物質からの蛍光強度を測定する；
ことを含む試料中のグルタミン酸の濃度を測定する方法に関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明はタンパク質の立体構造の変化から、検体中のグルタミン酸濃度を測定するもので従来のグルタミン酸濃度の測定方法と全く原理を異にし、次のような有利な効果を有する。
１）グルタミン酸の結合が直接光信号へ変換されるため、高感度が期待できる。光検出器に依存するが、現在の光検出技術はシングルフォトン検出が可能である。
２）原理的に、１マイクロリットル以下の極少量のサンプルのグルタミン酸濃度を定量可能である。この場合、本発明のセンサー分子をマイクロビーズ表面に固定し、そのビーズをＣＣＤカメラを用いた顕微鏡イメージングで観察する。
３）代謝型グルタミン酸受容体へのグルタミン酸結合はミリ秒オーダーの反応であり、非常に速いため、検出の高速化が期待できる。また、電極を用いず、光検出を利用するので、多検体をすばやく測定するハイスループット化が容易である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
ＬＢＤを蛍光標識するには２つの方法がある。その１つはＬＢＤと蛍光タンパク質との融合タンパク質を作ることであり、他の１つはＬＢＤのアミノ酸側鎖に低分子蛍光物質を結合させることである。いずれの場合もＦＲＥＴドナーとＦＲＥＴアクセプターの２つの蛍光物質が必要である。ＦＲＥＴドナーの蛍光波長はＦＲＥＴアクセプターの蛍光波長より短くなければならない。またドナーとなる蛍光物質の蛍光スペクトルはアクセプターとなる蛍光物質の吸収スペクトルとオーバーラップしなければならない。
蛍光タンパク質の選択
【０００９】
ＦＲＥＴのドナーとアクセプターとなりうる蛍光タンパク質の組み合わせには、ＣＦＰ （Cyan fluorescent protein:蛍光タンパク質のうちシアン色の蛍光を発するもの）／ＹＦＰ（yellow fluorescent protein：蛍光タンパク質のうち黄色の蛍光を発するもの）のペア、ＧＦＰ（green fluorescent protein：蛍光タンパク質のうち緑色の蛍光を発するもの）／ＲＦＰ（red fluorescent protein：蛍光タンパク質のうち赤色、あるいはそれより長波長の蛍光を発するもの）のペアがある。
Cyan fluorescent proteinとしてはClontech社のECFPが使用可能である。Yellow fluorescent proteinとしてはClontech社のYFPの他にEvrogen社のPhi-Yellowが使用可能である。Green fluorescent proteinとしてはClontech社のEGFPの他にEvrogen社のCop-Greenが使用可能である。Red fluorescent proteinとしてはClontech社のDsRed2、HcRed1の他にEvrogen社のHcRed-Tandemが使用可能である。
（２）ＬＢＤと蛍光タンパク質との融合タンパク質のヘテロダイマーの製造方法
【００１０】
ＬＢＤと蛍光タンパク質との融合タンパク質はつぎのように遺伝子組換法によって便利に製造できる。
代謝型グルタミン酸受容体の細胞外リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）（配列番号１）の遺伝子の３’末端にＦＲＥＴのドナー、アクセプターとなる蛍光タンパク質遺伝子を融合しておく。それをInvitrogen社のpFastBac Dualベクターの２つの発現遺伝子クローニングサイトに挿入する。（或いはpFastBac Dualベクターに１つのＬＢＤ−蛍光タンパク質融合遺伝子を挿入し、それをドナーとアクセプター分の２つ用意する。）そのプラスミドをバクミド調製用大腸菌ＤＨ１０Ｂａｃにトランスフォームし、そこから目的遺伝子を含有するバクミドを精製する。そのバクミドをInvitrogen社のCellfectin reagentを用いて昆虫細胞Ｓｆ９にトランスフェクションし、２７℃で数日培養してその培養上清を回収する。その培養上清には目的遺伝子を持ったバキュロウイルスが含まれている。さらに、より多くのウイルスを調製するためにＳｆ９細胞を大量調製してウイルス増幅を行った後、その培養上清をタンパク質発現用のウイルス溶液として保存しておく。タンパク質発現を行うために、ウイルス溶液をタンパク質発現用昆虫細胞であるHighFive細胞にインフェクションし、数日培養した後、培養上清を回収する。（pFastBac dualベクターにドナー融合遺伝子とアクセプター融合遺伝子の片方ずつを別々にクローニングした場合は、両方のベクターから調製した２つのウイルスを同時に同じ細胞にインフェクションすればよい。）目的遺伝子を持つウイルスはHighFive細胞に感染してその細胞の中で目的タンパク質が生産され培養上清に分泌されている。ＬＢＤはダイマーになる性質があるので、ドナー融合ＬＢＤとアクセプター融合ＬＢＤがヘテロダイマーになって培養上清に分泌されてくる。しかし、この段階では、ドナー融合ＬＢＤどうし、アクセプター融合ＬＢＤどうしがホモダイマーを形成しているものも多く含まれているため、アフィニティークロマトグラフィーを用いて最終的にドナーアクセプターへテロダイマーを調製する。例えば、ドナー融合遺伝子にＦＬＡＧタグ、アクセプター融合遺伝子にＨｉｓタグを付加しておき、これらの２つのアフィニティータグを利用してタンパク質精製を行えば、その結果得られたタンパク質は原理的にドナー融合ＬＢＤとアクセプター融合ＬＢＤのヘテロダイマーになっている。
【００１１】
図１は本発明のＬＢＤと蛍光タンパク質との融合タンパク質のヘテロダイマーの概念図の一例を示す。この例では、ＦＲＥＴドナータンパク質がＣＦＰであり、ＦＲＥＴアクセプタータンパク質がＹＦＰの場合であり、ＬＢＤ／ＣＦＰ融合タンパク質にはＨｉｓタグ、ＬＢＤ／ＹＦＰ融合タンパク質にはＦＬＡＧタグが付けてある。
【００１２】
また本発明の別の態様において、ＦＲＥＴドナータンパク質とＬＢＤ融合タンパク質の代わりに、ルシフェラーゼのような生物発光を触媒する酵素とＬＢＤとの融合タンパク質を用いてもよい。この場合、ルシフェラーゼの基質であるルシフェリンは酸素分子による酸化に伴う自由エネルギーで励起され発光するが、そのエネルギーの一部がＦＲＥＴアクセプタータンパク質に移動して蛍光を発する。
（３）低分子蛍光物質の選択
【００１３】
ＬＢＤを蛍光標識する他の方法はＬＢＤのアミノ酸側鎖に低分子蛍光物質を結合させることである。ＦＲＥＴドナーとなりうる低分子蛍光物質には、１，５−ＩＡＥＤＡＮＳ、ＩＡＡＮＳ、ＭＩＡＮＳ等のナフタレン誘導体、ピレンマレイミド、ピレンヨードアセタミド等のピレン誘導体、ＣＰＭ、ＤＣＩＡ、ＤＡＣＩＡ、ＤＡＣＭ、ＭＤＣＣ、ＩＤＣＣ等のクマリン誘導体、フルオレセインマレイミド、５−ヨードアセタミドフルオレセイン、５−ブロモメチルフルオレセイン、オレゴングリーン４８８マレイミド、オレゴングリーン４８８ヨードアセタミド等のフロレセイン誘導体、アレクサ４８８マレイミド、アレクサ５３２マレイミド、アレクサ５４６マレイミド、アレクサ５６８マレイミド、アレクサ５９４マレイミド、アレクサ５５５マレイミド等のアレクサ誘導体、BODIPY493/503ブロモメチル、BODIPY499/508マレイミド、BODIPY507/545ヨードアセタミド、BODIPY530/550ヨードアセタミド等のBODIPY誘導体、テトラメチルローダミンマレイミド、テトラメチルローダミンヨードアセタミド、ローダミンレッドマレイミド等のローダミン誘導体、テキサスレッドマレイミド、テキサスレッドヨードアセタミド等のテキサスレッド誘導体などがある。
【００１４】
ＦＲＥＴアクセプターとなりうる低分子蛍光物質には、フルオレセインマレイミド、５−ヨードアセタミドフルオレセイン、５−ブロモメチルフルオレセイン、オレゴングリーン４８８マレイミド、オレゴングリーン４８８ヨードアセタミド等のフロレセイン誘導体、アレクサ４８８マレイミド、アレクサ５３２マレイミド、アレクサ５４６マレイミド、アレクサ５６８マレイミド、アレクサ５９４マレイミド、アレクサ５５５マレイミド、アレクサ６３３マレイミド、アレクサ６４７マレイミド、アレクサ６６０マレイミド、アレクサ６８０マレイミド等のアレクサ誘導体、BODIPY493/503ブロモメチル、BODIPY499/508マレイミド、BODIPY507/545ヨードアセタミド、BODIPY530/550ヨードアセタミド、BODIPY577/618マレイミド、BODIPY630/650マレイミド等のBODIPY誘導体、テトラメチルローダミンマレイミド、テトラメチルローダミンヨードアセタミド、ローダミンレッドマレイミド等のローダミン誘導体、テキサスレッドマレイミド、テキサスレッドヨードアセタミド等のテキサスレッド誘導体などがある。
【００１５】
好ましいＦＲＥＴドナー／アクセプターの組み合わせの例はピレンマレイミド／フロレセインマレイミド、ＣＰＭ／フルオレセインマレイミド、フルオレセインマレイミド／テキサスレッドマレイミド、アレクサ４８８マレイミド／テキサスレッドマレイミド、テトラメチルローダミンマレイミド／アレクサ６３３マレイミドなどがある。
（４）ＬＢＤと低分子蛍光物質の結合方法
【００１６】
ＬＢＤと低分子蛍光物質の結合は、ＬＢＤに部位特異的に導入したシステイン残基を標的にして結合させる。まず、ＬＢＤリガンド結合ドメインの中で、蛍光色素を結合させたい位置を立体構造から決定し、その部位のアミノ酸残基をシステインに置換する変異、およびその前後のアミノ酸をアルギニンに置換する変異を、ＬＢＤ遺伝子にＰＣＲを用いて導入する。両サイドをアルギニン残基にすることで標的システインの反応性が増大する。そのＬＢＤ遺伝子からバキュロウイルスをＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステムを用いて作成し、そのウイルスと昆虫細胞ＨｉｇｈＦｉｖｅを使って目的タンパク質を発現させる。そのタンパク質をＦＬＡＧタグを用いて精製し、１０μＭ程度に濃縮、バッファー交換する（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、５０ｍＭ ＮａＣｌ）。次にＴＣＥＰを添加して標的システインを活性化しておき、そこにタンパク質等のモル程度のドナー蛍光物質を添加し、室温で３０分攪拌しながら反応させる。反応後、ゲルろ過により、ラベルタンパク質と残存蛍光物質を分離し、タンパク質は再度濃縮する。次に、タンパク質の１０等量程度のアクセプター蛍光物質を同様に室温で反応させ、再度ゲルろ過によりラベルタンパク質と残存蛍光色素を分離精製する。ここで得られたラベルタンパク質は、ドナーとアクセプターがダブルラベルされたタンパク質（ＬＢＤ）である（ただし、ドナーのラベル率はアクセプターのラベル率よりも小さい。
【００１７】
（５）グルタミン酸濃度の測定
液相法：
このセンサー分子（蛍光標識ヘテロダイマー）の水溶液をグルタミン酸を含む検体と混合し（センサー分子０.５μＭ ｉｎ ２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７.４，５０ｍＭ ＮａＣｌ。検体はこのセンサー溶液約５００μリットルに対して約１μリットル程度添加する）、蛍光光度計を用いて、ドナーの励起光を照射し（励起光の波長はドナー蛍光物質の蛍光波長より短くする）、それぞれの蛍光物質の蛍光強度が単独でピークとなる波長で蛍光強度をそれぞれ測定してその比をとる。一方濃度既知のグルタミン酸溶液を調製し、同様に蛍光強度の比をとり、検量線を作成しておく。この検量線を用いれば検体のグルタミン酸濃度を求めることができる。
【００１８】
固相法：
適当な固体担体、例えば、直径約１００マイクロメーター程度のＦＬＡＧ抗体アガロースビーズ表面にこの蛍光２重標識ＬＢＤをコートし、グルタミン酸を含む検体をビーズと接触させ、そのビーズを蛍光顕微鏡で観察する。検出器側には、ドナー、アクセプター両方の像が同時に観測できるＷ−ｖｉｅｗシステムを導入し、デジタルＣＣＤカメラを用いて画像をコンピュータに取り込む。２つの蛍光物質のそれぞれのチャネルの両画像の蛍光強度比を計算し、その値の違いを色の違いとして画像化する。ビーズの色はグルタミン酸濃度に応じて変化する。
用いるビーズは容積が１μｌ以下であるため、この方法を用いれば、最低その程度の極微量の検体量でグルタミン酸濃度が定量できることが期待される。
【実施例】
【００１９】
実施例１
ＬＢＤ−ＣＦＰ融合タンパク質／ＬＢＤ−ＹＦＰ融合タンパク質ヘテロダイマーの調製とその蛍光スペクトルの測定
代謝型グルタミン酸受容体のリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）（配列番号１）のＣ末端に蛍光タンパク質ＣＦＰ（配列番号３）及びＹＦＰ（配列番号２）を融合するために、Clontech社のpECFP、pEYFPをテンプレートにして、それぞれの蛍光タンパク質遺伝子部分をＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲするためのForward、Reverse両プライマーにはXbaIサイトを挿入しておき、この制限酵素サイトを用いてＬＢＤ遺伝子のＣ末端に連結した。ReverseプライマーのＣ末端にはストップコドンをデザインしておいた。ＹＦＰを融合するＬＢＤのＮ末端にはＦＬＡＧタグ付のヘマグルチニンの分泌シグナル配列を挿入し、ＣＦＰを融合するＬＢＤのＮ末端には本来この受容体がもつ分泌シグナルを挿入した。ＣＦＰ遺伝子を増幅するためのReverseプライマーにはヒスチジンタグを付加した。利用したＬＢＤは、代謝型グルタミン酸サブタイプ１のアミノ酸番号５２２番までをコードする遺伝子である。ＬＢＤ遺伝子（NotI−XbaI領域）とそれぞれの蛍光タンパク質（XbaI-XbaI領域）をXbaIサイトを用いて連結し、ＬＢＤ-蛍光タンパク質融合遺伝子（LBD-CFPとLBD-YFP、NotI−XbaI領域）を作成した。これをInvitrogen社のpFastBac dualベクターにNotI−XbaIサイトを利用してクローニングした。このプラスミドをバクミド産生大腸菌であるDH10BACにトランスフォームし、Luria-agarプレート上でのブルーホワイトセレクションにより目的遺伝子を含むバクミドを生産している大腸菌コロニーをクローニングした。この大腸菌からプラスミドミニプレップアルカリ法によりバクミドを調製した。次に、このバクミドからウイルスを生産するために、バクミドを昆虫細胞Ｓｆ９にCellfectin reagentを用いてトランスフェクションした。２７℃で３日間培養したのち、その培養上清を回収した。また、この時のＳｆ９細胞を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと抗ＦＬＡＧ抗体、抗Ｈｉｓｔａｇ抗体によるウエスタンブロッティングで目的タンパク質が細胞内で発現していることを確認した。この段階での培養上清にはウイルスがまだ少ないため、Ｓｆ９細胞をより大量に調製し、そこにこのウイルスを感染させて、目的遺伝子をコードしたウイルスを増殖させた。このように調製したＬＢＤ−ＣＦＰウイルス、ＬＢＤ−ＹＦＰウイルスの両ウイルスをタンパク質発現用昆虫細胞ＨｉｇｈＦｉｖｅに適量感染させ（２２５ｃｍ２プレート一枚に対して１００マイクロリットルのウイルス溶液を添加した）、４日から５日間培養し、その培養上清を回収してタンパク質精製に用いた（６０００ｒｐｍで１５分間回収した培養上清を遠心し、残存している細胞を除去した）。まず、培養上清にプロテアーゼインヒビターのカクテルを添加し（ＰＭＳＦ、ロイペプチン、ペプスタチン、アプロチニン）、それをＡｎｔｉ−ＦＬＡＧ抗体を架橋してあるアガロース樹脂カラム（約１ｍｌ）に直接通した。流速は１ｍＬ／ｍｉｎ程度で行った。すべての培養上清をカラムに通した後、１０ｍＬのバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７.５， ２０ｍＭ ＮａＣｌ）でカラムを洗った。その後、１５０μｇ／ｍＬのＦＬＡＧペプチド（配列：ＤＹＫＤＤＤＤＫ， ２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７.４ ３００ｍＭ ＮａＣｌ）で目的タンパク質をカラムから溶出した。次に、約１ｍＬのNi-agaroseに抗ＦＬＡＧ抗体カラムから溶出したサンプルを１ｍＬ／ｍｉｎの流速で通した。すべてのサンプルを通し終わった後、２５ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌのバッファーでカラムを洗い、続いて２００ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌのバッファーで目的タンパク質を溶出した。溶出サンプルを用いてウエスタンブロッティングを実施し、得られたタンパク質がＬＢＤ−ＣＦＰ、ＬＢＤ−ＹＦＰのヘテロダイマーであることを確認した。この方法で１リットルの培養上清から約０．５から１ｍｇの目的タンパク質を調製できる。
【００２０】
実施例２
ＬＢＤ−ＣＦＰ融合タンパク質／ＬＢＤ−ＹＦＰ融合タンパク質ヘテロダイマーの蛍光スペクトルの測定
得られたサンプルの蛍光スペクトル測定は、日立製作所社製の蛍光光度分光計（Ｆ−４５００）を用いて測定した。励起光は４３０ｎｍの光で行い、４５０ｎｍから６００ｎｍまでの蛍光スペクトルをコンピュータに記録した。測定バッファーは２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７.４、５０ｍＭ ＮａＣｌで行った。このヘテロダイマー溶液を４３０ｎｍの光で励起した時のスペクトルは図２Ａの実線のようであった。４８０ｎｍ付近をピークにＣＦＰの蛍光が、５３０ｎｍ付近をピークにＹＦＰの蛍光が観測されている。ここに１ｍＭのグルタミン酸を添加すると点線のように蛍光スペクトルが変化し、ＣＦＰの蛍光が上昇し逆にＹＦＰの蛍光が減少することが確認された（図２Ａ）。これはグルタミン酸が結合したことで分子内で構造変化がおこり、ＣＦＰ−ＹＦＰ間の蛍光エネルギー移動効率が変化したことを意味している。
一方、代謝型グルタミン酸受容体のアンタゴニストであるＳ−ＭＣＰＧ（ｓ−アルファメチルカルボキシフェニルグリシン）を添加しても、そのようなスペクトル変化はみられなかったことから（図２Ｂ）、図２Ａの変化はアゴニスト特異的であるといえる。
【００２１】
実施例３
検量線の作成
実施例２において様々なグルタミン酸濃度において、蛍光スペクトルの４８０ｎｍと５３０ｎｍの比をとり、それをプロットすると、１ｎＭから２ｍＭまでのグルタミン酸濃度に応じて、きれいに４８０／５３０の比が変化することがわかった（図３）。これを検量線とすれば、蛍光光度計を用いるこのような方法でサンプル中のグルタミン酸濃度を定量できる。この測定は、５００μｌのサンプル溶液に対して０．５μｌのリガンド溶液を添加して、約１分後に蛍光スペクトルの測定をするという作業を順次行った。最終的なデータはリガンド添加によるサンプル溶液体積の変化を考慮して計算した。
【００２２】
実施例４
固相法によるグルタミン酸濃度の定量
微量検体中のグルタミン酸濃度を定量する方法として、直径約１００マイクロメータ程度のＦＬＡＧ抗体アガロースビーズ表面にこの分子をコートし、検体と接触させ、そのビーズを蛍光顕微鏡観察した。約３００μｇ／ｍｌの濃度のセンサー分子溶液と、５０マイクロリットルの抗ＦＬＡＧ抗体コートアガロースビース（Ｓｉｇｍａ社製）を混合し、４℃で１２時間転倒攪拌して、センサー分子をビーズ表面にコートした。微量遠心機を用いてビーズを沈殿させ（１５０００ｒｐｍ、３０秒）、上清を捨ててＷａｓｈバッファー（２０ｍＭＨＥＰＥＳ ｐＨ７.４、５０ｍＭ ＮａＣｌを３回繰り返し添加してビーズを調製した。カバーガラス上にこのビーズ溶液を１０μｌ程度のせ、蛍光顕微鏡で観察した。対物レンズは１０倍（オリンパス）を使用した。リガンドを添加したときのビーズ蛍光の変化は、リガンド溶液約０．５μｌをビーズ溶液ドロップに添加する形で実施した。検出器側には、ＣＦＰ、ＹＦＰ両方の像が同時に観測できるＷ−ｖｉｅｗシステム（浜松ホトニクス社製）を導入し、デジタルＣＣさＤカメラさを用いて画像をコンピュータに取り込んだ（アクアコスモスイメージングシステム、浜松ホトニクス社製）。ＣＦＰチャネルとＹＦＰチャネルの両画像の蛍光強度比（ＣＦＰ画像強度／ＹＦＰ画像強度）を計算し、その値の違いを色の違いとして画像化した。ビーズの色はグルタミン酸濃度に応じて変化することが確認された（図４Ａ、Ｂ）。
【産業上の利用可能性】
【００２３】
食品等の味覚検査やグルタミン酸を含む製品の品質管理・検査、また医療分野における診断、血液検査など、グルタミン酸を検出、定量、濃度測定するために用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】。本発明のＬＢＤと蛍光タンパク質との融合タンパク質のヘテロダイマーの概念図の一例を示す。この例では、ＦＲＥＴドナータンパク質がＣＦＰであり、ＦＲＥＴアクセプタータンパク質がＹＦＰの場合であり、ＬＢＤ／ＣＦＰ融合タンパク質にはＨｉｓタグ、ＬＢＤ／ＹＦＰ融合タンパク質にはＦＬＡＧタグが付いている。
【図２】Ａ：グルタミン酸センサー分子（ＬＢＤと蛍光タンパク質との融合タンパク質のヘテロダイマー）の蛍光スペクトルを示す。実線はグルタミン酸を添加しない場合、破線は１ｍＭのグルタミン酸を添加した場合である。Ｂ：実線はグルタミン酸を添加しない場合、破線は１ｍＭのＳ−ＭＣＰＧ１を添加した場合である。
【図３】グルタミン酸濃度依存的な蛍光スペクトル変化を示す。
【図４】Ａ：グルタミン酸センサー分子をコートしたアガロースビーズのＲａｔｉｏ画像を示す。グルタミン酸濃度依存的にビーズの色が変化する。Ｂ：各グルタミン酸濃度におけるＲａｔｉｏ画像をグラフ化したものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
代謝型グルタミン酸受容体の細胞外リガンド結合ドメインタンパク質（ＬＢＤ）に２種類の蛍光物質をそれぞれ結合させた蛍光標識ＬＢＤタンパク質ヘテロダイマーであって、２種類の蛍光物質が蛍光エネルギー移動（fluorescence resonance energy transfer）（ＦＲＥＴ）におけるドナーおよびアクセプターであるヘテロダイマー。
【請求項２】
蛍光標識タンパク質がＬＢＤに蛍光タンパク質を融合した融合タンパク質である請求項１に記載のヘテロダイマー。
【請求項３】
ドナー蛍光タンパク質がシアンフルオレセントプロテイン（ＣＦＰ）であり、アクセプター蛍光タンパク質がイエローフルオレセントプロテイン（ＹＦＰ）である請求項２に記載のヘテロダイマー。
【請求項４】
ドナー蛍光タンパク質がグリーンフルオレセントプロテイン（ＧＦＰ）であり、アクセプター蛍光タンパク質がレッドフルオレセントプロテイン（ＲＦＰ）である請求項２に記載のヘテロダイマー。
【請求項５】
蛍光標識タンパク質がＬＢＤのアミノ酸残基の側鎖に低分子蛍光物質を結合させた請求項１に記載のヘテロダイマー。
【請求項６】
ドナー低分子蛍光物質がピレンマレイミドであり、アクセプター低分子蛍光物質がフロレセインマレイミドである請求項５に記載のヘテロダイマー。
【請求項７】
ドナー低分子蛍光物質がＣＰＭであり、アクセプター低分子蛍光物質がフルオレセインマレイミドである請求項５に記載のヘテロダイマー。
【請求項８】
ドナー低分子蛍光物質がフルオレセインマレイミドであり、アクセプター低分子蛍光物質がテキサスレッドマレイミドである請求項５に記載のヘテロダイマー。
【請求項９】
ドナー低分子蛍光物質がアレクサ４８８マレイミドであり、アクセプター低分子蛍光物質がテキサスレッドマレイミドである請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
ドナー低分子蛍光物質がテトラメチルローダミンマレイミドであり、アクセプター低分子蛍光物質がアレクサ６３３マレイミドである請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
１）請求項１〜１０のいずれかに記載のヘテロダイマーとグルタミン酸を含む検体とを接触させ；
２）励起光を照射し、ドナー蛍光物質とアクセプター蛍光物質からの蛍光強度を測定する；
ことを含む検体中のグルタミン酸の濃度を測定する方法。
【請求項１２】
ヘテロダイマーと検体の接触を液相で行う請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
蛍光強度の測定を蛍光分光光度計を用いて行う請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ヘテロダイマーを固相に固定して検体と接触させる請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
蛍光強度の測定を蛍光顕微鏡とＣＣＤカメラを組み合わせた顕微鏡イメージング技術を用いて行う請求項１４に記載の方法。
【請求項１】
代謝型グルタミン酸受容体の細胞外リガンド結合ドメインタンパク質（ＬＢＤ）に２種類の蛍光物質をそれぞれ結合させた蛍光標識ＬＢＤタンパク質ヘテロダイマーであって、２種類の蛍光物質が蛍光エネルギー移動（fluorescence resonance energy transfer）（ＦＲＥＴ）におけるドナーおよびアクセプターであるヘテロダイマー。
【請求項２】
蛍光標識タンパク質がＬＢＤに蛍光タンパク質を融合した融合タンパク質である請求項１に記載のヘテロダイマー。
【請求項３】
ドナー蛍光タンパク質がシアンフルオレセントプロテイン（ＣＦＰ）であり、アクセプター蛍光タンパク質がイエローフルオレセントプロテイン（ＹＦＰ）である請求項２に記載のヘテロダイマー。
【請求項４】
ドナー蛍光タンパク質がグリーンフルオレセントプロテイン（ＧＦＰ）であり、アクセプター蛍光タンパク質がレッドフルオレセントプロテイン（ＲＦＰ）である請求項２に記載のヘテロダイマー。
【請求項５】
蛍光標識タンパク質がＬＢＤのアミノ酸残基の側鎖に低分子蛍光物質を結合させた請求項１に記載のヘテロダイマー。
【請求項６】
ドナー低分子蛍光物質がピレンマレイミドであり、アクセプター低分子蛍光物質がフロレセインマレイミドである請求項５に記載のヘテロダイマー。
【請求項７】
ドナー低分子蛍光物質がＣＰＭであり、アクセプター低分子蛍光物質がフルオレセインマレイミドである請求項５に記載のヘテロダイマー。
【請求項８】
ドナー低分子蛍光物質がフルオレセインマレイミドであり、アクセプター低分子蛍光物質がテキサスレッドマレイミドである請求項５に記載のヘテロダイマー。
【請求項９】
ドナー低分子蛍光物質がアレクサ４８８マレイミドであり、アクセプター低分子蛍光物質がテキサスレッドマレイミドである請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
ドナー低分子蛍光物質がテトラメチルローダミンマレイミドであり、アクセプター低分子蛍光物質がアレクサ６３３マレイミドである請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
１）請求項１〜１０のいずれかに記載のヘテロダイマーとグルタミン酸を含む検体とを接触させ；
２）励起光を照射し、ドナー蛍光物質とアクセプター蛍光物質からの蛍光強度を測定する；
ことを含む検体中のグルタミン酸の濃度を測定する方法。
【請求項１２】
ヘテロダイマーと検体の接触を液相で行う請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
蛍光強度の測定を蛍光分光光度計を用いて行う請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ヘテロダイマーを固相に固定して検体と接触させる請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
蛍光強度の測定を蛍光顕微鏡とＣＣＤカメラを組み合わせた顕微鏡イメージング技術を用いて行う請求項１４に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００６−１５３６３７（Ｐ２００６−１５３６３７Ａ）
【公開日】平成１８年６月１５日（２００６．６．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−３４４１９３（Ｐ２００４−３４４１９３）
【出願日】平成１６年１１月２９日（２００４．１１．２９）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）国等の委託研究の成果に係る特許出願（平成１６年度新エネルギー・産業技術総合開発機構 健康維持・増進のためのバイオテクノロジー基盤研究プログラム／生体高分子立体構造情報解析 委託研究、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受けるもの
【出願人】（５０２０５５４８１）技術研究組合 生物分子工学研究所 (4)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年６月１５日（２００６．６．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１１月２９日（２００４．１１．２９）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）国等の委託研究の成果に係る特許出願（平成１６年度新エネルギー・産業技術総合開発機構 健康維持・増進のためのバイオテクノロジー基盤研究プログラム／生体高分子立体構造情報解析 委託研究、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受けるもの
【出願人】（５０２０５５４８１）技術研究組合 生物分子工学研究所 (4)
【Ｆターム（参考）】
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