蛍光観察装置
【課題】蛍光画像のＳＮ比を高めつつ、対物レンズと標本とを近づけて標本の深い部分を観察することができる蛍光観察装置を提供する。
【解決手段】励起光を標本Ａに照射する一方、標本Ａからの蛍光を集光する対物光学系４０と、対物光学系４０の径方向外側に配置され、標本Ａからの蛍光を取り込む付加光学系５０と、対物光学系４０および付加光学系５０により集光された標本Ａからの蛍光を検出する光検出器１７，２３とを備える蛍光観察装置１を採用する。
【解決手段】励起光を標本Ａに照射する一方、標本Ａからの蛍光を集光する対物光学系４０と、対物光学系４０の径方向外側に配置され、標本Ａからの蛍光を取り込む付加光学系５０と、対物光学系４０および付加光学系５０により集光された標本Ａからの蛍光を検出する光検出器１７，２３とを備える蛍光観察装置１を採用する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光観察装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
多光子励起では、非線形効果により励起光の集光点近傍にある蛍光物質のみが励起され、集光点近傍以外では蛍光物質は励起されない。その原理を利用して、従来、標本における励起光の集光点を走査しながら蛍光を検出し、画像を再構成する多光子励起顕微鏡が知られている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
非特許文献１に開示されている多光子励起顕微鏡は、対物レンズと標本との間に、励起光の集光位置に向けて配置された複数の光ファイバを備えている。このような構成を有することで、対物レンズに入らなかった蛍光を光ファイバにより捉えて、蛍光画像のＳＮ比を高めるようになっている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】ＯＰＴＩＣＳ ＥＸＰＲＥＳＳ，ｐ．６４２１−６４３５，ＶＯＬ．１７，Ｎｏ．８，２００９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、非特許文献１に開示されている多光子励起顕微鏡では、ファイバ先端が対物と標本との間にあるため、対物レンズを標本中に挿入することができず、標本の深い部分を観察することができないという不都合がある。例えば、表面から数ｍｍの深さにあるマウスの海馬などを観察することができない。
【０００６】
また、表面からさらに深い部分を観察する場合、対物レンズと標本表面との距離を近づけてピント位置を標本深部に合わせる必要があるが、ファイバ先端が対物と標本との間にあるため、対物レンズを標本に近づけることができない。このため、標本内の深いところにピントを合わせられないという不都合がある。
【０００７】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、蛍光画像のＳＮ比を高めつつ、対物レンズと標本とを近づけて標本の深い部分を観察することができる蛍光観察装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を採用する。
本発明は、励起光を標本に照射する一方、前記標本からの蛍光を集光する対物光学系と、該対物光学系の径方向外側に配置され、前記標本からの蛍光を取り込む付加光学系と、前記対物光学系および前記付加光学系により集光された前記標本からの蛍光を検出する光検出部とを備える蛍光観察装置を採用する。
【０００９】
本発明によれば、励起光が標本に照射されることで発生した蛍光を対物光学系により集光するとともに、対物光学系に入射しなかった標本からの蛍光を付加光学系により取り込むことができる。そして、このように対物光学系および付加光学系により集光された蛍光を光検出部により検出し、これら蛍光を合成して標本の画像を生成することで、画像のＳＮ比を高めることができ、精度の高い観察を行うことができる。
【００１０】
この場合において、付加光学系を対物光学系の径方向外側に配置することで、対物レンズ先端を標本に近づけた際に、付加光学系が邪魔になることはない。そのため、対物レンズ先端を標本に近づけて、標本の表面から深い位置にピントを合わせることができ、標本の深部の観察精度を向上することができる。
【００１１】
上記発明において、前記付加光学系が、前記対物光学系の光軸方向に移動可能に設けられていることとしてもよい。
標本の深部においては、集光点で励起されて発生した蛍光が標本中を進む距離が、散乱の平均自由行程（散乱で妨害されること無く進むことのできる距離の平均値）を越える場合がある。この場合、散乱されずに標本表面に直接達する蛍光は非常に少なく、ほとんどの蛍光が標本内で多重散乱して標本表面に達する。多重散乱した蛍光は、さまざまな方向の成分を持って標本表面から射出されるので、標本表面から付加光学系までの距離が離れていると、標本表面からの出射方向が付加光学系から外れてしまい、付加光学系に取り込まれる蛍光が急激に減少する。
【００１２】
したがって、付加光学系を対物光学系の光軸方向に移動可能にすることで、標本に対して対物光学系の位置を固定した状態で、付加光学系を標本に近接または密着させることができる。これにより、付加光学系により多くの散乱光を取り込むことができ、画像のＳＮ比を高めて観察精度を向上することができる。
【００１３】
上記発明において、前記対物光学系が、前記標本内に挿入するための細径先端部を有することとしてもよい。
このようにすることで、細径先端部を標本内に挿入した状態で、標本の観察を行うことができる。これにより、励起光が標本内を通る距離を短くすることができ、標本内における励起光の散乱を少なくして集光点における励起光の光密度が高め、励起効率を向上することができる。また、標本からの蛍光が標本内を通る距離を短くすることで、標本内における蛍光の散乱が少ない状態で対物光学系により集光することができ、光検出部による蛍光の検出効率を向上することができる。
【００１４】
上記発明において、前記付加光学系が、前記対物光学系を中心とする環状の正レンズであることとしてもよい。
付加光学系を正レンズとすることで、集光点からの蛍光を途中で屈折させて、効率よく光検出部に導くことができる。また、付加光学系を対物光学系を中心とする環状に形成することで、対物光学系に入射しなかった標本からの蛍光を効率的に取り込むことができる。
【００１５】
上記発明において、前記付加光学系の前記標本からの蛍光を入射させる入射面が、前記対物光学系の光軸に略垂直に形成されていることとしてもよい。
このようにすることで、付加光学系の入射面全体を標本表面に密着させることができ、標本表面での散乱を減らして蛍光の検出効率を向上することができる。
【００１６】
上記発明において、前記入射面に入射させた蛍光を導光する導光部を備え、該導光部の光軸が、前記入射面における蛍光の屈折角と略同じ角度で配置されていることとしてもよい。
集光点で発生した蛍光は、付加光学系の入射面で対物光学系の光軸方向に向けて屈折する。この屈折角に導光部の光軸方向を合わせて配置することで、蛍光の検出効率を向上することができる。この構成は、標本の散乱が比較的小さく、集光点からの非散乱光が多い場合に特に有効である。
【００１７】
上記発明において、前記付加光学系が、先端に向かって径が小さくなるように形成されていることとしてもよい。
このようにすることで、標本へのダメージを抑えて、付加光学系を標本内に挿入することができる。これにより、付加光学系を集光点に近づけるができ、付加光学系に取り込む蛍光の光量を増加させ、画像のＳＮ比を向上することができる。
【００１８】
上記発明において、前記付加光学系の出口と略一致する面に、前記対物光学系により集光された蛍光の中間結像面を形成する有限系レンズと、前記中間結像面からの蛍光と前記付加光学系の出口からの蛍光の両方の瞳の共役面を同一の前記光検出部に導くアダプタレンズとを備えることとしてもよい。
【００１９】
このようにすることで、励起光を走査した場合でも、対物光学系および付加光学系により集光された蛍光の両方を常に同一の光検出部に入射させることができる。これにより、光検出部を１つとすることができ、装置および制御を簡易化することができる。
また、対物光学系と付加光学系の蛍光をそれぞれ別々の光検出部で検出する場合と比較して、１つの検出器に入る蛍光の光量が多くなり、ＳＮ比を高めることができる。
【００２０】
上記発明において、前記付加光学系が、前記付加光学系の前記標本からの蛍光を入射させる入射面と、該入射面に入射させた蛍光を導光する導光部と、該導光部の基端部と前記中間結像面が形成される位置との間に設けられ、前記導光部の基端部と共役な面を、前記中間結像面が形成される位置に形成する付加光学系リレーレンズとを備えることとしてもよい。
【００２１】
通常、付加光学系の導光部の基端部のＮＡと有限系レンズの中間結像面側のＮＡが大きく異なるものを使用した場合、光が途中でけられないようにするため、アダプタレンズのＮＡを大きいほうに合わせる必要がある。しかしながら、上記の構成とすることで、付加光学系リレーレンズを使って、導光部の基端部のＮＡを有限系レンズのＮＡに合わせられるので、アダプタレンズのＮＡをどちらかに大きいほうに合わせる必要がなくなる。
【００２２】
上記発明において、前記対物光学系により集光された蛍光と前記付加光学系により取り込まれた蛍光とを合成する光合成手段を備えることとしてもよい。
このようにすることで、対物光学系により集光された蛍光と付加光学系により取り込まれた蛍光とを光合成手段により合成し、合成した光を同一の光検出部により検出することができる。これにより、光検出部を１つとすることができ、装置および制御を簡易化することができる。
また、対物光学系と付加光学系の蛍光をそれぞれ別々の光検出部で検出する場合と比較して、１つの検出器に入る蛍光の光量が多くなり、画像のＳＮ比を高めることができる。
【００２３】
上記発明において、前記光合成手段が、励起光および前記対物光学系により集光された蛍光が通る中心部と、前記付加光学系により取り込まれた蛍光が通る周辺部とで構成され、前記周辺部が、前記導光部の基端部の蛍光を略平行にする形成する付加光学系コリメートレンズと、前記付加光学系コリメートレンズからの光を偏向する偏向素子とを有することとしてもよい。
【００２４】
対物光学系により集光された蛍光は、対物光学系でほぼ平行光束になって、光合成手段の中心部を通り、蛍光観察装置本体に入射する。
導光部を通って、導光部の基端側から射出された蛍光は、付加光学系コリメートレンズで屈折され、略平行光束になる。付加光学系コリメートレンズを出た蛍光は、偏向素子によって、対物光学系の光束と同じ方向に偏向され、対物光学系の光束の外側を通って、蛍光観察装置本体に入射する。蛍光観察装置本体に入射した蛍光は、同一の光検出部により検出される。
【００２５】
これにより、付加光学系を備えていない通常の対物光学系でも、光合成手段を蛍光観察装置本体と対物光学系との間に挿入し、それに付加光学系の先端部を組み合わせて使うことができ、画像のＳＮ比を高めることができる。これにより、標本のより深い部分の観察が可能になる。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によれば、蛍光画像のＳＮ比を高めつつ、対物レンズと標本とを近づけて標本の深い部分を観察することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明の第１の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置の全体構成図である。
【図２】図１の光ファイバ束の集合前の位置における横断面図である。
【図３】図１の光ファイバ束の集合後の位置における横断面図である。
【図４】図１の光学系の焦点位置を説明する図である。
【図５】図１の変形例に係る光学系の縦断面図である。
【図６】図１の変形例に係る光学系の縦断面図である。
【図７】図１の変形例に係る光学系の縦断面図である。
【図８】図１の変形例に係る光学系の縦断面図である。
【図９】本発明の第２の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置の全体構成図である。
【図１０】図９の光学系の正面図である。
【図１１】図９の光学系の横断面図である。
【図１２】図９の変形例に係る光学系の正面図である。
【図１３】図９の変形例に係る光学系の正面図である。
【図１４】図９の変形例に係る光学系の縦断面図である。
【図１５】本発明の第３の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置の全体構成図である。
【図１６】図１５の光学系の中間像面位置における横断面図である。
【図１７】図１５のレーザ顕微鏡装置の光路を説明する図である。
【図１８】図１５の変形例に係るレーザ顕微鏡装置の全体構成図である。
【図１９】図１５の変形例に係る光学系の中間像面位置における横断面図である。
【図２０】本発明の第４の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置の全体構成図である。
【図２１】本発明の第５の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置の全体構成図である。
【図２２】図２１の蛍光合成部の横断面図である。
【図２３】図２１の蛍光合成部の光ファイバ束接続位置における側面図である。
【図２４】図２１のレーザ顕微鏡装置において、対物光学系の視野外に付加光学系の光を通す場合の光路を説明する図である。
【図２５】図２４の変形例に係る光路を説明する図である。
【図２６】図２４または図２５に示す光路による、光検出部における蛍光の入射位置を示す平面図である。
【図２７】図２１のレーザ顕微鏡装置において、対物光学系の瞳の外側に付加光学系からの蛍光を通す場合の光路を説明する図である。
【図２８】図２７に示す光路による、光検出部における蛍光の入射位置を示す平面図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
〔第１の実施形態〕
本発明の第１の実施形態に係る蛍光観察装置１について、図１から図８を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る蛍光観察装置１は、図１に示すように、励起光を射出するとともに標本Ａにおいて発生した蛍光を検出する顕微鏡本体１０と、顕微鏡本体１０とは別個に設けられ、標本Ａからの蛍光を検出する光検出ユニット２０と、顕微鏡本体１０からの励起光および標本Ａからの蛍光を導く光学系３０とを備えている。
【００２９】
顕微鏡本体１０は、多光子励起顕微鏡であり、標本Ａに励起光を照射することで、標本Ａ内の蛍光物質を励起させ、発生した蛍光を検出するようになっている。
顕微鏡本体１０は、励起光である短パルスレーザ光を射出するレーザ光源１１と、標本Ａ上において短パルスレーザ光の集光点を光軸に直交する方向に走査する走査ミラー１２と、短パルスレーザ光の瞳をリレーするリレー光学系１３と、励起光と標本Ａからの蛍光とを分離するダイクロイックミラー１４と、標本Ａからの蛍光の瞳をリレーするリレー光学系１６と、ダイクロイックミラー１４とリレー光学系１６との間に設けられた励起光カットフィルタ１５と、標本Ａからの蛍光を検出する、例えば光電子増倍管等の光検出器１７とを備えている。
【００３０】
光学系３０は、顕微鏡本体１０から射出された励起光を標本Ａに照射する一方、標本Ａからの蛍光を集光する対物光学系４０と、対物光学系４０の径方向外側に配置され、標本Ａからの蛍光を取り込む付加光学系５０とを備えている。
【００３１】
対物光学系４０は、標本Ａからの蛍光が入射する入射面４１と、入射面４１の後段に配置された対物レンズ４２とを備えている。
入射面４１は、標本Ａ上に載置されたカバーガラス３２に近接または当接され、標本Ａの集光点（ピント位置）３４において発生した蛍光が入射するようになっている。
【００３２】
対物レンズ４２は、標本Ａの集光点３４に顕微鏡本体１０からの励起光を集光するとともに、標本Ａの集光点３４において発生し、入射面４１に入射した標本Ａからの蛍光を集光するようになっている。対物レンズ４２は、例えば無限遠光学系で設計されており、標本Ａからの蛍光を略平行な光束にして、顕微鏡本体１０へ取り込み、リレー光学系１６で光検出器１７に導くようになっている。
【００３３】
付加光学系５０は、対物光学系４０の径方向外側に配置され、標本Ａからの蛍光が取り込まれる蛍光取り込み窓（入射面）５１と、蛍光取り込み窓５１に取り込まれた蛍光を導光する光ファイバ束（導光部）５２と、光ファイバ束５２により導光された蛍光を射出する蛍光出口部５３とを備えている。
【００３４】
蛍光取り込み窓５１は、光軸に沿う方向には、対物光学系４０の先端部（入射面４１）と略同じ高さに設けられており、光軸に直交する方向には、対物光学系４０の先端部（入射面４１）の外側に設けられている。蛍光取り込み窓５１の具体的な形状は、例えば、先端側に凸面を向けた平凸型の正レンズ５４であり、対物光学系４０が配置された中心部分がくり抜かれた円筒形状（円環形状）を有している。
【００３５】
光ファイバ束５２は、図１および図２に示すように、蛍光取り込み窓５１の後段において対物光学系４０を取り囲むように配置されている。また、光ファイバ束５２は、図１および図３に示すように、途中位置で一つの束にまとめられ、蛍光出口部５３まで続いている。
【００３６】
光ファイバ束５２は、蛍光取り込み窓５１と蛍光出口部５３との間において、全体として被覆されているが、被覆の中で個々の光ファイバはばらばらになっていて、柔軟性をもたせている。光ファイバ束５２は、高ＮＡ（例えばＮＡ０．６５）で径が小さい（例えば直径３０μｍ）の多成分ガラスの光ファイバを束ねたものである。
【００３７】
蛍光出口部５３と光検出ユニット２０とは光学的に接続されており、付加光学系５０を通った蛍光は光検出ユニット２０に導かれる。
なお、対物レンズ４２および蛍光出口部５３はともに着脱自在になっていて、対物光学系４０および付加光学系５０は交換可能とされている。
【００３８】
光検出ユニット２０は、光ファイバ束５２により導光された蛍光の瞳をリレーするリレー光学系２１と、リレー光学系２１によりリレーされた光から励起光をカットする励起光カットフィルタ２２と、標本Ａからの蛍光を検出する、例えば光電子増倍管等の光検出器２３とを備えている。
【００３９】
上記構成を有する蛍光観察装置１の作用について説明する。
レーザ光源１１から励起光として射出された短パルスレーザ光は、走査ミラー１２により偏向された後、リレー光学系１３により瞳がリレーされる。そして、短パルスレーザ光は、ダイクロイックミラー１４により対物光学系４０に向けて反射され、対物光学系４０（対物レンズ４２）により標本Ａ内の集光点３４に集光される。
【００４０】
これにより、標本Ａにおける集光点３４近傍の蛍光物質が励起され、蛍光が発生する。
標本Ａ内で発生した蛍光のうち、対物光学系４０の開口範囲内に入ったもの（直接光および散乱光）は、対物光学系４０（対物レンズ４２）により集光され、ダイクロイックミラー１４を透過する。ダイクロイックミラー１４を透過した蛍光は、励起光カットフィルタ１５により励起光が取り除かれた後、リレー光学系１６を介して光検出器１７により検出され、電気信号に変換される。
【００４１】
一方、標本Ａ内で発生した蛍光のうち、対物光学系４０の開口範囲内に入らなかった光の一部（直接光および散乱光）は、付加光学系５０（蛍光取り込み窓５１）により取り込まれ、光ファイバ束５２により導光される。光ファイバ束５２により導光された蛍光は、リレー光学系２１によりリレーされ、励起光カットフィルタ２２により励起光が取り除かれた後、光検出器２３により検出され、電気信号に変換される。
【００４２】
この際、走査ミラー１２により２軸方向に短パルスレーザ光を偏向させることで、標本Ａ上において集光点３４を水平方向に走査させる。そして、走査ミラー１２の動きに合わせて、光検出器１７および光検出器２３により検出された蛍光の強度を合成してモニター上（図示略）で画像を再構成すると、標本Ａの２次元画像が得られる。さらに、対物レンズ４２と標本Ａとの間隔を変える走査を行うことで、標本Ａの３次元の画像を構築することができる。
なお、走査ミラー１２の走査位置による明るさのムラを少なくするために、光検出器１７の位置は、対物光学系４０の瞳位置と共役な位置近傍にあることが望ましい。
【００４３】
以上のように、本実施形態に係る蛍光観察装置１によれば、励起光が標本Ａに照射されることで発生した蛍光を対物光学系４０により集光するとともに、対物光学系４０に入射しなかった標本Ａからの蛍光を付加光学系５０により取り込むことができる。そして、このように対物光学系４０および付加光学系５０により集光された蛍光を光検出器１７および光検出器２３により検出し、これら蛍光を合成して標本Ａの画像を生成することで、画像のＳＮ比を高めることができ、精度の高い観察を行うことができる。
【００４４】
この場合において、付加光学系５０を対物光学系４０の径方向外側に配置することで、対物レンズ先端を標本Ａに近づけた際に、付加光学系５０が邪魔になることはない。そのため、対物光学系４０先端（入射面４１）を標本Ａに近づけて、標本Ａの表面から深い位置に対物光学系４０のピントを合わせることができ、標本Ａの深部の観察精度を向上することができる。
【００４５】
また、付加光学系５０に正レンズ５４を採用することで、集光点３４からの蛍光を途中で屈折させて、効率よく光検出器２０に導くことができる。また、付加光学系５０を、対物光学系４０を中心とする円筒形状（円環形状）とすることで、対物光学系４０に入射しなかった標本Ａからの蛍光を効率的に取り込むことができる。
【００４６】
なお、蛍光取り込み窓５１を対物光学系４０先端部の外側に配置すると、集光点３４から蛍光取り込み窓５１まで距離が比較的長くなってしまう。しかしながら、蛍光取り込み窓５１を正レンズ５４とすることで、集光点３４からの蛍光を途中で屈折させて、効率よく光ファイバ束５２に導くことができ、効率的に蛍光を検出することができる。
また、対物光学系４０の側面は大きさの制限が無いので、光ファイバ束５２の径を大きくすることで、蛍光の光量を増やすことも可能である。
【００４７】
また、集光点３４からの蛍光を効率良く取り込むため、図４に示すように、標本Ａ側焦点Ｆｓおよび光ファイバ側の焦点Ｆｆを配置することが望ましい。具体的には、図４に示すように、正レンズ５４の標本Ａ側焦点Ｆｓは、対物光学系４０の光軸上の集光点３４の近傍に配置し、光ファイバ側の焦点Ｆｆは、光軸方向において光ファイバ束５２の端部近傍に配置することが望ましい。
【００４８】
図４において、点線は、集光点３４が対物光学系４０の光軸上にあるときの光線を示しており、実線は、集光点３４が走査によって対物光学系４０の光軸からずれたときの光線を示している。上記条件により、集光点３４が光軸に直交する方向に走査されて対物光学系４０の光軸から外れ、標本Ａ側の焦点位置が焦点Ｆｅとなった場合にも、そこからの蛍光が常に光ファイバ束５２の同じ位置を通過するようになるので、走査による明るさムラを防止することができる。
【００４９】
また、図５に示すように、付加光学系５０の蛍光取り込み窓５１の形状を、光ファイバ束５２側を凸面、標本Ａ側を対物光学系４０の光軸に垂直な平面に形成することとしてもよい。
このような形状とすることで、蛍光取り込み窓５１の先端側（入射面５１）が平面なので、標本Ａと蛍光取り込み窓５１との間にある媒質の屈折率の影響を受けにくくすることができ、対物光学系４０が水浸または油浸タイプの場合に好適である。
【００５０】
また、標本Ａ側の入射面５１が対物光学系４０の光軸に垂直な平面なので、蛍光取り込み窓５１全体を標本Ａの表面に密着させることができ、標本Ａの表面での散乱を減らして蛍光の検出効率を向上することができる。
【００５１】
また、図６に示すように、付加光学系５０の正レンズ５４の中心部分（空洞部分）を、先端に近づくに従って内径が小さくなる形状とすることで、対物光学系４０の先端部を、先端に近づくに従って径が小さくなるようなテーパー形状にしてもよい。このような形状とすることで、対物光学系４０に近い部分を通った蛍光も付加光学系５０に取り込むことができるので、蛍光の取得効率を高めて蛍光画像のＳＮ比を向上することができる。
【００５２】
また、図７に示すように、付加光学系５０の蛍光取り込み窓５１の光軸方向の位置を、対物光学系４０の先端の位置よりも基端側（図７において上側）に配置してもよい。この場合、対物光学系４０の先端を視認できるので、ユーザが観察したい場所を確認しながら蛍光観察を行うことができる。
【００５３】
また、図８に示すように、図６と同様に対物光学系４０を先端に近づくに従って径が小さくなるようなテーパー形状として、光ファイバ束５２をその周りに沿って、対物光学系４０の光軸に対して傾けて配置することとしてもよい。この場合には、光ファイバ束５２の先端を接着剤で固めた後、その先端面が対物光学系４０の光軸に対して垂直になるように研磨し、これを蛍光取り込み窓５１としてもよい。
【００５４】
このような形状とすることで、光ファイバ束５２の光軸を集光点３４に向けることができる。
なお、図８に示す例において、光ファイバ束５２の光軸の向きを、蛍光取り込み窓５１における蛍光の屈折角と略同じ角度となるように、光ファイバ束５２を配置することが好適である。
【００５５】
このようにすることで、光ファイバ束５２内において、蛍光取り込み窓５１に取り込まれた蛍光を光ファイバ束５２の光軸に沿う方向に導光することができるので、蛍光の検出効率を向上することができる。
上記の構成は、標本Ａの散乱が比較的小さく、集光点３４からの非散乱光が多い場合に特に有効である。
【００５６】
また、導光手段である光ファイバ束５２は、例えば直径１ｍｍ程度の太い石英ファイバを使用してもよいし、あるいは液体ファイバを用いてもよい。
光ファイバ束５２を液体ファイバとした場合、ファイバとファイバとの隙間が無いため、蛍光の取得効率をさらに高め、蛍光画像のＳＮ比を向上することができる。
【００５７】
また、光検出器１７や光検出器２３の前段に、ダイクロイックミラーなどの分光素子などを入れて蛍光の進路を波長帯ごとに分けて、各波長帯の光をそれぞれ別々の光検出素子で検出してもよい。
また、対物光学系４０に対して付加光学系５０の先端部が光軸方向に可動するように構成し、蛍光取り込み窓５１の光軸方向の位置を自由に決められるようにしてもよい。
また、対物光学系４０に有限系の顕微鏡対物レンズを使用してもよい。
【００５８】
〔第２の実施形態〕
次に、本発明の第２の実施形態に係る蛍光観察装置１について、主に図９から図１４を参照して説明する。以下、本実施形態の蛍光観察装置２について、第１の実施形態に係る蛍光観察装置１と共通する点については説明を省略し、異なる点について主に説明する。
【００５９】
本実施形態に係る蛍光観察装置２は、標本Ａは生体、特に脳組織等の比較的柔らかいものを観察するのに適した実施形態である。
図９に示すように、対物光学系４０は、標本Ａ内部に損傷を少なく挿入できるように、対物光学系４０が、先端の径が小さく形成された細径先端部４３を有している。具体的には、細径先端部４３の直径は２ｍｍ以下で、より望ましくは１ｍｍ以下が好適である。
【００６０】
付加光学系５０は、蛍光取り込み窓５１と、蛍光出口部５３と、これらの間を光学的に接続する光ファイバ束５２とで構成される。
蛍光取り込み窓５１は、図１０に示すように、複数の薄い（例えば厚さ０．３ｍｍ程度）平行平板ガラスが対物光学系４０の細径先端部４３を取り囲むように配置されて形成されている。
【００６１】
蛍光取り込み窓５１の後段には、図１１に示すように、複数の光ファイバ束５２が対物光学系４０を取り囲むように配置されている。
第１の実施形態と同様に、複数の光ファイバ束５２は途中位置で１つの束にまとめられている。複数の光ファイバ束５２は、例えば、外径は５ｍｍ、内径は細径先端部４３の外径よりも少し大きい径である。
【００６２】
光ファイバ束５２は蛍光取り込み窓５１に固定されており、この蛍光取り込み窓５１が、細径先端部４３に対して対物光学系４０の光軸方向に移動可能になっている。さらに、蛍光取り込み窓５１は、対物光学系４０に対して、ネジなどで位置を固定できるようになっている。
【００６３】
このように構成することで、対物光学系４０の細径先端部４３を標本Ａの深部まで挿入し、蛍光取り込み窓５１の位置を調整して、蛍光取り込み窓５１と標本Ａ表面を近接させて観察を行うことができる。なお、可能であれば、蛍光取り込み窓５１と標本Ａの表面とを密着させることが望ましい。
【００６４】
上記構成を有する蛍光観察装置２によれば、第１の実施形態と同様に、付加光学系５０を対物光学系４０の径方向外側に配置することで、対物レンズ先端を標本Ａに近づけた際に、付加光学系５０が邪魔になることはない。そのため、対物光学系４０の先端部を標本Ａに近づけて、標本Ａの表面から深い位置に対物光学系４０のピントを合わせることができ、標本Ａの深部の観察精度を向上することができる。
【００６５】
さらに、従来の蛍光観察装置は、対物レンズの径が大きいため、標本Ａの内部に挿入することは不可能であった。これに対して、本実施形態に係る蛍光観察装置２によれば、対物光学系４０に細径先端部４３を設けることで、標本Ａの組織の損傷を小さく抑えつつ、対物光学系４０を標本Ａの内部に挿入することができる。標本Ａの深部まで対物光学系４０の細径先端部４３を挿入すると、集光点３４の標本Ａの表面からの深さが従来と同じでも、励起光が標本Ａ内を通る距離が短くなる。これにより、励起光の散乱を少なく抑えることができ、励起光の光密度を高め、励起効率を向上することができる。
【００６６】
また、標本Ａにおいて発生した蛍光についても、標本Ａの内部を通る距離が短くなるため、標本Ａ内における散乱を低減することができ、対物光学系４０の開口の外へ逃げてしまう蛍光の光量を低下させ、蛍光の検出効率を向上することができる。
【００６７】
また、標本Ａの深部においては、集光点３４で励起されて発生した蛍光が標本Ａ中を進む距離が、散乱の平均自由行程（散乱で妨害されること無く進むことのできる距離の平均値）を越える場合がある。この場合、散乱されずに標本Ａの表面に直接達する蛍光は非常に少なく、ほとんどの蛍光が標本Ａ内で多重散乱して標本Ａの表面に達する。多重散乱した蛍光は、さまざまな方向の成分を持って標本Ａの表面から射出されるので、標本Ａの表面から付加光学系５０までの距離が離れていると、標本Ａの表面からの出射方向が付加光学系５０から外れてしまい、付加光学系５０に取り込まれる蛍光が急激に減少する。
【００６８】
したがって、本実施形態に係る蛍光観察装置２のように、付加光学系５０を対物光学系４０の光軸方向に移動可能にすることで、標本Ａに対物光学系４０を挿入した状態で、付加光学系５０（蛍光取り込み窓５１）を標本Ａに近接または密着させることができる。これにより、付加光学系５０により多くの散乱光を取り込むことができ、画像のＳＮ比を高めて観察精度を向上することができる。
【００６９】
なお、多成分ガラスの光ファイバは、曲げ応力が小さく、曲げ半径も小さく柔軟性が高い。そこで、光ファイバ束５２に多成分ガラスの光ファイバを用いることで、付加光学系５０の蛍光取り込み窓５１の位置を容易に調整することができる。
【００７０】
また、図１２に示すように、蛍光取り込み窓５１を、対物光学系４０の細径先端部４３が通る中心部だけ貫通穴をあけた平行平板ガラスにしても良い。また、平行平板ガラスを取り付けないで、接着剤で光ファイバ束５２を固めても良い。このようにすることで、部品点数を減らすことができ、コストを削減することができる。
【００７１】
また、図１３に示すように、光ファイバ束５２を円環状に配置しても良い。このようにすることで、付加光学系５０の先端部の外径が同じでも、光ファイバ束５２のファイバ本数を増やすことが出来るので、より多くの蛍光を光検出ユニット２０まで導くことができ、高いＳＮ比を実現することができる。
【００７２】
また、図１４に示すように、対物光学系４０の先端形状を、先端に近づくに従って径が小さくなるようなテーパー形状としてもよい。さらに、付加光学系５０の光ファイバ束５２の先端を融着または接着してから、先端に近づくに従って径が小さくなるようなテーパー形状に研磨して、このテーパー面を蛍光取り込み窓５１としてもよい。
【００７３】
上記構成を有する蛍光観察装置２によれば、対物光学系４０および蛍光取り込み窓５１を先端に近づくに従って細径となるテーパー形状とすることで、標本Ａのダメージをより低減させつつ、対物光学系４０および付加光学系５０を標本Ａの内部に挿入できる。これにより、蛍光取り込み窓５１を集光点３４に近づけることができ、蛍光取り込み窓５１に取り込む蛍光量を増加させることができる。その結果、画像のＳＮ比を向上することができ、標本Ａのより深い部分の観察を行うことができる。
【００７４】
〔第３の実施形態〕
次に、本発明の第３の実施形態に係る蛍光観察装置３について、主に図１５から図１９を参照して説明する。以下、本実施形態の蛍光観察装置３について、前述の各実施形態に係る蛍光観察装置と共通する点については説明を省略し、異なる点について主に説明する。
本実施形態に係る蛍光観察装置３は、図１５に示されるように、対物光学系４０を通った蛍光と付加光学系５０を通った蛍光を同一の光検出器１７で検出できるようにしたものである。
【００７５】
対物光学系４０は、先端側に有限系レンズ４５，４６を有しており、有限系レンズ４５，４６の基端側には中間結像面６１が形成されるようになっている。中間結像面６１の近傍には、図１６に示すように、リング状の遮光部材４７が配置されている。この遮光部材４７は、有限系レンズ４５，４６の視野を規定しており、標本Ａ上で励起光が走査される範囲を規定している。
【００７６】
付加光学系５０は、蛍光取り込み窓５１と、蛍光出口部５３と、これらの間を光学的に接続する光ファイバ束５２とで構成されている。本実施形態においては、光ファイバ束５２の基端部が蛍光出口部５３となっている。蛍光取り込み窓５１は第１の実施形態と同様である。光ファイバ束５２は、図１６に示すように、例えばＮＡ０．２２で径が比較的大きい（例えば直径１ｍｍ）の石英系の光ファイバ６本が、対物光学系４０の外側を囲うように配置されている。
【００７７】
中間結像面６１と蛍光出口部５３は、対物光学系４０の光軸方向では、略同じ位置に配置されており、光軸に直交する方向では、対物光学系４０の中間結像面６１位置での視野の周辺に蛍光出口部５３が並べて配置されている。
本実施形態では、光ファイバ束５２の基端側（蛍光出口部５３）と有限系レンズ４５，４６の基端側の瞳位置をともに無限大（すなわちテレセントリック）に構成している。
【００７８】
中間結像面６１と蛍光出口部５３の基端側には、中間結像面６１からの蛍光と蛍光出口部５３からの蛍光の両方を顕微鏡本体１０に導くアダプタレンズ６２が配置されている。アダプタレンズ６２は無限遠光学系の正レンズであり、基端側の焦点が光検出器１７と共役な位置に設定されている。
【００７９】
上記構成を有する蛍光観察装置３の作用について説明する。
第１の実施形態と同様に顕微鏡本体１０から射出され、平行光束で対物光学系４０に入射した励起光は、アダプタレンズ６２（無限遠系レンズ）によって対物光学系４０内の中間結像面６１上で一旦集光され、有限系レンズ４５，４６によって再び標本Ａ内の集光点３４に集光される。
【００８０】
集光点３４では標本Ａ内の蛍光物質が励起され、蛍光が発生する。この蛍光の光路について図１７を用いて説明する。
図１７において、標本Ａ内の集光点３４で発した蛍光のうち、対物光学系４０の有限系レンズ４５，４６の開口範囲内に入ったもの（直接光および散乱光）は実線で示している。また、標本Ａ内の集光点３４で発した蛍光のうち、付加光学系５０に入ったもの（直接光および散乱光）は点線で示している。なお、図１７は、励起光が走査されて、対物光学系４０の光軸から外れたときの状態を示している。
【００８１】
標本Ａにおいて発生した蛍光のうち、対物光学系４０に入射した蛍光は、有限系レンズ４５，４６を通って、アダプタレンズ６２（無限遠系レンズ）により集光され、ダイクロイックミラー１４を透過する。そして、励起光カットフィルタ１５を通過することで励起光がカットされ、リレー光学系１６を介して光検出器１７に入射し、光検出器１７により電気信号に変換される。
【００８２】
標本Ａにおいて発生した蛍光のうち、対物光学系４０の有限系レンズ４５，４６の開口範囲内に入らなかった蛍光の一部は、付加光学系５０に入射する。この蛍光は、蛍光取り込み窓５１に入射した後、光ファイバ束５２により導光され、蛍光出口部５３から射出される。そして、アダプタレンズ６２（無限遠系レンズ）により集光され、ダイクロイックミラー１４を透過する。そして、励起光カットフィルタ１５を通過することで励起光がカットされ、リレー光学系１６を介して光検出器１７に入射し、光検出器１７により電気信号に変換される。
【００８３】
上記のように、対物光学系４０の有限系レンズ４５，４６を通った蛍光と付加光学系５０を通った蛍光の両方が同一の光検出器１７で検出される。
以上のように、本実施形態に係る蛍光観察装置３によれば、第１の実施形態と同様に、付加光学系５０を対物光学系４０の径方向外側に配置することで、対物レンズ先端を標本Ａに近づけた際に、付加光学系５０が邪魔になることはない。そのため、対物光学系４０の先端部を標本Ａに近づけて、標本Ａの表面から深い位置に対物光学系４０のピントを合わせることができ、標本Ａの深部の観察精度を向上することができる。
【００８４】
また、本実施形態では、光ファイバ束５２の基端側（蛍光出口部５３）と有限系レンズ４５，４６の基端側の瞳位置をともに無限大（すなわちテレセントリック）にし、さらに、アダプタレンズ６２を無限遠系光学系として、その基端側の焦点と、光検出器１７を共役関係になるように配置している。これにより、励起光を走査したときでも、対物光学系４０の有限系レンズ４５，４６を通った蛍光は、常に光検出器１７に入射させることができ、さらに、付加光学系５０を通った蛍光も同じ光検出器１７に入射するようにできる。
【００８５】
これにより、対物光学系４０と付加光学系５０を別々の光検出器で検出する場合と比較して、光検出器に入る蛍光の光量が多くなるので、画像のＳＮ比を向上させることができる。これにより、標本Ａのより深い部分の観察が可能になる。また、光検出器１７からの情報を１つとすることができ、後に実行される電気的な処理（例えば画質向上のための処理）を簡易的なものとすることができる。
【００８６】
また、付加光学系５０用の光検出器を別途設ける必要が無いので、一般の多光子励起顕微鏡をそのまま使うことができる。
なお、これらの光学系の瞳位置の配置は、上記に限定されるものではなく、対物光学系４０の有限系レンズ４５，４６の基端側の瞳位置と付加光学系５０の基端側の瞳位置が一致するように構成し、これらの瞳がアダプタレンズ６２によって、光検出器１７の位置にリレーされるようにしてあればよい。
【００８７】
また、図１８に示すように、対物光学系４０の先端部および付加光学系５０の先端部を、第２の実施形態で示した態様としてもよい。
図１８に示すように、本変形例に係る蛍光観察装置３’は、対物光学系４０の先端に細径先端部４３を有している。また、第２の実施形態と同様に、光ファイバ束５２が蛍光取り込み窓５１に固定されており、蛍光取り込み窓５１が、対物光学系４０の光軸方向に移動可能になっている。
【００８８】
光ファイバ束５２は、第２の実施形態と同様に、高ＮＡ（例えばＮＡ０．６５）で径が小さい（例えば直径３０μｍ）の多成分ガラスの光ファイバを束ねたものである。
上記構成を有する蛍光観察装置３’によれば、第２の実施形態と同様に、励起効率や蛍光の検出効率を上げることができ、画像のＳＮ比を向上することができる。
【００８９】
なお、励起光の光走査の範囲について、励起光が光ファイバ束５２の基端部に集光して光ファイバ束５２に損傷を与えないようにするため、対物光学系４０のアダプタレンズ６２を通過した後の中間像位置で、付加光学系５０の蛍光出口部５３の有効範囲に励起光が入らないようにすることが望ましい。
具体的には、例えば図１６に示すように、励起光の走査範囲に遮光部材４７を設け、付加光学系５０の蛍光出口部５３を走査範囲の外に配置することが考えられる。
【００９０】
また、励起光の走査範囲が円形では無く、正方形や長方形の場合、図１９に示すように、励起光の走査範囲に合わせて遮光部材４７を正方形や長方形としてもよい。この場合には、光ファイバ束５２を遮光部材４７の側面の周囲に配置し、これらを束ねて蛍光出口部５３とすることで、アダプタレンズ６２の視野数を大きく取らずにすむメリットがある。
【００９１】
なお、対物光学系４０のアダプタレンズ６２を通過した後の中間像位置で、付加光学系５０の蛍光出口部５３の有効範囲に励起光が入らないように走査すれば遮光部材は不要である。
また、光ファイバ束５２（導光手段）は蛍光を蛍光出口部５３まで導けば良く、第１の実施形態と同様に他の導光手段に変更することも可能である。
【００９２】
〔第４の実施形態〕
次に、本発明の第４の実施形態に係る蛍光観察装置４について、主に図２０を参照して説明する。以下、本実施形態の蛍光観察装置４について、前述の各実施形態に係る蛍光観察装置と共通する点については説明を省略し、異なる点について主に説明する。
本実施形態に係る蛍光観察装置４は、図２０に示されるように、第３の実施形態に係る蛍光観察装置３において、蛍光出口部５３の部分が変形された態様である。
【００９３】
付加光学系５０の先端部４３は、図１８に示される第３の実施形態（変形例）に係る蛍光観察装置３’の先端形状と同様である。
第３の実施形態に係る蛍光観察装置３と異なる点は、有限系レンズ４５，４６の中間像面が、光ファイバ束５２の基端部（蛍光出口部５３）ではなく、光ファイバ束５２の基端部の共役面である中間結像面６１に形成される点である。
【００９４】
光ファイバ束５２の基端部の共役面は、付加光学系５０に設けられたリレーレンズ（付加光学系リレーレンズ）５５およびミラー５６によって形成される。
付加光学系５０のリレーレンズ５５の基端側（ミラー５６で反射後）の瞳位置は、付加光学系５０からの蛍光が効率よく光検出器１７に入るように、対物光学系４０の光軸方向に有限系レンズ４５，４６と瞳位置を略一致させている。
【００９５】
本実施形態では、付加光学系５０のリレーレンズ５５は、両テレセントリック光学系（瞳位置が前後ともに無限大）になっており、ミラー５６で付加光学系５０の光軸を直角に曲げて、中間像部分での付加光学系５０の瞳位置も無限大としている。また、有限系レンズ４５，４６の基端側の瞳位置も、これに合わせて無限大（すなわち、テレセントリック）としている。
【００９６】
上記構成を有する蛍光観察装置４の作用について説明する。
第３の実施形態において、付加光学系５０の光ファイバ束５２の基端部のＮＡと有限系レンズ４５，４６の中間像側のＮＡが大きく異なるものを使用した場合、光が途中でけられないようにするため、アダプタレンズ６２のＮＡを大きいほうにあわせる必要がある。しかし、本実施形態のように付加光学系５０のリレーレンズ５５を使って、付加光学系５０の中間結像面６１におけるＮＡを有限系レンズ４５，４６のＮＡにあわせることで、アダプタレンズ６２のＮＡをどちらかに大きいほうにあわせる必要がなくなる。
【００９７】
なお、ミラー５６は、光ファイバ束５２の基端部と、その共役面である中間結像面６１との距離が長いので、光ファイバ束５２およびリレーレンズ５５を付加光学系５０の光軸に対して横方向に逃がすために設けている。
【００９８】
また、光ファイバ束５２の基端部と付加光学系５０のリレーレンズ５５を着脱自在にして、付加光学系５０を交換できるようにしてもよい。その際、各々の付加光学系５０に対して付加光学系５０のリレーレンズ５５で蛍光出口部５３側のＮＡを調整して有限系レンズ４５，４６に合わせるようにすればよい。
なお、目的に合わせて、付加光学系５０の仕様（光ファイバ束５２の太さやＮＡ，蛍光取り込み窓５１の形状など）を交換しても、有限系レンズ４５，４６やアダプタレンズ６２を変える必要が無い。
【００９９】
また、光ファイバ束５２の基端部、付加光学系５０のリレーレンズ５５、およびミラー５６を一体で着脱可能としてもよい。
さらに、光ファイバ束５２が同じＮＡであれば、光ファイバ束５２の基端部から着脱してもよい。
【０１００】
〔第５の実施形態〕
次に、本発明の第５の実施形態に係る蛍光観察装置５について、主に図２１から図２８を参照して説明する。以下、本実施形態の蛍光観察装置５について、前述の各実施形態に係る蛍光観察装置と共通する点については説明を省略し、異なる点について主に説明する。
【０１０１】
本実施形態に係る蛍光観察装置５は、対物光学系４０を通った蛍光と付加光学系５０を通った蛍光とを同一の光検出器１７で検出するようにするための蛍光合成手段を、前述の第３の実施形態および第４の実施形態とは別の構成で実現するものである。
【０１０２】
本実施形態に係る蛍光観察装置５は、図２１に示されるように、顕微鏡本体１０と、対物光学系４０、付加光学系５０と、対物光学系４０基端部と顕微鏡本体１０の間に設けられた蛍光合成部（光合成手段）７０とを備えている。
なお、図２１に示す例では、細径先端部４３を有する対物光学系４０を示しているが、それ以外の対物光学系４０でもよい。
【０１０３】
蛍光合成部７０は、図２２に示すように、励起光および対物光学系４０を通ってきた蛍光が通る中心部７３と、付加光学系５０を通ってきた蛍光が通る周辺部７４で構成されており、これら蛍光を合成するようになっている。
周辺部７４は、光ファイバ束５２の基端部から蛍光が入射するコリメートレンズ（付加光学系コリメートレンズ）７１と、コリメートレンズ７１からの蛍光を偏向するプリズム（偏向素子）７２で構成されている。なお、プリズム７２に代えて、ミラーを配置することとしてもよい。
【０１０４】
光ファイバ束５２の基端部は、蛍光取り込み窓５１に接続された光ファイバ束５２が一旦ばらばらになった後、複数の束にまとめられたもので、蛍光合成部７０の側面に配置されている。
【０１０５】
上記構成を有する蛍光観察装置５の作用について説明する。
対物光学系４０を通った蛍光は、対物光学系４０で略平行光束になって、蛍光合成部７０の中心部７３を通り、顕微鏡本体１０に入射する。
【０１０６】
蛍光取り込み窓５１および光ファイバ束５２を通って、光ファイバ束５２の基端側から射出された蛍光は、コリメートレンズ７１により屈折される。コリメートレンズ７１は、コリメートレンズ７１の焦点と光ファイバ束５２の基端部を略一致させて、光ファイバ束５２の一点から出た光が略平行光束になるように配置されている。実際には、光ファイバ束５２は面積をもっているので、複数の平行光束が角度を持って重なり合った形になる。
【０１０７】
コリメートレンズ７１を出た蛍光は、プリズム７２により対物光学系４０の光束と同じ方向に偏向され、対物光学系４０の光束の外側に通って、顕微鏡本体１０に入射する。このように、対物光学系４０および付加光学系５０を通った蛍光は、蛍光合成部７０により合成され、顕微鏡本体１０のリレーレンズ１６により同一の光検出器１７に集光され、該光検出器１７により検出される。
【０１０８】
ここで、光ファイバ束５２の基端側の形状は、図２３に示すように、円弧状にするとよい。このような形状にすることで、付加光学系５０を通った蛍光の光束の広がり角が横方向に大きくならないので、顕微鏡本体１０側の視野数を大きくしないで済む。
【０１０９】
また、蛍光合成部７０における導光方法は、顕微鏡本体１０と対物光学系４０の条件によって、以下の２通りの設定の仕方がある。
１つ目は、顕微鏡本体１０の視野が対物光学系４０の視野と比較して大きい場合であり、この場合には対物光学系４０の視野外に付加光学系５０からの蛍光を通すことが有利である。
２つ目は光検出器１７の検出領域が対物光学系４０で使用する領域よりも大きい場合であり、この場合には対物光学系４０の瞳の外側に付加光学系５０からの蛍光を通すことが有利である。
【０１１０】
以下、上記の蛍光合成部７０における導光方法について、それぞれの場合に分けて詳述する。
まず、１つ目の条件のときの蛍光合成部７０での光の条件設定、すなわち対物光学系４０の視野外に付加光学系５０の光を通す場合について説明する。
図２４および図２５は、蛍光の光路を示している。
図２４および図２５においてダイクロイックミラー１４と励起光カットフィルタは省略してある。また、実線は対物光学系４０の最大視野のマージナル光線、点線は付加光学系５０を通る光束を示している。また、符号８１は対物光学系４０の瞳面、符号８２はコリメートレンズ７１の瞳面を示している。
【０１１１】
光ファイバ束５２の基端部とコリメートレンズ７１との位置関係は、コリメートレンズ７１の焦点と光ファイバ束５２の基端部を略一致させて、光ファイバの一点から出た光が略平行光束になるようにしてある。実際の光束の形は、光ファイバ束５２は面積をもっているので、複数の平行光束が角度を持って重なり合う形になる。
【０１１２】
光ファイバ束５２の基端側から射出されて、コリメートレンズ７１で屈折された蛍光は、プリズム７２により、対物光学系４０の光束の外側に通るようになっている。
このときの光束の角度は以下のように設定している。
【０１１３】
付加光学系５０を通る蛍光でコリメートレンズ７１から射出される光の光束のうち、対物光学系４０の光軸に対する角度が最も小さいもの（角度α）が、対物光学系４０の最大視野のマージナル光線の瞳位置での光軸に対する角度（β）よりも大きくなるように、プリズム７２、光ファイバ束５２の形状、コリメートレンズ７１の焦点距離などを設定する。
【０１１４】
観察時は励起光の走査範囲を角度αより小さくする。例えば、図２４に示す例では、光ファイバ束５２の中心をコリメートレンズ７１に合わせ、コリメートレンズ７１の光軸を対物光学系４０の光軸に直交させ、プリズム７２の角度を対物光学系４０の光軸に対して少し外側に傾けることで、付加光学系５０の光束の角度が上記条件に当てはまるように設定している。
【０１１５】
なお、付加光学系５０の光束の角度の設定は、例えば、図２５に示すように、コリメートレンズ７１の光軸に対して光ファイバ束５２の基端部を偏心させる方法や、その他の方法でもよい。
【０１１６】
光ファイバ束５２の基端部およびコリメートレンズ７１の位置は、以下のように設定する。付加光学系５０のコリメートレンズ７１から射出される蛍光の光束は、プリズム７２で反射されているので、対物光学系４０側へ投影して考える。
コリメートレンズ７１の瞳位置の設定は、ミラー７５によって対物光学系４０の光束を遮らない範囲で、対物光学系４０の瞳とできるだけ多く重なるようにするとよい。
【０１１７】
ここで、図２６は、上記設定をしたときの対物光学系４０および付加光学系５０を通った蛍光の光検出器１７上での分布である。符号７６は対物光学系４０を通った蛍光の投影範囲、符号７７は付加光学系５０を通った蛍光の投影範囲を示している。
上記の設定を行うことで、図２６に示すように、光検出器１７の中心付近に付加光学系５０を通った光を多く導くことができ、蛍光の検出効率を高めることができる。このように、付加光学系５０を通った蛍光を、対物光学系４０の視野外を通して光検出器１７まで到達させることができる。
【０１１８】
次に、２つ目の条件のときの蛍光合成部７０での光の条件設定、すなわち対物光学系４０の瞳の外側に付加光学系５０の光を通す場合について説明する。
図２７は、光ファイバ束５２の基端部の中心とコリメートレンズ７１の光軸を一致させて、ミラー７５によりコリメートレンズ７１の光軸を顕微鏡本体１０側に直角に曲げている例を示している。また、符号８１は対物光学系４０の瞳面、符号８２はコリメートレンズ７１の瞳面、符号８３はコリメートレンズ７１の瞳相当面を示している。
【０１１９】
図２４および図２５との違いは、光ファイバ束５２の基端部、コリメートレンズ７１、ミラー７５の配置を変えて、コリメートレンズ７１から射出される蛍光（付加光学系５０を通る蛍光）の光束が対物光学系４０の光軸と平行になる成分を含むようにしている点である。
【０１２０】
まず、光ファイバ束５２の基端部およびコリメートレンズ７１の位置設定について説明する。
本実施形態では、コリメートレンズ７１の基端側の瞳位置（ミラー７５より先端側にある場合は瞳に相当する位置）を、光軸方向で対物光学系４０の瞳位置の近傍に配置している。また、横方向は、ミラー７５が対物光学系４０の最大視野の光束を遮らない範囲で、できるだけ光軸に近いところに互いの瞳が重ならないようにずらして配置している。
【０１２１】
図２８は、以上の設定をしたときの対物光学系４０および付加光学系５０を通った蛍光の光検出器１７上での分布である。光検出器１７上では、対物光学系４０と通った蛍光の周辺に付加光学系５０を通った蛍光が分布する形になる。ここで、符号７６は対物光学系４０を通った蛍光の投影範囲、符号７７は付加光学系５０を通った蛍光の投影範囲を示している。
【０１２２】
また、励起光が付加光学系５０に入らないように、すなわち励起光が光ファイバ束５２の基端部に達しないようにするため、コリメートレンズ７１とミラー７５との間に励起光カットフィルタ７８を設けることが望ましい。また、励起カットフィルタ７８の代わりに、ミラー７５を、励起光を透過させる一方で、多光子励起によって発生した蛍光を反射する特性にしてもよい。あるいは、励起光の瞳径を対物光学系４０の瞳径にできるだけ合わせて小さくして、付加光学系５０の瞳に入らないようにしてもよい。
上記の設定を行うことで、付加光学系５０を通った蛍光を、対物光学系４０の瞳の外側を通して光検出器１７まで到達させることができる。
【０１２３】
以上のように、本実施形態に係る蛍光観察装置５によれば、付加光学系５０を有していない蛍光観察装置でも、蛍光合成部７０を顕微鏡本体１０と対物光学系４０との間に挿入し、付加光学系５０の先端部を組み合わせて使うことで、画像のＳＮ比を向上することができる。これにより、標本Ａのより深い部分の観察が可能になる。
【０１２４】
また、対物光学系４０と付加光学系５０を別々の光検出器で検出する場合と比較して、光検出器に入る蛍光の光量が多くなるので、画像のＳＮ比を向上させることができる。これにより、標本Ａのより深い部分の観察が可能になる。また、光検出器１７からの情報を１つとすることができ、後に実行される電気的な処理（例えば画質向上のための処理）を簡易的なものとすることができる。
【符号の説明】
【０１２５】
Ａ 標本
１，２，３，３’，４，５ 蛍光観察装置
１０ 顕微鏡本体
１１ レーザ光源
１２ 走査ミラー
１３ リレー光学系
１４ ダイクロイックミラー
１５ 励起光カットフィルタ
１６ リレー光学系
１７ 光検出器（光検出部）
２０ 光検出ユニット
２１ リレー光学系
２２ 励起光カットフィルタ
２３ 光検出器（光検出部）
３０ 光学系
３４ 集光点（ピント位置）
４０ 対物光学系
４１ 入射面
４２ 対物レンズ
４３ 細径先端部
４５ 有限系レンズ
４６ 有限系レンズ
５０ 付加光学系
５１ 蛍光取り込み窓（入射面）
５２ 光ファイバ束（導光部）
５３ 蛍光出口部
５４ 正レンズ
５５ リレーレンズ（付加光学系リレーレンズ）
５６ ミラー
６１ 中間結像面
６２ アダプタレンズ
７０ 蛍光合成部（光合成手段）
７１ コリメートレンズ（付加光学系コリメートレンズ）
７２ プリズム（偏向素子）
７３ 中心部
７４ 周辺部
７５ ミラー（偏向素子）
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光観察装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
多光子励起では、非線形効果により励起光の集光点近傍にある蛍光物質のみが励起され、集光点近傍以外では蛍光物質は励起されない。その原理を利用して、従来、標本における励起光の集光点を走査しながら蛍光を検出し、画像を再構成する多光子励起顕微鏡が知られている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
非特許文献１に開示されている多光子励起顕微鏡は、対物レンズと標本との間に、励起光の集光位置に向けて配置された複数の光ファイバを備えている。このような構成を有することで、対物レンズに入らなかった蛍光を光ファイバにより捉えて、蛍光画像のＳＮ比を高めるようになっている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】ＯＰＴＩＣＳ ＥＸＰＲＥＳＳ，ｐ．６４２１−６４３５，ＶＯＬ．１７，Ｎｏ．８，２００９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、非特許文献１に開示されている多光子励起顕微鏡では、ファイバ先端が対物と標本との間にあるため、対物レンズを標本中に挿入することができず、標本の深い部分を観察することができないという不都合がある。例えば、表面から数ｍｍの深さにあるマウスの海馬などを観察することができない。
【０００６】
また、表面からさらに深い部分を観察する場合、対物レンズと標本表面との距離を近づけてピント位置を標本深部に合わせる必要があるが、ファイバ先端が対物と標本との間にあるため、対物レンズを標本に近づけることができない。このため、標本内の深いところにピントを合わせられないという不都合がある。
【０００７】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、蛍光画像のＳＮ比を高めつつ、対物レンズと標本とを近づけて標本の深い部分を観察することができる蛍光観察装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を採用する。
本発明は、励起光を標本に照射する一方、前記標本からの蛍光を集光する対物光学系と、該対物光学系の径方向外側に配置され、前記標本からの蛍光を取り込む付加光学系と、前記対物光学系および前記付加光学系により集光された前記標本からの蛍光を検出する光検出部とを備える蛍光観察装置を採用する。
【０００９】
本発明によれば、励起光が標本に照射されることで発生した蛍光を対物光学系により集光するとともに、対物光学系に入射しなかった標本からの蛍光を付加光学系により取り込むことができる。そして、このように対物光学系および付加光学系により集光された蛍光を光検出部により検出し、これら蛍光を合成して標本の画像を生成することで、画像のＳＮ比を高めることができ、精度の高い観察を行うことができる。
【００１０】
この場合において、付加光学系を対物光学系の径方向外側に配置することで、対物レンズ先端を標本に近づけた際に、付加光学系が邪魔になることはない。そのため、対物レンズ先端を標本に近づけて、標本の表面から深い位置にピントを合わせることができ、標本の深部の観察精度を向上することができる。
【００１１】
上記発明において、前記付加光学系が、前記対物光学系の光軸方向に移動可能に設けられていることとしてもよい。
標本の深部においては、集光点で励起されて発生した蛍光が標本中を進む距離が、散乱の平均自由行程（散乱で妨害されること無く進むことのできる距離の平均値）を越える場合がある。この場合、散乱されずに標本表面に直接達する蛍光は非常に少なく、ほとんどの蛍光が標本内で多重散乱して標本表面に達する。多重散乱した蛍光は、さまざまな方向の成分を持って標本表面から射出されるので、標本表面から付加光学系までの距離が離れていると、標本表面からの出射方向が付加光学系から外れてしまい、付加光学系に取り込まれる蛍光が急激に減少する。
【００１２】
したがって、付加光学系を対物光学系の光軸方向に移動可能にすることで、標本に対して対物光学系の位置を固定した状態で、付加光学系を標本に近接または密着させることができる。これにより、付加光学系により多くの散乱光を取り込むことができ、画像のＳＮ比を高めて観察精度を向上することができる。
【００１３】
上記発明において、前記対物光学系が、前記標本内に挿入するための細径先端部を有することとしてもよい。
このようにすることで、細径先端部を標本内に挿入した状態で、標本の観察を行うことができる。これにより、励起光が標本内を通る距離を短くすることができ、標本内における励起光の散乱を少なくして集光点における励起光の光密度が高め、励起効率を向上することができる。また、標本からの蛍光が標本内を通る距離を短くすることで、標本内における蛍光の散乱が少ない状態で対物光学系により集光することができ、光検出部による蛍光の検出効率を向上することができる。
【００１４】
上記発明において、前記付加光学系が、前記対物光学系を中心とする環状の正レンズであることとしてもよい。
付加光学系を正レンズとすることで、集光点からの蛍光を途中で屈折させて、効率よく光検出部に導くことができる。また、付加光学系を対物光学系を中心とする環状に形成することで、対物光学系に入射しなかった標本からの蛍光を効率的に取り込むことができる。
【００１５】
上記発明において、前記付加光学系の前記標本からの蛍光を入射させる入射面が、前記対物光学系の光軸に略垂直に形成されていることとしてもよい。
このようにすることで、付加光学系の入射面全体を標本表面に密着させることができ、標本表面での散乱を減らして蛍光の検出効率を向上することができる。
【００１６】
上記発明において、前記入射面に入射させた蛍光を導光する導光部を備え、該導光部の光軸が、前記入射面における蛍光の屈折角と略同じ角度で配置されていることとしてもよい。
集光点で発生した蛍光は、付加光学系の入射面で対物光学系の光軸方向に向けて屈折する。この屈折角に導光部の光軸方向を合わせて配置することで、蛍光の検出効率を向上することができる。この構成は、標本の散乱が比較的小さく、集光点からの非散乱光が多い場合に特に有効である。
【００１７】
上記発明において、前記付加光学系が、先端に向かって径が小さくなるように形成されていることとしてもよい。
このようにすることで、標本へのダメージを抑えて、付加光学系を標本内に挿入することができる。これにより、付加光学系を集光点に近づけるができ、付加光学系に取り込む蛍光の光量を増加させ、画像のＳＮ比を向上することができる。
【００１８】
上記発明において、前記付加光学系の出口と略一致する面に、前記対物光学系により集光された蛍光の中間結像面を形成する有限系レンズと、前記中間結像面からの蛍光と前記付加光学系の出口からの蛍光の両方の瞳の共役面を同一の前記光検出部に導くアダプタレンズとを備えることとしてもよい。
【００１９】
このようにすることで、励起光を走査した場合でも、対物光学系および付加光学系により集光された蛍光の両方を常に同一の光検出部に入射させることができる。これにより、光検出部を１つとすることができ、装置および制御を簡易化することができる。
また、対物光学系と付加光学系の蛍光をそれぞれ別々の光検出部で検出する場合と比較して、１つの検出器に入る蛍光の光量が多くなり、ＳＮ比を高めることができる。
【００２０】
上記発明において、前記付加光学系が、前記付加光学系の前記標本からの蛍光を入射させる入射面と、該入射面に入射させた蛍光を導光する導光部と、該導光部の基端部と前記中間結像面が形成される位置との間に設けられ、前記導光部の基端部と共役な面を、前記中間結像面が形成される位置に形成する付加光学系リレーレンズとを備えることとしてもよい。
【００２１】
通常、付加光学系の導光部の基端部のＮＡと有限系レンズの中間結像面側のＮＡが大きく異なるものを使用した場合、光が途中でけられないようにするため、アダプタレンズのＮＡを大きいほうに合わせる必要がある。しかしながら、上記の構成とすることで、付加光学系リレーレンズを使って、導光部の基端部のＮＡを有限系レンズのＮＡに合わせられるので、アダプタレンズのＮＡをどちらかに大きいほうに合わせる必要がなくなる。
【００２２】
上記発明において、前記対物光学系により集光された蛍光と前記付加光学系により取り込まれた蛍光とを合成する光合成手段を備えることとしてもよい。
このようにすることで、対物光学系により集光された蛍光と付加光学系により取り込まれた蛍光とを光合成手段により合成し、合成した光を同一の光検出部により検出することができる。これにより、光検出部を１つとすることができ、装置および制御を簡易化することができる。
また、対物光学系と付加光学系の蛍光をそれぞれ別々の光検出部で検出する場合と比較して、１つの検出器に入る蛍光の光量が多くなり、画像のＳＮ比を高めることができる。
【００２３】
上記発明において、前記光合成手段が、励起光および前記対物光学系により集光された蛍光が通る中心部と、前記付加光学系により取り込まれた蛍光が通る周辺部とで構成され、前記周辺部が、前記導光部の基端部の蛍光を略平行にする形成する付加光学系コリメートレンズと、前記付加光学系コリメートレンズからの光を偏向する偏向素子とを有することとしてもよい。
【００２４】
対物光学系により集光された蛍光は、対物光学系でほぼ平行光束になって、光合成手段の中心部を通り、蛍光観察装置本体に入射する。
導光部を通って、導光部の基端側から射出された蛍光は、付加光学系コリメートレンズで屈折され、略平行光束になる。付加光学系コリメートレンズを出た蛍光は、偏向素子によって、対物光学系の光束と同じ方向に偏向され、対物光学系の光束の外側を通って、蛍光観察装置本体に入射する。蛍光観察装置本体に入射した蛍光は、同一の光検出部により検出される。
【００２５】
これにより、付加光学系を備えていない通常の対物光学系でも、光合成手段を蛍光観察装置本体と対物光学系との間に挿入し、それに付加光学系の先端部を組み合わせて使うことができ、画像のＳＮ比を高めることができる。これにより、標本のより深い部分の観察が可能になる。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によれば、蛍光画像のＳＮ比を高めつつ、対物レンズと標本とを近づけて標本の深い部分を観察することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明の第１の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置の全体構成図である。
【図２】図１の光ファイバ束の集合前の位置における横断面図である。
【図３】図１の光ファイバ束の集合後の位置における横断面図である。
【図４】図１の光学系の焦点位置を説明する図である。
【図５】図１の変形例に係る光学系の縦断面図である。
【図６】図１の変形例に係る光学系の縦断面図である。
【図７】図１の変形例に係る光学系の縦断面図である。
【図８】図１の変形例に係る光学系の縦断面図である。
【図９】本発明の第２の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置の全体構成図である。
【図１０】図９の光学系の正面図である。
【図１１】図９の光学系の横断面図である。
【図１２】図９の変形例に係る光学系の正面図である。
【図１３】図９の変形例に係る光学系の正面図である。
【図１４】図９の変形例に係る光学系の縦断面図である。
【図１５】本発明の第３の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置の全体構成図である。
【図１６】図１５の光学系の中間像面位置における横断面図である。
【図１７】図１５のレーザ顕微鏡装置の光路を説明する図である。
【図１８】図１５の変形例に係るレーザ顕微鏡装置の全体構成図である。
【図１９】図１５の変形例に係る光学系の中間像面位置における横断面図である。
【図２０】本発明の第４の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置の全体構成図である。
【図２１】本発明の第５の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置の全体構成図である。
【図２２】図２１の蛍光合成部の横断面図である。
【図２３】図２１の蛍光合成部の光ファイバ束接続位置における側面図である。
【図２４】図２１のレーザ顕微鏡装置において、対物光学系の視野外に付加光学系の光を通す場合の光路を説明する図である。
【図２５】図２４の変形例に係る光路を説明する図である。
【図２６】図２４または図２５に示す光路による、光検出部における蛍光の入射位置を示す平面図である。
【図２７】図２１のレーザ顕微鏡装置において、対物光学系の瞳の外側に付加光学系からの蛍光を通す場合の光路を説明する図である。
【図２８】図２７に示す光路による、光検出部における蛍光の入射位置を示す平面図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
〔第１の実施形態〕
本発明の第１の実施形態に係る蛍光観察装置１について、図１から図８を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る蛍光観察装置１は、図１に示すように、励起光を射出するとともに標本Ａにおいて発生した蛍光を検出する顕微鏡本体１０と、顕微鏡本体１０とは別個に設けられ、標本Ａからの蛍光を検出する光検出ユニット２０と、顕微鏡本体１０からの励起光および標本Ａからの蛍光を導く光学系３０とを備えている。
【００２９】
顕微鏡本体１０は、多光子励起顕微鏡であり、標本Ａに励起光を照射することで、標本Ａ内の蛍光物質を励起させ、発生した蛍光を検出するようになっている。
顕微鏡本体１０は、励起光である短パルスレーザ光を射出するレーザ光源１１と、標本Ａ上において短パルスレーザ光の集光点を光軸に直交する方向に走査する走査ミラー１２と、短パルスレーザ光の瞳をリレーするリレー光学系１３と、励起光と標本Ａからの蛍光とを分離するダイクロイックミラー１４と、標本Ａからの蛍光の瞳をリレーするリレー光学系１６と、ダイクロイックミラー１４とリレー光学系１６との間に設けられた励起光カットフィルタ１５と、標本Ａからの蛍光を検出する、例えば光電子増倍管等の光検出器１７とを備えている。
【００３０】
光学系３０は、顕微鏡本体１０から射出された励起光を標本Ａに照射する一方、標本Ａからの蛍光を集光する対物光学系４０と、対物光学系４０の径方向外側に配置され、標本Ａからの蛍光を取り込む付加光学系５０とを備えている。
【００３１】
対物光学系４０は、標本Ａからの蛍光が入射する入射面４１と、入射面４１の後段に配置された対物レンズ４２とを備えている。
入射面４１は、標本Ａ上に載置されたカバーガラス３２に近接または当接され、標本Ａの集光点（ピント位置）３４において発生した蛍光が入射するようになっている。
【００３２】
対物レンズ４２は、標本Ａの集光点３４に顕微鏡本体１０からの励起光を集光するとともに、標本Ａの集光点３４において発生し、入射面４１に入射した標本Ａからの蛍光を集光するようになっている。対物レンズ４２は、例えば無限遠光学系で設計されており、標本Ａからの蛍光を略平行な光束にして、顕微鏡本体１０へ取り込み、リレー光学系１６で光検出器１７に導くようになっている。
【００３３】
付加光学系５０は、対物光学系４０の径方向外側に配置され、標本Ａからの蛍光が取り込まれる蛍光取り込み窓（入射面）５１と、蛍光取り込み窓５１に取り込まれた蛍光を導光する光ファイバ束（導光部）５２と、光ファイバ束５２により導光された蛍光を射出する蛍光出口部５３とを備えている。
【００３４】
蛍光取り込み窓５１は、光軸に沿う方向には、対物光学系４０の先端部（入射面４１）と略同じ高さに設けられており、光軸に直交する方向には、対物光学系４０の先端部（入射面４１）の外側に設けられている。蛍光取り込み窓５１の具体的な形状は、例えば、先端側に凸面を向けた平凸型の正レンズ５４であり、対物光学系４０が配置された中心部分がくり抜かれた円筒形状（円環形状）を有している。
【００３５】
光ファイバ束５２は、図１および図２に示すように、蛍光取り込み窓５１の後段において対物光学系４０を取り囲むように配置されている。また、光ファイバ束５２は、図１および図３に示すように、途中位置で一つの束にまとめられ、蛍光出口部５３まで続いている。
【００３６】
光ファイバ束５２は、蛍光取り込み窓５１と蛍光出口部５３との間において、全体として被覆されているが、被覆の中で個々の光ファイバはばらばらになっていて、柔軟性をもたせている。光ファイバ束５２は、高ＮＡ（例えばＮＡ０．６５）で径が小さい（例えば直径３０μｍ）の多成分ガラスの光ファイバを束ねたものである。
【００３７】
蛍光出口部５３と光検出ユニット２０とは光学的に接続されており、付加光学系５０を通った蛍光は光検出ユニット２０に導かれる。
なお、対物レンズ４２および蛍光出口部５３はともに着脱自在になっていて、対物光学系４０および付加光学系５０は交換可能とされている。
【００３８】
光検出ユニット２０は、光ファイバ束５２により導光された蛍光の瞳をリレーするリレー光学系２１と、リレー光学系２１によりリレーされた光から励起光をカットする励起光カットフィルタ２２と、標本Ａからの蛍光を検出する、例えば光電子増倍管等の光検出器２３とを備えている。
【００３９】
上記構成を有する蛍光観察装置１の作用について説明する。
レーザ光源１１から励起光として射出された短パルスレーザ光は、走査ミラー１２により偏向された後、リレー光学系１３により瞳がリレーされる。そして、短パルスレーザ光は、ダイクロイックミラー１４により対物光学系４０に向けて反射され、対物光学系４０（対物レンズ４２）により標本Ａ内の集光点３４に集光される。
【００４０】
これにより、標本Ａにおける集光点３４近傍の蛍光物質が励起され、蛍光が発生する。
標本Ａ内で発生した蛍光のうち、対物光学系４０の開口範囲内に入ったもの（直接光および散乱光）は、対物光学系４０（対物レンズ４２）により集光され、ダイクロイックミラー１４を透過する。ダイクロイックミラー１４を透過した蛍光は、励起光カットフィルタ１５により励起光が取り除かれた後、リレー光学系１６を介して光検出器１７により検出され、電気信号に変換される。
【００４１】
一方、標本Ａ内で発生した蛍光のうち、対物光学系４０の開口範囲内に入らなかった光の一部（直接光および散乱光）は、付加光学系５０（蛍光取り込み窓５１）により取り込まれ、光ファイバ束５２により導光される。光ファイバ束５２により導光された蛍光は、リレー光学系２１によりリレーされ、励起光カットフィルタ２２により励起光が取り除かれた後、光検出器２３により検出され、電気信号に変換される。
【００４２】
この際、走査ミラー１２により２軸方向に短パルスレーザ光を偏向させることで、標本Ａ上において集光点３４を水平方向に走査させる。そして、走査ミラー１２の動きに合わせて、光検出器１７および光検出器２３により検出された蛍光の強度を合成してモニター上（図示略）で画像を再構成すると、標本Ａの２次元画像が得られる。さらに、対物レンズ４２と標本Ａとの間隔を変える走査を行うことで、標本Ａの３次元の画像を構築することができる。
なお、走査ミラー１２の走査位置による明るさのムラを少なくするために、光検出器１７の位置は、対物光学系４０の瞳位置と共役な位置近傍にあることが望ましい。
【００４３】
以上のように、本実施形態に係る蛍光観察装置１によれば、励起光が標本Ａに照射されることで発生した蛍光を対物光学系４０により集光するとともに、対物光学系４０に入射しなかった標本Ａからの蛍光を付加光学系５０により取り込むことができる。そして、このように対物光学系４０および付加光学系５０により集光された蛍光を光検出器１７および光検出器２３により検出し、これら蛍光を合成して標本Ａの画像を生成することで、画像のＳＮ比を高めることができ、精度の高い観察を行うことができる。
【００４４】
この場合において、付加光学系５０を対物光学系４０の径方向外側に配置することで、対物レンズ先端を標本Ａに近づけた際に、付加光学系５０が邪魔になることはない。そのため、対物光学系４０先端（入射面４１）を標本Ａに近づけて、標本Ａの表面から深い位置に対物光学系４０のピントを合わせることができ、標本Ａの深部の観察精度を向上することができる。
【００４５】
また、付加光学系５０に正レンズ５４を採用することで、集光点３４からの蛍光を途中で屈折させて、効率よく光検出器２０に導くことができる。また、付加光学系５０を、対物光学系４０を中心とする円筒形状（円環形状）とすることで、対物光学系４０に入射しなかった標本Ａからの蛍光を効率的に取り込むことができる。
【００４６】
なお、蛍光取り込み窓５１を対物光学系４０先端部の外側に配置すると、集光点３４から蛍光取り込み窓５１まで距離が比較的長くなってしまう。しかしながら、蛍光取り込み窓５１を正レンズ５４とすることで、集光点３４からの蛍光を途中で屈折させて、効率よく光ファイバ束５２に導くことができ、効率的に蛍光を検出することができる。
また、対物光学系４０の側面は大きさの制限が無いので、光ファイバ束５２の径を大きくすることで、蛍光の光量を増やすことも可能である。
【００４７】
また、集光点３４からの蛍光を効率良く取り込むため、図４に示すように、標本Ａ側焦点Ｆｓおよび光ファイバ側の焦点Ｆｆを配置することが望ましい。具体的には、図４に示すように、正レンズ５４の標本Ａ側焦点Ｆｓは、対物光学系４０の光軸上の集光点３４の近傍に配置し、光ファイバ側の焦点Ｆｆは、光軸方向において光ファイバ束５２の端部近傍に配置することが望ましい。
【００４８】
図４において、点線は、集光点３４が対物光学系４０の光軸上にあるときの光線を示しており、実線は、集光点３４が走査によって対物光学系４０の光軸からずれたときの光線を示している。上記条件により、集光点３４が光軸に直交する方向に走査されて対物光学系４０の光軸から外れ、標本Ａ側の焦点位置が焦点Ｆｅとなった場合にも、そこからの蛍光が常に光ファイバ束５２の同じ位置を通過するようになるので、走査による明るさムラを防止することができる。
【００４９】
また、図５に示すように、付加光学系５０の蛍光取り込み窓５１の形状を、光ファイバ束５２側を凸面、標本Ａ側を対物光学系４０の光軸に垂直な平面に形成することとしてもよい。
このような形状とすることで、蛍光取り込み窓５１の先端側（入射面５１）が平面なので、標本Ａと蛍光取り込み窓５１との間にある媒質の屈折率の影響を受けにくくすることができ、対物光学系４０が水浸または油浸タイプの場合に好適である。
【００５０】
また、標本Ａ側の入射面５１が対物光学系４０の光軸に垂直な平面なので、蛍光取り込み窓５１全体を標本Ａの表面に密着させることができ、標本Ａの表面での散乱を減らして蛍光の検出効率を向上することができる。
【００５１】
また、図６に示すように、付加光学系５０の正レンズ５４の中心部分（空洞部分）を、先端に近づくに従って内径が小さくなる形状とすることで、対物光学系４０の先端部を、先端に近づくに従って径が小さくなるようなテーパー形状にしてもよい。このような形状とすることで、対物光学系４０に近い部分を通った蛍光も付加光学系５０に取り込むことができるので、蛍光の取得効率を高めて蛍光画像のＳＮ比を向上することができる。
【００５２】
また、図７に示すように、付加光学系５０の蛍光取り込み窓５１の光軸方向の位置を、対物光学系４０の先端の位置よりも基端側（図７において上側）に配置してもよい。この場合、対物光学系４０の先端を視認できるので、ユーザが観察したい場所を確認しながら蛍光観察を行うことができる。
【００５３】
また、図８に示すように、図６と同様に対物光学系４０を先端に近づくに従って径が小さくなるようなテーパー形状として、光ファイバ束５２をその周りに沿って、対物光学系４０の光軸に対して傾けて配置することとしてもよい。この場合には、光ファイバ束５２の先端を接着剤で固めた後、その先端面が対物光学系４０の光軸に対して垂直になるように研磨し、これを蛍光取り込み窓５１としてもよい。
【００５４】
このような形状とすることで、光ファイバ束５２の光軸を集光点３４に向けることができる。
なお、図８に示す例において、光ファイバ束５２の光軸の向きを、蛍光取り込み窓５１における蛍光の屈折角と略同じ角度となるように、光ファイバ束５２を配置することが好適である。
【００５５】
このようにすることで、光ファイバ束５２内において、蛍光取り込み窓５１に取り込まれた蛍光を光ファイバ束５２の光軸に沿う方向に導光することができるので、蛍光の検出効率を向上することができる。
上記の構成は、標本Ａの散乱が比較的小さく、集光点３４からの非散乱光が多い場合に特に有効である。
【００５６】
また、導光手段である光ファイバ束５２は、例えば直径１ｍｍ程度の太い石英ファイバを使用してもよいし、あるいは液体ファイバを用いてもよい。
光ファイバ束５２を液体ファイバとした場合、ファイバとファイバとの隙間が無いため、蛍光の取得効率をさらに高め、蛍光画像のＳＮ比を向上することができる。
【００５７】
また、光検出器１７や光検出器２３の前段に、ダイクロイックミラーなどの分光素子などを入れて蛍光の進路を波長帯ごとに分けて、各波長帯の光をそれぞれ別々の光検出素子で検出してもよい。
また、対物光学系４０に対して付加光学系５０の先端部が光軸方向に可動するように構成し、蛍光取り込み窓５１の光軸方向の位置を自由に決められるようにしてもよい。
また、対物光学系４０に有限系の顕微鏡対物レンズを使用してもよい。
【００５８】
〔第２の実施形態〕
次に、本発明の第２の実施形態に係る蛍光観察装置１について、主に図９から図１４を参照して説明する。以下、本実施形態の蛍光観察装置２について、第１の実施形態に係る蛍光観察装置１と共通する点については説明を省略し、異なる点について主に説明する。
【００５９】
本実施形態に係る蛍光観察装置２は、標本Ａは生体、特に脳組織等の比較的柔らかいものを観察するのに適した実施形態である。
図９に示すように、対物光学系４０は、標本Ａ内部に損傷を少なく挿入できるように、対物光学系４０が、先端の径が小さく形成された細径先端部４３を有している。具体的には、細径先端部４３の直径は２ｍｍ以下で、より望ましくは１ｍｍ以下が好適である。
【００６０】
付加光学系５０は、蛍光取り込み窓５１と、蛍光出口部５３と、これらの間を光学的に接続する光ファイバ束５２とで構成される。
蛍光取り込み窓５１は、図１０に示すように、複数の薄い（例えば厚さ０．３ｍｍ程度）平行平板ガラスが対物光学系４０の細径先端部４３を取り囲むように配置されて形成されている。
【００６１】
蛍光取り込み窓５１の後段には、図１１に示すように、複数の光ファイバ束５２が対物光学系４０を取り囲むように配置されている。
第１の実施形態と同様に、複数の光ファイバ束５２は途中位置で１つの束にまとめられている。複数の光ファイバ束５２は、例えば、外径は５ｍｍ、内径は細径先端部４３の外径よりも少し大きい径である。
【００６２】
光ファイバ束５２は蛍光取り込み窓５１に固定されており、この蛍光取り込み窓５１が、細径先端部４３に対して対物光学系４０の光軸方向に移動可能になっている。さらに、蛍光取り込み窓５１は、対物光学系４０に対して、ネジなどで位置を固定できるようになっている。
【００６３】
このように構成することで、対物光学系４０の細径先端部４３を標本Ａの深部まで挿入し、蛍光取り込み窓５１の位置を調整して、蛍光取り込み窓５１と標本Ａ表面を近接させて観察を行うことができる。なお、可能であれば、蛍光取り込み窓５１と標本Ａの表面とを密着させることが望ましい。
【００６４】
上記構成を有する蛍光観察装置２によれば、第１の実施形態と同様に、付加光学系５０を対物光学系４０の径方向外側に配置することで、対物レンズ先端を標本Ａに近づけた際に、付加光学系５０が邪魔になることはない。そのため、対物光学系４０の先端部を標本Ａに近づけて、標本Ａの表面から深い位置に対物光学系４０のピントを合わせることができ、標本Ａの深部の観察精度を向上することができる。
【００６５】
さらに、従来の蛍光観察装置は、対物レンズの径が大きいため、標本Ａの内部に挿入することは不可能であった。これに対して、本実施形態に係る蛍光観察装置２によれば、対物光学系４０に細径先端部４３を設けることで、標本Ａの組織の損傷を小さく抑えつつ、対物光学系４０を標本Ａの内部に挿入することができる。標本Ａの深部まで対物光学系４０の細径先端部４３を挿入すると、集光点３４の標本Ａの表面からの深さが従来と同じでも、励起光が標本Ａ内を通る距離が短くなる。これにより、励起光の散乱を少なく抑えることができ、励起光の光密度を高め、励起効率を向上することができる。
【００６６】
また、標本Ａにおいて発生した蛍光についても、標本Ａの内部を通る距離が短くなるため、標本Ａ内における散乱を低減することができ、対物光学系４０の開口の外へ逃げてしまう蛍光の光量を低下させ、蛍光の検出効率を向上することができる。
【００６７】
また、標本Ａの深部においては、集光点３４で励起されて発生した蛍光が標本Ａ中を進む距離が、散乱の平均自由行程（散乱で妨害されること無く進むことのできる距離の平均値）を越える場合がある。この場合、散乱されずに標本Ａの表面に直接達する蛍光は非常に少なく、ほとんどの蛍光が標本Ａ内で多重散乱して標本Ａの表面に達する。多重散乱した蛍光は、さまざまな方向の成分を持って標本Ａの表面から射出されるので、標本Ａの表面から付加光学系５０までの距離が離れていると、標本Ａの表面からの出射方向が付加光学系５０から外れてしまい、付加光学系５０に取り込まれる蛍光が急激に減少する。
【００６８】
したがって、本実施形態に係る蛍光観察装置２のように、付加光学系５０を対物光学系４０の光軸方向に移動可能にすることで、標本Ａに対物光学系４０を挿入した状態で、付加光学系５０（蛍光取り込み窓５１）を標本Ａに近接または密着させることができる。これにより、付加光学系５０により多くの散乱光を取り込むことができ、画像のＳＮ比を高めて観察精度を向上することができる。
【００６９】
なお、多成分ガラスの光ファイバは、曲げ応力が小さく、曲げ半径も小さく柔軟性が高い。そこで、光ファイバ束５２に多成分ガラスの光ファイバを用いることで、付加光学系５０の蛍光取り込み窓５１の位置を容易に調整することができる。
【００７０】
また、図１２に示すように、蛍光取り込み窓５１を、対物光学系４０の細径先端部４３が通る中心部だけ貫通穴をあけた平行平板ガラスにしても良い。また、平行平板ガラスを取り付けないで、接着剤で光ファイバ束５２を固めても良い。このようにすることで、部品点数を減らすことができ、コストを削減することができる。
【００７１】
また、図１３に示すように、光ファイバ束５２を円環状に配置しても良い。このようにすることで、付加光学系５０の先端部の外径が同じでも、光ファイバ束５２のファイバ本数を増やすことが出来るので、より多くの蛍光を光検出ユニット２０まで導くことができ、高いＳＮ比を実現することができる。
【００７２】
また、図１４に示すように、対物光学系４０の先端形状を、先端に近づくに従って径が小さくなるようなテーパー形状としてもよい。さらに、付加光学系５０の光ファイバ束５２の先端を融着または接着してから、先端に近づくに従って径が小さくなるようなテーパー形状に研磨して、このテーパー面を蛍光取り込み窓５１としてもよい。
【００７３】
上記構成を有する蛍光観察装置２によれば、対物光学系４０および蛍光取り込み窓５１を先端に近づくに従って細径となるテーパー形状とすることで、標本Ａのダメージをより低減させつつ、対物光学系４０および付加光学系５０を標本Ａの内部に挿入できる。これにより、蛍光取り込み窓５１を集光点３４に近づけることができ、蛍光取り込み窓５１に取り込む蛍光量を増加させることができる。その結果、画像のＳＮ比を向上することができ、標本Ａのより深い部分の観察を行うことができる。
【００７４】
〔第３の実施形態〕
次に、本発明の第３の実施形態に係る蛍光観察装置３について、主に図１５から図１９を参照して説明する。以下、本実施形態の蛍光観察装置３について、前述の各実施形態に係る蛍光観察装置と共通する点については説明を省略し、異なる点について主に説明する。
本実施形態に係る蛍光観察装置３は、図１５に示されるように、対物光学系４０を通った蛍光と付加光学系５０を通った蛍光を同一の光検出器１７で検出できるようにしたものである。
【００７５】
対物光学系４０は、先端側に有限系レンズ４５，４６を有しており、有限系レンズ４５，４６の基端側には中間結像面６１が形成されるようになっている。中間結像面６１の近傍には、図１６に示すように、リング状の遮光部材４７が配置されている。この遮光部材４７は、有限系レンズ４５，４６の視野を規定しており、標本Ａ上で励起光が走査される範囲を規定している。
【００７６】
付加光学系５０は、蛍光取り込み窓５１と、蛍光出口部５３と、これらの間を光学的に接続する光ファイバ束５２とで構成されている。本実施形態においては、光ファイバ束５２の基端部が蛍光出口部５３となっている。蛍光取り込み窓５１は第１の実施形態と同様である。光ファイバ束５２は、図１６に示すように、例えばＮＡ０．２２で径が比較的大きい（例えば直径１ｍｍ）の石英系の光ファイバ６本が、対物光学系４０の外側を囲うように配置されている。
【００７７】
中間結像面６１と蛍光出口部５３は、対物光学系４０の光軸方向では、略同じ位置に配置されており、光軸に直交する方向では、対物光学系４０の中間結像面６１位置での視野の周辺に蛍光出口部５３が並べて配置されている。
本実施形態では、光ファイバ束５２の基端側（蛍光出口部５３）と有限系レンズ４５，４６の基端側の瞳位置をともに無限大（すなわちテレセントリック）に構成している。
【００７８】
中間結像面６１と蛍光出口部５３の基端側には、中間結像面６１からの蛍光と蛍光出口部５３からの蛍光の両方を顕微鏡本体１０に導くアダプタレンズ６２が配置されている。アダプタレンズ６２は無限遠光学系の正レンズであり、基端側の焦点が光検出器１７と共役な位置に設定されている。
【００７９】
上記構成を有する蛍光観察装置３の作用について説明する。
第１の実施形態と同様に顕微鏡本体１０から射出され、平行光束で対物光学系４０に入射した励起光は、アダプタレンズ６２（無限遠系レンズ）によって対物光学系４０内の中間結像面６１上で一旦集光され、有限系レンズ４５，４６によって再び標本Ａ内の集光点３４に集光される。
【００８０】
集光点３４では標本Ａ内の蛍光物質が励起され、蛍光が発生する。この蛍光の光路について図１７を用いて説明する。
図１７において、標本Ａ内の集光点３４で発した蛍光のうち、対物光学系４０の有限系レンズ４５，４６の開口範囲内に入ったもの（直接光および散乱光）は実線で示している。また、標本Ａ内の集光点３４で発した蛍光のうち、付加光学系５０に入ったもの（直接光および散乱光）は点線で示している。なお、図１７は、励起光が走査されて、対物光学系４０の光軸から外れたときの状態を示している。
【００８１】
標本Ａにおいて発生した蛍光のうち、対物光学系４０に入射した蛍光は、有限系レンズ４５，４６を通って、アダプタレンズ６２（無限遠系レンズ）により集光され、ダイクロイックミラー１４を透過する。そして、励起光カットフィルタ１５を通過することで励起光がカットされ、リレー光学系１６を介して光検出器１７に入射し、光検出器１７により電気信号に変換される。
【００８２】
標本Ａにおいて発生した蛍光のうち、対物光学系４０の有限系レンズ４５，４６の開口範囲内に入らなかった蛍光の一部は、付加光学系５０に入射する。この蛍光は、蛍光取り込み窓５１に入射した後、光ファイバ束５２により導光され、蛍光出口部５３から射出される。そして、アダプタレンズ６２（無限遠系レンズ）により集光され、ダイクロイックミラー１４を透過する。そして、励起光カットフィルタ１５を通過することで励起光がカットされ、リレー光学系１６を介して光検出器１７に入射し、光検出器１７により電気信号に変換される。
【００８３】
上記のように、対物光学系４０の有限系レンズ４５，４６を通った蛍光と付加光学系５０を通った蛍光の両方が同一の光検出器１７で検出される。
以上のように、本実施形態に係る蛍光観察装置３によれば、第１の実施形態と同様に、付加光学系５０を対物光学系４０の径方向外側に配置することで、対物レンズ先端を標本Ａに近づけた際に、付加光学系５０が邪魔になることはない。そのため、対物光学系４０の先端部を標本Ａに近づけて、標本Ａの表面から深い位置に対物光学系４０のピントを合わせることができ、標本Ａの深部の観察精度を向上することができる。
【００８４】
また、本実施形態では、光ファイバ束５２の基端側（蛍光出口部５３）と有限系レンズ４５，４６の基端側の瞳位置をともに無限大（すなわちテレセントリック）にし、さらに、アダプタレンズ６２を無限遠系光学系として、その基端側の焦点と、光検出器１７を共役関係になるように配置している。これにより、励起光を走査したときでも、対物光学系４０の有限系レンズ４５，４６を通った蛍光は、常に光検出器１７に入射させることができ、さらに、付加光学系５０を通った蛍光も同じ光検出器１７に入射するようにできる。
【００８５】
これにより、対物光学系４０と付加光学系５０を別々の光検出器で検出する場合と比較して、光検出器に入る蛍光の光量が多くなるので、画像のＳＮ比を向上させることができる。これにより、標本Ａのより深い部分の観察が可能になる。また、光検出器１７からの情報を１つとすることができ、後に実行される電気的な処理（例えば画質向上のための処理）を簡易的なものとすることができる。
【００８６】
また、付加光学系５０用の光検出器を別途設ける必要が無いので、一般の多光子励起顕微鏡をそのまま使うことができる。
なお、これらの光学系の瞳位置の配置は、上記に限定されるものではなく、対物光学系４０の有限系レンズ４５，４６の基端側の瞳位置と付加光学系５０の基端側の瞳位置が一致するように構成し、これらの瞳がアダプタレンズ６２によって、光検出器１７の位置にリレーされるようにしてあればよい。
【００８７】
また、図１８に示すように、対物光学系４０の先端部および付加光学系５０の先端部を、第２の実施形態で示した態様としてもよい。
図１８に示すように、本変形例に係る蛍光観察装置３’は、対物光学系４０の先端に細径先端部４３を有している。また、第２の実施形態と同様に、光ファイバ束５２が蛍光取り込み窓５１に固定されており、蛍光取り込み窓５１が、対物光学系４０の光軸方向に移動可能になっている。
【００８８】
光ファイバ束５２は、第２の実施形態と同様に、高ＮＡ（例えばＮＡ０．６５）で径が小さい（例えば直径３０μｍ）の多成分ガラスの光ファイバを束ねたものである。
上記構成を有する蛍光観察装置３’によれば、第２の実施形態と同様に、励起効率や蛍光の検出効率を上げることができ、画像のＳＮ比を向上することができる。
【００８９】
なお、励起光の光走査の範囲について、励起光が光ファイバ束５２の基端部に集光して光ファイバ束５２に損傷を与えないようにするため、対物光学系４０のアダプタレンズ６２を通過した後の中間像位置で、付加光学系５０の蛍光出口部５３の有効範囲に励起光が入らないようにすることが望ましい。
具体的には、例えば図１６に示すように、励起光の走査範囲に遮光部材４７を設け、付加光学系５０の蛍光出口部５３を走査範囲の外に配置することが考えられる。
【００９０】
また、励起光の走査範囲が円形では無く、正方形や長方形の場合、図１９に示すように、励起光の走査範囲に合わせて遮光部材４７を正方形や長方形としてもよい。この場合には、光ファイバ束５２を遮光部材４７の側面の周囲に配置し、これらを束ねて蛍光出口部５３とすることで、アダプタレンズ６２の視野数を大きく取らずにすむメリットがある。
【００９１】
なお、対物光学系４０のアダプタレンズ６２を通過した後の中間像位置で、付加光学系５０の蛍光出口部５３の有効範囲に励起光が入らないように走査すれば遮光部材は不要である。
また、光ファイバ束５２（導光手段）は蛍光を蛍光出口部５３まで導けば良く、第１の実施形態と同様に他の導光手段に変更することも可能である。
【００９２】
〔第４の実施形態〕
次に、本発明の第４の実施形態に係る蛍光観察装置４について、主に図２０を参照して説明する。以下、本実施形態の蛍光観察装置４について、前述の各実施形態に係る蛍光観察装置と共通する点については説明を省略し、異なる点について主に説明する。
本実施形態に係る蛍光観察装置４は、図２０に示されるように、第３の実施形態に係る蛍光観察装置３において、蛍光出口部５３の部分が変形された態様である。
【００９３】
付加光学系５０の先端部４３は、図１８に示される第３の実施形態（変形例）に係る蛍光観察装置３’の先端形状と同様である。
第３の実施形態に係る蛍光観察装置３と異なる点は、有限系レンズ４５，４６の中間像面が、光ファイバ束５２の基端部（蛍光出口部５３）ではなく、光ファイバ束５２の基端部の共役面である中間結像面６１に形成される点である。
【００９４】
光ファイバ束５２の基端部の共役面は、付加光学系５０に設けられたリレーレンズ（付加光学系リレーレンズ）５５およびミラー５６によって形成される。
付加光学系５０のリレーレンズ５５の基端側（ミラー５６で反射後）の瞳位置は、付加光学系５０からの蛍光が効率よく光検出器１７に入るように、対物光学系４０の光軸方向に有限系レンズ４５，４６と瞳位置を略一致させている。
【００９５】
本実施形態では、付加光学系５０のリレーレンズ５５は、両テレセントリック光学系（瞳位置が前後ともに無限大）になっており、ミラー５６で付加光学系５０の光軸を直角に曲げて、中間像部分での付加光学系５０の瞳位置も無限大としている。また、有限系レンズ４５，４６の基端側の瞳位置も、これに合わせて無限大（すなわち、テレセントリック）としている。
【００９６】
上記構成を有する蛍光観察装置４の作用について説明する。
第３の実施形態において、付加光学系５０の光ファイバ束５２の基端部のＮＡと有限系レンズ４５，４６の中間像側のＮＡが大きく異なるものを使用した場合、光が途中でけられないようにするため、アダプタレンズ６２のＮＡを大きいほうにあわせる必要がある。しかし、本実施形態のように付加光学系５０のリレーレンズ５５を使って、付加光学系５０の中間結像面６１におけるＮＡを有限系レンズ４５，４６のＮＡにあわせることで、アダプタレンズ６２のＮＡをどちらかに大きいほうにあわせる必要がなくなる。
【００９７】
なお、ミラー５６は、光ファイバ束５２の基端部と、その共役面である中間結像面６１との距離が長いので、光ファイバ束５２およびリレーレンズ５５を付加光学系５０の光軸に対して横方向に逃がすために設けている。
【００９８】
また、光ファイバ束５２の基端部と付加光学系５０のリレーレンズ５５を着脱自在にして、付加光学系５０を交換できるようにしてもよい。その際、各々の付加光学系５０に対して付加光学系５０のリレーレンズ５５で蛍光出口部５３側のＮＡを調整して有限系レンズ４５，４６に合わせるようにすればよい。
なお、目的に合わせて、付加光学系５０の仕様（光ファイバ束５２の太さやＮＡ，蛍光取り込み窓５１の形状など）を交換しても、有限系レンズ４５，４６やアダプタレンズ６２を変える必要が無い。
【００９９】
また、光ファイバ束５２の基端部、付加光学系５０のリレーレンズ５５、およびミラー５６を一体で着脱可能としてもよい。
さらに、光ファイバ束５２が同じＮＡであれば、光ファイバ束５２の基端部から着脱してもよい。
【０１００】
〔第５の実施形態〕
次に、本発明の第５の実施形態に係る蛍光観察装置５について、主に図２１から図２８を参照して説明する。以下、本実施形態の蛍光観察装置５について、前述の各実施形態に係る蛍光観察装置と共通する点については説明を省略し、異なる点について主に説明する。
【０１０１】
本実施形態に係る蛍光観察装置５は、対物光学系４０を通った蛍光と付加光学系５０を通った蛍光とを同一の光検出器１７で検出するようにするための蛍光合成手段を、前述の第３の実施形態および第４の実施形態とは別の構成で実現するものである。
【０１０２】
本実施形態に係る蛍光観察装置５は、図２１に示されるように、顕微鏡本体１０と、対物光学系４０、付加光学系５０と、対物光学系４０基端部と顕微鏡本体１０の間に設けられた蛍光合成部（光合成手段）７０とを備えている。
なお、図２１に示す例では、細径先端部４３を有する対物光学系４０を示しているが、それ以外の対物光学系４０でもよい。
【０１０３】
蛍光合成部７０は、図２２に示すように、励起光および対物光学系４０を通ってきた蛍光が通る中心部７３と、付加光学系５０を通ってきた蛍光が通る周辺部７４で構成されており、これら蛍光を合成するようになっている。
周辺部７４は、光ファイバ束５２の基端部から蛍光が入射するコリメートレンズ（付加光学系コリメートレンズ）７１と、コリメートレンズ７１からの蛍光を偏向するプリズム（偏向素子）７２で構成されている。なお、プリズム７２に代えて、ミラーを配置することとしてもよい。
【０１０４】
光ファイバ束５２の基端部は、蛍光取り込み窓５１に接続された光ファイバ束５２が一旦ばらばらになった後、複数の束にまとめられたもので、蛍光合成部７０の側面に配置されている。
【０１０５】
上記構成を有する蛍光観察装置５の作用について説明する。
対物光学系４０を通った蛍光は、対物光学系４０で略平行光束になって、蛍光合成部７０の中心部７３を通り、顕微鏡本体１０に入射する。
【０１０６】
蛍光取り込み窓５１および光ファイバ束５２を通って、光ファイバ束５２の基端側から射出された蛍光は、コリメートレンズ７１により屈折される。コリメートレンズ７１は、コリメートレンズ７１の焦点と光ファイバ束５２の基端部を略一致させて、光ファイバ束５２の一点から出た光が略平行光束になるように配置されている。実際には、光ファイバ束５２は面積をもっているので、複数の平行光束が角度を持って重なり合った形になる。
【０１０７】
コリメートレンズ７１を出た蛍光は、プリズム７２により対物光学系４０の光束と同じ方向に偏向され、対物光学系４０の光束の外側に通って、顕微鏡本体１０に入射する。このように、対物光学系４０および付加光学系５０を通った蛍光は、蛍光合成部７０により合成され、顕微鏡本体１０のリレーレンズ１６により同一の光検出器１７に集光され、該光検出器１７により検出される。
【０１０８】
ここで、光ファイバ束５２の基端側の形状は、図２３に示すように、円弧状にするとよい。このような形状にすることで、付加光学系５０を通った蛍光の光束の広がり角が横方向に大きくならないので、顕微鏡本体１０側の視野数を大きくしないで済む。
【０１０９】
また、蛍光合成部７０における導光方法は、顕微鏡本体１０と対物光学系４０の条件によって、以下の２通りの設定の仕方がある。
１つ目は、顕微鏡本体１０の視野が対物光学系４０の視野と比較して大きい場合であり、この場合には対物光学系４０の視野外に付加光学系５０からの蛍光を通すことが有利である。
２つ目は光検出器１７の検出領域が対物光学系４０で使用する領域よりも大きい場合であり、この場合には対物光学系４０の瞳の外側に付加光学系５０からの蛍光を通すことが有利である。
【０１１０】
以下、上記の蛍光合成部７０における導光方法について、それぞれの場合に分けて詳述する。
まず、１つ目の条件のときの蛍光合成部７０での光の条件設定、すなわち対物光学系４０の視野外に付加光学系５０の光を通す場合について説明する。
図２４および図２５は、蛍光の光路を示している。
図２４および図２５においてダイクロイックミラー１４と励起光カットフィルタは省略してある。また、実線は対物光学系４０の最大視野のマージナル光線、点線は付加光学系５０を通る光束を示している。また、符号８１は対物光学系４０の瞳面、符号８２はコリメートレンズ７１の瞳面を示している。
【０１１１】
光ファイバ束５２の基端部とコリメートレンズ７１との位置関係は、コリメートレンズ７１の焦点と光ファイバ束５２の基端部を略一致させて、光ファイバの一点から出た光が略平行光束になるようにしてある。実際の光束の形は、光ファイバ束５２は面積をもっているので、複数の平行光束が角度を持って重なり合う形になる。
【０１１２】
光ファイバ束５２の基端側から射出されて、コリメートレンズ７１で屈折された蛍光は、プリズム７２により、対物光学系４０の光束の外側に通るようになっている。
このときの光束の角度は以下のように設定している。
【０１１３】
付加光学系５０を通る蛍光でコリメートレンズ７１から射出される光の光束のうち、対物光学系４０の光軸に対する角度が最も小さいもの（角度α）が、対物光学系４０の最大視野のマージナル光線の瞳位置での光軸に対する角度（β）よりも大きくなるように、プリズム７２、光ファイバ束５２の形状、コリメートレンズ７１の焦点距離などを設定する。
【０１１４】
観察時は励起光の走査範囲を角度αより小さくする。例えば、図２４に示す例では、光ファイバ束５２の中心をコリメートレンズ７１に合わせ、コリメートレンズ７１の光軸を対物光学系４０の光軸に直交させ、プリズム７２の角度を対物光学系４０の光軸に対して少し外側に傾けることで、付加光学系５０の光束の角度が上記条件に当てはまるように設定している。
【０１１５】
なお、付加光学系５０の光束の角度の設定は、例えば、図２５に示すように、コリメートレンズ７１の光軸に対して光ファイバ束５２の基端部を偏心させる方法や、その他の方法でもよい。
【０１１６】
光ファイバ束５２の基端部およびコリメートレンズ７１の位置は、以下のように設定する。付加光学系５０のコリメートレンズ７１から射出される蛍光の光束は、プリズム７２で反射されているので、対物光学系４０側へ投影して考える。
コリメートレンズ７１の瞳位置の設定は、ミラー７５によって対物光学系４０の光束を遮らない範囲で、対物光学系４０の瞳とできるだけ多く重なるようにするとよい。
【０１１７】
ここで、図２６は、上記設定をしたときの対物光学系４０および付加光学系５０を通った蛍光の光検出器１７上での分布である。符号７６は対物光学系４０を通った蛍光の投影範囲、符号７７は付加光学系５０を通った蛍光の投影範囲を示している。
上記の設定を行うことで、図２６に示すように、光検出器１７の中心付近に付加光学系５０を通った光を多く導くことができ、蛍光の検出効率を高めることができる。このように、付加光学系５０を通った蛍光を、対物光学系４０の視野外を通して光検出器１７まで到達させることができる。
【０１１８】
次に、２つ目の条件のときの蛍光合成部７０での光の条件設定、すなわち対物光学系４０の瞳の外側に付加光学系５０の光を通す場合について説明する。
図２７は、光ファイバ束５２の基端部の中心とコリメートレンズ７１の光軸を一致させて、ミラー７５によりコリメートレンズ７１の光軸を顕微鏡本体１０側に直角に曲げている例を示している。また、符号８１は対物光学系４０の瞳面、符号８２はコリメートレンズ７１の瞳面、符号８３はコリメートレンズ７１の瞳相当面を示している。
【０１１９】
図２４および図２５との違いは、光ファイバ束５２の基端部、コリメートレンズ７１、ミラー７５の配置を変えて、コリメートレンズ７１から射出される蛍光（付加光学系５０を通る蛍光）の光束が対物光学系４０の光軸と平行になる成分を含むようにしている点である。
【０１２０】
まず、光ファイバ束５２の基端部およびコリメートレンズ７１の位置設定について説明する。
本実施形態では、コリメートレンズ７１の基端側の瞳位置（ミラー７５より先端側にある場合は瞳に相当する位置）を、光軸方向で対物光学系４０の瞳位置の近傍に配置している。また、横方向は、ミラー７５が対物光学系４０の最大視野の光束を遮らない範囲で、できるだけ光軸に近いところに互いの瞳が重ならないようにずらして配置している。
【０１２１】
図２８は、以上の設定をしたときの対物光学系４０および付加光学系５０を通った蛍光の光検出器１７上での分布である。光検出器１７上では、対物光学系４０と通った蛍光の周辺に付加光学系５０を通った蛍光が分布する形になる。ここで、符号７６は対物光学系４０を通った蛍光の投影範囲、符号７７は付加光学系５０を通った蛍光の投影範囲を示している。
【０１２２】
また、励起光が付加光学系５０に入らないように、すなわち励起光が光ファイバ束５２の基端部に達しないようにするため、コリメートレンズ７１とミラー７５との間に励起光カットフィルタ７８を設けることが望ましい。また、励起カットフィルタ７８の代わりに、ミラー７５を、励起光を透過させる一方で、多光子励起によって発生した蛍光を反射する特性にしてもよい。あるいは、励起光の瞳径を対物光学系４０の瞳径にできるだけ合わせて小さくして、付加光学系５０の瞳に入らないようにしてもよい。
上記の設定を行うことで、付加光学系５０を通った蛍光を、対物光学系４０の瞳の外側を通して光検出器１７まで到達させることができる。
【０１２３】
以上のように、本実施形態に係る蛍光観察装置５によれば、付加光学系５０を有していない蛍光観察装置でも、蛍光合成部７０を顕微鏡本体１０と対物光学系４０との間に挿入し、付加光学系５０の先端部を組み合わせて使うことで、画像のＳＮ比を向上することができる。これにより、標本Ａのより深い部分の観察が可能になる。
【０１２４】
また、対物光学系４０と付加光学系５０を別々の光検出器で検出する場合と比較して、光検出器に入る蛍光の光量が多くなるので、画像のＳＮ比を向上させることができる。これにより、標本Ａのより深い部分の観察が可能になる。また、光検出器１７からの情報を１つとすることができ、後に実行される電気的な処理（例えば画質向上のための処理）を簡易的なものとすることができる。
【符号の説明】
【０１２５】
Ａ 標本
１，２，３，３’，４，５ 蛍光観察装置
１０ 顕微鏡本体
１１ レーザ光源
１２ 走査ミラー
１３ リレー光学系
１４ ダイクロイックミラー
１５ 励起光カットフィルタ
１６ リレー光学系
１７ 光検出器（光検出部）
２０ 光検出ユニット
２１ リレー光学系
２２ 励起光カットフィルタ
２３ 光検出器（光検出部）
３０ 光学系
３４ 集光点（ピント位置）
４０ 対物光学系
４１ 入射面
４２ 対物レンズ
４３ 細径先端部
４５ 有限系レンズ
４６ 有限系レンズ
５０ 付加光学系
５１ 蛍光取り込み窓（入射面）
５２ 光ファイバ束（導光部）
５３ 蛍光出口部
５４ 正レンズ
５５ リレーレンズ（付加光学系リレーレンズ）
５６ ミラー
６１ 中間結像面
６２ アダプタレンズ
７０ 蛍光合成部（光合成手段）
７１ コリメートレンズ（付加光学系コリメートレンズ）
７２ プリズム（偏向素子）
７３ 中心部
７４ 周辺部
７５ ミラー（偏向素子）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
励起光を標本に照射する一方、前記標本からの蛍光を集光する対物光学系と、
該対物光学系の径方向外側に配置され、前記標本からの蛍光を取り込む付加光学系と、
前記対物光学系および前記付加光学系により集光された前記標本からの蛍光を検出する光検出部とを備える蛍光観察装置。
【請求項２】
前記付加光学系が、前記対物光学系の光軸方向に移動可能に設けられた請求項１に記載の蛍光観察装置。
【請求項３】
前記対物光学系が、前記標本内に挿入するための細径先端部を有する請求項１に記載の蛍光観察装置。
【請求項４】
前記付加光学系が、前記対物光学系を中心とする環状の正レンズである請求項１に記載の蛍光観察装置。
【請求項５】
前記付加光学系の前記標本からの蛍光を入射させる入射面が、前記対物光学系の光軸に略垂直に形成されている請求項１に記載の蛍光観察装置。
【請求項６】
前記入射面に入射させた蛍光を導光する導光部を備え、
該導光部の光軸が、前記入射面における蛍光の屈折角と略同じ角度で配置されている請求項５に記載の蛍光観察装置。
【請求項７】
前記付加光学系が、先端に向かって径が小さくなるように形成されている請求項１に記載の蛍光観察装置。
【請求項８】
前記付加光学系の出口と略一致する面に、前記対物光学系により集光された蛍光の中間結像面を形成する有限系レンズと、
前記中間結像面からの蛍光と前記付加光学系の出口からの蛍光の両方の瞳の共役面を同一の前記光検出部に導くアダプタレンズとを備える請求項１に記載の蛍光観察装置。
【請求項９】
前記付加光学系が、
前記付加光学系の前記標本からの蛍光を入射させる入射面と、
該入射面に入射させた蛍光を導光する導光部と、
該導光部の基端部と前記中間結像面が形成される位置との間に設けられ、前記導光部の基端部と共役な面を、前記中間結像面が形成される位置に形成する付加光学系リレーレンズとを備える請求項８に記載の蛍光観察装置。
【請求項１０】
前記対物光学系により集光された蛍光と前記付加光学系により取り込まれた蛍光とを合成する光合成手段を備える請求項１に記載の蛍光観察装置。
【請求項１１】
前記光合成手段が、励起光および前記対物光学系により集光された蛍光が通る中心部と、前記付加光学系により取り込まれた蛍光が通る周辺部とで構成され、
前記周辺部が、前記導光部の基端部の蛍光を略平行にする形成する付加光学系コリメートレンズと、前記付加光学系コリメートレンズからの光を偏向する偏向素子とを有する請求項１０に記載の蛍光観察装置。
【請求項１】
励起光を標本に照射する一方、前記標本からの蛍光を集光する対物光学系と、
該対物光学系の径方向外側に配置され、前記標本からの蛍光を取り込む付加光学系と、
前記対物光学系および前記付加光学系により集光された前記標本からの蛍光を検出する光検出部とを備える蛍光観察装置。
【請求項２】
前記付加光学系が、前記対物光学系の光軸方向に移動可能に設けられた請求項１に記載の蛍光観察装置。
【請求項３】
前記対物光学系が、前記標本内に挿入するための細径先端部を有する請求項１に記載の蛍光観察装置。
【請求項４】
前記付加光学系が、前記対物光学系を中心とする環状の正レンズである請求項１に記載の蛍光観察装置。
【請求項５】
前記付加光学系の前記標本からの蛍光を入射させる入射面が、前記対物光学系の光軸に略垂直に形成されている請求項１に記載の蛍光観察装置。
【請求項６】
前記入射面に入射させた蛍光を導光する導光部を備え、
該導光部の光軸が、前記入射面における蛍光の屈折角と略同じ角度で配置されている請求項５に記載の蛍光観察装置。
【請求項７】
前記付加光学系が、先端に向かって径が小さくなるように形成されている請求項１に記載の蛍光観察装置。
【請求項８】
前記付加光学系の出口と略一致する面に、前記対物光学系により集光された蛍光の中間結像面を形成する有限系レンズと、
前記中間結像面からの蛍光と前記付加光学系の出口からの蛍光の両方の瞳の共役面を同一の前記光検出部に導くアダプタレンズとを備える請求項１に記載の蛍光観察装置。
【請求項９】
前記付加光学系が、
前記付加光学系の前記標本からの蛍光を入射させる入射面と、
該入射面に入射させた蛍光を導光する導光部と、
該導光部の基端部と前記中間結像面が形成される位置との間に設けられ、前記導光部の基端部と共役な面を、前記中間結像面が形成される位置に形成する付加光学系リレーレンズとを備える請求項８に記載の蛍光観察装置。
【請求項１０】
前記対物光学系により集光された蛍光と前記付加光学系により取り込まれた蛍光とを合成する光合成手段を備える請求項１に記載の蛍光観察装置。
【請求項１１】
前記光合成手段が、励起光および前記対物光学系により集光された蛍光が通る中心部と、前記付加光学系により取り込まれた蛍光が通る周辺部とで構成され、
前記周辺部が、前記導光部の基端部の蛍光を略平行にする形成する付加光学系コリメートレンズと、前記付加光学系コリメートレンズからの光を偏向する偏向素子とを有する請求項１０に記載の蛍光観察装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【公開番号】特開２０１１−１９６８５２（Ｐ２０１１−１９６８５２Ａ）
【公開日】平成２３年１０月６日（２０１１．１０．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−６４６９３（Ｐ２０１０−６４６９３）
【出願日】平成２２年３月１９日（２０１０．３．１９）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１０月６日（２０１１．１０．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月１９日（２０１０．３．１９）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
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