蛍光顕微鏡および光学フィルタ
【課題】蛍光観察に用いる光学フィルタの透過波長帯域を迅速に変更する。
【解決手段】試料２に照射する励起光を照明光から抽出するための励起フィルタ１３内には、チューナブルバンドパスフィルタ２１ａ，２１ｂが光軸に沿って並べられている。チューナブルバンドパスフィルタ２１ａ，２１ｂは、光の入射角により透過波長帯域の幅をほぼ一定に保ったまま中心波長が変化する。チューナブルバンドパスフィルタ２１ａ，２１ｂは、光軸に対する角度を個別に調整することが可能である。本発明は、例えば、蛍光顕微鏡に適用できる。
【解決手段】試料２に照射する励起光を照明光から抽出するための励起フィルタ１３内には、チューナブルバンドパスフィルタ２１ａ，２１ｂが光軸に沿って並べられている。チューナブルバンドパスフィルタ２１ａ，２１ｂは、光の入射角により透過波長帯域の幅をほぼ一定に保ったまま中心波長が変化する。チューナブルバンドパスフィルタ２１ａ，２１ｂは、光軸に対する角度を個別に調整することが可能である。本発明は、例えば、蛍光顕微鏡に適用できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光顕微鏡および光学フィルタに関し、特に、蛍光観察に用いて好適な蛍光顕微鏡および光学フィルタに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、蛍光色素により染色した試料や蛍光タンパク質を発現した試料に所定の波長の励起光を照射し、試料から発せられる蛍光を顕微鏡により観察する蛍光観察が行われている。
【０００３】
励起光および試料から発せられる蛍光の波長は、蛍光色素または蛍光タンパク質の種類によりそれぞれ異なる。そこで、複数のフィルタセットをターレットにセットしておき、観察対象となる蛍光色素または蛍光タンパク質を変更する度に、使用するフィルタセットを交換することが一般的に行われている（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００８−１３９７９４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、ターレットを用いてフィルタセットを交換する場合、所望のフィルタセットが光路に設定される位置までターレットを回転させる必要があり、交換作業に時間がかかっていた。
【０００６】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、蛍光観察に用いる光学フィルタの透過波長帯域を迅速に変更できるようにするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の第１の側面の蛍光顕微鏡は、試料に照射する励起光を照明光から抽出するための第１の光学フィルタ、または、前記試料からの光の所定の波長帯域を透過する第２の光学フィルタのうち少なくとも一方が、光の入射角により透過波長帯域の幅をほぼ一定に保ったまま中心波長が変化する複数の可変フィルタが光軸に沿って並べられ、複数の前記可変フィルタの光軸に対する角度を個別に調整可能な光学フィルタにより構成される。
【０００８】
本発明の第２の側面の光学フィルタは、光の入射角により透過波長帯域の幅をほぼ一定に保ったまま中心波長が変化する複数の可変フィルタが光軸に沿って並べられ、複数の前記可変フィルタの光軸に対する角度を個別に調整可能である。
【０００９】
本発明の第１の側面においては、第１の光学フィルタに備えられている複数の可変フィルタの光軸に対する角度を個別に調整することにより、励起光の波長が変更され、第２の光学フィルタに備えられている複数の可変フィルタの光軸に対する角度を個別に調整することにより、試料を観察する光の波長が変更される。
【００１０】
本発明の第２の側面においては、複数の可変フィルタの光軸に対する角度を個別に調整することにより、光学フィルタの透過波長帯域が変更される。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の第１の側面または第２の側面によれば、蛍光観察に用いる光学フィルタの透過波長帯域を迅速に変更することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明を適用した蛍光顕微鏡の照明光学系の構成例を示す図である。
【図２】本発明を適用した蛍光顕微鏡の観察光学系の構成例を示す図である。
【図３】チューナブルバンドパスフィルタの特性の一例を示す図である。
【図４】励起フィルタの透過波長帯域の一例を模式的に示す図である。
【図５】顕微鏡システムの構成例を示すブロック図である。
【図６】顕微鏡システムにより実行される観察処理を説明するためのフローチャートである。
【図７】GFPとYFPの励起スペクトルを示す図である。
【図８】GFPとYFPの蛍光スペクトルを示す図である。
【図９】顕微鏡システムにより実行されるアンミキシング観察処理を説明するためのフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を実施するための形態（以下、実施の形態という）について説明する。なお、説明は以下の順序で行う。
１．実施の形態
２．変形例
【００１４】
＜１．実施の形態＞
［蛍光顕微鏡の構成例］
図１および図２は、本発明を適用した蛍光顕微鏡の光学系の一実施の形態を示す図である。図１は、蛍光顕微鏡１の照明光学系の構成例を示し、図２は、蛍光顕微鏡１の観察光学系の構成例を示している。
【００１５】
光源１１から発せられた照明光は、コリメータレンズ１２により平行光束とされ、励起フィルタ１３に入射する。励起フィルタ１３は、透過波長帯域が可変の光学フィルタであり、入射する照明光のうち設定された波長帯域（以下、励起波長帯域と称する）の光を透過し、それ以外の波長帯域の光を遮断または減衰することにより、励起光を抽出する。
【００１６】
励起フィルタ１３により抽出された励起光は、集光レンズ１４を透過し、ダイクロイックミラー１５により対物レンズ１６の方向に反射され、対物レンズ１６を透過して、試料２に照射される。
【００１７】
励起光が照射された試料２からの光（以下、観察光と称する）は、対物レンズ１６およびダイクロイックミラー１５を透過し、バリアフィルタ１７に入射する。試料２は、所定の蛍光色素により染色されたり、あるいは、蛍光タンパク質が発現しており、励起光を照射することにより蛍光色素または蛍光タンパク質から発せられる蛍光が観察光に含まれる。
【００１８】
なお、以下、蛍光色素および蛍光タンパク質など励起光を照射することにより蛍光を発する物質を蛍光物質と総称する。
【００１９】
バリアフィルタ１７は、透過波長帯域が可変の光学フィルタであり、観察光のうち設定された波長帯域（以下、シグナル取得波長帯域と称する）の光を透過し、それ以外の波長帯域の光を遮断または減衰する。
【００２０】
バリアフィルタ１７を透過した観察光は、結像レンズ１８に入射し、結像レンズ１８により試料２の像３が結ばれる。
【００２１】
ここで、さらに図３および図４を参照して、励起フィルタ１３およびバリアフィルタ１７の特性について説明する。
【００２２】
励起フィルタ１３内には、チューナブルバンドパスフィルタ２１ａ，２１ｂが光軸に沿って並べられている。同様に、バリアフィルタ１７内には、チューナブルバンドパスフィルタ２１ｃ，２１ｄが光軸に沿って並べられている。チューナブルバンドパスフィルタ２１ａ乃至２１ｄは、透過波長帯域が可変の同じ種類の光学フィルタである。以下、チューナブルバンドパスフィルタ２１ａ乃至２１ｄを個々に区別する必要がない場合、単に、チューナブルバンドパスフィルタ２１と称する。
【００２３】
図３は、チューナブルバンドパスフィルタ２１の特性の一例を示している。なお、図３の横軸は波長（単位はnm）を示し、縦軸は透過率（単位は％）を示している。チューナブルバンドパスフィルタ２１は、入射光の角度（入射角）を所定の許容範囲内で調整することにより、透過波長帯域の幅（以下、透過波長帯幅と称する）をほぼ一定に保ったまま、中心波長（以下、透過中心波長と称する）を変更することができる光学フィルタである。例えば、Semrock社のVersaChorome（商標）をチューナブルバンドパスフィルタ２１として採用することが可能である。
【００２４】
例えば、図３の波形５１は、入射角が０度の場合のチューナブルバンドパスフィルタ２１の透過特性を示し、波形５２は、入射角が許容範囲の最大値（例えば、６０度）である場合のチューナブルバンドパスフィルタ２１の透過特性を示している。そして、許容範囲内で入射角を変化させることにより、波形５１と波形５２の間の範囲内において、透過波長帯幅をほぼ一定に保ったまま、透過中心波長を連続して変化させることができる。
【００２５】
図４は、励起フィルタ１３の透過波長帯域の一例を模式的に示す図である。波形６１ａは、チューナブルバンドパスフィルタ２１ａの透過波長帯域を示し、波形６１ｂは、チューナブルバンドパスフィルタ２１ｂの透過波長帯域を示している。
【００２６】
励起フィルタ１３全体の透過波長帯域は、波形６１ａと波形６１ｂとが重なる斜線で示される範囲、すなわち、２つのチューナブルバンドパスフィルタ２１の透過波長帯域が重なる帯域となる。つまり、励起フィルタ１３を透過する透過光の中心波長および波長帯幅は、チューナブルバンドパスフィルタ２１ａ，２１ｂの透過中心波長の相対的な差によって決定される。
【００２７】
従って、チューナブルバンドパスフィルタ２１ａ，２１ｂの光軸に対する角度（以下、設定角度と称する）を個別に調整し、両者の透過波長帯域が重なる範囲を変えることにより、励起フィルタ１３の透過中心波長を、チューナブルバンドパスフィルタ２１ａ，２１ｂの透過中心波長の設定可能範囲内で任意の値に設定することができ、励起フィルタ１３の透過波長帯幅を、チューナブルバンドパスフィルタ２１ａ，２１ｂの透過波長帯幅の範囲内で任意の値に設定することができる。
【００２８】
なお、チューナブルバンドパスフィルタ２１ａ，２１ｂの設定角度の調整は、手動または電動のどちらで行うようにしてもよい。
【００２９】
また、バリアフィルタ１７は、励起フィルタ１３と同様の構成を有しており、励起フィルタ１３と同様の方法により、シグナル取得波長帯域を任意の値に設定することが可能である。
【００３０】
このように、蛍光顕微鏡１では、例えば、励起スペクトルが近接した蛍光色素で多重染色した試料において特定の色素だけを励起したり、蛍光褪色や生細胞への光毒性を抑制したりするために、透過波長帯幅を変更する場合、または、蛍光のブリードスルーの悪影響を避けるためにシグナル取得波長帯幅を変更する場合などに、光学フィルタを交換する手間や時間を省くことができる。すなわち、各チューナブルバンドパスフィルタ２１の設定角度を調整するだけで、迅速に透過波長帯域およびシグナル取得波長帯域を所望の値に設定することができる。
【００３１】
また、ターレットや複数の種類の光学フィルタを設ける必要がなく、蛍光顕微鏡１の構成をシンプルにすることができる。
【００３２】
［顕微鏡システムの構成例］
図５は、蛍光顕微鏡１を用いた顕微鏡システム１０１の構成例を示すブロック図である。顕微鏡システム１０１は、蛍光顕微鏡１、カメラ１１１および制御装置１１２を含むように構成される。
【００３３】
カメラ１１１は、例えば、ＣＣＤイメージセンサ、ＣＭＯＳイメージセンサなどの撮像素子を用いたデジタルカメラであり、試料２の像３を撮影し、その結果得られた画像（以下、観察画像と称する）を制御装置１１２に供給する。
【００３４】
制御装置１１２は、例えば、市販のコンピュータにより構成される。制御装置１１２は、撮影制御部１２１、励起波長帯域制御部１２２、シグナル取得波長帯域制御部１２３、観察位置制御部１２４、画像処理部１２５、表示制御部１２６、入力部１２７、表示部１２８、および、記憶部１２９を含むように構成される。撮影制御部１２１、励起波長帯域制御部１２２、シグナル取得波長帯域制御部１２３、観察位置制御部１２４、画像処理部１２５、表示制御部１２６、入力部１２７、表示部１２８、および、記憶部１２９は、バス１３０を介して相互に接続されている。
【００３５】
撮影制御部１２１は、カメラ１１１を制御するとともに、カメラ１１１により撮影された観察画像を取得し、記憶部１２９に記憶させる。
【００３６】
励起波長帯域制御部１２２は、励起フィルタ１３のチューナブルバンドパスフィルタ２１ａ，２１ｂの設定角度を個別に調整し、励起フィルタ１３の励起波長帯域の設定を行う。
【００３７】
シグナル取得波長帯域制御部１２３は、バリアフィルタ１７のチューナブルバンドパスフィルタ２１ｃ，２１ｄの設定角度を個別に調整し、バリアフィルタ１７のシグナル取得波長帯域の設定を行う。
【００３８】
観察位置制御部１２４は、蛍光顕微鏡１のステージ（不図示）等の位置を制御することにより、試料２の観察位置の設定を行う。
【００３９】
画像処理部１２５は、観察画像を記憶部１２９から取得し、取得した観察画像に対して各種の画像処理を施し、記憶部１２９に記憶させる。
【００４０】
表示制御部１２６は、記憶部１２９に記憶されている観察画像を、表示部１２８に表示させる。また、表示制御部１２６は、顕微鏡システム１０１の操作や設定等を行うための画面を表示部１２８に表示させる。
【００４１】
入力部１２７は、例えば、キーボード、マウス、ボタン、スイッチ等の各種の入力装置により構成される。入力部１２７は、ユーザにより入力された各種の指令を制御装置１１２の各部に供給する。
【００４２】
表示部１２８は、例えば、ＬＣＤ（Liquid Crystal Display）等の表示装置により構成され、表示制御部１２６の制御の基に、観察画像や、顕微鏡システム１０１の操作や設定等を行うための画面を表示する。
【００４３】
記憶部１２９は、例えば、ハードディスクドライブ等の記憶装置により構成される。記憶部１２９には、上述した観察画像の他に、各蛍光物質の励起スペクトルおよび蛍光スペクトルのデータ等が記憶される。
【００４４】
［観察処理］
次に、図６のフローチャートを参照して、顕微鏡システム１０１により実行される観察処理について説明する。なお、この処理は、例えば、１種類以上の蛍光色素により染色された試料２、または、１種類以上の蛍光タンパク質が発現した試料２が、蛍光顕微鏡１のステージにセットされた状態で行われる。
【００４５】
ステップＳ１において、制御装置１１２は、試料２に適用されている蛍光物質の種類を取得する。具体的には、例えば、表示制御部１２６は、蛍光物質（蛍光色素および蛍光タンパク質）の一覧を表示部１２８に表示させる。ユーザは、入力部１２７を用いて、表示された一覧の中から、試料２に適用されている蛍光物質を選択する。なお、複数の蛍光物質が試料２に適用されている場合、ユーザは、その複数の蛍光物質を一覧の中から選択する。入力部１２７は、ユーザにより選択された蛍光物質の種類を、励起波長帯域制御部１２２およびシグナル取得波長帯域制御部１２３に通知する。
【００４６】
ステップＳ２において、励起波長帯域制御部１２２およびシグナル取得波長帯域制御部１２３は、励起波長帯域およびシグナル取得波長帯域を設定する。具体的には、励起波長帯域制御部１２２は、観察対象となる蛍光物質の励起スペクトルのデータを記憶部１２９から取得し、シグナル取得波長帯域制御部１２３は、観察対象となる蛍光物質の蛍光スペクトルのデータを記憶部１２９から取得する。
【００４７】
なお、観察対象となる蛍光物質は、その都度ユーザが入力部１２７を介して指定するようにしてもよいし、例えば、タイムラプス観察を行う場合などには、観察対象とする蛍光物質の順番を予め設定しておくようにしてもよい。
【００４８】
そして、励起波長帯域制御部１２２は、取得した励起スペクトルのデータに基づいて、励起フィルタ１３のチューナブルバンドパスフィルタ２１ａ，２１ｂの設定角度を調整し、観察対象となる蛍光物質に適した励起波長帯域を設定する。また、シグナル取得波長帯域制御部１２３は、取得した蛍光スペクトルのデータに基づいて、バリアフィルタ１７のチューナブルバンドパスフィルタ２１ｃ，２１ｄの設定角度を調整し、観察対象となる蛍光物質に適したシグナル取得波長帯域を設定する。
【００４９】
ここで、励起波長帯域およびシグナル取得波長帯域の設定方法の具体例について説明する。
【００５０】
まず、試料２に適用されている蛍光物質が１種類の場合、または、試料２に適用されている複数の蛍光物質の励起スペクトルが互いに離れている場合、励起波長帯域制御部１２２は、例えば、観察対象となる蛍光物質の励起スペクトルのピークを透過中心波長とする所定の幅の波長帯域を励起波長帯域に設定する。
【００５１】
同様に、試料２に適用されている蛍光物質が１種類の場合、または、試料２に適用されている複数の蛍光物質の蛍光スペクトルが互いに離れている場合、シグナル取得波長帯域制御部１２３は、例えば、観察対象となる蛍光物質の蛍光スペクトルのピークを透過中心波長とする所定の幅の波長帯域をシグナル取得波長帯域に設定する。
【００５２】
また、試料２に適用されている複数の蛍光物質の励起スペクトルが互いに近接している場合、励起波長帯域制御部１２２は、観察対象となる蛍光物質の励起スペクトルが他の蛍光物質の励起スペクトルと重ならない範囲を、励起波長帯域に設定する。
【００５３】
図７は、GFP（Green Fluorescent Protein）とYFP（Yellow Fluorescent Protein）の励起スペクトルを示している。なお、図７の横軸は、波長（単位はnm）を示し、縦軸は、スペクトルの強度を示している。ただし、各励起スペクトルの強度は、ピーク値を１００に正規化した値で示している。
【００５４】
図７を見ると、GFPの励起スペクトルの強度がピークとなる波長付近では、YFPの励起スペクトルもある程度の強度を有している。従って、試料２がGFPとYFPにより染色されている場合、GFPの励起スペクトルのピーク付近に励起波長帯域を設定すると、GFPだけでなくYFPも励起され、観察画像においてブリードスルーが発生してしまう。
【００５５】
そこで、励起波長帯域制御部１２２は、観察対象となるGFPの励起スペクトルの強度が所定の第１の閾値以上となり、YFPの励起スペクトルの強度が所定の第２の閾値（＜第１の閾値）以下となる波長の範囲内で、励起波長帯域を設定する。例えば、励起波長帯域制御部１２２は、図７の斜線で示される約400nm〜450nmの範囲内において、励起波長帯域を設定する。
【００５６】
同様に、試料２に適用されている複数の蛍光物質の蛍光スペクトルが互いに近接している場合、シグナル取得波長帯域制御部１２３は、観察対象となる蛍光物質の蛍光スペクトルが他の蛍光物質の蛍光スペクトルと重ならない範囲を、シグナル取得波長帯域に設定する。
【００５７】
図８は、GFPとYFPの蛍光スペクトルを示している。なお、図８の横軸は、波長（単位はnm）を示し、縦軸は、スペクトルの強度を示している。ただし、各蛍光スペクトルの強度は、ピーク値を１００に正規化した値で示している。
【００５８】
図８を見ると、GFPの蛍光スペクトルの強度がピークとなる波長付近では、YFPの蛍光スペクトルもある程度の強度を有している。従って、試料２がGFPとYFPにより染色されている場合、観察対象となるGFPの蛍光スペクトルのピーク付近にシグナル取得波長帯域を設定すると、GFPからの蛍光とYFPからの蛍光が混ざり、観察画像においてブリードスルーが発生してしまう。
【００５９】
そこで、シグナル取得波長帯域制御部１２３は、GFPの蛍光スペクトルの強度が所定の第３の閾値以上となり、YFPの蛍光スペクトルの強度が所定の第４の閾値（＜第３の閾値）以下となる波長帯域の範囲内で、シグナル取得波長帯域を設定する。例えば、シグナル取得波長帯域制御部１２３は、図８の斜線で示される約480nm〜500nmの範囲内において、シグナル取得波長帯域を設定する。
【００６０】
また、タイムラプス観察を行う場合、通常の観察を行う場合と比較して、励起光が試料２に照射される時間が長くなり、蛍光褪色が発生したり、光毒性により試料２がダメージを受けたりしやすくなる。従って、蛍光褪色や光毒性を軽減するために、できる限り励起光の強度を抑えることが望ましい。一方、観察画像の画質を向上させるためには、試料２の像３に含まれる蛍光の強度をできるだけ強くすることが望ましい。
【００６１】
従って、タイムラプス観察を行う場合には、通常の観察時と比較して、励起波長帯域を狭く設定し、シグナル取得波長帯域を広く設定するようにすることが望ましい。あるいは、観察時間が長くなるほど、励起波長帯域を狭く設定し、シグナル取得波長帯域を広く設定するようにしてもよい。
【００６２】
なお、例えば、蛍光褪色や光毒性の軽減、蛍光物質が複数適用されている場合のクロストークの回避などを目的として、励起波長帯域制御部１２２およびシグナル取得波長帯域制御部１２３により設定された励起波長帯域およびシグナル取得波長帯域を、さらにユーザが調整することも可能である。
【００６３】
ステップＳ３において、撮影制御部１２１は、観察画像のシグナル強度が最適な値になるようにカメラ１１１のパラメータ、例えば、露光時間、ゲイン等を調整する。なお、撮影制御部１２１は、励起波長帯域またはシグナル取得波長帯域の少なくとも一方が変更され、観察画像のシグナル強度が変化する度に、カメラ１１１の各パラメータを調整する。
【００６４】
ステップＳ４において、顕微鏡システム１０１は、観察画像を取得する。具体的には、カメラ１１１は、撮影制御部１２１の制御の基に、試料２の像３を撮影し、得られた観察画像を記憶部１２９に記憶させる。
【００６５】
なお、複数の種類の蛍光物質が試料２に適用されており、各蛍光物質による蛍光の観察画像を個別に取得する場合、ステップＳ２乃至Ｓ４の処理が繰り返され、各蛍光物質が順番に観察対象に設定され、励起波長帯域、シグナル取得波長帯域、および、カメラ１１１のパラメータが、観察対象に設定された蛍光物質に適した値に設定され、設定された条件で観察画像が取得される。
【００６６】
また、タイムラプス観察を行う場合、ユーザにより設定されたプログラムに従って、観察位置制御部１２４が、蛍光顕微鏡１のステージの位置を制御し、試料２の観察位置を移動しながら、各位置における観察画像が所定のタイミングで取得される。
【００６７】
なお、記憶部１２９に記憶された観察画像は、自動的に、あるいは、ユーザの指令に従って、表示制御部１２６の制御の基に、表示部１２８に表示される。
【００６８】
このようにして、蛍光物質の種類によって光学フィルタを交換することなく、迅速に励起波長帯域およびシグナル取得波長帯域を適切な値に調整し、各蛍光物質からの蛍光による観察画像を良好な画質で取得することができる。
【００６９】
また、従来、タイムラプス観察を行う場合、励起光の強度を弱めるために減光フィルタ（ＮＤフィルタ）が用いられているが、この場合、蛍光褪色や光毒性を軽減することができる一方で、取得される観察画像のＳ／Ｎ比が悪化する恐れがある。一方、本実施形態では、励起波長帯域全体を減光するのではなく、励起波長帯域およびシグナル取得波長帯域を調整することにより、蛍光褪色や光毒性を軽減するため、減光フィルタを用いる場合と比較して、観察画像のＳ／Ｎ比が向上する。
【００７０】
次に、図９のフローチャートを参照して、顕微鏡システム１０１により実行されるアンミキシング観察処理について説明する。なお、この処理は、例えば、１種類以上の蛍光色素により染色された試料２、または、１種類以上の蛍光タンパク質が発現した試料２が、蛍光顕微鏡１のステージにセットされた状態で行われる。また、この処理では、励起フィルタ１３は用いられない。すなわち、光源１１からの照明光が、そのまま励起光として試料２に照射される。
【００７１】
ステップＳ３１において、制御装置１１２は、取得するスペクトルの範囲および波長分解能の設定値を取得する。具体的には、例えば、表示制御部１２６は、取得するスペクトルの範囲および波長分解能の設定画面を表示部１２８に表示させる。ユーザは、入力部１２７を用いて、所望のスペクトルの範囲および波長分解能を入力する。入力部１２７は、ユーザにより入力されたスペクトルの範囲および波長分解能の設定値をシグナル取得波長帯域制御部１２３に供給する。
【００７２】
なお、以下、取得するスペクトルの範囲が500nm〜600nmに設定され、波長分解能が2nmに設定された場合について説明する。
【００７３】
ステップＳ３２において、シグナル所得波長帯域制御部１２３は、シグナル取得波長帯域を設定する。例えば、シグナル所得波長帯域制御部１２３は、バリアフィルタ１７のチューナブルバンドパスフィルタ２１ｃ，２１ｄの角度を調整し、バリアフィルタ１７のシグナル取得波長帯域を500nm〜502nmに設定する。
【００７４】
ステップＳ３３において、顕微鏡システム１０１は、観察画像を取得する。具体的には、カメラ１１１は、撮影制御部１２１の制御の基に試料２の像３を撮影し、得られた観察画像を記憶部１２９に記憶させる。
【００７５】
ステップＳ３４において、シグナル所得波長帯域制御部１２３は、全ての範囲のスペクトルを取得したか否かを判定する。シグナル所得波長帯域制御部１２３は、設定されたスペクトルの範囲のうち、まだ所得していない波長帯域が残っている場合、まだ全ての範囲のスペクトルを取得していないと判定し、処理はステップＳ３５に進む。
【００７６】
ステップＳ３５において、シグナル取得波長帯域制御部１２３は、シグナル取得波長帯域をシフトする。すなわち、シグナル取得波長帯域制御部１２３は、バリアフィルタ１７のチューナブルバンドパスフィルタ２１ｃ，２１ｄの角度を調整し、バリアフィルタ１７のシグナル取得波長帯域を、現在の波長帯域に波長分解能を加えた波長帯域にシフトする。例えば、いまの場合、シグナル取得波長帯域が502nm〜504nmにシフトされる。
【００７７】
その後、処理はステップＳ３３に戻り、ステップＳ３４において全ての範囲のスペクトルを取得したと判定されるまで、ステップＳ３３乃至Ｓ３５の処理が繰返し実行される。
【００７８】
一方、ステップＳ３４においてシグナル取得波長帯域制御部１２３は、設定されたスペクトルの範囲内において所得していない波長帯域が残っていない場合、全ての範囲のスペクトルを取得したと判定し、処理はステップＳ３６に進む。
【００７９】
このステップＳ３３乃至Ｓ３５の処理により、指定されたスペクトルの範囲を指定された波長分解能で分割した各波長帯域にシグナル取得波長帯域が順番に設定され、各シグナル取得波長帯域に設定されたバリアフィルタ１７を透過した試料２の光の像３が撮影される。この例の場合、500nm〜600nmの範囲内において2nm刻みでシグナル取得波長帯域が設定され、各シグナル取得波長帯域に対応する合計50枚（＝（600nm−500nm）÷2nm）の観察画像が取得される。
【００８０】
ステップＳ３６において、画像処理部１２５は、アンミキシング画像処理を実行する。例えば、画像処理部１２５は、ステップＳ３３乃至Ｓ３５の処理で取得された、シグナル取得波長帯域が異なる複数の観察画像を記憶部１２９から取得し、取得した複数の観察画像に基づいて、観察画像の各画素のスペクトル分布を検出する。次に、画像処理部１２５は、各画素のスペクトル分布、および、試料２に適用されている各蛍光物質の蛍光スペクトルのデータに基づいて、各蛍光物質に対応する蛍光の含有率を画素毎に算出する。
【００８１】
そして、画像処理部１２５は、各画素における各蛍光の含有率に基づいて、各蛍光を分離した観察画像を生成し、記憶部１２９に記憶させる。なお、このとき、蛍光毎に異なる観察画像を生成するようしてもよいし、１枚の観察画像内において複数の蛍光を区別して示すようにしてもよい。また、表示部１２８は、表示制御部１２６の制御の基に、画像処理部１２５により生成された観察画像を表示する。
【００８２】
このようにして、蛍光スペクトルが近接する複数の蛍光を分離したり、蛍光物質による蛍光と自家蛍光とを分離して観察することができる。また、試料２内の蛍光スペクトルや蛍光スペクトルの経時変化を観察することができる。
【００８３】
また、観察画像の各画素のスペクトル分布を所望の波長分解能で取得することができる。
【００８４】
さらに、従来、観察画像の各画素のスペクトル分布の検出は、観察画像の各画素に対応する観察光を分光し、複数のＰＭＴ（光電子増倍管）を用いて各波長帯域の光の強度を検出することにより行われている。一方、本実施の形態では、ＣＣＤイメージセンサなどの２次元の撮像素子を用いて、観察画像の各画素のスペクトル分布を検出することが可能である。また、ＰＭＴの数を増やすなどの対応を行うことなく、簡単に波長分解能を任意の値に設定することができる。
【００８５】
＜２．変形例＞
以上の説明では、励起フィルタ１３およびバリアフィルタ１７にそれぞれ２つのチューナブルバンドパスフィルタ２１を設ける例を示したが、３つ以上設けるようにすることも可能である。
【００８６】
また、励起フィルタ１３およびバリアフィルタ１７のいずれか一方にのみ、本発明を適用した光学フィルタを用いるようにすることも可能である。
【００８７】
さらに、制御装置１１２の機能の一部または全部を蛍光顕微鏡１に設けるようにすることも可能である。
【００８８】
また、本発明は、上述した蛍光顕微鏡１以外にも、光学フィルタの透過波長帯域を変更する必要がある光学顕微鏡などの各種の装置に適用することが可能である。
【００８９】
なお、本明細書において、システムの用語は、複数の装置、手段などより構成される全体的な装置を意味するものとする。
【００９０】
また、本発明の実施の形態は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。
【符号の説明】
【００９１】
１ 蛍光顕微鏡， ２ 試料， ３ 像， １１ 光源， １２ コリメータレンズ， １３ 励起フィルタ， １４ 集光レンズ， １５ ダイクロイックミラー， １６ 対物レンズ， １７ バリアフィルタ， １８ 結像レンズ， ２１ａ乃至２１ｄ チューナブルバンドパスフィルタ， １０１ 顕微鏡システム， １１１ カメラ， １１２ 制御装置， １２１ 撮影制御部， １２２ 励起波長帯域制御部， １２３ シグナル取得波長帯域制御部， １２４ 観察位置制御部， １２５ 画像処理部， １２６ 表示制御部， １２７ 入力部， １２８ 表示部， １２９ 記憶部
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光顕微鏡および光学フィルタに関し、特に、蛍光観察に用いて好適な蛍光顕微鏡および光学フィルタに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、蛍光色素により染色した試料や蛍光タンパク質を発現した試料に所定の波長の励起光を照射し、試料から発せられる蛍光を顕微鏡により観察する蛍光観察が行われている。
【０００３】
励起光および試料から発せられる蛍光の波長は、蛍光色素または蛍光タンパク質の種類によりそれぞれ異なる。そこで、複数のフィルタセットをターレットにセットしておき、観察対象となる蛍光色素または蛍光タンパク質を変更する度に、使用するフィルタセットを交換することが一般的に行われている（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００８−１３９７９４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、ターレットを用いてフィルタセットを交換する場合、所望のフィルタセットが光路に設定される位置までターレットを回転させる必要があり、交換作業に時間がかかっていた。
【０００６】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、蛍光観察に用いる光学フィルタの透過波長帯域を迅速に変更できるようにするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の第１の側面の蛍光顕微鏡は、試料に照射する励起光を照明光から抽出するための第１の光学フィルタ、または、前記試料からの光の所定の波長帯域を透過する第２の光学フィルタのうち少なくとも一方が、光の入射角により透過波長帯域の幅をほぼ一定に保ったまま中心波長が変化する複数の可変フィルタが光軸に沿って並べられ、複数の前記可変フィルタの光軸に対する角度を個別に調整可能な光学フィルタにより構成される。
【０００８】
本発明の第２の側面の光学フィルタは、光の入射角により透過波長帯域の幅をほぼ一定に保ったまま中心波長が変化する複数の可変フィルタが光軸に沿って並べられ、複数の前記可変フィルタの光軸に対する角度を個別に調整可能である。
【０００９】
本発明の第１の側面においては、第１の光学フィルタに備えられている複数の可変フィルタの光軸に対する角度を個別に調整することにより、励起光の波長が変更され、第２の光学フィルタに備えられている複数の可変フィルタの光軸に対する角度を個別に調整することにより、試料を観察する光の波長が変更される。
【００１０】
本発明の第２の側面においては、複数の可変フィルタの光軸に対する角度を個別に調整することにより、光学フィルタの透過波長帯域が変更される。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の第１の側面または第２の側面によれば、蛍光観察に用いる光学フィルタの透過波長帯域を迅速に変更することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明を適用した蛍光顕微鏡の照明光学系の構成例を示す図である。
【図２】本発明を適用した蛍光顕微鏡の観察光学系の構成例を示す図である。
【図３】チューナブルバンドパスフィルタの特性の一例を示す図である。
【図４】励起フィルタの透過波長帯域の一例を模式的に示す図である。
【図５】顕微鏡システムの構成例を示すブロック図である。
【図６】顕微鏡システムにより実行される観察処理を説明するためのフローチャートである。
【図７】GFPとYFPの励起スペクトルを示す図である。
【図８】GFPとYFPの蛍光スペクトルを示す図である。
【図９】顕微鏡システムにより実行されるアンミキシング観察処理を説明するためのフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を実施するための形態（以下、実施の形態という）について説明する。なお、説明は以下の順序で行う。
１．実施の形態
２．変形例
【００１４】
＜１．実施の形態＞
［蛍光顕微鏡の構成例］
図１および図２は、本発明を適用した蛍光顕微鏡の光学系の一実施の形態を示す図である。図１は、蛍光顕微鏡１の照明光学系の構成例を示し、図２は、蛍光顕微鏡１の観察光学系の構成例を示している。
【００１５】
光源１１から発せられた照明光は、コリメータレンズ１２により平行光束とされ、励起フィルタ１３に入射する。励起フィルタ１３は、透過波長帯域が可変の光学フィルタであり、入射する照明光のうち設定された波長帯域（以下、励起波長帯域と称する）の光を透過し、それ以外の波長帯域の光を遮断または減衰することにより、励起光を抽出する。
【００１６】
励起フィルタ１３により抽出された励起光は、集光レンズ１４を透過し、ダイクロイックミラー１５により対物レンズ１６の方向に反射され、対物レンズ１６を透過して、試料２に照射される。
【００１７】
励起光が照射された試料２からの光（以下、観察光と称する）は、対物レンズ１６およびダイクロイックミラー１５を透過し、バリアフィルタ１７に入射する。試料２は、所定の蛍光色素により染色されたり、あるいは、蛍光タンパク質が発現しており、励起光を照射することにより蛍光色素または蛍光タンパク質から発せられる蛍光が観察光に含まれる。
【００１８】
なお、以下、蛍光色素および蛍光タンパク質など励起光を照射することにより蛍光を発する物質を蛍光物質と総称する。
【００１９】
バリアフィルタ１７は、透過波長帯域が可変の光学フィルタであり、観察光のうち設定された波長帯域（以下、シグナル取得波長帯域と称する）の光を透過し、それ以外の波長帯域の光を遮断または減衰する。
【００２０】
バリアフィルタ１７を透過した観察光は、結像レンズ１８に入射し、結像レンズ１８により試料２の像３が結ばれる。
【００２１】
ここで、さらに図３および図４を参照して、励起フィルタ１３およびバリアフィルタ１７の特性について説明する。
【００２２】
励起フィルタ１３内には、チューナブルバンドパスフィルタ２１ａ，２１ｂが光軸に沿って並べられている。同様に、バリアフィルタ１７内には、チューナブルバンドパスフィルタ２１ｃ，２１ｄが光軸に沿って並べられている。チューナブルバンドパスフィルタ２１ａ乃至２１ｄは、透過波長帯域が可変の同じ種類の光学フィルタである。以下、チューナブルバンドパスフィルタ２１ａ乃至２１ｄを個々に区別する必要がない場合、単に、チューナブルバンドパスフィルタ２１と称する。
【００２３】
図３は、チューナブルバンドパスフィルタ２１の特性の一例を示している。なお、図３の横軸は波長（単位はnm）を示し、縦軸は透過率（単位は％）を示している。チューナブルバンドパスフィルタ２１は、入射光の角度（入射角）を所定の許容範囲内で調整することにより、透過波長帯域の幅（以下、透過波長帯幅と称する）をほぼ一定に保ったまま、中心波長（以下、透過中心波長と称する）を変更することができる光学フィルタである。例えば、Semrock社のVersaChorome（商標）をチューナブルバンドパスフィルタ２１として採用することが可能である。
【００２４】
例えば、図３の波形５１は、入射角が０度の場合のチューナブルバンドパスフィルタ２１の透過特性を示し、波形５２は、入射角が許容範囲の最大値（例えば、６０度）である場合のチューナブルバンドパスフィルタ２１の透過特性を示している。そして、許容範囲内で入射角を変化させることにより、波形５１と波形５２の間の範囲内において、透過波長帯幅をほぼ一定に保ったまま、透過中心波長を連続して変化させることができる。
【００２５】
図４は、励起フィルタ１３の透過波長帯域の一例を模式的に示す図である。波形６１ａは、チューナブルバンドパスフィルタ２１ａの透過波長帯域を示し、波形６１ｂは、チューナブルバンドパスフィルタ２１ｂの透過波長帯域を示している。
【００２６】
励起フィルタ１３全体の透過波長帯域は、波形６１ａと波形６１ｂとが重なる斜線で示される範囲、すなわち、２つのチューナブルバンドパスフィルタ２１の透過波長帯域が重なる帯域となる。つまり、励起フィルタ１３を透過する透過光の中心波長および波長帯幅は、チューナブルバンドパスフィルタ２１ａ，２１ｂの透過中心波長の相対的な差によって決定される。
【００２７】
従って、チューナブルバンドパスフィルタ２１ａ，２１ｂの光軸に対する角度（以下、設定角度と称する）を個別に調整し、両者の透過波長帯域が重なる範囲を変えることにより、励起フィルタ１３の透過中心波長を、チューナブルバンドパスフィルタ２１ａ，２１ｂの透過中心波長の設定可能範囲内で任意の値に設定することができ、励起フィルタ１３の透過波長帯幅を、チューナブルバンドパスフィルタ２１ａ，２１ｂの透過波長帯幅の範囲内で任意の値に設定することができる。
【００２８】
なお、チューナブルバンドパスフィルタ２１ａ，２１ｂの設定角度の調整は、手動または電動のどちらで行うようにしてもよい。
【００２９】
また、バリアフィルタ１７は、励起フィルタ１３と同様の構成を有しており、励起フィルタ１３と同様の方法により、シグナル取得波長帯域を任意の値に設定することが可能である。
【００３０】
このように、蛍光顕微鏡１では、例えば、励起スペクトルが近接した蛍光色素で多重染色した試料において特定の色素だけを励起したり、蛍光褪色や生細胞への光毒性を抑制したりするために、透過波長帯幅を変更する場合、または、蛍光のブリードスルーの悪影響を避けるためにシグナル取得波長帯幅を変更する場合などに、光学フィルタを交換する手間や時間を省くことができる。すなわち、各チューナブルバンドパスフィルタ２１の設定角度を調整するだけで、迅速に透過波長帯域およびシグナル取得波長帯域を所望の値に設定することができる。
【００３１】
また、ターレットや複数の種類の光学フィルタを設ける必要がなく、蛍光顕微鏡１の構成をシンプルにすることができる。
【００３２】
［顕微鏡システムの構成例］
図５は、蛍光顕微鏡１を用いた顕微鏡システム１０１の構成例を示すブロック図である。顕微鏡システム１０１は、蛍光顕微鏡１、カメラ１１１および制御装置１１２を含むように構成される。
【００３３】
カメラ１１１は、例えば、ＣＣＤイメージセンサ、ＣＭＯＳイメージセンサなどの撮像素子を用いたデジタルカメラであり、試料２の像３を撮影し、その結果得られた画像（以下、観察画像と称する）を制御装置１１２に供給する。
【００３４】
制御装置１１２は、例えば、市販のコンピュータにより構成される。制御装置１１２は、撮影制御部１２１、励起波長帯域制御部１２２、シグナル取得波長帯域制御部１２３、観察位置制御部１２４、画像処理部１２５、表示制御部１２６、入力部１２７、表示部１２８、および、記憶部１２９を含むように構成される。撮影制御部１２１、励起波長帯域制御部１２２、シグナル取得波長帯域制御部１２３、観察位置制御部１２４、画像処理部１２５、表示制御部１２６、入力部１２７、表示部１２８、および、記憶部１２９は、バス１３０を介して相互に接続されている。
【００３５】
撮影制御部１２１は、カメラ１１１を制御するとともに、カメラ１１１により撮影された観察画像を取得し、記憶部１２９に記憶させる。
【００３６】
励起波長帯域制御部１２２は、励起フィルタ１３のチューナブルバンドパスフィルタ２１ａ，２１ｂの設定角度を個別に調整し、励起フィルタ１３の励起波長帯域の設定を行う。
【００３７】
シグナル取得波長帯域制御部１２３は、バリアフィルタ１７のチューナブルバンドパスフィルタ２１ｃ，２１ｄの設定角度を個別に調整し、バリアフィルタ１７のシグナル取得波長帯域の設定を行う。
【００３８】
観察位置制御部１２４は、蛍光顕微鏡１のステージ（不図示）等の位置を制御することにより、試料２の観察位置の設定を行う。
【００３９】
画像処理部１２５は、観察画像を記憶部１２９から取得し、取得した観察画像に対して各種の画像処理を施し、記憶部１２９に記憶させる。
【００４０】
表示制御部１２６は、記憶部１２９に記憶されている観察画像を、表示部１２８に表示させる。また、表示制御部１２６は、顕微鏡システム１０１の操作や設定等を行うための画面を表示部１２８に表示させる。
【００４１】
入力部１２７は、例えば、キーボード、マウス、ボタン、スイッチ等の各種の入力装置により構成される。入力部１２７は、ユーザにより入力された各種の指令を制御装置１１２の各部に供給する。
【００４２】
表示部１２８は、例えば、ＬＣＤ（Liquid Crystal Display）等の表示装置により構成され、表示制御部１２６の制御の基に、観察画像や、顕微鏡システム１０１の操作や設定等を行うための画面を表示する。
【００４３】
記憶部１２９は、例えば、ハードディスクドライブ等の記憶装置により構成される。記憶部１２９には、上述した観察画像の他に、各蛍光物質の励起スペクトルおよび蛍光スペクトルのデータ等が記憶される。
【００４４】
［観察処理］
次に、図６のフローチャートを参照して、顕微鏡システム１０１により実行される観察処理について説明する。なお、この処理は、例えば、１種類以上の蛍光色素により染色された試料２、または、１種類以上の蛍光タンパク質が発現した試料２が、蛍光顕微鏡１のステージにセットされた状態で行われる。
【００４５】
ステップＳ１において、制御装置１１２は、試料２に適用されている蛍光物質の種類を取得する。具体的には、例えば、表示制御部１２６は、蛍光物質（蛍光色素および蛍光タンパク質）の一覧を表示部１２８に表示させる。ユーザは、入力部１２７を用いて、表示された一覧の中から、試料２に適用されている蛍光物質を選択する。なお、複数の蛍光物質が試料２に適用されている場合、ユーザは、その複数の蛍光物質を一覧の中から選択する。入力部１２７は、ユーザにより選択された蛍光物質の種類を、励起波長帯域制御部１２２およびシグナル取得波長帯域制御部１２３に通知する。
【００４６】
ステップＳ２において、励起波長帯域制御部１２２およびシグナル取得波長帯域制御部１２３は、励起波長帯域およびシグナル取得波長帯域を設定する。具体的には、励起波長帯域制御部１２２は、観察対象となる蛍光物質の励起スペクトルのデータを記憶部１２９から取得し、シグナル取得波長帯域制御部１２３は、観察対象となる蛍光物質の蛍光スペクトルのデータを記憶部１２９から取得する。
【００４７】
なお、観察対象となる蛍光物質は、その都度ユーザが入力部１２７を介して指定するようにしてもよいし、例えば、タイムラプス観察を行う場合などには、観察対象とする蛍光物質の順番を予め設定しておくようにしてもよい。
【００４８】
そして、励起波長帯域制御部１２２は、取得した励起スペクトルのデータに基づいて、励起フィルタ１３のチューナブルバンドパスフィルタ２１ａ，２１ｂの設定角度を調整し、観察対象となる蛍光物質に適した励起波長帯域を設定する。また、シグナル取得波長帯域制御部１２３は、取得した蛍光スペクトルのデータに基づいて、バリアフィルタ１７のチューナブルバンドパスフィルタ２１ｃ，２１ｄの設定角度を調整し、観察対象となる蛍光物質に適したシグナル取得波長帯域を設定する。
【００４９】
ここで、励起波長帯域およびシグナル取得波長帯域の設定方法の具体例について説明する。
【００５０】
まず、試料２に適用されている蛍光物質が１種類の場合、または、試料２に適用されている複数の蛍光物質の励起スペクトルが互いに離れている場合、励起波長帯域制御部１２２は、例えば、観察対象となる蛍光物質の励起スペクトルのピークを透過中心波長とする所定の幅の波長帯域を励起波長帯域に設定する。
【００５１】
同様に、試料２に適用されている蛍光物質が１種類の場合、または、試料２に適用されている複数の蛍光物質の蛍光スペクトルが互いに離れている場合、シグナル取得波長帯域制御部１２３は、例えば、観察対象となる蛍光物質の蛍光スペクトルのピークを透過中心波長とする所定の幅の波長帯域をシグナル取得波長帯域に設定する。
【００５２】
また、試料２に適用されている複数の蛍光物質の励起スペクトルが互いに近接している場合、励起波長帯域制御部１２２は、観察対象となる蛍光物質の励起スペクトルが他の蛍光物質の励起スペクトルと重ならない範囲を、励起波長帯域に設定する。
【００５３】
図７は、GFP（Green Fluorescent Protein）とYFP（Yellow Fluorescent Protein）の励起スペクトルを示している。なお、図７の横軸は、波長（単位はnm）を示し、縦軸は、スペクトルの強度を示している。ただし、各励起スペクトルの強度は、ピーク値を１００に正規化した値で示している。
【００５４】
図７を見ると、GFPの励起スペクトルの強度がピークとなる波長付近では、YFPの励起スペクトルもある程度の強度を有している。従って、試料２がGFPとYFPにより染色されている場合、GFPの励起スペクトルのピーク付近に励起波長帯域を設定すると、GFPだけでなくYFPも励起され、観察画像においてブリードスルーが発生してしまう。
【００５５】
そこで、励起波長帯域制御部１２２は、観察対象となるGFPの励起スペクトルの強度が所定の第１の閾値以上となり、YFPの励起スペクトルの強度が所定の第２の閾値（＜第１の閾値）以下となる波長の範囲内で、励起波長帯域を設定する。例えば、励起波長帯域制御部１２２は、図７の斜線で示される約400nm〜450nmの範囲内において、励起波長帯域を設定する。
【００５６】
同様に、試料２に適用されている複数の蛍光物質の蛍光スペクトルが互いに近接している場合、シグナル取得波長帯域制御部１２３は、観察対象となる蛍光物質の蛍光スペクトルが他の蛍光物質の蛍光スペクトルと重ならない範囲を、シグナル取得波長帯域に設定する。
【００５７】
図８は、GFPとYFPの蛍光スペクトルを示している。なお、図８の横軸は、波長（単位はnm）を示し、縦軸は、スペクトルの強度を示している。ただし、各蛍光スペクトルの強度は、ピーク値を１００に正規化した値で示している。
【００５８】
図８を見ると、GFPの蛍光スペクトルの強度がピークとなる波長付近では、YFPの蛍光スペクトルもある程度の強度を有している。従って、試料２がGFPとYFPにより染色されている場合、観察対象となるGFPの蛍光スペクトルのピーク付近にシグナル取得波長帯域を設定すると、GFPからの蛍光とYFPからの蛍光が混ざり、観察画像においてブリードスルーが発生してしまう。
【００５９】
そこで、シグナル取得波長帯域制御部１２３は、GFPの蛍光スペクトルの強度が所定の第３の閾値以上となり、YFPの蛍光スペクトルの強度が所定の第４の閾値（＜第３の閾値）以下となる波長帯域の範囲内で、シグナル取得波長帯域を設定する。例えば、シグナル取得波長帯域制御部１２３は、図８の斜線で示される約480nm〜500nmの範囲内において、シグナル取得波長帯域を設定する。
【００６０】
また、タイムラプス観察を行う場合、通常の観察を行う場合と比較して、励起光が試料２に照射される時間が長くなり、蛍光褪色が発生したり、光毒性により試料２がダメージを受けたりしやすくなる。従って、蛍光褪色や光毒性を軽減するために、できる限り励起光の強度を抑えることが望ましい。一方、観察画像の画質を向上させるためには、試料２の像３に含まれる蛍光の強度をできるだけ強くすることが望ましい。
【００６１】
従って、タイムラプス観察を行う場合には、通常の観察時と比較して、励起波長帯域を狭く設定し、シグナル取得波長帯域を広く設定するようにすることが望ましい。あるいは、観察時間が長くなるほど、励起波長帯域を狭く設定し、シグナル取得波長帯域を広く設定するようにしてもよい。
【００６２】
なお、例えば、蛍光褪色や光毒性の軽減、蛍光物質が複数適用されている場合のクロストークの回避などを目的として、励起波長帯域制御部１２２およびシグナル取得波長帯域制御部１２３により設定された励起波長帯域およびシグナル取得波長帯域を、さらにユーザが調整することも可能である。
【００６３】
ステップＳ３において、撮影制御部１２１は、観察画像のシグナル強度が最適な値になるようにカメラ１１１のパラメータ、例えば、露光時間、ゲイン等を調整する。なお、撮影制御部１２１は、励起波長帯域またはシグナル取得波長帯域の少なくとも一方が変更され、観察画像のシグナル強度が変化する度に、カメラ１１１の各パラメータを調整する。
【００６４】
ステップＳ４において、顕微鏡システム１０１は、観察画像を取得する。具体的には、カメラ１１１は、撮影制御部１２１の制御の基に、試料２の像３を撮影し、得られた観察画像を記憶部１２９に記憶させる。
【００６５】
なお、複数の種類の蛍光物質が試料２に適用されており、各蛍光物質による蛍光の観察画像を個別に取得する場合、ステップＳ２乃至Ｓ４の処理が繰り返され、各蛍光物質が順番に観察対象に設定され、励起波長帯域、シグナル取得波長帯域、および、カメラ１１１のパラメータが、観察対象に設定された蛍光物質に適した値に設定され、設定された条件で観察画像が取得される。
【００６６】
また、タイムラプス観察を行う場合、ユーザにより設定されたプログラムに従って、観察位置制御部１２４が、蛍光顕微鏡１のステージの位置を制御し、試料２の観察位置を移動しながら、各位置における観察画像が所定のタイミングで取得される。
【００６７】
なお、記憶部１２９に記憶された観察画像は、自動的に、あるいは、ユーザの指令に従って、表示制御部１２６の制御の基に、表示部１２８に表示される。
【００６８】
このようにして、蛍光物質の種類によって光学フィルタを交換することなく、迅速に励起波長帯域およびシグナル取得波長帯域を適切な値に調整し、各蛍光物質からの蛍光による観察画像を良好な画質で取得することができる。
【００６９】
また、従来、タイムラプス観察を行う場合、励起光の強度を弱めるために減光フィルタ（ＮＤフィルタ）が用いられているが、この場合、蛍光褪色や光毒性を軽減することができる一方で、取得される観察画像のＳ／Ｎ比が悪化する恐れがある。一方、本実施形態では、励起波長帯域全体を減光するのではなく、励起波長帯域およびシグナル取得波長帯域を調整することにより、蛍光褪色や光毒性を軽減するため、減光フィルタを用いる場合と比較して、観察画像のＳ／Ｎ比が向上する。
【００７０】
次に、図９のフローチャートを参照して、顕微鏡システム１０１により実行されるアンミキシング観察処理について説明する。なお、この処理は、例えば、１種類以上の蛍光色素により染色された試料２、または、１種類以上の蛍光タンパク質が発現した試料２が、蛍光顕微鏡１のステージにセットされた状態で行われる。また、この処理では、励起フィルタ１３は用いられない。すなわち、光源１１からの照明光が、そのまま励起光として試料２に照射される。
【００７１】
ステップＳ３１において、制御装置１１２は、取得するスペクトルの範囲および波長分解能の設定値を取得する。具体的には、例えば、表示制御部１２６は、取得するスペクトルの範囲および波長分解能の設定画面を表示部１２８に表示させる。ユーザは、入力部１２７を用いて、所望のスペクトルの範囲および波長分解能を入力する。入力部１２７は、ユーザにより入力されたスペクトルの範囲および波長分解能の設定値をシグナル取得波長帯域制御部１２３に供給する。
【００７２】
なお、以下、取得するスペクトルの範囲が500nm〜600nmに設定され、波長分解能が2nmに設定された場合について説明する。
【００７３】
ステップＳ３２において、シグナル所得波長帯域制御部１２３は、シグナル取得波長帯域を設定する。例えば、シグナル所得波長帯域制御部１２３は、バリアフィルタ１７のチューナブルバンドパスフィルタ２１ｃ，２１ｄの角度を調整し、バリアフィルタ１７のシグナル取得波長帯域を500nm〜502nmに設定する。
【００７４】
ステップＳ３３において、顕微鏡システム１０１は、観察画像を取得する。具体的には、カメラ１１１は、撮影制御部１２１の制御の基に試料２の像３を撮影し、得られた観察画像を記憶部１２９に記憶させる。
【００７５】
ステップＳ３４において、シグナル所得波長帯域制御部１２３は、全ての範囲のスペクトルを取得したか否かを判定する。シグナル所得波長帯域制御部１２３は、設定されたスペクトルの範囲のうち、まだ所得していない波長帯域が残っている場合、まだ全ての範囲のスペクトルを取得していないと判定し、処理はステップＳ３５に進む。
【００７６】
ステップＳ３５において、シグナル取得波長帯域制御部１２３は、シグナル取得波長帯域をシフトする。すなわち、シグナル取得波長帯域制御部１２３は、バリアフィルタ１７のチューナブルバンドパスフィルタ２１ｃ，２１ｄの角度を調整し、バリアフィルタ１７のシグナル取得波長帯域を、現在の波長帯域に波長分解能を加えた波長帯域にシフトする。例えば、いまの場合、シグナル取得波長帯域が502nm〜504nmにシフトされる。
【００７７】
その後、処理はステップＳ３３に戻り、ステップＳ３４において全ての範囲のスペクトルを取得したと判定されるまで、ステップＳ３３乃至Ｓ３５の処理が繰返し実行される。
【００７８】
一方、ステップＳ３４においてシグナル取得波長帯域制御部１２３は、設定されたスペクトルの範囲内において所得していない波長帯域が残っていない場合、全ての範囲のスペクトルを取得したと判定し、処理はステップＳ３６に進む。
【００７９】
このステップＳ３３乃至Ｓ３５の処理により、指定されたスペクトルの範囲を指定された波長分解能で分割した各波長帯域にシグナル取得波長帯域が順番に設定され、各シグナル取得波長帯域に設定されたバリアフィルタ１７を透過した試料２の光の像３が撮影される。この例の場合、500nm〜600nmの範囲内において2nm刻みでシグナル取得波長帯域が設定され、各シグナル取得波長帯域に対応する合計50枚（＝（600nm−500nm）÷2nm）の観察画像が取得される。
【００８０】
ステップＳ３６において、画像処理部１２５は、アンミキシング画像処理を実行する。例えば、画像処理部１２５は、ステップＳ３３乃至Ｓ３５の処理で取得された、シグナル取得波長帯域が異なる複数の観察画像を記憶部１２９から取得し、取得した複数の観察画像に基づいて、観察画像の各画素のスペクトル分布を検出する。次に、画像処理部１２５は、各画素のスペクトル分布、および、試料２に適用されている各蛍光物質の蛍光スペクトルのデータに基づいて、各蛍光物質に対応する蛍光の含有率を画素毎に算出する。
【００８１】
そして、画像処理部１２５は、各画素における各蛍光の含有率に基づいて、各蛍光を分離した観察画像を生成し、記憶部１２９に記憶させる。なお、このとき、蛍光毎に異なる観察画像を生成するようしてもよいし、１枚の観察画像内において複数の蛍光を区別して示すようにしてもよい。また、表示部１２８は、表示制御部１２６の制御の基に、画像処理部１２５により生成された観察画像を表示する。
【００８２】
このようにして、蛍光スペクトルが近接する複数の蛍光を分離したり、蛍光物質による蛍光と自家蛍光とを分離して観察することができる。また、試料２内の蛍光スペクトルや蛍光スペクトルの経時変化を観察することができる。
【００８３】
また、観察画像の各画素のスペクトル分布を所望の波長分解能で取得することができる。
【００８４】
さらに、従来、観察画像の各画素のスペクトル分布の検出は、観察画像の各画素に対応する観察光を分光し、複数のＰＭＴ（光電子増倍管）を用いて各波長帯域の光の強度を検出することにより行われている。一方、本実施の形態では、ＣＣＤイメージセンサなどの２次元の撮像素子を用いて、観察画像の各画素のスペクトル分布を検出することが可能である。また、ＰＭＴの数を増やすなどの対応を行うことなく、簡単に波長分解能を任意の値に設定することができる。
【００８５】
＜２．変形例＞
以上の説明では、励起フィルタ１３およびバリアフィルタ１７にそれぞれ２つのチューナブルバンドパスフィルタ２１を設ける例を示したが、３つ以上設けるようにすることも可能である。
【００８６】
また、励起フィルタ１３およびバリアフィルタ１７のいずれか一方にのみ、本発明を適用した光学フィルタを用いるようにすることも可能である。
【００８７】
さらに、制御装置１１２の機能の一部または全部を蛍光顕微鏡１に設けるようにすることも可能である。
【００８８】
また、本発明は、上述した蛍光顕微鏡１以外にも、光学フィルタの透過波長帯域を変更する必要がある光学顕微鏡などの各種の装置に適用することが可能である。
【００８９】
なお、本明細書において、システムの用語は、複数の装置、手段などより構成される全体的な装置を意味するものとする。
【００９０】
また、本発明の実施の形態は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。
【符号の説明】
【００９１】
１ 蛍光顕微鏡， ２ 試料， ３ 像， １１ 光源， １２ コリメータレンズ， １３ 励起フィルタ， １４ 集光レンズ， １５ ダイクロイックミラー， １６ 対物レンズ， １７ バリアフィルタ， １８ 結像レンズ， ２１ａ乃至２１ｄ チューナブルバンドパスフィルタ， １０１ 顕微鏡システム， １１１ カメラ， １１２ 制御装置， １２１ 撮影制御部， １２２ 励起波長帯域制御部， １２３ シグナル取得波長帯域制御部， １２４ 観察位置制御部， １２５ 画像処理部， １２６ 表示制御部， １２７ 入力部， １２８ 表示部， １２９ 記憶部
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料に照射する励起光を照明光から抽出するための第１の光学フィルタ、または、前記試料からの光の所定の波長帯域を透過する第２の光学フィルタのうち少なくとも一方が、光の入射角により透過波長帯域の幅をほぼ一定に保ったまま中心波長が変化する複数の可変フィルタが光軸に沿って並べられ、複数の前記可変フィルタの光軸に対する角度を個別に調整可能な光学フィルタにより構成される
ことを特徴とする蛍光顕微鏡。
【請求項２】
前記試料に適用する蛍光物質の種類に応じて、前記第１の光学フィルタに備えられている複数の前記可変フィルタの光軸に対する角度を個別に調整し、前記第１の光学フィルタの透過波長帯域を設定する透過波長帯域制御手段を
さらに備えることを特徴とする請求項１に記載の蛍光顕微鏡。
【請求項３】
前記透過波長帯域制御手段は、さらに、前記試料に適用する蛍光物質の種類に応じて、前記第２の光学フィルタに備えられている複数の前記可変フィルタの光軸に対する角度を個別に調整し、前記第２の光学フィルタの透過波長帯域を設定するとともに、前記試料の観察時間が長くなるほど、前記第１の光学フィルタの透過波長帯域を狭く設定し、前記第２の光学フィルタの透過波長帯域を広く設定する
ことを特徴とする請求項２に記載の蛍光顕微鏡。
【請求項４】
前記試料に適用する蛍光物質の種類に応じて、前記第２の光学フィルタに備えられている複数の前記可変フィルタの光軸に対する角度を個別に調整し、前記第２の光学フィルタの透過波長帯域を設定する透過波長帯域制御手段を
さらに備えることを特徴とする請求項１に記載の蛍光顕微鏡。
【請求項５】
前記第２の光学フィルタに備えられている複数の前記可変フィルタの光軸に対する角度を個別に調整し、指定された波長帯域を指定された波長分解能で分割した各波長帯域に、前記第２の光学フィルタの透過波長帯域を設定する透過波長帯域制御手段と、
各透過波長帯域に設定された第２の光学フィルタを透過した前記試料からの光の像をそれぞれ撮影した複数の画像を取得する画像取得手段と、
複数の前記画像に基づいて、前記画像の各画素のスペクトル分布を検出するスペクトル分布検出手段と
をさらに備えることを特徴とする請求項１に記載の蛍光顕微鏡。
【請求項６】
光の入射角により透過波長帯域の幅をほぼ一定に保ったまま中心波長が変化する複数の可変フィルタが光軸に沿って並べられ、複数の前記可変フィルタの光軸に対する角度を個別に調整可能な光学フィルタ。
【請求項１】
試料に照射する励起光を照明光から抽出するための第１の光学フィルタ、または、前記試料からの光の所定の波長帯域を透過する第２の光学フィルタのうち少なくとも一方が、光の入射角により透過波長帯域の幅をほぼ一定に保ったまま中心波長が変化する複数の可変フィルタが光軸に沿って並べられ、複数の前記可変フィルタの光軸に対する角度を個別に調整可能な光学フィルタにより構成される
ことを特徴とする蛍光顕微鏡。
【請求項２】
前記試料に適用する蛍光物質の種類に応じて、前記第１の光学フィルタに備えられている複数の前記可変フィルタの光軸に対する角度を個別に調整し、前記第１の光学フィルタの透過波長帯域を設定する透過波長帯域制御手段を
さらに備えることを特徴とする請求項１に記載の蛍光顕微鏡。
【請求項３】
前記透過波長帯域制御手段は、さらに、前記試料に適用する蛍光物質の種類に応じて、前記第２の光学フィルタに備えられている複数の前記可変フィルタの光軸に対する角度を個別に調整し、前記第２の光学フィルタの透過波長帯域を設定するとともに、前記試料の観察時間が長くなるほど、前記第１の光学フィルタの透過波長帯域を狭く設定し、前記第２の光学フィルタの透過波長帯域を広く設定する
ことを特徴とする請求項２に記載の蛍光顕微鏡。
【請求項４】
前記試料に適用する蛍光物質の種類に応じて、前記第２の光学フィルタに備えられている複数の前記可変フィルタの光軸に対する角度を個別に調整し、前記第２の光学フィルタの透過波長帯域を設定する透過波長帯域制御手段を
さらに備えることを特徴とする請求項１に記載の蛍光顕微鏡。
【請求項５】
前記第２の光学フィルタに備えられている複数の前記可変フィルタの光軸に対する角度を個別に調整し、指定された波長帯域を指定された波長分解能で分割した各波長帯域に、前記第２の光学フィルタの透過波長帯域を設定する透過波長帯域制御手段と、
各透過波長帯域に設定された第２の光学フィルタを透過した前記試料からの光の像をそれぞれ撮影した複数の画像を取得する画像取得手段と、
複数の前記画像に基づいて、前記画像の各画素のスペクトル分布を検出するスペクトル分布検出手段と
をさらに備えることを特徴とする請求項１に記載の蛍光顕微鏡。
【請求項６】
光の入射角により透過波長帯域の幅をほぼ一定に保ったまま中心波長が変化する複数の可変フィルタが光軸に沿って並べられ、複数の前記可変フィルタの光軸に対する角度を個別に調整可能な光学フィルタ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２０１２−１５０２５３（Ｐ２０１２−１５０２５３Ａ）
【公開日】平成２４年８月９日（２０１２．８．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−８４５３（Ｐ２０１１−８４５３）
【出願日】平成２３年１月１９日（２０１１．１．１９）
【出願人】（０００００４１１２）株式会社ニコン (12,601)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年８月９日（２０１２．８．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１月１９日（２０１１．１．１９）
【出願人】（０００００４１１２）株式会社ニコン (12,601)
【Ｆターム（参考）】
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